特表 2025-500458 閉端ＤＮＡベクターの拡張可能かつ高純度の無細胞合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】閉端ＤＮＡベクターの拡張可能かつ高純度の無細胞合成

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/64 20060101AFI20241226BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP

   A01K 67/0278 20240101ALI20241226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20241226BHJP

【ＦＩ】

C12N15/64 Z

C12N15/88 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A01K67/0278

C12N15/63 Z

A61K31/7088

A61K9/51

A61P43/00

A61K35/76

A61K48/00

C12N15/12 ZNA

C12N15/13

C12N15/52 Z

C12N15/09 100

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538120

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(85)【翻訳文提出日】2024-06-21

(86)【国際出願番号】 US2022053868

(87)【国際公開番号】W WO2023122303

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/293,337

(32)【優先日】2021-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520068043

【氏名又は名称】ジェネレーション バイオ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】モンズ， ラッセル

(72)【発明者】

【氏名】シピ， ジョリス

(72)【発明者】

【氏名】ブラックストック， ダニエル ジェイソン

(72)【発明者】

【氏名】デュラント， ジョン チェスター

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AB01

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4B065CA44

4C076AA65

4C076AA95

4C084AA13

4C084MA38

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4C084ZB21

4C086AA01

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4C086MA01

4C086MA04

4C086MA38

4C086NA13

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA38

4C087NA13

4C087ZB21

(57)【要約】

本開示は、ＤＮＡベクター、特に導入遺伝子の送達及び発現のための直鎖状で連続的な構造を有する閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の拡張可能かつ高純度の無細胞合成のための方法を提供する。無細胞合成は、二本鎖ＤＮＡ構築物を、認識部位とは異なる切断部位で構築物を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して、その後のライゲーション反応の高い特異性を調節する固有のオーバーハングを有するインサートを放出することを含む。次いで、インサートは、逆位末端反復（ＩＴＲ）オリゴヌクレオチドとライゲーションされて、閉端ＤＮＡベクターを形成する。これらの方法によって調製された対応するＤＮＡベクター及び関連産物とともに、方法と関連付けられた他の塩基並びに中間ベクター及び構築物もまた、本開示で提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを産生する方法であって、前記方法は、
（ａ）センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖ＤＮＡ構築物を、少なくとも第１の制限エンドヌクレアーゼ及び少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることであって、
前記構築物が、
導入遺伝子発現カセットと、
前記導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、
前記導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含み、
前記第１の制限エンドヌクレアーゼが、前記第１の切断部位で前記二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、前記第２の切断部位で前記二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、
前記二本鎖ＤＮＡ構築物を前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることが、第１の一本鎖オーバーハングを含む第１の末端及び第２の一本鎖オーバーハングを含む第２の末端を有するインサートを放出させる、接触させることと、
（ｂ）前記第１の末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることと、
（ｃ）前記第２の末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることと、を含み、
それによって、ｃｅＤＮＡベクターを産生する、方法。

【請求項2】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＩＴＲを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが異なる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが同じである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～３又は５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記オリゴヌクレオチドの各々が、独立して、１、２、３、４、又はそれ以上のステムループ領域を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記オリゴヌクレオチドの各々が、独立して、２又は３のステムループ領域を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第１の切断部位が、互いに別個の、かつ異なる部位であり、両方の部位が、前記導入遺伝子発現カセットの上流に位置する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の切断部位が、前記構築物の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約２２ヌクレオチド離れている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記第１の切断部位が、前記構築物の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約８ヌクレオチド離れている、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第２の切断部位が、互いに別個の、かつ異なる部位であり、両方の部位が、前記発現カセットの下流に位置する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第２の切断部位が、前記構築物の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約２２ヌクレオチド離れている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の切断部位が、前記構築物の前記センス及び前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約８ヌクレオチド離れている、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、各々、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の各々において異なる５’から３’方向のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記インサートの前記末端における前記一本鎖オーバーハングのうちの一方又は両方が、５’オーバーハングである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記インサートの前記末端における前記一本鎖オーバーハングのうちの一方又は両方が、３’オーバーハングである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

１つ以上のヘアピン構造を含む前記第１のオリゴヌクレオチド及び１つ以上のヘアピン構造を含む前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして三次元構成を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記三次元構成が、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

１つ以上のヘアピン構造を含む前記第１のオリゴヌクレオチド及び１つ以上のヘアピン構造を含む前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして、各オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかに一本鎖オーバーハングを更に形成する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして、各オリゴヌクレオチドの前記５’末端における一本鎖オーバーハングを更に形成する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして、各オリゴヌクレオチドの前記３’末端における一本鎖オーバーハングを更に形成する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

各オリゴヌクレオチドの前記５’末端が、リン酸化されている、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、約１～約１２ヌクレオチド長である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、約１～約８ヌクレオチド長である、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、約２～約６ヌクレオチド長である、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、約３、約４、約５、又は約６ヌクレオチド長である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、３又は４ヌクレオチド長である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングの前記５’から３’方向のヌクレオチド配列が、互いに対して非相補的である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングの前記５’から３’方向のヌクレオチド配列が、同じである、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記インサートの各末端における前記一本鎖オーバーハングが、同じ５’から３’方向のヌクレオチド配列を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、前記インサートの前記末端における前記一本鎖オーバーハングのうちの両方に対して相補的である、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングの前記５’から３’方向のヌクレオチド配列が異なる、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記インサートの各末端における前記一本鎖オーバーハングの前記５’から３’方向のヌクレオチド配列が異なる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、各々、前記インサートの前記末端における前記一本鎖オーバーハングのうちの１つのみに対して相補的である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハング及び／又は前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖オーバーハングが、ＣＴＣＴ、ＣＴＣＡ、ＣＡＣＴ、ＣＴＣ、及びＧＣＴからなる群から選択される５’から３’方向のヌクレオチド配列を含む、請求項２１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドのうちの一方又は両方が、合成である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々、約４０ヌクレオチド～約７５ヌクレオチド長である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド長である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、各々独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記第１のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造と、前記第２のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造とが、少なくとも約４塩基対長であるステム領域を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記第１のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造と、前記第２のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造とが、約４塩基対～約２０塩基対長であるステム領域を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記第１のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造と、前記第２のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造とが、約４塩基対～約１５塩基対長であるステム領域を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記第１のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造と、前記第２のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造とが、約４塩基対～約６塩基対長であるステム領域を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記第１のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造と、前記第２のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造とが、約６塩基対～約８塩基対長であるステム領域を含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

ステム領域長が、いかなる一本鎖オーバーハングも含まない、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、前記同じ制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼの各々が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼの前記各々が、独立して、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択されるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓａＩ又はそのアイソシゾマーである、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、Ｅｓｐ３Ｉ又はそのアイソシゾマーである、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記ライゲーションすることの後に、前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、得られるｃｅＤＮＡベクターにおいて再生されない、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、前記導入遺伝子発現カセットに各々隣接する少なくとも第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲを更に含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記第１の部分ＩＴＲが、前記導入遺伝子発現カセットの上流、かつ前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第１の切断部位の下流にある、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記第２の部分ＩＴＲが、前記導入遺伝子発現カセットの下流、かつ前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第２の切断部位の上流にある、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項63】

前記第１の切断部位が、前記第１の部分ＩＴＲに隣接し、前記第２の切断部位が、前記第２の部分ＩＴＲに隣接する、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、前記第１の部分ＩＴＲと前記導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、前記第２の部分ＩＴＲと前記導入遺伝子発現カセットとの間に第２のスペーサを更に含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、又は直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記得られるｃｅＤＮＡベクターが、前記導入遺伝子発現カセットと、前記導入遺伝子発現カセットに各々隣接する少なくとも第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲと、を含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記第１のＩＴＲが、前記導入遺伝子発現カセットの上流にある、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記第２のＩＴＲが、前記導入遺伝子発現カセットの下流にある、請求項６７又は６８に記載の方法。

【請求項70】

前記第１のＩＴＲが、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第１の部分ＩＴＲからのヌクレオチド配列を含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記第２のＩＴＲが、前記第２のオリゴヌクレオチド及び前記第２の部分ＩＴＲからのヌクレオチド配列を含む、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記第１のＩＴＲが、前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位を欠いている、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記第２のＩＴＲが、前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位を欠いている、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲが、各々、ヘアピン構造及び／又はＴ字形若しくはＹ字形ステムループ構造を含む、請求項６７～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲが、各々、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造が、Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びに２つのＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループを含むステムを含む、請求項２０～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ又はＡＡＶ由来のＩＴＲである、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、野生型ＩＴＲである、請求項６７～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲの両方が、野生型ＩＴＲである、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、修飾型ＩＴＲである、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲが、互いに対称又は実質的に対称である、請求項６７～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲが、非対称のＩＴＲである、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、付加、欠失、切断、及び点変異からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項６７～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記１つ以上の修飾が、前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方又は両方の前記Ａ－Ａ’ステム領域、前記Ｂ－Ｂ’ループ、前記Ｃ－Ｃ’ループ、及び／又はＤ－Ｄ’ステム領域に位置する、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記１つ以上の修飾が、前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方又は両方の前記Ｂ－Ｂ’ループ及び／又は前記Ｃ－Ｃ’ループに位置する、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項86】

前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲのうちの一方の前記Ｂ－Ｂ’ループ及び前記Ｃ－Ｃ’ループが、切断されている、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記導入遺伝子発現カセットが、前記第１のＩＴＲと前記導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む、請求項６７～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記導入遺伝子発現カセットが、前記第２のＩＴＲと前記導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む、請求項６７～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記導入遺伝子発現カセットが、前記第１のＩＴＲと前記導入遺伝子発現カセットとの間の第１のスペーサと、前記第２のＩＴＲと前記導入遺伝子発現カセットとの間の第２のスペーサと、を更に含む、請求項６７～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記導入遺伝子発現カセットが、導入遺伝子を含む、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記治療用タンパク質が、酵素、凝固因子又は補因子、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記導入遺伝子発現カセットが、プロモータ、エンハンサ、イントロン、転写後調節エレメント、及びポリアデニル化シグナルからなる群から選択される遺伝子エレメントを更に含む、請求項１～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記ライゲーションすることが、リガーゼ又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によって行われる、請求項１～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記リガーゼが、Ｔ４リガーゼである、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記方法が、前記得られるｃｅＤＮＡベクターを単離又は精製することを更に含む、請求項１～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記方法が、前記ライゲーションすることの前に前記インサートを単離又は精製することを更に含む、請求項１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記方法が、前記ライゲーションすることの前に前記インサートを単離又は精製することを含まない、請求項１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、単一の反応容器内で実施される、請求項１～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記得られるｃｅＤＮＡベクターが、前記ｃｅＤＮＡベクターのモノマー種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含む、請求項１～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター。

【請求項103】

請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項104】

請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む、脂質ナノ粒子組成物。

【請求項105】

請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む、単離された宿主細胞。

【請求項106】

請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む、トランスジェニック動物。

【請求項107】

対象における障害、疾患、又は病態を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター、又は請求項１０３に記載の医薬組成物、又は請求項１０４に記載の脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法。

【請求項108】

前記障害、疾患、又は病態が、遺伝性障害、疾患、又は病態である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

対象に治療用タンパク質を送達する方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法によって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター、又は請求項１０３に記載の医薬組成物、又は請求項１０４に記載の脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法。

【請求項110】

前記治療用タンパク質が、酵素、凝固因子又は補因子、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質からなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

以下からなる群から選択される、逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列。

【表21】

【請求項112】

前記ヌクレオチド配列が、以下からなる群から選択されるスペーサを更に含む、請求項１１１に記載のＩＴＲヌクレオチド配列。

【表22】

【請求項113】

導入遺伝子発現カセットと、前記導入遺伝子発現カセットに隣接する少なくとも第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲと、を含む、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、前記第１のＩＴＲ及び前記第２のＩＴＲが、各々、請求項１１１又は１１２に記載のＩＴＲヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ｃｅＤＮＡベクター。

【請求項114】

前記ベクターが、二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１１３に記載のｃｅＤＮＡベクター。

【請求項115】

請求項１１３又は１１４に記載のｃｅＤＮＡベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項116】

請求項１１３又は１１４に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、脂質ナノ粒子組成物。

【請求項117】

請求項１１３又は１１４に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、単離された宿主細胞。

【請求項118】

請求項１１３又は１１４に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、トランスジェニック動物。

【請求項119】

対象における障害、疾患、又は病態を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の、請求項１１３又は１１４に記載のｃｅＤＮＡベクター、又は請求項１１５に記載の医薬組成物、又は請求項１１６に記載の脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法。

【請求項120】

前記障害、疾患、又は病態が、遺伝性障害、疾患、又は病態である、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

対象に治療用タンパク質を送達する方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の、請求項１１３又は１１４に記載のｃｅＤＮＡベクター、又は請求項１１５に記載の医薬組成物、又は請求項１１６に記載の脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法。

【請求項122】

前記治療用タンパク質が、酵素、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

閉端ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）の合成産生で使用するためのＤＮＡベクターであって、
導入遺伝子を受容することができるマルチクローニング部位と、
前記マルチクローニング部位の上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、
前記マルチクローニング部位の下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、
前記マルチクローニング部位に各々隣接する第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲと、を含む、ＤＮＡベクター。

【請求項124】

前記第１の部分ＩＴＲが、前記マルチクローニング部位の上流、かつ前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第１の切断部位の下流にある、請求項１２３に記載のＤＮＡベクター。

【請求項125】

前記第２の部分ＩＴＲが、前記マルチクローニング部位の下流、かつ前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第２の切断部位の上流にある、請求項１２３又は１２４に記載のＤＮＡベクター。

【請求項126】

１つ以上のスペーサを更に含む、請求項１２３～１２５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項127】

複製起源及び選択可能なマーカー遺伝子を更に含む、請求項１２３～１２６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項128】

前記マルチクローニング部位が、導入遺伝子と、プロモータ、エンハンサ、イントロン、転写後調節エレメント、及びポリアデニル化シグナルからなる群から選択される１つ以上の追加の遺伝子エレメントと、を受容することができる、請求項１２３～１２７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項129】

前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、第１の制限エンドヌクレアーゼに特異的であり、前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼに特異的である、請求項１２３～１２８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項130】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである、請求項１２９に記載のＤＮＡベクター。

【請求項131】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである、請求項１２９に記載のＤＮＡベクター。

【請求項132】

前記制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１２９～１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項133】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼの各々が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１２９～１３２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項134】

前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１３２又は１３３に記載のＤＮＡベクター。

【請求項135】

各ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、独立して、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１３３又は１３４に記載のＤＮＡベクター。

【請求項136】

前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１３１～１３５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項137】

前記ＤＮＡベクターが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２３～１３６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。

【請求項138】

導入遺伝子を含む閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを調製するためのキットであって、前記キットが、
請求項１２３～１３７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクターと、
前記ＤＮＡベクターを前記マルチクローニング部位で切断して、前記マルチクローニング部位が導入遺伝子を受容することを可能にすることができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
前記第１の切断部位及び前記第２の切断部位で切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
リガーゼと、
使用説明書と、を含む、キット。

【請求項139】

１つ以上のヘアピン構造を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項１３８に記載のキット。

【請求項140】

導入遺伝子発現カセットを含む閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターの調製を容易にするように操作された二本鎖環状ＤＮＡ構築物であって、前記二本鎖環状ＤＮＡ構築物が、
導入遺伝子発現カセットと、
前記導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、
前記導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、
前記導入遺伝子発現カセットに各々隣接する第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲと、を含む、二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項141】

前記第１の部分ＩＴＲが、前記導入遺伝子発現カセットの上流、かつ前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第１の切断部位の下流にある、請求項１４０に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項142】

前記第２の部分ＩＴＲが、前記導入遺伝子発現カセットの下流、かつ前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び前記対応する第２の切断部位の上流にある、請求項１４０又は１４１に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項143】

前記第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、第１の制限エンドヌクレアーゼに特異的であり、前記第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼに特異的である、請求項１４０～１４２のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項144】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４３に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項145】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４３に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項146】

前記制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４０～１４５のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項147】

前記第１の制限エンドヌクレアーゼ及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼの各々が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項148】

前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１４６又は１４７に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項149】

各ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、独立して、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１４６～１４８のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項150】

前記少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１４６～１４８のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ構築物。

【請求項151】

導入遺伝子発現カセットを含む閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを調製するためのキットであって、前記キットが、
請求項１４０～１５０のいずれか一項に記載の二本鎖ＤＮＡ構築物と、
前記二本鎖ＤＮＡ構築物を前記第１の切断部位及び前記第２の切断部位で切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
リガーゼと、
使用説明書と、を含む、キット。

【請求項152】

１つ以上のヘアピン構造を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項１５１に記載のキット。

【請求項153】

ローリングサークル増幅を介してプラスミド鋳型から二本鎖ＤＮＡ構築物を産生する方法であって、
（ａ）前記プラスミド鋳型を、鎖置換活性を有する熱安定性ポリメラーゼと接触させるステップであって、ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ単位）に対するプラスミド鋳型濃度（ｎｇ／μｌ単位）の比が、約１を超える、ステップと、
（ｂ）前記プラスミド鋳型をオリゴヌクレオチドプライマ及びｄＮＴＰと接触させるステップと、
（ｃ）前記プラスミド鋳型、前記ポリメラーゼ、前記オリゴヌクレオチドプライマ、及び前記ｄＮＴＰを、約４０℃以下の温度で、少なくとも約５時間の期間にわたってインキュベートするステップと、を含み、
それによって、二本鎖ＤＮＡ構築物を産生する、方法。

【請求項154】

前記ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ単位）に対するプラスミド鋳型濃度（ｎｇ／μｌ単位）の比が、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０を超える、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

前記プラスミド鋳型濃度が、約０．０１ｎｇ／μｌ、約０．０５ｎｇ／μｌ、約０．１ｎｇ／μｌ、約０．１５ｎｇ／μｌ、約０．２ｎｇ／μｌ、約０．２１ｎｇ／μｌ、約０．２２ｎｇ／μｌ、約０．２３ｎｇ／μｌ、約０．２４ｎｇ／μｌ、約０．２ｎｇ／μｌ、約０．２６ｎｇ／μｌ、約０．２７ｎｇ／μｌ、約０．２８ｎｇ／μｌ、約０．２９ｎｇ／μｌ、約０．３ｎｇ／μｌ、約０．３５ｎｇ／μｌ、約０．４ｎｇ／μｌ、約０．４５ｎｇ／μｌ、約０．５ｎｇ／μｌ、約０．６ｎｇ／μｌ、約０．７ｎｇ／μｌ、約０．８ｎｇ／μｌ、約０．９ｎｇ／μｌ、又は約１．０ｎｇ／μｌである、請求項１５３又は１５４に記載の方法。

【請求項156】

前記ポリメラーゼ濃度が、約０．０１Ｕ／μｌ、約０．０２Ｕ／μｌ、約０．０３Ｕ／μｌ、約０．０４Ｕ／μｌ、約０．０５Ｕ／μｌ、約０．０６Ｕ／μｌ、約０．０７Ｕ／μｌ、約０．０８Ｕ／μｌ、約０．０９Ｕ／μｌ、約０．１Ｕ／μｌ、約０．１５Ｕ／μｌ、約０．２Ｕ／μｌ、約０．２５Ｕ／μｌ、約０．３Ｕ／μｌ、約０．３５Ｕ／μｌ、約０．４Ｕ／μｌ、又は約０．４５Ｕ／μｌである、請求項１５３～１５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

ステップ（ｃ）における前記温度が、約４０℃、約３９℃、約３８℃、約３７℃、約３６℃、約３５℃、約３４℃、約３３℃、約３２℃、約３１℃、約３０℃、約２９℃、約２８℃、約２７℃、約２６℃、約２５℃、約２４℃、約２３℃、約２２℃、又は約２１℃未満である、請求項１５３～１５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項158】

前記期間が、少なくとも約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約２１時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、又は約４０時間である、請求項１５３～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記期間が、約６時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約２１時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、又は約４０時間未満である、請求項１５３～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

前記プラスミド鋳型濃度が、約０．２５ｎｇ／μｌであり、前記温度が、約３０℃であり、前記ポリメラーゼ濃度が、約０．０５Ｕ／μｌであり、前記期間が、約１８～２６時間である、請求項１５３～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

前記オリゴヌクレオチドプライマ濃度が、約５０μＭ未満である、請求項１５３～１６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

前記オリゴヌクレオチドプライマ濃度が、少なくとも約１０μＭである、請求項１５３～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

前記オリゴヌクレオチドプライマ濃度が、少なくとも約１０μＭかつ約５０μＭ未満である、請求項１５３～１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項164】

前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ又はその誘導体若しくはバリアントである、請求項１５３～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記熱安定性ポリメラーゼが、ＥＱＵＩＰＨＩ２９（商標）である、請求項１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記方法が、少なくとも約１００μｌの総反応体積で実施される、請求項１５３～１６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記方法が、少なくとも約１００μｌ、約２００μｌ、約３００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌ、約５５ｍｌ、約６０ｍｌ、約６５ｍｌ、約７０ｍｌ、約７５ｍｌ、約８０ｍｌ、約８５ｍｌ、約９０ｍｌ、約９５ｍｌ、約１００ｍｌ、約２００ｍｌ、約３００ｍｌ、約４００ｍｌ、約５００ｍｌ、約６００ｍｌ、約７００ｍｌ、約８００ｍｌ、約９００ｍｌ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、又は約１０００Ｌの総反応体積で実施される、請求項１５３～１６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項168】

前記方法が、前記総反応体積の少なくとも２倍の容量を有する反応容器内で実施される、請求項１５３～１６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項169】

前記オリゴヌクレオチドプライマが、前記プラスミド鋳型中の骨格配列にハイブリダイズする、請求項１５３～１６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

前記オリゴヌクレオチドプライマが、ユニバーサルプライマである、請求項１５３～１６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項171】

ｄＮＴＰ濃度が、約４ｍＭである、請求項１５３～１７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項172】

請求項１５３～１７１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、二本鎖ＤＮＡ構築物。

【請求項173】

閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを産生する方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１５３～１７１のいずれか一項に記載の方法を使用して二本鎖ＤＮＡ構築物を産生すること、
（ｂ）請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法を実施して、前記二本鎖ＤＮＡ構築物からｃｅＤＮＡベクターを産生すること、を含む、方法。

【請求項174】

請求項１７３に記載の方法によって産生された、ｃｅＤＮＡベクター。

【請求項175】

請求項１７３に記載の方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項176】

１７３の方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む、脂質ナノ粒子組成物。

【請求項177】

閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ構築物を少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと接触させることであって、
前記構築物が、
導入遺伝子発現カセットと、
前記導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、
前記導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含み、
前記少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼが、前記第１の切断部位及び前記第２の切断部位で前記構築物を切断して、インサートの５’及び３’末端における一本鎖オーバーハングを有する前記インサートを放出させることができる、接触させることと、
（ｂ）前記インサートの前記５’及び３’末端を、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）オリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションして、前記ｃｅＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２９３，３３７号の優先権を主張する。前述の出願の全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

本開示は、対象又は細胞において導入遺伝子を発現させる目的のための非ウイルス性ベクターの高スループットかつ高純度の産生を含む、遺伝子療法の分野に関する。例えば、本開示は、非ウイルス性ＤＮＡベクターを合成する無細胞法を提供する。本開示はまた、それによって産生された核酸構築物及びそれらの使用方法にも関する。

【背景技術】

【0003】

遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異又は後天性疾患のいずれかを罹患している患者についての臨床転帰を向上することを目的とする。遺伝子療法は、障害、疾患、悪性腫瘍などをもたらし得る欠陥遺伝子又は異常な調節若しくは発現、例えば、過小発現若しくは過剰発現に起因する医学的状態の治療又は予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患又は障害は、修復遺伝材料の患者への送達によって治療、予防、若しくは改善され得るか、又は患者の中で遺伝材料の治療的発現をもたらす、例えば、患者に対する修復遺伝材料を用いて欠陥遺伝子を変更若しくはサイレンシングすることによって治療、予防、若しくは改善され得る。

【0004】

遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、又は別の結果をもたらし得る。遺伝子療法を使用して、他の因子によって引き起こされる疾患又は悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達及び発現によって治療することができる。患者の標的細胞中の修復遺伝子の送達及び発現は、操作されたウイルス及びウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行することができる。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスなど）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus、ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。

【0005】

アデノ随伴ウイルス（adeno-associated viruses、ＡＡＶ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶに由来するベクター（すなわち、組換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）又はＡＡＶベクター）は、（ｉ）筋細胞及びニューロンを含む多種多様な非分裂及び分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができ、（ｉｉ）それらはウイルス構造遺伝子を欠き、それによって、ウイルス感染に対する宿主細胞応答、例えば、インターフェロン媒介応答を減少させ、（ｉｉｉ）野生型ウイルスは、ヒトにおいて非病的であると考えられ、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターはｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして存続するし、したがって、挿入変異誘発又は遺伝毒性のリスクを制限し、かつ（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは一般に免疫原が比較的弱いと考えられ、したがって、大幅な免疫応答を誘発せず（ｉｉを参照）、したがって、ベクターＤＮＡの持続性及び潜在的に治療用導入遺伝子の長期発現を得るため、遺伝材料の送達のための魅力がある。

【0006】

しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法を受ける対象の候補が、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングされる必要があることである。第３の欠点は、初回治療から除外されなかった患者への再投与を妨げるカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースタ」ショットとして有効に作用するベクターに応答して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。

【0007】

追加的に、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞及び組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫応答を誘導することも分かった。

【0008】

したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫応答に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝材料の制限された範囲、及び遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。

【0009】

治療又は他の目的のためにインビボで１つ以上の所望の導入遺伝子を送達することができ、ＡＡＶ及び他のウイルスベクター系の上記の欠点を回避する閉端ＤＮＡベクターが開発されている。しかしながら、そのようなｃｅＤＮＡベクターを産生する方法は、伝統的な細菌又は昆虫細胞の産生方法に依存してきた。そのような方法は、ベクター（例えば、Ｓｆ９細胞）を産生するために使用される細胞からの汚染物質（例えば、核酸汚染物質）をもたらす可能性があり、除去するのに不便であるか又は費用がかかり、ｃｅＤＮＡ治療製剤に含まれる場合、望ましくない副作用を有する可能性がある。したがって、そのような汚染物質又は精製方法の他のアーチファクトによって導入されるものなどの、最小のオフターゲット効果で遺伝子発現を制御する方法で使用される組換えベクターの生成を可能にする技術の分野が必要である。この技術が組換えベクターの大規模製造に好適であり、それを支持することも有利であろう。本明細書に提供される方法は、これらの満たされていない必要性に対処する。

【発明の概要】

【0010】

ウイルス及びウイルス由来のＤＮＡを産生するための従来の方法は、典型的には、真核細胞、例えば、哺乳動物又は昆虫細胞を使用する。一般に使用される１つの昆虫細胞株は、Ｓｆ９である。しかしながら、これらの細胞には、酵素、及び複製されるＤＮＡに有害な影響を与える可能性のある他のタンパク質の両方が含有されているだけでなく、細胞溶解物から所望のＤＮＡを精製するプロセスにより、その存在が所望のＤＮＡ産物の精製をより困難にし得る細胞性核酸が導入される。更に、そのような不純物又は汚染物質は、所望のＤＮＡが投与される対象において、一連の有害な及び／又は望ましくない影響を有する可能性がある。追加的に、そのような伝統的な細胞ベースの産生方法は、産生されるＤＮＡベクター産物の量に関して問題が生じる可能性があり、望ましい収量を生み出すために細胞株自体又は産生技術の大幅な操作が必要になることは珍しくない。

【0011】

本明細書に提供される、これらのベクター産生課題に対する技術的解決策は、限定されるものではないが、閉端ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）などの閉環ヘアピンループ含有ＤＮＡベクターを、真核細胞を使用する従来の手段によるよりもより高純度で容易に産生することができる無細胞合成産生方法に関する（例えば、図１３を参照されたい）。

【0012】

したがって、閉端ＤＮＡ（closed-ended DNA、ｃｅＤＮＡ）ベクターを産生する方法であって、方法は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖ＤＮＡ構築物を、少なくとも第１の制限エンドヌクレアーゼ及び少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることであって、構築物が、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含み、第１の制限エンドヌクレアーゼが、第１の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、第２の制限エンドヌクレアーゼが、第２の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、二本鎖ＤＮＡ構築物を第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることが、第１の一本鎖オーバーハングを含む第１の末端及び第２の一本鎖オーバーハングを含む第２の末端を有するインサートを放出させる、接触させることと、第１の末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることと、第２の末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることと、を含み、それによって、ｃｅＤＮＡベクターを産生する、方法が、本明細書に提供される。

【0013】

一実施形態では、第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチドが、逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）を含む。一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが異なる。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが同じである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々が、独立して、１、２、３、４、又はそれ以上のステムループ領域を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々が、独立して、２又は３のステムループ領域を含む。

【0014】

一実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである。

【0015】

一実施形態では、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位が、互いに別個の、かつ異なる部位であり、両方の部位が、導入遺伝子発現カセットの上流に位置する。別の実施形態では、第１の切断部位が、構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約２２ヌクレオチド離れている。別の実施形態では、第１の切断部位が、構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約８ヌクレオチド離れている。

