特表 2025-500618 抗ＣＤ８４抗体およびキメラ抗原受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】抗ＣＤ８４抗体およびキメラ抗原受容体

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241226BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20241226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241226BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20241226BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241226BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20241226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20241226BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20241226BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/17

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K48/00

A61K35/76

G01N33/574 A

C07K14/705

C12N15/12

C12N15/13

C12N5/0783

C12P21/08

C12P21/02 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024540878

(86)(22)【出願日】2023-01-05

(85)【翻訳文提出日】2024-08-23

(86)【国際出願番号】 EP2023050194

(87)【国際公開番号】W WO2023131657

(87)【国際公開日】2023-07-13

(31)【優先権主張番号】22382003.6

(32)【優先日】2022-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22205399.3

(32)【優先日】2022-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524254372

【氏名又は名称】ギャラ セラピューティクス ソシエダ リミタダ

(71)【出願人】

【識別番号】523030500

【氏名又は名称】フンダシオ デ レセルカ クリニック バルセロナ－インスティテュート ディンベスティガシオンス ビオメディケス アウグスト ペイ イ スニェー

(71)【出願人】

【識別番号】524254383

【氏名又は名称】ホスピタル クリニク デ バルセロナ（エイチシービー）

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クレイン，ゴンザレス，ネラ

(72)【発明者】

【氏名】フアン オテロ，マヌエル

(72)【発明者】

【氏名】ヴィレラ プイグ，ラモン

(72)【発明者】

【氏名】ペレス アミル，ロレーナ

(72)【発明者】

【氏名】リベイロ ドス サントス，クラウディオ ジョアオ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA13

4C085AA14

4C085CC22

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

ＣＤ８４に結合する抗原結合ドメイン、抗体またはキメラ抗原受容体。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号１）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＶＳＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＲ（配列番号２）；およびＣＤＲ３－ＧＴＧＲＦＡＹ（配列番号３）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＬＧ（配列番号７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号８）；およびＣＤＲ３－ＹＥＧＧＹＹＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号１０）；ＣＤＲ２－ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号１１）；およびＣＤＲ３－ＱＱＳＫＡＶＰＲＴ（配列番号１２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１３）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１４）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号１５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＮＩＥＳＫＤ（配列番号１６）；ＣＤＲ２－ＤＤＡ（配列番号１７）；およびＣＤＲ３－ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（配列番号１８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｄ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＰ（配列番号１９）；ＣＤＲ２－ＩＳＹＨＧＲＮＫ（配列番号２０）；およびＣＤＲ３－ＡＲＤＲＤＡＴＰＧＧＴＧＶＧＮＨＧＭＡＶ（配列番号２１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＬＨＳＳＧＹＮＹ（配列番号２２）；ＣＤＲ２－ＭＧＳ（配列番号２３）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＬＱＴＰＰＴ（配列番号２４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｅ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＤＮＡ（配列番号２５）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＴＧＲＴＴ（配列番号２６）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号２７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＶＹＳＤＧＤＴＹ（配列番号２８）；ＣＤＲ２－ＫＶＳ（配列番号２９）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＴＨＷＰＰＮＴ（配列番号３０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｆ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号３１）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号３２）；およびＣＤＲ３－ＭＲＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＬＡ（配列番号３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＴＰＦＴ（配列番号３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｇ）配列：ＣＤＲ１－ＳＹＷＩＮ（配列番号３７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＬＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３８）；およびＣＤＲ３－ＳＧＧＹＬＧＹ（配列番号３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４０）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号４１）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｈ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＧ（配列番号４３）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号４４）；およびＣＤＲ３－ＳＴＴＹＹＳＳＹＷＣＦＤＶ（配列番号４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＡＮＹＬＡ（配列番号４６）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号４７）；およびＣＤＲ３－ＱＮＤＨＳＹＰＦＴ（配列番号４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｉ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＭＳ（配列番号４９）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号５０）；およびＣＤＲ３－ＰＧＰＴＶＶＡＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号５２）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＳＲＦＳ（配列番号５３）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｊ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＩＮ（配列番号５５）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号５６）；およびＣＤＲ３－ＤＴＴＩＡＹ（配列番号５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＴＴＳＲＹＳＹＭＨ（配列番号５８）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５９）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｋ）配列：ＣＤＲ１－ＧＹＮＭＮ（配列番号１３１）；ＣＤＲ２－ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３２）；およびＣＤＲ３－ＧＬＬＳＧＳＦＰＹ（配列番号１３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＧＳＰＬＴ（配列番号１３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｌ）配列：ＣＤＲ１－ＲＳＷＭＳ（配列番号１３７）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号１３８）；およびＣＤＲ３－ＦＹＤＧＹＳＩＹＷＹＦＤＶ（配列番号１３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＤＴＹＬＥ（配列番号１４０）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４１）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｍ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４３）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＲＳ（配列番号１４４）；およびＣＤＲ３－ＩＡＶＴＹＦＦＤＦ（配列番号１４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＦＡ（配列番号１４６）；ＣＤＲ２－ＮＡＲＴＬＡＥ（配列番号１４７）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＳＰＦＴ（配列番号１４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｎ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４９）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号１５０）；およびＣＤＲ３－ＭＳＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号１５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＬＦＴＳＶＡ（配列番号１５２）；ＣＤＲ２－ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１５３）；およびＣＤＲ３－ＱＱＨＹＳＳＰＦＴ（配列番号１５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｏ）配列：ＣＤＲ１－ＩＹＡＭＮ（配列番号１５５）；ＣＤＲ２－ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＲＦＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１５６）；およびＣＤＲ３－ＰＬＲＳＹＦＳＭＤＹ（配列番号１５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳ（配列番号１５８）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号１５９）；およびＣＤＲ３－ＧＱＴＹＳＹＰＷＴ（配列番号１６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含んでなる抗原結合ドメインを含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号６１配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６２または１０８の配列を有するＶＬドメイン；
ｂ）配列番号６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６４または１０９の配列を有するＶＬドメイン；
ｃ）配列番号６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６の配列を有するＶＬドメイン；
ｄ）配列番号６８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６９の配列を有するＶＬドメイン；
ｅ）配列番号７１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７２の配列を有するＶＬドメイン；
ｆ）配列番号７４の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７５の配列を有するＶＬドメイン；
ｇ）配列番号７６の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７７の配列を有するＶＬドメイン；
ｈ）配列番号７８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７９の配列を有するＶＬドメイン；
ｉ）配列番号８０の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８１の配列を有するＶＬドメイン；
ｊ）配列番号８２の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８３の配列を有するＶＬドメイン；
ｋ）配列番号１６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６２の配列を有するＶＬドメイン；
ｌ）配列番号１６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６４の配列を有するＶＬドメイン；
ｍ）配列番号１６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６６の配列を有するＶＬドメイン；
ｎ）配列番号１６７の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６８の配列を有するＶＬドメイン；または
ｏ）配列番号１６９の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１７０の配列を有するＶＬドメイン；
またはそれぞれそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体
を含んでなる、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項3】

ａ）ＣＡＲがｓｃＦｖ ＣＡＲであり；
ｂ）ＣＡＲがＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含み；
ｃ）ＣＡＲが４－１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含み；かつ／または
ｄ）ＣＡＲがＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含んでなる、
請求項１または２に記載のＣＡＲ。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする１以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。

【請求項5】

請求項４に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。

【請求項6】

請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載のベクターを含んでなる細胞。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲを含んでなる細胞。

【請求項8】

第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、第１のＣＡＲが請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲであり、場合により、第２のＣＡＲが抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ；または抗ＣＤ７ ＣＡＲである、細胞。

【請求項9】

Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり、場合により、自己または同種細胞である、請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項10】

請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、または請求項６～９のいずれか一項に記載の細胞を含んでなる医薬組成物。

【請求項11】

療法、場合により癌の治療である療法において使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、請求項６～９のいずれか一項に記載の細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

癌が血液悪性腫瘍、場合により、ＣＤ８４を発現する血液悪性腫瘍であり、および／または癌が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄増殖性症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、樹状細胞新生物および組織球性肉腫からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用のためのＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物。

【請求項13】

ａ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号１）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＶＳＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＲ（配列番号２）；およびＣＤＲ３－ＧＴＧＲＦＡＹ（配列番号３）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＬＧ（配列番号７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号８）；およびＣＤＲ３－ＹＥＧＧＹＹＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号１０）；ＣＤＲ２－ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号１１）；およびＣＤＲ３－ＱＱＳＫＡＶＰＲＴ（配列番号１２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１３）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１４）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号１５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＮＩＥＳＫＤ（配列番号１６）；ＣＤＲ２－ＤＤＡ（配列番号１７）；およびＣＤＲ３－ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（配列番号１８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｄ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＰ（配列番号１９）；ＣＤＲ２－ＩＳＹＨＧＲＮＫ（配列番号２０）；およびＣＤＲ３－ＡＲＤＲＤＡＴＰＧＧＴＧＶＧＮＨＧＭＡＶ（配列番号２１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＬＨＳＳＧＹＮＹ（配列番号２２）；ＣＤＲ２－ＭＧＳ（配列番号２３）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＬＱＴＰＰＴ（配列番号２４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｅ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＤＮＡ（配列番号２５）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＴＧＲＴＴ（配列番号２６）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号２７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＶＹＳＤＧＤＴＹ（配列番号２８）；ＣＤＲ２－ＫＶＳ（配列番号２９）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＴＨＷＰＰＮＴ（配列番号３０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｆ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号３１）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号３２）；およびＣＤＲ３－ＭＲＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＬＡ（配列番号３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＴＰＦＴ（配列番号３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｇ）配列：ＣＤＲ１－ＳＹＷＩＮ（配列番号３７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＬＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３８）；およびＣＤＲ３－ＳＧＧＹＬＧＹ（配列番号３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４０）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号４１）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｈ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＧ（配列番号４３）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号４４）；およびＣＤＲ３－ＳＴＴＹＹＳＳＹＷＣＦＤＶ（配列番号４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＡＮＹＬＡ（配列番号４６）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号４７）；およびＣＤＲ３－ＱＮＤＨＳＹＰＦＴ（配列番号４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｉ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＭＳ（配列番号４９）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号５０）；およびＣＤＲ３－ＰＧＰＴＶＶＡＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号５２）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＳＲＦＳ（配列番号５３）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｊ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＩＮ（配列番号５５）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号５６）；およびＣＤＲ３－ＤＴＴＩＡＹ（配列番号５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＴＴＳＲＹＳＹＭＨ（配列番号５８）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５９）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｋ）配列：ＣＤＲ１－ＧＹＮＭＮ（配列番号１３１）；ＣＤＲ２－ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３２）；およびＣＤＲ３－ＧＬＬＳＧＳＦＰＹ（配列番号１３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＧＳＰＬＴ（配列番号１３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｌ）配列：ＣＤＲ１－ＲＳＷＭＳ（配列番号１３７）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号１３８）；およびＣＤＲ３－ＦＹＤＧＹＳＩＹＷＹＦＤＶ（配列番号１３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＤＴＹＬＥ（配列番号１４０）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４１）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｍ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４３）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＲＳ（配列番号１４４）；およびＣＤＲ３－ＩＡＶＴＹＦＦＤＦ（配列番号１４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＦＡ（配列番号１４６）；ＣＤＲ２－ＮＡＲＴＬＡＥ（配列番号１４７）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＳＰＦＴ（配列番号１４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｎ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４９）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号１５０）；およびＣＤＲ３－ＭＳＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号１５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＬＦＴＳＶＡ（配列番号１５２）；ＣＤＲ２－ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１５３）；およびＣＤＲ３－ＱＱＨＹＳＳＰＦＴ（配列番号１５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｏ）配列：ＣＤＲ１－ＩＹＡＭＮ（配列番号１５５）；ＣＤＲ２－ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＲＦＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１５６）；およびＣＤＲ３－ＰＬＲＳＹＦＳＭＤＹ（配列番号１５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳ（配列番号１５８）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号１５９）；およびＣＤＲ３－ＧＱＴＹＳＹＰＷＴ（配列番号１６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含んでなる抗原結合ドメイン。

【請求項14】

請求項１３に記載の抗原結合ドメインを含んでなる抗体。

【請求項15】

サンプルのＣＤ８４発現レベルを決定するため、場合により、対象由来のサンプルのＣＤ８４発現レベルを分析するための、請求項１３に記載の抗原結合ドメイン、または請求項１４に記載の抗体の使用。

【請求項16】

抗ＣＤ８４ ＣＡＲまたは抗体による治療に適した対象を特定するための方法であって、対象から単離されたサンプルのＣＤ８４発現レベルを決定することを含み、ＣＤ８４発現レベルが請求項１３に記載の抗原結合ドメイン、または請求項１４に記載の抗体を用いて決定される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、抗ＣＤ８４抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびに療法、特に、癌療法におけるそれらの使用に関する。本発明はまた、サンプルのＣＤ８４レベルを決定するため、および抗ＣＤ８４抗体またはＣＡＲによる治療に適した対象を特定するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ヒトＣＤ８４タンパク質は、１９９３年に初めて同定された「分化抗原群」である。ＣＤ８４の塩基配列決定により、それはＳｌａｍ（シグナル伝達リンパ球活性化分子(Signaling Lymphocyte Activation Molecule)ファミリーのメンバーと同定された。

【0003】

ＣＤ８４受容体の細胞外部分は、非カノニカルなＩｇＶ遠位ドメインとＩｇＣ２ｇ近位ドメインを含み、これはＳＬＡＭファミリーの全メンバーに共通し、ＣＤ２にも似た構造である。ＣＤ８４はホモフィリック結合分子として機能し、受容体：リガンド相互作用にはＩｇＶドメインが関与し、細胞質ドメインとは独立しており、ホモフィリック界面にはＣＤ８４とＳＬＡＭファミリーの他の分子との結合を妨げる特異的な違いがある。

【0004】

ヒトＣＤ８４は、様々な種類の免疫細胞で発現される。発現レベルは細胞の種類およびその分化または活性化の状態によって異なる。ＣＤ８４は造血分化のごく初期に骨髄前駆細胞に見られ、ほとんどのＴ細胞およびＢ細胞に発現するが、メモリーＴ細胞およびＢリンパ球、濾胞性ヘルパーＴ細胞、および胚中心Ｂ細胞ではより発現が高い。単球および単球由来樹状細胞（ＤＣ）などの骨髄性抗原提示細胞もＣＤ８４陽性である。顆粒球もかなりのレベルのＣＤ８４を発現し、好塩基球および肥満細胞での発現が最も高い。全ての造血細胞の中で、血小板が最も高いレベルのＣＤ８４を発現し、当初は血小板－血小板相互作用の安定化に関与する凝集誘導シグナル伝達受容体として提唱された。しかしながら、ＣＤ８４欠損マウスを用いた研究では、ＣＤ８４は止血および血栓機能において重要な役割を果たしていないことが示されている。ＣＤ８４の発現はナチュラルキラー細胞（ＮＫ）では低く、赤血球では見られない。

【0005】

ＣＤ８４シグナルは、細胞の種類およびその活性化または分化の段階に応じて、白血球の機能を活性化したり抑制したりすることができる。ＣＤ８４を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞のサイトカイン分泌、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性、単球の活性化、自己貪食、同族Ｔ：Ｂの相互作用、および胚中心レベルでのＢ細胞寛容を包含する多様な免疫学的プロセスを調節する。

【0006】

ＣＤ８４の変異は自己免疫障害と関連している。例えば、ＣＤ８４の特定の対立遺伝子変異は、全身性紅斑性狼瘡および関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患と関連している。このような自己免疫疾患の典型的な治療は多くの場合、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）を含み、これらの薬物は治癒的ではないが、症状および／または病勢進行を停止したり遅延させたりする。

【0007】

ＣＤ８４は特定の癌、特に慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの血液悪性腫瘍で発現している。

【発明の概要】

【0008】

血液悪性腫瘍は多くの場合、化学療法または放射線療法で治療されるが、有害な副作用が知られている。従って、血液悪性腫瘍に対する治療法の改善が依然として強く求められている。

【0009】

発明の概要
本発明者らは、ＣＤ８４がバーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）および組織球性リンパ腫を包含する悪性血液疾患に由来する一定範囲の癌細胞株で過剰発現されることを決定付けた。

【0010】

本発明者らは、ＣＤ８４と結合する一定範囲の抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を研究および開発した。

【0011】

特に、本発明者らは、ＣＡＲの細胞発現の特性評価を行い、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖、サイトカイン産生、および一定範囲の標的癌細胞株に対する細胞傷害性の測定を通じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を機能的に特徴付けた。さらに、本発明者らは、本発明のキメラ抗原受容体が、ＣＤ８４を発現する癌細胞において細胞傷害性を誘導できることを実証した。

