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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】タンパク質発現を改善する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20241226BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024541634
(86)(22)【出願日】2023-01-10
(85)【翻訳文提出日】2024-07-16
(86)【国際出願番号】 IB2023050214
(87)【国際公開番号】W WO2023135519
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】63/299,303
(32)【優先日】2022-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391008951
【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ダン，サラ
(72)【発明者】
【氏名】ギブソン，スザンヌ
(72)【発明者】
【氏名】ケルソール，エマ
(72)【発明者】
【氏名】ハットン，ダイアン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA20
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB40
4B065BC50
4B065BD50
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】
本開示は、免疫グロブリン重鎖中の１又は２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。この核酸は、免疫グロブリン発現を増加させるのに有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されている核酸であって、前記免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸。
【請求項2】
前記リーダーイントロン又は前記ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
前記リーダーイントロンが欠失している、請求項２に記載の核酸。
【請求項4】
前記ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している、請求項２に記載の核酸。
【請求項5】
免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されている核酸であって、前記免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸。
【請求項6】
免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されている核酸であって、前記免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸。
【請求項7】
前記核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と共に発現された場合に、前記免疫グロブリン重鎖の全てのイントロン配列を含む核酸と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項8】
前記核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と共に発現された場合に、前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン配列を含まない核酸と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項9】
前記核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と共発現された場合に、免疫グロブリン断片を発現しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項10】
前記免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である、請求項７～９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項11】
前記核酸は、コドン最適化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項12】
前記発現された免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する、請求項７～１１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項13】
前記免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項14】
前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項16】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項17】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項18】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項19】
前記宿主細胞は、真核細胞である、請求項１７又は１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
前記真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項21】
免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及び前記細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；前記宿主細胞は、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖コード核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
【請求項22】
免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及び前記細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；前記宿主細胞は、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖コード核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
【請求項23】
免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及び前記細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；前記宿主細胞は、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖コード核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない、方法。
【請求項24】
前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸は、コドン最適化されている、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記発現された免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記発現された免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
クローンのプールから産生された前記発現された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
最高発現クローンから産生された前記免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記宿主細胞は、真核細胞である、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記真核細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
２０２３年１月１２日に出願された本出願は、２０２２年１月１３日に出願された下記の米国仮出願第６３／２９９，３０３号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張している。上記に列挙された出願の各々は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２０２３年１月１２日に出願された本出願は、２０２２年１月１３日に出願された下記の米国仮出願第６３／２９９，３０３号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張している。上記に列挙された出願の各々は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、目的のポリペプチドを発現する改善型の方法に関する。免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列と、イントロン欠失とを含む核酸は、免疫グロブリンの細胞比生産性を向上させるのに有用である。
【背景技術】
【0003】
ＤＮＡは、イントロン及びエクソンの配列で構成されており、イントロンは、スプライシングによるｍＲＮＡプロセシング中に除去される。このプロセスは、核膜孔複合体を通過するｍＲＮＡ核外輸送と密接に関連している。この輸送は、発現の基本であり、文献に詳細に記載されている。非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照されたい。
【0004】
発現ベクター中にコードされたコドン最適化重鎖定常領域内にイントロンが存在すると、この領域にイントロンが存在しない同じヌクレオチド配列と比較して、回収力価（ｈａｒｖｅｓｔ ｔｉｔｅｒ）が向上することが認められている。しかしながら、イントロンを含有する発現ベクターを使用することに伴うリスクは、抗体又は免疫グロブリン等の目的のタンパク質の発現中に、イントロン保持（ｉｎｔｒｏｎ－ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）現象及びミススプライシング現象が発生し、精製中に除去する必要のある不要な異常型タンパク質種が得られる可能性があることである。これにより、精製プロセスに余分な複雑性が追加され、下流プロセスの間にこれらの別の種を除去し得ない場合に、バッチ間変動が生じる可能性がある。
【0005】
重鎖定常領域のイントロンを含有する非コドン最適化配列を使用すると、重鎖定常領域中のスプライスバリアントの発生を排除し得ることが示されている。コドン最適化から発生するヌクレオチド配列の変化は、隠れたスプライシングを誘導してこのような別の種をもたらすと考えられる。また、イントロンの各々を個別に除去すると（それにより、３つのイントロンの内の２つを残したままにする）、回収力価における驚くべき向上が見られることが示されている。
【0006】
免疫グロブリン重鎖定常領域から１つ又は２つのイントロンを除去すると、イントロン保持現象及びミススプライシング現象のリスクを低減し得、一方で免疫グロブリン発現を増加させ得る。これは、結果として発現ベクターの新規な生成につながり、抗体ベースの又は免疫グロブリンベースの組換えタンパク質の産生中に異常型タンパク質種が生成されるリスクを低く抑える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｋｏｈｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：７６１－７７３（２００７）
【非特許文献2】Ｂｊｏｒｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２：４７－５４（２０１４）
【非特許文献3】Ｒｅｅｄ，Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：３２６－３３１（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は、全体として、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されている核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸を対象とする。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0009】
本開示はまた、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されている核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸も対象とする。
【0010】
本開示はまた、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されている核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸も対象とする。
【0011】
一態様では、核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と共に発現された場合に、免疫グロブリン重鎖の全てのイントロン配列を含む核酸と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。別の態様では、核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と共に発現された場合に、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン配列を含まない核酸と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。別の態様では、核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と共発現された場合に、免疫グロブリン断片を発現しない。別の態様では、免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である。別の態様では、核酸は、コドン最適化されている。別の態様では、発現された免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。別の態様では、免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである。別の態様では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【0012】
別の態様では、本開示は、本開示の核酸を含むベクター又は発現ベクターを対象とする。別の態様では、本開示は、本開示のベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。一態様では、宿主細胞は、真核細胞であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0013】
