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特表2025-500510糖転移酵素変異体、およびこれを利用したステビオール配糖体の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】糖転移酵素変異体、およびこれを利用したステビオール配糖体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20241226BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20241226BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241226BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10
C07K16/40 ZNA
C07K19/00
C12P19/00
C12N1/19
C12N1/21
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538435
(86)(22)【出願日】2022-12-26
(85)【翻訳文提出日】2024-06-24
(86)【国際出願番号】 KR2022021327
(87)【国際公開番号】W WO2023121427
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】10-2021-0187435
(32)【優先日】2021-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500578515
【氏名又は名称】サムヤン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジョンミン
(72)【発明者】
【氏名】コ，ヒョクジン
(72)【発明者】
【氏名】ムン，ジュンホ
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ウンス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AF41
4B064CA01
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA26X
4B065AA72X
4B065AA88Y
4B065AB01
4B065CA41
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA30
4H045DA89
4H045EA01
4H045EA02
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、糖転移酵素変異体、およびこれを利用したステビオール配糖体の製造用組成物および製造方法に関し、さらに詳しくはステビオール配糖体にグルコースを転移するレバウジオシドの糖転移酵素および突然変異酵素、前記酵素を発現する組換え菌株、およびこれらを利用したステビオール配糖体のレバウジオシド製造方法に関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目および２０２番目のアミノ酸からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸が、セリンおよびバリンからなる群より選択された１種以上のアミノ酸で置換されたものである、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を有する酵素タンパク質。
【請求項2】
前記ステビオール配糖体基質が、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択される１種以上である請求項１に記載の酵素タンパク質。
【請求項3】
前記酵素タンパク質が、２時間～２４時間の酵素反応でレバウジオシドＡの４５重量％以上をレバウジオシドＤに転換する活性を有するものである請求項１に記載の酵素タンパク質。
【請求項4】
前記酵素タンパク質が、２時間～２４時間の酵素反応で、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型酵素のレバウジオシドＡ基質をレバウジオシドＤに転換する活性１００％を基準に、１０１％以上である請求項１に記載の酵素タンパク質。
【請求項5】
請求項１に記載のＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素タンパク質とｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ酵素タンパク質が連結された融合タンパク質。
【請求項6】
前記ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓからなる群より選択された１種以上の微生物由来ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅである請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の酵素タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換え微生物。
【請求項8】
前記微生物が、大腸菌、サッカロマイセス属微生物、およびピキア属微生物からなる群より選択される請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項9】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含むステビオール配糖体製造用組成物。
【請求項10】
前記組成物が、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択される１種以上を含む基質を追加的に含む請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記組成物が、ステビオシドおよびレバウジオシドＡを含む混合基質である請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物が、レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＥをレバウジオシドＭ（Ｒｅｂ）に転換する酵素を追加的に含む請求項９に記載の組成物。
【請求項13】
前記Ｒｅｂ Ｍに転換する酵素が、ステビア由来のＵＧＴ７６Ｇ１である請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素タンパク質が、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ酵素タンパク質が連結された融合タンパク質である請求項９に記載の組成物。
【請求項15】
前記組成物が、グルコースドナー（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｄｏｎｏｒ）を含む請求項９に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物が、グルコースドナーはＵＤＰ－グルコースである請求項９に記載の組成物。
【請求項17】
ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ酵素タンパク質を追加的に含むか、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ酵素タンパク質が、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素タンパク質と融合タンパク質で提供される場合、前記組成物が、ｓｕｃｒｏｓｅとＵＤＰを含む請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、糖転移酵素、およびこれを利用したステビオール配糖体の製造用組成物および製造方法に関し、さらに詳しくはステビオール配糖体にグルコースを転移するレバウジオシドの糖転移酵素、前記酵素を発現する組換え菌株、およびこれらを利用したステビオール配糖体のレバウジオシド製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
甘味料は、食品、飲料、または菓子産業で最も一般的に利用される成分として知られている。甘味料は、製造の間の最終食品産物に組み込まれたり、または単独用途で適切に希釈させた際に、食卓甘味料またはベ－キングにおける砂糖の代用品として家庭で利用することができる。甘味料は、例えばスクロース、高果糖コーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜のような天然甘味料、そして例えばアスパルテーム、サッカリンおよびスクラロース（ｓｕｃｒａｌｏｓｅ）のような人工甘味料を含む。
【0003】
ステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物は、多年生低木であるステビアレバウジアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）から抽出できる天然甘味料である。様々なレベルで精製されたステビア抽出物は、食品およびブレンドで高感度調味料として使用されたり単独で食卓甘味料として市販される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ステビア植物の抽出物は、レバウジオシドおよび甘味に寄与するその他ステビオール配糖体を含有するが、従来の市販製品は主にレバウジオシドＡであり、少量のレバウジオシドＣ、Ｄ、およびＦのようなその他グリコシドがある。植物から抽出したステビア抽出物は、異臭（ｏｆｆ－ｆｌａｖｏｒｓ）の原因になる誘導された化合物のような汚染物質を含有し得る。このような異臭は、選択された食品システムまたは用途によっては、問題になる可能性がある。
そして、ステビア抽出物の組成物は、植物が成長する土壌および気候によって非常に多様である。原料植物、気候条件、および抽出工程により、商業的製造過程においてレバウジオシドＡの量は総ステビオールグリコシド含有量の２０～９７％と多様であると報告される。他のステビオールグリコシドがステビア抽出物内に多様な量で存在する。
ステビア植物から製造されたステビア抽出物は、様々なステビオール配糖体と異臭の原因になる化合物を含有しており、回収および精製が労働集約的であり非効率的であるため、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｍのような高収率が望まれるステビオールグリコシドを蓄積できる組換え製造システムが依然として求められている。このために、効率性が良い酵素の開発は依然として必要である。また、商業的用途のための組換え宿主からステビオールグリコシド（ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）であるＲｅｂ Ｍの製造のためのＲｅｂ Ｄの改善された製造に対する要求も依然として存在する。
そして、ステビア抽出物の組成物は、植物が成長する土壌および気候によって非常に多様である。原料植物、気候条件、および抽出工程により、商業的製造過程においてレバウジオシドＡの量は総ステビオールグリコシド含有量の２０～９７％と多様であると報告される。他のステビオールグリコシドがステビア抽出物内に多様な量で存在する。
