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特表2025-500884変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド、ならびにそのコード遺伝子およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-15
(54)【発明の名称】変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド、ならびにそのコード遺伝子およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/04 20060101AFI20250107BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250107BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20250107BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20250107BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20250107BHJP
A01M 21/04 20060101ALI20250107BHJP
【ＦＩ】
C12N9/04 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/04
C12N15/53
C12N5/10
C12N15/29
C12N15/31
A01H1/00 A
A01M21/04 C
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535757
(86)(22)【出願日】2021-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-08-09
(86)【国際出願番号】 CN2021138425
(87)【国際公開番号】W WO2023108495
(87)【国際公開日】2023-06-22
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517284463
【氏名又は名称】ベイジン ダーベイノン バイオテクノロジー カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000970
【氏名又は名称】弁理士法人 楓国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シャオ シャン
(72)【発明者】
【氏名】ソン チンファン
(72)【発明者】
【氏名】タオ チン
(72)【発明者】
【氏名】ユ ツァイホン
【テーマコード（参考）】
2B121
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B121AA19
2B121CC05
2B121EA26
4B065AA88X
4B065AA88Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA47
(57)【要約】
本発明は、変異させたヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）ポリペプチド、ならびにそのコード遺伝子およびその使用に関する。変異させたＨＰＰＤポリペプチドは、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチジン酸またはホモゲンチセートへの転換を触媒する活性を保持しており、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも低い。配列番号１に示すアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列は、以下の部位におけるアミノ酸変異、すなわちＦ３７２部位がＡ、ＧまたはＶによって置換され、かつＦ３８３部位がＷによって置換されているアミノ酸変異を含む。本発明は、様々な種の供給源由来のＨＰＰＤポリペプチドの３７２部位および３８３部位における組合せ変異が、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する相乗的耐性を植物に賦与し得ることを初めて開示しており、植物におけるその施用の見込みは広範囲である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチジン酸またはホモゲンチセートへの転換を触媒する活性を保持し、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも低い変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置における以下のアミノ酸変異、すなわち、３７２位のＦをＡ、ＧまたはＶに置換、かつ３８３位のＦをＷに置換したアミノ酸変異を含むことを特徴とし、好ましくは、前記変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置に対応する以下の位置におけるアミノ酸変異、すなわち、３７２位のＦをＡに置換、かつ３８３位のＦをＷに置換したアミノ酸変異を含む、
変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項2】
前記変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドが第２の変異をさらに含むことを特徴とし、好ましくは、前記第２の変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置における以下のアミノ酸変異、すなわち、Ａ１０６Ｇ、Ａ１０７欠失、Ａ１１１Ｔ、またはＫ３５１Ｎのうちの少なくとも１つを含む、
請求項１に記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項3】
前記変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドが、配列番号１７３、配列番号１８２、配列番号１８５、配列番号１８８、配列番号１９１、配列番号１９４、配列番号１９７、配列番号２００または配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項4】
前記変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドが、植物または微生物の野生型ＨＰＰＤに由来することを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項5】
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項6】
効果的に連結された制御配列の制御下にある請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、発現カセットまたは組換えベクター。
【請求項7】
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドを、請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド以外の少なくとも１つの除草剤耐性タンパク質と共に発現させることを含むことを特徴とする、植物が耐性を有する除草剤の範囲を拡大する方法。
【請求項8】
前記除草剤耐性タンパク質が、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＥＰＳＰＳ）、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクロム様タンパク質、および／またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであることを特徴とする、請求項７に記載の、植物が耐性を有する除草剤の範囲を拡大する方法。
【請求項9】
形質転換植物細胞を選択する方法であって、請求項５に記載のポリヌクレオチドで複数の植物細胞を形質転換することと、前記ポリヌクレオチドを発現する前記形質転換細胞の増殖を可能にするある濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤の下で前記細胞を培養する一方で、非形質転換細胞を死滅させるか、または非形質転換細胞の増殖を阻害することとを含むことを特徴とし、好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
形質転換植物細胞を選択する方法。
【請求項10】
雑草の防除方法であって、標的植物が植栽されている圃場に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用することを含み、前記標的植物は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とし、好ましくは、前記標的植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草であり、
好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
雑草の防除方法。
【請求項11】
ＨＰＰＤ阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与する方法であって、請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載の発現カセットまたは組換えベクターを植物に導入し、導入後の前記植物に十分な量の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドを産生させて、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤によって生じる損傷から前記植物を保護することを含むことを特徴とし、好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
方法。
【請求項12】
ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある植物の作製方法であって、請求項５に記載のポリヌクレオチドを前記植物のゲノムに導入することを含むことを特徴とし、好ましくは、前記導入の方法は、遺伝子形質転換、ゲノム編集、または遺伝子変異法を含み、
好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
作製方法。
【請求項13】
ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある植物の栽培方法であって、請求項５に記載のポリヌクレオチドをゲノムが含有する植物繁殖体を少なくとも１つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に生育することと、
少なくとも前記植物を含む植物生育環境に有効量の前記ＨＰＰＤ阻害除草剤を施用し、請求項５に記載のポリヌクレオチドがない他の植物と比較して、植物損傷が低減しかつ／または植物収量が増加した前記植物を収穫することと
を含むことを特徴とし、
好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
栽培方法。
【請求項14】
加工農産物を得る方法であって、請求項１３に記載の方法によって得られたＨＰＰＤ阻害除草剤耐性植物の収穫物を処理して加工農産物を得ることを含むことを特徴とする、方法。
【請求項15】
雑草の生育を防除する植栽システムであって、ＨＰＰＤ阻害除草剤と、少なくとも１つの標的植物が存在する植物生育環境とを含み、前記標的植物は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とし、好ましくは、前記標的植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草であり、
好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
植栽システム。
【請求項16】
ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するための請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドの使用であって、好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含み、より好ましくは、前記ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、前記イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、前記トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド、そのコード遺伝子およびその使用に関し、特に、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド、そのコード遺伝子およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ、ＨＰＰＤと略す）は、鉄イオン（Ｆｅ２＋）と酸素の存在下で、チロシン分解生成物である４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ、ＨＰＰと略す）が、トコフェロールおよびプラストキノン（ｐｌａｓｔｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱと略す）の植物内前駆体であるホモゲンチジン酸／ホモゲンチセート（ｈｏｍｏｇｅｎｔｉｓａｔｅ、ＨＧと略す）に変換される反応を触媒する酵素である。トコフェロールは膜関連の抗酸化物質として作用する。ＰＱは、ＰＳＩＩとシトクロムｂ６／ｆ複合体との間の電子伝達体として作用するだけでなく、カロテノイドの生合成に関与するフィトエンデサチュラーゼの必須補因子としても作用する。
【0003】
ＨＰＰＤを阻害することによって作用する除草剤としては、主に、トリケトン類、イソキサゾール類、およびピラゾリネート類の３つの化学ファミリーが挙げられる。ＨＰＰＤを阻害すると、植物中のチロシンからのＰＱの生合成が阻止され、そのため、ＰＱが枯渇し、カロテノイドが欠乏する。ＨＰＰＤ阻害除草剤は、光に曝露された新しい成長点および葉を白く出現させる植物師部移動性の漂白剤である。カロテノイドは光防御に不可欠である。カロテノイドの非存在下では、クロロフィルの合成と機能が紫外線と活性酸素中間体によって妨害されるため、植物の生育が抑制され、さらには枯死につながる。
【0004】
ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある植物を提供する方法としては、以下のものが挙げられる。１）ＨＰＰＤ酵素の阻害剤が存在してもその機能性酵素を必要なだけ利用可能にするために、ＨＰＰＤ阻害除草剤との関係において十分な量のＨＰＰＤ酵素が植物中で産生されるようにＨＰＰＤ酵素を過剰発現させる。２）標的ＨＰＰＤ酵素を、除草剤またはその活性代謝産物に対する感受性が低いがＨＧへの変換能力を保持している機能性ＨＰＰＤに変異させる。従来技術ではいくつかの変異ＨＰＰＤポリペプチドが報告されており、変異ＨＰＰＤポリペプチドは、それらが由来する元の野生型配列に対して１つまたは複数の位置にアミノ酸変異を有し、１つまたは複数のＨＰＰＤ阻害除草剤に対して向上した耐性を示す。さらに、従来技術では、２つのアミノ酸変異を組み合わせることによって得られた変異ＨＰＰＤポリペプチドは、その２つのアミノ酸変異のいずれかを単独で有するＨＰＰＤポリペプチドよりも、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して高い耐性を示すことがさらに報告されている。しかし、様々な種に由来し、エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）野生型ＨＰＰＤポリペプチドの３７２位および３８３位における変異の組合せを含むＨＰＰＤポリペプチドにより、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して、相乗的に向上した耐性を植物が示し得る可能性があることはまだ報告されてない。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は、新規の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド、そのコード遺伝子およびその使用を提供することである。変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドは、ＨＰＰＤ酵素活性を有するだけでなく、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された植物が、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して相乗的に向上した耐性を示すことを可能にする。
【0006】
上記目的を達成するために、本発明は、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸をホモゲンチジン酸またはホモゲンチセートに変換する反応を触媒する活性を保持し、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも低い変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列の以下の位置におけるアミノ酸変異、すなわち、３７２位のＦをＡ、ＧまたはＶに置換、かつ３８３位のＦをＷに置換したアミノ酸変異を含む変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドを提供する。
【0007】
好ましくは、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の以下の位置におけるアミノ酸変異、すなわち、３７２位のＦをＡに置換、かつ３８３位のＦをＷに置換したアミノ酸変異を含む。
【0008】
上記の技術的解決法に基づいて、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドは、第２の変異を含むことができる。
【0009】
好ましくは、第２の変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置における以下のアミノ酸変異、すなわち、Ａ１０６Ｇ、Ａ１０７欠失、Ａ１１１Ｔ、またはＫ３５１Ｎのうちの少なくとも１つを含む。
【0010】
特に、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドは、配列番号１７３、配列番号１８２、配列番号１８５、配列番号１８８、配列番号１９１、配列番号１９４、配列番号１９７、配列番号２００または配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【0011】
さらに、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドは、植物または微生物の野生型ＨＰＰＤに由来する。
【0012】
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、前記植物は、エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ヒヨコマメ（ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【0013】
好ましくは、前記微生物はシュードモナス・フルオレセンスである。
【0014】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0015】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、効果的に連結された制御配列の制御下にある前記ポリヌクレオチドを含む発現カセットまたは組換えベクターを提供する。
【0016】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドを、前記変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド以外の少なくとも１つの除草剤耐性タンパク質と共に発現させることを含む方法であって、植物が耐性を有する除草剤の範囲を拡大する方法を提供する。
【0017】
さらに、前記除草剤耐性タンパク質は、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＥＰＳＰＳ）、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクロム様タンパク質、および／またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである。
【0018】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、形質転換植物細胞を選択する方法であって、複数の植物細胞を前記ポリヌクレオチドで形質転換することと、前記ポリヌクレオチドを発現する形質転換細胞の増殖を可能にするある濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤の下で前記細胞を培養する一方で、非形質転換細胞を死滅させるか、または非形質転換細胞の増殖を阻害することとを含む方法を提供する。
【0019】
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、前記植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
【0020】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害剤除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、形質転換ダイズ植物細胞を選択する方法は、複数のダイズ植物細胞を前記ポリヌクレオチドで形質転換することと、前記ポリヌクレオチドを発現する形質転換細胞の増殖を可能にし、非形質転換細胞を死滅させるか、または非形質転換細胞の増殖を阻害するある濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤で前記細胞を培養することとを含み、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、トプラメゾン、メソトリオン、またはイソキサフルトールである。
【0021】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、雑草の防除方法であって、標的植物が植栽されている圃場に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用することを含み、標的植物は前記ポリヌクレオチドを含有する防除方法を提供する。
【0022】
好ましくは、標的植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、標的植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。さらに好ましくは、標的植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草である。
【0023】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、雑草の防除方法は、ダイズ植物が生育されている圃場に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用することを含み、ダイズ植物は前記ポリヌクレオチドを含み、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、トプラメゾン、メソトリオン、またはイソキサフルトールである。
【0024】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、ＨＰＰＤ阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与する方法であって、前記ポリヌクレオチドまたは発現カセットまたは組換えベクターを植物に導入し、導入後のその植物に十分な量の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドを産生させて、ＨＰＰＤ阻害除草剤によって生じる損傷から前記植物を保護することを含む方法を提供する。
【0025】
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、前記植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
【0026】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害剤除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物に付与する方法は、ポリヌクレオチドまたは発現カセットまたは組換えベクターをダイズ植物に導入し、その結果、ポリヌクレオチドまたは発現カセットまたは組換えベクターを導入したダイズ植物をＨＰＰＤ阻害除草剤の損傷から保護するのに十分な量の変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドを生じることを含み、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、トプラメゾン、メソトリオン、またはイソキサフルトールである。上記目的を達成するために、本発明はさらに、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある植物の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドを前記植物のゲノムに導入することを含む作製方法を提供する。
【0027】
好ましくは、導入の方法は、遺伝子形質転換、ゲノム編集、または遺伝子変異法を含む。
【0028】
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、前記植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
【0029】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害剤除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性があるダイズ植物の生成方法は、前記ポリヌクレオチドをダイズ植物のゲノムに導入することを含み、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤は、トプラメゾン、メソトリオン、またはイソキサフルトールである。
【0030】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある植物の栽培方法であって、
前記ポリヌクレオチドをゲノムが含有する植物繁殖体を少なくとも１つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に生育することと、
少なくとも前記植物を含む植物生育環境に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用し、前記ポリヌクレオチドがない他の植物と比較して、植物損傷が低減しかつ／または植物収量が増加した前記植物を収穫することと
を含む栽培方法を提供する。
前記ポリヌクレオチドをゲノムが含有する植物繁殖体を少なくとも１つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に生育することと、
少なくとも前記植物を含む植物生育環境に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用し、前記ポリヌクレオチドがない他の植物と比較して、植物損傷が低減しかつ／または植物収量が増加した前記植物を収穫することと
を含む栽培方法を提供する。
【0031】
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、前記植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
【0032】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害剤除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性があるダイズ植物の栽培方法は、前記ポリヌクレオチドをゲノム中に含む少なくとも１つのダイズ植物種子を植栽することと、前記ダイズ植物種子をダイズ植物に生育することと、少なくとも前記ダイズ植物を含む植物生育環境に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用し、前記ポリヌクレオチドを含まない他のダイズ植物と比較して、植物損傷が低減し、かつ／または植物収量が増加した前記ダイズ植物を収穫することとを含み、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、トプラメゾン、メソトリオン、またはイソキサフルトールである。
【0033】
本発明はまた、加工農産物を得る方法であって、上記方法によって得られたＨＰＰＤ阻害除草剤耐性植物の収穫物を処理して加工農産物を得ることを含む方法を提供する。
【0034】
上記目的を達成するために、本発明はさらに、雑草の生育を防除する植栽システムであって、ＨＰＰＤ阻害除草剤と、少なくとも１つの標的植物が存在する植物生育環境とを含み、標的植物は前記ポリヌクレオチドを含有する植栽システムを提供する。
【0035】
好ましくは、標的植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、標的植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。さらに好ましくは、標的植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草である。
【0036】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害剤除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、雑草の生育を防除する植栽システムは、ＨＰＰＤ阻害除草剤と、少なくとも１つのダイズ植物が存在する植物生育環境とを含み、ダイズ植物は前記ポリヌクレオチドを含有し、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、トプラメゾン、イソキサフルトール、またはメソトリオンである。上記目的を達成するために、本発明はさらに、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するための変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドの使用を提供する。
【0037】
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。より好ましくは、前記植物は、エンバク、コムギ、オオムギ、キビ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
【0038】
好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、ピラゾリネート類、トリケトン類および／またはイソキサゾール類のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤を含む。より好ましくは、ピラゾリネート類のＨＰＰＤ阻害除草剤はトプラメゾンであり、イソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトールであり、トリケトン類のＨＰＰＤ阻害剤除草剤はメソトリオンである。特に好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物に付与するための変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドの使用において、ＨＰＰＤ阻害除草剤は、トプラメゾン、イソキサフルトール、またはメソトリオンである。
【0039】
本明細書で用いる「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例えば、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つまたは複数の要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ））を意味する。さらに、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という用語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形語は、記載された要素、整数もしくは工程、または、要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる要素、整数もしくは工程、または、要素、整数もしくは工程の群も除外することを意味しないと理解すべきである。
【0040】
本発明の文脈において、「ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）」、「４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（４－ＨＰＰＤ）」および「ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ｐ－ＨＰＰＤ）」という用語は、同義である。
【0041】
「ＨＰＰＤ阻害除草剤」という用語は、直接的または間接的に作用してＨＰＰＤを阻害する除草剤を指し、この場合、この除草剤は漂白剤である。市販されているほとんどのＨＰＰＤ阻害除草剤は、以下に列挙する３つの化学ファミリーのうちの１つに属する。（１）トリケトン類、例えばスルコトリオン（すなわち、２－［２－クロロ－４－（メチルスルホニル）ベンゾイル］－１，３－シクロヘキサン－－ジオン）、メソトリオン（すなわち、２－［４－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンゾイル］－１，３－シクロヘキサンジオン）、テンボトリオン（すなわち、２－［２－クロロ－４－（メチルスルホニル）－３－［（２，２，２－トリフルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］－－１，３－シクロヘキサンジオン）；（２）イソキサゾール類、例えばイソキサフルトール（すなわち、（５－シクロプロピル－４－イソキサゾリル）［２－－（メチルスルホニル）－４－（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン）；（３）ピラゾリネート類、例えば、トプラメゾン（すなわち、［３－（４，５－ジヒドロ－３－イソキサゾリル）－２－メチル－４－（メチルスルホニル）フェニル］（５－ヒドロキシ－１－メチル－－ピラゾール－４－イル）メタノン）、ピラスルホトール（すなわち、（５－ヒドロキシ－１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）（２－メチル－－スルホニル－４－（トリフルオロメチルフェニル）メタノン）。