【0012】

よって、本発明は、
ａ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号１）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＶＳＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＲ（配列番号２）；およびＣＤＲ３－ＧＴＧＲＦＡＹ（配列番号３）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＬＧ（配列番号７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号８）；およびＣＤＲ３－ＹＥＧＧＹＹＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号１０）；ＣＤＲ２－ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号１１）；およびＣＤＲ３－ＱＱＳＫＡＶＰＲＴ（配列番号１２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１３）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１４）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号１５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＮＩＥＳＫＤ（配列番号１６）；ＣＤＲ２－ＤＤＡ（配列番号１７）；およびＣＤＲ３－ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（配列番号１８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｄ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＰ（配列番号１９）；ＣＤＲ２－ＩＳＹＨＧＲＮＫ（配列番号２０）；およびＣＤＲ３－ＡＲＤＲＤＡＴＰＧＧＴＧＶＧＮＨＧＭＡＶ（配列番号２１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＬＨＳＳＧＹＮＹ（配列番号２２）；ＣＤＲ２－ＭＧＳ（配列番号２３）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＬＱＴＰＰＴ（配列番号２４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｅ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＤＮＡ（配列番号２５）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＴＧＲＴＴ（配列番号２６）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号２７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＶＹＳＤＧＤＴＹ（配列番号２８）；ＣＤＲ２－ＫＶＳ（配列番号２９）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＴＨＷＰＰＮＴ（配列番号３０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｆ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号３１）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号３２）；およびＣＤＲ３－ＭＲＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＬＡ（配列番号３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＴＰＦＴ（配列番号３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｇ）配列：ＣＤＲ１－ＳＹＷＩＮ（配列番号３７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＬＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３８）；およびＣＤＲ３－ＳＧＧＹＬＧＹ（配列番号３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４０）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号４１）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｈ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＧ（配列番号４３）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号４４）；およびＣＤＲ３－ＳＴＴＹＹＳＳＹＷＣＦＤＶ（配列番号４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＡＮＹＬＡ（配列番号４６）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号４７）；およびＣＤＲ３－ＱＮＤＨＳＹＰＦＴ（配列番号４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｉ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＭＳ（配列番号４９）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号５０）；およびＣＤＲ３－ＰＧＰＴＶＶＡＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号５２）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＳＲＦＳ（配列番号５３）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｊ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＩＮ（配列番号５５）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号５６）；およびＣＤＲ３－ＤＴＴＩＡＹ（配列番号５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＴＴＳＲＹＳＹＭＨ（配列番号５８）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５９）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｋ）配列：ＣＤＲ１－ＧＹＮＭＮ（配列番号１３１）；ＣＤＲ２－ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３２）；およびＣＤＲ３－ＧＬＬＳＧＳＦＰＹ（配列番号１３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＧＳＰＬＴ（配列番号１３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｌ）配列：ＣＤＲ１－ＲＳＷＭＳ（配列番号１３７）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号１３８）；およびＣＤＲ３－ＦＹＤＧＹＳＩＹＷＹＦＤＶ（配列番号１３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＤＴＹＬＥ（配列番号１４０）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４１）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｍ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４３）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＲＳ（配列番号１４４）；およびＣＤＲ３－ＩＡＶＴＹＦＦＤＦ（配列番号１４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＦＡ（配列番号１４６）；ＣＤＲ２－ＮＡＲＴＬＡＥ（配列番号１４７）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＳＰＦＴ（配列番号１４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｎ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４９）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号１５０）；およびＣＤＲ３－ＭＳＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号１５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＬＦＴＳＶＡ（配列番号１５２）；ＣＤＲ２－ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１５３）；およびＣＤＲ３－ＱＱＨＹＳＳＰＦＴ（配列番号１５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｏ）配列：ＣＤＲ１－ＩＹＡＭＮ（配列番号１５５）；ＣＤＲ２－ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＲＦＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１５６）；およびＣＤＲ３－ＰＬＲＳＹＦＳＭＤＹ（配列番号１５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳ（配列番号１５８）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号１５９）；およびＣＤＲ３－ＧＱＴＹＳＹＰＷＴ（配列番号１６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含んでなる抗原結合ドメインを提供する。

【0013】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、
ａ）配列番号６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６２または１０８の配列を有するＶＬドメイン；
ｂ）配列番号６３の配列を有するＶＨドメイン；およびン配列番号６４または１０９の配列を有するＶＬドメイ；
ｃ）配列番号６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６の配列を有するＶＬドメイン；
ｄ）配列番号６８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６９の配列を有するＶＬドメイン；
ｅ）配列番号７１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７２の配列を有するＶＬドメイン；
ｆ）配列番号７４の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７５の配列を有するＶＬドメイン；
ｇ）配列番号７６の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７７の配列を有するＶＬドメイン；
ｈ）配列番号７８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７９の配列を有するＶＬドメイン；
ｉ）配列番号８０の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８１の配列を有するＶＬドメイン；
ｊ）配列番号８２の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８３の配列を有するＶＬドメイン；
ｋ）配列番号１６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６２の配列を有するＶＬドメイン；
ｌ）配列番号１６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６４の配列を有するＶＬドメイン；
ｍ）配列番号１６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６６の配列を有するＶＬドメイン；
ｎ）配列番号１６７の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６８の配列を有するＶＬドメイン；もしくは
ｏ）配列番号１６９の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１７０の配列を有するＶＬドメイン；
またはそれとそれぞれ少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体
を含んでなる。

【0014】

適切には、抗原結合ドメインは、ＣＤ８４結合ドメインである。

【0015】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。

【0016】

別の態様において、本発明は、本発明の抗原結合ドメインを含んでなる抗体を提供する。

【0017】

別の態様において、本発明は、本発明の抗原結合ドメインを含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0018】

適切には、本発明の抗原結合ドメイン、抗体またはＣＡＲは、ＣＤ８４に結合する。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖ ＣＡＲである。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含んでなる。

【0021】

抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、スペーサーにより連結されてよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＣＤ８ａヒンジまたはＣＤ２８ヒンジを含む。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ａヒンジを含む。

【0022】

ＣＡＲは、１つ以上、例えば、２つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含む。

【0023】

ＣＡＲは、１つ以上、例えば、２つまたは３つの共刺激ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＩＣＯＳ共刺激ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激ドメインを含む。

【0024】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＯＸ４０共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＩＣＯＳ共刺激ドメインを含む。

【0025】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含む。

【0026】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、本発明の抗原結合ドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含む。

【0027】

別の態様において、本発明は、本発明の抗原結合ドメイン、抗体またはＣＡＲをコードする１以上のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0028】

別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0029】

いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、好ましくは、レンチウイルスベクターである。

【0030】

別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を提供する。

【0031】

別の態様において、本発明は、本発明の抗原結合ドメインまたはＣＡＲを含む細胞を提供する。

【0032】

細胞は、さらなる（第２の）ＣＡＲを含んでもよい。

【0033】

別の態様において、本発明は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、第１のＣＡＲが本発明のＣＡＲである細胞を提供する。

【0034】

別の態様において、本発明は、第１の細胞および第２の細胞を含み、第１の細胞が第１のＣＡＲを含み、第２の細胞が第２のＣＡＲを含み、第１のＣＡＲが本発明のＣＡＲである組成物を提供する。

【0035】

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲは異なる。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲは異なる抗原に結合する。

【0036】

別の態様において、本発明は、タンデムＣＡＲを含んでなり、タンデムＣＡＲが第１の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含み、第１の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が本発明の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である細胞を提供する。

【0037】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と第２の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は異なる。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と第２の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は異なる抗原に結合する。

【0038】

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ＣＤ２０ ＣＡＲまたは抗ＣＤ２２ ＣＡＲ（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のため）；抗ＣＤ３３ ＣＡＲまたは抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ（例えば、ＡＭＬの治療のため）；または抗ＣＤ７ ＣＡＲ（例えば、Ｔ－ＡＬＬの治療のため）である。

【0039】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、抗ＣＤ２０抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）または抗ＣＤ２２抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のため）；抗ＣＤ３３抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）または抗ＣＤ１２３抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）（例えば、ＡＭＬの治療のため）；または抗ＣＤ７抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）（例えば、Ｔ－ＡＬＬの治療のため）である。

【0040】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、好ましくは、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、自己または同種Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、自己または同種ＮＫ細胞である。

【0041】

ＮＫ細胞は、例えば、いずれの好適な組織サンプル、細胞株または幹細胞供給源に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞（好ましくは、同種ＮＫ細胞）は、臍帯血（ＣＢ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄（ＢＭ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、細胞株（例えば、ＮＫ９２またはＹＴ）、または末梢血（ＰＢ）（例えば、自己または同種）に由来する。好ましくは、ＮＫ細胞は、ＣＢに由来する。

【0042】

別の態様において、本発明は、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含む医薬組成物を提供する。

【0043】

別の態様において、本発明は、療法において使用するための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0044】

いくつかの実施形態では、療法は、癌の治療である。

【0045】

別の態様において、本発明は、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む疾患を治療するための方法を提供する。

【0046】

いくつかの実施形態では、疾患は、癌である。

【0047】

別の態様において、本発明は、薬剤の製造のための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0048】

いくつかの実施形態では、薬剤は、疾患、好ましくは、癌を治療するためのものである。

【0049】

好ましい実施形態では、癌は、血液悪性腫瘍である。

【0050】

好ましい実施形態では、癌細胞は、ＣＤ８４を発現し、例えば、血液悪性腫瘍は、ＣＤ８４を発現する血液悪性腫瘍であり得る。

【0051】

いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄増殖性症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、樹状細胞新生物および組織球性肉腫からなる群から選択される。

【0052】

いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞 リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および組織球性肉腫からなる群から選択される。

【0053】

好ましい実施形態では、癌は、ＣＬＬ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬおよびＡＭＬからなる群から選択される。

【0054】

別の態様において、本発明は、ＡＭＬの治療において使用するための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0055】

別の態様において、本発明は、Ｔ－ＡＬＬの治療において使用するための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0056】

別の態様において、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の治療において使用するための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0057】

別の態様において、本発明は、バーキットリンパ腫の治療において使用するための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0058】

別の態様において、本発明は、サンプルのＣＤ８４発現レベルを決定するため、場合により、対象由来のサンプルのＣＤ８４発現レベルを分析するための本発明の抗原結合ドメインまたは抗体の使用を提供する。

【0059】

別の態様において、本発明は、抗ＣＤ８４ ＣＡＲまたは抗体による治療に適した対象を特定するための方法であって、対象から単離されたサンプルのＣＤ８４発現レベルを決定することを含み、ＣＤ８４発現レベルが本発明の抗原結合ドメインまたは抗体を用いて決定される方法を提供する。

【0060】

いくつかの実施形態では、サンプルは、血液サンプルである。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】図１． 全ての腫瘍サンプルおよび対となる正常組織のＣＤ８４（別名ＬＹ９Ｂ、ＳＬＡＭＦ５、ｈＣＤ８４、ｍＣＤ８４）遺伝子発現プロファイルを表す棒グラフ。棒の高さは、特定の腫瘍種または正常組織の発現中央値を表す。http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CD84から。

【図2】図２．異なる腫瘍種から得られた細胞株において、ＲＮＡシークエンシングケンス（上）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（下）で測定されたＣＤ８４ ｍＲＮＡ発現の箱ひげ（１０～９０パーセンタイル）表示。https://portals.broadinstitute.org/ccleから。図は、最も高いＣＤ８４発現を示す２０の腫瘍種のみを示す。

【図3】図３．異なる細胞株のＣＤ８４発現。薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのヒストグラムは、特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。

【図4】図４．フローサイトメトリーにより評価された、慢性リンパ球性白血病と診断された患者に由来する９サンプルにおけるＣＤ８４発現。薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのヒストグラムは、特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。

【図5】図５．急性骨髄性白血病と診断された患者由来の１０サンプルのＣＤ８４発現をフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ８４発現が中等度の患者Ｐ０４に関して代表的な一例とＣＤ８４の発現が高い患者Ｐ１０に関する一例を示す。薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのヒストグラムは、特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。

【図6】図６．ＣＤ８４ ＣＡＲ配列が挿入されていることを示すｐＣＣＬ－ＥＦ１α＿ＣＡＲ８４プラスミドベクターのマップ（上）。抗ＣＤ８４第二世代ＣＡＲ構築物のスキーム（下）。

【図7】図７．エフェクター：標的比２：１でＲａｍｏｓ細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞による、２４時間のインキュベーション後のＩＦＮ－γ分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性をクラスカル・ウォリス（ＵＴに対する多重比較）で決定した。４回の試験の平均±ＳＥＭを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図8】図８．エフェクター：標的比２：１でＲａｍｏｓ細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞による、２４時間のインキュベーション後のＩＬ－２分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性をクラスカル・ウォリス（ＵＴに対する多重比較）で決定した。４回の試験の平均±ＳＥＭを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図9】図９．エフェクター：標的比２：１でＲａｍｏｓ細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞による、２４時間のインキュベーション後のグランザイムＢ分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性をクラスカル・ウォリス（ＵＴに対する多重比較）で決定した。４回の試験の平均±ＳＥＭを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図10】図１０．エフェクター：標的比２：１でＲａｍｏｓ細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞による、２４時間のインキュベーション後のＴＮＦ－γ分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性をクラスカル・ウォリス（ＵＴに対する多重比較）で決定した。４回の試験の平均±ＳＥＭを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図11】図１１．エフェクター：標的比２：１で、インキュベーション期間２４時間の後の、Ｒａｍｏｓ－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。８回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊ｐ＜０．００１、^＊ｐ＜０．０１。

【図12】図１２．エフェクター：標的比２：１で、インキュベーション期間２４時間の後の、Ｋ５６２－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。８回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊ｐ＜０．００１、^＊ｐ＜０．０１。

【図13】図１３．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、Ｒａｍｏｓ－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊ｐ＜０．０５。

【図14】図１４．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、Ｋ５６２－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．：有意差なし。

【図15】図１５．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＭＯＬＭ－１３－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ、ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図16】図１６．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＮＡＬＭ６－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図17】図１７．エフェクター：標的比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＭＯＬＴ４－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。４回の独立した実験の平均± ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意差なし。

【図18】図１８．フローサイトメトリーにより評価した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ８４発現。薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのヒストグラムは、特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。ＰＢＭＣは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、およびＣＤ１４に対する特異的抗体で染色された。

【図19】図１９．インキュベーション期間１６時間の後の、ＣＦＳＥ^＋で標識されたＰＢＭＣおよびＲａｍｏｓ－ＧＦＰ^＋細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。３名の異なるドナーからの３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を対応のあるｔ検定（ＵＴと比較）で決定した：^＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。

【図20】図２０．ＣＤ８４抗原のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル画像。クーマシーブルー染色を施した還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ。

【図21】図２１．Ｔ－ＡＬＬと診断された２名の患者（Ｐ０１およびＰ０２）からの末梢血に由来する白血病細胞に対するフローサイトメトリーにより評価したＣＤ８４発現。ヒストグラムは、ＣＤ３４にゲートを設定した芽細胞上のＣＤ８４発現を表し、薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し，濃いグレーのものは、特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。

【図22】図２２．形質導入６～７日後のＣＡＲ Ｔ細胞の拡大増殖を、培養０日目のＴ細胞数に対する増加倍率として示す。図は、それぞれ異なる健常ドナー由来の細胞尾用いた５～１２回の独立した拡大増殖を表す。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。

【図23】図２３．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、Ｒａｍｏｓ－ＧＦＰｆｆＬｕｃ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図24】図２４．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＭＯＬＭ－１３ ＧＦＰｆｆＬｕｃ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。少なくとも５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図25】図２５．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、Ｕ９３７ ＧＦＰｆｆＬｕｃ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図26】図２６．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＭＯＬＴ－４ ＧＦＰｆｆＬｕｃ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。少なくとも５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図27】図２７．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＣＦＳＥで染色した初代ＡＭＬ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図28】図２８．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間および４８時間の後の、ＣＦＳＥで染色した初代Ｔ－ＡＬＬ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図29】図２９．エフェクター：標的比２：１で、２４時間のインキュベーション後の、示されるようにＲａｍｏｓ、ＭＯＬＭ－１３またはＭＯＬＴ－４細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計分析は、球面性を仮定する二元配置ＡＮＯＶＡ混合効果分析および多重比較（ＵＴに対する）のためのダネット事後検定で決定した。少なくとも３回の実験の平均±ＳＤを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図30】図３０．エフェクター：標的比２：１で、２４時間のインキュベーション後の、示されるようにＲａｍｏｓ、ＭＯＬＭ－１３またはＭＯＬＴ－４細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計分析は、球面性を仮定する二元配置ＡＮＯＶＡ混合効果分析および多重比較（ＵＴに対する）のためのダネット事後検定で決定した。少なくとも３回の実験の平均±ＳＤを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図31】図３１．エフェクター：標的比２：１で、２４時間のインキュベーション後の、示されるようにＲａｍｏｓ、ＭＯＬＭ－１３またはＭＯＬＴ－４細胞と共培養したＣＤ８４標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴＮＦ－γ分泌。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。。統計分析は、球面性を仮定する二元配置ＡＮＯＶＡ混合効果分析および多重比較（ＵＴに対する）のためのダネット事後検定で決定した。少なくとも３回の実験の平均±ＳＤを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図32】図３２．４日の時点で、ＣＦＳＥアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されたＣＡＲＴ細胞の増殖（フローサイトメトリー画像）。０日目と、培地のみ（対照）、ＩＬ－２で刺激した場合またはＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬ細胞の存在下で４日後の増殖。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。

【図33】図３３．同種幹細胞移植のために健常ドナーのアフェレーシス産物から単離されたＣＤ３４^＋ＨＰＳＣに対するフローサイトメトリーにより評価したＣＤ８４、ＣＤ３３およびＣＤ１２３発現。薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのものは、特異的抗体による染色を表す。

【図34】図３４．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１および２：１で、インキュベーション期間２４時間の後の、５つの異なる臍帯血ユニットから単離されたＣＤ３４^＋ＨＰＳＣに対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図35】図３５．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間の後の、同種幹細胞移植のために健常ドナーのアフェレーシス産物から単離されたＣＤ３４^＋ＨＰＳＣに対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的細胞単独）に対する標的生存細胞のパーセンテージを示す。３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図36】図３６．エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比４：１、２：１、１：１および０．５：１で、インキュベーション期間２４時間の後の、同じドナーから単離されたＣＤ３^＋Ｔ細胞に対する種々のＣＤ８４標的化ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。非処理細胞（標的Ｔ細胞単独）に対する標的生存Ｔ細胞のパーセンテージを示す。５回の独立した実験の平均±ＳＥＭ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。統計的有意性を二元配置ＡＮＯＶＡ（ＵＴに対する多重比較）で決定した：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図37】図３７．種々のＣＡＲＴ８４と共培養する前の標的Ｔ細胞および共培養した後の生存標的Ｔ細胞に関する種々のＴ細胞サブセットのフローサイトメトリーによる分析。以下のＴ細胞サブセットを検討した：ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ（白）、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー（濃いグレー）、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ－エフェクターメモリー（黒）、およびＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ－エフェクターＴ細胞（薄いグレー）。