【0016】

一実施形態では、第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位が、互いに別個の、かつ異なる部位であり、両方の部位が、導入遺伝子発現カセットの上流に位置する。別の実施形態では、第２の切断部位が、構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約２２ヌクレオチド離れている（例えば、約２～約２２、約２～約２０、約５～約２２、約５～約２０、約１０～約２２、約１０～約２０、約１５～約２２、約１５～約２０、約２～約１５、約５～約１５、約１０～約１５、約２～約１０、約５～約１０、約２～約１０、約２～約１０ヌクレオチド離れている）。別の実施形態では、第２の切断部位が、構築物のセンス及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも１つにおける第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約８ヌクレオチド離れている。

【0017】

一実施形態では、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、各々、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々において異なる５’から３’方向のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドである。

【0018】

一実施形態では、インサートの末端における一本鎖オーバーハングのうちの一方又は両方が、５’オーバーハングである。別の実施形態では、インサートの末端における一本鎖オーバーハングのうちの一方又は両方が、３’オーバーハングである。

【0019】

一実施形態では、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチド及び１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして三次元構成を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、三次元構成が、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造である。別の実施形態では、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチド及び１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして、各オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかに一本鎖オーバーハングを更に形成する。

【0020】

一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして、各オリゴヌクレオチドの５’末端における一本鎖オーバーハングを更に形成する。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして、各オリゴヌクレオチドの３’末端における一本鎖オーバーハングを更に形成する。一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが、各々、約１～約１２ヌクレオチド長、約１～約８ヌクレオチド長、約２～約６ヌクレオチド長、又は約３、約４、約５、若しくは約６ヌクレオチド長である。

【0021】

一実施形態では、各オリゴヌクレオチドの５’末端は、リン酸化されている。

【0022】

一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングの５’から３’方向のヌクレオチド配列が、互いに対して非相補的である。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングの５’から３’方向のヌクレオチド配列が、同じである。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが同じヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、インサートの各末端における一本鎖オーバーハングが、同じ５’から３’方向のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが、各々、インサートの末端における一本鎖オーバーハングのうちの両方に対して相補的である。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングの５’から３’方向のヌクレオチド配列が異なる。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、インサートの各末端における一本鎖オーバーハングの５’から３’方向のヌクレオチド配列が異なる。

【0023】

一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが、各々、インサートの末端における一本鎖オーバーハングのうちの１つのみに対して相補的である。

【0024】

一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び／又は第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが、ＣＴＣＴ、ＣＴＣＡ、ＣＡＣＴ、ＣＴＣ、及びＧＣＴからなる群から選択される５’から３’方向のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドのうちの一方又は両方が、合成である。

【0025】

一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、各々、約４０ヌクレオチド～約７５ヌクレオチド長、又は約４５～約６５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、各々独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、各々独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対する配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、各々独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列から構成される。

【0026】

一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造と、第２のオリゴヌクレオチドの各ヘアピン構造及び／又は各Ｔ字形若しくはＹ字形ステムループ構造とが、少なくとも約４塩基対長、約４塩基対～約２０塩基対長、約４塩基対～約１５塩基対長、約４塩基対～約６塩基対長、又は約６塩基対～約８塩基対長であるステム領域を含む。別の実施形態では、ステム領域長は、いかなる一本鎖オーバーハングも含まない。

【0027】

一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも一方又は両方は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼの各々が、独立して、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択されるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。更なる実施形態では、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓａＩ又はそのアイソシゾマーである。

【0028】

一実施形態では、ライゲーションすることの後に、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、得られるｃｅＤＮＡベクターにおいて再生されない。

【0029】

一実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物が、導入遺伝子発現カセットに各々隣接する少なくとも第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲを更に含む。別の実施形態では、第１の部分ＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの上流、かつ第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位の下流にある。別の実施形態では、第２の部分ＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの下流、かつ第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位の上流にある。別の実施形態では、第１の切断部位が、第１の部分ＩＴＲに隣接し、第２の切断部位が、第２の部分ＩＴＲに隣接する。別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物が、第１の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む。別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物が、第２の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間に第２のスペーサを更に含む。別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、又は直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子からなる群から選択される。

【0030】

一実施形態では、得られるｃｅＤＮＡベクターが、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットに各々隣接する少なくとも第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲと、を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの上流にある。別の実施形態では、第２のＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの下流にある。別の実施形態では、第１のＩＴＲが、第１のオリゴヌクレオチド及び第１の部分ＩＴＲからのヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第２のＩＴＲが、第２のオリゴヌクレオチド及び第２の部分ＩＴＲからのヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲが、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位を欠いている。別の実施形態では、第２のＩＴＲが、第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位を欠いている。

【0031】

一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、各々、ヘアピン構造及び／又はＴ字形若しくはＹ字形ステムループ構造を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、各々、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造を含む。別の実施形態では、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造が、Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びに２つのＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループを含むステムを含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ又はＡＡＶ由来のＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲの両方が、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、修飾ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、互いに対称又は実質的に対称である。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、非対称のＩＴＲである。

【0032】

一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、付加、欠失、切断、及び点変異からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む。別の実施形態では、１つ以上の修飾が、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方のＡ－Ａ’ステム領域、Ｂ－Ｂ’ループ、Ｃ－Ｃ’ループ、及び／又はＤ－Ｄ’ステム領域に位置する。別の実施形態では、１つ以上の修飾が、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方のＢ－Ｂ’ループ及び／又はＣ－Ｃ’ループに位置する。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方のＢ－Ｂ’ループ及びＣ－Ｃ’ループが、切断されている。

【0033】

一実施形態では、導入遺伝子発現カセットが、第１のＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む。別の実施形態では、導入遺伝子発現カセットが、第２のＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む。別の実施形態では、導入遺伝子発現カセットが、第１のＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間の第１のスペーサと、第２のＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間の第２のスペーサと、を更に含む。

【0034】

一実施形態では、導入遺伝子発現カセットが、導入遺伝子を含む。別の実施形態では、導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードする。別の実施形態では、治療用タンパク質が、酵素、凝固因子又は補因子、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質からなる群から選択される。

【0035】

一実施形態では、導入遺伝子発現カセットが、プロモータ、エンハンサ、イントロン、転写後調節エレメント、及びポリアデニル化シグナルからなる群から選択される遺伝子エレメントを更に含む。別の実施形態では、転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（WHP posttranscriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）を含む。

【0036】

一実施形態では、ライゲーションすることが、リガーゼ又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によって行われる。別の実施形態では、リガーゼが、Ｔ４リガーゼである。

【0037】

一実施形態では、方法が、得られるｃｅＤＮＡベクターを単離又は精製することを更に含む。別の実施形態では、方法が、ライゲーションすることの前にインサートを単離又は精製することを更に含む。別の実施形態では、方法が、ライゲーションすることの前にインサートを単離又は精製することを含まない。別の実施形態では、接触及びライゲーションするステップが、単一の反応容器内で実施される。

【0038】

一実施形態では、得られるｃｅＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターのモノマー種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含む。

【0039】

一実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターが本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む医薬組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む脂質ナノ粒子組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む単離された宿主細胞が本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含むトランスジェニック動物が本明細書に提供される。

【0040】

一実施形態では、対象における障害、疾患、又は病態（例えば、遺伝性障害、疾患、又は病態）を治療する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター、又は本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む医薬組成物、又は本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。

【0041】

一実施形態では、対象に治療用タンパク質を送達する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター、又は本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む医薬組成物、又は本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。

【0042】

別の実施形態では、治療用タンパク質が、酵素、凝固因子又は補因子、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質からなる群から選択される。

【0043】

別の実施形態では、以下に示される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１からなる群から選択される逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が、本明細書に提供される。

【0044】

【表12】

【0045】

別の実施形態では、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１からなる群から選択される配列を含む逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が、本明細書に提供される。別の実施形態では、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７５、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である配列を含む逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が、本明細書に提供される。別の実施形態では、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１からなる群から選択される配列からなる逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が、本明細書に提供される。

【0046】

別の実施形態では、ＩＴＲヌクレオチド配列が、以下に示されるように、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択されるスペーサを更に含む。

【0047】

【表13】

【0048】

別の実施形態では、ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択される配列を含むスペーサ配列を更に含む。別の実施形態では、ＩＴＲヌクレオチド配列が、以下に示されるように、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７５、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である配列を含むスペーサ配列を更に含む。別の実施形態では、ＩＴＲヌクレオチド配列が、以下に示されるように、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択される配列からなるスペーサ配列を更に含む。

【0049】

別の実施形態では、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットに隣接する少なくとも第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲと、を含む、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、各々、本明細書に開示されるＩＴＲヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ｃｅＤＮＡベクターが、本明細書に提供される。別の実施形態では、ベクターが、二本鎖ＤＮＡを含む。

【0050】

別の実施形態では、本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物が、本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書で開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子組成物が、本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかのｃｅＤＮＡベクターを含む単離された宿主細胞が、本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書で開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターを含むトランスジェニック動物が、本明細書に提供される。

【0051】

実施形態では、対象における障害、疾患、又は病態（例えば、遺伝性障害、疾患、又は病態）を治療する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の、本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクター、又は本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターを含む医薬組成物、又は本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。

【0052】

別の実施形態では、対象に治療用タンパク質を送達する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の、本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクター、又は本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターを含む医薬組成物、又は本明細書に開示されるＩＴＲ配列のうちのいずれかを含むｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。別の実施形態では、治療用タンパク質が、酵素、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質からなる群から選択される。

【0053】

一実施形態では、閉端ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）の合成産生で使用するためのＤＮＡベクターであって、導入遺伝子を受容することができるマルチクローニング部位（multiple cloning site）と、マルチクローニング部位の上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、マルチクローニング部位の下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、マルチクローニング部位に各々隣接する第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲと、を含む、ＤＮＡベクターが、本明細書に提供される。別の実施形態では、第１の部分ＩＴＲが、マルチクローニング部位の上流、かつ第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位の下流にある。別の実施形態では、第２の部分ＩＴＲが、マルチクローニング部位の下流、かつ第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位の上流にある。

【0054】

別の実施形態では、ＤＮＡベクターが、１つ以上のスペーサを含む。別の実施形態では、ＤＮＡベクターが、複製起源及び選択可能なマーカー遺伝子を含む。別の実施形態では、マルチクローニング部位が、導入遺伝子と、プロモータ、エンハンサ、イントロン、転写後調節エレメント、及びポリアデニル化シグナルからなる群から選択される１つ以上の追加の遺伝子エレメントと、を受容することができる。

【0055】

一実施形態では、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、第１の制限エンドヌクレアーゼに特異的であり、第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼに特異的である。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである。

【0056】

一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも一方が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼの各々が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。別の実施形態では、各ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、独立して、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。別の実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。

【0057】

一実施形態では、ＤＮＡベクターが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＤＮＡベクターが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＤＮＡベクターが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる。

【0058】

一実施形態では、導入遺伝子を含む閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを調製するためのキットであって、キットが、本明細書に開示される任意のＤＮＡベクターと、マルチクローニング部位でＤＮＡベクターを切断して、マルチクローニング部位が導入遺伝子を受容することを可能にすることができる、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、第１の切断部位及び第２の切断部位で切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、リガーゼと、を含む、キットが、本明細書に提供される。別の実施形態では、キットは、１つ以上のヘアピン構造を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを更に含む。

【0059】

一実施形態では、導入遺伝子発現カセットを含む閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターの調製を容易にするように操作された二本鎖環状ＤＮＡ構築物であって、二本鎖環状ＤＮＡ構築物が、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、導入遺伝子発現カセットに各々隣接する第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲと、を含む、二本鎖環状ＤＮＡ構築物が、本明細書に提供される。

【0060】

一実施形態では、第１の部分ＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの上流、かつ第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位の下流にある。別の実施形態では、第２の部分ＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの下流、かつ第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位の上流にある。別の実施形態では、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、第１の制限エンドヌクレアーゼに特異的であり、第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼに特異的である。

【0061】

一実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである。

【0062】

一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも一方が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼの各々が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。別の実施形態では、各ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、独立して、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及びそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。別の実施形態では、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーからなる群から選択される。

【0063】

一実施形態では、導入遺伝子発現カセットを含む閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを調製するためのキットであって、キットが、本明細書に開示される二本鎖ＤＮＡ構築物のうちのいずれかと、二本鎖ＤＮＡ構築物を第１の切断部位及び第２の切断部位で切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、リガーゼと、使用説明書と、を含む、キットが、本明細書に提供される。別の実施形態では、キットは、１つ以上のヘアピン構造を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを更に含む。

【0064】

一実施形態では、ローリングサークル増幅を介してプラスミド鋳型から二本鎖ＤＮＡ構築物を産生する方法であって、プラスミド鋳型を、鎖置換活性を有する熱安定性ポリメラーゼと接触させるステップであって、ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ単位）に対するプラスミド鋳型濃度（ｎｇ／μｌ単位）の比が、約１を超える、ステップと、プラスミド鋳型をオリゴヌクレオチドプライマ及びｄＮＴＰと接触させるステップと、プラスミド鋳型、ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマ、及びｄＮＴＰを、約４０℃以下の温度で、少なくとも約５時間の期間にわたってインキュベートするステップと、を含み、それによって、二本鎖ＤＮＡ構築物を産生する、方法が、本明細書に提供される。

【0065】

一実施形態では、ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ単位）に対するプラスミド鋳型濃度（ｎｇ／μｌ単位）の比が、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０を超える。

【0066】

一実施形態では、プラスミド鋳型濃度が、約０．０１ｎｇ／μｌ、約０．０５ｎｇ／μｌ、約０．１ｎｇ／μｌ、約０．１５ｎｇ／μｌ、約０．２ｎｇ／μｌ、約０．２１ｎｇ／μｌ、約０．２２ｎｇ／μｌ、約０．２３ｎｇ／μｌ、約０．２４ｎｇ／μｌ、約０．２ｎｇ／μｌ、約０．２６ｎｇ／μｌ、約０．２７ｎｇ／μｌ、約０．２８ｎｇ／μｌ、約０．２９ｎｇ／μｌ、約０．３ｎｇ／μｌ、約０．３５ｎｇ／μｌ、約０．４ｎｇ／μｌ、約０．４５ｎｇ／μｌ、約０．５ｎｇ／μｌ、約０．６ｎｇ／μｌ、約０．７ｎｇ／μｌ、約０．８ｎｇ／μｌ、約０．９ｎｇ／μｌ、又は約１．０ｎｇ／μｌである。

【0067】

一実施形態では、ポリメラーゼ濃度が、約０．０１Ｕ／μｌ、約０．０２Ｕ／μｌ、約０．０３Ｕ／μｌ、約０．０４Ｕ／μｌ、約０．０５Ｕ／μｌ、約０．０６Ｕ／μｌ、約０．０７Ｕ／μｌ、約０．０８Ｕ／μｌ、約０．０９Ｕ／μｌ、約０．１Ｕ／μｌ、約０．１５Ｕ／μｌ、約０．２Ｕ／μｌ、約０．２５Ｕ／μｌ、約０．３Ｕ／μｌ、約０．３５Ｕ／μｌ、約０．４Ｕ／μｌ、又は約０．４５Ｕ／μｌである。

【0068】

一実施形態では、ステップ（ｃ）における温度が、約４０℃、約３９℃、約３８℃、約３７℃、約３６℃、約３５℃、約３４℃、約３３℃、約３２℃、約３１℃、約３０℃、約２９℃、約２８℃、約２７℃、約２６℃、約２５℃、約２４℃、約２３℃、約２２℃、又は約２１℃未満である。

【0069】

一実施形態では、期間が、少なくとも約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約２１時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、又は約４０時間である。

【0070】

一実施形態では、期間が、約６時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約２１時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、又は約４０時間未満である。

【0071】

別の実施形態では、プラスミド鋳型濃度が、約０．２５ｎｇ／μｌであり、温度が、約３０℃であり、ポリメラーゼ濃度が、約０．０５Ｕ／μｌであり、期間が、約１８～２６時間である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマ濃度が、約５０μＭ未満、少なくとも約１０μＭ、又は少なくとも約１０μＭ、かつ約５０μＭ未満である。１７１．別の実施形態では、ｄＮＴＰ濃度が、約４ｍＭである。

【0072】

一実施形態では、熱安定性ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ又はその誘導体若しくはバリアントである。別の実施形態では、熱安定性ポリメラーゼが、ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）である。

【0073】

一実施形態では、方法が、少なくとも約１００μｌの総反応体積で実施される。別の実施形態では、方法が、少なくとも約１００μｌ、約２００μｌ、約３００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌ、約５５ｍｌ、約６０ｍｌ、約６５ｍｌ、約７０ｍｌ、約７５ｍｌ、約８０ｍｌ、約８５ｍｌ、約９０ｍｌ、約９５ｍｌ、約１００ｍｌ、約２００ｍｌ、約３００ｍｌ、約４００ｍｌ、約５００ｍｌ、約６００ｍｌ、約７００ｍｌ、約８００ｍｌ、約９００ｍｌ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、又は約１０００Ｌの総反応体積で実施される。別の実施形態では、方法が、総反応体積の少なくとも２倍の容量を有する反応容器内で実施される。

【0074】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマが、プラスミド鋳型中の骨格配列にハイブリダイズする。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマが、ユニバーサルプライマである。

【0075】

一実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生された二本鎖ＤＮＡ構築物が、本明細書に提供される。

【0076】

一実施形態では、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを産生する方法であって、本明細書に開示される方法のうちのいずれかを使用して二本鎖ＤＮＡ構築物を産生することと、本明細書に開示される方法のうちのいずれかを実施して、二本鎖ＤＮＡ構築物からｃｅＤＮＡベクターを産生することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。別の実施形態では、上記の方法のうちのいずれかによって産生されたｃｅＤＮＡベクター、上記の方法のうちのいずれかによって産生されたｃｅＤＮＡベクター及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、並びに上記の方法のうちのいずれかによって産生されたベクターを含む脂質ナノ粒子組成物が、本明細書に提供される。

【0077】

別の実施形態では、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを調製する方法であって、方法が、二本鎖ＤＮＡ構築物を少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと接触させることであって、構築物が、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含み、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼが、第１の切断部位及び第２の切断部位で構築物を切断して、インサートの５’及び３’末端における一本鎖オーバーハングを有するインサートを放出させることができる、接触させることと、インサートの５’及び３’末端を、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）オリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションして、ｃｅＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。

【0078】

本開示のこれらの及び他の態様は、下記で更に詳述される。

【図面の簡単な説明】

【0079】

特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つ図面を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁から提供されるであろう。

【0080】

上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。

【図1A】導入遺伝子と、導入遺伝子の発現を可能にし、及び／又は制御する１つ以上の調節配列と、を含む、導入遺伝子発現カセットに隣接するベクターの両端において、それぞれ、対称若しくは実質的に対称の逆位末端反復（ＩＴＲ）、又は非対称ＩＴＲを有する非限定的な例示的なｃｅＤＮＡベクターの概略図を示す。

【図1B】導入遺伝子と、導入遺伝子の発現を可能にし、及び／又は制御する１つ以上の調節配列と、を含む、導入遺伝子発現カセットに隣接するベクターの両端において、それぞれ、対称若しくは実質的に対称の逆位末端反復（ＩＴＲ）、又は非対称ＩＴＲを有する非限定的な例示的なｃｅＤＮＡベクターの概略図を示す。

【図2】例示的な基本ベクタープラスミド１１のマップである。

【図3】第ＶＩＩＩ因子（ＶＩＩＩ）発現導入遺伝子をプラスミド１１にサブクローニングすることによって生成された、例示的な構築物、すなわち、構築物１のマップである。

【図4】単一のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩを使用するｃｅＤＮＡの例示的な無細胞合成の概略図である。

【図5】ＥｃｏＲＩ及びＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼなどの従来の制限エンドヌクレアーゼの活性、特に、酵素が基質ＤＮＡ上のヌクレオチド配列をどのように認識及び切断するか、並びに切断から生成されたオーバーハングの性質を比較する概略図である。

【図6】二本鎖ＤＮＡ構築物を認識及び切断し、それによって、導入遺伝子発現カセットを担持し、適切なオーバーハングを有する断片のみが、相補的オーバーハングを有するＩＴＲオリゴ１とライゲーションすることになる、ＢｓａＩの機序を例示する概略図である。

【図7A】自己アニールして三次元ステムループ構造を形成する例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドの概略図であり、ステム長が７ｂｐ又は３ｂｐである。

【図7B】プラスミド２０インサートと、異なるステム長：１４ｂｐ、７ｂｐ、５ｂｐ、及び３ｂｐを有するＩＴＲオリゴヌクレオチドとを使用してライゲーション反応を分析するアガロースゲル画像である。

【図7C】例示的な基本ベクタープラスミド２０のマップである。

【図8】非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターを生成する機序を例示する概略図である。

【図9A-9C】図９Ａは、基本ベクター、ＩＴＲオリゴヌクレオチド、及びＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの異なる組み合わせを使用して複数のライゲーション反応を分析するアガロースゲル画像である。図９Ｂおよび図９Ｃは、標識付きＩＴＲオリゴヌクレオチドを使用するインサートの５’及び３’末端の両方におけるライゲーション特異性を確認するアガロースゲル画像である。

【図10】Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループの特定とともに、ＡＡＶ血清型２の野生型ＩＴＲ（ＡＡＶ２）のステムループ構造を示す概略図である（国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の配列番号５２、その内容全体は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。

【図11】未切断構築物１（レーン１）、構築物１の消化／ライゲーション反応（レーン２）、及びエキソヌクレアーゼ消化後の反応混合物（レーン３）を分析するアガロースゲル画像である。

【図12】（ｉ）未切断又はＢｇｌＩＩで切断された、閉端ベクターとして、開端鎖ＤＮＡとして、又は１つ以上のニック若しくはギャップを含有する閉端ベクターとして構築物１から産生されたＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの予測サイズと、（ｉｉ）未切断又はＢｇｌＩＩで切断された、ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの変性ゲル分析と、を例示する。

【図13】イオン交換クロマトグラフィカラムから単一の鋭いピークとして溶出するＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ原薬のクロマトグラムである。

【図14】５’及び３’ライゲーションジャンクションにおけるＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡのＤＮＡ配列を、ＩＴＲオリゴ１及び構築物１のＤＮＡ配列と比較し、それによって、ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡライゲーション産物のみに存在するが、ＩＴＲオリゴ１及び構築物１には存在しない、固有のジャンクション配列を明らかにする、ＤＮＡ配列分析を例示する概略図である。

【図15】本明細書に記載される無細胞合成方法を使用して生成されたｃｅＤＮＡを小スケール及び中スケールで示すアガロースゲル画像である。

【図16A】マウスを用いた流体力学的尾静脈注射研究における漸増用量レベルの合成及びＳｆ９で産生されたＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡのインビボＦＶＩＩＩ発現レベルを示すグラフである。

【図16B】マウスを用いた４２日間の静脈内注射研究における、脂質ナノ粒子組成物として製剤化された合成及びＳｆ９で産生されたＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡのインビボＦＶＩＩＩ発現レベルを示すグラフである。

【図17】任意選択の中間消化ステップを伴う場合（下）及び伴わない場合（上）の両方の、プライマ駆動多重鎖置換を使用するローリングサークルプラスミド増幅、それに続くｃｅＤＮＡへの増幅産物の酵素的変換の概略図である。

【図18】Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド鋳型及び増幅されたプラスミドのＤＮＡバンディングプロファイルのアガロースゲル分析を使用する、増幅されたプラスミド産物品質及びＤＮＡ収量に対するプライマ濃度の効果の評価を図示する。レーン、左から右に順に、（１）サイズマーカー、（２）プラスミド、ＢｓａＩ消化なし、（３）プラスミド、ＢｓａＩ消化、（４）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、５００μＭプライマ、（５）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、１００μＭプライマ、（６）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、５０μＭプライマ、（７）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、１０μＭプライマ、（８）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、５μＭプライマ、（９）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、１μＭプライマ、（１０）増幅されたプラスミド、ＢｓａＩ消化、０μＭプライマ。

【図19A】増幅された産物品質に対する温度及びポリメラーゼ量の影響を図示する。異なる増幅温度、ポリメラーゼ酵素の量、及び増幅時間の長さにおける、ＢｓａＩ処理された増幅されたプラスミドについてのＤＮＡバンディング及び産物品質のアガロースゲル分析を示す。各増幅反応温度（左から右に、４０℃、３７℃、３３℃、３０℃、及び２０℃）について、５０単位のＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）（上）及び５単位のＥｑｕｉＰｈｉ３９（商標）（下）の結果が示されている。追加的に、各反応温度について、４つのレーンは、左から右に、３時間、１２時間、２４時間、及び３６時間の増幅反応時間についての結果を示す。最も左のレーンは、サイズマーカーを含む。

【図19B】増幅された産物品質に対する温度及びポリメラーゼ量の影響を図示する。異なる量の野生型Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ酵素（左）及び操作されたＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）ポリメラーゼ酵素（右）による３０℃における増幅の結果を比較するアガロースゲルを示す。レーン、各ゲルについて、左から右に、（１）サイズマーカー、（２）２単位の酵素、（３）５単位の酵素。

【図20A】ＢｓａＩで消化されたＥ．ｃｏｌｉプラスミド、３０℃で増幅されたプラスミド、及び４５℃で増幅されたプラスミド（左）、並びにＥ．ｃｏｌｉプラスミド及び各増幅されたプラスミドの両方から産生された対応するｃｅＤＮＡベクター（右）のアガロースゲル比較を図示する。レーン、左から右に、（１）サイズマーカー、（２）ＢｓａＩで消化されたプラスミド、（３）ＢｓａＩで消化された３０℃で増幅されたプラスミド、（４）ＢｓａＩで消化された４５℃で増幅されたプラスミド、（５）サイズマーカー、（６）プラスミドから産生された精製されたｃｅＤＮＡ、（７）３０℃で増幅されたプラスミドから産生された精製されたｃｅＤＮＡ、（８）４５℃で増幅されたプラスミドから産生された精製されたｃｅＤＮＡ、（９）サイズマーカー。

【図20B】５つの異なる増幅されたプラスミド構築物から産生されたｃｅＤＮＡのアガロースゲル比較を図示する。予想されるｃｅＤＮＡ産物サイズは、左から右に、次のとおりである：２．９ｋｂ（構築物１）、３．８ｋｂ（構築物２）、５．９ｋｂ（構築物３）、４．７ｋｂ（構築物４）、及び６．２ｋｂ（構築物５）。最も左のレーンは、サイズマーカーを含む。

【図21A】漸増反応体積によるスケーリングされたプラスミド増幅を図示する。ＢｓａＩで消化された増幅されたプラスミド産物のアガロースゲル分析を、定量化された増幅されたＤＮＡ収量とともに示す。レーン、左から右に、（１）１００μｌ体積、１．５ｍＬチューブ：２５ｎｇのプラスミド投入、８０μｇの増幅されたＤＮＡ収量、（２）１ｍＬ体積、１．５ｍＬチューブ：２５０ｎｇのプラスミド投入、８００μｇの増幅されたＤＮＡ収量、（３）２５ｍＬ体積、５０ｍＬチューブ：６．３ｎｇのプラスミド投入、２０ｍｇの増幅されたＤＮＡ収量、（４）サイズマーカー。

【図21B】漸増反応体積によるスケーリングされたプラスミド増幅を図示する。２５ｍＬの反応体積からの２０ｍｇのｃｅＤＮＡ産物の断片クロマトグラム及びアガロースゲル分析を図示する（図２１Ａのレーン３に対応する）。

【図22】異なる量のポリメラーゼ酵素、反応温度、及び反応時間の長さを使用してプラスミド増幅を比較するアガロースゲル分析を図示する。粗反応物（左）及びＺｙｍｏ精製されたｃｅＤＮＡ（右）のＢｓａＩ消化の結果が示されている。初期プロセス：０．２５ｎｇ／μｌプラスミド鋳型、１０μＭアニーリングプライマ、４５℃、０．５Ｕ／μｌ ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）、５ｍＭ ｄＮＴＰ、３時間。更新されたプロセス：０．２５ｎｇ／μｌプラスミド鋳型、２５μＭアニーリングプライマ、３０℃、０．０５Ｕ／μｌ ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）、４ｍＭ ｄＮＴＰ、１８～２６時間。レーン、左から右に、（１）サイズマーカー、（２）ＢｓａＩで消化されたプラスミド、（３）ＢｓａＩで消化された粗い増幅されたプラスミド、更新されたプロセス、（４）ＢｓａＩで消化された粗い増幅されたプラスミド、初期プロセス、（５）サイズマーカー、（６）プラスミドから産生された精製されたｃｅＤＮＡ、（７）増幅されたプラスミドから産生された精製されたｃｅＤＮＡ、更新されたプロセス、（８）増幅されたプラスミドから産生された精製されたプラスミド、初期プロセス、（９）サイズマーカー。

