特表 2025-500508 肝臓標的物質及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】肝臓標的物質及びその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20241226BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241226BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 3/08 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241226BHJP

   C07K 14/605 20060101ALN20241226BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20241226BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

A61P1/16

A61K47/68

A61P3/10

A61P3/08

A61K39/395 Y

A61K39/395 C

A61K39/395 D

C07K14/605 ZNA

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538418

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(85)【翻訳文提出日】2024-06-24

(86)【国際出願番号】 KR2022021129

(87)【国際公開番号】W WO2023121370

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】10-2021-0185351

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515022445

【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】キム ジュン クク

(72)【発明者】

【氏名】リー ジョン スク

(72)【発明者】

【氏名】チョイ ジェ ヒョク

(72)【発明者】

【氏名】リー ジョン ミン

(72)【発明者】

【氏名】キム サン ユン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB02

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB27

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC16

4C076CC21

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA19

4C084BA23

4C084CA59

4C084MA05

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA10

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZC211

4C084ZC212

4C084ZC351

4C084ZC352

4C085AA13

4C085BB42

4C085CC22

4C085EE05

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA18

4H045BA40

4H045BA57

4H045CA40

4H045DA30

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、肝臓標的薬物及びその肝臓における薬物作用が必要な疾患に対する治療的用途に関する。また、本発明は、グルカゴンに対して活性を有する物質を用いて肝組織への標的化又は体内投与後に肝組織における分布増大を誘導する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝臓標的薬物を含む、投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い、薬学的組成物であって、
前記肝臓標的薬物は、下記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドである、薬学的組成物：
Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｙ－Ｌ－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ａ－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｖ－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｍ－Ｎ－Ｔ－Ｘ３０（一般式２、配列番号：４７）
前記一般式２において
Ｘ７はスレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１２はリシン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）であり；
Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）又はリシン（Ｋ）であり；
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ２４はバリン（Ｖ）又はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、存在しない
（ただし、前記一般式２のアミノ酸配列が配列番号１２と同一な場合は除く）。

【請求項2】

前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式１で示される、請求項１に記載の薬学的組成物：
［化学式１］
Ｘ－Ｌ－Ｆ
ここで、
Ｘは、前記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－は、ＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合連結を示す。

【請求項3】

前記体内臓器は、肝臓、心臓、肺、大腸、脾臓、すい臓、脂肪組織、小腸、胃、筋肉、腎臓及び脳であり、前記各臓器中、肝臓における分布度が最も高いものである、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記薬学的組成物は、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療に使用するための、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肝臓におけるＴ／Ｓ比率（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｏ－ｓｅｒｕｍ ｒａｔｉｏ）が下記から選択された一つ以上である、請求項１又は２に記載の薬学的組成物：
（ａ）投与後４０時間～５０時間でＴ／Ｓ比率が２０％～４０％；及び
（ｂ）投与後１６０時間～１８０時間でＴ／Ｓ比率が２５％～４０％。

【請求項6】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肝臓におけるＴ／Ｓ比率が下記から選択された一つ以上である、請求項５に記載の薬学的組成物：
（ａ）投与後２日でＴ／Ｓ比率が２５％～３５％；及び
（ｂ）投与後７日でＴ／Ｓ比率が２７％～３７％。

【請求項7】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比が１：２～４である、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比が１：２．２～３．２である、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記分布比は、投与後４０時間～１８０時間における分布比である、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記分布比は、投与後２日～７日における分布比である、請求項８に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記肝臓標的薬物は、
（ａ）投与後４０時間～５０時間で心臓に比べた肝臓における分布比が１：１．６～３．０であり；及び
（ｂ）投与後１６０時間～１８０時間で心臓に比べた肝臓における分布比が１：２．８～７．０である、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記肝臓標的薬物は、肝臓疾患、低血糖又は先天性高インスリン症に治療的活性を有する、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記肝臓における薬物作用が必要な疾患は、肝臓疾患、低血糖又は先天性高インスリン症である、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記低血糖は、急性低血糖又は慢性低血糖である、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

一般式２のＸ１６とＸ２０のアミノ酸間に環を形成する、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記ペプチドは、配列番号１３、１５、１９、３３、及び３６～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

前記ペプチドは、配列番号３３、及び３６～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

前記ペプチドは、そのＣ末端がアミド化するか、又は遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項19】

前記ペプチドは、そのＣ末端がアミド化された、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項20】

前記ペプチドのＣ末端は、変形されていない、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項21】

前記Ｌは、ポリエチレングリコールである、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項22】

前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項23】

前記Ｆは、ＩｇＧ Ｆｃ領域である、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項24】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれを必要とする個体に投与し、前記肝臓標的薬物の肝臓標的化を誘導する方法。

【請求項25】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれを必要とする個体に投与し、肝組織内で前記肝臓標的薬物の分布増大を誘導する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝臓標的薬物及びその肝臓における薬物作用が必要な疾患に対する治療的用途に関する。また、本発明は、肝臓標的薬物を用いて肝組織への標的化又は体内投与後に肝組織における分布増大を誘導する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肝臓は、人間の身体で最も大きい臓器の一つであり、多様で総括的な代謝過程で重要な役割を担当する。人間が摂取する多くの植物性あるいは動物性物質、そして生体機能遂行による代謝産物中には身体に有益なものもあるが、害になる物質も多い。肝臓は、このような物質中、有益なものに対しては正しい生体利用を助ける化学的過程を行い、害になる物質に対しては化学的代謝過程を通じて尿や便を通じて安全に体外に排出されるように助ける。肝臓は、人間の身体に必要な数種のタンパク質、脂肪、炭水化物を合成して分泌させることにより生体機能に必須の役割をする。従って、肝機能が悪くなると、種々の機能異常が現われることができる。血液の凝固に関与する凝固因子の生成が不足すると、出血がよく起こり、弱い歯茎などで頻繁な出血が現れ、肝硬変症患者の場合、インスリン分解がうまくいかず、肝臓のグリコーゲン貯蔵量も不足して空腹による低血糖がもたらされたりする。また、肝臓は、細菌侵入に対する防御作用に中枢的な役割もする。特に、肝臓内の細胞中、クッパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞が主に異質物あるいはバクテリアを捕食する大食作用をし、体内に入ってきたウイルスを免疫体系に露出させて体内の自然な免疫作用を誘導する役割もする。また、肝細胞で合成して分泌する主な物質である胆汁は、一日に約８００－１０００ｃｃ程度形成されるが、主成分は、水、電解質、胆汁酸、コレステロール、リン脂質、ビリルビンで構成されている。胆汁の主な機能を見ると、胆汁内の胆汁酸は、小腸で脂肪と脂溶性ビタミンを消化して吸収するのに重要な役割をし、胆汁自体が体内で生産される多くの老廃物を糞便として排泄する役割をする。多様な原因により引き起こされ、肝臓における薬物作用が必要な疾患として肝疾患、低血糖又は先天性高インスリン症など多様な疾患が存在する。

【0003】

一方、上述の肝疾患を治療するために、薬物を高濃度で肝臓に到達して分布させることは重要な技術的課題の一つである（韓国特許公開番号ＫＲ１０－２０１３－０１３１２２７）。

【0004】

肝臓標的薬物は、既存の医薬品の副作用を最小化し、効能及び効果を最大化させて必要な量の薬物を効率よく伝達できるようにして薬物治療を最適化することができる。これは、目的部位に到達する薬物の量を高めて生体利用率を高め、より効果的な治療を可能にし、目的部位以外の所に伝達されないようにして副作用を減らすことができ、患者の薬物に対する反応を良くして患者の順応度の増進に大きい役割をする。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国特許公開番号ＫＲ１０－２０１３－０１３１２２７

【特許文献2】国際公開特許ＷＯ ２０１６／１０８５８６

【特許文献3】国際公開特許ＷＯ ２０１７／００３１９１

【特許文献4】国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号

【特許文献5】国際特許公開第９６／３２４７８号

【特許文献6】国際公開特許ＷＯ ２０２０／２６３０６３

【特許文献7】国際公開特許ＷＯ２００７／０２１１２９

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４

【非特許文献2】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７

【非特許文献3】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３

【非特許文献4】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４）

【非特許文献5】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）

【非特許文献6】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４

【非特許文献7】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３

【非特許文献8】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２

【非特許文献9】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８（１９７９）

【非特許文献10】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５

【非特許文献11】Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

肝臓における薬物作用が必要な疾患の治療効果を高めるために、治療効果を有しながらも投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い優れた肝臓標的薬剤の開発が求められる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の一つの目的は、肝臓標的薬物を含む薬学的組成物、具体的には、肝臓標的薬物を含む投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い薬学的組成物を提供することにある。

【0009】

本発明のもう一つの目的は、肝臓標的薬物を含む薬学的組成物、具体的には、肝臓標的薬物を含む肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

【0010】

本発明の他の目的は、前記薬学的組成物又は肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療方法を提供することにある。

【0011】

本発明の他の目的は、前記肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療用薬剤の製造に使用するための、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質の用途を提供することにある。

【0012】

本発明の他の目的は、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与して肝臓標的化を誘導する方法を提供することにある。

【0013】

本発明の他の目的は、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与して肝組織内で前記生理活性物質の分布増大を誘導する方法を提供することにある。

【発明の効果】

【0014】

肝細胞の受容体と結合する物質を含む本発明の薬物（例、生理活性タンパク質あるいはペプチド誘導体）は、血管から肝組織に、より効果的に到達し、生体内投与後、体内臓器中、肝臓に相対的に多く分布する生理活性物質、具体的には、グルカゴン受容体と結合力を有することにより、肝組織に相対的に多く分布する生理活性物質として提供されるだけでなく、約７日以内にも肝臓における分布度が高く、患者の投薬に対する不便を減少させながら、肝臓疾患、低血糖、又は先天性高インスリン症などをはじめとする肝臓における薬物作用が必要な疾患などの治療に適用することができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明を具現する一態様は、肝臓標的薬物を含む薬学的組成物、具体的には、投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い、薬学的組成物である。一つの具体例として、前記肝臓標的薬物は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチド又はそれを含む持続型結合体の形態であることを特徴とする。もう一つの具体例として、前記肝臓標的薬物は、下記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチド又はそれを含む持続型結合体の形態であることを特徴とする。

