特表 2025-500468 フローセル及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】フローセル及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20241226BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20241226BHJP

   C40B 40/06 20060101ALN20241226BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A ZNA

C12Q1/6806 Z

C40B40/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538184

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(85)【翻訳文提出日】2024-08-19

(86)【国際出願番号】 US2022082280

(87)【国際公開番号】W WO2023122755

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/293,494

(32)【優先日】2021-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/323,890

(32)【優先日】2022-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/371,165

(32)【優先日】2022-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/380,878

(32)【優先日】2022-10-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500358711

【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジョハン・セバスティアン・バスキ

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン・マーク・ボーテル

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・エス・フィッシャー

(72)【発明者】

【氏名】ルイーズ・ジェーン・フレーザー

(72)【発明者】

【氏名】ウェイン・エヌ・ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】ナイル・アンソニー・ゴームリー

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド・ジョーンズ

(72)【発明者】

【氏名】シャオユ・マ

(72)【発明者】

【氏名】マリア・イネス・マーティンス・ヴィトリアノ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・メイ

(72)【発明者】

【氏名】オリヴァー・ジョン・ミラー

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー・プライス

(72)【発明者】

【氏名】セバスチャン・ゲオルグ・ガブリエル・リコールト

(72)【発明者】

【氏名】ヴィッキー・エス・トムソン

(72)【発明者】

【氏名】ジャクリーン・シー・ウィアー

(72)【発明者】

【氏名】ウェイフア・チャン

(72)【発明者】

【氏名】フイ・ハン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB20

4B029DG10

4B029GA08

4B029GB10

4B063QA13

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS03

(57)【要約】

フローセルの一例は、間隙領域によって分離された凹部を有する基材を含む。第１の及び第２のプライマーは、凹部内に固定される。第１のトランスポソーム複合体は、凹部内に固定され、第１のトランスポソーム複合体は、第１の増幅ドメインを含む。第２のトランスポソーム複合体も、凹部内に固定され、第２のトランスポソーム複合体は、第２の増幅ドメインを含む。第１のトランスポソーム複合体の一部、又は第２のトランスポソーム複合体の一部、又は第１の及び第２のトランスポソーム複合体の両方の一部は、タグメント化効率を低下させる修飾を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部の各々の中に固定された、第１のプライマー及び第２のプライマーと、
前記凹部の各々の中に固定され、第１の増幅ドメインを含む第１のトランスポソーム複合体と、
前記凹部の各々の中に固定され、第２の増幅ドメインを含む第２のトランスポソーム複合体と、を備え、
ｉ）前記第１のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉ）前記第２のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の両方の一部が、タグメント化効率を低下させる修飾を含む、フローセル。

【請求項2】

前記タグメント化効率を低下させる修飾が、ｉ）前記第１のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉ）前記第２のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の両方の一部の、非転移鎖の５’末端におけるリン酸基の排除である、請求項１に記載のフローセル。

【請求項3】

前記タグメント化効率を低下させる修飾が、ｉ）前記第１のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉ）前記第２のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の両方の一部の、非転移鎖の５’末端に結合したフルオロフォアである、請求項１に記載のフローセル。

【請求項4】

前記タグメント化効率を低下させる修飾が、ｉ）前記第１のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉ）前記第２のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の両方の一部の、非転移鎖の３’末端に結合したフルオロフォアである、請求項１に記載のフローセル。

【請求項5】

前記タグメント化効率を低下させる修飾が、ｉ）前記第１のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉ）前記第２のトランスポソーム複合体の一部、又はｉｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の両方の一部の、転移鎖の３’末端に結合したジデオキシシトシン、チミン、又はシトシンである、請求項１に記載のフローセル。

【請求項6】

間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部の各々の中に固定された、第１のプライマー及び第２のプライマーと、
第１の増幅ドメインを含む第１のトランスポソーム複合体と、
第２の増幅ドメインを含む第２のトランスポソーム複合体と、を備え、
ｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体が、前記凹部の各々の異なる領域に、各々固定され、又は
ｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体が、前記凹部の各々の内部、及び前記間隙領域の各々の上に、各々固定され、又は
ｉｉｉ）前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体が、前記間隙領域の異なる領域に、各々固定されている、フローセル。

【請求項7】

前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の各々が、
トランスポゾン末端と、
前記トランスポゾン末端に非共有結合したトランスポザーゼ酵素と、を含む、請求項６に記載のフローセル。

【請求項8】

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）試料のインサートサイズを増加させる方法であって、
ＤＮＡ試料をフローセルに導入するステップであって、前記フローセルが、
間隙領域によって分離された複数の凹部と、
前記凹部の各々の中に固定された第１のプライマー及び第２のプライマーと、
前記凹部の各々の中に、又は前記間隙領域上に固定され、第１の増幅ドメインを含む第１のトランスポソーム複合体と、
前記凹部の各々の内に、又は前記間隙領域上に固定され、第２の増幅ドメインを含む第２のトランスポソーム複合体と、を含む、ステップと、
前記ＤＮＡ試料に縮合剤又はタグメント化阻害剤を導入するステップであって、前記縮合剤が、ポリカチオン性アミン、ポリエチレングリコール、及びヒストンからなる群から選択されるか、又は前記タグメント化阻害剤が、カチオン、ｐＨ調整剤、及びクロマチンアセンブリキットからなる群から選択される、ステップと、
前記縮合剤又は前記タグメント化阻害剤の存在下で、前記フローセル内で前記ＤＮＡ試料をインキュベーションすることによって、前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の一部で、前記ＤＮＡ試料のタグメント化を起こすステップと、を含む方法。

【請求項9】

前記タグメント化の後に、
洗浄溶液を前記フローセルに導入するステップと、
前記洗浄溶液を含む前記フローセルを、約６０℃に加熱するステップと、次いで
伸長増幅ミックスをフローセルに導入するステップと、を更に含む請求項８に記載の方法。

【請求項10】

トランスポソーム複合体を緩衝溶液に導入するステップであって、前記トランスポソーム複合体が、
非転移鎖の一部にハイブリダイズした転移鎖の一部を含むトランスポゾン末端であって、前記転移鎖が５’末端アルキン官能基を含む、トランスポゾン末端と、
前記トランスポゾン末端に非共有結合したトランスポザーゼ酵素と、を含む、ステップと、
前記トランスポソーム複合体を含有する前記緩衝溶液を、間隙領域によって分離された凹部を含むフローセルに導入するステップであって、前記凹部が、末端アジド又はテトラジン基を有するポリマーヒドロゲルをその中に有する、ステップと、
前記フローセル内で前記緩衝溶液をインキュベーションすることによって、前記トランスポソーム複合体の少なくとも一部の前記５’末端アルキン官能基を各々、前記末端アジド又はテトラジン基の少なくとも一部に結合させるステップと、を含む方法。

【請求項11】

５’末端アルキン官能基が、ビシクロ［６．１．０］ノニンである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記緩衝溶液が硫酸ナトリウムであり、
前記インキュベーションが約３７℃で約２時間実施される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

トランスポソーム複合体をフローセルに導入するステップであって、
前記トランスポソーム複合体が、
非転移鎖の一部にハイブリダイズした転移鎖の一部を含むトランスポゾン末端であって、前記転移鎖が５’ビオチン化末端を含む、トランスポゾン末端と、
前記トランスポゾン末端に非共有結合した、トランスポザーゼ酵素と、を含み、
前記フローセルが、
間隙領域によって分離された凹部と、
前記凹部内のビオチン化ポリマーヒドロゲルと、を含む、ステップと、
ストレプトアビジンを前記フローセルに導入するステップと、
前記トランスポソーム複合体及び前記ストレプトアビジンを、前記フローセル中でインキュベーションすることによって、前記ストレプトアビジンが各々、前記トランスポソーム複合体の少なくとも一部の前記５’ビオチン化末端を、前記ビオチン化ポリマーヒドロゲルに結合させるステップと、を含む方法。

【請求項14】

ポリマーヒドロゲルの末端アジド又はテトラジン基に、ビシクロ［６．１．０］ノニン－ビオチンをグラフト化するステップによって、ビオチン化ポリマーヒドロゲルを調製するステップを更に含む請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ストレプトアビジンが、各トランスポソーム複合体の５’ビオチン化末端に予め結合し、したがって、各トランスポソーム複合体の一部として導入される、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記トランスポソーム複合体が前記フローセルに導入される前に、前記ストレプトアビジンが前記フローセルに導入される、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項17】

前記トランスポソーム複合体が、又は前記ストレプトアビジンが、又は前記トランスポソーム複合体及び前記ストレプトアビジンの両方が乾燥され、
前記方法が、
前記トランスポソーム複合体を前記フローセルに導入する前に、前記トランスポソーム複合体を緩衝液中で再構成するステップ、又は
前記ストレプトアビジンを前記フローセルに導入する前に、前記ストレプトアビジンを緩衝液中で再構成するステップ、又は
前記トランスポソーム複合体及び前記ストレプトアビジンの各々を、前記フローセルに導入する前に、各々の緩衝液中で各々再構成するステップを更に含む、請求項１３、１４、１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部内のビオチン化ポリマーヒドロゲルと、
前記凹部の各々の中に固定された第１のビオチン化プライマー及び第２のビオチン化プライマーと、
前記凹部の各々の中に固定され、第１の増幅ドメインを含む第１のビオチン化トランスポソーム複合体と、
前記凹部の各々の中に固定され、第２の増幅ドメインを含む第２のビオチン化トランスポソーム複合体と、を含む再使用可能なフローセル。

【請求項19】

前記第１のビオチン化プライマー及び前記第２のビオチン化プライマーが、ストレプトアビジンを介して、前記ビオチン化ポリマーヒドロゲルに固定されている、請求項１８に記載の再使用可能なフローセル。

【請求項20】

前記第１のビオチン化トランスポソーム複合体が、ストレプトアビジンを介して、前記ビオチン化ポリマーヒドロゲルに固定され、
前記第２のビオチン化トランスポソーム複合体が、ストレプトアビジンを介して、前記ビオチン化ポリマーヒドロゲルに固定されている、請求項１８又は１９に記載の再使用可能なフローセル。

【請求項21】

プロテアーゼ、２ｍＭ未満のエチレンジアミン四酢酸、カオトロピック剤、及び水を含み、無機塩を含まない溶解緩衝液中で、前記プロテアーゼの活性温度で、全血、骨髄穿刺液、組織試料、血液スポット、及び唾液からなる群から選択される試料を、前記無機塩を含まない溶解緩衝液に曝露することによって、前記試料からデオキシリボ核酸を抽出し、粗溶解物を生成するステップと、
熱又は阻害剤を使用して、前記粗溶解物中の前記プロテアーゼを不活性化するステップと、
前記カオトロピック剤のキレート剤を前記粗溶解物に添加して、複合体粗溶解物を生成するステップと、を含む方法。

【請求項22】

フローセル内の表面に固定されたトランスポソーム複合体及びプライマーを含むフローセルに前記複合体粗溶解物を導入するステップを更に含む請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抽出されたデオキシリボ核酸を、タグメント化に曝露するステップを更に含み、前記タグメント化が、
前記複合体粗溶解物が導入される際に、前記フローセルにタグメント化緩衝液を導入するステップと、
前記フローセルを３０℃以上の温度にするステップと、を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

洗浄溶液を前記フローセルに導入するステップと、
前記洗浄溶液を含む前記フローセルを、約６０℃に加熱するステップと、次いで、
伸長増幅ミックスを前記フローセルに導入するステップと、を更に含む請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記曝露するステップ、前記不活性化するステップ、及び前記添加するステップが、前記フローセルに搭載されていない溶解チューブ又はチャンバ内で実施される、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記複合体粗溶解物をライブラリ調製技術に曝露するステップを更に含む請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

前記カオトロピック剤のキレート剤が、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、及びメチルベータシクロデキストリンからなる群から選択される、シクロデキストリンである、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記キレート剤が乾燥形態であり、
前記乾燥形態のキレート剤が、前記乾燥形態のキレート剤の周囲のコーティング材料を含むカプセル化複合体の一部であり、
前記キレート剤を添加するステップが、
前記カプセル化複合体を前記粗溶解物に添加するステップと、
次いで、前記カプセル化複合体からの前記乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップと、
前記乾燥形態のキレート剤を再水和するステップと、を含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記コーティング材料が温度感受性ワックスであり、
前記乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップが、粗溶解物を温度感受性ワックスの融解温度まで加熱するステップを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記コーティング材料が温度感受性ポリマーであり、
前記乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップが、粗溶解物を温度感受性ポリマーの可溶化温度まで加熱するステップを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記コーティング材料がｐＨ感受性ポリマーであり、
前記乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップが、粗溶解物のｐＨを調整するステップを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記コーティング材料が時間感受性ポリマーであり、
前記乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップが、前記カプセル化複合体を、粗溶解物中で所定の時間インキュベーションするステップを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記無機塩を含まない溶解緩衝液がトリプシンを含み、
前記粗溶解物中のトリプシンを不活性化するステップが、前記粗溶解物を前記阻害剤に曝露するステップを含み、
前記阻害剤が、４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリドである、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記無機塩を含まない溶解緩衝液中の前記プロテアーゼが、プロテインキナーゼであり、
前記粗溶解物中の前記プロテインキナーゼを不活性化するステップが、前記粗溶解物を前記熱に曝露するステップを含み、
前記熱が、約８０℃である、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記無機塩を含まない溶解緩衝液中の前記プロテアーゼが、プロテインキナーゼであり、
前記粗溶解物中の前記プロテインキナーゼを不活性化するステップが、前記粗溶解物を前記阻害剤に曝露するステップを含み、
前記阻害剤が、テトラペプチジルクロロメチルケトンである請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記試料を前記無機塩を含まない溶解緩衝液に曝露する前に、前記無機塩を含まない溶解緩衝液を乾燥させ、
前記乾燥した無機塩を含まない溶解緩衝液を前記水で再構成するステップを更に含む請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

ＤＮＡ試料及び表面結合トランスポソーム複合体を使用してタグメント化反応を行い、それによって、複数の部分的に適合されたＤＮＡ断片を生成するステップと、
カオトロピック剤を導入して、前記表面結合トランスポソーム複合体のトランスポザーゼを除去するステップと、
前記カオトロピック剤のキレート剤を導入して、前記カオトロピック剤を分離するステップと、
伸長反応を実施して、前記部分的に適合されたＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップと、を含む方法。

【請求項38】

前記カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウムであり、
前記カオトロピック剤のキレート剤が、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、及びメチルベータシクロデキストリンからなる群から選択されるシクロデキストリンである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

ＤＮＡ試料をフローセルに導入するステップであって、前記フローセルが、
間隙領域によって分離された複数の凹部と、
前記凹部の各々の中に固定された、第１のプライマー及び第２のプライマーと、
前記凹部の各々の中に、又は前記間隙領域上に固定され、第１の増幅ドメインを含む第１のトランスポソーム複合体と、
前記凹部の各々の中に、又は前記間隙領域上に固定され、第２の増幅ドメインを含む第２のトランスポソーム複合体と、を含み、
前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の一部において、前記ＤＮＡ試料のタグメント化が実施されて、複数の部分的に適合されたＤＮＡ断片が生成される、ステップと、
カオトロピック剤を前記フローセルに導入して、前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体のトランスポザーゼを除去するステップと、
前記カオトロピック剤のキレート剤を導入して、前記カオトロピック剤を分離するステップと、
伸長反応を実施して、前記部分的に適合されたＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップと、を含む方法。

【請求項40】

前記カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウムであり、
前記カオトロピック剤のキレート剤が、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、及びメチルベータシクロデキストリンからなる群から選択されるシクロデキストリンである、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

フローセルであって、
間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部の各々の中に固定された、第１のプライマー及び第２のプライマーと、
複数の第１のトランスポソーム複合体であって、前記複数の第１のトランスポソーム複合体の各々が、第１のトランスポソーム複合体の非転移鎖の３’末端によって、前記凹部の１つの中に固定されている、複数の第１のトランスポソーム複合体と、
複数の第２のトランスポソーム複合体であって、前記複数の第２のトランスポソーム複合体の各々が、第２のトランスポソーム複合体の転移鎖の５’末端によって、前記凹部の１つの中に固定されている、複数の第２のトランスポソーム複合体と、を備え、
前記複数の第１のトランスポソーム複合体と前記複数の第２のトランスポソーム複合体が、１：１超から５：１までの範囲の比で前記フローセル中に存在する、フローセル。

【請求項42】

前記複数の第１のトランスポソーム複合体の各々が、
前記第１のトランスポソーム複合体の転移鎖の一部にハイブリダイズした前記第１のトランスポソーム複合体の非転移鎖の一部を含む第１のトランスポゾン末端と、
前記第１のトランスポゾン末端に非共有結合した第１のトランスポザーゼ酵素と、を含む、請求項４１に記載のフローセル。

【請求項43】

前記複数の第２のトランスポソーム複合体の各々が、
第２のトランスポソーム複合体の非転移鎖の一部にハイブリダイズした前記第２のトランスポソーム複合体の転移鎖の一部を含む第２のトランスポゾン末端と、
前記第２のトランスポゾン末端に非共有結合した第２のトランスポザーゼ酵素と、を含む、請求項４１又は４２に記載のフローセル。

【請求項44】

前記複数の第１のトランスポソーム複合体：前記複数の第２のトランスポソーム複合体の比が、４：１である、請求項４１から４３のいずれか一項に記載のフローセル。

【請求項45】

前記凹部の各々がその中にポリマーヒドロゲルの層を含み、
前記３’末端が前記ポリマーヒドロゲルに結合し、
前記５’末端が前記ポリマーヒドロゲルに結合している、請求項４１から４４のいずれか一項に記載のフローセル。

【請求項46】

前記凹部の各々がその中にビオチン化ポリマーヒドロゲルの層を含み、
前記３’末端及び前記５’末端の各々がビオチン化され、
ビオチン化された前記３’末端及び前記５’末端の各々が、ストレプトアビジンを介して、前記ビオチン化ポリマーヒドロゲルに結合している、請求項４１から４４のいずれか一項に記載のフローセル。

【請求項47】

ＤＮＡ試料及びタグメント化緩衝液をフローセルに導入するステップであって、前記フローセルが、
間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部の各々の中に固定された、第１のプライマー及び第２のプライマーと、
複数の第１のトランスポソーム複合体であって、前記複数の第１のトランスポソーム複合体の各々が、第１のトランスポソーム複合体の非転移鎖の３’末端によって、前記凹部の１つの中に固定されている、複数の第１のトランスポソーム複合体と、
複数の第２のトランスポソーム複合体であって、前記複数の第２のトランスポソーム複合体の各々が、第２のトランスポソーム複合体の転移鎖の５’末端によって、前記凹部の１つの中に固定されている、複数の第２のトランスポソーム複合体と、を含み、
前記複数の第１のトランスポソーム複合体及び前記複数の第２のトランスポソーム複合体が、１：１超～５：１の範囲の比で、前記フローセル中に存在する、ステップと、
前記ＤＮＡ試料及び前記タグメント化緩衝液を、前記フローセル内でインキュベーションすることによって、前記ＤＮＡ試料のタグメント化が、前記第２のトランスポソーム複合体の転移鎖の少なくとも一部、及び前記第１のトランスポソーム複合体の転移鎖の少なくとも一部に結合したＤＮＡ試料断片を生成するステップと、を含む方法。

【請求項48】

前記フローセルを約６０℃に加熱することによって、前記複数の第１のトランスポソーム複合体及び前記複数の第２のトランスポソーム複合体のトランスポザーゼを放出させるステップと、
前記フローセルを通して洗浄溶液を流すことによって、前記放出されたトランスポザーゼを除去するステップと、
伸長増幅ミックスを前記フローセルに導入するステップと、を更に含む請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記フローセルにドデシル硫酸ナトリウム又はプロテイナーゼを導入することによって、前記複数の第１のトランスポソーム複合体及び前記複数の第２のトランスポソーム複合体のトランスポザーゼを放出させるステップと、
前記フローセルを、前記第１のトランスポソーム複合体及び前記第２のトランスポソーム複合体の脱ハイブリダイゼーション温度に加熱するステップと、
前記フローセルを通して洗浄溶液を流すことによって、前記第２のトランスポソーム複合体の前記放出されたトランスポザーゼ及び放出された非転移鎖を除去するステップと、
伸長増幅ミックスを前記フローセルに導入するステップと、を更に含む請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
各凹部の第１の部分に配置された第１のポリマーヒドロゲルと、
各凹部の第２の部分に配置された第２のポリマーヒドロゲルと、
オルソゴナルに切断可能な結合を介して前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定されたトランスポソーム前駆体と、
前記第２のポリマーヒドロゲル上に固定された捕捉プライマーと、
前記第１のポリマーヒドロゲル及び前記第２のポリマーヒドロゲルの各々に固定された増幅プライマーセットの第１のプライマー及び第２のプライマーと、を含むフローセル。

【請求項51】

前記トランスポソーム前駆体が、前記第１のプライマーと同一の配列を有する第１の増幅ドメインを含み、
前記捕捉プライマーが、プレアセンブルトランスポソーム複合体の非転移鎖に相補的な配列を含む、請求項５０に記載のフローセル。

【請求項52】

前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定された前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーが、切断不可能な第１のプライマー及び切断可能な第２のプライマーを含み、
前記第２のポリマーヒドロゲル上に固定された前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーが、切断可能な第１のプライマー及び切断不可能な第２のプライマーを含み、
前記切断可能な第２のプライマーの切断部位、前記切断可能な第１のプライマーの切断部位、及び前記オルソゴナルに切断可能な結合の各々は、異なる切断化学に応答性である、請求項５０に記載のフローセル。

【請求項53】

フローセルであって、
間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
各凹部の第１の部分に配置された第１のポリマーヒドロゲルと、
各凹部の第２の部分に配置された第２のポリマーヒドロゲルと、
オルソゴナルに切断可能な結合を介して前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定されたトランスポソーム前駆体と、
前記第２のポリマーヒドロゲル上に固定された捕捉プライマーと、
前記第１のポリマーヒドロゲル及び前記第２のポリマーヒドロゲルの各々に固定された増幅プライマーセットの第１のプライマー及び第２のプライマーと、を含むフローセルと、
トランスポソーム前駆体とトランスポソーム複合体を構築するためのトランスポザーゼ酵素及び非転移鎖を含む第１の流体と、
前記捕捉プライマーにハイブリダイズするプレアセンブルトランスポソーム複合体を含む第２の流体と、を備えるキット。

【請求項54】

前記トランスポソーム前駆体が、前記第１のプライマーと同一の配列を有する第１の増幅ドメインを含み、
前記プレアセンブルトランスポソーム複合体が、前記捕捉プライマーの配列に相補的な非転移鎖と、前記第２のプライマーと同一の配列を有する第２の増幅ドメインを含む転移鎖と、を含む、請求項５３に記載のキット。

【請求項55】

前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定された前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーが、切断不可能な第１のプライマー及び切断可能な第２のプライマーを含み、
前記第２のポリマーヒドロゲル上に固定された前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーが、切断可能な第１のプライマー及び切断不可能な第２のプライマーを含み、
前記切断可能な第２のプライマーの切断部位、前記切断可能な第１のプライマーの切断部位、及び前記オルソゴナルに切断可能な結合の各々が、異なる切断化学に応答性である、請求項５３に記載のキット。

【請求項56】

複数のトランスポザーゼ酵素及び複数の非転移鎖を含む第１の流体を、フローセルに導入するステップであって、前記フローセルが、
間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
各凹部の第１の部分に配置された第１のポリマーヒドロゲルと、
各凹部の第２の部分に配置された第２のポリマーヒドロゲルと、
各々のオルソゴナルに切断可能な結合を介して前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定された複数のトランスポソーム前駆体と、
前記第２のポリマーヒドロゲル上に固定された複数の捕捉プライマーと、
前記第１のポリマーヒドロゲル及び前記第２のポリマーヒドロゲルの各々に固定された増幅プライマーセットの第１のプライマー及び第２のプライマーであって、前記第１のプライマーの各々が、前記複数のトランスポソーム前駆体の各々の第１の増幅ドメインと同一の配列を有する、第１のプライマー及び第２のプライマーと、を含み、
前記複数のトランスポソーム前駆体、前記複数の非転移鎖及び前記複数のトランスポザーゼ酵素の少なくとも一部が相互作用して、前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定された複数のトランスポソーム複合体を形成するステップと、
複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体を含む第２の流体を前記フローセルに導入することによって、前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の少なくとも一部の非転移鎖が、前記複数の捕捉プライマーの少なくとも一部に各々ハイブリダイズする、ステップと、
前記フローセル中でＤＮＡ試料をインキュベーションすることによって、前記ＤＮＡ試料のタグメント化が、前記複数のトランスポソーム複合体の転移鎖、及び前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の転移鎖に結合したＤＮＡ試料断片を生成するステップと、を含む方法。

【請求項57】

前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の転移鎖が、前記第２のプライマーと同一の配列を有する第２の増幅ドメインを含み、
前記複数のトランスポザーゼ酵素及び前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の各々のトランスポザーゼ酵素を、除去するステップと、
鎖置換反応を開始して、前記複数のトランスポソーム複合体及び前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の転移鎖の相補的コピーを生成し、前記第２のポリマーヒドロゲルから前記ＤＮＡ試料断片を分離することによって、前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の転移鎖の相補的コピーの少なくとも１つが、前記複数のトランスポソーム複合体の転移鎖の少なくとも１つを介して、前記第１のポリマーヒドロゲルに結合したままとなるステップと、
前記複数のプレアセンブルトランスポソーム複合体の転移鎖の相補的コピーのうちの少なくとも１つを、前記第１のポリマーヒドロゲル又は前記第２のポリマーヒドロゲル上の前記第２のプライマーの少なくとも１つにハイブリダイズさせるステップと、
前記相補的コピーのハイブリダイズした少なくとも１つに結合した前記ＤＮＡ試料断片に沿って、ポリメラーゼ伸長を開始して、前記第１のポリマーヒドロゲル又は前記第２のポリマーヒドロゲル上の前記第２のプライマーの少なくとも１つに結合した少なくとも１つのアンプリコンを生成するステップと、
ジオール切断剤を導入して、前記オルソゴナルに切断可能な結合を介して前記第１のポリマーヒドロゲルに結合した前記ＤＮＡ試料断片を切り離すステップと、を更に含む請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
各凹部の第１の部分に配置された第１のポリマーヒドロゲルと、
オルソゴナルに切断可能な結合を介して前記第１のポリマーヒドロゲル上に固定されたトランスポソーム前駆体と、
各凹部の第２の部分に配置され、前記第１のポリマーヒドロゲルが含まないトランスポソーム捕捉官能基を含む第２のポリマーヒドロゲルと、
前記第１のポリマーヒドロゲル及び前記第２のポリマーヒドロゲルの各々に固定された増幅プライマーセットの第１のプライマー及び第２のプライマーと、を備えるフローセル。

【請求項59】

約１８℃～約２５℃の範囲の温度で、細胞試料を酸化亜鉛ナノ材料に曝露することによって、前記細胞試料からの、デオキシリボ核酸又はリボ核酸の、界面活性剤を含まない抽出を開始し、粗溶解物を生成するステップと、
前記粗溶解物中の抽出されたデオキシリボ核酸又はリボ核酸を、タグメント化に曝露するステップと、を含む方法。

【請求項60】

前記酸化亜鉛ナノ材料が、プロテアーゼと組み合わされ、
前記粗溶解物中の抽出されたデオキシリボ核酸又はリボ核酸を、タグメント化に曝露する前に、熱を使用して前記プロテアーゼを不活性化するステップを更に含む請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記プロテアーゼが、熱分解性プロテインキナーゼである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記粗溶解物中の前記抽出されたデオキシリボ核酸又はリボ核酸を、タグメント化に曝露するステップが、フローセル内の表面に固定されたトランスポソーム複合体及びプライマーを含むフローセルに、粗溶解物を導入するステップを含む、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記粗溶解物が導入される際に、前記フローセルにタグメント化緩衝液を導入するステップと、
前記フローセルを３０℃以上の温度にするステップと、を更に含む請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記フローセルを約６０℃まで加熱するステップと、
洗浄溶液を前記フローセルに流すステップと、
増幅ミックスを前記フローセルに導入するステップと、を更に含む請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記タグメント化緩衝液が、前記トランスポソーム複合体のトランスポザーゼのための金属補因子を含む、請求項６３又は６４に記載の方法。

【請求項66】

前記粗溶解物が溶解チューブ中で生成され、前記粗溶解物中の抽出されたデオキシリボ核酸又はリボ核酸を、タグメント化に曝露するステップが、タグメント化緩衝液と、表面結合トランスポソーム複合体及び表面結合プライマーを含む固体支持体とを、前記溶解チューブに導入するステップを含む、請求項５９に記載の方法。

【請求項67】

前記タグメント化緩衝液が、前記表面結合トランスポソーム複合体のトランスポザーゼのための金属補因子を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記粗溶解物が試料収集デバイス内で生成され、前記酸化亜鉛ナノ材料が前記試料収集デバイスの表面上で乾燥される、請求項５９に記載の方法。

【請求項69】

前記細胞試料を前記酸化亜鉛ナノ材料に曝露するステップが、約２分間～約３０分間の範囲の時間にわたって実施される、請求項５９から６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記細胞試料と前記酸化亜鉛ナノ材料が、１：１の体積比で存在する、請求項５９から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記タグメント化が、溶液中で実施される、請求項５９に記載の方法。

【請求項72】

フローセルと試薬カートリッジとストレプトアビジンとを含むタグメント化キットであって、
前記フローセルが、
間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部の各々の中に固定された第１のプライマー及び第２のプライマーと、
前記凹部の各々の中に固定されたビオチン含有リンカーと、を含み、
前記試薬カートリッジが、
流体入力ポートと、
トランスポソーム緩衝液とタグメント化緩衝液とを各々含む複数のレセプタクルと、を含み、
前記トランスポソーム緩衝液が、第１の増幅ドメイン及び５’ビオチン化末端を各々有する複数の第１のトランスポソーム複合体と、第２の増幅ドメイン及び５’ビオチン化末端を各々有する第２のトランスポソーム複合体と、を含み、
前記ストレプトアビジンが、ビオチン含有リンカーに結合しているか、又は前記試薬カートリッジのレセプタクル内に含まれるかのいずれかである、タグメント化キット。

【請求項73】

前記試薬カートリッジが、前記レセプタクルの１つの中に、無機塩を含まない溶解緩衝液を更に含み、前記無機塩を含まない溶解緩衝液が、プロテアーゼ、２ｍＭ未満のエチレンジアミン四酢酸、及びカオトロピック剤を含む、請求項７２に記載のタグメント化キット。

【請求項74】

ｉ）前記無機塩を含まない溶解緩衝液が液体であり、前記無機塩を含まない溶解緩衝液が水を更に含む、又は
ｉｉ）前記無機塩を含まない緩衝液が乾燥固体であり、前記試薬カートリッジが前記複数のレセプタクルのうちの他の１つの中に再構成流体を更に含む、請求項７３に記載のタグメント化キット。

【請求項75】

前記試薬カートリッジが、前記レセプタクルの他の１つに前記カオトロピック剤の阻害剤を更に含む、請求項７３又は７４に記載のタグメント化キット。

【請求項76】

フローセルと試薬カートリッジとを含むタグメント化キットであって、
前記フローセルが、
間隙領域によって分離された複数の凹部を含む基材と、
前記凹部の各々の中に固定された、第１のプライマー及び第２のプライマーと、を含み、
前記試薬カートリッジが、
流体入力ポートと、
ビオチン含有リンカーとトランスポソーム緩衝液とを各々含む複数のレセプタクルと、を含み、
前記トランスポソーム緩衝液が、第１の増幅ドメイン及び５’ビオチン化末端を各々有する複数の第１のトランスポソーム複合体と、第２の増幅ドメイン及び５’ビオチン化末端を各々有する複数の第２のトランスポソーム複合体と、を含む、タグメント化キット。

【請求項77】

前記試薬カートリッジが、前記複数のレセプタクルのうちの１つの中に、無機塩を含まない溶解緩衝液を更に含み、前記無機塩を含まない溶解緩衝液が、プロテアーゼ、２ｍＭ未満のエチレンジアミン四酢酸、及びカオトロピック剤を含む、請求項７６に記載のタグメント化キット。

【請求項78】

ｉ）前記無機塩を含まない溶解緩衝液が液体であり、前記無機塩を含まない溶解緩衝液が水を更に含む、又は
ｉｉ）前記無機塩を含まない緩衝液が乾燥固体であり、前記試薬カートリッジが、前記複数のレセプタクルのうちの他の１つの中に再構成流体を更に含む、請求項７７に記載のタグメント化キット。

【請求項79】

前記試薬カートリッジが、前記複数のレセプタクルのうちの他の１つの中に前記カオトロピック剤の阻害剤を更に含む、請求項７７又は７８に記載のタグメント化キット。

【請求項80】

フローセルであって、
間隙領域によって分離された複数の深さの凹部を有する基材であって、各複数の凹部が、深部と浅部とを含む、基材と、
前記深部及び前記浅部の各々の内部の表面上に配置された、ポリマーヒドロゲルと、
前記浅部の表面に固定された第１のプライマーセットと、
前記浅部の表面に固定された第１のトランスポソーム複合体であって、第１の増幅ドメインを含む、第１のトランスポソーム複合体と、
前記深部の表面に固定された第２のプライマーセットと、
前記深部の表面に固定された第２のトランスポソーム複合体であって、第２の増幅ドメインを含む、第２のトランスポソーム複合体と、を含むフローセル。

【請求項81】

間隙領域によって分離された複数の深さの凹部を有する基材の上に、ポリマーヒドロゲルを施すステップであって、各複数の凹部が深部と浅部とを含む、ステップと、
前記間隙領域から前記ポリマーヒドロゲルを除去するステップと、
フォトレジストを現像して前記深部に不溶性フォトレジストを生成することによって、前記浅部を露出されたままにするステップと、
前記不溶性フォトレジストが前記深部にある間に、前記浅部の表面上に第１のプライマーセット及び第１のトランスポソーム複合体を固定するステップと、
前記不溶性フォトレジストを除去するステップと、
前記浅部の表面上に第２のプライマーセット及び第２のトランスポソーム複合体を固定するステップと、を含む方法。

【請求項82】

前記ポリマーヒドロゲルが、研磨を使用して前記間隙領域から除去される、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記フォトレジストがネガティブフォトレジスト、又はポジティブフォトレジストである、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

第１の非転移鎖にハイブリダイズした第１の転移鎖の一部と共に、第１のトランスポゾン末端を各々含む複数の第１のタイプのトランスポソーム複合体を使用して、溶液中でＤＮＡ試料をタグメント化するステップであって、前記第１の転移鎖が、第１の増幅ドメイン及びインデックス配列を含むことによって、最初に転移された鎖の３’末端に、５’末端でそれぞれ結合した二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、
前記二本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液を、フローセルの表面に固定された複数の第２のタイプのトランスポソーム複合体を含むフローセルに導入するステップであって、前記第２のタイプのトランスポソーム複合体が、第２の非転移鎖にハイブリダイズした第２の転移鎖の一部を有する第２のトランスポゾン末端を含み、前記第２の転移鎖が、第２の増幅ドメインを含み、インデックス配列を含まないことによって、二本鎖ＤＮＡ断片をタグメント化して、第２の転移鎖の３’末端に、５’末端でそれぞれ結合した新たな二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、を含む方法。

