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▶ バイオヴェンチャーズ リミテッド ライアビリティ カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-15
(54)【発明の名称】タンパク質凝集を減少させる小分子薬
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20250107BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250107BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20250107BHJP
A61K 31/40 20060101ALI20250107BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P43/00 105
A61P25/28
A61K31/40
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535421
(86)(22)【出願日】2022-12-13
(85)【翻訳文提出日】2024-08-13
(86)【国際出願番号】 US2022081454
(87)【国際公開番号】W WO2023114772
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/288,998
(32)【優先日】2021-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＮＯＮＩＤＥＴ
(71)【出願人】
【識別番号】518365086
【氏名又は名称】バイオヴェンチャーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100162422
【弁理士】
【氏名又は名称】志村 将
(72)【発明者】
【氏名】バラスブラマニアム ミーナクシスンダラム
(72)【発明者】
【氏名】アヤデヴァラ スリニヴァス
(72)【発明者】
【氏名】シュムクラー ライス ロバート ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】グリフィン スー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA161
4C084ZB211
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZB21
(57)【要約】
タンパク質凝集を減少させる小分子薬、及びそれらの使用方法が、本明細書に開示される。本発明の一態様においては、タンパク質凝集体中の凝集タンパク質の存在量を減少させる方法であって、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に安定に結合する化合物の有効量を対象に投与することを含み、凝集タンパク質が、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＰＡＲＴ、ＰＲＫＤＣ、又はそれらの任意の組合せを含む、方法が提供される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質凝集体中の凝集タンパク質の存在量を減少させる方法であって、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に安定に結合する有効量の化合物を対象に投与することを含み、前記凝集タンパク質が、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＰＡＲＴ、ＰＲＫＤＣ、又はそれらの組合せを含む、方法。
【請求項2】
前記対象が神経変性疾患に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記化合物がＭＳＲ１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
ＧＦＡＰがリン酸化ＧＦＡＰである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記化合物が、α－チューブリン、β－チューブリン、又はそれらのオリゴマーに対し無視できるほどの親和性しか有しない、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記化合物の、ＧＦＡＰに対するΔＧbindingが、－４０ｋｃａｌ／モル 未満である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記凝集タンパク質が、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＰＡＲＴ、及びＰＲＫＤＣを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
神経変性疾患に罹患している対象の治療のための方法であって、ＧＦＡＰに安定に結合する有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項10】
前記化合物がＭＳＲ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記神経変性疾患がＡＤである、請求項９又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＧＦＡＰがリン酸化ＧＦＡＰである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記化合物が、α－チューブリン、β－チューブリン、又はそれらのオリゴマーに対し無視できるほどの親和性しか有しない、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記化合物のΔＧbindingが、－５０ｋｃａｌ／モル 未満である、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
タンパク質凝集体中の凝集タンパク質の存在量を増加させる方法であって、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に安定に結合する有効量の化合物を対象に投与することを含み、前記凝集タンパク質が、ＣＢＸ８、ＴＳＰＹＬ５、ＣＤＫ２、ＫＲＴ３３Ｂ、又はそれらの組合せを含む、方法。
【請求項16】
前記対象が神経変性疾患に罹患している、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項18】
前記化合物がＭＳＲ１である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＧＦＡＰがリン酸化ＧＦＡＰである、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記化合物が、α－チューブリン、β－チューブリン、又はそれらのオリゴマーに対し無視できるほどの親和性しか有しない、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記化合物のΔＧbindingが、－４０ｋｃａｌ／モル 未満である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記凝集タンパク質が、ＣＢＸ８、ＴＳＰＹＬ５、ＣＤＫ２、及びＫＲＴ３３Ｂを含む、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２８８，９９８号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。
本願は、２０２１年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２８８，９９８号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所から授与されたＰ０１ＡＧ０１２４１１１７Ａ１及び退役軍人省から授与されたＭｅｒｉｔ ２ Ｉ０１ ＢＸ００１６５５の政府の支援のもとで行われた。政府は発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所から授与されたＰ０１ＡＧ０１２４１１１７Ａ１及び退役軍人省から授与されたＭｅｒｉｔ ２ Ｉ０１ ＢＸ００１６５５の政府の支援のもとで行われた。政府は発明に対して一定の権利を有する。
【0003】
電子形式の配列表の参照
電子形式の配列表（１６９８５２．００１０８．ｘｍｌ；サイズ：９，３４１バイト；作成日：２０２２年１２月１２日）の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
電子形式の配列表（１６９８５２．００１０８．ｘｍｌ；サイズ：９，３４１バイト；作成日：２０２２年１２月１２日）の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、主にアストロサイトに見出されるＩＩＩ型中間径フィラメント構造タンパク質であり、加齢に関連するいくつかの神経病理に関与するとされてきた。ＧＦＡＰは、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びアレキサンダー病などの進行性神経疾患と関連していることが示された（Ｈｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；Ｉｓｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｋａｍｐｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７；Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ ａｎｄ Ｈｏｌ， ２０１１；ｖａｎ Ｂｏｄｅｇｒａｖｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２１）。ＧＦＡＰの変異はローゼンタール線維の凝集をもたらし、これがアレキサンダー病の原因かつ徴候である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。ＧＦＡＰの発現は転写レベルと翻訳後レベルの両方で調節されており、重要な細胞骨格機能に影響を与える。ＧＦＡＰは複数の成長因子及び核内ホルモン受容体によって転写調節される（Ｌａｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。ＧＦＡＰの翻訳後修飾（ＰＴＭ）としては、複数のキナーゼによる部位特異的リン酸化（Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９；Ｃｌａｉｒｅｍｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１０；Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるアセチル化（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、及びＡＤにおける５個のアルギニン残基のシトルリン化（Ｉｓｈｉｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）などが観察されている。その結果生じるＧＦＡＰの構造的コンフォメーションの変化は、外傷性脳損傷（Ｌａｚａｒｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）又は自己免疫疾患（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）の一因となる可能性がある。ＧＦＡＰのいくつかの一塩基多型は、アレキサンダー病と強い関連性がある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。
【0005】
従って、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びアレキサンダー病などの神経疾患、並びにそれらと関連する認知症の治療のために、ＧＦＡＰを標的とする新規薬剤に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【0006】
タンパク質凝集を減少させる小分子薬、及びそれらの使用方法が、本明細書に開示される。本発明の一態様においては、タンパク質凝集体中の凝集タンパク質の存在量を減少させる方法であって、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に安定に結合する化合物の有効量を対象に投与することを含み、凝集タンパク質が、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＰＡＲＴ、ＰＲＫＤＣ、又はそれらの任意の組合せを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を患っている。
【0007】
本発明の別の一態様においては、タンパク質凝集体中の凝集タンパク質の存在量を増加させることが提供され、この方法は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に安定に結合する化合物の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、凝集タンパク質は、ＣＢＸ８、ＴＳＰＹＬ５、ＣＤＫ２、ＫＲＴ３３Ｂ、又はそれらの任意の組合せを含む。
本発明の非限定的な実施形態を、実施例により、添付の図面を参照しながら説明するが、これら図面は概略的なものであり、縮尺通りに描かれることを意図したものではない。図面に示されている同一又はほぼ同一の各構成要素は、通常、同じ数字で表されている。すべての図面ですべての構成要素の名称が表示されているわけではなく、また、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているわけでもない。これは明瞭化のためであり、当業者が本発明を理解するためにそれらの説明が不要なためである。
本発明の非限定的な実施形態を、実施例により、添付の図面を参照しながら説明するが、これら図面は概略的なものであり、縮尺通りに描かれることを意図したものではない。図面に示されている同一又はほぼ同一の各構成要素は、通常、同じ数字で表されている。すべての図面ですべての構成要素の名称が表示されているわけではなく、また、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているわけでもない。これは明瞭化のためであり、当業者が本発明を理解するためにそれらの説明が不要なためである。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】図１Ａ～１Ｃは、ＡＭＣにおけるよりも、ＡＤ凝集体においてＧＦＡＰが多く存在しており、より修飾されていることを示す。（図１Ａ）Ａβもしくはタウのイムノプルダウン（ＩＰ）によって単離されたサルコシル不溶性の凝集体における、又はＩＰなしの全凝集体における、ＧＦＡＰのスペクトル数は、ヒトＡＤでは年齢マッチ対照（ＡＭＣ）の海馬におけるよりも多い。ＡＤとＡＭＣは異分散ｔ検定において差がある：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５。
【図1B】（図１Ｂ）ＡＭＣ［ＡｐｏＥ（３，３）］（配列番号７）、ＡＤ［ＡｐｏＥ（３，３）］（配列番号８）、又はＡＤ［ＡｐｏＥ（４，４）］（配列番号９）の海馬から単離したＧＦＡＰで観察された、翻訳後修飾の相違（ＰＴＭ：Ｓｅｒ又はＴｈｒ残基のリン酸化、又はＭｅｔの酸化）を示す。ペプチドカバレッジをハイライトで示す。