本開示はまた、全体として、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0014】
本開示はまた、全体として、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。
【0015】
本開示はまた、全体として、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。
【0016】
本開示はまた、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0017】
本開示はまた、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。
【0018】
本開示はまた、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸であり、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。
【0019】
本開示はまた、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない、方法も対象とする。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0020】
本開示はまた、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない、方法も対象とする。
【0021】
本開示はまた、免疫グロブリンを製造する方法であって、宿主細胞を、培地中で及びこの細胞が免疫グロブリンを発現する条件下で培養することを含み；この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖コード核酸であり、この免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない、方法も対象とする。
【0022】
一態様では、免疫グロブリン重鎖コード核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。別の態様では、免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である。別の態様では、免疫グロブリン重鎖コード核酸は、コドン最適化されている。別の態様では、発現された免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。別の態様では、発現された免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）の免疫グロブリンである。
【0023】
一態様では、クローンのプールから産生された発現された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。別の態様では、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。
【0024】
一態様では、宿主細胞は、真核細胞である。別の態様では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ＭＡｂ１の高速サイズ排除クロマトグラフ、及び産生された免疫グロブリンバリアントの描写図を示す。
【図2】［図２Ａ－２Ｂ］図２Ａは、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）及びコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の略図を示す。図２Ｂは、ｇＤＮＡヌクレオチド配列又はｃＤＮＡヌクレオチド配列のいずれかを用いたＭＡｂ２産生の１４日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図3】［図３Ａ－３Ｂ］図３Ａは、免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有しないｇＤＮＡ、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しないｇＤＮＡ、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３を有しないｇＤＮＡ、及びＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡの略図を示す。図３Ｂは、下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有しないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３を有しないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡの各々を使用したＭＡｂ２産生の１３日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図4】［図４Ａ－４Ｄ］図４Ａは、下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有しないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３を有しないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡの各々に関する平均生細胞数（ＶＣＮ）（×１０６／ｍＬ）を表すグラフを示す。図４Ｂは、下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有しないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３を有しないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡの各々に関する細胞生存率（％）を表すグラフを示す。図４Ｃは、下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有しないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３を有しないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡの各々に関する生細胞濃度積分値（ＩＶＣ）（１０９個の細胞 日／Ｌ）を表すグラフを示す。図４Ｄは、下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有しないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３を有しないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡの各々に関する細胞生産性（ｑＰ）（ｐｇ／（細胞 日））を表すグラフを示す。
【図5】［図５Ａ－５Ｄ］図５Ａは、下記のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、並びに（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（コドン最適化）の各々を用いたＭＡｂ２産生の１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。図５Ｂは、下記のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（コドン最適化）、並びに（９）ＭＡｂ３（陽性対照）の各々に関する平均生細胞数（ＶＣＮ）（×１０６／ｍｌ）を表すグラフを示す。図５Ｃは、下記のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（コドン最適化）、並びに（９）ＭＡｂ３（陽性対照）の各々の各々に関する生細胞濃度積分値（ＩＶＣ）（１０９個の細胞 時／Ｌ）を表すグラフを示す。図５Ｄは、下記のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、並びに（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（コドン最適化）の各々に関する細胞生産性（ｑＰ）（ｐｇ／（細胞 日））を表すグラフを示す。
【図6】［図６Ａ－６Ｂ］図６Ａは、下記のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置にイントロン３を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置に、修飾されたイントロン３ヌクレオチド配列を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３の位置にイントロン１を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（９）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロン及び野生型ＩｇＧ１を有する非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（１０）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３並びに野生型ＩｇＧ１を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（１１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２並びに野生型ＩｇＧ１を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、並びに（１２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ｇＤＮＡ及び野生型ＩｇＧ１の略図を示す。図６Ｂは、下記のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置にイントロン３を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置に、修飾されたイントロン３ヌクレオチド配列を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３の位置にイントロン１を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にいかなるイントロンも有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（９）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロン及び野生型ＩｇＧ１を有する非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（１０）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３並びに野生型ＩｇＧ１を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（１１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２並びに野生型ＩｇＧ１を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、並びに（１２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ｇＤＮＡ及び野生型ＩｇＧ１を用いたＭＡｂ２産生の１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図7】ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、並びにＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しない非コドン最適化ｇＤＮＡの略図を示す。
【図8】ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、並びにＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しない非コドン最適化ｇＤＮＡの１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図9】ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ、並びにＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しない非コドン最適化ｇＤＮＡの力価レベルの経時変化を表すグラフを示す。
【図10】免疫グロブリン重鎖定常領域のゲノムＤＮＡ配列の略図を示す。
【図11】［図１１Ａ－１１Ｂ］図１１Ａは、ＭＡｂ２の下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であり、星は、（左から右へ）下記を表す：（ｉ）リーダーイントロン、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１イントロン、（ｉｉｉ）重鎖定常領域のイントロン１、（ｉｖ）重鎖定常領域のイントロン２、及び（ｖ）重鎖定常領域のイントロン３；（２）（ｉ）リーダーイントロン及び（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１イントロンを有する非コドン最適化ｇｃＤＮＡ；並びに（３）リーダーイントロンのみを有する非コドン最適化ｇｃＤＮＡの略図を示す。図１１Ｂは、図１１Ａのコンストラクトに関する１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）のグラフを示す。
【図12】［図１２Ａ－１２Ｂ］図１２Ａは、下記のコンストラクトＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロンを有する非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のみを有する非コドン最適化ｇＤＮＡ；及び（３）免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しない非最適化ｇＤＮＡの略図を示す。図１２Ｂは、図１２Ａのコンストラクトの逆転写酵素ＰＣＲ産物を分離するアガロースゲルを示す。
【図13】［図１３Ａ－１３Ｃ］図１３Ａは、ＭＡｂ２の下記のコンストラクト：（１）星が、（左から右へ）（ｉ）リーダーイントロン、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１イントロン、（ｉｉｉ）重鎖定常領域のイントロン１、（ｉｖ）重鎖定常領域のイントロン２、及び（ｖ）重鎖定常領域のイントロン３を表す、免疫グロブリン重鎖の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）；（２）（ｉ）リーダーイントロン、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び（ｉｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ；（３）（ｉ）リーダーイントロン及び（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１イントロンを有する非コドン最適化ｇｃＤＮＡ；（４）リーダーイントロンを有する非コドン最適化ｇｃＤＮＡ；（５）免疫グロブリン重鎖イントロンを有しない非コドン最適化ｇｃＤＮＡ；並びに（６）免疫グロブリン重鎖のイントロン１のみを有する非コドン最適化ｇＤＮＡの略図を示す。図１３Ｂは、図１３Ａのコンストラクトの１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）のグラフを示す。図１３Ｃは、図１３Ａのコンストラクトの細胞生産性（ｑＰ）（ｐｇ／（細胞 日））を表すグラフを示す。