【請求項85】

前記フローセルが、前記表面に固定された第１のプライマー及び第２のプライマーを更に含み、
前記第１の増幅ドメイン及び前記第１のプライマーが同一の配列を有し、
前記第２の増幅ドメイン及び前記第２のプライマーが同一の配列を有する、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記第１の非転移鎖及び前記第２の非転移鎖を脱ハイブリダイズするステップと、
前記新たな二本鎖ＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するために、伸長反応を実施するステップと、を更に含む請求項８４又は８５に記載の方法。

【請求項87】

表面に結合した複数の第１のタイプのトランスポソーム複合体を使用して、フローセルの表面に二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップであって、前記第１のタイプのトランスポソーム複合体が、第１の非転移鎖にハイブリダイズした第１の転移鎖の一部を有する第１のトランスポゾン末端を含み、前記第１の転移鎖が、第１の増幅ドメインを含み、前記二本鎖ＤＮＡ断片が、各々、５’末端で前記第１の転移鎖の３’末端に結合するステップと、
複数の第２のタイプのトランスポソーム複合体を、前記フローセルに導入するステップであって、前記第２のタイプのトランスポソーム複合体が、第２の非転移鎖にハイブリダイズした第２の転移鎖の一部を有する第２のトランスポゾン末端を含み、第２の転移鎖が、第２の増幅ドメインを含むことによって、前記二本鎖ＤＮＡ断片をタグメント化して、各々５’末端で前記第２の転移鎖の３’末端に結合した新しい二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、を含む方法。

【請求項88】

前記二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップが、
ＤＮＡ試料及びタグメント化緩衝液を前記フローセルに導入するステップと、
前記第１のタイプのトランスポソーム複合体を使用して、前記ＤＮＡ試料のタグメント化を実行するステップと、を含む、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記第１のタイプのトランスポソーム複合体及び前記第２のタイプのトランスポソーム複合体の各々のトランスポザーゼ酵素を除去するステップと、
前記新たな二本鎖ＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するために、伸長反応を実施するステップと、を更に含む請求項８７又は８８に記載の方法。

【請求項90】

第１のタイプのトランスポソーム複合体を、フローセルの凹部に導入するステップであって、前記第１のタイプのトランスポソーム複合体が、非転移鎖にハイブリダイズした転移鎖の一部を有するトランスポゾン末端を含み、前記転移鎖が、第１の増幅ドメインを含む、ステップと、
ＤＮＡ試料を前記フローセルに導入することによって、前記第１のタイプのトランスポソーム複合体が前記ＤＮＡ試料をタグメント化して、５’末端で前記転移鎖の３’末端に結合し、３’末端では結合していない第１の鎖と、３’末端及び５’末端の両方で結合していない第２の鎖とを有する二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、
第２のタイプのトランスポソーム複合体を前記フローセルに導入するステップであって、前記第２のタイプのトランスポソーム複合体が、第２の非転移鎖にハイブリダイズした第２の転移鎖の一部を有する第２のトランスポゾン末端を含み、前記第２の転移鎖が、第２の増幅ドメインを含むことによって、前記二本鎖ＤＮＡ断片の第２の鎖の５’末端が、前記第２の転移鎖に結合するステップと、を含む方法。

【請求項91】

前記第１のタイプのトランスポソーム複合体及び前記第２のタイプのトランスポソーム複合体の各々のトランスポソーム酵素を除去するステップと、
前記二本鎖ＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するために、伸長反応を実施するステップと、を更に含む請求項９０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２９３４９４号、２０２２年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／３２３８９０号、２０２２年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／３７１１６５号、２０２２年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／３８０８７８号の利益を主張するものであり、これらは各々、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（配列表の参照）
本明細書に添付して提出された配列表は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。ファイルの名称は「ILI228BPCT_IP-2481-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt」であり、ファイルのサイズは１２，５７６バイトであり、ファイルの作成日は２０２２年１２月１６日である。

【背景技術】

【0003】

二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的分子を断片化及びタグ付けして、より小さい一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）のライブラリを生成することができる。これらのより小さい一本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ配列決定反応における鋳型として、使用され得る。鋳型は、短いリード長を得ることを可能にし得、次いで、データ分析の間に、重複する短い配列リードを整列させて、より長い核酸配列を再構築することができる。二本鎖ＤＮＡの断片化及びタグ付けのためのいくつかの方法は、過剰な廃棄物を生成し、断片化のための高価な機器を伴い、時間がかかる。

【0004】

断片化及びタグ付けの前に、ｄｓＤＮＡ標的分子は、全血試料、骨髄穿刺液、組織試料、血液スポット、又は唾液から抽出され得る。いくつかの抽出プロセスは、断片化及び／又はタグ付けの間に起こる酵素反応を阻害する、１つ以上の試薬を利用する。したがって、抽出されたｄｓＤＮＡ標的分子は、更なる調製技術に曝露される前に、精製プロセスに曝露され得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

フローセル内の表面に結合したトランスポソーム複合体及びプライマーを含む、いくつかのフローセルが本明細書に開示される。第１のタイプのトランスポソーム複合体がフローセルの第１の部分上でアセンブルされ、第２のタイプのトランスポソーム複合体（例えば、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体）がフローセルの第２の部分に結合することを可能にする、他のフローセルが本明細書に開示される。これらの他のフローセルでは、プライマーは、第１の及び第２の部分の両方に結合する。これらのフローセルの各々の表面化学の一部として、トランスポソーム複合体及びプライマーは、ＤＮＡ試料タグメント化及び伸長増幅がフローセル表面上で起こることを可能にし、したがって、オフフローセルライブラリ調製（例えば、オフフローセルＤＮＡ試料タグメント化）の必要性を排除する。

【0006】

本明細書に開示されるフローセルのいくつかは、フローセル内の表面に非対称的に結合する、トランスポソーム複合体を含む。「非対称的に結合する」とは、一方のトランスポソーム複合体が、その５’末端を介してフローセル表面に結合し、他方のトランスポソーム複合体が、その３’末端を介してフローセルに結合することを意味する。これらの例では、非対称的に結合したトランスポソーム複合体の比率は、より多くの３’末端結合トランスポソーム複合体が存在するように歪められる。非対称結合及びその比は、伸長増幅の結果として、３’末端及び５’末端の両方に同一の増幅ドメインを有する、断片化鎖の発生を減少させる。これらの特定の断片化された鎖の発生を減少させることは、フィルタを通過するリードのパーセンテージ（すなわち、チャスティティ閾値を通過し、配列決定データの更なる処理及び分析のために使用される、クラスタを記載するために使用される指標）を増加させ得る。

【0007】

本明細書に開示されるフローセルの更に他の例は、フローセル内の表面に結合した、１つのタイプのトランスポソーム複合体のみを含む。これらの例では、第２のタグメント化ステップは、フローセルから離れて、又はワークフローのある時点でフローセルに追加のトランスポソーム複合体を導入するステップによって、形成することができる。

【0008】

トランスポソーム複合体をフローセル表面に結合させるための方法も、本明細書に開示される。これらの方法は効率的であり、フローセル製造中に、又はフローセルの初期設定の一部として、実施することができる。

【0009】

タグメント化ＤＮＡ試料のインサートサイズを増加させる方法も、本明細書に開示される。プラス鎖リード及びマイナス鎖リード（例えば、リード１及びリード２）は更に離れるので、より大きなインサートは、リードを参照に整列させるときに役立つ。より大きなインサートはまた、リード１及びリード２の重複の機会を減少させ、これは、ＧＣバイアスを助け、そうでなければ扱いにくい領域（例えば、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、ホモポリマーなど）の、配列決定精度を改善することができる。

【0010】

タグメント化を行った後、カオトロピック剤を導入して、トランスポソーム複合体からトランスポザーゼを除去してもよい。本明細書に開示される方法のいくつかは、カオトロピック剤の導入後に、カオトロピック剤のキレート剤の導入を含む。キレート剤は、カオトロピック剤を隔離することができ、したがって、伸長反応及び増幅反応などの、下流プロセスにおいて使用される酵素（例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ）の変性を防止する。

【0011】

全血試料、骨髄穿刺液、組織試料、血液スポット、又は唾液からなる群から選択される試料から、ＤＮＡを抽出するための、更なる方法が本明細書に開示される。この方法は、ＤＮＡを抽出するための特定の溶解緩衝液、及び溶解緩衝液中のカオトロピック剤を隔離するための前述のキレート剤を利用する。この方法は、複合体化された粗溶解物を生成し、これは、最初に精製プロセスに曝露される必要なく、本明細書中に開示されるオンフローセルＤＮＡ試料タグ付断片化を含む、種々のライブラリ調製方法において使用され得る。したがって、この方法は、ＤＮＡを抽出してから、抽出されたＤＮＡからライブラリ断片を生成するまでの間に含まれる、時間の量を減少させ得る。

【0012】

本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、同一ではないかもしれないが類似のものである構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて説明される場合も、説明されない場合もある。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】ポリマーヒドロゲルにグラフトされた、二量体形態のトランスポソーム複合体を含む、本明細書に開示されるフローセルの一例の、１つの凹部の概略図である。

【図1B】ポリマーヒドロゲルにグラフトされた単一のトランスポソーム複合体を含む、本明細書に開示されるフローセルの一例の、１つの凹部の概略図である。

【図1C】ＤＮＡ試料がタグメント化を受けた後の、図１Ｂの凹部の概略図である。

【図1D】トランスポザーゼ除去及び伸長反応後の、図１Ｃの凹部の概略図である。

【図2A】ビオチン含有リンカーを介してポリマーヒドロゲルに結合した、トランスポソーム複合体を含む、本明細書に開示されるフローセルの他の例の、１つの凹部の概略図である。

【図2B】ビオチン含有リンカーを介してポリマーヒドロゲルに結合した、トランスポソーム複合体及びプライマーを含む、本明細書に開示されるフローセルの更に他の例の、１つの凹部の概略図である。

【図3A】空間的に分離されたトランスポソーム複合体及びプライマーを含む、本明細書に開示されるフローセルの一例の、１つの凹部の概略図である。

【図3B】空間的に分離されたトランスポソーム複合体及びプライマーを含む、本明細書に開示されるフローセルの一例の、１つの多深度凹部の概略図である。

【図4】空間的に分離されたトランスポソーム複合体及びプライマーを含む、本明細書に開示されるフローセルの他の例の、１つの凹部の概略図である。

【図5】空間的に分離されたトランスポソーム複合体及びプライマーを含む、本明細書に開示されるフローセルの更に他の例の、１つの凹部の概略図である。

【図6】スペルミジンがＤＮＡ試料と共に添加された場合の、対照及び実施例のタグメント化後の、Ｘ軸上に示されるインサートサイズ（塩基対）を有する、リード（Ｙ軸）のパーセンテージを示すグラフである。

【図7】対照（非修飾トランスポソーム複合体を使用）、及びトランスポソーム複合体が非転移鎖から５’リン酸を除去するステップによって修飾される場合の実施例の、タグメント化後の、Ｘ軸に示されるインサートサイズ（塩基対）を有する、リード（Ｙ軸）のパーセンテージを示すグラフである。

【図8】対照（チューブ中のイルミナＰＣＲフリーＤＮＡ調製物）、並びにｉ）非転移鎖から５’リン酸を除去し、３’色素を非転移鎖に添加するステップ、ｉｉ）非転移鎖に３’色素を添加するステップ、及びｉｉｉ）非転移鎖から５’リン酸を除去するステップによって、トランスポソーム複合体を修飾した場合の、４つの異なる例の、タグメント化後の、Ｘ軸に示されるインサートサイズ（塩基対）を有する、リードのパーセンテージ（Ｙ軸）を示すグラフである。

【図9】対照（非修飾トランスポソーム複合体を使用）、及びトランスポソーム複合体が３’ジデオキシシトシンを転移鎖に付加するステップによって修飾される場合の、５つの異なる例の、タグメント化後の、Ｘ軸に示されるインサートサイズ（塩基対）を有する、リード（Ｙ軸）のパーセンテージを示すグラフである。

【図10】２つの異なる対照方法を使用して生成されたライブラリ断片、及び本明細書に開示される例示的な方法を使用して全血試料から生成されたライブラリ断片について、ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｉｉ）マッピングされたリードのパーセンテージ、ｉｖ）カバレッジ、及びｖ）フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【図11】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄは各々、２つの異なるポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＴ）中に、ベータシクロデキストリンがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対して有する効果を示す、自動電気泳動ゲル画像（白黒で再現）を示す。

【図12】２つの異なる対照試料及び実施例試料について、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）収率（ｎＭ、Ｙ軸）、対ギャップ充填ライゲーションステップで使用したベータシクロデキストリンのパーセンテージを示すグラフである。

【図13A】陥没内に非対称に結合したトランスポソーム複合体を含む、本明細書に開示されるフローセルの一例の、１つの凹部の概略図である。

【図13B】ＤＮＡ試料がタグメント化を受けた後の、図１３Ａの凹部の概略図である。

【図13C】トランスポザーゼ除去後で伸長反応前の、図１３Ｂの凹部の概略図である。

【図13D】脱ハイブリダイゼーション後の、図１３Ｂの凹部の概略図である。

【図14A】図１３Ａの非対称的に結合したトランスポソーム複合体の一例を、概略的に示す。

【図14B】図１３Ａの非対称的に結合したトランスポソーム複合体の他の例を、概略的に示す。

【図15A】本明細書に開示されるフローセルの他の例の１つの凹部の概略図であり、凹部は、フローセルの第１の部分上に第１のタイプのトランスポソーム複合体をアセンブルするため、及びフローセルの第２の部分に第２のタイプのトランスポソーム複合体（すなわち、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体）を結合させるための、異なる化学を含む。

【図15B】第１の部分上にアセンブルされた第１のタイプのトランスポソーム複合体、及び第２の部分に結合したプレアセンブルされたトランスポソーム複合体を有する、図１５Ａの凹部の概略図である。

【図15C】ＤＮＡ試料のタグメント化後の、図１５Ｂの凹部の概略図である。

【図15D】トランスポザーゼ除去後の、図１５Ｃの凹部の概略図である。

【図15E】鎖置換反応後の、図１５Ｄの凹部の概略図である。

【図15F】洗浄後の、図１５Ｅの凹部の概略図である。

【図15G】ハイブリダイゼーション後の、図１５Ｆの凹部の概略図である。

【図15H】ポリメラーゼ伸長後の、図１５Ｇの凹部の概略図である。

【図15I】オルソゴナルに切断可能な結合の切断後の、図１５Ｈの凹部の概略図である。

【図15J】クラスタリング後の、図１５Ｉの凹部の概略図である。

【図16A】図１５Ｂのアセンブルされたトランスポソーム複合体の一例を、概略的に示す。

【図16B】図１５Ｂのプレアセンブルされたトランスポソーム複合体の一例を、概略的に示す。

【図17】本明細書に開示されるフローセルのいくつかの例では使用することができる、例示的なプライマーセットの概略図である。

【図18】手動で抽出された、又は自動化プロセスを介して抽出された、血液試料についてのＤＮＡ収量を示す棒グラフであり、プロテイナーゼＫが溶解緩衝液に添加されたか、又は試料収集チップ上で予め乾燥された。

【図19】本明細書に開示される３つの例示的な方法を使用して全血試料から生成されたライブラリ断片について、ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｉｉ）マッピングされたリードのパーセンテージ、ｉｖ）カバレッジ、及びｖ）フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【図20】ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｉｉ）マッピングされたリードのパーセンテージ、ｉｖ）カバレッジ、並びにｖ）液体ストレプトアビジン、及び凍結乾燥及び再構成されたストレプトアビジンを使用して調製されたフローセルを使用して、ＤＮＡ試料から生成されたライブラリ断片についての、フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【図21】ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｉｉ）マッピングされたリードのパーセンテージ、ｉｖ）カバレッジ、並びにｖ）液体溶解緩衝液、及び凍結乾燥及び再構成された溶解緩衝液を使用して調製された全血試料から生成された、ライブラリ断片についての、フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【図22】ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｉｉ）マッピングされたリードのパーセンテージ、ｉｖ）カバレッジ、並びにｖ）液体タグメント化緩衝液、及び凍結乾燥及び再構成されたタグメント化緩衝液中で調製されたＤＮＡ試料から生成された、ライブラリ断片についての、フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【図23】ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｉｉ）マッピングされたリードのパーセンテージ、ｉｖ）ライブラリ断片のためのフィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）、並びにｖ）市販のＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）２Ｋ配列決定キット、及び本明細書中に記載される例示的なワークフローを使用して調製及び配列決定されたＤＮＡ試料から生成された、カバレッジを示すグラフである。

【図24】タグメント化キットの一例の、概略図である。

【図25】結合化学（ＢＣＮ－ビオチン－ストレプトアビジン）が異なる方法を介して導入されたフローセルを使用して、調製及び配列決定されたＤＮＡ試料から生成された、ライブラリ断片について、ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）占有率又は占有率％、ｉｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｖ）マッピングされたリードのパーセンテージ、及びｖ）フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【図26A】例示的な方法を示す概略図であり、ポリマーヒドロゲルが導入された複数の深さの凹部を示す。

【図26B】例示的な方法を示す概略図であり、複数の深さの凹部の一方の部分への第１のトランスポソーム及びプライマーセットの導入を示し、複数の深さの凹部の他方の部分は不溶性フォトレジストでマスクされている。

【図26C】例示的な方法を示す概略図であり、複数の深さの凹部の他方の部分への第２のトランスポソーム及びプライマーセットの導入を示す。

【図26D】例示的な方法を示す概略図であり、複数の深さの凹部にわたるタグメント化を示す。

【図27】フローセル凹部において１つのタイプのトランスポソーム複合体から始まる、異なる例示的な方法を示す、概略フロー図である。

【図28】連結化学（ＢＣＮ－ビオチン－ストレプトアビジン）が異なる方法を介して導入されたフローセルを使用して、調製及び配列決定されたＤＮＡ試料から生成された、ライブラリ断片について、ｉ）インサートサイズ（塩基対）、ｉｉ）占有率又は占有率％、ｉｉｉ）Ｑ３０塩基のパーセンテージ、ｉｖ）マッピングされたリードのパーセンテージ、及びｖ）フィルタを通過するリードのパーセンテージ（％ＰＦ）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本明細書に開示されるフローセルの例は、フローセルの表面に固定された、トランスポソーム複合体を含む。フローセル表面にトランスポソーム複合体を組み込むことによって、ＤＮＡ試料のタグ付けをフローセル表面で実施することができる。フローセルでは、タグメント化は、断片の増幅及び配列決定が実施される同一の表面上に、ＤＮＡ試料断片（又はより大きなＤＮＡ試料のライブラリ断片）を生成する。これは、ライブラリ断片を生成するためのオフフローセルＤＮＡ試料調製の必要性が排除され、したがって、より流れに沿った効率的なプロセスが提供される。

【0015】

いくつかの例では、トランスポソーム複合体及び／又はタグメント化において使用される試薬は、断片化産物のインサートサイズを増加させるために修飾され、これは望ましい場合がある。

【0016】

本明細書に開示される方法のいくつかにおいて、タグメント化が実施された後にカオトロピック剤を隔離するために、カオトロピック剤のキレート剤が使用される。本明細書に記載される様式での隔離は、カオトロピック剤を、下流プロセスにおいて使用される酵素（例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ）を変性させないままにし、また、タグメント化後の洗浄の必要性を排除する。ビーズベースのタグメント化プロセスが使用される場合、本明細書に記載される様式での隔離はまた、タグメント化緩衝液からビーズを分離するための、磁石の必要性を排除する。

【0017】

いくつかの例では、ＤＮＡ試料断片を生成するために使用されるＤＮＡ試料は、最初に精製に曝露されることなく、ライブラリ調製に直接曝露されることを可能にする様式で、全血試料から調製される。

【0018】

更に他の例では、タグメント化において使用されるトランスポソーム複合体は、３’末端及び５’末端の両方に同一の増幅ドメインを有する断片鎖の発生を減少させるために、非対称的に結合する。

【0019】

定義
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術の通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。

【0020】

本明細書で使用されるとき、単数形での記載は、文脈上明確に別段の指示がない限り、単数形並びに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。

【0021】

「一例」、「別の例」、「例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、組成、構成、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくともよいことを意味している。加えて、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせられ得ることを理解すべきである。

【0022】

特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」及び「約」という用語は、処理における変動などに起因するような小さな変動を記載及び説明するために使用される。例えば、これらの用語は、表示値から±５％以下を指すことができ、例えば、表示値から±２％以下、記載値から±１％以下、表示値から±０．５％以下、表示値から±０．２％以下、表示値から±０．１％以下、表示値から±０．０５％以下を指すことができる。

【0023】

アダプター：例えば、ライゲーション又はタグメンテーションによって核酸分子に融合され得る直鎖状オリゴヌクレオチド配列。好適なアダプターの長さは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、又は約１２ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの範囲であり得る。アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、アダプターは、鋳型増幅及びクラスタ生成のための開始点として機能し得る、例えば、Ｐ５又はＰ７配列などのユニバーサルヌクレオチド配列を有する、増幅ドメインを含み得る。他の例では、アダプターは、フローセル表面結合プライマー（ユニバーサルヌクレオチド配列を含む）の少なくとも一部に、相補的な配列を含み得る。後者の実施例では、アダプター配列は、増幅及びクラスタ生成の間に、相補的フローセル表面結合プライマーに、ハイブリダイズすることができる。いくつかの例では、アダプターはまた、配列決定プライマー配列（すなわち、配列決定結合部位）、又は配列決定試料インデックス（すなわち、バーコード配列）を含み得る。異なるアダプターの組み合わせを、タグメント化を介して生成したＤＮＡ断片などの、核酸分子に組み込むことができる。

【0024】

増幅ドメイン：鋳型増幅及びクラスタ生成のための開始点として役立ち得る、Ｐ５又はＰ７配列などのユニバーサルヌクレオチド配列を有する、アダプターの部分。

【0025】

非対称的に結合する：トランスポソーム複合体の群内で、一部は非転移鎖の３’末端を介してフローセル表面に結合し、他の一部は転移鎖の５’末端を介してフローセル表面に結合する。

【0026】

複合体粗溶解物：全血試料、骨髄穿刺液、組織試料、血液スポット、及び唾液からなる群から選択される試料を、ｉ）無機塩を含まない溶解緩衝液、ｉｉ）無機塩を含まない溶解緩衝液中に含まれるプロテアーゼの不活性化、及びｉｉｉ）無機塩を含まない溶解緩衝液中のカオトロピック剤のキレート剤に、曝露するステップによって生成される、生成物。この産物は、最初に精製方法に曝露されることなく、下流のライブラリ調製技術において使用され得る。

【0027】

堆積：手動又は自動のものであってよく、場合によっては表面特性の変更をもたらす、任意の適切な施用技術。一般に、堆積は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して実行され得る。いくつかの特定の例としては、化学気相堆積（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク又はディップコーティング、ドクターブレードコーティング、液滴分配（ｐｕｄｄｌｅ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）、フロースルーコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷などが挙げられる。

【0028】

凹部：基材又は層の間隙領域（複数可）によって少なくとも部分的に囲まれた、表面開口部を有する、基材又は基材の層（例えば、パターン化された樹脂）における、別個の凹状の特徴。凹部は、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状のいずれかをとることができる。表面と直交するようにとられた凹部の断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。凹部は、畝、段差など、より複雑なアーキテクチャを有してもよい。

【0029】

ＤＮＡ試料：ＲＮＡ（リボ核酸）試料に由来する、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド類似体、又は相補的デオキシリボヌクレオチドを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態。ＤＮＡ試料は、二本鎖である。ＤＮＡ試料は、窒素含有ヘテロ環塩基（アデニン、チミン、シトシン、及び／又はグアニンなどの核酸塩基）、糖（具体的には、デオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基を欠く糖）、及びホスホジエステル結合を含有する骨格を含む、天然に存在するＤＮＡを含み得る。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替骨格結合を有することができる。

【0030】

ＤＮＡ試料は、１つ以上の細胞、体液（例えば、全血、血液スポット、唾液）又は組織から単離することができる、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であってもよい。ｇＤＮＡは、ＤＮＡを含有する細胞を溶解するステップによって、調製することができる。細胞は、細胞のｇＤＮＡの完全性を実質的に保存する条件下において溶解してもよい。特定の一例では、熱溶解を使用して、細胞を溶解してもよい。別の特定の例では、細胞のアルカリ性ｐＨへの曝露を使用して、ｇＤＮＡへの損傷を比較的わずかにしながら細胞を溶解することができる。例えば水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムなどを含む、様々な塩基性化合物のいずれかを、溶解に使用することができる。加えて、比較的損傷していないｇＤＮＡは、細胞壁を分解する酵素によって溶解された細胞から得ることができる。天然又は酵素的除去に起因するかのいずれかである細胞壁を欠く細胞もまた、浸透ストレスへの曝露によって溶解することができる。細胞を溶解するために使用することができる他の条件としては、洗剤への曝露、機械的破壊、超音波処理熱、フレンチプレス装置などの圧力差、又はダウンス型ホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）が挙げられる。ｇＤＮＡを安定化する剤は、例えば、ヌクレアーゼ阻害剤、キレート剤、塩、及び緩衝剤などを含む、細胞溶解物又は単離されたｇＤＮＡ試料に含まれ得る。いくつかの例では、ｇＤＮＡを含有する粗細胞溶解物は、ｇＤＮＡを更に単離することなく直接使用され得る。一例では、全血試料は、無機塩を含まない溶解緩衝液を使用して溶解されてもよく、粗溶解物は、本明細書で定義される複合体粗溶解物を生成するために、特定の処理ステップに曝露されてもよい。この複合体化した粗溶解物はまた、更なる単離又は精製なしに、ＤＮＡ試料として使用され得る。

【0031】

各々：アイテムのコレクションを参照して使用される場合、各々が、コレクション内の個々のアイテムを識別するが、必ずしもコレクション内のすべてのアイテムを指すわけではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。

【0032】

フローセル：反応を実行できる流路と、チャンバに試薬（複数可）を送達するための入口と、チャンバから試薬（複数可）を除去するための出口とを有する容器。いくつかの例では、フローセルは、そこで発生する反応の検出を可能にする。例えば、フローセルは、アレイ、光学的標識分子などの光学的検出を可能にする１つ以上の透明な表面を含み得る。

【0033】

流路：液体試料を選択的に受け取ることができ、結合又はその他の方法で結合した、２つの構成要素間に画定された領域。いくつかの例では、流路は、２つの、パターン化された又はパターン化されていない配列決定表面の間に画定され得、したがって、配列決定表面（複数可）の１つ以上の構成要素と流体連通し得る。

【0034】

断片：ＤＮＡ試料の一部又は小片。「部分的に適合された断片」は、タグメント化されたＤＮＡ試料の一部又は断片であり、したがって、ＤＮＡ断片の５’末端にライゲーションされたアダプターを含む。「完全に適合された断片」は、ＤＮＡ断片の３’末端及び５’末端の両方に組み込まれたアダプターを有する、ＤＮＡ試料の一部又は断片である。

【0035】

無機塩を含まない溶解緩衝液：例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、及び炭酸ナトリウムなどのナトリウム塩、塩化カリウムなどのカリウム塩、及び塩化リチウムなどのリチウム塩、などの無機塩を含有しない、溶解緩衝液。無機塩を含まない溶解緩衝液は、キレート剤又は界面活性剤として機能するものを含む、有機塩を含んでもよい。

【0036】

プライマー：断片に結合したアダプターなど、標的配列にハイブリダイズし得る、一本鎖核酸分子。一例として、フローセル表面は、断片増幅及びクラスタ生成の開始点として、機能し得る。他の例として、断片又は断片アンプリコンに相補的な新しい鎖の合成をプライミングするために、断片又は断片アンプリコンにハイブリダイズすることができる、プライマー（例えば、配列決定プライマー）を導入することができる。任意のプライマーは、ヌクレオチド又はそれらの類似体の任意の組み合わせを含むことができる。一部の例では、プライマーは、一本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの長さは、任意の数の塩基長であり得る。一例では、フローセル表面の各々は、プライマーに結合しており、捕捉プライマー又は配列決定プライマーは、１０～６０塩基、又は２０～４０塩基の範囲の、一本鎖である。

【0037】

タグメント化：分析のために、ＤＮＡ試料が切断／断片化され、（例えば、アダプターで）タグ付けされるプロセス。タグメント化は、インビトロ転移反応である。

【0038】

転移鎖及び非転移鎖：「転移鎖」という用語は、トランスポゾン末端の転移した部分を含む、配列を指す。同様に、「非転移鎖」という用語は、トランスポゾン末端の非転移部分を含む、配列を指す。転移鎖の３’末端は、タグメント化の間に、二本鎖断片に、連結又は転移される。非転移鎖は、タグメント化の間に、二本鎖断片に、連結又は転移されない。一例では、転移鎖及び非転移鎖は、互いに共有結合している、少なくとも部分的に相補的な部分を含む。

【0039】

トランスポザーゼ：トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を含む機能複合体を形成し、例えば、インビトロ転移反応（すなわち、タグメント化）で、それがインキュベーションされる二本鎖ＤＮＡ試料への、トランスポゾン末端含有組成物の、挿入又は転位を触媒することができる、酵素。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。本明細書に記載の多くの実施例は、Ｔｎ５トランスポザーゼ、及び／又は過活性Ｔｎ５トランスポザーゼに言及するが、意図された目的でＤＮＡ試料に５’タグを付けて断片化するのに十分な効率で、トランスポゾン末端を挿入できる、任意のトランスポザーゼを使用し得ることが理解される。

【0040】

トランスポソーム複合体：トランスポザーゼと、トランスポザーゼ組み込み認識部位を含む二本鎖核酸との間で形成される、複合体。例えば、トランスポソーム複合体は、非共有結合複合体形成をサポートする条件下で二本鎖トランスポゾンＤＮＡとプレインキュベートされたトランスポザーゼ酵素であり得る。二本鎖トランスポゾンＤＮＡとしては、例えば、Ｔｎ５ ＤＮＡ、Ｔｎ５ ＤＮＡの一部、トランスポゾン末端組成物、トランスポゾン末端組成物の混合物、又は過活性Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼと相互作用することができる他の二本鎖ＤＮＡが挙げられ得る。

【0041】

トランスポゾン末端：タグメント化で機能するトランスポザーゼとの複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す、二本鎖核酸鎖。トランスポゾン末端の二本鎖核酸鎖は、トランスポザーゼと機能的複合体を形成するのに適した、任意の核酸又は核酸類似体を含むことができる。例えば、トランスポゾン末端は、天然ＤＮＡ、又はＤＮＡ類似体（修飾された塩基、又は骨格を含む）を含み得、一方の鎖又は両方の鎖にニックを含み得る。

【0042】

参照番号のいずれか、例えば、プライマー３６’、増幅ドメイン２６’などに対する、プライム（’）記号は、対応するエレメントプライマー３６、増幅ドメイン２６に対する、相補的配列を指すのではなく、むしろエレメントの更なる例であることが、理解されるべきである。特異的プライマー、例えば、Ｐ５’又はＰ７’を記載するために使用される場合、プライム（’）は相補的配列を指す。

【0043】

トランスポソーム複合体
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄは、フローセル凹部１２内に固定された、本明細書に開示される、トランスポソーム複合体１０、１０’のいくつかの例を示す。トランスポソーム複合体１０、１０’の単一セットがこれらの図の各々に示されているが、トランスポソーム複合体１０、１０’のいくつかのセットが単一の凹部１２内に結合してもよいことが、理解されるべきである。図１Ａのトランスポソーム複合体１０、１０’のセットは二量体形態で示され、図１Ｂ～図１Ｄに示されるトランスポソーム複合体１０、１０’のセットは、単一トランスポソーム複合体１０、１０’として示される。図１Ａ～図１Ｄに示す例では、トランスポソーム複合体１０、１０’は、凹部１２内に固定されている。トランスポソーム複合体１０、１０’はまた、図３Ａ～図５を参照して本明細書において以下に記載されるように、空間的に分離された様式で固定されてもよい。

【0044】

トランスポソーム複合体１０、１０’（又は図１３Ａ～図１３Ｄ、図１４Ａ及び図１４Ｂを参照して本明細書に記載される１０Ａ、１０Ｂ、又は図１５Ａ～図１５Ｊを参照して記載される１０Ｃ、１０Ｄ）の例は、別個の実体であるが、溶液中及びフローセル表面に結合した場合に、二量体を形成する。簡略化のために、単一のトランスポソーム複合体を図１Ｂ～図５に示すことを理解されたい。トランスポソーム例のいくつかの二量体形態は、例えば、図１Ａ、並びに図１３及び図１５シリーズのいくつかの図に示されている（例えば、図１３Ａ及び図１５Ｂを参照）。

【0045】

言及され、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、トランスポソーム複合体１０、１０’は、トランスポゾン末端１６、１６’に非共有結合した、トランスポザーゼ酵素１４、１４’を含む。各トランスポゾン末端１６、１６’は二本鎖核酸鎖であり、その一方の鎖３０、３０’は転移鎖１８、１８’の一部であり、その他方の鎖３２、３２’は非転移鎖２０、２０’の一部である。換言すれば、トランスポゾン末端１６、１６’は、非転移鎖２０、２０’の一部（例えば、鎖３２、３２’）にハイブリダイズされる、転移鎖１８、１８’の一部（鎖３０、３０’）を含む。

【0046】

転移鎖１８は、フローセル凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４の表面官能基に、直接又は間接的に、共有結合又は非共有結合することができる、５’末端官能基２２、第１の増幅ドメイン２６、及びトランスポゾン末端１６の一方の鎖３０に結合した配列決定プライマー配列２８を含む。トランスポゾン末端１６の鎖３０は、転移鎖１８の３’末端に位置する。転移鎖１８と同様に、転移鎖１８’は、フローセル凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４の表面官能基に、共有結合することができる、５’末端官能基２２’、第２の増幅ドメイン２６’、及びトランスポゾン末端１６’の一方の鎖３０’に結合した配列決定プライマー配列２８’を含む。トランスポゾン末端１６の鎖３０’は、転移鎖１８’の３’末端に位置する。

【0047】

５’末端官能基２２、２２’は、ポリマーヒドロゲル２４の表面官能基に、直接又は間接的に、共有結合又は非共有結合することができる、任意の官能基であってよく、したがって、ポリマーヒドロゲル２４の表面官能基に依存する。一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、アジド又はテトラジン表面基を含み、５’末端官能基２２、２２’は、末端アルキン（例えば、ヘキシニル）又は内部アルキンを含み、アルキンは、環状化合物（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ））の一部である。他の例では、ポリマーヒドロゲル２４は、ビオチン表面基で官能化され（本明細書では、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’と呼ぶ）、５’末端官能基２２、２２’もビオチンを含む。これらの例では、追加のストレプトアビジン又はアビジンを添加して、ビオチン基を互いに間接的に結合させる。

【0048】

第１の及び第２の増幅ドメイン２６、２６’は、互いに異なる配列を有するが、各々、ポリマーヒドロゲル２４に結合した、第１及び第２のプライマー３６、３６’と同一の配列を有する。第１の増幅ドメイン２６及びプライマー３６は、第２の増幅ドメイン２６’及びプライマー３６’と共に、タグメント化中に生成された、ＤＮＡ試料断片の増幅を可能にする。