ステビア植物から製造されたステビア抽出物は、様々なステビオール配糖体と異臭の原因になる化合物を含有しており、回収および精製が労働集約的であり非効率的であるため、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｍのような高収率が望まれるステビオールグリコシドを蓄積できる組換え製造システムが依然として求められている。このために、効率性が良い酵素の開発は依然として必要である。また、商業的用途のための組換え宿主からステビオールグリコシド（ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）であるＲｅｂ Ｍの製造のためのＲｅｂ Ｄの改善された製造に対する要求も依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の一例は、ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素、前記酵素タンパク質を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および形質転換微生物に関する。
【0006】
本発明の一例は、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、ステビオール配糖体の製造用組成物に関する。
【0007】
本発明の一例は、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を、前記酵素の基質と反応する工程を含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
【0008】
本発明の一例は、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する時必要な補助因子が活性型のグルコースであるＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅを供給し、グルコース転移を通じたステビオール配糖体を製造する方法に関する。
【0009】
本発明の追加の一例は、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する時必要な補助因子が、活性型のグルコースを提供しようとＵＤＰとｓｕｃｒｏｓｅを提供し、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅを追加的に含んで、グルコース転移を通じたステビオール配糖体を製造する方法に関する。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質は、従来知られているＵＧＴに比べてステビオール配糖体の複数の基質に作用する基質特異性を有し、反応副産物を作らない長所があり、前記酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択された１種以上の基質をグルコースドナーの存在下で反応して、ステビオール配糖体を製造することができ、ステビオール配糖体は高甘味度甘味料として様々な食品、飲料などに添加して使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の一例に係るＲｅｂ Ｄに転換する酵素を産生する酵母菌株の製造のためのベクターの開裂地図（ｃｌｅａｖａｇｅ ｍａｐ）である。
【図2】本発明の一例に係るＲｅｂ Ｄに転換する酵素の反応生成物をＨＰＬＣ分析で分析して得られた結果グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一例は、ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素に関するものであって、さらに詳しくはＵＤＰ－グルコシル転移酵素（すなわち、ウリジン二リン酸グルコシル転移酵素、ＵＧＴと略称する）である。
本発明の一例は、ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素に関するものであって、さらに詳しくはＵＤＰ－グルコシル転移酵素（すなわち、ウリジン二リン酸グルコシル転移酵素、ＵＧＴと略称する）である。
【0013】
具体的に、本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目および２０２番目のアミノ酸からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸が、セリンおよびバリンからなる群より選択された１種以上のアミノ酸で置換された変異酵素であってもよい。詳しくは、前記変異酵素は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目のトレオニンがセリンで置換、２０２番目のバリンがロイシンで置換、または２０１番目のトレオニンがセリンで置換と２０２番目のバリンがロイシンで置換されたものを含み、さらに詳しくは配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。
【0014】
また前記変異酵素を暗号化するポリヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目のトレオニンがセリンで置換、２０２番目のバリンがロイシンで置換または２０１番目のトレオニンがセリンで置換と２０２番目のバリンがロイシンで置換されたものを含み、さらに詳しくは配列番号３のアミノ酸配列によって暗号化されるポリヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド配列を含む変異酵素である。
【0015】
本発明に係る変異酵素ＴａＵＧＴｍ（Ｔ２０１Ｓ）は、配列番号１の野生型酵素アミノ酸配列でＮ－末端から２０１番に位置するＴｈｒがＳｅｒで置換されたものであり、例えばＡＣＣがＴＣＡで置換され、ＴａＵＧＴｍ（Ｖ２０２Ｌ）は２０１番に位置するＶａｌがＬｅｕで置換されたものであり、例えばＧＴＡがＴＴＡで置換されたものであり、またはＴａＵＧＴｍ（Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ）は、配列番号１の野生型酵素アミノ酸配列でＮ－末端から２０１番および２０２番のアミノ酸に該当するＴｈｒ－ＶａｌがＳｅｒ－Ｌｅｕで置換されたものであり、さらに詳しくは配列番号２のポリヌクレオチド配列でＡＣＣＧＴＡがＴＣＡＴＴＡで置換されるものであってもよい。
【0016】
本発明のさらに他の例によれば、前記変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列同一性が９２％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上のアミノ酸配列を含むことができ、酵素タンパク質と相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を含む変異型酵素タンパク質も含む。ただし、前記変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型酵素を含まない。
【0017】
前記変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を暗号化するポリヌクレオチド配列と配列同一性が４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上のポリヌクレオチド配列によって暗号化されるものであってもよい。ただし、前記変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号２のポリヌクレオチド配列からなる野生型酵素を含まない。
【0018】
前記において、用語「相同性」または「一致性」は、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、百分率で表示される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列は「％相同性」または「％同一性」と表示される。
【0019】
前記変異型酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型酵素のレバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）基質をレバウジオシドＤ（Ｒｅｂ Ｄ）に転換する活性１００％を基準に、１０１％以上、例えば１０１％～２００％の活性を有するものであってもよい。すなわち、酵素の活性向上のために突然変異による酵素改良を実施し、Ｒｅｂ ＤとＲｅｂ Ｅの生産速度を向上させ、第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素、例えばステビア由来のＵＧＴ７６Ｇ１と反応してレバウジオシドＭ（Ｒｅｂ Ｍ）を生産することができる。これにより、酵素転換反応をＲｅｂ ＤとＲｅｂ Ｅの生産性を増加させ、これを利用してＲｅｂ Ｍという高機能性ステビオール配糖体を高い生産性で製造することができる。
【0020】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、グルコースドナーの存在下でステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択される１種以上の基質からステビオール配糖体、例えばＲｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択される１種以上に転換する活性を有し、さらに詳しくはＲｅｂ ＡをＲｅｂ Ｄに転換し、ステビオシドをＲｅｂ Ｅに転換することができ（下記反応式１参照）、Ｒｅｂ Ａおよびステビオシドの単独基質または混合基質に対しては全て転換活性を有する。
【0021】
【化1】
【0022】
前記反応式１に示したように、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄに転換するのは、ステビオール環（Ｓｔｅｖｉｏｌ ｒｉｎｇ）でｂｅｔａ１－２ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｂｏｎｄを通じてグルコースを転移するもので、主にステビオール環の１９番位置で糖化が起こったステビオール配糖体を生成する。ステビオール配糖体は、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）がβ結合で１～３個が結合されたものである。ステビオール配糖体は、ステビアレバウジアナベルトニ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）の葉で発見される化合物の部類であり、これらはＣ１３およびＣ１９位置に炭水化物残基の存在によって異なる単一塩基（ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ）であるステビオールにより構造的に区別される。ステビオール配糖体は、一般にステビオシド、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）、レバウジオシドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＭなどを含むが、これらに限られない。
【0023】
Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄへの転換反応は、グルコース１分子がさらに添加される反応でＵＧＴ酵素によって起こる。この反応に必要なグルコースは、活性形態のＵＤＰ－グルコースが必要であり、ＵＧＴ酵素がＵＤＰ－グルコースでグルコースを転移してステビオール配糖体を製造する。したがって、本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素とＵＤＰ－グルコースを生成できるＳｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素と融合された融合タンパク質に関する。