【図1C】（図１Ｃ）ＡＭＣ（３，３）と比較したＡＤ（３，３）又はＡＤ（４，４）の海馬凝集体のリン酸化ＧＦＡＰを、ホスホＧＦＡＰ（Ｓｅｒ１３；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に対する抗体で検出したウェスタンブロット。＊＊＊各ＡＤ群とＡＭＣの差は、両側異分散ｔ検定においてＰ＜０．０００１である。
【図2D】（図２Ｄ）ＡＭＣ（未修飾）ＧＦＡＰと、ＡＤ（３，３）及びＡＤ（４，４）を模倣するためのリン酸化模倣置換を有するＧＦＡＰとを、５００ナノ秒ｉｎ ｓｉｌｉｃｏシミュレーションにおいて比較した際の、ＧＦＡＰ構造の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）の経時変化。
【図2E】（図２Ｅ）ＧＦＡＰ（４３２残基）全体における二乗平均平方根変動（ＲＭＳＦ）の分布。位置変動を残基ごとに示す。（図２Ｄ及び図２Ｅ）図２Ｄ及び図２Ｅの右側のキーは、ＲＭＳＤ値及びＲＭＳＦ値のカラーコードをそれぞれ示す。
【図3A】図３Ａ～３Ｅは、ＧＦＡＰ、又はその推定されるキナーゼを標的とするＲＮＡｉノックダウンが、凝集に及ぼす影響を示す。（図３Ａ）ヒト海馬凝集物で観察されたＧＦＡＰリン酸化と、その推定されるキナーゼ。
【図3B】（図３Ｂ）ＧＦＡＰ又はその候補キナーゼを標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトでリポソームを介したトランスフェクションを行った後の、チオフラビンＴ染色ヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞の蛍光像。
【図3E】（図３Ｅ）パネル３ｄと同様の凝集体のチオフラビンＴ染色における平均±ＳＥＭのヒストグラム。（図３Ｃ～３Ｅ）バーの上の数字は、両側ｔ検定による、処理群と対照群の差のＰ値である。ブラケット上の数字は、つないだグループ／バーに対して適用される。
【図4A】図４Ａ～４Ｂは、ＲＯＣＫ１タンパク質レベルが、ＡｐｏＥ４導入遺伝子を過剰発現するＴ９８Ｇ膠芽腫細胞において、ＡｐｏＥ３を過剰発現するＴ９８Ｇ細胞におけるよりも高いことを示す。（図４Ａ）ＲＯＣＫ１タンパク質に対する抗体をプローブとしたウェスタンブロット。
【図5A】図５Ａ～５Ｆは、薬剤ＭＳＲ１がＧＦＡＰと特異的に結合し、それによって凝集におけるＧＦＡＰの役割を阻害すると予測されることを説明するものである。（図５Ａ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングで得られた上位３種の薬剤の、ＭＭ－ＧＢＳＡ溶媒和ドッキングによって予測された、ＧＦＡＰ結合の安定性（結合のギブス自由エネルギー）を示すヒストグラム。ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ薬剤構造ライブラリーを、ＧＦＡＰとの結合に関してスクリーニングした。スクリーニングは徐々にストリンジェンシーを増加させながら３段階で行い、その後、チューブリンに対して親和性がある薬剤を除外するためのカウンタースクリーニングを行った。
【図5E】（図５Ｅ）ＧＦＡＰのｓｉＲＮＡノックダウンによって凝集体から完全に除去されたタンパク質のセットは、ＭＳＲ１によって排除されたセットとほぼ同じである。ベン図は、未処理のＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞由来のサルコシル不溶性凝集体で同定された２５１種のタンパク質（≧７ヒット）のプロテオミクス上の重複を示すが、これらはＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションを行ってから、又は１μＭ ＭＳＲ１による処理を行ってから、４８時間後には検出されなかった。逆に、未処理細胞の凝集体に存在しなかった４種のタンパク質が、両方の処理細胞群で同定された。
【図5F】（図５Ｆ）ＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡ処理後（ｘ軸）とＭＳＲ１処理後（ｙ軸）の凝集体タンパク質存在量のｌｏｇ２（倍率変化）の直線回帰。選択されたタンパク質には名称を表示してあり、凝集体架橋（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）によってＧＦＡＰのすぐ近傍にあることが示されたもの（ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＰＡＲＴ、ＰＲＫＤＣ、ＥＥＦ２、ＰＡＲＰ１、ＮＦＨ、及びＨ１４を含む赤いドット）を含む。破線の矩形内のドットは、いずれの処理によっても変化が２倍未満のものである。回帰はＲ＝０．７７であり、Ｆ検定による有意性はＰ＜３Ｅ－２８０であった。
【発明を実施するための形態】
【0009】
ＧＦＡＰを標的とし、タンパク質凝集を減少させる小分子薬が本明細書に開示される。本実施例は、アポリポタンパク質Ｅ［ε４，ε４］の遺伝子型ＡｐｏＥ（４，４）のＡＤ海馬において、特にＡＤ対象においては、年齢マッチ対照（ＡＭＣ）と比較して、ＧＦＡＰが顕著に過剰発現し、リン酸化が異なっていることを示す。ＡＭＣと比べ、ＡＤ脳の界面活性剤不溶性凝集体は、過剰リン酸化ＧＦＡＰを特に多く含む。ＡＤ脳で観察されるＧＦＡＰの部位特異的リン酸化の原因の可能性がある４種のキナーゼ（ＲＯＣＫ１、ＢＡＲＫ／ＧＲＫ、ＰＫＡ、及びＡＫＴ２）は、ＡＭＣと比較して、ＡＤで発現が上方制御されており、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSwヒト神経芽腫細胞又はＴ９８Ｇヒト膠芽腫細胞でこれらのキナーゼをノックダウンすると、アミロイドの蓄積が有意に減少した。アルツハイマー病様凝集のいくつかのモデル、及びハンチントン病で観察されるポリグルタミン凝集のモデルにおいて、Ｃ．エレガンスのオルソロガスなキナーゼをノックダウンすることによっても、タンパク質の凝集、及びそれに関連する行動特性が軽減した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのスクリーニングにより、ＧＦＡＰに安定かつ特異的に結合する、ＭＳＲ１と呼ばれる薬剤候補が同定された。細胞凝集体は、ＭＳＲ１曝露又はＧＦＡＰ特異的ＲＮＡｉノックダウンによって同程度減少し、枯渇する凝集タンパク質は極めてよく一致する。これらの実施例は、ＧＦＡＰが、神経障害性凝集体の増加に大きな役割を果たしていることを示す。ＧＦＡＰは、機能的標的でもあり、有用なバイオマーカーでもあり、また、ＡＤなどの神経変性疾患を予防もしくは緩和するための新規治療標的でもある。
【0010】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、主にアストロサイトに見出されるＩＩＩ型中間径フィラメント構造タンパク質であり、加齢に関連するいくつかの神経病理に関与している（Ｈｏｌ ａｎｄ Ｃａｐｅｔａｎａｋｉ， ２０１７）。ＧＦＡＰは、ＡＤ（Ｋａｍｐｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）及びアレキサンダー病（Ｈｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）の動物モデルに機能的に関連付けられてきた。ヒトＣＳＦ又は血清中のＧＦＡＰの検出は神経病理学の重要なバイオマーカーであり、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の診断に貢献している（Ｂａｒｔｌ ｅｔ ａｌ．， ２０２１；Ｉｓｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．， ２０２１）。
【0011】
ＧＦＡＰ変異はローゼンタール線維を形成する凝集を引き起こすことが多く、ローゼンタール線維はアレキサンダー病で見られるような慢性グリオーシスの原因かつ徴候である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。ＧＦＡＰのいくつかの一塩基多型は、この脱髄障害と強く関連している（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。ＧＦＡＰの発現は複数の成長因子及び核内ホルモン受容体によって転写調節される（Ｌａｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。以前に報告されたＧＦＡＰの翻訳後修飾（ＰＴＭ）としては、アレキサンダー病（Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ． ２０１９）、ＰＤ（Ｃｌａｉｒｅｍｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、及びＦＴＬＤ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）と関連する部位特異的リン酸化；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）における６個のリジン残基のアセチル化（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）；並びに、ＡＤにおける５個のアルギニン残基のシトルリン化（Ｉｓｈｉｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）などが挙げられる。ＧＦＡＰのシトルリン化は、外傷性脳損傷（Ｌａｚａｒｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）及び自己免疫疾患（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）の原因となる場合がある。
【0012】
ＧＦＡＰは、１７番染色体上の単一遺伝子によってコードされており、スプライス部位が異なる１０種のアイソフォームとして発現される（Ｂｒｏｄｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｋａｍｐｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｍｏｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。主要なアイソフォームであるＧＦＡＰ－α（４３２アミノ酸）は中枢神経系（ＣＮＳ）のグリア細胞とニューロンで高発現しており、その一方、β（ベータ）、γ（ガンマ）、ε（イプシロン）、κ（カッパ）、及びζ（ゼータ）のアイソフォームは、ＣＮＳのニューロンとグリア以外にも多くの組織及び細胞型で発現している（Ｋａｍｐｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｍｏｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。
疾患又は傷害によってニューロンのストレスが引き起こされると、それがアストロサイトの活性化を誘発し、肥大、増殖、及びＧＦＡＰ発現の増加などの反応が生ずる（ｄｅ Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；Ｆａｎ ａｎｄ Ｈｅ， ２０１６；Ｍｕｃｃｉｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｎａｗａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。傷害後の最初のグリア活性化は、脳損傷からの回復を可能にする急性期反応である（Ｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｄｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。しかし、長期的なニューロンの傷害又はストレスは、脳機能に悪影響を及ぼす慢性的な神経炎症を引き起こす（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｓｔｒｅｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ＡＤは、タウ特異的なもつれやアミロイド斑などの神経病変を伴う、又はそれらの後に続く、認知症として診断される（Ｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｈｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。ＡＤ患者の海馬では、年齢マッチ対照と比較して、ＧＦＡＰの上昇が観察された（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ）。
疾患又は傷害によってニューロンのストレスが引き起こされると、それがアストロサイトの活性化を誘発し、肥大、増殖、及びＧＦＡＰ発現の増加などの反応が生ずる（ｄｅ Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；Ｆａｎ ａｎｄ Ｈｅ， ２０１６；Ｍｕｃｃｉｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｎａｗａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。傷害後の最初のグリア活性化は、脳損傷からの回復を可能にする急性期反応である（Ｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｄｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。しかし、長期的なニューロンの傷害又はストレスは、脳機能に悪影響を及ぼす慢性的な神経炎症を引き起こす（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｓｔｒｅｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ＡＤは、タウ特異的なもつれやアミロイド斑などの神経病変を伴う、又はそれらの後に続く、認知症として診断される（Ｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｈｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。ＡＤ患者の海馬では、年齢マッチ対照と比較して、ＧＦＡＰの上昇が観察された（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ）。
【0013】
実施例は、タンパク質凝集におけるＧＦＡＰとそのＰＴＭの役割を示す。実施例は、実質的なリン酸化を欠く年齢マッチ対照（ＡＭＣ）のＧＦＡＰと比べ、ＡＤの海馬のＧＦＡＰが過剰にリン酸化されていることを示す。ＡＤ特異的リン酸化は、修飾ＧＦＡＰ部位を標的とする可能性のある上流キナーゼのＲＮＡｉノックダウンによって減少し、それぞれのノックダウンが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト神経芽腫細胞及びグリオーマ細胞によるアミロイド沈着の顕著な減少をもたらした。ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリーから約７５万個の小分子構造をスクリーニングし、部分的にアンフォールドされたＧＦＡＰに対して特異的な親和性を有する薬剤候補を同定した。これらのうちのひとつはＭＳＲ１（図６）と名付けられ、さまざまなＡＤモデル（ヒト細胞又はＣ．エレガンス）において、タンパク質の凝集及び病変を減少させるのに特に効果的であった。
