知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ユニフェルシテイト マーストリヒトの特許一覧 ▶ アカデミシュ ジーケンハウス マーストリヒトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイス
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20241226BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241226BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20241226BHJP
A61K 9/00 20060101ALI20241226BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20241226BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20241226BHJP
A61F 2/02 20060101ALI20241226BHJP
C12N 11/02 20060101ALN20241226BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20241226BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 Z
A61P3/10
A61K35/12
A61K9/00
A61K47/32
A61K47/34
A61F2/02
C12N11/02
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538332
(86)(22)【出願日】2022-12-21
(85)【翻訳文提出日】2024-08-13
(86)【国際出願番号】 EP2022087335
(87)【国際公開番号】W WO2023118360
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21217479.1
(32)【優先日】2021-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515288959
【氏名又は名称】ユニフェルシテイト マーストリヒト
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ
【住所又は居所原語表記】Ｍｉｎｄｅｒｂｒｏｅｄｅｒｓｂｅｒｇ ４－６ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
(71)【出願人】
【識別番号】517079054
【氏名又は名称】アカデミシュ ジーケンハウス マーストリヒト
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＳＣＨ ＺＩＥＫＥＮＨＵＩＳ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100105924
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 賢樹
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン アペルドールン、アールト アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】デ ボン、デニス フランソワーズ アントワネット
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
4B065
4C076
4C087
4C097
【Ｆターム（参考）】
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC01
4B029GB04
4B029GB09
4B029GB10
4B033NA16
4B033NC06
4B033ND12
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BD06
4B065BD50
4B065CA44
4C076AA51
4C076AA99
4C076BB32
4C076CC21
4C076EE05A
4C076EE16A
4C076EE23A
4C076EE24A
4C076GG01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087MA67
4C087NA05
4C087NA10
4C087ZC35
4C097AA30
(57)【要約】
【解決手段】本発明は、上部多孔性メンブレンと下部多孔性メンブレンの間にある封鎖された空間とメッシュとを備えた、対象に細胞を植え込むための免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスに関する。メッシュは細胞のクラスター形成を防ぐために使用される。さらに本発明は、閉鎖型の植込み可能な細胞送達デバイスを構築する方法に関する。本発明は処置の方法において使用するための前記デバイスにも関係する。
【選択図】図１０
【選択図】図１０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象に細胞または細胞凝集体を植え込むための免疫防護型の植込み可能なデバイスであって、前記デバイスは下部メンブレンおよび上部メンブレンを備え、前記下部メンブレンおよび前記上部メンブレンは支持構造物に接合されることで、前記下部メンブレン、上部メンブレンおよび前記支持構造物が、植え込まれたときに免疫系によるアクセスが可能でない封鎖された内部空間を形成するようになっており、前記下部メンブレンおよび前記上部メンブレンは、メンブレンを貫通して前記内部空間への栄養素および酸素の拡散を可能にする複数の細孔を備え、
前記デバイスは、前記細胞が凝集塊を形成しないように、前記細胞または細胞凝集体が前記デバイスの内部空間に含まれているときに細胞または細胞凝集体のための支持体となるような、前記デバイス内の前記内部空間に配置されたメッシュの存在を特徴とし、前記メッシュは６０～３００μｍの細孔寸法を有する、
植込み可能なデバイス。
【請求項2】
前記下部メンブレンおよび／または前記上部メンブレン、そして任意で支持構造物が、非水溶性ポリマー製、好ましくはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）／ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＥＯＴ／ＰＢＴ）製、または水溶性コポリマーと混合されたＰＶＤＦ製であり、好ましくは、前記メンブレンは細孔形成試薬をさらに含み、より好ましくは、前記細孔形成試薬はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である、請求項１に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項3】
前記下部メンブレンおよび前記上部メンブレンの孔径が、１０～５００ｎｍ、好ましくは５０～４５０ｎｍ、より好ましくは１００～４００ｎｍである、請求項１または２に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項4】
前記下部メンブレンおよび前記上部メンブレンが、１０～２００ｎｍ、好ましくは３５～２００ｎｍ、より好ましくは４０～１６０ｎｍの厚さを有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項5】
前記メッシュが非分解性ポリマーから構築され、好ましくは、前記非分解性ポリマーは、ナイロン、ＰＶＤＦ、ＰＴＦＥ、ＰＰ、ＰＥまたはＰＥＴから選択される、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項6】
前記メッシュが６０～２００μｍ、好ましくは７０～１５０μｍ、より好ましくは７５～１２０μｍの細孔寸法を有する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項7】
前記デバイスは内部空間に細胞を含み、好ましくは、前記細胞は細胞凝集体および／またはオルガノイドであり、好ましくは、前記細胞凝集体は内分泌細胞もしくはサイトカイン産生細胞またはその凝集体であり、好ましくは、前記細胞凝集体は、島細胞、ヒト間葉系幹細胞、腎臓細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、精巣細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、肝臓細胞、サイトカイン産生細胞から選択され、または好ましくは、前記オルガノイドは、腎臓オルガノイド、腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、神経オルガノイド、肝オルガノイド、甲状腺オルガノイド、胃オルガノイド、卵巣オルガノイド、前立腺オルガノイド、脾臓オルガノイド、食道オルガノイド、乳房オルガノイド、膀胱オルガノイド、肺オルガノイド、眼オルガノイド、内耳オルガノイド、心オルガノイド、胆嚢オルガノイド、唾液腺オルガノイド、下垂体オルガノイド、リンパ組織オルガノイド、膀胱オルガノイド、舌オルガノイド、大脳／脳オルガノイド、脊髄オルガノイド、ファロピウス管オルガノイド、涙腺オルガノイド、皮膚オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、上皮オルガノイド、ガストルロイド（胚オルガノイド）、ブラストイド（胚盤胞様オルガノイド）、網膜オルガノイドおよび海馬オルガノイドから選択される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項8】
互いに積み重ねられ、積み重ねられた個々の植込み可能なデバイス間に、開放的な空間が作り出されるようにスペーサーで分離された、２つ以上の植込み可能なデバイスを備えた、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項9】
前記植込み可能なデバイスが細胞を含む、医薬として使用するための、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項10】
前記植込み可能なデバイスが膵島細胞またはインスリンを分泌するように工学的に操作された細胞を含む、糖尿病の処置において使用するための、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項11】
前記糖尿病が１型糖尿病である、請求項１０に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項12】
前記使用が、それを必要とする対象に前記デバイスを植え込むことを含み、好ましくは、前記植込みは肝臓外部位に行われる、請求項１０または１１に記載の植込み可能なデバイス。
【請求項13】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイスを構築するための方法であって、下部メンブレンを用意すること、
支持構造物を大まかに前記下部メンブレンの縁部に沿って中央空間が残るように配置すること、
前記下部メンブレンの上で前記中央空間中にメッシュを配置すること、
前記支持構造物の上に、上部メンブレンを、前記メッシュを備える前記中央空間を覆うことでそれを完全に封鎖して内部空間を作り出すように、配置すること、ならびに
前記上部および下部メンブレンを前記支持構造物に、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、接着剤によって、またはより好ましくは超音波溶着によって、固定することを含む、
方法。
【請求項14】
前記上部および下部メンブレンが、デバイスに細胞を装填するための単一の開口部を残すように、支持構造物に固定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
植込み可能なデバイスに細胞を装填するための方法であって、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のデバイス、または請求項１３もしくは１４に記載の方法によって得られたもしくは得ることができるデバイスを用意すること、
細胞懸濁液を容器中に用意すること、
チューブを、一端が前記細胞懸濁液を含む前記容器の内部と開放的に接触するように、かつ他端が前記植込み可能なデバイスの前記内部空間中に開口部を通して挿入されるように、接続すること、および
前記容器中の前記細胞が前記チューブを通って前記植込み可能なデバイスの前記内部空間中に流れ出ることを可能にすること、および任意で、
前記植込み可能なデバイスにおける開口部を、前記チューブを除去した後で、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、接着剤によって、またはより好ましくはヒートシールによって、閉じることを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植込み可能な細胞送達デバイス、特に、植え込まれた細胞を宿主免疫細胞から隔離することを可能にする免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスの技術分野に関する。本発明は、特に、細胞を包埋するためのメッシュを備えた免疫防護デバイスに関する。そのようなデバイスは、膵島細胞などの細胞を対象に植え込むために使用されうる。本発明はさらに、デバイスを構築するための方法、およびデバイスに細胞を装填する方法に関する。さらに本発明は、デバイスを対象に植え込むことによる、ある疾患または障害の処置における、細胞を内包する閉鎖型の植込み可能な細胞送達デバイスの使用に関する。
【技術背景】
【0002】
患者へのドナー細胞の移植はさまざまな疾患を処置するための有望なツールになる。例えば糖尿病患者には膵島細胞を移植しうる。
【0003】
１型糖尿病（Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｔ１Ｄ）は、ランゲルハンス島中のインスリン産生β細胞が免疫系によって破壊される自己免疫疾患である。全世界で２０００万～４０００万人がＴ１Ｄを有すると見積もられている。インスリン投与は低血糖または高血糖を防ぐために厳格に管理される必要がある。というのも、低血糖や高血糖は、処置せずに放置すると生命にかかわりかねない組織および器官の損傷をもたらす場合があるからである。大半のＴ１Ｄ患者には毎日の外因性インスリンが処方されるが、血中グルコースレベルの厳格な管理の達成は、不十分な用量調整および患者のコンプライアンス不良ゆえに、依然として困難なままである。インスリンを使わずに正常血糖血中グルコースレベルを得るための方法の１つは、臨床島移植（clinical islet transplantation：ＣＩＴ）によるものである。ＣＩＴは、合併症がほとんどない低侵襲性治療であり、患者がおよそ５年間はインスリン非依存になることができるという利益がある。島はドナーの膵臓から単離され、レシピエントの肝門脈中に移植される。しかし、ドナーが不足していることと、あらゆる同種免疫または自己免疫の再発を防ぐために長寿命（long-life）の免疫抑制薬が必要であることとにより、ＣＩＴは管理不良の糖尿病患者にしか利用できない。ＣＩＴの効率には限界がある。移植された島の５０～７０％が、移植後早期に、即時型血液媒介性炎症反応（instant blood-mediated inflammatory reaction：ＩＢＭＩＲ）によって失われるからである。ＩＢＭＩＲは、島が血液に直接さらされることによって惹起され、血小板の迅速な活性化と島への結合をもたらす。次に島は凝血塊に封入されることになり、それが最終的には移植された細胞の喪失につながる。閉じた（免疫防護）デバイスなどの肝臓外島送達デバイスを使用すれば、細胞送達を改良することができる。免疫系はデバイスの内側の細胞にはアクセスできないので、ＩＢＭＩＲが回避され、レシピエントは免疫抑制薬を必要としなくなるからである。
【0004】
既存の閉鎖（免疫防護）型デバイスの短所は、細胞または細胞クラスターがデバイスの内側で凝集しがちなことである。例えば米国特許出願公開第２０２１／０２２８４６号明細書は、細胞を植え込むための閉じたデバイスを記載しているが、細胞が凝集塊を形成するのを防ぐための手段は記載されていない。細胞の凝集は、栄養素と酸素の枯渇により、細胞塊の中心にある細胞の壊死を引き起こしがちである。凝集を防ぐための方法は、免疫防護デバイスの内側で細胞（または細胞クラスター）をヒドロゲルに包埋することである。しかし、ヒドロゲルに包埋することの短所は、それが、クラスター形成とその結果起こる壊死を防ぎはするものの、栄養素、ガスおよびタンパク質の拡散を、依然として邪魔することである。これは、そのような免疫防護型デバイスの拡散能を低下させすぎて、意図した治療（例えば１型糖尿病における島様細胞移植）にとって十分な細胞を内包することができないデバイスをもたらす。さらにヒドロゲルは、分泌因子（例えば島細胞の場合であればインスリン）が植込みデバイスの外に拡散するのを妨害する。とりわけこれらの理由により、改良された免疫防護型デバイスが必要とされている。
【0005】
さらにまた、国際公開第２０１８／１１４０９８号は開放型デバイスを開示しており、ここでは、細胞が移動または凝集するのを防ぐためにメッシュが使用されうる。米国特許第６００８０４９号明細書は細胞培養デバイスを開示しており、そこではメッシュが使用されている。米国特許出願公開第２０２０／３６０５６６号明細書は、低酸素部位に植え込むための閉鎖型デバイスを記載しているが、これには、凝集塊の形成を防ぐためにビーズが使用されており、細胞はそのビーズに付着する。これらの文書は、例えばメッシュを使用することなどによって、細胞が凝集するのを防ぐための方法を記載しているが、これらの文書はいずれも、酸素および栄養素の拡散を可能にし、なおかつデバイスにおける細胞の均一な播種が可能になるような、閉じたデバイスにそれらを実装するための適切な方法を記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０２１／０２２８４６号明細書
【特許文献2】国際公開第２０１８／１１４０９８号
【特許文献3】米国特許第６００８０４９号明細書
【特許文献4】米国特許出願公開第２０２０／３６０５６６号明細書
【0007】
本発明は、本願特許請求の範囲に記載する免疫防護型デバイスおよび方法によって、とりわけ上記の課題に対処する。
【発明の概要】
【0008】