【0016】

一つの具体例として、前記肝臓標的薬物は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする：

【0017】

Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１、配列番号：４６）、

【0018】

前記式において、
Ｘ１はヒスチジン（Ｈ）、デスアミノ－ヒスチジル（ｄｅｓａｍｉｎｏ－ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、ジメチル－ヒスチジル（Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、ベータ－ヒドロキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ－ｈｙｄｒｏｘｙ ｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）、４－イミダゾアセチル（４－ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ）、ベータ－カルボキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ－ｃａｒｂｏｘｙ ｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）であるか、存在せず；
Ｘ２はアルファ－メチル－グルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ａｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ－アラニン、グリシン（Ｇ）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、セリン（Ｓ）又はＤ－セリンであり；
Ｘ７はスレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１２はリシン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１３はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、又はシステイン（Ｃ）であるか、存在せず；
Ｘ１７はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、又はバリン（Ｖ）であるか、存在せず；
Ｘ１８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、又はシステイン（Ｃ）であるか、存在せず；
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、又はシステイン（Ｃ）であるか、存在せず；
Ｘ２０はリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、又はシステイン（Ｃ）であるか、存在せず；
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、又はシステイン（Ｃ）であるか、存在せず；
Ｘ２３はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、又はアルギニン（Ｒ）であるか、存在せず；
Ｘ２４はバリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、又はロイシン（Ｌ）であるか、存在せず；
Ｘ２７はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、又はアルギニン（Ｒ）であるか、存在せず；
Ｘ２８はグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、又はアルギニン（Ｒ）であるか、存在せず；
Ｘ２９はリシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はスレオニン（Ｔ）であるか、存在せず；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、存在しない。

【0019】

本発明を具現する一態様は、肝臓標的薬物を含む、投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い薬学的組成物である。一つの具体例として、前記肝臓標的薬物は、下記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする：

【0020】

Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｙ－Ｌ－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ａ－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｖ－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｍ－Ｎ－Ｔ－Ｘ３０（一般式２、配列番号：４７）

【0021】

前記一般式２において
Ｘ７はスレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１２はリシン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）であり；
Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）又はリシン（Ｋ）であり；
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ２４はバリン（Ｖ）又はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、存在しない
（ただし、前記一般式２のアミノ酸配列が配列番号１２と同一な場合は除く）。

【0022】

他の具体例として、前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式１で示される、薬学的組成物であることを特徴とする：

【0023】

［化学式１］
Ｘ－Ｌ－Ｆ

【0024】

ここで、
Ｘは、前記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－は、ＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合連結を示す。

【0025】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記体内臓器は、肝臓、心臓、肺、大腸、脾臓、すい臓、脂肪組織、小腸、胃、筋肉、腎臓及び脳であり、前記各臓器中、肝臓における分布度が最も高いことを特徴とする。

【0026】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記組成物は、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療に使用するためのものであることを特徴とする。

【0027】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、投与後の肝臓におけるＴ／Ｓ比率（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｏ－ｓｅｒｕｍ ｒａｔｉｏ）が下記から選択された一つ以上であることを特徴とする：（ａ）投与後の約４０時間～約５０時間でＴ／Ｓ比率が約２０％～約４０％；及び（ｂ）投与後の約１６０時間～約１８０時間でＴ／Ｓ比率が約２５％～約４０％。

【0028】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、投与後の肝臓におけるＴ／Ｓ比率が下記から選択された一つ以上であることを特徴とする：：（ａ）投与後の約２日でＴ／Ｓ比率が約２５％～約３５％；及び（ｃ）投与後の約７日でＴ／Ｓ比率が約２７％～約３５％。

【0029】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比が１：約２～約４であることを特徴とする。

【0030】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比が１：約２．２～約３．２であることを特徴とする。

【0031】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比は、投与後の約４０時間～約１８０時間における分布比であることを特徴とする。

【0032】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比は、投与後の約２日～約７日間における分布比であることを特徴とする。

【0033】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、（ａ）投与後４０時間～５０時間で心臓に比べた肝臓における分布比が１：１．６～３．０であり；及び（ｂ）投与後１６０時間～１８０時間で心臓に比べた肝臓における分布比が１：２．８～７であることを特徴とする。

【0034】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、投与後、体内臓器中、肝臓に相対的に多く分布するペプチド又はそれを含む持続型結合体の形態であることを特徴とする。

【0035】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、肝臓における薬物作用が必要な疾患に治療的活性を有することを特徴とする。

【0036】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓における薬物作用が必要な疾患は、肝臓疾患、低血糖又は先天性高インスリン症であることを特徴とする。

【0037】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記低血糖は急性低血糖又は慢性低血糖であることを特徴とする。

【0038】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記肝臓標的薬物は、グルカゴン受容体に対して結合力を有するペプチドの配列を含むタンパク質あるいはペプチドであることを特徴とする。

【0039】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記一般式２のＸ１６とＸ２０のアミノ酸間に環を形成することを特徴とする。

【0040】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号１３、１５、１９、３３、及び３６～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0041】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号３３、及び３６～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0042】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４のいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0043】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４のいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0044】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記一般式１のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対中、少なくとも一つのアミノ酸対のアミノ酸のそれぞれが環を形成できるグルタミン酸又はリシンで置換されたことを特徴とする。

【0045】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｘ１２とＸ１６のアミノ酸対、Ｘ１６とＸ２０のアミノ酸対、又はＸ１７とＸ２１のアミノ酸対のアミノ酸のそれぞれが環を形成できるグルタミン酸又はリシンで置換されたことを特徴とする。

【0046】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記一般式１において、Ｘ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対中、少なくとも一つのアミノ酸対においてそれぞれのアミノ酸間に環を形成することを特徴とする。

【0047】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記ペプチドは、配列番号：１～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0048】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記ペプチドは、そのＣ末端がアミド化するか、又は遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有することを特徴とする。

【0049】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記ペプチドのＣ末端がアミド化したことを特徴とする。

【0050】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記ペプチドのＣ末端は変形されていないことを特徴とする。

【0051】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にあることを特徴とする。

【0052】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記化学式１の構造は、下記化学式３の構造であることを特徴とする：

【0053】

［化学式３］

【0054】

ここで、Ｘ及びＦは、化学式１で定義した通りである。

【0055】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記エチレングリコール繰り返し単位は［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎであり、ｎは自然数で、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａになるように定められることを特徴とする。

【0056】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１０ｋＤａになるように定められることを特徴とする。

【0057】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記Ｌはポリエチレングリコールであることを特徴とする。

【0058】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｘはペプチド内のシステインの硫黄原子を通じて連結されたことを特徴とする。

【0059】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記ＦはＩｇＧ Ｆｃ領域であることを特徴とする。

【0060】

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４由来であることを特徴とする。

【0061】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｆは２個のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を通じてのみ連結されたことを特徴とする。

【0062】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｆは配列番号７０のアミノ酸配列であるモノマーを含むことを特徴とする。

【0063】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｆは配列番号７０のアミノ酸配列であるモノマーのホモ二量体であることを特徴とする。

【0064】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記Ｆは配列番号７１のアミノ酸配列を含むホモ二量体であることを特徴とする。

【0065】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記ＦはそのＮ末端プロリンの窒素原子を通じて連結されたことを特徴とする。

【0066】

前述した具体例のいずれか一つによる組成物として、前記免疫グロブリンＦｃ領域であるＦとＸが糖鎖化されていないことを特徴とする。

【0067】

本発明を具現する他の一態様は、肝組織に標的化された生理活性物質、具体的には、肝臓に存在する受容体と結合力を有する物質を含み、肝組織に標的化された生理活性物質である。

【0068】

本発明を具現する他の一態様は、前記薬学的組成物又は肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療方法である。

【0069】

本発明を具現する他の一態様は、前記肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療用薬剤の製造に使用するための、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質の用途である。

【0070】

本発明を具現する他の一態様は、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与して肝臓標的化を誘導する方法である。

【0071】

本発明を具現する他の一態様は、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与して肝組織内で前記生理活性物質の分布増大を誘導する方法を提供することである。

【0072】

本発明を行うための具体的な内容を説明すると、次の通りである。一方、本願において開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本願において開示された多様な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは見られない。

【0073】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定の様態に対する多数の等価物を認知又は確認することができる。また、このような等価物は、本発明に含まれることが意図される。本明細書に記載された文献は、全体が参照として本願に組み込まれることができる。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本出願が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【0074】

本明細書全体を通じて、天然に存在するアミノ酸に対する通常の一文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソブチル酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、アルファ－メチル－グルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）などのような他のアミノ酸について一般的に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書で略語として言及されたアミノ酸はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法により記載された。

【0075】

アラニンＡｌａ、Ａ アルギニンＡｒｇ、Ｒ
アスパラギンＡｓｎ、Ｎ アスパラギン酸Ａｓｐ、Ｄ
システインＣｙｓ、Ｃ グルタミン酸Ｇｌｕ、Ｅ
グルタミンＧｌｎ、Ｑ グリシンＧｌｙ、Ｇ
ヒスチジンＨｉｓ、Ｈ イソロイシンＩｌｅ、Ｉ
ロイシンＬｅｕ、Ｌ リシンＬｙｓ、Ｋ
メチオニンＭｅｔ、Ｍ フェニルアラニンＰｈｅ、Ｆ
プロリンＰｒｏ、Ｐ セリンＳｅｒ、Ｓ
スレオニンＴｈｒ、Ｔ トリプトファンＴｒｐ、Ｗ
チロシンＴｙｒ、Ｙ バリンＶａｌ、Ｖ

【0076】

本明細書において「Ａｉｂ」は、「２－アミノイソブチル酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）」又は「アミノイソブチル酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）」と混用されてもよく、２－アミノイソブチル酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）とアミノイソブチル酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）は、混用されてもよい。

【0077】

本発明を具現するための一態様は、肝臓標的薬物を含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。具体的には、本発明を具現するための一態様は、肝臓標的薬物を含む、投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い、薬学的組成物に関する。

【0078】

体内臓器中、肝臓における分布度が高いということは、肝臓、心臓、肺、大腸、脾臓、すい臓、脂肪組織、小腸、胃、筋肉、腎臓及び脳からなる体内臓器中、肝臓標的薬物が体内に投与された後、肝臓標的薬物の分布が肝臓で最も高いことを意味するが、これに制限されない。

【0079】

前記薬学的組成物は、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療に使用するための薬学的組成物であってもよい。

【0080】

本出願において用語、「肝臓標的薬物」とは、肝組織に標的化され得る薬物を意味する。肝組織に標的化とは、前記薬物が投与された後、他の臓器に比べて肝臓における分布が高いことを意味するが、これに制限されない。前記肝臓標的薬物は、肝臓における薬物作用が必要な疾患に対する治療的活性を有する。