【図38】図３８．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＯＬＭ－１３細胞に対するＣＡＲＴ８４細胞の有効性。ＯＬＭ－１３の病勢進行を毎週、生物発光によりモニタリングした。生物発光定量（Ａ）および動物生存率（Ｂ）。生物発光定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる二元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。生存率の統計的有意性は、３比較に関してｐ値を補正したログランク検定で決定した。

【図39】図３９．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＯＬＭ－１３細胞に対するＣＡＲＴ８４細胞の有効性。ＭＯＬＭ－１３の病勢進行を毎週、生物発光によりモニタリングした。生物発光定量（Ａ）および動物生存率（Ｂ）。実験の終了時にマウスの骨髄（上）および脾臓（下）でフローサイトメトリーにより評価されたＭＯＬＭ－１３ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞（Ｃ）、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｄ）およびＣＡＲＴ細胞（Ｅ）の総数。生物発光定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる二元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。生存率の統計的有意性は、３比較に関してｐ値を補正したログランク検定で決定した。ＭＯＬＭ－１３およびＣＤ３^＋Ｔ細胞定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行い、ＣＡＲＴ細胞定量の分析は、テューキーの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。

【図40】図４０．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＯＬＭ－１３細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴ細胞の有効性。ＭＯＬＭ－１３の病勢進行を、毎週、生物発光により追跡した。生物発光定量（Ａ）および動物生存率（Ｂ）。実験の終了時にマウスの骨髄（上）および脾臓（下）でフローサイトメトリーにより評価されたＭＯＬＭ－１３ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞（Ｃ）、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｄ）およびＣＡＲＴ細胞（Ｅ）の総数。生物発光定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる二元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。生存率の統計的有意性は、３比較に関してｐ値を補正したログランク検定で決定した。ＭＯＬＭ－１３およびＣＤ３^＋細胞定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行い、ＣＡＲＴ細胞定量の分析は、テューキーの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。

【図41】図４１．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＯＬＴ－４細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴ細胞の有効性。ＭＯＬＴ－４の病勢進行を、毎週、生物発光によりモニタリングした。生物発光定量（Ａ）および動物生存率（Ｂ）。生物発光定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる二元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。生存率の統計的有意性は、３比較に関してｐ値を補正したログランク検定で決定した。

【図42】図４２．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＯＬＴ－４細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴ細胞の有効性。ＭＯＬＴ－４の病勢進行を、毎週、生物発光によりモニタリングした。生物発光定量（Ａ）および動物生存率（Ｂ）。実験の終了時にマウスの骨髄（上）および脾臓（下）でフローサイトメトリーにより検出されたＭＯＬＴ－４ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞（Ｃ）、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｄ）およびＣＡＲＴ細胞（Ｅ）の総数。生物発光定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる二元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。生存率の統計的有意性は、３比較に関してｐ値を補正したログランク検定で決定した。ＭＯＬＴ－４およびＣＤ３^＋細胞定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行い、ＣＡＲＴ細胞定量の分析は、テューキーの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。

【図43】図４３．フローサイトメトリーにより評価したヒト初代細胞上のＣＤ８４発現。薄いグレーのヒストグラムは、アイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのヒストグラムは、特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。

【図44】図４４．ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置を用い、細胞培養にＣＡＲＴ／ＵＴを添加（矢印）した後７２時間に測定された、ヒト初代細胞に対するＣＡＲＴ８４細胞１５２．３、１５３．５およびＵＴの細胞傷害性アッセイ。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。

【図45】図４５．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲａｍｏｓ細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴ細胞の有効性。（Ａ）Ｒａｍｏｓの病勢進行を、毎週、生物発光によりモニタリングした。生物発光定量の統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる二元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。（Ｂ）終了時にマウスの骨髄のフローサイトメトリーにより評価されたＲａｍｏｓ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞の総数。統計分析は、ＵＴ処置マウスと比較したダネットの多重比較を用いる一元配置ＡＮＯＶＡモデルで行った。ＵＴ：非形質導入Ｔ細胞。^＊ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0062】

発明の詳細な説明
「を含む(comprising)」、「を含む(comprises)」および「から構成される(comprised of)」という用語は、本明細書で使用される場合、「包含する(including)」もしくは「包含する(includes)」または「含有する(containing)」もしくは「含有する(contains)」と同義であり、包含またはオープンエンドを示し、列挙されていない付加的メンバー、要素または工程を除外しない。「を含む(comprising)」、「を含む(comprises)」および「から構成される(comprised of)」という用語にはまた、「からなる(consisting of)」という用語も含まれる。

【0063】

ＣＤ８４
ＣＤ８４（ＬＹ９ＢおよびＳＬＡＭＦ５としても知られる）は、シグナル伝達リンパ球活性化分子(signalling lymphocyte activation molecule)（ＳＬＡＭ）ファミリーのメンバーである膜糖タンパク質であり、それ自体は、Ｉｇスーパーファミリーのより大きなＣＤ２細胞表面受容体サブグループのサブセットである。

【0064】

ＣＤ８４受容体の細胞外部分は、非カノニカルなＩｇＶ遠位ドメインとＩｇＣ２ｇ近位ドメインを含み、これはＳＬＡＭファミリーの全メンバーに共通する構造である。ＣＤ８４はホモフィリック結合分子として機能し、多くの免疫細胞種で発現される。受容体：リガンド相互作用にはＩｇＶドメインが関与し、細胞質ドメインとは独立している。ホモフィリック界面にはＣＤ８４とＳＬＡＭファミリーの他の分子との結合を妨げる特異的な違いがある。

【0065】

本発明者らは、ＣＤ８４が、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）および組織球性リンパ腫を包含する悪性血液疾患に由来する様々な細胞株で過剰発現されていることを決定付けた。

【0066】

研究によれば、ＣＤ８４は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）で過剰発現されることが示唆されている。

【0067】

ＣＤ８４のアミノ酸配列例は以下の通りである。

【0068】

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識してそれと結合する能力を有するタンパク質またはペプチドであり得る。抗原結合ドメインとしては、目的の抗原に対する天然、合成、半合成のまたは組換え産生された結合相手が含まれる。

【0069】

例示的抗原結合ドメインとしては、抗体もしくは抗体フラグメントもしくは誘導体、受容体（例えば、ＴＣＲ）の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはその受容体結合ドメインが含まれる。

【0070】

好ましい実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体であるか、または抗体に由来する。抗体由来ドメインは、抗体のフラグメント、または抗体の１以上のフラグメントの遺伝子操作された産物であり得、そのフラグメントは、抗原との結合に関与する。例としては、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆａｂ、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）およびラクダ科動物抗体（ＶＨＨ）が挙げられる。

【0071】

抗原結合ドメインは、非ヒト（例えば、マウス）、キメラ、ヒト化または完全ヒト型であり得る。

【0072】

好ましい実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖであり得る。

【0073】

抗体またはその抗原結合フラグメントに関して「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域中の変動の大きいループを指す。ＣＤＲは、抗原のコンフォメーションと相互作用し、抗原との結合をほぼ決定することができる（ただし、いくつかのフレームワーク領域が結合に関与することが知られている）。重鎖可変領域と軽鎖可変領域はそれぞれ３つのＣＤＲを含んでいる。

【0074】

「重鎖可変領域」（ＶＨ）とは、抗体の重鎖の可変フラグメントを指し、フレームワーク領域として知られる隣接するストレッチ間に挿入された３つのＣＤＲを含み、フレームワーク領域は、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持する足場を形成している。

【0075】

「軽鎖可変領域」（ＶＬ）とは、抗体の軽鎖の可変フラグメントを指し、フレームワーク領域間に挿入された３つのＣＤＲを含んでいる。

【0076】

「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を保持する抗体の最小フラグメントを指す。Ｆｖは、１本の軽鎖の可変領域と１本の重鎖の可変領域が結合したものからなる。

【0077】

「一本鎖可変フラグメント」（ｓｃＦｖ）とは、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）が互いに直接またはペプチドリンカー配列を介して連結したものからなる操作抗体を指す。

【0078】

抗原結合ドメインは、抗原と特異的に結合することができ、例えば、その抗原には結合するが、他のペプチドには結合しないか、または他のペプチドにはより低い親和性でしか結合しない。

【0079】

２つの分子（例えば、抗原結合ドメインと抗原）の間の結合親和性は、例えば、解離定数（Ｋ_Ｄ）の決定により定量することができる。Ｋ_Ｄは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの技術を用いて、抗原結合ドメインと抗原の間の複合体形成および解離の速度を測定することで決定することができる。複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ｋ_ａ（またはｋ_ｏｎ）および解離速度定数ｋ_ｄ（またはｋ_ｏｆｆ）として表される。式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａから、Ｋ_Ｄは、ｋ_ａおよびｋ_ｄと関係がある。

【0080】

適切には、抗原結合ドメインは、ＣＤ８４結合ドメインである。

【0081】

【0082】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号１）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＶＳＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＲ（配列番号２）；およびＣＤＲ３－ＧＴＧＲＦＡＹ（配列番号３）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＬＧ（配列番号７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号８）；およびＣＤＲ３－ＹＥＧＧＹＹＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号１０）；ＣＤＲ２－ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号１１）；およびＣＤＲ３－ＱＱＳＫＡＶＰＲＴ（配列番号１２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１３）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１４）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号１５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＮＩＥＳＫＤ（配列番号１６）；ＣＤＲ２－ＤＤＡ（配列番号１７）；およびＣＤＲ３－ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（配列番号１８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＰ（配列番号１９）；ＣＤＲ２－ＩＳＹＨＧＲＮＫ（配列番号２０）；およびＣＤＲ３－ＡＲＤＲＤＡＴＰＧＧＴＧＶＧＮＨＧＭＡＶ（配列番号２１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＬＨＳＳＧＹＮＹ（配列番号２２）；ＣＤＲ２－ＭＧＳ（配列番号２３）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＬＱＴＰＰＴ（配列番号２４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＤＮＡ（配列番号２５）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＴＧＲＴＴ（配列番号２６）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号２７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＶＹＳＤＧＤＴＹ（配列番号２８）；ＣＤＲ２－ＫＶＳ（配列番号２９）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＴＨＷＰＰＮＴ（配列番号３０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号３１）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号３２）；およびＣＤＲ３－ＭＲＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＬＡ（配列番号３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＴＰＦＴ（配列番号３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＳＹＷＩＮ（配列番号３７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＬＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３８）；およびＣＤＲ３－ＳＧＧＹＬＧＹ（配列番号３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４０）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号４１）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＧ（配列番号４３）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号４４）；およびＣＤＲ３－ＳＴＴＹＹＳＳＹＷＣＦＤＶ（配列番号４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＡＮＹＬＡ（配列番号４６）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号４７）；およびＣＤＲ３－ＱＮＤＨＳＹＰＦＴ（配列番号４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＭＳ（配列番号４９）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号５０）；およびＣＤＲ３－ＰＧＰＴＶＶＡＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号５２）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＳＲＦＳ（配列番号５３）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＩＮ（配列番号５５）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号５６）；およびＣＤＲ３－ＤＴＴＩＡＹ（配列番号５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＴＴＳＲＹＳＹＭＨ（配列番号５８）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５９）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＧＹＮＭＮ（配列番号１３１）；ＣＤＲ２－ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３２）；およびＣＤＲ３－ＧＬＬＳＧＳＦＰＹ（配列番号１３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＧＳＰＬＴ（配列番号１３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＲＳＷＭＳ（配列番号１３７）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号１３８）；およびＣＤＲ３－ＦＹＤＧＹＳＩＹＷＹＦＤＶ（配列番号１３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＤＴＹＬＥ（配列番号１４０）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４１）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４３）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＲＳ（配列番号１４４）；およびＣＤＲ３－ＩＡＶＴＹＦＦＤＦ（配列番号１４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＦＡ（配列番号１４６）；ＣＤＲ２－ＮＡＲＴＬＡＥ（配列番号１４７）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＳＰＦＴ（配列番号１４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４９）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号１５０）；およびＣＤＲ３－ＭＳＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号１５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＬＦＴＳＶＡ（配列番号１５２）；ＣＤＲ２－ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１５３）；およびＣＤＲ３－ＱＱＨＹＳＳＰＦＴ（配列番号１５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列：ＣＤＲ１－ＩＹＡＭＮ（配列番号１５５）；ＣＤＲ２－ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＲＦＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１５６）；およびＣＤＲ３－ＰＬＲＳＹＦＳＭＤＹ（配列番号１５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳ（配列番号１５８）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号１５９）；およびＣＤＲ３－ＧＱＴＹＳＹＰＷＴ（配列番号１６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６２もしくは１０８の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６４もしくは１０９の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６９の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７２の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７４の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７５の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７６の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７７の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７９の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号８０の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８１の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号８２の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８３の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６２の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６４の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６６の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１６７の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６８の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１６９の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１７０の配列を有するＶＬドメイン、またはそれぞれそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。

【0112】

ＣＤ８４結合ドメインはｓｃＦｖであり得る。ｓｃＦｖは、例えば約１０～２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。ｓｃＦｖは、配向（Ｎ末端からＣ末端へ）ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨであり得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配向（Ｎ末端からＣ末端へ）ＶＨ－ＶＬである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配向（Ｎ末端からＣ末端へ）ＶＬ－ＶＨである。

【0113】

ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するためのリンカー配列の例としては、以下が挙げられる：

【0114】

抗原結合ドメインは、配列番号６１、６３、１１２～１２５もしくは１８１～１８４のいずれか１つの配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含み得る、またはからなり得る。

【0115】

適切には、変異体は、少なくともＣＤ８４、ならびに配列番号６１、６３、１１２～１２５または１８１～１８４として示される対応する抗原結合ドメインに結合し得る。例えば、変異体は、配列番号６１、６３、１１２～１２５または１８１～１８４として示される対応する抗原結合ドメインとＣＤ８４の間の結合親和性と少なくとも同等の親和性でＣＤ８４と特異的に結合し得る。

【0116】

【0117】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６１の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくはＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0118】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６３の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0119】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１２の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0120】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１３の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0121】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１４の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0122】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１５の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0123】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１６の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0124】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１７の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0125】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１８の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0126】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１９の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0127】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１２０の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0128】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１２１の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0129】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１２２の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0130】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１２３の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0131】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１２４の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0132】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１２５の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0133】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１８１の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0134】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１８２の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0135】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１８３の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0136】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１８４の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、ＣＤ８４との結合能を保持するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0137】

抗原結合ドメインは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれてよい。

【0138】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲまたはＣＡＲｓ）は、本明細書で使用される場合、細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞またはそれらの組合せなどのＴ細胞）に抗原特異性を付与することができる操作された受容体を指す。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体としても知られる。ＣＡＲはまた、ＮＫ細胞（例えば、臍帯血（ＣＢ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄（ＢＭ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、細胞株（例えば、ＮＫ９２もしくはＹＴ）、または末梢血（ＰＢ）由来）などの他の免疫細胞にも抗原特異性を付与することができる(Mehta et al. (2018) Front. Immunol. 9: 283; Liu et al. (2020) N. Engl. J. Med. 382: 545-553)。ＮＫ細胞で使用するＣＡＲは、他の膜貫通ドメイン（ＮＫＧ２ＤまたはＤＡＰ１２など）および他の共刺激ドメイン（ＮＫＧ２Ｄまたは２Ｂ４など）を有してもよく、ＣＡＲ－ＮＫ細胞にサイトカインのサポートを常に提供するために、それらにＣＡＲ構築物内にＩＬ－２またはＩＬ－１５の遺伝子を組み込んでもよい。

【0139】

ＣＡＲは、例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）を含んでもよい。

【0140】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８４結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。ＣＡＲは、１以上の共刺激ドメインを含み得る。

【0141】

ＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ８４結合ドメイン）は、本明細書に開示されるような抗原結合ドメインであり得る。

【0142】

別の態様において、本発明は、配列番号１７２～１８０のいずれか１つの配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0143】

適切には、変異体は、配列番号１７２～１８０として示される対応するＣＡＲと少なくとも同様に機能し得る。例えば、変異体は、配列番号１７２～１８０として示される対応するＣＡＲとＣＤ８４の間の結合親和性と少なくとも同等の結合親和性でＣＤ８４と特異的に結合し得る。

【0144】

別の態様において、本発明は、配列番号１７２の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0145】

別の態様において、本発明は、配列番号１７３の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0146】

別の態様において、本発明は、配列番号１７４の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0147】

別の態様において、本発明は、配列番号１７５の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0148】

別の態様において、本発明は、配列番号１７６の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0149】

別の態様において、本発明は、配列番号１７７の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0150】

別の態様において、本発明は、配列番号１７８の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0151】

別の態様において、本発明は、配列番号１７９の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0152】

別の態様において、本発明は、配列番号１８０の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0153】

膜貫通ドメイン
ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み得る。

【0154】

膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に由来する膜貫通配列を含み得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列も含み得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。

【0155】

ＣＡＲ構築物で使用される膜貫通（ＴＭ）領域の例としては、ａ）ＣＤ２８ ＴＭ領域(Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al., Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72)；ｂ）ＯＸ４０ ＴＭ領域(Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41)；ｃ）４－１ＢＢ ＴＭ領域(Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13 (18 Pt 1):5426-35)；ｄ）ＣＤ３－ζ ＴＭ領域(Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Di Stasi et al. Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402)；ｅ）ＣＤ８ａ ＴＭ領域(Maher et al., Nat Biotechnol, 2002, Jan;20(1):70-5; Imai C et al., Leukemia, 2004, Apr;18(4):676-84; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1) :5426-35; Milone et al., Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64)；ｆ）ＤＡＰ１２ ＴＭ領域(Mueller, N. et al. J. Immunother. 2015, June 01; 38, 197)）；ｇ）２Ｂ４ ＴＭ領域(Altvater, B. et al. Clin. Cancer Res, 2009, July 22; (15) 4857-4866)およびｈ）ＮＫＧ２Ｄ ＴＭ領域(Li, Y et al, Cell Stem Cell, 2018, Aug 2; (23):181-192)がある。

