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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-15
(54)【発明の名称】ヒトＮＧＦに対するイヌ化およびネコ化抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/22 20060101AFI20250107BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250107BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250107BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250107BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250107BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250107BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20250107BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250107BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250107BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20250107BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20250107BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250107BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250107BHJP
【ＦＩ】
C07K16/22 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P43/00 171
A61P25/02
A61P19/02
A61P29/00
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534461
(86)(22)【出願日】2022-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-08-05
(86)【国際出願番号】 EP2022086097
(87)【国際公開番号】W WO2023111157
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/290,264
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/327,076
(32)【優先日】2022-04-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】モーシー，モハマド
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ユアンジェン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA43
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA081
4C084ZA211
4C084ZA961
4C084ZB211
4C084ZC611
4C085AA14
4C085AA16
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、イヌＮＧＦに対する高い結合親和性を有する、イヌ化およびネコ化抗ヒトＮＧＦ抗体を提供する。本発明はまた、イヌ、ネコおよび他のコンパニオンアニマルにおける疼痛の治療におけるこれらの抗体の使用に関する。
【選択図】図９
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ネコ化抗体、またはネコ神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するいずれかの抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が重鎖および軽鎖を含み、ここで、前記軽鎖が、それぞれがアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ ｌｉｇｈｔ １（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ ｌｉｇｈｔ ２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ ｌｉｇｈｔ ３（ＣＤＲＬ３）を含み、そしてここで、前記重鎖が、それぞれがアミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ ｈｅａｖｙ １（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ ｈｅａｖｙ ２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ ｈｅａｖｙ ３（ＣＤＲＨ３）を含み、（ａ）ＣＤＲＨ１が配列番号１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＣＤＲＨ２が配列番号２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＣＤＲＨ３が配列番号３のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＣＤＲＬ１が配列番号４のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＣＤＲＬ２が配列番号５のアミノ酸配列を含み、そして
（ｆ）ＣＤＲＬ３が配列番号６のアミノ酸配列を含む、ネコ化抗体または抗原結合断片。
【請求項2】
ネコ重鎖定常領域を含み、前記ネコ重鎖定常領域が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列の１５１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および１８３位のアスパラギン残基（Ｎ）の両方がアラニン残基（Ａ）および配列番号５５で置換されており、ここで、前記アミノ酸配列の１５１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および１８３位のアスパラギン残基（Ｎ）の両方がアラニン残基（Ａ）で置換されている、請求項１に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
重鎖可変領域が、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
軽鎖可変領域が、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記重鎖可変領域が配列番号５７のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含むか、または前記重鎖可変領域が配列番号５７のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６２のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖可変領域が配列番号５８のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖可変領域が配列番号５８のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６２のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６２のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖可変領域が配列番号６０のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖可変領域が配列番号６０のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号６２のアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記軽鎖が、配列番号６８および配列番号６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記重鎖が、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６および配列番号６７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記重鎖が配列番号６４のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、または前記重鎖が配列番号６４のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６５のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６５のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６９のアミノ酸配列を含む、
請求項１～７のいずれか一項に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
前記重鎖が配列番号６５のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、または前記重鎖が配列番号６５のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、または
前記重鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖が配列番号６９のアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載のネコ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の軽鎖をコードする核酸。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載の重鎖をコードする核酸。
【請求項12】
核酸対であって、前記核酸対の一方が、請求項１～９に記載の抗体のいずれか１つの特定のネコ化抗体の前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、そして、前記核酸対の他方が、前記特定のネコ化抗体の前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸対。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸対、または請求項１０もしくは１１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項14】
発現ベクター対であって、一方が、前記特定のネコ化抗体の前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の核酸対の一方を含み、そして、他方が、前記特定のネコ化抗体の前記軽鎖をコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸対の他方を含む、発現ベクター対。
【請求項15】
請求項１３に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の発現ベクター対を含む宿主細胞。
【請求項16】
宿主細胞の対であって、前記宿主細胞の対の一方が、前記特定のネコ化抗体の前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の核酸対の一方を含む発現ベクターを含み、前記宿主細胞の対の他方が、前記特定のネコ化抗体の前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸対の他方を含む発現ベクターを含む、宿主細胞の対。
【請求項17】
請求項１～９のいずれか一項に記載のネコ化抗体、または請求項１３に記載の発現ベクター、または請求項１４に記載の発現ベクター対、またはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項18】
ネコの疼痛に関連する症状の治療を支援する方法であって、治療有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を前記ネコに投与することを含む、方法。
【請求項19】
変形性関節症、痛覚過敏、異痛症、疼痛、またはそれらの任意の組み合わせの治療に使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ネコＮＧＦに結合するネコ化抗体を作製する方法であって、ａ．請求項１６に記載の宿主細胞の対の各々を、個々に、または組み合わせて、前記核酸が発現される条件下で培養培地中で培養すること、それにより前記ネコ化抗体の前記軽鎖、前記ネコ化抗体の前記重鎖、またはその両方を含むポリペプチドを作製すること、および
ｂ．前記宿主細胞の対または培養培地から、前記ネコ化抗体の前記軽鎖、前記ネコ化抗体の前記重鎖、またはその両方を回収すること
を含む、方法。
【請求項21】
請求項１～９のいずれか一項に記載のネコ化抗体、または請求項１２に記載の発現ベクター、または請求項１４に記載の発現ベクター対、またはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、ネコの疼痛に関連する症状の治療の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
電子的に提出された配列表への言及
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＸＭＬファイルは２０２２年１２月１３日に作成され、名称は２５５４３ｘ．ｘｍｌである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＸＭＬファイルは２０２２年１２月１３日に作成され、名称は２５５４３ｘ．ｘｍｌである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６３／３２７，０７６号（２０２２年４月４日出願）および米国特許出願第６３／２９０，２６４号（２０２１年１２月１６日出願）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。その主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国仮特許出願第６３／３２７，０７６号（２０２２年４月４日出願）および米国特許出願第６３／２９０，２６４号（２０２１年１２月１６日出願）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。その主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本発明は、疼痛に関与するタンパク質に対する抗体に関する。より具体的には、本発明はさらに、イヌおよびネコＮＧＦへの高い結合親和性を有するヒトＮＧＦに対するイヌ化抗体またはネコ化抗体に関連する。本発明はまた、変形性関節症を有するイヌおよびネコの疼痛の治療における本発明の抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0004】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、神経系の発達において重要な役割を果たす、十分に特徴付けられた分泌タンパク質である。加えて、ＮＧＦはまた、非ニューロン細胞、および免疫系の細胞を含む組織に対して生物学的効果を有することが示されている。ＮＧＦは、最初に、３つの非共有結合的に連結されたサブユニットから構成される複合体としてマウス顎下腺において単離された。ＮＧＦのアルファおよびガンマサブユニットはセリンプロテアーゼのカリクレインファミリーに属するが、ＮＧＦ複合体のベータサブユニットはＮＧＦに起因する生物学的活性を示す。ＮＧＦ（ベータＮＧＦとも称される）は、１８アミノ酸残基のシグナルペプチドを有するプレプロペプチドとして産生される［Ｗｉｅｓｍａｎｎ ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ，ＣＬＭＳ：５８，７４８－７５９，（２００１）］。組換えヒトベータＮＧＦは、２つの１２０アミノ酸ポリペプチドのホモ二量体である。ヒトＮＧＦのＣ末端の１２０アミノ酸は、イヌおよびネコを含む他の種からのＮＧＦの予測されるＣ末端に対して約９８％の相同性を有する。
【0005】
多くの研究が、ＮＧＦが疼痛の伝達において重要な役割を果たすことを示している。例えば、ヒトにおいて、ＮＧＦレベルは、いくつかの関節炎症状を有する患者からの滑液中で上昇している［Ａｌｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｒｈｅｕｍ．，３５：３５１－３５５（１９９２）］。さらに、変形性関節症を有するイヌの滑液において、イヌＮＧＦ発現のレベルの上昇が明らかにされている［Ｉｓｏｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｃｏｍｐ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａｔｏｌ．，４：２７９（２０１１）］。また、ＮＧＦの機能を阻害する薬剤、例えば中和抗体が、神経障害性疼痛の動物モデルにおいて痛覚過敏および異痛症を防止することが実証されている［例えば、Ｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７－８４６（１９９９）およびＲｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ，７９：２６５－２７４（１９９９）を参照されたい］。ＮＧＦが特定の炎症性および非炎症性の症状、例えば変形性関節症および癌における疼痛の伝達に関与するという認識は、ＮＧＦの生物学的活性を中和することができる抗体の開発への関心をもたらした［当技術分野で公知の抗ＮＧＦ抗体の例には、下記が含まれる：国際公開第０１／７８６９８号、国際公開第０１／６４２４７号、国際公開第０２／０９６４５８号、米国特許第７，６０１，８１８ Ｂ２号、およびＧｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：２２６，（２０１３）］。
【0006】
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「従来技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第０１／７８６９８号明細書
【特許文献2】国際公開第０１／６４２４７号明細書
【特許文献3】国際公開第０２／０９６４５８号明細書
【特許文献4】米国特許第７，６０１，８１８ Ｂ２号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｗｉｅｓｍａｎｎ ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ，ＣＬＭＳ：５８，７４８－７５９，（２００１）
【非特許文献2】Ａｌｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｒｈｅｕｍ．，３５：３５１－３５５（１９９２）
【非特許文献3】Ｉｓｏｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｃｏｍｐ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａｔｏｌ．，４：２７９（２０１１）
【非特許文献4】Ｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７－８４６（１９９９）
【非特許文献5】Ｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ，７９：２６５－２７４（１９９９）
【非特許文献6】Ｇｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：２２６，（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、イヌおよび／またはネコＮＧＦに対する特異的結合親和性を有するだけでなく、イヌおよび／またはネコＮＧＦのそれぞれのＮＧＦ受容体への結合を阻止する能力を有する、イヌ化およびネコ化抗ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）抗体に関連する。本発明は、動物における痛覚過敏および異痛症の治療におけるそのような抗体の使用を含む。抗体はまた、変形性関節症を有するイヌ（ｄｏｇ）またはネコ（ｃａｔ）の疼痛を治療するために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
したがって、本発明は、ＮＧＦを結合し、中和することができる、重鎖および軽鎖を含む新規なイヌ化およびネコ化抗体、ならびにイヌ化およびネコ化抗体のそれらの抗原結合断片を提供する。イヌ化抗体の重鎖は、可変領域（ＶＨ）と、イヌ断片結晶化可能領域（ｃＦｃまたはｃＦｃ領域）を含む３つの定常領域とを含む。軽鎖も可変領域（ＶＬ）を含むが、定常領域は１つのみである。重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、それぞれ３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。したがって、軽鎖は、それぞれがアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ ｌｉｇｈｔ １（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ ｌｉｇｈｔ ２（ＣＤＲＬ２）、およびＣＤＲ ｌｉｇｈｔ ３（ＣＤＲＬ３）を含み、重鎖は、それぞれがアミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ ｈｅａｖｙ １（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ ｈｅａｖｙ ２（ＣＤＲＨ２）、およびＣＤＲ ｈｅａｖｙ ３（ＣＤＲＨ３）を含む。ＣＤＲＨ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３のアミノ酸配列を含み、対して、ＣＤＲＬ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0011】