【発明を実施するための形態】

【0081】

本開示は、無細胞ＤＮＡ増幅方法を使用する、より迅速かつ費用効率の高いプラスミド又はＤＮＡ産生のための新しいアプローチの開発を説明する。本明細書に提供される方法及び組成物は、少なくとも一部には、限定されるものではないが、Ｓｆ９細胞株などの昆虫細胞株で産生されたＤＮＡベクターと比較して高い純度及び収量を有する閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む、ＤＮＡベクターを生成するのに有用な無細胞合成産生方法の発見に基づき、かつ／あるいは産生プロセスは、従来の細胞ベースの産生方法と比較して、簡素化されるか、又はより効率若しくは費用効率が高くなる。例えば、一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ消化及びライゲーション反応における高い特異性は、両方の反応が単一の反応容器内で同時に行われることを可能にする。いくつかの実施形態では、消化及びライゲーション反応における高い特異性は、２つの反応の間の精製手順の必要性を更に排除する。制限エンドヌクレアーゼ消化及びライゲーション反応におけるこの高い特異性は、閉端ベクター、すなわち、逆位末端反復（ＩＴＲ）オリゴヌクレオチド及び二本鎖ＤＮＡ構築物を作製するベース材料における設計によって容易にされる。具体的には、ＩＴＲオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡの認識、結合、及び切断においてこれらの無細胞合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼの固有の活性を活用するヌクレオチド配列を含有する。

【0082】

本明細書の実施形態に記載される研究の結果は、大量の完全合成閉端ＤＮＡ分子を生成した、拡張可能で堅牢な無細胞の酵素的方法であり、細胞ベースの産生方法を上回る大幅な利点を表す。

【0083】

更に、これらの無細胞合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼの固有の活性を活用することは、制御されるべき１つよりも多くのＩＴＲオリゴヌクレオチドを利用するライゲーション反応の指向性を可能にし、それによって、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡの調製を可能にする。

【0084】

本明細書に提供される無細胞合成方法によって提供される、細胞ベースの産生方法を上回る、別の大幅な利点は、より高い収量に加えて、本明細書に記載される方法が、容易に拡張可能な小規模の反応（約１ｍＬ）かつ少なくとも中程度（＞４０ｍＬ）までであり、更に純度を損なうことがないことである。

【0085】

本明細書に記載されるように合成されたベクターは、任意の所望の導入遺伝子、例えば、所与の疾患を治療又は治癒するための導入遺伝子を発現することができる。当業者は、従来の組換えベクターを用いた従来の遺伝子療法方法で使用される任意の導入遺伝子が、例えば、本明細書に記載される合成方法によって作製されたｃｅＤＮＡベクターによる発現に適合できることを容易に認識するであろう。

【0086】

Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的及び技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。免疫学及び分子生物学における一般用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．により発行，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓにより発行，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３）、Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により発行，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により発行，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより発行，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（編），Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより発行，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出され得る。

【0087】

本明細書で使用される場合、「無細胞」、「無細胞合成」、「無細胞産生」、「合成閉端ＤＮＡベクター産生」、及び「合成産生」という用語、並びに全ての他の関連する対応物は、交換可能に使用され、細胞による、又は細胞内での、あるいは細胞抽出物の使用による、分子の複製又は他の増殖を伴わない様式における１つ以上の分子の産生を指す。合成産生は、産生された分子の細胞汚染物質（例えば、細胞タンパク質又は細胞核酸）による汚染を回避し、更に産生プロセス中の分子の望ましくない細胞特異的修飾（例えば、メチル化又はグリコシル化又は他の翻訳後修飾）を回避する。

【0088】

本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」及び「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達及び発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。

【0089】

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子発現カセット」、「発現カセット」、「転写カセット」、及び「遺伝子発現ユニット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモータ又は他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、又は逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、シス作用配列（例えば、プロモータ、エンハンサ、又はリプレッサ）、１つ以上のイントロン、１つ以上のポリアデニル化シグナル、及びＷＨＰ転写後調節エレメント（WHP post-transcriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）などの１つ以上の転写後調節エレメントを含む、１つ以上の調節遺伝子エレメントを追加的に含み得る。

【0090】

本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基若しくは他の天然、化学的修飾若しくは生化学的修飾、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離されるか、又は当該技術分野において既知の方法によって化学的に合成され得る。本明細書で使用される「逆位末端反復オリゴヌクレオチド」又は「ＩＴＲオリゴヌクレオチド」は、本明細書で定義される完全ＩＴＲの少なくとも部分配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチドを指し、自己アニールして、ヘアピン構造又はＴ字形若しくはＹ字形ステムループ構造を有するＩＴＲの三次元構成を形成することができる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

【0091】

本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はそうでなければ天然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するように修飾されるか、又は合成である、一本鎖又は二本鎖の核酸分子（例えば、ＤＮＡ構築物）を指す。

【0092】

「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」若しくは「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度及び溶液イオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で配列特異的、逆平行様式で別の核酸（例えば、別の一本鎖ＤＮＡ）に「アニール」又は「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野において既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、及びシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。

【0093】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。いくつかの実施形態では、定義される導入遺伝子発現カセット中の導入遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質が、酵素、凝固因子又は補因子、抗体又はその抗原結合断片、抗原、遺伝子編集タンパク質、及び細胞傷害性タンパク質から選択される。

【0094】

特定のＲＮＡ又はタンパク質遺伝子産物を「コードする」、導入遺伝子などのＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡ及び／又はタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。

【0095】

本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の用途のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。

【0096】

本明細書で使用される場合、「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、及びパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端反復又は合成配列を含み得る。Ｒｅｐ結合配列（「Rep-binding sequence、ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）及び末端分離部位（terminal resolution site、「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳ及び少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆の相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、及びプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書の本開示において予想外に見出されたように、全長にわたって逆の相補体でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲ又は非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ若しくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、又はＡＡＶ ＩＴＲ若しくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルス及びディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来し得るか、又はＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、及び／若しくは付加によって更に修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスは、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ及び無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス科を含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。

【0097】

「野生型ＩＴＲ」又は「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性及びＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶ又は他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コード又はドリフトの縮退に起因して天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。

【0098】

本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」又は「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆の相補体配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性及び全体的な三次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される場合）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ又はＲＢＥ’）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。

【0099】

本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」又は「ｍｏｄ－ＩＴＲ」又は「変異体ＩＴＲ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの三次元空間構成と比較して、ＩＴＲにおけるＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループのうちの１つ以上の変化をもたらし得（図１０を参照されたい）、三次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその三次元構造）の変化をもたらし得る。

【0100】

本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも称される「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆の相補体ではない単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの三次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の三次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、三次元空間におけるそれらのＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’ループ及び／又は短いＢ－Ｂ’ループを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、又は点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲであり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型又は合成ＩＴＲ）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ ＩＴＲではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’ループを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる三次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一ループ、又は短いＢ－Ｂ’ループなど）を有し得る。

【0101】

本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して変異又は修飾され、それらの全長にわたって逆の相補体である単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。いずれのＩＴＲも野生型ＩＴＲではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、変異体ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、又は点変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。

【0102】

本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」又は「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆の相補体配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性及び全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆の相補体配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、三次元空間に構成された同じＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補体ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な三次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な三次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来してもよく、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来していてもよいが、両方が同じ対応する変異を有していてもよく（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な三次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性又は全体的な形状に影響を及ぼさず、それらが三次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（modified ITR、ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）又はデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ－Ａステム領域及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。

【0103】

「隣接する」という用語は、別の核酸配列に関する１つの核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣにおいて、ＢはＡ及びＣに隣接している。配列Ａ×Ｂ×Ｃについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続しているか、又はすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。

【0104】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域を更に組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサ領域を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。

【0105】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサ領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサ領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサ領域は、例えば、プラスミド又はバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供するか又は増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサ領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、又は既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分離部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。同様に、スペーサを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分離部位との間に組み込むことができる。

【0106】

本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、及び「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆の相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号）の配列番号６０、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列が挙げられる。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ ＲＢＳ配列及び他の天然に既知の又は合成ＲＢＳ配列を含む、本開示の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６０を参照されたい）に結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチドに直接結合し、安定してアセンブリすると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基及びホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性又は低配列特異性であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定させる。

【0107】

本明細書で使用される場合、「末端分離部位」及び「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ ｐｏｌデルタ又はＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲである場合、得られる産物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６１）を含む。他の既知のＡＡＶ ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ、ＧＧＴＴＧＧ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６３）、ＡＧＴＴＧＧ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６４）、ＡＧＴＴＧＡ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６５）などの他の天然に既知の又は合成ＴＲＳ配列、及びＲＲＴＴＲＲ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６６）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本開示の実施形態において使用することができる。

【0108】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。

【0109】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。

【0110】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。

【0111】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。

【0112】

本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。

【0113】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端共有結合閉端を含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。

【0114】

本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、又は発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞又は生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起された場合に細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生じる反応を触媒させ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験又は診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase、ＡＰ）、チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）、及び他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase、ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、並びに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0115】

本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば、毒素、又は選択された薬剤若しくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを直接標的又は損傷する任意のタンパク質又はペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、及びリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の応答性の範囲及び複雑性を拡張する。

【0116】

転写調節因子は、目的の遺伝子の転写を活性化又は抑制する、誘導及びリプレッサータンパク質を含む、転写アクチベータ及びリプレッサを指す。プロモータは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベータは、典型的に、転写プロモータの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサは、転写プロモータに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、並びに細胞条件及び環境条件に応じて、アクチベータ又はリプレッサのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、及びロイシン－ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0117】

本明細書で使用される場合、「担体」又は「賦形剤」としては、任意かつ全ての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

【0118】

「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中又は生物内で起こるアッセイ又はプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法又は使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物又は植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞及び細胞株を含む）、形質転換細胞株、及び抽出組織又は細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法及び使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイ及び方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞又は細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。

【0119】

本明細書で使用される場合、「プロモータ」という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモータは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモータは、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモータはまた、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモータは、プロモータ自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモータ配列内では、転写開始部位、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモータは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモータを含む様々なプロモータを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモータ配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され得、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含むように上流（５’方向）に伸びる。

【0120】

本明細書で使用される場合、「エンハンサ」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質又は転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流又は遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサは、非関連遺伝子のイントロン領域内又はエキソン領域内に位置付けられ得る。

【0121】

プロモータは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、又は転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、及び「転写制御下」という語句は、プロモータが、核酸配列に関して正しい機能的位置及び／又は配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモータ」は、核酸配列が逆配向にあるプロモータを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモータ配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節することができる。加えて、様々な実施形態では、プロモータをエンハンサと併せて使用することができる。

【0122】

プロモータは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子又は配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモータは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモータ」又は「異種プロモータ」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において作動可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモータを指す。組換え又は異種エンハンサは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサを指す。そのようなプロモータ又はエンハンサは、他の遺伝子のプロモータ又はエンハンサ、任意の他の原核、ウイルス、又は真核細胞から単離されたプロモータ又は、及び「天然に存在」しない合成プロモータ又はエンハンサを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は当該技術分野において既知エンハンサの遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモータ及びエンハンサの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモータ配列は、本明細書に開示される合成生物的回路及びモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたい）。更に、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。

【0124】

本明細書に記載される場合、「誘導性プロモータ」は、誘導因子若しくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、又はそれによって接触される場合に、転写活性を開始又は強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」又は「誘導剤」は、内因性であり得るか、又は誘導性プロモータからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物又はタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子又は誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、又はタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写又は発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分又はモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモータの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータは、リプレッサなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモータの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモータ、及びマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（mouse mammary tumor virus long terminal repeat、ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、並びに他のステロイド応答性プロモータ、ラパマイシン応答性プロモータなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

本明細書で企図される「プロモータ」という用語は、本明細書で定義される１つ以上のプロモータ（又はプロモータ配列）及び本明細書で定義される１つ以上のエンハンサ（又はエンハンサ配列）を含む系を指す、プロモータセットを包含する。本明細書で使用される「プロモータセット」という用語は、プロモータ及びエンハンサエレメント又は配列が、約１～５０ヌクレオチド長（例えば約２、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３７、３８、４０、４２、４３、４５、４７、４８、又は５０ヌクレオチド長）であるスペーサ領域又は配列によって分離されている配列を包含する。

【0126】

本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。

【0127】

「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された方法で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモータがその転写又は発現に影響を与える場合、プロモータは、コード配列に操作可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモータ又は他の調節配列に作動可能に連結されている異種ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモータには、例えば、組織特異的プロモータが含まれる。プロモータは、ＡＡＶ起源でもあり得る。

【0128】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えば、マス、ナマズ、及びサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類又はヒトである。対象は、男性又は女性であり得る。追加的に、対象は、幼児又は子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児又は胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患及び障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／又はペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、又は民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者又は他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、又は成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、又はヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、又は非ヒト胚若しくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。

【0129】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物又はｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４^＋細胞）、人工多能性幹細胞、又はいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のうちのいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、又は生物におけるインサイチュ又はインビボの細胞であり得る。

【0130】

「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸又はポリペプチドをそのような細胞又は生物に導入することが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）又はポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞又は生物における核酸又はポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現又はレベルをもたらすことが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物などの生物系に導入された核酸又はポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系又は細胞に対して天然である物質を指す。

【0131】

「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、上記）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。

【0132】

本明細書で使用される「相同性」又は「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一である相同性アームのヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば、相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性又は未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」とみなされる。

【0133】

本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸又はタンパク質には見られないヌクレオチド又はポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。

【0134】

「ベクター」又は「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入物」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源及び／又は最終形態でウイルス性又は非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用される場合、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝子エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクター又は組換えベクターであり得る。

【0135】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、多くの場合、しかし必ずしもそうではないが、細胞にとって異種である。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及び処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロ又はインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、同様に、個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合及び含まれない場合がある。

【0136】

「組換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、又はインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物及び療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。

【0137】

本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する病態によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、変異、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、及びテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。

【0138】

本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」という用語は、方法又は組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、及びそれぞれの構成成分に関して使用される。

【0139】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規又は機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさないエレメントの存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。

【0140】

「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されていないいずれの要素も除いた、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらそれぞれの構成成分を指す。

【0141】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的及び新規又は機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。

【0142】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、及び／又は本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、及び／又はステップを含む。同様に、「又は」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料は、下記で説明される。省略形「例えば（e.g.）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、「例えば（for example）」と同義である。

【0143】

作動例又は別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。「約」という用語は、パーセンテージに関連して使用される場合、±１％を意味し得る。本開示は、以下の実施例によって更に詳細に説明されるが、本開示の範囲は、それに限定されるべきではない。

【0144】

本明細書に開示される本開示の代替要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー又は本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュグループの記述を満たす。

【0145】

態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又は人間若しくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。

【0146】

本明細書では、本開示の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。

【0147】

本出願全体を通して引用される；参考文献、発行された特許、公開された特許出願、未公開の特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。

【0148】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示のある特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書に提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【0149】

前述の実施形態のうちのいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示の特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。

【0150】

本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。

【0151】

ＩＩ．ＤＮＡベクターの無細胞合成
本明細書に記載される技術は、一般に、細胞又は細胞株の非存在下でＤＮＡベクターを生成するための方法を対象とする。したがって、得られるベクターは、従来の細胞ベースの産生方法論を使用して作製された同等のベクターよりも少ない不純物を有し、これは、投与後により長い持続時間で持続されるより良好なインビボ発現に変換され得る（例えば、図１６Ｂ参照）。本明細書で例示されるように、この無細胞合成はまた、小規模の反応（～１ｍＬ）から大規模（＞４０、１００、２００、５００、１，０００ｍＬ）まで、更に純度を損なうことなく（例えば、図１５参照）拡張可能であり、したがって、ベクターが治療用途のために大量に調製されることを可能にする。更に、細胞ベースの方法は、ベクターが産生されるのに数週間かかる可能性があるが、本明細書に記載される無細胞方法は、規模に応じて、２～４日などの１週間未満でベクターを産生する。

【0152】

いくつかの実施形態によると、本明細書に記載される無細胞方法は、ＤＮＡプラスミド鋳型の＞１０００倍のローリングサークル及び多重鎖置換（ＭＳＤ）増幅と、その後の、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ＩＴＲオリゴ、及びエキソヌクレアーゼ酵素を使用する、ｃｅＤＮＡ分子への得られる産物の変換と、を含む。

【0153】

一態様によると、本開示は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを産生する方法であって、方法は、（ａ）センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖ＤＮＡ構築物を、少なくとも第１の制限エンドヌクレアーゼ及び少なくとも第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることであって、構築物が、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含み、第１の制限エンドヌクレアーゼが、第１の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、第２の制限エンドヌクレアーゼが、第２の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、二本鎖ＤＮＡ構築物を第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることが、第１の一本鎖オーバーハングを含む第１の末端及び第２の一本鎖オーバーハングを含む第２の末端を有するインサートを放出させる、接触させることと、（ｂ）第１の末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることと、（ｃ）第２の末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることと、を含み、それによって、ｃｅＤＮＡベクターを産生する、方法を提供する。

【0154】

いくつかの実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチドが、逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。更なる実施形態によると、第２のオリゴヌクレオチドが、ＩＴＲを含む。他の実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが異なる。いくつかの他の実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが同じである。

【0155】

ｃｅＤＮＡベクターを調製する無細胞合成方法の例示的な実施形態の概要が図４に例示される。簡単に説明すると、導入遺伝子発現カセット（斜線）が、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを使用して二本鎖ＤＮＡ構築物から切除され、続いて、インサートを逆位末端反復（ＩＴＲ）オリゴヌクレオチドとライゲーションしてｃｅＤＮＡを形成する。ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、自己アニールして、ＩＴＲ様三次元構成を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである。必ずしも限定されるものではないが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼなどの、本明細書で記載される方法で使用される制限エンドヌクレアーゼは、認識部位内ではなく異なる部位でＤＮＡを切断する。本明細書に開示される無細胞合成方法で使用されるこれらの制限エンドヌクレアーゼはまた、非パリンドロームヌクレオチド配列を認識し、その結果、酵素に対する認識配列（これはまた、結合部位である）は、１つの鎖上にのみコードされる（例えば、図５参照）。したがって、このクラスの制限エンドヌクレアーゼによる切断は、指向性であり、認識部位の上流又は下流のいずれかで起こるが、ＥｃｏＲＩなどの、分子生物学において最も頻繁に使用される他の制限エンドヌクレアーゼとは異なり、認識部位自体の中では起こらない（図５参照）。認識配列をコードする鎖は、配列のどちらの側（すなわち、下流又は上流）が切断されるかを決定する。まとめると、本明細書に記載される方法で使用される制限エンドヌクレアーゼの固有の活性は、特定の認識部位から所定の距離内の任意の配列が制限エンドヌクレアーゼによって切断されることを可能にし、その結果、任意のオーバーハング配列が生成されることを可能にする。特別な制限エンドヌクレアーゼによる消化は、ＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングと適合性である、切除されたインサートの５’及び３’末端の両方における粘着性オーバーハングを生じさせる。言い換えると、ＩＴＲオリゴヌクレオチド及びインサートオーバーハングの設計は、ＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハング及びインサートオーバーハングが互いに適合するように、ライゲーションプロセスの高い特異性を駆動する。一旦ライゲーションされると、所望のｃｅＤＮＡ産物は、認識部位が再生されないため、制限エンドヌクレアーゼによる消化に感受性ではない。しかしながら、切除されたインサート及びプラスミド断片が元の構築物に再ライゲーションする状況では、認識部位が再生され、したがって、構築物が切断されることを可能にする。

【0156】

本明細書で記載される無細胞合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼの固有の活性、インサート末端上の固有のオーバーハングの生成、及びサブクローニングプロセスの高い特異性を駆動するＩＴＲオリゴヌクレオチド上の固有のオーバーハングの設計に起因して、消化及びライゲーションは、ライゲーションの前に消化産物を精製する必要なく、単一の反応容器内で起こり得る。図４に示されるように、消化／ライゲーションの後にエキソヌクレアーゼによる処理が続き、開端ＤＮＡ断片及び中間体を分解する、いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、及びエキソヌクレアーゼ分解が、単一の反応容器内で行われ、全ての反応が同時に起こり得る。

【0157】

加えて、本明細書に記載される無細胞合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼの固有の活性は、１つよりも多くのＩＴＲオリゴヌクレオチドを利用するライゲーション反応の指向性を可能にし、それによって、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡの調製を可能にする。

【0158】

一般的な無細胞合成産生方法
いかなる微生物学的ステップの使用も必要としない、閉端ＤＮＡベクターの合成のためのプロセスが、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、プロセスは、制限エンドヌクレアーゼを使用する酵素切断ステップ及びライゲーションステップを使用する系での閉端ＤＮＡベクターの合成を可能にし、閉端ＤＮＡベクターを生成する。ほぼ全ての実施形態では、ＤＮＡベクター産生のための合成系は、無細胞系である。

【0159】

合成産生方法で使用される１つ以上の酵素又はオリゴヌクレオチド成分のうちの１つ以上が細胞から産生され、精製された形態で本開示の方法において使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、合成産生方法における手順自体は無細胞である。しかしながら、二本鎖ＤＮＡ構築物及びＩＴＲオリゴヌクレオチドなどのベース材料、並びに制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼなどの酵素は、細胞を利用する方法及び技術を使用して産生され得る。

【0160】

一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ及び／又はライゲーションコンピテントタンパク質は、細胞、例えば、細菌細胞において発現ベクターから発現又は提供することができる。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ又はリガーゼ酵素のうちの１つ以上を発現する発現ベクターを含む、細菌細胞などの細胞が存在し得る。したがって、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるＤＮＡベクターを生成するための無細胞合成方法を主に対象とするが、一実施形態では、細胞、例えば、昆虫細胞ではなく細菌細胞が存在し、方法で必要な酵素のうちの１つ以上を発現するように使用され得る、合成産生方法も包含される。そのような実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ及び／又はライゲーションコンピテントタンパク質を発現する細胞は、昆虫細胞ではない。細胞が存在し、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ又はライゲーションコンピテントタンパク質を発現する全ての実施形態では、細胞は、閉端ＤＮＡベクターを複製しない。言い換えると、細胞の細胞内機構は複製されないか、又はＤＮＡベクターの複製に関与しない。

【0161】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の合成は、二本鎖ＤＮＡ構築物又は１つ以上のオリゴヌクレオチドのいずれかから始まるインビトロ無細胞プロセスで実行される。二本鎖ＤＮＡ構築物又は１つ以上のオリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼで切断され、ライゲーションされてＤＮＡ分子を形成する。いくつかの実施形態では、化学的に合成することができるオリゴヌクレオチドであるため、典型的に細菌内で繁殖する必要のある所望の配列全体をコードする大きな出発鋳型の使用を回避する。所望のＤＮＡ配列が合成されると、それは、本明細書に開示されるように、切断され、他のオリゴヌクレオチドとライゲーションされ得る。本明細書に開示される方法を使用する閉端ＤＮＡベクターの生成における複数のオリゴヌクレオチドの使用は、ＤＮＡベクター生成へのモジュラーアプローチを可能にし、末端反復、例えば、ＩＴＲの調整及び／又は特定の選択、並びに末端反復のスペーシング、また合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター内の異種核酸配列の選択を可能にする。

【0162】

ＤＮＡベクターの無細胞合成産生
細胞ベースの方法を使用して様々なＩＴＲ構成を含むｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号及び同第ＷＯ２０１９／１１３３１０号の実施例１に記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0163】

対照的に、本明細書に提供される方法は、合成産生方法、例えば、いくつかの実施形態では、無細胞産生方法に関し、本明細書では「合成閉端ＤＮＡベクター産生」又は「合成産生」とも呼ばれる。

【0164】

一態様では、閉端ＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物から導入遺伝子発現カセットを切除し、続いて、インサートの末端を、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチド及び１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションして、ｃｅＤＮＡを形成することによって生成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々が、独立して、１、２、３、４、又はそれ以上のステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々が、独立して、２又は３のステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘアピン構造を含む第１のオリゴヌクレオチド及び１つ以上のヘアピン構造を含む第２のオリゴヌクレオチドが、各々、自己アニールして三次元構成を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、三次元構成が、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造である。

【0165】

別の態様では、閉端ＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物から導入遺伝子発現カセットを切除し、続いて、インサートの末端を、ＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションして、ｃｅＤＮＡを形成することによって生成される。ライゲーションは、リガーゼ（例えば、Ｔ４リガーゼ）又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によって達成され得る。一実施形態では、反応混合物は、ライゲーション前に精製されない。そのような実施形態では、導入遺伝子発現カセットの切除（例えば、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼによる）及びライゲーションは、単一の反応容器内で同時に行われる。代替的な実施形態では、ライゲーションの前に反応混合物が精製される。

【0166】

本明細書に記載される無細胞合成方法によって調製される得られる閉鎖ＤＮＡベクターが、ベクターのモノマー種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含む。本明細書に記載される無細胞合成方法によって調製される得られる閉鎖ＤＮＡベクターが、ベクターのサブモノマー種の約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満を含む。

【0167】

本明細書で使用される場合、「サブモノマー種」という用語は、例えば、イオン交換クロマトグラフィ（ion exchange chromatography、ＩＥＸ）によって決定されるような、ｃｅＤＮＡゲノム、ｃｅＤＮＡベクター、ＡＡＶゲノム、又はＡＡＶベクターなどの、本明細書で定義される治療用核酸のモノマー形態よりも一般に小さい核酸の複合体を指すことを意味する。「サブモノマー種」及び「サブモノマーＤＮＡ」という用語はまた、２つのサブモノマー単位によって形成される二量体、及び３つ以上のサブモノマー単位によって形成される多量体を包含する。二量体及び多量体の形成は不安定であり、したがって、一過性であり得、二量体及び多量体は、最終的にそれらのサブモノマー形態に分解し得る。サブモノマーＤＮＡの量及び濃度は、例えば、ピーク定量化のためのイオン交換高速液体クロマトグラフィ（ion exchange high-performance liquid chromatography、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）、及び／又はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒなどのチップベースのキャピラリー電気泳動機械を使用するなどの、キャピラリー電気泳動を使用して、定量化され、質量単位（例えば、μｇ、ｎｇ、ｐｇ）又は質量／体積単位で表され得る。

【0168】

一実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、又は直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子から選択される。そのような実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物は、少なくとも、５’から３’方向の順に、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含む。一実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼは、第１の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、第２の制限エンドヌクレアーゼは、第２の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができ、二本鎖ＤＮＡ構築物を第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼと接触させることは、第１の一本鎖オーバーハングを含む第１の末端及び第２の一本鎖オーバーハングを含む第２の末端を有するインサートを放出させる。更なる実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼ及び第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物は、少なくとも、５’から３’方向の順に、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、第１の部分ＩＴＲと、導入遺伝子発現カセットと、第２の部分ＩＴＲと、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含む。二本鎖ＤＮＡ構築物が、第１の切断部位及び第２の切断部位で構築物を切断して、インサートの５’及び３’末端（すなわち、粘着末端）における一本鎖オーバーハングを有するインサートを放出させることができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと接触させられる。次いで、これらのインサートの端が、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）オリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションされて、ｃｅＤＮＡベクターを形成する。一実施形態では、インサートの５’及び３’末端における一本鎖オーバーハングのうちの一方又は両方が、５’オーバーハングである。一実施形態では、インサートの５’及び３’末端における一本鎖オーバーハングのうちの一方又は両方が、３’オーバーハングである。一実施形態では、これらのオーバーハングは、約１～約３０ヌクレオチド長、例えば、約１～約２５ヌクレオチド、又は約１～約２０ヌクレオチド、又は約１～約１８ヌクレオチド、又は約１～約１５ヌクレオチド、又は約１～約１２ヌクレオチド、又は約１～約１０ヌクレオチド、又は約１～約８ヌクレオチド、又は約２～約８ヌクレオチド、又は約２～約７ヌクレオチド、又は約２～約６ヌクレオチド、又は約１ヌクレオチド、又は約２ヌクレオチド、又は約３ヌクレオチド、又は約４ヌクレオチド、又は約５ヌクレオチド、又は約６ヌクレオチド、又は約７ヌクレオチド、又は約８ヌクレオチド、又は約９ヌクレオチド、又は約１０ヌクレオチド長である。

【0169】

非パリンドロームヌクレオチド配列を認識し、その認識部位及び結合部位とは異なる切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼの使用
注目すべきことに、本明細書に提供される合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼは、非パリンドロームヌクレオチド配列を認識する。本明細書で使用される場合、「非パリンドローム」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに言及する場合、センス鎖とアンチセンス鎖との間に異なる５’→３’ヌクレオチド配列を有することを意味し、一方、「パリンドローム」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに言及する場合、センス鎖とアンチセンス鎖との間に同一の５’→３’ヌクレオチド配列を有することを意味する。

【0170】

したがって、図５に例示されるように、そのような制限エンドヌクレアーゼは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に異なる５’→３’ヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを認識する。これは、図５に例示される例では５’－ＧＧＴＣＴＣ－３’などの、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列が鎖の１つのみにコードされていることを意味する。本明細書に記載される合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼについての別の顕著な特徴は、酵素が、認識配列の上流又は下流のいずれかであるが、認識部位自体の中ではない切断部位でＤＮＡを切断することである。認識部位をコードする鎖は、認識配列のどちらの側（すなわち、下流又は上流）が切断されるかを決定する。