【図14】［図１４Ａ－１４Ｃ］図１４Ａは、Ｍａｂ２の下記のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域からの非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）；（２）免疫グロブリン重鎖定常領域からのイントロン２及び３を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ；（３）免疫グロブリン重鎖定常領域からのイントロン１及び２を有しない非コドン最適化ｇＤＮＡ；（４）免疫グロブリン重鎖定常領域からのイントロン１～３を有しない非コドン最適化ｇｃＤＮＡ；（５）免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロン１の位置でイントロン３を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ；（６）免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロン１の位置で修飾イントロン３ヌクレオチド配列を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ；並びに（７）免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロン３の位置でイントロン１を有する非コドン最適化ｇＤＮＡの略図を示す。図１４Ｂは、図１４Ａのコンストラクトの逆転写酵素ＰＣＲ産物のアガロースゲル分離を示す。図１４Ｃは、図１４Ａのコンストラクトに関する１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本開示の理解を促進するために、複数の用語及び表現が下記に定義される。
【0027】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」、「抗体」、及び「複数の抗体」という用語は、専門用語であり、本明細書において互換的に使用され得、抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を有する分子又は分子の複合体を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」、「抗体」、及び「複数の抗体」という用語は、専門用語であり、本明細書において互換的に使用され得、抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を有する分子又は分子の複合体を指す。
【0028】
抗体として、例えば、モノクローナル抗体、組換えで産生される抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、表面再構成抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖分子及び２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖のペア、細胞内抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ科抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗－抗Ｉｄ抗体を含む）、二重特異性抗体、及び多特異性抗体が挙げられ得る。ある特定の態様では、本明細書で説明されている抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、若しくはＩｇＡ２）、又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ）のものであり得る。ある特定の態様では、本明細書で説明されている抗体は、ＩｇＧ抗体、又はそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４）、又はそのサブクラスである。特定の態様では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の特定の態様では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、例えば、免疫グロブリンであるヒトモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、又はＩｇＧ４抗体である。
【0029】
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」という用語、及び類似の用語は、抗原に対する特異性を抗体分子に付与するアミノ酸残基を含む抗体分子の部分（例えば相補性決定領域（ＣＤＲ））を指す。抗原結合領域は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、又はハムスター）及びヒト等の任意の動物種に由来し得る。
【0030】
「モノクローナル」抗体は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、様々な抗原決定基に対して向けられる様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル」抗体という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子及び完全長免疫グロブリン分子の両方、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル」抗体は、下記に限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物によるものを含むいくつもの方法で作製されるような抗体を指す。
【0031】
「キメラ」抗体という用語は、アミノ酸配列が２種以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖双方の可変領域は、所望される特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）の１つの種に由来する抗体の可変領域に相当する一方、定常領域は、その種における免疫応答を誘発することを回避するために、別の種（通常ヒト）に由来する抗体中の配列に相同である。
【0032】
「ヒト化」抗体という用語は、最小限の非ヒト（例えばマウスの）配列を含有する非ヒト（例えばマウスの）抗体の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲの残基によって置き換えられている（「ＣＤＲグラフト化」）ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８））。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられている。そのヒト化抗体は、Ｆｖフレームワーク領域内での、及び／又は置き換えられた非ヒト残基内でのさらなる残基の置換によってさらに修飾されて、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を精密化して最適化し得る。概して、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する一方、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含み得る。ヒト化抗体を生成するのに用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９－９７３（１９９４）及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５－９０４（１９９６）で説明されている。
【0033】
「表面再構成抗体」又は「複数の表面再構成抗体」という用語は、組換えＦＶのＶ領域の表面で利用可能なアミノ酸のみをヒト化することによってヒト抗体に似るように再設計されているマウス抗体を意味する。マウスのモノクローナル抗体を表面再構成してその免疫原性を低減すると、天然のフレームワーク－ＣＤＲの相互作用は保持されるため、元のモノクローナル抗体の結合力を再構成型において維持するのに有益であり得る。
【0034】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するアミノ酸配列を有する抗体を意味し、そのような抗体は、当技術分野で既知の任意の技術を使用して作製される。
【0035】
可変領域は、典型的には、抗体の一部分、一般に、軽鎖又は重鎖の一部分、典型的には成熟重鎖中のアミノ末端の約１１０～１２５個のアミノ酸、及び成熟軽鎖中の約９０～１１５個のアミノ酸を指し、これらは抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において使用される。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域中に集中しており、一方、可変ドメイン中のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。いかなる特定の機序にも理論にも縛られることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、主に抗体と抗原との相互作用及び特異性を担うものと考えられる。ある特定の態様では、可変領域は、ヒト可変領域である。ある特定の態様では、可変領域は、齧歯動物又はマウスのＣＤＲ、及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の態様では、可変領域は、霊長類（例えば非ヒト霊長類）の可変領域である。ある特定の態様では、可変領域は、齧歯動物又はマウスのＣＤＲ、及び霊長類（例えば非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【0036】
本明細書で使用される場合、「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、互換性があり、当技術分野での一般的な意味を有する。定常領域は、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用等の様々なエフェクター機能を発揮し得る抗体部分（例えば、軽鎖及び／又は重鎖のカルボキシル末端部分）である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比較して保存されたアミノ酸配列を有する。免疫グロブリンの「定常領域」又は「定常ドメイン」は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、又はこれらのドメインのサブセット、例えば、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有し得る。本明細書で提供されるある特定の態様では、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１ドメインを含有しない。本明細書で提供されるある特定の態様では、免疫グロブリン定常領域は、ヒンジを含有しない。本明細書で提供されるある特定の態様では、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有する。
【0037】
「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、細胞の抗体受容体及び補体のＣ１ｑ成分への結合を担う、供給源抗体の部分に相当するか又はそれに由来するポリペプチド配列を指す。Ｆｃとは「結晶性断片」を意味し、タンパク質結晶を容易に形成する抗体の断片を指す。元来タンパク質消化によって説明された異なるタンパク質断片は、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を規定し得る。「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び任意選択的なヒンジの全て又はその一部を含有する。「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、単一のポリペプチド又は２つのジスルフィド結合したポリペプチドを指し得る。免疫グロブリンの構造及び機能のレビューについては、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．Ｖ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７），ｐｐ．４９－１４０；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９－２１７，１９９４を参照されたい。本明細書で使用される場合、Ｆｃという用語は、天然の配列のバリアントを含む。
【0038】
「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、天然の抗体の重鎖中に見られるＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入り、それらを連結するか（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤの場合）、又はＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間に入り、それらを連結する（ＩｇＥ及びＩｇＭの場合）天然の上部及び中間部のヒンジアミノ酸配列を指す。ある特定の態様では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列は、ヒトのものであり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含み得る。「改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域」又は「改変免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）３０％までのアミノ酸変化（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％までのアミノ酸置換又は欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は（ｂ）約５個のアミノ酸長から（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸）約１２０個のアミノ酸長までを有する（例えば、約１０～約４０個のアミノ酸長、又は約１５～約３０個のアミノ酸長、又は約１５～約２０個のアミノ酸長、又は約２０～約２５個のアミノ酸長を有する）野生型免疫グロブリンヒンジ領域の部分を指し、約３０％までのアミノ酸変化（例えば、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％までのアミノ酸置換若しくは欠失、又はこれらの組み合わせ）を有し、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／００９５０９７号明細書に開示されているＩｇＧコアヒンジ領域を有する。
【0039】
本明細書で使用される場合、抗体に関して使用される場合の「重鎖」という用語は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、任意の別個のタイプ、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）を指し得、これらはそれぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの抗体のクラスを生じ、ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。