【0024】
好ましくは、ＵＤＰ－グルコースは、高価な補助基質であり、より安価な供給を必要とする。Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素は、ｓｕｃｒｏｓｅを分解してフルクトースとＵＤＰ－グルコースを作る酵素である。したがって、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄに転換する反応、あるいはステビオシドからＲｅｂ Ｅに転換する反応にＳＵＳ酵素を追加して、ＵＤＰとｓｕｃｒｏｓｅを供給し、最終的にＵＧＴ酵素にＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを供給すれば、より経済的にＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを供給し反応を進行することができる。前記ＳＵＳ酵素は、本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素を含むステビオール配糖体製造用組成物にそれ自体で、または本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素と融合タンパク質形態で提供することができる。
【0025】
例えば、ＵＧＴとＳＵＳを融合タンパク質で製造して前記転換反応を行うと、二つの反応が一つのチャンネルを形成して酵素反応が一括して起こり得るため、効果的な転換反応を起こすことができる。また、ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を利用する場合、基質に対して１／１０のＵＤＰを使用して転換が可能であり、ＵＤＰの場合ＲＡ４０に対して１／１００より低い量を利用した反応が可能である。前記融合酵素を利用した転換反応を通じて経済的な基質転換が可能であり、高濃度基質反応によるステビオール配糖体を生成することができる。
【0026】
前記ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓからなる群より選択された１種以上の微生物由来ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅであるがこれに限られない。さらに詳しくは前記ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ＳＵＳ１酵素であり、例えば配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号４のアミノ酸配列によって暗号化されるポリヌクレオチド配列または配列番号５のポリヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
【0027】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、直接またはリンカーを介してｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅと融合することができる。前記リンカーは、アミノ酸４～１５個で構成されたペプチドであるが、さらに詳しくはＧ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）およびＰ（Ｐｒｏ）からなる群より選択された１種以上のアミノ酸を４個～１５個含むものであり、具体的にＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）、またはＧＧＧＧＰＳＰＧＧＧＧＳ（配列番号１１）であってもよい。
【0028】
本発明の具体的な一例において、本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素と、リンカー（ＧＧＧＧＳＧ）を介してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ＳＵＳ１酵素と連結された融合タンパク質であり、具体的に配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または配列番号７のアミノ酸配列によって暗号化されるポリヌクレオチド配列または配列番号８のポリヌクレオチド配列を有することができる。
【0029】
本発明に係る変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、２時間～２４時間の酵素反応で、Ｒｅｂ Ａの４５重量％以上がＲｅｂ Ｄに転換する活性を有し、具体的にＲｅｂ Ａの４５重量％以上、５０重量％以上、７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、または９５重量％以上が、Ｒｅｂ Ｄに転換する活性を有し、好ましくは７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、または９５重量％以上が、Ｒｅｂ Ｄに転換する活性を有する。さらに詳しくは前記酵素の転換活性は、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で測定されたものである。前記Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）は、下記数式１によって計算され、詳しい事項は実施例４に記載されている。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
【0030】
本発明に係る変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素に比べて、２時間～２４時間の酵素反応でＲｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性として、Ｒｅｂ Ｄの相対転換率が１０１％以上、１０３％以上、１０５％以上、１０７％以上、１０８％以上、１０９％以上、または１１０％以上を有し、より好ましくは１０５％以上、１０７％以上、１０８％以上、１０９％以上、１１０％以上、１１５％以上、１２０％以上または１２５％以上を有する。前記酵素の転換活性は、３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で測定されたものである。前記酵素のＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、前記数式１に従って計算する。詳しい測定基準は下記実施例４に記載されている。
【0031】
また、変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質で２時間～２４時間の酵素反応で、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質の５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、７９重量％以上、８０重量％以上、８１重量％以上、８２重量％以上、８３重量％以上、８５重量％以上、または８７重量％以上が、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅに転換する活性（Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率）を有する。さらに詳しくは前記酵素の転換活性は、３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で測定されたものである。
【0032】
本発明に係る変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素に比べて、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質で２時間～２４時間の酵素反応で、Ｒｅｂ Ａおよびステビオシドを含む混合基質の５０重量％以上がＲｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅに転換する活性（Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率）を、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性とステビオシドをＲｅｂ Ｅに転換する活性の合計活性として、Ｒｅｂ Ｄ／Ｅの相対転換率が１０３重量％以上、１０５重量％以上、１０６重量％以上、１０８重量％以上、１０９重量％以上、または１１０重量％以上を有する。さらに詳しくは前記酵素の転換活性は、３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件およびｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ：ＳＴＥ（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）＝４０：６０を有する混合基質を使用して測定されたものである。前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計相対転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ転換率１００重量％を基準に換算した野生型酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ転換率を意味する。すなわち、混合基質に対するＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率は、下記数式２に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅの相対的合計転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率１００重量％を基準に換算した変異型ＴａＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
【0033】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素の野生型酵素は、植物由来の酵素を探索して得られた、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の酵素に関する。前記タンパク質の機能を明らかにしてＵＧＴ酵素活性を確認し、ステビオシドまたはＲｅｂ Ａを、それぞれＲｅｂ ＥまたはＲｅｂ Ｄに転換する酵素活性を確認した。
【0034】
高甘味度を有するＲｅｂ Ｄは、ステビア植物体に少量存在する糖であり、Ｒｅｂ Ａから生成され、この生成過程に関与する周知の酵素は、ステビアのＵＧＴ９１Ｄ２である。これと類似の活性を有する酵素が、米に存在するＥＵＧＴ１１酵素である。ステビアのＵＧＴ９１Ｄ２の場合、ステビオールグリコシドのＲｅｂ ＡをＲｅｂ Ｄに転換する活性を有するが、転換活性が低く、高濃度のＲｅｂ Ｍを高収率で製造するには困難がある。
【0035】
また、従来に知られたＵＧＴ酵素は、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）から由来するＵＧＴ、稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）から由来するＵＧＴ（以下、ＥＵＧＴ１１という）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）から由来するＵＧＴ（以下、ＨｖＵＧＴという）がある。本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素、従来に知られたＥＵＧＴ１１およびＨｖＵＧＴに比べてステビオール配糖体の複数の基質に作用する基質特異性を有し、反応副産物を作らない長所がある。前記ＥＵＧＴ１１酵素のアミノ酸配列を配列番号１２に示し、ポリヌクレオチド配列は配列番号１３に示す。前記ＨｖＵＧＴ酵素のアミノ酸配列を配列番号１４に示し、ポリヌクレオチド配列は配列番号１５に示している。
