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特表2025-500511医薬品グレードのローズベンガルの光力学的抗グラム陽性菌活性
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】医薬品グレードのローズベンガルの光力学的抗グラム陽性菌活性
(51)【国際特許分類】
A61K 31/352 20060101AFI20241226BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241226BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241226BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
A61K31/352
A61K9/08
A61P31/04
A61P43/00 125
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538438
(86)(22)【出願日】2022-12-27
(85)【翻訳文提出日】2024-06-21
(86)【国際出願番号】 US2022054061
(87)【国際公開番号】W WO2023129535
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】63/294,252
(32)【優先日】2021-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510293969
【氏名又は名称】プロヴェクタス ファーマテック，インク．
(71)【出願人】
【識別番号】512018287
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ テネシー リサーチ ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100093300
【弁理士】
【氏名又は名称】浅井 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ミチオ クロス
(72)【発明者】
【氏名】ドミニク ロドリゲス
(72)【発明者】
【氏名】エドワード ブイ． パーシング
(72)【発明者】
【氏名】ブルース ホロヴィッツ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン 三世、 レイシー
(72)【発明者】
【氏名】エリック エー． ワクター
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA36
4C076AA53
4C076BB01
4C076BB11
4C076CC31
4C076CC32
4C076CC44
4C076EE16
4C076EE32
4C076EE33
4C076EE38
4C076FF67
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086GA13
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA21
4C086MA34
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA06
4C086NA07
4C086ZB35
4C086ZC71
(57)【要約】
この発明は、ローズベンガル（ＲＢ）誘導体と細菌の光照射とを組み合わせて使用して、照射された細菌を治療し殺すことを意図する。一態様では、グラム陽性菌は、本明細書中で考察した式Ｉのローズベンガル（ＲＢ）化合物を含む、約０.２から約３.１μｇ／ｍＬで溶解又は分散させた水性医薬組成物と細菌を接触させる方法で治療される。接触させた細菌は、約１から約１０分間、約５００ｎｍから約６００ｎｍの波長の光と接触させて、約０.７から約７.２Ｊ／ｃｍ２の光量を与える。約２から約１５μＭの濃度のＲＢ化合物を含む水性医薬組成物を使用して、バークホルデリア、サルモネラ、及びプロテウスのうちの１つ以上であるグラム陰性菌を治療する同様の方法が意図される。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グラム陽性菌を治療する方法であって、ａ）前記グラム陽性菌を、以下の式Ｉのローズベンガル（ＲＢ）化合物を含む、約０．２から約３．１μｇ／ｍＬの濃度で溶解又は分散させた水性医薬組成物と接触させるステップと、
ｂ）前記接触させた菌に約１から約１０分間、波長約５００ｎｍから約６００ｎｍの光を照射して、約０．７から約７．２Ｊ／ｃｍ２の光量を与えるステップと
を含み、
【化1】
Ｘが酸素である場合に、Ｒ１が、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ＋、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及び以下に定義する芳香環からなる群から選択され、
Ｘが窒素である場合に、Ｒ１及びＲ２が同じか又は異なり、水素、Ｃ１－Ｃ４アルキル、又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共に、及び以下に定義する芳香環からなる群から選択され、
前記芳香環が、５若しくは６員を含む単環、又は５、６若しくは６、６縮合芳香環系であり、前記芳香環又は環系が、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む方法。
【請求項2】
前記ＲＢ化合物がローズベンガルジナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記グラム陽性菌が、薬剤感受性及び薬剤耐性のＳ.アウレウス、Ｓ.エピダーミス、Ｅ.フェカーリス及びＥ.フェシウムのうちの１つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記グラム陽性菌が、枯草菌、セレウス菌、及び唾液連鎖球菌のうちの１つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記グラム陽性菌が、接触したときに哺乳類細胞内又は細胞上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記グラム陽性菌がバイオフィルムとして存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記グラム陽性菌が、約２から約５分間照射されて約１.４から約３.６Ｊ／ｃｍ２の光量を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記芳香環置換基が、【化2】
式中、
【化3】
【請求項9】
バークホルデリア、サルモネラ、及びプロテウスのうちの１つ以上からなる群から選択されるグラム陰性菌を治療する方法であって、ａ）前記グラム陽性菌を、以下の式Ｉのローズベンガル（ＲＢ）化合物を含む、約２から約１５μＭの濃度で溶解又は分散させた水性医薬組成物と接触させるステップと、
ｂ）前記接触させた菌に約１から約１０分間、波長約５００ｎｍから約６００ｎｍの光を照射して、約０．７から約７．２Ｊ／ｃｍ２の光量を与えるステップと
を含み、
【化4】
Ｘが酸素である場合に、Ｒ１が、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ＋、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及び以下に定義する芳香環からなる群から選択され、
Ｘが窒素である場合に、Ｒ１及びＲ２が同じか又は異なり、水素、Ｃ１－Ｃ４アルキル、又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共に、及び以下に定義する芳香環からなる群から選択され、
前記芳香環が、５若しくは６員を含む単環、又は５、６若しくは６、６縮合芳香環系であり、前記芳香環又は環系が、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む方法。
【請求項10】
前記グラム陽性菌が、接触したときに哺乳類細胞内又は細胞上に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記グラム陽性菌が、約２から約５分間照射されて約１.４から約３.６Ｊ／ｃｍ２の光量を与える、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
多剤耐性（ＭＤＲ）グラム陽性菌の出現の高まりは、公衆衛生上の大きな脅威の１つである［１－３］。特に、ブドウ球菌、腸球菌、及び連鎖球菌種のＭＤＲ株は、罹患率と死亡率に大きな影響を与える［４］。これらの病原体の極めて重要な抗菌剤（例えば、β－ラクタム、マクロライド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、グリコペプチド、オキサゾリジノン、環状ペプチド、デプシペプチド）に対する耐性率の増加は、大きな懸念事項である［５］。現在まで、ＭＤＲ細菌性病原体による感染症の治療を目的とした後期臨床試験で検討された新規化学物質はほとんどない［６］。
【0002】
天然由来の染料及び合成染料が抗菌剤や抗原虫剤として応用されてきた［７］。例えば、メチレンブルーやクロファジミンは今でも重要な希少疾病用医薬品と考えられている［８、９］。
【0003】
商用グレードのローズベンガル（ＲＢ）
ローズベンガル（ＲＢ）は、ウール染料として１９世紀に初めて合成され、その後日本において食用色素（食用赤色１０５号）として使われた明るいローズレッドのキサンテン誘導体化合物である［２８］。より具体的には、ＲＢはキサンテン化合物フルオレセインの誘導体である。フルオレセインと比較すると、ＲＢは、２種類の追加のハロゲン、すなわち４つの塩化物置換基及び４つのヨウ化物置換基を有する。
ローズベンガル（ＲＢ）は、ウール染料として１９世紀に初めて合成され、その後日本において食用色素（食用赤色１０５号）として使われた明るいローズレッドのキサンテン誘導体化合物である［２８］。より具体的には、ＲＢはキサンテン化合物フルオレセインの誘導体である。フルオレセインと比較すると、ＲＢは、２種類の追加のハロゲン、すなわち４つの塩化物置換基及び４つのヨウ化物置換基を有する。
【0004】
ＲＢを人間の眼表面損傷の視覚的診断（点眼による）に使用することは、１９１４年に初めて記述された［２９］。ＲＢは後に、１００ｍｇの単回投与後のヒトの肝臓の機能的能力を評価するための静脈内投与の比較的迅速な診断補助として導入された［３０］。１９７１年には、１３１Ｉ ＲＢ（Ｒｏｂｅｎｇａｔｏｐｅ（登録商標）、ローズベンガルナトリウム１３１Ｉ注射液（ＵＳＰ）が、肝機能を判断する際の診断補助薬として使用するために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された［３１、３２］。
【0005】
２００９年、Ｒｏｂｅｎｇａｔｏｐｅの製造業者であるＢｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ.は、肝臓画像診断のより新しい方法（コンピュータ断層撮影など）の出現により、ＲＢ製品を米国市場から正式に撤退させた。１９７４年、Ｂａｒｎｅｓ－Ｈｉｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.（Ｂａｒｎｅｓ－Ｈｉｎｄ）は、角膜損傷の染色、角膜炎、角結膜炎、乾性角膜炎の診断、及び眼内異物の検出を目的とした１％ＲＢ水溶液の医療機器製品を導入した［３３］。１９８１年、Ｂａｒｎｅｓ－Ｈｉｎｄは同じ適応症に対して同じ濃度の眼科用ストリップを導入した。両製品は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に販売が認められたものの、溶液及びストリップ機器もそれぞれの主張も、導入が正式なＦＤＡの審査及び承認より前であったため承認されなかった。
【0006】
市販されている染料含有量が８０％から９５％のＲＢ（総汚染物質と物質関連の不純物を含む）である商用グレードのＲＢは、１８８０年代にＧｎｅｈｍにより開発された歴史的プロセスを用いて製造される。診断用途に使用されるＲＢは、いくらかの不純物を含む商用グレードのＲＢであると考えられている［３４］。米国薬局方（ＵＳＰ）は以前、ＲＢを分析標準としてリストしていた。ＲＢは２０１９年にＵＳＰから削除された。したがって、商用グレードのＲＢは、現代の診断設定及び治療設定との関連性を欠いている。したがって、ＲＢをヒトの疾患の治療に適用することを検証することは、重大な規制上の課題をもたらす。
【0007】
ローズベンガル（ＲＢ）染料（４、５、６、７－テトラクロロ－２'、４'、５'、７'－テトラヨードフルオレセイン）は、黒色腫及びその他の固形癌の治療のために臨床的に研究されている［１０－１４］。ＲＢの光力学的抗菌性は散発的に報告されている［１５－２７及び７０］。例えば、Ｄｅｅｓ ｅｔ ａｌ．［７５］は、１～１０μＭのＲＢを５００～６００ｎｍの波長帯の緑色光照射と組み合わせて、グラム陽性及びグラム陰性の抗生物質耐性菌に使用することを教示しているが、光源、その強度又は照射時間についての詳細は記載されていない。その開示では、腫瘍の治療に２００ｍＷ／ｃｍ２の強度で１００Ｊ／ｃｍ２の５３２ｎｍ光とＲＢを使用するという報告があった（テーブル３）。
【0008】
ここでは、純粋なＲＢの抗菌活性と、光の存在下及び非存在下でのＭＤＲグラム陽性菌感染症の治療のための抗菌剤としての範囲と限界を報告する。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、ローズベンガル誘導体と、約１から約１０分間の波長約５００ｎｍから約６００ｎｍの光を細菌に照射することを併用して、照射した細菌を処理し殺すことを意図する。一態様では、グラム陽性菌は、細菌を、約０．２から約３．１μｇ／ｍＬの濃度で溶解又は分散させた、以下の式Ｉのローズベンガル（ＲＢ）化合物を含む水性医薬組成物と接触させるステップと、接触させた細菌に約１から約１０分間、波長約５００ｎｍから約６００ｎｍの光を照射して、約０．７から約７．２Ｊ／ｃｍ２の光量を与えるステップとを含む方法で治療される。式ＩのＲＢ化合物を以下に示す。
【0010】
【化1】
【0011】
ここで、Ｘは酸素又は窒素であり、「ｎ」はゼロ又は１であり、Ｘが酸素の場合、ｎはゼロでＲ２は存在しないのに対して、Ｘが窒素の場合、ｎは１でＲ２が存在する。Ｘが酸素の場合、Ｒ１は、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ＋、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及び後に本明細書で定義される芳香環含有置換基からなる群から選択される。Ｘが窒素の場合、Ｒ１及びＲ２は同じか又は異なり、水素、Ｃ１－Ｃ４アルキル、又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共に、及び芳香環置換基からなる群から選択される。芳香環置換基は、５若しくは６員を含む単環、又は５、６若しくは６、６縮合芳香環系であり、芳香環又は環系置換基は、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む可能性がある。
【0012】
例示的な芳香環置換基の構造式を以下に示す。
【0013】
【化2】
【0014】
治療するグラム陽性菌の例としては、薬剤感受性及び薬剤耐性のＳ.アウレウス、Ｓ.エピダーミス、Ｅ.フェカーリス及びＥ.フェシウムのうちの１つ以上、並びに枯草菌、セレウス菌、及び唾液連鎖球菌のうちの１つ以上が挙げられる。グラム陽性菌は、接触した場合又はバイオフィルムとして存在する場合に、哺乳類細胞内又は細胞上に存在する。好ましくは、細菌は、約２から約５分間照射されて、約１.４から約３.６Ｊ／ｃｍ２の光量を与える。
【0015】