特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。関連する実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の関連する実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0012】
特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、イヌ化抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、イヌ化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、イヌ化抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、イヌ化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0013】
イヌ化抗体はヒンジ領域も含む。イヌヒンジ領域は、好ましくは、イヌヒンジ領域である。特定の実施形態では、イヌヒンジ領域は、配列番号４５のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、イヌヒンジ領域は、配列番号４６のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、イヌヒンジ領域は、配列番号４７のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、イヌヒンジ領域は、配列番号４８のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0014】
本発明のイヌ化抗体は、イヌ断片結晶化可能領域（ｃＦｃ領域）を含む。一実施形態では、イヌｃＦｃ領域は、配列番号４９のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、イヌｃＦｃ領域は、配列番号５０のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、イヌｃＦｃ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、イヌｃＦｃ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、イヌｃＦｃ領域は、配列番号２０および／または配列番号５１のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含むｃＦｃＩｇＧ－Ｂｍであり、ここで、配列番号５０の３１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および配列番号５０の６３位のアスパラギン残基（Ｎ）の両方は、アラニン残基（Ａ）で置換されている。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0015】
いくつかの実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。さらに他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0016】
特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0017】
本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体の軽鎖可変領域のいずれか１つをコードする核酸（単離された核酸を含む）を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする。
【0018】
本発明はまた、本発明のイヌ化抗体の軽鎖のいずれか１つをコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする。
【0019】
同様に、本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体の重鎖可変領域のいずれか１つをコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする。
【0020】
加えて、本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体の重鎖のいずれか１つをコードする核酸を提供する。関連する実施形態では、核酸は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする。本発明はさらに、本発明の抗体の抗原結合断片のいずれか１つをコードする核酸を提供する。
【0021】
したがって、本発明は、核酸対を提供し、核酸対の一方は、本発明の特定のネコ化抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、前記特定のネコ化抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0022】
本発明はさらに、本発明の核酸の１つ以上を含み、発現する発現ベクターを提供する。特定の実施形態では、発現ベクターは、本発明のイヌ化抗体の重鎖をコードする核酸、およびそのイヌ化抗体の軽鎖をコードする核酸を含み、発現する。本発明はまた、本発明の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0023】
本発明はまた、イヌ化抗体および／または抗体の抗原結合断片および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明のイヌ化抗体の重鎖をコードする核酸と、そのイヌ化抗体の軽鎖をコードする核酸と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。他の実施形態では、医薬組成物は、本発明のイヌ化抗体の重鎖およびそのイヌ化抗体の軽鎖の両方をコードする核酸を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と、本発明のイヌ化抗体の重鎖およびそのイヌ化抗体の軽鎖をコードする１つ以上の核酸を含むことにより、本発明のイヌ化抗体および／または抗体の抗原結合断片をインビボで発現することができる発現ベクターとを含む。
【0024】
本発明はさらに、動物対象の疼痛に関連する症状を治療する方法を提供する。治療方法は、治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする動物対象に投与することを含み得る。特定の実施形態では、方法は、変形性関節症の治療に使用される。他の実施形態では、方法は、痛覚過敏の治療に使用される。さらに他の実施形態では、方法は、異痛症の治療に使用される。さらに他の実施形態では、方法は、疼痛の治療に使用される。さらに他の実施形態では、方法は、変形性関節症、痛覚過敏、異痛症、および／または疼痛の任意の組み合わせの治療に使用される。投与される抗体がイヌ化抗体である場合、動物対象は好ましくはイヌである。
【0025】
本発明はまた、イヌ化抗体、またはイヌＮＧＦに結合するその抗原結合断片を作製する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、本発明のイヌ化抗体の軽鎖および／またはそのイヌ化抗体の重鎖をコードおよび発現する１つ以上の発現ベクターを含む１つ以上の宿主細胞を、核酸が発現される条件下で培養し、それにより、本発明のイヌ化抗体の軽鎖および／またはそのイヌ化抗体の重鎖を含むポリペプチドを作製することを含む。次いで、ポリペプチドを１つ以上の宿主細胞または培養培地から回収する。特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体の軽鎖を含むポリペプチドおよびそのイヌ化抗体の重鎖を含むポリペプチドを、イヌ化抗体を形成しやすい条件下でそれぞれと組み合わせる。
【0026】
上記で示すように、本発明は、ネコ化抗ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）抗体にも関連し、それはイヌおよび／またはネコＮＧＦに対する特異的結合親和性を有するだけでなく、イヌおよび／またはネコＮＧＦのそれぞれのＮＧＦ受容体への結合を阻止する能力を有する。したがって、軽鎖は、それぞれがアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ ｌｉｇｈｔ １（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ ｌｉｇｈｔ ２（ＣＤＲＬ２）、およびＣＤＲ ｌｉｇｈｔ ３（ＣＤＲＬ３）を含み、重鎖は、それぞれがアミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ ｈｅａｖｙ １（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ ｈｅａｖｙ ２（ＣＤＲＨ２）、およびＣＤＲ ｈｅａｖｙ ３（ＣＤＲＨ３）を含む。ＣＤＲＨ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３のアミノ酸配列を含み、対して、ＣＤＲＬ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0027】
特定の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【0028】
関連する実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0029】
特定の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ネコ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0030】
ネコ化抗体はヒンジ領域も含む。ネコヒンジ領域は、好ましくは、ネコヒンジ領域である。
【0031】
本発明のネコ化抗体は、ネコ重鎖定常領域をさらに含む。一実施形態では、ネコ重鎖定常領域は、配列番号５４のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ネコ重鎖定常領域は、配列番号５５のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネコ重鎖定常領域は、配列番号５６のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネコ重鎖定常領域は、配列番号５４のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここで１５１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および１８３位のアスパラギン残基（Ｎ）の両方は、アラニン残基（Ａ）で置換されている。さらに別の実施形態では、ネコ重鎖定常領域は、配列番号５５のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここで１５１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および１８３位のアスパラギン残基（Ｎ）の両方は、アラニン残基（Ａ）で置換されている。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0032】
いくつかの実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。関連する実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0033】
特定の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。さらに他の実施形態では、ネコ化抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0034】
本発明はさらに、これらの抗体のすべての抗原結合断片を提供する。
【0035】
本発明はまた、本発明のネコ化抗体およびその抗原結合断片のいずれかをコードする、単離された核酸を含む核酸を提供する。したがって、本発明は、本発明のネコ化抗体の軽鎖可変領域のいずれか１つをコードする核酸（単離された核酸を含む）を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする。本発明はまた、本発明のネコ化抗体の軽鎖のいずれか１つをコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする。
【0036】
同様に、本発明はさらに、本発明のネコ化抗体の重鎖可変領域のいずれか１つをコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする。さらに他の実施形態では、核酸は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする。さらに他の実施形態では、核酸は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする。
【0037】
加えて、本発明はさらに、本発明のネコ化抗体の重鎖のいずれか１つをコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする。関連する実施形態では、核酸は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする。他の実施形態では、核酸は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする。
【0038】
本発明はさらに、本発明の抗体の抗原結合断片のいずれか１つをコードする核酸を提供する。
【0039】
したがって、本発明は、ネコ化抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域；ネコ化抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖、ネコ化抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域、および／またはネコ化抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖をコードする核酸を提供する。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、本発明のいずれか１つの抗体の特定のネコ化抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、その（前記）特定のネコ化抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、そのような核酸対、または本発明の個々の核酸を含む発現ベクターを提供する。加えて、本発明は、発現ベクター対を提供し、発現ベクター対の一方は、本発明のいずれか１つのネコ化抗体の特定のネコ化抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、発現ベクター対の他方は、その（前記）特定のネコ化抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。したがって、本発明は、本発明のネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする核酸を提供する。本発明は、本発明のネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードする核酸をさらに提供する。本発明はまた、本発明のネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。本発明はまた、本発明のネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0040】
本発明はさらに、３つの重鎖ＣＤＲのセットをコードする核酸および３つの軽鎖ＣＤＲの対応するセットをコードする核酸を対として提供する。特定の実施形態では、３つの重鎖ＣＤＲのセットをコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖可変領域をコードし、３つの軽鎖ＣＤＲのセットをコードする対応する核酸は、その（前記）ネコ化抗体の軽鎖可変領域をコードする。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、３つの重鎖ＣＤＲのセットをコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、３つの軽鎖ＣＤＲのセットをコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0041】
特定の実施形態では、核酸は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むネコ化抗体重鎖をコードする。関連する実施形態では、核酸は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むネコ化抗体軽鎖をコードする。本発明はさらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むネコ化抗体重鎖をコードする核酸、ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むネコ化抗体軽鎖をコードする核酸を対として提供する。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0042】
特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号５７のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６１のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0043】
他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号５７のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６２のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0044】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号５８のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６１のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0045】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号５８のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６２のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0046】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号５９のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６１のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0047】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号５９のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６２のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0048】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号６０のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６１のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0049】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は配列番号６０のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は配列番号６２のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域をコードする核酸は、ネコ化抗体の重鎖をコードし、軽鎖可変領域をコードする対応する核酸は、そのネコ化抗体の軽鎖をコードする。
【0050】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６８のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0051】
さらに他の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0052】
特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６５のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６８のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0053】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６５のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0054】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６８のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0055】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0056】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６７のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６８のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0057】
さらに他の特定の実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードし、重鎖は配列番号６７のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、本発明の核酸は、ネコ化抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードし、軽鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸対をさらに提供し、核酸対の一方は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、核酸対の他方は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、この２つの核酸対を含むキットを提供する。