【0036】
前記配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素は、ＨｖＵＧＴおよびＥＵＧＴ１１とアミノ酸配列と配列同一性を分析した結果、ＨｖＵＧＴとは９１％、ＥＵＧＴとは６６％のアミノ酸配列同一性を有し、ポリヌクレオチド配列同一性を分析した結果、ＨｖＵＧＴとは３６％、ＥＵＧＴ１１とは３７％のポリヌクレオチド配列同一性を有すると分析された。
【0037】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、反応温度１０～５０℃およびｐＨ５．０～９．０の水系中で行うことができる。好ましくは、反応を温度２５～４０℃およびｐＨ６．０～８．０の水系（ａｑｕｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）中で、より好ましくは反応を温度３０℃およびｐＨ７．２の水系中で行うことができる。発明の好ましい一例によれば、反応をｐＨ７．２のリン酸緩衝液中で行うことができる。本発明の一例は、ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクターおよび形質転換微生物に関する。
【0038】
前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質は、ＵＤＰ－グルコースを生成できるＳｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素と融合された融合タンパク質で発現できるように、融合タンパク質を暗号化する核酸分子で提供することができ、前記ＵＤＰ－グリコシル転移酵素と直接またはリンカーを介して連結される。前記グルコースを転移する糖転移酵素タンパク質、ＳＵＳ酵素、これらの融合タンパク質については上述した通りである。
【0039】
本発明によれば、組換え微生物または細胞は、微生物細胞であり、好ましくは大腸菌、サッカロマイセス属菌株、例えばサッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア属菌株などを含むが、これに限られない。
【0040】
本明細書において、用語「形質転換」は、標的タンパク質を暗号化する核酸を含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記核酸が暗号化するタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換された核酸は、宿主細胞内で発現することができる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なしにこれら全てを含むことができる。また、前記核酸は、標的タンパク質を暗号化するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記核酸は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態で導入されてもよい。例えば、前記核酸は、自ら発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体の発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、通常前記核酸に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位および翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記核酸は、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞での発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり、これに限られない。
【0041】
本出願で使用されるベクターは特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。細胞内染色体挿入用ベクターを介して目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって行われるが、これに限定されない。前記染色体挿入の有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。
【0042】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本発明の目的タンパク質を暗号化する核酸の転写を開始および媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0043】
本発明の一例によるステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質を暗号化する核酸分子を含む組換えベクターの一例は、図１の開裂地図に示されている。例えば、本発明に係る酵素を暗号化する核酸分子と、前記核酸分子に連結されて作動可能な転写調節配列としてＧＡＬ１０プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターなどを含むことができる。前記転写プロモーターは、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＴＥＦ１、ＧＰＤ１、およびＴＤＨ３プロモーターなどを含むことができ、前記転写ターミネーターは、ＣＹＣ１、ＴＥＦ１およびＰＧＫ１などを含むことができる。
【0044】
本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入する方法も含まれ、宿主細胞に応じて、当分野に公知の通り適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈澱、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【0045】
本発明の一例は、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、ステビオール配糖体の製造用組成物に関する。
【0046】
前記ステビオール配糖体の製造用組成物は、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択される１種以上を含む基質を追加的に含むことができ、例えばステビオシドまたはＲｅｂ Ａ単独基質、またはこれらの混合基質であってもよい。前記混合基質は、ステビオシドまたはＲｅｂ Ａを混合したり、ステビオシドまたはＲｅｂ Ａを含むステビア抽出物（またはステビア）であってもよい。前記基質または反応原料は、具体的にレバウジオシドＡがステビア抽出物全体体積基準に、５０～７０（ｖ／ｖ）％、５０～６５（ｖ／ｖ）％、５０～６２（ｖ／ｖ）％、５５～７０（ｖ／ｖ）％、５５～６５（ｖ／ｖ）％、５５～６２（ｖ／ｖ）％、５８～７０（ｖ／ｖ）％、５８～６５（ｖ／ｖ）％または５８～６２（ｖ／ｖ）％、例えば、６０（ｖ／ｖ）％の含有量で含まれ、ステビオシドが、ステビア抽出物全体体積基準に３０～５０（ｖ／ｖ）％、３０～４５（ｖ／ｖ）％、３０～４２（ｖ／ｖ）％、３５～５０（ｖ／ｖ）％、３５～４５（ｖ／ｖ）％、３５～４２（ｖ／ｖ）％、３８～５０（ｖ／ｖ）％、３８～４５（ｖ／ｖ）％または３８～４２（ｖ／ｖ）％、例えば、４０（ｖ／ｖ）％の含有量で含まれるが、これに制限されない。
【0047】
前記ステビオール配糖体の製造用組成物は、Ｒｅｂ ＤまたはＲｅｂ Ｅを、Ｒｅｂ Ｍに転換する酵素を追加的に含むことができ、例えば第２ＵＤＰ－グリコシル転移酵素であり、具体的にステビア由来のＵＧＴ７６Ｇ１などを含む。
【0048】
前記組成物は、グルコースドナーを追加的に含むことができ、例えばＵＤＰ－グルコースまたはＵＤＰ－グルコースを生成できる糖類を含む。
【0049】
前記組成物は、グルコースドナーの一例であるＵＤＰ－グルコースを生成できるＳｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素とその基質は砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）を追加的に含むことができる。本発明の一例において、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質がＳＵＳ酵素タンパク質と融合タンパク質で提供され、この場合、ＳＵＳ酵素タンパク質と砂糖を必要とせずステビオール配糖体を製造することができる。
【0050】
前記培養物は、ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物から産生された酵素を含むもので、前記菌株を含むか、菌株を含まない無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）形態であってもよい。前記破砕物は、ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物の菌体を破砕した破砕物、または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液を意味し、前記ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物から産生された酵素を含むものである。
【0051】
前記菌株の培養物は、前記ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物から産生された酵素を含み、前記微生物菌体を含むか、または含まない無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）形態であってもよい。本明細書において、別途の言及がない限り、使用されるＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌体の破砕物、前記破砕物の上澄み液、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含むものを意味する。
【0052】
前記ステビオール配糖体製造用組成物を利用してステビオール配糖体を製造する場合、ＵＤＰ－グルコシル転移酵素または酵素を産生する微生物を利用した反応温度および反応ｐＨ条件は、前記酵素の反応温度および反応ｐＨ条件で上述した通りである。
【0053】
本発明の一例は、前記ステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を、前記酵素の基質と反応する工程を含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
【0054】
前記製造されたステビオール配糖体は、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択された１種以上であるか、またはＲｅｂ Ｍであってもよい。
【0055】
本発明の一例は、前記製造されたステビオール配糖体は、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択された１種以上である場合であり、具体的に本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択された１種以上の基質をグルコースドナーの存在下で反応する工程を含む、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択された１種以上のステビオール配糖体を製造する方法に関する。