同様の方法が、バークホルデリア、サルモネラ、及びプロテウスのうちの１つ以上であるグラム陰性菌を治療するのにも検討される。ここで、上記ＲＢ化合物は、水性医薬組成物中に約２から約１５μＭの濃度で溶解又は分散して存在する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
本開示の一部を構成する図面において、
【0017】
【図1A】６つの部分（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、及び図１Ｆ）に分かれたテーブル１であり、蛍光灯、ＬＥＤライト、（窓ガラス越しの）太陽光で照明した場合及び暗所の場合の、０.９Ｎ塩化ナトリウムの水溶液に溶解したさまざまな濃度のローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）に接触したグラム陽性菌及びグラム陰性菌の増殖の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。すべての試験を三重に行った。ＭＩＣ値は、リサズリン又はマラカイトグリーンを使用したＯＤ及び比色分析によって測定した。細菌はＡＴＣＣから購入するか、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州マナサス）から入手した。１７Ｗ、６３.８ｃｍ２の蛍光灯を使用した。ＭＩＣは２４時間（ｈ）の処理（２３.０ＫＪ／ｃｍ２）の後に測定した。９.５Ｗ、２８.３ｃｍ２のＬＥＤライトを使用した。ＭＩＣは２４時間の処理（２９.０ＫＪ／ｃｍ２）の後に測定した。試験は、テネシー大学健康科学センター（ＵＴＨＳＣ）薬学部５階のＢＳＬ－２実験室で実施された。９６ウェルプレートは実験室の東側に置かれ、建築窓から差し込む日光にさらされた。試験は９時間後に終了した（午前８時～午後５時、晴れ、３４℃（屋外）、２７℃（屋内））。試験は暗室で実施された。９６ウェルプレートはアルミホイルで覆われていた。ＭＩＣ値は２４時間後に測定された。“ｇ”＝ＭＩＣは測定されなかった。
【図2】寒天希釈及び液体希釈によって蛍光灯で照明したＲＢＤと接触させた１１種の細菌株のＭＩＣ及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を示す。すべての試験を三重に行った。ＭＩＣ値はコロニー形成単位（ＣＦＵ）を数えることによって決定した。細菌は、上記のようにＡＴＣＣから購入するか、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから入手した。１７Ｗ、６３.８ｃｍ２の蛍光灯を使用した。ＭＩＣは２４時間（ｈ）の処理（２３.０ＫＪ／ｃｍ２）の後に測定された。ＭＢＣ：最小殺菌濃度（μｇ／ｍＬ）。「日光」試験は図１のように実施した。「暗」試験は暗室で実施した。２４ウェルプレート及び３５ｍｍ培養皿で調製したＲＢ寒天培地をアルミホイルで覆うか、（寒天希釈によって）暗所に置いた。
【図3A】３つのパネル（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃ）に分かれた、細胞生存率（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）対時間（分単位）を示す時間－殺菌動態試験であって、図３ＡはＰＶ－１０（登録商標）、テネシー州ノックスビルのＰｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.から入手可能な０.９パーセント含水塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）中に１０％ローズベンガル（ｗ／ｖ）を含む製剤化したローズベンガル（ＨＢ－ＲＢｆ）組成物、５.０ｍｇ／ｍＬのＨＢ－ＲＢｆ、１.６ｍｇ／ｍＬのＨＢ－ＲＢｆ、１８ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシン、及び１０ｍｇ／ｍＬのリネゾリドを使用するものである。
【図3B】３つのパネル（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃ）に分かれた、細胞生存率（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）対時間（分単位）を示す時間－殺菌動態試験であって、図３Ｂは薬剤耐性グラム陽性菌に対する時間－殺菌動態試験において、Ｓ.アウレウスＢＡＡ－４４（登録商標）（３.２ｍｇ／ｍＬ）、Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）（０.８ｍｇ／ｍＬ）及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５（１.６ｍｇ／ｍＬ）に対して、２倍のＭＩＣ濃度のＨＢ－ＲＢｆが使用される。
【図3C】３つのパネル（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃ）に分かれた、細胞生存率（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）対時間（分単位）を示す時間－殺菌動態試験であって、図３ＣはＢ.セパシア（ＵＣＢ７０７）に対するＲＢ及び抗グラム陰性抗生物質の時間－殺菌動態を示すグラフ。
【図4A】３つのパネル（図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃ）に分かれており、３種類のグラム陽性菌のそれぞれによるバイオフィルムの処理において、図４Ａは、Ｓ.アウレウス６５０８（登録商標）による、蛍光灯下又は暗所でＨＢ－ＲＢｆ処理を行った場合の、リネゾリドとＨＢ－ＲＢｆの注目濃度の比較を示す。
【図4B】３つのパネル（図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃ）に分かれており、３種類のグラム陽性菌のそれぞれによるバイオフィルムの処理において、図４Ｂは、Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）による、蛍光灯下又は暗所でＨＢ－ＲＢｆ処理を行った場合の、リネゾリドとＨＢ－ＲＢｆの注目濃度の比較を示す。
【図4C】３つのパネル（図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃ）に分かれており、３種類のグラム陽性菌のそれぞれによるバイオフィルムの処理において、図４Ｃは、Ｅ.フェシウムＮＲ－３２０６５による、、蛍光灯下又は暗所でＨＢ－ＲＢｆ処理を行った場合の、リネゾリドとＨＢ－ＲＢｆの注目濃度の比較を示す。
【図6】図６は、Ａ（上群）とＢ（下群）の２つのパネルに分かれており、蛍光灯下でＨＢ－ＲＢｆ（すなわち「ＰＶ－１０」、上記の定義を参照）で処理した多層ヒト上皮ケラチン細胞（ＨＥＫａ）の顕微鏡写真であり、この細胞は、Ｎｕｎｃ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＳ－ＡＮ－０４７Ｗ）を使用して２５日間育てられ［６７］、蛍光灯下で１時間（１７Ｗ、６３.８ｃｍ２、０.９６ＫＪ／ｃｍ２）ＲＢの非存在下（対照群）、１０μＭ、１００μＭ及び２００μＭ存在下で育てられ、回収された後にヘマトキシリン及びエオシンで染められた。Ａの顕微鏡写真は１０倍の上面図であり、Ｂの顕微鏡写真は４０倍の側面図である。
【0018】
一部のグラム陽性菌株が、本明細書において「耐性」若しくは「薬剤耐性」又は耐性の他の文法上の変形と呼ばれる。ここで言う「耐性」とは、その種類の細菌に対して既知の濃度及び細菌細胞密度で殺菌性があると通常みなされる１つ以上の抗菌医薬品による治療に対する細菌の耐性である。したがって、黄色ブドウ球菌（Ｓ.アウレウス）、表皮ブドウ球菌（Ｓ.エピダーミス）、エンテロコッカスフェカーリス（Ｅ.フェカーリス）及びエンテロコッカスフェシウム（Ｅ.フェシウム）などの細菌の「薬剤感受性」及び「薬剤耐性」株が存在する。いくつかの一般的な細菌株が耐性となった薬剤の例として、バンコマイシン、メチシリン及びゲンタマイシンが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の１つの実施形態は、約５００から約６００ｎｍの波長を有する光の存在下でのローズベンガル（ＲＢ）又はその誘導体（ＲＢ化合物）（以下に示す）のグラム陽性菌に対する殺菌剤としての医薬用途を意図する。１つの態様では、グラム陽性菌に感染したヒトなどの哺乳類細胞及び細菌は、感染細胞によって取り込まれるＲＢ化合物と接触する。光は、意図されるＲＢ化合物が薬学的に許容される希釈剤に溶解又は分散された約０．２から約３．１μｇ／ｍＬの濃度で感染哺乳類細胞と接触して存在する意図されるＲＢ含有医薬組成物と共に投与される可能性がある。光はまた、細菌又は細菌を含む哺乳類細胞と接触させるために、医薬組成物の適用後すぐに、例えば約２から約５分以内に投与することもできる。細菌は、感染哺乳類細胞内で又はバイオフィルムとして存在する場合に治療することができる。
【0020】
前治療と一見似ているが、ＲＢ化合物の濃度は以前に使われていたものより低く、光量が従来の方法の約１０分の１以下であると考えられる。そのため、抗菌ＲＢ化合物の使用量が少なくなる可能性があり、照明も安価になるため、家庭での使用もより実際的になる。
【0021】
ＲＢで処理した感染哺乳類細胞は、約１から約１０分間、より好ましくは約２から約５分間照射される。そのような照射により、約０.７から約７.２Ｊ／ｃｍ２の光量、より好ましくは約１.４から約３.６Ｊ／ｃｍ２の光量が得られる。
【0022】
処理及び殺菌の対象となるグラム陽性菌の例としては、薬剤感受性及び薬剤耐性のＳ.アウレウス、Ｓ.エピダーミス、Ｅ.フェカーリス及びＥ.フェシウムのうちの１つ以上、同様に枯草菌、セレウス菌、及び唾液連鎖球菌のうちの１つ以上が挙げられる。
【0023】
意図されるＲＢ化合物は、以下の構造式（式Ｉ）を有し、式中、ＸはＯ（酸素）又はＮ（窒素）であり、「ｎ」はゼロ又は１である。
【0024】
【化3】
【0025】
Ｘが酸素の場合、ｎはゼロで存在しないため、ＲＢ化合物は、ａ）－Ｘ－Ｒ１が－Ｏ－Ｈであるローズベンガル、ｂ）Ｘ－Ｒ１が－Ｏ－Ｍ＋であり、Ｍ＋が薬学的に許容されるカチオンであるＲＢの薬学的に許容される塩、ｃ）Ｃ１－Ｃ４アルキルエステル、又はｄ）以下に定義される芳香族エステルである。
【0026】
代替的に、Ｘが窒素原子の場合、ｎは１であり、Ｒ２はＲ１と共に存在する。したがって、Ｒ１及びＲ２は同じか又は異なる可能性があり、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ１Ｒ２は、窒素原子が、ａ）置換されていない［－Ｘ－（Ｒ１Ｒ２）かつＲ１及びＲ２が両方とも水素（Ｈ）である］、ｂ）１つ若しくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されるか若しくはアミド窒素原子と一緒になって５若しくは６員環を形成する、又はｃ）Ｒ１が水素であり、Ｒ２が以下で考察する芳香族置換基であるために好ましくは一置換の芳香族アミドであるアミドである。
【0027】
説明を簡単にするために、芳香族エステル又は芳香族アミドは、まとめて芳香族誘導体と呼ぶ。したがって、それらの誘導体は、好ましくは一置換の、単一の５若しくは６員芳香環、又は独立して窒素、酸素又は硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む５、６若しくは６、６縮合芳香環系を有するアルコール又はアミンから形成される。
【0028】
そのような芳香族アルコールエステル部の実例を以下に名前付きで示す。ここで、Ｏは酸素原子であり、線Ｏは、環酸素が環の利用可能な炭素からのものであり得ることを示し、波線が交差したＯ線は、描かれたアルコキシ基が別の分子、エステル化されたＲＢ分子の一部分であることを示す。
【0029】
【化4】
【0030】
ローズベンガル（ＲＢ）は好ましいＲＢ化合物であり、そのジナトリウム塩であるローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）は、最も好ましいＲＢ化合物である。これらの化合物は、本明細書ではＲＢ化合物の群として例示的に使用される。
【0031】
ローズベンガルの化学名は、４,５,６,７－テトラクロロ－２',４',５',７'－テトラヨード－フルオレセインである。好ましい形態であるローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）は、次の構造式を有する。
【0032】
【化5】
【0033】
意図される組成物のこの好ましい実施形態の特定の詳細は、米国特許第５,９９８,５９７号、第６,３３１,２８６号、第６,４９３,５７０号、及び第８,９７４,３６３号に記載されており、これらの開示内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。上記の特許には、癌細胞を殺すためにＲＢＤを使用することが記載されている。
【0034】
上記と同様の方法が、バークホルデリア、サルモネラ、及びプロテウスのうちの１つ以上であるグラム陰性菌の治療のための実施形態において意図される。この実施形態では、前述の式Ｉのローズベンガル（ＲＢ）化合物が、約２から約１５μＭの濃度で水性医薬組成物に溶解又は分散される。
【0035】
医薬組成物
ローズベンガル（ＲＢ）
ローズベンガル（ＲＢ）
【0036】
液体組成物
想定される液体組成物が、経口投与、非経口投与又は局所投与用に製剤化される可能性がある。
想定される液体組成物が、経口投与、非経口投与又は局所投与用に製剤化される可能性がある。
【0037】
まず、非経口組成物について、前述のＰＶ－１０（登録商標）組成物は、特に好ましいＲＢ化合物であるローズベンガルジナトリウムを含む非経口投与可能な医薬組成物を示している。考えられる組成物のハロゲン化フルオレセイン成分の送達は、組成物のｐＨ値が生理的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ７）に近い場合、特にｐＨ値が約４より大きい場合に最も好ましく、それによってハロゲン化フルオレセインが組成物中で二塩基形態のままであることが保証される。したがって、好ましい実施形態では、組成物のｐＨ値は約５から約９、より好ましくは約６～約７.５、最も好ましくは約ｐＨ６.５～約ｐＨ７.４である。これらのｐＨ値では、ハロゲン化フルオレセインは通常、低ｐＨ値で生じるラクトンではなく二塩基形態のままである。
【0038】
ローズベンガルなどのＲＢ化合物は二塩基性であり、ｐＫａ値は２.５２と１.８１である。いくつかの考えられるハロゲン化フルオレセインのｐＫａ値の決定は、Ｂａｔｓｉｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．によるＳｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ Ｐａｒｔ Ａ ７９（５）：８８９－８９７（２０１１年９月）に見られる。
【0039】
親水性基剤は、ハロゲン化フルオレセイン成分、特に酸及び／又は塩の形態のＲＢ化合物の組織への分配を最大化するための薬剤の好ましい媒体の１つである。したがって、好ましい実施形態では、基剤には、そのような分配を妨げ得る非親水性成分が最小限含まれている。したがって、組成物の好ましい製剤には、親水性、好ましくは含水基剤に、ＲＢ、又は特に好ましいＲＢジナトリウムが含まれている。
【0040】
座剤以外の非経口投与の場合、ＲＢ化合物含有医薬組成物は、好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンと、塩化物、リン酸塩及び硝酸塩からなる群から選択される少なくとも１つのアニオンとを含む水溶性電解質を含む。電解質は、濃度が好ましくは約０.１％（ｗ／ｖ）から約２％（ｗ／ｖ）である。
【0041】
また、電解質は、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇまでの浸透圧を提供するのに十分なレベルで存在する。より好ましくは、薬剤組成物の浸透圧は２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、最も好ましくは約３００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【0042】