第１の態様において、本発明は、対象に細胞または細胞凝集体を植え込むための免疫防護型の植込み可能なデバイスであって、デバイスは下部メンブレンおよび上部メンブレンを備え、下部メンブレンおよび上部メンブレンは支持構造物に接合されることで、下部メンブレン、上部メンブレンおよび支持構造物が、植え込まれたときに免疫系によるアクセスが可能でない封鎖された内部空間を形成するようになっており、下部メンブレンおよび上部メンブレンは、メンブレンを貫通して内部空間への栄養素および酸素の拡散を可能にする複数の細孔を備え、デバイスは、細胞が凝集塊を形成しないように、細胞または細胞凝集体がデバイスの内部空間に挿入されたときに細胞または細胞凝集体のための支持体となるような、デバイス内の内部空間に配置されたメッシュをさらに備え、メッシュは６０～３００μｍの細孔寸法を有する、植込み可能なデバイスに関する。
【0009】
第２の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明の第１の態様のいずれか１つによる植込み可能なデバイスであって、細胞または細胞凝集体を含む植込み可能なデバイスに関する。
【0010】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の植込み可能なデバイスを構築する方法であって、下部メンブレンを用意すること、支持構造物を大まかに下部メンブレンの縁部に沿って中央空間が残るように配置すること、下部メンブレンの上で中央空間中にメッシュを配置すること、支持構造物の上に、上部メンブレンを、メッシュを備える中央空間を覆うことでそれを完全に封鎖して内部空間を作り出すように、配置すること、ならびに上部および下部メンブレンを支持構造物に、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、接着剤によって、より好ましくは超音波溶着によって、固定することを含む方法に関する。
【0011】
第４の態様において、本発明は、植込み可能なデバイスに細胞または細胞凝集体を装填するための方法であって、本発明の第１の態様によるデバイス、または本発明の第２の方法によって得られたもしくは得ることができるデバイスを用意すること、細胞または細胞凝集体の懸濁液を容器中に用意すること、チューブを、一端が細胞または細胞凝集体の懸濁液を含む容器の内部と開放的に接触する（in opne contace with）ように、かつ他端が植込み可能なデバイスの内部空間中に開口部を通して挿入されるように、接続すること、および容器中の細胞または細胞凝集体がチューブを通って植込み可能なデバイスの内部空間中に流れ出ることを可能にすること、および任意で、植込み可能なデバイスにおける開口部を、チューブを除去した後で、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、接着剤によって、より好ましくはヒートシールによって、閉じることを含む方法に関する。
【0012】
定義
本発明に関して、次の用語を以下に定義する。
本明細書において使用される単数形の用語「Ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、別段の明確な指示がある場合を除き、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば「ａ ｃｅｌｌ」（細胞）への言及には、２つ以上の細胞の組合せなどが含まれる。本明細書において使用される場合、「細胞」（ｃｅｌｌまたはｃｅｌｌｓ）という用語には、特に、「細胞凝集体」（a cell aggregateまたはcell aggregates）も含まれる。
本発明に関して、次の用語を以下に定義する。
本明細書において使用される単数形の用語「Ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、別段の明確な指示がある場合を除き、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば「ａ ｃｅｌｌ」（細胞）への言及には、２つ以上の細胞の組合せなどが含まれる。本明細書において使用される場合、「細胞」（ｃｅｌｌまたはｃｅｌｌｓ）という用語には、特に、「細胞凝集体」（a cell aggregateまたはcell aggregates）も含まれる。
【0013】
本明細書において使用される「および／または」という用語は、言明された事例のうちの１つ以上が、単独で、または言明された事例のうちの少なくとも１つとの組合せとして、最大で言明されたすべての事例との組合せとして、起こりうる状況を指す。
【0014】
本明細書において使用される「少なくとも」ある特定値という用語（the term "at least" a particular value）は、その特定値以上を意味する。例えば「少なくとも２」は、「２以上」、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、…などと同じであると理解される。本明細書において使用される「多くて」ある特定値という用語（the term "at most" a particular value）は、その特定値以下を意味する。例えば「多くて５」は、「５以下」、すなわち５、４、３、…、－１０、－１１などと同じであると理解される。
【0015】
本明細書において使用される「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」（を含む、を備える）という単語またはその変化形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、言明した要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、他のいかなる要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群も排除しないと理解されるだろう。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（を含む、を備える）という動詞には、「essentially consisting of」（から本質的になる）および「consisting of」（からなる）という動詞が包含される。
【0016】
本明細書において使用される「従来技法」という用語は、本発明の方法において使用される従来技法を実行する方法が当業者には明白であるだろう状況を指す。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組織工学、再生医学、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシングおよび関連分野における従来技法の実際は、当業者には周知であり、例えば次の参考文献において論じられている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Molecular Cloning.A Laboratory Manual」，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら，「Current Protocols in Molecular Biology」，John Wiley&Sons，ニューヨーク，１９８７および定期改訂版、ならびに「Methods in Enzymology」シリーズ，Academic Press，サンディエゴ、Ｍｏｚａｆａｒｉら，「Handbook of Tissue Engineering Scaffolds」第２巻，２０１９ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｔａｌａら，「Principles of Regenerative Medicine」第３版，２０１９。
【0017】
本明細書において使用される「インビトロ」という用語は、それぞれの自然条件からは隔離された生物の構成要素を使って行われる実験または測定を指す。
【0018】
本明細書において使用される「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」という用語は同じ意味で使用され、診断、予後または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、農用動物、および動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛、クマなどが含まれる。本明細書において定義される対象は、生きている場合も、死んでいる場合もありうる。試料は対象から死後に、すなわち死亡してから、採取することができ、および／または試料は生きている対象から採取することができる。
【0019】
本明細書において使用される「処置」、「処置する」、「緩和する」、「軽減する」または「寛解させる」という用語は、同じ意味で使用され、限定するわけではないが治療的利益などといった、有益な結果または望ましい結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、処置される基礎疾患の根絶もしくは寛解、またはその進行の低減（もしくは遅延）を意味する。また、治療的利益は、患者が依然として基礎疾患に冒されている場合があるにもかかわらず、改善または減退の減速もしくは低減が患者において観察されるような形での、基礎疾患に関連する生理学的症状のうちの１つ以上の根絶もしくは寛解またはその進行の低減（もしくは遅延）によって達成される。
【0020】
本明細書において使用される「植込み可能な細胞送達デバイス」という用語は、「植込みデバイス」、「細胞送達デバイス」、「植込み可能なデバイス」、「マクロ封入インプラント」、「細胞担体」または単に「デバイス」と同じ意味で使用され、細胞を保持するのに適した囲いであって、対象に植え込むことが意図されているものを指す。したがって本デバイスは、対象に細胞を植え込むための媒体として役立つ。それゆえに、本デバイスは対象への植込みに適した材料でできていて、本デバイスは生きている細胞を内包するのに適するように構築されると、想定されうる。
【0021】
本明細書において使用される「閉じた（閉鎖）」という用語は、植込み可能な細胞送達デバイスに関する場合には、内側に細胞を封止した後は、免疫細胞または宿主の血管新生がデバイスに侵入することを可能にするほど大きな開口部を、デバイスが有しないことを含意する。したがって、閉じた（閉鎖）という用語は、必須分子、例えば栄養素、ガス、低分子タンパク質またはペプチド、代謝産物、サイトカイン、ホルモン、および他の生体分子の物質輸送を可能にするために存在する細孔または開口部の存在を、必ずしも排除するものではない。本明細書において使用される場合、細孔という用語は、栄養素、ガス、低分子タンパク質またはペプチド、代謝産物、サイトカイン、ホルモンおよび他の生体分子の拡散（または物質輸送）を可能にする直径を持つが、その直径は、小さすぎて、デバイスの内側での血管新生を許さず、デバイスへの免疫細胞の進入を許すこともない、開口部を指す。
【0022】
本明細書にいう「孔径」、「細孔寸法」または「メッシュサイズ」とは、メッシュに関する場合には、メッシュの開口部のサイズを指し、開口部が実質上円形の場合は開口部の平均直径であり、また開口部が実質上正方形または長方形の場合は辺の平均サイズであると解釈されるべきである。
【0023】
発明の詳細な説明
本明細書において使用されるセクション見出しには構成上の目的しかなく、記載されている主題を限定すると解釈してはならない。
本明細書において使用されるセクション見出しには構成上の目的しかなく、記載されている主題を限定すると解釈してはならない。
【0024】
本発明の一部には、著作権保護の対象となる資料（限定するわけではないが、例えば図表、デバイス写真、または本開示の他の任意の態様であって、任意の管轄区域において、それに対する著作権保護が利用可能であるか、または利用可能でありうるもの）が含まれる。著作権者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に表示される形で、何びとかによって特許文書または特許発明が複製されることに対して異議を唱えないが、それ以外にはすべての著作権を留保する。
【0025】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通し、本発明の方法、組成物、使用および他の態様に関して、さまざまな用語が使用される。そのような用語には、別段の表示がある場合を除き、本発明が関係する技術分野における、それぞれの通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書において提供される定義と合致するように解釈されるものとする。本明細書には好ましい材料および方法を記載するが、本明細書に記載するものと類似するまたは等価な方法および材料はいずれも、本発明の試験のための実施において使用することができる。
【0026】
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、当技術分野における通常の技能を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。
【0027】
本発明は、例えば疾患を処置する手段などとして対象に細胞を植え込むことを意図した、免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイス、または閉じたデバイスに関する。植込み治療において使用することができるであろう典型的細胞は、糖尿病の処置における島細胞であるが、植込みによる治療方法において使用することができるであろう細胞は他にも当業者に知られている。
【0028】
島細胞などの細胞を移植に先立って封入することにより、現在の臨床細胞移植治療（例えば臨床島移植）が直面する難題を克服できる可能性がある。ただし、本デバイスは、例えば誘導多能性幹細胞または分化転換誘導細胞供給源などに基づく新規治療を含めて、細胞または細胞凝集体の移植の恩恵を受けるあらゆるタイプの処置に使用することができると理解される。ここに本発明者らは、多孔性メンブレン製の免疫防護島封入デバイスであって、細胞を免疫細胞から保護すると共に、栄養素の拡散を可能にすることによって細胞を生存可能で機能的な状態に保つデバイスの開発を記載する。現在の細胞封入デバイスの開発には大きく３つの難題がある。第１に、生体適合性材料を選択して異物応答を回避するかまたは異物応答を低減させることにより、本発明者らは潜在的生体材料をスクリーニングし、それらの結果に基づいて、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を典型的な候補生体適合性材料として選択した。第２に、封入された細胞への栄養素、ガス、低分子タンパク質またはペプチド、代謝産物、サイトカイン、ホルモンおよび他の生体分子の輸送を可能にすることにより、薄い多孔性メンブレンの作製により、最終的に、封入された細胞を、免疫細胞の通過を許さない細孔を持つ免疫防護メンブレンを使用することによって、免疫系から保護する（Second, by enabling the transport of nutrients, gases, small proteins or peptides, metabolites, cytokines, hormones and other biomolecules to the encapsulated cells, by the production of thin and porous membranes and finally protect the encapsulated cells against the immune system by using immunoprotective membranes with pores that do not allow passage of immune cells.）。
【0029】
第３に、よく見られる課題は、植込みデバイスに封鎖された細胞は凝集して大きな凝集体を形成しがちであり、その内部では、酸素および栄養素の欠如により、壊死（ネクローシス）が起こるということである。この課題は、例えば細胞または細胞クラスターを包埋するためにデバイスの内腔にヒドロゲルを使用することなどによって対処されてきた。この解決策は細胞が大きな凝集体へと凝集するのをある程度は防ぐが、ヒドロゲルの存在は、依然として酸素および栄養素の拡散を阻むと共に、細胞が産生する因子類（例えばインスリン）がデバイスの外に効率よく拡散するのも妨げることがわかった。
【0030】
本明細書において使用される場合、メンブレンおよびフィルムまたは薄膜という用語は、同じ意味で使用され、平坦なシート様の材料を指す。
【0031】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象に細胞または細胞凝集体を植え込むための免疫防護型の植込み可能なデバイスであって、デバイスは下部メンブレンおよび上部メンブレンを備え、下部メンブレンおよび上部メンブレンは支持構造物に接合されることで、下部メンブレン、上部メンブレンおよび支持構造物が、植え込まれたときに免疫系によるアクセスが可能でない封鎖された内部空間を形成するようになっており、下部メンブレンおよび上部メンブレンは、メンブレンを貫通して内部空間への栄養素および酸素の拡散を可能にする複数の細孔を備え、デバイスは、細胞が凝集塊を形成しないように、細胞がデバイスの内部空間に含まれているときに細胞のための支持体となるような、デバイス内の内部空間に配置されたメッシュをさらに備え、メッシュは６０～３００μｍの細孔寸法を有する、植込み可能なデバイスに関する。このように、メッシュの組入れは、大きな細胞塊の形成を防ぐか、または低減し、その結果、細胞または細胞凝集体は、より長く生き残り、より良く機能することになる。本明細書において使用される場合、凝集塊または凝集塊を形成するという用語は、大きな細胞凝集体（またはその形成）であって、細胞凝集体がその大きなサイズゆえに負の効果、例えば限定するわけではないが、壊死、成長障害または機能障害を起こすものを指す。
【0032】
メッシュを使用することで、細胞凝集塊形成という課題に効果的に対処できることがわかった。開放型細胞送達デバイスではメッシュが記載されているが（例えば米国特許出願公開第２０１７／１８２１３９号明細書）、本発明者らの知る限り、閉じた（免疫防護）デバイスにおける同様の解決策はない。そのようなデバイスに細胞または細胞凝集体を適正に収容することは極めて難しいというのが、その理由である。そのようなデバイスは、好ましくは細胞なしで、組立てと提供が行われ、使用時には、デバイスを対象に植え込む直前に、細胞が播種される。しかし、閉じたデバイスに狭い開口部を通して細胞を播種して、デバイス内のメッシュ全体への細胞（または細胞クラスター）の均一な分布を可能にすることは難易度が高く、一般に細胞は最終的にはデバイス内で大きな凝集塊になるだろう。
【0033】
理論的には、デバイスは、植込みに先立って最終組立てを受けることができる。つまり、細胞がメッシュ上に播種され、次にそのメッシュがデバイスの外層（メンブレン）の間に封鎖されて、メッシュ上の細胞の均一な分布を可能にする。しかし実際には、この解決策はうまくいかない。構成要素を１つに組み立てて固定することは細胞にとってはあまりに破壊的であり、細胞が死ぬかまたはデバイス内でずれる原因になる。本発明者らは、後述するように、デバイス中に細胞を播種する新しい方法を、ここに開発した。これにより、既に組み立てられたデバイス中に細胞（または細胞凝集体）を均一に播種することが可能になり、よってメッシュを持つ閉じたデバイスのための実用的な解決策が可能になる。