【0042】
本明細書で用いる場合、トプラメゾン（ＢＡＳ－６７０Ｈとしても知られる）は、白色結晶性固体である［３－（４，５－ジヒドロ－３－イソキサゾリル）－２－メチル－４－（メチルスルホニル）フェニル］（５－ヒドロキシ－１－メチル－ピラゾール－４－イル）メタノンを指す。これは、通常の剤形である３０％懸濁濃縮液において、茎および葉を出芽後処理するためのピラゾリネート類の浸透移行性の伝導型ＨＰＰＤ阻害除草剤である。トプラメゾンの市販製剤（トプラメゾンＳＣなど）は、１エーカーあたり５．６～６．７ｇで、イネ科雑草および広葉雑草の防除に使用することができる。効果的に防除することができる雑草としては、オニメヒシバ（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ ｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ（Ｃａｌａｔｈｏｄｅｓ ｏｘｙｃａｒｐａ））、イヌビエ（Ｂａｒｎｙａｒｄ ｇｒａｓｓ）、オヒシバ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｉｎｄｉｃａ Ｇａｅｒｔｎ）、ナルコビエ（Ｅｒｉｏｃｈｌｏａ ｖｉｌｌｏｓａ）、エノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ）（アキノエノコログサ（Ｇｉａｎｔ ｆｏｘｔａｉｌ））、シロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）、イチビ（Ａｂｕｔｉｌｏｎ ａｖｉｃｅｎｎａｅ）、イチビ（Ａｂｕｔｉｌｏｎ ｔｈｅｏｐｈｒａｓｔｉ）、アカザ（Ｐｉｇｗｅｅｄ）、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ ｓｔｒｕｍａｒｉｕｍ）、およびイヌホオズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。トプラメゾンＳＣとアトラジンとを組み合わせると、効果を著しく向上させることができる。前述の雑草に対する優れた効力とは別に、トプラメゾンはまた、極めて有害な広葉雑草、例えばセファラノプロス・セゲツム・キタム（Ｃｅｐｈａｌａｎｏｐｌｏｓ ｓｅｇｅｔｕｍ Ｋｉｔａｍ）（Ｃｉｒｓｉｕｍ ｓｅｇｅｓｔｕｍ）、ソンクス・アルベンシス（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）、エノキグサ（Ａｃａｌｙｐｈａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、およびツユクサ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（Ａｓｉａｔｉｃ ｄａｙｆｌｏｗｅｒ）に対して良好な防除効果をもたらすことができ、特にメソトリオンによる防除が困難なエノコログサ、オニメヒシバ、オヒシバ、およびナルコビエを効果的に防除することができる。
【0043】
本明細書で用いる場合、「有効量」のトプラメゾンとは、２５～２００ｇ ａｉ／ｈａの範囲、例えば２５～５０ｇ ａｉ／ｈａ、５０～１００ｇ ａｉ／ｈａ、１００～１５０ｇ ａｉ／ｈａまたは１５０～２００ｇ ａｉ／ｈａの量で使用されることを意味する。
【0044】
本明細書で用いる場合、イソキサフルトールは、白色から淡黄色の固体である５－シクロプロピル－４－イソキサゾリル）［２－（メチルスルホニル）－４－（トリフルオロメチル）フェニル］メタノンを指す。これは有機複素環式イソキサゾール類の選択的な浸透移行性の出芽前ＨＰＰＤ阻害除草剤であり、主として、若い雑草の根を介して吸収され移行することによって作用する。イソキサフルトールは主に、多様な一年生の広葉雑草、例えばイチビ、シロザ、ホウキギ、サルソラ・アルブシュラ（Ｓａｌｓｏｌａ ａｒｂｕｓｃｕｌａ）、イヌホオズキ、アオゲイトウ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓ）、ポリゴヌム・ブンゲアヌム（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍ）、コセンダングサ（Ｂｉｄｅｎｓ ｐｉｌｏｓａ）、スベリヒユ、ハコベ（Ｃｈｉｃｋｗｅｅｄ）、ナギナタコウジュ（Ｅｌｓｈｏｌｔｚｉａ）、オナモミ、エノキグサ、ルリハッカ（Ａｍｅｔｈｙｓｔｅａ ｃａｅｒｕｌｅａ）、オオイヌタデ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ Ｌａｐａｔｈｉｆｏｌｉｕｍ）、およびイヌノフグリ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｏｌｉｔａ）を、乾燥地作物の圃場において防除するのに有用であり、また、いくつかの一年生のイネ科雑草、例えばオニメヒシバ、イヌビエ、オヒシバ、アゼガヤ（Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、アキノエノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｆａｂｅｒｉ）、およびエノコログサに対しても良好な防除効力を有する。
【0045】
本明細書で用いる場合、「有効量」のイソキサフルトールとは、３５～２８０ｇ ａｉ／ｈａの範囲、例えば３５～７０ｇ ａｉ／ｈａ、７０～１４０ｇ ａｉ／ｈａ、１４０～２００ｇ ａｉ／ｈａまたは２００～２８０ｇ ａｉ／ｈａの量で使用されることを意味する。
【0046】
本明細書で用いる場合、「メソトリオン」とは、褐色または薄黄色の固体である２－［４－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンゾイル］－１，３－シクロヘキサンジオンを指す。これは、植物における出芽前および出芽後両方の雑草防除を提供するトリケトン類の選択的な浸透移行性の伝導型ＨＰＰＤ阻害除草剤である。メソトリオンは、葉および根を通して植物に吸収され、上部から下部へ下向きに移行し、その結果、除草剤施用から３～５日後に成長点のクロロシス（黄変）の症状に続いてネクローシス（死滅組織）を生じさせ、さらに植物全体を枯死させることができる。メソトリオンは、植物における一年生広葉雑草およびイネ科雑草の出芽前および出芽後の防除に有用であり、防除することができる一年生の広葉雑草には、主に、オナモミ、イチビ、シロザ、アマランス（ａｍａｒａｎｔｈ）、タデ科、イヌホオズキ、およびオオブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ）が含まれ、防除することができるイネ科雑草には、主に、幼齢のイヌビエ、オニメヒシバ、エノコログサおよびブラキアリア・デクンベンス（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）が含まれる。
【0047】
本明細書で用いる場合、「有効量」のメソトリオンとは、５２．５～４２０ｇ ａｉ／ｈａの範囲、例えば５２．５～１０５ｇ ａｉ／ｈａ、１０５～２１０ｇ ａｉ／ｈａ、２１０～３００ｇ ａｉ／ｈａまたは３００～４２０ｇ ａｉ／ｈａの量で使用されることを意味する。
【0048】
本明細書で用いる場合、「抵抗性」という用語は、遺伝性であり、通常の除草剤を用いた効果的な処理が所与の植物に行われる状況下でも、植物が生育し繁殖することを可能にする。当業者に認識されるように、除草剤で処理された所与の植物に、ある程度の損傷（小さなネクローシス、溶解またはクロロシスなどの損傷）があっても、少なくとも収量が著しく損なわれていなければ、植物は依然として「抵抗性である」とみなすことができる。言い換えれば、所与の植物は、除草剤によって誘発される多様な程度の損傷に抵抗する能力が高まっており、一般に、同じ用量の除草剤でも、同じ遺伝子型の野生型植物に対しては損傷が生じ得る。本発明における「耐性の」または「耐性」という用語は、「抵抗性」という用語よりも広義であり、「抵抗性」を含む。
【0049】
本明細書で用いる場合、「付与する」という用語は、特性または形質、例えば除草剤耐性および／またはその他の望ましい形質を植物に提供することを指す。
【0050】
本明細書で用いる場合、「異種」という用語は、別の供給源由来のものを意味する。ＤＮＡの文脈では、「異種」とは、同じ種の別の植物由来のものを含め、外来の任意の「非自己」ＤＮＡを指す。例えば、本発明において、遺伝子導入法によってダイズ植物で発現させることができるダイズＨＰＰＤ遺伝子は、やはり「異種」ＤＮＡとみなされる。
【0051】
本明細書で用いる場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを含み、特に明記しない限り、野生型ヌクレオチドの本質的特性を有し、野生型のヌクレオチドと同様の様式で一本鎖の核酸にハイブリダイズする既知の類似体（例えばペプチド核酸）を包含する。
【0052】
本明細書で用いる場合、「コードする」または「コードされた」という用語は、特定の核酸の文脈で用いられる場合、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を指示するために、核酸が必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされた情報は、コドンの使用によって特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えばイントロン）を含む場合もあれば、またはそのような介在非翻訳配列がない場合もある（例えばｃＤＮＡ中のように）。
【0053】
本発明のタンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含め、多様な方法で変えられてもよい。例えば、変異ＨＰＰＤタンパク質のアミノ酸配列バリアントおよび断片は、ＤＮＡにおける変異によって調製することができる。ポリヌクレオチド変異の誘導方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に多くの場合で影響を与えない適当なアミノ酸置換に関する指針が、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が最適であり得る。
【0054】
本明細書に記載するように、変異ＨＰＰＤポリペプチドまたはそのバリアントおよびその断片は、ＨＰＰＤ酵素活性を有し、特定のクラスのＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与する。変異ＨＰＰＤポリペプチドは、それらが由来する出発野生型配列に対して１つまたは複数の位置でアミノ酸が変化しており、１つまたは複数のＨＰＰＤ阻害除草剤に対する向上した耐性を示す。少なくとも１つのＨＰＰＤ阻害除草剤に対して向上した耐性を示すＨＰＰＤ酵素は、類似した未変異の出発酵素に対し、特定の特徴を示すことによってその耐性を示している可能性がある。
【0055】
このような変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、未変異の出発酵素を同様に発現している類似植物と比較して、１つまたは複数のＨＰＰＤ阻害除草剤に対する向上した耐性をもたらす本発明の植物、植物細胞および種子の提供において用いられる。
【0056】
このような変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする植物ＨＰＰＤ遺伝子は、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性がある植物を生成するのに有用である。上記のように修飾された植物ＨＰＰＤ遺伝子は、植物に除草剤耐性を付与するための植物内発現に特に適している。
【0057】
多くのＨＰＰＤ配列が当技術分野で既知であり、これらを用いて、対応するアミノ酸において置換、欠失および／または付加を生じさせることにより、変異ＨＰＰＤ配列を生成することができる。基準である配列番号１に記載のエンバクの野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列のアミノ酸３７２位または３８３位を用いて、本発明の３７２位および３８３位が算出される。本発明による変異ＨＰＰＤポリペプチドは、配列番号１の３７２位および３８３位に対応するアミノ酸位置における組合せ変異を含み、組合せ変異は、３７２位におけるＦのＡ、ＧまたはＶによる置換、および３８３位におけるＦのＷによる置換を含む。好ましくは、前記変異は、３７２位におけるＦのＡによる置換、および３８３位におけるＦのＷによる置換を含む。したがって、標準的な配列アライメントツールを用いて、既知のまたは疑われるＨＰＰＤ配列を配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントすることができ、本明細書に記載の配列番号１に記載されるアミノ酸配列に対して対応するアミノ酸における置換または欠失は、既知のまたは疑われるＨＰＰＤ配列において生じさせることができる。
【0058】
本発明は、変異ＨＰＰＤポリペプチドであって、植物または微生物中のＨＰＰＤに由来し、ＨＰＰＤ酵素活性を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも３７２位および３８３位における組合せ変異を含み、任意選択でさらに、他の位置（ＨＰＰＤポリペプチド中に存在する対応する位置）における変異と組み合わせて、例えば、以下の対応する位置における１つまたは複数の変異、すなわちエンバク由来のＨＰＰＤのアミノ酸配列におけるＡ１０６Ｇ、Ａ１０７欠失、Ａ１１１ＴまたはＫ３５１Ｎと組み合わせて、前記組合せ変異を含む変異ＨＰＰＤポリペプチドを含む。上記の多様な実施形態において、３７２位および３８３位における組合せ変異は、Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ、Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３Ｗ、またはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗであってもよい。３７２位および３８３位における組合せ変異と他の位置における変異とにおける組合せ変異は、Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ＋Ａ１０７欠失、Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ＋Ａ１１１Ｔ、Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ＋Ａ１０６Ｇ、Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ＋Ａ１０６Ｇ＋Ｋ３５１Ｎ、Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ＋Ａ１０７欠失＋Ｋ３５１Ｎ、またはＦ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ＋Ａ１１１Ｔ＋Ｋ３５１Ｎを含む。さらに、本発明は、様々な種または同一種内の様々な生態型の植物または微生物のＨＰＰＤに由来する（置換、欠失および／または付加による）変異ＨＰＰＤポリペプチドを含む。同一種内の様々な生態型由来の例示的なＨＰＰＤとしては、以下に限定されないが、以下の種内の生態型由来のＨＰＰＤが挙げられる。すなわち、受入番号がＸＰ＿００３６１７３９１．２、ＡＡＸ５９００６．１、ＸＰ＿００３６１７３８４．１、ＸＰ＿０１３４６６１１５．１、ＡＥＴ００３４２．２、またはＡ０Ａ３９６ＨＷＨ５である様々な生態型のアルファルファ由来のＨＰＰＤ；受入番号がＡ０Ａ０Ｄ２ＰＷＱ６、Ａ０Ａ２Ｐ５ＳＩ６６、Ａ０Ａ０Ｄ２ＬＷＮ１、またはＡ０Ａ０Ｄ２Ｎ７Ｆ６である様々な生態型のワタ由来のＨＰＰＤ；受入番号がＶＤＣ６４４１７．１、ＣＤＹ１０２１０．１、ＡＦＢ７４２０８．１、ＸＰ＿０１３６９５６４０．１、ＸＰ＿０１３６９５６４１．１、ＲＩＤ４０４０６．１、ＲＩＤ４８９３２．１、ＸＰ＿００９１１８５３３．１、ＸＰ＿００９１１９０４９．１、ＸＰ＿０１３７２３２３７．１、ＡＦＢ７４２１８．１、またはＡＦＢ７４２０７．１である様々な生態型のアブラナ由来のＨＰＰＤ；受入番号がＡ５Ｚ１Ｎ７、Ｉ１Ｍ６Ｚ４、Ａ０Ａ０８８ＭＧＨ９、またはＩ１Ｍ６Ｚ５である様々な生態型のダイズ由来のＨＰＰＤ；受入番号がＸＰ＿００９７７００８８．１またはＸＰ＿００９５８７２０３．１である様々な生態型のタバコ由来のＨＰＰＤ；受入番号がＡ３Ａ３Ｊ１、Ｂ８ＡＩＨ６、またはＡ０Ａ０Ｅ０Ｇ１Ｗ２である様々な生態型のイネ由来のＨＰＰＤ；受入番号がＢＡＪ８６７３２．１、ＢＡＪ９５７１４．１、またはＦ２Ｅ４１２である様々な生態型のオオムギ由来のＨＰＰＤが挙げられる（これらの受入番号は、ジェンバンク・データベースまたはユニプロット・ナレッジベース（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ）・データベースで入手可能である）。
【0059】
「３７２位」、「３７２番目」、または「３７２単一位置」という用語は、狭義で、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸（フェニルアラニン）を指すだけでなく、広義で、標準的な配列アライメントツール（ＣＬＵＳＴＡＬソフトウェアなど）を用いて、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントすることができる既知のまたは疑われるＨＰＰＤアミノ酸配列において得られた、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸に対応する位置も含み、これは、そのＨＰＰＤのアミノ酸配列の３７２位ではない場合がある。
【0060】
「３８３位」、「３８３番目」、または「３８３単一位置」という用語は、狭義で、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸（フェニルアラニン）を指すだけでなく、広義で、標準的な配列アライメントツール（ＣＬＵＳＴＡＬソフトウェアなど）を用いて、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントすることができる既知のまたは疑われるＨＰＰＤアミノ酸配列において得られた、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸に対応する位置も含み、これは、そのＨＰＰＤのアミノ酸配列の３８３位ではない場合がある。
【0061】
「４１５位」、「４１５番目」、または「４１５単一位置」という用語は、狭義で、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４１５位のアミノ酸（フェニルアラニン）を指すだけでなく、広義で、標準的な配列アライメントツール（ＣＬＵＳＴＡＬソフトウェアなど）を用いて、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントすることができる既知のまたは疑われるＨＰＰＤアミノ酸配列において得られた、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４１５位のアミノ酸に対応する位置も含み、これは、そのＨＰＰＤのアミノ酸配列の４１５位ではない場合がある。
【0062】
同様に、「３７２位」または「３７２番目」に関する上記の解釈は、他の位置のものにも適用される。
【0063】
「に対応する」とは、標準的な配列アライメントツールを用いて、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、様々な種または同一種内の様々な生態型に由来するＨＰＰＤアミノ酸配列とをアライメントすることによって得た、配列番号１に記載のアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する位置を指し、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３７２位または３８３位のアミノ酸に対応する位置を指す。
【0064】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、それに対応する野生型アミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに野生型アミノ酸ポリマーに適用される。本発明のポリペプチドは、本明細書に開示する核酸から作製することができ、または標準的な分子生物学的技術によって作製することができる。例えば、本発明の切断タンパク質は、適当な宿主細胞における本発明の組換え核酸の発現によって、あるいは、プロテアーゼ消化および精製など、エクスビボ手順を組み合わせることによって作製することができる。
【0065】
したがって、本発明はまた、ＨＰＰＤの酵素活性を有する変異HPPDポリペプチドであって、ＨＰＰＤを阻害する特定のクラスの除草剤に対する耐性を植物内で付与する変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにそのバリアントおよび断片を提供する。一般に、本発明は、本明細書に記載の変異ＨＰＰＤポリペプチドのいずれかをコードする任意のポリヌクレオチド配列、ならびに本明細書に記載の変異ＨＨＰＤポリペプチドに対する保存的アミノ酸置換を１つまたは複数有するＨＰＰＤポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド配列を含む。機能的に同様であるアミノ酸を提供する保存的置換体は、当技術分野で周知である。以下の五つの群はそれぞれ、互いに保存的置換体であるアミノ酸を含む。脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；イオウ含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【0066】
一実施形態において、本発明は、植物または微生物中のＨＰＰＤに由来するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を提供し、当該ポリペプチドは、ＨＰＰＤ酵素活性を有し、少なくとも配列番号１の３７２位および３８３位のアミノ酸に対応する位置における組合せ変異を含む。
【0067】
したがって、本発明の変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする遺伝子にハイブリダイズし、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性活性を有する配列が、本発明の中に含まれる。例示的な配列は、本発明の配列番号１１～１２、配列番号３３～３４、配列番号４５～４６、配列番号５７～５８、配列番号６９～７０、配列番号８１～８２、配列番号９３～９４、配列番号１０５～１０６、配列番号１１７～１１８、配列番号１２９～１３０、配列番号１４１～１４２、配列番号１５３～１５４、配列番号１５９～１６０、配列番号１６５～１６６、配列番号１７４～１７５、配列番号１８３～１８４、配列番号１８６～１８７、配列番号１８９～１９０、配列番号１９２～１９３、配列番号１９５～１９６、配列番号１９８～１９９、配列番号２０１～２０２、および配列番号２０４～２０５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含む。
【0068】
任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅法を用いて、本発明の変異ＨＰＰＤ遺伝子の存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で、他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本発明において、２つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することができれば、これら２つの核酸分子は、互いに特異的にハイブリダイズし得るとみなすことができる。２つの核酸分子が完全な相補性を示せば、２つのうちの一方の核酸分子は、他方の核酸分子の「相補体」であると言う。本発明において、核酸分子の各ヌクレオチドが別の核酸分子の対応するヌクレオチドと相補的である場合、これら２つの核酸分子は「完全相補性」を示すと言う。２つの核酸分子が、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールし結合するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができれば、これら２つの核酸分子は「最小相補的」であると言う。同様に、２つの核酸分子が、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールし結合するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができれば、これら２つの核酸分子は「相補的」であると言う。完全相補性からのずれは、このずれによって２分子が二本鎖構造を形成することを完全に妨げられない限り、許容される。核酸分子をプライマーまたはプローブとして作用可能にするためには、特定の溶媒および塩濃度の条件下で安定した二本鎖構造が形成されるように、分子がその配列において十分な相補性を有することを確保するだけである。
【0069】
本発明において、実質的に相同な配列とは、高ストリンジェンシー条件下で、適合した核酸分子の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる核酸分子のことである。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件は当業者に周知であり、例えば、適切なストリンジェントな条件は、約４５℃の条件下で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）で処理し、次いで５０℃の条件下、２．０×ＳＳＣで洗浄することによって達成され得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約２．０×ＳＳＣで５０℃の低ストリンジェンシー条件から、約０．２×ＳＳＣで５０℃の高ストリンジェンシー条件までで選択することができる。また、洗浄工程の温度条件は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度条件と塩濃度のどちらも変えることができ、その２つのうちの一方を変えずに、他方を変えることも可能である。好ましくは、本発明におけるストリンジェントな条件は、６５℃の６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ溶液中で、本発明の変異ＨＰＰＤ遺伝子に特異的にハイブリダイズさせ、次いで、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、そして１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１回ずつ、膜を洗浄することによって達成され得る。
【0070】
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡの中に特定のヌクレオチド配列が存在する場合に、ストリンジェントな条件下で、その配列のみに分子が結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
【0071】
遺伝コドンの縮重により、多様な異なるＤＮＡ配列が同じアミノ酸配列をコードする場合がある。同じかまたは実質的に同じタンパク質をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を作製することは、当業者の技術範囲内である。これらの異なるＤＮＡ配列は、本発明の範囲に含まれる。「実質的に同じ」配列とは、除草剤耐性活性に実質的に影響を及ぼさない、アミノ酸の置換、欠失、付加または挿入がある配列を指し、除草剤耐性活性を保持している断片を含む。
【0072】
本発明における「機能的活性」または「活性」という用語は、本発明で使用するタンパク質／酵素（単独、または他のタンパク質と組み合わさった）が、除草剤を分解するか除草剤活性を低下させる能力を有することを意味する。本発明のタンパク質を産生する植物は、除草剤でその植物が処理される場合に、前記タンパク質の発現レベルが除草剤に対する完全または部分的な耐性をその植物に付与するのに十分であるように、好ましくは「有効量」の前記タンパク質を産生する（特に明記しない限り、一般的な量で）。除草剤は、標的植物を普通は枯死させる量、または通常の圃場の量および濃度で使用することができる。好ましくは、本発明の植物細胞および植物は、除草剤を用いた処理によって生じる生育抑制または損傷から保護される。本発明の形質転換された植物および植物細胞は、好ましくは、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性があり、すなわち、形質転換された植物および植物細胞は、有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤の存在下で生育することができる。
【0073】
本発明における遺伝子およびタンパク質は、特定の例示的な配列を含むだけでなく、その特定の例示的なタンパク質に特徴的なＨＰＰＤ阻害除草剤耐性活性を保持する部分および／または断片（全長タンパク質と比較した場合の内部欠失および／または末端欠失を含む）、バリアント、変異体、バリアントタンパク質、置換体（置換アミノ酸を有するタンパク質）、キメラおよび融合タンパク質を含む。
【0074】
本発明における「バリアント」という用語は、実質的に同様である配列を意味することを意図している。ポリヌクレオチドの場合、バリアントは、基準ポリヌクレオチド中の１つまたは複数の内部部位における１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および／もしくは付加、ならびに／または、変異ＨＰＰＤポリヌクレオチドの１つまたは複数の部位における１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で用いる場合、「基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド」という用語は、それぞれ変異ＨＰＰＤヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。本明細書で用いる場合、「野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチド」という用語は、それぞれ野生型ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合、保存的バリアントは、遺伝コードの縮重により、本発明の変異ＨＰＰＤポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードする上記の複数の配列を含む。上記のような野生型の対立遺伝子バリアントは、周知の分子生物学的技術を用いて、例えば、下記に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を用いて特定することができる。バリアントポリヌクレオチドはまた、例えば部位指定変異誘発を用いて生成されたものの依然として本発明の変異ＨＰＰＤタンパク質をコードするものなど、合成由来のポリヌクレオチドも含む。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、配列アライメントのプログラムおよびパラメータによって決定されるその特定のポリヌクレオチドと、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【0075】
本発明における「バリアントタンパク質」とは、変異ＨＰＰＤタンパク質の１つまたは複数の内部部位における１つまたは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／または変異ＨＰＰＤタンパク質の１つまたは複数の部位における１つまたは複数のアミノ酸の置換によって、基準タンパク質から誘導されるタンパク質を意味することを意図している。本発明に包含されるバリアントタンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは変異ＨＰＰＤタンパク質の所望の生物活性、すなわち、本明細書に記載のＨＰＰＤ酵素活性および／または除草剤耐性を引き続き有している。このようなバリアントは、例えば遺伝子多型または人為的な操作によって生じてもよい。本発明の変異ＨＰＰＤタンパク質の生物学的に活性なバリアントは、配列アライメントのプログラムおよびパラメータによって決定される変異ＨＰＰＤタンパク質のアミノ酸配列全体と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性なバリアントは、本発明のタンパク質と、わずか１～１５個のアミノ酸残基、わずか１～１０個のアミノ酸残基、例えば６～１０個、わずか５個、わずか４個、３個、２個、またはただ１個のアミノ酸残基の数だけ異なっていてもよい。
【0076】
配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知であり、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカル・アライメント・アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３のグローバル・アライメント・アルゴリズム、および、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７において修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４のアルゴリズムなどの数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。 これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装を配列の比較に利用して、配列同一性を決定することができる。このような実装としては、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（インテリジェネティクス、カリフォルニア州マウンテンビューから入手可能）；ＧＣＧウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ、バージョン１０のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（アクセルリス社、米国カリフォルニア州サンディエゴ、スクラントン・ロード９６８５番地から入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0077】
実施例によっては、変異ＨＰＰＤポリペプチドまたはＨＰＰＤ酵素活性を保持するそのバリアントをコードするアミノ酸を、所望の形質の植物を作るために、目的のポリヌクレオチド配列の任意の組合せと積み重ねることができる。「形質」という用語は、特定の配列または配列群に由来する表現型を指す。例えば、変異ＨＰＰＤポリペプチドまたはＨＰＰＤ酵素活性を保持するそのバリアントをコードするアミノ酸／ポリヌクレオチドは、望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする任意の他のポリヌクレオチと積み重ねられてもよく、望ましい形質としては、病害、昆虫および除草剤に対する抵抗性、熱および干ばつに対する耐性、作物が成熟するまでの時間の短縮、例えばデンプンまたはバイオマスを発酵可能な糖に転換する場合などの工業的処理の改善、ならびに、油分およびタンパク質を高含量にするなどの農学的品質の向上が挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
