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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】ヌクレオチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20241226BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20241226BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241226BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20241226BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241226BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241226BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/115 Z
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K48/00
A61K38/17
A61P43/00 105
A61P27/02
A61P27/16
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024541917
(86)(22)【出願日】2023-01-06
(85)【翻訳文提出日】2024-08-22
(86)【国際出願番号】 CN2023070867
(87)【国際公開番号】W WO2023134560
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】202210025336.8
(32)【優先日】2022-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522039717
【氏名又は名称】広州瑞風生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＲＥＦＯＲＧＥＮＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リャン、チュンピン
(72)【発明者】
【氏名】オウ、チアユイ
(72)【発明者】
【氏名】シュイ、ホイ
(72)【発明者】
【氏名】リン、スーミャオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA44
4C084CA18
4C084CA25
4C084CA53
4C084DA40
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZA34
4C084ZB21
(57)【要約】
ヌクレオチド及びその使用を提供し、特にＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３に特異的に結合する核酸分子を提供し、更に、前記核酸分子の調製方法及び使用を提供する。核酸分子はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端序列又はその断片に特異的に結合する能力を持ち、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを標的に妨害することができ、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のシングルスキッピングの比率を増加させることもでき、効率を有意に向上させると同時に安全性を保障することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である核酸分子。
【請求項2】
配列番号１に示される配列又はその断片に特異的に結合する能力を有する核酸分子。
【請求項3】
配列番号１に示される配列中の１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的である核酸分子。
【請求項4】
配列番号１に示される配列、又はその相補配列の１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項5】
前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項6】
前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な２２個～２７個のヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項7】
前記核酸分子は、少なくとも１６個のヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項8】
前記核酸分子は、２２個～２７個のヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項9】
前記核酸分子は、少なくとも６０個のヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記核酸分子は、Ｃｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６５９０、及びＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５８６からなる群より選択されるゲノムの位置に相補的な相応するｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項11】
前記核酸分子は、配列番号１０～２１のいずれか１個に相補的な配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項12】
前記核酸分子は、配列番号１０～２１のいずれか１個に示される配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項13】
前記核酸分子は、修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項14】
前記修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－メトキシ及び／又は２’－Ｏ－メトキシエチルからなる群より選択される修飾を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項15】
前記修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル及び／又は２’－Ｏ－エチルからなる群より選択される修飾を含む、請求項１３～１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項16】
前記核酸分子は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項17】
前記核酸分子の５’末端は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項18】
前記核酸分子の５’末端は、１個～３個の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項19】
前記核酸分子の３’末端は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項20】
前記核酸分子の３’末端は、１個～３個の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項21】
前記核酸分子は、６’－修飾された二環式ヌクレオシド、５’－修飾された二環式ヌクレオシド、６’－二置換の二環式ヌクレオシド、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体及び／又は２’－デオキシ２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノースヌクレオチド（２’－ＦＡＮＡ修飾されたヌクレオチド）からなる群より選択されるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体モノマーを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項22】
前記核酸分子は、修飾されたリン酸結合を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項23】
前記ヌクレオチド分子は、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アルキルホスホネート、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキレンホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミダート、アミノアルキルホスホロアミダート、チオホスホロアミダート、チオカルボニルアルキルホスホネート、チオカルボニルアルキルホスホトリエステル、ホスホロチオエート、セレノホスフェート、ボラノホスフェート、ホスホジエステル結合、Ｒｐ－ホスホロチオエート結合、Ｓｐ－ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－５’、３’－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－５’）、メチルホスホネート結合及び／又は３’－チオメチラール結合（３’Ｓ－ＣＨ２－Ｏ５’）からなる群より選択される化学結合により連結される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項24】
前記修飾されたリン酸結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスフェート結合、ホスホロアミダート結合、及び／又はボラノホスフェート結合からなる群より選択されるものを含む、請求項２２～２３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項25】
前記核酸分子は、少なくとも１個の修飾されたリン酸結合を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項26】
前記核酸分子の５’末端は、少なくとも１個の修飾されたリン酸結合を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項27】
前記核酸分子の５’末端は、１個～３個の修飾されたリン酸結合を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項28】
前記核酸分子の３’末端は、少なくとも１個の修飾されたリン酸結合を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項29】
前記核酸分子の３’末端は、１個～３個の修飾されたリン酸結合を含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項30】
前記核酸分子は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項31】
前記核酸分子は、一本鎖又は二本鎖である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項32】
前記核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項33】
前記核酸分子は、核内低分子ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項34】
前記核内低分子ＲＮＡは、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ及び／又はＵ７核内低分子ＲＮＡを含む、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項35】
前記核酸分子は、Ｃａｓ酵素に結合しない、請求項１～３４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項36】
前記核酸分子は、Ｃａｓ酵素に結合可能な構造を含まない、請求項１～３５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項37】
前記Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１３酵素である、請求項３５～３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項38】
前記核酸分子は、ステムループドメイン又はその誘導体構造を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項39】
前記ステムループドメインは、配列番号６に示される配列を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項40】
前記核酸分子は、ｓｍタンパク質に結合可能なドメイン又はその誘導体構造を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項41】
前記ｓｍタンパク質に結合可能なドメインは、配列番号５に示される配列を含む、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項42】
前記核酸分子は、スプライシング調節タンパク質に結合可能なドメインを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項43】
前記核酸分子は、ＳＲＳＦ１（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ １）、ＲＢＭ４（ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＤＡＺＡＰ１（ＤＡＺ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、及びＳＲ（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ－Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択されるタンパク質に結合可能なドメインを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項44】
前記核酸分子は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質に結合可能なドメインを含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項45】
前記ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質に結合可能なドメインは、配列番号３０に示される配列を含む、請求項４４に記載の核酸分子。
【請求項46】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び任意選択で発現制御エレメントを含むか、或いはコードする遺伝子発現カセット。
【請求項47】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び／又は請求項４６に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列を含むか、或いはコードするベクター。
【請求項48】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、及び／又は請求項４７に記載のベクター含むウイルス粒子。
【請求項49】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、請求項４７に記載のベクター、及び／又は請求項４８に記載のウイルス粒子含む細胞。
【請求項50】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載のウイルス粒子、及び／又は請求項４９に記載の細胞、並びに任意選択な薬学的許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項51】
前記医薬組成物は、第１担体及び第２担体を含み、前記第１担体は、請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、前記第２担体は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３及びその両側領域又はその断片に特異的に結合する能力を有する核酸分子を含む、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項52】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の両側領域は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡイントロン１２及び／又はイントロン１３を含む、請求項５０～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項53】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載のウイルス粒子、請求項４９に記載の細胞、及び／又は請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項54】
ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列又はその断片に結合可能な前記核酸分子を発現及び／又は合成することを含み、前記ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列のゲノム位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子を調製する方法。
【請求項55】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットを提供することを含む、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の発現及び／又は機能を阻害する方法。
【請求項56】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットを提供することを含む、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン１３のスプライシングスキッピングする方法。
【請求項57】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットを提供することを含む、エクソン１３を欠損した成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの調製方法。
【請求項58】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットを提供することを含む、エクソン１３の発現産物を含むＵｓｈｅｒｉｎタンパク質のレベルを低下させる方法。
【請求項59】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載のウイルス粒子、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットを提供することを含む、エクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の調製方法、並びに／或いはエクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の量を増加させる方法。
【請求項60】
請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載のウイルス粒子、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットを提供することを含む、突然変異したＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の機能を回復する方法。
【請求項61】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に用いられる医薬の調製における請求項１～４５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載のウイルス粒子、請求項４９に記載の細胞、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項５３に記載のキットの使用。
【請求項62】
前記疾患は、眼疾患及び／又は耳疾患を含む、請求項６１に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は生物医学の分野に関し、特にヌクレオチド及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｕｓｈｅｒ症候群（Ｕｓｈｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、難聴－網膜色素変性症症候群としても知られる遺伝性疾患の一種であり、程度の異なる先天性感音性難聴と、網膜色素変性症（ＲＰ）による進行性の視力喪失を特徴とする。その中で、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異はＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群の最も一般的な原因であり、Ｕｓｈｅｒ症候群患者の５０％以上を占めている。同時に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異は非症候性網膜色素変性症（ＮＳＲＰ）の重要な原因の一つでもある。ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３、エクソン５０、及びイントロン４０の突然変異は、Ｕｓｈｅｒ症候群を引き起こす。現在まで、ＵＳＨ２Ａ遺伝子全体に分布する１，０００個を超える病原性変異が同定され、エクソン１３はＵＳＨ２Ａ遺伝子で最も頻繁に突然変異するエクソンであり、約３５％を占めている。ＵＳＨ２Ａコード領域の長さは約１５．６ｋｂであり、現在の通常の遺伝子治療送達方法（組換えレンチウイルス、組換えアデノ随伴ウイルスなど）では、このような大きなコード配列をパッケージングすることが困難であるため、ＵＳＨ２Ａを直接治療することが困難になる。