電解質は、好ましくは塩化ナトリウムである。電解質は、好ましくは約０．５～約１．５％の濃度で存在し、更に好ましくは約０．８から約１．２％の濃度で存在し、最も好ましくは生理食塩水と同じ約０．９％の濃度で存在する。
【0043】
組成物の水媒体（希釈剤）は、注射の使用基準を満たす水のみであることが好ましい。希釈剤の最大約２０体積パーセントが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，２－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、エリトリトール、トレイトール、トリメチロールプロパン、ソルビトールなどの１つ以上のＣ１－Ｃ６一価又は多価アルコールである可能性がある。より好ましくは、アルコールは、考えられる組成物中に、希釈剤の約１０体積パーセント未満、より好ましくは約５体積パーセント未満で存在する。
【0044】
それらの種々の文法的な形態における「生理学的に許容される塩」及び「薬学的に許容される塩」という用語は、当技術分野で既知の方法で調製され得る、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、及びプロタミン亜鉛塩を含む、製薬業界で一般的に使用されるアルカリ金属、アルカリ土類金属、及びアンモニウム塩などの非毒性カチオンを指す。考えられるカチオンは水溶性ＲＢ塩を提供する。好ましくは、塩は、一塩基性塩又は二塩基性塩の形態のナトリウム、カリウム、及びカルシウムである。医薬化合物と生理学的／薬学的に許容される塩を形成する、一般的に使用される生理学的に（又は薬学的に）許容される酸及び塩基のリストについては、Ｂｅｒｇｅ、Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ.１９７７ ６８（１）：１－１９を参照のこと。
【0045】
ＲＢ含有医薬組成物のｐＨ値は、当業者に知られている任意の適切な手段によって制御又は調整することができる。酸又は塩基などの添加によって組成物を緩衝化したり、ｐＨ値を調整したりすることができる。ＲＢ、又はその生理学的に許容される塩は弱酸であるため、その濃度及び／又は電解質濃度によっては、組成物のｐＨ値に緩衝剤及び／又はｐＨ値調整剤の使用を必要としないことがある。しかしながら、組成物が緩衝剤を含まず、投与後に生物学的環境に適応させることが特に好ましい。
【0046】
また、医薬組成物には防腐剤が含まれないことも好ましい。防腐剤の多くは、医薬組成物又はその製剤に有害な干渉を及ぼす可能性がある、又はＲＢ化合物含有組成物の有効成分と錯体を形成したり別の相互作用をしたり、その有効成分の送達を妨害したりすることがある。防腐剤が使用される限り、イミド尿素は、医薬組成物中又は投与時にＲＢ化合物と相互作用しないため、好ましい防腐剤である。
【0047】
考えられる液体医薬組成物は、治療対象の哺乳動物対象への経口投与にも適応可能である。好ましい態様では、先に考察したように、ＲＢ化合物は、哺乳動物対象に投与される際に水性希釈剤に溶解又は分散される。水性希釈剤には、香料として存在する糖類及び／又は緩衝剤を除き、等張化剤が含まれていないことがより好ましい。
【0048】
最大約２０体積パーセントの希釈剤が、先に考察したように１つ以上のＣ１－Ｃ６一価又は多価アルコールである可能性がある。より好ましくは、アルコールが、考えられる組成物中に、希釈剤の約１０体積パーセント未満、更に好ましくは約５体積パーセント未満で存在する。
【0049】
局所的に適用される液体組成物も考えられる。乾癬治療のための臨床試験が行われているそのような液体組成物の１つは、テネシー州ノックスビルのＰｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒａｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.によるＰＨ－１０（登録商標）と呼ばれる開発薬剤である。この薬剤は、水性希釈剤に溶解又は分散された０.００１から０.０１％ｗ／ｖの濃度で存在するＲＢＤを、薬剤に１０～１０００ｃｐｓの粘度を与えるのに十分なレベルで存在する少なくとも１つのビルダー、薬剤に１００ｍＯｓｍから５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を与えるのに十分なレベルで０.９％ｗ／ｖの濃度で存在する電解質としての塩化ナトリウムとともに含む。この薬剤は、例えば米国特許第８,９７４,３６３号に記載され、特許請求されている。
【0050】
固体組成物
ＲＢ又はジナトリウムＲＢなどのＲＢ化合物が、感染の部位の背側の組織に結合する無駄なＲＢ化合物を少なくし、組織染色を見えにくくするように、胃を通過し細菌感染の部位の比較的近くでＲＢ化合物を放出するために腸溶性被覆されている、経口投与用の固体医薬組成物で投与されることが更に意図される。ＲＢ化合物は一般に、固体希釈剤マトリックス中に溶解若しくは分散されるか、又は固体希釈剤マトリックス上に分散される。
ＲＢ又はジナトリウムＲＢなどのＲＢ化合物が、感染の部位の背側の組織に結合する無駄なＲＢ化合物を少なくし、組織染色を見えにくくするように、胃を通過し細菌感染の部位の比較的近くでＲＢ化合物を放出するために腸溶性被覆されている、経口投与用の固体医薬組成物で投与されることが更に意図される。ＲＢ化合物は一般に、固体希釈剤マトリックス中に溶解若しくは分散されるか、又は固体希釈剤マトリックス上に分散される。
【0051】
哺乳類の体内における経口投与された固体医薬品の溶解に作用するいくつかの要因がある。それらの要因は、ＧＩ管に沿った様々な場所における薬剤の滞留時間、粒子サイズ、口から肛門にかけて遭遇する可能性がある体液への薬剤の個々の成分の溶解度、様々なコーティング層がある場合に薬剤に施される順序、及び特定のコーティング層が溶解できるｐＨ値である。
【0052】
例えば強酸性の胃環境（絶食状態でｐＨ１．５～２；摂食状態でｐＨ３～６）は、十二指腸で約ｐＨ６に急速に上昇し、小腸に沿って増加して回腸末端でｐＨ７．４になる。盲腸におけるｐＨ値はｐＨ６よりやや下落し、結腸で再度上昇して直腸でｐＨ６．７に達する［Ｈｕａ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１：Ａｒｔｉｃｌｅ ５２４（２０２０年４月）］。ヒトの胃のｐＨ値を有する水溶液に混入されたジナトリウムＲＢの溶液の観察によって、混合剤の急速な混濁及び以前の可溶性ジナトリウムＲＢの恐らくはラクトン型への凝集が明らかになった。
【0053】
胃通過は、絶食状態で０から２時間に及ぶ可能性があり、摂食状態で６時間まで延びる可能性がある。一般に、小腸の通過時間は比較的一定で約３～４時間と考えられるが、健常人で２～６時間に及ぶ可能性がある。結腸通過時間は非常にばらつきがある可能性があり、６～７０時間の範囲が報告されている［Ｈｕａ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１：Ａｒｔｉｃｌｅ ５２４（２０２０年４月）］。
【0054】
ＧＩ管内の特定の場所への薬剤の予測可能な放出に有用な１つのアプローチは、上記のような予め選択されたＧＩ管ｐＨ値で溶解又は崩壊するｐＨ特異的なコーティング及びマトリックスに依存する。結腸内又はその付近での放出に特に好ましい中性又は弱アルカリ性のｐＨ値を使用して、小腸の遠位部分又は結腸において薬物を放出する。
【0055】
下の表は、結腸ターゲティング（局所治療）のために単独又は組み合わせて使用されてきたｐＨ依存ポリマーコーティングの一部の例を示しており、一部のメタクリル樹脂（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）としてドイツのエッセンにあるＥｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， ＡＧから市販されている）、及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標）としてデラウェア州ウィルミントンにあるＤｕＰｏｎｔ及びＢｅｎｅｃｅｌ（登録商標）としてデラウェア州ウィルミントンにあるＡｓｈｌａｎｄ， Ｉｎｃ．から入手可能）誘導体を含んでいる。また、特定のｐＨ値範囲での放出をトリガすることに加えて、腸溶性コーティングは、過酷なＧＩ管環境（例えば、胃液、胆汁酸、及び微生物分解）から取り込まれたＲＢ化合物活性薬剤を保護することができるとともに、治療効率を高めるために薬物の持続及び遅延放出特性を生み出すことができる。
【0056】
下の表は、いくつかの市販の腸溶性コーティングポリマー及びそれらのメーカーの「公表ｐＨ放出」値を示している。「公表ｐＨ放出」値は、すべての組成物又は環境に対して絶対的というわけではなく、溶解又は崩壊のための本明細書に記載のｐＨ値はそれらの公表値に基づいている。
【0057】
【表1】
【0058】
結腸感染の局所治療については、従来の非標的療法は望ましくない副作用があり、標的部位に到達する前の薬物の体内吸収により有効性が低いため、結腸標的薬物送達システムが積極的に追及されてきている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ７４：３１１－３１５（２０１０年）は、緩衝剤を含むＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓのアルカリ性水溶液を内層に、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓの有機溶液を外層に使用することによる二重コーティングアプローチを採用し、７より大きいｐＨ値での薬物溶解を加速させた。その後、Ｖａｒｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ８４：５７３－５７７（２０１３年）は、この二重被覆システムのヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏパフォーマンスを評価し、主に下部腸管で二重被覆錠剤のより着実な崩壊を示した。
【0059】
Ｈａｓｈｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ３：４２０－４３４（２０１３年）は、プレドニソロンの結腸送達のための時間依存システム及びｐＨ依存システムを組み合わせたマイクロスフィアを開発した。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓとエチルセルロースを組み合わせて使用することによって、腸上部での早過ぎる薬物放出を防ぎながらより優れた結腸薬物送達を達成した。
【0060】
Ｅｕｄｒａｃｏｌ（登録商標）は、薬物放出が遅延して均一な、結腸への標的薬物送達を行うマルチユニット技術の別の例である。このシステムは、ペレットをＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬ／ＲＳ及びＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ３０Ｄで被覆することに基づいており、ｐＨ及び時間依存的に結腸特異的な薬物放出を行う［Ｐａｔｅｌ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ８：１２４７－１２５８（２０１１年）］。
【0061】
小腸を標的にする１つの組成物は、約６０から約９５重量％のアクリル酸又はメタクリル酸のフリーラジカル重合されたＣ１－Ｃ４アルキルエステル、及び約５から約４０重量％の酸性基をアルキルラジカルに含む（メタ）アクリル酸モノマーから構成される１又は複数の（メタ）アクリル酸コポリマー層で被覆されている微粒子ローズベンガル（ＲＢ）で被覆された糖／スクロースビーズの希釈剤マトリックスを含む。
【0062】
特に適している（メタ）アクリル酸コポリマーは、約１０から約３０重量％のメタクリル酸メチル、約５０から約７０重量％のアクリル酸メチル及び約５から約１５重量％のメタクリル酸を含む（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳタイプ）。同様に適しているのは、約２０から約４０重量％のメタクリル酸及び約８０から約６０重量％のメタクリル酸メチルの（メタ）アクリル酸コポリマーである（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓタイプ）。「（メタ）アクリル酸」という語は、アクリル酸モノマー及びメタクリル酸モノマーの一方又は両方を使用できることを意味するのに使用されている。
【0063】
これらのコーティングポリマーは、粒子が胃から出る前のＲＢ化合物放出をほとんど許可しない。十二指腸内の流体のｐＨ値は一般に約６であり、回腸に向かって約７．４に上昇する。したがって、細菌感染が胃に近い場合、より多量の遊離カルボン酸基を有するコーティングポリマーが使用されるのに対し、腫瘍が回腸寄りにある場合、より少量の酸性基を有するポリマーを使用することができる。
【0064】
通常の錠剤又はトローチ剤を、ラクトース（２０％）及び活性成分（８０％；ＲＢ化合物）を高速混合器（ドイツのオスナブリュックにあるＤＩＯＳＮＡ社のタイプＰ１０）で混合した混合物によって調製することができる。ポビドン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ、ブフス、スイス）などの賦形剤ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有する水溶液を、均一な組成物が得られるまで少しずつ添加する。湿潤粉体混合物をスクリーニングする。その後、よく知られているようにこれから錠剤を作り、乾燥させる。
【0065】
その後、結果として生じた錠剤又はトローチ剤は、好ましくはしばしば流動床装置を使用して保護ポリマーフィルムで被覆される。フィルム形成ポリマーが通常、可塑剤と混合され、適切なプロセスによって薬剤を放出する。フィルム形成剤はこの場合、溶液又は懸濁液の形態である可能性がある。フィルム形成のための賦形剤は、同様に溶解又は懸濁される可能性がある。有機溶媒若しくは水性溶媒、又は分散剤を使用することができる。分散を安定させるために安定剤を使用することもできる（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０又はその他の適当な乳化剤若しくは安定剤）。
【0066】
離型剤の例は、グリセロールモノステアレート又は他の適当な脂肪酸誘導体、ケイ酸誘導体若しくはタルクである。可塑剤の例は、プロピレングリコール、フタル酸塩、ポリエチレングリコール、セバシン酸塩又はクエン酸塩、及び前述し文献に記載されたその他の物質である。
【0067】
別の好適な薬剤の種類は、水溶性のカプセル又はブリスターであり、カプセルの水又は体液への溶解又は崩壊の際にＲＢ化合物を素早く放出する１つ以上のポリマー樹脂層で覆われる、ローズベンガルジナトリウム又はローズベンガルラクトンなどのＲＢ化合物の複数の粒子を含有する。カプセルは通常、ゼラチンから作られており、ジェルキャップと呼ばれることが多い。ゼラチンは動物製品である。ベジタリアンカプセルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）で作られることが多い。
【0068】
一部の実施形態では、ＲＢ化合物は、形が概ね球状の粒子を形成するために１つ以上のポリマーのコートが直接積層される。そのような粒子はビーズと呼ばれることが多い。好ましい態様では、粒子（ビーズ）は、約９０重量パーセントが２０メッシュの篩（開口＝８５０μｍ）スクリーンを通過し、約９０重量パーセントが８０メッシュの篩（開口＝１８０μｍ）スクリーン上に保持される大きさとされる。
【0069】
例示的なｐＨ値に敏感なコーティングポリマー樹脂を以上で考察した。例示的なｐＨ値に鈍感なコーティングポリマー樹脂も以上で考察した。コーティングポリマー樹脂のｐＨ値感度は、先に考察したようなＧＩ管に沿って生理学的に存在するｐＨ値という観点から理解されるべきである。