【0156】

さらなる膜貫通ドメインは、当業者に自明である。

【0157】

ＣＤ８ａ膜貫通ドメインのアミノ酸配列例は、

である。

【0158】

ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列例は、

である。

【0159】

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２７もしくは１２８の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0160】

シグナルペプチド
ＣＡＲは、ＣＡＲが細胞内で発現された際に、そのタンパク質が小胞体に、その後、細胞表面に向けられるようなシグナルペプチドを含み得る。

【0161】

シグナルペプチドは、トランスロケーション中またはトランスロケーション後にシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されて成熟タンパク質を生成し得る。

【0162】

いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８ａシグナルペプチドである。

【0163】

スペーサー
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサーを含み得る。

【0164】

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトもしくはマウスＣＤ８スタークを含み得る。

【0165】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ａスタークを含んでなる。

【0166】

細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内ドメインは、ＣＡＲにおけるシグナル伝達を提供することができる。

【0167】

細胞内シグナル伝達ドメインは、１以上の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)（ＩＴＡＭ）を含んでなってもよく、ＩＴＡＭは、免疫系の特定の細胞表面タンパク質の細胞質テールで２回繰り返される４つのアミノ酸の、保存された配列である。このモチーフは、ロイシンまたはイソロイシンから任意の２つの他のアミノ酸によって隔てられてチロシンを含む（ＹｘｘＬ／Ｉ）。これらのモチーフのチロシン残基は、受容体分子とそれらのリガンドとの相互作用後にリン酸化され、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質との結合部位を形成し得る。

【0168】

細胞内シグナル伝達ドメインは、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζエンドドメインを含み得る、またはからなり得る。ＣＤ３－ζエンドドメインは、抗原が結合した後、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達し得る。

【0169】

ＣＡＲは、１以上の共刺激ドメインを含み得る。例えば、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）は、ＣＤ３－ζとともに使用することができ、またはＣＤ２８、ＯＸ４０および／もしくはＩＣＯＳは、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３－ζとともに使用することができる。また、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても知られる）、ＤＡＰ１２および／またはＤＡＰ１０も、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３－ζとともに使用することができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含み、共刺激ドメインを欠く。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインと１以上の共刺激ドメインを含んでなる。

【0171】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメインおよびＯＸ４０共刺激ドメインからなる群から選択される１以上の共刺激ドメインを含んでなる。

【0172】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含んでなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含んでなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＯＸ４０共刺激ドメインを含んでなる。

【0173】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含んでなる。

【0174】

ＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列例は、

である。

【0175】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号１２９の配列、またはそれとなくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0176】

４－１ＢＢ共刺激ドメインのアミノ酸配列例は、

である。

【0177】

ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列例は、

である。

【0178】

いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、配列番号１３０もしくは１７１の配列、またはそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、またはそれからなる。

【0179】

ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。当業者ならば、遺伝コードの縮重の結果として多くの異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードし得ることを理解するであろう。さらに、当業者ならば、通常の技術を用いて、本発明のポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、本発明のポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行えることも理解されるであろう。

【0180】

ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能ないずれの方法によって修飾されてもよい。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドｉｎ ｖｉｖｏ活性を高めるため、または寿命を延ばすために行うことができる。

【0181】

ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換え的、合成的に、または当業者に利用可能ないずれの手段によって生産してもよい。それらはまた標準的な技術によってクローニングしてもよい。

【0182】

より長いポリヌクレオチドは一般に、組換え手段を用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて生産される。これは、クローニングが望まれる標的配列に隣接するプライマー対（例えば、約１５～３０ヌクレオチド）を作製すること、それらのプライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅が起こる条件下でＰＣＲを実行すること、増幅されたフラグメントを単離すること（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによる）および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。これらのプライマーは、増幅されたＤＮＡが適したベクターにクローニングできるように適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。

【0183】

ポリヌクレオチドは、本発明の抗原結合ドメイン、抗体またはＣＡＲをコードする１以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの構成要素が、両方が実質的に障害なくそれらの機能を遂行できる様式で相互に連結されていることを意味し得る。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、抗原結合ドメイン、抗体またはＣＡＲの発現を促進および／または増強し得る。

【0184】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。

【0185】

ベクター
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターである。

【0186】

好ましくは、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスゲノムである。

【0187】

別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるウイルスベクターを提供する。

【0188】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクター粒子の形態である。

【0189】

ベクターは、ある環境から別の環境へと実体の移動を可能にするか、または容易にするツールである。本発明によれば、一例として、組換え核酸技術で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）のような実体を標的細胞に移入することを可能にする。ベクターは、異種核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞内に維持し、核酸セグメントを含んでなるベクターの複製を促進し、および／または核酸セグメントによってコードされるタンパク質の発現を促進するという目的を果たすことができる。

【0190】

本発明で使用されるポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、トランスフェクション、形質導入および形質転換などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて細胞に導入することができる。

【0191】

トランスフェクションは、核酸を細胞に組み込む一般的プロセスを指し、非ウイルスベクターを用いて細胞にポリヌクレオチドを送達するプロセスを含む。形質導入は、ウイルスベクターを用いて細胞に核酸を組み込むプロセスを指し得る。

【0192】

レトロウイルスおよびレチウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、いずれの適切なレトロウイルスから誘導されてもよく、または誘導可能である。多数の異なるレトロウイルスが特定されている。例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、エイブルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、鳥類骨髄細胞腫症ウイルス－２９（ＭＣ２９）および鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストは、Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63に乱すことができる。

【0193】

レトロウイルスは、「単純型」と「複雑型」の２つのカテゴリーに大別される。レトロウイルスはさらに7つのグループに分けられる。このうち5つのグループは発癌性を持つレトロウイルスである。残りの2つのグループはレンチウイルスとスプーマウイルスである。

【0194】

レトロウイルスゲノムとレンチウイルスゲノムの基本構造には、５’ ＬＴＲおよび３’ ＬＴＲなどの多くの共通の特徴がある。これらの間またはこれらの中には、ゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にする組み込み部位、ならびにパッケージング構成要素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子（これらはウイルス粒子の組み立てに必要なポリペプチドである）が配置されている。レンチウイルスには、ＨＩＶのｒｅｖおよびＲＲＥ配列などの付加的な特徴があり、組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物を核から感染標的細胞の細胞質へ効率的に輸送することができる。

【0195】

プロウイルスでは、これらの遺伝子の両末端に長い末端反復配列(long terminal repeats)（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。これらのＬＴＲは、プロウイルスの組込みおよび転写を担う。ＬＴＲはまた、エンハンサー－プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。

【0196】

ＬＴＲ自体は同一の配列で、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５の３つの要素に分けられる。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端の繰り返し配列に由来する。Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。これらの３つの要素の大きさはレトロウイルスによってかなり異なる。

【0197】

欠陥レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないか、または機能しないかであり得る。

【0198】

典型的なレトロウイルスベクターでは、複製に必須の１以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部がウイルスから除去されてよい。これによりウイルスベクターは複製欠陥型となる。

【0199】

レンチウイルスベクターは、より大きなレトロウイルスベクター群の一部である。レンチウイルス詳細なリストは、Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63に見出すことができる。要するに、レンチウイルスは、霊長類群と非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、限定されるものではないが、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスの例としては、プロトタイプの「スローウイルス」であるビスナ／メディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、および最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。

【0200】

レンチウイルス科は、レンチウイルスが分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染能がある(Lewis, P et al. (1992) EMBO J. 11: 3053-8; Lewis, P.F. et al. (1994) J. Virol. 68: 510-6)という点でレトロウイルスとは異なる。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、非分裂細胞または分裂の遅い細胞、例えば、例えば、筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成している細胞に感染能がない。

【0201】

レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの構成要素部分を含んでなるベクターである。好ましくは、その構成要素部分は、ベクターが細胞に感染するか、遺伝子を発現するか、または複製される生物学的機序に関与する。

【0202】

レンチウイルスベクターは、「霊長類」ベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクターであってもよい（すなわち、霊長類、特にヒトに基本的に感染しないウイルスに由来する）。非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類には本来感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであり得る。

【0203】

レンチウイルス系ベクターの例として、ＨＩＶ－１系およびＨＩＶ－２系ベクターを以下に記載する。

【0204】

ＨＩＶ－１ベクターは、単純レトロウイルスにも見られるシス作用エレメントを含む。ｇａｇオープンリーディングフレームにわたる配列がＨＩＶ－１のパッケージングに重要であることが示されている。従って、ＨＩＶ－１ベクターは多くの場合、翻訳開始コドンが変異したｇａｇの関連部分を含む。さらに、ほとんどのＨＩＶ－１ベクターはＲＲＥを含むｅｎｖ遺伝子の一部も含む。ＲｅｖはＲＲＥに結合し、核から細胞質への全長または単一スプライシングｍＲＮＡの輸送を可能にする。Ｒｅｖおよび／またはＲＲＥが存在しないと、全長ＨＩＶ－１ ＲＮＡは核内に蓄積する。あるいは、メイソンファイザーサルウイルスなどのある種の単純レトロウイルスからの構成的輸送エレメントを用いて、ＲｅｖとＲＲＥの必要性を緩和することもできる。ＨＩＶ－１ ＬＴＲプロモーターからの効率的な転写には、ウイルスタンパク質Ｔａｔが必要である。

【0205】

ほとんどのＨＩＶ－２系ベクターは、ＨＩＶ－１ベクターに構造上よく似ている。ＨＩＶ－１系ベクターと同様に、ＨＩＶ－２ベクターも、全長または単一スプライシングウイルスＲＮＡの効率的な輸送にＲＲＥを必要とする。

【0206】

好ましくは、本発明で使用されるウイルスベクターは、最少量のウイルスゲノムを含む。

【0207】

「最少量のウイルスゲノム」とは、目的のヌクレオチド配列を標的宿主細胞に感染、導入、および送達するために必要な機能を提供するために、ウイルスベクターが非必須要素を除去し、必須要素を保持するように操作されていると理解されるべきである。この戦略についてのさらなる詳細は、ＷＯ１９９８／０１７８１５に見出すことができる。

【0208】

好ましくは、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを生産するために使用されるプラスミドベクターは、パッケージング構成要素の存在下で、ＲＮＡゲノムのウイルス粒子へのパッケージングを可能とするのに十分なレンチウイルス遺伝情報を有し、これらのウイルス粒子は、標的細胞に感染することはできるが、最終標的細胞内で独自に複製して感染力のあるウイルス粒子を生産することはできない。好ましくは、ベクターは、機能的なｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子および／またはｅｎｖ遺伝子および／または複製に必須な他の遺伝子を欠く。

【0209】

しかしながら、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを生産するために使用されるプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞内でゲノムの転写を命令するためにレンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列も含む。これらの調節配列は、転写されるウイルス配列（すなわち、５’ Ｕ３領域）に会合した天然配列であってもよいし、または別のプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）などの異種プロモーターであってもよい。

【0210】

ベクターは、ウイルスのエンハンサーおよびプロモーター配列が欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターであってもよい。ＳＩＮベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて野生型ベクターと同程度の有効性で生成され、非分裂細胞に形質導入することができる。ＳＩＮプロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）の転写不活性化は、複製コンピテントウイルスによる動員を防ぐはずである。これはまた、ＬＴＲのシス作用効果を排除することにより、内部プロモーターからの遺伝子の調節された発現を可能にするはずである。

【0211】

ベクターは、組込み欠陥型であってもよい。組込み欠陥型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）は、例えば、ベクターに触媒的に不活性なインテグラーゼ（触媒部位にＤ６４Ｖ変異を有するＨＩＶインテグラーゼなど；Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-7; Naldini, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-8; Leavitt, A.D. et al. (1996) J. Virol. 70: 721-8）をパッケージングすること、またはベクターＬＴＲの必須のａｔｔ配列を修飾するか、もしくはベクターＬＴＲから必須のａｔｔ配列を削除すること(Nightingale, S.J. et al. (2006) Mol. Ther. 13: 1121-32)、または上記の組合せによって生産することができる。

【0212】

細胞
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、抗原結合ドメインまたはＣＡＲを含んでなる細胞を提供する。

【0213】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、リンパ球または幹細胞、例えば、造血幹細胞、臍帯血幹細胞（ＣＢ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0214】

例えば、細胞は、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、Ｔｈ０細胞、Ｔｃ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、γ／δ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ダブルネガティブＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、造血幹細胞および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択され得る。

【0215】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、好ましくは、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、自己または同種Ｔ細胞である。

【0216】

細胞は、対象から単離されたものであってよい。

【0217】

本発明の細胞は、養子細胞移入に使用するために提供され得る。本明細書で使用される場合、「養子細胞移入」という用語は、患者への細胞集団の投与を指す。一般に、細胞は、対象から単離された後に遺伝的に修飾され、患者に投与される前にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞である。

【0218】

養子細胞移入は、同種異型または自己であり得る。

【0219】

「自己細胞移入」とは、出発細胞集団（その後本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質導入される）が、形質導入された細胞集団が投与される対象と同じ対象から得られることと理解される。自己移入は、免疫学的不適合に関連する問題を回避し、遺伝的に一致したドナーが利用可能かどうかに関係なく対象に利用可能であるので有利である。

【0220】

「同種細胞移入」とは、出発細胞集団（その後本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質導入される）が、形質導入された細胞集団が投与される対象とは異なる対象から得られることと理解される。好ましくは、免疫学的不適合のリスクを最小化するために、ドナーは細胞が投与される対象と遺伝的に一致している。あるいは、ドナーは不一致で患者とは無関係でもよい。

【0221】

治療方法
別の態様において、本発明は、療法において使用するための本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0222】

いくつかの実施形態では、療法は、癌の治療である。

【0223】

好ましい実施形態では、癌は、血液悪性腫瘍である。

【0224】

好ましい実施形態では、癌細胞は、ＣＤ８４を発現し、例えば、血液悪性腫瘍は、ＣＤ８４を発現する血液悪性腫瘍であり得る。

【0225】

いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄増殖性症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、樹状細胞新生物および組織球性肉腫からなる群から選択される。

【0226】

いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および組織球性肉腫からなる群から選択される。

【0227】

好ましい実施形態では、癌は、ＣＬＬ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬおよびＡＭＬからなる群から選択される。

【0228】

好ましい実施形態では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬおよびＡＭＬからなる群から選択される。

【0229】

別の態様において、本発明は、ＡＭＬの治療において使用するための、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0230】

別の態様において、本発明は、Ｔ－ＡＬＬの治療において使用するための、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0231】

別の態様において、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の治療において使用するための、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0232】

別の態様において、本発明は、バーキットリンパ腫の治療において使用するための、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。

【0233】

いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞リンパ腫でない。いくつかの実施形態では、癌は、成熟Ｔ細胞リンパ腫でない。いくつかの実施形態では、癌はＣＬＬでない。いくかの実施形態では、癌は，固形腫瘍でない。

【0234】

哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒトの治療および獣医学的治療の両方が本発明の範囲内にある。

【0235】

医薬組成物および注射溶液
本発明で使用するための薬剤は単独で投与することができるが、特にヒトの療法では、一般に、医薬担体、賦形剤または希釈剤と混合して投与される。

【0236】

本発明の薬剤、例えば、細胞またはベクター粒子は、医薬組成物として製剤してよい。これらの組成物は、薬剤に加えて、薬学上許容される担体、希釈剤、賦形剤、バッファー、保存剤または当技術分野で周知のその他の材料を含んでなってよい。このような材料は、非毒性であるべきで、有効成分の有効性に干渉してはならない。担体またはその他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば、静脈内であるか動脈内であるかによって当業者に決定可能である。

【0237】

医薬組成物は一般に、液体の形態である。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水溶液、塩化マグネシウム、デキストロースもしくはその他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールも含み得る。いくつかの場合、プルロニック(登録商標)アシッド（ＰＦ６８）０．００１％などの界面活性剤が使用可能である。いくつかの場合、血清アルブミンが組成物に使用可能である。

【0238】

注射のためには、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する水溶液の形態であり得る。当業者ならば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液または乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することが十分可能である。必要に応じて、保存剤、保存剤、バッファー、抗酸化剤および／またはその他の添加剤を含めてもよい。

【0239】

遅延放出のためには、薬剤は、当技術分野で公知の方法によって、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセル、またはリポソーム担体系など、緩徐放出のために調剤された医薬組成物中に含まれてよい。

【0240】

細胞療法製剤の取り扱いは、細胞療法に関するＦＡＣＴ－ＪＡＣＩＥ国際基準に準拠して行うことが好ましい。

【0241】

投与
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物は、対象に全身投与される。

【0242】

いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物は、対象に局所投与される。

【0243】

「全身送達」または「全身投与」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、薬剤の広域分布を達成するために、本発明の薬剤が循環系に投与されることを意味する。対照的に、局所または局部投与は、薬剤の送達を限局された領域に制限する。

【0244】

いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物は、血管内、静脈内または動脈内に投与される。

【0245】

好ましい実施形態では、本発明の抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または医薬組成物は、静脈内に投与される。

【0246】

用量
当業者ならば、対象に投与する本発明の薬剤の適切な用量を容易に決定することができる。一般に、医師が個々の患者に最も適した実際の用量を決定し、それは、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用時間、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬剤の組合せ、特定の病態の重症度、および治療を受ける個人を包含する様々な要因に依存する。当然のことながら、より高用量または低用量範囲が妥当な個々の例もあり得、そのような場合も本発明の範囲内にある。