【0171】

ある特定の実施形態では、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位が、導入遺伝子発現カセットの上流に位置する互いに別個の、かつ異なる部位である。第１の切断部位は、構築物のセンス及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも一方における第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～３５ヌクレオチド離れており、例えば、構築物のセンス及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも一方における第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約２２ヌクレオチド離れて、又は約１～約２０ヌクレオチド離れて、又は約１～約１５ヌクレオチド離れて、又は約１～約１２ヌクレオチド離れて、又は約１～約１０ヌクレオチド離れて、又は約１～約８ヌクレオチド離れて、又は約１、又は約２、又は約３、又は約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８、又は約９、又は約１０ヌクレオチド離れている。

【0172】

ある特定の実施形態では、第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位は、発現カセットの下流に位置する互いに別個の、かつ異なる部位である。第２の切断部位は、構築物のセンス及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも一方における第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～３５ヌクレオチド離れており、例えば、構築物のセンス及びアンチセンス鎖のうちの少なくとも一方における第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１～約２２ヌクレオチド離れて、又は約１～約２０ヌクレオチド離れて、又は約１～約１５ヌクレオチド離れて、又は約１～約１２ヌクレオチド離れて、又は約１～約１０ヌクレオチド離れて、又は約１～約８ヌクレオチド離れて、又は約１、又は約２、又は約３、又は約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８、又は約９、又は約１０ヌクレオチド離れている。

【0173】

単一の制限エンドヌクレアーゼは、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位並びにそれらの対応する切断部位の両方を標的とすることができる。代替的に、２つの異なる制限エンドヌクレアーゼは、第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位並びにそれらの対応する切断部位の両方を標的とする。

【0174】

ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ
一実施形態では、非パリンドロームヌクレオチド配列を認識し、認識部位の外側のＤＮＡを切断する、本明細書に提供される合成方法で使用される制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの非限定例としては、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｓＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢＣｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｒｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、及び上述のうちのいずれかのアイソシゾマーが挙げられる。アイソシゾマーは、同じ認識配列に特異的である制限エンドヌクレアーゼの対である。例えば、ＢｃｏＤＩ及びＢｓｍＡＩは、互いのアイソシゾマーであり、両方とも５’－ＧＴＣＴＣ－３’の認識配列に特異的である。一実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、及びＳａｐＩ、並びにそれらのアイソシゾマーから選択される。一実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＢｂｓＩ又はそのアイソシゾマーである。一実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＢｓａＩ又はそのアイソシゾマーである。一実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＢｂｓＩ又はそのアイソシゾマーである。一実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｅｓｐ３Ｉ又はそのアイソシゾマーである。一実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＳａｐＩ又はそのアイソシゾマーである。

【0175】

ＩＴＲオリゴヌクレオチド
本明細書に開示される無細胞合成方法においてインサートの５’及び３’末端がライゲーションされる第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、各々、自己アニールして三次元構成を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、そのようなものは、ヘアピン構造又はＴ字形若しくはＹ字形ステムループ構造のようなＩＴＲ三次元構造を有する。一実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドのうちの一方又は両方は、合成であるか、又は合成される。

【0176】

いくつかの実施形態では、三次元ＩＴＲ構造に加えて、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、各々、自己アニールして、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかにおいて一本鎖オーバーハングを更に形成する。そのような実施形態では、インサートの一本鎖オーバーハングは、ＩＴＲオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングにライゲーションされる。ＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハングは、約１～約３０ヌクレオチド長、例えば、約１～約２５ヌクレオチド、又は約１～約２０ヌクレオチド、又は約１～約１８ヌクレオチド、又は約１～約１５ヌクレオチド、又は約１～約１２ヌクレオチド、又は約１～約１０ヌクレオチド、又は約１～約８ヌクレオチド、又は約２～約８ヌクレオチド、又は約２～約７ヌクレオチド、又は約２～約６ヌクレオチド、又は約１ヌクレオチド、又は約２ヌクレオチド、又は約３ヌクレオチド、又は約４ヌクレオチド、又は約５ヌクレオチド、又は約６ヌクレオチド、又は約７ヌクレオチド、又は約８ヌクレオチド、又は約９ヌクレオチド、又は約１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハングは、ＣＴＣＴ、ＣＴＣＡ、ＣＡＣＴ、ＣＴＣ、又はＧＣＴの５’→３’ヌクレオチド配列を含む。

【0177】

第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、互いに対して非相補的な５’→３’ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、同一の配列、すなわち、同じ５’→３’ヌクレオチド配列を含むか、又は有し、更なる実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチドである。そのような実施形態では、インサートの５’及び３’末端におけるオーバーハングは、同じ５’→３’ヌクレオチド配列を含むか、又は有する。ＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、インサートのオーバーハングのいずれか及び両方に対して相補的である。ｃｅＤＮＡの無細胞合成で単一のＩＴＲオリゴヌクレオチドが使用されるそのような実施形態は、本明細書で定義される対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡを調製するのに有用である。

【0178】

代替的な実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、異なる配列、すなわち、異なる５’→３’ヌクレオチド配列を含むか、又は有し、したがって、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、異なるオリゴヌクレオチドである。そのような実施形態では、インサートの５’及び３’末端におけるオーバーハングは、異なる５’→３’ヌクレオチド配列を含むか、又は有する。ＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、各々、インサートのオーバーハングのうちの１つのみに対して相補的である。

【0179】

ＩＴＲオリゴヌクレオチドの長さに関して、いくつかの実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、各々、約４０ヌクレオチド～約７５ヌクレオチド長、例えば、約４０ヌクレオチド～約７２ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約６８ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約７５ヌクレオチド、又は約４５ヌクレオチド～約７２ヌクレオチド、又は約４５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、又は約４５ヌクレオチド～約６８ヌクレオチド、又は約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチドである。一実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドが、各々かつ独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８（表１参照）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0180】

一実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドが、各々かつ独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８（表１参照）からなる群から選択されるものに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドが、各々かつ独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８（表１参照）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる。

【0181】

【表1】

【0182】

ライゲーション効率を増強するために、限定されるものではないが、表１のＩＴＲオリゴヌクレオチドを含む、ＩＴＲオリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化され得る。

【0183】

一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、各々、ヘアピン構造及び／又はＴ字形若しくはＹ字形ステムループ構造を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、各々、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造を含む。別の実施形態では、Ｔ字形又はＹ字形ステムループ構造が、Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びに２つのＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループを含むステムを含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ又はＡＡＶ由来のＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲの両方が、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲのうちの一方又は両方が、修飾ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、互いに対称又は実質的に対称である。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲが、非対称のＩＴＲである。

【0184】

いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲオリゴヌクレオチド及び第２のＩＴＲオリゴヌクレオチドのＴ字形又はＹ字形ステムループ構造（例えば、単一ステム＋２ループ又は単一ステム＋２ループ）は、少なくとも約４塩基対（ヌクレオチド）長、例えば、約４塩基対～約３０塩基対、又は４塩基対～約２５塩基対、又は４塩基対～約２２塩基対、又は４塩基対～約２０塩基対、又は４塩基対～約１８塩基対、又は４塩基対～約１５塩基対、又は４塩基対～約１２塩基対、又は４塩基対～約１０塩基対、又は４塩基対～約８塩基対、又は４塩基対～約７塩基対、又は４塩基対～約６塩基対、又は６塩基対～約８塩基対、又は約４塩基対、又は約５塩基対、又は約６塩基対、又は約７塩基対、又は約８塩基対、又は約９塩基対、又は約１０塩基対、又は約１１塩基対、又は約１２塩基対、又は約１３塩基対、又は約１４塩基対、又は約１５塩基対であるステム領域（すなわち、図１０に示されるＡ－Ａ’ステム領域、Ｄ－Ｄ’ステム領域、又はＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域の両方）を含む。一実施形態では、このステム領域長は、オーバーハング長を含まない。

【0185】

部分ＩＴＲ及びスペーサ
いくつかの実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、両端にｃｅＤＮＡ産物の完全なＩＴＲを形成する。他の実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ｃｅＤＮＡのＩＴＲを部分的に形成するが、ＩＴＲの残りの連続配列は、インサート上の部分ＩＴＲに見出される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される無細胞合成方法で導入遺伝子発現カセットが切除される二本鎖ＤＮＡ構築物は、少なくとも第１の部分ＩＴＲ及び第２の部分ＩＴＲを更に含み、各々、導入遺伝子発現カセットに隣接する。一実施形態では、第１の部分ＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの上流、かつ第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位の下流にある。第２の部分ＩＴＲが、導入遺伝子発現カセットの下流、かつ第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位の上流にある。一実施形態では、第１の切断部位が、第１の部分ＩＴＲに隣接し、第２の切断部位が、第２の部分ＩＴＲに隣接する（すなわち、切断部位と部分ＩＴＲとの間にスペーサがない）。

【0186】

ある特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物又は切除されたインサートは、１つ以上のスペーサ領域を更に含む。一実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物又はインサートが、第１の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間に第１のスペーサを更に含む。別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物が、第２の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間に第２のスペーサを更に含む。各スペーサ領域又は配列が、約１～５０ヌクレオチド長、例えば、約２、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３７、３８、４０、４２、４３、４５、４７、４８、又は５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の（若しくは左の）部分ＩＴＲ又は第２の（若しくは右の部分ＩＴＲ）と導入遺伝子発現カセットとの間のスペーサは、表２に示される配列を含むスペーサから選択される。いくつかの実施形態によると、スペーサは、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態によると、スペーサは、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択される核酸配列からなる。

【0187】

【表2】

【0188】

いくつかの態様では、本開示は、ローリングサークル増幅を介してプラスミド鋳型から二本鎖ＤＮＡ構築物を産生する方法であって、（ａ）プラスミド鋳型を、鎖置換活性を有する熱安定性ポリメラーゼと接触させるステップであって、ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ単位）に対するプラスミド鋳型濃度（ｎｇ／μｌ単位）の比が、約１を超える、ステップと、（ｂ）プラスミド鋳型をオリゴヌクレオチドプライマ及びｄＮＴＰと接触させるステップと、（ｃ）プラスミド鋳型、ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマ、及びｄＮＴＰを、約４０℃以下の温度で、少なくとも約５時間の期間にわたってインキュベートするステップと、を含み、それによって、二本鎖ＤＮＡ構築物を産生する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ単位）に対するプラスミド鋳型濃度（ｎｇ／μｌ単位）の比が、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０を超える。いくつかの実施形態では、プラスミド鋳型濃度が、約０．０１ｎｇ／μｌ、約０．０５ｎｇ／μｌ、約０．１ｎｇ／μｌ、約０．１５ｎｇ／μｌ、約０．２ｎｇ／μｌ、約０．２１ｎｇ／μｌ、約０．２２ｎｇ／μｌ、約０．２３ｎｇ／μｌ、約０．２４ｎｇ／μｌ、約０．２ｎｇ／μｌ、約０．２６ｎｇ／μｌ、約０．２７ｎｇ／μｌ、約０．２８ｎｇ／μｌ、約０．２９ｎｇ／μｌ、約０．３ｎｇ／μｌ、約０．３５ｎｇ／μｌ、約０．４ｎｇ／μｌ、約０．４５ｎｇ／μｌ、約０．５ｎｇ／μｌ、約０．６ｎｇ／μｌ、約０．７ｎｇ／μｌ、約０．８ｎｇ／μｌ、約０．９ｎｇ／μｌ、又は約１．０ｎｇ／μｌである。他の実施形態では、ポリメラーゼ濃度が、約０．０１Ｕ／μｌ、約０．０２Ｕ／μｌ、約０．０３Ｕ／μｌ、約０．０４Ｕ／μｌ、約０．０５Ｕ／μｌ、約０．０６Ｕ／μｌ、約０．０７Ｕ／μｌ、約０．０８Ｕ／μｌ、約０．０９Ｕ／μｌ、約０．１Ｕ／μｌ、約０．１５Ｕ／μｌ、約０．２Ｕ／μｌ、約０．２５Ｕ／μｌ、約０．３Ｕ／μｌ、約０．３５Ｕ／μｌ、約０．４Ｕ／μｌ、又は約０．４５Ｕ／μｌである。更なる実施形態では、ステップ（ｃ）における温度が、約４０℃、約３９℃、約３８℃、約３７℃、約３６℃、約３５℃、約３４℃、約３３℃、約３２℃、約３１℃、約３０℃、約２９℃、約２８℃、約２７℃、約２６℃、約２５℃、約２４℃、約２３℃、約２２℃、又は約２１℃未満である。いくつかの実施形態では、期間が、少なくとも約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約２１時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、又は約４０時間である。いくつかの実施形態では、期間が、約６時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約２１時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、又は約４０時間未満である。いくつかの実施形態では、プラスミド鋳型濃度が、約０．２５ｎｇ／μｌであり、温度が、約３０℃であり、ポリメラーゼ濃度が、約０．０５Ｕ／μｌであり、期間が、約１８～２６時間である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマ濃度は、約５０μＭ未満である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマ濃度は、少なくとも約１０μＭである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマ濃度は、少なくとも約１０μＭかつ約５０μＭ未満である。更なる実施形態では、熱安定性ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ又はその誘導体若しくはバリアントである。他の更なる実施形態では、熱安定性ポリメラーゼが、ＥＱＵＩＰＨＩ２９（商標）である。他の実施形態では、方法が、少なくとも約１００μｌの総反応体積で実施される。他の更なる実施形態では、方法が、少なくとも約１００μｌ、約２００μｌ、約３００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌ、約５５ｍｌ、約６０ｍｌ、約６５ｍｌ、約７０ｍｌ、約７５ｍｌ、約８０ｍｌ、約８５ｍｌ、約９０ｍｌ、約９５ｍｌ、約１００ｍｌ、約２００ｍｌ、約３００ｍｌ、約４００ｍｌ、約５００ｍｌ、約６００ｍｌ、約７００ｍｌ、約８００ｍｌ、約９００ｍｌ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、又は約１０００Ｌの総反応体積で実施される。

【0189】

いくつかの実施形態では、方法が、総反応体積の少なくとも２倍の容量を有する反応容器内で実施される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマは、プラスミド鋳型中の骨格配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマは、ユニバーサルプライマである。

【0190】

いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰ濃度は、約４ｍＭである。

【0191】

単離及び精製
例示的な閉端ＤＮＡベクターである、ｃｅＤＮＡベクターを生成及び単離する方法が、本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載される合成方法によって産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、最後のライゲーション反応後の適切な時点で採取又は収集することができ、ｃｅＤＮＡベクターの高収量産生を達成するために最適化することができる。閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、並びに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。

【0192】

代替的に、反応混合物をクロマトグラフィ分離に供することによって、精製を実施することができる。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｑ（登録商標））上に反応混合物を装填し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上で更なるクロマトグラフィ精製を実施することによって実施され得る。次いで、ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、沈殿によって回収される。

【0193】

ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料及び未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡの存在を確認することによって確認され得る。

【0194】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される合成産生方法によって産生された閉端ＤＮＡベクターは、本明細書で論じられるような様々な好適な方法によってインビトロ又はインビボで標的細胞に送達され得る。ベクターのみを適用又は注射することができる。ベクターは、トランスフェクション試薬又は他の物理的手段の助けなしに細胞に送達され得る。代替的に、ベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進するトランスフェクション試薬又は他の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクションなどを使用して送達され得る。

【0195】

合成産生方法を使用して産生された環状ＤＮＡベクター
本明細書では、ＤＮＡ分子及び閉端ＤＮＡベクターのインビトロ産生の様々な方法が提供される。いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターである。代替的な実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、例えば、ダンベルＤＮＡベクター又はドッグボーンＤＮＡベクターである（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／００８６６２６を参照されたい）。

【0196】

ＩＩＩ．一般的なｃｅＤＮＡベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生される閉端ＤＮＡベクターは、導入遺伝子を発現し得るｃｅＤＮＡベクターを含む、ｃｅＤＮＡベクターである。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、サイズによって制限されず、それにより、例えば、単一ベクターからの導入遺伝子の発現に必要な全ての構成成分の発現を可能にする。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。

【0197】

一般に、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子発現カセットと、導入遺伝子発現カセットの上流の第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位と、導入遺伝子発現カセットの下流の第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位と、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される導入遺伝子発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＩＴＲは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。

【0198】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む方法及び組成物が本明細書に包含され、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系を更に含み得る。使用のために包含される非限定的な例示的リポソームナノ粒子系が、本明細書に開示されている。いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスによって取得されたｃｅＤＮＡを用いて作製及び負荷される脂質ナノ粒子製剤は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２８９号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0199】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターには、ウイルスカプシド内の制限された空間によって課されるパッケージングの制約はない。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を可能にする。

【0200】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の図１Ａ～図１Ｇは、非限定的な例示的ｃｅＤＮＡベクターの概略図、又は対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターはカプシドを含まず、第１のＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから得ることができる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を可能にする及び／又は制御する１つ以上の調節配列を含み得、例えば、発現カセットは、エンハンサ／プロモータ、ルシフェラーゼ又は導入遺伝子などのＯＲＦレポーター、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順番で含み得る。

【0201】

発現カセットはまた、内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモータ、リボスイッチ、インスレータ、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモータ、並びにエンハンサが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモータとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。

【0202】

発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有せず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が効率的な導入遺伝子をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。

【0203】

ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、若しくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）若しくは導入遺伝子、又は所望の生物学的若しくは治療効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、欠陥遺伝子又は転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。原則として、発現カセットは、変異のために低減若しくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、若しくはＲＮＡをコードする、又は過剰発現が本開示の範囲内であるとみなされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。

【0204】

発現カセットは、対象の疾患又は障害を治療するために有用な任意の導入遺伝子を含み得る。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、ポリペプチドをコードする核酸、又は非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲなど）、並びに対象のゲノム中のウイルス配列、例えば、ＨＩＶウイルス配列などを含む外因性遺伝子及びヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、任意の関心対象の遺伝子を対象に送達し、発現させることができる。好ましくは、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチドに使用される。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ’ｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））、抗体、融合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を発現させるのに有用である。

【0205】

発現カセットはまた、ポリペプチド、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験又は診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のものを含み得る。

【0206】

発現カセット、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、標的宿主細胞に最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウス又はヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧＥＮＥ ＦＯＲＧＥ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公開データベースを使用して決定することができる。

【0207】

いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、治療遺伝子である。いくつかの実施形態では、治療遺伝子は、抗体、又は抗体断片、又はその抗原結合断片、例えば、中和抗体又は抗体断片などである。

【0208】

特に、治療遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、及び／又は障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、及び／又は改善における使用のための、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、抗原結合断片、並びにそのバリアント及び／又は活性断片を含むが、これらに限定されない１種以上の治療剤である。例示的な治療遺伝子は、本明細書において「治療の方法」と題されたセクションに記載されている。

【0209】

プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。本明細書における合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合及び末端分離部位（ＲＢＳ及びＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、並びに細菌型ＤＮＡメチル化、又は実際に所与の細胞型における産生と関連し、哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定的な例としてプロモータ又はエンハンサ領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。

【0210】

本明細書に提供される合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（例えば、図１１及び図１２参照）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（具体的には、直鎖状対環状）及びこれらの異なる対象物（下記を参照されたい）を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。

【0211】

本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用することには、プラスミドベースの発現ベクターよりもいくつかの利点があり、そのような利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核生物特異的メチル化（例えば、６－メチルアデノシン及び５－メチルシトシンのメチル化）を受けるが、カプシドを含まないＡＡＶベクター配列は、真核生物起源であり、原核生物特異的メチル化を受けない、結果として、カプシドを含まないＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症応答及び免疫応答を誘導する可能性が低い、２）プラスミドは産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない、３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解を回避するために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスシスエレメント（すなわち、ＩＴＲ）を含有し、これは、ヌクレアーゼに対して耐性を付与し、核に標的化及び送達するように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小定義エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＡＡＶ２の場合、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の配列番号６０）、及び末端分離部位（ＴＲＳ、ＡＡＶ２の場合５’－ＡＧＴＴＧＧ－３’（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６４））＋ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列；及び４）である。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｔｏｌｌ様ファミリーの受容体のメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発すると報告されている原核生物由来プラスミドにおいてしばしば見られるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞及び組織型を効率的に標的とし得る。

【0212】

固有のジャンクション配列
本明細書に記載される無細胞合成方法を使用して調製されたｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡに固有の両端上のインサートとＩＴＲオリゴヌクレオチドとの間のライゲーションジャンクションにヌクレオチド配列を含む。そのようなジャンクション配列は、ＩＴＲオリゴヌクレオチドにおいても、導入遺伝子発現カセットが切除される二本鎖ＤＮＡ構築物においても見出されない。ＤＮＡ配列決定分析（例えば、図１４参照）において明らかにされるように、そのようなジャンクション配列の存在は、ライゲーション反応の成功を確認するために有用である。

【0213】

したがって、本開示の別の態様は、ｃｅＤＮＡベクター中に見出されるＩＴＲヌクレオチド配列、これらのＩＴＲヌクレオチド配列を含むｃｅＤＮＡベクター、並びにそのようなｃｅＤＮＡベクターを含む組成物、宿主細胞、及びトランスジェニック動物を対象とする。そのようなＩＴＲヌクレオチド配列の例の非網羅的リストが、以下の表３に提供される。

【0214】

【表3】

【0215】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＩＴＲヌクレオチド配列は、スペーサ配列を更に含む。一実施形態では、スペーサは、表２に提供されるスペーサ配列のうちのいずれか１つから選択される。一実施形態では、表３のＩＴＲヌクレオチド配列のいずれか１つは、表２に提供されるスペーサ配列のいずれか１つを更に含み得る。

【0216】

ＩＶ．ＩＴＲ
本明細書に開示されているように、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に位置付けられた導入遺伝子又は異種核酸配列を含有し、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲは、非対称のＩＴＲ対又は対称若しくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系を更に含み得る。

【0217】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ及び昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つの亜科を含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに由来し得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ亜科（パルボウイルスと称される）は、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、並びに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルス及びＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，」Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。

【0218】

ＷＴ－ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２ ＷＴ－ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、又は任意の合成ＡＡＶ由来のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウス由来微小ウイルス（Minute Virus from Mouse、ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）由来である。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるように、５’ＷＴ－ＩＴＲは、１つの血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。

【0219】

当業者であれば、ＩＴＲ配列が、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ字形又はＹ字形ヘアピン構造であり（例えば、図１０を参照されたい）、各ＷＴ－ＩＴＲが、２つのループ（Ｂ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’、その両方がパリンドローム二本鎖ＤＮＡ配列を含む）及びステム（Ａ－Ａ’、これもまたパリンドローム二本鎖ＤＮＡ配列を含む）、並びに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップ又はフロップ配向を定義する）ことを知っている。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６）由来の、かつＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６、８０（１）；４２６－４３９、）Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４－３７９、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９；２６１；８－１４に記載のＩＴＲの構造分析及び配列比較を参照されたい。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡ－プラスミドで使用するための任意のＡＡＶ血清型からＷＴ－ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９に記載の、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６、並びにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）及びウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））由来のＩＴＲの配列比較を参照されたい。これは、他の血清型由来の左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの％同一性：ＡＡＶ－１（８４％）、ＡＡＶ－３（８６％）、ＡＡＶ－４（７９％）、ＡＡＶ－５（５８％）、ＡＡＶ－６（左ＩＴＲ）（１００％）、及びＡＡＶ－６（右ＩＴＲ）（８２％）を示す。

【0220】

対称又は実質的に対称のＩＴＲ対
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲを含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は３次元空間で同じＡ－Ａ’ステム、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補体（逆位）である同じ配列を有し得る。代替的な実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称の三次元形状を有し得る。

【0221】

野生型ＩＴＲ（ＷＴ－ＩＴＲ）
いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。

【0222】

したがって、本明細書で開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも２つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に位置付けられた導入遺伝子又は異種核酸配列を含有し、互いに逆相補（逆位）であるか、又は代替的に互いに実質的に対称である。すなわち、ＷＴ－ＩＴＲ対は、対称の三次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）は、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、例えば、ＡＡＶ２の場合、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の配列番号６０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及び機能的末端分離部位（ＴＲＳ、例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’、ＷＯ２０１９／１４３８８５号の配列番号６２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含む。

【0223】

一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも２つのＷＴ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ構築物から取得可能である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称の三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じ又は異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型に由来する。

【0224】

ＷＴ－ＩＴＲは周知である。一実施形態では、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型に由来する。ある特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同であるいくつかの血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８がある。一実施形態では、密接に相同なＩＴＲ（例えば、類似のループ構造を有するＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様なＡＡＶ ＷＴ ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５を使用することができ、更に別の一実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる、すなわち、それはＷＴの基本ループ構造を有するが、特性を変更しないか又は影響しないいくつかの保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型に由来するＷＴ－ＩＴＲを使用する場合、１つ以上の調節配列を更に使用することができる。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性の調整を可能にする調節スイッチである。

【0225】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターに関し、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの野生型逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＷＴ－ＩＴＲは、同じ血清型、異なる血清型に由来し得るか、又は互いに対して実質的に対称であり得る（すなわち、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるように対称の３次元空間構成を有するか、又は３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する）。いくつかの実施形態では、対称ＷＴ－ＩＴＲは、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシドにはない。

【0226】

いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲは同じであるが、互いの逆相補体である。例えば、５’ＩＴＲの配列ＡＡＣＧは、対応する部位の３’ＩＴＲのＣＧＴＴ（すなわち、逆相補体）であり得る。一実施例では、５’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（すなわち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補体）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ ｃｅＤＮＡは、末端分離部位及び複製タンパク質結合部位（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位（Rep binding site、ＲＢＳ）を更に含む。

【0227】

ＷＴ－ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＷＴ－ＩＴＲ配列は、ＷＴ－ＩＴＲの対（５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲ）を示す、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の表２に示されている。

【0228】

例示的な実施例として、本開示は、調節スイッチの有無にかかわらず、導入遺伝子（例えば、遺伝子編集配列）に操作可能に連結されたプロモータを含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）ＷＴ－ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ－プラスミド（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の図１Ｆ～図１Ｇを参照）から産生され、各ＷＴ－ＩＴＲは、そのヘアピン二次構成で同じ数の分子内二重化塩基対を有し（好ましくはこれらの参照配列と比較して、この構成のいかなるＡＡＡ又はＴＴＴ末端ループの欠失も除外する）、及び（ｂ）未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの同定のためのアッセイを使用してｃｅＤＮＡとして特定される。

【0229】

いくつかの実施形態では、隣接するＷＴ－ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲが同一の逆相補体ではないように、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの１つの血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し得る。例えば、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶのうちのいずれかから選択される２つの異なるパルボウイルスから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６からのＷＴ－ＩＴＲの組み合わせである。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲは、一方が他方のＩＴＲに対して反転されたときに、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全ての点のパーセンテージだけ同一であり、同じ対称の三次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、それらが対称の三次元空間構成を有する、例えば、Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域、並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ルームの同じ三次元構成を有するため、実質的に対称である。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲ対は、他方に対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．．９９．５％、及びその間の全ての点で同一あり、一方のＷＴ－ＩＴＲは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）（国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の配列番号６０及び末端分離部位（ｔｒｓ）を保持する。いくつかの実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲ対は、互いに対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．．９９．５％、及びその間の全ての点で同一であり、一方のＷＴ－ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６０）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を保持する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、デフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなど、当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定することができる。

【0230】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ ７８又はＲｅｐ ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、又は上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、Ａ及びＡ’アーム、Ｂ及びＢ’アーム、Ｃ及びＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）及びＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、並びに末端分離部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。

【0231】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の表１は、ＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせの非網羅的なリストを提供する。ＷＯ２０１９／１４３３８５の表２は、異なるＡＡＶ血清型由来の例示的なＷＴ－ＩＴＲの非網羅的なリストの配列を提供する。

【0232】

いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は、（例えば、１、２、３、４若しくは５個以上のヌクレオチド又はその中の任意の範囲を修飾することにより）修飾され得、それにより修飾は、相補的ヌクレオチドの置換、例えば、Ｃの場合はＧ、及びその逆、Ａの場合はＴ、及びその逆である。

【0233】

本開示のある特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１、２、５～１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなるＷＴ－ＩＴＲを有しない。本開示の代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターが、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１、２、５～１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含むＷＴ－ＩＴＲを有する場合、隣接するＩＴＲもＷＴであり、ｃｅＤＮＡは、例えば、本明細書及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号に開示されているように、調節スイッチを含む（例えば、ＷＯ２０１９／０５１２５５号の表１１を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、及びＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１、２、５～１４からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択されたＷＴ－ＩＴＲを含む。

【0234】

本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ’部分を保持するＷＴ－ＩＴＲ構造を含み得る。例示的な目的で野生型ＩＴＲを使用する、ＷＯ２０１９／１４３８８５の図２Ａ及び図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の作動のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ－結合部位（ＡＡＶ２の場合（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６０））及び末端分離部位（ＴＲＳ、５’－ＡＧＴＴ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６２））を含む１つ以上の機能性ＷＴ－ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲは、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが互いに実質的に対称である２つのＷＴ－ＩＴＲを含む代替的な実施形態では、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲが非機能的である。