【0070】
他の実施形態では、小さい概ね球状のコアである、糖／デンプン種子などの小さいペレット、ノンパレイユ又は顆粒が、１つ又は複数のＲＢ化合物の層及び１つ以上のポリマーコーティングの層で被覆される。例示的な糖／デンプンコアは、約４０メッシュの篩（４２５ｍｍ開口）スクリーンから約５０メッシュの篩（３００ｍｍ開口）スクリーンを通過し、無水ベースで計算して６２．５パーセント以上９１．５パーセント以下のスクロースを含有し、残りが主としてデンプンから構成される糖球体ＮＦである。（ＵＳＰ ＮＦ １９９５ ２３１３）。
【0071】
具体例では、１００キログラム（ｋｇ）量のジナトリウムローズベンガル、７．１ｋｇ量の架橋カルボキシメチルセルロース（好ましくはクロスカルメロースナトリウムＮＦ）、及び１１．９ｋｇ量のデンプンＮＦをそれぞれ二分し、２つの同じバッチを形成するために３つの成分を混合する。バッチのそれぞれをフィッツパトリックミルなどのミルを使用して８０メッシュスクリーンを通して粉砕する。次いで２つの粉砕したバッチを、混合物を形成するために混ぜ合わせ、当業者によく知られている認められた品質保証検査法に従って混合物の組成を検査する。
【0072】
その後、ジナトリウムローズベンガル混合物を３つの等しい部分に分け、第１の部分を全体のままとし、第２及び第３の部分をそれぞれ５０パーセント、３０パーセント及び２０パーセントのロットに分割する。２５．６ｋｇ量の４０～５０メッシュ糖／デンプン種子（例えば糖球体ＮＦ）をステンレス鋼コーティングパンに入れる。８０リットル（Ｌ）量の５パーセントのポビドン／イソプロパノール（ＩＰＡ）溶液を粒子に噴霧するために用意する。
【0073】
コーティングパンは糖球体から始まり、その上にポビドン／ＩＰＡ溶液の塗装（１回につき約０．１７３ｋｇ）を噴霧し、またその上に第１の部分（全体のままの部分）からジナトリウムローズベンガル混合物の塗装（約０．３２ｋｇ）を振りかける。振りかけは標準的な振りかけ器を使用して行う。噴霧及び振りかけステップは、混合物の第１の部分が糖球体に塗装されて一群の部分的に被覆された球体を形成するまで継続される。
【0074】
次いで部分的に被覆された球体を２つの同一のロットに分け、各ロットをコーティングパンに入れる。２つのロットのそれぞれに別々に、ポビドン／ＩＰＡ溶液の噴霧及び５０パーセントロットに分割されているジナトリウムローズベンガル混合物の振りかけを、５０パーセントロットが球体に塗装されるまで継続する。５０パーセントロットの塗装の後に、球体を必要であれば２５メッシュスクリーンを使用してスクリーニングすることができる。
【0075】
ポビドン／ＩＰＡ溶液の噴霧及び３０パーセントロットに分割されているジナトリウムローズベンガル混合物の振りかけを開始し、３０パーセントロットが球体に塗装されるまで継続する。被覆された球体を２５メッシュスクリーンを使用して再度スクリーニングすることができる。
【0076】
ポビドン／ＩＰＡ溶液の噴霧及びジナトリウムローズベンガル混合物の振りかけを、２０パーセントロットに分割されている混合物を使用して、２０パーセントロットが球体に塗装されるまで継続する。プロセスのこの時点で、ジナトリウムローズベンガル混合物の全量が球体に塗装され、約５０ｋｇの５パーセントのポビドン／ＩＰＡ溶液が球体に塗装されている。
【0077】
７．５パーセントのポビドン／ＩＰＡ溶液を用意し、密封剤として球体に塗装する。密封した球体を約１時間乾燥機で乾燥させ、重さを量り、約１２２°Ｆ（５０℃）のオーブンに２４時間入れる。乾燥後、球体を２０メッシュスクリーン及び３８メッシュスクリーンでスクリーニングして即時（遅延と比較して急速又は高速）放出粒子を形成する。
【0078】
以上で考察したＲＢ化合物含有球体又はそのカプセル（若しくはブリスター）はまた、ＧＩ管に放出されると、ｐＨ値が所望のＧＩ管位置のものでない限り球体がその活性成分であるＲＢ化合物をその周囲に提供しないように、先に考察したｐＨ値に敏感な腸溶性コーティングポリマーで被覆される可能性がある。
【0079】
ＲＢ化合物の放出位置を制御する別の方法は、以上で考察した球体（ＲＢ被覆粒子）を、ＲＢ化合物の球体からの放出が制御され６～１０時間にわたって放出されるように、球体の表面に塗装されたポリマー樹脂の溶出制御被膜で更に被覆することである。この目的で使用される物質は、これらに限定されるわけではないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、並びにエタクリル酸及びメタクリル酸のコポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標））、又は任意の他のアクリル酸誘導体（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）など）である可能性がある。
【0080】
また、腸溶性コーティング剤が、単独で、又は上記のｐＨに鈍感なコーティングと組み合わせて使用される可能性もある。これらの材料には、これらに限定されるわけではないが、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びすべてのセルロースエーテルのフタル酸エステルが含まれる。また、アクリル酸誘導体（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標））のフタル酸エステル、又は酢酸フタル酸セルロース。
【0081】
これらのコーティング剤は、表面を約１．０％（Ｗ／Ｗ）から約２５％（Ｗ／Ｗ）の量で被覆する際に使用される可能性がある。好ましくは、これらのコーティング剤は約８．０～約１２．０パーセント（Ｗ／Ｗ）で存在する。
【0082】
賦形剤
薬学において慣習的な賦形剤を、剤型の製造においてそれ自体が知られている方法で使用することができる。これらの賦形剤は、コア又はコーティング剤中に存在する可能性がある。
薬学において慣習的な賦形剤を、剤型の製造においてそれ自体が知られている方法で使用することができる。これらの賦形剤は、コア又はコーティング剤中に存在する可能性がある。
【0083】
ポリマー
ＲＢ化合物を糖顆粒又は球体に付着させるのに役立つ接着剤として使用される高分子材料は、ＲＢ化合物のコーティング層が使用される場合に賦形剤と見なされる。そのようなポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、及びヒドロキシプロピルセルロースなどの他の水溶性の薬学的に許容されるフィルム形成ポリマーである。
ＲＢ化合物を糖顆粒又は球体に付着させるのに役立つ接着剤として使用される高分子材料は、ＲＢ化合物のコーティング層が使用される場合に賦形剤と見なされる。そのようなポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、及びヒドロキシプロピルセルロースなどの他の水溶性の薬学的に許容されるフィルム形成ポリマーである。
【0084】
乾燥剤（非粘着剤）
乾燥剤は次のような特性を有する：比表面積が大きいこと、化学的に不活性であること、流動性があること、及び微粒子を含むこと。これらの特性によって、乾燥剤は、極性コモノマーを官能基として含有するポリマーの粘着性を低下させる。乾燥剤の例は、アルミナ、酸化マグネシウム、カオリン、タルク、微粒子シリカ、硫酸バリウム及びセルロースである。
乾燥剤は次のような特性を有する：比表面積が大きいこと、化学的に不活性であること、流動性があること、及び微粒子を含むこと。これらの特性によって、乾燥剤は、極性コモノマーを官能基として含有するポリマーの粘着性を低下させる。乾燥剤の例は、アルミナ、酸化マグネシウム、カオリン、タルク、微粒子シリカ、硫酸バリウム及びセルロースである。
【0085】
崩壊剤
経口固形製剤にその分解を助けるために崩壊剤を添加する。崩壊剤は、水分と接触したときに固形製剤の急速な崩壊を引き起こすように製剤化される。崩壊は通常、溶出プロセスの第１のステップと見なされる。例示的な崩壊剤は、クロスカルメロースナトリウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）及びデンプングリコール酸ナトリウムを含む。
経口固形製剤にその分解を助けるために崩壊剤を添加する。崩壊剤は、水分と接触したときに固形製剤の急速な崩壊を引き起こすように製剤化される。崩壊は通常、溶出プロセスの第１のステップと見なされる。例示的な崩壊剤は、クロスカルメロースナトリウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）及びデンプングリコール酸ナトリウムを含む。
【0086】
離型剤
離型剤の例は、脂肪酸又は脂肪アミドのエステル、脂肪族長鎖カルボン酸、脂肪アルコール及びそのエステル、モンタンワックス又はパラフィンワックス及び金属石鹸；特に言及すべきはグリセロールモノステアレート、ステアリルアルコール、グリセロールベヘン酸エステル、セチルアルコール、パルミチン酸、カルナウバワックス、密ろうなど。通常の量の割合は、コポリマーに対して０．０５から５重量％、好ましくは０．１から３重量％の範囲にある。
離型剤の例は、脂肪酸又は脂肪アミドのエステル、脂肪族長鎖カルボン酸、脂肪アルコール及びそのエステル、モンタンワックス又はパラフィンワックス及び金属石鹸；特に言及すべきはグリセロールモノステアレート、ステアリルアルコール、グリセロールベヘン酸エステル、セチルアルコール、パルミチン酸、カルナウバワックス、密ろうなど。通常の量の割合は、コポリマーに対して０．０５から５重量％、好ましくは０．１から３重量％の範囲にある。
【0087】
製薬的に常用の他の賦形剤
ここで言及すべきは、例えば安定剤、着色剤、抗酸化剤、湿潤剤、顔料、光沢剤などである。賦形剤は通常、加工助剤として使用され、確実で再現可能な製造プロセスと良好かつ長期の保存安定性とを保証することが意図される。製薬的に常用される別の賦形剤は、ポリマーコーティングに対して０．００１重量％から１０重量％、好ましくは０．１から１０重量％の量で存在することがある。
ここで言及すべきは、例えば安定剤、着色剤、抗酸化剤、湿潤剤、顔料、光沢剤などである。賦形剤は通常、加工助剤として使用され、確実で再現可能な製造プロセスと良好かつ長期の保存安定性とを保証することが意図される。製薬的に常用される別の賦形剤は、ポリマーコーティングに対して０．００１重量％から１０重量％、好ましくは０．１から１０重量％の量で存在することがある。
【0088】
可塑剤
可塑剤として適当な物質は一般的に１００～２０，０００の分子量を有し、分子中に１個以上の親水基、例えばヒドロキシル、エステル又はアミノ基を有する。クエン酸塩、フタル酸塩、セバシン酸塩、ヒマシ油が適当である。更なる適当な可塑剤の例は、クエン酸アルキル、グリセロールエステル、フタル酸アルキル、セバシン酸アルキル、スクロースエステル、ソルビタンエステル、セバシン酸ジブチル及びポリエチレングリコール４０００～２０，０００である。好ましい可塑剤はクエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、セバシン酸ジブチル及びセバシン酸ジエチルである。使用量は（メタ）クリル酸コポリマーに対して１から３５重量％、好ましくは２から１０重量％である。
可塑剤として適当な物質は一般的に１００～２０，０００の分子量を有し、分子中に１個以上の親水基、例えばヒドロキシル、エステル又はアミノ基を有する。クエン酸塩、フタル酸塩、セバシン酸塩、ヒマシ油が適当である。更なる適当な可塑剤の例は、クエン酸アルキル、グリセロールエステル、フタル酸アルキル、セバシン酸アルキル、スクロースエステル、ソルビタンエステル、セバシン酸ジブチル及びポリエチレングリコール４０００～２０，０００である。好ましい可塑剤はクエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、セバシン酸ジブチル及びセバシン酸ジエチルである。使用量は（メタ）クリル酸コポリマーに対して１から３５重量％、好ましくは２から１０重量％である。
【0089】
全身バイオアベイラビリティを最適化すること
本明細書に記載の固体医薬組成物はＧＩ管内の細菌性疾患組織への直接送達を最適化することに関連して考察されているが、送達部位及び送達速度を制御するこれらのアプローチは、送達部位及び速度を制御することに基づいて全身摂取のバイオアベイラビリティを最適化することに同様に適用可能である。
本明細書に記載の固体医薬組成物はＧＩ管内の細菌性疾患組織への直接送達を最適化することに関連して考察されているが、送達部位及び送達速度を制御するこれらのアプローチは、送達部位及び速度を制御することに基づいて全身摂取のバイオアベイラビリティを最適化することに同様に適用可能である。
【0090】
本明細書で使用される「投与」は、治療計画の開始を意味するのに使用される。したがって、液体、錠剤又はその他の経口投与製剤を飲み込むことは、ＩＶフローが開始されるときや局所組成物が適用されるときと同様に、治療計画の開始である。
【0091】
方法
考えられる治療方法は、グラム陽性菌細胞を抗グラム陽性菌量のＲＢ化合物を含む組成物と接触させ、その間にそれらの細菌細胞に約５００から約５７５ｎｍ、より好ましくは約５１０から約５５０ｎｍの波長を含む光を照射することを含む。
考えられる治療方法は、グラム陽性菌細胞を抗グラム陽性菌量のＲＢ化合物を含む組成物と接触させ、その間にそれらの細菌細胞に約５００から約５７５ｎｍ、より好ましくは約５１０から約５５０ｎｍの波長を含む光を照射することを含む。
【0092】
一実施形態では、グラム陽性菌細胞は、対象哺乳動物の表面又は内部に存在する（例えば、感染している）。例示的に、対象哺乳動物は、化膿連鎖球菌などの皮膚グラム陽性菌感染症に罹患している可能性があり、特に開放創の局所治療の場合には、現在の感染症の治療薬として、またその後のグラム陽性菌感染症の予防薬として用いられる可能性がある。
【0093】
治療対象となる哺乳動物は、ヒトなどの霊長類、チンパンジーやゴリラなどの類人猿、カニクイザルやマカクなどのサル、ラット、マウス若しくはうさぎなどの実験動物、犬、猫、馬などのコンパニオンアニマル、又は雌牛若しくは去勢雄牛、羊、子羊、豚、山羊、ラマなどの食用動物などである可能性がある。
【0094】
それぞれの考えられる組成物投与は、典型的には、治療される細菌性疾患（感染症）が検出できないなど、所望の程度まで減少するまで繰り返される。したがって、必要とする哺乳動物対象への投与は、治療医の指示に従って、１日、毎日、毎週、毎月又は数ヶ月から数年にわたって複数回行われる可能性がある。
【0095】
グラム陽性菌の殺菌有効量のＲＢが、必要としている哺乳動物対象に投与され、通常の液体、ゲル、固体又はその他の形式を用いて製剤化される可能性がある。ほとんどの場合、ＲＢは、好ましくはラムダマックス（λｍａｘ）が約５００から約６００ｎｍ、より好ましくは約５１０から約５５０ｎｍの光源を使用した照射とともに投与される。例示的な光源、その強度及びその持続時間を以下で考察する。
【0096】
結果
【0097】
ローズベンガル（ＲＢ）の治療グレード
テネシー州ノックスビルのＰｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.（Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓ）は、商用グレードのＲＢを使用して、製剤原料として純粋な形のＲＢを調製するための精製プロセスを探していた。しかしながら、染料製造プロセス中に商用グレードの反応が発生すること、及びヨウ化物置換基の１つ以上が失われた他の副産物が原因で、ＲＢの精製にはいくつかの課題が見つかった。
テネシー州ノックスビルのＰｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.（Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓ）は、商用グレードのＲＢを使用して、製剤原料として純粋な形のＲＢを調製するための精製プロセスを探していた。しかしながら、染料製造プロセス中に商用グレードの反応が発生すること、及びヨウ化物置換基の１つ以上が失われた他の副産物が原因で、ＲＢの精製にはいくつかの課題が見つかった。