防除される雑草のスペクトルの向上、および／または野生型でより耐性のある種もしくは抵抗性のある雑草種の防除において、２つ以上の作用機序を組み合わせる利点を、ＨＰＰＤ耐性作物の他に、人為的方法（遺伝子導入または非遺伝子導入のいずれか）によって作物の除草剤耐性を可能にした化学物質にも拡大適用し得ることは、当業者に周知である。実際、以下の抵抗因子をコードする形質を単独で、または複数の組合せで重ね合わせて、除草剤に対する雑草の変化を効果的に防除または予防する能力を提供することができる。上記の抵抗因子とは、グリホサート抵抗因子（抵抗性植物または細菌由来のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸおよびＧＡＴなど）、グルホシネート抵抗因子（ＰＡＴおよびＢａｒなど）、アセト乳酸合成酵素（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＡＬＳ）阻害剤に対する除草剤抵抗因子（イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾールピリミジン、スルホン化アニリン、ピリミジニルチオ安息香酸などの化学物質の抵抗性遺伝子など、例えば、ＡＨＡＳ、Ｃｓｒｌ、およびＳｕｒＡ）、フェノキシオーキシン除草剤抵抗因子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ－１２（ａｒｙｌｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１２：ＡＡＤ－１２）など）、ジカンバ除草剤抵抗因子（ジカンバモノオキシゲナーゼ（ｄｉｃａｍｂａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＤＭＯ）など）、ブロモキシニル抵抗因子（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ：Ｂｘｎなど）、フィトエン不飽和化酵素（ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ：ＰＤＳ）阻害剤抵抗因子、光化学系ＩＩ阻害剤に対する除草剤抵抗因子（ｐｓｂＡなど）、光化学系Ｉ阻害剤に対する除草剤抵抗因子、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ：ＰＰＯ）阻害剤に対する除草剤抵抗因子（ＰＰＯ－１など）、フェニル尿素除草剤抵抗因子（ＣＹＰ７６Ｂ１など）、およびジクロロメトキシ安息香酸分解酵素である。
【0079】
グリホサートは、非常に広域なスペクトルの広葉およびイネ科の雑草種を防除するので、広く使用されている。しかし、グリホサート耐性作物および非作物への施用においてグリホサートを反復使用することにより、雑草が、野生型でより耐性のある種やグリホサート抵抗性の生物型へ変化することを選択してきた（引き続きそうである）。ほとんどの除草剤抵抗性管理プログラムでは、抵抗性雑草の出芽を遅延させる手段として、タンク混合された複数の除草剤の同類物を有効量使用することが提案されており、除草剤の同類物とは、同じ種を防除するものの異なる作用機序を有するものである。本発明の変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする遺伝子とグリホサート耐性形質（および／または他の除草剤耐性形質）とを重ね合わせることによって、グリホサート耐性作物において、グリホサート除草剤およびＨＰＰＤ阻害除草剤（トプラメゾン、メソトリオン、またはイソキサフルトールなど）の同作物における選択的使用を可能にすることにより、グリホサート抵抗性雑草種（１つまたは複数のＨＰＰＤ阻害除草剤によって防除される広葉雑草種）の防除を達成することができる。これらの除草剤は、作用機序の異なる２つ以上の除草剤を含有するタンク混合物で同時に施用することができ、または、単一の除草剤組成物において単独の逐次施用で（例えば、植栽前、または出芽前もしくは出芽後）（２時間から３ヶ月の範囲の施用間隔で）施用することができる。あるいは、これらの除草剤の施用は、施用可能な各化合物カテゴリーを代表する任意の数の除草剤を、任意の時期（作物の植栽後７ヶ月から、作物が収穫される時期（または、単一の除草剤については収穫前の間隔で、最も短い間隔））に組み合わせて使用することにより、施用することができる。
【0080】
広葉雑草の防除においては、施用時期、単一除草剤の施用量、頑固な雑草または抵抗性雑草を防除する能力の点から、柔軟性が非常に重要である。グリホサート抵抗性遺伝子／変異ＨＰＰＤ遺伝子と重ね合わせたグリホサートの作物における施用範囲は、２５０～２５００ｇ ａｅ／ｈａであり得る。ＨＰＰＤ阻害除草剤（１つまたは複数）の施用範囲は、２５～５００ｇ ａｉ／ｈａであり得る。これらの施用に最適な時期の組合せは、特定の条件、種および環境に依拠する。
【0081】
除草剤製剤（例えば、エステル、酸もしくは塩の製剤、または可溶性濃縮物、乳化性濃縮物もしくは可溶性液体）、およびタンク混合添加剤（例えば、アジュバントまたは相溶化剤）が、所与の除草剤の雑草防除、または１つもしくは複数の除草剤を組み合わせた雑草防除に著しく影響を与える可能性がある。前述の除草剤のいずれかの任意の化学的組合せは、本発明の範囲内である。
【0082】
また、本発明の変異ＨＰＰＤポリペプチドを単独で、または除草剤抵抗性作物の他の特性と積み重ねた状態でコードする遺伝子は、１つまたは複数の他の入力形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性もしくはストレス耐性など）、または出力形質（例えば、収量の増加、油量の向上、繊維品質の向上など）と積み重ねることができる。したがって、本発明を用いて、いかなる数の農業害虫も柔軟かつ経済的に防除する能力で作物の品質を向上させる完全な農業解決策を提供することができる。
【0083】
上記の積み重ねた組合せは任意の方法によって作ることができ、その方法としては、任意の従来法もしくはトップクロス法による交配植物、または遺伝子形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝的に植物を形質転換することによって配列を積み重ねる場合、目的のポリヌクレオチド配列は、いつでもどのような順序でも組み合わせることができる。例えば、１つまたは複数の所望の形質を含む遺伝子導入植物を標的として用いて、その後の形質転換によってさらなる形質を導入することができる。その形質は、形質転換カセットの任意の組合せによって提供される目的のポリヌクレオチドと共に、共形質転換プロトコールで同時に導入することができる。例えば、２つの配列が導入される場合、それら２つの配列は、別々の形質転換カセット（ｔｒａｎｓ）に含めることもできるし、または同じ形質転換カセット（ｃｉｓ）に含めることもできる。それらの配列の発現は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって推進することができる。場合によっては、目的のポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入することが望ましいこともある。これを、他の抑制カセットまたは大量発現カセットの任意の組合せと組み合わせて、植物において所望の形質の組合せを生成してもよい。さらに、部位特異的組換え系を用いると、所望のゲノム位置にポリヌクレオチド配列を積み重ね得ることが認識されている。
【0084】
本発明による変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対してより高い耐性を有し、このことは、除草剤耐性作物および選択性マーカー形質の可能性の重要な根拠である。
【0085】
本明細書で用いる「発現カセット」という用語は、適当な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸分子を意味し、目的のヌクレオチド配列（すなわち、変異ＨＰＰＤポリペプチドまたはＨＰＰＤ酵素活性を保持するそのバリアントをコードするポリヌクレオチドであって、単独であるか、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする１つまたは複数の付加的な核酸分子との組合せであるポリヌクレオチド）に効果的に連結されるプロモーターを含み、その目的のヌクレオチド配列は、終結シグナルに効果的に連結される。コード領域は普通、目的のタンパク質についてコード化しているが、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡについても、センスまたはアンチセンスの方向でコード化していてもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、野生型のものであってもよいが、異種発現に有用な組換え型で得られたものである。しかし、通常は、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、宿主細胞において野生型で生じるのではなく、形質転換イベントによって新しい宿主細胞に導入されていなければならない。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、または、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。さらに、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発生段階に、特異的であり得る。
【0086】
本発明は、目的のポリヌクレオチド（すなわち、変異ＨＰＰＤポリペプチドまたはＨＰＰＤ酵素活性を保持するそのバリアントをコードするポリヌクレオチドであって、単独であるか、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする１つまたは複数の付加的な核酸分子との組合せであるポリヌクレオチド）を発現することができる発現カセットを用いた植物の形質転換を包含する。発現カセットは、転写の５′－３′方向に、転写および翻訳の開始領域（すなわちプロモーター）ならびにポリヌクレオチド・オープン・リーディング・フレームを含む。発現カセットは、任意選択で、植物において機能的な転写および翻訳の終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現カセットは、安定な形質転換体の選択を可能にする選択性マーカー遺伝子を含む。本発明の発現構築物はまた、リーダー配列、および／または目的のポリヌクレオチドの誘導性発現を可能にする配列を含んでもよい。
【0087】
発現構築物の制御配列は、目的のポリヌクレオチドに効果的に連結される。本発明における制御配列には、変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする除草剤耐性遺伝子に作用可能に連結されたプロモーター、輸送ペプチド、ターミネーター、エンハンサー、リーダー配列、イントロンなどの制御配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0088】
プロモーターは、植物発現性プロモーターである。「植物発現性プロモーター」とは、植物細胞において、そのプロモーターに連結されたコード配列の発現を確実にするプロモーターを指す。植物発現性プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。植物において構成的発現を指示するプロモーターの例としては、カリフラワー・モザイク・ウイルスに由来する３５Ｓプロモーター、トウモロコシＵｂｉプロモーター、イネＧＯＳ２遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、植物発現性プロモーターは組織特異的プロモーターであり得、組織特異的プロモーターとは、すなわち、緑色組織などのいくつかの組織において、植物の他の組織よりも高いレベル（従来のＲＮＡ試験によって測定することができる）で、コード配列の発現を指示するプロモーターであり、例えば、ＰＥＰカルボキシラーゼプロモーターがある。あるいは、植物発現性プロモーターは、創傷誘導性プロモーターであり得る。創傷誘導性プロモーター、または創傷誘導性発現パターンを指示するプロモーターとは、力学的要因、または昆虫のかじり取りによって生じる創傷を植物が被った場合に、プロモーターの調節下にあるコード配列の発現が、通常の生育条件と比較して著しく向上することを意味する。創傷誘導性プロモーターの例としては、ジャガイモおよびトマトのプロテアーゼ阻害遺伝子（ｐｉｎ Ｉおよびｐｉｎ ＩＩ）、ならびにトウモロコシのプロテアーゼ阻害遺伝子（ＭＰＩ）のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0089】
輸送ペプチド（分泌シグナル配列またはターゲティング配列としても既知である）は、遺伝子導入産物を特定の小器官または細胞コンパートメントに導く。受容体タンパク質の場合、輸送ペプチドは異種であってもよく、例えば、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を用いて葉緑体をターゲティングするもの、または「ＫＤＥＬ」保持配列を用いて小胞体をターゲティングするもの、またはオオムギの植物性凝集素遺伝子のＣＴＰＰを用いて液胞をターゲティングするものがある。
【0090】
リーダー配列に含まれるものとしては、ＥＭＣＶリーダー配列（脳心筋炎ウイルスの５′非コード領域）などの小型ＲＮＡウイルスリーダー配列、ＭＤＭＶ（トウモロコシ矮性モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ Ｄｗａｒｆ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）リーダー配列などのジャガイモウイルスＹ群リーダー配列、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、アルファルファ・モザイク・ウイルス（Ａｌｆａｌｆａ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質ｍＲＮＡの非翻訳リーダー配列（ＡＭＶ ＲＮＡ４）、およびタバコ・モザイク・ウイルス（Ｔｂａｃｃｏ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ：ＴＭＶ）リーダー配列があるが、これらに限定されない。
【0091】
エンハンサーに含まれるものとしては、カリフラワー・モザイク・ウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ：ＣａＭＶ）エンハンサー、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ：ＦＭＶ）エンハンサー、カーネーション・エッチドリング・ウイルス（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ Ｅｔｃｈｅｄ Ｒｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ：ＣＥＲＶ）エンハンサー、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ Ｖｅｉｎ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ：ＣｓＶＭＶ）エンハンサー、ミラビリス・モザイク・ウイルス（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ：ＭＭＶ）エンハンサー、ケストルム黄化葉巻ウイルス（Ｃｅｓｔｒｕｍ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ：ＣｍＹＬＣＶ）エンハンサー、ワタ葉巻ムルタンウイルス（Ｃｏｔｔｏｎ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ Ｖｉｒｕｓ：ＣＬＣｕＭＶ）エンハンサー、ツユクサ黄色斑紋ウイルス（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ Ｙｅｌｌｏｗ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ：ＣｏＹＭＶ）エンハンサー、およびピーナッツクロロティック条斑カリモウイルス（Ｐｅａｎｕｔ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｓｔｒｅａｋ Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ：ＰＣＬＳＶ）エンハンサーがあるが、これらに限定されない。
【0092】
単子葉植物で用いられる場合、イントロンに含まれるものとしては、トウモロコシｈｓｐ７０イントロン、トウモロコシ・ユビキチン・イントロン、Ａｄｈイントロン１、スクロース合成酵素イントロン、またはイネＡｃｔ１イントロンがあるが、これらに限定されない。双子葉植物で用いられる場合、イントロンに含まれるものとしては、ＣＡＴ－１イントロン、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬイントロン、ＰＩＶ２イントロン、および「スーパーユビキチン」イントロンがあるが、これらに限定されない。
【0093】
ターミネーターは、植物において機能する適切なポリアデニル化シグナル配列であり得、適切なポリアデニル化シグナル配列に含まれるものとしては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリン合成酵素（Ｎｏｐａｌｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＮＯＳ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、プロテアーゼ阻害剤ＩＩ（ｐｉｎＩＩ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、エンドウマメｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、およびαチューブリン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列があるが、これらに限定されない。
【0094】
本発明における「効果的に連結する」とは、核酸配列の１つが、それに連結される配列に必要な機能を提供することを可能にする核酸配列の結合を表す。本発明において「効果的に連結する」ことにより、プロモーターを目的の配列に連結することができ、その結果、目的の配列の転写がプロモーターによって制御および調節される。目的の配列がタンパク質をコードしており、そしてそのタンパク質の発現が所望される場合、「効果的に連結する」とは、生じる転写物が効果的に翻訳されるような様式で、プロモーターが前記配列に連結されることを意味する。プロモーターのコード配列への連結が転写物融合であり、そしてコードされたタンパク質の発現が達成される場合、そのような連結は、生じる転写物の最初の翻訳開始コドンがコード配列の開始コドンであるように作られる。あるいは、プロモーターのコード配列への連結が翻訳融合であり、そしてコードされたタンパク質の発現が達成される場合、そのような連結は、５′非翻訳配列に含有される最初の翻訳開始コドンが、生じる翻訳産物と所望のタンパク質をコードする翻訳オープン・リーディング・フレームとの関係がインフレームであるような様式で、プロモーターに連結されるように作られる。「効果的に連結され」得る核酸配列として挙げられるものには、遺伝子発現機能を提供する配列（すなわち、プロモーター、５′非翻訳領域、イントロン、タンパク質コード領域、３′非翻訳領域、ポリアデニル化部位および／または転写ターミネーターなどの遺伝子発現エレメント）、ＤＮＡ転移および／または組込み機能を提供する配列（すなわち、Ｔ－ＤＮＡ境界配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、およびインテグラーゼ認識部位）、選択的機能を提供する配列（すなわち、抗生物質抵抗性マーカーおよび生合成遺伝子）、マーカースコアリング機能を提供する配列、インビトロまたはインビボにおける配列操作において補助する配列（すなわち、ポリリンカー配列および部位特異的組換え配列）、ならびに複製機能を提供する配列（すなわち、細菌性複製起点、自己複製配列、およびセントロメア配列）があるが、これらに限定されない。
【0095】
本発明における植物、植物組織または植物細胞のゲノムとは、植物、植物組織または植物細胞の中の任意の遺伝物質を指し、細胞核、色素体およびミトコンドリアのゲノムが含まれる。
【0096】
本明細書で用いる場合、「植物部分」または「植物組織」という用語には、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および、植物または植物の部分において無傷である植物細胞が含まれ、植物の部分とは、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、コブ、外皮、茎、根、根端、葯などである。
【0097】
本発明の変異ＨＰＰＤポリペプチドは、様々な種類の植物に施用することができる。双子葉植物に含まれるものとしては、アルファルファ、マメ、カリフラワー、キャベツ、ニンジン、セロリ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ズッキーニ、ダイコン、アブラナ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ、トマト、シロイヌナズナ、ピーナッツ、またはスイカがあるが、これらに限定されない。好ましくは、双子葉植物は、キュウリ、ダイズ、シロイヌナズナ、タバコ、ワタ、ピーナッツ、アブラナを指す。単子葉植物に含まれるものとしては、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、キビ、サトウキビ、エンバク、またはシバクサがあるが、これらに限定されない。好ましくは、単子葉植物は、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、キビ、サトウキビ、またはエンバクを指す。
【0098】
本明細書で用いる場合、「植物形質転換」という用語は、除草剤抵抗性または除草剤耐性の変異ＨＰＰＤポリヌクレオチドを、単独で、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする１つまたは複数の付加的な核酸分子と組み合わせて、発現系にクローニングした後、植物細胞に形質転換することを意味する。本発明のレセプターおよび標的発現カセットは、当技術分野で認識されている複数の手法で植物細胞に導入することができる。例えば目的のヌクレオチド構築物であるポリヌクレオチドの文脈における「導入」という用語は、ポリヌクレオチドが植物の細胞内部に到達するような手法において、ポリヌクレオチドの植物への提示を意味することを意図している。２つ以上のポリヌクレオチドを導入する場合、これらのポリヌクレオチドを、単一のヌクレオチド構築物の一部として、または別々のヌクレオチド構築物として組み立てることができ、同じかまたは異なる形質転換ベクターに配置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントにおいて、別々の形質転換イベントにおいて、または、例えば植物では育種プロトコールの一部として、目的の宿主細胞に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを植物に導入する特定の方法に依拠せず、（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドが植物の少なくとも１つの細胞の内部に到達することのみに依拠する。１つまたは複数のポリヌクレオチドを植物に導入する方法は当技術分野で既知であり、その方法としては、一過性形質転換法、安定形質転換法、およびウイルス媒介法またはゲノム編集技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【0099】
「安定形質転換」という用語は、外来遺伝子が植物のゲノムに導入されて、その植物またはその植物のどの継代のゲノムにも安定的に組み込まれ、その結果、その外来遺伝子が安定的に遺伝することを意味する。
【0100】
「一過性形質転換」という用語は、核酸分子またはタンパク質が植物細胞に導入されて機能が実行されるものの、その植物のゲノムには組み込まれず、その結果、外来遺伝子が安定的に遺伝しないことを意味する。
【0101】
「ゲノム編集技術」とは、ゲノムを改変するために用いられる技術であって、ゲノム配列を正確に操作して、部位指定遺伝子の突然変異、挿入および欠失などの操作を実現することができる技術を指す。現在のところ、ゲノム編集技術としては主に、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ：ＨＥ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＴＡＬＥＮ）、およびクリスパー（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（クラスター化した規則的間隔配置の短回文反復配列）：ＣＲＩＳＰＲ）の技術が挙げられる。
【0102】
植物の形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターが当業者に既知であり、本発明に関係する遺伝子は、任意のそのようなベクターと組み合わせて用いることができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術、および形質転換のための標的種に依拠する。標的種によっては、異なる抗生物質または除草剤の選択マーカーが好ましい場合がある。形質転換で日常的に用いられる選択マーカーとして挙げられるのは、カナマイシンおよび関連する抗生物質または除草剤に対する抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：１８４－１８７（１９８３）に発表された）；除草剤グルホシネート（ホスフィノトリシンとも呼ばれる）に対する抵抗性を付与するｐａｔ遺伝子およびｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：１０６２（１９９０）、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｏｎ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：６２５－６３１（１９９０）ならびに米国特許第５，５６１，２３６号および５，２７６，２６８号明細書を参照されたい）；抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２９２９－２９３１）；メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ． ２（７）：１０９９－１１０４（１９８３））；グリホサートに対する抵抗性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第４，９４０，９３５号および第５，１８８，６４２号明細書）；同じくグリホサートに対する抵抗性を付与するグリホサートＮ－アセチル基転移酵素（ＧＡＴ）遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４：１１５１－１１５４、米国特許出願公開第２００７０００４９１２号、第２００５０２４６７９８号および第２００５００６０７６７号明細書）；ならびにマンノースを代謝する能力を提供するマンノース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子（米国特許第５，７６７，３７８号および第５，９９４，６２９号明細書）である。
【0103】
植物の再生方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、Ｔｉプラスミドベクターが外来ＤＮＡの送達に利用されており、ＤＮＡの直接的取込み、リポソーム、電気穿孔、微量注入、および微粒子銃も同様である。
【0104】
本発明における植栽システムは、１つまたは複数の除草剤に対する耐性を有する遺伝子導入植物および／または植物の様々な発生段階において利用可能な除草剤処理の組合せを含む。除草剤が施用される場合、前記植栽システムは、雑草の生育を効果的に防除し、収量がより高くかつ／または損傷がより少ない植物を作製し得る。
【0105】
本発明において、雑草とは、植物生育環境で栽培される標的植物と競合する植物を指す。
【0106】
本発明における「防除」および／または「予防」という用語は、雑草の発生を最小限に抑え、かつ／または雑草の生育を停止させるために、植物生育環境に有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を少なくとも直接（例えば散布により）施用することを指す。同時に、栽培される標的植物は形態学的に正常であるべきであり、産物の消費および／または生成のために従来の方法で栽培することができる。好ましくは、栽培される植物は、非遺伝子導入野生型植物と比較して植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。植物損傷の低減には、茎の抵抗性の向上および／または穀物重量の増加などが含まれるが、これらに限定されない。変異ＨＰＰＤポリペプチドの雑草に対する「防除」および／または「予防」の効果は独立して存在することができ、雑草を「防除」および／または「予防」することができる他の物質の存在により、減少および／または消失することはない。具体的には、（変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする遺伝子を含有する）遺伝子導入植物のいずれかの組織が、変異ＨＰＰＤポリペプチド、および／または雑草を防除し得る別の物質を、同時および／もしくは別々に有しかつ／または産生する場合、その別の物質の存在が変異ＨＰＰＤポリペプチドの雑草に対する「防除」および／または「予防」の効果に影響を与えることもなければ、「防除」および／または「予防」の効果が、変異ＨＰＰＤポリペプチドに関係なく、結果的にその別の物質によって完全および／または部分的にもたらされることもない。
【0107】
本発明における「植物繁殖体」には、植物有性繁殖体および植物栄養繁殖体が含まれるが、これらに限定されない。植物有性繁殖体としては植物の種子が挙げられるが、これに限定されず、植物栄養繁殖体とは、エクスビボ条件下で新しい植物を生成し得る植物の栄養器官または特定の組織を指す。栄養器官または特定の組織としては、限定されないが、根、茎、および葉が挙げられ、例えば、根を栄養繁殖体とする植物にはイチゴ、サツマイモなどが挙げられ、茎を栄養繁殖体とする植物にはサトウキビ、ジャガイモ（塊茎）などが挙げられ、葉を栄養繁殖体とする植物にはアロエ、ベゴニアなどが挙げられる。
【0108】
本発明により、新規な除草剤抵抗性形質が植物に付与され得、表現形質（収量など）への悪影響は観察されない。本発明における植物は、試験した少なくとも１つの除草剤の一般的な施用レベルの、例えば、０．５×、１×、２×、３×、４×、または８×に耐性を示し得る。これらの耐性レベルの向上は、本発明の範囲内である。例えば、所与の遺伝子の発現を増大させるために、当技術分野で既知の様々な技術について、予見可能な最適化とさらなる開発を行うことができる。
【0109】
本発明は、以下の利点を有する変異ＨＰＰＤポリペプチド、そのコード遺伝子およびその使用を提供する。
【0110】
１．本発明は、様々な種由来のヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドの３７２位＋３８３位における組合せ変異が、ピラゾリネート類、トリケトン類およびイソキサゾール類のＨＰＰＤ阻害除草剤に対する相乗的に向上した耐性を植物に付与し得、特に、４倍の圃場濃度のトプラメゾン、イソキサフルトールおよびメソトリオンに対する耐性を遺伝子導入ダイズ植物に付与し得ることを初めて開示する。したがって、本発明には、植物における広域施用の見込みがある。
【0111】
２．本発明のヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドにおいて、３７２位＋３８３位における組合せ変異と他の位置における変異との組合わせは、３７２位＋３８３位における組合せ変異のみによって産生されるＨＰＰＤ阻害除草剤に対する相乗的に向上した耐性に影響を与えず、このことは、ＨＰＰＤポリペプチドの３７２位＋３８３位における組合せ変異によって付与されるＨＰＰＤ阻害除草剤に対する植物の耐性の重要性および安定性を実証している。
【0112】
３．本発明のヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドの３７２位＋３８３位における組合せ変異に基づいて、ＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端を最適化することが、イソキサフルトールに対する植物の耐性を向上させるのに有益である。
【0113】
本発明の技術的解決法について、下記の図面および実施例により、さらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0114】
【図1】本発明によるＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の概略構造図である。
【図2】本発明による対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎの概略構造図である。
【図3】本発明による様々な種由来のＨＰＰＤの系統樹である。
【発明を実施するための形態】
【0115】
本発明による変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチド、そのコード遺伝子およびその使用に関する実施形態について、具体的な実施例でさらに説明する。
【0116】
実施例１：組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）のためのＡｓＨＰＰＤの３７２位および３８３位の選択ならびにその変異効果の検証
１．ＡｓＨＰＰＤおよびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ遺伝子の獲得
エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）野生型ＨＰＰＤのアミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤ）を配列表の配列番号１として記載し、ＡｓＨＰＰＤをコードするＡｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号２として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤをコードするＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３として記載する。
１．ＡｓＨＰＰＤおよびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ遺伝子の獲得
エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）野生型ＨＰＰＤのアミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤ）を配列表の配列番号１として記載し、ＡｓＨＰＰＤをコードするＡｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号２として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤをコードするＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３として記載する。