【0081】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肝臓におけるＴ／Ｓ比率（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｏ－ｓｅｒｕｍ ｒａｔｉｏ）が下記から選択された一つ以上であってもよいが、それに制限されない：（ａ）投与後の約４０時間～約５０時間でＴ／Ｓ比率が約２０％～約４０％、約２４％～約４０％、約２５％～約４０％、約２５％～約３８％、約２５％～約３５％、約２５％～約３４％、約２５％～約３３％、約２６％～約３３％、約２６％～約３２％、約２７％～約３２％、約２８％～約３２％、約２９％～約３１％、又は約２９．５％～約３０．５％；及び（ｂ）投与後の約１６０時間～約１８０時間でＴ／Ｓ比率が約２５％～約４０％、約２６％～約３８％、約２７％～約３５％、約２７％～約３４％、約２７％～約３３％、約２８％～約３３％、約２９％～約３３％、約２９％～約３２％、約３０％～約３２％、又は約３０．５％～約３１．５％。前記特徴は、（ａ）又は（ｂ）から選択された１個以上、又は２個の両方であってもよいが、これに制限されない。

【0082】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肝臓におけるＴ／Ｓ比率が下記から選択された一つ以上であってもよいが、それに制限されない：（ａ）投与後の約２日でＴ／Ｓ比率が約２５％～約３５％、約２６％～約３４％、約２７％～約３３％、約２８％～約３２％、約２９％～約３１％、約２９．５％～約３０．５％、又は約２９．８％；及び（ｃ）投与後の約７日でＴ／Ｓ比率が約２７％～約３５％、約２７％～約３４％、約２８％～約３３％、約２９％～約３２％、約３０％～約３１．５％、又は約３１％。前記特徴は、（ａ）、又は（ｂ）から選択された１個以上、又は２個の両方であってもよいが、これに制限されない。

【0083】

Ｔ／Ｓ比率（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｏ－ｓｅｒｕｍ ｒａｔｉｏ）は、組織対血清の濃度割合であり、％で換算され、公知の方法を通じて測定することができる。その例として、Ｔ／Ｓ比率（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｏ－ｓｅｒｕｍ ｒａｔｉｏ）、Ｔ／Ｓ ｒａｔｉｏ（％）は、組織濃度／血清濃度×１００で計算される。濃度測定は、臓器を摘出した後、ＥＬＩＳＡ方法などにより物質濃度を測定する。

【0084】

Ｔ／Ｓ比率が高いほど前記組織で投与された物質が低いＴ／Ｓ比率を有する組織に比べて分布が高いことを意味する。一般に、薬物が体内に投与される場合、薬物の分布度が多い臓器が肺及び心臓であるところ、肺組織及び心臓組織における分布度を肝組織と比較し、肺組織及び心臓組織に比べて肝組織における分布が多くなると、これは、本発明の肝臓標的薬物が効果的に肝組織に標的化されることを意味する。それ以外にも肝臓標的薬物が効果的に肝組織に標的化するということを確認できるＴ／Ｓ比率を測定し、肝組織のＴ／Ｓ比率と比較できる組織は、制限なく含まれ得る。

【0085】

前記肝臓標的薬物は、投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比が１：約２～約４．０、１：約２～約３．５、１：約２．１～約３．４、１：約２．２～３．２、１：約２．２～約３．３、１：約２．３～約３．２、１：約２．４～約３．２、１：約２．４～約３．１、１：約２．４～約３．０、１：約２．５～約２．９５、１：約２．５～２．９、１：２．５５～約２．８７、１：又は２．６～２．９、１：約２．５～３．９であってもよいが、これに制限されない。

【0086】

前記分布比は、Ｔ／Ｓ（％）を基に測定することができ、肺のＴ／Ｓ（％）を基準である１とすると、肝臓におけるＴ／Ｓ（％）がどのような倍数であるかにより確認することができる。

【0087】

前記投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比は、投与後の約４０時間～約１８０時間、約４５時間～約１７０時間、又は約２日～約７日であってもよいが、これに制限されない。

【0088】

前記投与後の肺組織に比べた肝臓における分布比は、投与後の約２日で１：約２．４～約２．７、１：約２．４～約２．７、１：約２．５～約２．６、又は１：約２．５～３．７、約７日で１：約２．５～３、１：約２．７～約３、１：約２．８～約３．０、１：約２．８～約２．９、又は１：約２．８～約３．９の分布比であってもよいが、これに制限されない。

【0089】

前記投与後に心臓に比べた肝臓における分布比は、（ａ）投与後の約４０時間～約５０時間で心臓に比べた肝臓における分布比が１：約１．６～約３．０であり；及び（ｂ）投与後の約１６０時間～約１８０時間で心臓に比べた肝臓における分布比が１：約２．８～約７．０であってもよいが、これに制限されない。

【0090】

前記投与後に心臓に比べた肝臓における分布比は、（（ａ）投与後の約４０時間～約５０時間、約４５時間～約５０時間、又は約２日で心臓に比べた肝臓における分布比が１：約１．６～３．０、１：約１．６～２．５、１：約１．６～約２．２、１：約１．７～約２．１、１：約１．７～約２．０、１：約１．８～２．０、１：約１．８～２．０、１：約１．８９～２．０、１：約１．８～２．０、又は１：約１．８～２．９であり；及び（ｂ）投与後の約１６０時間～約１８０時間、約１６０時間～約１８０時間、又は約７日で心臓に比べた肝臓における分布比が１：約２．８～約４、１：約２．９～約３．８、１：約３．０～約３．８、１：約３．０～約３．６、１：約３．０～約３．５、１：約３．０～約３．４、１：約３．１～約３．４、１：約３．２～約３．４、１：約３．２～約３．３、１：約２．８～約７．０、又は１：約３．３～約６．６であってもよいが、これに制限されない。

【0091】

前記分布比は、Ｔ／Ｓ（％）を基に測定することができ、心臓のＴ／Ｓ（％）を基準である１とする時、肝臓におけるＴ／Ｓ（％）がどのような倍数であるかにより確認することができる。

【0092】

本出願において用語、「約」は±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、±０．０５などを全て含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに制限されない。

【0093】

前記肝臓標的薬物は、肝組織に標的化され得る物質を含むことができる。具体的には、前記肝臓標的薬物は、肝臓標的化を誘導できるグルカゴン又はその誘導体を含むペプチドあるいはタンパク質であり、グルカゴン受容体に対して活性を有するペプチド配列を含むものであってもよい。その例として、前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチド又はそれを含む持続型結合体の形態、又は前記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチド又はそれを含む持続型結合体の形態であってもよいが、これに制限されない。前記ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性を有するペプチドであり、具体的には、グルカゴン誘導体であってもよいが、これに制限されない。

【0094】

一方、本発明において肝臓標的薬物であるグルカゴン又はその誘導体は、当該薬物を動物の血液内に伝達した時に血液から肝臓に標的化できる程度にグルカゴン受容体に結合力を有することをいう。より具体的には、当該薬物を動物の血液内に伝達した後、少なくとも６時間、３０時間、少なくとも４８時間、又は少なくとも１６８時間で前記薬物の臓器分布比率を確認した時、心臓、肺、大腸、脾臓、すい臓、脂肪組織、小腸、胃、筋肉、腎臓、又は脳のような少なくとも一つの他の臓器に比べて肝臓に分布した比率が、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、又は約４０％以上高いことを意味するが、比較対象臓器に比べて分布比率が高い限り、特にこれに制限されない。

【0095】

前記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質は、グルカゴン受容体に対して有意なレベルの活性を有する多様な物質、例えば、化合物又はペプチド形態の物質を含む。

【0096】

特にこれに限定されるものではないが、前記グルカゴンに対して有意なレベルの活性を有する物質は天然型グルカゴンだけでなく、グルカゴン受容体に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が当該受容体の天然型リガンド（天然型グルカゴン）に比べて０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上を示すものであってもよい。

【0097】

このようなグルカゴン又はグルカゴン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法は、本願明細書の実験例１を参照することができるが、特にこれに限定されるものではない。

【0098】

前記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質の例として、天然型グルカゴン、そのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）、又はその誘導体があるが、特にこれに限定されるものであってもよい。

【0099】

本発明によるグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンと比較してアミノ酸配列に一つ以上の差があるペプチド、天然型グルカゴン配列を改質（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じて変形させたペプチド、天然型グルカゴンのようにグルカゴン受容体を活性化させる天然型グルカゴンの模倣体を含み、投与された個体の体内臓器中、前記ペプチドの肝臓における分布度が高ければ、本発明の範囲に属することができる。

【0100】

前記グルカゴン誘導体の種類として、国際公開特許ＷＯ ２０１６／１０８５８６及び国際公開特許ＷＯ ２０１７／００３１９１に記載された種類が挙げられ、前記国際公開特許の明細書全体は、本願に参考資料として全て含まれる。また、前記グルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体の製造方法はＷＯ ２０１７／００３１９１に記載されており、前記国際公開特許の明細書全体も本願に参考資料として含まれることは明らかである。

【0101】

このようなグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに対して変化したｐＩを有して改善された物性を示すものであってもよい。また、前記グルカゴン誘導体は、グルカゴン受容体を活性化させる活性を有しながら溶解度が改善されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0102】

また、前記グルカゴン誘導体は、非自然な（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。

【0103】

一方、天然型グルカゴンは、次のアミノ酸配列を有することができる：

【0104】

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号：１）

【0105】

本発明において用語「等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ）」又は「ｐＩ」とは、あるポリペプチドあるいはペプチドのような分子においてその全体純荷電（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）がなくなる（０）ｐＨ値を意味する。多様な荷電された官能基が存在するポリペプチドの場合、ｐＩにおいてこれら荷電の和はゼロである。ｐＩより高いｐＨにおいてポリペプチドの全体純荷電は陰性になるはずであり、ｐＩより低いｐＨ値においてポリペプチドの全体純荷電は陽性になるはずである。

【0106】

ｐＩは、ポリアクリルアミド、澱粉又はアガロースで構成される固定されたｐＨ勾配ゲル状で等電点電気泳動により、又は、例えば、ＥｘＰＡＳｙサーバーでｐＩ／ＭＷツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００３）を用いてアミノ酸配列からｐＩを推算することにより決定され得る。

【0107】

本発明において用語「変化したｐＩ」とは、天然グルカゴンのアミノ酸配列で一部の配列が負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基で置換されて天然グルカゴンのｐＩとは異なる、即ち、これより減少又は増加したｐＩを有することを意味する。このように変化したｐＩを有するペプチドは、グルカゴン誘導体として中性ｐＨで改善された溶解度及び／又は高い安定性を示すことができる。しかし、特にこれに限定されるものではない。

【0108】

その例として、前記グルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのｐＩ値（６．８）ではなく変化したｐＩ値を有するものであってもよく、６．８未満、６．７以下、６．５以下、また、６．８超過、７以上、７．５以上であってもよいが、これらに限定されるものではなく、天然型グルカゴンと相違するｐＩ値を有すれば、本発明の範疇に含まれる。特に、天然型グルカゴンと相違するｐＩ値を有することにより、天然型グルカゴンに比べて中性ｐＨで改善された溶解度を示すことで凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）される程度が低ければ、本発明の範疇に含まれてもよいが、これに制限されない。

