特表 2025-500910 植物を編集するための改変アグロバクテリア

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-15

(54)【発明の名称】植物を編集するための改変アグロバクテリア

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20250107BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20250107BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20250107BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20250107BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20250107BHJP

   C12N 15/84 20060101ALN20250107BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20250107BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

A01H1/00 A

A01H5/00 A

C12N15/09 110

C12N15/31

C12N15/09 100

C12N15/84 Z

C12N15/60

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536073

(86)(22)【出願日】2022-12-15

(85)【翻訳文提出日】2024-08-13

(86)【国際出願番号】 EP2022086045

(87)【国際公開番号】W WO2023111130

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】2118416.3

(32)【優先日】2021-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519428096

【氏名又は名称】トロピック バイオサイエンシーズ ユーケー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】ラダー、スティーヴン

(72)【発明者】

【氏名】グリーン、ロバート トリスタン

(72)【発明者】

【氏名】マオリ、エヤル

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA11X

4B065AA11Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA53

(57)【要約】

本発明は、植物細胞中の標的配列に所望の変異を導入するための改変アグロバクテリアに関し、この細菌はVirD5活性が低下しており、部位特異的DNA編集機構を保有している。また、本発明は、そのような細菌を用いて植物細胞、植物部分、植物またはそれらの集団を作製する方法を提供する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物細胞にヌクレオチド配列を導入することができる細菌であって：
(c) vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列であって、VirD5の発現および／または活性が低下したまたは破壊された、ヌクレオチド配列、および
(d) 植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードするT-DNA配列
を含む、細菌。

【請求項2】

請求項1に記載の細菌であって、部位特異的DNA編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、CRISPR関連エンドヌクレアーゼおよび改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む、細菌。

【請求項3】

請求項1に記載の細菌であって、部位特異的DNA編集剤が、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列が、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする、細菌。

【請求項4】

請求項1に記載の細菌であって、部位特異的DNA編集剤が、塩基エディター、プライムエディター、Cas9エンドヌクレアーゼ、またはSpCas9、xCas9、SpCas9-NG、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、CjCas9、NmCas9、StCas9、TdCas9、eSpCas9、HypaCas9、Cas9-SpRY／SpG、Cas4-Cas1-Cas2複合体およびMAD7からなる群から選択される、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含む、細菌。

【請求項5】

請求項1に記載の細菌であって、部位特異的DNA編集剤が塩基エディターを含み、T-DNA配列が植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする、細菌。

【請求項6】

請求項1に記載の細菌であって、部位特異的DNA編集剤がプライムエディターを含み、T-DNA配列が、植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的なpegRNAである1つ以上のガイドRNAもコードする、細菌。

【請求項7】

請求項1に記載の細菌であって、部位特異的DNA編集剤が、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列が、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレートもコードし、任意で、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする、細菌。

【請求項8】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、またはエンシファー属の細菌であり、任意で、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ファブラム str.C58、アグロバクテリウム・ジェノモスプ、アグロバクテリウム sp.S2/73、アグロバクテリウム sp.13-2099-1-2、アグロバクテリウム sp.NCPPB925、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・サリニトレランス、アグロバクテリウム・ヴィティス、アグロバクテリウム・アルセニイェビッチ、アグロバクテリウム・デルタエンセ、アグロバクテリウム・ラリームーレイ、リゾビウム sp.AB2/73、リゾビウム sp.16-488-2b、リゾビウム sp.16-488-2a, リゾビウム sp. 16-449-1b, リゾビウム sp. L58/93, リゾビウム sp. L245/93, リゾビウム sp. E27B/91, リゾビウム sp. K1/93, リゾビウム sp.BK007、リゾビウム・チューモリジーンズ、リゾビウム・スキエルニウィセンス、リゾビウム・ルシタナム、ネオリゾビウム sp.NCHU2750、ネオリゾビウム・ガレガエ、エンシファー sp.YR511、およびエンシファー・アドヘレンスからなる群から選択される、細菌。