【0058】
本発明はさらに、本発明の核酸の１つ以上を含み、発現する発現ベクターを提供する。特定の実施形態では、発現ベクターは、本発明のネコ化抗体の重鎖をコードする核酸およびそのネコ化抗体の軽鎖をコードする核酸を含み、発現する。本発明はまた、本発明の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0059】
本発明はまた、ネコ化抗体および／または抗体の抗原結合断片および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明のネコ化抗体の重鎖をコードする核酸およびそのネコ化抗体の軽鎖をコードする核酸および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。他の実施形態では、医薬組成物は、本発明のネコ化抗体の重鎖およびそのネコ化抗体の軽鎖の両方をコードする核酸を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と、本発明のネコ化抗体の重鎖およびそのネコ化抗体の軽鎖をコードする１つ以上の核酸を含むことにより、本発明のネコ化抗体および／または抗体の抗原結合断片をインビボで発現することができる発現ベクターとを含む。
【0060】
本発明はさらに、動物対象の疼痛に関連する症状を治療する方法を提供する。治療方法は、治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする動物対象に投与することを含み得る。特定の実施形態では、方法は、変形性関節症の治療に使用される。他の実施形態では、方法は、痛覚過敏の治療に使用される。さらに他の実施形態では、方法は、異痛症の治療に使用される。さらに他の実施形態では、方法は、疼痛の治療に使用される。さらに他の実施形態では、方法は、変形性関節症、痛覚過敏、異痛症、および／または疼痛の任意の組み合わせの治療に使用される。ネコ化抗体またはその抗原結合断片を投与する場合、動物対象は、好ましくはネコである。
【0061】
本発明はまた、ネコ化抗体、またはネコＮＧＦに結合するその抗原結合断片を作製する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、本発明のネコ化抗体の軽鎖および／またはそのネコ化抗体の重鎖をコードおよび発現する１つ以上の発現ベクターを含む１つ以上の宿主細胞を、核酸が発現される条件下で培養し、それにより、本発明のネコ化抗体の軽鎖および／またはそのネコ化抗体の重鎖を含むポリペプチドを作製することを含む。次いで、ポリペプチドを１つ以上の宿主細胞または培養培地から回収する。特定の実施形態では、本発明のネコ化抗体の軽鎖を含むポリペプチドおよびそのネコ化抗体の重鎖を含むポリペプチドを、ネコ化抗体を形成しやすい条件下でそれぞれと組み合わせる。
【0062】
本発明は、宿主細胞の対をさらに提供し、宿主細胞の対の一方は、本発明の特定のネコ化抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸対の一方を含む発現ベクターを含み、宿主細胞の対の他方は、前記特定のネコ化抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸対の他方を含む発現ベクターを含む。本発明はさらに、ネコＮＧＦに結合する本発明のネコ化抗体を作製する方法であって、宿主細胞の対の各々を、個々に、または組み合わせて、核酸が発現される条件下で培養培地中で培養すること、それによりネコ化抗体の軽鎖、ネコ化抗体の重鎖、またはその両方を含むポリペプチドを作製すること、次いで宿主細胞の対または培養培地から、ネコ化抗体の軽鎖、ネコ化抗体の重鎖、またはその両方を回収することを含む方法を提供する。
【0063】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明を参照することによってよりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【0064】
【図1】ヒト－イヌキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）およびイヌ化フラヌマブ（ｃＦｕｌ）抗体のバリアントの、イヌＮＧＦへの結合を示す。
【0065】
Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ（●）、ｃＦｕｌＶＨ１Ｌ１（■）、ｃＦｕｌＶＨ１Ｌ２（▲）、ｃＦｕｌＶＨ２Ｌ１（▼）、ｃＦｕｌＶＨ２Ｌ２（◆）、およびｍａｂ対照（○）
【図2】ヒト－イヌキメラファシヌマブ（Ｆａｓ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）および個々のイヌ化ファシヌマブ（ｃＦａｓ）抗体のバリアントのイヌＮＧＦへの結合を示す。Ｆａｓ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ（●）、ｃＦａｓＶＨ２Ｌ２（■）、ｃＦａｓＶＨ２Ｌ３（▲）、およびｍａｂ対照（○）
【図3】イヌＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦの結合を示す。イヌＮＧＦのイヌＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）への結合をＥＬＩＳＡによって決定した。イヌＮＧＦ（●）
【図4】ヒト－イヌキメラフラヌマブまたは個々のイヌ化抗体によるイヌＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦ結合の阻害を示す。Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ（●）、ｃＦｕｌＶＨ１Ｌ１（■）、ｃＦｕｌＶＨ１Ｌ２（▲）、ｃＦｕｌＶＨ２Ｌ１（▼）、ｃＦｕｌＶＨ２Ｌ２（◆）、およびｍａｂ対照（○）
【図5】イヌＮＧＦによるＴＦ－１細胞増殖の刺激を示す。［イヌＮＧＦ（●）］
【図6】ヒト－イヌキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）または個々のイヌ化抗ＮＧＦ抗体によるＴＦ－１細胞増殖の阻害を示す。Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ（●）、ｃＦｕｌＶＨ１Ｌ１（■）、ｃＦｕｌＶＨ１Ｌ２（▲）、ｃＦｕｌＶＨ２Ｌ１（▼）、ｃＦｕｌＶＨ２Ｌ２（◆）、およびｍａｂ対照（○）
【図7】ヒト－ネコキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）およびネコ化抗体（ｆＦｕｌ）のバリアントのネコＮＧＦへの結合を示す。結合をＥＬＩＳＡアッセイで決定した。Ｆｕｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ（●）、ｆＦｕｌＨ２Ｌ１（■）、ｆＦｕｌＨ２Ｌ２（▲）、ｆＦｕｌＨ４Ｌ１（▼）、およびｆＦｕｌＶＨ４Ｌ２（◆）
【図8】ＴＦ－１細胞の増殖を刺激するネコＮＧＦのＣ末端部分（●）の用量依存的能力を示す。
【図9】ヒト－ネコキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｈ－Ｆ）、フラヌマブの列挙されたネコ化バリアントおよびアイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）のＴＦ－１細胞増殖を阻止する能力を示す。ヒト－ネコキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｈ－Ｆ）（●）、ｆＦｕｌＨ２Ｌ１（■）、ｆＦｕｌＨ２Ｌ２（▲）、ｆＦｕｌＨ４Ｌ１（▼）、ｆＦｕｌＨ４Ｌ２（◆）、およびｍａｂ対照（□）
【発明を実施するための形態】
【0066】
イヌおよびネコにおける疼痛に対するより良好な療法への要求に応答して、本発明は、ＮＧＦに関連する疼痛および／またはＮＧＦに起因する疼痛を軽減するための有意な効果を達成することができる製剤および方法論を提供する。したがって、驚くべきことに、ヒトＮＧＦに対して最初に起こされたある抗体に由来するＣＤＲのセットを含むイヌ化抗体およびネコ化抗体は、イヌＮＧＦおよびネコＮＧＦにそれぞれ強く結合することができたが、ヒトＮＧＦに対して最初に起こされた別の抗体に由来するＣＤＲのセットを含むイヌ化抗体は、イヌＮＧＦに測定可能に結合することができなかったことが見出された。対応する両方のヒト－イヌキメラ構築物がイヌＮＧＦに強固に結合することができたとしても、これは真であった。
【0067】
略語
本発明の詳細な説明および実施例を通して、以下の略語を使用する。
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ 補体依存性細胞障害
ＣＤＲ Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して定義される、免疫グロブリン可変領域中の相補性決定領域
ＥＣ５０ ５０％の有効性または結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＲ 抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域。
ＩＣ５０ ５０％阻害をもたらす濃度
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔが創始した免疫グロブリンのアラインメントおよびナンバリングシステム［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）］
ｍＡｂ モノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭＡｂとも）
Ｖ領域 異なる抗体間で配列が可変であるＩｇＧ鎖のセグメント
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＬ 免疫グロブリン軽鎖可変領域
本発明の詳細な説明および実施例を通して、以下の略語を使用する。
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ 補体依存性細胞障害
ＣＤＲ Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して定義される、免疫グロブリン可変領域中の相補性決定領域
ＥＣ５０ ５０％の有効性または結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＲ 抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域。
ＩＣ５０ ５０％阻害をもたらす濃度
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔが創始した免疫グロブリンのアラインメントおよびナンバリングシステム［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）］
ｍＡｂ モノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭＡｂとも）
Ｖ領域 異なる抗体間で配列が可変であるＩｇＧ鎖のセグメント
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＬ 免疫グロブリン軽鎖可変領域
【0068】
定義
本発明がより容易に理解され得るように、特定の技術的用語および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本発明がより容易に理解され得るように、特定の技術的用語および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0069】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、それらの対応する複数の言及を含む。
【0070】
分子の「活性」は、分子のリガンドまたは受容体への結合、触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナル伝達、分化、または成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節などを説明し、またはそれらを指すことができる。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば接着を調節もしくは維持する活性、または細胞の構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格を維持する活性を指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［タンパク質ｍｇ］、または［免疫活性］／［タンパク質ｍｇ］、生体コンパートメント中の濃度などを意味し得る。「活性」は、自然免疫系または適応免疫系の成分の調節を指し得る。
【0071】
「投与」および「治療」は、動物、例えばイヌまたはネコ対象、細胞、組織、器官、または体液に適用される場合、外因性の医薬、治療、診断薬、または組成物と動物、例えばイヌまたはネコ対象、細胞、組織、器官、または体液との接触を指す。細胞の治療は、細胞への試薬の接触、ならびに細胞と接触している流体への試薬の接触を包含する。
【0072】
「投与」および「治療」はまた、試薬、診断、結合化合物または別の細胞による、例えば、細胞のインビトロおよびエクスビボ治療を意味する。「対象」という用語は、任意の生物、好ましくは非ヒト動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌまたはネコ）、最も好ましくはイヌまたはネコを含む。
【0073】
「治療する」または「治療すること」は、治療剤、例えば本発明の抗体のいずれかを含有する組成物を、薬剤が治療活性を有する１つ以上の症状を有するか、または症状を有すると疑われるイヌまたはネコ対象または患者に内部的または外部的に投与することを意味する。典型的には、薬剤は、治療された対象または集団における１つ以上の疾患／状態症状を、任意の臨床的に測定可能な程度でそのような症状の退縮を誘導することによって、またはそのような（１または複数の）症状の進行を阻害することによって緩和および／または改善するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患／状態症状を緩和するのに有効な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、要因、例えばイヌまたはネコの疾患／症状段階、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する医薬組成物の能力に応じて変化し得る。疾患／状態症状が緩和または改善されたかどうかは、その症状の重症度または進行症状を評価するために獣医または他の熟練したヘルスケア提供者によって通常使用される、任意の臨床測定によって評価することができる。本発明の実施形態（例えば、治療方法または製造品）は、すべての対象において（１または複数の）標的疾患／状態症候を軽減するのに有効ではないかもしれないが、それは、当該分野で公知の任意の統計学的検定、例えば、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウィルコクソン検定によって決定されるような、統計学的に有意な数の対象において（１または複数の）標的疾患／状態症状を軽減するはずである。
【0074】
「治療」は、獣医学的対象（例えば、イヌまたはネコ）または研究対象に適用される場合、治療的処置ならびに研究および診断用途を指す。「治療」は、獣医学的対象（例えば、イヌまたはネコ）、または研究対象、または細胞、組織、または器官に適用される場合、本発明の抗体と、例えばイヌまたはネコ、細胞、組織、生理学的コンパートメント、または生理学的流体との接触を包含する。
【0075】
本明細書で使用される場合、「イヌ」という用語は、特に明記しない限り、すべての飼いイヌ、カニス・ルプス・ファミリアリスまたはカニス・ファミリアリスを含む。
【0076】
本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科のあらゆるメンバーを指す。このファミリーのメンバーには、野生、動物園、および家庭のメンバー（飼いネコ、純血および／または雑種コンパニオンキャット、興行用ネコ、実験用ネコ、クローンネコ、および野生または自然のネコを含む）が含まれる。
【0077】
本明細書で使用される場合、「イヌフレーム」という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を指す。イヌ化抗体に関して、大部分の実施形態では、天然のイヌＣＤＲのアミノ酸配列は、両方の鎖において対応する外来ＣＤＲ（例えば、マウスまたはヒト由来のもの）で置き換えられる。イヌ抗体の重鎖および／または軽鎖は、例えば、下記に例示されるような、および／または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号明細書に開示されるような、イヌ化抗体内の外来ＣＤＲのコンフォメーションを保存するために、および／またはＦｃ領域機能を修飾するために、いくつかの外来非ＣＤＲ残基を含有していてもよい。
【0078】
本明細書で使用される場合、「ネコフレーム」という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外のネコ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を指す。ネコ化抗体に関して、大部分の実施形態では、天然のネコＣＤＲのアミノ酸配列は、両方の鎖において対応する外来ＣＤＲ（例えば、マウスまたはヒト由来のもの）で置き換えられる。ネコ抗体の重鎖および／または軽鎖は、例えば、下記に例示されるように、および／または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号にイヌ化抗体について開示されるように、ネコ化抗体内の外来ＣＤＲのコンフォメーションを保存するために、および／またはＦｃ領域機能を修飾するために、いくつかの外来非ＣＤＲ残基を含有していてもよい。
【0079】
「Ｆｃ」と略されるか、または「Ｆｃ領域」と互換的に使用される「断片結晶化可能領域」は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する抗体のＣＨ３－ＣＨ２部分に対応する。４つのイヌＩｇＧの各々のイヌ断片結晶化可能領域（ｃＦｃ領域）は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．によって最初に記載された［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１）；Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１５７：３１－４１（２０１４）および米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号も参照されたい］。
【0080】
本明細書で使用される場合、イヌＦｃ（ｃＦｃ）「ＩｇＧ－Ｂｍ」は、ＩｇＧ－Ｂの配列番号２０のアミノ酸配列のように（下記参照）、２つのアミノ酸残基置換、Ｄ３１ＡおよびＮ６３Ａを含み、好ましくはｃ末端リジン（「Ｋ」）、すなわち配列番号５１）を含まない、イヌＩｇＧ－Ｂ Ｆｃである。配列番号５０の３１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および配列番号５０の６３位のアスパラギン残基（Ｎ）は、いずれもＩｇＧ－Ｂｍにおいてアラニン残基（Ａ）に置換されている。これらの２つのアミノ酸残基置換は、天然イヌＩｇＧ－Ｂの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有意に減少させるのに役立つ［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号を参照されたい］。ＩｇＧ－Ｂｍに対するさらなるアミノ酸置換も想定され、それらは、ＩｇＧ－Ｂにおいてなされ得るものに対応する。ネコ重鎖定常領域、ＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列の類似の変化も以下の実施例に提供され、このような修飾をそれぞれ「ＩｇＧ１ａｍ」または「ＩｇＧ１ｂｍ」と表記する。
【0081】
本明細書中で使用される場合、抗体のアミノ酸配列における別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、例えば、別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の交換」と同等であり、アミノ酸配列における特定の位置における特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって交換されている（または置換されている）ことを示す。そのような置換は、特に設計することができる、すなわち、例えば組換えＤＮＡ技術によってアミノ酸配列の特定の位置でアラニンをセリンで意図的に置換することができる。あるいは、抗体の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の列は、自然な選択プロセスを通して、例えば細胞によって産生された抗体がその抗原上の所与の領域、例えばエピトープまたはその一部を含有するものに結合する能力に基づいて、かつ／または置換されているＣＤＲと同じ正規の構造を保持する特定のＣＤＲを抗体が含むために、１つまたは複数のアミノ酸残基によって置換され得る。このような置換／交換は、「バリアント」ＣＤＲおよび／またはバリアント抗体をもたらし得る。
【0082】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、所望の生物学的活性を示す抗体の任意の形態を指す。抗体は、モノマー、二量体、またはより大きな多量体であり得る。したがって、それは最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、イヌ化抗体、完全イヌ化抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体を包含するが、これらに限定されない。「親抗体」は、意図される使用のための抗体の修飾、例えばイヌ治療用抗体として使用するための抗体のイヌ化またはネコ化の前に、免疫系を抗原に曝露することによって得られる抗体である。
【0083】
本明細書で使用される場合、「遮断する」または「遮断している」、または例えば、イヌのリガンドとその結合パートナー（例えば、その受容体）もしくはネコのリガンドとその結合パートナー（例えば、その受容体）との「結合を遮断している」本発明の抗体は、標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー）で決定されるように、リガンドとその受容体およびその逆の結合を（部分的または完全に）遮断する抗体である。
【0084】