【0049】

第１の増幅ドメイン２６／プライマー３６、及び第２の増幅ドメイン２６’／プライマー３６’に適した配列の例としては、Ｐ５及びＰ７プライマー配列が挙げられる。Ｐ１５及びＰ７プライマー配列；又は本明細書に記載される、ＰＡプライマー配列、ＰＢプライマー配列、ＰＣプライマー配列、及びＰＤプライマー配列の任意の組み合わせ。Ｐ５及びＰ７プライマーの例は、例えば、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑＸ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＭｉＳｅｑＤＸ（登録商標）、ＭｉＮＩＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑＤＸ（登録商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）、ｉＳＥＱ（登録商標）、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）及び他の装置プラットフォーム上での配列決定のために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている、市販のフローセルの表面上で使用される。

【0050】

Ｐ５プライマー配列は、以下の通りである：
Ｐ５ ＃１：５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡｎＣＴＡＣＡＣ（配列番号１）
ここで、「ｎ」は、配列中のウラシルである。
Ｐ５ ＃２：５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡｎＣＴＡＣＡＣ（配列番号２）
ここで、「ｎ」は、配列中のアルケン－チミジン（すなわち、アルケン－ｄＴ）である。

【0051】

Ｐ７プライマー配列は、以下のいずれかであり得る：
Ｐ７ ＃１：５’→３’
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡｎＡＴ（配列番号３）
Ｐ７ ＃２：５’→３’
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣｎＡＧＡＴ（配列番号４）
ここで、「ｎ」は、各配列中の８－オキソグアニンである。

【0052】

Ｐ１５プライマー配列は、以下の通りである：
Ｐ１５：５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡｎＣＴＡＣＡＣ（配列番号５）
式中、「ｎ」はアリル－Ｔである。

【0053】

上記の他のプライマー（ＰＡ－ＰＤ）には、以下のものが含まれる：
ＰＡ ５’→３’
ＧＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＧＴＴＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＧ（配列番号６）
ＰＢ ５’→３’
ＣＧＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴ（配列番号７）
ＰＣ ５’→３’
ＡＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＧＴＣＧＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴ（配列番号８）
ＰＤ ５’→３’
ＧＣＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＴＡＧＣＣＧＧＡＣＴＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＧＣ（配列番号９）

【0054】

ＰＡ－ＰＤについての例示的な配列には示されていないが、これらの配列のいずれも、鎖の任意の点に、切断部位（例えば、ウラシル、８－オキソグアニン、アリル－Ｔなど）を含み得ることが、理解されるべきである。第１の増幅ドメイン２６／プライマー３６、及び第２の増幅ドメイン２６’／プライマー３６’の配列は、オルソゴナルな切断部位（すなわち、一方の切断部位は、他方の切断部位に使用される切断剤に対して感受性ではない）を有するように選択され得、その結果、増幅後、順方向鎖又は逆方向鎖が切断され得、配列決定のために逆方向鎖又は順方向鎖の他方を残す。

【0055】

プライマー３６、３６’はまた、プライマー配列の５’末端に、ポリＴ配列を含み得る。いくつかの例では、ポリＴ領域は、２個のＴ塩基～２０個のＴ塩基を含む。具体例として、ポリＴ領域は、３、４、５、６、７、又は１０個のＴ塩基を含み得る。

【0056】

配列決定プライマー配列２８、２８’は、タグメント化及び増幅後にフローセルに導入された、配列決定プライマーに各々結合する、互いに異なる配列を有する。例として、配列決定プライマー配列２８は、フ順方向鎖断片／断片アンプリコンに相補的である新しい鎖の合成をプライミングする、配列決定プライマーに結合してもよく、配列決定プライマー配列２８’は、逆方向鎖断片／断片アンプリコンに相補的である新しい鎖の合成をプライミングする、配列決定プライマーに結合してもよい。

【0057】

各トランスポソーム複合体１０、１０’のトランスポゾン末端１６、１６’は、鎖３２、３２’に各々ハイブリダイズした鎖３０、３０’を含む。したがって、鎖３０及び３２は相補的であり、鎖３０’、３２’は相補的である。二本鎖トランスポゾン末端１６、１６’は各々、トランスポザーゼ１４、１４’と複合体を形成することができる。例として、トランスポゾン末端１６、１６’の鎖３０、３２及び３０’、３２’は、Ｔｎ５トランスポザーゼの活性の基質として機能する、関連するが同一でない１９塩基対（ｂｐ）の外側末端（例えば、鎖３０、３０’）及び内側末端（例えば、鎖３２、３２’）配列、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識されるモザイク末端、又はＭｕＡトランスポザーゼによって認識されるＲ１末端（例えば、鎖３０、３０’）及びＲ２末端（鎖３２、３２’）であり得る。

【0058】

図１Ｃは、ＤＮＡ試料が導入された後の、凹部１２を示す。ＤＮＡ試料は、水、任意選択的に共溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）、トランスポザーゼのための金属補因子（例えば、酢酸マグネシウム）、及び緩衝塩（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス又はトリス）酢酸塩、ｐＨ７．６）を含み得る、タグメント化緩衝液と共に導入され得る。一例では、任意選択の共溶媒は、最大約１１％の量で存在してもよく、金属補因子は、約３ｍＭ～約５．５ｍＭの範囲の濃度で存在してもよく、緩衝塩は、約７ｍＭ～約１２ｍＭの範囲の濃度で存在してもよい。

【0059】

ＤＮＡ試料（参照番号３４で断片化されて示される）がトランスポソーム複合体１０、１０’を含むフローセルに導入されると、ＤＮＡ試料は断片化され、二本鎖断片３４の両方の鎖３５、３７の５’末端は、トランスポソーム複合体１０、１０’の転移鎖１８、１８’の各々の３’末端に、ライゲーションされる。断片化及びライゲーションは、３０℃以上の温度で起こり得る。一例では、温度は、約３０℃～約５５℃の範囲であり得る。他の例では、温度は、約３５℃～約４５℃の範囲であり得る。二本鎖断片３４の３’末端は、非転移鎖２０、２０’の５’末端にライゲーションされない。したがって、ＤＮＡ断片鎖３５の３’末端と非転移鎖２０’の５’末端との間に、ギャップ３９が存在し、ＤＮＡ断片鎖３７の３’末端と非転移鎖２０’の５’末端との間に、ギャップ３９’が存在する。一例では、各ギャップ３９、３９’は、９塩基対長である。

【0060】

図１Ｄに示すように、次いで、トランスポザーゼ１４、１４’が複合体１０、１０’から除去され、ここで、複合体１０、１０’は、転移鎖１８、１８’を介して断片に結合する。トランスポザーゼ１４、１４’の除去は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）若しくはプロテイナーゼを使用して、又はフローセルを約６０℃に加熱するステップによって、達成され得る。したがって、タグメント化の後、いくつかの例示的な方法は、洗浄溶液をフローセルに導入するステップと、洗浄溶液を含有するフローセルを約６０℃に加熱するステップと、次いで、伸長増幅ミックスをフローセルに導入するステップとを含む。伸長増幅ミックスを導入する前に、温度を約３８℃に低下させてもよい。

【0061】

タグメント化後のフローセルの加熱は、更なる緩衝液又は試薬を含まずに、トランスポザーゼ１４、１４’を変性させるのに十分であり得ることが、見出されている。例示的な伸長増幅ミックスは、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、及びアクセサリータンパク質を含む。例示的な洗浄溶液は、緩衝剤（例えば、トリス）、塩（例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）ポリソルベート）、及び／又はキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む、水溶液である。一例では、洗浄溶液は、水、約２５ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度の塩、約０．０１重量％～約０．１重量％の範囲の量の界面活性剤、及び任意選択的に、キレート剤を含む。洗浄溶液は、比較的高いｐＨ（例えば、約７～約１０の範囲）を有し得る。

【0062】

トランスポザーゼ１４、１４’の除去が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、又は他のカオトロピック剤を使用して達成される場合、この試薬の存在は、例えば、リコンビナーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼなどが関与するその後の酵素反応の、阻害剤として作用し得る。したがって、カオトロピック剤の存在は、その後のライブラリ調製反応、及び／又は増幅反応に、有害な影響を及ぼし得る。この例示的な方法では、カオトロピック剤のキレート剤を添加して、カオトロピック剤を分離することができる。使用されるキレート剤は、使用されるカオトロピック剤に依存する。一例では、カオトロピック剤は、ドデシル硫酸ナトリウムであり、カオトロピック剤のキレート剤は、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、及びメチルベータシクロデキストリンからなる群から選択される、シクロデキストリンである。約１重量％～約４重量％のシクロデキストリンを含有する水溶液を、使用することができる。他の例では、水溶液は、約１重量％～約２重量％のシクロデキストリンを含み得る。シクロデキストリンは、親水性の外部及び疎水性のコアを有する、カップ型構造である。これらの化合物は、親水性分子（例えば、ＳＤＳ又はトランスポザーゼ１４、１４’を除去するために使用される他のカオトロピック剤）と、複合体を形成する能力を有する。特に、ＳＤＳの長い疎水性尾部は、シクロデキストリンのカップに引き込まれ、これは、トランスポザーゼ１４、１４’除去後にＳＤＳを効果的にロックし、下流のライブラリ調製及び／又は増幅において使用されるものを含む、酵素を変性させることを防止する。

【0063】

熱又はカオトロピック剤のいずれが使用されても、トランスポザーゼ１４、１４’の除去は、転移鎖１８、１８’及びそれに各々結合したＤＮＡ断片３５、３７を含む、部分的に適合されたＤＮＡ断片を遊離させる。トランスポザーゼ１４、１４’を除去するためのこの精製工程に続いて、非転移鎖２０、２０’が脱ハイブリダイズされ、排除増幅試薬（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から入手可能なＥｘＡｍｐ試薬）を使用する伸長反応によって、部分的に適合された断片の３’末端に、追加の配列（アダプター）が付加される。ＳＤＳ又は他のカオトロピック剤がシクロデキストリンでキレート化されている例では、フローセルから、ＳＤＳ又は他のカオトロピック剤を除去するために、１回以上の洗浄サイクルを実施する必要なく、伸長反応を実施することができることを理解されたい。伸長反応は、各々の転移鎖１８’、１８’を鋳型として使用して、ＤＮＡ断片３５、３７の３’末端から鋳型依存的に、ヌクレオチドを付加するステップを含む。したがって、ＤＮＡ断片３５は、セクション３０’、２８’、及び２６’に沿って伸長されて、ＤＮＡ断片３５に結合した相補的セクション３０’Ｃ、２８’Ｃ、及び２６’Ｃを生成し、そしてＤＮＡ断片３７は、セクション３０、２８、及び２６に沿って伸長されて、ＤＮＡ断片３７に結合した相補的セクション３０Ｃ、２８Ｃ、及び２６Ｃを生成する。

【0064】

要するに、図１Ｃ及び図１Ｄに示される方法の一例は、間隙領域３８によって分離された凹部１２を含むフローセルに、ＤＮＡ試料を導入するステップと、各凹部１２内に固定された第１のプライマー３６及び第２のプライマー３６’と、第１のトランスポソーム複合体１０は、各凹部１２の各々の中に、又は間隙領域３８上に固定され、第１のトランスポソーム複合体１０は、第１の増幅ドメイン２６を含み、第２のトランスポソーム複合体１０’は、凹部１２の各々の中に、又は間隙領域３８上に固定され、第２のトランスポソーム複合体１０’は、第２の増幅ドメイン２６’を含み、ＤＮＡ試料のタグメント化が第１のトランスポソーム複合体１０及び第２のトランスポソーム複合体１０’の一部で起こり、複数の部分的に適合されたＤＮＡ断片を生成するステップと、フローセルにカオトロピック剤を導入して、第１のトランスポソーム複合体１０及び第２のトランスポソーム複合体１０’の、トランスポザーゼ１４を除去するステップと、カオトロピック剤のキレート剤を導入して、カオトロピック剤を分離するステップと、伸長反応を実施して、部分的に適合されたＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップとを含む。

【0065】

カオトロピック剤及びキレート剤の導入はまた、トランスポソーム複合体１０、１０’がビーズ（例えば、磁気ビーズ）などの、他の基材表面に結合する方法において、使用されてもよい。この例示的な方法は、より一般的には、ＤＮＡ試料及び表面結合トランスポソーム複合体１０、１０’を使用して、タグメント化反応を実施し、それによって、複数の部分的に適合されたＤＮＡ断片を生成するステップと、カオトロピック剤を導入して、トランスポソーム複合体１０、１０’の、トランスポザーゼ１４、１４’を除去するステップと、カオトロピック剤のキレート剤を導入して、カオトロピック剤を分離するステップと、伸長反応を実施して、部分的に適合されたＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップとを含む。この方法は、フローセルから離れて実施され得、次いで、ビーズ（それに結合した完全に適合されたＤＮＡ断片を有する）が、捕捉部位（ビーズを結合させるための）、及びプライマー３６、３６’を含むフローセルに、添加され得る。ビーズは捕捉部位に結合することができ、次いで、完全に適合されたＤＮＡ断片がビーズから放出され、フローセル表面上のプライマーを使用する増幅に曝露され得る。

【0066】

図１Ｃに戻って参照すると、伸長反応から得られた配列は、部分的に適合された断片を完全に適合させ、更なる増幅及びクラスタ生成の準備を整える。

【0067】

クラスタ生成の一例では、図１Ｄに示される完全に適合された断片は、互いから変性され、そして、隣接する相補的プライマー３６、３６’にハイブリダイズするようにループし、そして、ポリメラーゼは、コピーされた鋳型をコピーして二本鎖架橋を形成し、これは、変性されて２つの一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして、隣接する相補的なプライマー３６、３６’にハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスタを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスタが変性される。一例では、逆方向鎖は、逆方向鎖が結合しているプライマー３６又は３６’の切断部位に適した、切断剤によって除去され（例えば、特異的塩基切断）、順方向鋳型鎖／アンプリコンが残る。他の例では、順方向鎖は、順方向鎖が結合するプライマー３６又は３６’の切断部位に適した、切断剤によって除去され（例えば、特異的塩基切断）、逆方向鋳型鎖／アンプリコンが残る。クラスタ化は、凹部１２上に固定された、いくつかの鋳型鎖の形成をもたらす。

【0068】

トランスポソーム複合体１０、１０’の各々のいくつかが、フローセルの単一の凹部１２内に存在し得るので、複数の完全に適合された断片が、タグメント化及び伸長後に、単一の凹部１２内に存在し得る。複数の完全に適合された断片の増幅は、凹部１２内のポリクローナル性（すなわち、各完全に適合された断片の複数のアンプリコン）をもたらし、これは、任意の１つのタイプのアンプリコンのシグナル分解を、より困難にし得る。本明細書に開示される例のいくつかでは、トランスポソーム複合体１０及び／又は１０’は、複合体１０及び／又は１０’のタグメント化効率を低下させるように、修飾される。これらの修飾は、フローセルにわたる１つ以上の凹部１２内のトランスポソーム複合体１０及び／又は１０’の一部を、タグメント化に完全に関与できないようにすることができ、したがって、生成されるＤＮＡ断片のインサートサイズを増加させ、所与の凹部１２内の完全に適合された断片の数を減少させることもできる。

【0069】

トランスポソーム複合体１０及び／又は１０’修飾の一部は、非転移鎖２０、２０’の３’末端で実施される。

【0070】

一例では、タグメント化効率を低下させるための修飾は、ｉ）第１のトランスポソーム複合体１０の一部、又はｉｉ）第２のトランスポソーム複合体１０’の一部、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’の両方の一部の、非転移鎖２０、２０’の３’末端に結合した、フルオロフォアである。適切なフルオロフォアの例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）ファミリーのフルオロフォア（例えば、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７など）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＴＥＴ（商標）Ｄｙｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅなどが挙げられる。フルオロフォアは、その合成中に、且つトランスポソーム複合体１０及び／又は１０’がフローセル表面に結合する前に、非転移鎖２０、２０’の３’末端に付加することができる。この修飾は、トランスポソーム複合体１０又は１０’を部分的に不活性化し、これは、より少ないタグメント化イベントをもたらすか、又はＤＮＡ試料結合をもたらすがタグメント化をもたらさない。

【0071】

トランスポソーム複合体１０及び／又は１０’修飾の他のものは、非転移鎖２０、２０’の５’末端で実施される。

【0072】

一例では、タグメント化効率を低下させるための修飾は、ｉ）第１のトランスポソーム複合体１０の一部、又はｉｉ）第２のトランスポソーム複合体１０’の一部、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’の両方の一部の、非転移鎖２０、２０’の５’末端における、リン酸基の排除である。非転移鎖２０、２０’は、５’リン酸なしで合成され得る。この修飾は、トランスポソーム複合体１０又は１０’を部分的に不活性化し、これは、より少ないタグメント化イベントをもたらすか、又はＤＮＡ試料結合をもたらすがタグメント化をもたらさない。

【0073】

他の例では、タグメント化効率を低下させるための修飾は、ｉ）第１のトランスポソーム複合体１０の一部、又はｉｉ）第２のトランスポソーム複合体１０’の一部、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’の両方の一部の、非転移鎖２０、２０’の５’末端に結合した、フルオロフォアである。フルオロフォアは、トランスポソーム複合体１０、１０’の作製中に、非転移鎖２０、２０’の５’末端に付加されてもよい。

【0074】

更に他の例では、タグメント化効率を低下させるための修飾は、ｉ）第１のトランスポソーム複合体１０の一部、又はｉｉ）第２のトランスポソーム複合体１０’の一部、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’の両方の一部の、非転移鎖２０、２０’の５’末端から、最後の１つ又は複数の塩基を、変更又は除去するステップを含む。例として、５’末端塩基ＣＡＴ又はＣＡＣは、例えば、ＣＡＧと比較して、タグメント化効率を低下させ得る。

【0075】

トランスポソーム複合体１０及び／又は１０’修飾の更に他のものは、転移鎖１８、１８’の３’末端で実施される。タグメント化効率を低下させるためのこの修飾の一例は、ｉ）第１のトランスポソーム複合体１０の一部、又はｉｉ）第２のトランスポソーム複合体１０’の一部、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’の両方の一部の、転移鎖１８、１８’の３’末端に結合した、ジデオキシシトシン、チミン、又はシトシンである。転移鎖１８及び／又は１８’の３’末端におけるジデオキシシトシンの存在は、トランスポソーム複合体１０又は１０’を完全に不活性化し、これは、ＤＮＡ試料結合をもたらすが、タグメント化はもたらさない。転移鎖１８及び／又は１８’の３’末端にチミン又はシトシンが含まれると、タグメント化の効率が低下する。

【0076】

更に、非転移鎖（複数可）２０、２０’の５’末端で実施することができる修飾のいずれも、非転移鎖（複数可）２０、２０’の３’末端で実施することができる修飾のいずれか、又は転移鎖１８、１８’の３’末端で実施することができる修飾のいずれかと、組み合わせることができる。更に、非転移鎖２０、２０’の３’末端で実施することができる修飾のいずれかを、転移鎖１８、１８’の３’末端で実施することができる修飾のいずれかと、組み合わせることができる。

【0077】

図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄは、フローセル凹部１２内に固定された本明細書に開示されるトランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂの他の例を示す。

【0078】

トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂの各々の実施例を、各々、図１４Ａ及び図１４Ｂにより詳細に示す。図示すように、各複合体１０Ａ、１０Ｂは、トランスポゾン末端１６Ａ、１６Ｂに非共有結合した、トランスポザーゼ酵素１４Ａ、１４Ｂを含む。各トランスポゾン末端１６Ａ、１６Ｂは、二本鎖核酸鎖であり、その一方の鎖３０Ａ、３０Ｂは、転移鎖１８Ａ、１８Ｂの一部であり、その他方の鎖３２Ａ、３２Ｂは、非転移鎖２０Ａ、２０Ｂの一部である。換言すれば、トランスポゾン末端１６Ａ、１６Ｂは、非転移鎖２０Ａ、２０Ｂの一部（例えば、鎖３２Ａ、３２Ｂ）にハイブリダイズされる、転移鎖１８Ａ、１８Ｂの一部（鎖３０Ａ、３０Ｂ）を含む。

【0079】

トランスポソーム複合体１０Ａのこの例では、転移鎖１８Ａは、第１の増幅ドメイン２６Ａと、トランスポゾン末端１６Ａの一方の鎖３０Ａに結合した配列決定プライマー配列２８Ａとを含む。トランスポゾン末端１６Ａの鎖３０Ａは、転移鎖１８Ａの３’末端に位置する。

【0080】

転移鎖１８Ａと同様に、トランスポソーム複合体１０Ｂの転移鎖１８Ｂは、第２の増幅ドメイン２６Ｂと、トランスポゾン末端１６Ｂの一方の鎖３０Ｂに結合した配列決定プライマー配列２８Ｂとを含む。トランスポゾン末端１６Ｂの鎖３０Ｂは、転移鎖１８Ｂの３’末端に位置する。

【0081】

トランスポソーム複合体１０、１０’の、第１の及び第２の増幅ドメイン２６、２６’と同様に、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂの、第１の及び第２の増幅ドメイン２６Ａ、２６Ｂは、互いに異なる配列を有するが、ポリマーヒドロゲル２４、２４’（以下に記載するように、ビオチン化されていてもよい）に結合した、第１の及び第２のプライマー３６Ａ、３６Ｂと各々同一の配列を有する。第１の増幅ドメイン２６Ａ及びプライマー３６Ａは、第２の増幅ドメイン２６Ｂ及びプライマー３６Ｂと共に、タグメント化中に生成された、ＤＮＡ試料断片の増幅を可能にする。第１の増幅ドメイン２６／プライマー３６、及び第２の増幅ドメイン２６’／プライマー３６’について、本明細書に記載される配列のいずれも、各々、第１の増幅ドメイン２６Ａ／プライマー３６Ａ、及び第２の増幅ドメイン２６Ｂ／プライマー３６Ｂについて使用され得る。

【0082】

配列決定プライマー配列２８、２８’と同様に、配列決定プライマー配列２８Ａ、２８Ｂは、タグメント化及び増幅後にフローセルに導入された配列決定プライマーに各々結合する、互いに異なる配列を有する。

【0083】

各トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂのトランスポゾン端１６Ａ、１６Ｂは、鎖３２Ａ、３２Ｂに各々ハイブリダイズした、鎖３０Ａ、３０Ｂを含む。したがって、鎖３０Ａ及び３２Ａは相補的であり、鎖３０Ｂ、３２Ｂは相補的である。二本鎖トランスポゾン末端１６Ａ、１６Ｂは、各々、トランスポザーゼ１４Ａ、１４Ｂと、複合体を形成することができる。例として、トランスポゾン末端１６Ａ、１６Ｂの鎖３０Ａ、３２Ａ及び３０Ｂ、３２Ｂは、Ｔｎ５トランスポザーゼの活性の基質として機能する、関連するが同一でない１９塩基対（ｂｐ）の、外側末端（例えば、鎖３０、３０’）及び内側末端（例えば、鎖３２、３２’）配列、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識されるモザイク末端、又はＭｕＡトランスポザーゼによって認識されるＲ１末端（例えば、鎖３０、３０’）及びＲ２末端（鎖３２、３２’）であり得る。

【0084】

トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂは、フローセル表面への非対称結合のために構成される（図１３Ａに示すように）。したがって、複合体の一方、例えば、複合体１０Ａは、フローセル表面への結合のための３’末端基２２Ａを含み、複合体の他方、例えば複合体１０Ｂは、フローセル表面への結合のための５’末端基２２Ｂを含む。したがって、図１３Ａ、図１４Ａ、及び図１４Ｂに示すように、複合体１０Ａの非転移鎖２０Ａは、３’末端基２２Ａを含み、複合体１０Ｂの転移鎖１８Ｂは、５’末端基２２Ｂを含む。３’末端基２２Ａ及び５’末端基２２Ｂは、ポリマーヒドロゲル２４、２４’の表面官能基に直接又は間接的に共有結合又は非共有結合することができる、任意の官能基であってもよく、したがって、ポリマーヒドロゲル２４、２４’の表面官能基に依存する。一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、アジド、又はテトラジン表面基を含み、３’末端基２２Ａ及び５’末端基２２Ｂは、各々、末端アルキン（例えば、ヘキシニル）、又は内部アルキンを含み、アルキンは、環状化合物（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ））の一部である。他の例では、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’は、フローセルの凹部１２内に存在し、３’末端基２２Ａ及び５’末端基２２Ｂの各々は、ビオチンである。これらの例では、追加のストレプトアビジン又はアビジンを添加して、ビオチン基を互いに間接的に結合させる。

【0085】

図１３Ａに戻って参照すると、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂをフローセルに導入することができ、フローセルは、間隙領域３８によって分離された凹部１２と、凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４又は２４’（後者は、図２Ａ及び図２Ｂを参照して詳細に記載する）の例とを含む。

【0086】

トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂはまた、約０．１μＭ～約１μＭの範囲の濃度で、キャリア液中に含まれてもよい。トランスポソーム複合流体のこの例のキャリア液体は、水であってもよい。高分子ヒドロゲル２４が使用される場合、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂを、ポリマーヒドロゲル２４の適切な官能基にグラフト化するために、緩衝液及び／又は塩をキャリア液に添加してもよい。緩衝液は、５～１２の範囲のｐＨを有する。本明細書に記載される、中性緩衝液及び／又は塩のいずれも、トランスポソーム複合流体のこの例に添加することができる。

【0087】

グラフト化のために、トランスポソーム複合体流体を、フローセルに導入する。トランスポソーム複合流体は、フロースルー堆積を使用して、導入することができる。グラフト化は、約３５℃～約４５℃の範囲の温度で、約３０時間～約１２０時間の範囲の時間にわたって、実施することができる。グラフト化の間、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂは、ポリマーヒドロゲル２４の、アジド又はテトラジン基の少なくとも一部に結合し、フローセルの間隙領域３８又は縁部分に対して、親和性を有さない。

【0088】

ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’が使用される場合、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂのフローセル表面への結合は、図２Ａ～図５を参照してより詳細に本明細書に記載される、例のいずれかを使用して、実施することができる。簡潔には、アビジン又はストレプトアビジンを使用して、３’及び５’末端２２Ａ、２２Ｂ（この例では、ビオチン化されている）を、本明細書中の「フローセル」の節に記載されるような、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’に結合し得ることが、理解されるべきである。実施例として、アビジン又はストレプトアビジンは、複合体１０Ａ、１０Ｂがフローセルに導入され、インキュベーションされる前に、３’及び５’ビオチン化末端２２Ａ、２２Ｂに予め結合してもよく、又は、アビジン又はストレプトアビジンを、３’及び５’ビオチン化トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂと共にフローセルに導入し、インキュベーションしてもよく、又は、アビジン又はストレプトアビジンをフローセルに導入し、ポリマーヒドロゲル２４と共にインキュベーションし、次いで、３’及び５’ビオチン化トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂを添加し、インキュベーションしてもよく、あるいは、アビジン又はストレプトアビジン及びビオチンを互いに予め結合させ、次いで、フローセルに導入し、そこで、ビオチンをＲ^Ａ基の一部を介して（直接又はリンカーを介して）ポリマーヒドロゲル２４の表面に結合させ、次いで、ビオチン化トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂを、ポリマーヒドロゲル２４’の一部としてストレプトアビジン－ビオチン結合対を含有する、フローセルに導入してもよい。上述したように、これらの方法の各々の更なる詳細は、図２～図５を参照して本明細書に記載される。

【0089】

図１３Ａに示されるフローセルはまた、プライマー３６Ａ、３６Ｂを含む。本明細書に記載される、プライマー３６、３６’及びポリマーヒドロゲル２４又は２４’へのプライマー３６、３６’の好適な結合機構のいずれも、プライマー３６Ａ、３６Ｂに使用され得る。

【0090】

この例では、複数の第１のトランスポソーム複合体（例えば、本明細書において３’結合トランスポソーム複合体１０Ａと呼ぶことができる、トランスポソーム複合体１０Ａ）、及び複数の第２のトランスポソーム複合体（例えば、本明細書において５’結合トランスポソーム複合体１０Ｂと呼ぶことができる、トランスポソーム複合体１０Ｂ）は、１：１超～５：１の範囲の比で、フローセル内に存在する。他の例では、３’ビオチン化トランスポソーム複合体１０Ａ、及び５’ビオチン化トランスポソーム複合体１０Ｂは、４：１の比で、フローセルに導入される。図１３Ｃ及び図１３Ｄを参照してより詳細に説明されるように、フローセル表面に導入され、したがって、所与の範囲内の比で、フローセル表面に存在する、非対称的に結合した複合体１０Ａ、１０Ｂは、通過フィルタパーセンテージを改善し得る。

【0091】

図１３Ｂは、ＤＮＡ試料が導入された後の、凹部１２を示す。ＤＮＡ試料は、水、任意選択的に共溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）、トランスポザーゼのための金属補因子（例えば、酢酸マグネシウム）、及び緩衝塩（例えば、トリス酢酸塩、ｐＨ７．６）を含み得る、タグメント化緩衝液と共に導入され得る。一例では、任意選択の共溶媒は、最大約１１％の量で存在してもよく、金属補因子は、約３ｍＭ～約５．５ｍＭの範囲の濃度で存在してもよく、緩衝塩は、約７ｍＭ～約１２ｍＭの範囲の濃度で存在してもよい。

【0092】

ＤＮＡ試料（参照番号３４で断片化されて示される）が、３’及び５’結合トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂを含むフローセルに導入されると、ＤＮＡ試料は断片化され、二本鎖断片３４の両方の鎖３５、３７の５’末端は、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂの転移鎖１８Ａ、１８Ｂの各々の３’末端に、ライゲーションされる。断片化及びライゲーションは、３０℃以上の温度で起こり得る。一例では、温度は、約３０℃～約５５℃の範囲であり得る。他の例では、温度は、約３５℃～約４５℃の範囲であり得る。二本鎖断片３４の３’末端は、非転移鎖２０Ａ、２０Ｂの５’末端に、ライゲーションされない。したがって、ＤＮＡ断片鎖３７の３’末端と非転移鎖２０Ａの５’末端との間に、ギャップ３９Ａが存在し、ＤＮＡ断片鎖３５の３’末端と非転移鎖２０Ｂの５’末端との間に、ギャップ３９Ｂが存在する。一例では、各ギャップ３９Ａ、３９Ｂは、９塩基対長である。

【0093】

次いで、トランスポザーゼ１４Ａ、１４Ｂは、複合体１０Ａ、１０Ｂから除去され、ここで、複合体１０Ａ、１０Ｂは、転移鎖１８Ａ、１８Ｂを介して、断片３５、３７に結合する。トランスポザーゼ除去１４Ａ、１４Ｂは、フローセルを加熱するステップによって、達成することができる。この例では、洗浄溶液が、フローセルに導入される。洗浄溶液を含有するフローセルを約６０℃に加熱し、次いで、伸長増幅ミックスを、フローセルに導入する。伸長増幅ミックスの導入前に、温度を約３８℃に低下させてもよい。

【0094】

次いで、伸長ミックスを添加して、両端にアダプターを有する、完全に伸長された断片を形成する。伸長反応の２つの実施例を、図１３Ｃ及び図１３Ｄに示す。両方の実施例では、断片３５、３７の伸長は、ＤＮＡ断片３５、３７の３’末端からの鋳型依存様式での、ヌクレオチドの付加を含む。図１３Ｃは、トランスポザーゼ除去１４Ａ、１４Ｂ後に、鎖１８Ａ、２０Ａ及び１８Ｂ、２０Ｂの少なくとも一部がハイブリダイズされたままである場合の、伸長を示す。この例では、伸長反応は、非転移鎖２０Ａ、２０Ｂを置換し、転移鎖１８Ａ、１８Ｂがコピーされることを可能にし、したがって、完全に伸長された（完全に適合された）断片を形成することができる（図１Ｄに示される例と同様に）。図１３Ｄは、トランスポザーゼ除去１４Ａ、１４Ｂの間に、鎖１８Ａ、２０Ａ及び１８Ｂ、２０Ｂの少なくとも一部が脱ハイブリダイズする場合の、伸長を示す。非転移鎖２０Ａ、２０Ｂは比較的短いので、それらの溶融温度は、低くてもよい（例えば、約４０℃～約５０℃）。したがって、トランスポザーゼ除去温度は、トランスポゾン末端の少なくとも一部を脱ハイブリダイズするのに、十分であり得る。対照的に、より長い断片３５、３７は、ハイブリダイズされたままであり得る。より長い断片３５、３７は、より低い融解温度を有する領域（例えば、ＡＴリッチ領域）で脱ハイブリダイズし得るが、全体的なインサートサイズは、脱ハイブリダイズしない、より高い融解温度を有する領域を含むことが、理解されるべきである。これらの領域は、より長い二本鎖断片３５、３７が四散しないようにする。トランスポザーゼ除去温度が６０℃を超えて上昇する場合、インサートサイズはシフトし得、これは二本鎖断片３５、３７の一部の脱ハイブリダイゼーションをもたらし得る。

【0095】

他の例では、トランスポザーゼ除去１４Ａ、１４Ｂは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、又はプロテイナーゼを使用して達成され、その後、洗浄溶液の導入、非転移鎖２０Ｂの脱ハイブリダイゼーション、及び伸長増幅反応が続く。

【0096】

本明細書に開示される実施例のいずれにおいても、ランダムタグメント化は、タグメント化プロセス中に実施することができることを、理解されたい。「ランダムタグメント化」とは、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端が、同一のタイプのトランスポソーム複合体１０Ａ又は１０Ｂ（あるいは１０又は１０’）の各々の３’末端に、ライゲーションされることを意味する。ランダムタグメント化の実施例が図１３Ｂに示されており、ここでは、鎖３５’、３７’の各々が、（複合体１０Ａの）転移鎖１８Ａの３’末端に、各々ライゲーションされる。伸長増幅反応の後、これらの完全に適合された断片は、両方の末端（例えば、元の転移鎖１８Ａ及び相補的部分）に、同一の増幅ドメイン２６Ａを有する。示されていないが、二本鎖断片の両方の鎖が、代替的に、（複合体１０Ｂの）転移鎖１８Ｂの各々の３’末端にライゲーションされ得ることが、理解されるべきである。伸長反応後、これらの完全に適合された断片は、両端に、同一の増幅ドメイン２６Ｂを有する（例えば、元の転移鎖１８Ｂ及び相補的セクションにおいて）。

【0097】

両方の末端に同一の増幅ドメイン２６Ａ又は２６Ｂを有する、完全に適合された断片は、フィルタを通過することができるリードの、パーセンテージを低減することができる。しかしながら、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂの非対称結合、及び５’結合トランスポソーム複合体１０Ｂに対する３’結合トランスポソーム複合体１０Ａの比は、末端に異なる増幅ドメイン２６Ａ、２６Ｂを有する、完全に適合した断片のより高い収率を生成する。

【0098】

フローセル
本明細書に開示される、トランスポソーム複合体１０、１０’、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄは、修飾されていようと非修飾であろうと、フローセル表面に固定される。図１Ａ～図１Ｄに示すように、一例では、トランスポソーム複合体１０、１０’は、フローセルの凹部１２内の、ポリマーヒドロゲル２４に結合する。図１３Ａ～図１３Ｄに示すように、別の実施例では、トランスポソーム複合体１０Ａ、１０Ｂは、フローセルの凹部１２内の、ポリマーヒドロゲル２４、２４’に非対称に結合している。これらの凹部１２が、これらの例の各々に示されているが、複数の凹部１２が、本明細書で記載されるように、基材表面にわたってアレイ状に形成されてもよいことを、理解されたい。