【0040】
本明細書で使用される場合、抗体に関して使用される場合の「軽鎖」という用語は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、任意の別個のタイプ、例えば、カッパ（κ）又はラムダ（λ）を指し得る。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野において周知である。特定の態様では、軽鎖は、ヒト軽鎖である。
【0041】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の多量体を指す。この多量体は、直鎖又は分岐鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、且つ非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、天然に又は介在により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）及び当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義の範囲に含まれる。当然のことながら、本発明のポリペプチドは抗体をベースとしているため、ある特定の態様では、ポリペプチドは、一本鎖又は会合鎖として存在し得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、及び一本鎖形態若しくは二本鎖形態のそれらの多量体を指す。特に限定されない限り、これらの用語は、基準の核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明確に指定された配列と同様に、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換体）及び相補的配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされているｍＲＮＡと互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体、並びにこれらの誘導体、断片、及び相同体を含むことが意図されている。
【0043】
「イントロン」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡに転写され、その後、典型的にはスプライシングによってＲＮＡから除去されて、成熟型のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを作るヌクレオチドの配列を指す。典型的には、イントロンのヌクレオチド配列は、成熟ＲＮＡには組み入れられず、イントロン配列もその部分も、典型的にはポリペプチドに翻訳も組み入れもされない。スプライス供与体及びスプライス受容体等のスプライスシグナル配列が、細胞のスプライシング機構によって使用されて、イントロンがＲＮＡから除去される。
【0044】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の核酸によるセグメントを含む直鎖状又は環状の核酸を指す。
【0045】
「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の発現単位を含む直鎖状又は環状の核酸分子を指す。１つ又は複数の発現単位に加えて、発現ベクターはまた、～等の追加の核酸セグメントを含み得る。発現ベクターは、一般に、プラスミド又はウイルスのＤＮＡに由来し得るか、又は両方の要素を含み得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、任意の種類の細胞、例えば、一次細胞、培養細胞、又は細胞株由来細胞とし得る。特定の態様では、「宿主細胞」という用語は、核酸分子をトランスフェクトした細胞、及びそのような細胞の後代又は潜在的後代を指す。そのような細胞の後代は、例えば、後続世代において又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みにおいて生じ得る変異又は環境の影響のために、核酸分子をトランスフェクトした親細胞と同一でない場合がある。
【0047】
「生細胞数」という用語は、本明細書で使用される場合、培養中に存在する生（生存）細胞の数を指す。
【0048】
「細胞生存率」という用語は、本明細書で使用される場合、培養細胞がある一定の培養条件一式又は実験変動の下で生存する能力を指す。この用語はまた、本明細書で使用される場合、培養中のある特定の時間の生存細胞及び死滅細胞の全数に対して、その時間に生存している細胞の割合も指す。
【0049】
「回収力価」又は「力価」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞培養物中で産生された、発現したポリペプチド又は免疫グロブリンの総量を所定の量の培地体積で除したものを指す。
【0050】
「ｑＰ」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞比生産性を指し、産生された総免疫グロブリンを生細胞濃度積分値で除したものから決定される。
【0051】
「ＩＶＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、生細胞濃度積分値を指し、
によって算出され、式中、Ｘは生細胞濃度であり、Ｖは培養物の体積であり、ｔは時間である。
【数1】
【0052】
「単離されている」ポリペプチド、抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物は、自然界では見出されない形態のポリペプチド、抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物である。単離されているポリペプチド、抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物は、もはや自然界で見出される形態ではなくなる程度まで精製されているものが含まれる。一部の態様では、単離されている抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋な（即ち夾雑物がない）物質を指す。一部の例では、物質は、少なくとも９０％純粋であるか、少なくとも９５％純粋であるか、少なくとも９８％純粋であるか、又は少なくとも９９％純粋である。
【0053】
当然のことながら、「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、他に指示がない限り、「１つ又は複数」の挙げられた構成要素を指す。
【0054】
特に指定がないか、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、包括的であると理解される。「及び／又は」という用語は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」の両方、「Ａ」及び「Ｂ」を含むものとする。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」等の語句で使用される場合、下記の態様の各々を包含するものとする：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【0055】
当然のことながら、「含む」という語とともに態様が本明細書で説明されている場合は常に、「からなる」及び／又は「から実質的になる」という用語で説明されている、他の点では類似の態様も提供され、それらは本願の開示の一部である。本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」、及び「有する」等は、米国及び欧州の特許法においてそれらがもつ意味を有し得、且つ「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得る。「から実質的になる」又は「実質的になる」は、同様に、米国及び欧州の特許法に基づく意味を有する。当然のことながら、米国特許法に関する限り、この用語はオープンエンドであり、言及されていることの基本的な又は新規の特徴が、言及されていることを超える存在によって変化させられない限り、言及されていることを超える存在が許容されるが、先行技術の態様は除外される。以下もまた当然のことながら、欧州特許法に関する限り、「から実質的になる」又は「実質的に含む」の使用は、特定のさらなる構成要素、即ち、化合物又は組成物の本質的特徴に実質的に影響しないものが存在し得ることを意味する。
【0056】
本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値又は数範囲を修飾するために使用される場合、この値又は範囲の５％上まで又は５％下までの偏差が、記載された値又は範囲の意図される意味の内に留まることを示す。
【0057】
ＩＩ．免疫グロブリンをコードする核酸
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含有し、それらは一緒になって、免疫グロブリンを形成する。免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖を有し、これは、エピトープへの結合を助ける可変軽鎖領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。免疫グロブリン軽鎖はまた、軽鎖定常領域も含有する。ＩｇＧ軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかであり得る。
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含有し、それらは一緒になって、免疫グロブリンを形成する。免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖を有し、これは、エピトープへの結合を助ける可変軽鎖領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。免疫グロブリン軽鎖はまた、軽鎖定常領域も含有する。ＩｇＧ軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかであり得る。
【0058】
免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖を有し、これは、エピトープへの結合を助ける可変重鎖領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。免疫グロブリン重鎖はまた、重鎖定常領域も含有する。ＩｇＧ重鎖定常領域中に、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）並びにヒンジ領域がある。
【0059】
ヒトＩｇＧ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、３つのイントロンを含有する（図１０を参照されたい）。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中のイントロン１は、ＣＨ１領域をコードするエクソンとヒンジ領域をコードするエクソンとの間に位置している。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中のイントロン２は、ヒンジ領域をコードするエクソンとＣＨ２領域をコードするエクソンとの間に位置している。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中のイントロン３は、ＣＨ２領域をコードするエクソンとＣＨ３領域をコードするエクソンとの間に位置している。同様に、ヒトＩｇＧ重鎖領域をコードするヌクレオチド配列は、リーダーイントロンと、可変重ドメイン（ＶＨ）と定常ドメイン１（ＣＨ１）との間のイントロンとを含む。
【0060】
イントロンは、核膜孔複合体を通過するｍＲＮＡ核外輸送に関連していることが知られている。概括的には、Ｋｏｈｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：７６１－７７３（２００７）；Ｂｊｏｒｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２：４７－５４（２０１４）；Ｒｅｅｄ，Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：３２６－３３１（２００３）を参照されたい。そのため、組換え免疫グロブリン産生のための核酸を調製する場合には、内因性イントロンは通常、切除されない。なぜならば、イントロンを有する核酸は、典型的には、対応するｃＤＮＡバージョンと比較して免疫グロブリン産生力価を増加させるからである。例えば、図２を参照されたい。
【0061】
ヒトＩｇＧ重鎖中に内因性イントロンを含有する核酸を用いる免疫グロブリン産生は、免疫グロブリン力価を増加させるが、イントロンは、免疫グロブリンの断片又はバリアントをもたらし得る不正確なスプライス部位を導入する可能性があり、そのため産物の純度を低下させる。免疫グロブリンプール中に免疫グロブリンの断片又はバリアントが導入されると、これらの断片及びバリアントの精製において困難さが増す可能性があり、そのため、精製プロセスに不当な負担がかかり、産物の純度の低下の一因となる。
【0062】
一態様では、ＩｇＧ重鎖定常領域中の１つ又は２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失していると、免疫グロブリンの断片又はバリアントの産生が減少し、ＩｇＧ軽鎖をコードする適切な核酸と一緒に発現させる場合に、免疫グロブリン力価の上昇が得られる。
【0063】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第１のイントロンの配列を含み、且つ免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのみを含む、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２のイントロンのみを含む、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第３のイントロンのみを含む、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0064】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域の３つの内因性イントロンの内の１つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第１のイントロンが欠失している。一部の例では、第２のイントロンが欠失している。一部の例では、第３のイントロンが欠失している。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第２及び第３のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第１及び第３のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第１及び第２のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0065】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の３つの内因性イントロンの内の２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第１及び第２のイントロンが欠失している。一部の例では、第１及び第３のイントロンが欠失している。一部の例では、第２及び第３のイントロンが欠失している。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第１のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第２のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１及び第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列が第３のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１及び第２のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0066】