典型的には、本発明の抗体または抗原結合断片は、その活性がモルベースで表される場合、そのイヌまたはネコ抗原結合活性の少なくとも１０％を保持する（親抗体と比較した場合）。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合断片は、親抗体としてのイヌ抗原結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％以上を保持する。本発明の抗体または抗原結合断片は、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的バリアント」または「機能保存バリアント」と呼ばれる）を含み得ることも意図される。
【0085】
「単離された抗体」は、精製状態を指し、そのような状況において分子が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの他の生物学的分子、または細胞残屑および増殖培地などの他の材料を実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、本明細書に記載の結合化合物の実験的または治療的使用に実質的に干渉する量で存在しない限り、そのような材料が全く存在しないこと、または水、緩衝液もしくは塩が存在しないことを指すことを意図しない。
【0086】
本明細書で使用される場合、抗体は、所与の抗原配列（この場合、イヌおよび／またはネコＮＧＦのアミノ酸配列の一部分）を含むポリペプチドに、イヌおよび／またはネコＮＧＦのアミノ酸配列のその部分を含むポリペプチドには結合するが、イヌおよび／またはネコＮＧＦの配列のその部分を欠く他のイヌ（またはネコ）タンパク質には結合しない場合、特異的に結合すると言われる。例えば、イヌおよび／またはネコＮＧＦを含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は、イヌおよび／またはネコＮＧＦのＦＬＡＧ（登録商標）標識形態に結合し得るが、他のＦＬＡＧ（登録商標）標識イヌおよび／またはネコタンパク質には結合しないであろう。
【0087】
本明細書中で使用される場合、別段示されない限り、「抗体断片」または「抗原結合断片」とは、抗体の抗原結合断片、すなわち、全長抗体によって結合される抗原（例えば、イヌおよび／またはネコＮＧＦ）に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片のことを指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ－Ｆｖ；抗体断片から形成されたナノボディおよび多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0088】
抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合化合物が、そのイヌおよび／もしくはネコ抗原またはそのバリアントもしくはムテインに「特異性で」結合するのは、試験した任意の他のイヌおよび／またはネコ抗原への親和性よりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍大きいそのイヌおよび／もしくはネコ抗原またはそのバリアントもしくはムテインへの親和性を有する場合である。イヌおよび／またはネコのＮＧＦに「特異性で」結合する抗体はさらに、別の種に由来するＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合し得る。
【0089】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、第１の抗体由来の可変ドメインおよび第２の抗体由来の定常ドメインを有する抗体であり、第１および第２の抗体は異なる種に由来する。［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４）］。典型的には、可変ドメインは、げっ歯類（またはヒト免疫系を含むげっ歯類）などの実験動物由来の抗体「親抗体」から得られ、定常ドメイン配列は、動物対象抗体、例えばイヌまたはネコから得られ、それにより、得られたキメラ抗体は、イヌまたはネコ対象それぞれにおいて有害な免疫応答を誘発する可能性が親（例えば、げっ歯類）抗体よりも少ないであろう。
【0090】
本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」という用語は、イヌ抗体および非イヌ（例えば、マウスまたはヒト）抗体の両方からの配列を含む抗体の形態を指し、一方、本明細書で使用される場合、「ネコ化抗体」という用語は、ネコ抗体および非ネコ（例えば、マウスまたはヒト）抗体の両方からの配列を含む抗体の形態を指す。一般に、イヌ化抗体またはネコ化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、それぞれ非イヌまたは非ネコ免疫グロブリンのものに対応し（例えば、以下に例示されるような６つのＣＤＲを含む）、フレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべて（および典型的には残りのフレームのすべてまたは実質的にすべて）が、それぞれイヌ免疫グロブリンまたはネコ免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ以上、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。
【0091】
イヌ化抗体は、例えば、ヒト抗ヒトＮＧＦ抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲＳの両方を、イヌフレームまたは修飾イヌフレームと一緒に含むことができる。修飾イヌフレームは、イヌ化抗体の有効性をさらに最適化して、例えば、イヌ抗原へのその結合、および／またはイヌ抗原の天然結合パートナーへのそのイヌ抗原の結合を遮断する能力を増加する、本明細書に例示される１つ以上のアミノ酸変更を含む。
【0092】
同様に、ネコ化抗体は、例えば、ヒト抗ヒトＮＧＦ抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲＳの両方を、ネコフレームまたは修飾ネコフレームと一緒に含むことができる。修飾ネコフレームは、ネコ化抗体の有効性をさらに最適化して、例えば、そのネコ抗原へのその結合、および／またはネコ抗原の天然結合パートナーへのそのネコ抗原の結合を遮断する能力を増加する、本明細書に例示される１つ以上のアミノ酸変更を含む
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は、一般に、同じである。典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって整列させられ、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｋａｂａｔ、ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．；第５版；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５（１９７８）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）］の定義に従う。
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は、一般に、同じである。典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって整列させられ、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｋａｂａｔ、ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．；第５版；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５（１９７８）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）］の定義に従う。
【0093】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合の要因である抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のＬＣＤＲ１またはＣＤＲＬ１、ＬＣＤＲ２またはＣＤＲＬ２、およびＬＣＤＲ３またはＣＤＲＬ３、ならびに重鎖可変ドメイン中のＨＣＤＲ１またはＣＤＲＨ１、ＨＣＤＲ２またはＣＤＲＨ２、およびＨＣＤＲ３またはＣＤＲＨ３）。［抗体のＣＤＲ領域を配列によって定義する、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと；抗体のＣＤＲ領域を構造によって定義する、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）も参照のこと］。本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。
【0094】
イヌでは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ばれる４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、ＩｇＧ－Ａ（またはＩｇＧＡ）、ＩｇＧ－Ｂ（またはＩｇＧＢ）、ＩｇＧ－Ｃ（またはＩｇＧＣ）、およびＩｇＧ－Ｄ（またはＩｇＧＤ）と呼ばれるイヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを表す。２つの重鎖の各々は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＨ－１、ＣＨ－２、およびＣＨ－３と呼ばれる３つの定常ドメインとからなる。ＣＨ－１ドメインは、「ヒンジ」または代替的に「ヒンジ領域」と呼ばれるアミノ酸配列を介してＣＨ－２ドメインに接続している。２つの既知の軽イヌ鎖サブタイプは、ラムダおよびカッパと呼ばれる。
【0095】
「相同性」は、本明細書中で使用される場合、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列の、それらが最適にアラインメントされた場合の配列類似性を指す。２つの比較された配列の両方のある位置が同じ塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同である。相同性のパーセントは、比較した位置の総数で割った、２つの配列が共有する相同位置の数×１００である。例えば、配列が最適にアラインメントされる場合、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が一致または相同であれば、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、２つの配列をアラインメントして、最大パーセントの相同性が得られたときに行われる。配列同一性は、２つの配列が最適にアラインメントされたときに、２つのポリペプチドのアミノ酸が同等な位置で同じである程度を指す。本明細書で使用される場合、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１つのアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」である。
【0096】
したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、アミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対して５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えばタンパク質、または比較されるポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基の連続ブロックにわたって行われる。特定の実施形態では、別途２つのアミノ酸配列間の対応関係を変化させ得る、選択された欠失または挿入が考慮される。配列類似性は、同一の残基、および非同一の生化学的に関連するアミノ酸、例えば、類似の特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸を含む。
【0097】
「保存的修飾バリアント」または「保存的置換」は、タンパク質のアミノ酸を類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格コンフォメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指し、それにより、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁に変更を行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する［例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（第４版；１９８７）を参照のこと］。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換をすぐ下の表Ａに示す。
【表1】
【0098】
本発明の抗体の機能保存的バリアントも本発明によって企図される。本明細書で使用される「機能保存的バリアント」は、所望の特性、例えば抗原親和性および／または特異性を変化させることなく１つ以上のアミノ酸残基が変化した抗体または断片を指す。そのようなバリアントは、限定されないが、アミノ酸の同様の特性を有するものでの置換、例えば上記の表Ａの保存的アミノ酸置換を含む。
【0099】
「単離された核酸分子」は、ゲノムのＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源またはそれらの何らかの組み合わせを意味し、それらは、単離されたポリヌクレオチドが本来は発見されるか、または本来は連結されないポリヌクレオチドに連結されているポリヌクレオチドの全部または一部に関連しない。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」が完全な染色体を包含しないことを理解されたい。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０またはさらには最大２０またはそれを超える他のタンパク質またはその一部分もしくは断片のコード配列を含み得るか、または列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する、作動可能に連結された調節配列を含み得るか、かつ／またはベクター配列を含み得る。
【0100】
本発明は、本発明の単離されたイヌ化抗体およびネコ化抗体、症状の治療、例えばイヌまたはネコにおける変形性関節症の治療における抗体の使用方法を提供する。
【0101】
これらの４つの重鎖の核酸およびアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１）］によって最初に同定された。これらの重鎖のアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である。例えば、ＩｇＧＡ重鎖のアミノ酸配列はアクセッション番号ＡＡＬ３５３０１．１であり、ＩｇＧＢはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０２．１であり、ＩｇＧＣはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０３．１であり、ＩｇＧＤはアクセッション番号（ＡＡＬ３５３０４．１）である。イヌ抗体はまた、２種類の軽鎖、カッパおよびラムダを含有する。これらの軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手することができる。例えば、カッパ軽鎖アミノ酸配列はアクセッション番号ＡＢＹ ５７２８９．１を有し、ラムダ軽鎖はアクセッション番号ＡＢＹ ５５５６９．１を有する。
【0102】
４つの未修飾イヌＦｃの既知のアミノ酸配列は以下の通りである。
【0103】
ｃＩｇＧ－Ａ ［配列番号４９］
【0104】
ｃＩｇＧ－Ｂ ［配列番号５０］
【0105】
ｃＩｇＧ－Ｃ ［配列番号５２］
【0106】
ｃＩｇＧ－Ｄ ［配列番号５３］
【0107】
本発明では、４つのイヌＩｇＧ Ｆｃ領域の各々のアミノ酸配列は、前出のＴａｎｇ ｅｔ ａｌによって決定されたとおり、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインの同定された境界に基づく。
【0108】
本発明はまた、イヌ断片結晶化可能領域（ｃＦｃ領域）を含み、ｃＦｃ領域が、１つ以上のエフェクター機能を増強、縮小、または排除するように遺伝子組換えされている、本発明の抗体を提供する。本発明の一態様では、遺伝子組換えｃＦｃ領域は、１つ以上のエフェクター機能を縮小または排除する。本発明の別の態様では、遺伝子組換えｃＦｃ領域は、１つ以上のエフェクター機能を増強する。ある特定の実施形態において、遺伝子組換えｃＦｃ領域は、遺伝子組換えイヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域である。別のこのような実施形態において、遺伝子組換えｃＦｃ領域は、遺伝子組換えイヌＩｇＧＣ Ｆｃ領域である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、増強、縮小、または排除される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。別の実施形態では、エフェクター機能は、増強、縮小、または排除される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。さらに別の実施形態では、ｃＦｃ領域は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増強、縮小または排除するように遺伝子組換えされている。
【0109】
本発明の特定の実施形態において、イヌＮＧＦの結合に加えて、本発明のその抗原に対するイヌまたはイヌ化抗体は、最適には、２つの特質を有する：
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能が無い、ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィーに基づく技術など、業界標準技術を使用して容易に大規模精製される。
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能が無い、ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィーに基づく技術など、業界標準技術を使用して容易に大規模精製される。
【0110】
両方の基準を満たす天然イヌＩｇＧアイソタイプは存在しない。例えば、ＩｇＧ－Ｂは、プロテインＡを使用して精製することができるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を有する。一方、ＩｇＧ－ＡはプロテインＡへの結合が弱いが、ＡＤＣＣ活性も示す。さらに、ＩｇＧ－ＤはＡＤＣＣ活性を示さないが、ＩｇＧ－ＣもＩｇＧ－ＤもプロテインＡカラムで精製することはできない。（ＩｇＧ－Ｃは、かなりのＡＤＣＣ活性を有する）。本発明が特定の実施形態においてこれらの問題に対処する１つの方法は、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能を欠き、業界標準のプロテインＡクロマトグラフィーを使用して容易に精製することができる、本発明の抗原に特異的な本発明の修飾イヌＩｇＧ－Ｂ抗体を提供することによるものである。以下の実施例に開示されるように、ネコＩｇＧの２つの重鎖定常領域：ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂは、同様に修飾することができる。
【0111】
ＩｇＧ－Ｂのアミノ酸配列、配列番号５０：
【化1】
【0112】
ＩｇＧ－Ｂｍのアミノ酸配列、配列番号５１を以下に提供する。
【0113】
【0114】
Ｃ末端リジン（Ｋ）を有するＩｇＧ－Ｂｍのアミノ酸配列、配列番号２０：
【0115】
エフェクター機能を欠くイヌＩｇＧのバリアントを生成するために、多数の変異イヌＩｇＧＢ重鎖を生成した。これらのバリアントは、重鎖アミノ酸配列のＦｃ部分に以下：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３Ｇ、およびＰ９５Ａの単一または組み合わせの置換の１つまたは複数を含み得る。バリアント重鎖（すなわち、このようなアミノ酸置換を含む）を発現プラスミドにクローニングし、軽鎖をコードする遺伝子を含むプラスミドと共にＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトする。完全な抗体をＨＥＫ ２９３細胞から発現および精製し、次いで、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑへの結合について評価して、免疫エフェクター機能の媒介に対するそれらの可能性を評価することができる。［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号を参照されたい］。
【0116】
本発明はまた、修飾イヌＩｇＧ－Ｄを提供し、それらはその天然のＩｇＧ－Ｄヒンジ領域の代わりに、以下からのヒンジ領域を含む：
【0117】
あるいは、ＩｇＧ－Ｄヒンジ領域は、セリン残基をプロリン残基で置換することによって遺伝子組換えをすることができ、すなわちＰＫＥＳＴＣＫＣＩＰＰＣＰＶＰＥＳ 配列番号４８（下線を引いた太字のプロリン残基（Ｐ）による天然セリン残基の置換）。そのような修飾は、Ｆａｂアーム交換を欠くイヌＩｇＧ－Ｄをもたらし得る。修飾イヌＩｇＧ－Ｄは、組換えＤＮＡ技術の標準的な方法を用いて構築することができる［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）］。これらのバリアントを構築するために、イヌＩｇＧ－Ｄのアミノ酸配列をコードする核酸を、修飾ＩｇＧ－Ｄをコードするように修飾することができる。次いで、修飾された核酸配列は、タンパク質発現のために発現プラスミドにクローニングされる。
【0118】
本明細書中に記載されるようなイヌ化マウスまたはヒト抗ＮＧＦ抗体の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウスまたはヒト軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むイヌ抗体のカッパ（ｋ）軽鎖またはラムダ（ｌ）軽鎖と、マウスまたはヒト重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むイヌ抗体の重鎖とを含むことができる。
【0119】
同様に、本発明は、ネコＮＧＦに結合し、好ましくはまた、ネコＴｒｋＡに対するそのネコＮＧＦの結合を遮断する、本発明のネコ化マウスまたはヒト抗体（単離されたネコ化マウスまたはヒト抗ヒトＮＧＦ抗体が含まれる）をさらに提供する。本発明はまた、ネコ化ＮＧＦ抗体、およびネコにおける疼痛、例えば変形性関節症の治療における本発明のネコ化抗体の使用方法を提供する。さらに、本発明は、対応する軽鎖と合わせてネコ化抗体を作製することができる完全長ネコ化重鎖を提供する。したがって、本発明はまた、本発明のネコ化マウスまたはヒト抗ＮＧＦ抗体（単離されたネコ化ヒト抗ヒトＮＧＦ抗体を含む）、ならびに、症状の治療、例えば、ネコにおける疼痛の治療における本発明の抗体の使用方法を提供する。