【0117】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号４に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６として記載する。
【0118】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号７に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９として記載する。
【0119】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１０に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２として記載する。
【0120】
２．前述のヌクレオチド配列の合成
合成したＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列（配列番号３）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列（配列番号６）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列（配列番号９）、およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列（配列番号１２）の５′末端および３′末端をそれぞれ、以下のユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結した。
５′末端用ユニバーサル・アダプター・プライマー１：配列表の配列番号２３０に記載の５′－ａｇｔｔｔｔｔｃｔｇａｔｔａａｃａｇａｃｔａｇｔ－３′。
３′末端用ユニバーサル・アダプター・プライマー１：配列表の配列番号２３１に記載の５′－ｃａａａｔｇｔｔｔｇａａｃｇａｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃ－３′。
合成したＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列（配列番号３）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列（配列番号６）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列（配列番号９）、およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列（配列番号１２）の５′末端および３′末端をそれぞれ、以下のユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結した。
５′末端用ユニバーサル・アダプター・プライマー１：配列表の配列番号２３０に記載の５′－ａｇｔｔｔｔｔｃｔｇａｔｔａａｃａｇａｃｔａｇｔ－３′。
３′末端用ユニバーサル・アダプター・プライマー１：配列表の配列番号２３１に記載の５′－ｃａａａｔｇｔｔｔｇａａｃｇａｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃ－３′。
【0121】
３．エンバクＨＰＰＤ遺伝子（Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ）を含有する、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターの構築
制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＡｓｃ Ｉを用い、植物発現ベクターＤＢＮＢＣ－０１を二重消化して、その植物発現ベクターを線状化した。消化産物を精製して、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーン（ベクターバックボーン：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡから入手可能））を得、次いで、タカラＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎプロダクツ・シームレス・コネクション・キット（クロンテック、米国カリフォルニア州、ＣＡＴ：１２１４１６）の説明書の手順に従い、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列と組換え反応を行って、図１に示す概略構造を有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６を構築した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン遺伝子、ＲＢ：右境界、ｅＦＭＶ：ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの３４Ｓエンハンサー（配列番号１３）、ｐｒＢｒＣＢＰ：アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）のプロモーター（配列番号１４）、ｓｐＡｔＣＴＰ２：シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド（配列番号１５）、ＥＰＳＰＳ：５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子（配列番号１６）、ｔＰｓＥ９：エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子のターミネーター（配列番号１７）、ｐｒＡｔＵｂｉ１０：シロイヌナズナのユビキチン１０遺伝子のプロモーター（配列番号１８）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２：ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列（配列番号１２）、ｔＮｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（配列番号１９）、ｐｒ３５Ｓ－０１：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号２０）、ＰＡＴ：ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子（配列番号２１）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号２２）、ＬＢ：左境界）。
制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＡｓｃ Ｉを用い、植物発現ベクターＤＢＮＢＣ－０１を二重消化して、その植物発現ベクターを線状化した。消化産物を精製して、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーン（ベクターバックボーン：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡから入手可能））を得、次いで、タカラＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎプロダクツ・シームレス・コネクション・キット（クロンテック、米国カリフォルニア州、ＣＡＴ：１２１４１６）の説明書の手順に従い、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列と組換え反応を行って、図１に示す概略構造を有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６を構築した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン遺伝子、ＲＢ：右境界、ｅＦＭＶ：ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの３４Ｓエンハンサー（配列番号１３）、ｐｒＢｒＣＢＰ：アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）のプロモーター（配列番号１４）、ｓｐＡｔＣＴＰ２：シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド（配列番号１５）、ＥＰＳＰＳ：５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子（配列番号１６）、ｔＰｓＥ９：エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子のターミネーター（配列番号１７）、ｐｒＡｔＵｂｉ１０：シロイヌナズナのユビキチン１０遺伝子のプロモーター（配列番号１８）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２：ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列（配列番号１２）、ｔＮｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（配列番号１９）、ｐｒ３５Ｓ－０１：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号２０）、ＰＡＴ：ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子（配列番号２１）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号２２）、ＬＢ：左境界）。
【0122】
大腸菌Ｔ１コンピテント細胞を、以下の熱ショック条件下で熱ショック法を用いることにより、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６で形質転換した。大腸菌Ｔ１コンピテント細胞５０μＬとプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６）１０μＬとを４２℃で３０秒間水浴させ、３７℃で１時間振盪培養し（振盪には振盪機を回転数１００ｒｐｍで使用）、次いで、温度３７℃の条件下で、スペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体プレートで１２時間培養した。白色の細菌コロニーを取り出し、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌ；ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）において、温度３７℃の条件下で一晩培養した。細胞内のプラスミドをアルカリ法によって抽出した。菌液を回転速度１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿した菌糸体を、氷で予冷した溶液Ｉ（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）および５０ｍＭのグルコース、ｐＨ８．０）１００μＬに懸濁した。新たに調製した溶液ＩＩ（０．２ＭのＮａＯＨ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）２００μＬを添加し、チューブを４回反転させて混合し、氷上に３～５分間置いた。氷冷した溶液ＩＩＩ（３Ｍの酢酸カリウム、５Ｍの酢酸）１５０μＬを添加し、直ちに均一に混合し、氷上に５～１０分間置いた。温度４℃、回転数１２，０００ｒｐｍの条件下で混合物を５分間遠心分離し、２倍の体積の無水エタノールを上清に添加し、均一に混合し、室温で５分間置いた。温度４℃、回転数１２，０００ｒｐｍの条件下で混合物を５分間遠心分離し、上清を捨て、濃度７０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールで沈殿物を洗浄した後、風乾した。ＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３０μＬを添加して、沈殿物を溶解した。得られた産物を温度３７℃で３０分間水浴させてＲＮＡを消化し、使用に備えて温度－２０℃で保存した。抽出したプラスミドを配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６のＳｐｅ Ｉ部位とＡｓｃ Ｉ部位との間のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２に記載のもの、すなわちＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列であることが示された。
【0123】
組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６を構築する上記の方法に従い、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８およびＤＢＮ１１７２９を順に構築した。それぞれの配列決定により、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８およびＤＢＮ１１７２９におけるヌクレオチド配列が、それぞれ配列表の配列番号３に記載のヌクレオチド配列、配列番号６に記載のヌクレオチド配列、および配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含んでおり、すなわち、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列が正しく挿入されたことを確認した。
【0124】
対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを構築し、その構造を図２に示した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン遺伝子、ＲＢ：右境界、ｅＦＭＶ：ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの３４Ｓエンハンサー（配列番号１３）、ｐｒＢｒＣＢＰ：アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）のプロモーター（配列番号１４）、ｓｐＡｔＣＴＰ２：シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド（配列番号１５）、ＥＰＳＰＳ：５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子（配列番号１６）、ｔＰｓＥ９：エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子のターミネーター（配列番号１７）、ｐｒ３５Ｓ－０１：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号２０）、ＰＡＴ：ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子（配列番号２１）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号２２）、ＬＢ：左境界）。
【0125】
４．シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６、ＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８、ＤＢＮ１１７２９およびＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下でアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。１００μＬのアグロバクテリウムＧＶ３１０１および３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＧＶ３１０１をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養し、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体プレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６～ＤＢＮ１１７２９およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６、ＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８、ＤＢＮ１１７２９およびＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下でアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。１００μＬのアグロバクテリウムＧＶ３１０１および３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＧＶ３１０１をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養し、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体プレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６～ＤＢＮ１１７２９およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
【0126】
５．遺伝子導入シロイヌナズナ植物の獲得
野生型シロイヌナズナの種子を０．１％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液に懸濁した。同調的種子発芽を確実にするために、懸濁した種子を４℃で２日間保存して、休眠要求を満たした。バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して湿潤状態にし、混合土壌から２４時間かけて水を排出した。上記の前処理した種子をその混合土壌に播種し、７日間保湿カバーで覆った。種子を発芽させ、恒温（２２℃）、恒湿（４０～５０％）、光強度１２０～１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ－１の長日光条件下（１６時間明期／８時間暗期）の温室内で、植物を栽培した。最初はホーグランド栄養溶液で植物に灌水し、次いで脱イオン水で灌水して、湿っているが水はしみ通らない状態に土壌を保った。
野生型シロイヌナズナの種子を０．１％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液に懸濁した。同調的種子発芽を確実にするために、懸濁した種子を４℃で２日間保存して、休眠要求を満たした。バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して湿潤状態にし、混合土壌から２４時間かけて水を排出した。上記の前処理した種子をその混合土壌に播種し、７日間保湿カバーで覆った。種子を発芽させ、恒温（２２℃）、恒湿（４０～５０％）、光強度１２０～１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ－１の長日光条件下（１６時間明期／８時間暗期）の温室内で、植物を栽培した。最初はホーグランド栄養溶液で植物に灌水し、次いで脱イオン水で灌水して、湿っているが水はしみ通らない状態に土壌を保った。
【0127】
シロイヌナズナは、花浸漬法を用いて形質転換した。スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培養液（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ；ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整）の１つまたは複数の前培養物１５～３０ｍＬに、取り出したアグロバクテリウムのコロニーを接種した。その前培養物を温度２８℃、回転数２２０ｒｐｍで一晩、一定速度で振盪しながらインキュベートした。各前培養物を用いて、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培養液の培養物５００ｍＬを２つ接種し、その培養物を２８℃で一晩、連続振盪しながらインキュベートした。回転数約４，０００ｒｐｍで遠心分離を２０分間、室温で行って細胞を沈殿させ、生じた上清を捨てた。細胞沈殿物を、１／２×ＭＳ塩／Ｂ５ビタミン、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０４４μＭのベンジルアミノプリン（１０μＬ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬの保存ＤＭＳＯ溶液））および３００μＬ／ＬのＳｉｌｖｅｔ Ｌ－７７を含有する浸透圧培養液５００ｍＬに穏やかに再懸濁した。月齢約１ヵ月のシロイヌナズナ植物を、再懸濁した細胞を含有する浸透圧培養液に１５秒間漬けて、最新の花序を確実に浸漬した。次いで、シロイヌナズナ植物を横向きに置いて蓋をし、２４時間暗所で湿潤状態を保った。そのシロイヌナズナ植物を、２２℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で通常通りに栽培した。約４週間後に種子を収穫した。
【0128】
この新たに収穫した（ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、および対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎ）Ｔ１種子を、室温で７日間乾燥させた。この種子を２６．５ｃｍ×５１ｃｍの発芽ディスクに播種し、ディスク１枚当たり２００ｍｇのＴ１種子（約１０，０００粒）を入れた。ここでの種子は、同調的種子発芽を確実にするために、あらかじめ蒸留水に懸濁し、４℃で２日間保存して休眠要求を満たしたものとした。
【0129】
バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して湿潤状態にし、重力により水を排出した。ピペットを使用して、前処理した種子を混合土壌に均等に播種し、４～５日間保湿カバーで覆った。初期形質転換体を選択するために、（共形質転換ＰＡＴ遺伝子の選択に使用した）グルホシネートを出芽後散布施用する１日前に、カバーを外した。
【0130】
リバティ（Ｌｉｂｅｒｔｙ）除草剤（グルホシネート２００ｇ ａｉ／Ｌ）の０．２％溶液を、植栽から７日後（ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｐｌａｎｔｉｎｇ：ＤＡＰ）および１１ＤＡＰ（それぞれ子葉期および２～４枚の葉期）に、デビルビス圧縮空気ノズルにより、１０ｍＬ／ディスク（７０３Ｌ／ｈａ）の散布体積でＴ１植物に散布して、１回の施用につきグルホシネートの有効量２８０ｇ ａｉ／ｈａを提供した。最終散布から４～７日後に生存植物（活発に生育している植物）を特定し、馬糞堆肥土およびバーミキュライトで準備した７ｃｍ×７ｃｍの正方形の鉢に移植した（３～５株／ディスク）。移植した植物を３～４日間保湿カバーで覆い、２２℃の培養庫に置くか、上記の温室に直接移した。次いで、カバーを外し、ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性を提供する変異ＨＰＰＤ遺伝子の能力を試験する少なくとも１日前に、植物を温室内（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、明期１４時間：暗期１０時間、最低５００μＥ／ｍ２ｓ－１の野生型＋補助光）で植栽した。
【0131】
６．ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する遺伝子導入シロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
グルホシネート選択スキームを用いて、非形質転換種子からＴ１形質転換体を最初に選択した。ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＤＢＮ１１７２６Ｎ）、および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの濃度（１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、２００ｇ ａｉ／ｈａ（８倍圃場濃度、８×）および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの濃度（１４０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの濃度（２１０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、除草剤に対するシロイヌナズナの耐性を判定した。散布から７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤によって生じた損傷の程度を、漂白葉の面積の割合（漂白葉の面積の割合＝漂白葉の面積／全体の葉の面積×１００％）に従って、各植物について測定した。基本的に漂白された表現型がない場合を等級０と定義し、漂白葉の面積の割合が５０％未満の場合を等級１と定義し、漂白葉の面積の割合が５０％超の場合を等級２と定義し、漂白葉の面積の割合が１００％の場合を等級３と定義する。
グルホシネート選択スキームを用いて、非形質転換種子からＴ１形質転換体を最初に選択した。ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＤＢＮ１１７２６Ｎ）、および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの濃度（１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、２００ｇ ａｉ／ｈａ（８倍圃場濃度、８×）および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの濃度（１４０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの濃度（２１０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、除草剤に対するシロイヌナズナの耐性を判定した。散布から７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤によって生じた損傷の程度を、漂白葉の面積の割合（漂白葉の面積の割合＝漂白葉の面積／全体の葉の面積×１００％）に従って、各植物について測定した。基本的に漂白された表現型がない場合を等級０と定義し、漂白葉の面積の割合が５０％未満の場合を等級１と定義し、漂白葉の面積の割合が５０％超の場合を等級２と定義し、漂白葉の面積の割合が１００％の場合を等級３と定義する。
【0132】
式Ｘ＝［Σ（Ｎ×Ｓ）／（Ｔ×Ｍ）］×１００に従って、各組換え発現ベクターの形質転換イベントの抵抗性能をスコアリングし（Ｘ－農薬損傷のスコア、Ｎ－損傷の等級が同じである植物の数、Ｓ－農薬損傷等級、Ｔ－植物の総数、Ｍ－農薬損傷の最大等級）、そのスコアに基づいて、高抵抗性植物（スコア０～１５）、中抵抗性植物（スコア１６～３３）、低抵抗性植物（スコア３４～６７）、非抵抗性植物（スコア６８～１００）として抵抗性を評価した。その結果を表１に示した。
【0133】
【表1】
【0134】
表１の結果から、ＣＫと比較して、シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は全て、４倍または８倍の圃場濃度のトプラメゾンに対して高抵抗耐性を示したが、ＡｓＨＰＰＤ－０２およびＤＢＮ１１７２６Ｎはどちらも、トプラメゾンに対する耐性を示さなかったことが示されている。
【0135】
【表2】
【0136】
表２の結果から以下のことが示されている。（１）ＣＫと比較して、シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、異なる濃度のイソキサフルトールに対して程度が異なる耐性を示したが、ＡｓＨＰＰＤ－０２およびＤＢＮ１１７２６Ｎはどちらも、イソキサフルトールに対する耐性を示さなかった。（２）シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、２倍の圃場濃度のイソキサフルトールに対して、それぞれ中抵抗耐性、中抵抗耐性、および高抵抗耐性を示し、野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）が、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗよりも良好な効果をもたしたことが示された。（３）シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、４倍の圃場濃度のイソキサフルトールに対して、それぞれ低抵抗耐性、低抵抗耐性、および高抵抗耐性を示し、野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）が、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗよりも良好な効果をもたらし、さらに、除草剤耐性の効果を相乗的に向上させたことが示された。
【0137】
【表3】
【0138】
表３の結果から以下のことが示されている。（１）ＣＫと比較して、シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、異なる濃度のメソトリオンに対して程度が異なる耐性を示したが、ＡｓＨＰＰＤ－０２およびＤＢＮ１１７２６Ｎはどちらも、メソトリオンに対する耐性を示さなかった。（２）シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、２倍の圃場濃度のメソトリオンに対して、それぞれ中抵抗耐性、中抵抗耐性、および高抵抗耐性を示し、野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）が、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗよりも良好な効果をもたらしたことが示された（３）シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、４倍の圃場濃度のメソトリオンに対して、それぞれ低抵抗耐性、低抵抗耐性、および高抵抗耐性を示し、野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）が、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗよりも良好な効果をもたらし、さらに、除草剤耐性の効果を相乗的に向上させたことが示された。
【0139】
上記の表２および表３により、野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）が、相乗的に向上したＨＰＰＤ阻害除草剤耐性の効果を有したことが十分に示されている。
【0140】
実施例２：様々な種由来のＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）における組合せ変異、ならびにその変異効果の検証
ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異の相乗効果をさらに検証するために、（図３に示す）様々な種由来のＨＰＰＤの系統樹について分析した。変異効果を検証するために、様々な枝の代表的な種由来のＨＰＰＤを選択し、アミノ酸配列の３７２位および３８３位のアミノ酸を変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）させた。
ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異の相乗効果をさらに検証するために、（図３に示す）様々な種由来のＨＰＰＤの系統樹について分析した。変異効果を検証するために、様々な枝の代表的な種由来のＨＰＰＤを選択し、アミノ酸配列の３７２位および３８３位のアミノ酸を変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）させた。
【0141】
１．様々な種由来のＨＰＰＤおよび変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
（１）シロイヌナズナ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＨＰＰＤ（ＡｔＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に記載し、ＡｔＨＰＰＤをコードするＡｔＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号２４として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤをコードするＡｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２５として記載する。
（１）シロイヌナズナ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＨＰＰＤ（ＡｔＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に記載し、ＡｔＨＰＰＤをコードするＡｔＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号２４として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤをコードするＡｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２５として記載する。
【0142】
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号２６に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２７として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２８として記載する。
【0143】
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２９に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３０として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３１として記載する。
【0144】
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号３２に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３３として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３４として記載する。
【0145】
（２）アルファルファ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２ＡおよびＦ３８３Ｗ）の獲得
野生型アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）ＨＰＰＤ（ＭｓＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号３５として記載し、ＭｓＨＰＰＤをコードするＭｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号３６として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＭｓＨＰＰＤをコードするＭｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３７として記載する。