【0247】

対象
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒト動物を指す。

【0248】

非ヒト動物の例としては、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、齧歯類（例えば、マウス、ラットまたはモルモット）、ブタおよびウシが挙げられる。非ヒト動物は、伴侶動物であり得る。

【0249】

好ましくは、対象はヒトである。

【0250】

変異体、誘導体、類似体、ホモログおよびフラグメント
本明細書で述べられる特定のタンパク質およびヌクレオチドに加え、本発明はまた、それらの変異体、誘導体、類似体、ホモログおよびフラグメントも包含する。

【0251】

本発明の文脈で、所与の配列の「変異体」は、残基の特定の配列（アミノ酸残基であれ核酸残基であれ）が、対象とするポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその内因性機能のうち少なくとも１つを保持するように修飾されている配列である。変異体配列は、天然ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置き換えおよび／または変動によって得ることができる。

【0252】

「誘導体」という用語は、本明細書で本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、結果として生じるタンパク質またはポリペプチドがその内因性の機能のうち少なくとも１つを保持する限り、配列からのまたは配列への１（または複数の）アミノ酸残基のいずれの置換、変動、修飾、置き換え、欠失および／または付加も包含する。

【0253】

「類似体」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、任意の模倣剤、すなわち、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性の機能のうち少なくとも１つを有する化学化合物を包含する。

【0254】

一般に、アミノ酸置換は、修飾された配列が必要とされる活性または能力を保持する限り、例えば、１、２または３から１０または２０の置換を行うことができる。アミノ酸置換は、非天然類似体の使用を含み得る。

【0255】

本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレント変異を生じ、機能的に同等のタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、内因性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負電荷を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正電荷を有するアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非電荷極性頭基を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられる。

【0256】

保存的置換は、例えば、下表に従って行うことができる。第２列の同じブロック、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換することができる。

【0257】

【0258】

「ホモログ」という用語は、本明細書で使用される場合、野生型アミノ酸配列または野生型ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同等と見なすことができる。

【0259】

本文脈において、相同配列とは、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％または９７％または９８％または９９％同一であり得るアミノ酸配列を包含するものとする。一般に、ホモログは、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含んでなる。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）という観点で考えることもできるが、本発明の文脈では、配列同一性という観点で相同性を表すことが好ましい。

【0260】

本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％または９７％または９８％または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を包含すると見なされる。相同性は類似性の観点から考えることもできるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。

【0261】

好ましくは、本明細書において詳述される配列番号のいずれか１つに対する同一性パーセントを有する配列という場合には、言及される配列番号の全長にわたって記載の同一性パーセントを有する配列を指す。

【0262】

相同性比較は目視により、またはより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けで行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の相同性または同一性のパーセントを計算することができる。

【0263】

相同性パーセントは、連続する配列にわたって計算することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインし、一方の配列の各アミノ酸またはヌクレオチドを、他方の配列の対応するアミノ酸またはヌクレオチドと、1残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数の場合にのみ行われる。

【0264】

これは非常に簡単で一貫性のある方法であるが、例えば、それ以外は同一の配列ペアにおいて、アミノ酸またはヌクレオチド配列に１つの挿入または欠失があると、それに続く残基またはコドンがアラインメントから外れてしまうことがあり、その結果、グローバルアラインメントを実行した際に、相同性パーセントが大きく減少する可能性があることを考慮することができない。結果として、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアに過度のペナルティを与えることなく、可能性のある挿入および欠失を考慮した最適なアラインメントを生成するように設計されている。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入し、局所的な相同性を最大化しようとすることで達成される。

【0265】

しかしながら、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一アミノ酸またはヌクレオチドに対して、比較する２配列間のより高い関連性を反映して、できるだけギャップの少ない配列アラインメントは、ギャップの多いものよりも高いスコアとなるように、アラインメントで発生する各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内のそれに続く各残基に対してより小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然のことながらギャップの少ない最適化されたアラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップが－１２、各エクステンションが－４である。

【0266】

従って、最大相同パーセントの計算には、まずギャップペナルティを考慮した最適なアラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学，ＵＳＡ；Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12: 387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18参照）、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410)および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツが挙げられる。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡも、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58～7-60参照）。しかしながら、用途によっては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。別のツール、ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓもタンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である(FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8)。

【0267】

最終的な相同性パーセントは同一性の観点から評価することもできるが、アラインメントプロセス自体は通常、オール・オア・ナッシングのペア比較に基づいていない。その代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいて各対の比較にスコアを割り当てる、スケール化された類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用されるこのようなマトリックスの例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムスーツのデフォルトマトリックス）がある。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは一般に、公開デフォルト値または提供されている場合にはカスタムシンボル比較テーブルのいずれかを使用する（さらなる詳細はユーザーマニュアルを参照）。アプリケーションによっては、ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値、または他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。

【0268】

ソフトウェアが最適なアラインメントを作成したら、相同性パーセント、好ましくは配列同一性パーセントを計算することができる。ソフトウェアは通常、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。

【0269】

「フラグメント」もまた変異体であり、この用語は通常、機能性または例えばアッセイにおいて注目するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を指す。従って、「フラグメント」とは、全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸配列を指す。

【0270】

このような変異体は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。挿入が行われる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域とともに挿入配列をコードする合成ＤＮＡを作製すればよい。隣接領域には、天然に存在する配列の部位に対応する便利な制限部位が含まれているので、適切な酵素で配列を切断し、その切断部位に合成ＤＮＡを連結すればよい。その後、ＤＮＡは本発明に従って発現され、コードされたタンパク質が作られる。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作に関して当技術分野で知られている多くの標準的技術を例示したに過ぎず、他の既知の技術を使用してもよい。

【0271】

コドンの最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドはコドンの最適化を行ってもよい。コドンの最適化は、これまでにＷＯ１９９９／４１３９７およびＷＯ２００１／７９５１８に記載されている。細胞が異なれば、特定のコドンの使用が異なる。このコドンの偏りは、細胞種における特定のｔＲＮＡの相対存在量の偏りに対応する。対応するｔＲＮＡの相対存在量に合うように配列中のコドンを変更することで、発現を増加させることができる。同様に、特定の細胞種では対応するｔＲＮＡが稀であることが知られているコドンを意図的に選択することで、発現を減少させることもできる。このように、さらに高度な翻訳制御が可能になる。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞だけでなく、他の様々な生物についても当分野で知られている。

【0272】

当業者は、開示された本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明の全ての特徴を組み合わせることができることを理解するであろう。

【0273】

以下、本発明の好ましい特徴および実施形態を限定されない例として説明する。

【0274】

本発明の実施には、特に断りのない限り、化学、生化学、分子生物学、微生物学および免疫学の従来技術を用いるが、これらは当業者の能力の範囲内にある。このような技術は文献で説明されている。例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Pressを参照のこと。これらの一般的なテキストのそれぞれは参照により本明細書の一部とされる。

【実施例】

【0275】

実施例１：血液悪性腫瘍におけるＣＤ８４の発現
本発明者らは、ＣＤ８４が様々な悪性血液疾患で過剰発現していることを認めた。ＴＣＧＡおよびＧＴＥｘプロジェクトからの９，７３６の腫瘍および８，５８７の正常サンプルのＲＮＡシーケンシング発現データを解析するための対話型ウェブサーバーであるＧＥＰＩＡを使用して(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html; Tang et al. GEPIA: a web server for cancer and normal gene expression profiling and interactive analyses. Nucleic Acids Res. 2017; 10.1093/nar/gkx247)、以下のことを見出した。
・ＣＤ８４発現は、４７のリンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（図１では、ＤＬＢＣとして表す）では、３３７の血液サンプルの４．２倍。
・ＣＤ８４発現は、１７３の急性骨髄性白血病（図１では、ＬＡＭＬとして表す）では、７０の骨髄サンプルの１０．１倍。

【0276】

本発明者らはまた、様々なタイプの固形および血液腫瘍に由来する１，１００を超える細胞株パネルのｍＲＮＡ発現データを含むＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）データセットも調査した(https://portals.broadinstitute.org/ccle)。ｍＲＮＡ発現のＲＮＡｓｅｑとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析の両方から、ＣＤ８４はバーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、およびＴ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）由来の細胞株では高レベルで発現しているが、Ｔ細胞性リンパ腫または固形腫瘍でそうではないことが示された（図２）。

【0277】

本発明者らは、次に、異なる血液悪性腫瘍に由来する細胞株の表面におけるＣＤ８４発現を評価した。表１に、使用した細胞株、それが由来する血液悪性腫瘍、および図３に示したサイトメトリー解析に基づくＣＤ８４発現の定性的評価を示す。

【0278】

【表1】

【0279】

本発明者らは、ＣＬＬ患者からの９サンプルにおけるＣＤ８４の発現をフローサイトメトリーで解析した。表２に、図４に示したサイトメトリー解析に基づくＣＤ８４発現の定性的評価を示す。白血病細胞におけるＣＤ８４の発現を、リンパ球（ＣＤ８４^{ｍｏｄｅｒａｔｅ}）および単球（ＣＤ８４^ｈｉｇｈ）におけるＣＤ８４の発現と比較した。薄いグレーのヒストグラムはアイソタイプ適合対照抗体による染色を表し、濃いグレーのヒストグラムは特異的ＣＤ８４抗体による染色を表す。

【0280】

【表2】

【0281】

ある種のゲノムデータベースは、ＡＭＬにおいてＣＤ８４がｍＲＮＡレベルで過剰発現していることを示唆しているが、本発明者らは、ＡＭＬと診断された患者（ｎ＝１０）の悪性細胞の表面にＣＤ８４が発現しているかどうかを確認しようとした（表３）。

【0282】

【表3】

【0283】

フローサイトメトリーデータの２つの代表例を図５に示す：患者０４と患者１０のサンプルは、それぞれＣＤ８４の発現が中と高を示す。

【0284】

実施例２：ＣＤ８４抗体
マウスモノクローナル抗体
本発明者らは、２つの抗ＣＤ８４マウスモノクローナル抗体（１５２－１Ｄ５と１５３－４Ｄ９; Engel et al. B-cell antigens section report, in Schlossman S (ed): Leucocyte Typing V. Oxford, UK, Oxford University Press, 1995, page 483; Palou et al. Genomic characterization of CD84 reveals the existence of five isoforms differing in their cytoplasmic domains. Tissue Antigens. 2000; 55(2):118-27)の配列を研究および決定した。

【0285】

さらに、本発明者らは、ヒトＣＤ８４タンパク質でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することにより、方法に記載されているように、多数の新しい抗ＣＤ８４マウスモノクローナル抗体を作製した。表３に、方法に記載されたように特性評価を行ったこれらの抗体の特徴をまとめる。３００．１９－ＣＤ８４^＋、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓ細胞、リンパ球および単球への結合は、等量／等濃度の抗ＣＤ８４抗体を添加したハイブリドーマ上清を用いて行った。

【0286】

【表4】

【0287】

軽鎖の可変領域（ＶＬ）に相当する配列と重鎖の可変領域（ＶＨ）に相当する配列は、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて異なるハイブリドーマから決定した。この領域のサンガーシーケンシングは、ＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎｔｉｂｏｄｙ（英国）により行われた。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ａｂｙｓｉｓ（配列はＫａｂａｔナンバリングスキームで定義）、ＩＭＧＴおよびＩｇＢＬＡＳＴデータベースを用いて同定した。

【0288】

表５は、これらの抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列を示す。各配列の３つのＣＤＲが太字および下線で強調されている。

【0289】

【表5】

【0290】

ヒトｓｃＦｖ
ファージディスプレースクリーニングを用いて、ＣＤ８４に結合する新規なヒトｓｃＦｖを同定した。３つの異なるｓｃＦｖが同定され（Ｒ３－Ｂ３、Ｒ３－Ｇ７およびＲ３－Ｈ３）；重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのＣＤＲおよびＦＲの配列を表６に示す。

【0291】

【表6】

【0292】

実施例３：ＣＤ８４ ＣＡＲの作製
本発明者らは、いくつかの抗ＣＤ８４ ＣＡＲ構築物（ＣＡＲ８４）を作製した。完全なＣＡＲ８４配列を、ＥＦ１αプロモーターの制御下にシグナルペプチド、ＣＤ８４に特異的なｓｃＦｖ、ＣＤ８ａのヒンジ領域と膜貫通領域、共刺激ドメイン４－１ＢＢ、およびシグナル伝達ドメインＣＤ３－ζを包含する第三世代レンチウイルスベクターｐＣＣＬ(Dull et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 1998:72:8463-8471)にクローニングした（図６）。

【0293】

ｓｃＦｖドメインの様々な変種が、上述の抗体に基づいて設計された。これらのｓｃＦｖは、ＶＨ配列とＶＬ配列の順序（ＶＨ鎖のみを有する変種もある）、およびＶＨとＶＬの間に使用されるリンカーが異なり、３つ（Ｓ３）または４つ（Ｓ４）のモチーフ（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）が使用されている。各ＣＡＲ変種に付けられた名称は、ｓｃＦｖの設計を反映している。合成され、ｐＣＣＬベクターにクローニングされた種々のｓｃＦｖドメインの配列を表７に示す。

【0294】

【表7】

【0295】

完全なＣＡＲ配列を表８に示す。

【0296】

【表8】

【0297】

ＣＤ８４ ＣＡＲＴの生産
ｐＣＣＬ－ＥＦ１α－ＣＤ８４ベクターの種々の変種を含むレンチウイルス（ＬＶ）をＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で産生し、限界希釈法によって導入ユニット数を決定した。次に、これらのレンチウイルスを用いて全血から単離したＴ細胞に形質導入した。その後、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を６～８日間、拡大培養した。

【0298】

下表（表９～１１）は、種々のＣＡＲＴに関して３回の独立した形質導入の後に得られたＴ細胞の数、ならびにこれらのＴ細胞のうち表面にＣＤ８４ ＣＡＲを発現したもののパーセンテージをまとめたものである。

【0299】

【表9】

【0300】

【表10】

【0301】

【表11】

【0302】

以下のＣＡＲ ＬＶは、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞：１５２．１、１５３．１、１５３．２、Ｂ３．４およびＢ３．５の効率的な拡大増殖をもたらさなかった。１５２．１および１５３．１ ＣＡＲはさらなる実験に使用しなかった。

【0303】

実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン生産におけるＣＤ８４ ＣＡＲＴ
各ＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出能を評価するために、エフェクター－標的細胞の共培養の上清を採取した。ＣＤ８４^ｈｉｇｈ細胞株Ｒａｍｏｓを標的細胞として、２：１のエフェクター：標的細胞比で使用した。上清中のＩＦＮ－γ（図７）、ＩＬ－２（図８）、グランザイム－Ｂ（図９）およびＴＮＦ－α（図１０）のレベルを、２４時間の共培養後に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を陰性対照として使用した（標的細胞と共培養）。４回の独立した実験を行った。

【0304】

これらの結果は、Ｒ３－Ｂ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ結合ドメインを有するＣＡＲＴ細胞がサイトカイン放出活性を欠くことを示し、従って、次の実験には使用しなかった。他方、Ｒ３－Ｈ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ結合ドメインを有するＣＡＲＴ細胞は、多量のサイトカインを放出し、これら２つのＣＡＲＴ細胞（Ｈ３．４およびＨ３．５）は、最大の炎症性プロファイルを有するものであり（ＴＮＦ－α分泌に基づく）、次いで、１５２－１Ｄ５抗体ＣＡＲ結合ドメインを有するＣＡＲＴ細胞であり、これも高いサイトカイン放出プロファイルを示す。１５２－１Ｄ５ ＣＡＲＴ細胞は、ｓｃＦｖの設計（ＶＨ－ＶＬの順およびリンカー長）とは関わらず類似のプロファイルを示した。１５３－４Ｄ９およびＲ３－Ｇ７抗体に基づくＣＡＲＴ細胞は類似のプロファイルを有し、サイトカインをほとんど分泌しない１５３．３ ＣＡＲＴ細胞を除き、Ｒ３－Ｈ３および１５２－１Ｄ５ ＣＡＲＴ細胞に比べて低いサイトカイン放出を示した。

【0305】

実施例５：抗ＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＡＲＴ８４細胞の有効性を評価するために、本発明者らは、ＣＤ８４発現レベルが異なり、リンパ起源（Ｒａｍｏｓ、ＮＡＬＭ６およびＭＯＬＴ－４細胞株）と骨髄起源（Ｋ５６２およびＭＯＬＭ－１３細胞株）の両方のいくつかのＧＦＰ発現標的細胞株に対して、各ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイを行った。ＣＡＲＴ細胞傷害性は、２４時間の共培養の後に、サイトメトリーにより生ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定することで評価した。エフェクター：標的細胞比 ４：１、２：１、１：１および０．５：１を試験した。

【0306】

まず、本発明者らは、ＣＤ８４^ｈｉｇｈ Ｒａｍｏｓ細胞株に対して全てのＣＡＲを試験した（図１１）。エフェクター：標的比 ２：１の結果を示す。Ｒ３－Ｈ３および１５２－１Ｄ５ ＣＡＲＴ細胞は、この細胞株に対して最も高い細胞傷害活性を示したが、１５３－４Ｄ９およびＲ３－Ｇ７ ＣＡＲＴ細胞は、それより低い細胞傷害活性を示した。１５３．３ ＣＡＲＴ細胞は、１５３－４Ｄ９構築物に基づく全てのＣＡＲで最も低い細胞傷害活性を示した。

【0307】

次に、本発明者らは、ＣＤ８４発現の低い骨髄細胞株であるＫ５６２に対して全てのＣＡＲを試験した（図１２）。エフェクター：標的比 ２：１の結果を示す。１５２－１Ｄ５および１５３－４Ｄ９抗体に基づくＣＡＲは、ＵＴ細胞に比べて統計的に有意な細胞傷害活性を示した。