【0014】
本発明の一態様は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）と安定に結合する化合物の使用を提供する。本発明の一態様は、凝集体中のタンパク質の存在量を減少させる方法を提供することである。この方法は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）と安定に結合する化合物の有効量を対象に投与することを含む。「タンパク質凝集体」という用語は、細胞内又は細胞外プロセスで形成される、タンパク質とその他の構成成分の凝集体のことを指す。このプロセスが、ミスフォールドされた、又は本質的に不規則なタンパク質を、それらのコンフォメーションを介して互いに合体させ、不溶性の凝集体を生じさせる。これら凝集体は球状である場合もあり、フィブリルとして構成される場合もある。タンパク質凝集体は、サルコシル（ラウリルサルコシン酸ナトリウム）などの中程度の強度の界面活性剤に不溶性である場合がある。「凝集タンパク質」とは、タンパク質凝集体の中に見出される、又は見出され得るタンパク質のことを指す。
「凝集タンパク質の存在量を減少させる」という用語は、タンパク質の凝集を抑制することを指す。いくつかの実施形態では、タンパク質の凝集が５０％以上抑制される。いくつかの実施形態では、タンパク質の凝集が５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれよりも多く抑制される。実施例で示されるように、ＭＳＲ１は様々なモデル系でタンパク質の凝集を６０～７５％抑制した。
「凝集タンパク質の存在量を減少させる」という用語は、タンパク質の凝集を抑制することを指す。いくつかの実施形態では、タンパク質の凝集が５０％以上抑制される。いくつかの実施形態では、タンパク質の凝集が５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれよりも多く抑制される。実施例で示されるように、ＭＳＲ１は様々なモデル系でタンパク質の凝集を６０～７５％抑制した。
【0015】
複数の異なる凝集タンパク質の存在量を減少させる場合もある。いくつかの実施形態では、５０種、１００種、１５０種、２００種、又は２５０種以上の凝集タンパク質が、タンパク質凝集体から部分的又は完全に除去される。低減され得る凝集タンパク質としては、限定されるものではないが、図５Ｆに示されるものが挙げられ、例えば、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＤＬＧ４、ＡＮＫ２、ＧＪＡ１、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ２５Ａ１２、ＰＦＫＰ、ＰＣ、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＧＣＮ１、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＹＷＨＡＧ、ＰＲＫＤＣ、ＳＰＡＲＴ、ＥＥＦ２、及びその他のものが挙げられる。いくつかの実施形態において、凝集タンパク質は、ＧＦＡＰのすぐ近傍のものを含む場合があり、それらの例として、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、ＰＬＥＣ、ＲＡＢ１０、ＭＡＰ１Ａ、ＤＣＴＮ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＰＡＲＴ、ＰＲＫＤＣ、ＥＥＦ２、ＰＡＲＰ１、ＮＦＨ、Ｈ１４、又はそれらの任意の組み合わせなどが挙げられる。「すぐ近傍の」とは、凝集物内の隣接のことを指す。それら以外タンパク質はＧＦＡＰに直接接触していない場合があるが、よりＧＦＡＰに近接した他のタンパク質を介してＧＦＡＰと「連結している」場合がある。タンパク質凝集体から部分的又は完全に除去され得る凝集タンパク質としては、ＲＰＳ４Ｘ、ＳＬＣ２５Ａ５、ＰＳＭＣ１、Ｃ１１ｏｒｆ９８、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＴＲＭＴ６、ＣＣＴ５、ＬＡＲＰ１、ＭＳＨ６、ＵＢＡ１、ＣＳＤＥ１、ＴＡＲＳ、ＥＩＦ２Ａ、ＵＴＰ２０、ＳＮＲＰＥ、ＵＱＣＲＣ２、ＣＹＦＩＰ２、ＡＬＤＯＡ、ＰＤＳ５Ａ、ＡＨＣＴＦ１、ＢＡＮＦ１、ＹＷＨＡＱ、ＥＰ４００、ＳＭＡＲＣＡ４、ＩＰＯ５、ＤＬＳＴ、ＭＲＰＬ４９、ＰＰＰ１ＣＢ、ＳＬＣ２５Ａ１３、ＧＰＩ、ＭＹＨ９、ＧＳＴＭ３、ＲＩＦ１、ＣＨＤ２、ＥＬＡＶＬ４、ＶＡＲＳ、ＳＮＲＰＤ２、ＤＰＹＳＬ３、ＮＳＤ２、ＳＥＰＴＩＮ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＨＳＰＢ１、ＧＮＡＩ２、ＡＧＯ２、ＦＬＮＢ、ＹＷＨＡＢ、ＣＨＤ８、ＩＱＧＡＰ１、ＲＢＭ８Ａ、ＰＤＳ５Ｂ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＲＰＬ３８、ＥＭＤ、ＧＮＡＩ１、ＥＸＯＳＣ７、ＮＰＥＰＰＳ、ＣＥＰ１７０、ＧＡＫ、ＰＧＫ１、ＵＳＰ１０、ＸＰＯ５、ＤＰＹＳＬ５、ＬＵＣ７Ｌ、ＦＹＮ、ＰＲＭＴ１、ＰＹＧＢ、ＮＯＣ３Ｌ、ＡＴＰ２Ａ２、ＬＲＰＰＲＣ、ＳＦ３Ｂ１、ＰＤＨＢ、ＬＹＮ、ＰＤＨＡ１、ＳＴＲＡＰ、ＭＡＲＳ、ＦＬＩＩ、ＦＳＣＮ１、ＴＵＢＢ１、ＴＵＢＢ、ＴＵＢＢ３、ＣＤＫ１８、ＩＡＲＳ、ＦＬＯＴ２、ＴＵＢＢ６、ＡＧＯ１、ＷＤＲ１、ＲＡＮＢＰ２、ＣＢＸ１、ＩＰＯ７、ＴＬＮ１、ＮＤＵＦＳ３、ＡＴＡＤ５、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＹＷＨＡＧ、ＣＲＭＰ１、ＧＬＵＤ１、ＴＵＢＢ２Ｂ、ＮＯＣ２Ｌ、ＧＴＦ３Ｃ３、ＨＳＰＡ４、ＤＹＮＬＬ２、ＣＯＸ４Ｉ１、ＳＥＰＴＩＮ６、ＡＴＰ５Ｆ１Ｂ、ＳＮＲＰＡ、ＲＡＢ３９Ａ、ＴＵＢＢ２Ａ、ＨＥＡＴＲ１、ＤＹＮＬＬ１、ＺＭＹＭ４、ＣＤＫ１２、ＲＡＢ１Ｂ、ＣＨＤ７、ＳＥＰＴＩＮ１１、ＰＲＤＸ４、ＡＲＨＧＥＦ２、ＣＬＴＣ、ＧＮＡ１３、ＨＣＦＣ１、ＹＥＳ１、ＡＰＥＨ、ＳＩＮ３Ａ、ＣＯＸ５Ａ、ＣＯＸ５Ｂ、ＬＡＲＳ、ＲＰＳ２３、ＡＧＯ３、ＷＤＲ３３、ＲＡＢ３９Ｂ、ＹＷＨＡＨ、ＤＹＮＣ１Ｈ１、ＰＰＰ１ＣＣ、ＳＥＰＴＩＮ８、ＳＰＴＢＮ１、ＰＰＰ１ＣＡ、ＳＡＲＴ３、ＴＵＢＢ４Ａ、ＣＤＫ５、ＮＡＰ１Ｌ１、ＲＡＢ６Ａ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＥＰＴＩＮ７、ＥＸＯＳＣ６、ＳＯＧＡ１、ＤＤＸ１９Ａ、ＡＴＰ１３Ａ１、ＭＹＯ１８Ａ、ＣＢＲ１、ＧＮＢ２、ＴＵＢＡＬ３、ＣＡＰ１、ＭＹＯ１Ｂ、ＣＴＮＮＤ１、ＰＵＦ６０、ＣＷＣ２２、ＭＡＲＫ３、ＰＬＰ１、ＵＳＯ１、ＴＵＢＡ４Ａ、ＤＰＹＳＬ４、ＡＢＣＦ２、ＣＨＤ４、ＡＬＤＯＣ、ＧＣＮ１、ＤＰＹＳＬ２、ＴＵＢＡ８、ＺＮＦ４６２、ＧＤＩ１、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＭＢＰ、ＤＬＡＴ、ＦＬＯＴ１、ＰＰＩＬ１、ＨＲＮＲ、ＭＡＳＴ３、ＹＬＰＭ１、ＭＡＲＫ２、ＶＤＡＣ３、ＡＣＯ２、ＫＩＦ２１Ａ、ＧＮＡＯ１、ＮＥＦＬ、ＲＡＢ１０、ＩＮＡ、ＣＡＮＤ１、ＳＬＣ２５Ａ２２、ＳＴＸＢＰ１、ＮＥＦＭ、ＧＮＢ１、ＡＴＩＣ、ＡＰ１Ｂ１、ＡＰ２Ｍ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＮＩＰＢＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＲＡＣ１、ＡＣＴＮ４、ＳＵＣＬＡ２、ＡＴＰ６ＡＰ１、ＤＮＡＪＢ２、ＡＬＤＨ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＣＡＭＫ２Ａ、ＧＯＴ２、ＤＣＴＮ１、ＡＧＡＰ３、ＭＡＣＦ１、ＦＡＲＰ１、ＤＨＸ３６、ＣＤ５９、ＣＤＣ４２ＢＰＡ、ＳＰＴＡＮ１、ＡＰ２Ｂ１、ＤＮＭ２、ＧＦＡＰ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＰＬＥＣ、ＡＣＴＮ１、ＡＴＰ２Ｂ４、ＴＨＹ１、ＭＡＰ１Ａ、ＳＰＴＢＮ２、ＣＫＭＴ１Ａ、ＴＵＦＭ、ＭＡＰ２、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＡＴＰ２Ｂ２、ＣＮＰ、ＵＳＰ５、ＡＰ２Ａ２、ＡＡＲＳ、ＡＴＰ１Ａ１、ＮＳＦ、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＬＯＮＰ１、ＡＰ２Ａ１、ＣＫＢ、ＡＴＰ２Ｂ１、ＭＹＣＢＰ２、ＷＤＲ３７、ＰＦＫＬ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ２５Ａ１２、ＰＦＫＭ、ＣＮＴＮ１、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＳＰＴＢ、ＧＬＳ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ１、ＡＴＰ１Ａ３、ＰＦＫＰ、ＤＮＭ１、ＩＡＲＳ２、ＡＴＰ１Ａ２、ＤＮＭ３、ＤＣＬＫ１、ＰＣ、ＧＪＡ１、ＤＬＧ４、ＡＮＫ２、ＣＮＴＮＡＰ１、ＢＳＮ、ＳＹＮ１、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0016】
本発明の他の一態様は、タンパク質凝集体中の凝集タンパク質の存在量を増加させる方法を提供することである。この方法は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）と安定に結合する化合物の有効量を対象に投与することを含む。「凝集タンパク質の存在量を増加させる」という用語は、タンパク質の凝集を抑制することを指す。いくつかの実施形態では、タンパク質の凝集が５０％以上増加する。いくつかの実施形態では、タンパク質の凝集が５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれよりも多く増加する。複数の異なる凝集タンパク質の存在量を増加させる場合もある。増加し得る凝集タンパク質としては、限定されるものではないが、ＣＢＸ８、ＴＳＰＹＬ５、ＣＤＫ２、ＫＲＴ３３Ｂ、又はそれらの任意組み合わせが挙げられる。
「安定に結合する」という用語は、タンパク質に対するΔＧbindingが０ｋｃａｌ／モル未満（すなわち負エネルギー）の化合物のことを指す。いくつかの実施形態では、化合物のΔＧbindingは－４０ｋｃａｌ／モル未満である。いくつかの実施形態では、化合物のΔＧbindingは、－４３ｋｃａｌ／モル未満、－４６ｋｃａｌ／モル未満、－４９ｋｃａｌ／モル未満、－５０ｋｃａｌ／モル未満、又は－５２ｋｃａｌ／モル未満である。
「ΔＧbinding」という用語は、結合のギブス自由エネルギーの変化のことを指し、これによって結合プロセスに関連するリガンドとタンパク質の間の予測親和性が推定される。結合親和性の大きさは、リガンドとタンパク質の間の相互作用の強さの尺度であり、従って、リガンドの有効性に直接関係することが多い。
「無視できるほどの親和性（negligible affinity）」という用語は、タンパク質に対するΔＧbindingが－７ｋｃａｌ／モル以上の化合物のことを指す。
ＧＦＡＰと安定に結合する化合物の例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ＭＳＲ１、ＭＳＲ２、又はＭＳＲ３。
「ＭＳＲ１」という用語は、３－クロロ－Ｎ－｛［トランス－４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキシル］メチル｝－４－ピロリジン－１－イルベンズアミドという化合物のことを指す。その分子式はＣ19Ｈ27ＣｌＮ2Ｏ2である。ＭＳＲ１の構造を図６に示す。
「ＭＳＲ２」という用語は、３－｛［４－（５－クロロ－２－ピリジニル）－１－ピペラジニル］カルボニル｝－５，６，７，８－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－キノリノンという化合物のことを指す。その分子式はＣ19Ｈ21ＣｌＮ4Ｏ2である。ＭＳＲ２の構造を図６に示す。
「ＭＳＲ３」という用語は、１－（３－クロロ－４－ピロリジン－１－イルベンゾイル）－４－ピリジン－２－イルピペラジンという化合物のことを指す。その分子式はＣ20Ｈ23ＣｌＮ4Ｏである。ＭＳＲ３の構造を図６に示す。
「安定に結合する」という用語は、タンパク質に対するΔＧbindingが０ｋｃａｌ／モル未満（すなわち負エネルギー）の化合物のことを指す。いくつかの実施形態では、化合物のΔＧbindingは－４０ｋｃａｌ／モル未満である。いくつかの実施形態では、化合物のΔＧbindingは、－４３ｋｃａｌ／モル未満、－４６ｋｃａｌ／モル未満、－４９ｋｃａｌ／モル未満、－５０ｋｃａｌ／モル未満、又は－５２ｋｃａｌ／モル未満である。
「ΔＧbinding」という用語は、結合のギブス自由エネルギーの変化のことを指し、これによって結合プロセスに関連するリガンドとタンパク質の間の予測親和性が推定される。結合親和性の大きさは、リガンドとタンパク質の間の相互作用の強さの尺度であり、従って、リガンドの有効性に直接関係することが多い。
「無視できるほどの親和性（negligible affinity）」という用語は、タンパク質に対するΔＧbindingが－７ｋｃａｌ／モル以上の化合物のことを指す。
ＧＦＡＰと安定に結合する化合物の例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ＭＳＲ１、ＭＳＲ２、又はＭＳＲ３。
「ＭＳＲ１」という用語は、３－クロロ－Ｎ－｛［トランス－４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキシル］メチル｝－４－ピロリジン－１－イルベンズアミドという化合物のことを指す。その分子式はＣ19Ｈ27ＣｌＮ2Ｏ2である。ＭＳＲ１の構造を図６に示す。
「ＭＳＲ２」という用語は、３－｛［４－（５－クロロ－２－ピリジニル）－１－ピペラジニル］カルボニル｝－５，６，７，８－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－キノリノンという化合物のことを指す。その分子式はＣ19Ｈ21ＣｌＮ4Ｏ2である。ＭＳＲ２の構造を図６に示す。
「ＭＳＲ３」という用語は、１－（３－クロロ－４－ピロリジン－１－イルベンゾイル）－４－ピリジン－２－イルピペラジンという化合物のことを指す。その分子式はＣ20Ｈ23ＣｌＮ4Ｏである。ＭＳＲ３の構造を図６に示す。
【0017】
いくつかの実施形態では、化合物が、α－チューブリン、β－チューブリン、又はそれらのオリゴマーに対し無視できるほどの親和性しか有しない。「α－チューブリン」及び「β－チューブリン」という用語は、タンパク質であるチューブリンのα及びβサブユニットのことを指す。チューブリンタンパク質は重合して長鎖又はフィラメントになり、それらが微小管を形成する。微小管は生細胞の細胞内骨格系として機能する中空繊維である。微小管には様々なコンフォメーションをとる能力があり、それによって細胞は有糸分裂を行うことができ、又は細胞内輸送を行うことができる。α－チューブリンは比較的広範に存在する微小管成分であるのに対し、β－チューブリンはニューロンの微小管に特異的である。α－及びβ－チューブリンはともに共重合して微小管になる。微小管は真核生物の細胞骨格の主要な成分である。
「オリゴマー」及び「ポリマー」という用語は、複数のサブユニット（ポリペプチド鎖）から構成されるタンパク質のことを指す。従って、オリゴマータンパク質は、タンパク質の構造の階層の中で最も高いレベルの構成と一般的に考えられている、四次構造を有している。オリゴマータンパク質は、同一のポリペプチド鎖だけをいくつかのコピー数有するものであってもよく、この場合、それらタンパク質はホモオリゴマーと呼ばれる。あるいは、２つ以上の異なる種類のポリペプチド鎖を少なくとも１コピーずつ有してもよい（ヘテロオリゴマー）。