【0056】
本発明の追加的な一例は、前記製造されたステビオール配糖体は、Ｒｅｂ Ｍである場合であり、具体的に本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択された１種以上の基質をグルコースドナーの存在下で反応して、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択された１種以上のステビオール配糖体を製造する工程、および
前記製造されたステビオール配糖体、第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、グルコースドナーの存在下で反応する工程を含む、ステビオール配糖体のＲｅｂ Ｍの製造方法に関する。
前記製造されたステビオール配糖体、第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、グルコースドナーの存在下で反応する工程を含む、ステビオール配糖体のＲｅｂ Ｍの製造方法に関する。
【0057】
前記Ｒｅｂ Ｍの製造工程で使用された第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質は、ＵＧＴ７６Ｇ１などであってもよい。
【0058】
前記ステビオール配糖体を製造する工程で提供されるグルコースドナーは、ＵＤＰ－グルコースであってもよく、これは化合物で提供されたり、砂糖とＳｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素で提供される。ＳＵＳ酵素は、砂糖を分解してフルクトースとＵＤＰ－グルコースを作る酵素である。したがって、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄに転換する反応、あるいはステビオシドからＲｅｂ Ｅに転換する反応にＳＵＳ酵素を導入して、ＵＧＴ酵素にＵＤＰ－グルコースを供給すれば、より経済的にＵＤＰ－グルコースを供給し反応を進行することができる。またＵＧＴにＳＵＳを融合タンパク質で製造して前記転換反応を行うと、二つの反応が一つのチャンネルを形成し、酵素反応が一つで起こるため、効果的な転換反応を起こすことができる。前記ＳＵＳ酵素およびＵＧＴとＳＵＳの融合タンパク質については上述した通りである。
【0059】
本発明に係るステビオール配糖体の製造方法は、製造周期を顕著に短縮し、生産能力を向上させ、低コストで純度の高い製品を提供することができるため、食品、飲料業界によって経済的に利用することができる。
【0060】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質の基質は、ステビア抽出物でＲｅｂ Ａを５０％含み、抽出物のステビオール多糖体の比率は９０％を占めた基質であり、例えばＳＩＮＯＣＨＥＭ（中国）社のステビア抽出物でＲｅｂ Ａを５０％含み、抽出物のステビオール多糖体の比率は９０％を占めた基質を利用して酵素転換を行うことができる。
【0061】
本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物を利用して製造されたステビオール配糖体は、高甘味度甘味料として、様々な食品、飲料などに添加して使用されたり単独で食卓甘味料として市販される。
【実施例】
【0062】
本発明を下記実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明の範囲が下記例示的な実施例の範囲に限られない。
【0063】
実施例１ 野生型酵素を発現する微生物作製
１－１： 野生型酵素を発現するベクター作製
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素タンパク質をコードする遺伝子を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、合成された遺伝子のポリヌクレオチド配列は配列番号２に示す。合成された遺伝子は発現が可能な形態を作るためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現するｐｌａｓｍｉｄにｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇした。
具体的に、タンパク質の活性を確認するために製造したｖｅｃｔｏｒはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで選別が可能なＵｒａａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ（選別マーカ）を含むｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒを使用し、ｐｒｏｍｏｔｅｒとしては、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
このｐｌａｓｍｉｄに新しく合成した（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋ）配列番号２の遺伝子をクローニングした。ＴａＵＧＴ遺伝子のクローニングのために、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号１６）とｃｙｃ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒＢ（配列番号１７）と重なるようにプライマー対（配列番号１９および配列番号１９）を作製し、ＰＣＲ増幅を通じて酵素遺伝子を増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＨＩＦｉ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ）を通じて遺伝子をサブクローニングした。サブクローニングしたプラスミド形態の遺伝子は、大腸菌（ＤＨ５ａ）に形質転換して選別および増幅し、増幅されたプラスミドの配列を分析して該当酵素の発現遺伝子が正確にサブクローニングされたことを確認した。
１－１： 野生型酵素を発現するベクター作製
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素タンパク質をコードする遺伝子を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、合成された遺伝子のポリヌクレオチド配列は配列番号２に示す。合成された遺伝子は発現が可能な形態を作るためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現するｐｌａｓｍｉｄにｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇした。
具体的に、タンパク質の活性を確認するために製造したｖｅｃｔｏｒはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで選別が可能なＵｒａａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ（選別マーカ）を含むｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒを使用し、ｐｒｏｍｏｔｅｒとしては、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
このｐｌａｓｍｉｄに新しく合成した（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋ）配列番号２の遺伝子をクローニングした。ＴａＵＧＴ遺伝子のクローニングのために、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号１６）とｃｙｃ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒＢ（配列番号１７）と重なるようにプライマー対（配列番号１９および配列番号１９）を作製し、ＰＣＲ増幅を通じて酵素遺伝子を増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＨＩＦｉ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ）を通じて遺伝子をサブクローニングした。サブクローニングしたプラスミド形態の遺伝子は、大腸菌（ＤＨ５ａ）に形質転換して選別および増幅し、増幅されたプラスミドの配列を分析して該当酵素の発現遺伝子が正確にサブクローニングされたことを確認した。
【0064】
【表1】
【0065】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に遺伝子を導入する形質転換方法は、ＬｉＡｃ（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ）を０．１Ｍ処理して熱衝撃により導入した。導入された菌株は、ＳＣ_Ｕｒａ培地で選別し、選別されたコロニーは培養を通じて酵素の活性を確認した。
【0066】
製造された組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）菌株に形質転換した。ＳＣ－Ｕｒａ固体培地（ＳＣ_Ｕｒａ培地＋２％ａｇａｒ）で選別マーカを通じて遺伝子カセット挿入された組換え菌株を選別した。ＳＣ－Ｕｒａ固体培地の組成は、ＹＮＢ６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘ０．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ５０ｇ／Ｌおよびａｇａｒ２０ｇ／Ｌを含み、ｐＨを６．０に調整した。
【0067】
１－２： 組換え微生物の培養
実施例１－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
具体的に、ＳＣ_Ｕｒａ固体培地で選別されたコロニーを３ｍＬＳＣ_Ｕｒａ液体培地が含まれた試験管に接種し、一夜培養した。培養した菌体の濃度をＯＤ600吸光度の測定により確認し、２５ｍＬのＳＣ－Ｕｒａ液体培地を入れた２５０ｍＬフラスコにＯＤ600吸光度が最終的に０．１（ｆｉｎａｌ）になるように接種し、２４時間１次培養（３０℃、２４０ｒｐｍ）した。１次培養した菌体の酵素発現を誘導するために、ＹＰＧ培地を同量添加して２４時間２次培養した。前記２次培養した菌体は、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って集めた。ＳＣ_Ｕｒａ液体培地の組成は、ＹＮＢ（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｅ ｂａｓｅ）６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ｍｉｘ ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ｇ／ＬおよびＭＥＳ ｍＭを含み、ＮａＯＨを利用して培地ｐＨを６．０に調整した。前記ＹＰＧ培地組成は、Ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ２０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ２０ｇ／ＬおよびＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）１００ｍＭを含み、培地のｐＨを６．０に調整した。
実施例１－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