【0034】
どの移植部位または植込みでも懸念されるとおり、適正な栄養素の拡散は、移植された移植片の最適な生存および機能を保証するために不可欠である。例えば膵島は高い代謝活性を示し、それゆえに、生存するには酸素および栄養素の迅速なアクセスを必要とする。それゆえに、インプラントの内側の細胞への、および同細胞からの、拡散経路長を低減し、物質輸送時間を最小限に抑えるために、送達デバイスが可能な限り薄く、多孔性であることは、極めて重要である。それゆえに本発明は、とりわけ、細胞送達を実現するための免疫防護細胞送達デバイスを製作し、臨床的に妥当なデバイス寸法を有するインプラント設計を可能にするための方法を提供する。
【0035】
本発明の植込み可能な細胞送達デバイスは、対象に細胞を植え込むことを意図している。本特許に示す実施例は、本送達デバイスが、ベータ細胞と島だけに限定されるのではなく、例えばヒト間葉系幹細胞、アルファ細胞、または他の任意の関連する細胞タイプなど、細胞送達全般に使用されうることを例証している。実施例によれば、本植込み可能な細胞送達デバイスには、他の細胞タイプ、細胞タイプの混合物、オルガノイドまたは組織もしくは器官（のパーツ）を組み入れることができると理解される。本デバイスは対象への植込みを意図しているので、例えば使用材料が生体適合性でなければならないことや、デバイスの寸法などに、一定の制限がある。寸法はそのデバイスを植え込もうとしている対象に依存しうると理解される。本明細書において使用される場合、対象という用語は、齧歯動物もしくは哺乳動物などの動物、またはヒトを指しうる。したがって植込み可能な細胞送達デバイスに関するサイズ制限は、例えばマウスの場合はヒトと比べて異なるが、同じ種内であっても、例えば身体サイズなどの相違が、植込み可能な細胞送達デバイスのサイズを左右しうる。デバイスのサイズはさらに、植込み可能な細胞送達デバイスに組み入れようとする細胞タイプ、および細胞を植え込むことの機能または目的にも左右される。当業者は、インプラントのおおよその望ましいサイズを、とりわけ対象および植え込まれる細胞タイプに基づいて、見積もることができる。
【0036】
本発明の植込み可能な細胞送達デバイスは、下部メンブレンおよび上部メンブレンを備え、下部メンブレンおよび上部メンブレンは支持構造物に接合されることで、下部メンブレン、上部メンブレンおよび支持構造物が、植え込まれたときに免疫系によるアクセスが可能でない封鎖された内部空間を形成するようになっており、下部メンブレンおよび上部メンブレンは、メンブレンを貫通して内部空間への栄養素および酸素の拡散を可能にする複数の細孔を備えている。本デバイスは、デバイスの内部空間に配置されたメッシュを、さらに備えている。メッシュは、支持体およびスペーサー構造物として意図されている。メッシュを使用すれば、細胞培養でも、デバイス内に使用した場合にも、細胞または細胞クラスターの凝集が効果的に防止されることを、本発明者らは見いだした（例えば図１２参照）。細胞または細胞クラスターの凝集は望ましくなく、現在知られている細胞植込みデバイスに伴う課題である。細胞または細胞クラスターの凝集は、大きすぎる細胞凝集体をもたらし、そこでは、内部の細胞が栄養素および酸素を奪われ、結果として、とりわけ壊死、ならびに機能、力価（potency）および効力の喪失を起こす。それゆえに、細胞または細胞クラスターを互いに離れた状態に保つために、追加の手段が必要になる。本特許では、細胞送達デバイスの内側で細胞が凝集するのを、メッシュを使用することによって防ぐ方法が記載される。これにより、好都合なことに、細胞および細胞凝集体を互いに離れた状態に保ちつつ、栄養素の容易な拡散が可能になる。上部メンブレンと下部メンブレンはどちらも、細胞への栄養素と酸素の拡散、また任意で細胞からデバイス外への分泌因子の拡散を可能にする、多数の細孔を有する。分泌因子の非限定的な例はインスリンである。
【0037】
本明細書にいうメンブレンとは薄く平坦な材料を指す。本明細書にいうメンブレンの表面領域は上面および下面を指し、ここで上面および下面とは両者間の厚さが最も小さくて互いに相対する面である。本明細書にいう細孔とは、メンブレンを完全に貫通して、メンブレンの一方の面から他方の面への、好ましくは上面から下面への、分子などの通過を可能にする、メンブレン中の開口部または空洞を指す。
【0038】
本発明の植込み可能な細胞送達デバイスは、実質的に下部メンブレンの表面領域および上部メンブレンの表面領域の周囲に配置された支持構造物をさらに含み、その支持構造物は上部メンブレンおよび下部メンブレンの表面領域の平面内に配置されるようになっている。支持構造物は例えば楕円形または円形でありうるが、支持構造物はあらゆる種類の形状を有しうると理解される。理想的には、支持構造物の形状は上部および下部メンブレンの輪郭に沿う。例えば下部および上部メンブレンが楕円形の形状を有する場合、支持構造物は好ましくは下部および上部メンブレンの縁部に沿う楕円形のリングである。支持構造物は切れ目または空隙を有してもよいと理解され、例えば支持構造物はＵ字形であってもよい。
【0039】
本デバイスは追加の支持構造物を含みうると理解される。例えば本発明の免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスは、１つ以上の追加支持構造物を含んでもよく、その場合、好ましくは、１つ以上の追加支持構造物は、下部および上部メンブレンに関して、より中央に配置される。
【0040】
支持構造物の機能は、デバイスに多少の剛性を与えることである。植込み可能な細胞送達デバイスにはある程度の柔軟性が望ましいが、構造的完全性は保証されなければならない。下部および上部メンブレンは栄養素と酸素の拡散を許容する必要があるため、メンブレンの厚さには制限があり、それは一般に極めて薄く、したがって脆弱である。支持構造物は、メンブレンの引裂きまたは破裂を避けるのに役立つ。さらに、支持構造物を組み入れることにより、デバイスの折り畳みまたは屈曲が防止される。これらは、防止しなければ内部空間の増加につながり、結果として、デバイスのレシピエントにとって望ましくない拡散経路の増加および細胞機能の低減が起こる。したがって支持構造物は、一般に、下部および上部メンブレンの厚さを上回る厚さを有する。例えば、上部および下部メンブレンの厚さが、それぞれ個別に１０～２５０μｍ厚、好ましくは３５～２００μｍ、より好ましくは４０～１６０μｍでありうるのに対し、支持構造物は７５～５００μｍ厚前後、好ましくは１００～４００μｍ以上、例えば２００μｍ厚前後などでありうる。
【0041】
支持構造物はさらに、下部および上部メンブレンを取り付けるための足場を提供する。メンブレンは、支持構造物がメンブレンの縁部間に挟まれるような形で、支持構造物に取り付けてもよいし、あるいはメンブレンは、支持構造物の１つの面に、例えば上面または下面に、一緒に取り付けてもよい。メンブレンは、例えば超音波溶着、ヒートシール圧力シールまたは接着剤によって取り付けることができるが、超音波溶着が好ましい。
【0042】
本発明の植込み可能な細胞送達デバイスは、植え込まれたときに内部空間を実質的に、好ましくは完全に、封止するように、支持構造物に１か所または複数個所で取り付けられた、下部メンブレンおよび上部メンブレンを、さらに有する。したがって、デバイスは、植え込む準備が整ったときには、細孔を通した栄養素および酸素などの分子の拡散しか許さず、したがって栄養素の拡散はメンブレンの孔径を制御することによって制御することができる。ただし、細胞をデバイス中に装填する必要があるので、デバイスは、後述するように細胞をデバイスに挿入することが可能になるように、上部および／または下部メンブレンと支持構造物との間に開口部を残すように構築される。細胞をデバイスに挿入し終えたら、栄養素の拡散は細孔を通してのみ起こることができ、したがって、栄養素の拡散を許す、免疫細胞にとっての障壁が作り出されるように、その開口部は封止されることになる。したがって、本明細書にいう細孔とは、そのサイズゆえにデバイス中への免疫細胞の通過を許さないデバイス中の開口部であると解釈されるべきである。
【0043】
本デバイスはＰＶＤＦから好ましく構築されることがわかった。ＰＶＤＦは、機械的強度を維持しつつも、他の適切な材料と比べて改良された多孔性を有するからである。さらなる利点は、ＰＶＤＦが生体適合性であるため、免疫応答が大幅に低減することである。つまり、生体適合性でないために大幅に強い免疫応答を呈するデバイスと比べて免疫応答が著しく低減するため、デバイス中の細胞が受ける影響は小さくなる。ＰＶＤＦは、適切な材料と、例えば限定するわけではないがポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）と、組み合わせうると理解される。
【0044】
したがって、ある実施形態において、下部メンブレンおよび／または上部メンブレン、そして任意で支持構造物は、非水溶性ポリマー製、好ましくはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）／ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＥＯＴ／ＰＢＴ）製、または水溶性コポリマーと混合された非水溶性ポリマー製であり、好ましくは、メンブレンは細孔形成試薬をさらに含み、より好ましくは、細孔形成試薬はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【0045】
デバイスを製造するための材料としてＰＶＤＦを使用することのさらなる利点は、それにより、スポット溶着が可能になることである。したがって、ある実施形態において、上部および下部メンブレンはスポット溶着によって支持構造物に取り付けられる。スポット溶着には、免疫反応の引き金を引く可能性があり、生体適合性でない可能性があり、さらには毒性である可能性さえあり、あるいは時間と共に溶解してデバイスの構造的欠損をもたらす可能性がある、グルーなどの追加材料を使用する必要がないという利点がある。
【0046】
イメージングのためのマーカーをデバイス中またはデバイス上に組み入れることも、さらに想定される。これは、外科的処置を必要とすることなく対象におけるデバイスの位置を特定することが可能になるので、有利でありうる。したがって、ある実施形態において、デバイスはイメージング用の１つ以上のマーカーを含み、好ましくは、１つ以上のマーカーは、上部メンブレン、下部メンブレンおよび／または支持構造物のＰＶＤＦ中に注入されるか、または同ＰＶＤＦ上にコーティングされた、放射線不透過剤を含み、より好ましくは、放射線不透過剤は、硫酸バリウムなどのバリウム系、三酸化ビスマス、次炭酸ビスマスもしくはオキシ塩化ビスマスなどのビスマス系であるか、または放射線不透過剤はタングステンもしくは酸化グラフェンである。
【0047】
本明細書にいう放射線不透過剤は、放射線造影剤とも呼ばれ、電磁スペクトルのラジオ波およびｘ線波部分にとって不透明な（つまりその種の電磁放射線は相対的にその特定材料を透過することができない）物質である。放射線造影剤の非限定的な例として、チタン、タングステン、硫酸バリウム、酸化ビスマスおよび酸化ジルコニウムが挙げられる。いくつかの解決策は、界面臨界性の低い、より均一な材料を得るために、ポリマー鎖への重元素、例えばヨウ素の直接的結合を伴う。
【0048】
さらに、薬物または化合物をデバイスに含めることは有利でありうると、想定される。したがって、ある実施形態において本デバイスは、上部および下部メンブレンならびに／または支持構造物などのＰＶＤＦメンブレン中に注入されたまたはＰＶＤＦメンブレン上にコーティングされた、薬物または化合物を含む。例えば本デバイスは、線維性のカプセルが形成されるのを避けるための薬物、または異物応答を調節するための薬物でコーティングされていてもよい。あるいは、デバイスが対象における処置選択肢として植え込まれる場合には、治療薬を同時処置として含めうる。非限定的な例は、がんを処置するための化学治療剤、免疫チェックポイント阻害剤、細胞クラスターおよび／またはオルガノイドの、術後早期の生存を助ける、細胞ストレス阻害薬、または術後のインプラントを追跡するためのイメージングマーカーである。デバイス内での血管伸長を促進するための血管新生因子の組入れも、さらに想定される。
【0049】
上部および下部メンブレン中の細孔は、デバイス中の細胞への栄養素および酸素の拡散を可能にする。理想的には、平均孔径は、構造的完全性を維持し、かつ細胞がデバイスから出るのを防ぎつつも、最大限の拡散を可能にするように選ばれる。ある実施形態では、可溶性ポリマーをフィルムに組み入れることによって細孔が作り出され、これにより、フィルムにおける細孔の作出が可能になる。したがって、ある実施形態において、下部メンブレンおよび上部メンブレンの（平均）孔径は、１０～５００ｎｍ、好ましくは５０～４５０ｎｍ、より好ましくは１００～４００ｎｍである。孔径は、例えばフィルム製造中に使用される非可溶性ポリマーに対する（水）可溶性ポリマーの比を制御することなどによって、変更しうる。当業者に知られる他の方法も使用することができると理解される。さらに、細孔は免疫細胞がデバイス内に入ることを許してはならないので、孔径は免疫細胞によって制限されると理解される。上部メンブレンと下部メンブレンにおける平均孔径は同じであっても異なってもよい。
【0050】
メンブレンの厚さは構造的完全性（structural integrity）と栄養素を拡散させる能力との兼ね合いであると想定され、メンブレンが厚いほど強さは増すが、許される拡散は少なくなり、逆もまた同様である。したがって、ある実施形態では、下部メンブレンおよび上部メンブレンが、１０～２００ｎｍ、好ましくは３５～２００ｎｍ、より好ましくは４０～１６０ｎｍの厚さを有する。これらの値では、強さと拡散能とのバランスが良いことがわかった。
【0051】
メッシュは任意の非分解性ポリマーから構築できることがわかったが、生体適合性ポリマーが好ましい。したがって、ある実施形態において、メッシュは非分解性ポリマーから構築され、好ましくは、非分解性ポリマーは、ナイロン、ＰＶＤＦ、ＰＴＦＥ、ＰＰ、ＰＥまたはＰＥＴから選択される。ある実施形態において、メッシュは、島細胞を収容するために、５０～３００μｍ、好ましくは６０～２００μｍ、より好ましくは７０～１５０μｍ、最も好ましくは７５～１２０μｍの細孔寸法を有するが、異なる細胞タイプまたはオルガノイドについては、異なる細孔寸法を持つメッシュが望ましいと理解される。当業者は、それぞれの細胞タイプまたはオルガノイドに適した細孔寸法を決定することができる。
【0052】
ある実施形態において、デバイスは内部空間に細胞を含み、好ましくは、細胞は細胞凝集体および／またはオルガノイドであり、好ましくは、細胞凝集体は内分泌細胞もしくはサイトカイン産生細胞またはその凝集体であり、好ましくは、細胞凝集体は、島細胞、ヒト間葉系幹細胞、腎臓細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、精巣細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、肝臓細胞、サイトカイン産生細胞から選択され、または好ましくは、オルガノイドは、腎臓オルガノイド、腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、神経オルガノイド、肝オルガノイド、甲状腺オルガノイド、胃オルガノイド、卵巣オルガノイド、前立腺オルガノイド、脾臓オルガノイド、食道オルガノイド、乳房オルガノイド、膀胱オルガノイド、肺オルガノイド、眼オルガノイド、内耳オルガノイド、心オルガノイド、胆嚢オルガノイド、唾液腺オルガノイド、下垂体オルガノイド、リンパ組織オルガノイド、膀胱オルガノイド、舌オルガノイド、大脳／脳オルガノイド、脊髄オルガノイド、ファロピウス管オルガノイド、涙腺オルガノイド、皮膚オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、上皮オルガノイド、ガストルロイド（胚オルガノイド）、ブラストイド（胚盤胞様オルガノイド）、網膜オルガノイドおよび海馬オルガノイドから選択される。細胞凝集体は、切除された組織または器官の一片、例えばドナー生物から得られるものを指す場合もある。
デバイスのサイズは、意図する応用（例えば処置方法またはデバイスに内包される細胞のタイプ）に応じて、また対象に基づいて、拡大・縮小することができると理解される。ヒト対象への植込みを意図したデバイスは、齧歯動物への植込みを意図したデバイスより大きい必要があることは、当業者には明白だろう。デバイスは本質的に二次元であり、つまりくぼみを持つ単一の平面が存在するので、一部の応用については、ヒトなどの大型の哺乳動物ではデバイスを非現実的なサイズまで拡大する必要があると予想される。それゆえに、複数の小さなバージョンのデバイスを互いに積み重ねるか、または対象に別々に植え込むことが、さらに想定される。したがって、ある実施形態において、本発明は、本発明の第１の態様の植込み可能なデバイスであって、互いに積み重ねられ、積み重ねられた個々の植込み可能なデバイス間に、開放的な空間が作り出されるようにスペーサーで分離された、２つ以上の植込み可能なデバイスを備えたデバイスに関する。追加の支持構造物は、本質的には、個々のデバイス間のスペーサーとして機能する。
デバイスのサイズは、意図する応用（例えば処置方法またはデバイスに内包される細胞のタイプ）に応じて、また対象に基づいて、拡大・縮小することができると理解される。ヒト対象への植込みを意図したデバイスは、齧歯動物への植込みを意図したデバイスより大きい必要があることは、当業者には明白だろう。デバイスは本質的に二次元であり、つまりくぼみを持つ単一の平面が存在するので、一部の応用については、ヒトなどの大型の哺乳動物ではデバイスを非現実的なサイズまで拡大する必要があると予想される。それゆえに、複数の小さなバージョンのデバイスを互いに積み重ねるか、または対象に別々に植え込むことが、さらに想定される。したがって、ある実施形態において、本発明は、本発明の第１の態様の植込み可能なデバイスであって、互いに積み重ねられ、積み重ねられた個々の植込み可能なデバイス間に、開放的な空間が作り出されるようにスペーサーで分離された、２つ以上の植込み可能なデバイスを備えたデバイスに関する。追加の支持構造物は、本質的には、個々のデバイス間のスペーサーとして機能する。
【0053】