「オリゴマー」及び「ポリマー」という用語は、複数のサブユニット（ポリペプチド鎖）から構成されるタンパク質のことを指す。従って、オリゴマータンパク質は、タンパク質の構造の階層の中で最も高いレベルの構成と一般的に考えられている、四次構造を有している。オリゴマータンパク質は、同一のポリペプチド鎖だけをいくつかのコピー数有するものであってもよく、この場合、それらタンパク質はホモオリゴマーと呼ばれる。あるいは、２つ以上の異なる種類のポリペプチド鎖を少なくとも１コピーずつ有してもよい（ヘテロオリゴマー）。
【0018】
本明細書に開示された方法において使用される、ＧＦＡＰと安定に結合する化合物は、以下を含む医薬組成物として製剤化してよい：（ａ）本明細書に記載の１つ以上のタンパク質分解剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄｅｒ）の治療有効量；及び、（ｂ）１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤。医薬組成物は、約０．１～５０００ｍｇ（好ましくは約０．５～５００ｍｇ、より好ましくは約１～１００ｍｇ）の範囲で上記化合物を含んでよい。医薬組成物の投与を、約０．１～５００ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは約０．５～２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重）の１日用量で化合物を提供するように行ってよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、生物活性剤を更に含んでよい。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、固形剤形の医薬組成物として製剤化してもよいが、薬学的に許容される任意の剤形を利用することができる。固形剤形の例としては、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、小袋、ロゼンジ、散剤、丸剤、又は顆粒剤などが挙げられる。固形剤形としては、例えば、速溶性剤形、放出制御剤形、凍結乾燥剤形、遅延放出剤形、徐放性剤形、パルス放出剤形、及び、速放性剤形と放出制御剤形の混合剤形、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、担体を含む医薬組成物として製剤化してよい。担体は、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、及びデンプン－ゼラチンペーストからなる群から選択してよい。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁化剤、甘味剤、香料、保存料、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、及び発泡剤のうち１つ以上を含む医薬組成物として製剤化してよい。
好適な希釈剤は、例えば、薬学的に許容される不活性充填剤であってよく、それらの例として、微結晶セルロース、ラクトース、リン酸水素カルシウム、糖類、及び前述のいずれかの混合物などが挙げられる。
好適な崩壊剤としては、軽度に架橋したポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、変性デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及びこれらの混合物が挙げられる。
発泡剤の例としては、有機酸と炭酸塩又は重炭酸塩などの、組み合わせ発泡剤（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ ｃｏｕｐｌｅ）が挙げられる。あるいは、組み合わせ発泡剤の重炭酸ナトリウム成分だけが存在してもよい。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、任意の適した経路による送達のための医薬組成物として製剤化してよい。例えば、医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、及び肺経路で投与してよい。経口投与用の医薬組成物の例としては、カプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤、及び顆粒剤が挙げられる。
本明細書に開示された方法で利用される化合物は、当該分野で周知の従来の手順に従って有効成分を標準的な医薬担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される、従来の剤形で投与してよい。これらの手順には、所望の製剤に適した成分の、混合、造粒、圧縮、又は溶解が含まれ得る。
上記化合物を含む医薬組成物は、任意の適切な経路による投与に対して適合させてよく、経路の例として、経口（口腔又は舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（口腔、舌下、又は経皮を含む）、膣、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内を含む）経路、腹腔内注射、及び点眼などによる局所投与が挙げられる。このような製剤は、例えば有効成分を担体又は賦形剤と結合させるなど、薬学分野で公知の任意の方法によって調製してよい。
製剤は、単位用量又は複数回用量の容器内で提供されてよい。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、固形剤形の医薬組成物として製剤化してもよいが、薬学的に許容される任意の剤形を利用することができる。固形剤形の例としては、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、小袋、ロゼンジ、散剤、丸剤、又は顆粒剤などが挙げられる。固形剤形としては、例えば、速溶性剤形、放出制御剤形、凍結乾燥剤形、遅延放出剤形、徐放性剤形、パルス放出剤形、及び、速放性剤形と放出制御剤形の混合剤形、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、担体を含む医薬組成物として製剤化してよい。担体は、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、及びデンプン－ゼラチンペーストからなる群から選択してよい。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁化剤、甘味剤、香料、保存料、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、及び発泡剤のうち１つ以上を含む医薬組成物として製剤化してよい。
好適な希釈剤は、例えば、薬学的に許容される不活性充填剤であってよく、それらの例として、微結晶セルロース、ラクトース、リン酸水素カルシウム、糖類、及び前述のいずれかの混合物などが挙げられる。
好適な崩壊剤としては、軽度に架橋したポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、変性デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及びこれらの混合物が挙げられる。
発泡剤の例としては、有機酸と炭酸塩又は重炭酸塩などの、組み合わせ発泡剤（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ ｃｏｕｐｌｅ）が挙げられる。あるいは、組み合わせ発泡剤の重炭酸ナトリウム成分だけが存在してもよい。
本明細書に開示された方法において利用される化合物は、任意の適した経路による送達のための医薬組成物として製剤化してよい。例えば、医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、及び肺経路で投与してよい。経口投与用の医薬組成物の例としては、カプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤、及び顆粒剤が挙げられる。
本明細書に開示された方法で利用される化合物は、当該分野で周知の従来の手順に従って有効成分を標準的な医薬担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される、従来の剤形で投与してよい。これらの手順には、所望の製剤に適した成分の、混合、造粒、圧縮、又は溶解が含まれ得る。
上記化合物を含む医薬組成物は、任意の適切な経路による投与に対して適合させてよく、経路の例として、経口（口腔又は舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（口腔、舌下、又は経皮を含む）、膣、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内を含む）経路、腹腔内注射、及び点眼などによる局所投与が挙げられる。このような製剤は、例えば有効成分を担体又は賦形剤と結合させるなど、薬学分野で公知の任意の方法によって調製してよい。
製剤は、単位用量又は複数回用量の容器内で提供されてよい。
【0019】
本明細書に開示される組成物及び方法において使用される化合物は、医薬組成物として投与してよく、従って、この化合物を組み込んだ医薬組成物は、本明細書に開示される組成物の実施形態であると考えられる。このような組成物は、薬学的に許容される任意の物理的形態であってよく、例えば、経口投与用の医薬組成物とすることができる。このような医薬組成物は、開示された化合物の有効量を含み、この有効量は、投与される化合物の１日用量と関連する。各用量単位は、特定の化合物の１日用量を含んでもよい。あるいは、各用量単位は、１日用量の一部、例えば２分の１又は３分の１を含んでもよい。各用量単位に含まれる各化合物の量は、治療のために選択された特定の化合物が何であるのか、及び他の要因、例えば、何の適応症に対して化合物が投与されるかなどに部分的に依存し得る。本明細書に開示された医薬組成物は、患者への投与後に、有効成分の速放性、持続性、又は遅延性の放出が提供されるように、周知の手順を用いて製剤化してよい。本明細書に開示された方法に従って使用するための化合物は、単一の化合物として、又は化合物の組み合わせとして投与してよい。例えば、化合物は、単一の化合物として投与してもよいし、同一の、又は異なった薬理活性を有する別の化合物と組み合わせて投与してもよい。
【0020】
上記に示したように、開示された方法においては、上記化合物の薬学的に許容される塩が企図され、それらを利用してもよい。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」という用語は、生体に対して実質的に無毒な化合物の塩のことを指す。典型的な薬学的に許容される塩として、本明細書に開示される化合物を、薬学的に許容される鉱酸もしくは有機酸、又は有機もしくは無機塩基と反応させることによって調製される塩が挙げられる。このような塩は、酸付加塩及び塩基付加塩として知られている。本明細書に開示された化合物のほとんど、又はすべてが塩を形成可能であること、そして多くの場合、塩形態の医薬のほうが、遊離の酸又は塩基よりも結晶化及び精製が容易であるために、一般的に使用されるということが、当業者には理解されよう。
本明細書に開示された化合物の任意の塩の一部を形成する特定の対イオンは、その塩が全体として薬理学的に許容され、対イオンが塩全体に望ましくない性質を与えない限り、化合物の活性にとって重要でない場合がある。望ましくない性質として、望ましくない溶解性又は毒性を含む場合がある。
化合物の薬学的に許容されるエステル及びアミドもまた、本明細書に開示した組成物及び方法に用いることができる。好適なエステルの例としては、アルキル、アリール、及びアラルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ドデシルエステル、及びベンジルエステルなどが挙げられる。好適なアミドの例としては、無置換アミド、一置換アミド、及び二置換アミド、例えば、メチルアミド、ジメチルアミド、及びメチルエチルアミドなどが挙げられる。
更に、本明細書に開示した方法は、上記化合物、又はそれらの塩、エステル、及び／もしくはアミドの、溶媒和物の形態を用いて実施してもよい。溶媒和物の形態としては、エタノール溶媒和物及び水和物などが挙げられる。
本明細書に開示された化合物の任意の塩の一部を形成する特定の対イオンは、その塩が全体として薬理学的に許容され、対イオンが塩全体に望ましくない性質を与えない限り、化合物の活性にとって重要でない場合がある。望ましくない性質として、望ましくない溶解性又は毒性を含む場合がある。
化合物の薬学的に許容されるエステル及びアミドもまた、本明細書に開示した組成物及び方法に用いることができる。好適なエステルの例としては、アルキル、アリール、及びアラルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ドデシルエステル、及びベンジルエステルなどが挙げられる。好適なアミドの例としては、無置換アミド、一置換アミド、及び二置換アミド、例えば、メチルアミド、ジメチルアミド、及びメチルエチルアミドなどが挙げられる。
更に、本明細書に開示した方法は、上記化合物、又はそれらの塩、エステル、及び／もしくはアミドの、溶媒和物の形態を用いて実施してもよい。溶媒和物の形態としては、エタノール溶媒和物及び水和物などが挙げられる。
【0021】
本技術の一態様は、ＧＦＡＰと安定的に結合する化合物を必要とする対象の、治療のための方法を提供する。好適には、方法は、ＧＦＡＰと安定に結合する化合物の有効量を対象に投与することを含んでよい。本明細書で使用する「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」という用語は、それぞれ、症状を緩和すること、症状が生じた原因を一時的又は永続的に排除すること、及び／又は、特定の疾患又は障害によって生じる症状の出現を予防もしくは遅延させること、あるいは進行もしくは重症度を逆転させることを意味する。従って、本明細書に開示された方法は、治療的投与と予防的投与の両方を包含する。
本明細書で使用する「対象」は、「患者」又は「個体」と互換的であってよく、治療を必要とする動物のことを意味し、動物はヒト又は非ヒト動物であってよい。「治療を必要とする対象」としては、本明細書に開示される化合物を単独で用いた治療又はそれを別の生物活性剤と併用した治療に反応する疾患、障害又は状態を有する対象が挙げられる。疾患、障害、又は状態の例としては、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの神経変性疾患、外傷性脳損傷、その他の神経学的状態、又は心血管系の状態が挙げられるが、これらに限定されない。「生物活性剤」という用語は、生物活性を有する薬剤として本化合物と組み合わせて使用される、結合体以外の薬剤であって、本化合物の使用目的である治療、阻害、及び／又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ／ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の達成を補助する薬剤のことを表すために使用される。
本明細書で使用する「対象」は、「患者」又は「個体」と互換的であってよく、治療を必要とする動物のことを意味し、動物はヒト又は非ヒト動物であってよい。「治療を必要とする対象」としては、本明細書に開示される化合物を単独で用いた治療又はそれを別の生物活性剤と併用した治療に反応する疾患、障害又は状態を有する対象が挙げられる。疾患、障害、又は状態の例としては、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの神経変性疾患、外傷性脳損傷、その他の神経学的状態、又は心血管系の状態が挙げられるが、これらに限定されない。「生物活性剤」という用語は、生物活性を有する薬剤として本化合物と組み合わせて使用される、結合体以外の薬剤であって、本化合物の使用目的である治療、阻害、及び／又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ／ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の達成を補助する薬剤のことを表すために使用される。