【0235】

非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの一般的な修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）
本明細書で論じられるように、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対称のＩＴＲ対又は非対称のＩＴＲ対を含み得る。どちらの場合も、一方又は両方のＩＴＲは修飾型ＩＴＲであり得、その違いは、第１の場合（すなわち、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、同じ三次元空間構成を有する（すなわち、同じＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域、並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループ構成を有する）が、第２の場合（すなわち、非対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる三次元空間構成を有する（すなわち、Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域、並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ルームの異なる構成を有する）ことである。

【0236】

いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されるＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター中のＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６０）及び機能的末端分離部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６２）一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが非機能的ＩＴＲである。一実施形態では、異なる又は修飾型ＩＴＲは各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。

【0237】

ＩＴＲの特定の変更及び変異が本明細書において詳細に説明されているが、ＩＴＲの文脈では、「変更型」又は「変異型」又は「修飾型」とは、ヌクレオチドが野生型、参照、又は元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、及び／又は置換されたことを示す。変更型又は変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人間の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人間の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。

【0238】

いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、合成であり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶベース配列を含まない。更に別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、又は全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐ又は特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、又は場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。

【0239】

当業者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、又はＤ－Ｄ’領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又は他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本開示は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからｍｏｄ－ＩＴＲを含む集団及び複数のｃｅＤＮＡベクターを更に提供する。すなわち、１つのｍｏｄ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に由来し得るか、又はそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、又はそれに基づき得る。

【0240】

任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、又は塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロン及び骨格筋を選好的に標的とし、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、及び光受容体を選好的に標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋及び肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、及び膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、及び肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲに基づいている。

【0241】

より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、及びｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり得、Ａ若しくはＡ’アーム又はＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであり得、Ｃ又はＣ’アーム、ＲＢＥ、及びｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであり得、Ｂ及びＢ’アームは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｂ及びＢ’アームで置き換えられる。

【0242】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対する、そのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）の非網羅的な例を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃ及び／又はＣ’及び／又はＢ及び／又はＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ－Ｃ’ルーム、若しくは単一Ｂ－Ｂ’ルーム）、又は修飾型Ｃ－Ｂ’アーム若しくはＣ’－Ｂアーム、又は少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ－Ｃ’ループ及び／若しくは切断されたＢ－Ｂ’ループ）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一ループ、又は２つのループＩＴＲのループ（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ－Ｃ’アーム及び／又は切断されたＢ－Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。

【0243】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで使用するためのｍｏｄ－ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、及びＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ若しくはＣ’又はＢ若しくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、依然としてステムループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間及び／又はＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替的な実施形態では、ＣとＣ’との間及び／又はＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、及び／又はＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ及び／又はＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。

【0244】

一実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０以上のヌクレオチド、又はその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、ＩＴＲに対する特定の修飾が、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７、又は国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１１３３１０号の図７Ａ～図７Ｂに示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる（例えば、ＷＯ２０１９／１１３３１０の配列番号９７～９８、１０１～１０３、１０５～１０８、１１１～１１２、１１７～１３４、５４５～５４）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０以上のヌクレオチド、又はその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、又は１６５～１８７の修飾型ＩＴＲのうちの１つ、あるいはＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７、又は国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号の表２～９（すなわち、配列番号１１０～１１２、１１５～１９０、２００～４６８）に示されている、Ａ－Ａ’ステム領域及びＣ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループのＲＢＥ含有セクションと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有し得る。

【0245】

いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ－Ａ’ステム領域の全部若しくは一部、又はＢ－Ｂ’ループの全部若しくは一部、又はＣ－Ｃ’ループの全部若しくは一部の除去若しくは欠失、あるいは代替的に、ステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去（例えば、ＷＯ２０１９／１１３３１０号の図７ＡのＩＴＲ－２１を参照されたい）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去を含み得る（例えば、ＷＯ２０１９／１１３３１０の図３ＢのＩＴＲ－１又は図７ＡのＩＴＲ－４５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去、及びＢ－Ｂ’ループからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ－Ｃ’ループにおける６つの塩基対、及びＢ－Ｂ’ループにおける２つの塩基対が除去され得る。

【0246】

いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１～５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長ＷＴ ＩＴＲ配列に対して１～３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２～２０ヌクレオチド欠失を有する。

【0247】

いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、若しくは末端分離部位でのニッキング）に干渉しないように、Ａ又はＡ’ステム領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含有しない。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、及び／又はＣ領域に１つ以上の欠失を有する。

【0248】

いくつかの実施形態では、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、又は１６５～１８７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを含む。

【0249】

別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さ及び／又はループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、若しくは９ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステムの高さは、約５ヌクレオチド～約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施形態では、ステム高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施例では、ステムの高さは、約３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０ヌクレオチド、又はそれ以上、又はその中の任意の範囲を有し得る。

【0250】

別の実施形態では、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位又はＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加又は減少され得る。一実施例では、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、若しくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、又はその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列又はＧＡＧＹと同様の配列であり得る。

【0251】

別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥ及びヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加又は減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲であり得る。

【0252】

本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ’部分を保持する。いくつかの実施形態では、そのようなＩＴＲ（野生型又は修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、又は非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替的な実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。

【0253】

いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号に開示されているように、配列番号５００～５２９からなる、又は本質的にそれからなる任意の配列から選択される修飾型ＩＴＲを有しない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号５００～５２９から選択される任意の配列から選択されるＩＴＲを有しない。

【0254】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左又は右ＩＴＲ）は、ループ、切断されたループ、又はスペーサ内に修飾を有する。ループ、切断されたループ、又はスペーサ内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号の表２（すなわち、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１３５～１９０、２００～２３３）、ＷＯ２０１９／０５１２５５の表３（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号２３４～２６３）、ＷＯ２０１９／０５１２５５の表４（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号２６４～２９３）、ＷＯ２０１９／０５１２５５の表５（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号２９４～３１８）、ＷＯ２０１９／０５１２５５の表６（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号３１９～４６８）、及びＷＯ２０１９／０５１２５５の表７～９（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１０１～１１０、１１１～１１２、１１５～１３４）、又はＷＯ２０１９／０５１２５５の表１０Ａ若しくは１０Ｂ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号９、１００、４６９～４８３、４８４～４９９）に列挙されている。

【0255】

いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための修飾型ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／０５１２５５の表２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０Ａ～１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、又はそれらの組み合わせから選択される。

【0256】

上記のクラスの各々に非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで使用するための追加の例示的な修飾型ＩＴＲをＷＯ２０１９／１４３８８５の表４Ａ及び４Ｂに示す。

【0257】

一実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに非対称である。すなわち、それらは互いに異なる３次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方ともｍｏｄ－ＩＴＲであるが、異なる配列を有するか、又は異なる修飾を有し、したがって同じ修飾型ＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲにおける任意の変化が他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを含むか、又は代替的に、非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。ｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ－プラスミドを生成するために使用するための例示的な非対称ＩＴＲは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表４Ａ及び４Ｂに示されている。

【0258】

代替的な実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、２つの対称的なｍｏｄ－ＩＴＲを含む。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、互いの逆相補鎖（逆位）である。いくつかの実施形態では、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、又は置換の少なくとも１つ又は任意の組み合わせを含む。対称のＩＴＲの付加、欠失、又は置換は同じであるが、互いの逆相補体である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域への３ヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域の対応するセクションへの３つの逆相補体ヌクレオチドの挿入に反映される。

【0259】

代替的な実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称の三次元形状を有し得る。例えば、１つの修飾型ＩＴＲは、１つの血清型に由来し得、他の修飾型ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得るが、それらは同じ領域において同じ変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、又は置換）を有する。言い換えると、単なる説明の目的で、５’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、Ｃ領域に欠失を有し、３’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ５に由来し得、Ｃ’領域に対応する欠失を有する。５’ｍｏｄ－ＩＴＲ及び３’ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ又は対称な三次元空間構成を有することを条件として、それらは本明細書における修飾型ＩＴＲ対としての使用に包含される。

【0260】

いくつかの実施形態では、実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ－Ａ’ステム領域、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。単なる例として、実質的に対称のＩＴＲは、それらの構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、対称空間構成を有し得る。これは、例えば、Ｇ－Ｃ対が、例えばＣ－Ｇ対に、若しくはその逆に修飾されたとき、又はＡ－Ｔ対がＴ－Ａ対に、若しくはその逆に修飾されたときに起こり得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲ対が対称立体化学を有するため、そのような修飾型ＩＴＲは、実質的に対称である。

【0261】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の表５は、例示的な対称修飾型ＩＴＲ対（すなわち、左修飾型ＩＴＲ及び対称右修飾型ＩＴＲ）を提供する。

【0262】

いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターは、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表４Ａ～４Ｂのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列若しくはＩＴＲ部分配列、あるいは国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１１３３１０号の図７Ａ及び図７Ｂに示されているか、又は国際出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号の表２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０Ａ～１０Ｂに開示されている配列における修飾のうちのいずれかに対応する修飾を有するＩＴＲを含み得る。

【0263】

Ｖ．例示的なｃｅＤＮＡベクター
上記のように、本開示は、合成的に産生された組換えｃｅＤＮＡ発現ベクター、及び上記の非対称のＩＴＲ対、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対のうちのいずれか１つを含む導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡベクターに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ及び導入遺伝子を有する合成的に産生された組換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ＩＴＲは、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置する関心対象のヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット）を更に含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。

【0264】

合成的に産生されたｃｅＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＩＴＲが変更されている場合、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってよい。本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。ある特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、直鎖状であってもよい。ある特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在し得る。ある特定の実施形態では、本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノムへのドナー配列の組み込みを可能にするエレメントを含有し得る。

【0265】

ここで本明細書に提供される図１Ａ～図１Ｂ、更に国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の図１Ａ～図１Ｇを参照すると、非対称ＩＴＲ又は対称若しくは実質的に対称なＩＴＲを有するｃｅＤＮＡの２つの非限定的な例の機能的構成要素の概略図が示されている。いくつかの実施形態では、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサ／プロモータ、１つ以上の相同性アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ、例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６７））、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ、例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６８）を含む。

【0266】

調節エレメント
本明細書に記載され、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書で定義される非対称のＩＴＲ対又は対称のＩＴＲ対を含み得、シス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモータ、リボスイッチ、インスレータ、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモータ、並びにエンハンサが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモータとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、又はｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。本開示で使用され得る調節スイッチを含む調節エレメントは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号においてより完全に論じられている。

【0267】

いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、調節配列、及びヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するのに好適である。ある特定の実施形態では、調節配列は、本開示のヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列などのプロモータ配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモータ配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサ配列がプロモータの上流に提供されて、プロモータの効力を増大させる。ある特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサ及びプロモータを含み、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモータは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

【0268】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６７）及びＢＧＨポリＡ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６８）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含み得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。

【0269】

プロモータ
当業者は、本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで使用されるプロモータが、それらが促進する特定の配列に対して適切に調整されるべきであることを理解するであろう。例えば、ガイドＲＮＡは、その機能が、未変性ＤＮＡ上の特定の標的配列と二重鎖を形成して組換え事象を発生させるため、プロモータを全く必要としない場合がある。対照的に、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされたヌクレアーゼは、プロモータから恩恵を受けるため、ベクターから効率的に、かつ任意選択的に調節可能な方法で発現させることができる。

【0270】

本開示の発現カセットは、全体発現レベル並びに細胞特異性に影響を及ぼし得る、プロモータを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモータを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果及び免疫応答を低減するために組織特異的真核生物プロモータを含有し得る。好ましい実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７２）などの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモータは、（ｉ）サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）初期エンハンサエレメント、（ｉｉ）プロモータ、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエキソン及び第１のイントロン、並びに（ｉｉｉ）ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、発現カセットは、アルファ－１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７３若しくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７５若しくは配列番号７６）、又はヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモータ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７７若しくは配列番号７８）を含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモータ、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモータ（任意選択的にＲＳＶエンハンサを有する）、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ（任意選択的にＣＭＶエンハンサを有する、例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７９）を含む。代替的に、誘導性プロモータ、導入遺伝子の未変性プロモータ、組織特異的プロモータ、又は当該技術分野において既知の様々なプロモータを使用することができる。

【0271】

上記のものを含む好適なプロモータは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモータと称され得るか、又はそれらは、原核生物又は真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモータを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモータとしては、ＳＶ４０初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモータ；アデノウイルス主要後期プロモータ（adenovirus major late promoter、Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、例えば、ＣＭＶ最初期プロモータ領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、ヒトＵ６小核プロモータ（Ｕ６、例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８０）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、増強されたＵ６プロモータ（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモータ（Ｈ１）（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８１又は配列番号１５５）、ＣＡＧプロモータ、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ＨＡＡＴ）プロモータ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８２）などが挙げられる。ある特定の実施形態では、これらのプロモータは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモータＤＮＡに対して外来である。

【0272】

一実施形態では、使用されるプロモータは、治療用タンパク質をコードする遺伝子のネイティブプロモータである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモータ及び他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモータ領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７９及び配列番号８３）を更に含み得る。

【0273】

本開示による使用のための好適なプロモータ又はプロモータセットの非限定的な例としては、例えば、ＣＡＧプロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７２）、ＨＡＡＴプロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８２）、ヒトＥＦ１－αプロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７７）、又はＥＦ１ａプロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号７８）、ＩＥ２プロモータ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８４）、及びラットＥＦ１－αプロモータ（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８５）、又は１Ｅ１プロモータ断片（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１２５）が挙げられる。

【0274】

ポリアデニル化配列
ポリアデニル化配列をコードする配列は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、及び核輸送及び翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、又はその間の任意の範囲を含む。

【0275】

発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列又はその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６８）若しくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８６）から単離された天然に存在する配列、又は合成配列（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサ（upstream enhancer、ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。

【0276】

発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（Woodchuck Hepatitis Virus、ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号６７）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２及びＶＫ－Ａ２６配列、例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号８８及び配列番号８９に連結され得る。

【0277】

核局在化配列
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするベクターは、１つ以上の核局在化配列（nuclear localization sequence、ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端又はその近く、カルボキシ末端又はその近く、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳ及び／又はカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが複数のコピーに、及び／又は１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。ＮＬＳの非限定的な例は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の表６に示されている。

【0278】

ｃｅＤＮＡベクターの追加の構成要素
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子発現のための他の構成成分をコードするヌクレオチドを含有し得る。例えば、特定の遺伝子標的事象を選択するには、保護ｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡに埋め込み、アルブミン遺伝子座などの高活性遺伝子座に部位特異的に統合するように設計された組換えｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。そのような実施形態は、Ｎｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ ８，２０１６に記載されているような任意の遺伝的背景における遺伝子修飾肝細胞のインビボ選択及び拡大のための系を提供し得る。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などされた細胞の選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含有し得る。選択可能なマーカーは、その産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、ＮｅｏＲなどを提供する遺伝子である。ある特定の実施形態では、正の選択マーカーが、ＮｅｏＲなどのドナー配列に組み込まれる。負の選択マーカーは、ドナー配列の下流に組み込むことができ、例えば、負の選択マーカーをコードする核酸配列ＨＳＶ－ｔｋを、ドナー配列の下流の核酸構築物に組み込むことができる。

【0279】

実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１１３３１０号に開示されているように遺伝子編集に使用することができ、５’相同性アーム、３’相同性アーム、ポリアデニル化部位上流、及び５’相同性アームに近接のうちの１つ以上を含み得る。例示的な相同性アームは、５’及び３’アルブミン相同性アーム（ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１５１及び１５２）又はＣＣＲ５ ５’及び３’相同性アーム（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の配列番号１５３、１５４）である。

【0280】

調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに応答して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける関心対象の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始又は停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターにおける使用に包含される例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１１３３１０号においてより完全に論じられている。

【0281】

（ｉ）バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、関心対象の遺伝子に操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモータ、シスエレメント、リプレッサ、エンハンサなどを追加的に含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子又は外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチ又は誘導性若しくは抑制性プロモータによって調節され得る。誘導性プロモータの非限定的な例は、ホルモン誘導性又は金属誘導性プロモータである。他の例示的な誘導性プロモータ／エンハンサエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモータ、エクジソン誘導性プロモータ、ラパマイシン誘導性プロモータ、及びメタロチオネインプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。

【0282】

（ｉｉ）小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０（２０１０）：１５に開示されている作動可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモータとともに直交性リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体バリアント／ＬＧ３３５及びＧＲＱＣＩＭＦＩ、操作されたステロイド受容体（例えば、プロゲステロンに結合できないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）に結合するＣ末端切断を有する修飾プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体及びそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２－１４５１７、又はＳａｎｄｏ Ｒ ３^ｒｄ；Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５－８に開示される抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つ又は組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号及び同第６，３３９，０７０号に開示されるものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。

【0283】

（ｉｉｉ）「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」又は「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能し、すなわち、導入遺伝子の発現及び／又は抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件Ａ及びＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７つ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ又はＡ、Ｂ、及びＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、及びＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、及びＣは、以下のとおりであり得る：条件Ａは、病態又は疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン応答であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する応答である。例えば、導入遺伝子が欠陥ＥＰＯ遺伝子を編集する場合、条件Ａは、慢性腎疾患（Chronic Kidney Disease、ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（Erythropoietin-producing cell、ＥＰＣ）動員が不全であるか、又は代替的に、ＨＩＦ－２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、又は所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。

【0284】

いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチ又は「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲及び複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死を誘起するデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存又は導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件又はパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現及び／又は細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。

【0285】

本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸ベーススイッチ、小分子－核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、及び本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれか及び全ての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）に記載されており、Ｋｉｓの表１にまとめられている。

【0286】

（ｉｖ）導入遺伝子発現を制御するための核酸ベース調節スイッチ
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５２５３号、同第２００８／０２６９２５８号、同第２０１７／０２０４４７７号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８０２６７６２（Ａ１）号、米国特許第９，２２２，０９３号、及びＶｉｌｌａ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８ Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されているものなどが挙げられる。国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０７５４８６号及び同第ＷＯ２０１７／１４７５８５号に開示されるものなどの、代謝物応答性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。

【0287】

いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２０１８号に開示される組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子発現を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１２７１６２号及び米国特許第８，３２４，４３６号に開示されているようなリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。

【0288】

（ｖ）転写後及び翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子又は遺伝子を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、米国特許出願公開第２０１８／０１１９１５６号、英国特許出願公開第ＧＢ２０１１／０７７６８号、国際特許出願公開第ＷＯ２００１／０６４９５６（Ａ３）号、欧州特許第２７０７４８７号、及びＢｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ ５２６－５３４；Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６ Ｎｏｖ ２；５．Ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されているように、テトラサイクリン又はテオフィリンに感受性のあるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、及びリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。

【0289】

（ｖｉ）他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチを合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することができる。更なる例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ法、遺伝暗号の拡大及び非生理的アミノ酸、放射線制御又は超音波制御オン／オフスイッチ（例えば、Ｓｃｏｔｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１－５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、及び国際特許出願公開第ＷＯ１９９９／０２５３８５（Ａ１）号を参照されたい。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、米国特許出願公開第２００７／０１９００２８（Ａ１）号に開示されている埋め込み型システムによって制御され、遺伝子発現が、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを活性化する電磁エネルギーを含む１つ以上の形態のエネルギーによって制御される。

【0290】

いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性又はストレス活性化スイッチ、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ１９９９０６０１４２（Ａ２）号、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、米国特許出願公開第２０１５／０３２２４１０号、Ｇｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ９，Ｓ３６８、並びにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、及びＮＲＳＥエレメント、並びに条件的誘導性サイレンシングエレメント（低酸素応答エレメント（hypoxia response element、ＨＲＥ）、炎症反応エレメント（inflammatory response element、ＩＲＥ）、及び米国特許第９，３９４，５２６号に開示されている剪断応力活性化エレメント（shear-stress activated element、ＳＳＡＥ）が含まれる）に開示されているものである。そのような実施形態は、虚血後、又は虚血性組織及び／若しくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。

【0291】

（ｖｉｉ）キルスイッチ
本開示の他の実施形態は、キルスイッチを含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、又は導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、又はアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、がん細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結びつけられることは、当業者によって理解されるであろう。全ての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナル又は他の指定条件の不在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつ堅牢な細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書においてｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象から合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを除去すること、又はコードされた導入遺伝子を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。

【0292】

ＶＩ．関連する基本ベクター、構築物、及びキット
本開示の更なる態様は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターなどのＤＮＡベクターの無細胞合成を容易にするように操作された基本ベクター及び二本鎖ＤＮＡ構築物を対象とする。

【0293】

基本ベクター
本明細書に提供される基本ベクターは、いかなる導入遺伝子も異種核酸も保有しないベクターである。代わりに、これらの基本ベクターは、導入遺伝子を受容することができるマルチクローニング部位を含有する。追加的に、基本ベクターは、非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び複数のクローニング部位に隣接するそれらの対応する切断部位を含む。基本ベクターはまた、マルチクローニング部位に隣接する部分的ＩＴＲを更に含む。したがって、一実施形態、及び認識部位が特異的である制限エンドヌクレアーゼの実施形態を含む、本明細書に開示される上述のうちのいずれかの全ての実施形態では、基本ベクターは、５’→３’の順序で：第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位、第１の部分ＩＴＲ、マルチクローニング部位、第２の部分ＩＴＲ、並びに第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位を含有する。いくつかの実施形態では、基本ベクターは、複製起源及び選択可能なマーカー遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、基本ベクターは、第１の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間のスペーサ、第２の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間のスペーサ、及び／又はマルチクローニング部位内のスペーサなどの、１つ以上のスペーサ領域を更に含む（例えば、例示的な基本ベクタープラスミド１１を示す図２を参照されたい）。

【0294】

例示的な基本ベクターとしては、以下に示される、プラスミド１７（配列番号９）、プラスミド２０（配列番号１０）、プラスミド１８（配列番号１１）、プラスミド１５（配列番号１２）、プラスミド１（配列番号１３）、プラスミド１１（配列番号１４）、プラスミド８（配列番号１５）、プラスミド７（配列番号１６）、及びプラスミド６（配列番号１７）が挙げられる。

【0295】

プラスミド１７（配列番号９）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0296】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号９からなる。

【0297】

プラスミド２０（配列番号１０）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0298】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１０からなる。

【0299】

プラスミド１８（配列番号１１）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0300】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１１からなる。

【0301】

プラスミド１５（配列番号１２）
ＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣ

【0302】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１２からなる。

【0303】

プラスミド１（配列番号１３）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0304】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１３からなる。

【0305】

プラスミド１１（配列番号１４）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0306】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１４からなる。

【0307】

プラスミド８（配列番号１５）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0308】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１５からなる。

【0309】

プラスミド７（配列番号１６）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0310】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１６からなる。

【0311】

プラスミド６（配列番号１７）
ＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴ

【0312】

いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して８５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して９０％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して９５％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して９６％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して９７％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して９８％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７に対して９９％同一である。いくつかの実施形態によると、基本ベクターは、配列番号１７からなる。

【0313】

二本鎖ＤＮＡ構築物
本明細書に開示されるように、ＤＮＡベクターの無細胞合成は、二本鎖ＤＮＡ構築物から導入遺伝子発現カセットを切除することを伴う。二本鎖ＤＮＡ構築物は、例えば、導入遺伝子発現カセットを基本ベクターにサブクローニングすることによって調製され得る。したがって、一実施形態、及び認識部位が特異的である制限エンドヌクレアーゼの実施形態を含む、本明細書に開示される上述のうちのいずれかの全ての実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物は、５’→３’の順序で：第１の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第１の切断部位、第１の部分ＩＴＲ、導入遺伝子発現カセット、第２の部分ＩＴＲ、並びに第２の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び対応する第２の切断部位を含有する。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物は、複製起源及び選択可能なマーカー遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、基本ベクターは、第１の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間のスペーサ及び第２の部分ＩＴＲと導入遺伝子発現カセットとの間のスペーサなどの１つ以上のスペーサ領域を更に含む（例えば、ＦＶＩＩＩ発現導入遺伝子発現カセットを担持する例示的な二本鎖ＤＮＡ構築物、構築物１を示す図３を参照されたい）。

【0314】

キット
一実施形態では、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターなどのＤＮＡベクターを調製するためのキットは、上記の基本ベクターと、マルチクローニング部位でＤＮＡベクターを切断して、マルチクローニング部位が導入遺伝子を受容することを可能にすることができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ（例えば、プラスミド１１に対するＢｓａＩ、図２を参照されたい）と、第１の切断部位及び第２の切断部位で切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ（例えば、プラスミド１１に対するＮｏｔＩ及びＸｂａＩ、図２を参照されたい）と、リガーゼと、を含む。

【0315】

別の実施形態では、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターなどのＤＮＡベクターを調製するためのキットは、上記のような二本鎖ＤＮＡ構築物と、第１の切断部位及び第２の切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ（例えば、構築物１に対するＢｓａＩ、図３を参照されたい）と、リガーゼと、を含む。

【0316】

上記のキットの更なる実施形態は、本明細書で定義される１つ以上のＩＴＲオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0317】

ＶＩＩ．医薬組成物
別の一態様では、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクター、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。

【0318】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込まれ得る。典型的に、医薬組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター及び薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高濃度の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに、適切な緩衝液に必要量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクターを含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子又はドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。

【0319】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば、対象の細胞に様々な目的のための導入遺伝子を送達するように製剤化することができる。

【0320】

治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高濃度の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせに組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製され得る。

【0321】

本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、前房内、及び硝子体内）、蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、鼻）投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。

【0322】

いくつかの態様では、本明細書に提供される方法は、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む１つ以上の閉端ＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生された細胞、及びそのような細胞を含むか又はそのような細胞から産生された生物（動物、植物、又は真菌など）も提供される。核酸の送達方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、及び薬剤によって増強されたＤＮＡの取り込みが挙げられ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロ若しくはエクスビボ投与）又は標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。

【0323】

核酸を細胞に送達するための様々な技法及び方法が、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、又はコアシェルナノ粒子に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化又はカチオン性脂質（若しくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性又は中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧ若しくはＰＥＧ－脂質コンジュゲート）、及び任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。

【0324】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを細胞に送達するための別の方法は、細胞により内在化されるリガンドと核酸を結合させることによる。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、形質膜陥入を介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合的に連結され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的なコンジュゲートは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／００６７４０号、同第ＷＯ２０１４／０２５８０５号、同第ＷＯ２０１２／０３７２５４号、同第ＷＯ２００９／０８２６０６号、同第ＷＯ２００９／０７３８０９号、同第ＷＯ２００９／０１８３３２号、同第ＷＯ２００６／１１２８７２号、同第ＷＯ２００４／０９０１０８号、同第ＷＯ２００４／０９１５１５号、及び同第ＷＯ２０１７／１７７３２６号に記載されている。

【0325】

核酸、及び本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、トランスフェクションによって細胞に送達することもできる。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、又はリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、及びＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が含まれるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス法を介して細胞に送達され得る。

【0326】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注射、注入、局所用途、及びエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時的であり、より効果的な反応を提供し得る。

【0327】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に記載されている方法により、造血幹細胞に送達することができる。

【0328】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞又は標的臓器への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（active pharmaceutical ingredient、ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。例示的なリポソーム及びリポソーム製剤は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２８９号及び同第ＷＯ２０１９／１１３３１０号に開示されており、例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」と題されたセクションを参照されたい。

【0329】

当該技術分野において既知の様々な送達方法又はその修正を使用して、本明細書に記載される合成プロセスを使用してインビトロ又はインビボで産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、又はレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化された細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、又は当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、又は肝臓細胞中に直接注射される。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金又はタングステン球状粒子（１～３μｍ直径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。

【0330】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター及び薬学的に許容される担体を含む組成物は、本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって所望される任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び関節内、又はそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って好適に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与レジメン及び投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、又は電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、若しくは超音波などの他の物理的方法によって投与され得る。

【0331】

場合によっては、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、内臓及び肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物及び粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注射によって送達される。

【0332】

場合によっては、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓又は腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、閉端ＤＮＡのサイズ及び濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、磁場を使用してマグネトフェクションによって送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞に濃縮する。

【0333】

場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセル又はカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、及び脂質－ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0334】

エキソソーム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、エキソソームに被包されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出される形質膜陥入起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ球、マスト細胞（mast cell、ＭＣ）、及び樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するエキソソームが使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、又は特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本開示のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。

【0335】

微粒子／ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５（３）：４９８－５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。

【0336】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満である直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満である直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。

【0337】

当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、及び同第９，５１８，２７２号に記載されている。

【0338】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、金ナノ粒子に共有結合的に結合され得るか、又は金ナノ粒子に非共有結合的に結合され得（例えば、電荷－電荷相互作用によって結合され）、例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）．Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５－１０８３によって説明される。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子－核酸コンジュゲートは、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載される方法を使用して産生される。

【0339】

コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、複合される（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（cell penetrating peptide、ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、及びポリアミン（例えば、スペルミン）にコンジュゲートし得る。細胞取り込みを増加させる薬剤の更なる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９に開示されている。

【0340】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）又は葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０００／３４３４３号及び同第２００８／０２２３０９号に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されるように、葉酸分子に複合される。

【0341】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されるように、炭水化物にコンジュゲートされる。

【0342】

ナノカプセル
代替的に、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。

【0343】

リポソーム
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞又は標的臓器への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。