２つ以上のデバイスは、原則的に、よりコンパクトなデザインが得られるように積み重ねることができる。ただし、細胞への栄養素および酸素の適正な拡散が保証されることが前提である。このことは、３層以上を積み重ねる場合に、中間の層（デバイス）に関して、特に重要になる。それゆえに、積み重ねられた層（デバイス）はスペーサーによって分離されるべきであることを、本発明者らは見いだした。好ましくは、スペーサーは、層間の空間がスペーサーによって完全には封鎖されず、デバイス間での分子の容易な拡散が可能になるように構築される。したがって、いくつかの小さなスペーサーを使用してもよいし、あるいはスペーサーが開口部を有してもよい。スペーサーは追加の支持構造物とみなしうるので、本明細書にいうスペーサーを「追加の支持構造物」という場合もある。好ましくは、スペーサーも、生体適合性を保証するためにＰＶＤＦから構築される。支持構造物とスペーサー（追加の支持構造物）とが１つの連続した構造物であることが、さらに想定される。スペーサーは、超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、または接着剤を使って、より好ましくは超音波溶着によって、支持構造物またはメンブレンに取り付けうる。
【0054】
デバイスは医療方法または処置の方法において使用されうると、想定される。したがって、第２の態様において本発明は、医薬として使用するための本発明の免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスに関する。本発明はさらに、疾患の処置、防止または寛解に使用するための、本発明の第１の態様の免疫防護型の植込み可能なデバイスに関する。本デバイスは、好ましくは細胞、より好ましくは細胞凝集体またはオルガノイドを含む。それゆえに、ある実施形態において本発明は、疾患の処置、防止または寛解に使用するための、本発明の、細胞、好ましくは細胞凝集体および／またはオルガノイドを含む、免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスに関する。あるいは、本発明は、ある疾患または状態を処置し、防止し、または寛解させる必要がある対象において、その疾患または状態を処置し、防止し、または寛解させる方法であって、細胞、好ましくは細胞凝集体またはオルガノイドを含むデバイスを対象に植え込むことを含む方法に関する。
【0055】
いくつかの処置選択肢が本デバイスに関して想定される。例えばデバイスは糖尿病の処置に使用しうる。それゆえに、ある実施形態において、処置は糖尿病の処置、好ましくは１型糖尿病の処置である。好ましくは、処置が糖尿病の処置である場合、デバイスはインスリン分泌細胞、例えば島細胞またはインスリンを分泌するように工学的に操作された細胞を含む。
【0056】
しかし、本デバイスの使用が糖尿病の処置に限定されないことは、当業者には明らかだろう。本デバイスは、あらゆるタイプの細胞、細胞凝集体またはオルガノイドの組込みに対応できるからである。本デバイスは、例えば、ある治療において有益でありうる細胞外因子を排出する細胞を植え込むために使用しうる。細胞外因子の非限定的な例として、インスリン、グルカゴン、サイトカイン、成長因子、ホルモン、炭水化物、および凝固因子などのペプチドおよびタンパク質が挙げられる。
【0057】
したがって本デバイスは、限定するわけではないが、免疫関連障害、例えば多発性骨髄腫、黒色腫、関節リウマチ、炎症性腸疾患、ループス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、ミオパチー、ライム病、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ディジョージ症候群、高免疫グロブリンＥ症候群（ヨブ症候群とも呼ばれる）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、高ＩｇＭ症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ）、ＮＦ－κＢ基本調節因子（ＮＦ－κＢ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｒ：ＮＥＭＯ）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ；ブルトン型無ガンマグロブリン血症とも呼ばれる）、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、毛細血管拡張性運動失調症または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の処置に使用されうる。さらに、本デバイスは、がんなどの成長因子関連疾患の処置にも使用されうる。さらに、本デバイスは、ホルモンまたは内分泌関連障害、例えば腎機能不全、アジソン病、クッシング病、クッシング症候群、巨人症（先端巨大症）、甲状腺機能亢進、グレーブス病、甲状腺機能低下、下垂体機能低下症、多発性内分泌腫瘍症Ｉ型およびＩＩ型（ＭＥＮ ＩおよびＭＥＮ ＩＩ）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）または思春期早発症においても使用されうる。さらに、本デバイスは、凝固障害、例えば第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン遺伝子変異、凝固を防ぐ天然タンパク質（例えばアンチトロンビン、プロテインＣおよびプロテインＳ）の欠損、ホモシステインレベルの上昇、フィブリノゲンまたは機能障害性フィブリノゲンのレベルの上昇（異常フィブリノゲン血症）、第ＶＩＩＩ因子ならびに第ＩＸ因子および第ＸＩ因子を含む他の因子のレベルの上昇、線維素溶解系異常、例えば低プラスミノゲン血症、異常プラスミノゲン血症およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ－１）のレベルの上昇、がん、肥満、妊娠、補充エストロゲンの使用、例えば経口避妊ピル（産児制限ピル）、ホルモン補充治療、長期床上安静または不動、心臓発作、うっ血性心不全、卒中および活動低下につながる他の病気、ヘパリン誘発性血小板減少症、抗リン脂質抗体症候群、深部静脈血栓症または肺塞栓症の既往歴、骨髄増殖性障害、例えば真性赤血球増加症または本態性血小板増加症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、炎症性腸症候群、ＨＩＶ／ＡＩＤＳまたはネフローゼ症候群の処置にも使用されうる。さらに、本デバイスは、再生医学適応症、例えば限定するわけではないが、脊髄傷害、１型糖尿病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、心臓疾患、卒中、熱傷、がんおよび変形性関節症においても使用されうる。
第３の態様において、本発明は、請求項１～８のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイスを構築する方法であって、下部メンブレンを用意すること、支持構造物を大まかに下部メンブレンの縁部に沿って中央空間が残るように配置すること、下部メンブレンの上で中央空間中にメッシュを配置すること、支持構造物の上に、上部メンブレンを、メッシュを備える中央空間を覆うことでそれを完全に封鎖して内部空間を作り出すように、配置すること、ならびに上部および下部メンブレンを支持構造物に、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、接着剤によって、より好ましくは超音波溶着によって、固定することを含む方法に関する。ある実施形態では、上部および下部メンブレンが、デバイスに細胞を装填するための単一の開口部を残すように、支持構造物に固定される。
第３の態様において、本発明は、請求項１～８のいずれか一項に記載の植込み可能なデバイスを構築する方法であって、下部メンブレンを用意すること、支持構造物を大まかに下部メンブレンの縁部に沿って中央空間が残るように配置すること、下部メンブレンの上で中央空間中にメッシュを配置すること、支持構造物の上に、上部メンブレンを、メッシュを備える中央空間を覆うことでそれを完全に封鎖して内部空間を作り出すように、配置すること、ならびに上部および下部メンブレンを支持構造物に、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、接着剤によって、より好ましくは超音波溶着によって、固定することを含む方法に関する。ある実施形態では、上部および下部メンブレンが、デバイスに細胞を装填するための単一の開口部を残すように、支持構造物に固定される。
【0058】
本明細書において使用される「スポット溶着」という用語は、好ましくは、超音波スポット溶着を指す。超音波スポット溶着は、高周波の超音波音響振動が、一緒に保持された被加工物に加圧下で局所的に適用されて固体の溶着部を作り出す、工業プロセスである。これは一般的にはプラスチックに使用される。
【0059】
本発明者らが知る限り、メッシュを備えた免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスは、他にない。その理由は、デバイスに細胞を装填できる方法が簡単ではないなど、そのようなデバイスの構築にはいくつかの障壁があるからだろう。１つの方法は、デバイスの組立てに先立って下部層に細胞を播種することだろうが、そこには実用的でない点がいくつかある。というのも、デバイスは、そのデバイスを使用することになる外科医もしくは研究者に、またはそのデバイスを受容することになる患者もしくは対象に、好ましくは組み立てられた形態で輸送されるからである。その上、細胞の近くにポリマー層を溶着することは、細胞の生存率の激しい喪失につながるだろう。これらの問題を克服するために、本発明者らは、デバイスに播種する方法であって、播種後にデバイスの組立てを必要としない方法、つまりデバイスを完全に組み立ててからデバイスに播種する方法を開発した。したがって、第４の態様において本発明は、植込み可能なデバイスに細胞を装填するための方法であって、本発明の第１の態様によるデバイスまたは本発明の第２の態様の方法によって得られたもしくは得ることができるデバイスを用意すること、細胞懸濁液を容器中に用意すること、チューブを、一端が細胞懸濁液を含む容器の内部と開放的に接触する（in open contact with）ように、かつ他端が植込み可能なデバイスの内部空間中に開口部を通して挿入されるように、接続すること、および容器中の細胞がチューブを通って植込み可能なデバイスの内部空間中に流れ出ることを可能にすること、および任意で、植込み可能なデバイスにおける開口部を、チューブを除去した後で、好ましくは超音波溶着、ヒートシール、圧力シール、または接着剤によって、より好ましくはヒートシールによって、閉じることを含む方法に関する。
【0060】
構築後のデバイスは、播種用インレットを除いて、完全に閉じられる。細胞は、デバイスをほぼ水平に保持することにより、播種用インレットを介して播種されることになる。細胞懸濁液を含むチューブが、デバイスの内部において、上部メンブレンとメッシュの間で、単一の開口部に挿入される。このようにして、細胞、細胞クラスターまたはオルガノイドが、メッシュ構造の内側に捕捉される。
【0061】
したがって、ある実施形態では、細胞は重量によりチューブを通って、免疫防護型の植込み可能な細胞送達デバイスの内部空間に移動する。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】作製されたＰＶＤＦおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンの表面モルフォロジーおよび断面の代表的ＳＥＭ像。２００μｍでキャストした１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦメンブレン（Ａ～Ｃ）および２００μｍでキャストした１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦ＋５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦメンブレン（Ｄ～Ｆ）。（Ａ～Ｆ）ガラス側、倍率５，０００倍および２５，０００倍（Ａ、Ｄ）、空気側、倍率５，０００倍および２５，０００倍（Ｂ、Ｅ）、ならびに断面（Ｃ、Ｆ）の図。Ａ、Ｂ、ＤおよびＥにおいてスケールバーは４μｍを表す。ＣおよびＦにおいてスケールバーは５０μｍを表す。（Ｇ）ＳＥＭ断面から測定された、作製されたメンブレンの厚さ。（Ｈ）空気ばく露部位で測定された、作製されたメンブレンの細孔直径。データは平均±ＳＤとして表されている（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定による。
【図2】作製されたＰＶＤＦ単体メンブレンおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンの物理的性質。（Ａ）作製されたメンブレンの両側からの水接触角。データは平均±ＳＤとして表されている（ｎ＝９）。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。（Ｂ）作製されたメンブレンの水接触角測定の代表的画像。（Ｃ～Ｆ）ヤング率（Ｃ）、ピーク応力（Ｄ）、破断ひずみＩ、および破断応力（Ｆ）によって特徴づけられる、作製されたメンブレンの機械的性質。データは平均±ＳＤとして表されている（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。
【図3】作製されたＰＶＤＦ単体メンブレンおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンの間接的細胞毒性試験および化学組成。（Ａ）ＭＴＴアッセイ中にさまざまなばく露媒体と接触させたＩＮＳ－１Ｅ細胞の代謝活性のレベル。データは平均±ＳＤとして表されている（Ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ。（Ｂ）さまざまなばく露媒体と接触させたＩＮＳ－１Ｅ細胞のＬＤＨ放出の測定。データは平均±ＳＤとして表されている（Ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ。（Ｃ）作製されたメンブレンのＦＴＩＲスペクトル。約１６６０ｃｍ－１の緑色の線はＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレン中に存在するＣ＝Ｏピークを示す。約１４００および約１１８０ｃｍ－１のそれぞれ赤色および黒色の線は、ＰＶＤＦ基本構造中に存在するＣＨ２およびＣＦ２に対応する。
【図4】２チャンバー拡散装置（Ａ～Ｊ）または組み立てられたデバイス（Ｋ～Ｌ）における、作製されたＰＶＤＦ単体メンブレンおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレン越しのさまざまな分子の拡散特性。（Ａ～Ｃ）２００分にわたる２ｍｇ／ｍＬの３～５ｋＤａ蛍光標識デキストランビーズの拡散（Ａ）、その流束計算値（Ｂ）および拡散係数（Ｃ）。データは平均±ＳＴＤとして表されている（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。（Ｄ～Ｆ）２００分にわたる２０ｍＭのＤ－グルコースの拡散（Ｄ）、そのｆｌＩ計算値（Ｅ）および拡散係数（Ｆ）。データは平均±ＳＴＤとして表されている（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。（Ｇ～Ｉ）計２４時間後のパーセンテージとしてのＦＩＴＣ標識インスリンの拡散、その流束計算値（Ｈ）および拡散係数（Ｉ）。データは平均±ＳＴＤとして表されている（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。（Ｊ）計３時間後のパーセンテージとしてのＩｇＧの拡散。データは平均±ＳＴＤとして表されている（ｎ＝４）。（Ｋ～Ｌ）２１％酸素から５％酸素への酸素の拡散（Ｋ）および酸素拡散の曲線下面積（ＡＵＣ）（Ｌ）。データは平均±ＳＴＤとして表されている（Ｎ＝３）。
【図5】作製されたメンブレンＰＶＤＦおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰの免疫防護特性（Ａ）さまざまな多孔性トランスウェルインサート（０．４、１、３および８μｍの細孔）または作製されたメンブレンの上に播種された固定ヒト初代マクロファージの代表的ＳＥＭ像。細孔を通って遊走することができた細胞を代表的下部像に見ることができる。どの画像においてもスケールバーは１０μｍを表す。（Ｂ）２４ウェルプレートの下部上の遊走したヒト初代マクロファージの定量。データは平均±ＳＴＤとして表されている（Ｎ＝３）。（Ｃ）２４時間後の３μｍおよび８μｍトランスウェルのウェルプレート下部の代表的光学顕微鏡像。スケールバーは２００μｍを表す。
【図6】デバイス作製および島播種の略図。（Ａ）デバイスの３層、２つのメンブレンシート（明灰色）および中間の支持リング（暗灰色）。（Ｂ）デバイスの３層を超音波溶着で封止する。（Ｃ）播種用インレットを持つ組み立てられたデバイス。（Ｄ）播種用インレットを通した島の播種。（Ｅ）播種用インレットをヒートシールで閉じる。（Ｆ）細胞が装填されたデバイスの培養。
【図7】封入デバイスの作製と試験。（Ａ）封入デバイスの組立ての略図。（Ｂ）組み立てられた封入デバイス。（Ｃ）組み立てられた封入デバイスの取り扱い。漏出に関するデバイス試験のカメラ画像（Ｄ～Ｅ）。（Ｄ）漏出が起こらないデバイスと、漏出が起こるデバイス（leakinlevice）（Ｅ）。ヒートシールおよび超音波溶着シールの機械的性質（Ｆ～Ｇ）。シールの（Ｆ）破断応力および（Ｇ）破断ひずみ。データは平均±ｓｔｄとして表されている（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。
【図8】免疫防護デバイスの内側で培養されたヒト島。（Ａ）８日間の培養後の封入デバイスの内側のヒト島の代表的画像。赤色チャンネルは死細胞を表し、緑色チャンネルは生細胞を表す。スケールバーはすべての写真において２００μｍを表す。（Ｂ）封入デバイスの内側での、または対照としてのデバイスなしでの、８日間の培養後のヒト島生存率の定量。データは平均±ＳＴＤとして表されている（Ｎ＝３）。（Ｃ）総インスリンに対して正規化された、デバイスの内側で８日間培養した後のＧＳＩＳ時のヒト島のインスリン放出プロファイル。＊Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡによる。（Ｄ）８日目の刺激指数。データは平均±ＳＥＭとして表されている（Ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定による。
【図9】さまざまなメッシュサイズの模式的概観。この図は、さまざまなメッシュサイズを模式的に描いている。表示したマイクロメートル単位のサイズは島細胞の場合の目安であり、他の細胞タイプまたはオルガノイドには異なるサイズのメッシュが必要になるだろう。メッシュが小さすぎて（左）細胞が依然としてクラスターを形成しうる状況、細胞が互いに隔離されている理想的なメッシュサイズ（中央）、またはメッシュが大きすぎて（右）、細胞がメッシュから落ちて、やはりクラスターを形成しうる状況（上段：平面図、下段：断面図）が、模式的に描かれている。
【図10】デバイスの模式的断面。上部および下部メンブレン、メッシュおよびメッシュ上に包埋されたデバイス内側の細胞が描かれている。さらに、支持構造物（この場合は支持リング）が示されている。