【0022】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、対象への単回又は複数回の投与時などにおいて所望の効果をもたらす、化合物の量又は用量のことを指す。例えば、癌の治療に関して、有効量は、腫瘍成長速度を減少させ、腫瘍量を減少させ、転移数を減少させ、腫瘍進行までの時間を増加させ、又は、生存時間を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％増加させる、治療薬の量を表す。感作に関して、有効量とは、上記の対象又は細胞の感作をもたらす治療薬の量のことを指す。
有効量は、当業者としての担当診断医が、既知の技術を用いて類似の環境下で得られた結果を観察することにより、決定することができる。投与する化合物の有効量又は用量を決定する際、担当診断医は多くの要素を考慮することができ、それらの例として、対象の種；対象の大きさ、年齢、及び全体的な健康；関係する疾患又は障害の、関連度又は重症度；対象個体の反応；投与される特定の化合物；投与様式；投与される製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択される用法；併用薬の使用；並びに、その他の関連する状況；が挙げられる。
有効量は、当業者としての担当診断医が、既知の技術を用いて類似の環境下で得られた結果を観察することにより、決定することができる。投与する化合物の有効量又は用量を決定する際、担当診断医は多くの要素を考慮することができ、それらの例として、対象の種；対象の大きさ、年齢、及び全体的な健康；関係する疾患又は障害の、関連度又は重症度；対象個体の反応；投与される特定の化合物；投与様式；投与される製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択される用法；併用薬の使用；並びに、その他の関連する状況；が挙げられる。
【0023】
いくつかの実施形態において、対象は神経変性疾患を有する。「神経変性疾患」という用語は、脳又は末梢神経系の神経細胞が時間とともに機能を失い、最終的に死滅する疾患の一種のことを指す。神経変性疾患は、脳内の不溶性タンパク質凝集体の蓄積によって示される、タンパク質恒常性の破綻によって特徴づけられる。一般的な神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動ニューロン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症、レビー小体病、多系統萎縮症、及び進行性核上性麻痺などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、対象はアルツハイマー病（ＡＤ）を有する。「アルツハイマー病」という語は、脳が収縮（萎縮）し、脳細胞が死滅する進行性の神経疾患のことを指す。ＡＤは、認知症と、思考力、行動力、及び社会性の継続的低下の最も一般的な原因である。ＡＤ患者では、脳細胞の結合及び細胞そのものが変性及び死滅し、最終的には記憶と、その他の重要な精神機能が破壊される。
いくつかの実施形態では、対象はアルツハイマー病（ＡＤ）を有する。「アルツハイマー病」という語は、脳が収縮（萎縮）し、脳細胞が死滅する進行性の神経疾患のことを指す。ＡＤは、認知症と、思考力、行動力、及び社会性の継続的低下の最も一般的な原因である。ＡＤ患者では、脳細胞の結合及び細胞そのものが変性及び死滅し、最終的には記憶と、その他の重要な精神機能が破壊される。
【0024】
他に断りがない限り、又は文脈によって示されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語は、「１つ以上」を意味する。例えば、「ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ」は「１つ以上の分子」を意味する解釈されるべきである。
本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「大幅に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、及び「かなり（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」という用語は、当業者によって理解され、また、それらの語が使用される文脈によってある程度異なりうる。用語が用いられる文脈において、その使用が当業者にとって不明確である場合、「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は特定の用語の±１０％以内のことを意味し、「大幅に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」及び「かなり（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」という用語は特定の用語の±１０％超のことを意味する。
本明細書において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じ意味を有する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素に更に追加的な構成要素を含めることを可能にする、「オープンな」移行語であると解釈すべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素に追加的な構成要素を含めることができない「クローズドな」移行語であると解釈すべきである。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、部分的にクローズドであり、請求項に記載された主題の性質を根本的に変えない追加的な構成要素のみを含めることを可能にすると解釈すべきである。
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に断りがない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適した順番で行われうる。本明細書で提供されるあらゆる実施例、又は例示的な言葉（「など（ｓｕｃｈ ａｓ）等」）の使用は、発明をより良く説明することのみを意図しており、他に断りがない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。本明細書中のいかなる言葉も、請求項に記載されていないいずれかの要素が本発明の実施にとって不可欠なものであることを示すと解釈されるべきではない。
本明細書中に引用されている刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、参照により、各参考文献が個々に具体的に参照により本明細書に組み込まれるように示され、その全体が明記された場合と同程度に本明細書に組み込まれるものとする。
本発明の好ましい態様を、本願発明者らが知る、本発明を実施するための最良の形態を含めて、本明細書に記載する。前述の説明を読むことにより、これらの好ましい態様の変形が当業者に明らかになるであろう。本願発明者らは、当業者が適宜このような変形を採用することを期待しており、本願発明者らは、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用される法律によって許可される限り、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変物及び均等物を含む。更に、本明細書に別段の断りがない限り、又は文脈上明らかに矛盾する場合を除き、あらゆる可能な変形における上記要素のいずれの組み合わせも本発明に包含される。
本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「大幅に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、及び「かなり（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」という用語は、当業者によって理解され、また、それらの語が使用される文脈によってある程度異なりうる。用語が用いられる文脈において、その使用が当業者にとって不明確である場合、「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は特定の用語の±１０％以内のことを意味し、「大幅に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」及び「かなり（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」という用語は特定の用語の±１０％超のことを意味する。
本明細書において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じ意味を有する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素に更に追加的な構成要素を含めることを可能にする、「オープンな」移行語であると解釈すべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素に追加的な構成要素を含めることができない「クローズドな」移行語であると解釈すべきである。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、部分的にクローズドであり、請求項に記載された主題の性質を根本的に変えない追加的な構成要素のみを含めることを可能にすると解釈すべきである。
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に断りがない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適した順番で行われうる。本明細書で提供されるあらゆる実施例、又は例示的な言葉（「など（ｓｕｃｈ ａｓ）等」）の使用は、発明をより良く説明することのみを意図しており、他に断りがない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。本明細書中のいかなる言葉も、請求項に記載されていないいずれかの要素が本発明の実施にとって不可欠なものであることを示すと解釈されるべきではない。
本明細書中に引用されている刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、参照により、各参考文献が個々に具体的に参照により本明細書に組み込まれるように示され、その全体が明記された場合と同程度に本明細書に組み込まれるものとする。
本発明の好ましい態様を、本願発明者らが知る、本発明を実施するための最良の形態を含めて、本明細書に記載する。前述の説明を読むことにより、これらの好ましい態様の変形が当業者に明らかになるであろう。本願発明者らは、当業者が適宜このような変形を採用することを期待しており、本願発明者らは、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用される法律によって許可される限り、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変物及び均等物を含む。更に、本明細書に別段の断りがない限り、又は文脈上明らかに矛盾する場合を除き、あらゆる可能な変形における上記要素のいずれの組み合わせも本発明に包含される。
【実施例】
【0025】
方法
Ｃ．エレガンス株：本研究で用いた線虫の株は、すべてＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。アルツハイマー病様アミロイドーシスの線虫モデルは、ヒトＡβ1-42を筋肉で発現するＣＬ４１７６［ｓｍｇ－１ts；ｍｙｏ－３ｐ：：Ａβ1-42：：ｌｅｔ－８５１ ３’－ＵＴＲ；ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６）］；及びヒトＡβ1-42を全ニューロンで発現するＣＬ２３５５［ｓｍｇ－１ts；ｓｎｂ－１：：Ａβ1-42：：３’－ＵＴＲ（ｌｏｎｇ）；ｍｔｌ－２：：ｇｆｐ］であった。ＡＭ１４１株は筋肉中でポリグルタミンレポーター（Ｑ４０：：ＹＦＰ）を発現することから、ハンチントン病及び他のいくつかの神経病理で観察されるものと類似したグルタミントラクト凝集のモデルとなっている（Ｍｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。特に断りのない限り、すべての株は、大腸菌ＯＰ５０株で被覆した、線虫増殖培地（ＮＧＭ）を含む２％（ｗ／ｖ）寒天プレート上で２０℃にて増殖させた。
Ｃ．エレガンス株：本研究で用いた線虫の株は、すべてＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。アルツハイマー病様アミロイドーシスの線虫モデルは、ヒトＡβ1-42を筋肉で発現するＣＬ４１７６［ｓｍｇ－１ts；ｍｙｏ－３ｐ：：Ａβ1-42：：ｌｅｔ－８５１ ３’－ＵＴＲ；ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６）］；及びヒトＡβ1-42を全ニューロンで発現するＣＬ２３５５［ｓｍｇ－１ts；ｓｎｂ－１：：Ａβ1-42：：３’－ＵＴＲ（ｌｏｎｇ）；ｍｔｌ－２：：ｇｆｐ］であった。ＡＭ１４１株は筋肉中でポリグルタミンレポーター（Ｑ４０：：ＹＦＰ）を発現することから、ハンチントン病及び他のいくつかの神経病理で観察されるものと類似したグルタミントラクト凝集のモデルとなっている（Ｍｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。特に断りのない限り、すべての株は、大腸菌ＯＰ５０株で被覆した、線虫増殖培地（ＮＧＭ）を含む２％（ｗ／ｖ）寒天プレート上で２０℃にて増殖させた。
【0026】
ＡβトランスジェニックＣ．エレガンスＣＬ２３５５株及びＣＬ４１７６株における走化性及び麻痺アッセイ。ニューロン（ＣＬ２３５５）又は筋肉（ＣＬ４１７６）でＡβ1-42を発現するトランスジェニックＣ．エレガンス株を、十分な大腸菌（ＯＰ５０）を用いて２０℃で増殖させ、成虫の１日目に虫体を溶解して卵を放出させ、同調コホートを生成した。その後、卵を、ＧＦＡＰオルソログを標的とするＲＮＡｉ発現細菌（大腸菌ＨＴ１１５）、又は空ベクター対照細菌を播種した１００ｍｍのＮＧＭ寒天シャーレに置いた。Ｌ３～Ｌ４移行期の虫体を、２５．５℃にアップシフトしてヒトＡβ1-42導入遺伝子の発現を誘導し、４８時間後にアッセイを行った。走化性（Ｄｏｓａｎｊｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）及び麻痺（Ｄｏｓｔａｌ ａｎｄ Ｌｉｎｋ， ２０１０）アッセイを既報に従って実施した（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７；Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ；Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｄ；Ｋａｋｒａｂａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。
【0027】