【0344】

リポソームの形成及び使用は、一般に、当業者に既知である。向上された血清安定性及び循環半減期を有するリポソームが開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号）。更に、潜在的な薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、及び同第５，７９５，５８７号）。

【0345】

例示的なリポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。

【0346】

ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２８９号及び同第ＷＯ２０１９／１１３３１０号、並びに２０２１年７月１６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４０４３号に開示されており、本明細書に開示される方法及び組成物における使用が想定されている。

【0347】

いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物に対する親水性及び疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。又は、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧ又はＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであり得る。

【0348】

いくつかの態様では、本開示は、延長放出又は制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間～数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間～数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。

【0349】

いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリン及び本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、オプティソーム（optisome）を含む。

【0350】

いくつかの態様では、本開示は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコールコンジュゲート脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）、ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）、ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）、ＳＭ（スフィンゴミエリン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステロール（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、又はそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。

【0351】

いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びＰＥＧ化脂質を含有するリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基及びコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質コンジュゲート、及びコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。

【0352】

いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、及びエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、及びＤＯＰＥを含む。

【0353】

いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロース及び／又はグリシンを更に含むリポソーム製剤を提供する。

【0354】

いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０～２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。

【0355】

いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を添加することにより、本明細書に開示又は記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製及び負荷されるリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３まで増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に送る。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマー又は非ポリマー高電荷アニオン及びリポソーム内捕捉剤、例えば、ポリリン酸塩又はオクタ硫酸スクロースが利用される。

【0356】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクター、及びイオン化脂質を含む、脂質ナノ粒子を提供する。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２８９号に開示されるプロセスによって取得されたｃｅＤＮＡを用いて作製及び負荷される脂質ナノ粒子製剤。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合及び核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。

【0357】

一般に、脂質粒子は、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲内であり得る。脂質及びｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0358】

イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えば、ｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、及び膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。

【0359】

例示的なイオン化脂質は、国際特許出願公開第２０１５／０９５３４０号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１８／０１１６３３号、同第２０１７／０４９２４５号、同第２０１５／０６１４６７号、同第２０１２／０４０１８４号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１５／０７４０８５号、同第２０１６／０８１０２９号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１７／０７５５３１号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１１／０２２４６０号、同第２０１３／１４８５４１号、同第２０１３／１１６１２６号、同第２０１１／１５３１２０号、同第２０１２／０４４６３８号、同第２０１２／０５４３６５号、同第２０１１／０９０９６５号、同第２０１３／０１６０５８号、同第２０１２／１６２２１０号、同第２００８／０４２９７３号、同第２０１０／１２９７０９号、同第２０１０／１４４７４０号、同第２０１２／０９９７５５号、同第２０１３／０４９３２８号、同第２０１３／０８６３２２号、同第２０１３／０８６３７３号、同第２０１１／０７１８６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４８５３６号、同第２０１０／０８８５３７号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０６号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１２／０１６１８４号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１１／０００１０６号、同第２０１１／０００１０７号、同第２００５／１２０１５２号、同第２０１１／１４１７０５号、同第２０１３／１２６８０３号、同第２００６／００７７１２号、同第２０１１／０３８１６０号、同第２００５／１２１３４８号、同第２０１１／０６６６５１号、同第２００９／１２７０６０号、同第２０１１／１４１７０４号、同第２００６／０６９７８２号、同第２０１２／０３１０４３号、同第２０１３／００６８２５号、同第２０１３／０３３５６３号、同第２０１３／０８９１５１号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／０９５３４６、及び同第２０１３／０８６３５４号、並びに米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０１５１２８４号、同第２０１７／０２１０６９７号、同第２０１５／０１４００７０号、同第２０１３／０１７８５４１号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１５／０１４１６７８号、同第２０１５／０２３９９２６号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１７／０１１９９０４号、同第２０１２／０１４９８９４号、同第２０１５／００５７３７３号、同第２０１３／００９０３７２号、同第２０１３／０２７４５２３号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２００９／００２３６７３号、同第２０１２／０１２８７６０号、同第２０１０／０３２４１２０号、同第２０１４／０２００２５７号、同第２０１５／０２０３４４６号、同第２０１８／０００５３６３号、同第２０１４／０３０８３０４号、同第２０１３／０３３８２１０号、同第２０１２／０１０１１４８号、同第２０１２／００２７７９６号、同第２０１２／００５８１４４号、同第２０１３／０３２３２６９号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０２０２８７１号、同第２０１１／００７６３３５号、同第２００６／００８３７８０号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１５／００６４２４２号、同第２００６／００５１４０５号、同第２０１３／００６５９３９号、同第２００６／０００８９１０号、同第２００３／００２２６４９号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１０／００６２９６７号、同第２０１３／０２０２６８４号、同第２０１４／０１４１０７０号、同第２０１４／０２５５４７２号、同第２０１４／００３９０３２号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１６／０３１７４５８、及び同第２０１３／０１９５９２０号に記載されている。

【0360】

いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である：

【0361】

【化1】

からなる群から選択され得る。

【0362】

脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３に説明されている。

【0363】

いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０７４０８５号に記載されている脂質ＡＴＸ－００２である。

【0364】

いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０４０１８４号に記載されている（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。

【0365】

いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２に記載される化合物６又は化合物２２である。

【0366】

限定なく、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、又は４０～５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。

【0367】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質を更に含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。

【0368】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されるｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターを含む方法及び組成物における使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２８９号及び同第ＷＯ２０１９／１１３３１０号に記載されている。

【0369】

例示的な非カチオン性脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されている。

【0370】

非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。

【0371】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分を更に含み得る。

【0372】

脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際特許出願公開第２００９／１２７０６０号及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されている。

【0373】

ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。

【0374】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲートした脂質分子を更に含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－複合脂質である。例示的なＰＥＧ－脂質複合体としては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、並びに米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１６／０３７６２２４号、及び同第２０１７／０１１９９０４号に記載されている。

【0375】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号に開示された化合物である。

【0376】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５／０３７６１１５号又は同第２０１６／０３７６２２４号に開示されている。

【0377】

ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択され得る。

【0378】

ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオン性ポリマー－脂質は、国際特許出願公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第２００２／０８７５４１号、同第２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、及び第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、及び同第２０１１／０１２３４５３号、並びに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、及び同第６，５８６，５５９号に記載されている。

【0379】

いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、がんを治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、標的がん療法（小分子、抗体、又は抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質又は抗ウイルス化合物）であり得る。更に別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患又は障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、又は１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質又は異なる化合物（治療薬など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本開示の組成物及び方法で使用することができる。

【0380】

いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。

【0381】

本明細書では、脂質ナノ粒子に封入された合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物もまた提供される。

【0382】

いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。

【0383】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合体化するか、脂質ナノ粒子の脂質位置に封入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡを含むＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって、例えば、水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子において本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、若しくは６０分、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。

【0384】

ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。

【0385】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち、非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。限定なく、非二層の形態には、例えば、三次元の管、ロッド、立方対称などが含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特徴付けられ得る。

【0386】

いくつかの更なる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。

【0387】

脂質構成成分の組成物及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。

【0388】

製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関させることができる（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照されたい。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。

【0389】

ＶＩＩＩ．閉端ＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、様々な好適な方法によってインビトロ又はインビボで標的細胞に送達することができる。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターのみを適用又は注射することができる。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬又は他の物理的手段の助けなしに細胞に送達することができる。代替的に、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬又は他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔などを使用して送達され得る。

【0390】

別の実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳又は眼）に投与される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、及び前頭葉、皮質、基底核、海馬、及び偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、並びに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、網膜、角膜、及び／又は視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、更に、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。

【0391】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。

【0392】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、ＣＮＳの所望の領域又は区画への直接注射（例えば、定位注射）によって液体製剤で投与される。他の実施形態では、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。更なる代替として、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。更に追加の実施形態では、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy、ＳＭＡ）など）を治療、改善、及び／又は予防することができる。例として、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。

【0393】

ＩＸ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の使用
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生された組成物、及びｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを使用して、様々な目的で標的遺伝子又は導入遺伝子を発現させることができる。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態又は障害の治療、予防、又は改善に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする。得られる導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、又は機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、又は遺伝子の不適切な上方調節（得られる導入遺伝子が、その発現を抑制する、又は他の方法でその発現を低減させる）に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象において発現され得る。更に他の実施形態では、得られる導入遺伝子は、未変性遺伝子の欠陥コピーを置換又は補足する。導入遺伝子は、それ自体が転写される遺伝子のオープンリーディングフレームでなくてもよく、代わりに、それが標的遺伝子のプロモータ領域又はリプレッサ領域であってもよく、ｃｅＤＮＡベクターがそのような領域を修飾して、関心対象の遺伝子の発現をそのように調節してもよいことが、当業者によって理解されるであろう。

【0394】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における疾患状態の治療又は予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、又は機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。

【0395】

Ｘ．使用の方法
合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターはまた、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子）を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法において使用され得る。この方法は、特に導入遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するため、及び関心対象の疾患を治療するための方法であり得る。本開示は、導入遺伝子の発現の治療効果が生じるように、対象の細胞内のｃｅＤＮＡベクターにコードされる導入遺伝子、例えば、タンパク質、抗体、ｍｉＲＮＡなどの核酸などのインビボ発現を可能にする。これらの結果は、閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）送達のインビボ及びインビトロ両方の形態で見られる。

【0396】

加えて、本開示は、関心対象の核酸又は導入遺伝子を含む本開示の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の多回投与を含む、それを必要とする対象の細胞中の遺伝子編集分子の送達のための方法を提供する。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。

【0397】

合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）核酸は、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、静脈内（例えば、リポソーム製剤）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、筋肉内、及び他の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。

【0398】

閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の送達は、送達遺伝子置換に限定されない。例えば、本明細書に記載される合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）は、遺伝子療法の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用されてもよい。本開示に従って合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターと組み合わせることができる系の１つの非限定的な例は、導入遺伝子の効果的な遺伝子発現のために１つ以上の補因子又は免疫抑制因子を別々に送達する系を含む。

【0399】

本開示はまた、治療有効量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞又は組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。例えば、選択される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、上記及び本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。

【0400】

本明細書に提供される合成的に産生された組成物及びベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における疾患状態の治療又は予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、又は機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。

【0401】

原則として、発現カセットは、変異によって低減若しくは欠如しているタンパク質又はポリペプチドをコードする、又は過剰発現が本開示の範囲内であると考えられるときに、治療効果をもたらす核酸又は任意の導入遺伝子を含み得る。

【0402】

合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なる導入遺伝子、又は異なるプロモータ若しくはシス調節エレメントに操作可能に連結されるが同じ導入遺伝子を含む複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、又は対象に同時に又は順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数の遺伝子の遺伝子療法又は遺伝子送達を同時に行うことができる。導入遺伝子の異なる部分を別々のｃｅＤＮＡベクターに分離することも可能であり（例えば、導入遺伝子の機能に必要な異なるドメイン及び／又は補因子）、同時に又は異なる時間に投与することができ、別々に調節可能であり得、それによって追加レベルの導入遺伝子の発現の制御を付加する。送達はまた、複数回、及び重要なことに、ウイルスカプシドの不在に起因する抗カプシド宿主免疫応答の欠失を仮定して、後に増加又は減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド応答は起こらないと予想される。

【0403】

本開示はまた、治療有効量の本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞又は組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに作動可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、上記及び本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。

【0404】

ＸＩ．治療方法
本明細書に記載される技術はまた、開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、並びにそれを様々な方法（例えば、原位置外、インビトロ及びインビボ適用、方法論、診断手順、並びに／又は遺伝子療法レジメン）で使用する方法を実証する。

【0405】

治療有効量の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞若しくは組織、又は他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、上記及び本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。

【0406】

１種以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、又は賦形剤とともに本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの１つ以上を含む、ｃｅＤＮＡベクター組成物及び製剤が、本明細書で開示される。そのような組成物は、疾患、傷害、障害、外傷、又は機能不全の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための、１つ以上の診断的又は治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、又は機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、又は機能不全である。

【0407】

本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的又は治療的に有効な量の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、又は器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的又は治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を対象に提供することを含む。更なる態様では、対象は、ヒトである。

【0408】

本明細書に記載される技術の別の態様は、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための量及び時間にわたって投与するステップを含む。更なる態様では、対象は、ヒトである。

【0409】

別の態様は、疾患又は疾患状態の１つ以上の症状を治療又は低減するためのツールとしての、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節又は構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、いくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデル系において病態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その病態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター及び方法は、遺伝性疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、疾患状態は、疾患を引き起こす、又はそれをより重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は全体的に修繕することによって治療される。

【0410】

宿主細胞
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象の宿主細胞に導入遺伝子を送達する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４^＋細胞、肝細胞、がん細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼若しくは網膜細胞、上皮若しくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、又は哺乳動物起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、若しくは遺伝子療法が企図される対象のいずれか１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。

【0411】

本開示はまた、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む、上記のような組換え宿主細胞に関する。したがって、当業者には明らかであるように、目的に応じて複数の宿主細胞を使用することができる。ドナー配列を含む構築物又は合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入して、ドナー配列が、前述のように染色体組み込み体として維持されるようにする。宿主細胞という用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ドナー配列及びその供給源に大きく依存する。宿主細胞はまた、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞などの真核生物であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、幹細胞、又は不死化細胞株）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターをエクスビボで投与され、次いで遺伝子療法事象の後に対象に送達され得る。宿主細胞は、任意の細胞型、例えば、体細胞又は幹細胞、人工多能性幹細胞、又は血液細胞、例えば、Ｔ細胞若しくはＢ細胞、又は骨髄細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、同種細胞である。例えば、Ｔ細胞ゲノム操作は、がん免疫療法、ＨＩＶ療法（例えば、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５などの受容体ノックアウト）などの疾患調整、及び免疫不全療法に有用である。Ｂ細胞上のＭＨＣ受容体は、免疫療法の標的となり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾型宿主細胞、例えば、骨髄幹細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞、又は人工多能性幹細胞を、治療用タンパク質の発現のために患者に移植して戻すことができる。

【0412】

ｃｅＤＮＡベクターで治療される例示的な導入遺伝子及び疾患
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターはまた、欠陥遺伝子を訂正するために有用である。非限定的な例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのＤＭＤ遺伝子は、本明細書に開示されるように合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して送達することができる。

【0413】

合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター又はその組成物は、任意の遺伝性疾患の治療に使用され得る。非限定的な例として、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター又はその組成物は、例えば、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、変異体タンパク質が神経、心臓、胃腸系などでミスフォールドして凝集する奇病の治療に使用することができる。本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、変異体疾患遺伝子（ｍｕｔＴＴＲ）の欠失によって疾患を治療できることが本明細書で企図される。遺伝性疾患のそのような治療は、疾患の進行を止めることができ、確立された疾患の後退又は疾患の少なくとも１つの症状の少なくとも１０％の低減を可能にし得る。

【0414】

別の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター又はその組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、高アンモニア血症、又は新生児若しくは幼児のアンモニアを解毒する能力を損なう他の尿素サイクル障害の治療に使用することができる。先天性代謝の全ての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）、ＯＴＣ欠乏症を有する対象の少なくとも１つの症状ＯＴＣの低減及び／又は生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、ＯＴＣをコードする核酸は、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモータの後ろに挿入され得る。

【0415】

別の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター又はその組成物を、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸配列を送達することによるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療において使用して、ＰＫＵ患者に毒性であり得る食事性フェニルアラニンの蓄積を低減することができる。先天性代謝の全ての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）、ＰＫＵを有する対象のＰＫＵの少なくとも１つの症状の低減及び／又は生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモータの後ろに挿入することができる。

【0416】

別の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター又はその組成物は、酵素をコードする核酸配列を送達して、ＧＳＤを有する対象における異常なグリコーゲン合成又は分解を訂正することによる、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）の治療に使用され得る。本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター及び方法を使用して送達及び発現され得る酵素の非限定的な例には、グリコーゲンシンターゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、酸－アルファグルコシダーゼ、グリコーゲン分岐酵素、グリコーゲン分岐酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋肉ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコース輸送体－２（ＧＬＵＴ－２）、アルドラーゼＡ、ベータ－エノラーゼ、ホスホグルコムターゼ－１（ＰＧＭ－１）、及びグリコゲニン－１が含まれる。先天性代謝の全ての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）、ＧＳＤを有する対象のＧＳＤの少なくとも１つの症状の低減及び／又は生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、異常なグリコーゲン貯蔵を訂正するために酵素をコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモータの後ろに挿入することができる。

【0417】

本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターはまた、レーバー先天性黒内障（Leber Congenital Amaurosis、ＬＣＡ）、ポリＱリピートを含むポリグルタミン病、及びアルファ－１アンチトリプシン欠乏症（Ａ１ＡＴ）のうちのいずれかの治療における使用に企図されている。ＬＣＡは、失明を引き起こす稀な先天性眼疾患であり、以下の遺伝子：ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＬＣＡ５、ＲＰＧＲＩＰ１、ＣＲＸ、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、ＣＥＰ２９０、ＩＭＰＤＨ１、ＲＤ３、ＲＤＨ１２、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＫＣＮＪ１３、ＧＤＦ６、及び／又はＰＲＰＨ２のうちのいずれか１つにおける変異によって引き起こされ得る。本明細書では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター及び組成物及び方法が、ＬＣＡの症状の原因である遺伝子のエラーを訂正するために、ＬＣＡに関連する１つ以上の遺伝子の送達に適合され得ることが企図される。ポリグルタミン病には、歯列核淡蒼球ルイ体萎縮症、ハンチントン病、脊髄及び球根筋萎縮症、並びに脊髄小脳失調１型、２型、３型（マシャド・ジョセフ病としても知られている）、６型、７型、及び１７型が含まれるが、これらに限定されない。Ａ１ＡＴ欠乏症は、アルファ－１アンチトリプシンの産生不良を引き起こす遺伝性障害であり、血液及び肺での酵素活性の低下を招き、次にそれが罹患した対象の肺気腫又は慢性閉塞性肺疾患につながり得る。本明細書に概説されるようなｃｅＤＮＡベクター又はその組成物を使用するＡ１ＡＴ欠損症を有する対象の治療が、本明細書で具体的に企図される。本明細書では、ＬＣＡ、ポリグルタミン病又はＡ１ＡＴ欠損症の治療のための所望のタンパク質をコードする核酸を含むｃｅＤＮＡベクターを、治療を必要とする対象に投与できることが企図される。

【0418】

更なる実施形態では、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を使用して、とりわけウイルス配列、病原体配列、染色体配列、転座接合部（例えば、がんに関連する転座）、非コードＲＮＡ遺伝子又はＲＮＡ配列、疾患関連遺伝子を送達することができる。

【0419】

関心対象の任意の核酸又は標的遺伝子は、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって送達又は発現され得る。標的核酸及び標的遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、又は非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲｓなど）、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、若しくは獣医用途用）、又は免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって標的とされる標的核酸又は標的遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせをコードする。

【0420】

特に、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによる発現のための遺伝子標的又は導入遺伝子は、例えば、限定されないが、疾患、機能不全、傷害、及び／又は障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、及び／又は改善における使用のための、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、抗原結合断片、並びにそのバリアント、及び／又は活性断片をコードし得る。一態様では、疾患、機能不全、外傷、傷害、及び／又は障害は、ヒト疾患、機能不全、外傷、傷害、及び／又は障害である。

【0421】

発現カセットはまた、ポリペプチド、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験又は診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のものを含み得る。

【0422】

発現カセット、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、宿主細胞に最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウス又はヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公開データベースを使用して決定することができる。

【0423】

多くの生物は、特定のコドンを使用して、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする偏向を示す。生物間のコドン使用頻度の違いであるコドン優先又はコドン偏向は、遺伝暗号の縮退によってもたらされ、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドン偏向は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係があることが多く、特に翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。

【0424】

多種多様な動物、植物、及び微生物種で利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。

【0425】

本明細書に記載されるように、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、タンパク質若しくはペプチド、又は治療核酸配列をコードすることができ、又は治療剤としては、１種以上のアゴニスト、アンタゴニスト、抗アポトーシス因子、阻害剤、受容体、サイトカイン、細胞毒、エリスロポエチン剤、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、神経増殖因子、向神経活性ペプチド、向神経活性ペプチド受容体、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、酵素、受容体結合タンパク質、輸送タンパク質若しくはその１種以上の阻害剤、セロトニン受容体、又はその１種以上の取り込み阻害剤、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制剤、診断的分子、化学療法剤、細胞毒、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0426】

合成的に産生されたｃｅＤＮＡ遺伝子ベクターはまた、遺伝子発現の除去にも有用である。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸又は機能的ＲＮＡを発現させ、標的遺伝子のノックダウンを誘導することができる。非限定的な例として、ＨＩＶ受容体であるＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５の発現は、初代ヒトＴ細胞において首尾よく切除されており、Ｓｃｈｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５），ＰＮＡＳ １１２（３３）：１０４３７－１０４４２を参照されたい。標的化阻害の別の遺伝子はＰＤ－１であり、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、阻害核酸又はＲＮＡｉ又は機能的ＲＮＡを発現させてＰＤ－１の発現を阻害することができる。ＰＤ－１は、悪性腫瘍で起こる慢性的に活性なＴ細胞に免疫チェックポイント細胞表面受容体を発現する。Ｓｃｈｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい。

【0427】

いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、罹患した遺伝子を標的とする導入遺伝子を発現させることによって、欠陥遺伝子を訂正するために有用である。本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによる治療の影響を受けやすい疾患又は障害の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１７０７５３号のそれらの遺伝子及びそれらの関連遺伝子とともに表Ａ～Ｃに列挙されている。

【0428】

代替的な実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、セーフハーバー遺伝子、例えば、不活性イントロンにおける治療用タンパク質又はレポータータンパク質の発現のための発現カセットの挿入に使用される。ある特定の実施形態では、プロモータレスカセットが、セーフハーバー遺伝子に挿入される。そのような実施形態では、プロモータレスカセットは、セーフハーバー遺伝子調節エレメント（プロモータ、エンハンサ、及びシグナル伝達ペプチド）を利用することができ、セーフハーバー遺伝子座での挿入の非限定的な例は、Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（１５）：１７７７－１７８４に記載されているアルブミン遺伝子座への挿入である。アルブミンへの挿入は、血液への導入遺伝子の分泌を可能にするという利点を有する（例えば、実施例２２を参照）。加えて、ゲノムセーフハーバー部位は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，ＥＲ＆Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２４（４）：６７８－６８４（２０１６）又はＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １２：５１－５８（２０１２）に説明されている技術を使用して決定され得る。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムのセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位）は、本明細書に記載される方法及び組成物とともに使用され得る（例えば、Ｏｃｅｇｕｅｒａ－Ｙａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１：４３－５５（２０１６）又はＴｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １２（３）：６３０－７（２０１４）を参照されたい）。例えば、ＡＡＶＳ１ゲノムセーフハーバー部位は、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）における造血特異的導入遺伝子発現及び遺伝子サイレンシングの目的のために、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター及び組成物とともに使用することができる。加えて、染色体１９上のＡＡＳＶ１セーフハーバー部位に挿入するための、合成又は市販の相同性指向修復ドナー鋳型を、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクター又は組成物とともに使用できることが本明細書において企図される。例えば、相同性指向修復鋳型、及びガイドＲＮＡは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から商業的に購入し、ｃｅＤＮＡベクターにクローニングすることができる。

【0429】

いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子を発現させるか、又はＴ細胞中の標的遺伝子をノックアウトする若しくはその発現を減少させるために、例えば、養子細胞移入及び／又はＣＡＲ－Ｔ治療の改善のためにＴ細胞を操作するために使用される（例えば、実施例２４を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子をノックアウトする導入遺伝子を発現させることができる。Ｔ細胞の治療的に関連するノックアウトの非限定的な例は、ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（３３）：１０４３７－１０４４２に記載されている。

【0430】

遺伝子療法のための追加の疾患
一般に、上記の説明に従って本明細書に開示される合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、又は改善することができる。例示的な疾患状態としては、嚢胞性線維症（及び他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症及び他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経障害、がん、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（及び他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーバー遺伝性視神経萎縮症（Leber's hereditary optic neuropathy、ＬＨＯＮ）、リー症候群、及び亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）及び心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個体の治療において有利に使用され得る。

【0431】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、遺伝子又は遺伝子産物中の変異によって引き起こされる疾患又は障害を治療、改善、及び／又は予防することができる。ｃｅＤＮＡベクターで治療することができる例示的な疾患又は障害としては、代謝性疾患又は障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（phenylketonuria、ＰＫＵ）、糖原病）；尿素サイクル疾患又は障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ornithine transcarbamylase、ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積症又は障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（metachromatic leukodystrophy、ＭＬＤ）、ＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳＩＩ；ハンター症候群））；肝臓の疾患又は障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（progressive familial intrahepatic cholestasis、ＰＦＩＣ）；血液疾患又は障害（例えば、血友病Ａ及びＢ、サラセミア、並びに貧血）；がん及び腫瘍、並びに遺伝性疾患又は障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0432】

なおも更なる態様として、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモン又は増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。

【0433】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患又は障害をもたらす遺伝子産物の異常なレベル及び／又は機能（例えば、タンパク質中の非存在又は欠損）を訂正することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を産生し、かつ／又はタンパク質のレベルを修正して、タンパク質中の不在若しくは欠損によって引き起こされる特定の疾患若しくは障害から生じる症状を緩和若しくは低減するか、又は利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成することができ；血友病Ａ及びＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子のレベルを改変することによって達成することができ；ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを改変することによって達成することができ；ファブリー病又はゴーシェ病の治療は、機能的なアルファガラクトシダーゼ又はベータグルコセレブロシダーゼをそれぞれ産生することによって達成することができ；ＭＬＤ又はＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ、機能的アリールスルファターゼＡ又はイズロン酸－２－スルファターゼを産生することによって達成することができ；嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症膜貫通調節因子を産生することによって達成することができ；糖原病の治療は、機能的なＧ６Ｐａｓｅ機能を回復させることによって達成することができ；ＰＦＩＣの治療は、機能的なＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成することができる。

【0434】

代替的な実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸をインビトロ又はインビボで細胞に提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸又はＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子又はアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。

【0435】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、タイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、又はハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、並びにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子－３及び４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－α及び－βなど）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、目的の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で定義されるように、全長抗体又は抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、及び腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、及び腫瘍抑制因子遺伝子産物をコードする。

【0436】

代表的な実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における治療のために使用され得る。この方法は、治療、改善、又は予防に有効な量の、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸をコードするジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩカッパＢ優性変異体、サルコスパン、ウトロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチン若しくはミオスタチンポリペプチドに対する抗体若しくは抗体断片、及び／又はミオスタチンに対するＲＮＡｉを含む。特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の別の場所に記載されるように、骨格筋、横隔膜筋、及び／又は心筋に投与され得る。

【0437】

いくつかの実施形態では、通常は血液中で循環するポリペプチド（例えば、酵素）若しくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のため、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＶＩＩＩ）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など）又はリソソーム蓄積症（ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸アルファ－グルコシダーゼ］若しくはファブリー病［アルファ－ガラクトシダーゼＡ］）又はグリコーゲン蓄積疾患（ポンペ病［リソソーム酸アルファグルコシダーゼ）を治療、改善、及び／又は予防するための他の組織への全身送達のため、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、導入遺伝子を骨格筋、心筋、又は横隔膜筋に送達することができる。代謝障害を治療、改善、及び／又は予防するための他の好適なタンパク質は、上に記載される。

【0438】

他の実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、代謝障害の治療、改善、及び／又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法において、導入遺伝子を送達することができる。例示的な代謝障害及びポリペプチドをコードする導入遺伝子が、本明細書に記載される。任意選択的に、ポリペプチドが分泌される（例えば、その未変性状態の分泌ポリペプチドであるポリペプチド、又は例えば、当該技術分野において既知のような分泌シグナル配列との操作可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。

【0439】

本開示の別の態様は、それを必要とする対象において先天性心不全又はＰＡＤを治療、改善、及び／又は予防する方法であって、本明細書に記載の合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを哺乳動物対象に投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターが、例えば、筋小胞体Ｃａ^２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ、ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害剤又はドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガープロテイン、β２－アドレナリン作動性受容体、ベータ２－アドレナリン作動性受容体キナーゼ（．ｂｅｔａ．２－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ、ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、ｃａｌｓａｒｃａｎ、ベータ－アドレナリン作動性受容体キナーゼ阻害剤（．ｂｅｔａ．－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、βＡＲＫｃｔ）、プロテインホスファターゼ１の阻害剤１、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、切断された構成的に活性なβＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、サイモシン－β４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６及び／又はｍｉｒ－２０８などの、Ｇ－タンパク質結合受容体キナーゼ２型のノックダウンをもたらす分子をコードする導入遺伝子を含む。

【0440】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを、任意の好適な手段によって、任意選択的に、ｃｅＤＮＡベクターを含む呼吸域粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与することができ、これを対象が吸入する。呼吸域粒子は、液体又は固体であり得る。ｃｅＤＮＡベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に既知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器又は超音波噴霧器を用いるなど、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において既知の技法によって、任意の固体粒子薬剤エアロゾル生成器を用いて同様に産生され得る。