【0099】

本明細書に開示される、フローセルの各例は、間隙領域３８（図１Ａ～図１Ｄを参照）によって分離された凹部１２を有する基材４０と、凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４とを含む。このタイプの基材は、パターン化基材と称されてもよく、フローセルは、一緒に結合した２つのパターン化基材を含んでもよく、又は蓋に結合した単一のパターン化基材を含んでもよい。

【0100】

流路は、基材（複数可）と蓋との間に、画定される。流路１２の深さは、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用して、材料を堆積させて、基材（複数可）と蓋とを結合させる場合、単層の厚さと同程度であり得る。他の例では、流路の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。一例では、深さは、約１０μｍ～約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは、約１０μｍ～約３０μｍの範囲であり得る。更に別の例では、深さは、約５μｍ以下である。流路の深さは、上で指定した値よりも大きくてもよく、それよりも小さくてもよく、又はそれらの間であってもよいことを、理解すべきである。

【0101】

各流路は、入口及び出口（図示せず）と、流体連通している。入口及び出口は、フローセルの対向する端部に、配置されてもよい。各々の流路の入口及び出口は、望ましい流体の流れを可能にする、流路の長さ及び幅に沿った、任意の場所に配置されてもよい。

【0102】

入口は、流体が流路内に導入されることを可能にし、出口は、流体が流路から抜き出されることを可能にする。入口及び出口の各々は、流体の導入及び排出を制御する流体制御システム（例えば、リザーバ、ポンプ、バルブ、廃棄物容器などを含む）に流体接続される。

【0103】

基材４０は、そこに画定された凹部１２を有する、単層のベース支持体であってもよいし、又はその上に配置された他の層を含み、そこに画定された凹部１２を有する、多層構造であってもよい。

【0104】

好適な単一層ベース支持体の例としては、エポキシシロキサン、ガラス、修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎｓ／ｃｙｃｌｏ－ｏｌｅｆｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ、ＣＯＰ）（ＺｅｏｎのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリイミドなどを含む）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／酸化セラミック、シリカ、溶融シリカ、シリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、シリコン及び修飾シリコン（例えば、ホウ素ドープｐ＋シリコン）、窒化シリコン（Ｓｉ_３Ｎ_４）、酸化シリコン（ＳｉＯ_２）、五酸化タンタル（Ｔａ_２Ｏ_５）又は他の酸化タンタル（ＴａＯ_ｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ_２）、炭素、金属、無機ガラスなどが挙げられる。

【0105】

多層構造の例は、ベース支持体、及びベース支持体上の少なくとも１つの他の層を含む。

【0106】

他の層は、酸化タンタル（例えば、Ｔａ_２Ｏ_５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ_２Ｏ_３）、酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ_２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ_２）などの無機酸化物であってもよい。無機酸化物は、凹部１２及び隙間領域３８を形成するために、例えば、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して、選択的に施用され得る。

【0107】

あるいは、他の層は、ベース支持体に施用し、次いでパターン化することができる、ポリマー樹脂であってもよい。好適な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサン系樹脂、非多面体オリゴマーシルセスキオキサンエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、非晶質フルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング（ｄｕｎｋ ｃｏａｔｉｎｇ）、スピンコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシング、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などが挙げられる。好適なパターン形成技術としては、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス加工技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などが挙げられる。

【0108】

一例では、基材４０は、約２ｍｍ～約３００ｍｍ、例えば、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有する、円形シート、パネル、ウェハ、ダイなどであってもよいか、又は最大約１０フィート（約３メートル）の最大寸法を有する、長方形シート、パネル、ウェハ、ダイなどであってもよい。寸法の実施例を提供してきたが、任意の好適な寸法を有する基材４０が使用できることを、理解されたい。

【0109】

凹部１２は、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス加工技術、成形技術、マイクロエッチング技術などの、任意の適切なパターン形成技術を使用して、基材４０に形成することができる。

【0110】

規則的、反復的、及び非規則的なパターンを含む、凹部１２及び間隙領域３８の多くの異なるレイアウトが、想定され得る。一例では、凹部１２又は間隙領域３８は、密に充填して密度を向上させるために、六角形の格子を生成するように、配置される。他のレイアウトは、例えば、長方形のレイアウト、三角形のレイアウトなどを含んでもよい。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの他の例では、レイアウト又はパターンは、凹部１２及び間隙領域３８の繰り返し配置とすることができる。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、凹部１２及び間隙領域３８のランダムな配置とすることができる。

【0111】

レイアウト又はパターンは、画定された領域内の、複数の凹部１２の密度（数）に関して、特徴付けることができる。例えば、凹部１２は、１ｍｍ^２当たり、約２００万の密度で存在してもよい。例えば、１ｍｍ^２当たり約１００、１ｍｍ^２当たり約１，０００、１ｍｍ^２当たり約１０万、１ｍｍ^２当たり約１００万、１ｍｍ^２当たり約２００万、１ｍｍ^２当たり約５００万、１ｍｍ^２当たり約１０００万、１ｍｍ^２当たり約５０００万、又はそれ以上若しくはそれ以下の密度を含む、異なる密度に調整され得る。密度は、上記の範囲から選択される、下限値のうちの１つと上限値のうちの１つとの間であり得、又は他の密度（所与の範囲外）が使用され得ることを更に理解すべきである。実施例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離された、複数の凹部１２を有するものとして特徴付けることができ、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍで分離された、複数の凹部１２を有するものとして特徴付けることができ、低密度アレイは、約１μｍ超で分離された、複数の凹部１２を有するものとして特徴付けることができる。

【0112】

複数の凹部１２のレイアウト又はパターンは、平均ピッチ、又は１つの凹部１２の中心から隣接する凹部１２の中心までの間隔（中心間間隔）、又は１つの凹部１２の右縁部から隣接する凹部１２の左縁部までの間隔（縁部間間隔）に関して、更に又は代替的に特徴付けられてもよい。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、約５０ｎｍ、約０．１５μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍ、又はそれ以上若しくはそれ以下とすることができる。の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択される、低い方の値のうちの１つと高い方の値のうちの１つとの間であり得る。一例では、凹部１２は、約１．５μｍのピッチ（中心間間隔）を有する。平均ピッチ値の例を提供してきたが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解されたい。

【0113】

各凹部１２のサイズは、その容積、開口部面積、深さ、並びに／又は直径（凹部１２が円形の場合）、若しくは長及び幅によって、特徴付けられ得る。例えば、容積は、約１×１０^－３μｍ^３～約１００μｍ^３の範囲に及び、例えば、約１×１０^－２μｍ^３、約０．１μｍ^３、約１μｍ^３、約１０μｍ^３、又はそれ以上若しくはそれ以下であり得る。別の例では、開口部面積は、約１×１０^－３μｍ^２～約１００μｍ^２の範囲に及び、例えば、約１×１０^－２μｍ^２、約０．１μｍ^２、約１μｍ^２、少なくとも約１０μｍ^２、又はそれ以上若しくはそれ以下であり得る。更に別の例では、深さは、約０．１μｍ～約１００μｍの範囲に及び、例えば、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、又はそれ以上若しくはそれ以下であり得る。別の例では、深さは、約０．１μｍ～約１００μｍの範囲に及び、例えば、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、又はそれ以上若しくはそれ以下であり得る。更に別の例では、直径又は長さ及び幅の各々は、約０．１μｍ～約１００μｍの範囲に及び、例えば、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、又はそれ以上若しくはそれ以下であり得る。

【0114】

基材４０は、流路の長さに延在し、及び１つの流路を隣接する流路から分離する、間隙様領域を画定する、縁部領域を含んでもよい。縁部領域は、２つの基材４０を互いに取り付けることができる、又は１つの基材４０を蓋に取り付けることができる、結合領域を提供する。

【0115】

凹部１２は、ポリマーヒドロゲル２４のための、指定領域を提供する。本明細書に開示の一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、アクリルアミドコポリマーを含む。この例では、アクリルアミドコポリマーは、以下の構造を有し：

【0116】

【化1】

【0117】

式中、
Ｒ^Ａは、アジド、又はテトラジン、又はアルキンに結合することができる任意の他の官能基であり、
Ｒ^ＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
Ｒ^Ｃ、Ｒ^Ｄ、及びＲ^Ｅは各々、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ_２）_ｐ－の各々は、任意選択で置換され得、
ｐは１～５０の範囲の整数であり、
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり、且つ
ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である。

【0118】

構造（Ｉ）によって表されるアクリルアミドコポリマーの一具体例は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭ）である。

【0119】

当業者は、構造（Ｉ）における繰り返される「ｎ」及び「ｍ」個の特徴の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターニング、又はそれらの組み合わせ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。

【0120】

アクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａ～約１５００ｋＤａ又は約１０ｋＤａ～約１０００ｋＤａの範囲であり得るか、あるいは特定の例では、約３１２ｋＤａであり得る。

【0121】

いくつかの例では、アクリルアミドコポリマーは、線状ポリマーである。他のいくつかの例では、アクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。

【0122】

いくつかの例では、ゲル材料は、構造（Ｉ）の変形であり得る。一例では、アクリルアミドユニットはＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド

【0123】

【化2】

【0124】

で置き換えられ得る。他の実施例では、構造（Ｉ）中のアクリルアミドユニットは、

【0125】

【化3】

【0126】

で置換され得、式中、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、及びＲ^Ｆは、各々、Ｈ、又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ^Ｇ、及びＲ^Ｈは、各々、Ｃ１～Ｃ６アルキルである（アクリルアミドの場合のようにＨではない）。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。別の例では、アクリルアミドユニットに加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドが使用され得る。この例では、構造（Ｉ）は、繰り返される「ｎ」及び「ｍ」個の特徴に加えて、

【0127】

【化4】

【0128】

を含み得、式中、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、及びＲ^Ｆは、各々Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ^Ｇ及びＲ^Ｈは、各々Ｃ１～Ｃ６アルキルである。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。

【0129】

ポリマーヒドロゲルの別の例として、構造（Ｉ）における繰り返される「ｎ」個の特徴は、構造（ＩＩ）を有する複素環アジド基を含むモノマーで置換され得て：

【0130】

【化5】

【0131】

式中、Ｒ^１は、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ_２は、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｌは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される２～２０個の原子を含む線状鎖を含むリンカーであり、その鎖中の炭素原子及び任意の窒素原子上に１０個の任意選択の置換基を含み、Ｅは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される１～４個の原子を含む線状鎖であり、その鎖中の炭素原子及び任意の窒素原子上に任意選択の置換基を含み、Ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ４アルキルがＮに付着したＮ置換アミドであり、Ｚは、窒素含有複素環である。Ｚの例としては、単環構造又は縮合構造として存在する５～１０炭素含有環員が挙げられる。Ｚのいくつかの具体的な例としては、ピロリジニル、ピリジニル、又はピリミジニルが挙げられる。

【0132】

更に別の例として、ゲル材料は、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の各々の繰り返し単位を含み得て：

【0133】

【化6】

【0134】

式中、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^１ｂ及びＲ^２ｂの各々は、水素、任意選択で置換アルキル又は任意選択で置換フェニルから独立して選択され、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂの各々は、水素、任意選択で置換アルキル、任意選択で置換フェニル、又は任意選択で置換Ｃ７～Ｃ１４アラルキルから独立して選択され、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、任意選択で置換アルキレンリンカー又は任意選択で置換ヘテロアルキレンリンカーから独立して選択される。

【0135】

いくつかの例では、ポリマーヒドロゲル２４は、ビオチン化されている。これらの例では、ビオチンは、Ｒ^Ａ基の一部（すなわち、アジド、テトラジン、又はアルキンに結合することができる他の官能基）を介して、ポリマーヒドロゲル２４の表面に結合する。ビオチンは、Ｒ^Ａ基の一部かに共有結合することができる、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）などのリンカーに結合する。ビオチンとリンカーとの組み合わせは、少なくとも図２Ａ及び図２Ｂにおいて参照番号４２で示される、ビオチン含有リンカーの一例である。

【0136】

他の例では、ストレプトアビジン及びビオチンは互いに結合しており、ビオチンは、Ｒ^Ａ基の一部（すなわち、アジド、テトラジン、又はアルキンに結合することができる他の官能基）を介して、ポリマーヒドロゲル２４の表面に結合する。ビオチンは、Ｒ^Ａ基の一部に共有結合することができる、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）などのリンカーに結合してもよい。この例では、ビオチン含有リンカーは、リンカー、ビオチン、及びストレプトアビジンを含む。

【0137】

更に他の例では、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）リンカーは、ポリマーヒドロゲル２４のＲ^Ａ基の一部に結合することができ、ビオチンは結合しない。これらの例では、ビオチンは、ポリマーヒドロゲル２４が凹部１２に施用された後に、添加され得る。

【0138】

ポリマーヒドロゲル２４を凹部１２に導入するために、ポリマーヒドロゲル２４の混合物を生成し、次いで、基材４０に施用することができる。一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、（例えば、水との、又はエタノール及び水との）混合物中に存在してもよい。次いで、混合物は、スピンコーティング、又は浸漬若しくはディップコーティング、又は陽圧若しくは陰圧下での材料の流れ、又は他の好適な技術を使用して、基材表面に施用することができる。これらのタイプの技術は、ポリマーヒドロゲル２４を、凹部１２内に、及び間隙領域３８上に、被せて堆積させる。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術などを伴う）は、ポリマーヒドロゲル２４を、凹部１２内に特異的に堆積させ、間隙領域３８上には堆積させないように、使用することができる。

【0139】

いくつかの例では、基材４０を活性化してもよく、次いで、混合物（ポリマーヒドロゲル２４を含む）を、基材表面に施用してもよい。一例では、シラン又はシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）は、蒸着、スピンコーティング、又は他の堆積方法を使用して、基材４０の表面に堆積され得る。他の例では、基材４０は、ポリマーヒドロゲル２４に結合することができる、表面活性化剤（複数可）（例えば、－ＯＨ基）を生成するために、プラズマアッシングに曝露されてもよい。

【0140】

施用された混合物は、ポリマーヒドロゲル２４を硬化させるために、硬化プロセスに曝露されてもよい。一例では、硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。

【0141】

一部の例では、次いで、凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４を少なくとも実質的に無傷のまま残しながら、間隙領域３８からポリマーヒドロゲル２４を除去するために、研磨が実施されてもよい。研磨プロセスは、それらの領域３８において、下にある基材に悪影響を及ぼすことなく、ポリマーヒドロゲル２４、２６を間隙領域３８から除去することができる化学スラリー（例えば、研削剤、緩衝液、キレート剤、界面活性剤、及び／又は分散剤を含む）を使用して実行され得る。代替的に、研磨は、研磨剤粒子を含まない溶液により実行してもよい。

【0142】

化学的スラリーは、化学機械研磨システムで使用されて、間隙領域３８の表面を研磨し得る。研磨ヘッド（複数可）／パッド（複数可）、又は他の研磨ツール（複数可）は、間隙領域３８上に存在し得るポリマーヒドロゲル２４を、ポリマーヒドロゲル２４を凹部１２内に少なくとも実質的にそのまま残したまま、研磨することができる。一例として、研磨ヘッドは、Ｓｔｒａｓｂａｕｇｈ ＶｉＰＲＲ ＩＩ研磨ヘッドであってもよい。

【0143】

クリーン化及び乾燥プロセスは、研磨後に実行され得る。クリーン化プロセスは、水浴及び超音波処理を利用し得る。水浴は、約２２℃～約３０℃の範囲の、比較的低温にて維持されてもよい。乾燥プロセスは、スピン乾燥、又は別の好適な技術を介した乾燥を伴い得る。

【0144】

フローセルの各例はまた、プライマー３６、３６’、及びトランスポソーム複合体１０、１０’を含む。プライマー３６、３６’は、第１の及び第２の増幅ドメイン２６、２６’について本明細書に記載された、プライマー配列のいずれか２つを含む。プライマー３６、３６’の５’末端は、ポリマーヒドロゲル２４の化学に依存して変化する。図１Ａ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４、及び図５を参照して、プライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’が、フローセル内でどのように結合し得るかの、異なる例を記載する。

【0145】

図１Ａに示すように、プライマー３６、３６’の両方、及びトランスポソーム複合体１０、１０’の両方は、凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４に結合している。一例では、プライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’の５’末端は、ポリマーヒドロゲル２４の、アジド、及び／又はテトラジン官能基に共有結合することができる、官能基を含む。例として、５’末端官能基２２、２２’は、末端アルキン（例えば、ヘキシニル）、又は内部アルキンであってもよく、アルキンは、環状化合物（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ））の一部である。

【0146】

プライマー３６、３６’は、約０．５μＭ～約１００μＭの範囲の濃度で、キャリア液体中に含まれ得る。一例では、プライマー濃度は、約５μＭ～約２５μＭの範囲である。

【0147】

プライマー流体のキャリア液体は、水であってもよい。ポリマーヒドロゲル２８の適切な官能基に、プライマー３６、３６’をグラフト化するために、緩衝液及び／又は塩を、キャリア液体に添加してもよい。緩衝液は５～１２の範囲のｐＨを有し、使用される緩衝液は、プライマー３６、３６’の５’末端のアルキンに依存する。中性緩衝液及び／又は塩を、ＢＣＮ末端プライマーをグラフト化するためのプライマー流体に添加してもよく、一方、アルカリ性緩衝液を、銅アシストグラフト化法（例えば、クリック反応）のための、プライマー流体に添加してもよい。銅アシストグラフト化法で使用されるプライマー流体のいずれも、銅触媒を含んでもよい。中性緩衝液の例としては、トリス－ＨＣｌ、若しくはトリス－ＥＤＴＡなどの、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ又はＴＲＩＳ）緩衝液、又は炭酸緩衝液（例えば、０．２５Ｍ～１Ｍ）が挙げられる。硫酸ナトリウム（例えば、１Ｍ～２Ｍ）は、使用され得る適切な塩である。アルカリ性緩衝液の例としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＣＨＥＳ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、及びアルカリ性緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）が挙げられる。

【0148】

グラフト化のために、プライマー流体を、フローセルに導入する。プライマー流体は、フロースルー堆積を使用して、導入されてもよい。グラフト化は、約５５℃～約６５℃の範囲の温度で、約２０時間～約６０時間の範囲の時間にわたって、実施することができる。一例では、グラフト化は、６０℃で約３０分間又は６０分間実施される。より低い温度及びより長い時間、又はより高い温度及びより短い時間も使用され得ることが、理解されるべきである。テトラジン単位へのＢＣＮグラフト化を含むものなどの、いくつかのプライマーグラフト化技法は、室温（例えば、１８℃～約２５℃）で実施され得る。グラフト化の間、プライマー３６、３６’は、ポリマーヒドロゲル２４のアジド基又はテトラジン基の、少なくとも一部に結合し、間隙領域３８又はフローセルの縁部分に対して、親和性を有さない。

【0149】

トランスポソーム複合体１０、１０’はまた、約０．１μＭ～約１μＭの範囲の濃度で、キャリア液中に含まれてもよい。

【0150】

トランスポソーム複合体流体のキャリア液は、水であってもよい。トランスポソーム複合体１０、１０’をポリマーヒドロゲル２４の適切な官能基にグラフト化するために、緩衝液及び／又は塩を、キャリア液に添加してもよい。緩衝液は、５～１２の範囲のｐＨを有する。本明細書に記載の、中性緩衝液及び／又は塩のいずれかを、トランスポソーム複合流体に添加してもよい。

【0151】

グラフト化のために、トランスポソーム複合体流体を、フローセルに導入する。トランスポソーム複合流体は、フロースルー堆積を使用して、導入することができる。グラフト化は、約３５℃～約４５℃の範囲の温度で、約３０時間～約１２０時間の範囲の時間にわたって、実施することができる。一例では、グラフト化は、３７℃で約９０分間又は１２０分間実施される。グラフト化の間、トランスポソーム複合体１０、１０’は、ポリマーヒドロゲル２４の、アジド又はテトラジン基の少なくとも一部に結合し、間隙領域３８又はフローセルの縁部分に対して、親和性を有さない。

【0152】

図１Ａに示すように、別々のトランスポソーム複合体１０、１０’は、溶液中で二量体を形成し、これらの二量体は、ポリマーヒドロゲル２４に結合する。図１Ｂ～図１Ｃは、説明を簡単且つ容易にするために、１つの二量体からの１つのトランスポソーム複合体１０、及び他の二量体からの１つのトランスポソーム複合体１０’を示すことを、理解されたい。

【0153】

トランスポソーム複合体１０、１０’のグラフト化は、フローセル製造中に、実施することができる。あるいは、トランスポソーム複合体流体は、試薬カートリッジに含有されてもよく、トランスポソーム複合体１０、１０’のグラフト化は、試料調製の前に、配列決定機器上で実施されてもよい。

【0154】

図１Ａと同様に、図２Ａ及び図２Ｂは、凹部１２内のポリマーヒドロゲル２４に結合した、プライマー３６、３６’の両方、及びトランスポソーム複合体１０、１０’の両方を示す。図２Ａ及び図２Ｂの結合機構は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の、非共有結合相互作用を利用する。

【0155】

図２Ａ及び図２Ｂに示す例では、ポリマーヒドロゲル２４は、ビオチン化されている。ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’は、ポリマーヒドロゲル２４の表面にグラフト化された、ビオチン含有リンカー４２を含有する。ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’は、ポリマーヒドロゲル２４の、末端アジド又はテトラジン基の一部にビシクロノニン－ビオチン（ＢＣＮ－ビオチン）をグラフト化するステップによって、調製され得る。ビオチン含有リンカー４２は、ポリマーヒドロゲル２４がフローセル表面に添加される前に、又はポリマーヒドロゲル２４がフローセル表面に添加された後に、ポリマーヒドロゲル２４にグラフト化され得る。

【0156】

１つの例示的な方法では、ポリマーヒドロゲル２４は、図１Ａを参照して記載されるように凹部１２に施用され、次いで、ビオチン含有リンカー４２が、ポリマーヒドロゲル２４の表面にグラフトされる。この例では、ビオチン含有リンカー４２は、キャリア流体（例えば、本明細書に記載される、中性緩衝液及び／又は塩を含む水）に添加されてもよく、流体は、フローセルに導入され、インキュベーションされてもよい。グラフト化反応は、約５０℃～約７０℃の範囲の温度で、約３０時間～約１２０時間の範囲の時間にわたって、実施することができる。一例では、ビオチン含有リンカー４２のグラフト化は、６０℃で約１２０分間実施される。グラフト化中、ビオチン含有リンカー４２は、ポリマーヒドロゲル２４の、アジド又はテトラジン基の少なくとも一部に結合し、間隙領域３８又はフローセルの縁部分に対して、親和性を有さない。一旦グラフト化されると、ビオチン含有リンカー４２のビオチン４４は、表面にあり、したがって、続いて導入されるストレプトアビジン４６との相互作用に、利用可能である。

【0157】

図２Ａに示される例では、プライマー３６、３６’は、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’の、末端アジド又はテトラジン基の一部の他のものにグラフト化される。プライマーグラフト化は、図１Ａを参照して本明細書に記載されるように、実行され得る。

【0158】

図２Ａに示される例では使用されるトランスポソーム複合体１０、１０’は、５’末端官能基２２、２２’としてビオチンを含むことが、理解されるべきである。したがって、これらの例示的なトランスポソーム複合体１０、１０’の転移鎖１８、１８’は、５’ビオチン化末端を含む。

【0159】

一例では、これらのビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’は、間隙領域３８によって分離された凹部１２と、凹部１２内のビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’とを含む、フローセルに導入される。この例示的な方法はまた、ストレプトアビジン４６をフローセルに導入するステップと、トランスポソーム複合体１０、１０’及びストレプトアビジン４６をフローセル中でインキュベーションするステップとを含み、それによって、ストレプトアビジン４６は、トランスポソーム複合体１０、１０’の少なくとも一部の５’ビオチン化末端２２、２２’を、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’に各々結合させる。フローセル内でのトランスポソーム複合体１０、１０’及びストレプトアビジン４６のインキュベーションは、室温（例えば、約１８℃～約２５℃）で、約１５分～約６０分の範囲の時間、実施されてもよい。一例では、このインキュベーションは、約２２℃で約３０分間実施される。

【0160】

この例では、トランスポソーム複合体１０、１０’及びストレプトアビジン４６は、トランスポソーム複合体１０、１０’をビオチン含有リンカー４２にグラフト化するために、十分な量のストレプトアビジンが存在するように、約１：１～約１：２の範囲の重量比で、添加されてもよい。

【0161】

図２Ａに示すように、ストレプトアビジン４６は、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’の表面で、ビオチンと相互作用し、５’末端ビオチン官能基２２、２２’と相互作用する。

【0162】

図２Ｂに示される例は、プライマー３６、３６’もビオチン化されることを除いて、図２Ａに示される例と同様である。アルキンを含有するプライマー３６，３６’の５’末端の代わりに、５’末端は、ビオチン４４’を含有する。これらのプライマー３６、３６’は、ビオチン化プライマーと呼ばれる。

【0163】

この例では、ビオチン化トランスポソーム複合体（すなわち、５’末端ビオチン官能基２２、２２’を有する、複合体１０、１０’）、及びビオチン化プライマー（すなわち、５’末端ビオチンを有する、プライマー３６、３６’）は、各々、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’のビオチン含有リンカー４２に結合する。この例では、ストレプトアビジン４６は、所望のビオチン４４－ストレプトアビジン４６－ビオチン２２、２２’相互作用を達成するために、ビオチン化トランスポソーム複合体と共にフローセルに導入され、ストレプトアビジン４６は、所望のビオチン４４－ストレプトアビジン４６－ビオチン４４’相互作用を達成するために、ビオチン化プライマーと共にフローセルに導入される。したがって、この例では、第１の及び第２のビオチン化プライマー（３６、３６’と４４’）は、ストレプトアビジン４６を介して、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’に固定される。第１のビオチン化トランスポソーム（ビオチン５’末端官能基２２を有する１０’）は、ストレプトアビジン４６を介してビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’に固定され、第２のビオチン化トランスポソーム複合体（ビオチン５’末端官能基２２’を有する１０’）は、ストレプトアビジン４６を介してビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’に固定される。

【0164】

ビオチン－ストレプトアビジン相互作用は可逆的であるため、図２Ｂに示されるフローセルの例は、再利用可能であり得る。例えば、ＤＮＡ試料タグメント化、断片増幅、クラスタリング、及び配列決定の後、ビオチンストレプトアビジン切断組成物を、フローセルに導入することができる。ビオチンストレプトアビジン切断組成物の例としては、約９５％ホルムアミド及び約１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又は約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬、及び残部の塩緩衝液が挙げられる。適切な反応温度において、これらの切断組成物は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を破壊し、したがって、ビオチン２２、２２’、４４’に結合したもの（例えば、ＤＮＡ断片、新生鎖など）を放出する。あるいは、ビオチン及び／又はデスチオビオチンによる熱洗浄は、新たに添加されたビオチン及び／又はデスチオビオチンを、既に結合したビオチンと競合させる。

【0165】

したがって、図２Ｂに示される例は、間隙領域３８によって分離された凹部１２を含む基材４０と、凹部１２内のビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’と、凹部１２内に固定された第の１及び第２のビオチン化プライマー（３６、３６’及び４４’）と、凹部１２内に固定された第１のビオチン化トランスポソーム複合体（ビオチン５’末端官能基２２を有する１０’）であって、第１の増幅ドメイン２６を含む、第１のビオチン化トランスポソーム複合体と、凹部１２内に固定された第２のビオチン化トランスポソーム複合体（ビオチン５’末端官能基２２’を有する１０’）であって、第２の増幅ドメイン２６’を含む、第２のビオチン化トランスポソーム複合体とを含む、再利用可能なフローセルである。

【0166】

他の例では、ストレプトアビジン４６は、ビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’がフローセルに導入される前に、フローセルに導入されてもよい。ストレプトアビジン４６は、室温でフローセルに導入されてもよく、ポリマーヒドロゲル２４’のビオチン４４へのストレプトアビジン４６の結合は、３０分未満で生じてもよい。次いで、ビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’をフローセルに導入し、インキュベーションして、プレアセンブルされたストレプトアビジン４６に結合させることができる。

【0167】

更に他の例では、ストレプトアビジン４６は、フローセルに導入される前に、ビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’と混合されてもよい。ストレプトアビジン４６、及びビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’は、室温で、約３０分以下インキュベーションされてもよい。これは、ビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’上に、ストレプトアビジンをプレアセンブルする。次いで、ストレプトアビジン－ビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’をフローセルに導入し、インキュベーションして、ポリマーヒドロゲル２４’のビオチンに結合させることができる。

【0168】

更に他の例では、ストレプトアビジン４６及びビオチン４４は、ストレプトアビジン－ビオチン結合対を形成するために互いに予め結合し、次いで、ストレプトアビジン－ビオチン結合対のビオチン４４は、Ｒ^Ａ基のうちのいくつかを介してポリマーヒドロゲル２４の表面に結合する（すなわち、アジド、テトラジン、又はアルキンに結合することができる他の官能基）。ストレプトアビジン－ビオチン結合対のビオチン４４は、Ｒ^Ａ基の一部に共有結合することができる、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）などのリンカーに結合していてもよい。この例では、ビオチン化トランスポソーム複合体１０、１０’を、ポリマーヒドロゲル２４’の一部としてストレプトアビジン－ビオチン結合対を含有する、フローセルに導入することができる。

【0169】

更に他の例では、トランスポソーム複合体１０、１０’は、ビオチン－ストレプトアビジン－ビオチンを使用して完全にアセンブルすることができ、ビオチンは、他のビオチン４４に結合したストレプトアビジン４６に結合した、リンカー２２、２２’である。この例では、完全にアセンブルされたトランスポソーム複合体１０、１０’のビオチン４４に結合することができる、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）などの表面基又は表面結合リンカーを含む、ポリマーヒドロゲル２４が使用される。

【0170】

図１Ａ、図２Ａ、及び図２Ｂに示されるフローセルの１つの特定の例は、間隙領域３８によって分離された凹部１２を有する基材４０と、凹部１２内に固定された第１の及び第２のプライマー３６，３６’と、凹部１２内に固定された第１のトランスポソーム複合体１０であって、第１の増幅ドメイン２６を含む、第１のトランスポソーム複合体と、凹部１２内に固定された第２のトランスポソーム複合体１０’であって、第２の増幅ドメイン２６’を含む、第２のランスポソーム複合体１０’とを含み、ｉ）第１のトランスポソーム複合体１０の一部、又はｉｉ）第２のトランスポソーム複合体１０’の一部、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’の両方の一部は、タグメント化効率を低減するための修飾を含む。本明細書に記載されるトランスポソーム複合体修飾のいずれかを使用することができ、図１Ａ、図２Ａ、及び図２Ｂを参照して記載される、結合機構のいずれかを使用することができる。

【0171】

フローセルの他の例は、空間的に分離された配置で、基材表面に結合したトランスポソーム複合体１０、１０’を含む。いくつかの例を、図３Ａ、図３Ｂ、図４、及び図５に示す。フローセルのこれらの例は、間隙領域３８によって分離された凹部１２を有する基材４０と、凹部１２内に固定された第１の及び第２のプライマー３６，３６’と、第１の増幅ドメイン２６を含む第１のトランスポソーム複合体１０と、第２の増幅ドメイン２６’を含む第２のトランスポソーム複合体１０’とを含み、ｉ）第１の及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’は、各々、凹部１２の異なる領域Ａ、Ｂに固定され（図３Ａ及び図３Ｂ）、又はｉｉ）第１の及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’は、各々、凹部１２内及び間隙領域３８上に固定され（図４）、又はｉｉｉ）第１及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’は、各々、間隙領域３８の異なる領域Ｃ、Ｄに固定される（図５）。

【0172】

図３Ａに示される例では、ポリマーヒドロゲル２４は、２つの領域Ａ、Ｂを含む。一方の領域Ａには、第１のプライマー３６及び第１のトランスポソーム複合体１０が結合しており、他方の領域Ｂには、第２のプライマー３６’及び第２のトランスポソーム複合体１０’が結合している。

【0173】

一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、領域Ａ、Ｂ全体にわたって化学的に同一であり、適切な技法を使用して、プライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’を、各々の領域Ａ、Ｂに固定することができる。例えば、両方の領域Ａ、Ｂにわたるポリマーヒドロゲル２４は、アルキン（例えば、ＢＣＮ）に結合することができる、アジド及び／又はテトラジンを含むことができる。適切な技術の一例は、フォトレジストの使用を含んでもよい。この例では、フォトレジストを現像して、一方の領域Ａをマスクし、表面化学（例えば、プライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’）を他方の領域Ｂに加える。次いで、フォトレジストを除去し、領域Ｂ又はその表面化学に悪影響を及ぼさない条件下で、領域Ａに表面化学を加える。適切な技術の他の例は、アルミニウムなどの犠牲層の使用を含むことができる。この例では、犠牲層は、凹部１２の一部（例えば、半分）をマスクするように、基材４０に施用される。凹部１２の他の部分（例えば、他の半分）は、露出したままである。凹部の露出部分は、例えば、適切なシランを堆積させる（例えば、ＣＶＤを使用してノルボルネンシランを堆積させる）ことによって、活性化されてもよい。この例では、ポリマーヒドロゲル２４、Ａは、犠牲層の上、及び凹部１２の露出され活性化された部分の上に施用される。次いで、犠牲層がリフトオフされ、これにより、上にあるポリマーヒドロゲル２４が除去され、凹部１２の以前に覆われていた部分が露出される。凹部１２の他の部分上のポリマーヒドロゲル２４、Ａは、そのままである。プライマー３６及びトランスポソーム複合体１０は、次いで、ポリマーヒドロゲル２４、Ａにグラフト化され得る。一例では、プライマー３６グラフト化は、ポリマーヒドロゲル２４、Ａのアジド還元、その後の、ＮＨＳ－テトラジン剤の適用、その後の、ＢＣＮ末端トランスポソーム複合体１０及びＢＣＮ末端プライマー３６のグラフト化を含む。ポリマーヒドロゲル２４、Ａは、任意の未反応テトラジン基を不活性化するために、キャッピング試薬に曝露されてもよい。基材４０は、プライマー３６及び複合体１０に対して親和性を有さないので、凹部１２の露出部分は、影響を受けない。次に、基材４０を、例えば、ノルボルネンシランの溶液に曝露することによって、活性化することができる。次いで、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂは、領域Ａ又はその表面化学に悪影響を及ぼさない条件下（例えば、高イオン強度下（例えば、１０×ＰＢＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの存在下））で施用され得る。プライマー３６’及びトランスポソーム複合体１０’を、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂにグラフト化することができる。適切な技法の更に他の例は、事前グラフトされたプライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’を含み、事前グラフト化ポリマー材料を、領域Ａ、Ｂに、逐次的且つ選択的に適用するステップを含み得る。いくつかの例示的な方法が提供されているが、プライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’を、各々の領域Ａ、Ｂに固定するために、任意の他の方法が使用され得ることが、理解されるべきである。