【0109】

その例として、４～６．５及び／又は７～９．５、７．５～９．５、８．０～９．３のｐＩ値を有するものであってもよいが、これに制限されない。この場合、天然型グルカゴンに比べて高いか、又は低いｐＩを有するため、中性ｐＨで天然型グルカゴンに比べて改善された溶解度及び高い安定性を示すことができる。しかし、これに限定されるものではない。

【0110】

具体的には、天然型グルカゴンの誘導体は、天然型グルカゴンで一部アミノ酸が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及び修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のいずれか一つの方法又はこのような方法の組み合わせを通じて変形させることができる。

【0111】

前記方法の組み合わせにより作製されるグルカゴンの誘導体の例として、天然型グルカゴンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）した、グルカゴン受容体に対する活性化機能を有するペプチドなどがあるが、これに限定されず、誘導体の製造のための複数の方法の組み合わせにより本発明に適用される天然型グルカゴンの誘導体を製造することができる。

【0112】

また、天然型グルカゴンの誘導体の製造のためのこのような変形は、Ｌ－型あるいはＤ－型アミノ酸、及び／又は非－天然型アミノ酸を用いた変形；及び／又は天然型配列を改質、例えば、側鎖官能基の変形、分子内共有結合、例えば、側鎖間環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などのように改質することにより変形することを全て含む。また、前記変形は非天然型化合物での置換を全て含む。

【0113】

また、天然型グルカゴンのアミノ及び／又はカルボキシ末端に一つ又はそれ以上のアミノ酸が追加されたことを全て含む。

【0114】

前記置換又は追加されるアミノ酸は、ヒトタンパク質から通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく非定型又は非自然的発生アミノ酸を用いることができる。非定型アミノ酸の商業的出典にはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐとＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと定形的なペプチド配列は商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購買可能である。

【0115】

アミノ酸誘導体も同様の方式で入手することができるが、その例を一部だけ挙げると、４－イミダゾ酢酸（４－ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）などを用いることができる。

【0116】

グルカゴンは、約７のｐＩを有しており、生理学的ｐＨ（ｐＨ ４－８）の溶液中で不溶性であり、中性ｐＨでは沈殿する傾向がある。ｐＨ ３以下の水溶液中で、グルカゴンは初期には溶解するが、１時間以内にゲル形成により沈殿する。ゲル化したグルカゴンは、主にβ－シートフィブリルからなり、このように沈殿したグルカゴンはゲルが注射針や、静脈に投与される場合、血管を詰まらせるため、注射剤として用いるのに適しない。沈殿過程を遅延させるために、酸性（ｐＨ ２－４）の剤形を用いることが通常であるが、これを通じて短時間で、相対的に無凝集状態でグルカゴンを維持することができる。しかし、グルカゴンのフィブリル形成が低いｐＨで非常に速かになされるため、このような酸性剤形は、調剤後に直ちに注射されなければならない。

【0117】

本発明のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのｐＩを負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基の置換により変化させて延長された作用プロファイルを有することに開発されたものを含み、このような誘導体は、天然型グルカゴンに比べて変化したｐＩを有することにより、中性ｐＨで改善された溶解度及び／又は高い安定性を示すことを特徴とする。

【0118】

一つの具体的な様態として、前記グルカゴン又はグルカゴン誘導体は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。

【0119】

Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１、配列番号：４６）

【0120】

前記式において、
Ｘ１はヒスチジン、デスアミノ－ヒスチジル（ｄｅｓａｍｉｎｏ－ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、ジメチル－ヒスチジル（Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、ベータ－ヒドロキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ－ｈｙｄｒｏｘｙ ｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）、４－イミダゾアセチル（４－ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ）、ベータ－カルボキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ－ｃａｒｂｏｘｙ ｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）、トリプトファン、又はチロシンであるか、存在せず；
Ｘ２はアルファ－メチル－グルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ａｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ－アラニン、グリシン、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、セリン又はＤ－セリンであり；
Ｘ７はスレオニン、バリン又はシステインであり；
Ｘ１０はチロシン又はシステインであり；
Ｘ１２はリシン又はシステインであり；
Ｘ１３はチロシン又はシステインであり；
Ｘ１４はロイシン又はシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、グルタミン酸又はシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、アルファ－メチル－グルタミン酸、又はシステインであるか、存在せず；
Ｘ１７はアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、システイン、又はバリンであるか、存在せず；
Ｘ１８はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、バリン、又はシステインであるか、存在せず；
Ｘ１９はアラニン、アルギニン、セリン、バリン、又はシステインであるか、存在せず；
Ｘ２０はリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アルギニン、アルファ－メチル－グルタミン酸、又はシステインであるか、存在せず；
Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリン、又はシステインであるか、存在せず；
Ｘ２３はイソロイシン、バリン、又はアルギニンであるか、存在せず；
Ｘ２４はバリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルファ－メチル－グルタミン酸、又はロイシンであるか、存在せず；
Ｘ２７はイソロイシン、バリン、アラニン、リシン、メチオニン、グルタミン、又はアルギニンであるか、存在せず；
Ｘ２８はグルタミン、リシン、アスパラギン、又はアルギニンであるか、存在せず；
Ｘ２９はリシン、アラニン、グリシン、又はスレオニンであるか、存在せず；
Ｘ３０はシステインであるか、存在しなくてもよい。

【0121】

より具体的には、
前記一般式１において、
Ｘ１がヒスチジン、トリプトファン、又はチロシンであるか、存在せず；
Ｘ２がセリン又はＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はスレオニン、バリン又はシステインであり；
Ｘ１０はチロシン又はシステインであり；
Ｘ１２はリシン又はシステインであり；
Ｘ１３はチロシン又はシステインであり；
Ｘ１４はロイシン又はシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、又はシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、セリン又はシステインであり；
Ｘ１７はアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、システイン、又はバリンであり；
Ｘ１８はアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、又はシステインであり；
Ｘ１９はアラニン、又はシステインであり；
Ｘ２０はグルタミン、アスパラギン酸、リシン、又はシステインであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリン、又はシステインであり；
Ｘ２３はイソロイシン、バリン又はアルギニンであり；
Ｘ２４はバリン、アルギニン、アラニン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、又はロイシンであり；
Ｘ２７はイソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、グルタミン又はアルギニンであり；
Ｘ２８はグルタミン、リシン、アスパラギン又はアルギニンであり；
Ｘ２９はスレオニンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、存在しなくてもよい。

【0122】

その例として、前記ペプチドは、配列番号：１～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号：１～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。他の具体例として、本発明のペプチドは、配列番号２～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、又は配列番号２～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0123】

また、本願において「特定の配列番号で構成されるペプチド」と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一又は対応する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列の付加又は自然に生じ得る突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くものではなく、このような配列の追加もしくは突然変異を有する場合にも、本願の範囲内に属することが自明である。即ち、一部の配列の差があっても、一定レベル以上の相同性又は同一性を示し、投与された個体の体内臓器中、前記ペプチドの肝臓における分布度が高ければ、本発明の範囲に属することができる。

【0124】

その例として、特定の配列番号で構成されるペプチド、又は特定の配列番号を含むペプチドと少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するペプチドも含むことができ、投与された個体の体内臓器中、前記ペプチドの肝臓における分布度が高ければ、特定の配列に制限されない。

【0125】

本出願において用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」又は「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と相互間の関連した程度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性は、しばしば互換的に使用することができる。

【0126】

任意の二つのペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる。又は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０又は以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0127】

ペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、アミノ酸）の数を除した値と定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８（１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（又はギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。従って、本発明で使用されたものとして、用語「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）を示す。

【0128】

以上の内容は、本発明の他の具体例あるいは他の様態にも適用され得るが、これに限定されるものではない。

【0129】

また、一例として、前記ペプチドは、配列番号：３、１１～１７、１９～２７、２９、３１、３３、３５～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号：３、１１～１７、１９～２７、２９、３１、３３、３５～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0130】

また、一例として、前記ペプチドは、配列番号：１２、１４、１７、１９～２５、２７、２９、３３、３５～３８、４０～４２、及び４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号：１２、１４、１７、１９～２５、２７、２９、３３、３５～３８、及び４０～４２、４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0131】

また、一例として、前記ペプチドは、配列番号２～１３、１５、１７、２０～２４、２６～３０、及び３２～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２～１３、１５、１７、２０～２４、２６～３０、及び３２～４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0132】

また、一例として、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0133】

また、一例として、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0134】

また、一例として、前記ペプチドは、配列番号：１４、１６、１８、１９、２５、及び３１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号：１４、１６、１８、１９、２５、及び３１からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0135】

一つの具体例として、肝臓標的薬物を含む、投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い、薬学的組成物として、
前記肝臓標的薬物は、下記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい：

【0136】

Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｙ－Ｌ－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ａ－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｖ－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｍ－Ｎ－Ｔ－Ｘ３０（一般式２、配列番号：４７）

【0137】

前記一般式２において
Ｘ７はスレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１２はリシン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）であり；
Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）又はリシン（Ｋ）であり；
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ２４はバリン（Ｖ）又はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、存在しない
（ただし、前記一般式２のアミノ酸配列が配列番号１２と同一な場合は除く）。

【0138】

その例として、前記ペプチドは、配列番号１３、１５、１９、３３、及び３６～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号１３、１５、１９、３３、及び３６～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0139】

具体的には、前記一般式２において
Ｘ７はスレオニン、バリン又はシステインであり；
Ｘ１０はチロシン又はシステインであり；
Ｘ１２はリシンであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸であり；
Ｘ１６はグルタミン酸又はセリンであり；
Ｘ１７はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ２０はグルタミン又はリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり；
Ｘ２４はグルタミンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、存在しなくてもよいが、特にこれに限定されるものではない。

【0140】

その例として、前記ペプチドは、また、一例として、前記ペプチドは、配列番号３３、及び３６～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号３３、及び３６～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0141】

上述のグルカゴン誘導体は、分子内架橋（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｉｄｇｅ）を含むことができ（例えば、共有結合的架橋又は非共有結合的架橋）、具体的には、環を含む形態であってもよい。例えば、グルカゴン誘導体の１６番目及び２０番目のアミノ酸間に環が形成された形態であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。

【0142】

前記環の非制限的な例として、ラクタム架橋（又はラクタム環）を含むことができる。

【0143】

また、前記グルカゴン誘導体は環を含むように、目的とする位置に環を形成できるアミノ酸を含むように変形したものを全て含む。

【0144】

このような環は、前記グルカゴン誘導体内のアミノ酸の側鎖の間に形成されてもよく、その例としてリシンの側鎖とグルタミン酸の側鎖との間にラクタム環が形成される形態であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。