【図11】積み上げられたデバイスの断面を示している。互いに積み重ねられ、栄養素の拡散が可能になるように追加の支持構造物によって分離された、２つのデバイスが描かれている。
【図12】メッシュ上で培養された島細胞は凝集しない。組織培養ディッシュにおいて、メッシュなしで（左）またはメッシュと共に（右）、培地中で培養された膵島細胞。
【図13】メッシュ上で培養された島細胞は凝集しない。本明細書記載の植込みデバイスの内側において、メッシュなしで（左）またはメッシュと共に（右）、培養された膵島細胞。
【図14】デバイス内でｈＭＳＣ細胞クラスターを培養することができる。本明細書記載のデバイスの外側または内側で培養されたｈＭＳＣ細胞のクラスターを図示している。図示されているのは染色（示されていない）によって決定された生存細胞クラスターである。
【図15】デバイス内でアルファ－ＴＣ細胞クラスターを培養することができる。本明細書記載のデバイスの外側または内側で培養されたアルファ－ＴＣ細胞のクラスターを図示している。図示されているのは染色（示されていない）によって決定された生存細胞クラスターである。
【図16】メッシュ（孔径４００μｍ）を持つデバイスおよびメッシュを持たないデバイスの内側へのヒト島の播種。 上段は、細胞を播種した後の、メッシュを持たない（左）またはメッシュを持つ（右）デバイスの全体像の写真である。孔径４００μｍのデバイスを使用した。下段の写真は個々の細胞クラスターを示す拡大像である。
【図17】約５０μｍメッシュを持つデバイスへのベータ細胞凝集体の播種。 左の写真は、細胞を播種した後の、５０μｍメッシュを持つデバイスの全体像である。右は、個々の細胞クラスターを示す拡大像である。
【図18】８０μｍの細孔を持つメッシュの上への疑似島の播種。 Ａ）メッシュを持たないデバイスに、２つの異なる濃度（左：２ｍＬにつき１０００クラスター、右：１．５ｍＬ中に３０００クラスター）で播種した後、４日間成長させた細胞を図示している。Ｂ）８０μｍメッシュを持つデバイスに、４つの異なる濃度（左から右に向かって、１ｍＬにつき１０００クラスター、２ｍＬにつき１０００クラスター、５ｍＬにつき１０００クラスター、および１．５ｍＬ中に３０００クラスター）で播種した後、４日間成長させた細胞を図示している。写真はメッシュの下側（上段）およびメッシュの上（下段）から撮られている。
【実施例】
【0063】
実施例１
材料および方法
多孔性メンブレンの作製
１５％（ｗ／ｗ）ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（Ｋｙｎａｒ７２０、Ｆｏｓｔｅｒ、ドイツ）をＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミン（ＤＭＡ）（Sigma-Aldrich、オランダ）に溶解することによってキャスティング溶液を作り、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）含有メンブレンの場合は、５％（ｗ／ｗ）ＰＶＰ（４０ｋＤａ）（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）３０、ＢＴＣ、オランダ）を加えた。気泡のない均一な溶液が得られるまで、溶液をローラーバンク上、室温（ＲＴ）で、一晩混合した。次に、２００μｍキャスティングナイフを装着した自動フィルム塗布装置（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、オランダ）を使って、溶液をガラス板上にキャストし（ＲＴ、相対湿度＜３０％において）、その後ただちに、そのガラス板を凝固浴（ＲＴの蒸留水）に直接浸漬した。その凝固浴からメンブレンを収集し、ティッシュペーパーに挟んで２日間乾燥させてから使用した。
材料および方法
多孔性メンブレンの作製
１５％（ｗ／ｗ）ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（Ｋｙｎａｒ７２０、Ｆｏｓｔｅｒ、ドイツ）をＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミン（ＤＭＡ）（Sigma-Aldrich、オランダ）に溶解することによってキャスティング溶液を作り、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）含有メンブレンの場合は、５％（ｗ／ｗ）ＰＶＰ（４０ｋＤａ）（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）３０、ＢＴＣ、オランダ）を加えた。気泡のない均一な溶液が得られるまで、溶液をローラーバンク上、室温（ＲＴ）で、一晩混合した。次に、２００μｍキャスティングナイフを装着した自動フィルム塗布装置（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、オランダ）を使って、溶液をガラス板上にキャストし（ＲＴ、相対湿度＜３０％において）、その後ただちに、そのガラス板を凝固浴（ＲＴの蒸留水）に直接浸漬した。その凝固浴からメンブレンを収集し、ティッシュペーパーに挟んで２日間乾燥させてから使用した。
【0064】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
カーボンテープを使ってメンブレン試料を金属走査型電子顕微鏡スタブ上に固定し、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎスパッタコーター（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ １０８ ａｕｔｏ、英国）を使って金コーティングした。イメージングに先立ち、メンブレンを液体窒素に浸漬してから、各試料を半分に割ることによって、メンブレンの断面を作った。電子顕微鏡像は、高真空下で走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｔｅｎｅｏ、ＦＥＩ、オランダ）を使用し、ＥＴＤ検出による二次電子モード、作動距離１０ｍｍおよび加速電圧５．００ｋＶを使って取得した。
カーボンテープを使ってメンブレン試料を金属走査型電子顕微鏡スタブ上に固定し、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎスパッタコーター（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ １０８ ａｕｔｏ、英国）を使って金コーティングした。イメージングに先立ち、メンブレンを液体窒素に浸漬してから、各試料を半分に割ることによって、メンブレンの断面を作った。電子顕微鏡像は、高真空下で走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｔｅｎｅｏ、ＦＥＩ、オランダ）を使用し、ＥＴＤ検出による二次電子モード、作動距離１０ｍｍおよび加速電圧５．００ｋＶを使って取得した。
【0065】
支持リングの作製
ＰＶＤＦペレットを、金型（２００μｍ厚、内製）に挟み、ホットプレス（Ｓｐｅｃａｃ、英国）内で、１８０℃で１分間、予熱した。次に、２０ｋＮを適用してペレットを１分間軟化させることで、固形フィルムを作出した。最後に、金型をホットプレスから取り出し、ＲＴで５分間冷却してから、鋳型から固形ＰＶＤＦフィルムを取り外した。
ＰＶＤＦペレットを、金型（２００μｍ厚、内製）に挟み、ホットプレス（Ｓｐｅｃａｃ、英国）内で、１８０℃で１分間、予熱した。次に、２０ｋＮを適用してペレットを１分間軟化させることで、固形フィルムを作出した。最後に、金型をホットプレスから取り出し、ＲＴで５分間冷却してから、鋳型から固形ＰＶＤＦフィルムを取り外した。
【0066】
メンブレンの湿潤性
メンブレンをスライドガラス上に水平にマウントした。蒸留水（室温）４μＬの小滴をメンブレンの表面に１０μＬ／分の速度で供給し、高解像度画像を撮影した。液滴形状アナライザーを装備したＤｒｏｐ Ｓｈａｐｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ４ソフトウェア（Ｋｒｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、接触角を測定した。各メンブレンにつき９個の小滴の測定を行った。
メンブレンをスライドガラス上に水平にマウントした。蒸留水（室温）４μＬの小滴をメンブレンの表面に１０μＬ／分の速度で供給し、高解像度画像を撮影した。液滴形状アナライザーを装備したＤｒｏｐ Ｓｈａｐｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ４ソフトウェア（Ｋｒｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、接触角を測定した。各メンブレンにつき９個の小滴の測定を行った。
【0067】
機械的引張試験
作製されたフィルムおよび封止方法の機械的引張特性を、機械的引張試験機（４５ｋＮロードセル、Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ３２３０－ＥＳシリーズＩＩＩ、英国）によって決定した。試験試料の寸法は３５×１０ｍｍで、クランプ間の有効領域は１５×１０ｍｍだった。ランプ速度は０．０５ｍｍ／ｓとした。各条件を５回試験した。得られた応力－ひずみ曲線を使って、ピークひずみ、破断応力、破断ひずみおよびヤング率を算出した。異なるデバイス構成要素は、比較のために２つの異なる方法、すなわちフラットワイヤーインパルスシーラー（Ｄｕｒａｐａｋ、米国）によるヒートシールおよび超音波溶着（ＬＰＸ、Branson Ultrasonic、オランダ）を使って、互いにアニールした。次に、シールの強さを機械的張力で決定した。
作製されたフィルムおよび封止方法の機械的引張特性を、機械的引張試験機（４５ｋＮロードセル、Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ３２３０－ＥＳシリーズＩＩＩ、英国）によって決定した。試験試料の寸法は３５×１０ｍｍで、クランプ間の有効領域は１５×１０ｍｍだった。ランプ速度は０．０５ｍｍ／ｓとした。各条件を５回試験した。得られた応力－ひずみ曲線を使って、ピークひずみ、破断応力、破断ひずみおよびヤング率を算出した。異なるデバイス構成要素は、比較のために２つの異なる方法、すなわちフラットワイヤーインパルスシーラー（Ｄｕｒａｐａｋ、米国）によるヒートシールおよび超音波溶着（ＬＰＸ、Branson Ultrasonic、オランダ）を使って、互いにアニールした。次に、シールの強さを機械的張力で決定した。
【0068】
細胞培養
ＩＮＳ－１Ｅラットインスリノーマ細胞（Addexbio Technology、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Sigma-Aldrich、オランダ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、５ｍＭグルコース（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、２３．８ｍＭ重炭酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific、オランダ）および５０ｍＭベータ－メルカプトエタノール（Thermo Fisher Scientific、オランダ）を補足した、Ｌ－グルタミン（Sigma-Aldrich、オランダ）を含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地で培養した。Ｐ３８～Ｐ４３のＩＮＳ－１Ｅを使用した。ヒト初代マクロファージ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、オランダ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（Thermo Fisher Scientific、オランダ）で培養した。Ｐ６～Ｐ１０のマクロファージを使用した。細胞はすべて３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
ＩＮＳ－１Ｅラットインスリノーマ細胞（Addexbio Technology、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Sigma-Aldrich、オランダ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、５ｍＭグルコース（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、２３．８ｍＭ重炭酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific、オランダ）および５０ｍＭベータ－メルカプトエタノール（Thermo Fisher Scientific、オランダ）を補足した、Ｌ－グルタミン（Sigma-Aldrich、オランダ）を含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地で培養した。Ｐ３８～Ｐ４３のＩＮＳ－１Ｅを使用した。ヒト初代マクロファージ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、オランダ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（Thermo Fisher Scientific、オランダ）で培養した。Ｐ６～Ｐ１０のマクロファージを使用した。細胞はすべて３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【0069】
ヒト島培養
ヒト島は、臨床目的でのヒト島の分離をオランダ政府から許可されているライデン大学医療センター（Leiden University Medical Centre：ＬＵＭＣ、オランダ）のHuman Islet Isolation Laboratoryによって提供された。臓器ドナー（男性２人、性別不明のドナー１人）の平均年齢は４３±１４歳だった。平均島純度は７５±５％であった。島は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、オランダ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific、オランダ）および１０μｇ／ｍＬシプロフロキサシン（Sigma-Aldrich、オランダ）を補足したＣＭＲＬ－１０６６培地（Pan Biotech、ドイツ）で培養した。島は３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
ヒト島は、臨床目的でのヒト島の分離をオランダ政府から許可されているライデン大学医療センター（Leiden University Medical Centre：ＬＵＭＣ、オランダ）のHuman Islet Isolation Laboratoryによって提供された。臓器ドナー（男性２人、性別不明のドナー１人）の平均年齢は４３±１４歳だった。平均島純度は７５±５％であった。島は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、オランダ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific、オランダ）および１０μｇ／ｍＬシプロフロキサシン（Sigma-Aldrich、オランダ）を補足したＣＭＲＬ－１０６６培地（Pan Biotech、ドイツ）で培養した。島は３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【0070】
ＭＴＴアッセイ
３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のホルマザンへの変換を測定することによって、細胞の代謝活性を評価した。この過程は代謝的に活性な細胞においてのみ起こる。試験材料をＲＰＭＩ細胞培養培地（細胞培養の項参照）中で２４時間培養することによって、抽出試料を生成させた。ＲＰＭＩ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＶＷＲ、オランダ）を陰性対照として使用した。一方、陽性対照としては、無処理の培地を使用する。ＩＮＳ－１Ｅ細胞を９６ウェルプレートに５×１０５細胞／ｍＬで播種し（１００μＬ）、一晩インキュベートすることで、ＲＰＭＩ培地中に５０％コンフルエントの単層を形成させた。２４時間後に培地を取り除き、１００μＬの抽出試料を加え、一晩インキュベートした。２４時間後に培地を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Sigma-Aldrich、オランダ）中の１２ｍＭ ＭＴＴ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）溶液１０μＬを補足した１００μＬの新鮮な細胞培養培地に置き換えて、４時間インキュベートした。２５μＬを残して培地をすべて除去し、１００μＬのＤＭＳＯ（ＶＷＲ、オランダ）と混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。吸光度は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使って５４０ｎｍで測定した。細胞生存率は式１で算出した（ＯＤ５４０ｅ＝試験試料の抽出物の光学密度測定値、ＯＤ５４０ｂ＝ブランクの光学密度測定値）。
３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のホルマザンへの変換を測定することによって、細胞の代謝活性を評価した。この過程は代謝的に活性な細胞においてのみ起こる。試験材料をＲＰＭＩ細胞培養培地（細胞培養の項参照）中で２４時間培養することによって、抽出試料を生成させた。ＲＰＭＩ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＶＷＲ、オランダ）を陰性対照として使用した。一方、陽性対照としては、無処理の培地を使用する。ＩＮＳ－１Ｅ細胞を９６ウェルプレートに５×１０５細胞／ｍＬで播種し（１００μＬ）、一晩インキュベートすることで、ＲＰＭＩ培地中に５０％コンフルエントの単層を形成させた。２４時間後に培地を取り除き、１００μＬの抽出試料を加え、一晩インキュベートした。２４時間後に培地を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Sigma-Aldrich、オランダ）中の１２ｍＭ ＭＴＴ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）溶液１０μＬを補足した１００μＬの新鮮な細胞培養培地に置き換えて、４時間インキュベートした。２５μＬを残して培地をすべて除去し、１００μＬのＤＭＳＯ（ＶＷＲ、オランダ）と混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。吸光度は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使って５４０ｎｍで測定した。細胞生存率は式１で算出した（ＯＤ５４０ｅ＝試験試料の抽出物の光学密度測定値、ＯＤ５４０ｂ＝ブランクの光学密度測定値）。