【0003】
従って、本分野では、エクソンスキッピングの効率を改善し、治療の安全性を確保できるＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異関連疾患の治療方法が急務である。
【発明の概要】
【0004】
一つの方面において、本出願は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である核酸分子を提供する。
【0005】
一つの方面において、本出願は、配列番号１に示される配列又はその断片に特異的に結合する能力を有する核酸分子を提供する。
【0006】
一つの方面において、本出願は、配列番号１に示される配列のうちの１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的である核酸分子を提供する。
【0007】
一つの方面において、本出願は、配列番号１に示される配列、或いは、その相補的な配列における１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
【0008】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び任意の発現制御エレメントを含むか、或いはコードする遺伝子発現カセットを提供する。
【0009】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び／又は本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列を含むか、或いはコードするベクターを提供する。
【0010】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、及び／又は本出願に記載のベクターを含むウイルス粒子を提供する。
【0011】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、本出願に記載のベクター、及び／又は本出願に記載のウイルス粒子を含む細胞を提供する。
【0012】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、及び／又は本出願に記載の細胞、並びに任意選択な薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0013】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、及び／又は本出願に記載の医薬組成物を含むキットを提供する。
【0014】
一つの方面において、本出願は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列又はその断片に結合可能な前記核酸分子を発現及び／又は合成することを含み、前記ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列のゲノム位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である、本出願に記載の核酸分子を調製する方法を提供する。
【0015】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含むＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の発現及び／又は機能を阻害するための方法を提供する。
【0016】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含むＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングする方法を提供する。
【0017】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含むエクソン１３を欠く成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡを調製する方法を提供する。
【0018】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含むエクソン１３の発現産物を含むＵｓｈｅｒｉｎタンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。
【0019】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含むエクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質を調製する方法、及び／又はエクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の量を増加させる方法を提供する。
【0020】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含む突然変異型Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の機能を回復させる方法を提供する。
【0021】
一つの方面において、本出願は、医薬の調製における本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物及び／又は本出願に記載のキットの使用を提供し、前記医薬はＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に使用される。
【0022】
本出願は、ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有する核酸分子を提供する。現在、エクソンスキッピングを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）の技術が存在する。しかし、既存のＡＯＮはエクソン１３のスキッピングを促進すると同時に、エクソン１２とエクソン１３の同時キッピングも促進し、一部のＡＯＮ処理では、エクソン１２とエクソン１３の二重スキッピングが発生するが、単一スキッピングは発生しない。エクソン１２の全長は１９６ｂｐであり、３の整数倍ではないため、欠失するとフレームシフト突然変異が発生し、ＵＳＨ２Ａタンパク質が不活化される。例えば、本出願に記載のＵＳＨ２Ａエクソン１２は、ヒトＵＳＨ２Ａエクソン１２である。例えば、本出願に記載のＵＳＨ２Ａエクソン１３はヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３である。本出願で提供されるオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングに対して標的干渉を実行することができ、エクソン１３の単一スキッピングの比率を増加させることができるため、効率を有意に向上させるながら安全性を確保することができる。
【0023】
当業者であれば、下記の詳細な説明から本出願の他の態様及び利点を容易に理解できる。下記の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者が理解するように、本出願の内容により、当業者は、本出願に関する発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることができる。従って、本出願の図面及び説明は例示にすぎず、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0024】
本出願に関する発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本出願に関する発明の特徴及び利点は、下記に詳細に説明する例示的な実施形態及び添付の図面を参照することによって、よりよく理解することができる。図面の簡単な説明は下記の通りである：
【図1】本出願のＵ７－ｓｎＲＮＡの構造及び機能の模式図である。
【図2】異なる標的部位のＡＯＮによって誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング効果図である。
【図3B】同上
【図4B】同上
【図5】ｈｎＲＮＰ Ａ１を有するｓｎＲＮＡベクターの模式図である。
【図6B】同上
【図7】異なる標的部位のｓｎＲＮＡによって効率的に誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の単一スプライシングスキッピング効率図である。
【図8A】ＷＥＲＩ細胞において検出された化学合成Ｕ７ ｓｎＲＮＡによって誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３スプライシングスキッピング効率図である。レーン１：５０ｐｍｏｌの化学合成及び修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡ＃３０－＃４；レーン２：５０ｐｍｏｌの化学合成及び修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡ＃２６－＃１６；レーン３：５０ｐｍｏｌのＡＯＮ１；レーン４：５０ｐｍｏｌのＡＯＮ２；レーン５：ＥＧＦＰ；レーン６：ＧＬ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ２０００。図８Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲ電気泳動バンドの定量分析のヒストグラムを示す。▲Ｅ１２－Ｅ１３は、エクソン１２とエクソン１３を同時にスキップするＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡスプライスを表し、合計▲は、エクソン１３をスプライシングスキッピングする、又はエクソン１２とエクソン１３を同時にスプライシングスキッピングするＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの合計を示す。
【図8B】同上
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本出願の発明の実施形態について具体的な実施例例を挙げて説明するが、本技術に精通した者であれば、本明細書に開示された内容から本出願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。
【0026】
［用語定義］
本出願において、「単離された」という用語は、一般に、天然源に存在する他の物質から分離された分子を含むことを意図している。例えば、単離された核酸は、天然源に存在する他の物質から分離された核酸分子を指し得る。例えば、本出願において単離される分子は、人工的に合成された分子などの人工分子であってもよい。
本出願において、「単離された」という用語は、一般に、天然源に存在する他の物質から分離された分子を含むことを意図している。例えば、単離された核酸は、天然源に存在する他の物質から分離された核酸分子を指し得る。例えば、本出願において単離される分子は、人工的に合成された分子などの人工分子であってもよい。
【0027】
本出願において、「発現制御エレメント」という用語は一般に、遺伝子の転写及び翻訳のために、及び／又はインビボ、例えば所望の宿主細胞においてタンパク質の発現を制御するために提供される配列を指す。
【0028】
本出願において、「ウイルス粒子」という用語は、一般に、核酸ベクターを指す。例えば、ウイルス粒子は、ウイルス粒子内にパッケージ化されたベクターゲノム（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を含む、核酸送達ビヒクルとして機能するために使用され得るウイルスベクターであってもよい。
【0029】
本出願において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、一般に、標的核酸の対応する断片へのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【0030】
本出願において、「核酸」という用語は、一般に、単量体ヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない。
【0031】
本出願において、「核内低分子ＲＮＡ」という用語は、一般に低分子核酸分子を指す。例えば、核内低分子ＲＮＡは真核生物の核におけるＲＮＡプロセシングに関与することができる。例えば、核内低分子ＲＮＡは関連タンパク質と結合して核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ、即ち、ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）を形成することができ、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）のスプライシングに関与する。
【0032】
本明細書で使用される場合、「相補性」又は「塩基相補性」という用語は、一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的核酸中の対応する核酸塩基と正確に塩基対を形成する（即ち、ハイブリダイゼーション）能力を指し、そしてそれは、対応する核酸塩基間のワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）相互作用力の結合によって媒介される。
【0033】
本出願において、「遺伝子発現カセット」という用語は一般に、特定の制限部位で、又は相同組換えによって核酸又はポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡセグメントを指す。例えば、遺伝子発現カセットは、標的核酸をコードするポリヌクレオチド断片を含む。
【0034】
本出願において、「ゲノム位置」という用語は一般に、対象となるＤＮＡ領域を説明する染色体座標を指す。例えば、染色体座標は、２００９年２月にリリースされたヒトゲノムデータベースバージョンＨｇ１９（又は「Ｈｇ１９座標」と称される）と一致してもよい。例えば、本出願のＤＮＡ領域は、Ｈｇ１９座標によって限定される領域に由来してもよい。
【0035】
本出願において、「スプライシングスキップング」という用語は、一般にＲＮＡ分子のプロセシングの過程において、スプライシングスキップングされた配列は、プロセシングされたＲＮＡ分子には含まれないことを指す。例えば、スプライシングスキッピングにより、配列の一部がスキップされることができる。例えば、スプライシングスキッピングにより、スプライスされたＲＮＡ分子に配列の一部が含まれないことができる。
【0036】
本出願において、「修飾されたオリゴヌクレオチド」という用語は、一般に、少なくとも１個の修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された糖、及び／又は修飾された核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを指す。本出願において、用語「２’－Ｏ－メトキシエチル」（又は、２’－ＭＯＥ及び２’－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ３及びＭＯＥとも称される）は、一般に、フラノース環の２’位のＯ－メトキシ－エチル修飾を指す。２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は修飾された糖である。本出願において、「２’－ＭＯＥヌクレオシド」（２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドとも称される）という用語は、一般に、ＭＯＥ修飾された糖部分を含むヌクレオシドを指す。本出願において、「２’置換されたヌクレオシド」という用語は、一般に、フラノース環の２’位にＨ又はＯＨ以外の置換基を含むヌクレオシドを指す。特定の実施形態では、２’置換ヌクレオシドは、二環式修飾された糖を有するヌクレオシドを含む。本出願において、「５－メチルシトシン」という用語は、一般に、５’位に結合したメチルで修飾されたシトシンを指す。５－メチルシトシンは修飾された核酸塩基である。
【0037】
本出願において、「修飾されたリン酸結合」という用語は、一般に、天然に存在するヌクレオシド間結合（即ち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）に対する修飾されたリン酸結合の存在下での置換又は何らかの変化を指す。
【0038】
本出願において、「ステムループドメイン」という用語は、一般に、塩基対形成を通じて核酸分子自体によって形成される二次構造を指す。例えば、塩基対が形成されて二本鎖になった部分が「ステム」であり、塩基対の間の配列が「ループ」を形成する。
【0039】
本出願において、「連続する」という用語は、一般に、互いに直接隣接する２個以上の核酸塩基を指す。
【0040】
本出願において、「エキソン」という用語は、一般に、ｍＲＮＡの成熟型に存在する遺伝子の一部を指す。
【0041】
本出願において、「ベクター」という用語は一般に、それに結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。
【0042】
本出願において、「Ｃａｓ酵素」という用語は一般に、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼを指す。例えば、特定のＤＮＡ配列に二本鎖切断を形成することができる。Ｃａｓヌクレアーゼは通常、ＣＲＩＳＰＲ配列に相補的であり、特定のＤＮＡ鎖を認識して切断するためのガイド（ｇｕｉｄｅ）としてＣＲＩＳＰＲ配列を使用できる。
【0043】
本出願において、「ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」という用語は一般に前駆体ｍＲＮＡを指す。例えば、一次転写物はＤＮＡ転写によって合成された一本鎖リボ核酸産物であり、転写物は修飾されなくてもよい。例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソンとイントロンのゲノム構造は変化しない。
【0044】
本出願において、「ｓｍタンパク質」という用語は、一般に、ｓｎＲＮＡに結合して核内低分子リボ核タンパク質複合体ｓｎＲＮＰを形成することができるタンパク質又はその変異体を指す。
【0045】
本出願において、「ＵＳＨ２Ａ」という用語は一般に、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質をコードする遺伝子を指す。例えば、ＵＳＨ２Ａ（Ｕｓｈｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｔｙｐｅ－２Ａ）のＮＣＢＩ遺伝子登録番号は７３９９であってもよい。本出願において、ＵＳＨ２Ａは、その未処理形態、任意の加工された形態、その変異体、又はその機能的に活性な断片を含む物質を含み得る。
【0046】
本出願において、「投与」という用語は、一般に、動物に医薬品を提供することを指し、医学専門家による投与及び自己投与が含まれるがこれに限定されない。
【0047】
［発明の詳細な説明］
一つの方面において、本出願は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置がＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３（ＮＣＢＩデータベースＧＲｃｈ３８バージョンに対応）である核酸分子を提供する。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９０、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５８６である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２６、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２６である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２１、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２１である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２４、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２４である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６１７、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６１７である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６５９３、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２６であり、その配列は、配列番号３９に示された通りである。例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の塩基対の組み合わせであり得る。例えば、突然変異した配列の組み合わせであり得る。例えば、前記組み合わせは１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ又は５ｂｐのミスマッチを含み得る。