【0145】

例えば、前記一般式１又は一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドは、一般式１又は一般式２のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対において、各アミノ酸対のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸又はリシンで置換されたものであってもよいが、これに制限されない。前記、Ｘｎ（ｎは自然数）においてｎは提示されたアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸の位置を示す。

【0146】

また、前記一般式１又は一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｘ１２とＸ１６のアミノ酸対、Ｘ１６とＸ２０のアミノ酸対、又はＸ１７とＸ２１のアミノ酸対のアミノ酸のそれぞれが環を形成できるグルタミン酸又はリシンで置換されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0147】

また、前記一般式１又は一般式２において、Ｘ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対中、少なくとも一つのアミノ酸対において各アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸間に環（例えば、ラクタム環）を形成したものであってもよいが、これに制限されない。

【0148】

また、前記一般式１又は一般式２において、Ｘ１６がグルタミン酸であり、Ｘ２０はリシンであり、Ｘ１６とＸ２０の側鎖がラクタム環を形成しているものであってもよいが、これに制限されない。

【0149】

また、前記ペプチドは、天然型グルカゴンに比べて体内半減期が延長したものであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。

【0150】

また、本発明によるペプチドは、Ｎ末端及び／又はＣ末端が変形されないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断酵素から保護し、安定性を増加させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾されたり有機基で保護されたり、又はペプチド末端などにアミノ酸が追加されて変形された形態も本発明によるペプチドの範疇に含まれる。Ｃ末端が変形されていない場合、本発明によるペプチドの末端はカルボキシル基を有するが、特にこれに限定されるものではない。

【0151】

又は化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するためにＮ末端をアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及び／又はＣ末端をアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）してもよいが、特にこれに制限されない。

【0152】

本明細書において特に指すところがなければ、本発明による「ペプチド」又はこのようなペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合で連結された「結合体」に関する明細書の詳細な説明や請求の範囲の記述は、当該ペプチド又は結合体はもちろんのこと、当該ペプチド又は結合体の塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、又はその溶媒和物の形態を全て含む範疇にも適用される。従って、明細書に「ペプチド」又は「結合体」とだけ記載されていても当該記載内容は、その特定の塩、その特定の溶媒和物、その特定の塩の特定の溶媒和物にも同様に適用される。このような塩の形態は、例えば、薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。

【0153】

前記塩の種類は、特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全で効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに限定されるものではない。

【0154】

前記用語、「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、又はアレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。

【0155】

本出願において用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、又は塩基から誘導された塩を含む。適した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適した塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含み得る。

【0156】

また、本発明で用いられた用語「溶媒和物」は、本発明によるペプチド、結合体、又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したものをいう。

【0157】

本発明によるペプチドのＣ末端はアミド化するか、又は遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有するペプチドであるか、又はＣ末端が変形されていないペプチドを含むものであってもよいが、これに制限されない。

【0158】

一つの具体例として、前記ペプチドは、Ｃ末端がアミド化しているものであってもよいが、これに制限されない。

【0159】

一つの具体例として、前記ペプチドは、非グリコシル化したものであってもよいが、これに制限されない。

【0160】

本発明のペプチドは、Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ合成法を通じて合成されてもよく、組換え方法でも生産可能であり、商業的に依頼して製造してもよいが、これに制限されない。

【0161】

また、本発明のペプチドは、その長さに応じてこの分野でよく知られている方法、例えば、自動ペプチド合成器により合成することができ、遺伝子操作技術により生産することもできる。

【0162】

具体的には、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム、又は任意の他の当該分野の方法により製造され得る。従って、本発明によるペプチドは、例えば、下記を含む方法を含む多数の方法で合成することができる：

【0163】

（ａ）ペプチドを固相又は液相法の手段で段階的に又は断片組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法；又は
（ｂ）ペプチドをエンコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；又は
（ｃ）ペプチドをエンコードする核酸作製物の無細胞試験管内の発現を行い、発現生成物を回収する方法；又は
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドの断片を得、続いて、断片を連結させてペプチドを得、当該ペプチドを回収する方法。

【0164】

また、前記一般式１又は一般式２のアミノ酸配列を含むペプチド、又はグルカゴン誘導体は、その生体内半減期を増加させる生体適合性物質部に結合された、持続型結合体の形態であってもよいが、これに制限されない。本明細書において、前記生体適合性物質部はキャリアと混用され得る。

【0165】

前記持続型結合体の形態の一般式１又は一般式２のアミノ酸配列を含むペプチド（結合体形態）、又は一般式１又は一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドそれ自体は肝臓標的薬物であり、投与された個体の体内臓器中、前記薬物の肝臓における分布度が高い、薬学的組成物の有効成分である。

【0166】

本出願において用語、「持続型結合体」は、生理活性物質（例えば、グルカゴン誘導体）に生体適合性物質部又はキャリアが結合された形態であり、具体的には、前記結合体は、ペプチド部位及び前記ペプチド部位に共有結合で連結された生体適合性物質部を含み、前記ペプチド部位は、前記一般式１又は一般式２のアミノ酸配列又は配列番号２～１１、及び１３～４５と同一の配列であるか、又はこれを含む配列であってもよい。前記持続型結合体において生体適合性物質部又はキャリアは、生理活性物質に共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに制限されない。

【0167】

本発明において前記ペプチドの結合体は、キャリアが結合されていない前記ペプチドに比べて増加した効力の持続性及び／又は血中半減期の増大を示すことができ、本発明では、このような結合体を「持続型結合体」と称する。

【0168】

一方、このような結合体は、非自然な（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。

【0169】

本発明の具体的な実施形態において、前記持続型結合体は、グルカゴン誘導体に免疫グロブリンＦｃ領域が互いに連結された形態を指す。具体的には、前記結合体は、グルカゴン誘導体に免疫グロブリンＦｃ領域がリンカーを通じて共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに制限されない。

【0170】

一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域とＸはグリコシル化されていなくてもよいが、これに制限されない。

【0171】

本発明の一つの具体例において、前記持続型結合体は、下記化学式１で示される、結合体である：

【0172】

［化学式１］
Ｘ－Ｌ－Ｆ

【0173】

ここで、
Ｘは、前記ペプチドであり；
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－は、ＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合連結を示す。

【0174】

前記化学式１の持続型結合体のＸは、上述のグルカゴン誘導体であってもよいが、これに制限されない。

【0175】

一つの具体例として、前記化学式１の持続型結合体のＸは、前記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。

【0176】

具体的には、前記Ｘは、配列番号１３、１５、１９、３３、及び３６～４５からなる群から選択されるいずれか一つの配列番号のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、又は配列番号３３及び３６～４４からなる群から選択されたいずれか一つの配列番号のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよいが、これに制限されない。

【0177】

また、一例として、前記Ｘは一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、又は、前記Ｘは配列番号２～４５のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、又は配列番号２～１１及び１３～４５のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、又は、前記Ｘは配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであってもよいが、これに制限されない。

【0178】

前記結合体においてＦはＸ、即ち、肝臓標的薬物、具体的には、グルカゴン受容体に対して活性を有するペプチドであり、本発明の前記結合体を構成するモイエティの一構成に該当する。前記肝臓標的薬物は、前述したことが全部適用される。

【0179】

前記Ｆは、Ｘと共有化学結合又は非共有化学結合で互いに結合されるものであってもよく、共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせによりＬを通じてＦとＸとが互いに結合されるものであってもよい。

【0180】

本発明において用語「化学式１の持続型結合体」は、グルカゴン誘導体及び免疫グロブリンＦｃ領域が互いにリンカーで連結された形態であり、前記結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合されていないグルカゴン誘導体に比べて増加した効力の持続性を示すことができる。

【0181】

前記持続型結合体においてＦはＸ、即ち、グルカゴン誘導体の半減期を増加させる物質であり、本発明の前記結合体を構成するモイエティの一構成に該当する。

【0182】

化学式１の持続型結合体においてグルカゴン誘導体であるペプチドであるＸと免疫グロブリンＦｃ領域の連結は、物理又は化学結合であるか、非共有又は共有結合であってもよく、具体的には、共有結合であってもよいが、これに制限されない。

【0183】

また、化学式１の持続型結合体のグルカゴン誘導体であるＸと免疫グロブリンＦｃ領域の連結方法は、特に制限されないが、リンカーを通じてグルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域が互いに連結されたものであってもよい。

【0184】

前記化学式１において共有結合でＬを通じてＸとＦが互いに結合される。

【0185】

より具体的には、ＸとＬ、及びＬとＦは共有結合で互いに連結されてもよく、その時、前記結合体は、化学式１の順序で、Ｘ、Ｌ、及びＦが共有結合を通じてそれぞれ連結された結合体であってもよい。

【0186】

また、前記Ｘは、Ｆはリンカー（Ｌ）を通じて連結されたものであってもよい。

【0187】

一方、前記Ｌは、非ペプチド性リンカー、例えば、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであってもよい。

【0188】

本発明において「非ペプチド性リンカー」は、繰り返し単位が二つ以上結合された生体適合性ポリマーを含む。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく任意の共有結合を通じて互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体のモイエティをなす一構成であってもよく、前記化学式１においてＬに該当する。本発明で使用できる非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリマーであれば、制限なく使用できる。本発明において、前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性ポリマーと混用されてもよい。

【0189】

特にこれに制限されないが、前記非ペプチド性リンカーはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカー、例えば、ポリエチレングリコールであってもよく、また、当該分野に既に知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。

【0190】

前記非ペプチド性リンカーの繰り返し単位はエチレングリコール繰り返し単位であってもよく、具体的には、前記非ペプチド性リンカーはエチレングリコール繰り返し単位を含みながら、結合体として構成される以前には結合体の製造に用いられる官能基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は、前記官能基を通じてＸとＦが連結された形態であってもよいが、これに制限されない。本発明において、前記非ペプチド性リンカーは二つ又は三つ以上の官能基を含むことができ、各官能基は同一又は相異してもよいが、これに制限されない。

【0191】

具体的には、前記リンカーは下記化学式２で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよいが、これに限定されるものではない：

【0192】

［化学式２］

【0193】

ここで、ｎ＝ １０～２４００、ｎ＝ １０～４８０、又はｎ ＝ ５０～２５０であるが、これに制限されない。

【0194】

前記持続型結合体においてＰＥＧモイエティは、－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－構造だけでなく、連結要素とこの－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－との間に介在する酸素原子も含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0195】