【0071】
【数1】
【0072】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイ
細胞培養培地中のＬＤＨレベルによる測定を行うことによって、細胞毒性を評価した。ＩＮＳ－１Ｅ細胞を９６ウェルに５×１０５細胞／ｍＬで播種し（１００μＬ）、一晩インキュベートした。次に、１０μＬの抽出試料を加え（ＭＴＴアッセイ参照）、４５分間インキュベートした。５０μＬの各試料を９６ウェルプレートに移し、５０μＬの反応混合物（Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オランダ）を加え、遮光下に、ＲＴで３０分間、インキュベートした。次に、５０μＬの停止溶液を加え、混合してから、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダーで４９０ｎｍおよび６８０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞毒性は式２で算出した。
細胞培養培地中のＬＤＨレベルによる測定を行うことによって、細胞毒性を評価した。ＩＮＳ－１Ｅ細胞を９６ウェルに５×１０５細胞／ｍＬで播種し（１００μＬ）、一晩インキュベートした。次に、１０μＬの抽出試料を加え（ＭＴＴアッセイ参照）、４５分間インキュベートした。５０μＬの各試料を９６ウェルプレートに移し、５０μＬの反応混合物（Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オランダ）を加え、遮光下に、ＲＴで３０分間、インキュベートした。次に、５０μＬの停止溶液を加え、混合してから、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダーで４９０ｎｍおよび６８０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞毒性は式２で算出した。
【0073】
【数2】
【0074】
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）（Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５０－ＦＴ－ＩＲ、Thermo Scientific、オランダ）を使って、作製されたメンブレンの化学組成を分析した。赤外スペクトルを４００～４０００ｃｍ－１の波長範囲で記録した。化学結合に関係するピークを特定するためにＳｐｅｃｔｒａＧｒｙｐｈ（バージョン１．２．１３、ドイツ）を使って結果を解析した。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）（Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５０－ＦＴ－ＩＲ、Thermo Scientific、オランダ）を使って、作製されたメンブレンの化学組成を分析した。赤外スペクトルを４００～４０００ｃｍ－１の波長範囲で記録した。化学結合に関係するピークを特定するためにＳｐｅｃｔｒａＧｒｙｐｈ（バージョン１．２．１３、ドイツ）を使って結果を解析した。
【0075】
封入デバイスの組立て
メンブレンおよび支持リングを、カッティングマシン（Ｃｕｒｉｏ、Ｓｉｌｈｏｕｅｔｔｅ、オランダ）を使って、楕円形状（４４×２８ｍｍ）に裁断した。支持リングを２つのメンブレンシートの間に置き、特注鋳型（ＩＤＥＥ、オランダ）の内側において、超音波溶着（ＬＰＸ、Branson Ultrasonic、オランダ）によってそれらをアニールすることにより、デバイスを作製した。組み立てられたデバイスを、気泡試験によって漏出について試験した。簡単に述べると、組み立てられたデバイスを、インレットからデバイス中に空気（約４Ｌ／分）を吹き込みながら、水に沈める。そして、デバイスから気泡が漏れているのが観察された場合は、漏出が検出されたことになる。
メンブレンおよび支持リングを、カッティングマシン（Ｃｕｒｉｏ、Ｓｉｌｈｏｕｅｔｔｅ、オランダ）を使って、楕円形状（４４×２８ｍｍ）に裁断した。支持リングを２つのメンブレンシートの間に置き、特注鋳型（ＩＤＥＥ、オランダ）の内側において、超音波溶着（ＬＰＸ、Branson Ultrasonic、オランダ）によってそれらをアニールすることにより、デバイスを作製した。組み立てられたデバイスを、気泡試験によって漏出について試験した。簡単に述べると、組み立てられたデバイスを、インレットからデバイス中に空気（約４Ｌ／分）を吹き込みながら、水に沈める。そして、デバイスから気泡が漏れているのが観察された場合は、漏出が検出されたことになる。
【0076】
メンブレンの拡散特性
メンブレンを７０％エタノール中で２分間プリウェットし、次にエタノールを除去するために蒸留水で２分間洗浄した。ドナーチャンバーとレシーバーチャンバーを備えるインライン型平衡拡散セル（Sigma-Aldrich、オランダ）に、濡らしたメンブレンを入れた。ドナーチャンバーを、２ｍｇ／ｍＬ ３～５ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（Sigma-Aldrich、オランダ）、２０ｍＭ Ｄ－グルコース溶液（Sigma-Aldrich、オランダ）もしくは０．５ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ標識ヒトインスリン（Sigma-Aldrich、オランダ）を含有するＰＢＳ溶液、または１ｍｇ／ｍＬ ＩｇＧ溶液（Sigma-Aldrich、オランダ）を含有するＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）で満たした。レシーバーチャンバーは、デキストラン、グルコースもしくはインスリン拡散についてはＰＢＳで、またＩｇＧ拡散については１５０ｍＭ ＮａＣｌで満たした。両方のチャンバーから１０μｌの試料を、０、５、１０、２０、３０、６０、１２０、１８０分の時点で取り出し、インスリン拡散の場合は、１４４０分の時点で追加の試料を採取した。拡散したＦＩＴＣ－デキストランおよびＦＩＴＣ－インスリンの定量的分析は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダーを使った蛍光強度（励起波長および蛍光波長＝４８０ｎｍおよび５３０ｎｍ）に基づいて決定した。グルコースの量は、比色グルコースアッセイ（Bio-connect Diagnostic、オランダ）を製造者のプロトコールに従って使用することによって測定した。簡単に述べると、試料を収集し、ＰＢＳに希釈した。５０μＬのグルコース溶液を５０μＬの反応混合物と共に３７℃で２０分間インキュベートした。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（励起波長＝５５５ｎｍ）を使って吸光度を測定した。ＩｇＧの量は、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）で、製造者のプロトコールに従って測定した。特定時点において関心対象の分子がどのくらい多くメンブレン越しに拡散するかについての洞察を得るために、式３を使って流束値を算出した（Ｃレシーバー＝レシーバーチャンバーにおける濃度、Ｖレシーバー＝レシーバーチャンバーの体積、Ａ＝メンブレンの面積、ｔ＝時刻）。拡散係数は式４を使って算出した（ΔＣ＝ドナーとレシーバーの間の濃度差、Ｉ＝メンブレンの厚さ）。各条件を少なくとも４回は試験した。
メンブレンを７０％エタノール中で２分間プリウェットし、次にエタノールを除去するために蒸留水で２分間洗浄した。ドナーチャンバーとレシーバーチャンバーを備えるインライン型平衡拡散セル（Sigma-Aldrich、オランダ）に、濡らしたメンブレンを入れた。ドナーチャンバーを、２ｍｇ／ｍＬ ３～５ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（Sigma-Aldrich、オランダ）、２０ｍＭ Ｄ－グルコース溶液（Sigma-Aldrich、オランダ）もしくは０．５ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ標識ヒトインスリン（Sigma-Aldrich、オランダ）を含有するＰＢＳ溶液、または１ｍｇ／ｍＬ ＩｇＧ溶液（Sigma-Aldrich、オランダ）を含有するＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）で満たした。レシーバーチャンバーは、デキストラン、グルコースもしくはインスリン拡散についてはＰＢＳで、またＩｇＧ拡散については１５０ｍＭ ＮａＣｌで満たした。両方のチャンバーから１０μｌの試料を、０、５、１０、２０、３０、６０、１２０、１８０分の時点で取り出し、インスリン拡散の場合は、１４４０分の時点で追加の試料を採取した。拡散したＦＩＴＣ－デキストランおよびＦＩＴＣ－インスリンの定量的分析は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダーを使った蛍光強度（励起波長および蛍光波長＝４８０ｎｍおよび５３０ｎｍ）に基づいて決定した。グルコースの量は、比色グルコースアッセイ（Bio-connect Diagnostic、オランダ）を製造者のプロトコールに従って使用することによって測定した。簡単に述べると、試料を収集し、ＰＢＳに希釈した。５０μＬのグルコース溶液を５０μＬの反応混合物と共に３７℃で２０分間インキュベートした。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（励起波長＝５５５ｎｍ）を使って吸光度を測定した。ＩｇＧの量は、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（Thermo Fisher Scientific、オランダ）で、製造者のプロトコールに従って測定した。特定時点において関心対象の分子がどのくらい多くメンブレン越しに拡散するかについての洞察を得るために、式３を使って流束値を算出した（Ｃレシーバー＝レシーバーチャンバーにおける濃度、Ｖレシーバー＝レシーバーチャンバーの体積、Ａ＝メンブレンの面積、ｔ＝時刻）。拡散係数は式４を使って算出した（ΔＣ＝ドナーとレシーバーの間の濃度差、Ｉ＝メンブレンの厚さ）。各条件を少なくとも４回は試験した。
【0077】
【数3】
【0078】
【数4】
【0079】
デバイスの内側における酸素拡散特性
デバイスに培地を充填する前に、組み立てられたデバイスを７０％エタノールで２分間プリウェットし、次にエタノールを除去するために蒸留水で２分間洗浄した。デバイスに５００μＬのＲＰＭＩ細胞培養培地を充填することによって、酸素拡散を測定した。培地が充填されたデバイスをヒートシールし、１００ｍＬの新鮮な細胞培養培地が入っている１００ｍＬビーカーの内側に置いた。次に、デバイスが入っているビーカーを、５％Ｏ２の加湿インキュベータに、３７℃で置いた。デバイス内および外側の酸素濃度を、酸素計（ＯＸＹ－１０、Ｐｒｅｓｅｎ、ドイツ）に接続された較正済みニードル型酸素マイクロセンサ（ＮＴＨ－ＰＳｔ７、Ｐｒｅｓｅｎｓ、ドイツ）を使って、２４時間にわたって記録した。酸素測定の継続中は常にデバイスを培地に沈んだ状態に保った。各条件、対照および両デバイスを、独立に３回試験した。
デバイスに培地を充填する前に、組み立てられたデバイスを７０％エタノールで２分間プリウェットし、次にエタノールを除去するために蒸留水で２分間洗浄した。デバイスに５００μＬのＲＰＭＩ細胞培養培地を充填することによって、酸素拡散を測定した。培地が充填されたデバイスをヒートシールし、１００ｍＬの新鮮な細胞培養培地が入っている１００ｍＬビーカーの内側に置いた。次に、デバイスが入っているビーカーを、５％Ｏ２の加湿インキュベータに、３７℃で置いた。デバイス内および外側の酸素濃度を、酸素計（ＯＸＹ－１０、Ｐｒｅｓｅｎ、ドイツ）に接続された較正済みニードル型酸素マイクロセンサ（ＮＴＨ－ＰＳｔ７、Ｐｒｅｓｅｎｓ、ドイツ）を使って、２４時間にわたって記録した。酸素測定の継続中は常にデバイスを培地に沈んだ状態に保った。各条件、対照および両デバイスを、独立に３回試験した。
【0080】
メンブレンの免疫防護能
０．３３ｃｍ２空トランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）上にメンブレンをグルー（Ｂｉｓｏｎ、オランダ）およびＯ－リング（Ｅｒｉｋ、オランダ）でマウントした。グルーを一晩乾燥させた後、インサートを７０％エタノールで滅菌した。ヒト初代マクロファージを、２４ウェルプレート中の各インサートの上部コンパートメントに播種し（１００μＬ中に１００，０００細胞）、６００μＬの培地を各ウェルに加えた。細胞を２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。ノイバウエル血球計算盤を使って下部コンパートメントに遊走した細胞を手動で計数した。細胞の付着とメンブレン越しの浸潤を観察するために、メンブレンを、ＰＢＳ中の３．６％ホルムアルデヒド（ＶＷＲ、オランダ）で、ＲＴにおいて３０分間固定し、次に新鮮なＰＢＳで複数回すすいでから、メンブレンをインサートから切り出した。試料をエタノール上昇系列（３０、５０、７０、９０、９６、１００および１００％エタノール）（ＶＷＲ、オランダ）でそれぞれ１０分間脱水した。脱水試料を臨界点乾燥装置（Ｌｅｉｃａ、オランダ）で処理した。次に、乾燥メンブレン試料を調製し、先に述べたように走査型電子顕微鏡を使って撮像した。
０．３３ｃｍ２空トランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）上にメンブレンをグルー（Ｂｉｓｏｎ、オランダ）およびＯ－リング（Ｅｒｉｋ、オランダ）でマウントした。グルーを一晩乾燥させた後、インサートを７０％エタノールで滅菌した。ヒト初代マクロファージを、２４ウェルプレート中の各インサートの上部コンパートメントに播種し（１００μＬ中に１００，０００細胞）、６００μＬの培地を各ウェルに加えた。細胞を２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。ノイバウエル血球計算盤を使って下部コンパートメントに遊走した細胞を手動で計数した。細胞の付着とメンブレン越しの浸潤を観察するために、メンブレンを、ＰＢＳ中の３．６％ホルムアルデヒド（ＶＷＲ、オランダ）で、ＲＴにおいて３０分間固定し、次に新鮮なＰＢＳで複数回すすいでから、メンブレンをインサートから切り出した。試料をエタノール上昇系列（３０、５０、７０、９０、９６、１００および１００％エタノール）（ＶＷＲ、オランダ）でそれぞれ１０分間脱水した。脱水試料を臨界点乾燥装置（Ｌｅｉｃａ、オランダ）で処理した。次に、乾燥メンブレン試料を調製し、先に述べたように走査型電子顕微鏡を使って撮像した。
【0081】
封入デバイスへの島播種
７０％エタノール中で一晩インキュベートすることによってデバイスを滅菌した後、滅菌ＰＢＳで洗浄した。デバイス中に島を播種する前に、デバイスを培地中で一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培地５００μＬ中の３，０００ヒト島当量（islet equivalent：ＩＥＱ）を各デバイスの内側に播種した。対照試料については、１２μｍ細胞培養インサート（Ｍｅｒｃｋ、オランダ）に３０ＩＥＱを播種した。播種用インレットをヒートシール（Ｄｕｒａｐａｋ、米国）で閉じた。デバイスを８日間培養し（３７℃、５％ＣＯ２）、培地を１日おきに新しくした。
７０％エタノール中で一晩インキュベートすることによってデバイスを滅菌した後、滅菌ＰＢＳで洗浄した。デバイス中に島を播種する前に、デバイスを培地中で一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培地５００μＬ中の３，０００ヒト島当量（islet equivalent：ＩＥＱ）を各デバイスの内側に播種した。対照試料については、１２μｍ細胞培養インサート（Ｍｅｒｃｋ、オランダ）に３０ＩＥＱを播種した。播種用インレットをヒートシール（Ｄｕｒａｐａｋ、米国）で閉じた。デバイスを８日間培養し（３７℃、５％ＣＯ２）、培地を１日おきに新しくした。
【0082】
ヒト島の生存率
生細胞と死細胞にそれぞれｌｉｖｅーｄｅａｄ蛍光色素、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマー１（Thermo Fisher Scientific、オランダ）を使って、ヒト島の生存率を評価した。８日間の培養後に、デバイスを切開し、ＰＢＳでデバイスから島を流し出した。次に島を、２．５μＭカルセインＡＭおよび４μＭエチジウムホモダイマー１と共にＰＢＳ中で３０分間インキュベートし（遮光下）、蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｓ倒立顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ、オランダ）で可視化した。生細胞の面積を細胞の総面積（生細胞および死細胞）で割ることによって生存百分率を定量した。
生細胞と死細胞にそれぞれｌｉｖｅーｄｅａｄ蛍光色素、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマー１（Thermo Fisher Scientific、オランダ）を使って、ヒト島の生存率を評価した。８日間の培養後に、デバイスを切開し、ＰＢＳでデバイスから島を流し出した。次に島を、２．５μＭカルセインＡＭおよび４μＭエチジウムホモダイマー１と共にＰＢＳ中で３０分間インキュベートし（遮光下）、蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｓ倒立顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ、オランダ）で可視化した。生細胞の面積を細胞の総面積（生細胞および死細胞）で割ることによって生存百分率を定量した。
【0083】
グルコース刺激中のヒト島機能