【0441】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害、及び腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療、改善、又は予防するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊椎又は頭部傷害に起因する外傷、タイ・サック病、リーシュ・ナイアン病、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、抑うつ、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存（例えば、アルコール依存及び他の薬物依存）、ノイローゼ（例えば、不安症、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲痛、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚及び妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食又は体重障害（例えば、肥満、悪液質、拒食症、及び過食症）、並びにＣＮＳのがん及び腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0442】

本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターで治療、改善、又は予防され得る眼障害としては、網膜、後視床路、及び視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、及び他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。多くの眼科疾患及び障害は、（１）血管新生、（２）炎症、及び（３）変性の３タイプの適応症の１つ以上に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、抗血管新生因子、抗炎症因子、細胞の変性を遅らせるか、細胞温存を促進するか、又は細胞増殖を促進する因子、及び前述のものの組み合わせを送達するために用いることができる。糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体内）又は眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかで１つ以上の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つ以上の神経栄養因子を、眼内（例えば、硝子体内）又は眼周囲のいずれかに共送達することもできる。本開示のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、又は予防され得る追加の眼疾患としては、地図状萎縮、血管性又は「滲出型」黄斑変性、スタルガルト病、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（pseudoxanthoma elasticum、ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（x-linked retinitis pigmentosa、ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（x-linked retinoschisis、ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（Leber hereditary optic neuropathy、ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、並びに眼のがん及び腫瘍が挙げられる。

【0443】

いくつかの実施形態では、炎症性眼疾患又は障害（例えば、ブドウ膜炎）は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、又は予防され得る。１つ以上の抗炎症因子は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体又は前眼房）投与によって発現され得る。他の実施形態では、網膜変性（例えば、網膜色素変性症）を特徴とする眼の疾患又は障害は、本開示のｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、又は予防され得る。１つ以上の神経栄養因子をコードする、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体投与）を使用して、そのような網膜変性に基づく疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、血管新生及び網膜変性（例えば、加齢性黄斑変性）の両方に関与する疾患又は障害は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターで治療され得る。加齢性黄斑変性は、眼（例えば、硝子体）内に１つ以上の神経栄養因子及び／又は眼内若しくは眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に１つ以上の抗血管新生因子をコードする、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを投与することによって治療され得る。緑内障は、増加した眼圧及び網膜神経節細胞の喪失を特徴とする。緑内障の治療は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１つ以上の神経保護剤の投与を含む。したがって、そのような薬剤としては、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、及び神経栄養因子は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、眼内、任意選択的に硝子体内に送達され得る。

【0444】

他の実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、発作を治療する、例えば、発作の徴候、発生率、又は重症度を低減することができる。発作の治療的処置の有効性は動作的（例えば、揺動、眼若しくは口のチック）及び／又は電子記録的手段（ほとんどの発作は、顕著な電子記録的異常を有する）によって評価され得る。したがって、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、経時的に複数の発作によってマークされる癲癇を治療することもできる。代表的な一実施形態では、脳下垂体腫瘍を治療するために、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、ソマトスタチン（又はその活性断片）が脳に投与される。この実施形態に従い、ソマトスタチン（又はその活性断片）をコードする本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、脳下垂体への微小注入によって投与される。同様に、そのような治療を使用して、末端肥大症（脳下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療することができる。当該技術分野において既知である、ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）及びアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；処理された活性ペプチドソマトスタチン－２８及びソマトスタチン－１４を含有する）配列。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含む導入遺伝子をコードすることができる。

【0445】

本開示の別の態様は、インビボでの対象への全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、又は他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生するための、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターの使用に関する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されている）、スプライソソーム媒介トランススプライシングに影響を及ぼすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、及び同第６，０８３，７０２号を参照されたい）、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１参照）、又は「ガイド」ＲＮＡなどの他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９、Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードする導入遺伝子を含み得る。

【0446】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターはまた、レポーターポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質又はアルカリホスファターゼなどの酵素）をコードする導入遺伝子を更に含み得る。いくつかの実施形態では、実験又は診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、又はそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。

【0447】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、宿主染色体と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み替える、導入遺伝子又は異種ヌクレオチド配列を含み得る。このアプローチを利用して、宿主細胞中の遺伝子欠陥を訂正することができる。

【0448】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象における免疫原性ポリペプチドを発現するため、例えば、ワクチン接種のために使用され得る導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、当該技術分野において既知の関心対象の任意の免疫原をコードし得、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウイルス抗原などからの免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。

【0449】

ｃｅＤＮＡベクターを使用する良好な遺伝子発現の試験
当該技術分野において周知のアッセイを使用して、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによる遺伝子送達の効率を試験することができ、インビトロ及びインビボの両方のモデルで実施され得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡによる所望の導入遺伝子のノックイン又はノックアウトは、所望の導入遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを測定することによって（例えば、逆転写ＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））当業者により評価され得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡによる核酸変更（例えば、点変異、ＤＮＡ領域の欠失）は、ゲノム標的ＤＮＡのディープシーケンシングによって評価することができる。一実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡは、例えば、蛍光顕微鏡法又は発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、所望の導入遺伝子の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与の遺伝子及び／又は遺伝子産物の機能を試験して、遺伝子発現が成功したかどうかを判断することができる。例えば、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子遺伝子（ＣＦＴＲ）の点変異は、アニオン（例えば、Ｃｌ^－）をアニオンチャネルを介して移動させるＣＦＴＲの能力を阻害し、機能的（すなわち、非変異型）ＣＦＴＲ遺伝子をｃｅＤＮＡベクターとともに対象に送達することによって訂正され得ることが想定される。ｃｅＤＮＡベクターの投与後、当業者は、アニオンがアニオンチャネルを通って移動する能力を評価して、ＣＦＴＲ遺伝子が送達及び発現されたかどうかを決定することができる。当業者は、インビトロ又はインビボでタンパク質の機能性を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。

【0450】

本明細書では、細胞又は対象におけるｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の遺伝子発現の効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年にわたって継続し得るか、又は永続的であり得ることが企図される。

【0451】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、又はｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えば、マウス又はヒト（例えば、ヒト化された）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）又は別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。

【0452】

ＸＩＩ．投与
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４回以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。

【0453】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、及び／又は心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、及び動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面への、並びに経皮投与）、リンパ内など、並びに直接組織又は器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、若しくは脳への）が挙げられる。

【0454】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、及び眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍又はリンパ節内又はその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、及び／又は予防される病態の性質及び重症度、並びに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存するであろう。追加的に、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡは、単一のベクター又は複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に複数の導入遺伝子を投与できるようにする。

【0455】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの、本開示に従う骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、及び／又は下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意選択的に、脚及び／若しくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照）並びに／又は直接筋肉内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意選択的に単離された四肢灌流（例えば、静脈内又は動脈内投与による）によって投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、「流体力学的」技法を用いることなく投与され得る。

【0456】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの、心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、及び／又は中隔への投与が挙げられる。本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、及び／又は冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、及び／又はその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。

【0457】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、及び／又は心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー又は心疾患（例えば、ＰＡＤ若しくはうっ血性心不全）を治療、改善、及び／又は予防するため）。

【0458】

エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボの治療のために対象から細胞を取り出し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号参照）。代替的に、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、又は任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。

【0459】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは、薬学的担体と組み合わせて「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全又は治癒的である必要はないことを理解するであろう。

【0460】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、望ましくはインビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞中で産生される任意のポリペプチドである、導入遺伝子（時には異種ヌクレオチド配列と呼ばれる）をコードすることができる。例えば、本明細書で前述される治療の方法におけるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、例えば、抗原又はワクチンの産生のために、培養した細胞、及びそれから単離された発現遺伝子産物中に導入されてもよい。

【0461】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、獣医学及び医療の両方の用途で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、及びキジ）及び哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、及びウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、年少者、及び成人を含む。

【0462】

本明細書に記載される技術の一態様は、導入遺伝子を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビトロ方法では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを、本明細書に開示される方法及び当該技術分野において既知の他の方法を使用して細胞に導入することができる。本明細書に開示されている、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、好ましくは、生物学的に有効な量で細胞に投与される。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的に有効な量は、標的細胞における導入遺伝子の形質導入及び発現をもたらすのに十分な量である。

【0463】

用量範囲
インビボ及び／又はインビトロアッセイを任意選択的に用いて、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路及び病態の重症度に依存し、当業者の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれた用量反応曲線から推定され得る。

【0464】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されたもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。

【0465】

特定の「治療効果」を達成するために必要な合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子又はＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患又は障害、及び遺伝子、ＲＮＡ産物、又は得られる発現タンパク質の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子並びに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患又は障害を有する患者を治療するための合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。

【0466】

最適な治療応答を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、数回用量が毎日投与され得るか、又は治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、又は対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量及びスケジュールを容易に判定することができるであろう。

【0467】

「治療有効量」又は「治療有効用量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注射は、多量を必要とする）であろう。例えば、ヒト対象の骨格筋又は心筋への直接インビボ注射の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ～１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなるであろう。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターを送達するためにエキソソーム又は微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ～約１００ｇのベクターを送達することが予想される。更に、治療有効量とは、疾患の１つ以上の症状の低減をもたらすが、著しいオフターゲット又は著しい有害副作用には至らない、対象に影響を与えるのに十分な量の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量である。

【0468】

薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与及び治療計画の開発と同様に、当業者に周知である。

【0469】

インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０^６細胞）に送達される、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１～１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１～２０μｇ、より好ましくは１～１５μｇ又は８～１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とするであろう。エキソソーム又は微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定され得るが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。

【0470】

治療は、単一用量又は複数回用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、２回以上の用量が対象に投与され得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの非存在に起因して、抗カプシド宿主免疫反応を誘起する誘起せず、その製剤は、その合成産生に起因して望ましくない細胞汚染物質を含有しないため、実際に、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１～１００、好ましくは２～２０用量であり得る。

【0471】

任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の非存在）は、複数の場合に合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与できるようになる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２～１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）である。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、１０回より多く対象に送達される。

【0472】

いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、又は７暦日当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、暦週（例えば、７暦日）当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月当たり１回（例えば、３０暦日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、暦年（例えば、３６５日又は閏年では３６６日）当たり１回だけ対象に投与される。

【0473】

単位剤形
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、医薬組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。

【0474】

ＸＩＩＩ．様々な適用
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生された組成物及び閉端ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクターを含む）を使用して、上記のような様々な目的で導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質をコードするか、又は機能的ＲＮＡであり得、いくつかの実施形態では、研究目的、例えば、１つ以上の変異を有する体細胞トランスジェニック動物モデルを創り出すため、例えば、標的遺伝子の機能を研究するために修飾されたタンパク質又は機能的ＲＮＡであり得る。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを創り出すためにタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする。

【0475】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における病態の治療、改善、又は予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子は、異常な遺伝子配列に関連する疾患を治療するのに十分な量で患者に投与され得、これは標的遺伝子の発現の低減、発現の欠如、又は機能不全のうちのいずれか１つ以上をもたらし得る。

【0476】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、診断及びスクリーニング方法における使用のために想定され、これにより導入遺伝子は、細胞培養系又は代替的にトランスジェニック動物モデルにおいて一時的に又は安定して発現される。

【0477】

本明細書に記載される技術の別の態様は、哺乳動物細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。

【0478】

追加的に、本開示は、１つ以上の追加の成分で配合されるか、又はそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクター組成物を含む開示された閉端ＤＮＡのうちの１つ以上を含む、組成物、並びに治療及び／又は診断キットを提供する。

【0479】

本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターが投与される細胞は、任意のタイプのものであり得、神経細胞（末梢及び中枢神経系の細胞、特に脳細胞を含む）、肺細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、胃及び呼吸器上皮細胞）、筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。更なる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。なおも更なる代替として、細胞は、がん又は腫瘍細胞であり得る。更に、細胞は、上に示されるように、任意の種の起源に由来し得る。

【実施例】

【0480】

以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、本明細書に記載される野生型又は修飾型ＩＴＲのうちのいずれかを含む、対称又は非対称ＩＴＲ構成のうちのいずれかから構築され得ること、及び以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターを構築し、その活性を評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターを含む任意のＤＮＡベクターに適用可能である。

【0481】

実施例１：ｃｅＤＮＡの昆虫細胞ベースの産生
比較目的のため、実施例１は、昆虫細胞ベースの方法及びポリヌクレオチド構築物鋳型を使用するｃｅＤＮＡベクターの産生を記載し、また国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／０５１２５５号の実施例１にも記載される。例えば、実施例１に従って本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物鋳型は、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）及び発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物鋳型は、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、鋳型骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からの鋳型の切除（「レスキュー」）、及び第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。

【0482】

昆虫細胞を使用する方法でｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物鋳型は、左ＩＴＲ及び右ＩＴＲの両方を含む（両方とも、図１Ａの野生型であり、対称の実質的に対称なＩＴＲ、図１Ｂの非対称ＩＴＲを産生する）ＩＴＲ配列間に以下のものを含む：（ｉ）エンハンサ／プロモータ；（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位；（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））；及び（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａ及び図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入され、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）及びＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中で操作される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。

【0483】

ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミド又は制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミド及びトランスポサーゼプラスミドの形質転換体及び維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍｌの培地中で培養した。

【0484】

組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを、Ｅ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍｌの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞又は細胞残屑から分離した。

【0485】

任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍｌの培地中で増幅させた。オービタルシェーカ培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径及び約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に到達するまで、細胞直径及び生存率をモニタリングした。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に採取し、細胞及び残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。

【0486】

試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性又は力価を決定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌの４×２０ｍｌ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日決定した。

【0487】

「Ｒｅｐ－プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３３８５号の配列番号１３１若しくは１３３）又はＲｅｐ６８（ＷＯ２０１９／１４３３８５の配列番号１３０）及びＲｅｐ５２（ＷＯ２０１９／１４３３８５の配列番号１３２）又はＲｅｐ４０（ＷＯ２０１９／１４３３８５の配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生された。Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍｌの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）中に播種した。組換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。

【0488】

Ｓｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍｌの培地中で４日間培養し、感染性組換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス」）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍｌの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、又は濾過若しくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を決定した。具体的には、２．５×１０^６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日決定した。

【0489】

ｃｅＤＮＡベクター生成及び特徴付け
次いで、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミド又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを含有する試料、及び（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌ、２０ｍｌ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００及び１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径及び生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達した場合、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを回収した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水又は緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラム当たり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。

【0490】

Ｓｆ９昆虫細胞から産生及び精製されるｃｅＤＮＡベクターの収量は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。精製されたｃｅＤＮＡベクターは、実施例７に記載される電気泳動方法論を使用して、適切な閉端構成について評価され得る。

【0491】

実施例２：二本鎖ＤＮＡ構築物のための鋳型としての基本ベクターの調製
５’－ＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号４２）の配列を有するフォワードプライマ及び５’－ＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣ－３’（配列番号４３）の配列を有するリバースプライマを使用して、アンピシリン耐性遺伝子及び複製起源構成要素を含有するｐＵＣ１９プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の骨格が増幅される。ＰＣＲ増幅産物は、Ｆａｓｔ ＤｉｇｅｓｔＤｐｎＩで処理されて、鋳型を排除し、次いで、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製される。

【0492】

別に、２つの合成されたｇＢｌｏｃｋ（商標）ＤＮＡ断片が提供される（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。これらのｇＢｌｏｃｋ（商標）断片は、ｐＵＣ１９骨格を有する相同領域（配列番号４４及び配列番号４５）、部分ＩＴＲ配列（Ａ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域、例えば、表５参照）、２つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位、左及び右スペーサ領域（例えば、表２参照）、並びに導入遺伝子発現カセットがクローニングされる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を分離する役割を果たすランダムヌクレオチド配列を有するプレースホルダー領域などのいくつかの重要な構成要素を含有した。例えば、図２に示される例示的な基本ベクタープラスミド１１は、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩ認識部位を分離する役割を果たすランダムヌクレオチド配列を有する２００ｂｐのスペーサであるプレースホルダーＳｐ２００＿ＣＧ５００を有する。プレースホルダーＳｐ２００＿ＣＧ５００は、第ＶＩＩＩ因子発現導入遺伝子発現カセットで置換されて、実施例３に記載されるように構築物１を産生する。

【0493】

【表4】

【0494】

【表5】

【0495】

相同性クローニングを介して、増幅されたｐＵＣ１９骨格及び２つのｇＢｌｏｃｋ（商標）断片がライゲーションされ、ライゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で形質転換するために使用され、選択培地上でプレーティングされる。いくつかのコロニーがプレートから選択され、コロニーから精製されたプラスミドＤＮＡが検証のために配列決定される。基本ベクターは、実施例３に記載される二本鎖構築物の調製のための鋳型としての役割を果たす。

【0496】

実施例３：ｃｅＤＮＡの無細胞合成のための鋳型としての二本鎖ＤＮＡ構築物の調製
概要
導入遺伝子発現カセットを含有するインサートが、複製を可能にするｒｅｐ起源、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するマルチクローニング部位、及び抗生物質耐性遺伝子などの、選択を可能にする少なくとも１つの遺伝子を有する基本ベクターから切除される、二本鎖ＤＮＡ構築物。図２は、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩ認識部位を分離する役割を果たすランダムヌクレオチド配列を有する２００ｂｐスペーサであるプレースホルダー領域Ｓｐ２００＿ＣＧ５００と、左及び右スペーサと、ｃｅＤＮＡの無細胞合成を容易にする左及び右部分ＩＴＲと、ｒｅｐ起源と、ベクターにアンピシリン耐性を付与するｂｌａコード配列と、を有する、例示的な基本ベクター、プラスミド１１のマップを示す。プラスミド１１は、スペーサＳｐ２００＿ＣＧ５００が切除され、関心対象の導入遺伝子発現カセットがＮｏｔＩ及びＸｂａＩ部位にサブクローニングされて、構築物１を産生する、基本ベクターとしての役割を果たし、そのマップは、図３に示されており、これは、プレースホルダーＳｐ２００＿ＣＧ５００が、ＤＮＡ合成を介して、ＰＣＲ鎖アセンブリによって、又はプラスミド若しくは他のベクターからそのような分子を切除することによって提供され得る第ＶＩＩＩ因子発現導入遺伝子で置換されていることを除いて、その基本ベクタープラスミド１１と同じ遺伝子エレメントを有する。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の図１１Ｂを参照されたい。

【0497】

二本鎖ＤＮＡ構築物を調製するために、基本ベクターを、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化し、スペーサ（フィラー又はプレースホルダー）領域を放出させる。次いで、消化物を、アガロースゲル上で泳動させ、アガロースゲル上には、２つの断片を表す２つのバンド：プレースホルダー領域及び基本ベクター骨格が存在するはずである。基本ベクター骨格をゲル抽出する。

【0498】

関心対象の導入遺伝子発現カセットを、例えば、配列５’－ＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴ－３’（配列番号４８）を有する単一プライマをＱ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼとともに使用して、カセットを担持する鋳型ベクターからＰＣＲ増幅する。次いで、ＰＣＲ反応物を高速消化ＤｐｎＩで処理して、プラスミド鋳型を排除する。その後、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してＰＣＲ反応物を精製する。

【0499】

相同性クローニングを介して、基本ベクター骨格及びＰＣＲ増幅された導入遺伝子発現カセットをライゲーションし、ライゲーション混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、選択培地上にプレーティングする。いくつかのコロニーがプレートから選択され、コロニーから精製されたプラスミドＤＮＡが検証のために配列決定される。二本鎖構築物は、実施例４に記載されるｃｅＤＮＡの無細胞合成のための鋳型としての役割を果たす。

【0500】

実施例４：ｃｅＤＮＡの無細胞合成
概要
１つのタイプのＩＴＲオリゴヌクレオチドを有する対称のＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な無細胞合成方法が図４に例示されている。簡単に説明すると、導入遺伝子発現カセット（斜線）が、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｓａＩを使用して、二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される。次いで、これに続いて、切除されたインサート（導入遺伝子発現カセットを含有する）を、ＩＴＲオリゴヌクレオチド（図４でＩＴＲオリゴとして示される）にライゲーション（例えば、Ｔ４リガーゼ又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質などのリガーゼと）し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、自己アニールしてＩＴＲ様三次元構成を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＢｓａＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによる消化は、ＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングと適合性である、切除されたインサートの５’及び３’末端の両方における粘着性オーバーハングを生じさせる。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼがヌクレオチド配列を認識し、かつＤＮＡを切断するやり方の独自性が、図５及び図６に例示されており、本明細書の詳細な説明で説明されている。ＩＴＲオリゴヌクレオチド及びインサートオーバーハング配列の設計は、ＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハング及びインサートオーバーハングが互いに適合するように、ライゲーションプロセスの高い特異性を駆動する。このようにして、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、自己ライゲーションしてＩＴＲオリゴヌクレオチド二量体を形成することができない。ＢｓａＩ消化後のプラスミド骨格からの断片は、ＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションすることができない。ＢｓａＩ消化が不完全である導入遺伝子発現カセットのコピーは、ＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションすることができず、ＢｓａＩによって再切断されることになる。切除されたインサート及びプラスミド断片が元の構築物に再ライゲーションする状況では、ＢｓａＩ認識部位が再生され、したがって、構築物がＢｓａＩによって再び切断されることを可能にする。逆に、インサートの両末端におけるＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションされたインサートを有する所望のｃｅＤＮＡ産物は、ＢｓａＩ認識部位がｃｅＤＮＡ中に存在しないため、ＢｓａＩによる切断に感受性ではない。代わりに、所望のｃｅＤＮＡ産物は、ｃｅＤＮＡ産物中のみに存在し、ＤＮＡ構築物出発材料中にもＩＴＲオリゴヌクレオチド中にも存在しない、ライゲーションが起こる固有のジャンクション配列を含有する（図４で白丸によって表される）。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの固有の活性、インサート末端上の固有のオーバーハングの生成、及びサブクローニングプロセスの高い特異性を駆動するＩＴＲオリゴヌクレオチド上の固有のオーバーハングの設計に起因して、消化及びライゲーションは、ライゲーションの前に消化産物を精製する必要なく、単一の反応容器内で起こり得る。ライゲーションが完了した後、試料は、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ処理、例えば、Ｔ５エキソヌクレアーゼ処理を介して選択的に濃縮され、これは、開端ＤＮＡ断片及び中間体を選択的に標的とし、分解するが、閉端であるｃｅＤＮＡを標的としない。

【0501】

ｃｅＤＮＡの無細胞合成のための詳細な手順
凍結乾燥されたＩＴＲオリゴヌクレオチドを１×ＴＥ緩衝液に１００μＭ濃度で再懸濁してストックを作成し、これをＤｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ酢酸カリウム）で１：１０に希釈し、最終濃度１０μＭとして使用した。自己アニーリングを誘導するために、希釈されたＩＴＲオリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間インキュベートし、これを除去し、直ちに氷水浴に入れて急速に冷却する。

【0502】

次に、二本鎖構築物（例えば、ＦＶＩＩＩ発現導入遺伝子を担持する構築物１）、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓａＩ）、及びＴ４リガーゼを用いて、酵素による消化及びライゲーション反応の混合物を準備する。以下の表６は、単一のＩＴＲオリゴヌクレオチドが使用される、８００μＬ反応及び３２ｍＬ反応を設定するためのレシピを提供する。

【0503】

【表6】

【0504】

消化／ライゲーション反応混合物を３７℃で２．５時間インキュベートし、続いて、６５～７５℃で３０分間Ｔ４リガーゼを熱失活させる。その後、構築物骨格及びライゲーションされていないＩＴＲオリゴヌクレオチド及びインサートから残存する開端ＤＮＡ断片を３７℃で１～１．５時間除去するＴ５エキソヌクレアーゼ反応を以下のように準備する。

【0505】

【表7】

【0506】

Ｔ５エキソヌクレアーゼ消化後、反応混合物をＺｙｍｏＰＵＲＥ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、製造業者の指示に従って精製する。代替的に又は追加的に、反応混合物を希釈緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）と混合し、精製のために充填ＤＭＡＥ樹脂カラムに装填する。

【0507】

実施例５：自己アニーリングＩＴＲオリゴヌクレオチドの設計及び調製
実施例３に説明され、図４～図６に例示されるように、ｃｅＤＮＡベクターを産生する例示的な無細胞合成方法は、導入遺伝子発現カセットを含有する切除された二本鎖インサートを５’及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドにライゲーションすることを伴う。ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の任意の方法（例えば、インビトロＤＮＡ合成方法論）によって提供され得、遊離５’末端及び遊離３’末端を有する直鎖状分子として提供される。次いで、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、自己アニールして、二次塩基対合構造（例えば、ステムループ又はヘアピン）を形成するが、一次構造は、直鎖状一本鎖分子である。更に、ＩＴＲオリゴヌクレオチドが自己アニールして二次三次元構造を形成する場合、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかに粘着性オーバーハングが形成される。表８は、図４に例示されるように、二本鎖ＤＮＡ構築物の５’及び３’末端にライゲーションされ得る例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドを示す。

【0508】

【表8】

【0509】

本明細書に開示されるように、本明細書に開示される無細胞合成方法を使用して調製されたｃｅＤＮＡベクターは、野生型ＩＴＲ（ＷＴ－ＩＴＲ、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号の図６Ａ及び図６Ｂ参照）又は修飾型ＩＴＲ（対称及び非対称の両方、例えば、ＷＯ２０１９／１４３３８５の図７Ａ及び図７Ｂ参照）を含み得る。修飾型ＩＴＲは、Ｂ及びＢ’アーム並びに／又はＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含み得る（例えば、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表３参照）。上記の表８に列挙されるＩＴＲオリゴヌクレオチドに加えて、適切なオーバーハング配列と組み合わせて、ＷＯ２０１９／１４３８８５の表２、４Ａ、４Ｂ、及び５に列挙される野生型又は修飾型ＩＴＲヌクレオチド配列のうちのいずれかを完全に又は部分的に組み込むＩＴＲオリゴヌクレオチドを設計及び合成することができる。ＩＴＲヌクレオチド配列を部分的に組み込むＩＴＲオリゴヌクレオチドについて、ＩＴＲオリゴヌクレオチド上の部分ＩＴＲ配列が、インサートの５’及び３’末端に見出される対応する部分ＩＴＲ配列と結合する場合、完全なＩＴＲ配列が、インサートへのＩＴＲオリゴヌクレオチドのライゲーション後にｃｅＤＮＡ産物中で生成される。

【0510】

合成プロセスの一部として、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位をＩＴＲのステム部分に導入することができる。国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５の図６Ａ～図７Ｅは、制限エンドヌクレアーゼ部位が組み込まれている実施形態を含む、例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチド配列及び構造を提供する。

【0511】

ＩＴＲ様三次元構成を形成するためのＩＴＲオリゴヌクレオチドの自己アニーリングを誘導するために、実施例２に記載の手順を使用する。代替的に、オリゴヌクレオチドを、好適な緩衝液：例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中で等モル量で混合し、９４℃まで２分間加熱し、徐々に冷却した。重要な二次構造のないオリゴの場合、冷却ステップは、ヒートブロック又は水浴から室温に試料を移動させるのと同じくらい簡単であり得る。多くの二次構造を有すると予測されるオリゴの場合、より緩やかな冷却／アニーリングステップが有益である。これは、オリゴ溶液を水浴又はヒートブロックに入れ、機械のプラグを抜く／電源を切ることによって行われる。アニールされたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを含まない緩衝液中で希釈され、二本鎖のアニールされた形態で４℃で保存され得る。

【0512】

ＩＴＲオリゴヌクレオチドのステム長
本明細書に記載の無細胞ｃｅＤＮＡ産生方法におけるライゲーション反応の特異性を駆動する粘着性オーバーハングの設計及び形成に加えて、本発明者らは、折り畳まれたＩＴＲオリゴヌクレオチド（すなわち、三次元ステムループ構造を有するＩＴＲオリゴヌクレオチド）のステム領域の長さが、オリゴヌクレオチドの折りたたみ及びｃｅＤＮＡ産生に対して重要な役割を果たすことを見出した。図７Ａは、７ｂｐステムを有する折りたたまれたＩＴＲオリゴヌクレオチド及び３ｂｐステムを有する別の折りたたまれたＩＴＲオリゴヌクレオチドを示す概略図である。図７Ｂは、ＢｓａＩ消化を介してプラスミド２０から切除された約３２０ｂｐのインサートを、それぞれ、１４ｂｐ、７ｂｐ、５ｂｐ、及び３ｂｐのステムを有するＩＴＲオリゴヌクレオチドとライゲーションした、４つの異なる反応のライゲーション産物を示すアガロースゲル電気泳動画像である。プラスミド２０から切除された約３２０ｂｐのインサートは、図７Ｃのプラスミドマップに示されるように、２つのＢｓａＩ認識部位に隣接する左部分ＩＴＲ、左スペーサ、右スペーサ、及び右部分ＩＴＲを含む。４つの異なる反応からのライゲーション産物のサイズは、４８０ｂｐ（１４ｂｐステム）、３８０ｂｐ（７ｂｐステム）、３８０ｂｐ（５ｂｐステム）、及び３７５ｂｐ（３ｂｐステム）であると予想された。図７Ｂに示されるように、１４ｂｐ、７ｂｐ、及び５ｂｐステムを有するＩＴＲオリゴヌクレオチドを使用する反応は、上記の予想されるサイズを有するライゲーション産物を生じさせたが、３ｂｐステムを有するＩＴＲオリゴヌクレオチドを使用する反応は、いかなるライゲーション産物も生じなかった。