一つの具体例として、前記エチレングリコール繰り返し単位は、その例として、［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎで表されることができ、ｎ値は自然数で前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が０超～約１００ｋＤａになるように定められるが、これに制限されない。もう一つの例として、前記ｎ値は自然数で前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が約１～約１００ｋＤａ、約１～約８０ｋＤａ、約１～約５０ｋＤａ、約１～約３０ｋＤａ、約１～約２５ｋＤａ、約１～約２０ｋＤａ、約１～約１５ｋＤａ、約１～約１３ｋＤａ、約１～約１１ｋＤａ、約１～約１０ｋＤａ、約１～約８ｋＤａ、約１～約５ｋＤａ、約１～約３．４ｋＤａ、約３～約３０ｋＤａ、約３～約２７ｋＤａ、約３～約２５ｋＤａ、約３～約２２ｋＤａ、約３～約２０ｋＤａ、約３～約１８ｋＤａ、約３～約１６ｋＤａ、約３～約１５ｋＤａ、約３～約１３ｋＤａ、約３～約１１ｋＤａ、約３～約１０ｋＤａ、約３～約８ｋＤａ、約３～約５ｋＤａ、約３～約３．４ｋＤａ、約８～約３０ｋＤａ、約８～約２７ｋＤａ、約８～約２５ｋＤａ、約８～約２２ｋＤａ、約８～約２０ｋＤａ、約８～約１８ｋＤａ、約８～約１６ｋＤａ、約８～約１５ｋＤａ、約８～約１３ｋＤａ、約８～約１１ｋＤａ、約８～約１０ｋＤａ、約９～約１５ｋＤａ、約９～約１４ｋＤａ、約９～約１３ｋＤａ、約９～約１２ｋＤａ、約９～約１１ｋＤａ、約９．５～約１０．５ｋＤａ、又は約１０ｋＤａであってもよいが、これに制限されない。

【0196】

また、一つの具体的な実施形態において前記化学式１の持続型結合体は、一般式２のアミノ酸配列を含むペプチド（Ｘ）と免疫グロブリン領域（Ｆ）がエチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーを通じて共有結合で連結された構造であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0197】

前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコールホモポリマー、ＰＥＧコポリマー、又はモノメチル置換されたＰＥＧポリマー（ｍＰＥＧ）の形態をいずれも包括する用語であるが、特にこれに限定されるものではない。

【0198】

前記非ペプチド性ポリマーの分子量は、１～１００ｋＤａの範囲、具体的には１～２０ｋＤａの範囲、又は１～１０ｋＤａの範囲であるが、これに制限されない。また、前記Ｆに該当するポリペプチドと結合される本発明の非ペプチド性リンカーは一種類のポリマーだけでなく、相違した種類のポリマーの組み合わせが使用されてもよい。

【0199】

一つの具体例として、前記リンカーの両末端は、免疫グロブリンＦｃ領域のチオール基、アミノ基、ヒドロキシル基及びペプチド（Ｘ）のチオール基、アミノ基、アジド基、ヒドロキシル基に結合してもよいが、これに制限されない。

【0200】

具体的には、前記リンカーは、両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びペプチド（Ｘ）と結合できる反応基、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域のシステインのチオール基；Ｎ末端、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンに位置したアミノ基；及び／又はＣ末端に位置したヒドロキシル基と結合され、ペプチド（Ｘ）のシステインのチオール基；リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンのアミノ基；アジドリシンのアジド基；及び／又はヒドロキシル基と結合できる反応基を含んでもよいが、これに制限されない。

【0201】

より具体的には、前記リンカーの反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに制限されない。

【0202】

前記において、アルデヒド基（アルデヒドグループ）としてプロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を例として挙げられるが、これに制限されない。

【0203】

前記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタン酸、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタン酸、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられるが、これに制限されない。

【0204】

前記リンカーは、前記のような反応基を通じて免疫グロブリンＦｃ領域であるＦ及びペプチド（グルカゴン誘導体）であるＸに連結され、リンカー連結部に転換される。

【0205】

また、アルデヒド結合による還元性アミノ化（又は還元性アルキル化）で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものより遥かに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えば、ｐＨ ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成できるが、これに制限されない。

【0206】

また、本発明のリンカーの両末端の反応基は互いに同一又は互いに異なってもよい。前記リンカーは、末端にアルデヒド基の反応基を有するものであってもよく、また、前記リンカーは、末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド反応基を有するか、又は末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド反応基を有してもよいが、リンカーの各末端にＦ、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域とＸが結合されれば、これに制限されない。

【0207】

例えば、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有することができる。また、一例として、一方の末端にはスクシンイミジル基を、他方の末端にはプロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有することができる。

【0208】

プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールをリンカーとして用いる場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記多様な反応基で活性化するか、又は商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の結合体を製造することができる。

【0209】

一つの具体的な実施形態において前記リンカーの反応基がペプチド（Ｘ）のシステイン残基、より具体的には、システインの－ＳＨ基に連結されるものであってもよいが、これに制限されない。

【0210】

もし、マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はペプチドの－ＳＨ基とチオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）結合で連結し、アルデヒド基は免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ₂基と還元的アルキル化反応を通じて連結できるが、これに限定されず、これは一例に該当する。

【0211】

このような還元的アルキル化を通じてＰＥＧの一方の末端に位置する酸素原子に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端アミノ基が－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－の構造を有するリンカー官能基を通じて互いに連結され、－ＰＥＧ－Ｏ－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ－免疫グロブリンＦｃと同様な構造を形成することができ、チオエーテル結合を通じてＰＥＧの一方の末端がペプチドのシステインに位置する硫黄原子に連結された構造を形成することができる。上述のチオエーテル結合は、

の構造を含むことができる。

【0212】

しかし、上述の例に特に制限されるものではなく、これは一例に該当する。

【0213】

また、前記結合体において、リンカーの反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する－ＮＨ₂と連結されたものであってもよいが、これは一例に該当する。

【0214】

また、前記結合体において、本発明によるペプチドは反応基を有するリンカーとＣ末端を通じて連結されてもよいが、これは一例に該当する。

【0215】

本発明において「Ｃ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端を意味することであり、本発明の目的上、リンカーと結合できる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｃ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなくＣ末端周囲のアミノ酸残基をいずれも含めんでよく、具体的には、最末端から最初～２０番目のアミノ酸残基を含んでもよいが、これに制限されない。

【0216】

一つの具体例として、前記化学式１の結合体は、下記化学式３の構造を有することができる。

【0217】

［化学式３］

【0218】

前記化学式３において、Ｘは前記で説明したペプチド（グルカゴン誘導体）であり；
Ｆはヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり；
ｎは自然数であってもよい。この時、ｎに関する説明は前記で説明した通りである。

【0219】

一つの具体例として、前記化学式３の持続型結合体は、ペプチドＸとヒト免疫グロブリンＦｃ領域Ｆがエチレングリコール繰り返し部を介在し、共有結合で連結された構造であり、それぞれＸは化学式３のスクシンイミド環に、Ｆは化学式３のオキシプロピレン基に連結される形態であってもよい。

【0220】

前記化学式３において、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａ、又は１～２０ｋＤａ又は１０ｋＤａになるように定められるものであってもよいが、これに制限されない。

【0221】

ある実施形態において化学式３のスクシンイミド環にＸが連結される部位は、ＸのＣ末端システインの硫黄原子であってもよい。

【0222】

Ｆ内において前記オキシプロピレン基に連結される部位は、特に限定されない。本発明のある実施形態において前記オキシプロピレン基に連結されるＦの部位は、Ｎ末端の窒素又はＦ内部残基の窒素原子（例えば、リシンのイプシロン窒素）であってもよい。本発明のある具体的な実施形態において、Ｆが前記オキシプロピレン基に連結される部位は、ＦのＮ末端プロリンであってもよいが、これに制限されない。

【0223】

また、前記結合体において、非ペプチド性ポリマーの反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する－ＮＨ₂と連結されたものであってもよいが、これは一例に該当する。

【0224】

具体的な例として、前記化学式１のＦは免疫グロブリンＦｃ領域である。その例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ由来であってもよいが、特にこれに制限されない。

【0225】

本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除いた、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の持続型結合体のモイエティをなす一構成であってもよい。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、「免疫グロブリンＦｃ断片」と混用され得る。

【0226】

本明細書において、Ｆｃ領域と言えば、免疫グロブリンのパパイン消化から得る天然型配列だけでなくその誘導体、例えば、天然配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより変換されて天然のものとは異なる配列など変形体も含まれる。前記誘導体、置換体、変形体はＦｃＲｎに結合する能力を保有することを前提とする。本発明において、Ｆはヒト免疫グロブリン領域であってもよいが、これに制限されない。前記Ｆは、二つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を介してのみ連結されている構造であってもよいが、これに制限されるものではない。前記窒素原子を介する連結は、リシンのイプシロンアミノ原子やＮ末端のアミノ基に還元的アミノ化により連結されるものであってもよい。

【0227】

還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（即ち、還元的アミノ化が可能な官能基）と反応してアミンを生成し、次いで還元反応によりアミン結合を形成させる反応を意味し、当該技術分野で周知の有機合成反応である。

【0228】

一つの具体例として、前記Ｆは、そのＮ末端プロリンの窒素原子を通じて連結されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0229】

このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含んでもよいが、これに限定されるものではない。

【0230】

本発明における免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端に特定のヒンジ配列を含んでもよい。

【0231】

本発明の用語、「ヒンジ配列」とは、重鎖に位置してジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）により免疫グロブリンＦｃ領域の二量体を形成する部位を意味する。

【0232】

本発明における前記ヒンジ配列は、下記のアミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して一つのシステイン残基のみ有するように変異したものであってもよいが、それに制限されるものではない：

【0233】

Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５０）。

【0234】

前記ヒンジ配列は、配列番号５０のヒンジ配列中の８番目又は１１番目システイン残基が欠失して一つのシステイン残基のみ含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は、一つのシステイン残基のみ含む、３～１２個のアミノ酸からなるものであるが、これに制限されるものではない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は次のような配列を有することができる：Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５１）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号５２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５３）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号５４）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５５）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５６）、Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５７）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５８）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５９）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６０）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６１）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６３）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６４）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６５）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６７）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号６８）、Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６９）。

【0235】

より具体的には、前記ヒンジ配列は、配列番号６０（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）又は配列番号６９（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに制限されるものではない。

【0236】

本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列の存在により免疫グロブリンＦｃ鎖の二つの分子が二量体を形成した形態であってもよく、また、本発明の化学式１の結合体はリンカーの一方の末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ領域の一つの鎖に連結された形態であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0237】

本発明の用語、「Ｎ末端」とは、タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端を意味し、アミノ末端の最末端、又は最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個以上のアミノ酸まで含むものであってもよい。本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列をＮ末端に含んでもよいが、これに制限されるものではない。

【0238】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域のみを除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。