デバイスの内側におけるヒト島のインスリン放出を評価するために、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを行った。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma-Aldrich、オランダ）、１１５ｍＭ塩化ナトリウム（Sigma-Aldrich、オランダ）、２６ｍＭ重炭酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、オランダ）、５ｍＭ塩化カリウム（Sigma-Aldrich、オランダ）、１ｍＭ塩化マグネシウム二水和物（Sigma-Aldrich、オランダ）、２５ｍＭ塩化カルシウム二水和物（Sigma-Aldrich、オランダ）を、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ、オランダ）と共に、ＭｉｌｌｉＱに、ｐＨ７．３～７．５で溶解することによってクレブス緩衝液を調製し、滅菌濾過した。低グルコース溶液および高グルコース溶液は、クレブス緩衝液中に、それぞれ１．６７および１６．７ｍＭ Ｄ－グルコースを含有した。８日間の培養後に、デバイスおよび島を低グルコース溶液中で３回洗浄し、次に低グルコース中で１時間プレインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。次に、デバイスおよび島を低－高－低グルコース溶液にそれぞれ１時間ばく露し（３７℃、５％ＣＯ２）、その後、上清を収集して、分析を行うまで－３０℃で保存した。高グルコースばく露後はデバイスおよび島を低グルコース溶液で３回洗浄した。最後のインキュベーション工程後にデバイスを開き、細胞の内側のインスリンをすべて放出させるために、島を酸エタノールにばく露した。インスリン分泌は、ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン、またはＳａｎｂｉｏ、オランダ）により、製造者のプロトコールに従って決定した。グルコース刺激指数は、高グルコース溶液におけるインスリン分泌を低グルコース溶液における基礎インスリン分泌で割ることによって算出した。
デバイスの内側におけるヒト島のインスリン放出を評価するために、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを行った。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma-Aldrich、オランダ）、１１５ｍＭ塩化ナトリウム（Sigma-Aldrich、オランダ）、２６ｍＭ重炭酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、オランダ）、５ｍＭ塩化カリウム（Sigma-Aldrich、オランダ）、１ｍＭ塩化マグネシウム二水和物（Sigma-Aldrich、オランダ）、２５ｍＭ塩化カルシウム二水和物（Sigma-Aldrich、オランダ）を、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ、オランダ）と共に、ＭｉｌｌｉＱに、ｐＨ７．３～７．５で溶解することによってクレブス緩衝液を調製し、滅菌濾過した。低グルコース溶液および高グルコース溶液は、クレブス緩衝液中に、それぞれ１．６７および１６．７ｍＭ Ｄ－グルコースを含有した。８日間の培養後に、デバイスおよび島を低グルコース溶液中で３回洗浄し、次に低グルコース中で１時間プレインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。次に、デバイスおよび島を低－高－低グルコース溶液にそれぞれ１時間ばく露し（３７℃、５％ＣＯ２）、その後、上清を収集して、分析を行うまで－３０℃で保存した。高グルコースばく露後はデバイスおよび島を低グルコース溶液で３回洗浄した。最後のインキュベーション工程後にデバイスを開き、細胞の内側のインスリンをすべて放出させるために、島を酸エタノールにばく露した。インスリン分泌は、ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン、またはＳａｎｂｉｏ、オランダ）により、製造者のプロトコールに従って決定した。グルコース刺激指数は、高グルコース溶液におけるインスリン分泌を低グルコース溶液における基礎インスリン分泌で割ることによって算出した。
【0084】
データ解析
結果は、別段の指定がある場合を除き、平均±標準偏差（ＳＴＤ）として表す。実験は、指定がない限り、３重に行った。各実験では、１実験条件あたり３つの試料を採取した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９（GraphPad Software、米国）を使って行った。２つの群間の統計的差異は、対応のないスチューデントのｔ検定を使って行い、複数の群間では、クラスカル・ウォリス検定、または一元配置ＡＮＯＶＡ検定と多重比較を使って行った。ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意とみなした。
結果は、別段の指定がある場合を除き、平均±標準偏差（ＳＴＤ）として表す。実験は、指定がない限り、３重に行った。各実験では、１実験条件あたり３つの試料を採取した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９（GraphPad Software、米国）を使って行った。２つの群間の統計的差異は、対応のないスチューデントのｔ検定を使って行い、複数の群間では、クラスカル・ウォリス検定、または一元配置ＡＮＯＶＡ検定と多重比較を使って行った。ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意とみなした。
【0085】
結果
メンブレンの製作および物理化学的特徴づけ
溶媒／非溶媒キャスティング法を使って、１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦ＋５％（ｗ／ｗ）ＰＶＰ（ＰＶＤＦ／ＰＶＰ）溶液および１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦ（ＰＶＤＦ単体）溶液をガラス板上にキャストすることにより、薄い多孔性メンブレンを作った。ＰＶＰ有りおよびＰＶＰ無しのＰＶＤＦメンブレンの表面はどちらも、滑らかで一様な外観を有する。メンブレンのガラス側（図１Ａおよび図１Ｄ）にはメンブレンの空気側（図１Ｂおよび図１Ｅ）と比較して大きな細孔が観察された。ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンにおけるガラス側の細孔は、０．５１±０．１５μｍの平均直径を有し、一方、ＰＶＤＦメンブレンにおけるガラス側の細孔は０．２５±０．１２μｍの平均直径を有した（データ省略）。ＰＶＰの存在は空気ばく露側（図１Ｂおよび図１Ｅ）の孔径を増加させ、ＰＶＤＦ単体メンブレン（５１±２ｎｍ）と比べて、平均直径は１１３±４ｎｍと２倍以上に増加した（図１Ｈ）。ＰＶＤＦ単体メンブレンの断面は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレン（１３７±１９μｍ）と比べて、密であり、薄かった（４５±４μｍ）（図１Ｃ、図１Ｆ、図１Ｇ）。
メンブレンの製作および物理化学的特徴づけ
溶媒／非溶媒キャスティング法を使って、１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦ＋５％（ｗ／ｗ）ＰＶＰ（ＰＶＤＦ／ＰＶＰ）溶液および１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦ（ＰＶＤＦ単体）溶液をガラス板上にキャストすることにより、薄い多孔性メンブレンを作った。ＰＶＰ有りおよびＰＶＰ無しのＰＶＤＦメンブレンの表面はどちらも、滑らかで一様な外観を有する。メンブレンのガラス側（図１Ａおよび図１Ｄ）にはメンブレンの空気側（図１Ｂおよび図１Ｅ）と比較して大きな細孔が観察された。ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンにおけるガラス側の細孔は、０．５１±０．１５μｍの平均直径を有し、一方、ＰＶＤＦメンブレンにおけるガラス側の細孔は０．２５±０．１２μｍの平均直径を有した（データ省略）。ＰＶＰの存在は空気ばく露側（図１Ｂおよび図１Ｅ）の孔径を増加させ、ＰＶＤＦ単体メンブレン（５１±２ｎｍ）と比べて、平均直径は１１３±４ｎｍと２倍以上に増加した（図１Ｈ）。ＰＶＤＦ単体メンブレンの断面は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレン（１３７±１９μｍ）と比べて、密であり、薄かった（４５±４μｍ）（図１Ｃ、図１Ｆ、図１Ｇ）。
【0086】
作製されたメンブレンの親水性／疎水性を決定するために、静的固着液滴法によって接触角測定を行った。ガラスばく露側（どちらもおよそｘｘ（both approximately xx））とは異なり、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンの空気ばく露側の表面湿潤性は、ＰＶＤＦメンブレンと比較して有意に低かった（８０±３°対９９±４°；図２Ａおよび図２Ｂ）。
【0087】
作製されたメンブレンの機械的性質を機械的引張試験で決定した。ヤング率測定（（ＰＶＤＦ／ＰＶＰでは０．３２±０．０４ＭＰａ、ＰＶＤＦ単体では０．８７±０．１１ＭＰａ；図２Ｃ）およびピーク応力測定（ＰＶＤＦ／ＰＶＰでは０．９７±０．０３ＭＰａ、ＰＶＤＦ単体では４．９５±０．１６ＭＰａ；図２Ｄ）で決定した場合、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンは、ＰＶＤＦメンブレンと比べて有意に低い機械的強度を示した。さらにまた、破断ひずみ（図２Ｅ）および破断応力（図２Ｆ）はどちらも、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでは、ＰＶＤＦ単体メンブレンと比べて有意に低かった：それぞれ０．９２±０．０６ＭＰａ対４．７８±０．０７ＭＰａおよび１１±１％対８４±８％（:0.92 ± 0.06 MPa v. 4.78 ± 0.07 MPa and 11 ± 1% v. 84 ± 8%, respectively）。
【0088】
メンブレンの細胞毒性
作製されたＰＶＤＦメンブレンおよび支持リングのＩＮＳ－１Ｅ細胞に対する細胞毒性を決定するために、ＬＤＨアッセイおよびＭＴＴアッセイを行った。細胞生存率は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでは、ＰＶＤＦ単体メンブレンと比べて、わずかに、ただし有意に低かった（９２±８対１０６±９％；図４Ａ）。どちらのメンブレンも陽性対照と比べて細胞毒性に有意差は示さなかった（ＰＶＤＦメンブレンおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンについてそれぞれ－７±１５と１０±１４％；図４Ｂ）。ＰＶＰは水溶性であるが、残存する潜在的に細胞毒性のＰＶＰ粒子が、メンブレン製作後も残っていて、それが細胞毒性測定に影響を及ぼしたのかもしれない。そこで、ＦＴＩＲ分析を行って、ＰＶＰ残渣がまだ存在するかどうかを決定した（図３Ｃ）。ＰＶＤＦ単体メンブレンでは、ＰＶＤＦの基本構造中に存在するＣＨ２伸縮基とＣＦ２伸縮基に対応する約１４００ｃｍ－１と約１１８０ｃｍ－１にピークが存在した。ＰＶＤＦ／ＰＶＰでは、ＰＶＰ中に存在するＣ＝Ｏ基に対応する約１６６０ｃｍ－１に、追加のピークが観察された（図３Ｃ中の緑色の点線）。
作製されたＰＶＤＦメンブレンおよび支持リングのＩＮＳ－１Ｅ細胞に対する細胞毒性を決定するために、ＬＤＨアッセイおよびＭＴＴアッセイを行った。細胞生存率は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでは、ＰＶＤＦ単体メンブレンと比べて、わずかに、ただし有意に低かった（９２±８対１０６±９％；図４Ａ）。どちらのメンブレンも陽性対照と比べて細胞毒性に有意差は示さなかった（ＰＶＤＦメンブレンおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンについてそれぞれ－７±１５と１０±１４％；図４Ｂ）。ＰＶＰは水溶性であるが、残存する潜在的に細胞毒性のＰＶＰ粒子が、メンブレン製作後も残っていて、それが細胞毒性測定に影響を及ぼしたのかもしれない。そこで、ＦＴＩＲ分析を行って、ＰＶＰ残渣がまだ存在するかどうかを決定した（図３Ｃ）。ＰＶＤＦ単体メンブレンでは、ＰＶＤＦの基本構造中に存在するＣＨ２伸縮基とＣＦ２伸縮基に対応する約１４００ｃｍ－１と約１１８０ｃｍ－１にピークが存在した。ＰＶＤＦ／ＰＶＰでは、ＰＶＰ中に存在するＣ＝Ｏ基に対応する約１６６０ｃｍ－１に、追加のピークが観察された（図３Ｃ中の緑色の点線）。
【0089】
膜越しの低分子の拡散
メンブレンを横切るさまざまな分子の輸送についての洞察を得るために、本発明者らは、４種類の分子、すなわちデキストラン、グルコース、インスリン、およびＩｇＧについて試験した。メンブレンを２つのチャンバー、すなわちドナーチャンバーとレシーバーチャンバーの間に置いた。所定の時点において各チャンバーでさまざまな分子の濃度測定を行うことで、拡散動態を算出した。ＰＶＤＦ／ＰＶＰ越しのデキストラン（３～５ｋＤａ）の拡散は、ＰＶＤＦメンブレンの場合より、ほぼ３倍高く（図４Ａ）、算出された流束および拡散係数は有意に高かった（図４Ｂおよび図４Ｃ）。同様に、グルコース分子も、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレン越しに、より速く拡散し、３時間後には平衡（２つのチャンバーで等しい）に達したのに対し、ＰＶＤＦメンブレン越しに拡散するグルコースは同じ時点で３０％に過ぎなかった（図４Ｄ）。この観察結果は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでのグルコース流束１０＊１０－４ｇ・ｍ－２秒－１および拡散係数４．０＊１０－７ｃｍ２ｓ－１が、ＰＶＤＦ単体の場合（それぞれ４＊１０－４ｇ・ｍ－２秒－１および１．１＊１０－７ｃｍ２ｓ－１）と比べて有意に高いことによって裏付けられた（図４Ｅおよび図４Ｆ）。グルコースはメンブレンには吸収されなかった。グルコースの総濃度は経時的に変化しなかったからである。ＦＩＴＣ標識インスリンは、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでは、２４時間後には４７±２％のインスリンが拡散して平衡に達した。一方、これに比して、ＰＶＤＦメンブレンでは、同じ時点で２８±５％が拡散していた（図４Ｇ）。このインスリン拡散能は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでの流束１．９１＊１０－５ｇ・ｍ－２秒－１および拡散係数１．３１＊１０－８ｃｍ２ｓ－１が、ＰＶＤＦメンブレンの場合（それぞれ０．３５＊１０－５ｇ・ｍ－２秒－１および０．０８＊１０－８ｃｍ２ｓ－１）と比べて有意に高いことによって裏付けられた（図４Ｈおよび図４Ｉ）。ＩｇＧについては、１．６±０．７％だけがＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンを透過したが、ＰＶＤＦ単体メンブレンのレシーバーチャンバーでは検出されず、拡散は起こらないことが示唆された（図４Ｊ）。
メンブレンを横切るさまざまな分子の輸送についての洞察を得るために、本発明者らは、４種類の分子、すなわちデキストラン、グルコース、インスリン、およびＩｇＧについて試験した。メンブレンを２つのチャンバー、すなわちドナーチャンバーとレシーバーチャンバーの間に置いた。所定の時点において各チャンバーでさまざまな分子の濃度測定を行うことで、拡散動態を算出した。ＰＶＤＦ／ＰＶＰ越しのデキストラン（３～５ｋＤａ）の拡散は、ＰＶＤＦメンブレンの場合より、ほぼ３倍高く（図４Ａ）、算出された流束および拡散係数は有意に高かった（図４Ｂおよび図４Ｃ）。同様に、グルコース分子も、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレン越しに、より速く拡散し、３時間後には平衡（２つのチャンバーで等しい）に達したのに対し、ＰＶＤＦメンブレン越しに拡散するグルコースは同じ時点で３０％に過ぎなかった（図４Ｄ）。この観察結果は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでのグルコース流束１０＊１０－４ｇ・ｍ－２秒－１および拡散係数４．０＊１０－７ｃｍ２ｓ－１が、ＰＶＤＦ単体の場合（それぞれ４＊１０－４ｇ・ｍ－２秒－１および１．１＊１０－７ｃｍ２ｓ－１）と比べて有意に高いことによって裏付けられた（図４Ｅおよび図４Ｆ）。グルコースはメンブレンには吸収されなかった。グルコースの総濃度は経時的に変化しなかったからである。ＦＩＴＣ標識インスリンは、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでは、２４時間後には４７±２％のインスリンが拡散して平衡に達した。一方、これに比して、ＰＶＤＦメンブレンでは、同じ時点で２８±５％が拡散していた（図４Ｇ）。このインスリン拡散能は、ＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンでの流束１．９１＊１０－５ｇ・ｍ－２秒－１および拡散係数１．３１＊１０－８ｃｍ２ｓ－１が、ＰＶＤＦメンブレンの場合（それぞれ０．３５＊１０－５ｇ・ｍ－２秒－１および０．０８＊１０－８ｃｍ２ｓ－１）と比べて有意に高いことによって裏付けられた（図４Ｈおよび図４Ｉ）。ＩｇＧについては、１．６±０．７％だけがＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンを透過したが、ＰＶＤＦ単体メンブレンのレシーバーチャンバーでは検出されず、拡散は起こらないことが示唆された（図４Ｊ）。
【0090】
自由溶液（細胞培養培地）における酸素の輸送は、曲線下面積が同等であったので、ＰＶＤＦに基づくメンブレンデバイスとＰＶＤＦ／ＰＶＰに基づくメンブレンデバイスのどちらと比べても、有意に相違しなかった（図４Ｋおよび図４Ｌ）。
【0091】
ＰＶＤＦメンブレンの免疫防護機能
作製されたメンブレン（ＰＶＤＦおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰ）の免疫防護特性を評価するために、本発明者らは、特定のメンブレンで固定されたトランスウェルインサートの上部から下部へのマクロファージの遊走を評価した。ＳＥＭ像で示されるように（図５Ａ）、ＰＶＤＦおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンならびに０．４μｍの細孔を持つものの下部側では、マクロファージが検出されなかった。３および８μｍの細孔を持つメンブレンの下部側ではマクロファージが検出された。ただし、８μｍの細孔の場合にのみ、マクロファージは下部ウェルに完全に遊走することができた（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ヒトマクロファージの核は１μｍの細孔を通って遊走することができなかったが、それらの細孔は、細胞外環境を感知する細胞アンテナである糸状仮足の移動を可能とするには十分な大きさだった（図５Ａ）。