【0098】
商業グレードのＲＢは、ＦＤＡやその他の世界的な医薬品規制機関による臨床開発と登録をサポートするのに十分な量の医薬品グレードの材料を効率的に生産することができないと結論が下された。ＲＢを合成及び製造するための新しい多段階アプローチがＰｒｏｖｅｃｔｕｓによって確立された［３５、３６］。その研究の重要な要素は、重要な歴史的不純物の形成につながる条件を排除する能力であった。
【0099】
それらの合成及び精製方法は適正製造基準（ＧＭＰ）に適用され、医薬品グレードのＲＢが製造されている。このＲＢ、ＰＶ－１０（登録商標）は、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓから入手可能な０.９％生理食塩水中のローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）の滅菌１０％溶液であり、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインに従って製造され、注射用医薬品として適用されるように設計されている。医薬品グレードのＲＢＤは、ＰＨ－１０（登録商標）と呼ばれる異なる処方の局所用薬剤［３６－３９］にも存在する。どちらの製剤も、構造式が先に示されているローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）を有効成分として使用する。ローズベンガルの多くの可溶性塩は、ジナトリウム塩に加えて使用できるため、本明細書では「ＲＢ」はローズベンガルの薬学的に許容される塩の名称として使用するが、「ＲＢＤ」という名称はローズベンガルジナトリウムを具体的に指す。
【0100】
ＲＢの抗菌活性
光線力学的アプローチによるＲＢの抗菌活性は、いくつかの研究グループによって研究されてきた［１５－２７］。ＲＢの光線力学的療法の応用は、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、毛嚢炎、せつ及び癰を含む皮膚感染症に限定されない。ポリマー支持体上に固定化されたＲＢは、材料表面及び水中の除菌に効果的に適用された［１７、１８］。しかしながら、ＲＢの活性スペクトル、殺菌率、及びバイオフィルム破壊活性は散発的に報告されている。
光線力学的アプローチによるＲＢの抗菌活性は、いくつかの研究グループによって研究されてきた［１５－２７］。ＲＢの光線力学的療法の応用は、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、毛嚢炎、せつ及び癰を含む皮膚感染症に限定されない。ポリマー支持体上に固定化されたＲＢは、材料表面及び水中の除菌に効果的に適用された［１７、１８］。しかしながら、ＲＢの活性スペクトル、殺菌率、及びバイオフィルム破壊活性は散発的に報告されている。
【0101】
我々は、マイコバクテリウム種やサッカロミセス種を含むグラム陽性及び陰性好気性菌群に対する医薬品グレードＲＢの殺菌活性を、異なる光源（蛍光、ＬＥＤ、太陽光）下及び暗条件で再調査した。使用した蛍光灯は１７Ｗ（１,６４７ルーメン、６３.８ｃｍ２）であり、ＬＥＤは９.５Ｗ（８００ルーメン、２８.３ｃｍ２）であったが、その詳細については以下で考察する。建築窓からの太陽光の下での研究では、９６ウェルプレートは建物の東側（米国、テネシー州、メンフィス、テネシー大学健康科学センター、薬学部、５階のＢＳＬ－２実験室）に設置され、成長阻害研究は、（２０２１年、６月１８日）午前８時から午後５時まで実施された。
【0102】
より好ましい光源は、Ｅｘｐｌｕｘ ＰＡＲ３８ １２０Ｗ相当の投光器などの狭帯域ＬＥＤライトであり、約５４０ｎｍで８７０ルーメンを生成する。ＥｘｐｌｕｘグリーンＬＥＤランプは、直径４.７インチの表面（１１０ｃｍ２）から８７０ルーメンを生成する。ランプの表面では、これは約７.９ルーメン／ｃｍ２に相当する。１ルーメンは１／６８３ワットで、１／６８３Ｊ／ｓに等しい。したがって、７.９ルーメン／ｃｍ２は０.０１２Ｊ／／ｃｍ２－ｓである。このようなランプからの５分間露光を用いると、約３.５Ｊ／ｃｍ２の光量がもたらされる。
【0103】
液体希釈法及び寒天希釈法［蛍光（２３.０ＫＪ／ｃｍ２）及びＬＥＤライト（２９.０ＫＪ／ｃｍ２）条件下で２４時間（ｈ）並びに日光下で９ｈ]で得られた最小発育阻止濃度（ＭＩＣ、μｇ／ｍＬ）は、それぞれ図１及び図２として示されているテーブル１及びテーブル２にまとめられている。これらの研究では、一連のＦＤＡ承認薬（メロペネム、コリスチン、アミカシン、リネゾリド、リファンピシン、シプロフロキサシン、アジスロマイシン、イソニアジド、カプレオマイシン、及び５－フルオロウラシル）及び前臨床抗菌薬（ツニカマイシン、ＡＰＰＢ）が各ＭＩＣ試験の陽性対照及び陰性対照として含まれていた［４０－４４］。テーブル１及びテーブル２の研究で使用されているＲＢは、先に考察したＰｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.（米国、テネシー州、ノックスビル）から提供されたＰＶ－１０（登録商標）の希釈形態である［３５、３６］。
【0104】
ＰＶ－１０（登録商標）として提供されたＲＢは、照明条件下で０.２０～３.１μｇ／ｍＬのＭＩＣレベルで広範囲のグラム陽性菌を効果的に殺菌した（テーブル１のエントリ１～２３）。エントリ１～２３（テーブル１）で観察されたＲＢの殺菌活性は、光源によって顕著な差はなく、蛍光灯とＬＥＤライトのＭＩＣ値は等しいか非常に近いものであった。
【0105】
ＲＢは０.３９～０.７８μｇ／ｍＬの濃度でグラム陽性バチルス種を殺菌した（エントリ１～３）。黄色ブドウ球菌のＭＩＣ標準株が、ＲＢに対して低い感受性を示し、細菌の９９％超を殺菌するのに１.６μｇ／ｍＬのＲＢが必要であった（エントリ４）。
【0106】
ＲＢの殺菌活性は、テーブル１の異なるＳＣＣＭｅｃ型（エントリ５～１１）の７つのメチシリン耐性Ｓ.アウレウス（ＭＲＳＡ）のパネルに対して検査された［４５］。テーブル１でテストされたすべてのＭＲＳＡ株が、蛍光灯又はＬＥＤライトの下で０.７８～３.１μｇ／ｍＬの濃度でＲＢによって死滅された。ＲＢは更に、４つのバンコマイシン耐性Ｓ.アウレウス株（エントリ１２～１６）に対して検査され、すべてのバンコマイシン耐性株が、どちらの照明条件下でも１.０μｇ／ｍＬ未満の濃度で死滅された。
【0107】
表皮ブドウ球菌は嫌気性菌であるが、好気性条件下でもよく成長する。好気性条件下でＲＢによって効果的に殺菌された（エントリ１６）。薬剤感受性及び薬剤耐性のエンテロコッカスフェカーリス（バンコマイシン耐性株を含む）は、ＲＢの０.３９～０.７８μｇ／ｍＬの濃度範囲で殺菌された（エントリ１７～２１）。唾液連鎖球菌はＲＢに対して感受性があった（エントリ２３）が、肺炎連鎖球菌はＲＢに対して耐性を示した（エントリ２４）。その耐性の根拠は現在のところ不明である。
【0108】
暗条件下では、ＲＢは２５.０～１００μｇ／ｍＬの濃度で、エントリ１～２３（テーブル１）にリストされているすべてのグラム陽性菌に対して抗菌活性を示した。暗条件下では、ＲＢは高濃度で抗菌活性を示すことが知られている。我々のデータは、ＲＢが三重項酸素の励起メカニズムを介して細胞毒性活性酸素種を生成する以外に、細菌の増殖を阻害する１つ以上の未知のメカニズムを有するという考えを裏付ける。
【0109】
グラム陽性菌に対して優れた抗菌活性が観察されたが、検査したグラム陰性菌（３つの大腸菌株、２つの緑膿菌株、２つの肺炎桿菌株、及び２つのアシネトバクターバウマニー株）はＲＢに耐性を示した。これらのグラム陰性菌に対するＭＩＣレベルは５０又は１００μｇ／ｍＬ超であった（エントリ３１～３９）。嫌気性グラム陰性菌であるバクテロイデスフラギリスは、１００μｇ／ｍＬ以上の濃度でＲＢ処理に耐えた。
【0110】
ＲＢのグラム陰性菌の大きなグループに対する有効性は徹底的には調査されていないが、サルモネラ及びバークホルデリア種の増殖を阻害するためにＲＢを使用する光線力学的アプローチが研究された。エントリ４１～４２（テーブル１）にまとめたデータによると、エントリ４３～４７に示すように、蛍光灯又はＬＥＤライトの下で３.１３～１２.５μｇ／ｍＬの濃度でＲＢがバークホルデリア、サルモネラ、及びプロテウス種を殺菌するのに効果的であることが示唆されている。
【0111】
テーブル１で分析したすべてのグラム陰性菌は、暗条件下ではＲＢに対して感受性がなく、ＭＩＣは１００μｇ／ｍＬ超と判定された（エントリ３１～４７）。５種のマイコバクテリウム属菌に対するＲＢの抗菌活性を検査した（エントリ２５～２９）。照明条件下でのＲＢのＭＩＣ値は１２.５～２５.０μｇ／ｍＬ（エントリ２５～２９）で、グラム陽性菌（エントリ１～２３）の値よりも１５～６０倍高い。興味深いことに暗条件下では、これらのマイコバクテリウムは、照明条件下で観察されたものと同等又は同様のＭＩＣで死滅した。
【0112】
我々は、（ガラス窓から差し込まれる）日光下で限られた数の細菌に対するＲＢのＭＩＣを検査した。８種のグラム陽性菌及び３種のグラム陰性菌のＭＩＣ値は、蛍光灯やＬＥＤライト下で得られた値と良好な一致を示した（エントリ１～４、１６、２１～２３、４３及び４７）。ＲＢは、サッカロマイセスセレヴィシエの増殖を、３つの異なる光源下では同じＭＩＣレベルで、そして暗条件下でははるかに高い濃度で阻害した（エントリ３０）。
【0113】
照明条件下では、寒天希釈法で測定したＲＢのＭＩＣ値が、液体希釈法で測定した値よりも低いことが観察された（テーブル１）。２つの方法で測定したＭＩＣ値の差の選択例をテーブル２にまとめた。
【0114】
Ｂ.サブチリス、Ｂ.セレウス、及びＳ.アウレウスなどのグラム陽性菌の増殖は、液体希釈法で測定されたＭＩＣ値よりも７～７０倍低い０.０１～０.１０μｇ／ｍＬの濃度で阻害された（テーブル２のエントリ１～４）。大腸菌（３５２１８（登録商標））及びＢ.セパシア（ＵＣＢ７１７）株も、寒天希釈法では蛍光灯下でのＲＢに対する感受性が液体希釈法よりもはるかに高かった（エントリ５及び６）。同様に、Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７（登録商標））は、薬物含有寒天プレート（又はウェル）上で、培養液中よりも低濃度で死滅した（エントリ７）［４６］。
【0115】
暗条件下では、寒天希釈法で測定したＲＢのＭＩＣは、液体希釈法で測定した値と良好な一致を示した（エントリ１～７）。選択した細菌に対するＲＢの最小殺菌濃度（ＭＢＣ）もテーブル２にまとめられている。ＲＢは真菌Ｓ.セレヴィシエ種に対して細胞増殖抑制効果を有し、１.６μｇ／ｍＬで５０％の増殖抑制を示したが、蛍光灯下で酵母の９９％超を死滅させるには４００μｇ／ｍＬ（ＭＢＣ）が必要だった。暗条件下では、Ｓ. セレヴィシエは５００μｇ／ｍＬのＲＢでは死滅しなかった（エントリ１１）。
【0116】
ＲＢの時間－殺菌動態
ＲＢのいくつかの細菌に対する光線力学的増殖阻害はこれまでに研究されており、Ｓａｂｂａｈｉ ｅｔ ａｌ．は、可視光照射下でＳ.アウレウス株の約８０％が、１９.５μｇ／ｍＬのＲＢ（３０Ｊ／ｃｍ２の光フルエンス量）によって１０分（ｍｉｎ）でその生存能力を失ったと報告した［２６］。蛍光灯下で測定したＭＩＣ値（２４ｈ、２３.０ＫＪ／ｃｍ２、テーブル１）を考慮して、我々はＳ.アウレウス６５３８（登録商標）の１つの薬剤感受性株及び３つの薬剤耐性グラム陽性菌株（Ｓ.アウレウスＢＡＡ－４４、Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）、及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５）、並びに１つのグラム陰性菌（Ｂ.セパシアＵＣＢ７１７）を用いてＲＢの時間－殺菌動態検査を行った。我々の予備研究では、ＲＢは接触の２時間以内に６対数減少でグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を殺菌できることが示唆された。
ＲＢのいくつかの細菌に対する光線力学的増殖阻害はこれまでに研究されており、Ｓａｂｂａｈｉ ｅｔ ａｌ．は、可視光照射下でＳ.アウレウス株の約８０％が、１９.５μｇ／ｍＬのＲＢ（３０Ｊ／ｃｍ２の光フルエンス量）によって１０分（ｍｉｎ）でその生存能力を失ったと報告した［２６］。蛍光灯下で測定したＭＩＣ値（２４ｈ、２３.０ＫＪ／ｃｍ２、テーブル１）を考慮して、我々はＳ.アウレウス６５３８（登録商標）の１つの薬剤感受性株及び３つの薬剤耐性グラム陽性菌株（Ｓ.アウレウスＢＡＡ－４４、Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）、及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５）、並びに１つのグラム陰性菌（Ｂ.セパシアＵＣＢ７１７）を用いてＲＢの時間－殺菌動態検査を行った。我々の予備研究では、ＲＢは接触の２時間以内に６対数減少でグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を殺菌できることが示唆された。
【0117】
そこで、これらの細菌の経時変化実験を、蛍光灯下で２時間（０～１,１３０Ｊ／ｃｍ２）ＭＩＣの約２から約８倍の濃度（ＲＢ）で行った。使用した参照分子は、グラム陽性菌についてはリネゾリド（１０μｇ／ｍＬ）及びシプロフロキサシン（１０μｇ／ｍＬ）、グラム陰性菌についてはアミカシン（１０μｇ／ｍＬ）及びメロペネム（１０μｇ／ｍＬ）であった。ローズベンガルは、１分で６対数減少で４.６×１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）のＳ.アウレウス６５３８（登録商標）を減少させた。ＲＢ濃度１.６及び５.０μｇ／ｍＬでは、２分後にＣＦＵはカウントされなかった（図３Ａ）。
【0118】
同様に、ＲＢは、ＲＢ ＭＩＣの２倍の濃度で、Ｓ.アウレウスＢＡＡ－４４、Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）、及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５を２分以内に殺菌した（図３Ｂ）。Ｂ.セパシアＵＣＢ７１７（２.９×１０８ＣＦＵ）がＭＩＣ濃度の４倍のＲＢの処理（図３Ｃ）によって濃度と時間に依存して殺菌され、５分で細菌の５対数減少超を示した。ＲＢは、ＭＩＣ濃度の２倍で細菌数を５対数減少で減らすのに４０分を要した。
【0119】
治療グレードＲＢの抗バイオフィルム活性
前のセクションで観察されたＲＢの高速殺菌抗菌特性は、グラム陽性菌におけるＲＢの抗バイオフィルム効果を評価することを促した。上でまとめたデータは、ＲＢが顕著な薬剤親和性又はグラム陽性菌に対する浸透性を有することを示している。抗菌及び抗真菌光線力学療法が、バイオフィルム条件下で光増感剤を使用して研究されてきたが、ＲＢを使用して検査された細菌バイオフィルムの数は限られている［１５］。
前のセクションで観察されたＲＢの高速殺菌抗菌特性は、グラム陽性菌におけるＲＢの抗バイオフィルム効果を評価することを促した。上でまとめたデータは、ＲＢが顕著な薬剤親和性又はグラム陽性菌に対する浸透性を有することを示している。抗菌及び抗真菌光線力学療法が、バイオフィルム条件下で光増感剤を使用して研究されてきたが、ＲＢを使用して検査された細菌バイオフィルムの数は限られている［１５］。
【0120】
最近、歯の表面に潜むう蝕原性口腔細菌に対するＲＢの抗バイオフィルム活性が青色光ＬＥＤ下で示された（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ. ２０２１年）［２０］。ここで我々は、蛍光灯及び暗条件下での薬剤感受性Ｓ.アウレウス６５０８（登録商標）、薬剤耐性Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５のバイオフィルムに対するＲＢの有効性を検討した。リネゾリドはグラム陽性菌のバイオフィルムを根絶するのに効果的な薬剤ではないが、バイオフィルム形成の予防に有益な効果がある［４７］。
【0121】