ヒトタウ発現Ｃ．エレガンスＶＨ２５５株を用いた麻痺アッセイ。ヒトタウを汎ニューロン的に発現するＣ．エレガンスＶＨ２５５株（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， ２００９）を、大腸菌（ＯＰ５０）の菌叢を敷いた寒天プレート上で２５℃にて維持する。虫体をアルカリ性次亜塩素酸塩溶液で溶解することで未産卵の卵を取得し、それらを用いて同調培養物を生成する。その後、卵を１００ｍｍのＮＧＭ寒天プレートに移し、ＭＳＲ１又はＭＳＲ２を最終濃度１μＭになるようにプレートに加えた。ｉｆｐ－１のＲＮＡｉノックダウンには、二本鎖ｉｆｐ－１ ＲＮＡのエクソンセグメントを発現するＨＴ１１５株からなる菌叢を用いた（次節参照）。虫体は隔日で洗浄し、新しい薬剤平衡化プレートに加えた。３日目の成虫でアッセイを行い、麻痺した虫体の割合を評価した。
【0028】
Ｃ．エレガンスにおけるＲＮＡｉ。ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡ標的のエクソン断片に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌を摂食することで達成される（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｃ；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｋａｋｒａｂａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。簡単に説明すると、アルカリ性次亜塩素酸塩による溶解によって未産卵の卵を放出させることで、虫体の培養物を同調させた。空ベクターＬ４４４０（ｐＰＤ１２９．３６）を有する細菌（大腸菌ＨＴ１１５［ＤＥ３］）を播種した、又は、ｉｆｐ－１（ヒトＧＦＡＰに相同）、ｌｅｔ－５０２（ヒトＲＯＣＫ１とオルソロガス）、ａｋｔ－２（ＡＫＴ２）、ｋｉｎ－１（ＰＫＡ）、もしくはｇｒｋ－１（ＢＡＲＫ）を発現する細菌クローンを播種した、ＩＰＴＧ含有ＮＧＭプレート上に、孵化前の卵又はＬ４後期の幼虫を置いた。成虫３日目（孵化後５．５日目）の虫体を撮像して全凝集体蛍光（ＡＭ１４１株）の評価を行ったか、又は麻痺（ＶＨ２５５）もしくはｎ－ブタノールに対する走化性（ＣＬ２３５５）の評価を行った。
【0029】
ヒト細胞のｓｉＲＮＡノックダウン及びチオフラビンＴ染色。対数増殖期の培養物から得たＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞をトリプシン処理し、リンスした後、９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞ずつプレーティングし、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した「ＤＭＥＭ＋Ｆ１２」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃で１６時間増殖させた。約４０％コンフルエントの細胞に、ＧＦＡＰ（ＳＡＳ１＿Ｈｓ０１ ００２２７６１８）、ＡＫＴ２（ＳＡＳ１＿Ｈｓ０１ ０００３５０５８）、ＲＯＣＫ１（ＳＡＳ１ Ｈｓ ０００６５５７１）、ＢＡＲＫ（ＳＡＳ１ Ｈｓ ０００３９３２１）、又はＰＫＡ（ＳＡＳ１ Ｈｓ ００２１７２２３）を標的とする短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）コンストラクト（いずれもＭｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）から得たもの）をトランスフェクトした。ＲＮＡｉＭａｘ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、使用説明書に従い、上記ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後の細胞を４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで固定し、暗所容器中で０．１％（ｗ／ｖ）チオフラビンＴにより染色した。細胞をＰＢＳ内で４回洗浄した後、Ａｎｔｉｆａｄｅ＋ＤＡＰＩ（ＥＭＤ－ミリポア）で覆い、自動化されたウェルごとのイメージングのためのモーター駆動ステージ付きＫｅｙｅｎｃｅ蛍光顕微鏡を用いて、各ウェル９視野の蛍光を緑と青のチャンネルでキャプチャーした。チオフラビンＴ蛍光強度を各ウェルのＤＡＰＩ+核数で除して細胞あたりのアミロイド比を決定し、平均値±ＳＤとしてまとめた。
【0030】
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞のＭＳＲ１処理。ヒト神経芽腫（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw）細胞を、既報に従って増殖させた（Ｋａｋｒａｂａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。凝集傾向を示す「Ｓｗｅｄｉｓｈ」二重変異体アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰＳｗ）を発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中で３７℃にて培養した。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ中に懸濁し、バッファー中でリンスしてから再プレーティング又は回収を行った。アッセイ直前に、細胞をＤＭＳＯ（最終濃度０．０２％）に溶解した１０μＭのＭＳＲ１の存在下で、又は対照細胞については０．０２％ ＤＭＳＯ（溶媒のみ）中で、４８時間増殖させた。細胞を回収し、全タンパク質を単離して、凝集体タンパク質を以下のように精製した。
【0031】
ｐＧＦＡＰ及びＲＯＣＫ１に対する、グリア（Ｔ９８Ｇ）細胞のウェスタンブロット分析。ヒト膠芽腫細胞（Ｔ９８Ｇ）を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で維持した。細胞を回収し、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム）中で細胞のタンパク質を抽出して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて定量を行った。タンパク質のアリコート（５０μｇ）を４～２０％勾配のビス－トリスアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で１００Ｖにて２時間電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロット膜をＢＳＡブロッカー（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにプレインキュベートした後、ｐＧＦＡＰ又はＲＯＣＫ－１に対するウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００希釈）をプローブとして、４℃で一晩反応させた。洗浄後、膜を、二次抗体（ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＡｂＣａｍ、１：１０，０００希釈）又はウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ））とともに室温で１時間インキュベートし、ＥＣＬ化学発光検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて発色させた。データをデジタル化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて解析した。
【0032】
凝集タンパク質の単離。培養ヒト細胞を回収し、液体窒素中で急速冷凍し、非イオン性界面活性剤（１％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、及びプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤［ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ］）を含む緩衝液の存在下、０℃でホモジナイズした［１１、１２、３７］。ライセートを遠心分離（５分間、３０００ｒｐｍ、４℃）し、デブリを除去した。遠心分離（１８分間、１３，０００×ｇ、４℃）により細胞質タンパク質（１％ ＮＰ４０非イオン性界面活性剤に可溶性）を除去した後、タンパク質ペレットを１％（ｖ／ｖ）サルコシル（ラウリルサルコシン酸ナトリウム）と５ｍＭ ＥＤＴＡとを含む０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファーでｐＨ７．４にし、１００，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットタンパク質（サルコシル不溶性画分）をＬａｅｍｍｌｉローディングバッファー（５０ｍＭジチオスレイトール及び２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む）中に再懸濁し、９５℃で５分間加熱することによって、このバッファーに可溶なタンパク質を溶解し、１％（ｖ／ｖ） ＳＤＳを含む４～２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル上で電気泳動により分離した。ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色し、タンパク質を可視化した。ゲルのレーンをロボット制御によって切断して１ｍｍの薄片にし、トリプシンを用いて完全に消化した。各薄片中のタンパク質を、既報に従って質量分析により同定した（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５；Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ａ；Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ；Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｃ；Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｄ；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。
【0033】
ＧＦＡＰ構造のモデリング及びＭＤシミュレーション。ＧＦＡＰの３次元構造を、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲサーバーベースのアルゴリズムによって実行される、フォールド認識及び非経験的分子軌道法による構造予測法を用いてモデル化した。Ｉ－ＴＡＳＳＥＲによって生成された５つの異なるモデルの中から、最も低いエネルギーの配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）を選び、更に処理を進めた。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションでは、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｄｅｓｍｏｎｄシミュレーションスイートのタンパク質作製ウィザードを使用して、モデル構造を作製した。シミュレーション中に生理的条件を近似するため、単純点電荷（ＳＰＣ）水で満たされた斜方晶系シミュレーションボックスを作成し、局所的に帯電した部位を適切な対イオン（Ｎａ+、Ｃｌ-）で中和し、更に０．１５Ｍ ＮａＣｌを加えて生理的等張状態を達成した。平衡化のため、温度及び圧力をそれぞれ３００°Ｋ及び１１０．２３ｋＰａ（１．１０２３バール）に保つ。ランダムサンプリングの入力シードを実行ごとに変更し、それぞれ２００～５００ナノ秒のシミュレーションを少なくとも３回繰り返す。Ｍａｅｓｔｒｏの「Ｍｕｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ」プラグインの使用により、リン酸化を行うシミュレーションを組み込み、指定された残基をリン酸化された形態に変換した。トラジェクトリー（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）をＶＭＤで可視化し、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ）を用いて解析した。
【0034】
分子構造ライブラリーに対する標的タンパク質の仮想スクリーニング。ＧＦＡＰへのドッキングを目的としたＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ分子構造ライブラリーのハイスループット仮想スクリーニングを、まず、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ Ｇｌｉｄｅモジュールを用いて行った。ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ構造の２Ｄフォーマットでの取得及び作製を、ＬｉｇＰｒｅｐウィザード（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ）を用いて行った。仮想薬剤スクリーニングの効率を向上するため、３段階の戦略を採用した：（ｉ．）約７５万個の分子構造のライブラリー全体を、Ｇｌｉｄｅの高スループットモードでＧＦＡＰタンパク質に仮想的にドッキングした；（ｉｉ．）高スループットスクリーニングで得られた構造の上位１％を、Ｇｌｉｄｅの標準精度モードでＧＦＡＰに再度ドッキングした；そして、（ｉｉｉ．）標準精度ドッキングで得られた構造の上位１％に対し、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ Ｐｒｉｍｅモジュールを使用して、ＭＭ－ＧＢＳＡ条件下で結合自由エネルギーを予測した。最も親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）が高い（ΔＧbindingが最も低い）タンパク質－リガンド複合体に対してＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｄｅｓｍｏｎｄモジュールを用いてシミュレーションを行い、それらの経時的な安定性を評価した。
【0035】
統計分析。タンパク質凝集、走化性、及び麻痺の反復アッセイのため、対照群と実験群の差の有意性を、各実験を１点として扱ったＦｉｓｈｅｒ－Ｂｅｈｒｅｎｓの異分散ｔ検定（不等分散又は未知の分散の標本に対して適切）により評価した。実験内において、割合（麻痺又は走化性の割合）の差を、適宜サンプル数に基づいてカイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定で評価した。
【0036】
結果
アルツハイマー病の海馬で形成された凝集体は、グリア線維性酸性タンパク質を多く含み、過剰リン酸化しており、そして酸化されている。概して非構造化タンパク質であるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、ＡＤの海馬から得られた界面活性剤不溶性凝集体の３つのサブクラスにおいて、年齢マッチ対照（ＡＭＣ）の海馬と比較して、２～２．５倍多く含まれる（図１Ａ）。対照凝集体のＧＦＡＰには優勢な翻訳後修飾（ＰＴＭ）はないが、ＡＤ凝集体のＧＦＡＰでは、３～５個のセリン又はスレオニン残基がリン酸化されている（図１Ｂ）。注目すべきことに、ＧＦＡＰリン酸化シグネチャーは、ＡｐｏＥアレルε３，ε３又はε４，ε４（それぞれ「３，３」及び「４，４」と略記）を持つ個体間で、高い再現性で異なっていた。ＡＤ（３，３）及びＡＤ（４，４）試料のウェスタンブロットでは、ＡＤの組織には、ＡＭＣと比較して、過剰リン酸化ＧＦＡＰ（ｈＰ－ＧＦＡＰ）が有意に多く含まれることが確認された（図１Ｃ）。各遺伝子型群はＡＭＣ（３，３）対照試料とＰ＜０．０００１で相違する。