ある特定の態様では、本開示は、第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失しており、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び／又は第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失しており、且つ第２及び／又は第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第２のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の例では、第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。ある特定の態様では、本開示は、第１及び第２のイントロンのヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域から欠失しており、第２のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、第１及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域から欠失しており、第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失しており、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失しており、第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で各々置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0067】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２及び／又は第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第２のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の例では、第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されており、第１及び第３のイントロンの配列が欠失していない、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されており、第１及び第２のイントロンの配列が欠失していない、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されており、第１のイントロンの配列が欠失していない、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0068】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられており、第１及び／又は第２のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0069】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられており、且つ第１及び／又は第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0070】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0071】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸を包含する。
【0072】
ある特定の態様では、本開示は、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
【0073】
上記の態様のいずれかでは、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をまた、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させ得る。一部の例では、免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖である。一部の例では、免疫グロブリン軽鎖は、ラムダ軽鎖である。
【0074】
上記の態様のいずれかでは、核酸は、当該核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合に、重鎖定常領域中の全てのイントロン配列を含有する核酸と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0075】
上記の態様のいずれかでは、核酸は、当該核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合に、重鎖定常領域にイントロン配列を含有しない核酸と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0076】
上記の態様のいずれかでは、核酸は、コドン最適化されていない。上記の態様のいずれかでは、核酸は、コドン最適化されている。
【0077】
上記の態様のいずれかでは、発現された免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。
【0078】
上記の態様のいずれかでは、発現された免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである。
【0079】
本開示の核酸は、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖の場合には、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。一部の態様では、核酸は、もう１つの内因性イントロンを欠くＤＮＡである。
【0080】
一部の態様では、核酸は、非天然のヌクレオチドを含む。一部の態様では、核酸は、組換えで産生される。
【0081】
ある特定の態様では、核酸は、単離されている。
【0082】
ＩＩＩ．細胞及びベクター
本明細書で説明されている核酸を含むベクター及び細胞もまた提供される。
本明細書で説明されている核酸を含むベクター及び細胞もまた提供される。
【0083】
ある特定の態様では、本明細書で提供されるのは、免疫グロブリンをコードする、本明細書で説明されている核酸を発現する（例えば、組換えにより発現する）発現ベクターを含む細胞（例えば宿主細胞）である。本明細書で提供されるのは、宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）中での組換え発現のための免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）である。同様に本明細書で提供されるのは、免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を組換えにより発現するためのそのようなベクターを含む宿主細胞である。
【0084】
免疫グロブリンの組換え発現は、本明細書で説明されている免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する発現ベクターを必要とする。一部の態様では、ベクターは、免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含有する、本明細書で説明されている核酸を含む。一部の態様では、宿主細胞は、ベクターを含む。本開示はまた、本明細書で説明されている核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態のコンストラクトも提供する。一部の態様では、ベクターは、発現ベクター、宿主細胞中で組換え免疫グロブリン産生を助けるための追加のヌクレオチド配列（例えばプロモーター）である。
【0085】
発現ベクターを、従来技術によって細胞（例えば宿主細胞）に導入し得、その後、得られた細胞を、従来技術によって培養して、本明細書で説明されている免疫グロブリンを産生し得る。そのため、本明細書で提供されるのは、宿主細胞中でのそのような配列の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、本明細書で説明されている免疫グロブリン又はそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞である。
【0086】
ある特定の態様では、宿主細胞は、本明細書で説明されている免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含有する。ある特定の態様では、宿主細胞は、本明細書で説明されている免疫グロブリンのポリペプチドの全てをコードする核酸を含む複数の異なるベクターを含有する。
【0087】
ベクター又はベクターの組み合わせは、相互作用して本明細書で説明されている免疫グロブリンを形成する２種以上のポリペプチドをコードする核酸：例えば、重鎖をコードする第１の核酸、及び軽鎖をコードする第２の核酸を含み得る。２つの別個のベクター中で２種のポリペプチドが核酸によってコードされている場合、これらのベクターを、同じ宿主細胞中にトランスフェクトし得る。
【0088】
種々の宿主－発現ベクター系を利用して、本明細書で説明されている免疫グロブリン又はそのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域；重鎖又は軽鎖）を発現させ得る。そのような宿主－発現系は、目的のコード配列を産生し、続いて精製し得るビヒクルであるか、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換させた場合、又はそれをトランスフェクトした場合に、本明細書で説明されている免疫グロブリン又はそのポリペプチドを原位置で発現し得る細胞でもある。これらとして、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））等の微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス・ピキア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、若しくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系（例えば、クラミドモナス・レインハルドチ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）等の緑藻類）；又は哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１又はＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、及びＢＭＴ１０細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0089】
本明細書で説明されている免疫グロブリン又はそのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域；重鎖又は軽鎖）が、組換え発現によって産生されると、これを、当技術分野において既知の任意の抗体の精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡの後の特定の抗原に対する親和性によるアフィニティークロマトグラフィー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性差により、又は任意の他の標準的なタンパク質の精製技術により、精製し得る。さらに、本明細書で説明されている抗体を、精製を容易にするための、本明細書で説明されているか又はそれ以外では当技術分野において既知の異種ポリペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧタグ、ｈｉｓタグ、又はアビジン）に融合させ得る。
【0090】
ＩＶ．免疫グロブリンの製造
免疫グロブリンを、当技術分野において既知の任意の免疫グロブリンの合成方法によって、例えば、組換え発現技術によって、製造し得る。本明細書で説明されている方法は、他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、遺伝分析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当技術分野の技能の範囲内の関連分野における従来技術を使用する。これらの技術は、例えば、本明細書で引用されている参照文献で説明されており、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７及び年次改訂版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７及び年次改訂版）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
免疫グロブリンを、当技術分野において既知の任意の免疫グロブリンの合成方法によって、例えば、組換え発現技術によって、製造し得る。本明細書で説明されている方法は、他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、遺伝分析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当技術分野の技能の範囲内の関連分野における従来技術を使用する。これらの技術は、例えば、本明細書で引用されている参照文献で説明されており、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７及び年次改訂版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７及び年次改訂版）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【0091】
一部の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されている核酸、及び任意選択により、本開示の免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、単離されている核酸が提供される。そのような核酸は、免疫グロブリンのＣＬを含むアミノ酸配列及び／又はＣＨを含むアミノ酸配列（例えば、免疫グロブリンの軽定常鎖及び／又は重定常鎖）をコードし得る。そのような核酸は、免疫グロブリンのＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、免疫グロブリンの軽可変鎖及び／又は重可変鎖）をコードし得る。一部の態様では、そのような核酸を含む１種又は複数種のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。一部の態様では、そのような核酸を含む宿主細胞もまた提供される。一部の態様では、宿主細胞は、（１）免疫グロブリンの軽鎖を含むアミノ酸配列及び免疫グロブリンの重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）免疫グロブリンの軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び免疫グロブリンの重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これらをトランスフェクトされている）。