【0308】

ＲａｍｏｓおよびＫ５６２に対する細胞傷害性に基づいて、本発明者らは、さらなる特性評価のために以下のＣＡＲＴ細胞：１５２．３、１５３．４、１５３．５、Ｇ７．５およびＨ３．５を選択した。本発明者らは、いくつかの細胞株に対して、２４および４８時間の共培養の後に、４種類のエフェクター：標的比（４：１、２：１、１：１および０．５：１）で、これらのＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を評価した。Ｒａｍｏｓは、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫細胞株であり（図１３）、Ｋ５６２は、ＣＤ８４発現の低い急性骨髄性白血病細胞株であり（図１４）、一方、ＭＯＬＭ－１３は、ＣＤ８４発現が中程度の急性骨髄性白血病細胞株である（図１５）。ＮＡＬＭ－６は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株であり（図１６）、ＭＯＬＴ－４は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株である（図１７）。

【0309】

２：１比に関して示されるように（図１１）、選択されたＣＡＲは、各エフェクター：標的比について、ＵＴ細胞に比べ、Ｒａｍｏｓ細胞に対して統計的に有意な細胞傷害活性を示した（図１３）。Ｋ５６２の場合、図１２で示されたものと同じパターンが見られ、１５２－１Ｄ５および１５３－４Ｄ９抗体に基づくＣＡＲは、ＵＴ細胞に比べて統計的に有意な細胞傷害活性を示した（図１４）。

【0310】

選択された全てのＣＡＲが、ＭＯＬＭ－１３に対して細胞傷害活性を示し、１５２．１Ｄ５および１５３．４Ｄ９抗体に基づくＣＡＲが、Ｒ３－Ｇ７およびＲ３－Ｈ３抗体に基づくものよりも高い細胞傷害効果を示した（図１５）。

【0311】

１５２．１Ｄ５および１５３．４Ｄ９抗体に基づくＣＡＲは、Ｒ３－Ｇ７およびＲ３－Ｈ３ ｓｃＦｖに基づくＣＡＲよりも、ＮＡＬＭ－６細胞株に対して高い細胞傷害活性を示した（図１６）。ＭＯＬＴ－４細胞株では、１５２－１Ｄ５抗体に基づくＣＡＲがＵＴ細胞に比べて最も高い統計的に有意な細胞傷害活性を示し、次いで１５３－４Ｄ９およびＲ３－Ｇ７抗体に基づくＣＡＲであった（図１７）。

【0312】

実施例６：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ８４発現
本発明者らは、種々のＰＢＭＣ細胞集団におけるＣＤ８４発現をフローサイトメトリーにより評価し、得られた結果はこれまでに記載されたものと同様であった。単球は、Ｒａｍｏｓ細胞株で見られたものと同様の高いＣＤ８４発現を示す。Ｂ細胞は、中程度のＣＤ８４発現を示しす。ＣＤ４およびＣＤ８の両Ｔ細胞には、ＣＤ８４発現に関して明瞭に異なる亜集団（陽性および陰性）があり、陽性集団では中程度のＣＤ８４発現レベルであった（図１８）。

【0313】

実施例７：ＰＢＭＣに対するＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
本発明者らは、ＰＢＭＣに対するＣＤ８４ ＣＡＲＴの細胞傷害活性を評価した。各実験で、エフェクター細胞（すなわち、ＣＡＲＴ８４細胞）と標的細胞（ＰＢＭＣ）の両方を同じドナーから得た。３名の異なるドナーの３回の独立した実験の平均を示す。ＣＡＲＴ細胞は、それら固有のＰＢＭＣに対して統計的に有意な細胞傷害活性を示さなかった。しかしながら、これらのＣＡＲＴ細胞は、並行実験でＲａｍｏｓ細胞に対しては統計的に有意な細胞傷害活性を示した（図１９）。

【0314】

実施例８：実施例１～２０の方法
マウスモノクローナル抗ＣＤ８４抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３週間隔で３～４回、ＣＤ８４全長ＤＮＡで安定にトランスフェクトされた３００．１９細胞で免疫した(de la Fuente MA et al. CD84 leukocyte antigen is a new member of the Ig superfamily. Blood. 1997; 15;90(6):2398-405)。１回目の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射は、３００μｌのＰＢＳ中、２０×１０^６細胞からなり、２回目は、３００μｌのＰＢＳ中、２０×１０^６細胞からなり、最後の注射は、３００μｌのＰＢＳ中、 ３０×１０^６細胞からなった。最後の追加免疫後３日目にマウスを安楽死させ、脾細胞を採取して細胞融合を行った。

【0315】

ＮＳ１骨髄腫細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）と脾臓細胞を、４：１（脾細胞：ＮＳ１）の比で３７℃にてインキュベートし、室温で１０分間遠心分離し、絶えず撹拌しながら細胞ペレットに１ｍＬの温ＰＥＧ溶液を加えることによって融合させた。細胞をＲＰＭＩ培養培地にゆっくり再懸濁させ、遠心分離し、加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

【0316】

融合１０日後に、５０μｌのハイブリドーマ上清を、非トランスフェクト３００．１９細胞を陰性対照として用い、３００．１９－ＣＤ８４細胞とフローサイトメトリーで分析することによりスクリーニングを行った。３００．１９－ＣＤ８４細胞に陽性、３００．１９細胞に陰性と判定されたハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、コンフルエントになるまで増殖させた後、Ｔ７５フラスコに移した。次に、目的の抗体を産生する単一のハイブリドーマクローンを限界希釈により単離した。各ハイブリドーマについて、１０個の単一クローンを３００．１９－ＣＤ８４細胞を用いてフローサイトメトリーで再検査した。このクローニングプロトコールを陽性クローンの１つで繰り返した。

【0317】

各抗体について、アイソタイプ（クラスおよびサブクラス）は、抗ＩｇＧコートプレートに抗体を加えた後、抗マウスＨＲＰ抗体とともにプレートをインキュベートするＥＬＩＳＡ法により決定した。２つのＣＤ８４細胞外ドメインのどちらが抗体によって認識されるかを決定するために、ドメイン１（Ｄ１）と２（Ｄ２）の配列がヒトまたはマウスであるキメラＣＤ８４細胞外ドメインを発現するＣＯＳ細胞を用いてフローサイトメトリー解析を行った。

【0318】

完全ヒト抗ＣＤ８４ ｓｃＦｖの同定
哺乳動物細胞によって産生されたヒトＣＤ８４（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認；図２０）を抗原として使用し、５．３７×１０^１０ ｓｃＦｖ変異体という高い多様性を有するヒトナイーブファージディスプレーＬｉＡｂ ＳＦＭａｘライブラリー（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、フランス）のパンニングを行った。

【0319】

バイオパンニングラウンドでは、チューブを抗原でコーティングし、ブロッキングし、洗浄し、およびファージライブラリーとともにインキュベートした。洗浄後、グリシンＨＣｌでファージ結合剤の溶出を行い、次いで中和した。

【0320】

溶出したファージの濃度を決定するために、これらを大腸菌(E. coli)ＴＧ１細胞に加え、次いでプレートに注ぎ、逆さまにして培養した。ＰＦＵ（プラーク形成単位）の計算は、プレート上のプラーク（すなわち、死滅したＴＧ１）の数に基づいた。

【0321】

溶出したファージを増幅するために、これらを大腸菌ＴＧ１細胞に加え、次いでヘルパーファージを感染させ、培養した。ＰＥＧ／ＮａＣｌでファージを沈降させた後、再懸濁させ、増幅したファージをＥＬＩＳＡ分析の次のバイオパンニングラウンドに使用した。

【0322】

この分析では、ラウンドを重ねるごとに有意な濃縮が示され（表１２）、ラウンド３の産出量がすでに優れた濃縮を示していたため、ファージの多様性の低下を防ぐためにさらなるバイオパニングラウンドは行わなかった。

【0323】

【表12】

【0324】

ラウンド３のファージをモノクローナルＥＬＩＳＡ分析のために選択した。単一の大腸菌ＴＧ１クローンを採取し、ヘルパーファージとともに培養した。遠心分離の後、ファージを含む上清を回収した。

【0325】

プレートを抗原またはバッファーのいずれかでコーティングし、洗浄し、ブロッキングし、再び洗浄した。次に、ファージをプレートに加え、インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、抗ファージセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を加えた後、洗浄し、ＴＭＢ、次いでＨＣｌでインキュベートした。プレートを４５０ｎｍで読み取った。

【0326】

陽性クローンのシークエンシングの後、３つの異なるユニークな配列が同定された。同定された３つのユニークなクローンを次に、クローンの特異性を保証するためにＥＬＩＳＡにより再検定した。全てのファージを同じ濃度で検定した。プレートを抗原（Ａｇ）またはバッファー（ＮＣ）のいずれかでカバーした。これらの結果から、３つのクローンがＣＤ８４抗原と特異的に結合することが明らかになった（表１３）。

【0327】

【表13】

【0328】

ドナー、細胞株
健康なドナーの血液バフィーコートは、基準血液バンクＢａｎｃ ｄｅ Ｓａｎｇ ｉ Ｔｅｉｘｉｔｓ、バルセロナ（スペイン）から入手した。

【0329】

Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、ＭＯＬＭ－１３、Ｋａｓｕｍｉ－６、ＴＨＰ－１、およびＵ９３７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、ＮＳ１およびＴＨＰ－１細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｍｅｒｃｋ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌａｂｃｌｉｎｉｃｓ）を添加したＲＰＭＩ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で培養し、３００．１９細胞には、１％Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および０．１％２－β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）も添加した。ＨＥＫ２９３ＴおよびＣＯＳ細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｍｅｒｃｋ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌａｂｃｌｉｎｉｃｓ）を１％Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）とともに添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。全ての細胞株を３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させた。

【0330】

レンチウイルスの生産
直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ ２３９６６－１）を用い、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞を、パッケージングプラスミドｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５３）、ｐＭＤＬｇ／Ｐｒｒｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５１）、およびエンベローププラスミドｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５９）とともに本発明者らのトランスファーベクターｐＣＣＬ－ＥＦ１α－ＣＤ８４でトランスフェクトした。４８時間後にレンチウイルス上清を回収し、ＬｅｎｔｉＸ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ）を用い、製造舎のプロトコールに従って濃縮した。濃縮したレンチウイルスは使用まで－８０℃で保存した。

【0331】

レンチウイルスの力価測定
形質導入単位の数（ＴＵ／ｍＬ）は、限界希釈法で決定した。

【0332】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入の２４時間前に播種し、１：１０希釈のウイルス上清を調製し、８ｍｇ／ｍＬでポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に加えた。４８時間後に細胞をトリプシンで処理し、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１１５－１３６－０７２）で標識した。２％～２０％の陽性細胞に相当する希釈率を用いてウイルス力価を計算した。

【0333】

Ｔ細胞形質導入およびＣＡＲＴ拡大培養
Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）での密度勾配遠心分離中の全血から、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌからのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔカクテル）により単離した。Ｔ細胞は、５％ＡＢヒト血清（Ｓｉｇｍａ Ｈ４５２２）、ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１００ｍｇ／ｍＬ），および５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加したＸ－Ｖｉｖｏ １５ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）で培養した。次に、細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８ ｍＡｂ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｇｉｂｃｏ、１１１３１Ｄ）を結合させたビーズを用いて活性化した。２４時間後、これらの細胞に、８ｕｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、レンチウイルスで形質導入を行った。実験を行う前に６～８日間の拡大培養を要した。

【0334】

フローサイトメトリー
ＣＡＲ８４を、組換えＣＤ８４－Ｈｉｓタンパク質（Ｒ＆Ｄ、１８５５－ＣＤ）および二次Ｈｉｓ Ｔａｇ ＡＰＣ結合抗体（Ｒ＆Ｄ、ＩＣ０５０Ａ）およびビオチンＳＰ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２－フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１１５－０６５－０７２）またはビオチンＳＰ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２－フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１０９－０６５－００６）とＢＶ４２１結合ストレプトアビジン（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、５６３２５９）で検出した。ヒトタンパク質に対する以下のｍＡｂを使用した：ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８、ＣＤ１９－ＰＥ、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７、ＰＤ－１－ＰＥ－Ｃｙ７、ＴＩＭ－３－ＢＢ５１５、ＣＤ６９－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ（商標）５．５、ＬＡＧ－３－ＢＶ－６０５、ＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ、ＣＣＲ７－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ（商標）５．５、ＣＤ８４－ＰＥ、ＣＤ４－ ＰＥ－Ｃｙ（商標）７、ＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８４－ＡＰＣおよびＣＤ８４－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。サンプルをフローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ４Ｌ ｗｉｔｈ ＨＴＳ（ＢＤ）、およびＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ ４Ｌサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にかけた。ＥＬＩＳＡには、以下のｍＡｂを使用した：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ヤギで作製した抗マウスＩｇＧ－ペルオキシダーゼ抗体、Ｓｉｇｍａ、カタログ：Ａ３６７３－１ＭＬ）およびヤギで作製した抗マウスＩｇＧコーティング（抗マウスＩｇＧ抗体（ｓｉｇｍａ、カタログ：Ｍ２６５０－１ＭＬ）。データは、ＦｌｏｗＪｏ ソフトウェア１０．７．１を用いて解析した。

【0335】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を、種々のエフェクター：標的比を用い、種々の時点で評価した。これらのアッセイに使用した標的細胞は、従前に記載されているように(Shah et al. Antigen Presenting Cell-Mediated Expansion of Human Umbilical Cord Blood Yields Log-Scale Expansion of Natural Killer Cells with Anti-Myeloma Activity. PLoS One. 2013; 8(10))、ＧＦＰ－ホタルルシフェラーゼ（ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ）を過剰発現させるためにレンチウイルスベクターで改変した。

【0336】

生存ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の残存率をフローサイトメトリーにより分析し、下式：生細胞の％＝１００×（ｘ時点のＴ細胞とともにあるＧＦＰ^＋細胞の数／ｘ時点のＧＦＰ^＋細胞単独の数）を用いて計算した。

【0337】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
ＣＤ８４抗原に応答したＣＡＲＴ８４細胞の増殖を、ＣＦＳＥアッセイ(Castella, M. et al. (2019) Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. 12: 134-144)を用いて測定した。ＣＡＲＴ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５５９８４３１）で染色した後、刺激有りまたは無しで９６時間共培養した。増殖をフローサイトメトリーにより分析し、増殖指数（ＰＩ）を計算した（ＰＩ＝異なる世代の細胞数の合計／細胞の数）。

【0338】

ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン産生
ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１βサイトカインを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により、製造者のプロトコールに従って定量した。

【0339】

上記明細書に記載されている全ての刊行物は、参照により本明細書の一部とされる。開示されている本発明の抗原結合ドメイン、抗体、キメラ抗原受容体、使用および方法の種々の改変および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には自明であろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して開示してきたが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、当業者には自明である、本発明を実施するための開示された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【0340】

実施例９：ＣＤ８４ ＣＡＲの操作
本発明者らは、抗体ＧＹＣＤ８４．１－７、ＧＹＣＤ８４．１－２２６およびＧＹＣＤ８４．３－８９に基づくいくつかの抗ＣＤ８４ ＣＡＲ構築物を作製した。完全なＣＡＲ８４配列を、ＥＦ１αプロモーターの制御下にシグナルペプチド、ＣＤ８４に特異的なｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域、共刺激ドメイン４－１ＢＢおよびシグナル伝達ドメインＣＤ３－ζを包含する第三世代レンチウイルスベクターｐＣＣＬ(Dull et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 1998:72:8463-8471)にクローニングした（図６）。

【0341】

抗体ＧＹＣＤ８４．１－７に基づき、ＶＨ配列とＶＬ配列の順序が異なる２つの異なるｓｃＦｖを設計した。これらのＣＡＲは全て、４（Ｓ４）モチーフ（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）のリンカーを含む。各ＣＡＲ変種に付けられた名称は、ｓｃＦｖの設計を反映している。合成され、ｐＣＣＬベクターにクローニングされた種々のｓｃＦｖドメインの配列を表１４に示す。

【0342】

【表14】

【0343】

実施例１０：血液悪性腫瘍におけるＣＤ８４の発現
本発明者らは、ＡＭＬまたはＴ－ＡＬＬと診断された患者の白血病細胞のＣＤ８４発現をフローサイトメトリーにより分析した。表１５および１６に、それぞれＡＭＬ細胞およびＴ－ＡＬＬ細胞上でのＣＤ８４発現の定性評価をまとめる。ＡＭＬサンプルの初代白血病細胞のフローサイトメトリー分析の２つの代表例を図５に示す。Ｔ－ＡＬＬサンプル（患者０１および患者０２）の分析を図２１に示す。

【0344】

【表15】

【0345】

【表16】

【0346】

実施例１１：ＣＤ８４ ＣＡＲＴの生産
ＣＡＲＴ８４ １．７．３、１．２２６．５および３．８９．５ ｐＣＣＬ－ＥＦ１α－ＣＤ８４ベクターを含むレンチウイルス（ＬＶ）をＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で生産し、１ｍＬ当たりの形質導入単位の数を限界希釈法で決定した。レンチイルスを用いて全血から単離したＴ細胞に形質導入し、次に、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を６～８日間拡大培養した。

【0347】

表１７に、３回の独立した形質導入の後に得られたＴ細胞の数、ならびに表面にＣＤ８４ ＣＡＲを発現したＴ細胞のパーセンテージをまとめる。

【0348】

【表17】

【0349】

形質導入６～７日後のＣＡＲＴ８４ １．７．３、１．２２６．５および３．８９．５の拡大培養、ならびに１５２．３、１５３．５およびＨ３．５の拡大培養のさらなる分析を図２２に示し、０日目のＴ細胞数に対する増加倍率として表される。

【0350】

実施例１２：ＣＤ８４ ＣＡＲＴ ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
細胞傷害性に基づき、Ｒａｍｏｓ、Ｋ５６２、ＭＯＬＭ－１３、ＮＡＬＭ６およびＭＯＬＴ－４細胞、ＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５およびＨ３．５に対して得られた結果を、さらなる特性評価のために選択し、１．７．３および１．２２６．５および３．８９．５と比較した。本発明者らは、エフェクター：標的細胞比 ４：１、２：１、１：１および０．５：１で、２４時間または４８時間の共培養の後の、Ｒａｍｏｓ、ＭＯＬＭ－１３、Ｕ９３７およびＭＯＬＴ－４細胞に対するそれらの細胞傷害性を、サイトメトリーにより生ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定することにより評価した。これらの細胞上のＣＤ８４発現を図３に示す。