【0120】
核酸
本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸を含む（例えば、以下の実施例も参照されたい）。
本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸を含む（例えば、以下の実施例も参照されたい）。
【0121】
本発明はまた、変化しないＣＤＲを除いて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較すると、本明細書に提供されるイヌ化抗体およびネコ化抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を含み、アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長に対してそれぞれの配列間で最大の一致をもたらすように選択される。本発明はさらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較すると、参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、最も好ましくは少なくとも約９５％類似（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供し、アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長に対してそれぞれの配列間で最大の一致をもたらすように選択され、さらに本発明に含まれる。
【0122】
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同一性パーセントは、Ｃ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）、ならびにアラインメントデフォルトパラメータおよび同一性のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して決定され得る。これらの市販のプログラムを使用して、同じまたは類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性を決定することもできる。あるいは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を、例えば、デフォルトパラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用のプログラムマニュアル、バージョン７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルタ条件下で使用することができる。
【0123】
以下の参考文献は、配列分析にしばしば用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ、Ｗ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ、Ｔ．Ｌ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６（１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ、Ｊ．Ｃ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０（１９９４）；アラインメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．、ｅｔ ａｌ．、「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３）Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．）、ｐｐ．３４５－３５２、（１９７８）；Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、「Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３において）（１９７８）、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．）、ｐｐ．３５３－３５８（１９７８）、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５（１９９１）；Ｓｔａｔｅｓ、Ｄ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９（１９９２）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００（１９９３）；アラインメント統計：Ｋａｒｌｉｎ、Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ、Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）；Ｄｅｍｂｏ、Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９（１９９４）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて）（Ｓ．Ｓｕｈａｉ、ｅｄ．）、ｐｐ．１－１４、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）。
【0124】
抗体タンパク質工学
限定ではなく例として、上に示されるように、イヌ重鎖定常領域は、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、ＩｇＧ－Ｄに由来であり得、対応するｃＦｃは、修飾ｃＦｃ、例えば、本明細書で使用されるＩｇＧ－Ｂ重鎖定常領域のＩｇＧ－Ｂｍ［参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号を参照されたい］であり得、イヌ軽鎖は、カッパまたはラムダに由来する定常領域を含み得る。
限定ではなく例として、上に示されるように、イヌ重鎖定常領域は、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、ＩｇＧ－Ｄに由来であり得、対応するｃＦｃは、修飾ｃＦｃ、例えば、本明細書で使用されるＩｇＧ－Ｂ重鎖定常領域のＩｇＧ－Ｂｍ［参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７ Ｂ２号を参照されたい］であり得、イヌ軽鎖は、カッパまたはラムダに由来する定常領域を含み得る。
【0125】
抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、親（例えば、ヒト）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のイヌフレームワークおよび／またはイヌフレーム残基に対する修飾を含むように操作することができる。
【0126】
イヌ化またはネコ化抗ＮＧＦモノクローナル抗体の構築は、イヌまたはネコＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ決定することによって行うことができる。イヌまたはネコ重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列は当技術分野で公知であり、ＮＣＢＩ遺伝子およびタンパク質データベースを検索することによって得ることができる。
【0127】
イヌ化またはネコヒト抗ＮＧＦ抗体は、当該分野で公知の方法によって組換え的に作製され得る。本明細書に開示される抗体または断片の発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ－２９３細胞およびいくつかの他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスターの細胞が含まれる。どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって、特に好ましい細胞株が選択される。使用され得る他の細胞株は、Ｓｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞などの昆虫細胞株である。重鎖またはその抗原結合部分もしくは断片、軽鎖および／またはその抗原結合断片をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長している培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって作製される。
【0128】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。さらに、製造細胞株からの本発明の抗体（またはそれに由来する他の部分）の発現は、いくつかの公知の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、および第０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して全体的または部分的に論じられている。
【0129】
したがって、特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、重鎖定常領域、例えばイヌ定常領域、例えばＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－ＣおよびＩｇＧ－Ｄイヌ重鎖領域またはそのバリアントを含む。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域、例えばラムダもしくはカッパイヌ軽鎖領域またはそのバリアント由来のイヌ軽鎖定常領域を含む。限定ではなく例として、イヌ重鎖定常領域はＩｇＧ－Ｂｍ由来であり得、イヌ軽鎖定常領域はカッパ由来であり得る。
【0130】
本発明のイヌＮＧＦに結合するイヌ化哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）抗ヒトＮＧＦ抗体には、限定されないが、イヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－ＣおよびＩｇＧ－Ｄ重鎖および／またはイヌカッパ軽鎖もしくはラムダ軽鎖を抗ヒトＮＧＦ ＣＤＲと一緒に含む本発明の抗体が含まれる。したがって、本発明は、イヌＮＧＦに結合し、好ましくはまた、イヌＴｒｋＡに対するそのイヌＮＧＦの結合を遮断する、本発明のイヌ化マウスまたはヒト抗体（単離されたイヌ化マウスまたはヒト抗ヒトＮＧＦ抗体が含まれる）を提供する。
【0131】
本発明はさらに、イヌ化ＮＧＦ抗体、およびイヌにおける疼痛、例えば変形性関節症の治療における本発明のイヌ化抗体の使用方法を提供する。
【0132】
本発明はさらに、対応する軽鎖と合わせてイヌ化抗体を作製することができる完全長イヌ化重鎖を提供する。本発明はまた、対応する軽鎖と合わせてネコ化抗体を作製することができる完全長ネコ化重鎖を提供する。したがって、本発明はさらに、本発明のイヌ化マウスまたはヒト抗ＮＧＦ抗体（単離されたイヌ化ヒト抗ヒトＮＧＦ抗体を含む）、ならびにネコ化マウスまたはヒト抗ＮＧＦ抗体（単離されたネコ化ヒト抗ヒトＮＧＦ抗体を含む）、ならびに症状の治療、例えば、イヌおよびネコそれぞれにおける疼痛の治療における本発明の抗体の使用方法を提供する。
【0133】
医薬組成物および投与
本発明の抗体を含む医薬組成物または無菌組成物を調製するために、これらの抗体を薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。［例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照のこと］。
本発明の抗体を含む医薬組成物または無菌組成物を調製するために、これらの抗体を薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。［例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照のこと］。
【0134】
治療剤および診断薬の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製され得る［例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい］。一実施形態において、本発明の抗体は、酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５～６）で適切な濃度に希釈され、ＮａＣｌまたはスクロースが張性のために加えられる。さらなる薬剤、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０を添加して安定性を強化することができる。
【0135】
単独で、または別の薬剤と組み合わせて投与される抗体組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様では、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、イヌにおける使用のための投薬量の範囲の定式化に使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【0136】
投与様式は変化してもよい。適切な投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮、または動脈内が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、注射などの侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる実施形態において、本発明の抗体またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内に、または吸入によるエアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば、経口；例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤）による投与も本発明の範囲内である。
【0137】
組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、例えばプレフィルドシリンジまたは自動注入装置を含む、皮下注射針での注射によって投与することができる。本明細書に開示される医薬組成物はまた、無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第６，６２０，１３５号；６，０９６，００２号；５，３９９，１６３号；５，３８３，８５１号；５，３１２，３３５号；５，０６４，４１３号；４，９４１，８８０号；４，７９０，８２４号または４，５９６，５５６号に開示されているデバイスを用いて投与されてもよい。
【0138】
本明細書に開示される医薬組成物はまた、注入によって投与され得る。医薬組成物を投与する周知のインプラントおよびモジュール形態の例としては、制御された速度で薬剤を分配するための埋込み型マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流量埋込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号が挙げられる。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは、当業者に周知である。
【0139】
あるいは、本発明の抗体を全身的ではなく局所的に、しばしばデポ製剤または持続放出製剤で投与することができる。
【0140】
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織の代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、標的疾患／症状の改善をもたらすのに十分な治療用抗体を送達し、同時に望ましくない副作用を最小限に抑える。したがって、送達される生物学的製剤の量は、部分的には、特定の治療用抗体および治療される症状の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量の選択における指針が利用可能である［例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７０（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２（２０００）を参照されたい］。
【0141】
適切な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野で知られているまたは疑われるパラメータまたは因子を使用して、獣医によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりも幾分少ない量で始まり、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望または最適な効果が達成されるまで、わずかな増分で増加される。重要な診断手段には、症状のものが含まれる。
【0142】
本明細書で提供される抗体は、連続注入によって、または例えば、毎日、週に１～７回、毎週、隔週、毎月、隔月、四半期毎、半年毎、毎年、その他に投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内、または吸入によって提供され得る。総毎週用量は、一般に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である［例えば、Ｙａｎｇ、ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７－４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ、ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２－１６９８（２００２）；Ｌｉｕ、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１－４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ、ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３－１４４（２００３）を参照されたい］。イヌまたはネコの血清中の本発明の抗体の所定の目標濃度、例えば０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌ以上を達成するための用量も提供され得る。他の実施形態では、本発明の抗体を、毎週、隔週、「４週毎」、毎月、隔月または四半期毎ベースで、対象あたり１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇで皮下または静脈内投与する。
【0143】
本明細書で使用される場合、「阻害する」または「治療する」または「治療」は、障害に関連する症状の発症の延期および／またはそのような障害の症状の重症度の低下を含む。この用語はさらに、既存の無制御または望ましくない症状を改善すること、さらなる症状を予防すること、およびそのような症状の根本的な原因を改善または予防することを含む。したがって、これらの用語は、有益な結果が、障害、疾患および／もしくは症状を有するか、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発症する可能性を有する脊椎動物対象（例えば、イヌまたはネコ）に与えられたことを意味する。
【0144】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という用語は、単独で、または追加の治療剤と組み合わせて細胞、組織または対象、例えばイヌまたはネコに投与した場合に、疾患もしくは症状の１つ以上の症状またはそのような疾患もしくは症状の進行の測定可能な改善を引き起こすのに有効な本発明の抗体の量を指す。治療有効用量はさらに、症状の少なくとも部分的な改善、例えば関連する医学的症状の治療、治癒、予防もしくは改善、またはそのような症状の治療、治癒、予防もしくは改善の速度の増加をもたらすのに十分な抗体の量を指す。組み合わせに適用される場合、治療有効用量は、組み合わせて投与されるか、連続的に投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせ量を指す。治療薬の有効量は、診断尺度またはパラメータの少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらすであろう。有効量はまた、主観的尺度を使用して症状、例えば疼痛の重症度を評価する場合に、主観的尺度の改善をもたらすことができる。
【0145】
［実施例］
［実施例１］
イヌＮＧＦと反応性であるヒトＮＧＦに対する先行技術の抗体
イヌ、ネコおよびウマなどのコンパニオンアニマルにおける疼痛用（例えば、変形性関節症用）治療を開発するための取り組みにおいて、ヒトＮＧＦに対する２つの公知のヒト抗体またはヒト化抗体［例えば、米国特許第７，６０１，８１８ Ｂ２号（本明細書でｆｕｌと略されるフラヌマブ）、米国特許第７，９８８，９６７ Ｂ２号（本明細書でｆａｓと略されるファシヌマブ）を参照されたい］が、イヌ、ネコまたはウマ由来のＮＧＦにも結合し得るかどうかを知るための調査が行われた。ヒトＮＧＦに結合するヒト／ヒト化モノクローナル抗体はどちらもイヌＮＧＦに結合することが見出された。これらの２つの以前に開示された抗体のための６つの先行技術のＣＤＲのセットを、以下の表１Ａおよび１Ｂに提供する。
［実施例１］
イヌＮＧＦと反応性であるヒトＮＧＦに対する先行技術の抗体
イヌ、ネコおよびウマなどのコンパニオンアニマルにおける疼痛用（例えば、変形性関節症用）治療を開発するための取り組みにおいて、ヒトＮＧＦに対する２つの公知のヒト抗体またはヒト化抗体［例えば、米国特許第７，６０１，８１８ Ｂ２号（本明細書でｆｕｌと略されるフラヌマブ）、米国特許第７，９８８，９６７ Ｂ２号（本明細書でｆａｓと略されるファシヌマブ）を参照されたい］が、イヌ、ネコまたはウマ由来のＮＧＦにも結合し得るかどうかを知るための調査が行われた。ヒトＮＧＦに結合するヒト／ヒト化モノクローナル抗体はどちらもイヌＮＧＦに結合することが見出された。これらの２つの以前に開示された抗体のための６つの先行技術のＣＤＲのセットを、以下の表１Ａおよび１Ｂに提供する。
【0146】
【表2】
【表3】
【0147】
［実施例２］
イヌＮＧＦおよびイヌＮＧＦ ＴＲＫＡ受容体