一つの方面において、本出願は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置がＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３（ＮＣＢＩデータベースＧＲｃｈ３８バージョンに対応）である核酸分子を提供する。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９０、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５８６である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２６、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２６である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２１、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２１である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２４、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２４である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６１７、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６１７である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６５９３、及び／又はＣｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３である。例えば、本出願の前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６６２６であり、その配列は、配列番号３９に示された通りである。例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の塩基対の組み合わせであり得る。例えば、突然変異した配列の組み合わせであり得る。例えば、前記組み合わせは１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ又は５ｂｐのミスマッチを含み得る。
【0048】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子エクソン１３は突然変異を含み得、突然変異は、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｃｙｓ９３４Ｔｒｐ、中国の患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｅ７６７ＳｆｓＸ２１、ヨーロッパとアメリカの患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（アミノ酸変化：ｐ．Ｃ７５９Ｆ）、Ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ８４１Ｙ）、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４８Ｘ）、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ（Ｃ８４７Ｘ）、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ（Ｌｅｕ９２１ｆｓ）及びＣ．２７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ９２６Ｃ）、Ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ、Ｃ．２３１０ｄｅｌＡ、ｃ．２３９１＿２３９２ｄｅＩＴＧ、ｃ．２４３１Ａ＞Ｔ、Ｃ．２４３１＿２４３２ｄｅｌＡＡ、ｃ．２４４０Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５２５ｄｕｐ、Ｃ．２６１０Ｃ＞Ａ、Ｃ．２７５５Ｃ＞Ｔ、Ｃ．２１７６Ｔ＞Ｃ、Ｃ．２２３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２２９６Ｔ＞Ｃ、及び／又はＣ．２３３２Ｇ＞Ｔを含んでもよい。
【0049】
一つの方面において、本出願は、配列番号１に示される配列又はその断片に特異的に結合する能力を有してもよい核酸分子を提供する。例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の塩基対の組み合わせであってもよい。例えば、突然変異した配列に対する組み合わせであり得る。例えば、前記組み合わせは１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ又は５ｂｐのミスマッチを含んでもよい。
【0050】
一つの方面において、本出願は、配列番号１に示される配列中の１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的であってもよい核酸分子を提供する。例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の塩基対が相補的であり得る。例えば、突然変異した配列に相補的であり得る。例えば、前記相補性は１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ又は５ｂｐのミスマッチを含んでもよい。
【0051】
一つの方面において、本出願は、配列番号１に示される配列又はその相補配列中の１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含んでもよい核酸分子を提供する。例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の塩基対が相補的であり得る。例えば、突然変異した配列に相補的であり得る。例えば、前記相補性は１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ又は５ｂｐのミスマッチを含んでもよい。
【0052】
例えば、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的であってもよい少なくとも１６個のヌクレオチドを含む。例えば、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的であってもよい２２個～２７個のヌクレオチドを含む。例えば、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的であってもよい１５個～２７個、１６個～２７個、１８個～２７個、２０個～２７個、２２個～２７個、２５個～２７個、１５個～２５個、１６個～２５個、１８個～２５個、２０個～２５個、２２個～２５個、１５個～２２個、１６個～２２個、１８個～２２個、２０個～２２個、１５個～２０個、１６個～２０個、１８個～２０個、１５個～１８個、又は１６個～１８個のヌクレオチドを含む。例えば、認識ドメイン配列の長さは１６ｂｐ以上であってもよく、また、１８ｂｐ～４０ｂｐであってもよく、更に、２０ｂｐ～２７ｂｐであってもよい。一部の化学的に合成され修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡの実施例では、認識ドメイン配列の長さを、標的配列の５’末端又は／及び３’末端に沿った逆相補的対形成を通じて延長することができ、好ましくは、延長された単一認識ドメイン配列の長さは４０ｂｐ以下である。
【0053】
例えば、前記核酸分子は少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子は少なくとも２２個～２７個のヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子は１５個～２７個、１６個～２７個、１８個～２７個、２０個～２７個、２２個～２７個、２５個～２７個、１５個～２５個、１６個～２５個、１８個～２５個、２０個～２５個、２２個～２５個、１５個～２２個、１６個～２２個、１８個～２２個、２０個～２２個、１５個～２０個、１６個～２０個、１８個～２０個、１５個～１８個、又は１６個～１８個のヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子はＡＯＮ分子である。
【0054】
例えば、前記核酸分子は少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子は少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、又は少なくとも５００個のヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子はｓｎＲＮＡ分子である。例えば、ｓｎＲＮＡ分子はさらに多くの要素を含んでもよく、理論的に無限な長さを有し得る。一つの実施形態において、化学合成されたｓｎＲＮＡ配列の全長は９６ｂｐ以上である。一つの実施形態において、化学合成されたｓｎＲＮＡの両側の３～４０個の塩基は修飾され、特異的なリン酸エステル結合によって結合されている。
【0055】
例えば、前記核酸分子は、Ｃｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６５９０、及びＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５８６からなる群より選択されるゲノム位置に相補的な配列を含んでもよい。
【0056】
例えば、前記核酸分子は、配列番号１０～２１のいずれか一つに相補的な配列を含んでもよい。例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％以上の塩基対の相補性であり得る。例えば、突然変異した配列に対する相補であってもよい。例えば、前記相補性は、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、又は５ｂｐのミスマッチを含んでもよい。幾つかの化学的に合成され修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡの実施例において、認識ドメインは、標的部位と逆相補的対に０～５個のミスマッチヌクレオチドを有してもよく、例えば、０～１個であってもよい。
【0057】
例えば、前記核酸分子は、配列番号１０～２１のいずれか一つに示される配列を含んでもよい。
【0058】
例えば、前記核酸分子は修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
【0059】
例えば、前記修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－メトキシ、及び／又は２’－Ｏ－メトキシエチルからなる群より選択される修飾を含んでもよい。
【0060】
例えば、前記修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル及び／又は２’－Ｏ－エチルからなる群より選択される修飾を含んでもよい。
【0061】
例えば、前記核酸分子は少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡの両側の１～１０、６～８０個のみ、又はすべてのヌクレオチドは修飾され、特異的なリン酸エステル結合によって連結され、前記修飾は、１個又は２個以上の修飾の組み合わせであり、前記特異的なリンエステル酸結合は、１個又は２個以上のリン酸エステル結合の組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記化学合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡ中のすべてのヌクレオチドは、リン酸エステル結合を介して互いに連結され、すべてが２’－Ｏ－メトキシで修飾される。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡの両側の３個のヌクレオチドのみがリン酸エステル結合を介して連結され、２’－Ｏ－メトキシで修飾される。化学的に合成され修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡのいくつかの好ましい実施形態において、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの５’末端の最初のヌクレオチドは、好ましくは、アデニル酸（Ａ）であり、認識ドメインの５’末端の最初のヌクレオチドがアデニル酸（Ａ）ではない場合、５’末端にアデニル酸（Ａ）が連結される。
【0062】
例えば、前記核酸分子の５’末端は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子の５’末端は、１個～３個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子の５’末端は、１個、２個、３個、４個又は５個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
【0063】
例えば、前記核酸分子の３’末端は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子の３’末端は、１個～３個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子の３’末端は、１個、２個、３個、４個又は５個の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
【0064】
本出願に記載の核酸分子において、前記核酸分子中のヌクレオチド分子は、６’－修飾された二環式ヌクレオシド、５’－修飾された二環式ヌクレオシド、６’－二置換の二環式ヌクレオシド、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体及び／又は２’－デオキシ２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノースヌクレオチド（２’－ＦＡＮＡ修飾されたヌクレオチド）からなる群より選択されるものを含んでもよい。
【0065】
例えば、前記核酸分子は修飾されたリン酸結合を持つ。
【0066】
例えば、前記ヌクレオチド分子は、チオホスフェート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミダート結合、アミノアルキルホスホロアミダート結合、チオホスホロアミダート結合、チオカルボニルアルキルホスホネート結合、チオカルボニルアルキルホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合、セレノホスフェート結合、ボラノホスフェート結合からなる群より選択されるリン酸結合を介して結合される。
【0067】
例えば、前記修飾されたリン酸結合は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合（５’Ｏ－Ｐ（Ｓ）Ｏ－３Ｏ－、５’Ｓ－Ｐ（Ｏ）Ｏ－３’－Ｏ－及び５’Ｏ－Ｐ（Ｏ）Ｏ－３’Ｓ－）、ホスホロジチオエート結合、Ｒｐ－ホスホロチオエート結合、Ｓｐ－ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－５’及び３’－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－５’）、メチルホスホネート結合、３’－チオメチラール（ｔｈｉｏｍｅｔｈｙｌａｌ）結合、アミド結合（３’ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－５’）、及び／又はホスホロアミダート基からなる群より選択される組み合わせを含んでもよい。
【0068】
例えば、前記修飾されたリン酸結合は、チオホスフェート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、アミドホスフェート結合、及び／又はボラノホスフェート結合からなる群より選択される組み合わせを含んでもよい。
【0069】
例えば、前記修飾されたリン酸結合は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合（５’Ｏ－Ｐ（Ｓ）Ｏ－３Ｏ－、５’Ｓ－Ｐ（Ｏ）Ｏ－３’－Ｏ－及び５’Ｏ－Ｐ（Ｏ）Ｏ－３’Ｓ－）、ホスホロジチオエート結合、Ｒｐ－ホスホロチオエート結合、Ｓｐ－ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－５’及び３’－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－５’）、アルキルホスフェート結合、アミドホスフェート結合、メチルホスホネート結合、３’－チオメチラール結合、アミド結合（３’ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－５’）及び／又はホスホロアミダート基からなる群より選択される組み合わせを含んでもよい。
【0070】
例えば、前記核酸分子は、少なくとも１個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。
【0071】
例えば、前記核酸分子の５’末端は、少なくとも１個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。例えば、前記核酸分子の５’末端は、１個～３個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。例えば、前記核酸分子の５’末端は、１個、２個、３個、４個又は５個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。
【0072】
例えば、前記核酸分子の３’末端は、少なくとも１個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。例えば、前記核酸分子の３’末端は、１個～３個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。例えば、核酸分子の５’末端は、１個、２個、３個、４個又は５個の修飾されたリン酸結合を含んでもよい。
【0073】
例えば、前記核酸分子には、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含んでもよい。
【0074】
例えば、前記核酸分子は一本鎖又は二本鎖である。
【0075】
例えば、前記核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を含んでもよい。
【0076】
例えば、前記核酸分子は、核内低分子ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）を含んでもよい。
【0077】
例えば、前記核内低分子ＲＮＡはＵ１核内低分子ＲＮＡ及び／又はＵ７核内低分子ＲＮＡを含んでもよい。例えば、前記核内低分子ＲＮＡは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６及び／又はＵ７核内低分子ＲＮＡを含んでもよい。例えば、前記核内低分子ＲＮＡは、Ｕ１核内低分子ＲＮＡを含んでもよい。例えば、前記核内低分子ＲＮＡは、Ｕ７核内低分子ＲＮＡを含んでもよい。
【0078】
例えば、前記核酸分子はＣａｓ酵素に結合しない。例えば、前記核酸分子は、Ｃａｓ酵素と結合可能な構造を含まなくてもよい。例えば、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ１３酵素である。
【0079】
例えば、前記核酸分子はステムループドメイン又はその誘導体を含んでもよい。例えば、前記ステムループドメインは、配列番号６に示される配列を含んでもよい。
【0080】
例えば、前記核酸分子は、ＳＭタンパク質に結合可能なドメイン又はその誘導体構造を含んでもよい。例えば、前記ＳＭタンパク質に結合可能なドメインは、配列番号５に示される配列を含んでもよい。例えば、前記ｓｍタンパク質に結合可能なドメインは、最適化されたｓｍＯＰＴ配列を含んでもよい。例えば、前記ｓｍタンパク質結合ドメインは、ヒト由来、マウス由来又はブタ由来を含んでもよい。
【0081】
例えば、前記核酸分子は、スプライシング調節タンパク質を動員できるドメインを含んでもよい。例えば、前記核酸分子は、ＳＲＳＦ１（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ １）、ＲＢＭ４（ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＤＡＺＡＰ１（ＤＡＺ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、及びＳＲ（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ－Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択されるヒストンに結合可能なドメインを含んでもよい。
【0082】
例えば、前記核酸分子は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質に結合可能なドメインを含んでもよい。例えば、前記ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質に結合可能なドメインは、配列番号３０に示される配列を含んでもよい。
【0083】
例えば、本出願の核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列に対応するゲノムの位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３であり、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよく、前記核酸分子は少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよい。
【0084】