野生型アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）ＨＰＰＤ（ＭｓＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号３５として記載し、ＭｓＨＰＰＤをコードするＭｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号３６として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＭｓＨＰＰＤをコードするＭｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３７として記載する。
【0146】
ＭｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号３８に記載のＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３９として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４０として記載する。
【0147】
ＭｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号４１に記載のＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４２として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４３として記載する。
【0148】
ＭｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号４４に記載のＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４５として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４６として記載する。
【0149】
（３）ワタ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２ＡおよびＦ３８３Ｗ）の獲得
野生型ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＨＰＰＤ（ＧｓＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号４７として記載し、ＧｓＨＰＰＤをコードするＧｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号４８として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｓＨＰＰＤをコードするＧｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４９として記載する。
野生型ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＨＰＰＤ（ＧｓＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号４７として記載し、ＧｓＨＰＰＤをコードするＧｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号４８として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｓＨＰＰＤをコードするＧｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４９として記載する。
【0150】
ＧｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号５０に記載のＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５１として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５２として記載する。
【0151】
ＧｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号５３に記載のＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５４として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５５として記載する。
【0152】
ＧｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号５６に記載のＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５７として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５８として記載する。
【0153】
（４）アブラナ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２ＡおよびＦ３８３Ｗ）の獲得
野生型アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＨＰＰＤ（ＢｎＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号５９として記載し、ＢｎＨＰＰＤをコードするＢｎＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号６０として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＢｎＨＰＰＤをコードするＢｎＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６１として記載する。
野生型アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＨＰＰＤ（ＢｎＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号５９として記載し、ＢｎＨＰＰＤをコードするＢｎＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号６０として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＢｎＨＰＰＤをコードするＢｎＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６１として記載する。
【0154】
ＢｎＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号６２に記載のＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６３として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６４として記載する。
【0155】
ＢｎＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号６５に記載のＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６６として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６７として記載する。
【0156】
ＢｎＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号６８に記載のＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号６９として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７０として記載する。
【0157】
（５）ダイズ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２ＡおよびＦ３８３Ｗ）の獲得
野生型ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＨＰＰＤ（ＧｍＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号７１として記載し、ＧｍＨＰＰＤをコードするＧｍＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号７２として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｍＨＰＰＤをコードするＧｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７３として記載する。
野生型ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＨＰＰＤ（ＧｍＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号７１として記載し、ＧｍＨＰＰＤをコードするＧｍＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号７２として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｍＨＰＰＤをコードするＧｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７３として記載する。
【0158】
ＧｍＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号７４に記載のＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７５として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７６として記載する。
【0159】
ＧｍＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号７７に記載のＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７８として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号７９として記載する。
【0160】
ＧｍＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号８０に記載のＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８１として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８２として記載する。
【0161】
（６）タバコ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）ＨＰＰＤ（ＮｔＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号８３として記載し、ＮｔＨＰＰＤをコードするＮｔＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号８４として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＮｔＨＰＰＤをコードするＮｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８５として記載する。
野生型タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）ＨＰＰＤ（ＮｔＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号８３として記載し、ＮｔＨＰＰＤをコードするＮｔＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号８４として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＮｔＨＰＰＤをコードするＮｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８５として記載する。
【0162】
ＮｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号８６に記載のＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８７として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号８８として記載する。
【0163】
ＮｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号８９に記載のＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９０として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９１として記載する。
【0164】
ＮｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号９２に記載のＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９３として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９４として記載する。
【0165】
（７）イネ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＨＰＰＤ（ＯｓＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号９５として記載し、ＯｓＨＰＰＤをコードするＯｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号９６として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＯｓＨＰＰＤをコードするＯｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９７として記載する。
野生型イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＨＰＰＤ（ＯｓＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号９５として記載し、ＯｓＨＰＰＤをコードするＯｓＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号９６として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＯｓＨＰＰＤをコードするＯｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９７として記載する。
【0166】
ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号９８に記載のＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９９として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１００として記載する。
【0167】
ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１０１に記載のＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１０２として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１０３として記載する。
【0168】
ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１０４に記載のＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１０５として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１０６として記載する。
【0169】
（８）モロコシ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）ＨＰＰＤ（ＳｂＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１０７として記載し、ＳｂＨＰＰＤをコードするＳｂＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１０８として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＳｂＨＰＰＤをコードするＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１０９として記載する。
野生型モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）ＨＰＰＤ（ＳｂＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１０７として記載し、ＳｂＨＰＰＤをコードするＳｂＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１０８として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＳｂＨＰＰＤをコードするＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１０９として記載する。
【0170】
ＳｂＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１１０に記載のＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１１として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１２として記載する。
【0171】
ＳｂＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１１３に記載のＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１４として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１５として記載する。
【0172】
ＳｂＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１１６に記載のＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１７として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１１８として記載する。
【0173】
（９）オオムギ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）ＨＰＰＤ（ＨｖＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１１９として記載し、ＨｖＨＰＰＤをコードするＨｖＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２０として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨｖＨＰＰＤをコードするＨｖＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２１として記載する。
野生型オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）ＨＰＰＤ（ＨｖＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１１９として記載し、ＨｖＨＰＰＤをコードするＨｖＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２０として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨｖＨＰＰＤをコードするＨｖＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２１として記載する。
【0174】
ＨｖＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１２２に記載のＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２３として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２４として記載する。
【0175】
ＨｖＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１２５に記載のＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２６として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２７として記載する。
【0176】
ＨｖＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１２８に記載のＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１２９として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３０として記載する。
【0177】
（１０）トウモロコシ由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＨＰＰＤ（ＺｍＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１３１として記載し、ＺｍＨＰＰＤをコードするＺｍＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３２として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＺｍＨＰＰＤをコードするＺｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３３として記載する。
野生型トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＨＰＰＤ（ＺｍＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１３１として記載し、ＺｍＨＰＰＤをコードするＺｍＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３２として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＺｍＨＰＰＤをコードするＺｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３３として記載する。
【0178】
ＺｍＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１３４に記載のＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３５として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３６として記載する。
【0179】
ＺｍＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１３７に記載のＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３８として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１３９として記載する。
【0180】
ＺｍＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１４０に記載のＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１４１として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１４２として記載する。
【0181】
（１１）シュードモナス・フルオレセンス由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）の獲得
野生型シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤ（ＰｆＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１４３として記載し、ＰｆＨＰＰＤをコードするＰｆＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４４として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＰｆＨＰＰＤをコードするＰｆＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１４５として記載する。
野生型シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤ（ＰｆＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１４３として記載し、ＰｆＨＰＰＤをコードするＰｆＨＰＰＤ－０１ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４４として記載し、シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＰｆＨＰＰＤをコードするＰｆＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１４５として記載する。
【0182】
ＰｆＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１４６に記載のＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１４７として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１４８として記載する。
【0183】
ＰｆＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１４９に記載のＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５０として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５１として記載する。
【0184】
ＰｆＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１５２に記載のＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５３として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５４として記載する。
【0185】
２．様々な種由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗの組合せ変異、単一位置変異Ｆ３７２Ａまたは単一位置変異Ｆ３８３Ｗを有する）を含有する、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターの構築
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＰｆＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、およびＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３に正しく挿入されたことを確認した。
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＰｆＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、およびＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３に正しく挿入されたことを確認した。
【0186】
３．シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３、および実施例１の項目３で構築された対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用い、アグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３、および実施例１の項目３で構築された対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用い、アグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
【0187】
４．様々な種由来の変異ＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗの組合せ変異、単一位置変異Ｆ３７２Ａまたは単一位置変異Ｆ３８３Ｗを有する）を導入したシロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
本実施例２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３および実施例１の項目３で構築した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６ＮにおけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液にシロイヌナズナ花序を浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＭｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤ－０２）、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤ－０２）、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＢｎＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤ－０２）、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤ－０２）、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＮｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤ－０２）、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＯｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤ－０２）、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤ－０２）、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨｖＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤ－０２）、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＺｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤ－０２）、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＰｆＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤ－０２）、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、および、対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＤＢＮ１１７２６Ｎ）を得た。
本実施例２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０～ＤＢＮ１１７７３および実施例１の項目３で構築した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６ＮにおけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液にシロイヌナズナ花序を浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＭｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤ－０２）、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＭｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤ－０２）、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＢｎＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤ－０２）、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＢｎＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤ－０２）、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＧｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＮｔＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤ－０２）、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＮｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＯｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤ－０２）、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＯｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤ－０２）、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨｖＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤ－０２）、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨｖＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＺｍＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤ－０２）、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＺｍＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＰｆＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤ－０２）、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＰｆＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、および、対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＤＢＮ１１７２６Ｎ）を得た。