具体的に、ＳＣ_Ｕｒａ固体培地で選別されたコロニーを３ｍＬＳＣ_Ｕｒａ液体培地が含まれた試験管に接種し、一夜培養した。培養した菌体の濃度をＯＤ600吸光度の測定により確認し、２５ｍＬのＳＣ－Ｕｒａ液体培地を入れた２５０ｍＬフラスコにＯＤ600吸光度が最終的に０．１（ｆｉｎａｌ）になるように接種し、２４時間１次培養（３０℃、２４０ｒｐｍ）した。１次培養した菌体の酵素発現を誘導するために、ＹＰＧ培地を同量添加して２４時間２次培養した。前記２次培養した菌体は、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って集めた。ＳＣ_Ｕｒａ液体培地の組成は、ＹＮＢ（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｅ ｂａｓｅ）６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ｍｉｘ ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ｇ／ＬおよびＭＥＳ ｍＭを含み、ＮａＯＨを利用して培地ｐＨを６．０に調整した。前記ＹＰＧ培地組成は、Ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ２０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ２０ｇ／ＬおよびＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）１００ｍＭを含み、培地のｐＨを６．０に調整した。
【0068】
１－３： ＥＵＧＴ１１およびＨｖＵＧＴを発現する微生物製造
既存の活性が知られているＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ＥＵＧＴ１１遺伝子（配列番号１３）とＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来ＨｖＵＧＴの遺伝子（配列番号１５）を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、ＴａＵＧＴ遺伝子と同様に遺伝子を増幅し、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。同じ条件で酵素発現を誘導するために、ｐｒｏｍｏｔｅｒはＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
具体的に、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＥＵＧＴ１１の正方向プライマー（配列番号２０）、ＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＥＵＧＴ１１の逆方向プライマー（配列番号２１）、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＨｖＵＧＴの正方向プライマー（配列番号２２）、およびＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＨｖＵＧＴの逆方向プライマー（配列番号２３）を使用した。前記製造された酵素産生遺伝子カーセットを前記表１でＳｃはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを意味する。
その後、実施例１－１および１－２の方法と実質的に同じ方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に形質転換し、菌株選別および微生物培養を行った。
既存の活性が知られているＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ＥＵＧＴ１１遺伝子（配列番号１３）とＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来ＨｖＵＧＴの遺伝子（配列番号１５）を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、ＴａＵＧＴ遺伝子と同様に遺伝子を増幅し、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。同じ条件で酵素発現を誘導するために、ｐｒｏｍｏｔｅｒはＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
具体的に、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＥＵＧＴ１１の正方向プライマー（配列番号２０）、ＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＥＵＧＴ１１の逆方向プライマー（配列番号２１）、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＨｖＵＧＴの正方向プライマー（配列番号２２）、およびＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＨｖＵＧＴの逆方向プライマー（配列番号２３）を使用した。前記製造された酵素産生遺伝子カーセットを前記表１でＳｃはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを意味する。
その後、実施例１－１および１－２の方法と実質的に同じ方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に形質転換し、菌株選別および微生物培養を行った。
【0069】
１－４： 酵素活性評価
実施例１－２および実施例１－３で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集めて同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）の１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して、反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定した。
具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析に使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｄｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで確認した。移動相は０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水とアセトニトリルをそれぞれ利用してＧｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分分析して確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件を下記表２に示した。
実施例１－２および実施例１－３で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集めて同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）の１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して、反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定した。
具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析に使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｄｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで確認した。移動相は０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水とアセトニトリルをそれぞれ利用してＧｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分分析して確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件を下記表２に示した。
【0070】
【表2】
【0071】
前記転換生成物のＨＰＬＣ分析グラフは表３に示す。下記表３に示されたＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、下記数式１に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ相対転換率は、ＥＵＧＴ１１のＲｅｂ Ｄ転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴまたはＨｖＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
【0072】
【表3】
【0073】
表３に示したように、酵素反応による転換率は、初期３時間反応の結果、ＴａＵＧＴはＥＵＧＴ１１と類似するようにＲｅｂ ＡのＲｅｂ Ｄ転換を４０～４５％転換し、ＨｖＵＧＴ（３０～３５％転換）よりも３０％程度の活性向上を有する酵素であることを確認した。
また、１８時間の酵素反応液の生成されたＲｅｂ Ｄ含有量分析結果、三つの酵素の転換率大きさの順序が３時間反応と類似した傾向性を示した。
前記ＴａＵＧＴ酵素のポリヌクレオチド配列を（株）マクロジェンのポリヌクレオチド配列分析サービスを通じて分析し、ポリヌクレオチド配列に基づいてアミノ酸配列を分析し、その結果、アミノ酸配列は配列番号１に示し、ポリヌクレオチド配列は配列番号２に示す。
また、１８時間の酵素反応液の生成されたＲｅｂ Ｄ含有量分析結果、三つの酵素の転換率大きさの順序が３時間反応と類似した傾向性を示した。
前記ＴａＵＧＴ酵素のポリヌクレオチド配列を（株）マクロジェンのポリヌクレオチド配列分析サービスを通じて分析し、ポリヌクレオチド配列に基づいてアミノ酸配列を分析し、その結果、アミノ酸配列は配列番号１に示し、ポリヌクレオチド配列は配列番号２に示す。
【0074】
実施例２ 酵素変異体を発現する微生物作製
２－１： 酵素変異体発現のためのベクター作製
実施例１のＴａＵＧＴ酵素の突然変異を開発するために、既存のＥＵＧＴ１１遺伝子を基本にして突然変異を探索した。Ａｌｉｇｎｍｅｎｔを通じてｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎを確認し、ＵＧＴのＮ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ａｃｃｅｐｔｏｒとＣ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ｄｏｎｏｒ機能をするｄｏｍａｉｎの間の位置にアミノ酸の差を比較した。そのうち２０１番残基のトレオニンと２０２番残基のバリンの場合（ＥＵＧＴ１１ではセリンと、ロイシンアミノ酸が位置）トレオニンはセリンに、バリンはアラニンまたはロイシンに変えた。突然変異方法は、ＴａＵＧＴの該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２４および２５）して該当部位のポリヌクレオチド配列を変える突然変異遺伝子増幅（ＰＣＲ）を実施し、増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを介してｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。