例えば、本出願の核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列に対応するゲノムの位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３であり、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよく、前記核酸分子は少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでもよい。
【0085】
例えば、本出願の核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列に対応するゲノムの位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３であり、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよく、前記核酸分子は少なくとも６０個ヌクレオチドを含んでもよく、化学合成されたｓｎＲＮＡの両側の３～４０個の塩基が修飾され、特異的なリン酸結合によって結合される。
【0086】
例えば、本出願の核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列に対応するゲノムの位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３であり、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよく、前記核酸分子は少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでもよく、化学合成されたｓｎＲＮＡの両側の３～４０塩基は２’－メトキシで修飾され、チオホスフェート結合で結合される。
【0087】
例えば、本出願の核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列に対応するゲノムの位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３であり、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含んでもよく、前記核酸分子は少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでもよく、化学合成されたｓｎＲＮＡの両側の３個の塩基は２’－メトキシで修飾され、チオホスフェート結合で連結され、前記核酸分子は、ｓｍタンパク質に結合可能なドメイン又はその誘導体構造を含んでもよい。任意選択で、前記核酸分子は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質に結合可能なドメインを含んでもよい。
【0088】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び任意選択な発現制御エレメントを含むか、或いはコード可能な遺伝子発現カセットを提供する。
【0089】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び／又は本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列を含むか、或いはコード可能なベクターを提供する。一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、及び／又は本出願に記載のベクターを含んでもよいウイルス粒子を提供する。例えば、本出願のベクターは、ｐＵＣ５７であってもよく、又はｐＡＡＶ－ＣＭＶ（ＴＡＫＡＲＡ社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：６６５０）、レンチウイルス、トランスポゾン及び当技術分野で公知の核酸ベクターから選択されることができる。例えば、本出願は、ＡＡＶを介してＵ７ ｓｎＲＮＡを送達することにより、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導でき、前記ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、天然由来のものであってもよく、又は天然由来のキャプシドタンパク質に基づく変異体であってもよく、指向性進化を経てもよく、又はアミノ酸／ペプチド（コドン最適化、異なる血清型機能性ペプチドセグメントのキメリズムなど）などの合理的修飾を受けてもよく、組織及び臓器の指向性、免疫原性、トランスフェクション効率を向上させ、例えば、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ９．ＨＲ、ＣＡＭ１３０等である。前記天然由来のＡＡＶキャプシドタンパク質は、動物由来であってもよく、植物由来であってもよく、前記動物由来のＡＡＶキャプシドタンパク質はヒト（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９等）由来であってもよく、また、ヒト以外の霊長類（例えば、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０及びＡＡＶｒｈ．４３）由来であってもよく、また、マウス、ブタなどの脊椎動物由来であってもよく、昆虫由来であってもよい。本発明のＡＡＶプラスミド系において、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ血清型は、Ｒｅｐ遺伝子血清型と一致する必要があり、Ｃａｐ遺伝子血清型と一致しなくてもよい。
【0090】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、本出願に記載のベクター、及び／又は本出願に記載のウイルス粒子を含んでもよい細胞を提供する。
【0091】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、及び／又は本出願に記載の細胞、並びに任意選択な薬学的に許容される担体を含んでもよい医薬組成物を提供する。
【0092】
例えば、前記医薬組成物は、第１担体及び第２担体を含んでもよく、前記第１担体は、本出願に記載の核酸分子を含んでもよく、前記第２担体は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３及びその両側領域又はその断片に特異的に結合する能力を有する核酸分子を含んでもよい。例えば、第２ベクターは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡイントロン１２－エクソン１３－イントロン１３から選択される配列に特異的に結合する能力を有する核酸分子を含んでもよく、例えば、エクソン１３及びその両側の標的隣接領域から選択されてもよい。例えば、ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４７２４６に対応するｐｒｅ－ｍＲＮＡ領域から選択されることができる。例えば、標的配列が全く同じではない２個又は２個以上のＵ７－ｓｎＲＮＡを組み合わせて使用することができる。
【0093】
例えば、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の両側領域は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡイントロン１２及び／又はイントロン１３を含んでもよい。
【0094】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、及び／又は本出願に記載の医薬組成物を含むキットを提供する。
【0095】
一つの方面において、本出願は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列又はその断片に結合可能な核酸分子を発現及び／又は合成することができる、前記ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列のゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である、本出願に記載の核酸分子を調製するた方法を提供する。
【0096】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含んでもよい、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の発現及び／又は機能を阻害する方法を提供する。例えば、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の発現及び／又は機能を阻害するということは、成熟ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにエクソン１３の発現産物の領域が含まれないことを意味することができる。
【0097】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含んでもよい、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング方法を提供する。
【0098】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含んでもよい、エクソン１３を欠く成熟ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを調製する方法を提供する。
【0099】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含んでもよい、エクソン１３の発現産物を含んでもよいＵｓｈｅｒｉｎタンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。
【0100】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含んでもよい、エクソン１３の発現産物を含まなくてもよいＵｓｈｅｒｉｎタンパク質を調製する方法、及び／又はエクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の量を増加させる方法を提供する。例えば、本出願で調製されるＵｓｈｅｒｉｎタンパク質は、エキソン１３により発現されるポリペプチド又はその変異体を含まない。
【0101】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載のウイルス粒子、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供することを含んでもよい、突然変異型Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の機能を回復させる方法を提供する。例えば、エキソン１３をスプライシングスキップングすることにより、本出願で調製されたＵｓｈｅｒｉｎタンパク質は、健康な対象体内の野生型Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の機能を維持又は基本的に維持する。例えば、突然変異型Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質を発現している被験者では、網膜色素変性症、先天性変性神経性難聴、前庭機能障害、及びその他の疾患の症状が軽減される。
【0102】
一つの方面において、本出願は、医薬の調製における、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットの使用を提供し、前記医薬はＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に使用される。例えば、前記疾患は、眼疾患及び／又は耳疾患を含んでもよい。例えば、前記疾患はＵｓｈｅｒ症候群を含んでもよい。例えば、前記疾患はII型Ｕｓｈｅｒ症候群を含んでもよい。
【0103】
一つの方面において、本出願は、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを投与することを含む、ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療する方法を提供する。例えば、前記疾患は、眼疾患及び／又は耳疾患を含んでもよい。例えば、前記疾患はＵｓｈｅｒ症候群を含んでもよい。例えば、前記疾患はII型Ｕｓｈｅｒ症候群を含んでもよい。
【0104】
一つの方面において、本出願は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療する、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載のベクター、本出願に記載の細胞、本出願に記載の医薬組成物、及び／又は本出願に記載のキットを提供する。例えば、前記疾患は、眼疾患及び／又は耳疾患を含んでもよい。例えば、前記疾患はＵｓｈｅｒ症候群を含んでもよい。例えば、前記疾患はII型Ｕｓｈｅｒ症候群を含んでもよい。
【0105】
ＵＳＨ２Ａは通常、Ｕｓｈｅｒｉｎンをコードする遺伝子を指す。ＵＳＨ２Ａは１ｑ４１に位置し、ゲノム内で８００ｋｂ以上にまたがり、大きな膜貫通タンパク質Ｕｓｈｅｒｉｎをコードし、網膜光受容細胞及び内耳有毛細胞の原形質膜に固定されており、繊毛の発達と維持に不可欠な成分である。網膜において、ＵｓｈｅｒｉｎはＵＳＨ２複合体の重要な部分であり、光受容体の外節の安定化に役割を果たしていると考えられている。ＵＳＨ２Ａは２個のサブタイプがあり、網膜細胞の主なサブタイプには７２個のＥｘｏｎが含まれており、コード領域の長さは約１５．６ｋｂである。Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の細胞外部分は、１０個のＬａｍｉｎｉｎ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ（ＬＥ）ドメインと３５個のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ３（ＦＮ３）ドメインを含む多くの反復ドメインを含む。ヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３は長さ６４２ｂｐであり、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質中の１０個のＬＥドメインのうちの４個であるアミノ酸７２３～９３６をコードする。
【0106】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３、エクソン５０、及びイントロン４０の突然変異は、Ｕｓｈｅｒ症候群を引き起こす。現在までに、ＵＳＨ２Ａ遺伝子全体で１，０００を超える病原性突然変異が同定されており、そのうちエクソン１３はＵＳＨ２Ａ遺伝子内で最も頻繁に突然変異するエクソンであり、約３５％を占めている。ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３の突然変異は、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｃｙｓ９３４Ｔｒｐ、中国の患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｅ７６７ＳｆｓＸ２１、ヨーロッパとアメリカの患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（アミノ酸変化：ｐ．Ｃ７５９Ｆ）、Ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ８４１Ｙ）、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４８Ｘ）、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ（Ｃ８４７Ｘ）、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ（Ｌｅｕ９２１ｆｓ）及びＣ．２７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ９２６Ｃ）、Ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ、Ｃ．２３１０ｄｅｌＡ、ｃ．２３９１＿２３９２ｄｅＩＴＧ、ｃ．２４３１Ａ＞Ｔ、Ｃ．２４３１＿２４３２ｄｅｌＡＡ、ｃ．２４４０Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５２５ｄｕｐ、Ｃ．２６１０Ｃ＞Ａ、Ｃ．２７５５Ｃ＞Ｔ、Ｃ．２１７６Ｔ＞Ｃ、Ｃ．２２３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２２９６Ｔ＞Ｃ、Ｃ．２３３２Ｇ＞Ｔを含む。
【0107】
ＵＳＨ２Ａコード領域の長さは約１５．６ｋｂであり、現在の通常の遺伝子治療送達方法（例えば、組換えレンチウイルス、組換えアデノ随伴ウイルスなど）では、このような大きなコード配列をパッケージングすることが困難であるため、ＵＳＨ２Ａの直接送達による治療は困難でなる。マウスＵＳＨ２Ａエクソン１２はヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３と相同であり、両方とも長さは６４２ｂｐであり、当該エクソンの除去によってその後のフレームシフト突然変異は引き起こされない。研究により、マウスＵＳＨ２Ａのエクソン１２がノックダウンされた後でも、Ｕｓｈｅｒｉｎは依然として正しく配置され、通常の機能を実行できることが示された。病原性突然変異を含むヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３の場合、一連の方法を使用してスキッピングを誘導して治療することができる。
【0108】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるゲノムＤＮＡ編集は、エクソン１３を直接削除するか、ＲＮＡスプライシング関連部位を破壊する。断片の除去の使用には、染色体の再配列、ウイルスの組込み、逆再組込みなどのリスクが伴い、並びに、ＣＡＳシステムの長時間発現、又は比較的大きなゲノム背景に基づく２個のｇＲＮＡ誘導性二重切断のオフターゲットの確率が高くなる。単一の塩基エディターを使用して、上記のスプライシング関連部位の主要な塩基を変更する方法により、エクソンスキッピングを促進される可能性もある。ただし、既存の単一塩基エディターは単一のＡＡＶベクターを介してロードできない可能性があり、ＰＡＭ、編集ウィンドウ、及び塩基変換タイプによって制限され、スプライシング関連部位の近くに適切なｇＲＮＡがない可能性がある。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を使用して、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを標的に阻害して、より高い効率でエクソンスキッピングを促進する。ＡＯＮはエクソン１３のスキッピングを促進すると同時に、エクソン１２とエクソン１３の同時スキッピングも促進し、一部のＡＯＮ処理により、すべて二重スキップ読み取りが発生する可能性がある。エクソン１２の全長は１９６ｂｐであり、３の整数倍ではないため、欠失はフレームシフト突然変異を引き起こす。Ｕ７ ｓｎＲＮＡでｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを標的に干渉して、ＡＯＮよりもエクソンスキッピングの促進効率が高く、エクソン１３の単一スキッピングの割合が増加し、安全性を確保しながら効率を有意に向上させる。本出願によって発見された効果、即ち、本出願の領域を標的とするｓｎＲＮＡ分子は、エクソンスキッピングの効率を促進する効果は同じ標的を有するＡＯＮ分子よりも高いが、これは既知の先行技術では明らかではない。例えば、本分野のＣｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１を標的とするＡＯＮ分子は、当該領域を標的とするｓｎＲＮＡ分子よりエクソンの効率を促進するスキッピング効果が有意に優れている。細胞内には核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）があり、これは真核生物の転写後プロセシング中のＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することでｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。その長さは哺乳類では約１００～２１５ヌクレオチドであり、Ｕが豊富であるため７個のカテゴリーに分けられ、Ｕ１～Ｕ７と番号が付けられる。修飾されたＵ７ ＳｎＲＮＡは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの非標準的なＳｍ結合部位を主なスプライセオソームＵ ｓｎＲＮＰｓに由来するコンセンサス配列で置き換え、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの５’領域のヒストン結合配列を修飾対象の遺伝子の相補配列に変更し、エキソンを標的としてエキソンのスプライシングスキッピングを誘導できる。
【0109】
いかなる理論によっても制限することを意図するものではないが、以下の実施例は、本出願のヌクレオチド、調製方法及び使用を説明するのみのものであり、本出願の発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0110】
実施例１
ｓｎＲＮＡの合成