【0188】
上の実施例１の項目６に記載の方法に従い、前述のシロイヌナズナＴ１植物および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの濃度（２５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの濃度（３５ｇ ａｉ／ｈａ（半倍圃場濃度、０．５×）、７０ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの濃度（５２．５ｇ ａｉ／ｈａ（半倍圃場濃度、０．５×）、１０５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、除草剤に対するシロイヌナズナの耐性を検出した。実験結果を表４～表６に示す。
【0189】
【表4】
【表5】
【0190】
表４の結果から以下のことが示されている。（１）未変異のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物と比較して、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子、および３７２位における単一変異（Ｆ３７２Ａ）を有する様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、トプラメゾンに対する耐性の程度が異なっており、３８３位における単一変異（Ｆ３８３Ｗ）を有するいくつかの種（モロコシ、オオムギおよびトウモロコシ）由来のＨＰＰＤ遺伝子のみが、シロイヌナズナ植物にトプラメゾンに対する耐性を付与することができたが、ＣＫ植物および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎ植物は、トプラメゾンに対する耐性がなかった。
【0191】
（２）抵抗性評価の観点から、トプラメゾンに関しては、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する（アルファルファ以外の）様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性を示し、さらに、除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。
【0192】
（３）スコアの観点から、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するアルファルファ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物よりも耐性スコアが低かった。さらに、４倍圃場濃度のトプラメゾンで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異を有するアルファルファ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物の約５０％は、損傷レベルが等級０または等級１であり、３７２位における単一変異を有するアルファルファ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物の２５％は、損傷レベルが等級０または等級１であり、３８３位における単一変異を有するアルファルファ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物の中で、損傷レベルが等級０または１のシロイヌナズナ植物の数は０であった。このことは、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するアルファルファ由来のＨＰＰＤ遺伝子は、シロイヌナズナ植物に相乗的に向上した除草剤耐性を付与し得たことを示している。
【0193】
【表6】
【表7】
【表8】
【0194】
表５の結果から以下のことが示されている。（１）未変異のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物と比較して、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子、および３７２位における単一変異（Ｆ３７２Ａ）を有する様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、イソキサフルトールに対する耐性の程度が異なっており、３８３位における単一変異（Ｆ３８３Ｗ）を有するいくつかの種（モロコシ、オオムギおよびトウモロコシ）由来のＨＰＰＤ遺伝子のみが、シロイヌナズナ植物にイソキサフルトールに対する耐性を付与することができるが、ＣＫ植物および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎ植物は、イソキサフルトールに対する耐性がなかった。
【0195】
（２）抵抗性評価の観点から、イソキサフルトールに関しては、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する様々な種由来（トウモロコシ以外）のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性を示し、さらに、除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。
【0196】
（３）スコアの観点から、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するトウモロコシ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物よりも耐性スコアが低かった。さらに、１倍圃場濃度のイソキサフルトールで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異を有するトウモロコシ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物の約６９％は、損傷レベルが等級０または等級１であり、３７２位における単一変異を有するトウモロコシ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物の６％は、損傷レベルが等級０または等級１であり、３８３位における単一変異を有するトウモロコシ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物の中で、損傷レベルが等級０または等級１のシロイヌナズナ植物の数は０であった。このことは、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するトウモロコシ由来のＨＰＰＤ遺伝子は、シロイヌナズナ植物に相乗的に向上した除草剤耐性を付与し得ることを示している。
【0197】
【表9】
【表10】
【表11】
【0198】
表６の結果から以下のことが示されている。（１）未変異のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物と比較して、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子、および３７２位における単一変異（Ｆ３７２Ａ）を有する様々な種由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、メソトリオンに対する耐性の程度が異なっており、３８３位における単一変異（Ｆ３８３Ｗ）を有するいくつかの種（オオムギおよびトウモロコシ）由来のＨＰＰＤ遺伝子のみが、シロイヌナズナ植物にメソトリオンに対する耐性を付与することができるが、ＣＫ植物および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎ植物は、メソトリオンに対する耐性がなかった。
【0199】
（２）抵抗性評価の観点から、メソトリオンに関しては、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する様々な種由来（タバコ以外）のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性を示し、さらに、除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。
【0200】
（３）スコアの観点から、半倍または１倍の圃場濃度のメソトリオンで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するタバコ由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗのシロイヌナズナ植物よりも耐性スコアが低く、さらに、相乗的に向上した除草剤耐性の効果を示した。
【0201】
以上のことから、表４～表６の結果により、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を有する様々な種由来の全てのＨＰＰＤ遺伝子が、相乗的に向上した除草剤耐性の効果を植物に付与し得ることが示されている。
【0202】
実施例３：ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における異なる変異（組合せ変異Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗ）、ならびにその変異効果の検証
１．遺伝子ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３ＷおよびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗの獲得
（１）ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からグリシン（Ｇ）に変異させて、配列表の配列番号１５５に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５６として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５７として記載する。
１．遺伝子ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３ＷおよびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗの獲得
（１）ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からグリシン（Ｇ）に変異させて、配列表の配列番号１５５に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５６として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５７として記載する。
【0203】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からグリシン（Ｇ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１５８に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１５９として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６０として記載する。
【0204】
（２）ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）に変異させて、配列表の配列番号１６１に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６２として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６３として記載する。
【0205】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１６４に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６５として記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６６として記載する。
【0206】
２．エンバクＨＰＰＤ遺伝子（Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗ）を含有する、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターの構築
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２ヌクレオチド配列、およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７に正しく挿入されたことを確認した。
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２ヌクレオチド配列、およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７に正しく挿入されたことを確認した。
【0207】
３．シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換する方法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７、ならびにＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２９、および実施例１の項目３で構築した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７ならびにＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２９およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換する方法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７、ならびにＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２９、および実施例１の項目３で構築した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７ならびにＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２９およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
【0208】
４．ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２またはＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２のヌクレオチド配列を導入した遺伝子導入シロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
本実施例の項目２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２９、および実施例１の項目３で構築した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６ＮにおけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、シロイヌナズナ花序を本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液に浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物、および対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物を得た。
本実施例の項目２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７４～ＤＢＮ１１７７７、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２９、および実施例１の項目３で構築した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６ＮにおけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、シロイヌナズナ花序を本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液に浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物、および対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物を得た。
【0209】
５．Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗの相乗効果の検証
上の実施例１の項目６に記載の方法に従い、前述のシロイヌナズナＴ１植物および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、２００ｇ ａｉ／ｈａ（８倍圃場濃度、８×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの異なる濃度（すなわち、１４０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの異なる濃度（すなわち、２１０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、シロイヌナズナの除草剤耐性を検出した。実験結果を表７～表９に示す。
上の実施例１の項目６に記載の方法に従い、前述のシロイヌナズナＴ１植物および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、２００ｇ ａｉ／ｈａ（８倍圃場濃度、８×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの異なる濃度（すなわち、１４０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの異なる濃度（すなわち、２１０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、シロイヌナズナの除草剤耐性を検出した。実験結果を表７～表９に示す。
【0210】
【表12】
【0211】
表７の結果から、ＣＫと比較して、４倍または８倍の圃場濃度のトプラメゾンで処理した場合、シロイヌナズナ遺伝子型ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｇ－Ｆ３８３Ｗ－０２、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－０２およびＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ｖ－Ｆ３８３Ｗ－０２は全て高抵抗耐性を示したが、ＡｓＨＰＰＤ－０２および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎの植物は、トプラメゾンに対する耐性を示さなかったことが示されている。
【0212】
【表13】
【0213】
【表14】
【0214】
表８および表９の結果から以下のことが示されている。（１）ＣＫと比較して、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するエンバク由来のＨＰＰＤ遺伝子、３７２位における単一変異（Ｆ３７２ＧまたはＦ３７２Ｖ）を有するエンバク由来のＨＰＰＤ遺伝子、および３８３位における単一変異（Ｆ３８３Ｗ）を有するエンバク由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、イソキサフルトールおよびメソトリオンのどちらに対しても耐性の程度が異なっていたが、未変異のＨＰＰＤ遺伝子および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナ植物は、イソキサフルトールとメソトリオンのどちらに対しても耐性がなかった。
【0215】
（２）抵抗性評価の観点から、２倍圃場濃度のイソキサフルトールまたはメソトリオンで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するエンバク由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、３７２位における単一変異（中抵抗性）または３８３位における単一変異（中抵抗性）を有するＨＰＰＤ遺伝子が導入されたシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性（高抵抗性）を示した。４倍の圃場濃度のイソキサフルトールまたはメソトリオンで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異（Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗ）を有するエンバク由来のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、３７２位における単一変異（低抵抗性）または３８３位における単一変異（低抵抗性）を有するＨＰＰＤ遺伝子が導入されたシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性（高抵抗性）を示し、さらに除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。
【0216】
上記の表８および表９により、野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における異なる組合せ変異（組合せ変異Ｆ３７２Ｇ＋Ｆ３８３ＷまたはＦ３７２Ｖ＋Ｆ３８３Ｗ）もまた、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を相乗的に向上させたことが実証されている。
【0217】
実施例４：ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異と他の位置における変異との組合せ、ならびにその変異効果
１．複数の位置に組合せ変異を有する配列の獲得
（１）ＨＰＰＤｍ－１アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０７位の元のアラニン（Ａ）を欠失させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１６７に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６８に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６９に記載する。
１．複数の位置に組合せ変異を有する配列の獲得
（１）ＨＰＰＤｍ－１アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０７位の元のアラニン（Ａ）を欠失させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１６７に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６８に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１６９に記載する。
【0218】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０７位の元のアラニン（Ａ）を欠失させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１７０に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７１に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７２に記載する。
【0219】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０７位の元のアラニン（Ａ）を欠失させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１７３に記載のＨＰＰＤｍ－１アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－１アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－１－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７４に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－１アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－１－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７５に記載する。
【0220】
（２）ＨＰＰＤｍ－２アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１１１位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１７６に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７７に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７８に記載する。
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１１１位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させて、配列表の配列番号１７６に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７７に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１７８に記載する。
【0221】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１１１位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１７９に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８０に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８１に記載する。
【0222】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１１１位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１８２に記載のＨＰＰＤｍ－２アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－２アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－２－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８３に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－２アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－２－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８４に記載する。
【0223】
（３）ＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０６位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１８５に記載のＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－３－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８６に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－３－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８７に記載する。
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０６位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１８５に記載のＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－３－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８６に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－３アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－３－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８７に記載する。
【0224】
（４）ＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０７位の元のアラニン（Ａ）を欠失させ、３５１位のアミノ酸を元のリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１８８に記載のＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－４－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８９に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－４－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９０に記載する。
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０７位の元のアラニン（Ａ）を欠失させ、３５１位のアミノ酸を元のリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１８８に記載のＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－４－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１８９に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－４アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－４－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９０に記載する。
【0225】
（５）ＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１１１位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変異させ、３５１位のアミノ酸を元のリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１９１に記載のＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－５－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９２に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－５－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９３に記載する。
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１１１位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変異させ、３５１位のアミノ酸を元のリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１９１に記載のＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－５－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９２に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－５アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－５－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９３に記載する。
【0226】
（６）ＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）の獲得
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０６位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）に変異させ、３５１位のアミノ酸を元のリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１９４に記載のＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－６－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９５に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９６に記載する。