イヌＮＧＦタンパク質のアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）において、アクセッション番号ＮＰ＿００１１８１８７９．１［配列番号１３］で入手可能である。配列番号１４のアミノ酸配列を有するＮＧＦタンパク質の精製および部位特異的ビオチン化を容易にするために、イヌＮＧＦ－ＨＩＳ－Ａｖｉタンパク質を、６つのヒスチジン残基およびＡｖｉ ｔａｇ配列のＣ末端付加によってイヌＮＧＦの融合タンパク質として作製した。高親和性イヌ神経成長因子受容体（ＴｒｋＡ）の予測されるアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）において、アクセッション番号ＸＰ＿０３８５２７７４５で入手可能である。ＴｒｋＡのアミノ酸配列は配列番号１５である。ｃＮＧＦ－ｈＦｃ融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。イヌＮＧＦ受容体ＴｒｋＡ ＥＣＤ－イヌＦｃ融合タンパク質については、ＴｒｋＡ ＥＣＤの予測アミノ酸配列を、イヌＩｇＧ－Ｂ由来のｃＦｃのＣ末端付加を用いて融合タンパク質として作製した。この融合タンパク質の配列を配列番号１７に示す。
イヌＮＧＦおよびイヌＮＧＦ ＴＲＫＡ受容体
イヌＮＧＦタンパク質のアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）において、アクセッション番号ＮＰ＿００１１８１８７９．１［配列番号１３］で入手可能である。配列番号１４のアミノ酸配列を有するＮＧＦタンパク質の精製および部位特異的ビオチン化を容易にするために、イヌＮＧＦ－ＨＩＳ－Ａｖｉタンパク質を、６つのヒスチジン残基およびＡｖｉ ｔａｇ配列のＣ末端付加によってイヌＮＧＦの融合タンパク質として作製した。高親和性イヌ神経成長因子受容体（ＴｒｋＡ）の予測されるアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）において、アクセッション番号ＸＰ＿０３８５２７７４５で入手可能である。ＴｒｋＡのアミノ酸配列は配列番号１５である。ｃＮＧＦ－ｈＦｃ融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。イヌＮＧＦ受容体ＴｒｋＡ ＥＣＤ－イヌＦｃ融合タンパク質については、ＴｒｋＡ ＥＣＤの予測アミノ酸配列を、イヌＩｇＧ－Ｂ由来のｃＦｃのＣ末端付加を用いて融合タンパク質として作製した。この融合タンパク質の配列を配列番号１７に示す。
【表4】
【0148】
【0149】
［実施例３］
ヒト－イヌキメラＮＧＦ抗体の生成
先に開示されたＶＨ配列およびＶＬ配列［以下の表３を参照］を使用してキメラヒト－イヌ抗体を構築し、次いで、イヌＮＧＦに対して試験した。簡潔には、選択された抗体群のＶＨおよびＶＬの各々を、イヌＩｇＧ－Ｂ重鎖定常領域（ＣＨ１－ＣＨ３）および軽鎖（カッパ）定常領域と、それぞれ遺伝子結合（融合）させた［より詳細については表４を参照］。表４に列挙したヒト－イヌ（Ｈ－Ｃ）キメラのヒト／ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域をＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させ、次いでプロテインＡカラムを使用して精製した。個々のキメラ抗体の結合活性を、下記の実施例４に記載されるように、イヌＮＧＦでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにおいて試験した。
ヒト－イヌキメラＮＧＦ抗体の生成
先に開示されたＶＨ配列およびＶＬ配列［以下の表３を参照］を使用してキメラヒト－イヌ抗体を構築し、次いで、イヌＮＧＦに対して試験した。簡潔には、選択された抗体群のＶＨおよびＶＬの各々を、イヌＩｇＧ－Ｂ重鎖定常領域（ＣＨ１－ＣＨ３）および軽鎖（カッパ）定常領域と、それぞれ遺伝子結合（融合）させた［より詳細については表４を参照］。表４に列挙したヒト－イヌ（Ｈ－Ｃ）キメラのヒト／ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域をＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させ、次いでプロテインＡカラムを使用して精製した。個々のキメラ抗体の結合活性を、下記の実施例４に記載されるように、イヌＮＧＦでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにおいて試験した。
【表5】
【表6】
【0150】
［実施例４］
イヌ化ＮＧＦ抗体の生成
表１Ａ～１Ｂに提供される６つのＣＤＲの２つのセットを使用して、イヌ化抗体を構築した。イヌＮＧＦに対するキメラ抗体およびイヌ化抗体の結合活性をＥＬＩＳＡによって比較した（以下の実施例５を参照されたい）。図１および図２に示されるように、両方のキメラ抗体は、イヌＮＧＦに対して強い親和性を示す。正反対に、対照のイヌ化モノクローナル抗体（無関係のイヌ抗原に対して起こされたマウス抗体から得られた６つのＣＤＲのセットを有する）は全く結合しなかった。
イヌ化ＮＧＦ抗体の生成
表１Ａ～１Ｂに提供される６つのＣＤＲの２つのセットを使用して、イヌ化抗体を構築した。イヌＮＧＦに対するキメラ抗体およびイヌ化抗体の結合活性をＥＬＩＳＡによって比較した（以下の実施例５を参照されたい）。図１および図２に示されるように、両方のキメラ抗体は、イヌＮＧＦに対して強い親和性を示す。正反対に、対照のイヌ化モノクローナル抗体（無関係のイヌ抗原に対して起こされたマウス抗体から得られた６つのＣＤＲのセットを有する）は全く結合しなかった。
【0151】
したがって、図１は、ＥＬＩＳＡによって決定された、ヒト－イヌキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍ）、およびフラヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアント、およびアイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）の結合のプロットを示す。イヌＮＧＦに結合したキメラフラヌマブは２２ｐＭのＥＣ５０を有し、これに対して、イヌＮＧＦに結合したフラヌマブのイヌ化バリアントは３２～４９ｐＭの範囲のＥＣ５０を有した。これらの結果は、これらのイヌ化抗体がイヌＮＧＦに対して強い結合親和性を有し、それによって、それらをイヌにおける疼痛の治療用薬物としての開発に好適なものにすることを実証している。
【0152】
図２は、ＥＬＩＳＡによって決定された、ヒト－イヌキメラファシヌマブ（Ｆａｓ Ｃｈｉｍ）、およびファシヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアント、およびアイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）の結合のプロットを示す。しかしながら、驚くべきことに、キメラファシヌマブは１２２ｎＭのＥＣ５０でイヌＮＧＦに結合したのに対し、ファシヌマブ由来のＣＤＲを含有する対応するイヌ化バリアントのイヌＮＧＦに対する結合親和性は、低すぎて測定できなかった。これにより、イヌ化ファシヌマブ抗体は、イヌにおける疼痛の治療のための開発には不適当となる。これは、ヒトＮＧＦへの所与の抗体由来のＣＤＲのセットをコードするイヌ化抗体がイヌＮＧＦにも結合するかどうかは、対応するヒト－イヌキメラが十分に結合する場合であっても、予測不可能であることを実証している。
【表7】
【0153】
イヌ化抗体の重鎖および軽鎖
ｃＦｕｌＶＨ１－ｃＩｇＧＢ（配列番号３６）
ｃＦｕｌＶＨ１－ｃＩｇＧＢ（配列番号３６）
【0154】
ｃＦｕｌＶＨ２－ｃＩｇＧＢ（配列番号３７）
【0155】
ｃＦｕｌＶＬ１－ｃＣｋ（配列番号３８）
【0156】
ｃＦｕｌＶＬ２－ｃＣｋ（配列番号３９）
【0157】
ｃＦＡＳ－ＶＨ１－ｃＩｇＧＢ（配列番号４０）
【0158】
ｃＦＡＳ－ＶＨ２－ｃＩｇＧＢ（配列番号４１）
【0159】
ｃＦＡＳ－ＶＬ１－ｃＣｋ（配列番号４２）
【0160】
ｃＦＡＳ－ＶＬ２－ｃＣｋ（配列番号４３）
【0161】
ｃＦＡＳ－ＶＬ３－ｃＣｋ（配列番号４４）
【0162】
［実施例５］
キメラ抗体およびイヌ化抗ヒトＮＧＦ抗体のイヌＮＧＦへの結合
方法
キメラ抗体およびイヌ化抗体のイヌＮＧＦへの結合を以下のようにＥＬＩＳＡによって決定した：
１．イムノプレートにおいてウェルあたり１００ｎｇのイヌＮＧＦをコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）によって３回洗浄する。
３．室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡによってプレートをブロッキングする。
４．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
５．希釈プレートの各列または行で抗体を３倍希釈する。
６．希釈した抗体をイムノプレートの各列または行に移し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
７．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
８．１：２０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧ Ｆｃをプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
１０．ＴＭＢ基質をプレートの各ウェルに添加し、発色のために室温で１０～１５分間プレートをインキュベートする。
１１．１００μＬの１．５Ｍリン酸を各ウェルに添加して反応を停止させる。
１２．５４０ｎｍの参照波長と共に４５０ｎｍでプレートを読み取る。
キメラ抗体およびイヌ化抗ヒトＮＧＦ抗体のイヌＮＧＦへの結合
方法
キメラ抗体およびイヌ化抗体のイヌＮＧＦへの結合を以下のようにＥＬＩＳＡによって決定した：
１．イムノプレートにおいてウェルあたり１００ｎｇのイヌＮＧＦをコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）によって３回洗浄する。
３．室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡによってプレートをブロッキングする。
４．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
５．希釈プレートの各列または行で抗体を３倍希釈する。
６．希釈した抗体をイムノプレートの各列または行に移し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
７．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
８．１：２０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧ Ｆｃをプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
１０．ＴＭＢ基質をプレートの各ウェルに添加し、発色のために室温で１０～１５分間プレートをインキュベートする。
１１．１００μＬの１．５Ｍリン酸を各ウェルに添加して反応を停止させる。
１２．５４０ｎｍの参照波長と共に４５０ｎｍでプレートを読み取る。
【0163】
結果
図３は、イヌＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦの結合を示す。アッセイを発展させてイヌ化抗イヌＮＧＦ抗体の、イヌＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体への結合を遮断する能力を測定するために、イヌＮＧＦのイヌＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）への結合をＥＬＩＳＡによって決定した。図３に示されるように、イヌＮＧＦは、そのイヌＴｒｋＡ受容体に用量依存的に結合し、ＥＣ５０は５４ｎＭである。
図３は、イヌＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦの結合を示す。アッセイを発展させてイヌ化抗イヌＮＧＦ抗体の、イヌＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体への結合を遮断する能力を測定するために、イヌＮＧＦのイヌＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）への結合をＥＬＩＳＡによって決定した。図３に示されるように、イヌＮＧＦは、そのイヌＴｒｋＡ受容体に用量依存的に結合し、ＥＣ５０は５４ｎＭである。
【0164】
［実施例６］
キメラ抗体およびイヌ化抗体の遮断活性
方法
キメライヌ化抗ＮＧＦ抗体を、イヌＮＧＦのイヌＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）への結合の遮断について下記のように試験した：
１．イムノプレートにおいてウェルあたり１００ｎｇのイヌＴｒｋＡ－ＩｇＧＢＦｃ融合タンパク質をコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）によって３回洗浄する。
３．室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡによってプレートをブロッキングする。
４．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
５．希釈プレートの各列または行で抗体の３倍希釈物を作製し、次いで、ウェルあたり１００ｎｇのビオチン化イヌＮＧＦを加え、抗体と混合する。
６．希釈した抗体およびイヌＮＧＦ混合物をイムノプレートの各列または行に移し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
７．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
８．１：２０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンをプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
１０．ＴＭＢ基質をプレートの各ウェルに添加し、発色のために室温で１０～１５分間プレートをインキュベートする。
１１．１００μＬの１．５Ｍリン酸を各ウェルに添加して反応を停止させる。
１２．５４０ｎｍの参照波長と共に４５０ｎｍでプレートを読み取る。
キメラ抗体およびイヌ化抗体の遮断活性
方法
キメライヌ化抗ＮＧＦ抗体を、イヌＮＧＦのイヌＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）への結合の遮断について下記のように試験した：
１．イムノプレートにおいてウェルあたり１００ｎｇのイヌＴｒｋＡ－ＩｇＧＢＦｃ融合タンパク質をコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）によって３回洗浄する。
３．室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡによってプレートをブロッキングする。
４．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
５．希釈プレートの各列または行で抗体の３倍希釈物を作製し、次いで、ウェルあたり１００ｎｇのビオチン化イヌＮＧＦを加え、抗体と混合する。
６．希釈した抗体およびイヌＮＧＦ混合物をイムノプレートの各列または行に移し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
７．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
８．１：２０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンをプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で４５～６０分間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
１０．ＴＭＢ基質をプレートの各ウェルに添加し、発色のために室温で１０～１５分間プレートをインキュベートする。
１１．１００μＬの１．５Ｍリン酸を各ウェルに添加して反応を停止させる。
１２．５４０ｎｍの参照波長と共に４５０ｎｍでプレートを読み取る。
【0165】
結果
図４は、イヌ化抗体および対応するヒト－イヌキメラフラヌマブによるイヌＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦ結合の阻害を示す。ヒト－イヌキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍ）、およびフラヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアントの、イヌＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体への結合を遮断する能力をＥＬＩＳＡによって決定した。示されるように、キメラフラヌマブ、およびフラヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアントは、特異的かつ用量依存的にイヌＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体への結合を１０ｎＭ～８７ｎＭのＩＣ５０の範囲で阻害した。正反対に、アイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）はそうではなかった。これらの結果は、イヌ化抗体がイヌにおける疼痛の治療のための開発に適していることを示している。
図４は、イヌ化抗体および対応するヒト－イヌキメラフラヌマブによるイヌＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦ結合の阻害を示す。ヒト－イヌキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍ）、およびフラヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアントの、イヌＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体への結合を遮断する能力をＥＬＩＳＡによって決定した。示されるように、キメラフラヌマブ、およびフラヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアントは、特異的かつ用量依存的にイヌＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体への結合を１０ｎＭ～８７ｎＭのＩＣ５０の範囲で阻害した。正反対に、アイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）はそうではなかった。これらの結果は、イヌ化抗体がイヌにおける疼痛の治療のための開発に適していることを示している。
【0166】
［実施例７］
ＴＦ－１細胞におけるイヌＮＧＦ生物活性の阻害
材料および方法
ＴＦ－１細胞に基づくアッセイ
ＴＦ－１は、様々な種由良のＮＧＦに応答してヒトＴｒｋＡを発現し増殖する、ヒト赤白血病細胞株である。イヌＮＧＦのＴＦ－１細胞の増殖に対する効果、ならびにキメラ抗体およびイヌ化抗ＮＧＦ抗体のＴＦ－１細胞の増殖を遮断する能力を下記のように評価した：
ＴＦ－１細胞におけるイヌＮＧＦ生物活性の阻害
材料および方法
ＴＦ－１細胞に基づくアッセイ
ＴＦ－１は、様々な種由良のＮＧＦに応答してヒトＴｒｋＡを発現し増殖する、ヒト赤白血病細胞株である。イヌＮＧＦのＴＦ－１細胞の増殖に対する効果、ならびにキメラ抗体およびイヌ化抗ＮＧＦ抗体のＴＦ－１細胞の増殖を遮断する能力を下記のように評価した：
【0167】
材料
ＴＦ１細胞株（ＣＲＬ－２００３）
●増殖培地：ＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）、１０％ ＦＢＳおよび２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、７９５４－ＧＭ）
●アッセイ培地：１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）
●ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｇ８４６１）
ＴＦ１細胞株（ＣＲＬ－２００３）
●増殖培地：ＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）、１０％ ＦＢＳおよび２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、７９５４－ＧＭ）
●アッセイ培地：１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）
●ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｇ８４６１）
【0168】
方法
ＴＦ－１細胞培養：
１．細胞培養インキュベーター内のＴ７５フラスコ内で、５％ ＣＯ２かつ相対湿度８０％超の３７℃で細胞をインキュベートする。増殖培地に４～８×１０４細胞／ｍＬとして播種した場合、細胞を３～４日毎に継代する。
２．細胞増殖アッセイを行う１日前に細胞を継代する。
ＴＦ－１細胞培養：
１．細胞培養インキュベーター内のＴ７５フラスコ内で、５％ ＣＯ２かつ相対湿度８０％超の３７℃で細胞をインキュベートする。増殖培地に４～８×１０４細胞／ｍＬとして播種した場合、細胞を３～４日毎に継代する。
２．細胞増殖アッセイを行う１日前に細胞を継代する。
【0169】
イヌベータ－ＮＧＦアッセイによって媒介されるＴＦ－１細胞増殖：
１．アッセイ培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。
２．アッセイ培地中で９００ｎＭの組換えイヌベータ－ＮＧＦ（ｃＮＧＦ）を調製する。２５μＬのｃＮＧＦを第１のウェルに加える。二度の繰り返しで、プレート全体で３倍希釈し、最後の２５μＬ体積を廃棄する。
３．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。
４．５０μＬのＴＦ－１細胞をアッセイプレートの各ウェルに添加する。
５．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８時間（±８時間）、５％ ＣＯ２かつ相対湿度８０％超の３７℃でインキュベートする。
６．１００μＬ／ウェルのＣＥＬＬＩＴＥＲ－ＧＬＯ ＯＮＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮ ＡＳＳＡＹをプレートに添加する。内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、室温で１５分間（±５分間）インキュベートする。
７．プレートリーダーによって発光強度を測定する。
１．アッセイ培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。
２．アッセイ培地中で９００ｎＭの組換えイヌベータ－ＮＧＦ（ｃＮＧＦ）を調製する。２５μＬのｃＮＧＦを第１のウェルに加える。二度の繰り返しで、プレート全体で３倍希釈し、最後の２５μＬ体積を廃棄する。
３．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。
４．５０μＬのＴＦ－１細胞をアッセイプレートの各ウェルに添加する。