ＳｎＲＮＡ骨格を合成した。野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造（ｓｃａｆｆｏｒｄ）、Ｕ７特異的Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ、配列番号２）、及び認識ドメイン（ヒストンｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的）を含む。本出願のＵ７ ｓｎＲＮＡは、ＮＣＢＩ上のマウス野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの遺伝子配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＲ＿０２４２０１．３）に基づく、Ｕ７特異的Ｓｍ結合部位（ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ、配列番号３）は最適化されたコンセンサスＳｍ配列、即ち、ＳｍＯＰＴ（ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ、配列番号４；又はＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ、配列番号５）で置換され、ＳｍＯＰＴ配列の５’末端の元の認識ドメインは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの特異的標的部位と逆相補的対の認識ドメインに代替され、ＳｍＯＰＴ配列の３’末端はＵ７の元のステムループ構造配列（ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ、配列番号６）を保持する。
ｓｎＲＮＡの合成
ＳｎＲＮＡ骨格を合成した。野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造（ｓｃａｆｆｏｒｄ）、Ｕ７特異的Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ、配列番号２）、及び認識ドメイン（ヒストンｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的）を含む。本出願のＵ７ ｓｎＲＮＡは、ＮＣＢＩ上のマウス野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの遺伝子配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＲ＿０２４２０１．３）に基づく、Ｕ７特異的Ｓｍ結合部位（ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ、配列番号３）は最適化されたコンセンサスＳｍ配列、即ち、ＳｍＯＰＴ（ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ、配列番号４；又はＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ、配列番号５）で置換され、ＳｍＯＰＴ配列の５’末端の元の認識ドメインは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの特異的標的部位と逆相補的対の認識ドメインに代替され、ＳｍＯＰＴ配列の３’末端はＵ７の元のステムループ構造配列（ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ、配列番号６）を保持する。
【0111】
図１は、本出願のＵ７－ｓｎＲＮＡの構造と機能の模式図を示す。ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３を標的として誘導するＵ７ ｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡイントロン１２－エクソン１３－イントロン１３から選択される標的配列と逆相補的対になり、標的配列は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列標的領域から選択されることができる。ｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列の好ましい長さは１６ｂｐ以上であり、より好ましくは、１８ｂｐ～４０ｂｐであり、さらに好ましくは、２０ｂｐ～２７ｂｐである。
【0112】
具体的な操作過程：まず、全遺伝子合成により、遺伝子配列－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（５’－マウスＵ７プロモーター－ｓｍＯＰＴ配列－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｒｄ－ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’）を含むｐＵＣ５７ベクターを合成した。２個のＴｙｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、ＢｓａＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｍＢＩ等）をＵ７プロモーターとｓｍＯＰＴの間に加えて、その後の切断、他の認識ドメイン配列の置換及び挿入を容易にした。ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的な３’カセットは、マウスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５４７４８．１）Ｕ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端の後ろに、「ＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡ（配列番号７）」の配列を含み、ｐｒｅ－ｓｎＲＮＡのプロセシングに関与し、好ましくは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端の後ろの配列長は２８～１３１ｂｐの遺伝子断片であり、より好ましくは、配列長は１０６ｂｐである。
【0113】
標的領域を標的としたＵ７ ｓｎＲＮＡベクターの構築
表１ＡのｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、認識ドメイン配列に相応するＤＮＡ配列であり、５’にＣＣＧＣＡを加え、アンチセンス鎖は、認識ドメイン配列のアンチセンス相補配列の５’にＡＡＴＴを加え、３’にＴを加えた。例えば、認識ドメイン配列が５’－ＮＮＮ－３’である場合、合成したＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖は５’－ＣＣＧＣＡＮＮＮ－３’であり、アンチセンス鎖５’－ＡＡＴＴＮＮＮＴ－３’である。
表１ＡのｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、認識ドメイン配列に相応するＤＮＡ配列であり、５’にＣＣＧＣＡを加え、アンチセンス鎖は、認識ドメイン配列のアンチセンス相補配列の５’にＡＡＴＴを加え、３’にＴを加えた。例えば、認識ドメイン配列が５’－ＮＮＮ－３’である場合、合成したＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖は５’－ＣＣＧＣＡＮＮＮ－３’であり、アンチセンス鎖５’－ＡＡＴＴＮＮＮＴ－３’である。
【0114】
合成したＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖とアンチセンス鎖をアニーリング反応系（総反応量２０μｌ：Ｏｌｉｇｏ－Ｆ（１００μＭ）２μｌ＋Ｏｌｉｇｏ－Ｒ（１００μＭ）２μｌ＋１０×ＮＥＢ Ｃｕｔｔｅｒ ｓｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ＋脱イオン水１６μｌ）に従って混合し、９５℃で５分間培養した後、氷上に置いて冷却させ、アニーリングして粘着末端を持つ二本鎖ＤＮＡを形成した。１００倍に希釈した後、１μｌを取り、１０ｎｇのＢｓａＩによって酵素切断及び回収された線形化ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ骨格プラスミドとＴ４リガーゼ連結を実行した。連結生成物をさらに、大腸菌コンピテントセルの形質転換、単一クローニング、ＰＣＲ及び配列決定により、ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡベクターを得た。プラスミドを精製し、後で使用するために－２０℃で保存した。
【0115】
ＡＯＮの合成
表１ＢのＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の標的領域に従って、当該領域に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮの配列を設計及び合成した。
表１ＢのＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の標的領域に従って、当該領域に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮの配列を設計及び合成した。
【0116】
【表1A】
【0117】
【表1B】
【0118】
Ｕ７－ｓｎＲＮＡの化学合成と修飾
オリゴヌクレオチドと同じように、Ｕ７ ｓｎＲＮＡも直接化学合成によって、ガイド配列、ｓｍＯＰＴ及びＵ７ ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｒｄ含むＲＮＡを生成することができる。インビトロで合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡは、特異的修飾によってヌクレアーゼ分解に耐えるようにすることも、標的配列への親和性を高めることもできた。
オリゴヌクレオチドと同じように、Ｕ７ ｓｎＲＮＡも直接化学合成によって、ガイド配列、ｓｍＯＰＴ及びＵ７ ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｒｄ含むＲＮＡを生成することができる。インビトロで合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡは、特異的修飾によってヌクレアーゼ分解に耐えるようにすることも、標的配列への親和性を高めることもできた。
【0119】
本実施例は、Ｕ７ ｓｎＲＮＡを化学合成し、ヌクレアーゼ耐性を高めるために５’末端と３’末端の３個の塩基をそれぞれ２’メトキシ（２’－ＯＭＥ）修飾及びチオ修飾を実行した。ｓｎＲＮＡ＃２５、ｓｎＲＮＡ＃２６を例として、化学合成されたｓｎＲＮＡの配列と修飾は下記の通りである（＊はホスホロチオエート骨格を表し、ｍは２’－メトキシ修飾を表し、下線は標的配列に逆相補的な認識ドメインを表し、斜体はｓｍＯＰＴ配列を表す。）：
【0120】
【化1】
【0121】
本出願のＵ７ ｓｎＲＮＡにおける１個又は２個以上のヌクレオチドは、２’－Ｏアルキル、２’－Ｏ－メトキシ、２’－Ｏ－メトキシエチルのうちの１個又は２個で修飾され、前記２’－Ｏアルキルは、２’－Ｏメチルで修飾される。ｓｎＲＮＡのヌクレオチドに連結されるリン酸結合は、特異的なリン酸結合を介して連結されてもよく、前記特異的なリン酸結合は、チオホスフェート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスフェート結合、ホスホロアミダート結合（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合、及びキラル結合リン（ｃｈｉｒａｌ ｌｉｎｋａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ）のうちの１個又は２個以上で構成される。幾つかの実施例において、ｓｎＲＮＡの両側の１～１０、６～８０個のみ、又はすべてのヌクレオチドが修飾され、特異的なリン酸エステル結合で連結され、前記修飾は、１個又は２個以上の修飾の組み合わせであり、前記特異的なリン酸エステル結合は、１個又は２個以上のリン酸エステル結合の組み合わせである。幾つかの実施例において、前記化学合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡのすべてのヌクレオチドはチオホスフェート結合を介して互いに連結され、すべて２′－Ｏ－メトキシで修飾される。幾つかの実施例において、ｓｎＲＮの両側の３個のヌクレオチドのみがチオホスフェート結合を介して連結され、２′－Ｏ－メトキシで修飾される。化学的に合成され修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡのいくつかの好ましい実施形態において、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの５’末端の最初のヌクレオチドは、好ましくは、アデニル酸（Ａ）であり、認識ドメインの５’末端の最初のヌクレオチドがアデニル酸（Ａ）ではない場合は、５’末端にアデニル酸（Ａ）が連結される。化学的に合成され修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡのいくつかの実施例において、認識ドメインと標的部位の逆相補的対において０～５個、好ましくは０～１個のミスマッチヌクレオチドが存在してもよい。認識ドメイン配列の好ましい長さは１６ｂｐ以上であり、より好ましくは１８ｂｐ～４０ｂｐであり、さらに好ましくは２０ｂｐ～２７ｂｐである。化学的に合成され修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡのいくつかの実施例において、認識ドメイン配列の長さは、標的配列の５’末端又は／及び３’末端に沿った逆相補的対形成を通じて延長することができ、好ましくは、延長後の単一認識ドメイン配列の長さは４０ｂｐ以下である。幾つかの実施例において、好ましくは、化学合成されたｓｎＲＮＡ配列の全長は９６ｂｐ以上である。幾つかの実施例において、好ましくは、化学合成されたｓｎＲＮＡの両側の３～４０個の塩基は修飾され、特異的なリン酸結合を介して結合される。
【0122】
実施例２
ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を定量的に評価するためのレポーターベクター
ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔ配列（５’末端及び３’末端にそれぞれＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩの制限部位を加える）は全遺伝子合成により得られ、合成配列、ｐＸ６０１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、６１５９１）を制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動し、ゲルを回収し、連結し、合成した配列をｐＸ６０１ベクターのＡｇｅＩとＥｃｏＲＩ制限部位の間に挿入し、元のベクターのＳａＣａｓ９遺伝子配列を置き換えてレポーターベクターを得た。さらに、大腸菌コンピテントセルへの形質転換、単一クローニングの選択、ＰＣＲ、及び配列決定を通じて、精製されたレポーターベクタープラスミドを得、後で使用するために－２０℃で保存した。
ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を定量的に評価するためのレポーターベクター
ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔ配列（５’末端及び３’末端にそれぞれＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩの制限部位を加える）は全遺伝子合成により得られ、合成配列、ｐＸ６０１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、６１５９１）を制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動し、ゲルを回収し、連結し、合成した配列をｐＸ６０１ベクターのＡｇｅＩとＥｃｏＲＩ制限部位の間に挿入し、元のベクターのＳａＣａｓ９遺伝子配列を置き換えてレポーターベクターを得た。さらに、大腸菌コンピテントセルへの形質転換、単一クローニングの選択、ＰＣＲ、及び配列決定を通じて、精製されたレポーターベクタープラスミドを得、後で使用するために－２０℃で保存した。
【0123】
レポートベクターの構造：ｐＣＭＶ－ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔ、ＲＧは、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）を表し、ＲＧｌｅｆｔは、レポーティング機能のないレポーター遺伝子の５’末端の前半を表し、ＲＧｒｉｇｈｔは、レポーティング機能のないレポーター遺伝子の３’末端の後半を表し、ＲＧｌｅｆｔ及びＲＧｒｉｇｈｔのタンデム発現は、通常、完全なレポーター遺伝子として機能することができる。本発明の実施形態において、レポーター遺伝子は緑色蛍光遺伝子ＥＧＦＰであるため、ベクター構造はｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔであった。ＥＸＯＮ１３ｍｕｔは、病原性変異を含むＵＳＨ２Ａエクソン１３とその上流及び下流のイントロン配列（上流イントロン配列は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン１２の５’末端の２０４ｂｐと３’末端の４９０ｂｐの遺伝子配列を組み合わせたものであり；下流のイントロン配列は、ヒトＵＳＨ２Ａイントロン１３の５’末端の７０３ｂｐと３’末端の２１６ｂｐの遺伝子配列を組み合わせたものである）を表す。本発明の実施例に記載のＵＳＨ２Ａエキソン１３における病原性突然変異は、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ若しくはｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、又は任意選択の突然変異であり得、得られたベクターの構造は、それぞれｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２２９９ｄｅｌＧ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔである。いくつかの実施例における突然変異は、また、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ、Ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ及びＣ．２７７６Ｃ＞Ｔ等であるか、それを含むものである。
【0124】
ＲＧｌｅｆｔ、例えば、ＥＧＦＰｌｅｆｔの配列：
ａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｇａｃｇｔａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｔｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｃａｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇｇａｃｇａｃｇｇｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃｃｇｃｇｃｃｇａｇ（配列番号２６）
ａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｇａｃｇｔａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｔｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｃａｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇｇａｃｇａｃｇｇｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃｃｇｃｇｃｃｇａｇ（配列番号２６）
【0125】
ＲＧｒｉｇｈｔ、例えば、ＥＧＦＰｒｉｇｈｔの配列：
ｇｔｇａａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｇａｃｔｔｃａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇｇａｇｔａｃａａｃｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃａａｇｇｔｇａａｃｔｔｃａａｇａｔｃｃｇｃｃａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｇａｃｃａｃｔａｃｃａｇｃａｇａａｃａｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｇａｃａａｃｃａｃｔａｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃａｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇａｇｃａａａｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃａｃａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇａｔｃａｃｔｃｔｃｇｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇｔａａ（配列番号２７）
ｇｔｇａａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｇａｃｔｔｃａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇｇａｇｔａｃａａｃｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃａａｇｇｔｇａａｃｔｔｃａａｇａｔｃｃｇｃｃａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｇａｃｃａｃｔａｃｃａｇｃａｇａａｃａｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｇａｃａａｃｃａｃｔａｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃａｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇａｇｃａａａｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃａｃａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇａｔｃａｃｔｃｔｃｇｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇｔａａ（配列番号２７）