【0239】

例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１個又は２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ（例、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとヒンジ領域又はその一部との組み合わせ、そして上述の組み合わせを有するポリペプチド二つの二量体形態）、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0240】

本発明において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された、二量体又は多量体形態であってもよいが、これに制限されない。

【0241】

また、一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形態（ｄｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）であってもよく、二量体形態の一つのＦｃ領域にＸの一分子が共有結合的に連結され、この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは非ペプチド性ポリマーにより互いに連結される。一方、二量体形態の一つのＦｃ領域にＸの二分子が対称的に結合することも可能である。この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、非ペプチド性リンカーにより互いに連結される。しかし、前記例に制限されるものではない。

【0242】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。

【0243】

例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２又は３２７～３３１番目のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられてもよい。

【0244】

また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されるか、または天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号などに開示されている。

【0245】

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野で公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及びアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などにより修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。

【0246】

前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。

【0247】

また、このようなＦｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット又はモルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得られてもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得られる方法であってもよい。パパインを処理する場合にはＦａｂ及びＦｃで切断され、ペブシンを処理する場合にはｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）₂に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態では、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から得られた組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。

【0248】

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が減少又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より符合する形態は、糖鎖が除去されるか、または非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言える。

【0249】

本発明において「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、原核動物、より具体的な実施形態においては、大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。

【0250】

一方、免疫グロブリンＦｃ領域はヒト又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。

【0251】

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はそれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又はそれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものであり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来のものである。一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であるが、これらに限定されるものではない。

【0252】

また、一つの具体的な実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃの領域として、各モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ－ｃｈａｉｎ形態）により２個のモノマーが連結されたホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）の形態であってもよく、この時、ホモ二量体の各モノマーは、独立に３５番の及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合、即ち、二つの内部のジスルフィド結合（ｉｎｔｒａ－ｃｈａｉｎ形態）を有するものである／有するものであってもよい。各モノマーのアミノ酸数は、２２１個のアミノ酸からなり、ホモ二量体を形成するアミノ酸は、全体で４４２個のアミノ酸からなるが、これらに制限されるものではない。具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号７０のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有するモノマー２個が各モノマーの３番目のアミノ酸であるシステイン間にジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体のモノマーは、それぞれ独立して３５番目の及び９５番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番目及び１９９番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものであるが、これに制限されるものではない。

【0253】

前記化学式１のＦは、配列番号７０のアミノ酸配列であるモノマーを含むものであってもよく、前記Ｆは配列番号７０のアミノ酸配列のモノマーのホモ二量体であってもよいが、これに制限されない。

【0254】

一例として、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号７１のアミノ酸配列（４４２個のアミノ酸で構成される）を含むホモ二量体であってもよいが、これに制限されない。

【0255】

一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２個以上の断片から二量体又は多量体の製造が可能である。

【0256】

また、上述した結合体は、効力の持続性が天然型グルカゴンに比べて、又はＦが修飾されていないＸに比べて増加したものであってもよく、このような結合体は上述した形態だけでなく、生分解性ナノパーティクルに封入された形態などを全て含む。

【0257】

前記肝臓標的薬物を含む組成物、例えば、前記ペプチド（例えば、前記ペプチド自体又はこれに免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型結合体の形態）を含む組成物は、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療用であってもよい。

【0258】

本発明において用語「予防」とは、前記肝臓標的薬物を含む組成物の投与により肝臓における薬物作用が必要な疾患の発病を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記肝臓標的薬物を含む組成物の投与により肝臓における薬物作用が必要な疾患の症状が好転又は有益になるあらゆる行為を意味する。

【0259】

本発明において用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は特にこれに制限されないが、前記組成物が生体内標的に到達できる任意の一般的な経路を通じて投与され、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、又は直腸内投与などであってもよい。

【0260】

本出願において用語、「肝臓における薬物作用が必要な疾患」は、本発明による肝臓標的薬物が治療的活性を示す疾患であり、肝組織に投与された薬物の分布度が高くなることにより、予防又は治療効果を示す疾患を言う。例えば、肝臓疾患、低血糖又は先天性高インスリン症であってもよいが、特にこれに限定されるものではなく、本発明の肝臓標的薬物が標的化して治療できる疾患は制限なく含まれる。

【0261】

国際公開特許ＷＯ ２０２０／２６３０６３で開示されたように、グルカゴン受容体に活性を有するペプチド又はその持続型結合体は、代謝性肝疾患、単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝、肝臓炎症、非アルコール性脂肪肝炎、胆汁うっ滞性肝疾患、肝線維症、肝硬変、肝不全及び肝臓癌など、肝臓疾患に効果が優れる。これに対し、本発明の肝組織への標的化が優れた肝臓標的薬物である、グルカゴン受容体に活性を有するペプチド又はその持続型結合体は、前記肝疾患に予防又は治療効果も存在し、肝臓疾患治療剤としても効果的に提供されることができる。

【0262】

本発明において、「肝疾患」とは、肝臓で発病する疾患を意味し、非アルコール性脂肪肝臓疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝臓炎症（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胆汁うっ滞性肝疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。その例として、前記非アルコール性脂肪肝疾患は、肝細胞に脂肪の過度な蓄積のみがある単純脂肪症（ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ）、肝細胞壊死と炎症と線維化を伴う非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）などを含む一連の疾患群であり、前記胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）又はそれらの組み合わせであってもよいが、肝臓の組織及び機能に異常が生じる限り、肝疾患が前記疾病に制限されるものではない。

【0263】

本発明において用語「低血糖」は、血中糖量が正常な人より低い状態をいう。通常、血糖が５０ｍｇ／ｄｌ以下である時を言うが、特にこれに限定されるものではない。低血糖症が生じる一般的な原因は、経口用血糖降下剤やインスリンを用いる人が普段より食べ物摂取量が少ないか、活動量や運動量が過剰な場合である。それ以外にも飲酒や一部の血糖値を下げる薬物の使用、重症の身体的疾患、副腎皮質ホルモンやグルカゴンなどのホルモン欠乏、インスリン生成すい臓腫瘍、インスリンに対する自己免疫疾患がある場合、胃切除術患者、遺伝性炭水化物代謝酵素異常疾患などによっても低血糖が発生し得る。

【0264】

本発明において前記低血糖は、急性低血糖及び慢性低血糖の両方を含む。

【0265】

低血糖の症状は、元気がなく身体の震えがあり、青白、冷や汗、めまい、興奮、不安感、動悸、空腹感、頭痛、疲労感などを含む。低血糖が長く続くと痙攣や発作があり、ショック状態がもたらされて意識を失うこともある。

【0266】

より具体的には、前記低血糖は、遺伝的欠陥による持続性高インスリン症により引き起こされ得る。遺伝的欠陥による高インスリン症の原因としては、１１ｐ１５．１染色体にあるＳＵＲ又はＫｉｒ６．２遺伝子の突然変異、７ｐ１５－ｐ１３染色体にあるＧＫ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）遺伝子の突然変異によりＧＫ活性度が増加、ＧＤＨ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の突然変異によりＧＤＨが活性化され、これによりベータ島細胞内のＡＴＰの増加などが知られている。

【0267】

一方、先天性高インスリン症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｎｉｓｍ）は、新生児と小児で発生する深刻で持続的な低血糖を引き起こす原因疾患の一つである。低体重出生児あるいは糖尿妊婦の出生児で一時的なインスリン分泌の増加、遺伝子の突然変異によるすい臓細胞の異常機能などにより引き起こされ得る。

【0268】

一方、肝臓は、貯蔵しているグリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）の分解（ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ）及びブドウ糖新生合成（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を通じてグルコースを生産し得ることが知られている。したがって、低血糖発生時、肝臓でのグリコーゲン分解及びブドウ糖新生合成を誘発できる薬学的組成物、例えば、グルカゴン及びこれを含む結合体などを肝臓に標的することができれば、より効果的な低血糖の改善及び血糖正常化を期待できるものである。

【0269】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含み得る。このような薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤は、非自然なものであってもよい。

【0270】

本発明において用語「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を示すことができる程度の十分な量と副作用を引き起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合又は同時用いられる薬物など、医学分野によく知られている要素に応じて当業者により容易に決定され得る。

【0271】

本発明のペプチドを含む薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。前記担体は、特にこれに制限されないが、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。

【0272】

本発明の組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容可能な担体と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多数回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

【0273】

一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート又は鉱油などが用いられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含み得る。

【0274】

また、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。

【0275】

また、前記組成物は、薬学的分野において通常の方法により患者の身体内投与に適した単位投与形の製剤、具体的には、タンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化させて当業界において通常に用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む非経口投与経路により投与され得るが、これらに限定されるものではない。

【0276】

また、前記結合体は、生理食塩水又は有機溶媒のように薬剤として許容された種々の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して用いられ、安定性や吸水性を増加させるために、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）又はグルタチオンのような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート剤、低分子タンパク質又は他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）などが薬剤として用いられる。

【0277】

本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度などの種々の関連因子と共に、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。

【0278】

本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与され、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与され得る。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にすることができる。具体的には、本発明の結合体の好ましい全体用量は、一日に患者体重１ｋｇ当り約０．０００１ｍｇ～５００ｍｇであってもよい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食事及び排泄率など多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定し得るものである。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。

【0279】

本発明の薬学的組成物は生体内持続性及び力価に優れ、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を顕著に減少させることができる。

【0280】

本発明を具現するもう一つの態様は、肝組織に標的化された生理活性物質、具体的には、グルカゴン受容体と結合力を有する物質を含み、肝組織に標的化された生理活性物質を提供する。

【0281】

前記肝組織に標的化された生理活性物質、グルカゴン受容体と結合力を有する物質などについては前述したことが全部適用される。

【0282】

本発明を具現するもう一つ態様は、前記薬学的組成物又は肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0283】

前記薬学的組成物、肝組織に標的化された生理活性物質、肝臓における薬物作用が必要な疾患、予防及び治療については前述したことが全部適用される。

【0284】

本発明において前記個体は、肝臓における薬物作用が必要な疾患が疑われる個体であり、前記肝臓における薬物作用が必要な疾患が疑われる個体は、当該疾患が発病しているか、又は発病し得るヒトを含むラット、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の肝臓標的薬物を含む前記組成物で治療可能な個体は、制限なく含まれる。

【0285】

本発明の方法は、前記肝臓標的薬物を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含むことができる。適した総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定され、１回又は数回に分けて投与できる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が用いられるかどうかをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に用いられたり同時に用いられる薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子により異なって適用することが好ましい。

【0286】

本発明を具現するもう一つの態様は、前記肝臓における薬物作用が必要な疾患の予防又は治療用薬剤の製造に使用するための、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質の用途を提供することである。