【0092】
一部の態様では、免疫グロブリンをコードする本開示の核酸を含む宿主細胞は、抗体の発現に適した条件下で培養される。本開示の核酸を使用する免疫グロブリンの組換え産生については、重鎖及び／又は軽鎖をコードする１種又は複数種の核酸が単離され、本明細書で説明されている宿主細胞中でのさらなるクローニング及び／又は発現のため、１種又は複数種のベクターの中に挿入される。
【0093】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、全てのイントロン配列を含むか又はイントロン配列を含まない免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸を含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。特定の態様では、細胞は、単離されている細胞である。一部の態様では、第１のイントロンの核配列が欠失している。一部の態様では、第２のイントロンの核配列が欠失している。一部の態様では、第３のイントロンの核配列が欠失している。一部の態様では、第１及び第２のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。一部の態様では、第１及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。一部の態様では、第２のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の態様では、第３のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の態様では、第２のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。一部の態様では、第３のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。ある特定の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。ある特定の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。一部の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失してもいる。
【0094】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0095】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0096】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0097】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在している、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と同一の又はより高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0098】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0099】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0100】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３のいずれもが存在していない、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞と比べて高い力価で免疫グロブリンを発現する。
【0101】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない。一態様では、リーダーイントロン又はＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。一態様では、リーダーイントロンが欠失している。一態様では、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが欠失している。
【0102】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロンを除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない。
【0103】
ある特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、免疫グロブリン重鎖中の全てのイントロンのヌクレオチド配列が、リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１イントロン、及び重鎖定常領域中のイントロン１を除いて欠失している、核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、この宿主細胞は、免疫グロブリン断片を発現しない。
【0104】
上記の態様のいずれかでは、免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である。
【0105】
上記の態様のいずれかでは、核酸は、コドン最適化されている。上記の態様のいずれかでは、核酸は、コドン最適化されていない。
【0106】
上記の態様のいずれかでは、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。
【0107】
上記の態様のいずれかでは、免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである。
【0108】
上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。
【0109】
上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかでは、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。
【0110】
上記の態様のいずれかでは、宿主細胞は、真核細胞である。上記の態様のいずれかでは、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0111】
一部の態様では、外因性核酸が細胞中に導入されている。
【0112】
一部の態様では、本方法は、細胞又は宿主細胞から免疫グロブリンを精製する工程をさらに含む。
【0113】
本開示の態様は、下記の非限定的な例を参照することによってさらに規定され得る。これらの例は、本開示のある特定の抗体の調製及び本開示の抗体の使用方法を詳細に記載するものである。材料及び方法の両方に対する多くの変更が、本開示の範囲を逸脱することなくなされ得ることは、当業者には明らかであるだろう。
【実施例】
【0114】
当然のことながら、本明細書で説明されている例及び態様は、例示のみを目的とし、それに照らして様々な変形又は変更が当業者に対して示唆され、それらは本願の趣旨及び範囲に含まれることになる。
【0115】
実施例１． ミススプライシングされた免疫グロブリンバリアントの特性決定
イントロンは、選択的スプライシングの調整、遺伝子発現の増強、及びｍＲＮＡの核からの輸送の制御を含む複数の分野で重要である。そのため、内因性イントロンを含有する、免疫グロブリンを産生するための発現ベクター中に使用される核酸。しかしながら、これは、ミススプライシングされた免疫グロブリンバリアントをもたらす可能性があり、それは精製が困難であり得、及び／又は免疫グロブリン産物の回収力価を減少させ得る。
イントロンは、選択的スプライシングの調整、遺伝子発現の増強、及びｍＲＮＡの核からの輸送の制御を含む複数の分野で重要である。そのため、内因性イントロンを含有する、免疫グロブリンを産生するための発現ベクター中に使用される核酸。しかしながら、これは、ミススプライシングされた免疫グロブリンバリアントをもたらす可能性があり、それは精製が困難であり得、及び／又は免疫グロブリン産物の回収力価を減少させ得る。
【0116】
ＭＡｂ１の細胞培養産生は、イントロンのスプライスバリアントが原因で、３種の免疫グロブリンバリアントをもたらした。重鎖定常領域中に内因性イントロン配列を含む、各免疫グロブリンの軽鎖配列及び重鎖配列を含有する発現ベクターを、線形化し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクトした。線形化した発現ベクターのトランスフェクションを、ヌクレオフェクションによって行い、細胞のプールを生成した。線形化した発現ベクターを、ランダムな組み込みによってＣＨＯゲノム中に組み込んだ。ＭＡｂ１を発現する細胞のプールをクローン化して、その時点で適切な細胞株開発プロセスを使用してクローンを製造する細胞株を生成した。
【0117】
ＣＨＯ細胞を増殖させ、培養プレロス中にＭＡｂ１を分泌させた。免疫グロブリンを回収し、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を使用して免疫グロブリンを精製した。ＨＰＳＥＣ分画については、ＭＡｂ１を、ＴＳＫ－ゲルＧ３０００ＳＷ×Ｌカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）にカラム周囲温度で注入した。試料を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ硫酸ナトリウムから構成される移動相、ｐＨ６．８、流速１．０ｍＬ／分で、均一濃度で溶離した。複数回の注入から回収した画分をプールし、濃縮した後で特性決定及び分析をした。Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ，１１：１４５２－１４６３（２０１９）を参照されたい。
【0118】
図１に示すように、ＨＰＳＥＣは、３つのスプライスバリアント、即ち、伸長を有する単量体免疫グロブリン、及び２つの断片を明らかにしている。伸長を有する免疫グロブリンバリアントは、免疫グロブリンのＣ末端に追加のラムダ軽鎖定常ドメインを有することが確認された。これは、重鎖のＣ末端に追加のラムダ軽鎖定常ドメインを有する選択的重鎖転写物によってもたらされた。２つの断片は、ヒンジとＣＨ２領域との間のイントロン２に関連するスプライスバリアントであると判定された。具体的には、１つの断片は、インフレームの終止コドンが原因で切断型重鎖になり、他方は、フレームシフトが起こって終止コドンを作り、切断型重鎖になる、ミススプライシング現象である。そのため、免疫グロブリン断片バリアントは、免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロンによって産生される。
【0119】
実施例２． 免疫グロブリンスプライスバリアントを減少させるための核酸の操作
実施例１において産生される免疫グロブリン断片を排除するため、コドン最適化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列を、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロンを一切なくして作製した。ｃＤＮＡバージョンは、免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロン２を除去し、２種の断片の産生を防止した。
実施例１において産生される免疫グロブリン断片を排除するため、コドン最適化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列を、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロンを一切なくして作製した。ｃＤＮＡバージョンは、免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロン２を除去し、２種の断片の産生を防止した。
【0120】
しかしながら、ＣＨＯ細胞中でタンパク質発現を増強するためにはイントロンが必要であることが公知である。そのため、ＣＨＯ細胞に、ヌクレオフェクションによって、非コドン最適化ｇＤＮＡ又はコドン最適化ｃＤＮＡをトランスフェクトしてプールを生成し、増殖させ、振盪フラスコ中でのプール流加プロセス中に免疫グロブリンを分泌させた。図２Ａを参照されたい。図２Ｂは、回収力価によって示されているように、ＭＡｂ２のｃＤＮＡバージョンは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）バージョンと比較して、免疫グロブリンの産生が有意に少ないことを示す。
【0121】
２種の免疫グロブリン断片バリアントは、イントロン２におけるミススプライシングの結果として生じることから、個々のイントロンを免疫グロブリン重鎖定常領域から除去し、免疫グロブリン重鎖定常領域のいかなるイントロンも有しないｃＤＮＡバージョン又はｇＤＮＡバージョンと比較した。下記のコンストラクトを、作製して試験した：（１）重鎖定常領域中の３つ全てのイントロンを含有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ｃＤＮＡ（コドン最適化）、（３）イントロン１が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）イントロン２が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）イントロン３が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（６）全てのイントロンが除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）。図３Ａを参照されたい。
【0122】
実施例１で説明されているように、核酸を調製し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、プール段階にした。Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｃｙｔｅｎａ）を使用して、単一細胞クローンを得るためにプールをスクリーニングした。これは単一細胞を含有する液滴を３８４ウェルプレートのウェルに沈着させるものである。単一細胞沈着は、Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ（登録商標）プレートリーダー（Ｓｙｎｅｎｔｅｃ）を使用して確認される。さらなる特性決定のために、最高発現クローンを選択した。最高クローンを増殖させ、各コンストラクトに関してＭＡｂ２を分泌させた。ＭＡｂ２を、１３日目に回収した。図３Ｂは、ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡ（イントロンを含まない）の回収力価が最低の回収力価であったことを示す。一方、イントロン１、イントロン２、又はイントロン３のいずれかのうち１つがないｇＤＮＡのコンストラクトは、３つ全てのイントロンを含有するｇＤＮＡ、ｇＤＮＡ（イントロンを含まない）、及びｃＤＮＡの各コンストラクトと比較して、回収力価が増加した。
【0123】
図４Ａ～Ｃは、平均生細胞数（ＶＣＮ）、細胞生存率、及び生細胞濃度積分値（ＩＶＣ）が、全コンストラクト間でほぼ同じであったことを示すが、図４Ｄは、力価の増加が細胞生産性（ｑＰ）の増加に由来することを明らかにしている。イントロンが免疫グロブリン発現を増加させることが知られていたことから、１つのイントロンを除去すると回収力価が増加したのは意外であった。