【0174】

更に他の例では、ポリマーヒドロゲル２４の領域Ａ、Ｂは、化学的に異なっていてもよい（すなわち、一方の領域Ａがプライマー３６をグラフトすることができ、他方の領域Ｂがプライマー３６’をグラフトすることができるように、オルソゴナルであってもよい）。一例では、各々のプライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’の結合のために、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４を、領域Ａとして施用することができ、アジド又はテトラジン末端ポリマーヒドロゲル２４を、領域Ｂとして施用することができる。他の例では、領域Ａのポリマーヒドロゲル２４は、テトラジン末端基を有し、領域Ｂのポリマーヒドロゲル２４は、アルキン（非ＢＣＮ）末端基を有する。この例では、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）で終端された、プライマー３６及び複合体１０と、ピコリルアジドで終端された、プライマー３６’及び複合体１０’とを、ポリマーヒドロゲル２４の領域Ａ及び領域Ｂに、各々同時にグラフト化することができる。更に他の例では、領域Ａのポリマーヒドロゲル２４は、テトラジン末端基を有し、領域Ｂのポリマーヒドロゲル２４は、ジベンゾシクロオクチン末端基を有する。この例では、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）で終端された、プライマー３６及び複合体１０と、ピコリルアジドで終端された、プライマー３６’及び複合体１０’とを、ポリマーヒドロゲル２４の領域Ａ及び領域Ｂに、各々同時にグラフト化することができる。いくつかの例が提供されているが、オルソゴナルな化学の任意の組み合わせが、プライマー３６及び３６’を各々グラフトするために、領域Ａ及びＢにおいて使用され得ることが、理解されるべきである。

【0175】

図４に示される例では、ポリマーヒドロゲル２４は、２つの領域Ａ、Ｂを含む。一方の領域Ａには、第１のプライマー３６及び第１のトランスポソーム複合体１０が結合しており、他方の領域Ｂには、第２のプライマー３６’が結合している。この例では、第２のトランスポソーム複合体１０’は、間隙領域３８に結合している。図３Ａを参照して記載される方法を使用して、プライマー３６及び第１のトランスポソーム複合体１０を、領域Ａに結合させ、プライマー３６’を、領域Ｂに結合させることができる。この例では、間隙領域３８は、第２のトランスポソーム複合体１０’をそこに結合させることができる材料４８を、そこに選択的に添加することができる。間隙領域３８上に材料４８を選択的に施用するために、選択的堆積技術又は塩排除法を使用することができる。

【0176】

図５に示す例では、ポリマーヒドロゲル２４は、２つの領域Ａ、Ｂを含む。一方の領域Ａには、第１のプライマー３６が結合しており、他方の領域Ｂには、第２のプライマー３６’が結合している。この例では、第１の及び第２のトランスポソーム複合体１０、１０’は、間隙領域３８の領域に結合する。図３Ａを参照して記載した方法を使用して、プライマー３６を領域Ａに結合させ、プライマー３６’を領域Ｂに結合させることができる。トランスポソーム複合体１０、１０’のリンカー２２、２２’は、間隙領域３８に施用された材料４８、又は基材４０（材料４８が使用されない場合）に、結合するように、選択することができる。

【0177】

本明細書に開示されるプライマー３６、３６’及びトランスポソーム複合体１０、１０’の任意の例は、図３Ａ、図４、及び図５を参照して記載される、フローセルにおいて使用され得る。

【0178】

更に他の例では、トランスポソーム複合体１０、１０’の空間的に分離された配置は、複数の深さの凹部１２’を使用して達成される。凹部１２’を、図３Ｂに示す。空間的な分離を可能にするステップに加えて、この特定の凹部１２’の使用はまた、増加したインサートサイズをもたらし得る。

【0179】

複数深さの凹部１２’は、浅部８４及び深部８６を含む。浅部８４及び深部８６の深さは、凹部１２について本明細書に記載された範囲内であるが、深部８６は、浅部８４よりも大きい深さを有する。

【0180】

図３Ｂに示すように、ポリマーヒドロゲル２４は、複数の深さの凹部１２’内の表面上に施用される。図３Ｂには示されていないが、間隙領域３８がポリマーヒドロゲル２４を含まないままである限り、ポリマーヒドロゲル２４は、複数深さの凹部１２’内の表面（底面及び側壁を含む）のすべてに沿って、共形的にコーティングされてもよいことを理解されたい。本明細書に記載のポリマーヒドロゲル２４の任意の例が、この例で使用され得る。

【0181】

図３Ｂに示すように、第１のプライマーセット（切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１、及び切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１を含む）は、浅部８４内の表面上に固定され、第１のトランスポソーム複合体１０は、浅部８４内の表面上に固定され、第１のトランスポソーム複合体１０は、本明細書に記載される第１の増幅ドメイン２６を含み、深部８６の表面に固定された第２のプライマーセット（切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２、及び切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２）と、深部８６の表面に固定された第２のトランスポソーム複合体１０’であって、第２の増幅ドメイン２６’を含む第２のトランスポソーム複合体１０’と含む。切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１、切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１、切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２、及び切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２は、図１７を参照してより詳細に記載される。これらの例では、第１の増幅ドメイン２６は、例えば、切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２及び切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１と同一の配列を有し、第２の増幅ドメイン２６は、例えば、切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２及び切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１と同一の配列を有する。

【0182】

プライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１、３６Ｃ_２、３６Ｄ_２、及びトランスポソーム複合体１０、１０’は、それらをポリマーヒドロゲル２４に結合させることを可能にする、５’官能基を含む。本明細書に記載の例のいずれか、例えば、末端アルキン（例えば、ヘキシニル）又は内部アルキン、を使用することができ、アルキンは、環状化合物（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ））の一部である。

【0183】

図３Ｂに示される構成を作製するための方法の例が、図２６Ａ～図２６Ｄに概略的に示される。単一の多重深さの凹部１２’が示されているが、本方法は、基材４０内に多重深さ凹部１２’のアレイを生成してもよいことを、理解されたい。

【0184】

本方法は、概して、間隙領域３８によって分離された複数の深さの凹部１２’を有する基材４０上に、ポリマーヒドロゲル２４を施用するステップであって、各複数の深さの凹部１２’は、深部８６及び浅部８４を含む（図２６Ａ）、ステップと、間隙領域３８からポリマーヒドロゲル２４を除去するステップと（図２６Ｂ）、フォトレジストを現像して、深部８６に不溶性フォトレジスト８２を生成するステップであって、それによって、浅部８４が露出したままである、ステップと（図２６Ｂ）、不溶性フォトレジスト８２が深部８６にある間に、第１のプライマーセット及び第１のトランスポソーム複合体１０を浅部８４の表面上に固定するステップと（図２６Ｂ）、不溶性フォトレジストを除去するステップと（図２６Ｃ）、第２のプライマーセット及び第２のトランスポソーム複合体１０’を浅部８４の表面に固定するステップと（図２６Ｃ）を含む。

【0185】

方法の最初に、複数の深さの凹部１２’が、基材４０に形成される。複数の深さの凹部１２’は、ナノインプリントリソグラフィを使用して、形成されてもよい。一例として、基材材料が軟質である間に、ワーキングスタンプが基材４０（例えば、単一層ベース支持体、又はベース支持体上に配置された層）に押し込まれ、これにより、基材４０内に、ワーキングスタンプフィーチャのインプリント（ネガティブレプリカ）が作成される。次いで、基材４０は、ワーキングスタンプが所定の位置にある状態で、硬化され得る。

【0186】

硬化は、放射線硬化性樹脂材料が使用される場合、可視光線若しくは紫外（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ、ＵＶ）線などの化学線への曝露によって、又は熱硬化性樹脂材料が使用される場合、熱への曝露によって、達成され得る。硬化は、重合及び／又は架橋を促進し得る。一例として、硬化は、ソフトベーク（例えば、樹脂を堆積させるために使用され得る任意の液体担体を駆動するための）及びハードベークを含む複数の段階を含み得る。ソフトベークは、より低い温度（例えば、約５０℃～約１５０℃の範囲）で、０秒間超～約３分間の範囲にわたる時間、実施されてもよい。ハードベークの持続時間は、約１００℃～約３００℃の範囲の温度で約５秒～約１０分間続けてもよい。ソフトベーキング及び／又はハードベーキングに使用することができるデバイスの例としては、ホットプレート、オーブンなどが挙げられる。

【0187】

硬化後、作業スタンプが取り外される。これにより、基材４０に、トポグラフィー特徴を作り出す。

【0188】

次に、ポリマーヒドロゲル２４を、基材４０上に施用する。ポリマーヒドロゲル２４は、任意の好適な堆積技術を使用して施用され得る。最初に施用されるとき、ポリマーヒドロゲル２４は、複数の深さ凹部１２’の表面間隙領域３８を含む、基材４０全体を、共形的に被覆する。

【0189】

間隙領域３８の上に位置付けられているポリマーヒドロゲル２４は、例えば、研磨プロセスを使用して除去される。研磨プロセスは、それらの領域３８において、下にある基材４０に悪影響を及ぼすことなく、ポリマーヒドロゲル２４を間隙領域３８から除去することができる、化学スラリー（例えば、研削剤、緩衝液、キレート剤、界面活性剤、及び／又は分散剤を含む）を使用して実行され得る。代替的に、研磨は、研磨剤粒子を含まない溶液により実行してもよい。化学的スラリーは、化学機械研磨システムで使用されて、間隙領域３８の表面を研磨し得る。研磨ヘッド（複数可）／パッド（複数可）、又は他の研磨ツール（複数可）は、間隙領域３８の上に存在し得るポリマーヒドロゲル２４を、ポリマーヒドロゲル２４を凹部（複数可）１２内に少なくとも実質的にそのまま残したまま、研磨することができる。一例として、研磨ヘッドは、Ｓｔｒａｓｂａｕｇｈ ＶｉＰＲＲ ＩＩ研磨ヘッドであってもよい。クリーン化及び乾燥プロセスは、研磨後に実行され得る。クリーン化プロセスは、水浴及び超音波処理を利用し得る。水浴は、約２２℃～約３０℃の範囲の、比較的低温にて維持されてもよい。乾燥プロセスは、スピン乾燥、又は別の好適な技術を介した乾燥を伴い得る。

【0190】

複数の深さの凹部１２’内のポリマーヒドロゲル２４を、図２６Ａに示す。

【0191】

次に、フォトレジストが、ポリマーヒドロゲル２４上に施用される。フォトレジストは、ネガティブフォトレジストであってもよいし、ポジティブフォトレジストであってもよい。好適なポジティブフォトレジストの例としては、ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴ（登録商標）Ｓ１８００シリーズ又はＡＺ（登録商標）１５００シリーズが挙げられ、それらの両方が、Ｋａｙａｋｕ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。好適なポジティブフォトレジストの別の例は、ＳＰＲ（商標）－２２０（ＤｕＰｏｎｔ製）である。好適なネガティブフォトレジストとしては、ＳＵ－８シリーズ及びＫＭＰＲ（登録商標）シリーズ（両方ともＫａｙａｋｕ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）、ＵＶＮ（商標）シリーズ（ＤｕＰｏｎｔから入手可能）、又はＮＲ（登録商標）シリーズフォトレジスト（Ｆｕｔｕｒｒｅｘから入手可能）が挙げられる。ポジティブ又はネガティブフォトレジストは、本明細書に開示される任意の好適な堆積技術を使用して、施用され得る。

【0192】

ポジティブフォトレジストが使用される場合、深部８６内のポジティブフォトレジストの部分は、不溶性フォトレジスト８２を形成するために、特定の波長の光に露光されない。露光された部分は可溶性のままであり、適切な現像液で除去することができる。ポジティブフォトレジスト３８のための好適な現像液の例としては、希釈水酸化ナトリウム、希釈水酸化カリウム、又は金属イオンフリー有機ＴＭＡＨ（テトラメチルアミノヒドロキシド）の水溶液などの、水性アルカリ溶液が挙げられる。

【0193】

ネガティブフォトレジストが使用される場合、深部８６におけるネガティブフォトレジストの部分は、不溶性フォトレジスト８２を形成するために、特定の波長の光に露光される。露光されなかった部分は可溶性のままであり、適切な現像液で除去することができる。ネガティブフォトレジストのための好適な現像液の例としては、希釈水酸化ナトリウム、希釈水酸化カリウム、又は金属イオンフリー有機ＴＭＡＨ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、テトラメチルアミノヒドロキシド）の水溶液などの水性アルカリ溶液が挙げられる。

【0194】

いずれの例でも、マスクを使用して、フォトレジストを、所望の方法で光に選択的に露光することができる。ネガティブフォトレジストが使用される場合、光が基材４０を透過して深部８６に到達し、基材４０を透過して浅部８４に到達するのが阻止される限り、裏面露光（例えば、基材４０を通して）が使用されてもよい。この特定の例では、深部８６及び浅部８４における基材４０の厚さは、各々、光透過性及び光遮断性であるように、選択することができる。

【0195】

可溶性フォトレジストを除去すると、図２６Ｂに示すように、間隙領域３８及び浅部８４の高分子ヒドロゲル２４が露出され、不溶性フォトレジスト８２が深部に残る。

【0196】

不溶性フォトレジスト８２が深部８６にある間に、第１のプライマーセット及び第１のトランスポソーム複合体１０は、浅部８４においてポリマーヒドロゲル２４の表面上に固定される（図２６Ｂ）。固定のために、トランスポソーム複合体１０及びプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１は、約０．１μＭ～約１μＭの範囲の濃度で、キャリア液中に含まれてもよい。キャリア液体は、水であってもよい。トランスポソーム複合体１０及びプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１を、ポリマーヒドロゲル２４の適切な官能基にグラフトするために、緩衝液及び／又は塩を、キャリア液に添加してもよい。緩衝液は、５～１２の範囲のｐＨを有する。本明細書に記載される中性緩衝液及び／又は塩のいずれかが、使用され得る。

【0197】

トランスポソーム複合体１０及びプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１を含有する流体は、フロースルー堆積を使用して、導入することができる。グラフト化は、約３５℃～約４５℃の範囲の温度で、約３０時間～約１２０時間の範囲の時間にわたって、実施することができる。グラフト化の間、トランスポソーム複合体１０及びプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１は、ポリマーヒドロゲル２４の、アジド又はテトラジン基の少なくとも一部に結合し、間隙領域３８に対する親和性を有さない。

【0198】

洗浄溶液をフローセルに流して、グラフト化されていないトランスポソーム複合体１０及び／又はプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１を、除去することができる。

【0199】

次いで、不溶性フォトレジスト８２’を、除去してもよい。不溶性ポジティブフォトレジストは、超音波処理を使用したメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの除去剤で、又はアセトン洗浄液で、又はプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート洗浄液で、又はＮＭＰ（Ｎ－メチル－２－ピロリドン）ベースのストリッパ洗浄液で、リフトオフされてもよい。不溶性のネガティブフォトレジストは、超音波処理を使用したメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの除去剤で、アセトンで、又はＮＭＰ（Ｎ－メチル－２－ピロリドン）ベースのストリッパで、リフトオフされてもよい。

【0200】

次いで、図２６Ｃに示すように、第２のプライマーセット及び第２のトランスポソーム複合体１０’を、深部８６の表面に固定する。固定のために、トランスポソーム複合体１０’及びプライマー３６Ｃ_２、３６Ｄ_２は、約０．１μＭ～約１μＭの範囲の濃度で、キャリア液中に含まれてもよい。トランスポソーム複合体１０’及びプライマー３６Ｃ_２、３６Ｄ_２を含有するキャリア液体は、水であってもよく、緩衝液及び／又は塩を含んでもよい。このキャリア流体は、フロースルー堆積を使用してフローセルに導入されてもよく、グラフト化は、本明細書に記載されるように実施されてもよい。

【0201】

第２のプライマーセット及び第２のトランスポソーム複合体１０’は、トランスポソーム複合体１０及びプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１の存在により、浅部８４におけるポリマーヒドロゲル２４へのグラフト化から、実質的にブロックされる。

【0202】

洗浄溶液をフローセルに流して、グラフト化されていないトランスポソーム複合体１０’及びプライマー３６Ｃ_２、３６Ｄ_２を、除去することができる。

【0203】

次いで、ＤＮＡ試料３４をフローセルに導入し、タグメント化及び伸長に曝露して、完全に適合したＤＮＡ断片を生成することができる。断片をトランスポソーム複合体１０、１０’から切断し、プライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_１、３６Ｃ_２、３６Ｄ_２の１つを播種し、両方のプライマーセットにわたる増幅に曝露することができる。増幅は、深部８６及び浅部８４の両方において、順方向鎖及び逆方向鎖を生成する。しかしながら、切断可能なプライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_２の各々における、切断部位（図１７を参照して記載される）は、順方向鎖が深部８６又は浅部８４のいずれかから切断されること、及び逆方向鎖が浅部８４又は深部８６の他方から切断されることを、可能にする。したがって、逆方向鎖は部分８６又は８４に残り、順方向鎖は部分８４又は８６に残る。これにより、ペアエンド配列決定を、同時に実施することができる。

【0204】

図３Ａに示される例では、クラスタ生成は、３つの異なるタイプの架橋及び完全伸長（完全適応）断片アンプリコンを、形成し得る。ポリマーヒドロゲル２４、Ａ上に形成された、完全適応フラグメントアンプリコンは、同一のトランスポソーム１０及び同一のプライマー３６が、ポリマーヒドロゲル２４、Ａ上に存在するため、両端に同一の増幅ドメイン２６を有する（例えば、Ｐ５－Ｐ５）、同様に、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上に形成された、完全適応フラグメントアンプリコンは、同一のトランスポソーム１０’及び同一のプライマー３６’が、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上に存在するため、両端に同一の増幅ドメイン２６’を有する（例えば、Ｐ７－Ｐ７）対照的に、高分子ヒドロゲル２４、Ａ及び２４、Ｂの両方に形成された、完全に適合したフラグメントアンプリコン（すなわち、ヒドロゲル２４、Ａ及び２４、Ｂを橋渡しするもの）は、対向する末端に、異なる増幅ドメイン２６、２６’を有する（例えば、Ｐ５－Ｐ７）。これは、両方のポリマーヒドロゲル２４、Ａ及び２４、Ｂにわたって実施される、タグメント化及び増幅が、両方のトランスポソーム１０、１０’及び両方のプライマー３６、３６’を含むためである。

【0205】

完全適合断片アンプリコンの増幅ドメイン２６、２６’における、オルソゴナルな切断基に起因して、特異的塩基切断が実施される場合、一方のタイプの架橋された完全適合断片アンプリコン（例えば、ポリマーヒドロゲル２４上に形成されたもの、Ａ）は除去されるが、他方のタイプの架橋された完全適合断片アンプリコン（例えば、ポリマーヒドロゲル２４上に形成されたもの、Ｂ）は架橋されたままである。例として、特異的塩基切断は、増幅ドメイン２６中の切断基を標的とする。この例では、特異的塩基切断はまた、対向する末端に異なる増幅ドメイン２６、２６’を有する、完全適合断片アンプリコンを線状化し、これは、この例では、それらをポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合させたままにする。これらの線状化された完全適合断片アンプリコンは、配列決定され、次いで、配列決定された産物が除去される。

【0206】

次いで、クラスタ化は、以前に線状化された完全適合断片アンプリコン（例えば、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上に形成されたもの）、及び他のポリマーヒドロゲル２４、Ａ上のプライマー３６を使用して、再び実施される。配列決定の第１ラウンド後に架橋されたままである完全適合断片アンプリコン（例えば、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上に形成されたもの）は、クラスタ化に関与しない。この例では、残存する架橋された完全適合断片アンプリコン（例えば、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上に形成されたもの）が除去されるように、特異的塩基切断が実施される。この特定の例では、特異的塩基切断は、増幅ドメイン２６’中の切断基を標的とする。この特異的な塩基切断は、対向する末端に異なる増幅ドメイン２６、２６’を有する新たに生成された完全適合断片アンプリコンを線状化し、これは、この例では、それらをポリマーヒドロゲル２４、Ａに結合させたままにする。これらの線状化された完全適合断片アンプリコンは、配列決定され、次いで、配列決定された産物が除去される。

【0207】

図３Ａの例では、異なる増幅ドメイン２６、２６’を有する完全適合断片が、２つのポリマーヒドロゲル２４、Ａ及び２４、Ｂにわたる領域に限定されるため、配列決定中の強度が影響を受ける可能性がある。フローセル及び方法の他の例を使用して、形成される対向する末端に異なる増幅ドメイン２６、２６’を有する、完全適合断片の数を増加させることができる。この例示的なフローセルを図１５Ａに示し、例示的な方法を、図１５Ａ～図１５Ｊに概略的に示す。

【0208】

図１５Ａに示されるフローセルは、間隙領域３８によって分離された凹部１２を有する基材４０と、各凹部１２の第１の部分に配置された第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａと各凹部１２の第２の部分に配置された第２のポリマーヒドロゲル２４，Ｂと、オルソゴナルな開裂可能な結合５４を介して第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａ上に固定されたトランスポソーム前駆体５２と、第２のポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上に固定された捕捉プライマー５６と、第１及び第２のポリマーヒドロゲル２４Ａ、２４Ｂの各々上に固定された増幅プライマーセットの第１及び第２のプライマー３６Ｃ、３６Ｄとを含む。

【0209】

基材４０は、本明細書に記載の例のいずれかであってもよい。

【0210】

増幅プライマーセットのプライマー３６Ｃ、３６Ｄは、それらがオルソゴナルな切断部位を有する限り、プライマー３６、３６’について本明細書に記載される例のいずれかであり得る。図１７を参照して更に記載される他の例では、増幅プライマーセットの第１の及び第２のプライマーの各々は、切断可能プライマー及び切断不可能プライマーの両方を含む。

【0211】

捕捉プライマー５６は、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄにハイブリダイズすることができるが、増幅プライマーセット中のプライマー３６Ｃ、３６Ｄにオルソゴナルであるため、他の方法では増幅に関与しない。本明細書で更に詳細に論じられるように、捕捉プライマーは、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの非転移鎖２０Ｄ（図１５Ｂ及び図１６Ｂ）に、相補的な配列を含む。一例として、捕捉プライマー５６（ＰＸ）の配列は、以下の通りであり得る：
ＰＸ ５’→３’
ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号１０）

【0212】

捕捉プライマー５６はまた、プライマー配列の５’末端に、ポリＴ配列を含み得る。捕捉プライマー５６は、切断部位を含まない。

【0213】

トランスポソーム前駆体５２は、その５’末端からその３’末端に向かって、オルソゴナルに切断可能な結合５４、増幅ドメイン２６Ｃ、配列決定プライマー配列２８Ｃ、及びトランスポゾン末端１６Ｃを形成することができる鎖３０Ｃを含む（図１６Ａ参照）。図１６Ａに示すように、トランスポソーム前駆体５２は、フローセル表面上にアセンブルされるトランスポソーム複合体１０Ｃの、転移鎖１８Ｃになる。

【0214】

オルソゴナルに切断可能な結合５４は、増幅プライマーセットのプライマー３６Ｃ、３６Ｄに対する、オルソゴナルな切断化学を有する。したがって、オルソゴナルに切断可能な結合５４は、プライマー３６Ｃ、３６Ｄの切断部位のいずれかに使用される切断剤に感受性ではなく、プライマー３６Ｃ、３６Ｄの切断部位は、オルソゴナルに切断可能な結合５４に使用される切断剤に感受性ではない。切断部位を含むことに加え、オルソゴナルに切断可能な結合５４は、その３’末端で増幅ドメイン２６Ｃに共有結合することができ、その５’末端でポリマーヒドロゲル２４、Ａの表面官能基に共有結又は非共有結合することができるという点で、二官能性である。オルソゴナルに切断可能な結合５４は、ビシナルジオール結合（過ヨウ素酸塩試薬による処理などの、酸化によって切断され得る）、ジスルフィド結合（例えば、還元条件下（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下）、又はホスフィンの存在下で切断可能）、オルト－ニトロベンジル基（例えば、光分解によって切断可能）、アゾベンゼン結合（例えば、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４の存在下で切断可能）、アルキル－セレン結合（例えば、過酸化水素による処理などの、酸化によって切断可能）、シリルエーテル結合（例えば、フッ化物イオン、酸、又は塩基によって切断可能）、又はアリルカルバメート結合（例えば、パラジウム錯体の存在下で切断可能）であってもよい。オルソゴナルに切断可能な結合５４のいくつかの例としては、ビシナルジオールを有する脂肪族リンカー、ジスルフィドを有するポリ（エチレングリコール）リンカーなどが挙げられる。

【0215】

トランスポソーム前駆体５２はまた、増幅ドメイン２６Ｃも含む。トランスポソーム前駆体５２の増幅ドメイン２６Ｃは、増幅ドメイン２６Ｃが第１のプライマー３６Ｃの切断部位を含まないことを除いて、第１のプライマー３６Ｃと同一の配列を有する。

【0216】

トランスポソーム前駆体５２はまた、配列決定プライマー配列２８Ｃも含む。配列決定プライマー配列２８Ｃは、タグメント化及び増幅後にフローセルに導入された、配列決定プライマーに結合することができる。

【0217】

トランスポソーム前駆体５２はまた、鎖３０Ｃも含む。鎖３０は、鎖３２Ｃとトランスポゾン末端１６Ｃを形成することができ、これは続いて、トランスポザーゼ１４Ｃと共にフローセルに導入される（図１５Ｂ参照）。したがって、鎖３０Ｃは、鎖３２Ｃと相補的である。鎖３０の例は、鎖３０Ｃに使用することができる。

【0218】

図３Ａに示される例と同様に、ポリマーヒドロゲル２４は、２つの領域Ａ、Ｂを含む。一方の領域Ａは、トランスポソーム前駆体５２及びそれに結合したプライマー３６Ｃ、３６Ｄを有し、他方の領域Ｂは、捕捉プライマー５６及びそれに結合したプライマー３６Ｃ、３６Ｄを有する。

【0219】

一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、領域Ａ、Ｂ全体にわたって化学的に同一である。この例では、ポリマーヒドロゲル２４は、図１Ａ～図１Ｄを参照して本明細書に記載されるように施用してよく、例えば、ブランケット堆積を使用し、次いで研磨して、間隙領域３８からポリマーヒドロゲル２４を除去する。この例では、ブランケットグラフト化技術を使用して、プライマー３６Ｃ、３６Ｄを領域Ａ、Ｂの両方に固定してもよく、又はプライマー３６Ｃ、３６Ｄをポリマーヒドロゲル２４に予めグラフト化してから、凹部１２に施用してもよい。次いで、技術を使用して、トランスポソーム前駆体５２を領域Ａに、捕捉プライマー５６を領域Ｂに、選択的に固定することができる。適切な選択的固定技術は、図３Ａを参照して記載される。ポリマーヒドロゲル２４が領域Ａ、Ｂ全体にわたって化学的に同一である例では、プライマー３６Ｃ、３６Ｄの５’末端官能基、及びオルソゴナルに切断可能な結合５４の５’末端官能基は、実体３６Ｃ、３６Ｄ、５４の切断部位がオルソゴナルである限り、同一であり得る。

【0220】

他の例では、ポリマーヒドロゲル２４は、領域Ａ、Ｂにおいて化学的に異なる。この例では、一方の領域Ａは、プライマー３６Ｃ、３６Ｄ及びトランスポソーム前駆体５２の一部をグラフト化するように構成され、他方の領域Ｂは、プライマー３６Ｃ、３６Ｄ及び捕捉プライマー５６の他の一部をグラフトするように構成される。したがって、プライマー３６Ｃ、３６Ｄの一部は、化学的に異なる領域Ａ、Ｂへの所望の結合を達成するために、プライマー３６Ｃ、３６Ｄの他の一部とは異なる、５’末端官能基を有してもよい。プライマー３６Ｃ、３６Ｄ及びトランスポソーム前駆体５２の一部がポリマーヒドロゲル２４、Ａに結合し、プライマー３６Ｃ、３６Ｄ及び捕捉プライマー５６の他の一部がポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合する限り、本明細書に記載の共有結合又は非共有結合機構のいずれを使用してもよい。この例では、プライマー３６Ｃ、３６Ｄ及びトランスポソーム前駆体５２の一部を、ポリマーヒドロゲル２４、Ａに予めグラフト化し、ポリマーヒドロゲル２４、Ａを、凹部１２の第１の部分に選択的に施用し、プライマー３６Ｃ、３６Ｄ及び捕捉プライマー５６の他の一部を、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂに予めグラフト化し、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂを、凹部１２の第２の部分に選択的に施用してもよい。あるいは、ポリマーヒドロゲル２４、Ａ及び２４、Ｂは、選択的に施用され得、次いで、プライマー３６Ｃ、３６Ｄ、トランスポソーム前駆体５２、及び捕捉プライマー５６の結合は、それらがポリマーヒドロゲル２４の領域Ａ及びＢに各々結合するように構成されるので、同時に起こり得る。

【0221】

図１５Ｂは、トランスポソーム複合体１０Ｃのオンフローセルアセンブリ、及びプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄのオンフローセル結合を示す。

【0222】

トランスポソーム複合体１０Ｃのオンフローセルアセンブリは、複数のトランスポザーゼ酵素１４Ｃ及び複数の非転移鎖２０Ｃを含む、第１の流体を、図１５Ａに示すフローセルに導入するステップによって、達成することができる。

【0223】

第１の流体では、トランスポザーゼ酵素１４Ｃは、トランスポザーゼ１４、１４’について本明細書に記載される例のいずれかであってもよい。また、第１の流体において、非転移鎖２０Ｃは鎖３２Ｃであり、これは、ポリマーヒドロゲル２４Ａに結合している鎖３０Ｃと、トランスポゾン末端１６Ｃを形成することができる。したがって、非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃは、鎖３０Ｃと相補的である。鎖３２の例は、鎖３２Ｃ、２０Ｃに使用することができる。第１の流体中のトランスポザーゼ酵素１４Ｃ及び非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃの各々の濃度は、ポリマーヒドロゲル２４に結合したトランスポソーム前駆体５２の数に依存し得る。トランスポソーム前駆体５２に対して、過剰なトランスポザーゼ酵素１４Ｃ及び非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃの各々を使用して、所望の数のトランスポソーム複合体１０Ｃが形成されることを確実にし得る。任意の非反応トランスポザーゼ酵素１４Ｃ及び非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃは、洗浄溶液中で除去することができる。

【0224】

第１の流体はまた、水であってもよい、キャリア液体を含む。

【0225】

図１５Ａのフローセルに導入されると、第１の流体は、複数のトランスポソーム前駆体５２、複数の非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃ、及び複数のトランスポザーゼ酵素１４Ｃの、少なくとも一部が相互作用して、ポリマーヒドロゲル２４Ａ上に固定された複数のトランスポソーム複合体１０Ｃを形成するように、フローセル内でインキュベーションされる。第１の流体は、第１の流体中の非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃと、（トランスポソーム前駆体５２の）鎖３０Ｃとの、ハイブリダイゼーションに適した温度で、インキュベーションされる。ハイブリダイズした鎖３０Ｃ、３２Ｃはトランスポゾン末端１６Ｃを形成し、これに、トランスポザーゼ酵素１４Ｃが非共有結合することができる。得られたトランスポソーム複合体１０Ｃを、図１５Ｂ及び図１６Ａの両方に示す。

【0226】

図１６Ａに詳細に示すように、トランスポソーム複合体１０Ｃは、トランスポゾン末端１６Ｃで非転移鎖２０Ｃ、３２Ｃにハイブリダイズした、転移鎖１８Ｃを含む。転移鎖１８Ｃは、増幅ドメイン２６Ｃ、及びオルソゴナルに切断可能な結合５４（ポリマーヒドロゲル２４、Ａに結合する）を含む。上述のように、増幅ドメイン２６Ｃは、切断部位を除いて、第１のプライマー３６Ｃと同一の配列を有する。これにより、トランスポソーム複合体１０Ｃは、プライマー３６Ｃ、３６Ｄを使用した増幅に関与し、プライマー３６Ｃ、３６Ｄとは別に切断されることが可能となる。

【0227】

トランスポソーム複合体１０Ｃをフローセル上でアセンブルした後、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄを、フローセル内のポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合させることができる。

【0228】

プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄを、図１５Ｂ（ポリマーヒドロゲル２４、Ｂへの結合後、及び図１６Ｂ（ポリマーヒドロゲル２４、Ｂへの結合前）に示す。プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄは、トランスポゾン末端１６Ｄに非共有結合したトランスポザーゼ酵素１４Ｄを含む。トランスポゾン末端１６Ｄは二本鎖核酸鎖であり、その一方の鎖３０Ｄは、転移鎖１８Ｄの一部であり、その他方の鎖３２Ｄは、非転移鎖３２Ｄの一部である。各々トランスポザーゼ酵素１４、鎖３０、鎖３２の任意の例は、トランスポザーゼ酵素１４Ｄ、鎖３０Ｄ、鎖３２Ｄに使用することができる。

【0229】

転移鎖１８Ｄは、トランスポゾン末端１６Ｄの鎖３０Ｄに結合した、分岐アダプターを含む。分岐アダプターは、増幅ドメイン２６Ｄ、及び配列決定プライマー配列２８Ｄを含む。分岐アダプターは、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂと結合しない。増幅ドメイン２６Ｄは、第２のプライマー３６Ｄと同一の配列を有し、配列決定プライマー配列２８Ｄは、下流の配列決定中に、配列決定プライマーに結合することができる。

【0230】

非転移鎖２０Ｄは２つの鎖部分を含み、その一方はトランスポゾン末端１６Ｄの鎖３２Ｄであり、他方は鎖５８である。図１６Ｂに示すように、鎖５８は、鎖３２Ｄの３’末端に結合している。鎖５８は、捕捉プライマー５６に相補的な配列を有し、したがって、捕捉プライマー５６が結合したポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合するための、ハイブリダイゼーション機構を有する、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄを提供する。

【0231】

プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄは、フローセルの外側の溶液中で調製されてもよい。最初に、鎖１８Ｄ及び２０Ｄが合成され得、次いで、鎖部分３０Ｄ及び３２Ｄが一緒にハイブリダイズされて、分岐アダプターを形成する。トランスポザーゼ酵素１４Ｄを添加し、トランスポゾン末端１６Ｄと複合体を形成する。

【0232】

プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄをキャリア流体に添加して、第２の流体を形成することができる。第２の流体中のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの濃度は、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合した捕捉プライマー５６の数に依存し得る。第２の流体のキャリア液体は、水であり得る。捕捉プライマー５６に対して過剰のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄを使用して、所望の数のトランスポソーム複合体１０Ｄが結合することを、確実にすることができる。任意の未反応のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄは、洗浄溶液中で除去することができる。

【0233】

プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄのオンフローセル結合は、トランスポソーム複合体１０Ｃがアセンブルされた後に、複数のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄを含む第２の流体を、フローセルに導入するステップによって達成されてもよい。第２の流体は、部分鎖５８（図１６Ｂ参照）と捕捉プライマー５６とのハイブリダイゼーションに適した温度で、インキュベーションされる。これは、図１５Ｂに示すように、トランスポソーム複合体１０Ｄを、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合させる。

【0234】

他の例示的な方法では、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄは、複合体１０Ｃのオンフローセルアセンブリの前に、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合させることができる。

【0235】

次に、ＤＮＡ試料を、図１５Ｂのフローセルに導入する。ＤＮＡ試料は、本明細書に開示されるタグメント化緩衝液の例と共に導入され得る。

【0236】

図１５Ｃは、ＤＮＡ試料が導入された後の凹部１２を示す。ＤＮＡ試料はＤＮＡ断片３５、３７に断片化され、その５’末端は、各々転移鎖１８Ｃ又は１８Ｄの一方の３’末端ライゲーションされる。より具体的には、この例では、ＤＮＡ断片３５Ａ、３７Ａの５’末端は、トランスポソーム複合体１０Ｃの転移鎖１８Ｃの、各々の３’末端にライゲーションされる。ＤＮＡ断片３５Ｂ、３７Ｂの５’末端は、プレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの転移鎖１８Ｄの各々の３’末端にライゲーションされ、ＤＮＡ断片３５Ｃ、３７Ｃの５’末端は、トランスポソーム複合体１０Ｄ、１０Ｃの転移鎖１８Ｄ、１８Ｃの各々の３’末端にライゲーションされる。したがって、ＤＮＡ断片３５Ａ、３７Ａは、ポリマーヒドロゲル２４ Ａに結合し、ＤＮＡ断片３５Ｂ、３７Ｂはポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合し、ＤＮＡ断片３５Ｃ、３７Ｃはポリマーヒドロゲル２４、Ａ及び２４、Ｂを架橋する。