バイオフィルムアッセイでは、リネゾリドを陽性対照として、６００μｇ／ｍＬ（浮遊細胞の場合は１００×ＭＩＣ超）の非常に高い濃度で適用した。ここでテストしたすべての株がポリスチレンウェルプレート上で強力なバイオフィルムを形成することを確認した。蛍光灯下では、ＲＢは３０.０μｇ／ｍＬ（３８×ＭＩＣ）の濃度でＳ.アウレウス６５０８のバイオフィルムを７対数減少で根絶する可能性があり、これはリネゾリド（６００μｇ／ｍＬ）で観察されたのと同じレベルの有効性を示した（図４Ａ）。
【0122】
ＲＢは用量依存的にバイオフィルム根絶活性を示した。図４Ａに示すように、６０.０μｇ／ｍＬ（７７×ＭＩＣ）の濃度で、５対数減少超が達成された。１００μｇ／ｍＬではＣＦＵはカウントされなかった。はるかに高い濃度が必要であるが、ＲＢは暗条件下でバイオフィルム根絶活性を示した。５０.０μｇ／ｍＬ（暗闇下で２×ＭＩＣ）の濃度では、ＲＢは生菌の数を大幅に減らした。５００μｇ／ｍＬ（２０×ＭＩＣ）の濃度では、約１１０から約１５０ＣＦＵ／ｍＬしか観察されなかった。１,０００μｇ／ｍＬの濃度では生菌は現れなかった。
【0123】
これらの傾向は、薬剤耐性Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５のバイオフィルムで、はるかに低いＲＢ濃度で観察された（図４Ｂ及び４Ｃ）。蛍光灯下で、図４Ｂは、１０.０μｇ／ｍＬの濃度で生菌の６対数減少超が観察されたことを示している。３０.０μｇ／ｍＬ以上の濃度ではＣＦＵはカウントされなかった。
【0124】
Ｓ.アウレウスのコロニーが空気に暴露されたバイオフィルムとみなせるかどうかについては議論が分かれる［４８］。しかし、我々の研究では、（３７℃で２日間）寒天プレート上で増殖したＳ.アウレウスのコロニーは、ＦＤＡ承認の抗生物質を使用しても数時間で減少させることは不可能であることが示された。
【0125】
下のテーブル３のデータは、蛍光灯（１７Ｗ、１時間、０.５７ＫＪ／ｃｍ２）下でＭＲＳＡ、ＳアウレウスＢＡＡ－４４（登録商標）の空気暴露バイオフィルムに対するＲＢの効果をまとめたものである。ＲＢ（５.０μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬ溶液、２５０μＬ（２回））を噴霧し、蛍光灯を（１時間）照射したところ、（５.８×１０９の希釈で測定して）バイオフィルム中のかなりの生菌が４対数減少で根絶された。
【0126】
【表2】
【0127】
テーブル３にまとめた研究は、ＲＢがバイオフィルムマトリックスに容易に浸透し、グラム陽性菌の細胞壁を越えて拡散し得ることを示している。これらの観察結果は、ＲＢが重篤な細菌性皮膚感染症を治療する可能性があることを強く裏付ける。
【0128】
ＲＢの抗菌メカニズム
ＲＢの抗菌光線力学療法については、いくつかの論文で報告されている。ＲＢが細菌細胞壁を透過し、細胞膜に結合して活性酸素種を生成することは、照明条件下での殺菌メカニズムである可能性が高い［４９、５０］。比較的高い濃度が必要であるが、ＲＢは暗条件でマイコバクテリウム種を含むグラム陽性菌の大部分を殺す。また、（上記）グラム陽性菌のバイオフィルムを効果的に根絶する。暗条件でのＲＢの抗菌活性は、まだ完全に解明されているとは言えない［５１、５２］。
ＲＢの抗菌光線力学療法については、いくつかの論文で報告されている。ＲＢが細菌細胞壁を透過し、細胞膜に結合して活性酸素種を生成することは、照明条件下での殺菌メカニズムである可能性が高い［４９、５０］。比較的高い濃度が必要であるが、ＲＢは暗条件でマイコバクテリウム種を含むグラム陽性菌の大部分を殺す。また、（上記）グラム陽性菌のバイオフィルムを効果的に根絶する。暗条件でのＲＢの抗菌活性は、まだ完全に解明されているとは言えない［５１、５２］。
【0129】
ＲＢは、照明状態では１２.５～２５.０ｍｇ／ｍＬで、暗状態では２５.０～５０.０ｍｇ／ｍＬでマイコバクテリア種を殺す（テーブル１）。両状態において、ＲＢは５つのマイコバクテリア種をグラム陽性菌よりも遅い速度で殺す。ＲＢはマイコバクテリア細胞壁の透過性が低いと見られる。ＲＢは暗状態でもグラム陽性菌に対して迅速な殺菌効果を発揮するため、グラム陽性菌のＲＢ耐性変異体の生成は極めて困難な課題である。
【0130】
我々は、ＭＩＣ値が２００ｍｇ／ｍＬのＭ.スメグマチスのＲＢ耐性変異体の生成に成功した［４６］。ＲＢ耐性株は、ほとんどの結核治療薬［アミカシン、カプレオマイシン、リファンピシン、アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド（ＡＰＰＢ）、及びエチオナミド］に感受性を示した（下記テーブル４）。
【0131】
【表3】
【0132】
しかし、イソニアジド（ＩＮＨ）に交差耐性を示した。ＩＮＨはカタラーゼペルオキシダーゼファミリーに属する酵素ＫａｔＧによる酸化的活性化を必要とするプロドラッグである。ＫａｔＧはＩＮＨを酸化して求電子種であるイソニコチノイルラジカル分子を形成し、これがマイコバクテリアのミコール酸の生合成に関与する酵素であるＮＡＤＨ依存性エノイル－ＡＣＰ（アシル担体タンパク質）還元酵素と反応する（下記スキーム１）［５３、５４］。
【0133】
【化6】
【0134】
ＲＢ耐性Ｍ.スメグマチス株は中程度のＩＮＨ耐性を獲得したが、エチオナミド（ＥＴＨ）に対する耐性は示さなかった。ＩＮＨ耐性の主なメカニズムはｋａｔＧの変異であり、ＥＴＨはモノオキシゲナーゼＥｔｈＡによって活性化される［５５］。我々の観察は、ＲＢの抗菌メカニズムが１つ以上のＩＮＨ代謝酵素を共有して殺菌種を形成することを示唆している可能性がある。
【0135】
潜在的な作用機序を解明するために、次世代ＤＮＡ配列決定技術［５６］を用いてＲＢ耐性Ｍ.スメグマチスＡＴＣＣ６０７株の全ゲノム配列解析を行った。我々は、抗シグマＥ因子遺伝子（ｒｓｅＡ：エビデンス ＴＧ：１０４対Ｔ：０）及びアクアポリンファミリータンパク質遺伝子（エビデンス ＧＣＡＣＣＣＴ：７１対Ｇ：０）にそれぞれ１つの挿入変異が発生したことを特定した。
【0136】
その結果、これらの挿入変異は対応するタンパク質の読み枠の変化を引き起こし、親株と比較して短縮されたタンパク質を生成した。ＲｓｅＡがヒト型結核菌の特異的な抗シグマＥ因子として機能すること、及びシグマＥ因子（ＳｉｇＥ）がマイコバクテリア生物がさまざまなストレス応答に耐えることを可能にすることが報告されている［５７、５８］。したがって、ＲＢ耐性変異体における非機能的ＲｓｅＡの発現はＳｉｇＥの活性に影響を及ぼし、ＲＢに対する細菌耐性を高めることがある。一方、アクアポリンファミリータンパク質はさまざまな生物に存在し、細胞膜を通過する水と非荷電溶質の双方向フラックスにおいて重要な役割を果たす。
【0137】
連鎖球菌アクアポリンホモログのヌル変異により細胞内のＨ２Ｏ２保持が増加することが報告されており、これは、アクアポリンが連鎖球菌種におけるＨ２Ｏ２の輸送を媒介することを示している［５９］。したがって、ＲＢがアクアポリンの機能を阻害し、細菌細胞内へのＨ２Ｏ２の蓄積をもたらし得ると仮定する。興味深いことに、フレームシフト変異を引き起こす１つのヌクレオチド欠失が、ＲＢ耐性株のモリブドプテリン依存性酸化還元酵素（エビデンス Ｔ：７４対ＴＣ：０）で観察された。
【0138】
酸化還元酵素系は、分子酸素の還元によってスーパーオキシドを、又は無機硝酸塩の還元によってＮＯを形成する可能性がある。ＲＢは、ラジカルアニオン（ＲＢ'－）又はＲＢ三重項状態を生成することになる酸化還元酵素の酸化還元において単一電子受容体として機能し、酸素との電子移動反応を起こすことがある。そのため、我々は、暗条件下でのＲＢの励起による活性酸素種又は活性窒素種の生成にモリブドプテリン依存性酸化還元酵素が関与することを提案する（下記スキーム２）。スキーム２の酸化還元酵素は、モリブドプテリン依存性酸化還元酵素キサンチン脱水素酵素ファミリータンパク質である。スキーム２の「・ＯＨ+ＯＨ－」は、活性酸素種（ＲＯＳ）又は活性窒素種である。
【0139】
【化7】
【0140】
ｋａｔＧ遺伝子はＲＢ耐性株では無傷であった。そのため、ＩＮＨとの交差耐性を与えるメカニズムを推測することは依然として困難である。しかし、ＫａｔＧの発現レベルに影響を与え、ＩＮＨ活性化を抑制し得るＲＢ耐性株のいくつかの転写制御因子の変異を観察した。これは、Ｈ２Ｏ２のフェントン反応を通じてヒドロキシラジカル（活性酸素種）を生成する。マイコバクテリア種を含むグラム陽性菌に対する殺菌活性を示すために比較的高濃度のＲＢが必要であることは、ＲＢとカタラーゼの親和性が中程度であることを意味することがある。同様に、哺乳類細胞におけるＲＢの細胞毒性機構が、以下のスキーム３に示すように説明されることがある。
【0141】
【化8】
【0142】
光下でのＲＢの細胞毒性
ＲＢの細胞毒性は、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓの腫瘍薬開発プログラムで広範囲に評価されており、黒色腫や肝腫瘍の治療を目的とした病巣内投与による研究が行われた［３７、３８］。Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓの毒性研究の結果、ＲＢは治療濃度では全身性毒性作用、変異原性潜在力、及び女性の生殖及び発達への影響がないことが示された［６０］。これらのデータは、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓの米国特許（Ｅａｇｌｅ ｅｔ ａｌ. ２０１９年）［６１］に記載されている。全身投与における毒性研究の他に、照明状態における医薬品グレードＲＢの哺乳類細胞に対する細胞毒性については考察されていない。
ＲＢの細胞毒性は、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓの腫瘍薬開発プログラムで広範囲に評価されており、黒色腫や肝腫瘍の治療を目的とした病巣内投与による研究が行われた［３７、３８］。Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓの毒性研究の結果、ＲＢは治療濃度では全身性毒性作用、変異原性潜在力、及び女性の生殖及び発達への影響がないことが示された［６０］。これらのデータは、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓの米国特許（Ｅａｇｌｅ ｅｔ ａｌ. ２０１９年）［６１］に記載されている。全身投与における毒性研究の他に、照明状態における医薬品グレードＲＢの哺乳類細胞に対する細胞毒性については考察されていない。
【0143】
ＲＢは５０年以上にわたって眼疾患や肝臓疾患の診断に使用されてきた。結膜疾患や瞼疾患などの特定の医療問題を診断する際の染色剤として有用であることが多い（上記参照）。これらの用途では、０.１～２.０％のＲＢが使用されてきた。
【0144】
２.０％未満の濃度のＲＢは、自然光及び人工光下で安全であると考えられる［６２］。照明条件下でのＲＢの正常な細胞に対する細胞毒性レベルは、光線力学的抗菌化学療法のために明らかにされるべきであるが、これらのデータは公開されていない。我々は、蛍光灯下でのＲＢのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を測定するために、２つの正常な細胞株、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞と皮膚（ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫａ）細胞を選択した。
【0145】
我々は、ベロ細胞に対する抗菌剤と抗癌剤の細胞毒性に関する大規模なデータセットを生成しており、これにより新しい分子の毒性レベルを比較することができる［６３、６４］。ＨＥＫａ細胞に対する細胞毒性は、安全な局所適用抗菌剤の開発に有用な毒性情報を提供する［６５、６６］。
【0146】
これらの研究では、ＨＥＫａ細胞が気液界面を介して重層扁平上皮に分化した。このタイプの上皮は、ＲＢの処理によって表皮壊死症を研究するために生体組織として適用される可能性がある。暗闇下での２４時間の研究で、ＲＢはベロ細胞に対して３００μＭ（２９２μｇ／ｍＬ）のＩＣ５０値を示した。
【0147】
蛍光条件下では、ＲＢは時間及び濃度依存的にベロ細胞に対する細胞毒性を示した。図５は、ＲＢ（０～３００μＭ）の処理による融合ベロ細胞の時間効果をまとめたものである。４時間で１００μＭ（９７.４μｇ／ｍＬ）の濃度のＲＢ処理によって、コンフルエンシーの５０％近くが失われたが、単層は１００μＭのＲＢの１時間照射では無傷であった。２００μＭでは１時間でコンフルエンスの約１８％が失われたのに対し、４時間ではコンフルエンスの８０％超が失われた。３００μＭの濃度では、２時間以内に細胞生存率の完全な喪失が観察された。
【0148】
したがって、蛍光灯下で、ベロ細胞は１時間、１００～２００μＭに耐えられると結論付けられた。先にまとめた時間－殺菌動態研究では、ＲＢはグラム陽性菌を１～２分で、グラム陰性菌を５分でそれぞれ殺すことが示された。細胞毒性と抗菌活性の間のウィンドウを測定する比率である選択指数（ＳＩ）は、１時間の処理時間で６２.５超（グラム陽性菌の場合）及び７.９超（グラム陰性菌の場合）であると判定された。
【0149】
ＲＢのこれらの好ましい毒性プロファイルは、ＨＥＫａ細胞を用いた細胞毒性研究によって更に裏付けられた（上記参照）。ＲＢは角質層に局在していた。ＲＢは１０及び１００μＭの濃度で１時間の暴露では角質層細胞の壊死を引き起こさなかった。濃度が２００μＭに増加したとき、表面組織にいくらかの壊死が観察された（図６）。ＲＢの治療濃度は５～１０μＭの間である可能性が高い。したがって、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験は、照明条件下では宿主細胞の細胞毒性を引き起こすことなく、皮膚感染症をＲＢで治療できることを示唆している。
【0150】
結論
Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓは、ｃＧＭＰとＩＣＨの両方の要件を満たす医薬品グレードＲＢの製造及び精製プロセスを確立した。我々は、医薬品グレードＲＢ配合製品（ＰＶ－１０（登録商標））の抗菌活性と細胞毒性を、照明及び暗状態で例示的なＲＢ化合物として評価した。ここでまとめた生理食塩水で希釈したＰＶ－１０（登録商標）によるＲＢの包括的なＭＩＣデータは、ＲＢが、肺炎連鎖球菌種を除くほとんどのグラム陽性菌（ＭＩＣ０.３９～３．１μｇ／ｍＬ）を殺すのに非常に効果的であることを示す。
Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓは、ｃＧＭＰとＩＣＨの両方の要件を満たす医薬品グレードＲＢの製造及び精製プロセスを確立した。我々は、医薬品グレードＲＢ配合製品（ＰＶ－１０（登録商標））の抗菌活性と細胞毒性を、照明及び暗状態で例示的なＲＢ化合物として評価した。ここでまとめた生理食塩水で希釈したＰＶ－１０（登録商標）によるＲＢの包括的なＭＩＣデータは、ＲＢが、肺炎連鎖球菌種を除くほとんどのグラム陽性菌（ＭＩＣ０.３９～３．１μｇ／ｍＬ）を殺すのに非常に効果的であることを示す。
【0151】
Ｓ．肺炎菌は、抗グラム陰性菌薬であるコリスチン（ポリミキシンＥ）に感受性のある非常に数少ないグラム陽性菌の１つである。我々は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方におけるＲＢの殺菌効果とコリスチン耐性の関係を研究した。Ｓ.肺炎菌のＲＢに対する耐性メカニズムは、他の箇所で報告されることになる。
【0152】
ＲＢは、照明条件下でＭＩＣ値１２.５～２５.０μｇ／ｍＬでマイコバクテリア種を殺す。ミコール酸を含む厚い細胞壁が荷電ＲＢの細胞取り込みを減少させ、マイコバクテリア種に対するＭＩＣ値をグラム陽性菌よりもはるかに高くするものと推測される。
【0153】
ＲＢが薬剤耐性株を含むグラム陽性菌のバイオフィルムを根絶する優れた薬剤であることが確認された。蛍光及び暗条件下では、ＲＢは濃度依存的にＳ.アウレウス及びＥ.フェシウムの薬剤耐性株の生細胞数を大幅に減少させた。ＲＢは、１時間以内に蛍光灯暴露下でＭＲＳＡ株の空気暴露バイオフィルムに対して有意な殺菌効果を示した。これらの研究は、ＲＢがあらゆる増殖期に薬剤耐性菌を殺す潜在的な抗菌剤を有することを示している。