【0124】
実施例３． 回収力価を増加させるための核酸の操作
ＣＨＯ細胞が免疫グロブリンを産生する能力に対する各イントロンの重要性をさらに判定するために、下記のＭＡｂ２コンストラクトを作製した：（１）イントロン２が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１及び２が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）イントロン２及び３が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（４）いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。コドン最適化されたヌクレオチド配列を使用することの重要性を判定するために、コドン最適化された配列を使用すること以外は、同じコンストラクトのセットを作製した。
ＣＨＯ細胞が免疫グロブリンを産生する能力に対する各イントロンの重要性をさらに判定するために、下記のＭＡｂ２コンストラクトを作製した：（１）イントロン２が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１及び２が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）イントロン２及び３が除去されたｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（４）いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。コドン最適化されたヌクレオチド配列を使用することの重要性を判定するために、コドン最適化された配列を使用すること以外は、同じコンストラクトのセットを作製した。
【0125】
実施例２のように、コンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。同様に、実施例２での培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。１１日目に、免疫グロブリン産物を回収し、回収力価、ｑＰ、ＶＣＮ、及びＩＶＣを全て決定した。図５Ａは、ヌクレオチド配列がコドン最適化されたか否かにかかわらず、イントロン２を有しないｇＤＮＡ、並びにイントロン２及び３を有しないｇＤＮＡから産生された免疫グロブリンの回収力価が最も高かったことを明らかにしている。しかし、イントロン１及び２を有しないｇＤＮＡは、いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡと力価レベルが類似していた。図５Ｂ及び５Ｃは、各々についてＶＣＮ及びＩＶＣがほぼ同じであることを示す。しかし、細胞生産性（ｑＰ）は、イントロン２を有しないｇＤＮＡ、並びにイントロン２及び３を有しないｇＤＮＡが、最も生産性が高かったことを明らかにした。図５Ｄを参照されたい。このことは、イントロン１が、免疫グロブリンの産生の増加に重要であることを示唆する。
【0126】
免疫グロブリンの産生の増加に対するイントロン１の重要性をさらに理解するために、複数の新規なＭＡｂ２コンストラクトを作製した。上記で作製した非コドン最適化コンストラクト（即ち、全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン２を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン２及び３を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、並びにイントロン１及び２を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化））に加えて、下記のコンストラクトを作製した：（１）イントロン１の位置に移動したイントロン３を有しており、且つイントロン１及び２が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１の位置に移動したイントロン３を有しており、イントロン３のヌクレオチド配列は、イントロン配列に１つのヌクレオチドの変化を作ることによって５’スプライス供与部位の強度を増すように修飾されており、且つイントロン１及び２が欠失している、ｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）イントロン３の位置に移動したイントロン１を有しており、且つイントロン２及び３が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）野生型ＩｇＧ１及び全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（６）野生型ＩｇＧ１を有し、イントロン２及び３を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（７）野生型ＩｇＧ１を有し、イントロン１及び２を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、並びに（８）野生型ＩｇＧ１を有し、いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。図６Ａを参照されたい。
【0127】
実施例１で説明されているように、これらのコンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。実施例１で説明されている培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定した。図６Ｂは、イントロン１をイントロン３の位置に移動させると、全てのイントロンを有するｇＤＮＡ、及び通常の位置でのイントロン１のみを有するｇＤＮＡと類似の回収力価をもたらすことを示す。図６Ｂはまた、３つ全てのイントロンを含有するコンストラクトと類似の力価を維持することにおけるイントロン１の効果は、型が野生型ＩｇＧ１であるか半減期延長ＩｇＧ１であるかには影響されないことも裏付ける。
【0128】
実施例４． 回収力価の増加があるかどうかを判定するための、追加の免疫グロブリンにおける核酸の操作
ＭＡｂ２において見られる結果が、当該免疫グロブリンに特異的であるのかどうかを判定するために、追加の免疫グロブリン分子を試験する。図７は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４について作製された様々なコンストラクトを示す。各免疫グロブリンについて、下記のコンストラクトを作製した：（１）全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１のみを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（３）いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。ＭＡｂ２及びＭＡｂ３は、カッパ軽鎖を含有し、ＭＡｂ１及びＭＡｂ４は、ラムダ軽鎖を含有する。ラムダ軽鎖は、可変軽鎖と定常軽鎖との間での様々なイントロンと、様々なｐｏｌｙＡ尾部とを有する。実施例１で既に説明されているように、これらのコンストラクトを作製した。実施例２で説明されているように、これらのコンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトして、プールを生成した。実施例２で説明されている培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定した。
ＭＡｂ２において見られる結果が、当該免疫グロブリンに特異的であるのかどうかを判定するために、追加の免疫グロブリン分子を試験する。図７は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４について作製された様々なコンストラクトを示す。各免疫グロブリンについて、下記のコンストラクトを作製した：（１）全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１のみを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（３）いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。ＭＡｂ２及びＭＡｂ３は、カッパ軽鎖を含有し、ＭＡｂ１及びＭＡｂ４は、ラムダ軽鎖を含有する。ラムダ軽鎖は、可変軽鎖と定常軽鎖との間での様々なイントロンと、様々なｐｏｌｙＡ尾部とを有する。実施例１で既に説明されているように、これらのコンストラクトを作製した。実施例２で説明されているように、これらのコンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトして、プールを生成した。実施例２で説明されている培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定した。
【0129】
図８は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ１、及びＭＡｂ４の重鎖定常領域にイントロン１のみが存在すると、重鎖定常領域の全てのイントロンを有する各コンストラクトと比較して、類似の免疫グロブリン力価をもたらすことを示す。加えて、イントロン１のみを有するコンストラクトは、免疫グロブリン重鎖定常領域中にいかなるイントロンも有しないｇＤＮＡと比較して、力価を増加させた。さらに、図９は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ１、及びＭＡｂ４に関して、重鎖定常領域の全てのイントロンを有するコンストラクト間では、重鎖定常領域中にイントロン１のみを有するコンストラクトと比較して、７日目～１１日目の免疫グロブリン力価が類似していることを示す。試験した全ての分子に関して、いかなるイントロンも有しないｇＤＮＡは、重鎖定常領域中に全てのイントロンを有するコンストラクト、及びイントロン１のみのコンストラクトと比べて、免疫グロブリン力価が有意に低かった。
【0130】
これらのデータは、重鎖定常領域のイントロン１が、より高い免疫グロブリン力価レベルの維持において重要であることのさらなるエビデンスを提供する。さらに、このデータは、力価レベルの増加がＭＡｂ２に限定されないことを示す。さらに、免疫グロブリンのカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖の存在は、力価レベルに影響を及ぼさない。
【0131】
実施例５． イントロン３をイントロン１と同じサイズのイントロンで置き換えるための核酸の操作
なぜイントロン１は回収力価を増加させ得るかを特定するために、この実施例は、その理由がイントロン１のヌクレオチド配列自体よりむしろそのサイズであることを実証することになる。ＭＡｂ２中のイントロン１は、３９１個のヌクレオチドであり、一方イントロン３は、９７個のヌクレオチドである。下記のコンストラクトを作製することになる：（１）全てのイントロンを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン２及び３を有しないＭＡｂ２（非コドン最適化）、（３）イントロン１及び２を有しないが、イントロン３中のヌクレオチドの数を、イントロン１とほぼ同じサイズに増加させている、ＭＡｂ２（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２（非コドン最適化）であるが、イントロン１のサイズをほぼイントロン３のサイズに縮小させ、且つイントロン２及び３が欠失している、並びに（５）いかなるイントロンも有しないＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コドン最適化）。
なぜイントロン１は回収力価を増加させ得るかを特定するために、この実施例は、その理由がイントロン１のヌクレオチド配列自体よりむしろそのサイズであることを実証することになる。ＭＡｂ２中のイントロン１は、３９１個のヌクレオチドであり、一方イントロン３は、９７個のヌクレオチドである。下記のコンストラクトを作製することになる：（１）全てのイントロンを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン２及び３を有しないＭＡｂ２（非コドン最適化）、（３）イントロン１及び２を有しないが、イントロン３中のヌクレオチドの数を、イントロン１とほぼ同じサイズに増加させている、ＭＡｂ２（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２（非コドン最適化）であるが、イントロン１のサイズをほぼイントロン３のサイズに縮小させ、且つイントロン２及び３が欠失している、並びに（５）いかなるイントロンも有しないＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コドン最適化）。
【0132】
実施例２で既に説明されているように、これらのコンストラクトを作製することになる。実施例２で説明されているように、これらのコンストラクトを、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトすることになる。実施例１で説明されているように、ＣＨＯ細胞を増殖させ、免疫グロブリンを産生するように誘導することになる。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定することになる。その結果は、イントロン３のサイズを増大すると、回収力価の増加をもたらし、イントロン２及び３を有しないＭＡｂ２と同等になることを示すであろう。しかしながら、イントロン１のサイズを縮小すると、イントロン１及び２を有しないＭＡｂ２と同等の結果になるであろう。この実施例は、イントロン１のサイズが、そのヌクレオチド配列自体よりも重要であることを明らかにするであろう。
【0133】
実施例６． ＶＨ－ＣＨ１イントロンを除去するための核酸の操作により、力価が増加する
免疫グロブリン重鎖は、下記の５つのイントロンを有する：（１）リーダーイントロン；（２）ＶＨ－ＣＨ１イントロン；（３）重鎖定常領域のイントロン１；（４）重鎖定常領域のイントロン２；及び（５）重鎖定常領域のイントロン３。上記で示すように、重鎖定量領域のイントロン２及び／又は３の除去により、免疫グロブリン断片の産生が減少し、且つ力価が増加する。そのため、重鎖定常領域のイントロン１～３以外のイントロンが抗体力価に影響を及ぼすかどうかを判定するために、下記のコンストラクトを作製した：（１）５つ全てのイントロを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コトン最適化）；（２）重鎖定常領域のイントロン１～３を有しないＭＡｂＸ ｇｃＤＮＡ（非コドン最適化）；及び（３）リーダーイントロンのみを有するＭＡｂＸ ｇＤＮＡ（非コトン最適化）。図１１Ａを参照されたい。
免疫グロブリン重鎖は、下記の５つのイントロンを有する：（１）リーダーイントロン；（２）ＶＨ－ＣＨ１イントロン；（３）重鎖定常領域のイントロン１；（４）重鎖定常領域のイントロン２；及び（５）重鎖定常領域のイントロン３。上記で示すように、重鎖定量領域のイントロン２及び／又は３の除去により、免疫グロブリン断片の産生が減少し、且つ力価が増加する。そのため、重鎖定常領域のイントロン１～３以外のイントロンが抗体力価に影響を及ぼすかどうかを判定するために、下記のコンストラクトを作製した：（１）５つ全てのイントロを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コトン最適化）；（２）重鎖定常領域のイントロン１～３を有しないＭＡｂＸ ｇｃＤＮＡ（非コドン最適化）；及び（３）リーダーイントロンのみを有するＭＡｂＸ ｇＤＮＡ（非コトン最適化）。図１１Ａを参照されたい。
【0134】