【0126】
実施例３
２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して合成した１００ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ＃２０、ＡＯＮ＃２４、ＡＯＮ＃２５、ＡＯＮ＃３１（合成されたＡＯＮのすべてのヌクレオシドモノマーは、２’－Ｏ－メトキシとホスホロチオエートで修飾される）を、それぞれレポータープラスミドｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔと同時に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後の細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化し、次に、フローサイトメトリーを使用して、異なるＡＯＮ群のＧＦＰ陽性率（即ち、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３がスプライシングスキッピングするように誘導された細胞の比率）とＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度（即ち、ＧＦＰ細胞における、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの平均レベル）を検出し、下記の表２及び図２は、２個の領域を標的とするＡＯＮにより誘導されたＵＳＨ２Ａｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効果を示す。実験結果は、３’末端領域を標的とするＡＯＮの効果が、＃２０領域などの他の領域を標的とするＡＯＮの効果よりも有意に優れていることを示す。
２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して合成した１００ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ＃２０、ＡＯＮ＃２４、ＡＯＮ＃２５、ＡＯＮ＃３１（合成されたＡＯＮのすべてのヌクレオシドモノマーは、２’－Ｏ－メトキシとホスホロチオエートで修飾される）を、それぞれレポータープラスミドｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔと同時に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後の細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化し、次に、フローサイトメトリーを使用して、異なるＡＯＮ群のＧＦＰ陽性率（即ち、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３がスプライシングスキッピングするように誘導された細胞の比率）とＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度（即ち、ＧＦＰ細胞における、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの平均レベル）を検出し、下記の表２及び図２は、２個の領域を標的とするＡＯＮにより誘導されたＵＳＨ２Ａｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効果を示す。実験結果は、３’末端領域を標的とするＡＯＮの効果が、＃２０領域などの他の領域を標的とするＡＯＮの効果よりも有意に優れていることを示す。
【0127】
【表2】
【0128】
実施例４
２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ及びＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）に同時にトランスフェクトし、レポータープラスミド単独でトランスフェクトした（Ｒｅｐｏｒｔ、レポーター群）、レポータープラスミドとｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅ（ＳＣ群）で同時にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をそれぞれ２個の陰性対照とし、いかなるプラスミドでもトランスフェクトしない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメトリーを使用して、異なるＵ７ ｓｎＲＮＡ群のＧＦＰ陽性率（即ち、ＵＳＨ２Ａエクソン１３がスプライシングスキッピングするように誘導された細胞の比率）を検出した。本実施例は、異なる実験群の平均ＦＩＴＣ強度、即ち、ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ蛍光強度、並びにＧＦＰ陽性率、陽性細胞におけるＧＦＰタンパク質の発現レベルを検出した。
２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ及びＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）に同時にトランスフェクトし、レポータープラスミド単独でトランスフェクトした（Ｒｅｐｏｒｔ、レポーター群）、レポータープラスミドとｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅ（ＳＣ群）で同時にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をそれぞれ２個の陰性対照とし、いかなるプラスミドでもトランスフェクトしない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメトリーを使用して、異なるＵ７ ｓｎＲＮＡ群のＧＦＰ陽性率（即ち、ＵＳＨ２Ａエクソン１３がスプライシングスキッピングするように誘導された細胞の比率）を検出した。本実施例は、異なる実験群の平均ＦＩＴＣ強度、即ち、ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ蛍光強度、並びにＧＦＰ陽性率、陽性細胞におけるＧＦＰタンパク質の発現レベルを検出した。
【0129】
本実施例では、異なる標的部位のＵ７－ｓｎＲＮＡにより誘導されたスプライススキッピング効率を比較した。下記の表３及び図３Ａ～３Ｂは、異なる標的部位のＵ７ ｓｎＲＮＡにより誘導された、レポーター細胞におけるＵＳＨ２Ａｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効果を示す。結果は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡがレポーター細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができ、ＵＳ Ｈ２Ａが高効率でスプライシングスキッピングを誘導することを示す。
【0130】
【表3】
【0131】
実施例５
化学合成されたｓｎＲＮＡにより効率的に誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の単一スプライシングスキッピング
ヒト由来宿主細胞を２４ウェルプレートに６×１０５／ウェルで播種し、本実施例で選択したヒト由来網膜神経細胞はＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞（網膜神経細胞株）であった。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してインビトロで合成した１００ｐｍｏｌのＵ７－ｓｎＲＮＡ＃２４、＃２５、＃２６、＃２７、＃２８、＃２９、＃３０、＃３３、＃３４をＷＥＲＩ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を７２時間培養し、その後、各実験群の細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得、プライマーＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号３４）及びＣＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３５）を介してＲＴ－ＰＣＲ実験を実行し、成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡのエクソンスプライシングスキッピングを検出し、電気泳動の結果は図７に示された通りである。結果により、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃２４～３４は、いずれもエクソン１３のスプライシングスキッピングを効率的に誘導することができ、エクソン１３とエクソン１２の共スプライシングスキッピングはほとんどなく、３’末端領域を標的とするＵ７ ｓｎＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の単一スプライシングスキッピングを効率的に誘導することができ、高い安全性を有することが分かる。
化学合成されたｓｎＲＮＡにより効率的に誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の単一スプライシングスキッピング
ヒト由来宿主細胞を２４ウェルプレートに６×１０５／ウェルで播種し、本実施例で選択したヒト由来網膜神経細胞はＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞（網膜神経細胞株）であった。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してインビトロで合成した１００ｐｍｏｌのＵ７－ｓｎＲＮＡ＃２４、＃２５、＃２６、＃２７、＃２８、＃２９、＃３０、＃３３、＃３４をＷＥＲＩ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を７２時間培養し、その後、各実験群の細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得、プライマーＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号３４）及びＣＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３５）を介してＲＴ－ＰＣＲ実験を実行し、成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡのエクソンスプライシングスキッピングを検出し、電気泳動の結果は図７に示された通りである。結果により、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃２４～３４は、いずれもエクソン１３のスプライシングスキッピングを効率的に誘導することができ、エクソン１３とエクソン１２の共スプライシングスキッピングはほとんどなく、３’末端領域を標的とするＵ７ ｓｎＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の単一スプライシングスキッピングを効率的に誘導することができ、高い安全性を有することが分かる。
【0132】
実施例６
異なる標的部位のＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果
Ｕ７－ｓｎＲＮＡマルチ標的組み合わせベクターを構築した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ技術に従って、異なるＵ７ ｓｎＲＮＡプラスミドをテンプレートとして使用し、ＰＣＲでＵ７ ｓｎＲＮＡ ｃａｓｓｅｔｔｅ（発現カセット）を増幅すると同時に、プライマーを介してアンプリコンの両端に追加の５’フランキング塩基と正しい方向のＢｓａＩ酵素切断部位を導入して、隣接する異なるＵ７ ｓｎＲＮＡ ｃａｓｓｅｔｔｅがＢｓａＩによって消化され、特定の相補的な粘着末端を生成し、頭部及び尾部のＵ７ ｓｎＲＮＡ ｃａｓｓｅｔｔｅをＢｓａＩにより消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩによって消化された線状骨格ベクターと同じ粘着末端を生成した。最後にＮＥＢ（登録商標） Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ＢｓａＩ－ＨＦ（登録商標）ｖ２）（ＮＥＢ＃Ｅ１６０１）を使用して上記のＰＣＲ産物と、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩ消化によって回収されたｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ Ｂａｃｋｂｏｎｅを組み立てた。組み立て方法：ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ 骨格（Ｂａｃｋｂｏｎｅ）－ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩ、８０ｎｇ；Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ａ カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ） ＰＣＲ 生成物、２０ｎｇ；Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ｂ カセット ＰＣＲ 生成物、２０ｎｇ；Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ｃ カセット ＰＣＲ 生成物、２０ｎｇ；Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ （１０Ｘ）、２μｌ；ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｉｘ、１μｌ；反応過程：（３７℃、５ｍｉｎ→１６℃、５ｍｉｎ）×２０→６０℃、５ｍｉｎ。
異なる標的部位のＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果
Ｕ７－ｓｎＲＮＡマルチ標的組み合わせベクターを構築した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ技術に従って、異なるＵ７ ｓｎＲＮＡプラスミドをテンプレートとして使用し、ＰＣＲでＵ７ ｓｎＲＮＡ ｃａｓｓｅｔｔｅ（発現カセット）を増幅すると同時に、プライマーを介してアンプリコンの両端に追加の５’フランキング塩基と正しい方向のＢｓａＩ酵素切断部位を導入して、隣接する異なるＵ７ ｓｎＲＮＡ ｃａｓｓｅｔｔｅがＢｓａＩによって消化され、特定の相補的な粘着末端を生成し、頭部及び尾部のＵ７ ｓｎＲＮＡ ｃａｓｓｅｔｔｅをＢｓａＩにより消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩによって消化された線状骨格ベクターと同じ粘着末端を生成した。最後にＮＥＢ（登録商標） Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ＢｓａＩ－ＨＦ（登録商標）ｖ２）（ＮＥＢ＃Ｅ１６０１）を使用して上記のＰＣＲ産物と、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩ消化によって回収されたｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ Ｂａｃｋｂｏｎｅを組み立てた。組み立て方法：ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ 骨格（Ｂａｃｋｂｏｎｅ）－ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩ、８０ｎｇ；Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ａ カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ） ＰＣＲ 生成物、２０ｎｇ；Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ｂ カセット ＰＣＲ 生成物、２０ｎｇ；Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ｃ カセット ＰＣＲ 生成物、２０ｎｇ；Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ （１０Ｘ）、２μｌ；ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｉｘ、１μｌ；反応過程：（３７℃、５ｍｉｎ→１６℃、５ｍｉｎ）×２０→６０℃、５ｍｉｎ。
【0133】
Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙアセンブリ生成物を大腸菌コンピテントセルの形質転換、単一クローンの選択、ＰＣＲ及びシークエンシングによってさらに同定して、ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡマルチ標的組み合わせベクターを得た。プラスミドを精製し、後で使用するために－２０℃で保存した。構築されたベクターを、例えば、ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ａ＋Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ｂ＋Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃Ｃと命名した。
【0134】
異なる標的部位のＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングをより効率的に誘導した。２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔをそれぞれ異なる標的のＵ７ ｓｎＲＮＡ組み合わせプラスミド又は単一ターゲットプラスミドと２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、レポータープラスミド（Ｒｅｐｏｒｔ、レポーター群）単独でトランスフェクトした、レポータープラスミドとｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅ（ＳＣ群）で同時にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をそれぞれ２個の陰性対照とし、いかなるプラスミドもトランスフェクトしない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメーターを使用して、異なるｓｎＲＮＡ群のＧＦＰ陽性率を検出した。下記の表４及び図４Ａ～４Ｂは、異なる標的部位を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせにより誘導されたＵＳＨ２Ａｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効率を示す。
【0135】
本実施例では、異なる標的部位を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡを組み合わせて使用することにより、レポーター遺伝子細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導効率を向上できることが分かった。本実施例における異なる標的の組み合わせにより誘発されたスプライシングスキッピング効率は、単一標的の場合よりも高く、ＵＳＨ２Ａのエキソン１３の既知のスプライシングスキッピング技術よりも優れている可能性がある。
【0136】
【表4】
【0137】
本出願の異なる標的部位のＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせのうち、１個のｓｎＲＮＡは、本出願のＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の３’末端配列又はその断片を標的にすることができ、もう１個又は複数のｓｎＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロ１２－エクソン１３－イントロン１３の配列又はその断片を標的にすることができ、例えば、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメイン配列は、ＵＳＨ２Ａｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１２、エクソン１３、又はイントロン１３の標的配列に逆相補的であり、好ましくは、エクソン１３及び両側の標的隣接領域（ｃｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４７２４６に対応するｐｒｅ－ｍＲＮＡ領域）から選択される。異なる標的部位のＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせは、標的配列がまったく同じではない２個又は２個以上のＵ７－ｓｎＲＮＡの組み合わせである。
【0138】
実施例７
ＷＥＲＩ細胞における、化学合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡの組み合わせにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング
ヒト由来宿主細胞を２４ウェルプレートに６×１０５／ウェルで播種し、本実施例ではＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞株を使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してインビトロで合成した５０ｐｍｏｌのｓｎＲＮＡ組み合わせ１（Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃３０及びＵ７－ｓｎＲＮＡ＃４）、組み合わせ２（Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃２６及びＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１６）をＷＥＲＩ細胞にそれぞれトランスフェクトし、同じ用量（５０ｐｍｏｌ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ１（５′－ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊－３′、「Ｍ」は２′－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）及びＡＯＮ２（５′－ＭＵ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊－３′、「Ｍ」は２′－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）を対照群としてトランスフェクトし、１μｇのＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトして陰性対照とし、いかなるプラスミドもトランスフェクトしないＷＥＲＩ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて７２時間培養し、その後、各実験群の細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得、プライマーＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号３４）及びＣＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３５）を使用してＲＴ－ＰＣＲ実験を実行し、成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡエクソンにスプライシングスキッピングがあるか否かを検出し、電気泳動の結果は図８Ａに示された通りである。ｒｔ－ＰＣＲ電気泳動バンドをＩｍａｇｅＪソフトウェアによりさらに定量的に分析し、図８Ｂに示されるように、エクソン１３をスプライシングスキッピングする、又はエクソン１２及び１３をスプライシングスキッピングする成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの比率について統計及び分析を実行した。
ＷＥＲＩ細胞における、化学合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡの組み合わせにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング
ヒト由来宿主細胞を２４ウェルプレートに６×１０５／ウェルで播種し、本実施例ではＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞株を使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してインビトロで合成した５０ｐｍｏｌのｓｎＲＮＡ組み合わせ１（Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃３０及びＵ７－ｓｎＲＮＡ＃４）、組み合わせ２（Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃２６及びＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１６）をＷＥＲＩ細胞にそれぞれトランスフェクトし、同じ用量（５０ｐｍｏｌ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ１（５′－ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊－３′、「Ｍ」は２′－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）及びＡＯＮ２（５′－ＭＵ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊－３′、「Ｍ」は２′－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）を対照群としてトランスフェクトし、１μｇのＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトして陰性対照とし、いかなるプラスミドもトランスフェクトしないＷＥＲＩ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて７２時間培養し、その後、各実験群の細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得、プライマーＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号３４）及びＣＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３５）を使用してＲＴ－ＰＣＲ実験を実行し、成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡエクソンにスプライシングスキッピングがあるか否かを検出し、電気泳動の結果は図８Ａに示された通りである。ｒｔ－ＰＣＲ電気泳動バンドをＩｍａｇｅＪソフトウェアによりさらに定量的に分析し、図８Ｂに示されるように、エクソン１３をスプライシングスキッピングする、又はエクソン１２及び１３をスプライシングスキッピングする成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの比率について統計及び分析を実行した。
【0139】
Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質を内因的に発現するＷＥＲＩ細胞において、異なる標的部位Ｕ７ ｓｎＲＮＡの組み合わせにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３スプライシングスキッピング効果を、既存技術の好ましいＡＯＮ技術解決策と比較し、ＲＴ－ＰＣＲ試験データと分析結果から、ｓｎＲＮＡ組み合わせ１とｓｎＲＮＡ組み合わせ２により誘導されたエクソン１３の単一スプライシングスキッピング効果は、従来の最適な技術解決策ＡＯＮ１及びＡＯＮ２よりも有意に優れ、ＳｎＲＮＡ組み合わせ１及びｓｎＲＮＡ組み合わせ２により誘導されたエクソン１２及び１３の二重スプライシングスキッピングｍＲＮＡが、合計スプライシングスキッピングｍＲＮＡに占める比率はＡＯＮ１及びＡＯＮ２より低いことが分かる。従って、Ｕ７ ｓｎＲＮＡが二重スキッピングＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡ副産物の低減を確保しながら、エキソン１３の単一スプライシングスキッピングの効率を有意に向上させることが確認できる。
【0140】
さらに、ｓｎＲＮＡ組み合わせ２は、従来技術のエクソン１２及び１３に隣接する二重スプライシングスキッピングの確率が非常に高いＡＯＮ部位を標的とするが、ｓｎＲＮＡ組み合わせ２は、二重スプライシングスキッピングの確率が非常に低い。
【0141】
実施例８
スプライシング制御タンパク質を動員するモチーフを備えたＵ７ ｓｎＲＮＡのスプライシングスキッピング効果
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７ ｓｎＲＮＡを構築した。表中の配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、標的配列の逆相補配列（認識ドメイン配列に相当するＤＮＡ配列）であり、５’にＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧ（配列番号２８）を加え、アンチセンス鎖は標的配列の５’にＡＡＴＴを加え、更に３’にＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴ（配列番号２９）を加えた。例えば、認識ドメイン配列はＮＮＮ（認識ドメインの長さは、１６個のヌクレオチドより長いことが好ましい。）であり、
スプライシング制御タンパク質を動員するモチーフを備えたＵ７ ｓｎＲＮＡのスプライシングスキッピング効果
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７ ｓｎＲＮＡを構築した。表中の配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、標的配列の逆相補配列（認識ドメイン配列に相当するＤＮＡ配列）であり、５’にＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧ（配列番号２８）を加え、アンチセンス鎖は標的配列の５’にＡＡＴＴを加え、更に３’にＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴ（配列番号２９）を加えた。例えば、認識ドメイン配列はＮＮＮ（認識ドメインの長さは、１６個のヌクレオチドより長いことが好ましい。）であり、
【0142】
【化2】
【0143】
合成したＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖とアンチセンス鎖をアニーリング反応系（総反応量２０μｌ：Ｏｌｉｇｏ－Ｆ（１００μＭ）２μｌ＋Ｏｌｉｇｏ－Ｒ（１００μＭ）２μｌ＋１０×ＮＥＢ Ｃｕｔｔｅｒ ｓｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ＋脱イオン水１６μｌ）に従って混合し、９５℃で５分間培養した後、氷上に置いて冷却させ、アニーリングして粘着末端を持つ二本鎖ＤＮＡを形成した。１００倍に希釈した後、１μｌを取り、１０ｎｇのＢｓａＩで消化し、回収した線状化ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ ｂａｃｋｂｏｎｅプラスミドを連結させた。さらに、大腸菌コンピテントセルの形質転換、単一クローニング、ＰＣＲ及び配列決定により、ＵＳＨ２Ａエクソン１３スプライシングジャンプングを誘導するためのｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフを含むＵ７－ｓｎＲＮＡベクターを得、ベクターをｐＵＣ５７－Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡ＃Ａと名付けた。プラスミドを精製し、後で使用するために－２０℃で保存した。図５は、ｈｎＲＮＰ Ａ１を含むｓｎＲＮＡベクターの模式図を示す。
【0144】
Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡは、本出願の実施例に記載の方法に従って化学合成及び修飾することもできる。ｓｎＲＮＡ＃２５を例に挙げると、化学合成されたＵ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡ配列と修飾は下記の通りである（＊はホスホロチオエート骨格を示し、ｍは２’－メトキシ修飾を示し、下線は標的配列に逆相補的な認識ドメインを示し、斜体はｓｍＯＰＴ配列を示し、太字はｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質結合モチーフを示す）：
【0145】
【化3】
【0146】
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７ ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導した。２９３Ｔを２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔをそれぞれｐＵＣ５７－Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡプラスミド、ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡプラスミドと２９３Ｔ細胞（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）に同時にトランスフェクトし、レポータープラスミド単独でトランスフェクトした（レポーター群）、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅ（ＳＣ群）で同時にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、それぞれ２個の陰性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメーターを使用して、異なるｓｎＲＮＡ群により誘導されたスプライシングジャンプング効率を検出した。下記の表５及び図６Ａ～６Ｂは、Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を示す。
【0147】
データにより、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’末端へのｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフの導入は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングジャンプングを誘導する効果を有意に改善することができ、エキソン１３のスプライシングジャンプングを持つ細胞（ＧＦＰ＋）の比率を増加させるだけではなく、各細胞内のスプライススキッピングのエクソンｍＲＮＡのレベル（平均ＦＩＴＣ強度）も増加させることが分かる。同時に、ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフをＵ７ ｓｎＲＮＡ＃２５に導入すると、平均ＦＩＴＣ強度が３．２５倍増加し、スプライシングスキッピング誘導効率を有意に向上させる。
【0148】
【表5】
【0149】
本実施例はＵ７－ｓｎＲＮＡの５’末端に遊離テールを導入し、前記遊離テール配列はｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ配列「ＵＡＧＧＧＵ」を含み、前記遊離テール配列は１個、２個、又は２個以上のｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質結合モチーフを含んでもよく、好ましくは、２個であり、遊離テール配列は、好ましくは、
【0150】
【化4】
であり、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質を動員してＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングジャンプングを促進でき、エクソン１２とエクソン１３の二重スキッピングは増加せず、その他の標的特異性に影響を与えず、標的離脱効果を誘発又は増加させない。例えば、本出願に記載のＵＳＨ２Ａエクソン１２は、ヒトＵＳＨ２Ａエクソン１２である。例えば、本出願に記載のＵＳＨ２Ａエクソン１３は、ヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３である。
【0151】
いくつかの実施形態において、前記Ｕ７ ｓｎＲＮＡの５’末端に導入された遊離テールは、スプライシング調節タンパク質をリクルートできるモチーフであり、前記スプライシング調節タンパク質は、ｈｎＲＮＰ Ａ１（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）、ＳＲＳＦ１（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ １）、ＲＢＭ４ （ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＤＡＺＡＰ１ （ＤＡＺ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＲ （Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ－Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等である。
【0152】
実施例９
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的としたＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ関連プラスミドベクターの構築とウイルスパッケージング
本実施例はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングジャンプングを標的として誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクターの２個のＩＴＲドメインの中央の遺伝子配列を置き換え、ｐＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡベクターを構築し、ＡＡＶパッケージングプラスミド：血清型ｐＲＣプラスミド（ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子と各血清型のそれぞれのＣａｐ遺伝子を含む）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を含むベクタープラスミド）を宿主細胞に同時トランスフェクトし、パッケージしてＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングジャンプングを標的とするＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡウイルスを得た。具体的な操作プロセスは下記の通りである：
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的としたＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ関連プラスミドベクターの構築とウイルスパッケージング
本実施例はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングジャンプングを標的として誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクターの２個のＩＴＲドメインの中央の遺伝子配列を置き換え、ｐＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡベクターを構築し、ＡＡＶパッケージングプラスミド：血清型ｐＲＣプラスミド（ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子と各血清型のそれぞれのＣａｐ遺伝子を含む）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を含むベクタープラスミド）を宿主細胞に同時トランスフェクトし、パッケージしてＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングジャンプングを標的とするＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡウイルスを得た。具体的な操作プロセスは下記の通りである：
【0153】
まず、全遺伝子合成により遺伝子配列－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（認識ドメインを含まない）：５’－マウスＵ７プロモーター－ｓｍＯＰＴ配列－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｒｄ－ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’を合成した。ここで、Ｕ７プロモーターとｓｍＯＰＴの間に２個のＴｐｙｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、ＢｓａＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｍＢＩ等）を加えて、その後の切断、他の認識ドメイン配列の置換及び挿入を容易にした。全遺伝子合成配列を、ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミド（ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット、ＴＡＫＡＲＡ社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：６６５０）の２個のＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間に挿入及び置換して、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格ベクターを得た。
【0154】
Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（認識ドメインは含まない）（配列番号３３）：
ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡｇａｇａｃｃａａｔｇｔｇｇｇｔｃｔｃｇＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡｇａｇａｃｃａａｔｇｔｇｇｇｔｃｔｃｇＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ
【0155】