５．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８時間（±８時間）、５％ ＣＯ２かつ相対湿度８０％超の３７℃でインキュベートする。
６．１００μＬ／ウェルのＣＥＬＬＩＴＥＲ－ＧＬＯ ＯＮＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮ ＡＳＳＡＹをプレートに添加する。内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、室温で１５分間（±５分間）インキュベートする。
７．プレートリーダーによって発光強度を測定する。
【0170】
抗ｃＮＧＦ抗体によるｃＮＧＦ媒介ＴＦ－１細胞増殖の阻害：
１．アッセイ培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。
２．アッセイ培地中で１８００ｎＭ抗体を調製する。２５μＬの抗体を最初のウェルに加える。二度の繰り返しでプレート全体で３倍希釈し、最後の２５μＬ体積を廃棄する。ｍＡｂアイソ対照、アッセイ培地および細胞のみを含むウェルが含まれる
３．アッセイ培地中で６０ｎＭのｃＮＧＦを調製する。等体積のｃＮＧＦを希釈抗体と混合する。
４．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。
５．５０μＬのＴＦ－１細胞を新たな９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。５０μＬの混合ｃＮＧＦ／抗体を細胞プレートの各ウェルに移す。
６．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８時間（±８時間）、５％ ＣＯ２かつ相対８０％超の３７℃でインキュベートする。
７．１００μＬ／ウェルのＣＥＬＬＩＴＥＲ－ＧＬＯ ＯＮＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮ ＡＳＳＡＹをプレートに添加する。内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、室温で１５分間（±５分間）インキュベートする。
８．プレートリーダーによって発光強度を測定する。
１．アッセイ培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。
２．アッセイ培地中で１８００ｎＭ抗体を調製する。２５μＬの抗体を最初のウェルに加える。二度の繰り返しでプレート全体で３倍希釈し、最後の２５μＬ体積を廃棄する。ｍＡｂアイソ対照、アッセイ培地および細胞のみを含むウェルが含まれる
３．アッセイ培地中で６０ｎＭのｃＮＧＦを調製する。等体積のｃＮＧＦを希釈抗体と混合する。
４．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。
５．５０μＬのＴＦ－１細胞を新たな９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。５０μＬの混合ｃＮＧＦ／抗体を細胞プレートの各ウェルに移す。
６．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８時間（±８時間）、５％ ＣＯ２かつ相対８０％超の３７℃でインキュベートする。
７．１００μＬ／ウェルのＣＥＬＬＩＴＥＲ－ＧＬＯ ＯＮＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮ ＡＳＳＡＹをプレートに添加する。内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、室温で１５分間（±５分間）インキュベートする。
８．プレートリーダーによって発光強度を測定する。
【0171】
結果
図５は、イヌＮＧＦによるＴＦ－１細胞増殖の刺激を示す。アッセイを発展させて、下流のシグナル伝達を遮断し、ＴＦ－１細胞におけるＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦの結合によって誘導される細胞増殖を阻害するイヌ化抗イヌＮＧＦ抗体の能力を測定するために、ＴＦ－１細胞の増殖を刺激するイヌＮＧＦの能力をバイオアッセイによって決定した。示されるように、イヌＮＧＦは、２８ｎＭのＥＣ５０で、用量依存的にＴＦ－１細胞によって発現される内因性ＴｒｋＡ受容体に結合し、ＴＦ－１細胞増殖を刺激する。この結果は、ＴＦ－１細胞に基づくアッセイを使用して、抗イヌＮＧＦ抗体の遮断活性を試験することができることを示す。
図５は、イヌＮＧＦによるＴＦ－１細胞増殖の刺激を示す。アッセイを発展させて、下流のシグナル伝達を遮断し、ＴＦ－１細胞におけるＴｒｋＡ受容体へのイヌＮＧＦの結合によって誘導される細胞増殖を阻害するイヌ化抗イヌＮＧＦ抗体の能力を測定するために、ＴＦ－１細胞の増殖を刺激するイヌＮＧＦの能力をバイオアッセイによって決定した。示されるように、イヌＮＧＦは、２８ｎＭのＥＣ５０で、用量依存的にＴＦ－１細胞によって発現される内因性ＴｒｋＡ受容体に結合し、ＴＦ－１細胞増殖を刺激する。この結果は、ＴＦ－１細胞に基づくアッセイを使用して、抗イヌＮＧＦ抗体の遮断活性を試験することができることを示す。
【0172】
図６は、イヌ化抗ＮＧＦ抗体によるＴＦ－１細胞増殖の阻害を示す。ヒト－イヌキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍ）、図６で同定されたフラヌマブ由来のＣＤＲＳを含有するイヌ化バリアント、およびアイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）のＴＦ－１細胞増殖を遮断する能力を、ＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイで決定した。示されるように、キメラ、およびフラヌマブ由来のＣＤＲを含有するイヌ化バリアントは、特異的かつ用量依存的にＴＦ－１細胞増殖を０．２６～０．４ｎＭのＩＣ５０の範囲で阻害した。これらの結果は、イヌ化抗体がイヌにおける疼痛の治療のための開発に適していることを実証している。
【0173】
［実施例８］
ネコ化ヒトＮＧＦ抗体、およびそれらのＴＦ－１細胞におけるネコＮＧＦ生物活性の阻害
ネコ化ヒトＮＧＦ抗体
材料および方法
ネコＩｇＧ重鎖定常領域：
ネコＩｇＧサブクラスの定常領域およびそれらのヒンジ領域は、以前に説明されている［Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｌ．，１５８：２１４－２２３（２０１４）］。ネコ重鎖定常領域のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手可能である［ＩｇＧ１ａ アクセッション番号ＢＡＡ３２２２９．１、ＩｇＧ１ｂ アクセッション番号ＢＡＡ３２２３０．１およびＩｇＧ２ アクセッション番号ＡＨＨ３４１６５．１］。ＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ１ｂは対立遺伝子バリアントであるとみられ、両方ともヒトＣ１ｑに強く結合し、補体を活性化できる可能性があることを示唆している。対照的に、ネコＩｇＧ２は、特にヒンジ領域において分岐配列を有し、Ｃ１ｑへの結合は無視できる。エフェクター機能を欠くＩｇＧ１ａまたはＩｇＧ１ｂ重鎖定常領域を提供するために、以下に示すように、以下の配列番号５４および配列番号５５の非置換アミノ酸配列において、１５１位のアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸をアラニンで置換し、１８３位のアスパラギン（Ｎ）アミノ酸をアラニン（Ａ）で置換する。ネコＩｇＧサブクラスのアラインメントは以下の通りである。
ネコ化ヒトＮＧＦ抗体、およびそれらのＴＦ－１細胞におけるネコＮＧＦ生物活性の阻害
ネコ化ヒトＮＧＦ抗体
材料および方法
ネコＩｇＧ重鎖定常領域：
ネコＩｇＧサブクラスの定常領域およびそれらのヒンジ領域は、以前に説明されている［Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｌ．，１５８：２１４－２２３（２０１４）］。ネコ重鎖定常領域のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手可能である［ＩｇＧ１ａ アクセッション番号ＢＡＡ３２２２９．１、ＩｇＧ１ｂ アクセッション番号ＢＡＡ３２２３０．１およびＩｇＧ２ アクセッション番号ＡＨＨ３４１６５．１］。ＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ１ｂは対立遺伝子バリアントであるとみられ、両方ともヒトＣ１ｑに強く結合し、補体を活性化できる可能性があることを示唆している。対照的に、ネコＩｇＧ２は、特にヒンジ領域において分岐配列を有し、Ｃ１ｑへの結合は無視できる。エフェクター機能を欠くＩｇＧ１ａまたはＩｇＧ１ｂ重鎖定常領域を提供するために、以下に示すように、以下の配列番号５４および配列番号５５の非置換アミノ酸配列において、１５１位のアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸をアラニンで置換し、１８３位のアスパラギン（Ｎ）アミノ酸をアラニン（Ａ）で置換する。ネコＩｇＧサブクラスのアラインメントは以下の通りである。
【0174】
【0175】
【表8】
【0176】
ヒト－ネコキメラおよびネコ化抗体を作製するための重鎖および軽鎖のリスト
ｈＦｕｌＶｈ－ｆＩｇＧ１ａｍ４ ［配列番号６３］
ｈＦｕｌＶｈ－ｆＩｇＧ１ａｍ４ ［配列番号６３］
【0177】
ｆＦｕｌＶＨ１－ｆＩｇＧ１ａｍ４ ［配列番号６４］
【0178】
ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４ ［配列番号６５］
【0179】
ｆＦｕｌＶＨ３－ｆＩｇＧ１ａｍ４ ［配列番号６６］
【0180】
ｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４ ［配列番号６７］
【0181】
ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ ［配列番号６８］
【0182】
ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋ ［配列番号６９］
【0183】
ｈＦｕｌＶｌ－ｆＣｋ ［配列番号７０］
【0184】
ＴＦ－１細胞におけるネコＮＧＦ生物活性の阻害：ネコ化抗体の遮断活性を試験するためのＴＦ－１細胞に基づくアッセイ
材料
・ＴＦ１細胞株（ＣＲＬ－２００３）
・増殖培地：ＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）、１０％ ＦＢＳおよび２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、７９５４－ＧＭ）
・アッセイ培地：１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｇ８４６１）
材料
・ＴＦ１細胞株（ＣＲＬ－２００３）
・増殖培地：ＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）、１０％ ＦＢＳおよび２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、７９５４－ＧＭ）
・アッセイ培地：１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１１８７５－０８５）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｇ８４６１）
【0185】
方法
ＴＦ－１は、様々な種由良のＮＧＦに応答してヒトＴｒｋＡ受容体を発現し増殖する、ヒト赤白血病細胞株である。ネコＮＧＦのＴＦ－１細胞の増殖に対する効果、ならびにキメラ抗体およびネコ化抗ＮＧＦ抗体のＴＦ－１細胞の増殖を遮断する能力を下記のように評価した：
ネコベータ－ＮＧＦアッセイによって媒介されるＴＦ－１細胞増殖：
１．細胞培養インキュベーター内のＴ７５フラスコ内で、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃で細胞をインキュベートする。増殖培地に４～８×１０４細胞／ｍＬとして細胞を播種した場合、細胞を３～４日毎に継代する。
２．細胞増殖アッセイを行う１日前に細胞を継代する。
３．二度の繰り返しで、ネコＮＧＦ（ｆＮＧＦ）を、７５μＬの２００ｎＭ ｆＮＧＦを９６ウェルアッセイプレートの最初のウェルに添加し、２５μＬを各列または行の５０μＬのアッセイ培地を含む隣のウェルから最後のウェルまで移し、最後のウェルから最後の２５μＬを廃棄することによって３倍希釈する。
４．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。４．５０μＬのＴＦ－１細胞を上記アッセイプレートの各ウェルに移す。
５．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８～７２時間、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃でインキュベートする。
６．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）－Ｇｌｏ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙをウェルあたり３０μＬでプレートに添加し、ピペットで上下に数回穏やかに混合する。室温で１０～１５分間インキュベートする。
７．プレートリーダーで発光強度を測定する。
ＴＦ－１は、様々な種由良のＮＧＦに応答してヒトＴｒｋＡ受容体を発現し増殖する、ヒト赤白血病細胞株である。ネコＮＧＦのＴＦ－１細胞の増殖に対する効果、ならびにキメラ抗体およびネコ化抗ＮＧＦ抗体のＴＦ－１細胞の増殖を遮断する能力を下記のように評価した：
ネコベータ－ＮＧＦアッセイによって媒介されるＴＦ－１細胞増殖：
１．細胞培養インキュベーター内のＴ７５フラスコ内で、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃で細胞をインキュベートする。増殖培地に４～８×１０４細胞／ｍＬとして細胞を播種した場合、細胞を３～４日毎に継代する。
２．細胞増殖アッセイを行う１日前に細胞を継代する。
３．二度の繰り返しで、ネコＮＧＦ（ｆＮＧＦ）を、７５μＬの２００ｎＭ ｆＮＧＦを９６ウェルアッセイプレートの最初のウェルに添加し、２５μＬを各列または行の５０μＬのアッセイ培地を含む隣のウェルから最後のウェルまで移し、最後のウェルから最後の２５μＬを廃棄することによって３倍希釈する。
４．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。４．５０μＬのＴＦ－１細胞を上記アッセイプレートの各ウェルに移す。
５．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８～７２時間、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃でインキュベートする。
６．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）－Ｇｌｏ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙをウェルあたり３０μＬでプレートに添加し、ピペットで上下に数回穏やかに混合する。室温で１０～１５分間インキュベートする。
７．プレートリーダーで発光強度を測定する。
【0186】
抗ｆＮＧＦ抗体によるｆＮＧＦ媒介ＴＦ－１細胞増殖の阻害：
１．細胞培養インキュベーター内のＴ７５フラスコ内で、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃で細胞をインキュベートする。増殖培地に４～８×１０４細胞／ｍＬとして細胞を播種した場合、細胞を３～４日毎に継代する。
２．細胞増殖アッセイを行う１日前に細胞を継代する。
３．二度の繰り返しで、７５μＬの２４０ｎＭ抗体を９６ウェル希釈プレートの最初のウェルに添加し、次いで２５μＬを各列または行の５０μＬのアッセイ培地を含む隣のウェルから最後のウェルまで移し、最後のウェルから最後の２５μＬを廃棄することによって、抗体を３倍希釈する。ｍＡｂアイソ対照については、アッセイ培地および細胞のみを含むウェルが含まれる。
４．１０μＬの１２ｎＭ ＦＮＧＦを各ウェルに添加し、２分間穏やかに振盪することによって混合する。
５．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。
６．５０μＬのＴＦ－１細胞をアッセイ９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで、５０μＬの混合ｆＦＮＧＦ／抗体を工程８の希釈プレートからプレートの各ウェルに移す。
７．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８～７２時間、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃でインキュベートする。
８．３０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）－Ｇｌｏ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙをプレートに添加する。内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、室温で１０～１５分間インキュベートする。
９．プレートリーダーで発光強度を測定する。
１．細胞培養インキュベーター内のＴ７５フラスコ内で、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃で細胞をインキュベートする。増殖培地に４～８×１０４細胞／ｍＬとして細胞を播種した場合、細胞を３～４日毎に継代する。
２．細胞増殖アッセイを行う１日前に細胞を継代する。
３．二度の繰り返しで、７５μＬの２４０ｎＭ抗体を９６ウェル希釈プレートの最初のウェルに添加し、次いで２５μＬを各列または行の５０μＬのアッセイ培地を含む隣のウェルから最後のウェルまで移し、最後のウェルから最後の２５μＬを廃棄することによって、抗体を３倍希釈する。ｍＡｂアイソ対照については、アッセイ培地および細胞のみを含むウェルが含まれる。
４．１０μＬの１２ｎＭ ＦＮＧＦを各ウェルに添加し、２分間穏やかに振盪することによって混合する。
５．ＴＦ－１細胞を採取し、アッセイ培地で３回洗浄する。細胞を、０．５～１×１０６細胞／ｍＬの濃度までアッセイ培地に再懸濁する。
６．５０μＬのＴＦ－１細胞をアッセイ９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで、５０μＬの混合ｆＦＮＧＦ／抗体を工程８の希釈プレートからプレートの各ウェルに移す。
７．プレートを細胞培養インキュベーター内で４８～７２時間、５％ ＣＯ２かつ８０％超ＲＨの３７℃でインキュベートする。
８．３０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）－Ｇｌｏ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙをプレートに添加する。内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、室温で１０～１５分間インキュベートする。
９．プレートリーダーで発光強度を測定する。
【0187】
結果
８つのネコ化バリアントを設計し、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた（以下の表７を参照されたい）。８つのうち４つ（ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ、およびｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋを含む）の発現に成功した。他の４つの発現不能は、バリアントが機能的抗体を形成することができないことを意味し得る。
８つのネコ化バリアントを設計し、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた（以下の表７を参照されたい）。８つのうち４つ（ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ、およびｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋを含む）の発現に成功した。他の４つの発現不能は、バリアントが機能的抗体を形成することができないことを意味し得る。
【表9】
【0188】
図７は、ＥＬＩＳＡによって決定された、ヒト－ネコキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍ）、および列挙されたフラヌマブのネコ化バリアントの結合を示す。図７に示すように、キメラフラヌマブは１８～１９ｐＭのＥＣ５０でネコＮＧＦに結合するが、フラヌマブのネコ化バリアントは５０～７０ｐＭのＥＣ５０範囲でネコＮＧＦに結合する。これらの結果は、ネコ化抗体がネコＮＧＦに対して強い結合親和性を有し、それらをネコにおける疼痛の治療用薬物としての開発に好適なものにすることを示している。
【0189】
ネコＮＧＦのＣ末端部分を発現させ、ＣＨＯ細胞から精製した。アッセイを発展させて、下流のシグナル伝達を遮断し、ＴＦ－１細胞におけるＴｒｋＡ受容体へのネコＮＧＦの結合によって誘導される細胞増殖を阻害するネコ化抗ネコＮＧＦ抗体の能力を測定するために、ＴＦ－１細胞の増殖を刺激するネコＮＧＦの能力をバイオアッセイによって決定した。図８に示すように、ネコＮＧＦは、強い親和性（ＥＣ５０ ０．１４ｎＭ）で用量依存的に（内因性ＴｒｋＡ受容体への結合を介して）ＴＦ－１細胞に結合し、ＴＦ－１細胞増殖を刺激する。この結果は、ＴＦ－１細胞に基づくアッセイを使用して、抗ネコＮＧＦ抗体の遮断活性を試験することができることを実証する。
【0190】
図９は、ヒト－ネコキメラフラヌマブ（Ｆｕｌ Ｃｈｉｍ）、フラヌマブの列挙されたネコ化バリアントおよびアイソタイプ対照ｍＡｂ（ｍＡｂ ｃｔｒｌ）のＴＦ－１細胞増殖を阻止する能力を示す。ＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイで判定を行った。図９に示されるように、キメラ、およびフラヌマブのネコ化バリアント［ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ１－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ２－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋ、ｆＦｕｌＶＨ４－ｆＩｇＧ１ａｍ４／ｆＦｕｌＶＬ２－ｆＣｋ］は、特異的かつ用量依存的に、０．１ｎＭ～０．２ｎＭのＩＣ５０の範囲内でＴＦ－１細胞増殖を阻害した。これらの結果は、ネコ化抗体がネコにおける疼痛の治療のための薬物としての開発に適していることを示している。
【0191】
（配列表）
ST.25 SEQUENCE LISTING FROM AN EARLIER FILING
SEQUENCE LISTING
<110> Intervet Inc.