アルツハイマー病の海馬で形成された凝集体は、グリア線維性酸性タンパク質を多く含み、過剰リン酸化しており、そして酸化されている。概して非構造化タンパク質であるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、ＡＤの海馬から得られた界面活性剤不溶性凝集体の３つのサブクラスにおいて、年齢マッチ対照（ＡＭＣ）の海馬と比較して、２～２．５倍多く含まれる（図１Ａ）。対照凝集体のＧＦＡＰには優勢な翻訳後修飾（ＰＴＭ）はないが、ＡＤ凝集体のＧＦＡＰでは、３～５個のセリン又はスレオニン残基がリン酸化されている（図１Ｂ）。注目すべきことに、ＧＦＡＰリン酸化シグネチャーは、ＡｐｏＥアレルε３，ε３又はε４，ε４（それぞれ「３，３」及び「４，４」と略記）を持つ個体間で、高い再現性で異なっていた。ＡＤ（３，３）及びＡＤ（４，４）試料のウェスタンブロットでは、ＡＤの組織には、ＡＭＣと比較して、過剰リン酸化ＧＦＡＰ（ｈＰ－ＧＦＡＰ）が有意に多く含まれることが確認された（図１Ｃ）。各遺伝子型群はＡＭＣ（３，３）対照試料とＰ＜０．０００１で相違する。
【0037】
ＰＥＡＫＳソフトウェア（ＰＴＭモジュール）を使用し、他のいくつかのＰＴＭをスクリーニングしたが、ＡＤとＡＭＣを区別する上で有用なものはなかった。すべてのグループで、Ｒ８８とＫ９５においてメチル化されたアルギニン及びリジンが観察され、Ｋ１０７はジメチル化されており、いずれも９０％超であった。脱アミド化は、いずれのＧＦＡＰペプチドにおいてもスペクトル数の１０％超で観察されることはなく、ピログルタミンは２５％を超えることはなかった（不掲載データ）。
【0038】
分子動力学シミュレーションはＧＦＡＰのアンフォールディングを予測し、ドラッガブルなポケットを同定する。ＡＤ凝集体で観察されるｈＰ－ＧＦＡＰ構造の分子動力学シミュレーション（リン酸化模倣置換によるレンダリング）によれば、ＡＭＣ凝集体で見られる非リン酸化ＧＦＡＰと比べ、ＡｐｏＥ（３，３）個体ではより順応性が高いＧＦＡＰ構造が予測され、一方でＡＤ（４，４）ではより高度な構造上の厳格さが予測される（図２Ａ～２Ｅ）。ＧＦＡＰは概して不規則なタンパク質であるため、その全長構造は実験的に決定されていない。そこで、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲのフォールド認識及び非経験的分子軌道法（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）の手順を用いて、その３次元構造を予測した。得られた仮想的な構造はヘリックスとループを含み（図２Ａ）、タンパク質の内溝の近くに小型のポケット又は空洞を形成している。
【0039】
その不規則な性質を考慮すると、予測されるタンパク質構造は不安定であり、自然にほどけて、ポケットの向き及び薬剤のアクセス性が変化すると予想される。タンパク質のアンフォールディングのトラジェクトリーを調査するため、完全に溶媒和したＧＦＡＰの予測される構造を０．５マイクロ秒（５００ナノ秒）間シミュレートした。ドラッガブルなポケットの容積（図２Ｂ）、及び原子位置の変動に関するいくつかの尺度（下記参照）から、構造変化の有用な記述子が提供される。これらの解析は、予想されていたＧＦＡＰの初期構造のアンフォールディングを支持するものであり、シミュレーションの過程でドラッガブルなポケット（図２Ａ及び２Ｃ）が拡大する。小分子の結合をスクリーニングするため、中間的な準安定構造（シミュレーションの２００ナノ秒の時点；図２Ｃ）を選択した。
【0040】
ＡＤ凝集体で観察されたＧＦＡＰのリン酸化の差（図１Ａ～１Ｃ）は、ＧＦＡＰの構造的動態に影響を及ぼす可能性があると予想される。この可能性を評価するため、観察されたリン酸化部位をグルタミン酸に「変異」させ（リン酸化模倣置換）、得られた構造を０．５マイクロ秒間シミュレートした。結果は、ＡＤ脳におけるＧＦＡＰの過剰リン酸化が、ＧＦＡＰの構造安定性を変化させる可能性が高いという予想を支持する。この時間間隔におけるＧＦＡＰ原子座標の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は、ＡＤ（３，３）凝集体で観察されるものと同様のリン酸化模倣構造である「ＡＤ（３，３） ＧＦＡＰ」よりも、非修飾分子である「ＡＭＣ（３，３） ＧＦＡＰ」の方が一貫して低い（図２Ｄ）。「ＡＤ（４，４） ＧＦＡＰ」（ＡＤ（４，４）凝集体で観察されるＧＦＡＰのリン酸化模倣体）は、最初はＡＭＣ（３，３） ＧＦＡＰよりもやや変動が大きいが、約２３５ナノ秒以降維持される比較的安定した構造を達成する（図２Ｄ）。
【0041】
個々の残基の平均二乗平均平方根変動（ＲＭＳＦ）を経時的にプロットしたところ、ＡＭＣ（３，３）とＡＤ（３，３）の両構造はＧＦＡＰ分子全体で中程度から高度の位置変動を示し（図２Ｅ）、このことはＡＤ（４，４）リン酸化模倣構造が比較的厳格であるのとは対照的であることが示された。これらのデータ（図２Ｄ及び２Ｅ）を合わせると、ＡＤと関連したリン酸化の相違はＧＦＡＰの構造を変化させることができ、その変化はＡｐｏＥ（３，３）ではやや不安定である一方で、ＡｐｏＥ（４，４）では比較的不変のコンフォメーションを生成するという予測が支持される。
【0042】
ＧＦＡＰリン酸化を媒介する可能性のあるキナーゼの同定。リン酸化予測ソフトウェアＮｅｔＰｈｏｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ）及びＧＰＳ（ｈｔｔｐ：／／ｇｐｓ．ｂｉｏｃｕｃｋｏｏ．ｏｒｇ／ ｏｎｌｉｎｅ．ｐｈｐ）を用いて、各推定ＧＦＡＰ標的残基の上流キナーゼを予測した（表１及び図３Ａ）。ＧＦＡＰを修飾部位でリン酸化すると予測された関連キナーゼ（ＡＫＴ２、ＲＯＣＫ１、ＢＡＲＫ／ＧＲＫ、及びＰＫＡ）は、すべて、これまでにＡＤの発症又は進行と関連があるとされたものであった（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１９；Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００９ａ；Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００９ｂ；Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｒｕｓｓｏ， ２０１９；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。そこで、ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw；図３Ｂ及び３Ｃ）及びヒト膠芽腫細胞（Ｔ９８Ｇ；図３Ｄ及び３Ｅ）におけるタンパク質凝集に対する個々のキナーゼのノックダウンの効果を調べるため、ｓｉＲＮＡを介したノックダウン有り又は無しで試験を行った。各キナーゼ遺伝子のＫＤによってＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞の凝集体が６０～７０％減少し、これはＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡの効果と同様な（又はそれを超える）ものであった（図３Ｃ）。Ｔ９８Ｇ細胞では、ＡＫＴ２ ｓｉＲＮＡのみがＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡと同程度の効率で凝集を緩和した（図３Ｅ）。
【表1】
【0043】
更に、タンパク質凝集のＣ．エレガンスモデルにおいて、キナーゼを標的としたノックダウンの影響を比較するため、これらのヒトキナーゼと最も近い線虫オルソログをサイレンシングするＲＮＡｉコンストラクトを用いた。ポリグルタミンアレイの凝集によるハンチントン病を模した凝集モデル（ＡＭ１４１株）、アミロイドを形成するＡβ1-42ペプチドのニューロンにおける発現を用いた、アルツハイマー病を模した凝集モデル（ＣＬ２３５５株）、又は、麻痺をもたらす毒性凝集体を形成する、筋肉におけるヒトタウの発現を模した凝集モデル（ＶＨ２５５株）を使用した。ハンチントンモデルでは、各虫体の総凝集体強度（図７Ａ）、すなわち各虫体の凝集体数と凝集体あたりの平均ＹＦＰ蛍光の積は、ＢＡＲＫ／ＧＲＫ又はＲＯＣＫ１にオルソロガスなＣ．エレガンス遺伝子のノックダウンによって５０～６０％減少し（それぞれＰ＜０．００００５）、これはｉｆｐ－１（ＧＦＡＰの部分的ホモログ）に対するＲＮＡｉの効果と同様であった。ＡＤ様ニューロンアミロイドーシスのＣ．エレガンスモデル（ＣＬ２３５５）では、Ａβ導入遺伝子をニューロンで誘導すると、走化性が低下し、ｎ－ブタノール（化学誘引物質）に向かって移動する虫体が減少した。ＲＯＣＫ１、ＡＫＴ２、又はＢＡＲＫ／ＧＲＫオルソログ（それぞれｌｅｔ－５０２、ａｋｔ－２、及びｇｒｋ－２）のＲＮＡｉノックダウンは、ヒトＧＦＰと相同性のある中間径フィラメントタンパク質であるｉｆｐ－１のＫＤと少なくとも同程度に、走化性障害を回復させた（図７Ｂ）。Ｃ．エレガンスにおけるこれらの結果は、ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇで観察された、ＲＯＣＫ１、ＡＫＴ２、又はＰＫＡのｓｉＲＮＡ ＫＤが総凝集タンパク質を５０～６０％減少させた結果（図７Ｃ）と類似している。
【0044】
ＲＯＣＫ１はＡｐｏＥ発現膠芽腫細胞で増加している。軽度認知障害及びＡＤではＲｈｏ関連プロテインキナーゼ１（ＲＯＣＫ１）のタンパク質レベルが上昇しており、ヘミ接合体ノックアウトによってＲＯＣＫ１を減少させると、ＡＤのマウスモデルで見られる高アミロイドレベルが緩和された（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。培養中のヒト細胞、及びインタクトなＣ．エレガンス凝集モデルの両者において、ＲＯＣＫ１レベルを低下させることによる有意な効果が観察されたことから、ＡＰＯＥ３又はＡＰＯＥ４のいずれかのアレルを過剰発現しているＴ９８Ｇ膠芽腫細胞において、そのレベルを測定した。ＡＰＯＥ４アレルを過剰発現するヒトグリア細胞では、ＡＰＯＥ３導入遺伝子を発現する同じ細胞よりもＲＯＣＫ１タンパク質レベルが少なくとも６倍高く（Ｐ＜０．０００１；図４Ａ及び４Ｂ）、このことが、ＡｐｏＥ（４，４）個体から得たＡＤ凝集体をＡｐｏＥ（３，３）個体と比較した際に追加的なＧＦＡＰリン酸化部位が観察された原因となっている可能性がある（図１Ｂ、１Ｃ）。
【0045】
ＧＦＡＰに安定に結合すると予測される新規小分子の、計算スクリーニングによる同定。新規ＧＦＡＰ特異的阻害剤を同定するため、約７５万個の小分子を含むＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリーから、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏドッキングシミュレーションによって構造をスクリーニングした。ターゲットベースのドッキングのために、ＧＦＡＰの過渡的構造において予測されるドラッガブルなポケット（図２Ｃ、２００ナノ秒）を選んだ。予測スループットを向上させるため、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｇｌｉｄｅドッキングモジュール（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）において、３段階の計算スクリーニングを行い、各段階でドッキングストリンジェンシーを増加させた（詳細については方法を参照）。まず、ハイスループットモードでＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリー全体の仮想ドッキングを行い、その後、標準精度モードで上位１％のリード分子の再ドッキングを行った。第２段階で得られた分子の上位１％（７４個の構造）について、ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒのＭＭ－ＧＢＳＡモジュール（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）を用いて、陰溶媒（ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｓｏｌｖｅｎｔ）ベースの相互作用の自由エネルギーを分析した。次に、ＧＦＡＰに対するΔＧbindingが最も低いと予測される分子について、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質凝集に対する影響を調べた。ドッキングをシミュレートするこの３段階の手順により、ＧＦＡＰの標的ポケットに最も高い親和性で安定に結合すると予測される分子のセットが生成された。最良の３つの候補（ＭＳＲ１、ＭＳＲ２、及びＭＳＲ３と呼ぶ）は、－４６ｋｃａｌ／モル超のΔＧbindingを有し、モデル化されたＧＦＡＰポケット内にうまく収まると予測された（図２Ｃ）。チューブリンへの結合に関するカウンタースクリーニングでは、これらの薬剤は、α又はβチューブリン、あるいはα及びβチューブリンのオリゴマーに対し無視できるほどの親和性しか有しない（ΔＧbinding≧－７ｋｃａｌ／モル）と予測されたが、上位にランクされた薬剤のほとんどは、ＧＦＡＰと結合するのと同程度の親和性でチューブリンと結合すると予測された（不掲載データ）。
【0046】
上位にランクされた薬剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの凝集をＧＦＡＰのノックダウンと同程度に効果的に抑制し、同じ共凝集成分を抑制する。ΔＧbindingの予測値が最も低かった３つのリード化合物（図５Ａ）について、神経変性アミロイドーシスのヒト細胞培養物モデル、及びＡＤ様凝集のＣ．エレガンス全動物（ｗｈｏｌｅ ａｎｉｍａｌ）モデルでの実験的検証を進めた。ＭＳＲ３は、最初の試験において、神経芽腫細胞に対して細胞毒性があり、試験したすべての用量でＣ．エレガンスの成長を遅延させることが判明した（不掲載データ）ため、検証を行わなかった。ＭＳＲ１とＭＳＲ２については、まず、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw神経芽腫細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を試験した。このモデルにおける凝集は、ＭＳＲ１によって特によく抑制された（図５Ｂ及び５Ｃ）。すべてのアッセイにおいて、ＭＳＲ１の有効性はＭＳＲ２より優れているか、又は同等であった。図５Ｂは、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw神経芽腫細胞を、ビヒクル（対照）又はＭＳＲ１に曝露した後、チオフラビンＴでアミロイド染色したものである。複数の実験において、ＭＳＲ１処理細胞では、チオフラビンの蛍光がほぼ半減した。全サルコシル不溶性凝集タンパク質を単離し、アクリルアミド－ＳＤＳゲル上で分離した後、タンパク質をＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙで染色した。ゲルのレーン（図５Ｄ、左から右）は、ビヒクル処理した対照細胞、ＧＦＡＰを標的とする短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で４８時間処理した細胞、又はＧＦＡＰに安定的かつ選択的に結合すると予測される薬剤であるＭＳＲ１又はＭＳＲ２で４８時間処理した細胞を示す。ＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡは凝集タンパク質を６５～８０％抑制し、ＭＳＲ１は６０～７５％抑制したが、ＭＳＲ２は凝集タンパク質の量を有意に減少させなかった。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞のサルコシル不溶性凝集体中のタンパク質をプロテオミクスにより同定したところ、対照細胞のサルコシル不溶性凝集体中に存在し（スペクトル数７以上）、ＭＳＲ１処理により完全に排除された（ヒット数０）タンパク質は、ＧＦＡＰのｓｉＲＮＡノックダウンにより排除されたタンパク質と驚くほどよく一致する（一致率８７％）ことが明らかになった（図５Ｅ）。一方、４つのタンパク質（ＣＢＸ８、ＴＳＰＹＬ５、ＣＤＫ２、及びＫＲＴ３３Ｂ）は、いずれの処理によっても実質的に発現が上昇制御されることが分かった。除外されたグループには、微小管の組み立て及び／又は相互作用に関与するいくつかのタンパク質が含まれる：プレクチン、ダイナクチン－１、シナプシン－１、アンキリンＢ、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ２、及びα－チューブリン。ＭＳＲ１とＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡは治療の効果がよく相関している（Ｒ＝０．７７、Ｐ＜３Ｅ－２８０；図５Ｆ）。ＭＳＲ１とＧＦＡＰ ＲＮＡｉが凝集体組成に対してこのような高度に一致した、相関性のある効果を示したという観察は、ＭＳＲ１が凝集を低下させる際の主な機能的標的がＧＦＡＰであるということに対して、説得力のある証拠を提供する。