作製されたメンブレン（ＰＶＤＦおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰ）の免疫防護特性を評価するために、本発明者らは、特定のメンブレンで固定されたトランスウェルインサートの上部から下部へのマクロファージの遊走を評価した。ＳＥＭ像で示されるように（図５Ａ）、ＰＶＤＦおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰメンブレンならびに０．４μｍの細孔を持つものの下部側では、マクロファージが検出されなかった。３および８μｍの細孔を持つメンブレンの下部側ではマクロファージが検出された。ただし、８μｍの細孔の場合にのみ、マクロファージは下部ウェルに完全に遊走することができた（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ヒトマクロファージの核は１μｍの細孔を通って遊走することができなかったが、それらの細孔は、細胞外環境を感知する細胞アンテナである糸状仮足の移動を可能とするには十分な大きさだった（図５Ａ）。
【0092】
免疫防護封入デバイスの組立て
封入デバイスを組み立てるために、図６Ａに図解するように、２枚のメンブレンシートを、その間に支持リングを使って、高周波超音波溶着またはヒートシールで互いに溶着した。小さな一部分は、デバイス中に細胞を装填するためのインレットとして役立つように、溶着しなかった（図６Ｄ）。各デバイスを加圧気泡試験で漏出について検査した。溶着欠陥は、気泡の漏れを目視検査することによって検出した（補足図４Ｄ(Supplementary figure 4D)）。溶着欠陥を持つデバイスはその後の実験には使用しなかった。
封入デバイスを組み立てるために、図６Ａに図解するように、２枚のメンブレンシートを、その間に支持リングを使って、高周波超音波溶着またはヒートシールで互いに溶着した。小さな一部分は、デバイス中に細胞を装填するためのインレットとして役立つように、溶着しなかった（図６Ｄ）。各デバイスを加圧気泡試験で漏出について検査した。溶着欠陥は、気泡の漏れを目視検査することによって検出した（補足図４Ｄ(Supplementary figure 4D)）。溶着欠陥を持つデバイスはその後の実験には使用しなかった。
【0093】
封入デバイスの内側におけるヒト島の生存率および機能
ヒト島を閉じた免疫防護デバイスの内側で８日間培養することで、それらの生存率と島機能とを、それぞれｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色およびＧＳＩＳアッセイを使って評価した。対照と比較して、ＰＶＤＦデバイスおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰデバイスの内側で培養された島の間で、生存率に有意差は観察されなかった（図８Ａおよび図８Ｂ）。ＰＶＤＦ／ＰＶＰ封入デバイスの内側での８日間の培養後に９２±４％のヒト島が生存可能であった。対照条件では、島がグルコースレベルの変化に応答して、８日間後に高グルコース条件下でのインスリン放出を増加させ、刺激指数は２．３±０．４だった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。高グルコース条件時のインスリン分泌の増加が、ＰＶＤＦ／ＰＶＰデバイスにおいて観察された（図８Ｃ）。ＰＶＤＦ／ＰＶＰデバイスの刺激指数はＰＶＤＦデバイスの刺激指数より有意に高く、それぞれ３．２±０．７と１．３±０．２だった（図８Ｄ）。
ヒト島を閉じた免疫防護デバイスの内側で８日間培養することで、それらの生存率と島機能とを、それぞれｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色およびＧＳＩＳアッセイを使って評価した。対照と比較して、ＰＶＤＦデバイスおよびＰＶＤＦ／ＰＶＰデバイスの内側で培養された島の間で、生存率に有意差は観察されなかった（図８Ａおよび図８Ｂ）。ＰＶＤＦ／ＰＶＰ封入デバイスの内側での８日間の培養後に９２±４％のヒト島が生存可能であった。対照条件では、島がグルコースレベルの変化に応答して、８日間後に高グルコース条件下でのインスリン放出を増加させ、刺激指数は２．３±０．４だった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。高グルコース条件時のインスリン分泌の増加が、ＰＶＤＦ／ＰＶＰデバイスにおいて観察された（図８Ｃ）。ＰＶＤＦ／ＰＶＰデバイスの刺激指数はＰＶＤＦデバイスの刺激指数より有意に高く、それぞれ３．２±０．７と１．３±０．２だった（図８Ｄ）。
【0094】
実施例２
より良い細胞分布のためのメッシュ（８０ｕｍ）の使用
膵臓ベータ細胞クラスターをメッシュの存在下または非存在下で成長させた。メッシュがない条件では、すべての細胞凝集体が互いに近接しあい、培養期間を延ばすと、それがさらなる細胞凝集体をもたらすことを観察することができる。メッシュがある条件では、細胞凝集体がより分散していることを観察することができる。これは、培養期間を延ばしたときに、細胞凝集体が集まってクラスター形成することを防止するためだろう。メッシュはクラスター形成を防ぐために細胞の分布を強化すると結論する。結果を図１２に図示する。画像は同じ倍率で作成され、同じ濃度の凝集体が同じ培養面積に播種された。
より良い細胞分布のためのメッシュ（８０ｕｍ）の使用
膵臓ベータ細胞クラスターをメッシュの存在下または非存在下で成長させた。メッシュがない条件では、すべての細胞凝集体が互いに近接しあい、培養期間を延ばすと、それがさらなる細胞凝集体をもたらすことを観察することができる。メッシュがある条件では、細胞凝集体がより分散していることを観察することができる。これは、培養期間を延ばしたときに、細胞凝集体が集まってクラスター形成することを防止するためだろう。メッシュはクラスター形成を防ぐために細胞の分布を強化すると結論する。結果を図１２に図示する。画像は同じ倍率で作成され、同じ濃度の凝集体が同じ培養面積に播種された。
【0095】
封入デバイスにおける試験
閉じた封入デバイスの内側に置いた場合のメッシュの効果は、ペトリ皿実験（上記参照）と比較して、類似する結果をもたらす。メッシュを持たないデバイスでは、細胞凝集体が互いに近接する（円参照）。メッシュを持つデバイスでは、細胞クラスターがデバイスの内側により均等に分布し、クラスター形成は少ない。メッシュの使用は、デバイスの内側でのより良い細胞凝集体分布にとって有益であることができると結論する。結果を図１３に図示する。画像は同じ倍率で作成され、同じ濃度の凝集体が同じ培養面積に播種された。
閉じた封入デバイスの内側に置いた場合のメッシュの効果は、ペトリ皿実験（上記参照）と比較して、類似する結果をもたらす。メッシュを持たないデバイスでは、細胞凝集体が互いに近接する（円参照）。メッシュを持つデバイスでは、細胞クラスターがデバイスの内側により均等に分布し、クラスター形成は少ない。メッシュの使用は、デバイスの内側でのより良い細胞凝集体分布にとって有益であることができると結論する。結果を図１３に図示する。画像は同じ倍率で作成され、同じ濃度の凝集体が同じ培養面積に播種された。
【0096】
閉じた封入デバイスの内側での７日間の培養後の細胞クラスターの生存率
クラスターを形成した細胞（アルファ－ＴＣ細胞およびｈＭＳＣ）はどちらも、閉じた封入デバイスの内側での７日間の培養後に、生存可能なままだった。生存率レベルは、封入デバイスの内側で培養されなかった細胞凝集体と同等だった。封入デバイスは、ランゲルハンス島を生きた状態に保つのに役立ちうるだけでなく、さまざまな細胞タイプを閉じた封入デバイスの内側で細胞クラスターの生存率に影響を及ぼすことなく培養することが可能であると、結論することができる。結果を図１４および図１５に図示する。
クラスターを形成した細胞（アルファ－ＴＣ細胞およびｈＭＳＣ）はどちらも、閉じた封入デバイスの内側での７日間の培養後に、生存可能なままだった。生存率レベルは、封入デバイスの内側で培養されなかった細胞凝集体と同等だった。封入デバイスは、ランゲルハンス島を生きた状態に保つのに役立ちうるだけでなく、さまざまな細胞タイプを閉じた封入デバイスの内側で細胞クラスターの生存率に影響を及ぼすことなく培養することが可能であると、結論することができる。結果を図１４および図１５に図示する。
【0097】
実施例３－さまざまなメッシュサイズ
参照実験１
目標：デバイスの内側での島の分布を観察する。
方法：
同等サイズのデバイスをメッシュありおよびメッシュなしで作った。使用したメッシュは４００μｍの細孔直径を有した。メッシュを、１つのメンブレンシートと支持構造物の間に置いた。およそ３，０００島当量（ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ：ＩＥＱ）を５００μＬの液量で、デバイス中に播種した。メッシュが入っているデバイスの場合：島細胞をメッシュの上に（島がメッシュの内側に捕捉された状態になりうるように）播種した。
観察：デバイスおよび細胞を図１６に図示する。
結論：デバイスの内側におけるこのメッシュの存在が島の分布を助けることはなかった。これは、拡大像に図示されているように、メッシュ構造が非常に開いていて、島が開口部から落ち、島が保持されることがないからである。
参照実験１
目標：デバイスの内側での島の分布を観察する。
方法：
同等サイズのデバイスをメッシュありおよびメッシュなしで作った。使用したメッシュは４００μｍの細孔直径を有した。メッシュを、１つのメンブレンシートと支持構造物の間に置いた。およそ３，０００島当量（ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ：ＩＥＱ）を５００μＬの液量で、デバイス中に播種した。メッシュが入っているデバイスの場合：島細胞をメッシュの上に（島がメッシュの内側に捕捉された状態になりうるように）播種した。
観察：デバイスおよび細胞を図１６に図示する。
結論：デバイスの内側におけるこのメッシュの存在が島の分布を助けることはなかった。これは、拡大像に図示されているように、メッシュ構造が非常に開いていて、島が開口部から落ち、島が保持されることがないからである。
【0098】
参照実験２
目標：約５０μｍメッシュを内側に持つ透明なデバイスを作製する。目的は、メッシュが、デバイスに播種された疑似島の凝集塊形成を防ぐのに役立つかどうか、および細孔は、疑似島が細孔から落ちるのを防止できるほど十分に小さいかどうかを検証することである。
方法：約５０μｍメッシュを使って２つのデバイスを作った。メッシュを、１つのメンブレンシートと支持構造物の間に置いた。およそ２，５００個の疑似島を５００μＬの液量で、デバイス中に播種した。メッシュが入っているデバイスの場合：島細胞をメッシュの上に（島がメッシュの内側に捕捉された状態になりうるように）播種した。
観察結果：デバイスおよび細胞を図１７に図示する。播種された疑似島はこの細孔からは落ちなかった。疑似島は表面上に均一には分布していなかった。
結論：播種された疑似島はメッシュから落ちなかった；これはおそらく、細孔直径が播種された疑似島の直径より小さかったからだろう。疑似島の分布は、メッシュがないデバイスと比較すると、メッシュがあるデバイスの方が良好だった。しかし、疑似島は互いに近接して定着する傾向があり、この細孔の内側には捕捉されなかった。したがって、互いに離れた状態を保ったのは、播種された細胞のうちの一部だけだった。より良い分布のためには、これよりわずかに大きい細孔が必要である。
目標：約５０μｍメッシュを内側に持つ透明なデバイスを作製する。目的は、メッシュが、デバイスに播種された疑似島の凝集塊形成を防ぐのに役立つかどうか、および細孔は、疑似島が細孔から落ちるのを防止できるほど十分に小さいかどうかを検証することである。
方法：約５０μｍメッシュを使って２つのデバイスを作った。メッシュを、１つのメンブレンシートと支持構造物の間に置いた。およそ２，５００個の疑似島を５００μＬの液量で、デバイス中に播種した。メッシュが入っているデバイスの場合：島細胞をメッシュの上に（島がメッシュの内側に捕捉された状態になりうるように）播種した。
観察結果：デバイスおよび細胞を図１７に図示する。播種された疑似島はこの細孔からは落ちなかった。疑似島は表面上に均一には分布していなかった。
結論：播種された疑似島はメッシュから落ちなかった；これはおそらく、細孔直径が播種された疑似島の直径より小さかったからだろう。疑似島の分布は、メッシュがないデバイスと比較すると、メッシュがあるデバイスの方が良好だった。しかし、疑似島は互いに近接して定着する傾向があり、この細孔の内側には捕捉されなかった。したがって、互いに離れた状態を保ったのは、播種された細胞のうちの一部だけだった。より良い分布のためには、これよりわずかに大きい細孔が必要である。
【0099】
実験３
目標：８０μｍメッシュを使ってウェルプレートにおける疑似島分布を評価し、浮遊対照と比較する。
目標：８０μｍメッシュを使ってウェルプレートにおける疑似島分布を評価し、浮遊対照と比較する。
【0100】
パート１：
方法：メッシュ（８０μｍの細孔）を６ウェルプレートに入れた。８０μｍの細孔を持つメッシュの上の疑似島の上に疑似島を播種する（Seed pseudo-islets on top of pseudo-islets on top of a mesh with 80 μm pores.）。疑似島はおよそ１５０μｍの直径を有する。備考：組織で処理していない６ウェルプレート（non tissue treated 6 well plates）を対照として使用した。
播種密度：
・Ｃ１：２ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｃ２：２ｍＬ中に３，０００個の凝集体
・Ｍ１：１ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｍ２：２ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｍ３：５ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｍ４：１．５ｍＬ中に３，０００個の凝集体
結果：対照における凝集体は自由に移動することができ、中央に集まろうとする。メッシュが存在すると、凝集体の一部はメッシュ構造の内側に捕捉され、凝集体の一部は依然として浮遊している。体積が大きいほどより多くの凝集体が浮遊して、メッシュ上のいくつかの領域に集中する結果になる。
方法：メッシュ（８０μｍの細孔）を６ウェルプレートに入れた。８０μｍの細孔を持つメッシュの上の疑似島の上に疑似島を播種する（Seed pseudo-islets on top of pseudo-islets on top of a mesh with 80 μm pores.）。疑似島はおよそ１５０μｍの直径を有する。備考：組織で処理していない６ウェルプレート（non tissue treated 6 well plates）を対照として使用した。
播種密度：
・Ｃ１：２ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｃ２：２ｍＬ中に３，０００個の凝集体
・Ｍ１：１ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｍ２：２ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｍ３：５ｍＬ中に１，０００個の凝集体
・Ｍ４：１．５ｍＬ中に３，０００個の凝集体
結果：対照における凝集体は自由に移動することができ、中央に集まろうとする。メッシュが存在すると、凝集体の一部はメッシュ構造の内側に捕捉され、凝集体の一部は依然として浮遊している。体積が大きいほどより多くの凝集体が浮遊して、メッシュ上のいくつかの領域に集中する結果になる。
【0101】
パート２：４日間の培養後に、疑似島の生存能を可視化するためにｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を行った。
観察および画像－結果を図１８に図示する。Ｃ１：多少大きなクラスターが見られ、それらは浮遊していた。クラスターの一部はウェルプレートに付着した。Ｃ２：クラスターの大半は浮遊しており、ウェルプレートに付着しなかった。生存率はわずかに低かった。クラスターはＣ１ほど丸くはなかった。Ｍ１：クラスターの大半はメッシュに付着し、分散した。メッシュの下に移動した凝集体はほんのわずかだった。Ｍ２：クラスターの一部がメッシュの下に移動し、凝集し始めた。しかし、それらの大半は依然としてメッシュの上にあり、メッシュに付着して、メッシュによって分離されていた。Ｍ３：比較的多量のクラスターがメッシュの下に移動し、凝集し始めたが、大きなクラスターは形成されなかった。メッシュ上のクラスターは互いに離れた状態のままである。Ｍ４：比較的多量のクラスターがメッシュの下に移動し、凝集し始めたが、大きなクラスターは形成されなかった。メッシュ上のクラスターは互いに離れた状態のままである。
結論：対照条件では疑似島が４日間の培養期間で合体し、その結果、大きなクラスターが形成された（Ｃ１およびＣ２）。メッシュ条件では疑似島がその場にとどまり、大きなクラスターを形成しなかった。生存率は高いままだったので、メッシュは封入された疑似島の生存率に影響しなかった。したがってメッシュは、疑似島を互いに離れた状態に保つことにおいて、正の効果を示した。
観察および画像－結果を図１８に図示する。Ｃ１：多少大きなクラスターが見られ、それらは浮遊していた。クラスターの一部はウェルプレートに付着した。Ｃ２：クラスターの大半は浮遊しており、ウェルプレートに付着しなかった。生存率はわずかに低かった。クラスターはＣ１ほど丸くはなかった。Ｍ１：クラスターの大半はメッシュに付着し、分散した。メッシュの下に移動した凝集体はほんのわずかだった。Ｍ２：クラスターの一部がメッシュの下に移動し、凝集し始めた。しかし、それらの大半は依然としてメッシュの上にあり、メッシュに付着して、メッシュによって分離されていた。Ｍ３：比較的多量のクラスターがメッシュの下に移動し、凝集し始めたが、大きなクラスターは形成されなかった。メッシュ上のクラスターは互いに離れた状態のままである。Ｍ４：比較的多量のクラスターがメッシュの下に移動し、凝集し始めたが、大きなクラスターは形成されなかった。メッシュ上のクラスターは互いに離れた状態のままである。
結論：対照条件では疑似島が４日間の培養期間で合体し、その結果、大きなクラスターが形成された（Ｃ１およびＣ２）。メッシュ条件では疑似島がその場にとどまり、大きなクラスターを形成しなかった。生存率は高いままだったので、メッシュは封入された疑似島の生存率に影響しなかった。したがってメッシュは、疑似島を互いに離れた状態に保つことにおいて、正の効果を示した。
【0102】
本実施例における実験から、メッシュサイズは４００μｍ未満、例えば３５０、３００、２５０、２００もしくは１５０μｍ、またはそれ未満であることが好ましいと結論することができる。さらに、メッシュサイズは、５０μｍ超、例えば６０、７０、７５もしくは８０μｍ、またはそれ以上であることが好ましいと結論することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【国際調査報告】