【0154】
ＲＢは、高い一重項酸素量子収率を有するアニオン性光増感剤である。これは、照明状態での抗菌活性の主な作用機序である。我々は、暗条件下でＭ.スメグマチスのＲＢ耐性変異体を生成することに成功した。これは、第一選択の結核治療薬であるＩＮＨに対して交差耐性を示した。我々は、生成された耐性変異体の全ゲノム解析を行った。その結果、ＲＢの殺菌活性のメカニズムを与え得る固有の変異が明らかになった。いくつかの酸化還元系、転写因子、及びアクアポリンが、ＲＢの耐性メカニズムに関与している場合がある。これらのデータに基づくと、ＲＢは、暗条件下で酸化還元酵素に関連する酵素によって励起状態に移行し、活性酸素種又は活性窒素種を形成し得ると推測される。暗条件下でのＲＢの殺菌活性には、特定の協力的なメカニズムが存在することがある。
【0155】
要約すると、ＲＢの医薬品グレード製剤であるＰＶ－１０（登録商標）は、照明条件下でのグラム陽性菌感染症の治療に適切な選択指数を持っていることが実証された。細菌バイオフィルムに対して有効なＲＢの迅速な殺菌効果は珍しい薬剤特性であり、臨床応用のための消毒剤としてのＲＢの進歩を約束する。
【0156】
材料及び方法
【0157】
ライト
これらの研究で使用されたＬＥＤ光源は、フィリップス９.５ワットソフトホワイト、８００ルーメン、２７００～３０００ケルビン、モデル番号Ｂ０７ＣＦＲＣＧＫＣ、品番４７９５７６であった。この電球からの光出力は、６０Ｗの同様の電球から放出される光に匹敵すると言われている。
これらの研究で使用されたＬＥＤ光源は、フィリップス９.５ワットソフトホワイト、８００ルーメン、２７００～３０００ケルビン、モデル番号Ｂ０７ＣＦＲＣＧＫＣ、品番４７９５７６であった。この電球からの光出力は、６０Ｗの同様の電球から放出される光に匹敵すると言われている。
【0158】
蛍光光源は、Ｓｕｎ Ｂｌａｓｔｅｒ（登録商標）、１８インチ、Ｔ５園芸照明蛍光水銀ランプ、１７Ｗ、６４００ケルビン、品番０９００３５４であった。
【0159】
抗生物質
すべての抗生物質は、商業的供給源から購入され［アミカシン二硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１７７４－１Ｇ）、硫酸カプレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４１４２－１Ｇ）、シプロフロキサシン塩酸塩一水和物（ＴＣＩ、Ｃ２２２７）、エチオナミド（ＴＣＩ、Ｅ０６９５）、イソニアジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ３３７７－５Ｇ）、リネゾリド（Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ、２９７２３）、メロペネム三水和物（Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ、ＡＫ１６１９８７）、リファンピシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ３５０１－１Ｇ）］、特に記載のない限り、更に精製することなく使用した。ＡＰＰＢ（アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド）は、報告された手順に従って合成した。［（ａ）Ｍｉｔａｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１８年、３：１７２６－１７３９;及び（ｂ）Ｍｉｔａｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１９年、６：２３０５－２３２１.］
すべての抗生物質は、商業的供給源から購入され［アミカシン二硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１７７４－１Ｇ）、硫酸カプレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４１４２－１Ｇ）、シプロフロキサシン塩酸塩一水和物（ＴＣＩ、Ｃ２２２７）、エチオナミド（ＴＣＩ、Ｅ０６９５）、イソニアジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ３３７７－５Ｇ）、リネゾリド（Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ、２９７２３）、メロペネム三水和物（Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ、ＡＫ１６１９８７）、リファンピシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ３５０１－１Ｇ）］、特に記載のない限り、更に精製することなく使用した。ＡＰＰＢ（アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド）は、報告された手順に従って合成した。［（ａ）Ｍｉｔａｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１８年、３：１７２６－１７３９;及び（ｂ）Ｍｉｔａｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１９年、６：２３０５－２３２１.］
【0160】
生理食塩水中での医薬品グレードローズベンガルの製剤化（ＰＶ－１０（登録商標））
ローズベンガルジナトリウム塩をＰｒｏｖｅｃｔｕｓの特許手順に従って合成した。詳細な手順は、米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号、及び第９,４２２,２６０号に記載されたとおりである。
ローズベンガルジナトリウム塩をＰｒｏｖｅｃｔｕｓの特許手順に従って合成した。詳細な手順は、米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号、及び第９,４２２,２６０号に記載されたとおりである。
【0161】
細菌の取得
このプログラムで使用した薬剤感受性細菌及び酵母は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス）から購入した。薬剤耐性株は、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から取得した。
このプログラムで使用した薬剤感受性細菌及び酵母は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス）から購入した。薬剤耐性株は、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から取得した。
【0162】
対数期細菌培養
すべての液体細菌培養は、エアフィルタ付きの三角フラスコを用いて行った。細菌株の単一コロニーをＡＴＣＣが推奨する条件に従って増殖させた。細菌の種培養及び大規模培養は、ＡＴＣＣが推奨する培地を使用して得た。Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７）は、０.５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ ミドルブルック ７Ｈ１０ニュートリエント寒天培地（０.４％グリセロール）で培養した［４６］。培養フラスコは、Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７）の場合は３～４日間、結核菌（Ｍ.ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖの場合は１０～１２日間、振とう培養器で３７℃、振とう速度２００ｒｐｍでインキュベートし、中間対数期（光学密度－０.５）まで培養した。光学密度は、９６ウェルマイクロプレートリーダを使用して６００ｎｍでモニタされた。
すべての液体細菌培養は、エアフィルタ付きの三角フラスコを用いて行った。細菌株の単一コロニーをＡＴＣＣが推奨する条件に従って増殖させた。細菌の種培養及び大規模培養は、ＡＴＣＣが推奨する培地を使用して得た。Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７）は、０.５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ ミドルブルック ７Ｈ１０ニュートリエント寒天培地（０.４％グリセロール）で培養した［４６］。培養フラスコは、Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７）の場合は３～４日間、結核菌（Ｍ.ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖの場合は１０～１２日間、振とう培養器で３７℃、振とう速度２００ｒｐｍでインキュベートし、中間対数期（光学密度－０.５）まで培養した。光学密度は、９６ウェルマイクロプレートリーダを使用して６００ｎｍでモニタされた。
【0163】
ＭＩＣアッセイ
すべての試験は、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）が定めたガイドラインに従う［６８］。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、液体希釈マイクロプレートアラマーブルーアッセイ又はＯＤ測定によって決定した。すべての化合物は、ＤＭＳＯ又は生理食塩水（１ｍｇ／１００μＬ濃度）に保存した。この濃度は、すべてのＭＩＣ研究に貯蔵液として使用された。貯蔵液からの各化合物は、滅菌９６ウェルプレートの第１のウェルに入れられ、培養液（総量１０μＬ）で連続希釈を行った。対数期の細菌懸濁液（１９０μＬ）を各ウェル（総量２００μＬ）に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。各ウェルに２０μＬのレザズリン（０.０２％）を加え、４時間インキュベートした（臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬＳ）法（ピンク＝増殖、青＝目に見える増殖なし））。比色分析を行う前に、すべての実験でＯＤ測定を行った。また、各ウェルの吸光度をＵＶ－Ｖｉｓを介して５７０ｎｍ及び６００ｎｍで測定した。
すべての試験は、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）が定めたガイドラインに従う［６８］。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、液体希釈マイクロプレートアラマーブルーアッセイ又はＯＤ測定によって決定した。すべての化合物は、ＤＭＳＯ又は生理食塩水（１ｍｇ／１００μＬ濃度）に保存した。この濃度は、すべてのＭＩＣ研究に貯蔵液として使用された。貯蔵液からの各化合物は、滅菌９６ウェルプレートの第１のウェルに入れられ、培養液（総量１０μＬ）で連続希釈を行った。対数期の細菌懸濁液（１９０μＬ）を各ウェル（総量２００μＬ）に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。各ウェルに２０μＬのレザズリン（０.０２％）を加え、４時間インキュベートした（臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬＳ）法（ピンク＝増殖、青＝目に見える増殖なし））。比色分析を行う前に、すべての実験でＯＤ測定を行った。また、各ウェルの吸光度をＵＶ－Ｖｉｓを介して５７０ｎｍ及び６００ｎｍで測定した。
【0164】
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）アッセイ
（寒天プレート上で増殖した）特定の細菌の単一コロニーを培養液に接種した。細菌培養物を一晩中（約１８時間）増殖させた後、増殖支援培養液で１×１０５から１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの間の濃度に希釈する。ＭＩＣ値に基づいて、薬剤（ＭＩＣ、２ｘ～２０ｘＭＩＣ）を含む寒天プレートを調製した。一連の薬剤含有寒天プレートに、等量の特定の細菌を接種した。寒天プレートを適切な温度と時間でインキュベートした。ＣＦＵ／ｍＬをカウントした。ＭＢＣ値は、細菌の９９.９％超の減少によって決定した。
（寒天プレート上で増殖した）特定の細菌の単一コロニーを培養液に接種した。細菌培養物を一晩中（約１８時間）増殖させた後、増殖支援培養液で１×１０５から１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの間の濃度に希釈する。ＭＩＣ値に基づいて、薬剤（ＭＩＣ、２ｘ～２０ｘＭＩＣ）を含む寒天プレートを調製した。一連の薬剤含有寒天プレートに、等量の特定の細菌を接種した。寒天プレートを適切な温度と時間でインキュベートした。ＣＦＵ／ｍＬをカウントした。ＭＢＣ値は、細菌の９９.９％超の減少によって決定した。
【0165】
時間－殺菌動態アッセイ
抗菌剤の時間－殺菌動態アッセイを、ＣＬＳＩガイドラインを若干変更して実施した。ＲＢ及び参照分子の時間－殺菌動態アッセイの複数の時点を実施した。培養液で増殖した細菌培養物を１×１０８から５.０×１０９ＣＦＵ／ｍＬの間の濃度に希釈した。
抗菌剤の時間－殺菌動態アッセイを、ＣＬＳＩガイドラインを若干変更して実施した。ＲＢ及び参照分子の時間－殺菌動態アッセイの複数の時点を実施した。培養液で増殖した細菌培養物を１×１０８から５.０×１０９ＣＦＵ／ｍＬの間の濃度に希釈した。
【0166】
抗菌試験物質のストック希釈液をＭＩＣ値の約２から約８倍に調製した。試験化合物に９６ウェルプレートに入れた等量の指定細菌を接種した。マイクロタイタープレートは、蛍光灯の下で３７℃で１～１２０分間インキュベートした（条件は図の説明にまとめられている）。各ウェルから一定分量の培養培地を採取し、連続希釈を行った。希釈した培養物を３７℃でインキュベートし、ＣＦＵ／ｍＬをカウントした。殺菌活性は、コロニー形成単位の３対数倍超の減少と定義した［６４］。
【0167】
抗バイオフィルムアッセイ
バイオフィルムを、各細菌を５日間インキュベートすることによって１２ウェルプレート上に生成した。培養培地中の浮遊細菌を丁寧に除去し、新鮮な培地を入れた。ＰＶ－１０（２５×ＭＩＣ）又はリネゾリド（２００×ＭＩＣ）を各ウェル中に添加し、３７℃、暗所又は明所で２４時間（６.７ＫＪ／ｃｍ２）インキュベートした。一定分量の各培養物を寒天プレート上で３７℃で２４時間希釈した（１０,０００倍又は１００,０００倍）。ＣＦＵ／ｍＬをカウントした［４７、６９］。
バイオフィルムを、各細菌を５日間インキュベートすることによって１２ウェルプレート上に生成した。培養培地中の浮遊細菌を丁寧に除去し、新鮮な培地を入れた。ＰＶ－１０（２５×ＭＩＣ）又はリネゾリド（２００×ＭＩＣ）を各ウェル中に添加し、３７℃、暗所又は明所で２４時間（６.７ＫＪ／ｃｍ２）インキュベートした。一定分量の各培養物を寒天プレート上で３７℃で２４時間希釈した（１０,０００倍又は１００,０００倍）。ＣＦＵ／ｍＬをカウントした［４７、６９］。
【0168】
細菌（約１.０×１０４）を寒天プレート上に広げ、３７℃のオーブンで２日間インキュベートした。寒天プレート上の空気暴露バイオフィルムをＰＶ－１０で処理した。蛍光灯（０.５７ＫＪ／ｃｍ２）下で１時間後、生理食塩水（２ｍＬ）を寒天表面に加えた。細菌懸濁液（１００ｍＬ）を滅菌チューブ内に入れ、連続希釈を行った。希釈サンプル（１００ｍＬ）を寒天プレートに広げ、３７℃で２４時間インキュベートした。ＣＦＵ／ｍＬをカウントした。
【0169】
哺乳類細胞株及び培養
ベロ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８１）はＡＴＣＣから購入した。ＨＥＫ細胞（ＳＣＣＥ０２０）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。細胞株はサプライヤーが推奨するように培地で培養し維持した。