薬剤ＭＳＲ１及びＭＳＲ２を、ヒト神経変性疾患のいくつかのＣ．エレガンスモデルでも試験した。Ｃ．エレガンスの筋肉に正常なヒトタウを発現するタウオパチーモデル株（ＶＨ２５５）では、タウの凝集が麻痺（刺激に反応して動くことができないこと）を引き起こしたが、１μＭのＭＳＲ１によって、又は、ＧＦＡＰの最も近い線虫ホモログであるｉｆｐ－１に対するｓｉＲＮＡで処理することによって、同程度に緩和された（図７Ｄ）。ＭＳＲ１はまた、ヒトＡβ42の汎ニューロン発現によって化学誘引物質への移動が障害される、Ｃ．エレガンスのニューロンアミロイドーシスモデル（ＣＬ２３５５）においても、走化性の有意な回復をもたらした。ＭＳＲ１を０．１μＭで添加することにより、走化性は約９０％まで回復し（図７ｅ）、野生型又は未誘導の虫体と同程度となった（図示せず）。筋肉にＱ４０：：ＹＦＰを発現する株では、年齢とともに蛍光を発する筋肉の凝集体が蓄積する。この株は、ハンチンチンタンパク質のポリグルタミンアレイの閾値までの拡大、すなわちヒトではハンチントン病、線虫では麻痺の症状を引き起こすのに十分な長さを模倣したものである。図７Ｆは、孵化後５日齢の各虫体における凝集強度を示す。１０μＭのＭＳＲ１では約５０％の減少であったのに対し、０．１μＭでは３５％の減少であった（それぞれの処理において、ビヒクルのみの対照とはＰ＜０．００５で差があった）。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰSw細胞のサルコシル不溶性凝集体中のタンパク質をプロテオミクスにより同定したところ、対照細胞のサルコシル不溶性凝集体中に存在し（スペクトル数７以上）、ＭＳＲ１処理により完全に排除された（ヒット数０）タンパク質は、ＧＦＡＰのｓｉＲＮＡノックダウンにより排除されたタンパク質と驚くほどよく一致する（一致率８７％）ことが明らかになった（図５Ｅ）。一方、４つのタンパク質（ＣＢＸ８、ＴＳＰＹＬ５、ＣＤＫ２、及びＫＲＴ３３Ｂ）は、いずれの処理によっても実質的に発現が上昇制御されることが分かった。除外されたグループには、微小管の組み立て及び／又は相互作用に関与するいくつかのタンパク質が含まれる：プレクチン、ダイナクチン－１、シナプシン－１、アンキリンＢ、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ２、及びα－チューブリン。ＭＳＲ１とＧＦＡＰ ｓｉＲＮＡは治療の効果がよく相関している（Ｒ＝０．７７、Ｐ＜３Ｅ－２８０；図５Ｆ）。ＭＳＲ１とＧＦＡＰ ＲＮＡｉが凝集体組成に対してこのような高度に一致した、相関性のある効果を示したという観察は、ＭＳＲ１が凝集を低下させる際の主な機能的標的がＧＦＡＰであるということに対して、説得力のある証拠を提供する。
薬剤ＭＳＲ１及びＭＳＲ２を、ヒト神経変性疾患のいくつかのＣ．エレガンスモデルでも試験した。Ｃ．エレガンスの筋肉に正常なヒトタウを発現するタウオパチーモデル株（ＶＨ２５５）では、タウの凝集が麻痺（刺激に反応して動くことができないこと）を引き起こしたが、１μＭのＭＳＲ１によって、又は、ＧＦＡＰの最も近い線虫ホモログであるｉｆｐ－１に対するｓｉＲＮＡで処理することによって、同程度に緩和された（図７Ｄ）。ＭＳＲ１はまた、ヒトＡβ42の汎ニューロン発現によって化学誘引物質への移動が障害される、Ｃ．エレガンスのニューロンアミロイドーシスモデル（ＣＬ２３５５）においても、走化性の有意な回復をもたらした。ＭＳＲ１を０．１μＭで添加することにより、走化性は約９０％まで回復し（図７ｅ）、野生型又は未誘導の虫体と同程度となった（図示せず）。筋肉にＱ４０：：ＹＦＰを発現する株では、年齢とともに蛍光を発する筋肉の凝集体が蓄積する。この株は、ハンチンチンタンパク質のポリグルタミンアレイの閾値までの拡大、すなわちヒトではハンチントン病、線虫では麻痺の症状を引き起こすのに十分な長さを模倣したものである。図７Ｆは、孵化後５日齢の各虫体における凝集強度を示す。１０μＭのＭＳＲ１では約５０％の減少であったのに対し、０．１μＭでは３５％の減少であった（それぞれの処理において、ビヒクルのみの対照とはＰ＜０．００５で差があった）。
【0047】
考察
加齢は、各種認知症だけでなく、高齢者に対して、また医療制度に対して大きな負担を強いる他の多くの生活習慣病にとっても、最も影響の大きい非遺伝的危険因子である（Ｎｉｃｃｏｌｉ ａｎｄ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ， ２０１２）。ＡＤ、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患、並びに高血圧（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｄ）、サルコペニア（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｃ）、更にはいくつかの癌（Ａｎｏ Ｂｏｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）さえも含む広範な疾患は、いずれも疾患特異的な「診断」タンパク質を特徴とする独特な凝集体の形成を示す。発明者らは、免疫精製した凝集体サブセット内の多くのタンパク質を同定し（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ）、架橋による凝集体内タンパク質－タンパク質界面の同定を行った（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。
加齢は、各種認知症だけでなく、高齢者に対して、また医療制度に対して大きな負担を強いる他の多くの生活習慣病にとっても、最も影響の大きい非遺伝的危険因子である（Ｎｉｃｃｏｌｉ ａｎｄ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ， ２０１２）。ＡＤ、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患、並びに高血圧（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｄ）、サルコペニア（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｃ）、更にはいくつかの癌（Ａｎｏ Ｂｏｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）さえも含む広範な疾患は、いずれも疾患特異的な「診断」タンパク質を特徴とする独特な凝集体の形成を示す。発明者らは、免疫精製した凝集体サブセット内の多くのタンパク質を同定し（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ）、架橋による凝集体内タンパク質－タンパク質界面の同定を行った（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。
【0048】
ＧＦＡＰは、年齢マッチ対照と比較してＡＤ凝集体に多量に存在する数多くのタンパク質の一つであるが（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ）、現在では、疾患特異的な過剰リン酸化を示す神経病理関連タンパク質の小さなセットに加えられている。これらには、タウ（ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ）、Ａβ1-42（ＡＤ）ＴＤＰ４３（ＡＬＳ）、及びαシヌクレイン（ＰＤ）が含まれる（Ａｙｙａｄｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ；Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１；Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２１；Ｍａｖｒｏｕｄｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；Ｓｔｅｒｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。発明者らは、ＡＤ（３，３）個体の海馬から単離された凝集体において高度にリン酸化されている３つのＧＦＡＰセリンを同定し、更に、ＡＤ（４，４）の凝集体でのみリン酸化が観察される、Ｎ末端及びＣ末端近傍の別のセリン及びスレオニンを同定した（図１Ｃ）。ＡＰＯＥ３又はＡＰＯＥ４ホモ接合体組織のみが調査対象であったが、ＡＰＯＥ３／Ｅ４ヘテロ接合体についても、中間的な結果を期待することが妥当である。
【0049】
ＡＤにおいてＧＦＡＰのリン酸化が観察された部位は、これまでにＡＤの発症に関与することが予測されてきたいくつかのキナーゼの既知の標的と一致している。これらには、ＡＫＴ２（２つの哺乳類ＡＫＴパラログのうちの１つ）、Ｒｈｏ関連キナーゼ１（ＲＯＣＫ１）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２（ＢＡＲＫ／ＧＲＫ２）、及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）が含まれる。インスリンシグナル伝達の変化がＡＤに関与するとされており、ＡＫＴはインスリン／インスリン様シグナルを伝達するキナーゼカスケードの重要な下流エフェクターである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｚｈｅｎｇ ａｎｄ Ｗａｎｇ， ２０２１）。ＧＲＫ２（ＢＡＲＫとしても知られる）もまた、心血管疾患の発症の一因であることが示された。ｃＡＭＰ依存性キナーゼであるＰＫＡは、複数のシグナル伝達経路に関与し、タウの過剰リン酸化に影響を及ぼし、ＡＤ、ＰＤ、及びＨＤを含むいくつかの神経変性疾患の進行に関与しているとされている（Ｃａｒｌｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｄａｇｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１；Ｇｒｅｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２１）。ＰＫＡは糖尿病（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、及び不安に関連した行動（Ｋｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）にも関与することが示されている。
【0050】
観察されたＧＦＡＰの過剰リン酸化の原因となり得るいくつかのキナーゼのノックダウンにより、Ｃ．エレガンス、及びアミロイド前駆体タンパク質を発現するヒト神経芽腫細胞において、タンパク質の凝集とそれに伴う生理的減退が緩和された。注意すべきは、これらと同じキナーゼのいくつかは、他のＡＤ関連タンパク質、例えば微小管関連タンパク質のタウなどに標的部位を有すると推定され、これによって更に影響力が増加すると予想されることである。これらのキナーゼがＡＤを助長する標的を複数持つということは、いくつかのキナーゼのノックダウンが、ＧＦＡＰそのもののノックダウンと比較して、より効果的なＡＤ様形質からの回復をもたらすという、図３Ｃ及び３Ｅに示す結果から示唆される。しかしながら、これらの実験では、ニューロンに対するｓｉＲＮＡノックダウンの有効性はモニターされておらず、典型的にはニューロンでは他の標的細胞よりも有効性が低いことから、前述の比較は誤解を招く可能性があることに注意されたい。
【0051】
今回のデータに基づくと、ＧＦＡＰは、ＡＤ及び他の凝集関連疾患における凝集負荷を軽減する、新規標的である。そこで、強力なフォールド認識と非経験的分子軌道法の手順によって予測されたＧＦＡＰの３次元構造から開始して、ＧＦＡＰを特異的に標的とする小分子をスクリーニングした（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。初期の最もΔＧの低い構造は、小さな、ドラッガブルなポケットを有する（図２Ａ）。ＧＦＡＰの構造について経時的な分子動力学シミュレーションを行ったところ、準安定状態への移行で結合空洞が初期容積の約３倍に拡大することが明らかになった。２００ナノ秒におけるＧＦＡＰの分子構造（図２Ｃ）を、薬剤スクリーニングの標的として選択した。シミュレーション中のＧＦＡＰ構造の変化をモニターするために、いくつかの記述子（ＲＭＳＤ、ＲＭＳＦ、及びポケット容積）を使用した。
【0052】
脳凝集体のプロテオミクスにより、ＡＤ組織由来のＧＦＡＰのリン酸化が顕著に異なっていることが示された。リン酸化模倣置換は実際のタンパク質のリン酸化を完全に模倣するものではないが、観察された擬似リン酸化部位を組み込んだＡＤ（３，３）及びＡＤ（４，４）の予測される構造のコンピューターシミュレーションは、リン酸化状態がＧＦＡＰの構造ダイナミクスを変化させ得るという仮説と矛盾がなかった。シミュレーションデータからは、個々のキナーゼ標的のリン酸化がＧＦＡＰ構造の不安定化にどの程度関与しているのか、あるいは、その後に修飾されるキナーゼ部位へのアクセスをどの程度促進し得るのかを推測することはできない。
【0053】
ＧＦＡＰ結合に関する３回の連続したスクリーニングから得られた上位３つの候補を試験し、また、チューブリンに結合する薬剤を除外するためのカウンタースクリーニングを行って、様々な凝集モデル系で有効性をテストした。各アッセイにおいては、これらのうち、ＭＳＲ１が、ＧＦＡＰノックダウン（ＧＦＡＰ又はその最も近い線虫ホモログに対するＲＮＡｉを使用）とほぼ同等の有効性を示し、また、凝集体のプロテオーム解析によれば、凝集体から枯渇又は排除されるタンパク質のセットもほぼ同じであることが明らかになった。
【0054】
これらの結果は、神経障害性凝集のヒト細胞モデル及びＣ．エレガンスモデルでのタンパク質の凝集に対する、ＧＦＡＰ及びその予測されるキナーゼの影響、そして、抗凝集効果のｉｎ ｖｉｖｏでの実証を示している。
【0055】
参考文献
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【配列表】
【国際調査報告】