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の１０６位のアミノ酸を元のアラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）に変異させ、３５１位のアミノ酸を元のリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変異させ、３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号１９４に記載のＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列）を得た。ＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－６－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９５に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－６アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９６に記載する。
【0227】
（７）ＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列の獲得
ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列に基づいたエンバク由来のＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸を変異させることによってＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列を得、そのＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列を配列表の配列番号１９７に記載する。ＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－７－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９８に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－７－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９９に記載する。
ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列に基づいたエンバク由来のＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸を変異させることによってＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列を得、そのＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列を配列表の配列番号１９７に記載する。ＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－７－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９８に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－７アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－７－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１９９に記載する。
【0228】
（８）ＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列の獲得
ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列に基づいたエンバク由来のＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸を変異させることによってＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列を得、そのＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列を配列表の配列番号２００に記載する。ＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－８－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０１に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列をコードするＰＰＤｍ－８－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０２に記載する。
ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列に基づいたエンバク由来のＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸を変異させることによってＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列を得、そのＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列を配列表の配列番号２００に記載する。ＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－８－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０１に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－８アミノ酸配列をコードするＰＰＤｍ－８－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０２に記載する。
【0229】
（９）ＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列の獲得
ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列に基づいたエンバク由来のＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸を変異させることによってＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列を得、そのＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列を配列表の配列番号２０３に記載する。ＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－９－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０４に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０５に記載する。
ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０６Ｇ－Ｋ３５１Ｎ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗアミノ酸配列に基づいたエンバク由来のＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸を変異させることによってＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列を得、そのＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列を配列表の配列番号２０３に記載する。ＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－９－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０４に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＨＰＰＤｍ－９アミノ酸配列をコードするＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０５に記載する。
【0230】
２．複数の位置に組合せ変異を有するＨＰＰＤを含有する、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターの構築
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－１－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－２－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－３－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－４－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－５－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－７－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－８－０２ヌクレオチド配列、およびＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０に正しく挿入されたことを確認した。
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－１－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－２－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－３－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－４－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－５－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－７－０２ヌクレオチド配列、ＨＰＰＤｍ－８－０２ヌクレオチド配列、およびＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０に正しく挿入されたことを確認した。
【0231】
３．シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換する方法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０、およびＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ならびに実施例１の項目３の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０、ＤＢＮ１１７２７およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換する方法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０、およびＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ならびに実施例１の項目３の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０、ＤＢＮ１１７２７およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
【0232】
４．複数の位置に組合せ変異を有するＨＰＰＤが導入されたシロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
本実施例の項目２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、および実施例１の項目３の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６ＮにおけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、シロイヌナズナ花序を本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液に浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨＰＰＤｍ－１－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－１－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨＰＰＤｍ－２－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－２－０２）、ＨＰＰＤｍ－３－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－３－０２）、ＨＰＰＤｍ－４－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－４－０２）、ＨＰＰＤｍ－５－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－５－０２）、ＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－６－０２）、ＨＰＰＤｍ－７－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－７－０２）、ＨＰＰＤｍ－８－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－８－０２）、およびＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－９－０２）、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤ－０２）、ならびに対照組換え発現ベクターを導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＤＢＮ１１７２６Ｎ）を得た。
本実施例の項目２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１１７７８～ＤＢＮ１１７９０、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、および実施例１の項目３の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６ＮにおけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、シロイヌナズナ花序を本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液に浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨＰＰＤｍ－１－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－１－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２）、ＨＰＰＤｍ－２－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－２－０２）、ＨＰＰＤｍ－３－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－３－０２）、ＨＰＰＤｍ－４－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－４－０２）、ＨＰＰＤｍ－５－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－５－０２）、ＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－６－０２）、ＨＰＰＤｍ－７－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－７－０２）、ＨＰＰＤｍ－８－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－８－０２）、およびＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＨＰＰＤｍ－９－０２）、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤ－０２）、ならびに対照組換え発現ベクターを導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＤＢＮ１１７２６Ｎ）を得た。
【0233】
上の実施例１の項目６に記載の方法に従い、前述のシロイヌナズナＴ１植物および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、２００ｇ ａｉ／ｈａ（８倍圃場濃度、８×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの異なる濃度（すなわち、１４０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの異なる濃度（すなわち、２１０ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、シロイヌナズナの除草剤耐性を検出した。実験結果を表１０～表１２に示す。
【0234】
【表15】
【0235】
表１０の結果から以下のことが示されている。（１）ＣＫおよび未変異のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物と比較して、４倍または８倍の圃場濃度のトプラメゾンで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異と他の位置における変異（Ａ１０７欠失、Ａ１１１Ｔ、Ａ１０６Ｇ、Ａ１０７＋Ｋ３５１Ｎ、Ａ１１１Ｔ＋Ｋ３５１Ｎ、Ａ１０６Ｇ＋Ｋ３５１Ｎ、Ａ１０７＋Ｋ３５１Ｎ＋Ｃ末端変異、Ａ１１１Ｔ＋Ｋ３５１Ｎ＋Ｃ末端変異、またはＡ１０６Ｇ＋Ｋ３５１Ｎ＋Ｃ末端変異など）との組合せを有するＨＰＰＤ遺伝子は全て、トプラメゾンに対する高抵抗耐性を植物に付与することができる。このことは、ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位＋３８３位における組合せ変異と他の位置における変異との組合せが、３７２位＋３８３位における組合せ変異単独のトプラメゾン耐性に影響を及ぼさなかったことを示しており、また、ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異によって付与されるＨＰＰＤ阻害除草剤に対する植物の耐性の重要性と安定性を示している。対照的に、対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物は、トプラメゾンに対する耐性がなかった。
【0236】
【表16】
【0237】
【表17】
【0238】
表１１および表１２の結果から以下のことが示されている。（１）ＣＫおよび未変異のＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物と比較して、２倍または４倍の圃場濃度のイソキサフルトールおよびメソトリオンで処理した場合、３７２位および３８３位における組合せ変異と他の位置における変異（Ａ１０７欠失、Ａ１１１Ｔ、Ａ１０６Ｇ、Ａ１０７＋Ｋ３５１Ｎ、Ａ１１１Ｔ＋Ｋ３５１Ｎ、Ａ１０６Ｇ＋Ｋ３５１Ｎ、Ａ１０７＋Ｋ３５１Ｎ＋Ｃ末端変異、Ａ１１１Ｔ＋Ｋ３５１Ｎ＋Ｃ末端変異、またはＡ１０６Ｇ＋Ｋ３５１Ｎ＋Ｃ末端変異など）との組合せを有するＨＰＰＤ遺伝子は全て、イソキサフルトールおよびメソトリオンに対する高抵抗耐性を植物に付与することができるが、対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したシロイヌナズナＴ１植物は、イソキサフルトールおよびメソトリオンに対する耐性がなかった。
【0239】
（２）抵抗性評価の観点から、４倍圃場濃度のイソキサフルトールまたはメソトリオンで処理した場合、ＨＰＰＤｍ－１－０２（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２）遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３７２Ａ－０２遺伝子（低抵抗性）またはＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１０７－Ｆ３８３Ｗ－０２遺伝子（低抵抗性）を導入したシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性（高抵抗性）を示し、さらに、除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。同様に、ＨＰＰＤｍ－２－０２（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ）遺伝子を導入したシロイヌナズナ植物は、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３７２Ａ－０２遺伝子（低抵抗性）またはＡｓＨＰＰＤｍ－Ａ１１１Ｔ－Ｆ３８３Ｗ－０２遺伝子（低抵抗性）を導入したシロイヌナズナ植物よりも良好な除草剤耐性（高抵抗性）を示し、さらに、除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。したがって、ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位＋３８３位における合せ変異と他の位置における変異との組合せは、３７２位＋３８３位における組合せ変異単独のＨＰＰＤ阻害除草剤に対する相乗的に向上した除草剤耐性に影響を及ぼさなかった。さらに、ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異によって付与されるＨＰＰＤ阻害除草剤に対する植物の耐性の重要性と安定性が示されている。
【0240】
（３）抵抗性スコアの観点から、４倍圃場濃度のイソキサフルトールで処理した場合、ＨＰＰＤｍ－７－０２～ＨＰＰＤｍ－９－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物は、ＨＰＰＤｍ－１－０２～ＨＰＰＤｍ－６－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物よりも抵抗性スコアが高く（０）、ＨＰＰＤアミノ酸配列のＣ末端の最適化が、イソキサフルトールに対する植物の耐性を向上させるのに有利であることが示された。
【0241】
実施例５：ＨＰＰＤアミノ酸配列の組合せ変異（組合せ変異Ｆ３７２Ａ（Ｆ３７２Ｇ／Ｆ３７２Ｖ）＋Ｆ３８３Ｗではない）およびその変異効果の検証
１．エンバクおよびシロイヌナズナ由来のＨＰＰＤアミノ酸配列の変異遺伝子（組合せ変異Ｆ３７２Ａ（Ｆ３７２Ｇ／Ｆ３７２Ｖ）＋Ｆ３８３Ｗではない）の獲得
（１）エンバク由来のＨＰＰＤの組合せ変異遺伝子（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ４１５Ｗ）
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の４１５位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２０６に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０７に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０８に記載する。
１．エンバクおよびシロイヌナズナ由来のＨＰＰＤアミノ酸配列の変異遺伝子（組合せ変異Ｆ３７２Ａ（Ｆ３７２Ｇ／Ｆ３７２Ｖ）＋Ｆ３８３Ｗではない）の獲得
（１）エンバク由来のＨＰＰＤの組合せ変異遺伝子（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ４１５Ｗ）
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の４１５位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２０６に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０７に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２０８に記載する。
【0242】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、４１５位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２０９に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１０に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１１に記載する。
【0243】
（２）シロイヌナズナ由来のＨＰＰＤの組合せ変異遺伝子（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ４１５Ｗ）
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の４２４位のアミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列の４１５位に対応、すなわち４１５番目）を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２１２に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１３に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１４に記載する。
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の４２４位のアミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列の４１５位に対応、すなわち４１５番目）を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２１２に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１３に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１４に記載する。
【0244】
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、４１５位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）に変異させて、配列表の配列番号２１５に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１６に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１７に記載する。
【0245】
（３）エンバク由来のＨＰＰＤの組合せ変異遺伝子（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｙ）
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）に変異させて、配列表の配列番号２１８に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１９に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２０に記載する。
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）に変異させて、配列表の配列番号２１８に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２１９に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２０に記載する。
【0246】
ＡｓＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位の位置のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）に変異させて、配列表の配列番号２２１に記載のＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列を得た。ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２２に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２３に記載する。
【0247】
（４）シロイヌナズナ由来のＨＰＰＤの組合せ変異遺伝子（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｙ）
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３９２位のアミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列の３８３位に対応、すなわち３８３番目）を元のフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）に変異させて、配列表の配列番号２２４に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２５に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２６に記載する。
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３９２位のアミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列の３８３位に対応、すなわち３８３番目）を元のフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）に変異させて、配列表の配列番号２２４に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２５に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２６に記載する。
【0248】
ＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変異させ、３８３位のアミノ酸を元のフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）に変異させて、配列表の配列番号２２７に記載のＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列を得た。ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０１ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２８に記載する。シロイヌナズナ／ダイズ共通のコドン使用バイアスに基づいて得た、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙアミノ酸配列をコードするＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２９に記載する。
【0249】
２．変異ＨＰＰＤ遺伝子（組合せ変異Ｆ３７２Ａ（Ｆ３７２Ｇ／Ｆ３７２Ｖ）＋Ｆ３８３Ｗではない）を含有する、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターの構築
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列、およびＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８に正しく挿入されたことを確認した。
上の実施例１の項目３に記載の、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６の構築方法に従って、ユニバーサル・アダプター・プライマー１に連結したＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列、およびＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化したＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応させて、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８を順に得た。配列決定法により、前述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８に正しく挿入されたことを確認した。
【0250】
３．シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換する方法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２８、ＡｔＨＰＰＤｍ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例２の項目２の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０、およびＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例２の項目２の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３１をそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８、ＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８、ＤＢＮ１１７３０およびＤＢＮ１１７３１の構造が、完全に正しいことが示された。
上の実施例１の項目４に記載の、シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換する方法に従って、正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２７、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例１の項目３の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２８、ＡｔＨＰＰＤｍ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例２の項目２の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３０、およびＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を含有する実施例２の項目２の組換え発現ベクターＤＢＮ１１７３１をそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。その結果を配列決定法によって確認したところ、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８、ＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８、ＤＢＮ１１７３０およびＤＢＮ１１７３１の構造が、完全に正しいことが示された。