Intervet International BV
Morsey, Mohamad
Zhang, Yuanzheng
<120> Caninized and Felinized Antibodies to Human NGF
<130> 25370 US-PSP-2
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Leu Ser Ile His
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ile Gly Val Val Thr Asn Phe Asp Asn
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Ala Phe Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 223
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 13
Glu Pro His Pro Glu Ser His Val Pro Ala Gly His Ala Ile Pro His
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Thr Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val Ala Ala
65 70 75 80
Asp Ala Gln Asp Leu Asp Leu Glu Ala Gly Ser Thr Ala Ser Val Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Val Phe His Arg
100 105 110
Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu
130 135 140
Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
145 150 155 160
Cys Arg Asp Pro Thr Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser
165 170 175
Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
180 185 190
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
195 200 205
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Arg Ala
210 215 220
<210> 14
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified canine
<400> 14
Glu Pro His Pro Glu Ser His Val Pro Ala Gly His Ala Ile Pro His
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Thr Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val Ala Ala
65 70 75 80
Asp Ala Gln Asp Leu Asp Leu Glu Ala Gly Ser Thr Ala Ser Val Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Val Phe His Arg
100 105 110
Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu
130 135 140
Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
145 150 155 160
Cys Arg Asp Pro Thr Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser
165 170 175
Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
180 185 190
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
195 200 205
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Arg Ala His
210 215 220
His His His His His Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
225 230 235 240
Glu Trp His Glu
<210> 15
<211> 796
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 15
Met Leu Arg Gly Gly Arg Leu Gly Gln Arg Gly Gly His Gly Arg Ala
1 5 10 15
Ala Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ala Trp Leu Val Leu Ala Ser Ala Gly
20 25 30
Ala Ala Pro Cys Pro Asp Val Cys Cys Pro His Gly Pro Ser Gly Leu
35 40 45
Arg Cys Thr Arg Ala Gly Ala Leu Gln Ser Leu His Arg Leu Pro Gly
50 55 60
Val Glu Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Ile Asp Asn Gln Glu His Leu Gln
65 70 75 80
His Leu Asp Ala Val His Leu Lys Gly Leu Gly Met Leu Arg Asp Leu
85 90 95
Thr Ile Val Lys Ser Gly Leu Arg Ser Val Ala Pro Asp Ala Phe His
100 105 110
Phe Thr Pro Arg Leu Arg Arg Leu Asn Leu Ser Phe Asn Ala Leu Glu
115 120 125
Ser Leu Ser Trp Lys Thr Val Gln Gly Leu Pro Leu Gln Glu Leu Val
130 135 140
Leu Ser Gly Asn Pro Leu His Cys Ser Cys Ala Leu His Trp Leu Leu
145 150 155 160
Arg Trp Glu Glu Glu Gly Leu Gly Gly Val Arg Gly Gln Arg Leu Gln
165 170 175
Cys Pro Gly Gln Gly Pro Leu Ala Leu Leu Ser Asn Ala Ser Cys Gly
180 185 190
Val Pro Val Leu Lys Val Gln Met Pro Asn Ala Ser Val Glu Val Gly
195 200 205
Asp Asp Val Leu Leu Gln Cys Gln Val Glu Gly Gln Gly Leu Glu Arg
210 215 220
Ala Gly Trp Ile Leu Pro Glu Val Glu Glu Leu Ala Thr Val Thr Gln
225 230 235 240
Ser Gly Asp Leu Pro Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Ser
245 250 255
Asp Leu Asn Arg Lys Asn Val Thr Cys Trp Ala Glu Asn Asp Val Gly
260 265 270
Arg Ala Glu Val Ser Val Gln Val Asn Val Ser Phe Pro Ala Ser Val
275 280 285
Gln Leu His Glu Ala Val Glu Leu His His Trp Cys Ile Pro Phe Ser
290 295 300
Val Asp Gly Gln Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Leu Phe Asn Gly Ser
305 310 315 320
Val Leu Asn Glu Thr Ser Phe Ile Phe Thr Glu Phe Leu Glu Pro Val
325 330 335
Ala Asn Glu Thr Val Arg His Gly Cys Leu Arg Leu Asn Gln Pro Thr
340 345 350
His Val Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Gly
355 360 365
Arg Ala Ala Ala Phe Val Met Ala Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe Glu
370 375 380
Phe Asn Pro Glu Asp Pro Ile Pro Val Ser Phe Ser Pro Val Asp Thr
385 390 395 400
Asn Ser Thr Ser Gly Asp Pro Val Glu Lys Lys Asp Glu Thr Pro Phe
405 410 415
Gly Val Ser Val Ala Val Gly Leu Ala Val Phe Ala Cys Leu Phe Leu
420 425 430
Ser Thr Leu Phe Leu Ala Leu Asn Lys Cys Gly Arg Arg Asn Lys Phe
435 440 445
Gly Gly Asn Arg Ala Val Val Leu Ala Pro Glu Asp Gly Leu Ala Met
450 455 460
Ser Leu His Phe Met Thr Leu Gly Gly Ser Ser Leu Ser Pro Thr Glu
465 470 475 480
Gly Lys Gly Ser Gly Leu Gln Gly His Ile Ile Glu Asn Pro Gln Tyr
485 490 495
Phe Ser Asp Ala Cys Val His His Ile Lys Arg Gln Asp Ile Val Leu
500 505 510
Lys Trp Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu
515 520 525
Cys His Asn Leu Leu Pro Glu Gln Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys
530 535 540
Ala Leu Lys Glu Val Ser Glu Ser Ala Arg Gln Asp Phe Gln Arg Glu
545 550 555 560
Ala Gln Leu Leu Thr Met Leu Gln His Gln His Ile Val Arg Phe Phe
565 570 575
Gly Val Cys Thr Glu Gly Arg Pro Leu Leu Met Val Phe Glu Tyr Met
580 585 590
Arg His Gly Asp Leu Asn Arg Phe Leu Arg Ser His Gly Pro Asp Ala
595 600 605
Lys Leu Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Pro Gly Pro Leu Gly Leu
610 615 620
Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Ser Gln Val Ala Ala Gly Met Val Tyr
625 630 635 640
Leu Ala Gly Leu His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys
645 650 655
Leu Val Gly Gln Gly Leu Val Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser
660 665 670
Arg Asp Ile Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly Arg Thr Met
675 680 685
Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Arg Lys Phe
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<223> Human canine fusion protein
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<213> Artificial Sequence
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<223> Human canine fusion protein
<400> 25
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Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu
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<213> Artificial Sequence
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<223> Caninized human
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<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Caninized human
<400> 28
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<213> Artificial Sequence
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<223> Caninized human
<400> 29
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<220>
<223> Caninized human
<400> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 31
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Glu Leu
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Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met
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Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
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<223> Caninized human
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<223> Caninized human
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<212> PRT
<213> Canis familiaris
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<213> Canis familiaris
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified canine
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<213> Canis familiaris
<400> 49
Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile
1 5 10 15
Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu
20 25 30
Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys
35 40 45
Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly
50 55 60
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu
65 70 75 80
Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser
85 90 95
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro
100 105 110
Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp
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Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
130 135 140
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180 185 190
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<210> 50
<211> 215
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 50
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu
20 25 30
Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser
85 90 95
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100 105 110
Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr
115 120 125
Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp
130 135 140
Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg
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Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
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195 200 205
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified canine
<400> 51
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1 5 10 15
Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Leu
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50 55 60
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<213> Canis familiaris
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195 200 205
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215
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<211> 216
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<213> Canis familiaris
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile
1 5 10 15
Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu
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50 55 60
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu
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Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser
85 90 95
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro
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Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile
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<213> Felis catus
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65 70 75 80
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Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys
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115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
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<211> 335
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 55
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
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Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
115 120 125
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130 135 140
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
145 150 155 160
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
165 170 175
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<211> 335
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 56
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 57
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 58
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1 5 10 15
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115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 59
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Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 60
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Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 61
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<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 62
Ala Ile Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Gln Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln His Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human-Feline fusion protein
<400> 63
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Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val
260 265 270
Val Ala Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr Trp Phe Val
275 280 285
Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln
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Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser
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<210> 64
<211> 458
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 64
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
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Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
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65 70 75 80
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Ala Lys Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala
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130 135 140
Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr Phe Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Arg Lys Thr
210 215 220
Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys Cys Pro Pro
225 230 235 240
Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val
260 265 270
Val Ala Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr Trp Phe Val
275 280 285
Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser
325 330 335
Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu Glu Leu Ser
355 360 365
Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe His Pro Pro
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe
405 410 415
Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln Arg Gly Asn
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<213> Artificial Sequence
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<223> Felinized human
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<213> Artificial Sequence
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<223> Felinized human
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<213> Artificial Sequence
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<223> Felinized human
<400> 68
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felinized human
<400> 69
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<213> Artificial Sequence
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<223> Human feline fusion protein
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SEQUENCE LISTING
<110> Intervet Inc.
Intervet International BV
Morsey, Mohamad
Zhang, Yuanzheng
<120> Caninized and Felinized Antibodies to Human NGF
<130> 25370 US-PSP-2
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified canine
<400> 14
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Glu Trp His Glu
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<213> Canis familiaris
<400> 15
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245 250 255
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Arg Ala Glu Val Ser Val Gln Val Asn Val Ser Phe Pro Ala Ser Val
275 280 285
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435 440 445
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Ala Gln Ala Pro Pro Val Tyr Leu Asp Val Leu Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> canine-human fusion protein
<400> 16
Glu Pro His Pro Glu Ser His Val Pro Ala Gly His Ala Ile Pro His
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Ala Arg Ser Ala Pro Ala Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Thr Gly Gln
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Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
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Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val Ala Ala
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Asp Ala Gln Asp Leu Asp Leu Glu Ala Gly Ser Thr Ala Ser Val Asn
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human canine fusion protein
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human canine fusion protein
<400> 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> Human canine fusion protein
<400> 26
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<223> Caninized human
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Caninized human
<400> 29
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 30
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<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 32
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Met
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Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 33
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asp
20 25 30
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Tyr Ala Ala Phe Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 34
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> caninized human
<400> 35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 36
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 37
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<223> Caninized human
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 42
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<213> Artificial Sequence
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<223> Caninized human
<400> 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Caninized human
<400> 44
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<211> 17
<212> PRT
<213> Canis familiaris
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<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 46
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<213> Canis familiaris
<400> 47
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20
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified canine
<400> 48
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Ser
<210> 49
<211> 216
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 49
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Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp
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Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
130 135 140
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<220>
<223> Felinized human
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】