ベロ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８１）はＡＴＣＣから購入した。ＨＥＫ細胞（ＳＣＣＥ０２０）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。細胞株はサプライヤーが推奨するように培地で培養し維持した。
【0170】
ベロ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、３０－００２－ＣＩ）、１％ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＨ３０２３８.０１）及び１％ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＨ３０２３９.０１）が補充されたＥａｇｌｅのＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）、１０－００９－ＣＶ）で培養し、湿度１００％、ＣＯ２５％の３７℃インキュベータでインキュベートした。培養物は、増殖速度に応じて約５日かかる１００％コンフルエンスに達するまで、２日ごとに新鮮な培地でリフレッシュした。
【0171】
ヒト表皮角化細胞、新生児（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）、カタログ番号ＳＣＣＥ０２０）をＥｐｉＧＲＯ（登録商標）ヒト表皮角化細胞完全培養培地キット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）、ＳＣＭＫ００１）で培養し、湿度１００％、ＣＯ２５％の３７℃インキュベータでインキュベートした。培養物が１００％のコンフルエンスに達するまで、２日後及び週３回新鮮な培地でリフレッシュする。
【0172】
ベロ細胞を用いた細胞毒性分析
すべての試験は、若干の変更を含む臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）が定めたガイドラインに従う。ＰＶ－１０の細胞毒性分析は、２４ウェルプレートで実施した。各ウェル（１ｍＬ培地／ウェル）に、１μＬの薬剤濃度を加えた。光下での室温（ｒ．ｔ．）での１、２、３及び４時間のインキュベーション後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで（３回）洗浄した。培地（１ｍＬ／ウェル）を加えた後、１０μＬの３－（４,５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２,５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃（５％ＣＯ２）でもう３時間インキュベートした。培地を除去し、ＤＭＳＯ（１ｍＬ／ウェル）を添加した。生存率はＭＴＴの紫色ホルマザン産物への細胞変換に基づいて評価した。着色したホルマザン産物の吸光度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）ＨＴ分光光度計によって５７０ｎｍで測定した［４３］。
すべての試験は、若干の変更を含む臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）が定めたガイドラインに従う。ＰＶ－１０の細胞毒性分析は、２４ウェルプレートで実施した。各ウェル（１ｍＬ培地／ウェル）に、１μＬの薬剤濃度を加えた。光下での室温（ｒ．ｔ．）での１、２、３及び４時間のインキュベーション後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで（３回）洗浄した。培地（１ｍＬ／ウェル）を加えた後、１０μＬの３－（４,５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２,５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃（５％ＣＯ２）でもう３時間インキュベートした。培地を除去し、ＤＭＳＯ（１ｍＬ／ウェル）を添加した。生存率はＭＴＴの紫色ホルマザン産物への細胞変換に基づいて評価した。着色したホルマザン産物の吸光度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）ＨＴ分光光度計によって５７０ｎｍで測定した［４３］。
【0173】
ベロ細胞［５×１０４細胞／ウェル（１９６μＬの培養培地中）を９６ウェルプレートに入れ、細胞培養物を４日間インキュベートして単層（１００％コンフルエンス）を形成した。各ウェル中にＲＢ（０～３００ｍＭ）を添加した。
【0174】
画像は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞イメージングシステム（ＥｓｓｅｎＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ミシガン州アナーバー）を使用して１時間ごとに取得された。細胞増殖は、統合ソフトウェアによって計算される、細胞で覆われる視野の面積の測定値であるメトリック位相物体コンフルエンス（ＰＯＣ）を使用して定量化された。
【0175】
ＨＥＫａ細胞を用いた細胞毒性分析
我々は、トランスウェル透過性支持体上の細胞単層の完全性試験（ＣＬＳ－ＡＮ－０４７Ｗ）に記載されているプロトコルを参照した。ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫａ）に対するＰＶ－１０の細胞毒性は、２４ウェルプレートの吊り下げ式細胞培養インサートで評価した。ＨＥＫａ（４×１０５細胞／ｍＬ、０.５ｍＬ）細胞懸濁液を、外側がＥｐｉＧＲＯ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ（１.５ｍＬ）で満たされたインサートに入れた［６７］。細胞懸濁液を３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートした。
我々は、トランスウェル透過性支持体上の細胞単層の完全性試験（ＣＬＳ－ＡＮ－０４７Ｗ）に記載されているプロトコルを参照した。ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫａ）に対するＰＶ－１０の細胞毒性は、２４ウェルプレートの吊り下げ式細胞培養インサートで評価した。ＨＥＫａ（４×１０５細胞／ｍＬ、０.５ｍＬ）細胞懸濁液を、外側がＥｐｉＧＲＯ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ（１.５ｍＬ）で満たされたインサートに入れた［６７］。細胞懸濁液を３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートした。
【0176】
翌日、元の培地を除去することなく、追加の培地０.５ｍＬを各インサートの内側に加え、３７℃で２日間インキュベートした。高品質のＨＥＫａは、液内培養の３日目までに１００％コンフルエンスに近づいた。４日目には、各インサートから培地を穏やかに吸引した。皮膚細胞培養物は空気／液体界面で維持された。
【0177】
皮膚培養物は３７℃で更に１０日間インキュベートされた。１０日間のインキュベーション中、培地は１日置きに交換され、インサート膜の下から気泡が除去された。
【0178】
２５日間の３Ｄ皮膚培養後、約６から８層の生きた上皮が生成された。ＨＥＫａ組織を蛍光灯下室温で１時間ＲＢ（０～２００ｍＭ）で処理し、ＰＢＳで（３回）洗浄し、４％ホルマリンで室温で１時間固定した。皮膚組織をインサートから解放し、パラフィンに包埋した。４μＭの切片を切り出し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色用スライドに移した［７１］。
【0179】
Ｍ.スメグマチス株の全ゲノム配列
ＲＢ耐性Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７（登録商標））株は、以前に報告された手順に従って調製された［７２］。細菌のＲＢ耐性に寄与し得る一塩基変異多型（ＳＮＰ）を同定するために、以前に報告された手順に従って、ＲＢ耐性変異体とその親対照株Ｍ.スメグマチス６０７（登録商標）の静置培養物からゲノムＤＮＡを精製した［４６］。
ＲＢ耐性Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７（登録商標））株は、以前に報告された手順に従って調製された［７２］。細菌のＲＢ耐性に寄与し得る一塩基変異多型（ＳＮＰ）を同定するために、以前に報告された手順に従って、ＲＢ耐性変異体とその親対照株Ｍ.スメグマチス６０７（登録商標）の静置培養物からゲノムＤＮＡを精製した［４６］。
【0180】
精製されたゲノムＤＮＡはミネソタ大学ゲノムセンター（ＵＭＧＣ）に送られ、品質管理分析、ライブラリ調製、及び高度なＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡ－ｓｅｑテクノロジを用いたＤＮＡ塩基配列決定が行われた。変異体及び対照からの配列読み取りは、ＦａｓｔＱＣを使用して品質が評価された。低品質のテール及びアダプタがＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用して除去された［７３］。Ｍ.スメグマチス株ＦＤＡＡＲＧＯＳ＿６７９の全ゲノム配列を参照として使用し、ＳＮＰ又は欠失や挿入などの他の変異は、バイオインフォマティクスツールＳｎｉｐｐｙ［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ／ｔｓｅｅｍａｎｎ／ｓｎｉｐｐｙ］を使用して呼び出された。
【0181】
抗生物質
すべての抗生物質を商業的供給源から購入し（アミカシン二硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１７７４－１Ｇ）、硫酸カプレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４１４２－１Ｇ）、シプロフロキサシン塩酸塩一水和物（ＴＣＩ、Ｃ２２２７）、エチオナミド（ＴＣＩ、Ｅ０６９５）、イソニアジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ３３７７－５Ｇ）、リネゾリド（Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ、２９７２３）、メロペネム三水和物（Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ、ＡＫ１６１９８７）、リファンピシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ３５０１－１Ｇ））、特に記載のない限り、更に精製することなく使用した。ＡＰＰＢ（アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド）は、報告された手順に従って合成した［７４］。
すべての抗生物質を商業的供給源から購入し（アミカシン二硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１７７４－１Ｇ）、硫酸カプレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４１４２－１Ｇ）、シプロフロキサシン塩酸塩一水和物（ＴＣＩ、Ｃ２２２７）、エチオナミド（ＴＣＩ、Ｅ０６９５）、イソニアジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ３３７７－５Ｇ）、リネゾリド（Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ、２９７２３）、メロペネム三水和物（Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ、ＡＫ１６１９８７）、リファンピシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ３５０１－１Ｇ））、特に記載のない限り、更に精製することなく使用した。ＡＰＰＢ（アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド）は、報告された手順に従って合成した［７４］。
【0182】
ＲＢの光下での細胞毒性
ベロ細胞におけるＲＢの細胞毒性分析は、２４ウェルプレートで実施した。各ウェル（１ｍＬ培地／ウェル）に、１μＬの薬剤濃度を加えた。蛍光灯下での室温での薬剤との１、２、３及び４時間のインキュベーション後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで（３回）洗浄した。
ベロ細胞におけるＲＢの細胞毒性分析は、２４ウェルプレートで実施した。各ウェル（１ｍＬ培地／ウェル）に、１μＬの薬剤濃度を加えた。蛍光灯下での室温での薬剤との１、２、３及び４時間のインキュベーション後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで（３回）洗浄した。
【0183】
画像はＡＭＧ ＥＶＯＳ ｘｌ透過光イメージング顕微鏡で収集された。培地（１ｍＬ／ウェル）を加えた後、１０μＬのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃（５％ＣＯ２）でもう３時間インキュベートした。培地を除去し、ＤＭＳＯ（１ｍＬ／ウェル）を添加した。生存率は、ＭＴＴの紫色ホルマザン産物への細胞変換に基づいて評価した。着色されたホルマザン産物の吸光度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）ＨＴ分光光度計によって５７０ｎｍで測定した。
【0184】
文献目録
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73. Lei, T.; Yang, J. Identification of target genes mediated by two-component regulators of Staphylococcus aureus using RNA-seq technology. Methods Mol. Biol. 2020, 2069, 125-138. doi: 10.1007/978-1-4939-9849-4_10.
74. (a) Mitachi, K.; Yun, H-G.; Kurosu, S. M.; Eslamimehr, S.; Lemieux, M. R.; Klaic, L.; Clemons, W. M.; Kurosu, M. ACS Omega 2018, 3, 1726-1739. (b) Mitachi, K.; Kurosu, S. M.; Gillman, C. D.; Yun, H. G.; Clemons, W. M.; Kurosu, M. MethodsX 2019, 6, 2305-2321.
75. H.C. Dees, T. C. Scott, E. A. Wachter and J. Smolik, Intracorporeal Medicaments For Photodynamic Treatment of Disease, U.S. Patent No. 7,390,668 B2.
【0185】
本明細書で引用した特許、特許出願及び論文は、それぞれ参照によって組み込まれる。冠詞「ａ」及び「ａｎ」（「１つの」）は、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すのに本明細書において使用される。
【0186】
前述の説明及び実施例は、例示を目的としたものであり、限定と捉えられるべきではない。本発明の趣旨及び範囲内で、更に他の変形も可能であり、当業者であれば容易に思いつくであろう。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】