【0251】
４．変異ＨＰＰＤ遺伝子（組合せ変異Ｆ３７２Ａ（Ｆ３７２Ｇ／Ｆ３７２Ｖ）＋Ｆ３８３Ｗではない）が導入されたシロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８、ＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８、ＤＢＮ１１７３０および実施例２で構築したＤＢＮ１１７３１におけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液にシロイヌナズナ花序を浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－０２）、およびＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）を得た。上の実施例１の項目６に記載の方法に従い、前述のシロイヌナズナＴ１植物および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、２５ ｇ ａｉ／ｈａ （１倍圃場濃度、１×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを５つの異なる濃度（すなわち、３５ｇ ａｉ／ｈａ（半倍圃場濃度、０．５×）、７０ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、１４０ ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ ｇ ａｉ／ｈａ （４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））（それらのうち、シロイヌナズナ由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、０．５×および１×の濃度のイソキサフルトールを使用し、エンバク由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、２×および４×の濃度のイソキサフルトールを使用した）で、ならびにメソトリオンを５つの異なる濃度（すなわち、５２．５ｇ ａｉ／ｈａ（半倍圃場濃度、０．５×）、１０５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、２１０ ｇ ａｉ／ｈａ （２倍圃場濃度、２×）、４２０ ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））（それらのうち、シロイヌナズナ由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、０．５×および１×の濃度のメソトリオンを使用し、エンバク由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、２×および４×の濃度のメソトリオンを使用した）でそれぞれ散布して、シロイヌナズナの除草剤耐性を検出した。実験結果を表１３～表１５に示す。
組換え発現ベクターＤＢＮ１１７９１～ＤＢＮ１１７９８、ＤＢＮ１１７２７、ＤＢＮ１１７２８、ＤＢＮ１１７３０および実施例２で構築したＤＢＮ１１７３１におけるＴ－ＤＮＡをシロイヌナズナ染色体に導入するために、上の実施例１の項目５に記載の方法に従い、本実施例の項目３に記載のアグロバクテリウムの溶液にシロイヌナズナ花序を浸漬することによって、それぞれに対応する遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た。すなわち、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ４１５Ｗ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｙ－０２）、ＡｓＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤ－０２）、ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｓＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）、ＡｔＨＰＰＤｍ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－０２）、およびＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したシロイヌナズナＴ１植物（ＡｔＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２）を得た。上の実施例１の項目６に記載の方法に従い、前述のシロイヌナズナＴ１植物および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（播種から１８日後）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、２５ ｇ ａｉ／ｈａ （１倍圃場濃度、１×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを５つの異なる濃度（すなわち、３５ｇ ａｉ／ｈａ（半倍圃場濃度、０．５×）、７０ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、１４０ ｇ ａｉ／ｈａ（２倍圃場濃度、２×）、２８０ ｇ ａｉ／ｈａ （４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））（それらのうち、シロイヌナズナ由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、０．５×および１×の濃度のイソキサフルトールを使用し、エンバク由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、２×および４×の濃度のイソキサフルトールを使用した）で、ならびにメソトリオンを５つの異なる濃度（すなわち、５２．５ｇ ａｉ／ｈａ（半倍圃場濃度、０．５×）、１０５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、２１０ ｇ ａｉ／ｈａ （２倍圃場濃度、２×）、４２０ ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））（それらのうち、シロイヌナズナ由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、０．５×および１×の濃度のメソトリオンを使用し、エンバク由来の変異ＨＰＰＤを導入したシロイヌナズナＴ１植物への散布には、０×、２×および４×の濃度のメソトリオンを使用した）でそれぞれ散布して、シロイヌナズナの除草剤耐性を検出した。実験結果を表１３～表１５に示す。
【0252】
【表18】
【0253】
【表19】
【0254】
【表20】
【0255】
表１３～表１５の結果から、組合せ変異Ｆ３７２Ａ＋Ｆ４１５ＷまたはＦ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｙを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナＴ１植物、および単一位置変異Ｆ３７２Ａを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したシロイヌナズナＴ１植物は、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して実質的に異なる耐性を示さなかったことが示されている。したがって、ＨＰＰＤアミノ酸配列の任意の２つの位置における全ての組合せ変異が、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する相乗的に向上した耐性を植物に付与できるわけではないことがわかり、また、本発明のＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位＋３８３位における変異によって生じる相乗的に向上した技術的効果が予想外であることも示されている。
【0256】
実施例６：遺伝子導入ダイズ植物の獲得および検証
１．組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
実施例２の項目２の、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５８、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５９、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７６０、およびＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７６１、ならびに実施例１の項目３の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（インビトロジェン、米国シカゴ、ＣＡＴ：１８３１３－０１５）に形質転換した。この形質転換は以下の形質転換条件の下で行った。１００μＬのアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４、および３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養した後、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５８、ＤＢＮ１１７５９、ＤＢＮ１１７６０、ＤＢＮ１１７６１およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
１．組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
実施例２の項目２の、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５８、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５９、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７６０、およびＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１１７６１、ならびに実施例１の項目３の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いてアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（インビトロジェン、米国シカゴ、ＣＡＴ：１８３１３－０１５）に形質転換した。この形質転換は以下の形質転換条件の下で行った。１００μＬのアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４、および３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養した後、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５８、ＤＢＮ１１７５９、ＤＢＮ１１７６０、ＤＢＮ１１７６１およびＤＢＮ１１７２６Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
【0257】
２．遺伝子導入ダイズ植物の獲得
組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５８、ＤＢＮ１１７５９、ＤＢＮ１１７６０、ＤＢＮ１１７６１およびＤＢＮ１１７２６ＮのＴ－ＤＮＡ（ゴマノハグサ・モザイク・ウイルス３４Ｓエンハンサー配列、アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）プロモーター配列、シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド配列、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子、エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子ターミネーター配列、シロイヌナズナユビキチン１０遺伝子プロモーター配列、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター配列、ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチル基転移酵素遺伝子、およびカリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター配列を含む）をダイズ染色体に導入するために、従来のアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したダイズ変種Ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ１３の子葉節組織を、本実施例の項目１に記載のアグロバクテリウムと共培養することにより、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したダイズ植物を得た。
組換え発現ベクターＤＢＮ１１７５８、ＤＢＮ１１７５９、ＤＢＮ１１７６０、ＤＢＮ１１７６１およびＤＢＮ１１７２６ＮのＴ－ＤＮＡ（ゴマノハグサ・モザイク・ウイルス３４Ｓエンハンサー配列、アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）プロモーター配列、シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド配列、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子、エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子ターミネーター配列、シロイヌナズナユビキチン１０遺伝子プロモーター配列、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター配列、ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチル基転移酵素遺伝子、およびカリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター配列を含む）をダイズ染色体に導入するために、従来のアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したダイズ変種Ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ１３の子葉節組織を、本実施例の項目１に記載のアグロバクテリウムと共培養することにより、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物、および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したダイズ植物を得た。
【0258】
アグロバクテリウム媒介のダイズ形質転換では、簡単に述べると、ダイズ発芽培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、スクロース２０ｇ／Ｌ、および寒天８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）でダイズ成熟種子を発芽させ、次いで、温度２５±１℃、光周期（明期／暗期）１６時間／８時間の条件下で培養した。発芽の４～６日後に、明緑色の子葉節で膨らんだダイズ無菌実生を採取し、子葉節から３～４ミリメータ下の胚軸を切り取り、子葉下軸を縦に切断し、頂芽、側芽、および種子根を除去した。メスの背を用いて子葉節に創傷を作り、創傷子葉節組織にアグロバクテリウム懸濁液を接触させた。ここで、アグロバクテリウムは、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、またはＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を、創傷子葉節組織に転移させることができる（工程１：感染工程）。この工程では、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６６０＝０．５～０．８、感染培地（ＭＳ塩２．１５ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、スクロース２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ：ＡＳ）４０ｍｇ／Ｌ、２－モルホリンエタンスルホン酸（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＭＥＳ）４ｇ／Ｌ、およびゼアチン（ｚｅａｔｉｎ：ＺＴ）２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．３））に子葉節組織を好ましくは浸漬して、接種を開始した。その子葉節組織を、アグロバクテリウムと一定期間（３日間）、共培養した（工程２：共培養工程）。好ましくは、感染工程の後、固体培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、スクロース２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、ＭＥＳ４ｇ／Ｌ、ＺＴ２ｍｇ／Ｌ、および寒天８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）で子葉節組織を培養した。この共培養段階の後、任意選択で「回収」工程を設けることができ、この工程では、アグロバクテリウムの増殖を阻害するために少なくとも１つの抗生物質（セファロスポリン１５０～２５０ｍｇ／Ｌ）を添加し、植物形質転換体のための選択剤を添加していない回収培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、ＺＴ２ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、およびアスパラギン酸１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）を使用した（工程３：回収工程）。好ましくは、子葉節から再生された組織塊を、抗生物質を含有し選択剤を含有しない固体培地で培養して、アグロバクテリウムを排除し、感染細胞のための回収段階を提供した。その後、子葉節から再生された組織塊を、選択剤（グリホサート）を含有する培地で培養し、増殖途中の形質転換カルスを選択した（工程４：選択工程）。好ましくは、選択剤を含有するスクリーニング固体培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、ビタミンＢ５、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、６－ベンジルアデニン（６－ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ：６－ＢＡＰ）１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸１００ｍｇ／Ｌ、およびＮ－（ホスホノメチル）グリシン０．２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．６）において、子葉節から再生された組織塊を培養することによって、形質転換細胞を選択的に増殖させた。次いで、形質転換細胞から植物を再生させた（工程５：再生工程）。好ましくは、選択剤を含有する培地で増殖させた子葉節から再生された組織塊を、固体培地（Ｂ５分化培地およびＢ５発根培地）で培養して、植物を再生した。
【0259】
スクリーニングした抵抗性組織をＢ５分化培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、ＺＴ１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸５０ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸５０ｍｇ／Ｌ、ジベレリン１ｍｇ／Ｌ、オーキシン１ｍｇ／Ｌ、およびＮ－（ホスホノメチル）グリシン０．２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．６）に移し、分化のため２５℃で培養した。分化した実生をＢ５発根培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、インドール－３－酪酸（ｉｎｄｏｌｅ－３－ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：ＩＢＡ）１ｍｇ／Ｌ）に移し、その発根培地において２５℃で培養して高さ約１０ｃｍにした後、ガラス温室に移して結実させた。温室では、２６℃で１６時間、当該植物を培養し、次いで２０℃で１日８時間培養した。
【0260】
ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ０植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ０植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ０植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ０植物、および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したダイズＴ０植物を、栽培し繁殖させるために温室内に移植して、それぞれに対応する遺伝子導入Ｔ１植物を得た。
【0261】
３．ＴａｑＭａｎを用いた遺伝子導入ダイズ植物の検証
ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したダイズＴ１植物から葉１００ｍｇを試料として採取し、そのゲノムＤＮＡをキアゲンのＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて抽出し、変異ＨＰＰＤ遺伝子のコピー数を決定するために、ＴａｑＭａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法によりＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数を検出した。同時に、野生型ダイズ植物を対照として使用し、上述の方法に従って検出および解析を行った。実験には３回の繰り返しを設定し、平均化した。
ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎを導入したダイズＴ１植物から葉１００ｍｇを試料として採取し、そのゲノムＤＮＡをキアゲンのＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて抽出し、変異ＨＰＰＤ遺伝子のコピー数を決定するために、ＴａｑＭａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法によりＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数を検出した。同時に、野生型ダイズ植物を対照として使用し、上述の方法に従って検出および解析を行った。実験には３回の繰り返しを設定し、平均化した。
【0262】
ＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数を検出する具体的な方法は、以下の通りであった。
【0263】
工程１１：ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、および野生型ダイズ植物から葉１００ｍｇを採取し、液体窒素を使用して乳鉢でホモジネートに粉砕し、各試料について３回の繰り返しを行った。
【0264】
工程１２：キアゲンのＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用し、製品マニュアルに記載された特定の方法で、上述の試料のゲノムＤＮＡを抽出した。
【0265】
工程１３：ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（サーモ・サイエンティフィック）を使用して、上述の試料のゲノムＤＮＡの濃度を検出した。
【0266】
工程１４：上述の各試料のゲノムＤＮＡの濃度を、８０～１００ｎｇ／μＬの範囲の同じ値に調整した。
【0267】
工程１５：Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法を用いて、試料のコピー数を特定した。ここでは、コピー数が既知で特定されている試料を標準とし、野生型ダイズ植物の試料を対照とし、各試料について３回の繰り返しを行って平均化した。蛍光定量ＰＣＲプライマーおよびプローブの配列は、以下の通りであった。
【0268】
ＥＰＳＰＳ遺伝子配列の検出には、以下のプライマーおよびプローブを使用した。
プライマー１：配列表の配列番号２３２に記載のｃｔｇｇａａｇｇｃｇａｇｇａｃｇｔｃａｔｃａａｔａ
プライマー２：配列表の配列番号２３３に記載のｔｇｇｃｇｇｃａｔｔｇｃｃｇａａａｔｃｇａｇ
プローブ１：配列表の配列番号２３４に記載のａｔｇｃａｇｇｃｇａｔｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃａｔｃｃｇｔａ
ＰＣＲ反応系：
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（シグマ） １０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物 １μＬ
ゲノムＤＮＡ ３μＬ
水（ｄｄＨ２Ｏ） ６μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物は、濃度１ｍＭの各プライマー４５μＬ、濃度１００μＭのプローブ５０μＬ、および１×ＴＥ緩衝液８６０μＬを含み、アンバーチューブに入れて４℃で保存した。
ＰＣＲ反応条件：
工程
温度
時間
２１
９５℃
５分
２２
９５℃
３０秒
２３
６０℃
１分
２４
工程２２に戻り、４０回繰り返す
ソフトウェアＳＤＳ２．３（アプライド・バイオシステムズ）を使用し、データを解析した。
プライマー１：配列表の配列番号２３２に記載のｃｔｇｇａａｇｇｃｇａｇｇａｃｇｔｃａｔｃａａｔａ
プライマー２：配列表の配列番号２３３に記載のｔｇｇｃｇｇｃａｔｔｇｃｃｇａａａｔｃｇａｇ
プローブ１：配列表の配列番号２３４に記載のａｔｇｃａｇｇｃｇａｔｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃａｔｃｃｇｔａ
ＰＣＲ反応系：
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（シグマ） １０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物 １μＬ
ゲノムＤＮＡ ３μＬ
水（ｄｄＨ２Ｏ） ６μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物は、濃度１ｍＭの各プライマー４５μＬ、濃度１００μＭのプローブ５０μＬ、および１×ＴＥ緩衝液８６０μＬを含み、アンバーチューブに入れて４℃で保存した。
ＰＣＲ反応条件：
工程
温度
時間
２１
９５℃
５分
２２
９５℃
３０秒
２３
６０℃
１分
２４
工程２２に戻り、４０回繰り返す
ソフトウェアＳＤＳ２．３（アプライド・バイオシステムズ）を使用し、データを解析した。
【0269】
ＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数に関する実験結果を解析することにより、さらに、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列、および対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎが全て、検出されたダイズ植物の染色体に組み込まれており、ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物の全てが、単一コピーの遺伝子導入ダイズ植物となったことが実証された。
【0270】
４．遺伝子導入ダイズ植物のＨＰＰＤ阻害除草剤に対する除草剤耐性の検出
ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、および野生型ダイズ植物（実生段階のＶ３～Ｖ４）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、２５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの異なる濃度（すなわち、７０ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの異なる濃度（すなわち、１０５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、ダイズ植物の除草剤耐性を検出した。実施例１の項目６の方法に従って、散布の７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤による各植物の損傷度を統計的に解析し、それに応じてスコアリングおよび抵抗性評価を行った。ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ１およびＳ２）からなり、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ３およびＳ４）からなり、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ５およびＳ６）からなり、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ７およびＳ８）からなり、対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計１つの系統（Ｓ９）からなり、野生型ダイズ植物は合計１つの系統（ＣＫ１）からなった。各系統から８株の植物を選択し、検出した。その結果を表１６～表１８に示す。
ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎヌクレオチド配列を導入したダイズＴ１植物、および野生型ダイズ植物（実生段階のＶ３～Ｖ４）に、トプラメゾンを３つの異なる濃度（すなわち、２５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、イソキサフルトールを３つの異なる濃度（すなわち、７０ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、２８０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにメソトリオンを３つの異なる濃度（すなわち、１０５ｇ ａｉ／ｈａ（１倍圃場濃度、１×）、４２０ｇ ａｉ／ｈａ（４倍圃場濃度、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））でそれぞれ散布して、ダイズ植物の除草剤耐性を検出した。実施例１の項目６の方法に従って、散布の７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤による各植物の損傷度を統計的に解析し、それに応じてスコアリングおよび抵抗性評価を行った。ＳｂＨＰＰＤ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ１およびＳ２）からなり、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ３およびＳ４）からなり、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ５およびＳ６）からなり、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２ヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計２つの系統（Ｓ７およびＳ８）からなり、対照ベクターＤＢＮ１１７２６Ｎヌクレオチド配列を導入したダイズ植物は合計１つの系統（Ｓ９）からなり、野生型ダイズ植物は合計１つの系統（ＣＫ１）からなった。各系統から８株の植物を選択し、検出した。その結果を表１６～表１８に示す。
【0271】
【表21】
【0272】
【表22】
【0273】
【表23】
【0274】
表１６～表１８の結果から以下のことが示されている。（１）未変異のＨＰＰＤ遺伝子を導入したダイズ植物および野生型ダイズ植物と比較して、ダイズ植物ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－０２、ＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３８３Ｗ－０２およびＳｂＨＰＰＤｍ－Ｆ３７２Ａ－Ｆ３８３Ｗ－０２は、異なる濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤に対して程度が異なる耐性を産生することができたが、ＤＢＮ１１７２６Ｎは、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性がなかった。（２）３７２位および３８３位に組合せ変異を有するＨＰＰＤ遺伝子（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）を導入したダイズ植物は、単一位置変異Ｆ３７２ＡまたはＦ３８３Ｗを有するＨＰＰＤ遺伝子を導入したダイズ植物よりも良好な除草剤耐性を示し、さらに、除草剤耐性の効果が相乗的に向上した。このことは、変異させたＨＰＰＤ（Ｆ３７２Ａ＋Ｆ３８３Ｗ）が、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する相乗的に向上した耐性を遺伝子導入ダイズ植物に付与し得ることを示しており、さらに、ＨＰＰＤアミノ酸配列の３７２位および３８３位における組合せ変異によって付与されるＨＰＰＤ阻害除草剤に対する植物の除草剤耐性の重要性および安定性を示している。
【0275】
結論として、本発明は、様々な種由来のヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼポリペプチドの３７２位および３８３位における組合せ変異が、ＨＰＰＤ阻害除草剤のピラゾリネート類、イソキサゾール類およびトリケトン類に対する相乗的に向上した耐性を植物に付与し得、特に、４倍の圃場濃度のトプラメゾン、イソキサフルトールまたはメソトリオンに対する耐性を遺伝子導入ダイズ植物に付与し得ることを初めて開示する。したがって、本発明には、植物における広域施用の見込みがある。
【0276】
最後に、上記の全ての実施例は、本発明を限定するためではなく、本発明の実施形態を説明するためにのみ用いられていることに留意されたい。好ましい実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、本発明の実施形態は、本発明の技術的解決法の趣旨および範囲から逸脱することなく、等価的に改変または置換され得ることを当業者は理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】