これらのコンストラクトを、発現ベクターを生成し、このベクターを線形化することにより作製し、このベクターを使用して、ヌクレオフェクションによりＣＨＯ細胞をトランスフェクトして、ＣＨＯ細胞のプールを生成した。実施例２で説明されているように、これらのコンストラクトを、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。実施例１で説明されている培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定した。図１１Ｂは、コンストラクト＃２が、対照（コンストラクト＃１）と比較して力価レベルを有意に低下させるが、コンストラクト＃３は対照コンストラクトと同程度の力価レベルであることを示した。この実施例から、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが免疫グロブリンの産生を低減することが示唆される。
【0135】
実施例７． 重鎖定常領域のイントロン１は、ＶＨ－ＣＨ１イントロン保持を軽減する
重鎖定常領域のイントロン１が、ＶＨ－ＣＨ１イントロン保持を軽減することにより免疫グロブリン力価を増加させるかどうかを判定するために、下記のコンストラクトを作製した：（１）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ１ ｇＤＮＡ（非最適化）；（２）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ１ ｇＤＮＡ（非最適化）；（３）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ１ ｇｃＤＮＡ（非最適化）；（４）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非最適化）；（５）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非最適化）；（６）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ１ ｇｃＤＮＡ（非最適化）；（７）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ３ ｇＤＮＡ（非最適化）；（８）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ３ ｇＤＮＡ（非最適化）；（９）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ３ ｇｃＤＮＡ（非最適化）；（１０）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ４ ｇＤＮＡ（非最適化）；（１１）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ４ ｇＤＮＡ（非最適化）、及び（１２）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ４ ｇｃＤＮＡ（非最適化）。図１２Ａを参照されたい。
重鎖定常領域のイントロン１が、ＶＨ－ＣＨ１イントロン保持を軽減することにより免疫グロブリン力価を増加させるかどうかを判定するために、下記のコンストラクトを作製した：（１）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ１ ｇＤＮＡ（非最適化）；（２）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ１ ｇＤＮＡ（非最適化）；（３）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ１ ｇｃＤＮＡ（非最適化）；（４）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非最適化）；（５）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非最適化）；（６）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ１ ｇｃＤＮＡ（非最適化）；（７）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ３ ｇＤＮＡ（非最適化）；（８）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ３ ｇＤＮＡ（非最適化）；（９）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ３ ｇｃＤＮＡ（非最適化）；（１０）重鎖定常領域のイントロン１～３を有するＭＡｂ４ ｇＤＮＡ（非最適化）；（１１）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂ４ ｇＤＮＡ（非最適化）、及び（１２）重鎖定常領域のイントロンを有しないＭＡｂ４ ｇｃＤＮＡ（非最適化）。図１２Ａを参照されたい。
【0136】
これらのコンストラクトを、発現ベクターを生成し、このベクターを線形化することにより作製し、このベクターを使用して、ヌクレオフェクションによりＣＨＯ細胞をトランスフェクトして、ＣＨＯ細胞のプールを生成した。ＣＨＯ細胞からＲＮＡを単離し、当技術分野で既知の標準的方法を使用してｃＤＮＡを調製した。ＶＨ領域及びＣＨ１領域に対する特異的プライマーを用いて逆転写酵素ＰＣＲを実施して、ＶＨ－ＣＨ１イントロンを含むコンストラクトを決定した。アガロースゲル電気泳動を実施して、ＰＣＲ産物を分離した。
【0137】
図１２Ｂは、４種の異なる抗体コンストラクトにおいて、重鎖定常領域のイントロン１がＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持を軽減するが、重鎖定常領域のイントロン１が除去される場合には（即ち、ｇｃＤＮＡコンストラクト）、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが保持されることを示す。この実施例から、重鎖定常領域のイントロン１が存在していない場合には、スプライスバリアントが力価レベルを低下させることが示唆される。
【0138】
実施例８． 重鎖定常領域のイントロン１は、免疫グロブリン力価の高い発生を維持する
ＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持により力価レベルが低下することから、免疫グロブリン力価が対照ｇＤＮＡと比較して変化するかどうかを判定するために、下記のコンストラクトを作製した：（１）５つ全ての免疫グロブリン重鎖イントロンを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ；（２）リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１、及び重鎖定常領域のイントロン１を有するＭＡｂＸ；（３）リーダーイントロン及びＶＨ－ＣＨ１イントロンのみを有するＭＡｂＸ（ｇｃＤＮＡ）；（４）リーダーイントロンのみを有するＭＡｂＸ；（５）免疫グロブリン重鎖イントロンを有しないＭＡｂＸ；並びに（６）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂＸ。図１３Ａを参照されたい。
ＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持により力価レベルが低下することから、免疫グロブリン力価が対照ｇＤＮＡと比較して変化するかどうかを判定するために、下記のコンストラクトを作製した：（１）５つ全ての免疫グロブリン重鎖イントロンを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ；（２）リーダーイントロン、ＶＨ－ＣＨ１、及び重鎖定常領域のイントロン１を有するＭＡｂＸ；（３）リーダーイントロン及びＶＨ－ＣＨ１イントロンのみを有するＭＡｂＸ（ｇｃＤＮＡ）；（４）リーダーイントロンのみを有するＭＡｂＸ；（５）免疫グロブリン重鎖イントロンを有しないＭＡｂＸ；並びに（６）重鎖定常領域のイントロン１のみを有するＭＡｂＸ。図１３Ａを参照されたい。
【0139】
これらのコンストラクトを、発現ベクターを生成し、このベクターを線形化することにより作製し、このベクターを使用して、ヌクレオフェクションによりＣＨＯ細胞をトランスフェクトして、ＣＨＯ細胞のプールを生成した。実施例１で説明されている培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価及び細胞生産性を決定した。
【0140】
ｇｃＤＮＡコンストラクトからのＶＨ－ＣＨ１イントロンの除去により、力価及び細胞生産性が増加する（コンストラクト＃４と比較したコンストラクト＃３）。図１３Ｂ及び図１３Ｃを参照されたい。リーダーイントロンのさらなる除去は、力価又は細胞生産性の差違を示さず（＃５と比較したコンストラクト＃４）、イントロン１のみは、イントロンなし又はリーダーイントロンのみと比較して力価又は細胞生産性の差違を示さない（＃４又は＃５と比較した＃６）。同上。この実施例により、重鎖定常領域のイントロン１は、ＶＨ－ＣＨ１イントロンを正確に除去することにより力価レベル及び細胞生産性を上昇させることが示される。
【0141】
実施例９． 重鎖定常領域のイントロン１は、重鎖定常領域中の新たな位置に移動した場合に、ＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持を軽減する
ＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持の軽減での重鎖定数領域のイントロン１の重要性をさらに理解するために、いくつかの新規のＭＡｂ２コンストラクトを作製した。上記で作製した非コドン最適化コンストラクト（即ち、全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン２及び３を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン１及び２を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、並びに重鎖定常領域のイントロン１～３を有しないｇｃＤＮＡ（非コドン最適化））に加えて、下記のコンストラクトを作製した：（１）イントロン３がイントロン１の位置に移動しており、且つイントロン１及び２が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）；（２）イントロン３がイントロンの１の位置に移動しており、イントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン配列中の１つのヌクレオチドを変化させることにより５’スプライス供与部位の強度を増加させるように修飾されており、且つイントロン１及び２が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）；並びに（３）イントロン１がイントロン３の位置に移動しており、且つイントロン２及び３が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）。図１４Ａを参照されたい。
ＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持の軽減での重鎖定数領域のイントロン１の重要性をさらに理解するために、いくつかの新規のＭＡｂ２コンストラクトを作製した。上記で作製した非コドン最適化コンストラクト（即ち、全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン２及び３を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン１及び２を有しないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、並びに重鎖定常領域のイントロン１～３を有しないｇｃＤＮＡ（非コドン最適化））に加えて、下記のコンストラクトを作製した：（１）イントロン３がイントロン１の位置に移動しており、且つイントロン１及び２が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）；（２）イントロン３がイントロンの１の位置に移動しており、イントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン配列中の１つのヌクレオチドを変化させることにより５’スプライス供与部位の強度を増加させるように修飾されており、且つイントロン１及び２が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）；並びに（３）イントロン１がイントロン３の位置に移動しており、且つイントロン２及び３が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）。図１４Ａを参照されたい。
【0142】
これらのコンストラクトを、発現ベクターを生成し、このベクターを線形化することにより作製し、このベクターを使用して、ヌクレオフェクションによりＣＨＯ細胞をトランスフェクトして、ＣＨＯ細胞のプールを生成した。実施例１で説明されている培養プロセス中に、ＣＨＯ細胞を増殖させて免疫グロブリンを分泌させた。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価及び細胞生産性を決定した。ＣＨＯ細胞からＲＮＡを単離し、当技術分野で既知の標準的方法を使用してｃＤＮＡを調製した。ＶＨ領域及びＣＨ１領域に対する特異的プライマーを用いて逆転写酵素ＰＣＲを実施して、ＶＨ－ＣＨ１イントロンを含むコンストラクトを決定した。アガロースゲル電気泳動を実施して、ＰＣＲ産物を分離した。
【0143】
図１４Ｂは、重鎖定常領域のイントロン３のみを含むコンストラクト、重鎖定常領域のイントロン３が重鎖定常領域のイントロン１の位置に移動しているコンストラクト、及び重鎖定常領域のイントロン３が（変異を伴って）重鎖定常領域のイントロの１の位置に移動しているコンストラクトは、ＶＨ－ＣＨ１イントロンの保持を軽減しなかったが、重鎖定常領域のイントロン１がイントロン３の位置に移動しているコンストラクトは、ＶＨ－ＣＨ１イントロンが適切にスプライスアウトされたことを示す。同様に、重鎖定常領域のイントロン３のみを含むコンストラクト、重鎖定常領域のイントロン３が重鎖定常領域のイントロン１の位置に移動しているコンストラクト、及び重鎖定常領域のイントロン３が（変異を伴って）重鎖定常領域のイントロの１の位置に移動しているコンストラクトの回収力価は、対照コンストラクト（ｇＤＮＡ）と比較して有意に減少したが、重鎖定常領域のイントロン１がイントロン３の位置に移動しているコンストラクトは、回収力価レベルが対照コンストラクトと同程度であり、このことから、イントロン１の位置は重要でないがイントロン１の配列は重要であることが示唆される。
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【0144】
本発明は、本明細書で説明されている特定の態様によって範囲を限定されるものではない。実際、説明されたものだけでなく、本発明の様々な変更形態が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【0145】
本明細書で引用される全ての参考文献（例えば、公報、又は特許、又は特許出願）は、それぞれの個々の参考文献（例えば、公報、又は特許、又は特許出願）が、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれると具体的に且つ個別に示されたのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0146】
他の態様は、下記の特許請求の範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【国際調査報告】