【0237】

断片化及びライゲーションは、３０℃以上の温度で起こり得る。一例では、温度は、約３０℃～約５５℃の範囲であり得る。

【0238】

図１５Ｃに示すように、ＤＮＡ断片３５Ａ、３７Ａ、３５Ｂ、３７Ｂ、３５Ｃ、３７Ｃの３’末端は、非転移鎖２０Ｃ、２０Ｄの５’末端にライゲーションされない。したがって、ギャップ３９は、ＤＮＡ断片鎖３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃの各々の３’末端と非転移鎖２０Ｃ又は２０Ｄの５’末端との間に存在し、ギャップ３９’は、ＤＮＡ断片鎖３７Ａ、３７Ｂ、３７Ｃの３’末端と非転移鎖２０Ｄ又は２０Ｃの５’末端との間に存在する。一例では、各ギャップ３９、３９’は、９塩基対長である。

【0239】

次いで、本方法は、複数のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの各々の、複数のトランスポザーゼ酵素１４Ｃ及びトランスポザーゼ酵素１４Ｄを除去するステップを含む。トランスポザーゼ酵素１４Ｃ、１４Ｄの除去は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はプロテイナーゼ又は他の変性剤を使用して、達成することができる。図１５Ｄは、トランスポザーゼ酵素除去後の、フローセル凹部１２を示す。

【0240】

次いで、本方法のこの例は、鎖置換反応を開始して、複数のトランスポソーム複合体１０Ｃ及び複数のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの転移鎖１８Ｃ、１８Ｄの、相補的コピー６０、６２を生成するステップを含む。鎖置換反応後のフローセルを、図１５Ｅに示す。

【0241】

鎖置換伸長のために、ヌクレオチド及び鎖置換酵素を含むヌクレオチド混合物が、フローセルに導入される。ヌクレオチド混合物は、水及び／又はイオン性塩緩衝液、例えば、ミリモルからモル濃度のクエン酸生理食塩水、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸緩衝生理食塩水等、及び／又は他の緩衝液、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）若しくは（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）であり得る。液体担体はまた、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、等の、鎖置換伸長反応を意図した、触媒金属を含んでもよい。単一の触媒金属又は触媒金属の組み合わせを使用してもよく、総濃度は、約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲であってもよい。

【0242】

鎖置換反応に使用される酵素は、転移鎖１８Ｃ、１８Ｄを各々の鋳型鎖として使用して、混合物中のヌクレオチドで、ＤＮＡ断片鎖３５Ａ、３７Ａ、３５Ｂ、３７Ｂ、３５Ｃ、３７Ｃの３’末端を伸長する。適切な鎖置換酵素の例としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

【0243】

鎖置換反応の間、酵素は、非転移鎖２０Ｃ、２０Ｄを置換する。その結果、図１５Ｅに示すように、ＤＮＡ断片３５Ｂ、３７Ｂ、３５Ｃ、３７Ｃは、第２のポリマーヒドロゲル２４、Ｂから分離されるようになる。これは、各々の表面結合捕捉プライマー５６にハイブリダイズされた、非転移鎖２０Ｄの鎖５８が置換されているという事実による。捕捉プライマー５６への結合がなければ、ＤＮＡ試料断片３５Ｂ、３７Ｂ、３５Ｃ、３７Ｃは、もはやポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合しない。トランスポソーム複合体１０Ｃの非転移鎖２０Ｃも、鎖置換反応中に置換される。

【0244】

次いで、分離及び置換された鎖は、変性及び洗浄プロセスに曝露され得る。一例では、変性及び洗浄は、ホルムアミド溶液を使用して実施される。このプロセスは、ポリマーヒドロゲル２４に共有結合していない任意の鎖を、フローセルから除去する。

【0245】

図１５Ｅには示していないが、変性及び洗浄プロセスはまた、架橋断片３５Ａ、３７Ａ、３５Ｂ、３７Ｂ、３５Ｃ、３７Ｃを変性し得ることが、理解されるべきである。架橋か又は一本鎖であるかにかかわらず、鎖置換反応及び洗浄後、図１５Ｅに示すように、ＤＮＡ試料断片３５Ａ、３７Ａ、３７Ｃは、ポリマーヒドロゲル２４、Ａに結合したままである。これは、これらのＤＮＡ試料断片３５Ａ、３７Ａ、３７Ｃが、捕捉プライマー５６を介してではなく、オルソゴナルに切断可能な結合５４を介して、ポリマー２４に結合しているという事実に起因する。単一の残りのＤＮＡ試料断片３７Ｃが図１５Ｅに示されているが、ポリマーヒドロゲル２４の領域Ａ、Ｂを架橋するＤＮＡ試料断片３７Ｃのいずれも、結合した転移鎖１８Ｃを介して、フローセル表面に結合したままであることを、理解されたい。したがって、複数のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの転移鎖１８Ｄの相補的コピー６２の少なくとも１つは、複数のトランスポソーム複合体１０Ｃの転移鎖１８Ｃの少なくとも１つを介して、第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａに結合したままである。

【0246】

本方法は、複数のプレアセンブルされたトランスポソーム複合体１０Ｄの転移鎖１８Ｄの相補的コピー６２の少なくとも１つを、第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａ又は第２のポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上の、第２のプライマー３６Ｄの少なくとも１つにハイブリダイズさせるステップを含む。図１５Ｇでは、相補的コピー６２は、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂ上の第２のプライマー３６Ｄの１つにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、フローセル、したがって、その内容物の温度を、好適なＤＮＡハイブリダイゼーション温度（例えば、６５℃）まで上昇させることによって開始され得る。

【0247】

次いで、図１５Ｈに示すように、ポリメラーゼ伸長が、ハイブリダイズされた相補的コピー６２のうちの少なくとも１つに結合する、ＤＮＡ試料断片３７Ｃに沿って開始されて、第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａ又は第２のポリマーヒドロゲル２４ｍＢ上の、第２のプライマー３６Ｄのうちの少なくとも１つに結合する、少なくとも１つのアンプリコン６４を生成する。

【0248】

ポリメラーゼ伸長のために、ヌクレオチド及びポリメラーゼを含むヌクレオチド混合物が、フローセルに導入される。ヌクレオチドを受け入れることができ、プライマー３６Ｄの３’末端にヌクレオチドの塩基をうまく組み込むことができる、任意のポリメラーゼを使用することができる。ポリメラーゼの例としては、Ｂｓｕ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ７Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び多数のものなどの、ファミリーＡからのポリメラーゼ；Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ及び他の高度にプロセッシブなポリメラーゼ（ファミリーＢ２）、Ｐｆｕポリメラーゼ（ファミリーＢ）、ＫＯＤポリメラーゼ（ファミリーＢ）、９ｏＮ（ファミリーＢ）等のファミリーＢ及びＢ２からのポリメラーゼ；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ等のファミリーＣからのポリメラーゼ、及び他の多くのポリメラーゼ、及び多くの他のもの、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ等のファミリーＤからのポリメラーゼ、及び多くの他のもの；ＤＮＡ Ｐｏｌ μ、ＤＮＡ Ｐｏｌ β、ＤＮＡ Ｐｏｌ σ、及び他の多く等のファミリーＸからのポリメラーゼが挙げられる。ヌクレオチド混合物は、水及び／又はイオン性塩緩衝液、例えば、ミリモルからモル濃度のクエン酸生理食塩水、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸緩衝生理食塩水等、及び／又は他の緩衝液、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）若しくは（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）であり得る。液体担体はまた、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、等の、伸長反応を意図した触媒金属を含んでもよい。単一の触媒金属又は触媒金属の組み合わせを使用してもよく、総濃度は約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲であってもよい。

【0249】

フローセルの温度は、鋳型伸長反応を開始するように調節され得る。ポリメラーゼは、相補的コピー６２、ＤＮＡ断片３７Ｃ、及び転移鎖１８Ｃを鋳型として使用して、プライマー３６Ｄの３’末端の伸長を可能にする。

【0250】

アンプリコン（複数可）６４が生成された後、オルソゴナルに切断可能な結合５４の切断剤が細胞に導入される。切断剤は、オルソゴナルに切断可能な部位５４に応じて、化学的切断剤又は酵素的切断剤であってもよい。オルソゴナルに切断可能な結合５４の切断は、転移鎖１８Ｃを切断し、したがって、ＤＮＡ断片３５Ａ、３７Ａ、３７Ｃをポリマーヒドロゲル２４、Ａから切り離す。一例では、ジオール切断剤を導入して、結合５４のジオール切断部位を介して、第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａに結合したＤＮＡ試料断片３５Ａ、３７Ａ、３７Ｃを切り離す。

【0251】

次いで、切り離された鎖３５Ａ、３７Ａは、本明細書に記載される洗浄溶液の例を使用して、フローセルから洗浄され得る。

【0252】

図１５Ｉに示すように、オルソゴナルに切断可能な結合５４の切断及び洗浄後、ＤＮＡ試料断片３７Ｃ及びそのアンプリコン６４は、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂに結合したままである。これは、ＤＮＡ試料断片３７Ｃが、転移鎖１８Ｃを介してではなく、プライマー３６Ｄへの相補的部分６２のハイブリダイゼーションを介して、ポリマー２４（領域Ａ又はＢ）に結合しているという、事実に起因する。単一の残りのＤＮＡ試料断片３７Ｃ及びアンプリコン６４が図１５Ｉに示されるが、プライマー３６ＤにハイブリダイズされたＤＮＡ試料断片３７Ｃ及びアンプリコン６４のいずれも、オルソゴナルに切断可能な結合５４の切断後に残ることが、理解されるべきである。

【0253】

アンプリコン６４は、プライマー３６Ｃ、３６Ｄを使用して凹部１２にわたって増幅を受けることができる、完全に適合された断片（増幅ドメイン２６Ｃ、２６Ｄ又はその相補体を対向する末端に含む）である。図１５Ｉに示す完全に適合したＤＮＡ試料断片３７Ｃ（増幅ドメイン２６Ｃ、２６Ｄ又はそれらの相補体も両端に含む）は、変性を介して除去することができる。次いで、アンプリコン６４を、クラスタ化に曝露する。特に、一本鎖アンプリコン６４は、ループオーバーして隣接する相補的プライマー３６Ｃにハイブリダイズし、ポリメラーゼがアンプリコン６４をコピーして、他の二本鎖架橋を形成し、これが変性して、ポリマーヒドロゲル２４（Ａ又はＢ）に結合した２本の一本鎖を形成する。これらの２つの鎖は、隣接する相補的なプライマー３６Ｃ、３６Ｄ上でループを形成し、これらにハイブリダイズし、再び伸長されて、２つの新たな二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって、各鋳型コピーに対して繰り返して、図１５Ｊに示すように、密集したクローンクラスタを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスタが変性される。一例では、逆方向鎖は、逆方向鎖が結合しているプライマー３６Ｃ又は３６Ｄの切断部位に適した、切断剤によって除去され（例えば、特異的塩基切断）、順方向鋳型鎖／アンプリコンが残る。他の例では、順方向鎖は、順方向鎖が結合しているプライマー３６Ｃ又は３６Ｄの切断部位に適した、切断剤によって除去され（例えば、特異的塩基切断）、逆方向鋳型鎖／アンプリコンが残る。クラスタ化は、凹部１２上に固定された、いくつかの鋳型鎖の形成をもたらす。

【0254】

図１５Ａ～図１５Ｊに示す例では、ポリマーヒドロゲル領域２４、Ａ、Ｂの間に間隙が存在する。間隙が含まれる場合、ＤＮＡ断片３５Ｃ、３７Ｃの少なくとも１つが間隙を架橋するため、生成され得る断片アンプリコンのサイズに、下限が課される。他の例では、ポリマーヒドロゲル２４の領域Ａ、Ｂは、凹部１２内で互いに当接してもよく、したがって、生成することができる断片アンプリコンのサイズに、下限が課されない。

【0255】

図１５Ａ～図１５Ｊを参照して記載される増幅プライマーセットは、連続的なペアエンド配列決定を可能にする。逐次的ペアエンド配列決定を使用して、ポリマーヒドロゲル２４の両方の領域Ａ、Ｂにわたって生成される、順方向鎖／断片アンプリコンを配列決定して除去することができ、次いで、ポリマーヒドロゲル２４の両方の領域Ａ、Ｂにわたって、逆方向鎖／断片アンプリコンを生成し、配列決定して除去することができる。他の例では、増幅プライマーセットは、同時ペアエンド配列決定を可能にする。この方法の例は、図１７を参照して示され、記載される。

【0256】

図１７に示されるプライマーセットは、２つのプライマーサブセット６６、６８を含む。これらのプライマーサブセット６６、６８は、単一の鋳型鎖（例えば、ＤＮＡ断片３５Ｃ）が、増幅され、両方のプライマーサブセット６６、６８にわたってクラスタ化されることを可能にし（図１５Ａ～図１５Ｊを参照して記載されるように）、順方向鎖のクラスタが、ポリマーヒドロゲル２４の１つの領域Ａにおいて生成され、逆方向鎖のクラスタが、ポリマーヒドロゲル２４の他の領域Ｂにおいて生成されることも可能にする。後者を可能にするために、プライマーサブセット６６、６８は、切断（線状化）化学が、異なるポリマーヒドロゲル領域２４、Ａ及び２４、Ｂで、オルソゴナルになるように制御される。

【0257】

より具体的には、プライマーサブセット６６、６８は、一方のセット６６が、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１及び切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１を含み、他方のセット６８が、切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２及び切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２を含むという点で、関連している。したがって、プライマーセット６８、６６の、切断不可能な第１の及び第２のプライマー３６Ｃ_２、３６Ｄ_１は、クラスタの線状化中に切断不可能である。

【0258】

プライマーサブセット６６は、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１及び切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１を含み、プライマーサブセット６８は、切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２及び切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２を含む。

【0259】

切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１及び切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１は、例えば、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１が順方向増幅プライマーであり、切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１が逆方向増幅プライマーであるか、又は切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１が順方向増幅プライマーであり、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１が逆方向増幅プライマーである、オリゴヌクレオチド対である。プライマーサブセット６６において、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１は切断部位７０を含むが、切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１は切断部位を含まない。

【0260】

切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２及び切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２は、例えば、切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２が順方向増幅プライマーであり、切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２が逆方向増幅プライマーであるか、又は切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２が順方向増幅プライマーであり、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_２が逆方向増幅プライマーである、オリゴヌクレオチド対である。プライマーセット６８において、切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２は切断部位７０又は７０’を含むが、切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２は切断部位を含まない。

【0261】

切断不可能な第１のプライマー３６Ｃ_２及び切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１は、切断可能な第１のプライマー３６Ｃ_１が、プライマー配列又はプライマー配列に結合した連結分子に組み込まれた、切断部位７０を含むことを除いて、同一のヌクレオチド配列を有する（例えば、両方とも順方向増幅プライマーである）ことが、理解されるべきである。同様に、切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２及び切断不可能な第２のプライマー３６Ｄ_１は、切断可能な第２のプライマー３６Ｄ_２が、プライマー配列又はプライマー配列に結合した連結分子に組み込まれた切断部位７０又は７０’を含むことを除いて、同一のヌクレオチド配列を有する（例えば、両方とも逆増幅プライマーである）。

【0262】

第１のプライマー３６Ｃ_１及び３６Ｃ_２が順方向増幅プライマーである場合、第２のプライマー３６Ｄ_１及び３６Ｄ_２は逆方向プライマーであり、逆もまた同様であることを、理解すべきである。

【0263】

切断不可能なプライマー３６Ｄ_１、３６Ｃ_２は、Ｐ５及びＰ７プライマー、Ｐ１５及びＰ７プライマー、又はＰＡ、ＰＤ、ＰＣ、ＰＤプライマーの任意の組み合わせ（例えば、ＰＡ及びＰＢ、又はＰＡ及びＰＤなど）などの増幅目的のためのユニバーサル配列を有する、任意のプライマー配列であってもよく、切断部位７０、７０’（例えば、本明細書に記載の配列のいくつかにおけるＵ又は「ｎ」）を含まない。

【0264】

対照的に、切断可能プライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_２は、本明細書中に示されるプライマー配列のいずれか、例えば、Ｐ５及びＰ７プライマー、Ｐ１５及びＰ７プライマー、又は他のユニバーサル配列プライマー（例えば、ＰＡ、ＰＢ、ＰＣ、ＰＤプライマー）であり得、各々の切断部位７０、７０’（例えば、本明細書に記載の配列のいくつかにおけるＵ又は「ｎ」）が、プライマー配列又はプライマー配列に結合した連結分子に、組み込まれている。切断部位７０又は７０及び７０’がオルソゴナルに切断可能なリンカー５４の切断部位に対してオルソゴナルな限り、切断部位７０は、切断可能プライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_２の各々において同一であってもよく、又は切断部位７０、７０’は、切断可能プライマー３６Ｃ_１、３６Ｄ_２の各々において異なっていてもよい。

【0265】

加えて、図１５Ａ～図１５Ｊに示されるフローセルは、プレアセンブルされたトランスポソーム１０Ｄのための、異なる結合機構を利用してもよい。この例では、フローセルは捕捉プライマー５６を含まず、むしろ、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂは、第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａが含まない（すなわち、第１のポリマーヒドロゲル２４、Ａが含まない）、トランスポソーム捕捉官能基を含む。一例では、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂは、トランスポソーム複合体１０Ｄの５’末端に共有結合することができる官能基を含み、ポリマーヒドロゲル２４、Ａは、これらの特定の官能基を含まない。他の例では、ポリマーヒドロゲル２４、Ｂは、ビオチン表面基で官能化されており（すなわち、ビオチン化ポリマーヒドロゲル２４’である）、ポリマーヒドロゲル２４、Ａはビオチン表面基を含まない。トランスポソーム複合体１０Ｄの５’末端官能基は、ビオチン表面基に結合することができる、本明細書に記載の例のいずれか（例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン－ビオチンなど）であってもよい。

【0266】

インサートサイズを増大させる方法
本明細書で言及されるように、修飾トランスポソーム複合体１０、１０’（例えば、３’若しくは５’非転移鎖３２、３２’、又は転移鎖１８、１８’の３’末端に修飾を有する）の例を使用して、断片化産物のインサートサイズを増加させることができる。以下の説明は、インサートサイズを増大させるために使用することができる、いくつかの他の方法を提供する。これらの方法は、修飾又は非修飾の本明細書に開示されるトランスポソーム複合体１０、１０’のいずれかと併せて、使用することができる。

【0267】

一例では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）試料のインサートサイズを増加させるための方法は、本明細書に開示されるフローセルの任意の例にＤＮＡ試料を導入するステップと、縮合剤又はタグメント化阻害剤をＤＮＡ試料と共に導入するステップであって、縮合剤が、ポリカチオン性アミン（例えば、スペルミジン、キトサン、プロタミンなど）、ポリエチレングリコール、及びヒストンからなる群から選択されるか、又はタグメント化阻害剤が、カチオン（Ｚｎ^２＋）、ｐＨ調整剤（例えば、グルタミン酸）、及びクロマチンアセンブリキットからなる群から選択されるステップと、縮合剤又はタグメント化阻害剤の存在下で、フローセル内でＤＮＡ試料をインキュベーションするステップであって、それによって、ＤＮＡ試料のタグメント化が、第１のトランスポソーム複合体１０及び第２のトランスポソーム複合体１０’の一部で実施されるステップとを含む。

【0268】

これらの例では、タグメント化に関与するトランスポソーム複合体１０、１０’のパーセンテージは、縮合剤又はタグメント化阻害剤が存在しないタグメント化に関与するトランスポソーム複合体１０、１０’のパーセンテージよりも低い。

【0269】

スペルミジン、キトサン、及びプロタミンは、ＤＮＡ縮合剤の例である。一例では、約２ｍＭ～約１０ｍＭのスペルミジン又はキトサン又はプロタミンを、ＤＮＡ試料と共に添加することができる。スペルミジン、キトサン及びプロタミンは、ＤＮＡ試料と共に添加された場合に、コンパクトで丸い構造を作り出すカチオン性ポリマーである。コンパクトで丸い構造は、ＤＮＡ試料からトランスポザーゼ１４、１４’の一部を遮断するのに、有効である。したがって、より少ないトランスポザーゼ１４、１４’が、タグメント化のためにＤＮＡ試料にアクセスすることができる。これは、タグメント化から生じるＤＮＡ断片のサイズを、増加させる。

【0270】

ポリエチレングリコールは、塩化ナトリウムの存在下で、ＤＮＡ縮合剤の他の例である。一例では、ポリエチレングリコールは、２５ｍＭ超のＮａＣｌと共に、２％（体積で）超の量で、ＤＮＡ試料に添加され得る。いくつかの例では、ポリエチレングリコールは、２５ｍＭ超のＮａＣｌと共に、５％（体積で）超の量で、ＤＮＡ試料に添加され得る。ポリエチレングリコールは、ＤＮＡ試料に組み込まれた場合にクラウディング剤として作用し、したがって、ＤＮＡ試料からトランスポザーゼ１４、１４’の一部を遮断するのに、有効である。したがって、より少ないトランスポザーゼ１４、１４’が、タグメント化のためにＤＮＡ試料にアクセスすることができる。これは、タグメント化から生じるＤＮＡ断片のサイズを、増加させる。

【0271】

Ｚｎ^２＋などのカチオン、又はグルタミン酸などのｐＨ調整剤を、タグメント化阻害剤として添加してもよい。これらの薬剤は、タグメント化の効率を低下させるために添加され得る。一例では、Ｚｎ^２＋カチオンは、約０．０２ｍＭ～約５ｍＭの範囲の濃度で、水溶液中に存在し得る。他の例では、グルタミン酸は、約０．２５ｍＭ～約１００ｍＭの範囲の濃度で、水溶液中に存在し得る。

【0272】

クロマチンアセンブリキットは、ＤＮＡ試料の存在下で、アセンブルされたクロマチンを生成することができる、試薬を含む。クロマチンはＤＮＡの一部をパッキングし、したがって、トランスポザーゼ１４、１４’がタグメント化のためにＤＮＡ試料にアクセスするステップを防止する。これは、タグメント化から生じるＤＮＡ断片のサイズを、増加させる。

【0273】

試料調製
本明細書に記載されるように、ＤＮＡ試料は、タグメント化が実施されるフローセルに導入される。本明細書に開示されるいくつかの例示的な方法は、ＤＮＡ試料の調製を含む。１つの例示的な方法は、セリンプロテアーゼ、２ｍＭ未満のエチレンジアミン四酢酸、カオトロピック剤、及び水を含む、無機塩を含まない溶解緩衝液中の、プロテアーゼの活性温度で、全血、組織試料、血液スポット、及び唾液からなる群から選択される試料を、無機塩を含まない溶解緩衝液に曝露し、それによって、全血試料からデオキシリボ核酸を抽出し、粗溶解物を生成するステップと、熱又は阻害剤を使用して粗溶解物中のプロテアーゼを不活性化するステップと、カオトロピック剤のキレート剤を粗溶解物に添加して、複合体化された粗溶解物を生成するステップとを含む。

【0274】

この例示的な方法において、試料は、最初に、無機塩を含まない溶解緩衝液中のプロテアーゼが活性である温度で、無機塩を含まない溶解緩衝液に曝露される。溶解緩衝液への曝露中に、試料中の白血球から、ｇＤＮＡが抽出される。本方法の一例では、試料の体積は、約２０μＬ～約５０μＬの範囲である。

【0275】

無機塩を含まない溶解緩衝液は、プロテアーゼ（例えば、熱不安定性プロテイナーゼＫ、トリプシンなどの、セリンプロテアーゼ）、２ｍＭ未満のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、カオトロピック剤、及び水を含み、いくつかの例では、それらからなる。

【0276】

プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ、熱不安定性プロテイナーゼＫ、又はトリプシンなどの、セリンプロテアーゼ）は、抽出中にｇＤＮＡに悪影響を及ぼし得るタンパク質を消化するため、及び抽出されたｇＤＮＡをヌクレアーゼから保護するために、無機塩を含まない溶解緩衝液中に含まれる。プロテアーゼが活性である温度は、使用されるプロテアーゼに依存するであろう。プロテイナーゼＫは、約２５℃～約６５℃の範囲の温度で活性であり、約８０℃で完全に不活性化され得る。あるいは、プロテイナーゼＫは、テトラペプチジルクロロメチルケトン（ＴＣＫ）などの、プロテアーゼ阻害剤に曝露された場合に、不活性化され得る。熱不安定性プロテイナーゼＫは、約２０℃～約４０℃の範囲の低温で活性であり、約５５℃で完全に不活性化され得る。トリプシンは、約４℃～約６５℃の範囲の温度で活性であり、４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリドなどの、プロテアーゼ阻害剤に曝露された場合に、不活性化され得る。このタイプのプロテアーゼ阻害剤は、ＤＮＡ夾雑物を含まず、したがって、ライブラリ調製の間、溶解物中に残り得る。プロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ、熱不安定性プロテイナーゼＫ、又はトリプシンを不活性化する能力は、より高温で実施される下流プロセス（例えば、より高温で実施されるその後のライブラリ調製プロセス）において使用される、酵素への損傷を最小限にするのに役立つ。無機塩を含まない溶解緩衝液は、１単位～５単位のプロテアーゼ、すなわち、約５単位／ｍＬ～約２０単位／ｍＬの範囲の濃度を含む。一例では、無機塩を含まない溶解緩衝液は、３．６単位の熱不安定性プロテイナーゼＫを含む。他の例では、無機塩を含まない溶解緩衝液は、約０．８ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む。

【0277】

無機塩を含まない溶解緩衝液は、２ｍＭ未満のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。全血試料からのＤＮＡ抽出のために、ＥＤＴＡは、酵素の触媒活性を増加させる補因子として働く、酵素中に存在する金属イオンをキレート化するためのキレート剤として使用されてもよい。ＥＤＴＡはＤＮアーゼ酵素（ＤＮＡを消化する）を容易に不活性化するが、ＥＤＴＡによってキレート化された金属イオンの一部は、その後のライブラリ調製技術において起こる酵素活性にとって望ましい場合がある。無機塩を含まない溶解緩衝液中の比較的低いＥＤＴＡ濃度は、ライブラリ調製の間にこれらの酵素の活性を阻害することなく、溶解手順の間の望ましい金属イオンキレート化を可能にする。一例では、ＥＤＴＡの濃度は、約０．５ｍＭ～１．５ｍＭの範囲である。他の例では、ＥＤＴＡの濃度は、約１ｍＭである。

【0278】

無機塩を含まない溶解緩衝液は、カオトロピック剤を含む。カオトロピック剤は、ＤＮＡ抽出において有用であり得るが、ライブラリ調製の間に生じる酵素反応の阻害剤としても作用し得る。カオトロピック剤の一例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、これは、タグメント化反応中に使用されるトランスポザーゼＴｎ５を阻害する。カオトロピック剤の他の例は、塩酸グアニジンである。一例では、カオトロピック剤は、無機塩を含まない溶解緩衝液中に、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖの量で存在する。１つの特定の例として、カオトロピック剤は、無機塩を含まない溶解緩衝液中に、約０．２％ｗ／ｖの量で存在する。

【0279】

無機塩を含まない溶解緩衝液の残りは、脱イオン水又は他の形態の精製水などの、水である。

【0280】

いくつかの例では、無機塩を含まない溶解緩衝液は、中性緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、及び非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（Ｃｒｏｄａ，Ｉｎｃ．から市販されているポリオキシエチレンソルビトールエステル）などの、適切な溶解緩衝液添加剤も含む。中性緩衝剤は、約２５ｍＭ～約１００ｍＭの範囲の濃度で存在してもよく、非イオン性界面活性剤は、約０．５％活性ｗ／ｖ～約０．７５％活性ｗ／ｖの範囲の量で、存在してもよい。一例では、無機塩を含まない溶解緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、及び約０．５％活性ｗ／ｖのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む。

【0281】

本明細書に記載されるように、溶解緩衝液は、無機塩（複数可）を含まない。塩化ナトリウムを含む無機塩（複数可）は、ＤＮＡ抽出中に有益であり得るが、それ／それらはまた、ライブラリ調製プロセスにおいて使用される１つ以上の酵素（複数可）の、阻害剤として機能し得る。無機塩の排除は、本明細書に開示される複合体粗溶解物が、ライブラリ調製において使用される前に精製を受ける必要がないという事実に寄与する。

【0282】

溶解温度での無機塩を含まない溶解緩衝液への全血試料の曝露は、粗溶解物を生成する。次いで、粗溶解物中のプロテアーゼを、熱又は阻害剤を使用して不活化する。使用される不活性化剤は、存在するプロテアーゼに依存する。

【0283】

他の例では、粗溶解物（及びその中に含有される内容物）の温度を約５５℃に上昇させることができ、これは、熱不安定性プロテイナーゼＫを不活性化する。他の例では、粗溶解物（及びその中に含有される内容物）の温度を約８０℃に上昇させることができ、これは、プロテイナーゼＫを不活性化する。不活性化温度は、使用されるプロテアーゼに応じて変動し得ることを理解されたい。

【0284】

他の例では、阻害剤を、粗溶解物に添加してもよい。１つの具体例として、無機塩を含まない溶解緩衝液がトリプシンを含む場合、粗溶解物中のトリプシンを不活性化するステップは、粗溶解物を阻害剤に曝露するステップを含み、阻害剤は、フッ化４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルである。他の具体例として、無機塩を含まない溶解緩衝液がプロテイナーゼＫを含む場合、粗溶解物中のプロテイナーゼＫを不活性化するステップは、粗溶解物を阻害剤に曝露するステップを含み、阻害剤はテトラペプチジルクロロメチルケトン（ＴＰＫ）である。一例では、阻害剤：セリンプロテアーゼの比は、１：１：～５０：１の範囲である。一例では、フローセルに導入される阻害剤（例えば、ＴＰＫ）は、一例のタグメント化緩衝液中に、約０．０４ｍｇ／ｍＬ～約０．１ｍｇ／ｍＬの範囲の量で存在する。選択される任意の阻害剤は、阻害剤を含む粗溶解物が、最初に精製に曝されることなく、ライブラリ調製において使用され得るように、ＤＮＡ夾雑物を含まないべきである。

【0285】

粗溶解物中のプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ、熱不安定性プロテイナーゼＫ、又はトリプシン）が不活性化された後、又は不活性化される際に、カオトロピック剤のキレート剤が粗溶解物に添加されて、複合体粗溶解物が生成される。使用されるキレート剤は、使用されるカオトロピック剤に依存する。例として、カオトロピック剤のキレート剤は、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、及びメチルベータシクロデキストリンからなる群から選択される、シクロデキストリンである。上述したように、シクロデキストリンは、親水性外部及び疎水性コアを有する、カップ型構造である。これらの化合物は、溶解緩衝液中で、ＳＤＳ又は他のカオトロピック剤などの親水性分子と、複合体を形成する能力を有する。特に、ＳＤＳの長い疎水性尾部は、シクロデキストリンのカップ内に引き込まれ、これは、溶解後にＳＤＳを効果的に固定し、下流のライブラリ調製において使用されるものを含む、酵素を変性させることを防止する。したがって、複合体粗溶解物は、最初に精製に曝露されることなく、ライブラリ調製において直接使用され得る。

【0286】

いくつかの例では、キレート剤は乾燥形態であり、キレート剤の乾燥形態は、キレート剤の乾燥形態を取り囲むコーティング材料を含む、カプセル化複合体の一部である。キレート剤を凍結乾燥又は他の方法で乾燥させてマイクロスフェアを形成し、次いで、これをコーティング材料によってカプセル化してもよい。これらの例では、キレート剤を粗溶解物に添加するステップは、カプセル化された複合体を粗溶解物に添加し、次いで、カプセル化複合体からの乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップ、及び乾燥形態のキレート剤を再水和するステップを含む。キレート剤の再水和は、キレート剤の任意の活性に先行する。使用される放出機構は、乾燥形態のキレート剤を取り囲む、コーティング材料のタイプに依存する。

【0287】

一例では、コーティング材料は温度感受性ワックスであり、乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップは、温度感受性ワックスの融解温度を超えて、粗溶解物を加熱するステップを含む。好適な温度感受性ワックスのいくつかの例としては、パラフィンワックス、又は大豆ワックスが挙げられ、これらは、各々、約４０℃～約５０℃の範囲の温度で融解する。好適な温度感受性ワックスの他の例としては、蜜蝋、微結晶ポリエチレンワックス、又はカルナウバワックスが挙げられ、これらは、各々、約６０℃～約８０℃の範囲の温度で融解する。これらの例では、粗溶解物を所望の温度に加熱してワックスを融解させ、乾燥形態のキレート剤を放出させる。キレート剤は再水和され、カオトロピック剤を隔離して、複合体粗溶解物を形成することができる。再水和は、水又は他の水性再水和溶液を使用して、達成され得る。

【0288】

他の例では、コーティング材料は温度感受性ポリマーであり、乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップは、温度感受性ポリマーの可溶化温度を超えて、粗溶解物を加熱するステップを含む。適切な温度感受性ポリマーの例としては、ポリ（アクリルアミド－ｃｏ－アクリロニトリル）、アガロース、又はゼラチンが挙げられ、これらの各々は、３０℃より高い温度で可溶化する。適切な温度感受性ポリマーの他の例としては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、メチルセルロース、又はポロキサマーが挙げられ、これらの各々は、３０℃未満の温度で可溶化する。これらの例では、粗溶解物を所望の温度に加熱して、ポリマーを可溶化し、乾燥形態のキレート剤を放出する。キレート剤は、再水和され（例えば、水又は水溶液で）、カオトロピック剤を隔離して、複合体粗溶解物を形成することができる。

【0289】

更に他の例では、コーティング材料はｐＨ感受性ポリマーであり、乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップは、粗溶解物のｐＨを調整するステップを含む。適切なｐＨ感受性ポリマーの例としては、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００（Ｅｖｏｎｉｋ，Ｉｎｃ．からのメタクリル酸コポリマー、タイプＢ）、又はＫＯＬＬＩＣＯＡＴ（登録商標）ＭＡＥ－１００（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．からのメタクリル酸コポリマー、タイプＡ）が挙げられ、これらの各々は、６を超えるｐＨで可溶性である。適切なｐＨ感受性ポリマーの他の例としては、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ／ＲＳ １００（Ｅｖｏｎｉｋ，Ｉｎｃ．からのアンモニオメタクリレート）、又はカルボキシメチルセルロースが挙げられ、これらの各々は、８を超えるｐＨで可溶性である。好適なｐＨ感受性ポリマーの更に他の例としては、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｅ（Ｅｖｏｎｉｋ，Ｉｎｃ．からのアミノジメチルメタクリレートコポリマー）、又はキトサンが挙げられ、これらの各々は、３未満のｐＨで可溶性である。これらの例では、粗溶解物のｐＨは、ポリマーが感受性であるｐＨより低くなるように（例えば、溶解度がｐＨ Ｘ以下である場合）、又はポリマーが感受性であるｐＨより高くなるように（例えば、溶解度がｐＨ Ｘ以上である場合）調整され、ポリマーは可溶化する。ポリマーの可溶化は、乾燥形態のキレート剤を放出する。キレート剤は、本明細書に記載されるように再水和され、カオトロピック剤を隔離して、複合体粗溶解物を形成することができる。