【0351】

全てのＣＡＲＴ８４がＲａｍｏｓ細胞（ＣＤ８４^ｈｉｇｈ）に対して高い細胞傷害効果を示し、これはＵＴと比較して統計的に有意であった（図２３）。細胞傷害効果は、全てのＣＡＲＴ細胞で経時的に増加したが、この効果は、Ｈ３．５および１．２２６．５の場合、特に低比率（１：１および０．５：１）では低かった。

【0352】

ＭＯＬＭ－１３（ＣＤ８４^{ｍｏｄｅｒａｔｅ}）およびＵ９３７（ＣＤ８４^ｌｏｗ）ＡＭＬ細胞に対して、ＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５、１．７．３、１．２２６．５および３．８９．５は高い細胞傷害効果を示し、これはＵＴと比較して統計的に有意であった（それぞれ図２４および２５）。ＣＡＲＴ８４ Ｈ３．５は、両細胞株の白血病細胞に対して、他のＣＡＲＴ細胞よりも低い細胞傷害活性を示した。細胞傷害効果は、全てのＣＡＲＴで経時的に増加した。Ｈ３．５を除く全てのＣＡＲＴ細胞が、それらの低いＣＤ８４発現にもかかわらずＵ９３７細胞に対して高い細胞傷害性を示した。

【0353】

最後に、本発明者らは、ＭＯＬＴ－４細胞（ＣＤ８４^ｈｉｇｈ）に対するＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５、１．７．５、１．２２６．５および３．８９．５の細胞傷害性を評価したところ、Ｕ９３７細胞で見られたものと同じパターンが見られ、すなわち、Ｈ３．５を除く全てのＣＡＲＴ細胞が高い細胞傷害効果を示し、これは経時的に増加し、ＵＴと比較して統計的に有意であった（図２６）。

【0354】

実施例１３：ＡＭＬおよびＴ－ＡＬＬ由来初代白血病芽細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
本発明者らは、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ ｄｅ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ（ＨＣＢ）から得た患者サンプル由来の初代ＡＭＬ細胞に対するＣＡＲＴ８４細胞１５２．３、１５３．５、Ｇ７．５およびＨ．３．５の細胞傷害性を評価した。ＣＤ８４発現を初代芽細胞で評価し、次にこれをＣＦＳＥで染色し、エフェクター細胞（ＣＡＲＴ／ＵＴ）とエフェクター：標的細胞比 ４：１、２：１、１：１および０．５：１で２４時間および４８時間共培養した。この期間の後、細胞をＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａで染色して生／死細胞を区別した。ＣＡＲＴ細胞１５２．３および１５３．５は、ＡＭＬ芽細胞に対して最も高い細胞傷害活性を示し、これはＵＴの効果と比較して統計的に有意であった。ＣＡＲＴ Ｈ３．５およびＧ７．５は、低い細胞傷害効果を示した。細胞傷害効果は、全てのＣＡＲＴにより誘導され、経時的に増加した（図２７）。

【0355】

本発明者らはまた、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ ｄｅ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ（ＨＣＢ）から得た初代Ｔ－ＡＬＬ患者サンプルに対するＣＡＲＴ８４細胞１５２．３、１５３．５、１．７．３、１．２２６．５および３．８９．５の細胞傷害性も評価した。実験はＡＭＬサンプルに関して上記したように行った。ＣＡＲＴ １５２．３、１５３．５および１．７．３の細胞傷害性は、ＣＡＲＴ １．２２６．５および３．８９．５より高かった（図２８）。

【0356】

実施例１４：ＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン産生
各ＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出能を評価するために、エフェクター－標的細胞共培養の上清を回収した。Ｒａｍｏｓ、ＭＯＬＭ－１３およびＭＯＬＴ－４を標的細胞として、２：１のエフェクター：標的細胞比で使用した。上清中のＩＦＮ－γ（図２９）、グランザイム－Ｂ（図３０）およびＴＮＦ－α（図３１）のレベルを、２４時間の共培養の後に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で決定した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を陰性対照として使用した（標的細胞と共培養）。４回の独立した実験を行った。ＩＦＮ－γおよびグランザイムＢは、細胞傷害性サイトカインであり、ＴＮＦ－αは炎症性サイトカインである。ＣＡＲＴ８４ Ｈ３．５は、Ｒａｍｏｓと共培養した場合、全ての供試ＣＡＲＴ８４のサイトカイン産生に最高値を示した。ＭＯＬＭ－１３およびＭＯＬＴ－４細胞と共培養した後のＣＡＲＴ８４ １．７．３のサイトカインプロファイルは、Ｈ３．５と同様であった。他の全ての供試ＣＡＲＴ細胞は、同様のレベルのサイトカインを産生した。これらの結果からは、Ｈ３．５と１．７．３の両ＣＡＲＴ細胞は、持続性のシグナル伝達、すなわちリガンド不在下で構成的または慢性的に活性化を示す可能性が示唆される。

【0357】

実施例１５：ＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖
各ＣＡＲＴ８４細胞の、抗原ＣＤ８４の結合実施例に特異的に増殖する能力を評価するために、ＣＦＳＥ増殖アッセイを行った。簡単に述べれば、０日目にＣＡＲＴ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥで染色した。０日目の細胞（ＵＴまたはＣＡＲＴ細胞）；培地で単独培養した４日目の細胞；ＩＬ－２（５０ＵＩ／ｍＬ）の非特異的刺激で刺激した４日目の細胞；および特異的抗原、すなわち、ＭＯＬＭ－１３細胞で、エフェクター：標的比 ０．５：１で刺激した４日目の細胞、の４つの条件を試験した。本発明者らは、ＣＤ８４抗原に曝露した場合、培地のみまたはＩＬ－２とともにインキュベートした場合よりも、ＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５および１．２２６．５がより増殖することを証明できた（図３２）。一方、ＣＡＲＴ Ｈ３．５、１．７．３および３．８９．５は、ＭＯＬＭ－１３またはＩＬ－２で刺激した際に同様に増殖したことから、これらのＣＡＲＴ８４は持続的シグナル伝達を示す可能性が示唆された。

【0358】

実施例１６：造血始原幹細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
ＣＤ８４は、数種の血液悪性腫瘍由来の悪性細胞上で発現する。これらにはＡＭＬがあり、ＣＤ８４の発現は、骨髄性白血病芽細胞間で、程度は低いが造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）間で共有されている。ＣＤ３３とＣＤ１２３も同様で、どちらもＡＭＬ治療用に開発中のＣＡＲＴ製剤の標的である。図３３はアフェレーシス産物からのＨＰＳＣにおけるＣＤ８４、ＣＤ３３およびＣＤ１２３の発現を示している。

【0359】

ＣＡＲＴ８４の潜在的な骨髄毒性を評価するために、ＨＰＳＣに対するそれらの細胞毒性を、２つの異なる供給源：臍帯血ユニット（ＣＢＵ、ＢＳＴ製）および同種幹細胞移植のためにＧ－ＣＳＦで動員された健康なドナーからのアフェレーシス産物（同じくＢＳＴ製）から得られたＣＤ３４^＋ＨＰＳＣで検討した。アフェレーシス産物からのＣＤ３４^＋細胞は、骨髄毒性を研究する理想的なモデルであるが、この種のオンターゲット／オフ腫瘍毒性を研究するためには、ＣＢＵからのＣＤ３４^＋細胞を用いるのがより一般的である。

【0360】

ＣＢＵからの精製ＣＤ３４^＋細胞を、エフェクター：標的細胞比 ４：１および２：１で、ＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５、１．７．３、１．２２９および３．８９．５と２４時間共培養した。ＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５、１．７．３および１．２２６．５は、ＣＢＵからのＣＤ３４^＋細胞に対して低～中の細胞傷害活性を示し、ＣＡＲＴ８４ ３．８９．５が最も高かった。図３４は、５回の独立した実験からの結果をまとめたものである。

【0361】

アフェレーシス産物由来のＣＤ３４^＋ＨＰＳＣに対する細胞傷害性アッセイでは、ＣＡＲＴ８４を作製するために３つの異なるドナーのバフィーコートを使用した。意外にも、これらの細胞に対するＣＡＲＴ８４の細胞傷害性は比較的低かった。４８時間後、ＣＡＲＴの細胞傷害性は増加したが、非特異的なＵＴの細胞傷害性も増加した（図３５）。

【0362】

実施例１７：ＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞毒性
ＣＤ８４はＴ細胞で発現することから、本発明者らはＣＡＲＴ８４のＴ細胞に対する潜在的毒性を調べた。Ｔ細胞はドナーの全血から直接単離し、その半分は活性化し、形質導入を行ってＣＡＲＴ細胞を生成し、残りの半分はＣＡＲＴ細胞が利用可能になるまで（すなわち６～７日間）凍結保存した。Ｔ細胞をＣＦＳＥで染色した後、ＣＡＲＴ８４と共培養した。図３６は、５回の独立した実験の結果を示す。ＣＡＲＴ８４ １５２．３、１５３．５、１．７．３および３．８９．５は、自身のＴ細胞に対して中程度の細胞傷害効果を示した。一方、１．２２６．５によって誘導された細胞傷害活性は低く、ＵＴと比較して統計的に有意ではなかった。

【0363】

どの特定のＴ細胞画分がＣＡＲＴ８４の標的とされているかをさらに理解するために、以下のＴ細胞サブセットナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、およびエフェクターＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞：に対する効果を分析した。異なるＴ細胞亜集団をフローサイトメトリーにより調べた：１）アッセイ前の標的Ｔ細胞、および２）図３７に示すように、異なるＣＡＲＴ８４と共培養した後の生存Ｔ細胞。ＣＤ８４はメモリーＴ細胞に多く発現していることから予想されるように、セントラルメモリーＴ細胞分画がＣＡＲＴ８４、特に１５２．３、１５３．５および１．７．３によって最も影響を受けることが観察された。さらに、全てのＴ細胞サブセットがＣＡＲＴ８４との共培養後も存在した。

【0364】

実施例１８：ＡＭＬモデルにおける抗ＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＧＦＰ－ホタルルシフェラーゼ（ＧＦＰｆｆＬｕｃ）を発現するように改変したＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬ細胞を用いて、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）免疫不全マウスでの３回の独立した実験で、数種のＣＡＲＴ８４細胞の有効性を試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性と安全性プロファイルが最も優れていたＣＡＲＴ８４が、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験用に選択された：１５２．３、１５３．５、Ｈ３．５、１．７．３および１．２２６．５。

【0365】

１回目と２回目の実験で、０日目に１×１０^６または０．２５×１０^６のＭＯＬＭ－１３ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞をそれぞれＮＳＧマウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した（図３８および３９）。６日後、４×１０^６～５×１０^６のＵＴ、ＣＡＲＴ８４細胞１５２．３、１５３．５、Ｈ３．５または１．７．３をマウスにｉ．ｖ．注射した。ＣＡＲＴ １５２．３、１５３．５および１．７．３で処置したマウスは、ＵＴで処置したマウスと比較して生存率に統計的に有意な増大を示した。

【0366】

図４０で示した実験において、０日目に１×１０^５のＭＯＬＭ－１３ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞をｉ．ｖ．注射し、２日後と１１日後にＵＴ、ＣＡＲＴ １５２．３、１５３．５および１．２２６．５をそれぞれ５×１０^６および３×１０^６細胞の用量で注射した。ＣＡＲＴ １５２．３および１５３．５は、生物発光によりモニタリングされる腫瘍進行を抑制し、これはＵＴで処置したマウスと比較して統計的に有意であった。さらに、ＣＡＲＴ １５２．３および１５３．５で処置したマウスは、ＵＴで処置したマウスと比較して生存率に統計的に有意な増大を示した。

【0367】

実験の終了時に安楽死させたマウスの骨髄および脾臓を回収し、腫瘍細胞（ＭＯＬＭ－１３－ＧＦＰｆｆＬｕｃ）、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞またはＣＡＲＴ細胞の存在を定量するためにフローサイトメトリーにより分析した。両実験で、ＣＡＲＴ８４処置マウスは、ＵＴ処置マウスと比較して骨髄および脾臓の両方で腫瘍細胞数が有意に少なかった（図３９Ｃおよび４０Ｃ）。ヒトＴ細胞は、ＵＴで処置したマウスの骨髄と脾臓の両方で増殖したが、これはおそらく異種移植片対宿主病（ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤ）のためであろう（図３９Ｄおよび４０Ｄ）。ＣＡＲＴ８４細胞は骨髄と脾臓の両方に見られ、ＣＡＲＴ８４ １５２．３の場合に最も顕著であった（図３９Ｅと４０Ｅ）。

【0368】

要約すると、１５２．３および１５３．５はＡＭＬの病勢進行を一貫して抑制することができ、処置した動物の生存率を増加させた。

【0369】

実施例１９：Ｔ－ＡＬＬモデルにおけるＣＡＲＴ８４のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃを発現するように改変したＭＯＬＴ－４ Ｔ－ＡＬＬ細胞を用い、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスでの２回の独立した実験でＣＡＲＴ８４細胞の有効性を調べた。以下のＣＡＲＴ８４を試験した：１５２．３、１５３．５、１．７．３および１．２２６．５。

【0370】

図４１に示した実験では、０日目にＮＳＧマウスに０．７５×１０^６のＭＯＬＴ－４ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞を注射し、５日後に３×１０^６のＣＡＲＴまたはＵＴをｉ．ｖ．注射した。ＣＡＲＴ８４ １５２．３は、生物発光によりモニタリングされる腫瘍進行を、ＵＴで処置したマウスと比較して統計的に有意に抑制した。さらに、ＣＡＲＴ １５２．３および１５３．５で処置したマウスは、ＵＴで処置したマウスと比較して生存に率統計的に有意な増大を示した。

【0371】

図４２に示す実験では、０日目に４×１０^５のＭＯＬＴ－４ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞をｉ．ｖ．注射し、２日後に５×１０^６のＣＡＲＴまたはＵＴを注射した。ＣＡＲＴ８４ １５２．３および１５３．５による処置は、生物発光によりモニタリングされる腫瘍進行の抑制と生存率の増大の両方にＵＴと比較して統計的に有意な有効性を惹起した。

【0372】

実験の終了時に安楽死させたマウスの骨髄および脾臓を、腫瘍細胞（ＭＯＬＴ－４）、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＡＲＴ細胞の存在を定量するためにフローサイトメトリーにより分析した。この場合、異なる群の動物の骨髄および脾臓に見られる腫瘍細胞の数に統計的に有意な違いは無かった（図４２Ｃ）。ヒトＴ細胞は、ＵＴで処置したマウスの骨髄と脾臓の両方で増殖したが、これはおそらくｘｅｎｏ－ＧｖＨＤのためであろう（図４２Ｄ）。ＣＡＲＴ細胞は、特に１５２．３細胞の場合、骨髄と脾臓の両方に見られた（図４２Ｅ）。

【0373】

ＣＡＲＴ８４ １５２．３および１５３．５は、両Ｔ－ＡＬＬ実験でＴ－ＡＬＬ疾患の抑制および生存の延長に最も有効であった。

【0374】

実施例２０：ヒト初代細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ傷害性
潜在的オンターゲット／オフ腫瘍傷害性を評価するため、ヒト初代細胞のＣＤ８４発現を調べ、その後ＣＡＲＴ８４によって誘導される潜在的な細胞傷害性効果を調べた。以下のヒト細胞：ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト小気道上皮細胞（ＨｓａＥｐＣ）、ヒト心筋細胞（ＨＣＭ）、ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥｐＣ）およびヒト子宮線維芽細胞（ＨＵＦ）を検討した。フローサイトメトリーを用いて、これらの細胞の表面にはＣＤ８４が発現していないことを証明することができた（図４３）。

【0375】

ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイで、本発明者らは、ＣＡＲＴ８４ １５２．３および１５３．５がＨｓａＥｐＣ、ＨＣＭ、ＨＲＥｐＣまたはＨＵＦに対して細胞傷害性を示さなかったことを見出した。しかしながら、ＨＣＡＥＣに対しては、ＣＤ８４発現がないにもかかわらずいくらかの細胞傷害性効果が見られ、この効果は抗原特異的でないことが示唆された。このことを確認するために、本発明者らは、ＣＡＲＴ８４の細胞傷害活性を、ＣＤ１２３（この抗原が内皮細胞の表面で発現されるため）を標的とするＣＡＲＴの細胞傷害活性と比較した。ＣＤ１２３に対するＣＡＲＴ細胞により誘導された細胞傷害性は、ＣＡＲＴ８４ １５２．３または１５３．５により誘導されたものより有意に高かった（図４４）。

【0376】

実施例２１：実施例９～２０の方法
ＣＤ１２３ ＣＡＲの作製
本発明者らは、ＵＳ２０１４／０２７１５８２からのＩＬ３ｓｃｆｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ）－ＣＤ２８ｇｇ－ζ（２６２９２）ＣＡＲに基づいて抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ構築物を作製した。ＣＡＲ配列を、ＥＦ１αプロモーターの制御下にシグナルペプチド（ＧＭＣＳＦＲα）、２６２９２ ｓｃＦｖ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ）、ＩｇＧ４－ＦｃヒンジおよびＣＤ２８膜貫通領域、共刺激ドメインＣＤ２８およびシグナル伝達ドメインＣＤ３－ζを包含する第三世代レンチウイルスベクターｐＣＣＬ(Dull et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 1998: 72:8463-8471)にクローニングした。

【0377】

フローサイトメトリー
Ｔ細胞の陽性ＣＡＲ画分をビオチン－ＳＰ（ロングスペーサー）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはビオチンＳＰ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２－フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出し、洗浄した後、ＢＶ４２１／ＰＥ結合ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および以下に記載するような各タンパク質パネルを調べるために必要な抗体とともにインキュベートした。