上記実施例に記載の方法に従い、本出願のｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列又は認識ドメイン配列のタンデム組み合わせに対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、それぞれ対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、Ｔｐｙｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって切断されるものと同様の粘着末端を両端に加えた。アニーリングして粘着末端を持つ認識ドメイン（単一／タンデム）二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｔ４リガーゼを対応するＴｐｙｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで消化した線状化ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格プラスミドでに連結させて、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の特異的部位のスプライシングジャンプングを標的として誘導するｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドの形成し、ｐＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ＃２５など、認識ドメイン配列に対応するｓｎＲＮＡ番号に従って名前を付けた。
【0156】
標的遺伝子（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングジャンプングを標的として誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット）を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミドのＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間の遺伝子配列を置き換えた後、ｐＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡプラスミドベクターを得た。ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット説明書及び標準的な細胞操作手順に従って、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングジャンプングを標的として誘導するＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルスをパッケージして得た。
【0157】
トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３／２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ細胞培養皿に播種し、培地は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地であり、コンフルエンスが８０％～９０％に達したときにトランスフェクションを実行した。トランスフェクションの３時間前に、古い培地を廃棄し、新しい培地に交換した。トランスフェクションの際に、同時に下記の表の系に従ってｐＡＡＶ－Ｕ７ ｓｎＲＮＡプラスミド、ｐＲＣプラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド、及びＰＥＩ（ポリエチレンイミン）トランスフェクション試薬を調製し、培養皿に滴加した。ＰＥＩトランスフェクション混合物を加えた後、培養皿を軽く振ってトランスフェクション試薬を均一に分散させ、培地を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0158】
ＰＥＩトランスフェクション系：ｐＡＡＶプラスミド（１μｇ／μｌ）、６μＬ；ｐＲＣ１／２／５／６プラスミド（１μｇ／μｌ）；（ｐＲＣプラスミドキャプシド遺伝子が血清型を決定する）、６μＬ；ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（１μｇ／μｌ）、６μＬ；無血清ＤＭＥＭ培地、５００μＬ；ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）、１１０μＬ、処理方法：数回ボルテックスして混合し、室温で５分間培養した。
【0159】
トランスフェクションの２４時間後、新鮮な２％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクションの４８～７２時間後、ＡＡＶウイルスを含む細胞を収集し、洗浄し、遠心分離し、細胞ペレットを収集し、ボルテックスして細胞ペレットをほぐした。続いて、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット説明書に従って、細胞ペレットに０．５ｍＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを加え、１５秒間ボルテックスして細胞ペレットを完全に懸濁させた。室温で５分間放置した後、更に１５秒間ボルテックスした。４℃、２０００～１４０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞破片を除去した。上清を新しい滅菌遠心チューブに収集し、５０μＬのＡＡＶ抽出溶液Ｂを加え、ピペットを使用して均一に混合し、異なる認識ドメインを持つＡＡＶ －Ｕ７ ｓｎＲＮＡウイルス溶液を得、一部を取ってｑＰＣＲを使用してウイルス力価を検出し、後で使用するために８０℃で保管した。
【0160】
ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドのＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間に挿入される標的遺伝子断片は２．５ｋｂ未満ではなければならないため、複数のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット（５’－マウスＵ７プロモーター認識ドメイン－ｓｍＯＰＴ配列、ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’）を挿入することにより、同じ数のＡＡＶウイルス粒子を確保しながらＵ７－ｓｎＲＮＡの発現レベルを増加させ、遺伝子配列の長さは約４５０ｂｐであり、好ましくは、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドは１～５個のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセットを担持し、前記ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミド内の複数のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセットは、同じ認識ドメイン又は認識ドメインの組み合わせを有するものであってもよく、異なる又は同一でない認識ドメインの組み合わせを有するものであってもよい。
【0161】
本出願では、ＡＡＶを使用してＵ７ ｓｎＲＮＡを送達して、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３スプライシングスキッピングを誘導し、前記ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、天然由来のものであっても、天然由来のキャプシドタンパク質の変異体、指向性進化、又はアミノ酸／ペプチドの合理的修飾（コドン最適化、異なる血清型の機能ペプチドセグメントのキメリズム等）によるものであってもよく、組織及び器官の指向性、免疫原性、トランスフェクション効率を向上させ、例えば、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ９．ＨＲ、ＣＡＭ１３０等である。前記天然由来のＡＡＶキャプシドタンパク質は、動物由来であっても、植物由来であってもよく、前記動物由来のＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質はヒト由来（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９等）であってもよく、非ヒト霊長類由来（例えば、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０及びＡＡＶｒｈ．４３）であってもよく、マウス、ブタなどの脊椎動物由来であってもよく、昆虫由来であってもよい。本発明のＡＡＶプラスミド系において、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ血清型はＲｅｐ遺伝子血清型と一致する必要があるが、Ｃａｐ遺伝子血清型とは一致しなくてもよい。
【0162】
前述の詳細な説明は、説明及び例として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。本明細書に記載の実施形態に対する様々な修正は当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にとどまる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に特異的に結合する能力を有し、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列に対応するゲノム位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である；又は、
配列番号１に示される配列又はその断片に特異的に結合する能力を有する、
核酸分子。
【請求項2】
配列番号１に示される配列中の１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的である；
又は、配列番号１に示される配列、又はその相補配列の１６個又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含む；
又は、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な少なくとも１６個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸分子であって、
好ましくは、前記核酸分子は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の３’末端配列又はその断片に相補的な２２個～２７個のヌクレオチドを含み、
より好ましくは、前記核酸分子は、少なくとも６０個のヌクレオチドを含む、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記核酸分子は、Ｃｈｒ１：２１６２４６６０３－２１６２４６６２６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９８－２１６２４６６２４、Ｃｈｒ１：２１６２４６５９４－２１６２４６６１７、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９１、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９３、Ｃｈｒ１：２１６２４６５７０－２１６２４６５９６、Ｃｈｒ１：２１６２４６５６７－２１６２４６５９０、及びＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６５８６のうちいずれか１つのゲノムの位置に相応するｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、
好ましくは、前記核酸分子は、配列番号１０～２１のいずれか１つに相補的な配列を含む；
又は、前記核酸分子は、配列番号１０～２１のいずれか１つに示される配列を含む、
請求項１又は請求項２に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記核酸分子は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含み、
好ましくは、
前記修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－メトキシ及び／又は２’－Ｏ－メトキシエチルからなる群より選択される修飾を含む；
及び／又は、前記核酸分子の５’末端及び／又は３’末端は、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含む；
及び／又は、前記核酸分子は、６’－修飾された二環式ヌクレオシド、５’－修飾された二環式ヌクレオシド、６’－二置換の二環式ヌクレオシド、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体及び／又は２’－デオキシ２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノースヌクレオチド（２’－ＦＡＮＡ修飾されたヌクレオチド）からなる群より選択されるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体モノマーを含む；
及び／又は、前記核酸分子は、修飾されたリン酸結合を含む、
より好ましくは、
前記修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル及び／又は２’－Ｏ－エチルからなる群より選択される修飾を含む；
及び／又は、前記核酸分子の５’末端及び／又は３’末端は、１個～３個の修飾されたヌクレオチドを含む；
及び／又は、前記核酸分子の５’末端及び／又は３’末端は、１個～３個の修飾されたリン酸結合を含む；
及び／又は、前記修飾されたリン酸結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスフェート結合、ホスホロアミダート結合、及び／又はボラノホスフェート結合からなる群より選択されるものを含む；
及び／又は、前記核酸分子は、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アルキルホスホネート、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキレンホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミダート、アミノアルキルホスホロアミダート、チオホスホロアミダート、チオカルボニルアルキルホスホネート、チオカルボニルアルキルホスホトリエステル、ホスホロチオエート、セレノホスフェート、ボラノホスフェート、ホスホジエステル結合、Ｒｐ－ホスホロチオエート結合、Ｓｐ－ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－５’、３’－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ）－５’）、メチルホスホネート結合及び／又は３’－チオメチラール結合（３’Ｓ－ＣＨ ２ －Ｏ５’）からなる群より選択される化学結合により連結される、
請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項5】
前記核酸分子は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む；
及び／又は、前記核酸分子は、一本鎖又は二本鎖である；
及び／又は、前記核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）及び／又はアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を含む；
好ましくは、前記核内低分子ＲＮＡは、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ及び／又はＵ７核内低分子ＲＮＡを含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項6】
前記核酸分子は、ステムループドメイン又はその誘導体構造を含む；
及び／又は、前記核酸分子は、ｓｍタンパク質に結合可能なドメイン又はその誘導体構造を含む；
好ましくは、
前記ステムループドメインは、配列番号６に示される配列を含む；
及び／又は、前記ｓｍタンパク質に結合可能なドメインは、配列番号５に示される配列を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項7】
前記核酸分子は、スプライシング調節タンパク質に結合可能なドメインを含む；
好ましくは、前記核酸分子は、ＳＲＳＦ１（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ １）、ＲＢＭ４（ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＤＡＺＡＰ１（ＤＡＺ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＲ（Ｓｅｒｉｎｅ Ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ－Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質からなる群より選択されるタンパク質に結合可能なドメインを含む；
より好ましくは、前記ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質に結合可能なドメインは、配列番号３０に示される配列を含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び任意選択で発現制御エレメントを、含むか或いはコードする、遺伝子発現カセット。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、及び／又は請求項８に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列を、含むか或いはコードする、ベクター又はウイルス粒子であって、前記ウイルス粒子は前記核酸分子のヌクレオチド配列、前記遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、及び／又は前記ベクターを含む、ベクター又はウイルス粒子。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、又は請求項９に記載のベクター若しくはウイルス粒子を含む細胞。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、請求項９に記載のベクター若しくはウイルス粒子、及び／又は請求項１０に記載の細胞、並びに任意選択で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
好ましくは、前記医薬組成物は、前記核酸分子を含む第１担体と、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３及びその両側領域又はその断片に特異的に結合する能力を有する核酸分子を含む第２担体とを含み、
より好ましくは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の両側領域は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡイントロン１２及び／又はイントロン１３を含む、
医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載の遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、請求項９に記載のベクター若しくはウイルス粒子、請求項１０に記載の細胞、及び／又は請求項１１に記載の医薬組成物を含む、キット。
【請求項13】
ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列又はその断片に結合可能な前記核酸分子を発現及び／又は合成することを含み、前記ＵＳＨ２Ａエクソン１３の３’末端配列のゲノム位置はＣｈｒ１：２１６２４６５６３－２１６２４６７５３である、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子を調製する方法。
【請求項14】
（１）ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の発現及び／又は機能を阻害する方法；又は
（２）ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン１３をスプライシングスキッピングする方法；又は
（３）エクソン１３を欠損した成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの調製方法；又は
（４）エクソン１３の発現産物を含むＵｓｈｅｒｉｎタンパク質のレベルを低下させる方法
における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項９に記載のベクター、請求項１０に記載の細胞、請求項１１に記載の医薬組成物、及び／又は請求項１２に記載のキット。
【請求項15】
（１）エクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の調製方法、及び／又はエクソン１３の発現産物を含まないＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の量を増加させる方法における使用；又は
（２）突然変異型Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の機能を回復する方法における使用；又は
（３）治療剤としての使用；又は
（４）ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療における使用、ここで前記疾患は好ましくは眼疾患及び／又は耳疾患を含む、
のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項９に記載のベクター若しくはウイルス粒子、請求項１０に記載の細胞、請求項１１に記載の医薬組成物、及び／又は請求項１２に記載のキット。
【国際調査報告】