【0290】

更なる例では、コーティング材料は時間感受性ポリマーであり、乾燥形態のキレート剤の放出を誘発するステップは、カプセル化された複合体を粗溶解物中で、所定の時間インキュベーションさせることを含む。適切な時間感受性ポリマーの例としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（その市販例は、ＤｕＰｏｎｔからのＭＥＴＨＯＣＥＬ（登録商標）である）、エチルセルロース（その市販例は、ＤｕＰｏｎｔからのＥＴＨＯＣＥＬ（登録商標）である）、酢酸セルロース（その市販例は、ＣｏｌｏｒｃｏｎからのＯＰＡＤＲＹ（登録商標）ＣＡである）、及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）が挙げられる。これらの例では、カプセル化された複合体をその中に有する粗溶解物は、ポリマーのタイプ、ポリマーコーティングの厚さ、並びに生じる反応の温度及び構成（例えば、ｐＨ）に依存する、所定の時間インキュベーションされる。時間と共に、ポリマーは分解し、乾燥形態のキレート剤を放出する。キレート剤は再水和され、カオトロピック剤を隔離して、複合体粗溶解物を形成することができる。

【0291】

カプセル化された複合体は、コーティング材料の分散液を生成し、流動床中でキレート剤の乾燥形態上に分散液をスプレーコーティングし、複合体を乾燥させることによって形成され得る。他の適切なコーティング技術（例えば、パンコーティング、噴霧乾燥など）は、乾燥形態のキレート剤の上に、コーティング材料のフィルムを効果的に形成するために、使用され得る。

【0292】

キレート剤（カプセル化されていてもいなくても）は、Ｔｒｉｓ－酢酸塩、酢酸マグネシウム、及び水の組み合わせなどの、タグメント化緩衝液と混合されてもよい。タグメント化緩衝液の使用は、複合体粗溶解物がタグメント化ライブラリ調製プロセスにおいて使用される場合に、特に望ましい場合がある。タグメント化緩衝液は、乾燥形態のキレート剤の放出を開始し得、したがって、カプセル化キレート剤及びタグメント化緩衝液の組み込みは、カプセル化キレート剤のコーティング、その溶解特性、及び複合体形成を達成するための所望のタイミングに依存し得ることが、理解されるべきである。

【0293】

いくつかの例では、プロテアーゼの阻害剤及びカオトロピック剤のキレート剤（封入されているか否かにかかわらず）もまた、タグメント化緩衝液と混合され得る。この例では、プロテアーゼの不活性化及び複合体粗溶解物の生成は、同時に起こり得る。

【0294】

タグメント化緩衝液中に組み込まれる場合、キレート剤の量は、約２％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの範囲であり得る。

【0295】

次いで、複合体粗溶解物は、ライブラリ調製技術に曝露され得る。複合体粗溶解物中の抽出されたＤＮＡ試料は、タグメント化が、又は遺伝子材料のより長い断片を断片化し、断片の末端に所望のアダプターを組み込む、任意のライブラリ調製技術に曝露され得る。

【0296】

一例では、本明細書に開示される複合体粗溶解物は、本明細書に開示されるフローセルの任意の例に導入されてもよく、フローセルタグメント化は、本明細書に記載されるように実施されてもよい。したがって、本方法のいくつかの例は、トランスポソーム複合体１０、１０’及びフローセル内の表面に固定されたプライマー３６、３６’を含むフローセルに、複合体粗溶解物を導入するステップを含む。この例では、抽出されたデオキシリボ核酸（複合体粗溶解物中に）は、複合体粗溶解物が導入される際にタグメント化緩衝液をフローセルに導入するステップ、及びフローセルを３０℃以上の温度にするステップ（図１Ｃを参照して本明細書に記載されるように）によって、タグメント化に曝露される。この例では、トランスポザーゼ１４、１４’は除去されてもよく、増幅は、洗浄溶液をフローセルに導入するステップと、洗浄溶液を含有するフローセルを約６０℃に加熱するステップと、次いで、伸長増幅ミックスをフローセルに導入するステップ（図１Ｄを参照してように）とによって、実施される。

【0297】

一例では、本明細書に開示されるＤＮＡ試料調製方法、すなわち、曝露するステップ、不活性化するステップ、及び添加するステップは、フローセルに搭載されていない溶解チューブ又はチャンバ内で実施される。

【0298】

溶解チューブが使用される場合、複合体粗溶解物は、溶解チューブから配列決定機器の試料入力ポートに投入され得る。次いで、配列決定機器の流体送達システムは、タグメント化及びその後の処理のために、複合体粗溶解物をフローセルに送達する。

【0299】

チャンバは、配列決定機器の構成要素である、ＤＮＡ試料調製チャンバであってもよい。したがって、チャンバが使用される場合、複合体粗溶解物は、タグメント化及びその後の処理のために、チャンバからフローセルに輸送され得る。

【0300】

他の例示的な試料調製方法は、約１８℃～約２５℃の範囲の温度で、細胞試料を酸化亜鉛ナノ材料に曝露するステップと、それによって、細胞試料からのデオキシリボ核酸又はリボ核酸の界面活性剤を含まない抽出を開始し、粗溶解物を生成するステップと、粗溶解物中の抽出されたデオキシリボ核酸又はリボ核酸をタグメント化に曝露するステップとを含む。一例では、酸化亜鉛ナノ材料を、細胞試料に添加する。他の例では、酸化亜鉛ナノ材料を水中に分散させ、分散液を細胞試料に添加する。後者の例では、細胞試料は、酸化亜鉛ナノ材料分散液に添加される、細胞ペレットの形態であってもよい。

【0301】

細胞試料は、任意の真核生物細胞又は原核生物細胞、並びに真菌細胞由来であり得る。細胞試料のいくつかの例としては、全血、骨髄穿刺液、血清、血漿、組織、血液スポット、唾液、及び他の体液が挙げられる。

【0302】

酸化亜鉛ナノ材料は、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノワイヤなどの形態であってもよい。ナノ粒子は、約１ｎｍ～約１０００ｎｍの範囲の、平均粒径を有してもよい。ナノチューブ又はナノワイヤは、約１ｎｍ～約１０００ｎｍの範囲の、平均直径を有してもよい。一例では、酸化亜鉛ナノ粒子は、約１０ｎｍ～約９５０ｎｍの範囲の、平均粒径を有する。一例では、酸化亜鉛ナノ粒子は、約３００ｎｍの、平均粒径を有する。平均粒径は、分布計算（数、表面積、又は体積）の基礎と関連付けられ得る、粒子の分布の平均値を表し得る。したがって、いくつかの例では、平均粒径は、体積平均直径、数平均直径、又は表面平均直径を表し得る。平均粒径は、粒径分析器を使用して、又はＸ線回折（ＸＲＤ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）などを使用して、決定することができる。酸化亜鉛ナノ材料の使用は、このＤＮＡ又はＲＮＡ抽出が界面活性剤を含まないことを、可能にする。

【0303】

この例示的な方法の最初に、細胞試料及び酸化亜鉛ナノ材料を、１．５：１～１：１．５の体積：体積で一緒に混合する。体積比又は体積：重量比。一例では、細胞試料及び酸化亜鉛ナノ材料は、１：１の体積で一緒に混合される。体積比又は体積：重量比。本方法の一例では、細胞試料及び酸化亜鉛ナノ粒子の各々の体積は、約２０μＬ～約１００μＬの範囲である。細胞試料及び酸化亜鉛ナノ材料を一緒に混合し、約２分～約３０分の範囲の時間インキュベーションする。インキュベーションの間、細胞は破壊され、これがＤＮＡ又はＲＮＡ抽出をもたらす。破壊が起こる機構は、酸化亜鉛ナノ材料から放出された過剰なＺｎ^２＋が細胞膜表面に吸着し、次いで細胞壁を貫通して破壊を引き起こす化学的機構、及び／又は酸化亜鉛ナノ材料が、アポトーシス細胞死及び細胞構造の崩壊をもたらす活性酸素種（ＲＯＳ）反応を誘発する生物学的機構であり得る。

【0304】

酸化亜鉛ナノ材料を使用するＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）又はＲＮＡ抽出は、室温、例えば、約１８℃～約２５℃で実施することができ、したがって、追加の加熱及び加熱装置は利用されない。

【0305】

一例では、粗溶解物は、試料収集デバイス（例えば、溶解チューブ、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ、乾燥血斑カードなど）内で生成され、亜鉛ナノ材料は、試料収集デバイスの表面上で乾燥される。この例では、細胞試料の添加は、溶解を活性化する。

【0306】

いくつかの例では、酸化亜鉛ナノ材料は、プロテアーゼと混合される。プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、例えば、熱不安定性プロテイナーゼＫ）は、抽出中にＤＮＡ又はＲＮＡに有害な影響を与え得るタンパク質を消化するため、及び抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡをヌクレアーゼから保護するために、含まれ得る。プロテアーゼは、１単位～５単位の範囲の量、すなわち、約５単位／ｍＬ～約２０単位／ｍＬの範囲の濃度で、添加され得る。プロテアーゼが活性である温度は、使用されるプロテアーゼに依存するであろう。熱不安定性プロテイナーゼＫは、約２０℃～約４０℃の範囲の低温で活性であり、約５５℃で完全に不活性化され得る。プロテアーゼ（例えば、熱不安定性プロテイナーゼＫ）を不活性化する能力は、より高温で実施される下流プロセス（例えば、より高温で実施されるその後のライブラリ調製プロセス）において使用される、酵素に対する損傷を最小限にするのに役立つ。

【0307】

細胞試料が血液試料である場合、ヘモグロビン干渉が起こり得る。ヘモグロビン干渉を回避するために、亜鉛ナノ材料は、ＨｅｍｏｇｌｏＢｉｎｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｇｒｏｕｐ製）、及びＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）などの、ヘモグロビン捕捉剤と混合することができる。これらのヘモグロビン捕捉剤の各々は、製造業者によって指示するように使用され得る。

【0308】

本明細書で述べたように、酸化亜鉛ナノ材料は、活性酸素種の生成を誘導することができる。この種は、抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡを潜在的に損傷する可能性があり、したがって、抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡ損傷の可能性を低減するために、ＲＯＳスカベンジャーを添加することが望ましい場合がある。ＲＯＳスカベンジャーの量は、存在する亜鉛の量に依存し得る。一例では、ＲＯＳスカベンジャーは、約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の量で、添加される。

【0309】

細胞試料の酸化亜鉛ナノ材料への曝露は、粗溶解物を生成する。次いで、粗溶解物は、ライブラリ調製技術に曝露され得る。

【0310】

この方法のいくつかの例では、酸化亜鉛ナノ材料は、プロテアーゼと組み合わされ、粗溶解物中の抽出されたデオキシリボ核酸をタグメント化に曝露する前に、方法は、熱を使用してプロテアーゼを不活性化するステップを更に含む。例えば、粗溶解物（及びその中に含まれる内容物）の温度を約５５℃に上昇させることができ、これは熱不安定性プロテイナーゼＫを不活性化する。不活性化温度は、使用されるプロテアーゼに応じて変動し得ることが、理解されるべきである。

【0311】

ライブラリ調製のために、粗溶解物中の抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡ試料は、タグメント化に、又は遺伝子物質のより長い片（複数可）を断片化し、断片の末端に所望のアダプターを組み込む、任意の他のライブラリ調製技術に、曝露され得る。

【0312】

一例では、方法のこの例を介して生成された粗溶解物は、本明細書に開示されるフローセルの任意の例に導入されてもよく、ここで、オンフローセルタグメント化は、本明細書に記載されるように実施されてもよい。したがって、本方法のいくつかの例は、トランスポソーム複合体１０、１０’及びフローセル内の表面に固定されたプライマー３６、３６’を含むフローセルに、粗溶解物を導入するステップを含む。この例では、（粗溶解物中の）抽出されたデオキシリボ核酸又はリボ核酸は、粗溶解物が導入される時にフローセルにタグメント化緩衝液を導入するステップ、及びフローセルを３０℃以上の温度にするステップ（図１Ｂを参照して本明細書に記載されるように）によって、タグメント化に曝露される。この例では、タグメント化緩衝液は、水、任意選択的な共溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）、及び緩衝塩（例えば、トリス酢酸塩、ｐＨ７．６）を含む。このタグメント化緩衝液のいくつかの例は、金属補因子（例えば、酢酸マグネシウム）も含む。粗溶解物はＺｎ^２＋を含むので、この例のタグメント化緩衝液は、代替的に、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼのための、金属補因子（例えば、酢酸マグネシウム）を含まなくてもよい。この特定の例では、酸化亜鉛材料を、過剰に使用することができる。タグメント化の後、トランスポザーゼを除去し、フローセルを約６０℃に加熱することよって増幅を実施し、（図１Ｃを参照して説明したように）洗浄溶液をフローセルに流し、増幅混合物をフローセルに導入することができる。

【0313】

一例では、酸化亜鉛ナノ材料を利用するＤＮＡ試料調製方法は、フローセルに搭載されていないチャンバ内で実施される。チャンバは、配列決定機器の構成要素である、ＤＮＡ試料調製チャンバであってもよい。したがって、チャンバが使用される場合、粗溶解物は、オンフローセルタグメント化及びその後の処理のために、チャンバからフローセルに輸送され得る。

【0314】

他の例では、酸化亜鉛ナノ材料を利用するＤＮＡ試料調製方法、及びタグメント化は、溶解チューブ中で実施される。溶解チューブが使用される場合、ビーズベースのタグメント化、又は溶液ベースのタグメント化が使用されてもよい。

【0315】

ビーズベースのタグメント化のために、固体支持体（すなわち、ビーズ）は、表面結合トランスポソーム複合体（１０、１０’に類似）、及び表面結合プライマー（３６、３６’に類似）を有する。タグメント化は固体支持体の表面上で起こり、その結果、得られたＤＮＡ断片が、表面に結合する。タグメント化緩衝液、並びに表面結合トランスポソーム複合体及び表面結合プライマーを含む、固体支持体を、溶解チューブに導入し、そこで、タグメント化、ライゲーション、及び伸長が実施される（例えば、図１Ａ～図１Ｃに記載されるように）。この例では、タグメント化緩衝液は、水、任意選択的な共溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）、緩衝塩（例えば、トリス酢酸塩、ｐＨ７．６）、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、アクセサリータンパク質、及び任意選択的な金属補因子を含む。

【0316】

溶液ベースのタグメント化の場合、タグメント化は、浮遊トランスポソーム及びプライマーを使用して、溶液中で実施される。タグメント化緩衝液が溶解チューブに導入され、そこでタグメント化、ライゲーション、及び伸長が実施される（例えば、図１Ａ～図１Ｃに記載されるように）。この例では、タグメント化緩衝液は、トランスポソーム、プライマー、水、任意選択的な共溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）、緩衝塩（例えば、トリス酢酸塩、ｐＨ７．６）、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、アクセサリータンパク質、及び任意選択的な金属補因子を含む。

【0317】

乾燥試薬
本明細書に記載される例のいずれかにおいて、フローセル調製及び／又は試料調製のための試薬の１つ以上は、フローセル上に導入される前に、乾燥され、カートリッジ内に貯蔵されてもよい。乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、又はマイクロ波乾燥を使用して、実施することができる。乾燥試薬の各々は、フローセル及び／又は試料を調製するために使用される前に、水中で再構成され得る。

【0318】

凍結乾燥は、試薬が凍結され真空下に置かれた後に、試薬から水を除去する、凍結乾燥プロセスである。凍結乾燥は、約－３０℃～約－５０℃の範囲の温度、及び約３０ＭＰａ～約９０ＭＰａの範囲の圧力で、実施することができる。このプロセスは、試薬成分の固体微小球を生成し、したがって、（対応する液体よりも）より凝縮し、貯蔵及び輸送のためにより安定である。

【0319】

一例では、トランスポソーム緩衝液を、乾燥させる。トランスポソーム緩衝液は、トランスポソーム複合体１０、１０’、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄをフローセルに導入するために使用される。トランスポソーム緩衝液は、緩衝溶液中に、トランスポソーム１０、１０’、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄの任意の例を含む。乾燥前に、トランスポソーム緩衝溶液は、緩衝剤（例えば、トリス）、塩（例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）ポリソルベート）、場合によっては、凍結乾燥賦形剤（例えば、トレハロース）、及び水を含み得る。

【0320】

他の例では、ストレプトアビジンを、乾燥させる。本明細書に開示される方法のいくつかによれば、ストレプトアビジンは、トランスポソーム複合体１０、１０’、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄを、ビオチン化ポリマーヒドロゲルに結合させるために、使用される。乾燥前に、ストレプトアビジンは、緩衝剤（例えば、トリス）、塩（例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）ポリソルベート）、場合によっては、凍結乾燥賦形剤（例えば、トレハロース）、及び水を含有する、緩衝液中に含有され得る。

【0321】

更に他の例では、本明細書に開示される無機塩を含まない溶解緩衝液が、乾燥され得る。無機塩を含まない溶解緩衝液の任意の例を、乾燥させてもよい。凍結乾燥が使用される場合、本明細書に開示される、無機塩を含まない溶解緩衝液の任意の例は、凍結乾燥が実施される前に、凍結乾燥賦形剤と混合される。

【0322】

更に他の例では、本明細書に開示されるタグメント化緩衝液が、乾燥され得る。タグメント化緩衝液の任意の例を、乾燥させてもよい。凍結乾燥が使用される場合、本明細書に開示されるタグメント化緩衝液の任意の例は、凍結乾燥が実施される前に、凍結乾燥賦形剤と混合される。

【0323】

凍結乾燥される試薬のいずれかにおいて、凍結乾燥賦形剤は、約２００ｍＭ～約７００ｍＭの範囲の濃度で、存在し得る。

【0324】

配列決定機器
フローセルの任意の例を、配列決定機器に導入することができ、配列決定機器は、フローセルレセプタクルと、ＤＮＡ試料（例えば、複合体粗溶解物）、洗浄溶液、伸長増幅ミックス、及び他の試薬を、フローセルレセプタクルに配置されたフローセルに、各々送達する送達流体を含む、流体制御システムと、フローセルレセプタクル内に位置決めされたフローセルを照明するように位置決めされた照明システムと、フローセルレセプタクル内に位置付けられたフローセルの画像をキャプチャするように位置付けられた検出システムと、流体制御システム、照明システム、及び検出システムと動作可能に通信する制御装置とを、含む。適切な位置にあるとき、フローセルは、流体制御システム（例えば、ポンプ、弁など）と流体連通し、照明システム及び検出システムと光通信状態にある。

【0325】

配列決定機器はまた、ＤＮＡ試料調製チャンバを含み得、ここで、例えば、全血試料（例えば、複合体粗溶解物）又は他の同様の試料が導入され、溶解又は他の技術に曝露された後、タグメント化、増幅、及び配列決定のためにフローセルに導入される。ＤＮＡ試料調製チャンバは、そこに導入された試料を所望の温度に加熱する位置に、ヒーターを有していてもよい。流体送達ラインは、ＤＮＡ試料調製チャンバとフローセルとを接続してもよく、弁は、フローセルを開閉するために、フローセルの入力ポートに位置付けられてもよい。

【0326】

配列決定機器の流体システムはまた、試薬カートリッジ（その例が、参照番号７６で、図２４に概略的に示される）を受容するための、レセプタクルを含んでもよい。試薬カートリッジ７６は、試料（例えば、血液試料、骨髄穿刺液など）を受容することができる、流体入力ポート７８と、異なる試薬（液体又は乾燥形態）を貯蔵するために互いに隔離されている、流体レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄとを含む。図２４には示されていないが、各流体レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄは、その中に含まれる試薬を、フローセル（図２４の参照番号７４）に送達される前の再構成のために、混合チャンバ（図示せず）に送達することができる、又は試薬カートリッジ７６及びフローセル７２の両方が配列決定機器内のそれらの各々の位置に挿入される時に、フローセル７４に送達することができる、流体ラインに選択的に流体接続される。

【0327】

キット
本明細書に開示されるフローセル及び試薬のいずれかは、タグメント化キットに含まれ得る。例示的なキットを、図２４に示す。一例では、キット７２は、フローセル７４、及び試薬カートリッジ７６を含む。フローセル７４は、本明細書に記載の例の、いずれかであってもよい。

【0328】

いくつかの例示的なキット７２では、フローセル７４は、本明細書に記載の固定されたトランスポソーム複合体１０、１０’又は１０Ａ、１０Ｂを含み、キット７２は、タグメント化緩衝液、無機塩を含まない溶解緩衝液、及び／又はカオトロピック剤の阻害剤を、更に含む。一例では、キット７２は、組み合わされた、タグメント化緩衝液、及びカオトロピック剤の阻害剤を含む。これらの流体の各々は、試薬カートリッジ７６の別個のレセプタクル、８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄ内に含まれ得る。

【0329】

他の例示的なキット７２では、フローセル７４は、トランスポソーム複合体１０Ｃをアセンブルするための、及びトランスポソーム複合体１０Ｄを結合するための（本明細書に記載されるように）、異なる化学物質を含み、キット７２は、トランスポソーム複合体１０Ｃを形成するための成分を有するトランスポソーム緩衝液、トランスポソーム複合体１０Ｄを有する第２のトランスポソーム緩衝液、及びタグメント化緩衝液を、更に含む。これらの流体の各々は、試薬カートリッジ７６の別個のレセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ内に含まれ得る。この例示的キット７２はまた、本明細書に開示される溶解緩衝液、阻害剤、又は他の流体のいずれかを含んでもよい。

【0330】

更に他の例示的なキット７２では、フローセル７４は、本明細書に開示されるトランスポソームのいずれも最初に含まない。

【0331】

このタイプのキット７２の一例では、試薬カートリッジ７６には、トランスポソーム１０、１０’を導入するための、試薬（複数可）が装填される。例えば、フローセル７４は、間隙領域３８によって分離された凹部１２を有する基材４０と、凹部１２の各々の中に固定された第１の及び第２のプライマー３６、３６’と、凹部１２の各々の中に固定された（例えば、ポリマーヒドロゲル２４に結合した）ビオチン含有リンカー４２とを含み得る。試薬カートリッジ７６は、流体入力ポート７８と、各々が第１の増幅ドメイン２６及び５’ビオチン化末端２２を有する第１のトランスポソーム複合体１０と、各々が第２の増幅ドメイン２６’及び５’ビオチン化末端２２’を有する第２のトランスポソーム複合体１０’とを含む、トランスポソーム緩衝液と、タグメント化緩衝液とを、各々含有する、レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄとを含むことができる。

【0332】

このタイプのキット７２の他の例では、試薬カートリッジ７６は、トランスポソーム導入のためにフローセル表面を調製し、トランスポソーム１０、１０’を導入するために、試薬（複数可）が装填される。例えば、フローセル７４は、間隙領域３８によって分離された凹部１２を有する基材４０と、凹部１２の各々の中に固定された第１の及び第２のプライマー３６、３６’と、試薬カートリッジ７６であって、流体入力ポート７８と、レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄであって、ビオチン含有リンカー４２と、各々が第１の増幅ドメイン２６及び５’ビオチン化末端２２を有する第１のトランスポソーム複合体１０と、各々が第２の増幅ドメイン２６’及び５’ビオチン化末端２２’を有する第２のトランスポソーム複合体１０’とを含むトランスポソーム緩衝液とを各々含有するレセプタクルとを含む、試薬カートリッジとを含むことができる。

【0333】

これらの例示的なキット７２のいずれかにおいて、試薬カートリッジ７６に導入される試料が、全血、組織試料、血液スポット、及び唾液からなる群から選択される場合、試薬カートリッジ７６は、レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄのうちの１つの中に、無機塩を含まない溶解緩衝液の、任意の例を更に含み得る。これらの例では、ｉ）無機塩を含まない溶解緩衝液は液体であり、無機塩を含まない溶解緩衝液は水を更に含む、又はｉｉ）無機塩を含まない緩衝液は乾燥固体であり、試薬カートリッジ７６は、レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄの他の１つの中に、再構成流体（例えば、水）を更に含む。また、これらの例では、試薬カートリッジ７６は、レセプタクル８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄの他の１つの中に、カオトロピック剤の阻害剤を更に含んでもよい。

【0334】

最初に１つのトランスポソームタイプを使用する方法
本明細書に開示される例のうちのいくつかは、２つの異なるトランスポソーム複合体１０、１０’又は１０Ａ、１０Ｂなどを利用する。図２７に示される例示的な方法は、フローセルの凹部１２内の１つのタイプのトランスポソーム複合体１０又は１０’（両方ではない）から始まり、その後、他のタイプのトランスポソーム複合体１０’又は１０が導入される。このようにして、トランスポソーム複合体１０、１０’が、順次に装填される。図２７の方法の一例は、Ａから、Ｂ、Ｃに移る。方法の他の例は、Ａから、Ｄに移る。本方法の更に他の例は、Ａから、Ｅ、Ｆに移る。

【0335】

次に、Ａ、Ｂ、及びＣを含む、図２７の例示的な方法について記載する。図２７のＡには、凹部１２の底面の一部が示されている。凹部１２は、高分子ハイドロゲル２４と、高分子ハイドロゲル２４に固定された１つのタイプのトランスポソーム複合体１０と、高分子ハイドロゲル２４に固定されたプライマー３６，３６’とを含む。固定は、本明細書に記載される官能基のいずれかを使用して達成され得る。一例では、ポリマーヒドロゲル２４は、アジド又はテトラジン表面基を含み、複合体１０及びプライマー３６、３６’の５’末端基は、各々、末端アルキン（例えば、ヘキシニル）、又は内部アルキンを含み、アルキンは、環状化合物（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ））の一部である。

【0336】

本明細書に記載されるように、１つの（第１の）タイプのトランスポソーム複合体１０は、非転移鎖２０、３２にハイブリダイズした転移鎖１８の部分３０を有するトランスポゾン末端１６を含み、転移鎖１８は、第１の増幅ドメイン２６を含む。

【0337】

この例示的な方法は、表面に結合した複数の第１のタイプのトランスポソーム複合体１０を使用して、フローセル表面に二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７を生成するステップであって、二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７は、各々、それらの５’末端で、第１の転移鎖１８の３’末端に結合している（図２７のＢ参照）ステップと、及び複数の第２のタイプのトランスポソーム複合体１０’をフローセルに導入し、それによって、二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７をタグメント化して、第２の転移鎖１８’の３’末端に各々５’末端で結合した、新たな二本鎖ＤＮＡ断片３５_１、３７_１、及び３５_２、３７_２を生成する（図２７のＣ参照）ステップとを含む。

【0338】

この例では、二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７を生成するステップは、ＤＮＡ試料及びタグメント化緩衝液をフローセルに導入するステップと、第１のタイプのトランスポソーム複合体１０を使用してＤＮＡ試料のタグメント化を実施するステップとを含む。タグメント化の詳細は、図１Ｃを参照して、本明細書に記載されている。タグメント化の後、フローセルは、本明細書に開示される洗浄溶液の例で、フラッシングされ得る。

【0339】

次に、第２のタイプのトランスポソーム複合体１０’を、フローセルに導入する。既に断片化されたＤＮＡ断片３５、３７を再度断片化し、新たに断片化された鎖３７_１、３５_２の５’末端を、トランスポソーム複合体１０’の転移鎖１８’の各々の３’末端に、ライゲーションする。第二のタグメント化を、図２７のＣに示す。この例では、タグメント化の第２の発生は、３０℃以上の温度で起こり得る。一例では、温度は、約３０℃～約５５℃の範囲であり得る。

【0340】

第２のタグメント化は、断片化された新しいＤＮＡ断片３５_１、３７_１、及び３５_２、３７_２をもたらす。３５_１、３７_１の５’末端は、各々、異なるトランスポソーム複合体１０、１０’の転移鎖１８、１８’に結合し、３５_２、３７_２の５’末端は、各々、異なるトランスポソーム複合体１０’、１０’の転移鎖１８’、１８に結合する。Ｃに示すように、新たに断片化された鎖３５_１、３７_２の３’末端は、（複合体１０’からの）非転移鎖３２’の５’末端に、ライゲーションされない。したがって、ＤＮＡ断片鎖３５_１、３７_２の３’末端と、対応する非転移鎖３２’の５’末端との間に、ギャップが存在する。

【0341】

次いで、本方法は、第１の及び第２のタイプのトランスポソーム複合体１０、１０’の、各々のトランスポザーゼ酵素１４、１４’、を除去するステップと、伸長反応を行って、新たな二本鎖ＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップとを含む。

【0342】

トランスポザーゼ酵素１４、１４’は、本明細書に記載されるように、ＳＤＳ若しくは他のカオトロピック剤、又は熱を使用して除去され得る。ＳＤＳ又は他のカオトロピック剤がトランスポザーゼ除去のために使用された場合、洗浄溶液は、伸長反応を開始する前に、流路を通してフラッシングされ得る。これにより、下流の酵素活性を妨害し得る、カオトロピック剤が除去される。あるいは、カオトロピック剤のキレート剤は、本明細書に記載されるように、導入され得る。

【0343】

伸長反応を開始するために、伸長増幅ミックスを、フローセル中に入れる。例示的な伸長増幅ミックスは、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、及びアクセサリータンパク質を含む。フローセルは、伸長増幅ミックスが導入される時、約３８℃であり得る。

【0344】

伸長反応の前に、非転移鎖３２、３２’は、最初に熱を使用して、脱ハイブリダイズされ得る。

【0345】

更なる配列（アダプター）が、排除増幅試薬（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から入手可能なＥｘＡｍｐ試薬）を使用する伸長反応によって、部分的に適合された断片の３’末端に付加される。伸長反応は、各々の転移鎖１８、１８’を鋳型として使用して、ＤＮＡ断片３５_１、３７_１及び３５_２、３７_２の３’末端から、鋳型依存的にヌクレオチドを付加するステップを含む。伸長反応から得られる配列は、部分的に適合されたＤＮＡ断片３５_１、３７_１及び３５_２、３７_２を完全に適合させ、更なる増幅及びクラスタ生成の準備を整える。クラスタ生成は、図１Ｃを参照して本明細書に記載されるように、実行され得る。

【0346】

この例では、フローセル表面に導入されるトランスポソーム複合体１０の密度は、（望ましくは）１つのトランスポソーム複合体１０が１つの凹部１２に装填されるように、低レベル（例えば、＜０．０５μＭ）に制御される。

【0347】

次に、Ａ及びＤを含む図２７の例示的な方法について説明する。この例では、１つのタグメント化プロセスが、フローセルから離れて実行され、第２のタグメント化プロセスが、フローセル上で実行される。この方法は、転移鎖１８’の一部が非転移鎖２０’にハイブリダイズした、トランスポゾン末端１６’を各々含む、複数のトランスポソーム複合体１０’を使用して、溶液中でＤＮＡ試料をタグメント化するステップであって、転移鎖１８’は増幅ドメイン２６’及びインデックス配列８６を含み、それによって、転移鎖１８’の３’末端に各々５’末端で結合した、二本鎖断片３５、３７を生成するステップと、二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７を含む溶液を、その表面に固定された複数の他のタイプのトランスポソーム複合体１０と、転移鎖１８の一部が非転移鎖２０にハイブリダイズしたトランスポゾン末端１６を含む他のタイプのトランスポソーム複合体１０とを含む、フローセルに導入するステップであって、非転移鎖２０にハイブリダイズした転移鎖１８は、増幅ドメイン２６を含み、インデックス配列を含まず、それによって、二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７をタグメント化して、各々その５’末端で、転移鎖１８の３’末端に結合した、新しい二本鎖ＤＮＡ断片３５_３、３７_３、３５_４、３７_４を生成するステップとを含む。

【0348】

フローセルから離れて実行されるタグメント化プロセスは、図２７のＡとＤとの間に示される。この例では、ＤＮＡ試料及びトランスポソーム複合体１０’を、反応容器中のタグメント化緩衝液に添加する。溶液中で、ＤＮＡ試料は、タグメント化される。トランスポソーム複合体１０’が示されているが、複合体１０を、溶液中でのタグメント化に使用できることを、理解されたい。更に、フローセル表面に結合した複合体１０は、インデックス／バーコード配列を含むこともできる。

【0349】

次いで、トランスポソーム複合体１０’が結合したタグメント化二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７を、Ａに示すフローセルに導入する。フローセル上で、既に断片化されたＤＮＡ断片３５、３７を再度断片化し、新たに断片化された鎖３７_３、３５_４の５’末端を、表面結合トランスポソーム複合体１０の転移鎖１８の、各々の３’末端にタグメント化する。第二のタグメント化を、図２７のＤに示す。この例では、断片化の第２の発生は、３０℃以上の温度で起こり得る。一例では、温度は、約３０℃～約５５℃の範囲であり得る。

【0350】

第２のタグメント化は、断片化された新しいＤＮＡ断片３５_３、３７_３、及び３５_４、３７_４をもたらす。３５_３、３７の５’末端は、異なるトランスポソーム複合体１０’、１０’の転移鎖１８’、１８に各々結合し、３５_４、３７_４の５’末端は、異なるトランスポソーム複合体１０、１０’の転移鎖１８、１８’に各々結合する。Ｅに示すように、新たに断片化された鎖３５_３、３７_４の３’末端は、（複合体１０からの）非転移鎖３２の５’末端に、ライゲーションされない。したがって、ＤＮＡ断片鎖３５_３、３７_４の３’末端と、対応する非転移鎖３２の５’末端との間に、ギャップが存在する。

【0351】

次いで、本方法は、第１の及び第２のタイプのトランスポソーム複合体１０、１０’の、各々のトランスポザーゼ酵素１４、１４’、を除去するステップと、伸長反応を行って、新たな二本鎖ＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップとを含む。

【0352】

トランスポザーゼ酵素１４、１４’の除去及び伸長反応は、本明細書に記載されるように、実施することができる。伸長反応から得られる配列は、部分的に適合されたＤＮＡ断片３５_３、３７_３、及び３５_４、３７_４を完全に適合させ、更なる増幅及びクラスタ生成の準備を整える。クラスタ生成は、図１Ｃを参照して本明細書に記載されるように、実行され得る。

【0353】

次に、Ａ、Ｅ及びＦを含む図２７の例示的な方法について記載する。この方法は、単一タイプの１つのトランスポソーム複合体１０をフローセルの凹部１２に導入するステップであって、トランスポソーム複合体１０は、非転移鎖２０にハイブリダイズされた転移鎖１８の部分３０を有するトランスポゾン末端１６を含み、転移鎖１８は、第１の増幅ドメイン２６を含むステップと、ＤＮＡ試料をフローセルに導入し、それによって、１つのトランスポソーム複合体がＤＮＡ試料をタグメント化して、第１の鎖３５が、その５’末端で転移鎖１８の３’末端に結合し、その３’末端で結合しておらず、第２の鎖３７_５がその３’末端及び５’末端の両方で結合していない、二本鎖ＤＮＡ断片３５、３７_５を生成するステップと（図２７のＥを参照されたい）、第２の転移鎖１８’の部分３０’が第２の非転移鎖２０’にハイブリダイズしている第２のトランスポゾン末端１６’を含む、第２のタイプのトランスポソーム複合体１０’をフローセルに導入するステップであって、第２の転移鎖１８’が第２の増幅ドメイン２６’を含み、それによって、二本鎖ＤＮＡ断片の第２の鎖３７_５の５’末端が、第２の転移鎖１８’に結合するステップとを含む。