結果として得られたｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされたＴａＵＧＴＴ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌと命名した。本実施例で使用したプライマ－の配列は下記表４に記載した。
２－１： 酵素変異体発現のためのベクター作製
実施例１のＴａＵＧＴ酵素の突然変異を開発するために、既存のＥＵＧＴ１１遺伝子を基本にして突然変異を探索した。Ａｌｉｇｎｍｅｎｔを通じてｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎを確認し、ＵＧＴのＮ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ａｃｃｅｐｔｏｒとＣ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ｄｏｎｏｒ機能をするｄｏｍａｉｎの間の位置にアミノ酸の差を比較した。そのうち２０１番残基のトレオニンと２０２番残基のバリンの場合（ＥＵＧＴ１１ではセリンと、ロイシンアミノ酸が位置）トレオニンはセリンに、バリンはアラニンまたはロイシンに変えた。突然変異方法は、ＴａＵＧＴの該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２４および２５）して該当部位のポリヌクレオチド配列を変える突然変異遺伝子増幅（ＰＣＲ）を実施し、増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを介してｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。
結果として得られたｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされたＴａＵＧＴＴ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌと命名した。本実施例で使用したプライマ－の配列は下記表４に記載した。
【0075】
【表4】
【0076】
２－２： 酵素変異体発現菌株作製
実施例１－２と実質的に同じ方法で、酵素の発現を確認するために、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされたＴａＵＧＴＴ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌは、ＬｉＡｃ方法で同様に酵母菌株に形質転換して選別した。形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は、液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
実施例１－２と実質的に同じ方法で、酵素の発現を確認するために、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされたＴａＵＧＴＴ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌは、ＬｉＡｃ方法で同様に酵母菌株に形質転換して選別した。形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は、液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
【0077】
実施例３： 酵素変異体の酵素活性評価
実施例２－２で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集めて同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は、基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定した。
具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析に使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで確認した。移動相は、０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水とアセトニトリルをそれぞれ利用してＧｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分の分析で確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件を下記表４に示した。前記転換生成物のＨＰＬＣ分析グラフは図２に示す。下記表４に示されたＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、下記数式１に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ相対転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ変異型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
実施例２－２で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集めて同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は、基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定した。
具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析に使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで確認した。移動相は、０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水とアセトニトリルをそれぞれ利用してＧｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分の分析で確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件を下記表４に示した。前記転換生成物のＨＰＬＣ分析グラフは図２に示す。下記表４に示されたＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、下記数式１に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ相対転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ変異型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
【0078】
前記ＴａＵＧＴの変異酵素とＲｅｂ Ａ基質を含む反応液を利用して酵素反応を１８時間行い、得られた転換生成物をＨＰＬＣ分析法で分析した。前記ＨＰＬＣ分析法で利用したＴａＵＧＴの変異酵素の活性分析結果は、下記表５および図２に示す。図２は、ＴａＵＧＴの変異酵素の利用したＲｅｂ Ｄ転換反応の反応生成物を分析したＨＰＬＣグラフである。
【0079】
【表5】
【0080】
実施例４ 混合基質を利用した酵素転換
菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を、冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は、基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ：ＳＴＥ（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）＝４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに実施例３に係る助酵素液０．２ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、反応開始後、１８時間に反応程度を確認した。実施例３の方法と実質的に同じ方法で、前記転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析した。
下記表６に示されたＲＡ４０混合基質に対するＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率は、下記数式２に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅの相対的合計転換率は、ＥＵＧＴ１１の全Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を、冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は、基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ：ＳＴＥ（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）＝４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに実施例３に係る助酵素液０．２ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、反応開始後、１８時間に反応程度を確認した。実施例３の方法と実質的に同じ方法で、前記転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析した。
下記表６に示されたＲＡ４０混合基質に対するＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率は、下記数式２に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅの相対的合計転換率は、ＥＵＧＴ１１の全Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
【0081】
【表6】
【0082】
前記実験の結果、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ２０１番をＳｅｒｉｎｅに変えた突然変異酵素の場合、野生型酵素を基準に相対転換率が１０６％であり、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ２０１番のＳｅｒｉｎｅへ、Ｖａｌｉｎｅ２０２番のＬｅｕｃｉｎｅへの変形を全て含む２重突然変異酵素は、野生型酵素を基準に相対転換率が１１４％に増加し、これにより、突然変異によって活性が向上する残基を確認し、活性が増加された変異酵素を確保した。
【0083】
実施例５ ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素作製および活性確認
実施例３で活性向上が確認されたＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を利用したステビオール配糖体の糖転移反応のために、必要なグルコースドナー（ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ）を供給しようと、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）酵素と融合タンパク質を製造した。
前記ＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を暗号化する核酸配列は下記表７の配列番号３０の核酸配列であり、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）は下記表７の配列番号５の核酸配列を使用した。