【0378】

ヒトタンパク質に対する以下のｍＡｂを用いてＣＡＲ Ｔ細胞表現型を調べた：ＣＤ１９７－ＢＶ５１０（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－Ｐｅｃｙ７、ＣＤ８－ＡＰＣＨ７、ＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。

【0379】

ヒトタンパク質に対する以下のｍＡｂを用いて、ＡＭＬ／Ｔ－ＡＬＬサンプル中に存在する種々の集団細胞を調べた：ＣＤ１１－ＡＰＣ、ＣＤ１９－Ｆｉｔｃ、ＨＬＡ－ＤＲ－Ａ４５０、ＣＤ４５－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ３４－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＡＰＣＨ７、ＣＤ３３－Ｆｉｔｃ、ＣＤ１４－Ｆｉｔｃ、ＣＤ１４－ＡＰＣＨ７、ＣＤ１３－ＰＥ、ＣＤ１３－ＢＶ４２１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８４－ＡＰＣ、ＣＤ８４－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５－Ａ７５０、ＣＤ１１７－ＰｅＣｙ７（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ１２３－ＰＥＣｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

【0380】

ヒトタンパク質に対する以下のｍＡｂを用いて、末梢血中に存在する種々の単核細胞集団を調べた：ＣＤ３－ＢＶ４２１、ＣＤ１４－ＡＰＣＨ７、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、ＣＤ３３－ＡＰＣ、ＣＤ３４－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ３８－ＡＰＣ、ＣＤ８４－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１２３－ＰＥＣｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨＬＡ－ＤＲ－ＢＶ４５０（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。

【0381】

タンパク質に対する以下のｍＡｂをＭＯＬＭ－１３モデルで行うｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用した：抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣＨ７、抗ヒトＣＤ３３－ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗マウスＣＤ４５－ＰＥＣｙ７、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。タンパク質に対する以下のｍＡｂをＭＯＬＴ－４モデルで行うｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用した：抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗マウスＣＤ４５ Ｐｅ－Ｃｙ７、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。

【0382】

全てのサンプルをＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）４Ｌ（ＤＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）フローサイトメーターに流し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．８．０ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。

【0383】

ＡＭＬおよびＴ－ＡＬＬ患者からの初代白血病芽細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
初代芽細胞をＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、エフェクター細胞（ＣＡＲＴ／ＵＴ）と、エフェクター：標的細胞比 ４：１、２：１、１：１および０．５：１で２４時間および４８時間、共培養した。この期間の後、共培養細胞をＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色して生／死細胞を区別した。残留している生芽細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより決定し、下式：生細胞％＝１００×（ｘ時点のＣＡＲＴ細胞とともにあるネガティブＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ陽性ＣＦＳＥ細胞の数／ｘ時点のネガティブＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ陽性ＣＦＳＥ細胞単独の数）を用いて計算した。

【0384】

ＣＤ３４^＋細胞の単離
造血始原幹細胞（ＣＤ３４^＋）は、臍帯血ユニット（ＣＢＵ、血液バンクＢａｎｃ ｄｅ Ｓａｎｇ ｉ Ｔｅｉｘｉｔｓ ｄｅ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、ＢＳＴ）および同種幹細胞移植のためにＧ－ＣＳＦで改変した健常ドナーからのアフェレーシス産物（これもＢＳＴから入手）から入手した。

【0385】

ＣＤ３４^＋細胞は、まず、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、次に、ヒトＣＤ３４マイクロビーズキットを用いた磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、陽性選択）によるＣＤ３４^＋造血始原幹細胞の精製によって、ＣＢＵから単離した。アフェレーシス産物からＣＤ３４^＋細胞を単離するために、細胞をそのままＣＤ３４磁性ビーズで精製した。

【0386】

ＣＤ３４^＋細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
ＣＤ３４^＋細胞に対するＣＤ８４ ＣＡＲＴ細胞傷害性を評価するために、ＣＤ３４^＋細胞をエフェクター細胞（ＣＡＲＴ／ＵＴ）と、エフェクター：標的細胞比 ４：１、２：１で、２４時間および４８時間、共培養した。この期間の後、共培養細胞をＡＰＣ結合ＣＤ３およびＰＥ結合ＣＤ３４抗体で染色してエフェクターを標的細胞から区別し、ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａで標識して生／死細胞を区別した。

【0387】

精製Ｔ細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
Ｔ細胞は、ドナーバフィーコートからのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離中に、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）からの免疫細胞単離試薬を用いて単離した。このプロセスで得られたＴ細胞の半分を活性化し、形質導入を行ってＣＡＲＴ細胞を生成し、残りの半分は、標的細胞として使用するために、ＣＡＲＴ細胞が利用可能になるまで（すなわち８日間）凍結保存した。細胞傷害性アッセイを行うために、Ｔ細胞を解凍し、ＣＦＳＥで染色した後、ＣＡＲＴ細胞と、種々のエフェクター：標的比で共培養した。２４時間後、エフェクターと標的細胞をどちらも固定し、ＬＩＶ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ細胞染色キットで染色した。

【0388】

残留している生Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーで決定し、下式：生細胞の％＝１００×（ｘ時点のＣＡＲＴ細胞とともにあるネガティブＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ陽性ＣＦＳＥ細胞の数／ｘ時点のネガティブＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ陽性ＣＦＳＥ細胞単独の数）を用いて計算した。

【0389】

残留する生Ｔ細胞サブセットを調べるために、フローサイトメトリーの節に説明したように、これらを表現型パネルからのヒトｍＡｂでも染色した。

【0390】

ｉｎ ｖｉｖｏ有効性アッセイ
８～１２週齢の非糖尿病－Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を飼育し、バルセロナ大学医学健康科学部の動物施設で病原体のない条件下で収容した。０．１～１×１０^６個のＧＦＰｆｆＬｕｃ発現ＭＯＬＭ－１３またはＧＦＰｆｆＬｕｃ－ＭＯＬＴ－４細胞を生理食塩水に再懸濁し、０日目に各ＮＳＧマウスの静脈内（ＩＶ）に注入した投与した。腫瘍細胞注入から２～９日後に、３～５×１０^６のＵＴまたはＣＤ８４ ＣＡＲＴを静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。腫瘍の進行は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ５０ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて生物発光によりモニタリングした。生物発光を測定するために、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｒｅｆ．１２２７９９）１００ｕＬを各マウスの腹腔内に投与し、腫瘍量を毎週モニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて可視化し、全発光束を算出した。マウスは、人道的エンドポイント基準の徴候を表した時点で安楽死させた。骨髄と脾臓を取り出し、フローサイトメトリーで腫瘍細胞、Ｔ細胞およびＣＡＲＴ細胞の存在を定量した。

【0391】

全ての手順は、バルセロナ大学医学・健康科学部の所内動物飼育委員会に従って行われた。

【0392】

初代ヒト細胞
以下の初代ヒト細胞：ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト小気道上皮細胞（ＨＳＡＥｐＣ）、ヒト子宮線維芽細胞（ＨＵＦ）、ヒト心筋細胞（ＨＣＭ）およびヒト腎臓上皮細胞（ＨＲＥｐＣ）をＰｒｏｍｏＣｅｌｌから取得した。細胞は、データシートに示されるように、特定の培地および添加剤（これもＰｒｏｍｏＣｅｌｌから）とともに３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0393】

接着細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
接着細胞に対するＣＡＲＴ細胞の傷害性を評価するために、インピーダンスにより生細胞増殖のリアルタイム測定を可能にするｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置を使用した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ用のＲＴＣＡ Ｅ－プレート（１６ウェル）に標的細胞を播種し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡマルチプルプレートモニタリングシステムを用いて２４時間、細胞指数をモニタリングした。この時点で、１００ｍＬの増殖培地またはＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞またはＣＡＲＴ細胞を４：１のエフェクター：標的比で）を各ウェルに加えた。各ウェルから取得したデータ（細胞指数）を１に対して正規化し、７２時間、細胞増殖をモニタリングした。データは、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｉｔｅ ２．０．０．１３０１を用いて解析した。

【0394】

実施例２２：Ｂ細胞リンパ腫モデルにおけるＣＡＲＴ８４のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
いくつかのＣＡＲＴ８４細胞の有効性を、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ実験において、ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃを発現するように改変したＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）細胞を用いて調べた。以下のＣＡＲＴ８４を調べた：１５２．３、１５３．５およびＨ３．５。

【0395】

図４５に示される実験では、４×１０^５個のＲａｍｏｓ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞を０日目にＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。２日後に、５×１０^６個のＣＡＲＴまたはＵＴ細胞をｉ．ｖ．注射した。ＣＡＲＴ １５２．３、１５３．５およびＨ３．５で処置したマウスは、より遅い増殖傾向を示した（図４５Ａ）。実験の終了時に安楽死させたマウスの骨髄を回収し、腫瘍細胞の存在を定量するためにフローサイトメトリーにより解析した。ＣＡＲＴ８４処置マウスは、ＵＴ処置マウスと比較した場合に、骨髄中のＲａｍｏｓ ＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ細胞の数が統計的に有意に低かった（図４５Ｂ）。

【0396】

実施形態
以下、本発明の様々な特徴および実施形態を、以下の番号を付けた段落を参照して説明する。

【0397】

１．ａ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号１）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＶＳＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＲ（配列番号２）；およびＣＤＲ３－ＧＴＧＲＦＡＹ（配列番号３）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６）；またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＬＧ（配列番号７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号８）；およびＣＤＲ３－ＹＥＧＧＹＹＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号１０）；ＣＤＲ２－ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号１１）；およびＣＤＲ３－ＱＱＳＫＡＶＰＲＴ（配列番号１２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１３）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１４）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号１５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
配列：ＣＤＲ１－ＮＩＥＳＫＤ（配列番号１６）；ＣＤＲ２－ＤＤＡ（配列番号１７）；およびＣＤＲ３－ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（配列番号１８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｄ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＰ（配列番号１９）；ＣＤＲ２－ＩＳＹＨＧＲＮＫ（配列番号２０）；およびＣＤＲ３－ＡＲＤＲＤＡＴＰＧＧＴＧＶＧＮＨＧＭＡＶ（配列番号２１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＬＨＳＳＧＹＮＹ（配列番号２２）；ＣＤＲ２－ＭＧＳ（配列番号２３）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＬＱＴＰＰＴ（配列番号２４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｅ）配列：ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＤＮＡ（配列番号２５）；ＣＤＲ２－ＩＳＧＴＧＲＴＴ（配列番号２６）；およびＣＤＲ３－ＡＫＷＤＣＳＤＧＲＣＹＷＡＹ（配列番号２７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＱＳＬＶＹＳＤＧＤＴＹ（配列番号２８）；ＣＤＲ２－ＫＶＳ（配列番号２９）；およびＣＤＲ３－ＭＱＧＴＨＷＰＰＮＴ（配列番号３０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｆ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号３１）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号３２）；およびＣＤＲ３－ＭＲＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＬＡ（配列番号３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＴＰＦＴ（配列番号３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｇ）配列：ＣＤＲ１－ＳＹＷＩＮ（配列番号３７）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＬＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３８）；およびＣＤＲ３－ＳＧＧＹＬＧＹ（配列番号３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号４０）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号４１）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｈ）配列：ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＧ（配列番号４３）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号４４）；およびＣＤＲ３－ＳＴＴＹＹＳＳＹＷＣＦＤＶ（配列番号４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＡＮＹＬＡ（配列番号４６）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号４７）；およびＣＤＲ３－ＱＮＤＨＳＹＰＦＴ（配列番号４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｉ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＭＳ（配列番号４９）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号５０）；およびＣＤＲ３－ＰＧＰＴＶＶＡＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号５２）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＳＲＦＳ（配列番号５３）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｊ）配列：ＣＤＲ１－ＲＹＷＩＮ（配列番号５５）；ＣＤＲ２－ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号５６）；およびＣＤＲ３－ＤＴＴＩＡＹ（配列番号５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＴＴＳＲＹＳＹＭＨ（配列番号５８）；ＣＤＲ２－ＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号５９）；およびＣＤＲ３－ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｋ）配列：ＣＤＲ１－ＧＹＮＭＮ（配列番号１３１）；ＣＤＲ２－ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３２）；およびＣＤＲ３－ＧＬＬＳＧＳＦＰＹ（配列番号１３３）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３４）；ＣＤＲ２－ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１３５）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＧＳＰＬＴ（配列番号１３６）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｌ）配列：ＣＤＲ１－ＲＳＷＭＳ（配列番号１３７）；ＣＤＲ２－ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号１３８）；およびＣＤＲ３－ＦＹＤＧＹＳＩＹＷＹＦＤＶ（配列番号１３９）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＤＴＹＬＥ（配列番号１４０）；ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４１）；およびＣＤＲ３－ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１４２）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｍ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４３）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＲＳ（配列番号１４４）；およびＣＤＲ３－ＩＡＶＴＹＦＦＤＦ（配列番号１４５）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＲＡＳＥＮＩＦＳＳＦＡ（配列番号１４６）；ＣＤＲ２－ＮＡＲＴＬＡＥ（配列番号１４７）；およびＣＤＲ３－ＱＨＨＹＡＳＰＦＴ（配列番号１４８）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｎ）配列：ＣＤＲ１－ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１４９）；ＣＤＲ２－ＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号１５０）；およびＣＤＲ３－ＭＳＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号１５１）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＬＦＴＳＶＡ（配列番号１５２）；ＣＤＲ２－ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１５３）；およびＣＤＲ３－ＱＱＨＹＳＳＰＦＴ（配列番号１５４）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｏ）配列：ＣＤＲ１－ＩＹＡＭＮ（配列番号１５５）；ＣＤＲ２－ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＲＦＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１５６）；およびＣＤＲ３－ＰＬＲＳＹＦＳＭＤＹ（配列番号１５７）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
配列：ＣＤＲ１－ＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳ（配列番号１５８）；ＣＤＲ２－ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号１５９）；およびＣＤＲ３－ＧＱＴＹＳＹＰＷＴ（配列番号１６０）、またはそれぞれ３個までのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するその変異体を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含んでなる抗原結合ドメイン。

【0398】

２．ａ）配列番号６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６２または１０８の配列を有するＶＬドメイン；
ｂ）配列番号６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６４または１０９の配列を有するＶＬドメイン；
ｃ）配列番号６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６の配列を有するＶＬドメイン；
ｄ）配列番号６８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６９の配列を有するＶＬドメイン；
ｅ）配列番号７１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７２の配列を有するＶＬドメイン；
ｆ）配列番号７４の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７５の配列を有するＶＬドメイン；
ｇ）配列番号７６の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７７の配列を有するＶＬドメイン；
ｈ）配列番号７８の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号７９の配列を有するＶＬドメイン；
ｉ）配列番号８０の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８１の配列を有するＶＬドメイン；または
ｊ）配列番号８２の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８３の配列を有するＶＬドメイン；
ｋ）配列番号１６１の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６２の配列を有するＶＬドメイン；
ｌ）配列番号１６３の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６４の配列を有するＶＬドメイン；
ｍ）配列番号１６５の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６６の配列を有するＶＬドメイン；
ｎ）配列番号１６７の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１６８の配列を有するＶＬドメイン；または
ｏ）配列番号１６９の配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１７０の配列を有するＶＬドメイン；
またはそれぞれそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体
を含んでなる、段落１の抗原結合ドメイン。

【0399】

３．段落１または２の抗原結合ドメインを含んでなる抗体。

【0400】

４．場合により、
ａ）ＣＡＲがｓｃＦｖ ＣＡＲであり；
ｂ）ＣＡＲがＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含み；
ｃ）ＣＡＲが４－１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含み；かつ／または
ｄ）ＣＡＲがＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含んでなる、
段落１または２の抗原結合ドメインを含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【0401】

５．段落１もしくは２の抗原結合ドメイン、段落３の抗体、または段落４のＣＡＲをコードする１以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。

【0402】

６．段落５のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。

【0403】

７．段落５のポリヌクレオチドまたは段落６のベクターを含んでなる細胞。

【0404】

８．段落１もしくは２の抗原結合ドメイン、または段落４のＣＡＲを含んでなる細胞。

【0405】

９．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、第１のＣＡＲが段落４のＣＡＲであり、場合により、第２のＣＡＲが抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ；または抗ＣＤ７ ＣＡＲである、細胞。

【0406】

１０．Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり、場合により、自己または同種細胞である、段落７～９のいずれか一項に記載の細胞。

【0407】

１１．段落１もしくは２の抗原結合ドメイン、段落３の抗体、段落４のＣＡＲ、段落５のポリヌクレオチド、段落６のベクター、または段落７～１０のいずれか１つの細胞を含んでなる医薬組成物。

【0408】

１２．療法、場合により癌の治療である療法において使用するための、段落１もしくは２の抗原結合ドメイン、段落３の抗体、段落４のＣＡＲ、段落５のポリヌクレオチド、段落６のベクター、段落７～１０のいずれか１つの細胞、または段落１１の医薬組成物。

【0409】

１３．癌が血液悪性腫瘍、場合により、ＣＤ８４を発現する血液悪性腫瘍であり、および／または癌が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄増殖性症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、樹状細胞新生物および組織球性肉腫からなる群から選択される、段落１２に記載の使用のための抗原結合ドメイン、抗体、ＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物。

【0410】

１４．サンプルのＣＤ８４発現レベルを決定するため、場合により、対象由来のサンプルのＣＤ８４発現レベルを分析するための、段落１もしく２の抗原結合ドメイン、または段落３の抗体の使用。

【0411】

１５．抗ＣＤ８４ ＣＡＲまたは抗体による治療に適した対象を特定するための方法であって、対象から単離されたサンプルのＣＤ８４発現レベルを決定することを含み、ＣＤ８４発現レベルが段落１もしくは２の抗原結合ドメイン、または段落３の抗体を用いて決定される、方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【配列表】

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【国際調査報告】