【0354】

この例では、フローセル表面に導入されるトランスポソーム複合体１０の密度は、（望ましくは）１つのトランスポソーム複合体１０が１つの凹部１２に装填されるように、低レベル（例えば、＜０．０５μＭ）に制御される。したがって、タグメント化の間、ＤＮＡ試料は緩く結合し、その結果、一方の末端は、凹部１２内のトランスポソーム複合体１０に結合し、他方の末端は、（Ｅで示すように）バルクタグメント化流体中に懸濁される。

【0355】

フローセルを洗浄溶液で洗浄した後、他のトランスポソーム複合体１０’を、フローセルに導入してもよい。新たに導入されたトランスポソーム複合体１０’の転移鎖１８’の３’末端は、第２の鎖３７_５の５’末端に結合する。これにより、第２の鎖３７_５を、部分的に適合させる。

【0356】

次いで、本方法は、第１の及び第２のタイプのトランスポソーム複合体１０、１０’の、各々のトランスポザーゼ酵素１４、１４’、を除去するステップと、伸長反応を行って、新たな二本鎖ＤＮＡ断片に追加のアダプターを付加するステップとを含む。

【0357】

トランスポザーゼ酵素１４、１４’の除去及び伸長反応は、本明細書に記載されるように、実施することができる。伸長反応から得られる配列は、部分的に適合されたＤＮＡ断片３５、３７_５を完全に適合させ、更なる増幅及びクラスタ生成の準備を整える。クラスタ生成は、図１Ｃを参照して本明細書に記載されるように、実行され得る。

【0358】

図２７のＡ、Ｅ、及びＦに示される実施例は、Ａ、Ｂ、及びＣに示される方法と組み合わせて配置されてもよく、Ｅ及びＦに示されるタグメント化（複数可）は、ＤＮＡ試料（例えば、次の固定トランスポソーム複合体１０に到達するのに十分な長さではない）の末端又はその付近で生じてもよい。

【0359】

本開示を更に説明するために、本明細書に例を示す。これらの例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるものではないことを理解されたい。

【0360】

非限定的な実施例
実施例１
凹部にＰＡＺＡＭ並びにグラフトされたＰ５及びＰ７プライマーを含む、フローセルを使用した。

【0361】

３’モザイク末端及び５’ＢＣＮリンカーを有するＰ５プライマーを、等量の相補的モザイク末端（５’リン酸を含む）と混合した。混合物を約９５℃で約２分間インキュベーションした後、－０．１℃／秒の速度で、１０℃まで冷却した。これにより、トランスポゾンＰ５が形成された。トランスポゾンＰ５を緩衝溶液中で２倍量のＴｎ５トランスポザーゼと混合し、混合物を、３７℃で、１２～２４時間インキュベーションした。これにより、ＢＣＮ－Ｐ５トランスポソームが形成された。３’モザイク末端を有するＰ７プライマーを使用して同一の手順を行って、ＢＣＮ－Ｐ７トランスポソームを形成した。

【0362】

ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、２つの異なるフローセル中で、ＰＡＺＡＭにグラフト化した。ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、硫酸ナトリウムグラフト化緩衝液中で希釈して、トランスポソーム混合物を形成した。フローセルを脱イオン水で洗浄し、硫酸ナトリウム溶液でフラッシングし、３７℃まで加熱した。トランスポソーム混合物を各フローセルに添加し、約２時間インキュベーションした。所望のインキュベーション期間の後、フローセルを緩衝液でフラッシングし、室温に冷却した。

【0363】

総投入量が３００ｎｇ～８００ｎｇとなるように、ＤＮＡ試料を水中で調製した。追加の水を、タグメント化緩衝液と共に加えた。

【0364】

対照として、ＤＮＡ試料（約１５０μＬ）をフローセルの１つに導入し、タグメント化を生じさせた。対照は、２回行った。

【0365】

一例では、ＤＮＡ試料（約１５０μＬ）を５ｍＭスペルミジンと共に導入し、タグメント化を起こさせた。実施例は、２回行った。

【0366】

タグメント化対照ＤＮＡ試料及びタグメント化実施例ＤＮＡ試料のインサートサイズを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＤｙｎａｍｉｃ Ｒｅａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＤＲＡＧＥＮ）ソフトウェアを使用して、データを配列決定及び整列するステップによって決定した。結果を、図６に示す。示すように、スペルミジンの存在は、インサートサイズを増加させた。

【0367】

実施例２
凹部にＰＡＺＡＭ並びにグラフトされたＰ５及びＰ７プライマーを含む、フローセルを使用した。

【0368】

対照として、実施例１からの、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を使用した。それらを、実施例１に記載したのと同一の方法で、対照フローセルに導入した。

【0369】

例として、非転移鎖上に５’リン酸を有さないＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、相補的モザイク末端が５’リン酸を含まないことを除いて、実施例１に記載されるように調製した。非転移鎖上に５’リン酸を含まないＢＣＮ－Ｐ５トランスポソーム複合体及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、実施例１に記載したのと同一の様式で、実施例のフローセルに導入した。

【0370】

ＤＮＡ試料を実施例１に記載のように調製し、対照フローセル及び実施例フローセルの各々に導入し、タグメント化を生じさせた。

【0371】

ＩｌｌｕｍｉｎａのＤｙｎａｍｉｃ Ｒｅａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＤＲＡＧＥＮ）ソフトウェアを使用して、データを配列決定及び整列させることによって、対照フローセル中のタグメント化ＤＮＡ試料、及び実施例フローセル中のタグメント化ＤＮＡ試料の、インサートサイズを決定した。結果を、図７に示す。示すように、５’リン酸の排除は、インサートサイズを増加させた。これらの結果は、トランスポゾンに対する修飾が、インサートサイズに影響を及ぼし得ることを示す。

【0372】

実施例３
凹部にＰＡＺＡＭ並びにグラフトされたＰ５及びＰ７プライマーを含む、フローセルを使用した。

【0373】

第１の例として、実施例１からの、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体（５’リン酸非転移鎖を有する）を使用した。それらを、実施例１に記載したのと同一の方法で、第１の例のフローセルに導入した。

【0374】

第２の例として、非転移鎖上に５’リン酸を有さず、非転移鎖上に３’ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素を有する、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、相補的モザイク末端が５’リン酸を含まず、３’ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素を含むことを除いて、実施例１に記載されるように調製した。非転移鎖上に５’リン酸を有さず、３’ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素を有するＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、実施例１に記載したのと同一の様式で、第２の例のフローセルに導入した。

【0375】

第３の例として、非転移鎖上に５’リン酸を有し、非転移鎖上に３’ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素を有する、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、相補的モザイク末端が３’ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素を含むことを除いて、実施例１に記載されるように調製した。非転移鎖上に５’リン酸及び３’ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素を有する、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、実施例１に記載したのと同一の様式で、第３の例のフローセルに導入した。

【0376】

第４の例として、非転移鎖上に５’リン酸を有さない、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、相補的モザイク末端が５’リン酸を含まないことを除いて、実施例１に記載されるように調製した。非転移鎖上に５’リン酸を有さない、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、実施例１に記載したのと同一の様式で、第４の例のフローセルに導入した。

【0377】

対照として、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製をチューブ中で行った。対照試料をフローセルの１つに導入し、タグメント化を生じさせた。

【0378】

ＤＮＡ試料を実施例１に記載したように調製し、第１のフローセル、第２のフローセル、第３のフローセル、及び第４のフローセルの各々に導入し、タグメント化を生じさせた。

【0379】

タグメント化対照ＤＮＡ試料、並びに第１の、第２の、第３の、及び第４の例フローセルを使用したタグメント化ＤＮＡ試料の、インサートサイズを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＤｙｎａｍｉｃ Ｒｅａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＤＲＡＧＥＮ）ソフトウェアを使用して、データを配列決定及び整列させることによって決定した。結果を図８に示している。示すように、非転移鎖からの５’リン酸の除去は、単独で、又は非転移鎖への３’フルオロフォアの付加と組み合わせて、インサートサイズを増加させた。

【0380】

実施例４
凹部にＰＡＺＡＭ並びにグラフトされたＰ５及びＰ７プライマーを含む、フローセルを使用した。

【0381】

実施例１からの、ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体（５’リン酸非転移鎖を有する）を、活性トランスポソーム複合体として使用した。

【0382】

転移鎖上に３’ジデオキシシトシンを有する、不活性ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体もまた、Ｐ５プライマーがモザイク末端に結合した３’ジデオキシシトシンを有することを除いて、実施例１に記載されるように調製した。

【0383】

活性ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体を、異なる割合の不活性ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体と共に、異なるフローセルに導入した。不活性ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体の割合は、１０％刻みで、２０％～６０％の範囲であった。

【0384】

ＤＮＡ試料を実施例１に記載のように調製し、フローセルの各々に導入し、タグメント化を生じさせた。

【0385】

ＩｌｌｕｍｉｎａのＤｙｎａｍｉｃ Ｒｅａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＤＲＡＧＥＮ）ソフトウェアを使用して、データを配列決定及び整列することによって、様々なフローセル中の、ＤＮＡ試料のインサートサイズを決定した。結果を図９に示し、試料は、フローセル中の不活性ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体のパーセンテージによって同定される。示すように、転移鎖上の３’ジデオキシシトシンの包含は、インサートサイズを増加させた。更に、インサートサイズは、不活性ＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体の割合が増加するにつれて増加した。

【0386】

実施例５
２５μｌの全血を、無機塩を含まない溶解緩衝液の例を含有する、溶解チューブに添加した。無機塩を含まない溶解緩衝液は、３．６単位の熱不安定性プロテイナーゼＫ（ＴＬＰＫ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び脱塩水からなっていた。溶解を、３７℃（ヒートブロックを使用）で約１５分間実施して、粗溶解物を生成した。

【0387】

次いで、粗溶解物の温度を５５℃に約１０分間上昇させて、培養ＴＬＰＫを不活性化した。

【0388】

アルファシクロデキストリン及びタグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩からなる、ｐＨ７．６）の混合物を、溶解チューブに添加して、複合体粗溶解物を生成した。

【0389】

ＰＡＺＡＭ、ＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマー、並びにＰＡＺＡＭにグラフト化された実施例１からのＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体（５’リン酸非転移鎖を有する）を含むフローセル上で、複合体粗溶解物をタグメント化に曝露した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0390】

第１の対照として、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製をチューブ中で実施して、ＤＮＡライブラリを生成した。ＤＮＡライブラリを、ＮａＯＨ及びＴｒｉｓ ＨＣｌを使用して変性し、ＰＡＺＡＭ、並びにＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマーを含む、フローセルに添加した。ＤＮＡライブラリを増幅して、フローセルの凹部にクラスタを生成した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0391】

第２の対照として、ＤＮＡを使用した。ＤＮＡを、複合体粗溶解物と同一の様式で調製した。

【0392】

タグメント化対照ＤＮＡ試料、及びタグメント化複合体粗溶解物試料の、インサートサイズを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＤｙｎａｍｉｃ Ｒｅａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＤＲＡＧＥＮ）ソフトウェアを使用して、データを配列決定及び整列することによって決定した。結果を、図１０に示す。図示するように、タグメント化された複合体粗溶解物のインサートサイズはより小さく、より小さい断片に対してより大きなバイアスがあった。

【0393】

図１０に提示される配列決定指標は、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、カバレッジ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージを含む。

【0394】

Ｑ３０は、１０００回中１回の誤ったベースコールの確率と同等である。これは、塩基呼び出しの精度（つまり、正しい塩基呼び出しの確率）が９９．９％であることを意味する。塩基呼び出しの精度が９９％（Ｑ２０）と低いと、１００分の１の誤った塩基呼び出し確率を有するステップになり、すなわち１００塩基対の配列決定読み取りごとにエラーが含まれ得ることを意味する。配列決定の品質がＱ３０に達する場合、事実上すべての読み取りが完全であり、エラーやあいまいさがなくなる。

【0395】

マッピングされたリードパーセンテージは、参照ゲノムに対してアライメントされる、リードのパーセンテージを指す。

【0396】

カバレッジ深度は、配列決定された試料中の各塩基にアライメントするか、又は各塩基を「カバーする」、配列決定リードの平均数を指す。Ｌａｎｄｅｒ／Ｗａｔｅｒｍａｎ式は、リード長（Ｌ）、リード数（Ｎ）、及び半数体ゲノム長（Ｇ）に基づいて、カバレッジ（Ｃ）を計算するための方法である：Ｃ＝ＬＮ／Ｇ。

【0397】

より高いマッピングされたリードパーセンテージ及びより高いカバレッジ深度は、配列決定の精度を示す。

【0398】

Ｐａｓｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ（ＰＦ）は、ｃｈａｓｔｉｔｙ閾値をパスするクラスタを記述するために使用されるメトリックであり、配列決定データの更なる処理と分析に使用される。％ＰＦ計算は、各クラスタへのチャスティティフィルタの適用を含む。「チャスティティ」は、最も明るい塩基強度を、最も明るい塩基強度と第２の最も明るい塩基強度との合計で割ったものとして、定義される。クラスタは、１つ以下のベースコールが、第１の２５サイクルにおいて０．６未満のチャスティティ値を有する場合には、「フィルタを通過する」。このフィルタリングプロセスは、画像分析結果から、最も信頼性の低いクラスタを除去する。したがって、より高い％通過フィルタ（％ＰＦ）結果は、使用可能な配列決定データの、収率の増加を示す。

【0399】

複合体粗溶解物試料についての、Ｑ３０スコア、マッピングされたリードパーセンテージ、及びカバレッジは、対照試料の両方と同等であった（ただし、試料のすべてがダウンサンプリングされたことに留意されたい）。複合体粗溶解物試料についての、％ＰＦ及びＧＣバイアスは、第２の対照試料と同等であったが、第１の対照試料はより高かった。

【0400】

本実施例は、３０×ヒトゲノムが、オンボードタグメント化、増幅、及び配列決定を使用して、フローセル上の粗溶解物から得られ得ることを示す。

【0401】

実施例６
本実施例は、ポリメラーゼ連鎖反応中に、ＳＤＳの影響から２つの異なるポリメラーゼを保護する際の、ベータシクロデキストリンの効率を評価するために実施した。

【0402】

ＰＣＲを、３５０塩基対のラムダＤＮＡ標的に対して行った。使用したポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢから）、及び低忠実度ポリメラーゼであった。各ポリメラーゼについて、１６個の試料を、試験した。８つの試料を、ＳＤＳなしで、異なる濃度（０％～８％）のベータシクロデキストリンを使用して試験し、８つの試料を、５μＬの１％ＳＤＳ（最終濃度０．０５％）、及び異なる濃度（０％～８％）のベータシクロデキストリンを使用して試験した。

【0403】

Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）システム、及びＤ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（登録商標）アッセイを使用して、ＰＣＲ産物のサイズ分析を行った。ｉ）ＳＤＳを含まないＱ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを含む試料、ｉｉ）ＳＤＳを含むＱ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを含む試料、ｉｉｉ）ＳＤＳを含まない低忠実度ポリメラーゼを含む試料、及びｉｖ）ＳＤＳを含む低忠実度ポリメラーゼを含む試料についての、ゲル画像の白黒再現を、各々、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、及び図１１Ｄに示す。

【0404】

図１１Ａ及び図１１Ｃに示すように、ＳＤＳを使用しなかった場合の増幅産物が、すべてのレーンに示されている。図１１Ｂ及び図１１Ｄの結果は、ＳＤＳが０．０５％で存在する場合、各ポリメラーゼは、ベータシクロデキストリンの非存在下又は低レベル（０．５％）のベータシクロデキストリンが含まれる場合に、ＤＮＡを増幅することができなかったことを示す。これらの結果は、ＳＤＳがポリメラーゼ活性に有害な影響を及ぼし得ることを示している。図１１Ｂ及び図１１Ｄの結果はまた、ベータシクロデキストリンのレベルが約１％（Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ試料について）、及び約２％（低忠実度ポリメラーゼについて）に増加した場合、ポリメラーゼ活性が回復したことを示す。これは、ベータシクロデキストリンがＳＤＳに対して有する、封鎖効果を明確に示す。より高いベータシクロデキストリン濃度（例えば、約６％～約８％）では、増幅はいくらか阻害された。したがって、このカオトロピック剤キレート剤の上限は、６％又は８％であり得る。

【0405】

実施例７
本実施例は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製中に、ギャップフィルライゲーション酵素をＳＤＳの影響から保護する際の、βシクロデキストリンの効率を評価するために実施した。

【0406】

第１の対照試料は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製のための、プロトコルに従った。ＤＮＡを以下のワークフローに曝露した：５０μＬのタグメント化緩衝液→１０μＬの１％ＳＤＳ→洗浄１回→ベータシクロデキストリン滴定（濃度は０％～５％で変化）を使用した５０μＬのギャップフィルライゲーション→上清除去→ＮａＯＨの添加→ＤＮＡを可逆的に結合させるための固相可逆的固定（ＳＰＲＩ）ビーズの添加。

【0407】

第２の対照試料は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製のための修飾プロトコルに従い、試薬体積を調整した。ＤＮＡを以下のワークフローに曝露した：２０μＬのタグメント化緩衝液→５μＬの０．６％ＳＤＳ→洗浄１回→ベータシクロデキストリン滴定（濃度は０％～５％で変化）を使用した１００μＬのギャップ充填ライゲーション→上清除去→ＮａＯＨの添加→ＤＮＡを可逆的に結合させるためのＳＰＲＩビーズの添加。

【0408】

第３の試料は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製のための修飾されたプロトコルに従い、洗浄ステップは完全に除去された。ＤＮＡを以下のワークフローに曝露した：２０μＬのタグメント化緩衝液→５μＬの０．６％ＳＤＳ→ベータシクロデキストリン滴定（濃度は０％～５％で変化）を使用した１００μＬのギャップフィルライゲーション→上清除去→ＮａＯＨの添加→ＤＮＡを可逆的に結合させるためのＳＰＲＩビーズの添加。

【0409】

各試料を定量ＰＣＲに供し、結果を図１２に示す。第１及び第２の対照試料における洗浄ステップを実施して、タグメント化中に使用されたＳＤＳ及びトランスポザーゼの両方を除去した。これは、その後のステップで使用される酵素（例えば、ギャップ充填ライゲーション酵素）の阻害を防止するために実施した。ベータシクロデキストリンを含まない第３の試料についての結果は、それが洗い流されない場合の、ＳＤＳの強い負の影響を示す。１％、２％、及び３％のベータシクロデキストリンを有する第３の試料についての結果は、ベータシクロデキストリンがＳＤＳを相殺するステップを示す。これらの結果は、少量のベータシクロデキストリンの添加が、カオトロピック剤の有害な効果を再導入せず、洗浄ステップの除去を可能にし、したがって、ライブラリ調製プロセスを合理化するのに役立ち得ることを示す。

【0410】

実施例８
本実施例では、手動ＤＮＡ抽出を行い、及びＨＡＭＩＬＴＯＮ（登録商標）装置を使用して、自動ＤＮＡ抽出を行った。両方の実験において、Ｍｉｔｒａチップを、血液試料の収集のために使用した。第１の実験では、プロテイナーゼＫを、溶解緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ ＰＣＲ－ｆｒｅｅ ｋｉｔから）に添加し、第２の実験では、プロテイナーゼＫを、血液収集前にＭｉｔｒａチップ上で予備乾燥させた。各実験からのＤＮＡ収量を決定し、結果を図１８に示す。示すように、各処理タイプの結果は同等であったが、予備乾燥された実施例は特に有効であった。同様の結果は、プロテイナーゼＫの代わりに、酸化亜鉛ナノ粒子使用しても達成され得ると考えられる。

【0411】

実施例９
この例では、３つの異なるワークフローを使用して、無機塩を含まない溶解緩衝液の異なる実施例、及び異なるプロテアーゼ不活性化技術を使用した、全血の溶解を比較した。

【0412】

第１のワークフローにおいて、２５μｌの全血を、無機塩を含まない溶解緩衝液の例を含有する、溶解チューブに添加した。無機塩を含まない溶解緩衝液は、３．６単位の熱不安定性プロテイナーゼＫ（ＴＬＰＫ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び脱塩水からなっていた。溶解を、３７℃（ヒートブロックを使用）で約１５分間実施して、粗溶解物を生成した。次いで、粗溶解物の温度を５５℃に約１０分間上昇させて、培養ＴＬＰＫを不活性化した。アルファシクロデキストリン（２．７％）、及びタグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．６からなる）の混合物を、溶解チューブに添加して、第１の複合体粗溶解物を生成した。

【0413】

第２のワークフローでは、２５μｌの全血を、無機塩を含まない溶解緩衝液の他の例を含有する、溶解チューブに添加した。無機塩を含まない溶解緩衝液は、０．８ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（ＰＫ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び脱イオン水からなっていた。溶解を、３７℃（ヒートブロックを使用）で約１５分間実施して、粗溶解物を生成した。次いで、粗溶解物の温度を、８０℃に、約１０分間～約１５分間上昇させて、ＰＫを不活性化した。アルファシクロデキストリン（２．７％）、及びタグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．６からなる）の混合物を、溶解チューブに添加して、第２の複合体粗溶解物を生成した。

【0414】

第３のワークフローでは、２５μｌの全血を、無機塩を含まない溶解緩衝液の他の例を含有する、溶解チューブに添加した。無機塩を含まない溶解緩衝液は、０．８ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（ＰＫ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び脱イオン水からなっていた。溶解を、３７℃（ヒートブロックを使用）で約１５分間実施して、粗溶解物を生成した。アルファシクロデキストリン（２．７％）、テトラペプチジルクロロメチルケトン（０．０８ｍｇ／ｍＬ）、及びタグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩からなる、ｐＨ７．６）の混合物を、溶解チューブに添加して、ＰＫを不活性化し、第３の複合体粗溶解物を生成した。

【0415】

第１の複合体粗溶解物、第２の複合体粗溶解物、及び第３の複合体粗溶解物の各々を、ＰＡＺＡＭ、ＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマー、並びにＰＡＺＡＭにグラフト化された実施例１からのＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体（５’リン酸非転移鎖を有する）を含む、フローセル上でのタグメント化に各々曝露した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0416】

インサートサイズ、及び配列決定指標（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、カバレッジ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５に記載されるように決定した（ただし、試料はダウンサンプリングしなかった）。結果を、図１９に示す。図１９に示すように、第１の複合体粗溶解物のインサートサイズは、第２の及び第３の複合体粗溶解物よりも、わずかに小さかった。全体として、ワークフローの各々、並びにその溶解緩衝液及び不活性化技術、例えば、熱又は阻害剤としてのＴＣＫは、適切なインサートサイズを生成し、同様の配列決定指標をもたらした。この例もまた、３０×を超えるヒトゲノムが、オンボードタグメント化、増幅、及び配列決定を使用して、フローセル上で粗溶解物から得られ得ることを示す。

【0417】

実施例１０
凍結乾燥しなかった試薬と比較した、凍結乾燥の効果を決定するために、本明細書に記載の、試薬（ストレプトアビジン、溶解緩衝液、タグメント化緩衝液、及びトランスポソーム緩衝液）のいくつかを、凍結乾燥した。

【0418】

ストレプトアビジン試薬は、２μＭストレプトアビジン、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、５４０ｍＭトレハロース、及び脱イオン水を使用して、調製した。

【0419】

無機塩を含まない溶解緩衝液を、０．０５６ｍＭプロテイナーゼＫ（ＰＫ）、０．４％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、４４０ｍＭトレハロース、及び脱イオン水を使用して、調製した。

【0420】

タグメント化緩衝液は、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２０ｍＭトリス酢酸塩（ｐＨ７．６）、５７１ｍＭトレハロース、及び脱イオン水を使用して、調製した。

【0421】

非対称トランスポソーム複合体を使用して、トランスポソーム緩衝液を調製した。Ｐ７トランスポソーム複合体は、非転移鎖の３’末端にビオチンを含み、Ｐ５トランスポソーム複合体は、転移鎖の５’末端にビオチンを含んだ。最終トランスポソーム濃度は、各々、０．４μＭ及び０．５μＭ（８０％のＰ７トランスポソーム複合体、及び２０％のＰ５トランスポソーム複合体）であった。０．４μＭトランスポソーム緩衝液は、０．６４％グリセロール、６３．３６ｍＭ ＮａＣｌ、１０１．６８ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、０．０３４ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、０．００３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び１８％トレハロースを含んでいた。０．５μＭトランスポソーム緩衝液は、０．８％グリセロール、６４．２ｍＭ ＮａＣｌ、１０２．１ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、０．０４２ｍＭ ＤＴＴ、０．００４％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、０．００４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び１８％トレハロースを含んでいた。

【0422】

各試薬について、液体試料を調製し、凍結乾燥試料を調製した。凍結乾燥は、約－２５℃～約－５０℃の範囲の温度、及び約３０ＭＰａ～約９０ＭＰａの範囲の圧力で実施した。得られたマイクロスフェア又は単一ブロック（ケーキ形式）中の、試薬成分の重量平均分子量及び／又は濃度を、表１～４に示す。

【0423】

【表1】

【0424】

【表2】

【0425】

【表3】

【0426】

【表4】

【0427】

凍結乾燥試料（マイクロスフェア又はブロック）の各々を、水で再構成した。

【0428】

ストレプトアビジンの結果
液体及び再構成された凍結乾燥ストレプトアビジン試料を、ビオチン化ＰＡＺＡＭ（ビオチンが、ＢＣＮリンカーを介してＰＡＺＡＭに結合している）、並びにビオチン－Ｐ５及びビオチン－Ｐ７トランスポソーム複合体を有する、ＰＡＺＡＭにグラフトされたＰ５及びＰ７プライマーを含む、各々のフローセル上に充填した。洗浄溶液をフローセルに流して、未結合ストレプトアビジン、及びトランスポソーム複合体を除去した。次に、タグメント化緩衝液中のＤＮＡ試料（５００ｎｇ）を、各々のフローセルに導入した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0429】

インサートサイズ、及び配列決定指標（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、カバレッジ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５に記載されるように決定した（ただし、試料はダウンサンプリングしなかった）。液体及び再構成された凍結乾燥ストレプトアビジン試料を使用して調製された、フローセル上で分析されたＤＮＡについての、インサートサイズ及び配列決定指標を、図２０に示す。示すように、トランスポソーム複合体を結合させるための、凍結乾燥され再構成されたストレプトアビジンの使用は、インサートサイズ又は配列決定指標に関して、下流のＤＮＡプロセシングに悪影響を及ぼさなかった。

【0430】

溶解緩衝液の結果
２５μｌの全血を、液体試料及び再構成した凍結乾燥溶解緩衝液試料の、各々に添加した。溶解を、３７℃（ヒートブロックを使用）で、約１５分間実施して、各々の粗溶解物を生成した。次いで、粗溶解物の温度を、８０℃に、約１０分間～約１５分間上昇させて、ＰＫを不活性化した。アルファシクロデキストリン（２．７％）、及びタグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．６からなる）の混合物を、溶解チューブに添加して、複合体粗溶解物を生成した。ＰＡＺＡＭ、ＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマー、並びにＰＡＺＡＭにグラフトされた実施例１からのＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体（５’リン酸非転移鎖を有する）を含む、フローセル上で、複合体粗溶解物（各々、液体溶解緩衝液及び再構成された凍結乾燥溶解緩衝液で形成された）の各々を、タグメント化に曝露した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0431】

インサートサイズ、及び配列決定指標（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、カバレッジ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５に記載されるように決定した（ただし、試料はダウンサンプリングしなかった）。結果を、図２１に示す。示すように、全血試料から粗溶解物を生成するための、凍結乾燥され再構成された溶解緩衝液の使用は、インサートサイズ又は配列決定指標に関して、下流のＤＮＡプロセシングに悪影響を及ぼさなかった。

【0432】

タグメント化緩衝液結果
ＤＮＡ試料（５００ｎｇ）を、各々液体及び再構成した凍結乾燥タグメント化緩衝液に導入した。次いで、これらの試料を、ＰＡＺＡＭ、ＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマー、並びにＰＡＺＡＭにグラフト化された実施例１からのＢＣＮ－Ｐ５及びＢＣＮ－Ｐ７トランスポソーム複合体（５’リン酸非転移鎖を有する）を含む、各々のフローセルに導入した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0433】

インサートサイズ、及び配列決定指標（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、カバレッジ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５に記載されるように決定した（ただし、試料はダウンサンプリングしなかった）。結果を、図２２に示す。示すように、タグメント化中の、凍結乾燥及び再構成されたタグメント化緩衝液の使用は、インサートサイズ又は配列決定指標に関して、下流のＤＮＡプロセシングに悪影響を及ぼさなかった。

【0434】

この例における結果は、凍結乾燥が、下流の配列決定に有害な影響を与えることなく、フローセル調製及び試料調製において使用される種々の試薬について、使用され得ることを示す。

【0435】

トランスポソーム結果
液体及び再構成された凍結乾燥トランスポソーム緩衝液試料を、ビオチン化ＰＡＺＡＭ（ビオチンが、ＢＣＮリンカーを介してＰＡＺＡＭに結合している）、並びにＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマーを含む、各々のフローセル上にロードした。洗浄溶液をフローセルに流して、未結合ストレプトアビジン、及びトランスポソーム複合体を除去した。次に、タグメント化緩衝液中のＤＮＡ試料（５００ｎｇ）を、各々のフローセルに導入した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0436】

インサートサイズ及び配列決定指標の一部（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５に記載されているように決定した（ただし、試料はダウンサンプリングしなかった）。この例では、占有率又は占有率％も決定した。本明細書で使用される場合、「占有率又は占有％」は、クラスタを含有する凹部対空の凹部のパーセンテージを指す。液体及び再構成された凍結乾燥ストレプトアビジン試料を使用して調製された、フローセル上で分析されたＤＮＡについての、インサートサイズ及び配列決定指標、を図２８に示す。示すように、異なる濃度での凍結乾燥及び再構成されたトランスポソームの使用は、インサートサイズ又は配列決定指標に関して、下流のＤＮＡプロセシングに悪影響を及ぼさなかった。

【0437】

実施例１１
対照として、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲフリーＤＮＡ調製（ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）２Ｋプロトコル）をチューブ内で実施して、ｇＤＮＡライブラリを生成した。ｇＤＮＡライブラリを、ＮａＯＨ及びＴｒｉｓ ＨＣｌを使用して変性させ、ＰＡＺＡＭ、並びにＰＡＺＡＭにグラフト化されたＰ５及びＰ７プライマーを含む、フローセルに添加した。ｇＤＮＡライブラリを増幅して、フローセルの凹部にクラスタを生成した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0438】

実施例のために、ビオチン化ＰＡＺＡＭ（ストレプトアビジンがビオチンに結合しており、ビオチンがＢＣＮリンカーを介してＰＡＺＡＭに結合している）、並びにグラフト化Ｐ１５及びＰ７プライマーを凹部に含む、フローセルを使用した。ビオチン－Ｐ１５及びビオチン－Ｐ７トランスポソームを、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、及び水）に取り込み、ストレプトアビジンを介して、ビオチン化ＰＡＺＡＭにグラフト化した。フローセルを、高塩濃度緩衝液で洗浄した。トランスポソーム混合物を、各フローセルに添加し、室温で、約３０分間インキュベーションした。所望のインキュベーション期間後、対照フローセルを、緩衝液でフラッシングした。

【0439】

一例として、５００ｎｇのｇＤＮＡを、タグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．６からなる）に組み込んだ。ｇＤＮＡを、フローセルの１つでタグメント化に曝露した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0440】

他の例では、３００μＬの複合体粗溶解物を使用した。全血を、無機塩を含まない溶解緩衝液の例を含有する溶解チューブに添加した。無機塩を含まない溶解緩衝液は、３．６単位の熱不安定性プロテイナーゼＫ（ＴＬＰＫ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及び脱塩水からなっていた。溶解を、３７℃（ヒートブロックを使用）で約１５分間実施して、粗溶解物を生成した。次いで、粗溶解物の温度を５５℃に約１０分間上昇させて、培養ＴＬＰＫを不活性化した。アルファシクロデキストリン（２．７％）、及びタグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．６からなる）の混合物を、溶解チューブに添加して、複合体粗溶解物を生成した。複合体粗溶解物を、フローセルの他の１つ上で、タグメント化に曝露した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0441】

インサートサイズ及び配列決定指標（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、カバレッジ、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５に記載されるように、対照及び実施例について決定した（試料をダウンサンプリングした）。結果を、図２３に示している。図２３に示すように、実施例ｇＤＮＡ及び粗溶解物の、両方のインサートサイズは、対照ｇＤＮＡよりもわずかに小さかった。全体として、配列決定指標は、対照と同等であった。

【0442】

実施例１２
本実施例は、その後のビオチン化トランスポソーム複合体の導入のために、ＢＣＮ－ビオチン及びストレプトアビジンを使用してフローセル表面を調製するための、２つの異なる方法を比較した。

【0443】

一例では、ＢＣＮ－ビオチンを、凹部にＰＡＺＡＭを含むフローセルに添加した。ＢＣＮ－ビオチン－ストレプトアビジンを、６０℃で、約２時間インキュベーションした。次いでストレプトアビジンを添加し、室温で、３０分間インキュベーションした。

【0444】

他の例では、ＢＣＮ－ビオチン（２０μＬ）及びストレプトアビジン（２０μＬ）を、２０μＬの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、及び水）中で、３０分間プレインキュベーションした。３０分後、混合物を、１４０μＬのＮａ_２ＳＯ_４緩衝液で希釈した。次いで、希釈したＢＣＮ－ビオチン－ストレプトアビジンを、凹部にＰＡＺＡＭを含むフローセルに添加し、６０℃で、約２時間インキュベーションした。

【0445】

５００ｎｇのｇＤＮＡを、タグメント化緩衝液（水、５ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１０ｍＭトリス酢酸塩からなる、ｐＨ７．６）に組み込んだ。各々のｇＤＮＡ試料を、各フローセル上で、タグメント化に曝露した。タグメント化から得られた断片を、プライマーを使用して増幅した。逆方向鎖を切断し、順方向鎖を配列決定した。

【0446】

インサートサイズ及び配列決定指標（すなわち、Ｑ３０塩基のパーセンテージ、マッピングされたリードのパーセンテージ、占有率、及びフィルタを通過するリードのパーセンテージ）を、実施例５及び１０に記載されるように、実施例について決定した。結果を、図２５に示す。図２５に示すように、ＢＣＮ－ビオチン－ストレプトアビジンを導入するための方法のいずれも、下流の指標に悪影響を及ぼすことなく使用することができる。

【0447】

追記事項
本明細書に開示される例のいずれにおいても、基材は、複数の凹部ではなく、その中に画定された単一のレーンを含んでもよい。レーン内で、ポリマーヒドロゲルを選択的に堆積させて、個々のパッドを形成することができる。パッドは、凹部内のポリマーヒドロゲルに類似しており、本明細書に開示される実施例のいずれにおいても使用することができる。

【0448】

以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念のすべての組み合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるものであることも理解されたい。

【0449】

「一つの例」、「別の例」、「一例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくてもよいことを意味している。加えて、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせられ得ることを理解すべきである。

【0450】

いくつかの例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解されたい。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えられるものである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図15I】

【図15J】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27】

【図28】

【配列表】

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【国際調査報告】