【0287】

前記肝臓における薬物作用が必要な疾患、肝臓標的薬物、及び肝組織に標的化された生理活性物質については前述したことが全部適用される。

【0288】

本発明を具現するもう一つの態様は、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与して前記肝臓標的薬物の肝臓標的化を誘導する方法を提供することである。

【0289】

前記肝臓標的薬物、肝組織に標的化された生理活性物質、及び個体については前述したことが全部適用される。

【0290】

本発明を具現するもう一つの態様は、前記肝臓標的薬物、具体的には、肝組織に標的化された生理活性物質をそれを必要とする個体に投与して肝組織内で前記生理活性物質の分布増大を誘導する方法を提供することである。

【0291】

前記肝臓標的薬物、肝組織に標的化された生理活性物質、及び個体については前述したことが全部適用される。

【0292】

前記肝臓標的化を誘導する方法は、当該物質が肝臓に標的化されるように適切な投与経路を通じて投与され、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）に投与されてもよいが、特にこれに限定されるものではない。

【0293】

以下、下記実施例により本発明をより詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

【0294】

実施例１：グルカゴン及びその誘導体ペプチドの製造
グルカゴン受容体に活性を示すグルカゴン及びその誘導体のペプチドを製造し、下記表１にその配列を示した。具体的には、配列番号：１の天然型グルカゴンのアミノ酸配列を負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基で置換し、下記表１のようなグルカゴン誘導体ペプチドを合成した。これに記載された相対的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、下記実験例１に記述された方法で測定した。

【0295】

【表1】

【0296】

前記表１に記載された配列においてＸと表記されたアミノ酸は、非天然型アミノ酸であるアミノイソブチル酸（Ａｉｂ）を、アミノ酸記号の下線は、下線を引いた当該アミノ酸対の側鎖の間でラクタム環の形成を、そして「－」は、当該位置にはアミノ酸残基がないことを示す。また、環状性有無に関する列において「－」は当該配列には環が形成されていないことを示す。

【0297】

実施例２：グルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体の製造
代表的なグルカゴン誘導体ペプチドとして前記実施例１で製造した表１の誘導体ペプチド中、配列番号３７のグルカゴン誘導体を選択し、結合体を次のような方法で製造した。

【0298】

両末端の水素がそれぞれ３－（３－マレイミドプロピオンアミド）プロピル基及び３－オキソプロピル基（プロピオンアルデヒド基）で置換された分子量１０ｋＤａの線状改質ポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（日本ＮＯＦ社）をシステインを有する配列番号３７のグルカゴン誘導体ペプチド誘導体に反応させ、このグルカゴン誘導体ペプチドのシステイン残基をマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのマレイミド側末端にペグ化させた。

【0299】

具体的には、配列番号３７のグルカゴン誘導体ペプチドとマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～５、タンパク質の濃度を３～１０ｍｇ／ｍｌにして低温で１～３時間反応させた。この時、反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）に２０～６０％のイソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液をＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用し、システインにモノ－ペグ化されたグルカゴン誘導体を精製した。

【0300】

免疫グロブリンＦｃ切片は、Ｎ末端にＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ配列（配列番号６０）のヒンジ領域を有する免疫グロブリンＦｃ切片（４９．８ｋＤａ、配列番号７０のモノマーである鎖の二つがジスルフィド結合で連結されたホモ二量体）を用いて国際公開特許ＷＯ２００７／０２１１２９に記載された方法で製造した。

【0301】

次に、前記精製されたモノペグ化されたグルカゴン誘導体ペプチドと免疫グロブリンＦｃ切片をモル比が１：２～１０、タンパク質の濃度を１０～５０ｍｇ／ｍＬにして４～８℃で１２～１８時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）に還元剤である１０～５０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムと１０～２０％のイソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液をＢｕｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）とＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用し、前記モノペグ化されたグルカゴン誘導体ペプチドのアルデヒド側のポリエチレングリコール末端が免疫グロブリンＦｃホモ二量体の二鎖中の一鎖のＮ末端プロリン窒素に連結されたグルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体を精製した。

【0302】

製造後、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーで分析した純度は、９５％以上であった。

【0303】

ここで、グルカゴン誘導体ペプチド及び免疫グロブリンＦｃ切片がＰＥＧを通じて連結された結合体を、「グルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体」、「グルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃを含む結合体」、「グルカゴン誘導体の持続型結合体」、又は「持続型グルカゴン誘導体」と命名し、これらは本願において混用され得る。

【0304】

実験例１：グルカゴン誘導体の持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定
前記実施例１で製造されたグルカゴン誘導体の活性を測定するために、グルカゴン（ＧＣＧ）受容体が各形質転換された細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞活性を測定する方法を用いた。

【0305】

前記各細胞株は、ＣＨＯ（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）にヒトＧＣＧ受容体遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、ＧＣＧの活性を測定するのに適している。従って、ＧＣＧ受容体に対する活性をそれぞれの形質転換細胞株を用いて測定した。

【0306】

具体的には、ヒトグルカゴン受容体遺伝子のｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． ＵＳＡ）においてＯＲＦに該当する部分を鋳型とし、ＥｃｏＲＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位をそれぞれ含む下記配列番号：４８及び４９の正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを行った。

【0307】

この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で６０秒の変性、５５℃で６０秒のアニーリング及び６８℃で３０秒の伸張過程を３０回繰り返した。これから増幅されたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後４５０ｂｐサイズのバンドを溶離して得た。

【0308】

正方向プライマー（配列番号：４８）：
５’－ＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＴＡＡＧＧＣＣ－３’
逆方向プライマー（配列番号：４９）：
５’－ＣＴＡＡＣＣＧＡＣＴＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣ－３’

【0309】

前記ＰＣＲ産物を公知となった動物細胞発現ベクターであるｘ０ＧＣ／ｄｈｆｒにクローニングして組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＣＧＲを製造した。

【0310】

前記製造した組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＣＧＲを１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞にリポフェクタミンを用いて形質転換し、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０ｎＭメトトレキサートを含む選別培地で選別培養した。これから制限希釈法でモノクローナル細胞株を選別し、この中からグルカゴンに対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株を最終的に選別した。

【0311】

前記細胞株において実施例１で合成されたグルカゴン誘導体の活性を測定した。具体的には、前記形質転換細胞株を１週間に３回又は４回継代培養した後、３８４ウェルプレートに各ウェル当たり６×１０³個の継代培養された細胞株を分注し、２４時間培養した。前記培養された細胞に０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液に天然型グルカゴンは２００ｎＭで、グルカゴン誘導体は１６００ｎＭでそれぞれ懸濁させた後、４倍ずつ１０回連続的に希釈し、これをｃＡＭＰアッセイキット（ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ３８４ ｋｉｔ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に適用して前記細胞に添加した後、蛍光値を測定した。測定後、最も高い蛍光値を１００％と選定した後、これからグルカゴン誘導体のＥＣ₅₀値を算出した後、天然型グルカゴンと互いに比較した。その結果を前記表１に示した。

【0312】

前記で製造したグルカゴン誘導体は、グルカゴン受容体に活性が高いため肝細胞への標的が増加し、また、グルカゴン受容体を活性化させ、肝臓で目的とする疾患の治療的物質として利用され得る。

【0313】

実験例２：グルカゴン誘導体のｐＩの測定
前記実施例１で合成されたグルカゴン誘導体の改善された物性を確認するために、ＥｘＰＡＳｙサーバーでｐＩ／Ｍｗツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００３）を用いてアミノ酸配列からｐＩを推算した。

【0314】

前記表１に示されるように、配列番号：１の天然型グルカゴンが６．８のｐＩを有する一方、本発明による一部のグルカゴン誘導体は、約４～６の範囲のｐＩを有した。このようなグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに比べて低いか、高いｐＩを有するため、中性ｐＨなどで天然型グルカゴンに比べて改善された溶解度及び高い安定性を示すことができる。

【0315】

このような本発明によるグルカゴン誘導体は、肝臓で目的とする疾患に対する治療剤として使用時、患者のコンプライアンスを高めることができる。

【0316】

実験例３：グルカゴン誘導体持続型結合体の組織分布の確認
３匹のＳＤラット（ｒａｔ）でグルカゴン誘導体持続型結合体の代表例として選択した配列番号３７持続型結合体の組織及び臓器内の分布を比較した。

【0317】

具体的には、グルカゴン誘導体持続型結合体を各１５５８μｇ／ｋｇずつ皮下注射した後、４、４８、及び１６８時間で臓器を摘出した後、ＥＬＩＳＡ法を通じて組織（血清、脳、すい臓、心臓、腎臓、胃、小腸、大腸、肺、肝、脾臓、脂肪組織及び筋肉）における各物質濃度を測定及び比較した。Ｔ／Ｓ ｒａｔｉｏ（％）は、組織濃度／血清濃度＊１００で計算し、例えば、下記表３の４８時間データは、血清：１５５００．８±２６８６．９、肝臓：４６２５．４±１２１６．９であるが、Ｔ／Ｓ ｒａｔｉｏ（％）は４６２５．４／１５５００．８＊１００で約２９．８％と算出した。濃度の測定は、臓器を摘出した後、ＥＬＩＳＡ法で物質濃度を測定した。

【0318】

その結果、グルカゴン誘導体持続型結合体は、投与後４８時間で組織分布が最も強く検出され、特に肝臓で高い分布比率を示した。組織の分布は、肝臓、心臓、肺、大腸、脾臓、小腸、筋肉、胃、すい臓、脂肪組織、腎臓の順で高かった。投与後１６８時間にも依然として肝臓で最も高い割合で検出され、投与後７日目までも肝臓で高い割合で存在することが分かった。併せて、投与後１６８時間では肝臓で最も高い割合で存在し、４８時間と比較し、心臓より肺で分布比率が高かった。前記実施例で確認した配列番号３７持続型結合体の血清に比べた組織分布比率の結果を要約すると、下記表２の通りである。

【0319】

【表2】

【0320】

前記のような結果は、本発明のグルカゴン誘導体の持続型結合体が他の組織に比べて肝臓で組織分布性に優れ、目的とする疾患の治療的物質として利用できることを示唆することである。従って、肝組織への標的化を誘導し、必要な量の薬物を効率よく伝達できるようにして薬物治療を最適化できる新たな用途でグルカゴン誘導体の持続型結合体を用いることができる。

【0321】

また、前記のような結果は、投与後７日目にも肝臓における分布が高いことを示唆することであり、１週に約１回投与できる製剤としての便宜性を裏付けることである。

【0322】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものでないことをで理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【0323】

［国家支援研究開発に関する説明］
本研究は、科学技術情報通信部、産業通商資源部、保健福祉部の財源で国家新薬開発事業団の国家新薬開発事業支援により行われた（ＨＮ２１Ｃ０６０１）。

【配列表】

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【国際調査報告】