【0513】

実施例６：非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡを含むｃｅＤＮＡの無細胞合成の概念の証明
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡの無細胞合成方法は、異なるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び異なるＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハングに適合する。具体的には、基本ベクター及びＩＴＲオリゴヌクレオチドは、異なるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを用いて（すなわち、適切な認識部位を組み込むことによって）、異なるインサートオーバーハングを用いて、異なるＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハングを用いて、及び異なるＩＴＲオリゴヌクレオチドを用いて、ｃｅＤＮＡ合成を支持するような様式で設計及び修飾され得る。以下の表９は、例示的な基本ベクター、それらの対応するＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＴＲオリゴヌクレオチド、及びＩＴＲオリゴヌクレオチドオーバーハングのリストを提供する。

【0514】

【表9】

【0515】

概念実証実験を行い、それによって、表９に列挙される基本ベクターをそれらのそれぞれのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼで切除して、表９に示されるそれらのそれぞれのＩＴＲオリゴヌクレオチドのオーバーハングに適合する５’及び３’末端におけるオーバーハングを有するインサート（導入遺伝子発現カセットを担持しない）を得て、続いて、これらのＩＴＲオリゴヌクレオチドとライゲーションする。図９Ａのアガロースゲル画像は、ゲル中に示されるＤＮＡバンドが約４００ｂｐの予想されるサイズを有していたため、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ消化及びその後のＩＴＲオリゴヌクレオチドとのライゲーションが、表９に概説されるように準備された反応の全てについて両方とも成功したことを示す。

【0516】

注目すべきことに、これらの概念実証研究はまた、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡの無細胞合成の実行可能性を証明した。例えば、基本ベクタープラスミド１５を、ＢｓａＩで消化してインサートの５’及び３’末端における直交オーバーハングを生成するように設計し、それらのうちの一方は、ＩＴＲオリゴ１によって提示される５’－ＣＴＣＡ－３’オーバーハングに適合し、他方は、ＩＴＲオリゴ３によって提示される５’－ＣＡＣＴ－３’オーバーハングに適合する。言い換えると、プラスミド１５、ＩＴＲオリゴ１、及びＩＴＲオリゴ３の設計は、ライゲーション反応の指向性及び特異性を制御する。これは、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡが調製されることを可能にする。実際、表９に示されるように、ＩＴＲオリゴ３は、９ｂｐ欠失を有する変異体ＩＴＲ配列を含有する。ＩＴＲオリゴ１をＣｙ３で標識し、ＩＴＲオリゴ３をＣｙ５で標識することは、インサートの５’及び３’末端の両方におけるライゲーション特異性の確認を可能にした（図９Ｂ及び図９Ｃ参照）。非対称ＩＴＲ、及び非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡは、本明細書並びに国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／１４３８８５号及び同第ＷＯ２０１７／１５２１４９号においても明確に定義されている。基本ベクター及びＩＴＲオリゴヌクレオチドの適切な設計及び修飾によると、非対称ＩＴＲを有し、それによって、ＩＴＲのうちの少なくとも１つがＡ－Ａ’ステム領域、Ｂ－Ｂ’ループ、Ｃ－Ｃ’ループ、及び／又はＤ－Ｄ’ステム領域に位置する修飾を有するｃｅＤＮＡは、本明細書に提供される無細胞合成方法を用いて調製され得る。単に例としてＡＡＶ血清型２ ＩＴＲを使用して、図１０は、ステム－ループ構造を有するＩＴＲにおけるＡ－Ａ’及びＤ－Ｄ’ステム領域並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’ループの場所を示す。

【0517】

実施例７：電気泳動によるｃｅＤＮＡ産生、閉端性、及び純度の精製及び確認
本明細書に説明される無細胞合成方法を使用して調製されたｃｅＤＮＡベクター産物のうちのいずれかは、例えば、熟練者に一般に既知の方法を使用して、不純物、未使用成分、又は副産物を除去するために精製され得、かつ／又は分析されて、産生されたＤＮＡベクター（この例では、ｃｅＤＮＡベクター）が所望の分子であることを確認し得る。ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡの精製のための例示的な方法は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することであり、かつ／又はゲル精製によるものである。

【0518】

非変性アガロースゲル電気泳動
ｃｅＤＮＡベクター産生は、例えば、天然又は変性条件下におけるアガロースゲル電気泳動によって評価され得る。非変性ゲル分析は、本明細書に説明される無細胞ｃｅＤＮＡ産生の制限エンドヌクレアーゼ消化／ライゲーション反応及びエキソヌクレアーゼ消化反応の成功を確認する。図１１は、第ＶＩＩＩ因子発現導入遺伝子発現カセットを供給する二本鎖ＤＮＡ構築物として構築物１を使用するＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの無細胞合成を伴う、レーン１、２、及び３における３つの試料を示すアガロースゲル画像である。レーン１の試料は、８１９０ｂｐの未消化プラスミド１１を示したラダーの６ｋｂのバンドの上に単一の太いバンドを示した（図６に示されるマップ）。レーン２の試料は、ＢｓａＩ消化及びライゲーション反応であり、予想される３つのバンドを示す。強いバンドは、ラダーの６ｋｂバンドと整列し、導入遺伝子発現カセット及びＩＴＲを含有する６０８３ｂｐインサートに対応し、２つの他のバンドは、プラスミド骨格由来の１１６１ｂｐ及び９４６ｂｐ断片に対応した。レーン３の試料は、エキソヌクレアーゼ消化後に、予想されるｃｅＤＮＡライゲーション産物（約６．３ ｋｂ）のみが残っていたことを示したが、これは、開端プラスミド骨格断片とは対照的に、閉端ライゲーション産物がエキソヌクレアーゼ消化に感受性ではなかったためである。

【0519】

変性アガロースゲル電気泳動
変性ゲル分析もまた、本明細書に説明される無細胞ｃｅＤＮＡ産生の制限エンドヌクレアーゼ消化／ライゲーション反応及びエキソヌクレアーゼ消化反応の成功を確認し得る。例示的な例として構築物１からのＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの無細胞合成を使用して、変性ゲル（例えば、尿素を含有する）上における電気泳動後、直鎖状及び開端二本鎖ＤＮＡは、約６．３ｋｂの予測されるサイズを有することになり、これは、未切断直鎖状ＰＣＲ対照試料を含有するレーン２に示されるバンドＣによって確認され、それに対応した（図１２参照）。

【0520】

アガロースゲル電気泳動の変性条件は、ＤＮＡ分子中の２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する。したがって、閉端二本鎖ＤＮＡである所望のＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡライゲーション産物は、連結された２つのＤＮＡ鎖が折りたたまれておらず、一本鎖の長さの２倍（約６．３ｋｂ）であるため、約１２．６ｋｂで分解すると予測された。更に、ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡライゲーション産物は、１つ以上のニック又はギャップを含有し得る。ｃｅＤＮＡにおけるニック及びギャップの存在の根拠は、国際特許出願公開第ＷＯ２０２１／０１１８４０号に詳細に記載されている。追加的に、本開示で企図されるｃｅＤＮＡの無細胞及び酵素ベースの合成（すなわち、消化のための制限エンドヌクレアーゼ及びライゲーションのためのリガーゼの使用）の文脈で、ｃｅＤＮＡにおけるニック及びギャップの存在は、以下の理由に起因し得る：（ｉ）リガーゼが、ＩＴＲオリゴヌクレオチド及びインサートを完全にライゲーションすることができなかったこと、（ｉｉ）制限エンドヌクレアーゼスリップ、並びに（ｉｉｉ）ニック及びギャップが、導入遺伝子発現カセットを担持する二本鎖構築物などの出発材料中に含有されていたこと（構築物をボルテックスする複数回の凍結融解サイクルなどのプラスミド操作中の機械的応力に起因する）。

【0521】

したがって、超らせん状であった変性非ニック化ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡは、ニック化された形態であるニック化されたＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡと比較して、アガロースゲル上でより高い位置に移動すると予想された。確定的には、図１２のレーン１に示されるように、変性ゲル分析は、ＤＮＡの大部分が約１５，０００ｋｂの閉端形態と一致したサイズで分解された（バンドＡ）が、一方、少量の単一のニック化された形態のＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡは、バンドＢとしてバンドＡのすぐ下で分解したことを示した。

【0522】

更に、既知のＢｇｌＩＩ制限部位を含有するＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡを酵素で消化し、変性ゲル上で分析した。直鎖状かつ開端の約６．３ｋｂの二本鎖ＤＮＡは、約３．８ｋｂのサイズの２つの一本鎖ＤＮＡ分子と、約２．５ｋｂのサイズの別の２つの一本鎖ＤＮＡ分子とに分離すると予想された。対照的に、閉端の約１２．６ｋｂの二本鎖ＤＮＡである所望のＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡライゲーション産物は、２つのバンド：約７．６ｋｂバンド（すなわち、２つの連結された約３．８ｋｂの一本鎖ＤＮＡ）及び約５ｋｂバンド（すなわち、２つの連結された約２．５ｋｂの一本鎖ＤＮＡ）として分解すると予測された。図１２のレーン３は、ＢｇｌＩＩで消化されたＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ試料を示す。具体的には、レーン３は、ＢｇｌＩＩで消化された閉端二本鎖ＤＮＡから得られる約７．６ｋｂ及び約５ｋｂのバンドにそれぞれ対応する強いバンドＤ及びＥを示し、それによって、試料中に存在するＤＮＡの大部分が閉端形態であったことを再び示した。弱いバンドもまた、レーン３に見ることができ、これは、開端形態からの約３．８ｋｂ及び約２．５ｋｂのＢｇｌＩＩで消化された断片に対応し、それによって、微量の開端ＤＮＡが精製された原薬試料中に存在することを示している。

【0523】

実施例８：ｃｅＤＮＡのクロマトグラフィ精製
次に、イオン交換クロマトグラフィ（ion-exchange chromatography、ＩＥＸ）実験を実施して、本明細書に記載の無細胞合成方法を使用して生成されたｃｅＤＮＡを更に精製し、その純度を評価した。簡単に説明すると、弱陰イオン交換クロマトグラフィ方法を利用して、ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ原薬試料のサイズバリアント種を、それらのリン酸骨格の長さに正比例することになるそれらの正味負電荷に基づいて分離し、分析物正味電荷のサイズに基づく分離手段を可能にした。三級アミン官能基を有するモノリス樹脂を固定相として使用し、漸増塩化カリウム塩濃度の勾配を使用して、分析物を選択的に溶出させ、オンラインＵＶ検出器によって２６０ｎｍで検出した。ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ原薬試料は、図１３のクロマトグラムに示されるように、単一ピークとして溶出し、それによって、原薬が単一分子種、すなわち、＞９９％モノマーとして存在したことを示した。これは、本明細書に記載される無細胞合成方法が、純度の観点で従来の細胞ベース（例えば、Ｓｆ９などの昆虫細胞）の産生方法よりも優れていることを示唆する。ＡＡＶベクターを含む遺伝子療法ベクターの細胞ベースの産生は、スナップバックゲノム又は中間領域に欠失を有するベクターゲノムのいずれかを有する複数のカテゴリーのサブモノマー又はサブゲノム粒子の混入を含む課題に直面することが知られている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０８．０１．２３０７５５参照）。

【0524】

実施例９：ＤＮＡ配列決定分析によってｃｅＤＮＡ産生を確認する
本明細書に記載の無細胞合成方法を使用して調製されたｃｅＤＮＡベクター産物のうちのいずれも、ＤＮＡ配列決定分析によって確認され得る。具体的には、ｃｅＤＮＡベクター産物は、ベクターの両端のライゲーションジャンクションの各々において配列を含有すると予測された。これらのジャンクション配列は、二本鎖ＤＮＡ構築物又はＩＴＲオリゴヌクレオチドのいずれにも存在しないが、ｃｅＤＮＡ産物に固有である。図１４は、ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡのＤＮＡ配列分析を示し、これは、構築物１から第ＶＩＩＩ因子発現導入遺伝子発現カセットを担持するインサートを切除し、インサートの両末端でインサートをＩＴＲオリゴ１とライゲーションすることによって調製される。

【0525】

５’及び３’（又は左及び右）ライゲーションジャンクションを包含する配列領域、すなわち、（ｉ）左領域：ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの５’末端にあるＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡのヌクレオチド７８～ヌクレオチド１５１、及び（ｉｉ）右領域：ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの３’末端にあるＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡのヌクレオチド６１０７～ヌクレオチド６１９に注目した。左領域中のＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡヌクレオチド配列を、構築物１ ＤＮＡ配列決定データ（左）－試料１及びＩＴＲオリゴ１の既知の配列と比較して、５’－ＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧ－３’（図１４の左ジャンクション１）の固有のジャンクション配列を得た。追加的に、左領域におけるＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡヌクレオチド配列を、構築物１ ＤＮＡ配列決定データ（左）－試料２（異なる配列決定試料に由来する）及びＩＴＲオリゴ１の既知の配列（配列番号１）と比較して、５’－ＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧ－３’（図１４における左ジャンクション２、配列番号４１）のより短い固有のジャンクション配列を得た。同様の様式で、右領域のＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡヌクレオチド配列を、構築物１ ＤＮＡ配列決定データ（右）及びＩＴＲオリゴ１の既知の配列（配列番号１）と比較して、５’－ＣＧＣＴＣ－３’の固有のジャンクション配列を得た（図１４の右ジャンクション）。

【0526】

実施例１０：ｃｅＤＮＡの無細胞合成の拡張性
有利には、本明細書に提供される無細胞合成方法は、実施例４で実証されるように、約１ｍＬの反応（例えば、単一のエッペンドルフチューブ又は９６ウェルプレート中）から約５０ｍＬ反応まで容易に拡張可能である。本発明者らは、これらの無細胞合成方法が、ｃｅＤＮＡの大規模製造のための高スループット自動バイオリアクタシステムに更にかつ直接的に拡張可能であることを実証した。図１５のアガロースゲル画像は、各々、２ｍｇ／ｍＬ又は０．４ｍｇ／ｍＬの構築物１を二本鎖構築物ベース材料として使用して、１ｍＬエッペンドルフチューブ（エキソヌクレアーゼ消化反応体積＝１ｍＬ）及びＡｍｂｒ（登録商標）バイオリアクタシステム（エキソヌクレアーゼ消化反応体積＝１３７．５ｍＬ）中で調製されたｃｅＤＮＡ産物を示す。両スケールにおける反応で、匹敵する収量及び純度レベルが得られた。

【0527】

実施例１１：マウスにおける合成的に調製されたｃｅＤＮＡからのタンパク質発現
上記の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターからの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）発現導入遺伝子のインビボタンパク質発現を、従来のＳｆ９細胞ベースのプロセスを使用して、流体力学的尾静脈注射を介して、またｃｅＤＮＡベクターを含有する脂質ナノ粒子製剤の静脈内投与を介して調製された対応するｃｅＤＮＡベクターと比較して、マウスにおいてインビボ評価した。

【0528】

ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡベクターの流体力学的尾静脈注射
げっ歯類の肝臓に核酸を導入する周知の方法は、流体力学的尾静脈注射によるものである。この系では、封入されていない核酸を大量に加圧注射すると、細胞透過性が一過性に増加し、組織及び細胞に直接送達される。これは、マクロファージ送達など、宿主の免疫系の多くを迂回する実験的な機序を提供し、そのような活性の不在下で送達及び発現を観察する機会を提供する。

【0529】

ｃｅＤＮＡ研究の流体力学的尾静脈注射を、表１０において以下のように設計した。この研究の目的は、合成及び細胞ベースのプロセスによって産生されたｃｅＤＮＡの流体力学的送達後のＦＶＩＩＩ発現を評価することであった。

【0530】

【表10】

ＩＶ＝静脈内、ＲＯＡ＝投与経路
５０匹のおよそ４週齢の雄ＣＤ－１マウスに、０．００２μｇ／動物、又は０．０１μｇ／動物、０．０５μｇ／動物、０．２５μｇ／動物の単回流体力学的尾静脈静脈内投与（tail vein intravenous administration）を、９０～１００ｍＬ／ｋｇの以下のものの中で行った：（ｉ）本明細書に記載の無細胞合成方法を使用して調製されたＦＶＩＩＩ発現導入遺伝子カセットを担持するｃｅＤＮＡである合成ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ、（ｉｉ）Ｓｆ９昆虫細胞を使用する従来の細胞ベースの方法を使用して調製された同じＦＶＩＩＩ発現導入遺伝子カセットを有するＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの第１のロット（ロット１は、＞４９％のｃｅＤＮＡのモノマー種を含有する）、及び（ｉｉｉ）Ｓｆ９細胞を使用して調製された同じＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡの第２のロット（ロット２は、？７２％のｃｅＤＮＡのモノマー種を含有する）。注射後０日目の６０～１２０分、０日目の終わり、及び剖検前の１日目にマウスを評価した。マウスの体重もまた、０日目及び１日目に記録した。次いで、マウスを注射の２４時間後に安楽死させ（±５％）、全血を使用して、ＦＶＩＩＩの血漿濃度（ＩＵ／ｍＬ）を評価するための血漿を提供した。

【0531】

図１６Ａは、漸増用量レベルのＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ（合成又は細胞ベース）をマウスに投与した場合のＦＶＩＩＩの血漿濃度を示すグラフである。全てのｃｅＤＮＡ試料は、合成的に調製されたものであっても、Ｓｆ９細胞培養物中で調製されたものであっても、投与される用量レベルが０．００２μｇ／動物から０．２５μｇ／動物に増加するにつれて、測定されるＦＶＩＩＩ血漿濃度が着実に増加する、用量応答性を呈した。この流体力学的尾静脈注射研究では、合成的に調製されたｃｅＤＮＡのＦＶＩＩＩ発現レベルは、Ｓｆ９で産生されたｃｅＤＮＡの発現レベルと同等であったことが分かる。ロット２のＳｆ９で産生されたｃｅＤＮＡの発現レベルは、ロット１よりもわずかに高かったが、これは、ロット２がロット１よりも高い濃度のｃｅＤＮＡのモノマー種を含有し、したがって、より高い純度であったため、予想外ではなかった。

【0532】

ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ製剤の静脈内注射
この研究の目的は、ＬＮＰ組成物として製剤化されたｃｅＤＮＡの静脈内送達後のＦＶＩＩＩ発現及び活性を決定することであった。研究設計は、以下のとおりである。

【0533】

【表11】

ＩＶ＝静脈内、ＲＯＡ＝投与経路

【0534】

１７匹のおよそ５週齢の雄Ｒａｇ２マウス（成熟Ｔ細胞又はＢ細胞を産生しないノックアウトマウスである）に、（ｉ）本明細書に説明される無細胞合成方法を使用して調製されたＦＶＩＩＩ発現導入遺伝子カセットを担持するｃｅＤＮＡである合成ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡと、（ｉｉ）Ｓｆ９昆虫細胞を使用する従来の細胞ベースの方法を使用して調製された同じＦＶＩＩＩ発現導入遺伝子カセットを有するＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡとを担持する５ｍＬ／ｋｇのＬＮＰ組成物中の２．０μｇ／動物の単回静脈内投与を与えた。ＬＮＰ組成物は、２０２１年７月１６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４２０３３号に記載の方法を使用して調製された。イオン化脂質、コレステロール、ペグ化脂質などのＬＮＰ組成及びそれらの濃度は、合成ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡを封入する製剤とＳｆ９で産生されたＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡを封入する製剤との間で同じに保った。

【0535】

図１６Ｂは、ＬＮＰ組成物（合成又は細胞ベース）として製剤化された２．０μｇ／動物のＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡをマウスに投与した場合のＦＶＩＩＩの血漿濃度を示すグラフである。合成ＦＶＩＩＩ－ｃｅＤＮＡで治療されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現レベルは、Ｓｆ９で産生されたＦＶＩＩＩ ｃｅＤＮＡで治療されたマウスにおける発現レベルよりも約２倍高く、これらの高い発現レベルは、４２日間継続した研究期間を通して維持された。

【0536】

実施例１２：大規模におけるＤＮＡ鋳型増幅
プラスミド産生のためにＥ．ｃｏｌｉ発酵を使用するＤＮＡ鋳型スケーリングの代替として、無細胞ＤＮＡ増幅方法を使用する、より迅速かつ費用効率の高いプラスミド又はＤＮＡ産生のための新しいアプローチを開発した。無細胞方法は、ＤＮＡプラスミド鋳型の＞１０００倍のローリングサークル及び多重鎖置換（ＭＳＤ）増幅と、その後の、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ＩＴＲオリゴ、及びエキソヌクレアーゼ酵素を使用する、ｃｅＤＮＡ分子への得られる産物の変換と、を含む。

【0537】

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージに由来するＰｈｉ２９ポリメラーゼは、その天然鎖置換能力に起因して、等温的に作動する高度なプロセッシブ酵素である。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、その３’から５’方向のエキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性に起因して、１０^－６～１０^－７という非常に低いエラー率を呈する。その高いプロセシビティ及び等温特性に起因して、Ｐｈｉ２９は、特に高温熱サイクルを必要とするＰＣＲ方法と比較した場合に、ＤＮＡの拡張可能な産生に大きな利点を提供する。追加的に、Ｐｈｉ２９の変異体バージョンはまた、耐熱性及び増強されたプロセシビティを提供し、これは、産生の強化及びプロセス耐久性を可能にする。これらの理由から、ｃｅＤＮＡインサート（例えば、発現カセット）を含有するＤＮＡ鋳型プラスミドのローリングサークル及び多置換増幅を伴う本発明の方法で、ｐｈｉ２９ポリメラーゼを用いた。

【0538】

方法開発は、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたプラスミドと少なくとも同等であるか、又はそれより優れた高品質の増幅されたプラスミドＤＮＡの産生を駆動するために増幅反応を特徴付けることと、その後のｃｅＤＮＡへの変換反応における容易さを確実にすることと、を含んだ。反応の増幅部分を特徴付けるために、増幅されたプラスミドの中間ＢｓａＩ消化物を適用して、ＤＮＡバンディングプロファイルに基づいてプラスミド品質を評価した。次いで、消化された材料は、リガーゼ、ＩＴＲオリゴ、及びエキソヌクレアーゼによる処理によってｃｅＤＮＡに変換されることができた。より単純な代替例として、増幅されたプラスミドをＢｓａＩ、リガーゼ、ＩＴＲオリゴ、及びエキソヌクレアーゼで直接処理してｃｅＤＮＡを生成した（図１７）。

【0539】

簡単に説明すると、増幅は、迅速な増幅速度に関して典型的には４２～４５℃の温度で機能する操作された熱安定性ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）を使用して実施した。フォワード及びリバースプライマは、アンピシリン耐性遺伝子のプロモータ部位付近のプラスミド骨格中の保存領域を標的とするように設計した。アニーリングステップ及び増幅反応中のある範囲の異なるプライマ濃度を使用することは、高い産物純度及びＤＮＡ増幅における複数桁の増加が得られた。

【0540】

増幅されたプラスミドの産物品質を評価するために、粗い多置換増幅産物をＢｓａＩで処理し、アガロースゲルＤＮＡバンディング分析を使用してＥ．ｃｏｌｉで産生されたプラスミド鋳型と直接比較した。プライマ濃度が消化性に強い影響を及ぼすことが見出された（図１８）。例えば、５０ｕＭを超えるプライマ濃度では、残留高分子量産物がウェル中に一貫して観察され、これは、酵素消化にアクセス不可能なＤＮＡ又は大きい一本鎖副産物のいずれかであると推測された（図１８）。例えば、１０～５０ｕＭの低いプライマアニーリング濃度が、高い増幅レベルをもたらすが、一方で、産物品質も確保することが見出された。

【0541】

プラスミド増幅反応を更に特徴付け、増強するために、ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）酵素の量及び増幅反応の温度も評価した。図１９Ａ及び図１９Ｂに示されるように、増幅反応速度は、反応温度及びポリメラーゼ量によって大きく影響された。より高い反応温度は、より速い反応速度及び３時間以内の実質的な産物生成を駆動した。しかしながら、より低い温度では、反応時間がますます長くなるにつれて、大幅により高い産物収量が達成された（図１９Ａ）。追加的に、低減された濃度のポリメラーゼでは、産物生成の反応速度が遅くなった。しかしながら、反応温度を低下させ、ｐｈｉ２９の量を低減させることはまた、図１９Ａに示されるように、特に副産物産生を示す低減されたバンドスメアリング、及び予想されるプラスミドＤＮＡバンディングの高い強度を伴って、増強された産物品質をもたらしたことが注目された。増幅されたプラスミドＤＮＡバンディングの分析は、野生型及び操作されたＰｈｉ２９ポリメラーゼ酵素（ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標））について非常に類似した産物品質のプロファイルを実証し、直接的な適用可能性を示したが、収量は、操作されたＰｈｉ２９で達成された収量のおよそ１０分の１であった（図１９Ｂ）。

【0542】

次いで、増幅されたプラスミドを、ｃｅＤＮＡ産物への酵素的変換について更に分析した。評価は、３０℃及び４５℃の増幅反応に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉ由来プラスミド及び同じＥ．ｃｏｌｉ由来プラスミド鋳型を使用して生成されたＭＤＡプラスミド産物を使用することを含んだ。図２０Ａに示されるように、ＢｓａＩで消化されたプラスミドプロファイルは、全ての試料について明確なプラスミドバンディングを示したが、一方で、増幅された反応産物は、ウェル中に高分子量種を含有していた。４５℃プロセスはまた、追加のバンドスメアリングをもたらした高レベルの副産物を含有した。プラスミド試料をＢｓａＩ、リガーゼ、ＩＴＲオリゴ、及びエキソヌクレアーゼで処理した場合、全てが同様の品質のｃｅＤＮＡを産生し、酵素的ｃｅＤＮＡアセンブリプロセスの堅牢性を実証した。更に、酵素的プラスミド増幅及びｃｅＤＮＡアセンブリ方法の適用可能性を評価するために、５つの異なるプラスミド構築物を増幅し、本明細書に説明されるｃｅＤＮＡに酵素的に変換した。ｃｅＤＮＡ構築物サイズ（２．９ｋｂ～６．２ｋｂの範囲）及びＤＮＡバンディング品質プロファイルを、図２０Ｂに示されるようにアガロースゲルにおいて確認した。

【0543】

酵素増幅及び酵素アセンブリ方法の拡張性を評価するために、反応混合物を異なる体積（１００μｌ、１ｍＬ、及び２５ｍＬ反応体積）で調製し、増幅されたプラスミド品質の収量及び一貫性について評価した。図２１Ａに示されるように、全ての増幅されたプラスミド材料は、全ての試験された反応体積スケールについて、高い産物品質及び増加した増幅レベル（例えば、全ての体積についておよそ０．８μｇ／μＬの粗収量、又は入力鋳型ＤＮＡの約３０００倍の増幅）を実証した。ｃｅＤＮＡ生成方法全体の拡張性を更に実証するために、アンプリコン材料を、本明細書に記載の方法を使用してｃｅＤＮＡに酵素的に変換した。得られたｃｅＤＮＡを陰イオン交換カラムを使用して精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して純度を決定した。本増幅及びその後の変換方法は、著しく純粋な、合成的に作製された、閉端ＤＮＡの成功した産生をもたらすことが示された（図２１Ｂ、大きいｃｅＤＮＡピーク及び他のＤＮＡ副産物の欠如を示す）。

【0544】

最後に、酵素的増幅及び酵素的アセンブリ方法を従来の反応条件と比較した。図２２は、異なる量のポリメラーゼ酵素、反応温度、及び反応時間の長さを使用してプラスミド増幅を比較するアガロースゲル分析を図示する。示されるように、本明細書に記載されるプロセス（「更新されたプロセス」：０．２５ｎｇ／μｌプラスミド鋳型、２５μＭアニーリングプライマ、３０℃、０．０５Ｕ／μｌ ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）、４ｍＭ ｄＮＴＰ、１８～２６時間）は、従来の反応条件（「初期プロセス」：０．２５ｎｇ／μｌプラスミド鋳型、１０μＭアニーリングプライマ、４５℃、０．５Ｕ／μｌ ＥｑｕｉＰｈｉ２９（商標）、５ｍＭ ｄＮＴＰ、３時間）と比較して、１０倍低い濃度の酵素の使用を可能にする（コスト及び潜在的な供給制約を低減する）が、一方で、実質的に増強された産物品質をもたらし、低減されたスメアリング及び低減された高分子量種（酵素操作できない）を示す。

【0545】

本明細書に開示される結果は、大量の完全な合成閉端ＤＮＡ分子を生成するための、拡張可能で、堅牢な、無細胞の酵素的方法を実証した。

【0546】

参考文献
特許、公開及び未公開特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書及び本明細書の実施例で引用される全ての刊行物及び参考文献は、各々、あたかも個々の刊行物又は参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、その全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物及び参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9A-9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【国際調査報告】