実施例３で活性向上が確認されたＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を利用したステビオール配糖体の糖転移反応のために、必要なグルコースドナー（ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ）を供給しようと、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）酵素と融合タンパク質を製造した。
前記ＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を暗号化する核酸配列は下記表７の配列番号３０の核酸配列であり、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）は下記表７の配列番号５の核酸配列を使用した。
【0084】
【表7-1】
【0085】
【表7-2】
【0086】
融合酵素の作製はｐｒｉｍｅｒを合成してＴａＵＧＴｍとＳＵＳとの間に連結アミノ酸配列をリンカー（ＧＧＧＧＳＧ、配列番号８）を使用し、それぞれの遺伝子は該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２６、配列番号２７）して、当該部位の塩基配列増幅（ＰＣＲ）を実施した。
遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を実施して増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じて、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングしてｐＲＳ４２６ＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳを作製した。前記使用されたＳＵＳ酵素タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４に示し、前記酵素タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列は、配列番号５に示し、前記融合酵素タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、前記融合タンパク質製造に使用されたリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧ（配列番号８）を有し、前記ＳＵＳ１酵素タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列、および使用されたプライマ－情報は下記表８に示す。
遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を実施して増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じて、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングしてｐＲＳ４２６ＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳを作製した。前記使用されたＳＵＳ酵素タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４に示し、前記酵素タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列は、配列番号５に示し、前記融合酵素タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、前記融合タンパク質製造に使用されたリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧ（配列番号８）を有し、前記ＳＵＳ１酵素タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列、および使用されたプライマ－情報は下記表８に示す。
【0087】
【表8】
【0088】
実施例１－２と同様な方法で、前記作製された融合酵素発現ベクターは酵母に形質転換した後選別して確保した。
実施例１－３と実質的に同じ方法で前記培養した菌体の破砕液を利用して助酵素液を製造した。具体的に、実施例３と実質的に同じ方法で、組換え菌株の培養物で遠心分離を利用して回収した菌体を回収し、ｇｌａｓｓ ｂｅａｄで菌体を破砕して助酵素液として使用した。
具体的に、反応液は、基質ＲＡ４０反応基質（９０重量％純度）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ、ｓｕｃｒｏｓｅを混合し、これにＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳ融合酵素の助酵素液をそれぞれ０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液でＲＡ４０反応基質１０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2１ｍＭ、およびＵＤＰ１ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ１２５ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、２０時間反応して酵素転換を確認した。
前記実施例１－４と実質的に同じ方法で、反応液の転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析して確認し、融合酵素の場合、ＵＤＰを利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ供給によってＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０）をＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換したことを確認した。ＳＴＥはステビオシドを示す。
実施例１－３と実質的に同じ方法で前記培養した菌体の破砕液を利用して助酵素液を製造した。具体的に、実施例３と実質的に同じ方法で、組換え菌株の培養物で遠心分離を利用して回収した菌体を回収し、ｇｌａｓｓ ｂｅａｄで菌体を破砕して助酵素液として使用した。
具体的に、反応液は、基質ＲＡ４０反応基質（９０重量％純度）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ、ｓｕｃｒｏｓｅを混合し、これにＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳ融合酵素の助酵素液をそれぞれ０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液でＲＡ４０反応基質１０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2１ｍＭ、およびＵＤＰ１ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ１２５ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で酵素反応を行い、２０時間反応して酵素転換を確認した。
前記実施例１－４と実質的に同じ方法で、反応液の転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析して確認し、融合酵素の場合、ＵＤＰを利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ供給によってＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０）をＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換したことを確認した。ＳＴＥはステビオシドを示す。
【0089】
反応前基質１００重量％に対して、初期融合酵素の転換反応で３３重量％程度の基質がＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換された。混合基質（ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０））の転換反応により、Ｒｅｂ Ｄ（Ｄ誘導体含む）とＲｅｂ Ｅは、それぞれ２１．７％と１２．１％に転換された。融合酵素の砂糖を利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ生成とこれを利用した基質の糖化により、ステビオール配糖体転換を確認し、基質の量と反応条件最適化により、酵素の転換反応を増加させることが可能であることを確認した。
融合酵素を利用した転換の場合、ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０）の転換のために、１０ｇ／Ｌ基質の場合、約１０ｍＭに該当する基質に転換反応する場合、１０～２０ｍＭ以上のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅが必要である。したがって、高濃度多量の転換をする場合、高価のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅの過剰量が必要である。高濃度基質を利用した酵素反応する場合、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅを過剰に使用すべきで、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ過剰量によって酵素活性を阻害するため好ましくない。
本実験によれば、ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を利用する場合、基質に対して１／１０のＵＤＰを使用して転換が可能であり、ＵＤＰの場合、ＲＡ４０に対して１／１００よりも低い量を利用した反応が可能である。融合酵素を利用した転換反応を通じて、経済的な酵素転換が可能であり、高濃度基質反応によるステビオール配糖体の生成が誘導されることを確認した。
融合酵素を利用した転換の場合、ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ＝４０：６０）の転換のために、１０ｇ／Ｌ基質の場合、約１０ｍＭに該当する基質に転換反応する場合、１０～２０ｍＭ以上のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅが必要である。したがって、高濃度多量の転換をする場合、高価のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅの過剰量が必要である。高濃度基質を利用した酵素反応する場合、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅを過剰に使用すべきで、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ過剰量によって酵素活性を阻害するため好ましくない。
本実験によれば、ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を利用する場合、基質に対して１／１０のＵＤＰを使用して転換が可能であり、ＵＤＰの場合、ＲＡ４０に対して１／１００よりも低い量を利用した反応が可能である。融合酵素を利用した転換反応を通じて、経済的な酵素転換が可能であり、高濃度基質反応によるステビオール配糖体の生成が誘導されることを確認した。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】