【請求項9】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性が破壊された、細菌。

【請求項10】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、前記vir起源をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性の低下または破壊が、VirD5をコードする配列中の少なくとも1つの変異によって媒介される、細菌。

【請求項11】

請求項１０に記載の細菌であって、前記VirD5をコードする配列における少なくとも1つの変異が：
(a）少なくとも1つのヌクレオチド挿入；
(b）少なくとも1つのヌクレオチド欠失；
(c）挿入-欠失（indel）；
(d) 逆位；
(e）少なくとも1つのヌクレオチド置換；および
(f) (a)から(e)のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択され、
ここで、任意で、挿入または欠失は、フレームシフト挿入またはフレームシフト欠失である、細菌。

【請求項12】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、Vir-ヘルパープラスミド、TiプラスミドまたはRiプラスミドなどのプラスミドである、細菌。

【請求項13】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、植物細胞がバナナ細胞であり、少なくとも1つの標的配列がACOまたはPPO、好ましくはACO1またはPPO2を含む、細菌。

【請求項14】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、植物細胞における少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異が、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を含み、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性である、細菌。

【請求項15】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、植物細胞における少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ここで、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異がALS阻害剤に対する耐性を提供し、任意で、ALS遺伝子が、バナナにおけるアセト乳酸合成酵素1（ALS1）遺伝子またはアセト乳酸合成酵素2（ALS2）遺伝子であり、ここで、植物細胞がバナナ細胞である、細菌。

【請求項16】

請求項１４または１５に記載の細菌であって、T-DNA配列が、追加の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードする、細菌。

【請求項17】

先行請求項のいずれかに記載の細菌であって、T-DNA配列が：
(a) 少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、
(b） 第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNA、および
(c） 第２の標的配列に特異的な第２のガイドRNA、
をコードし、
ここで、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、かつ第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、細菌。

【請求項18】

請求項17に記載の細菌であって、ここで：
(A）少なくとも1つの改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、かつ第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、1つ以上の塩基エディターである；または
(B）（a）T-DNA配列が、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができるドナーテンプレートもコードする；または（b）T-DNA配列が、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる第1のドナーテンプレート、および相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができる第2のドナーテンプレートもコードする；または
(C）少なくとも1つの改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、1つ以上のプライムエディターであり、第1のガイドRNAが、第1の標的配列に特異的であり、かつ第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる第1のpegRNAであり、第2のガイドRNAが、第2の標的配列に特異的であり、かつ第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる第2のpegRNAである；または
(D）少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、少なくとも2つの異なるエンドヌクレアーゼを含み、ここで、第1のエンドヌクレアーゼが、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2のエンドヌクレアーゼが、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、
細菌。

【請求項19】

請求項１７または１８に記載の細菌であって、第1の標的配列に導入された少なくとも1つの変異が、植物細胞において選択可能な形質をもたらし、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ここで、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異が、ALS阻害剤に対する耐性を提供する、細菌。

【請求項20】

少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を含む、植物、植物部分、植物細胞またはその集団を作製する方法であって、植物、植物部分または植物細胞を先行請求項のいずれか1つに記載の細菌と接触させる工程を含み、任意で、植物全体を得るために前記細胞または植物部分を再生する工程をさらに含む、方法。

【請求項21】

請求項２０に記載の方法であって、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異が：
c. 植物、植物部分または植物細胞において選択可能な形質をもたらす、第1の標的配列における少なくとも1つの変異であって、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、第1の標的配列がALS遺伝子であり、任意で、変異がALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する、変異；および
d. 第2の遺伝子における少なくとも1つの変異
を含む、方法。

【請求項22】

請求項２０に記載の方法であって、標的配列における変異の少なくとも1つが、植物細胞、植物部分または植物に選択可能形質を与え；任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり；任意で、標的配列の少なくとも1つがALS遺伝子にあり、ここで、変異がALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する、方法。

【請求項23】

請求項20～22のいずれか一項に記載の方法であって、ここで：
(a）作製される植物、植物部分または植物細胞のゲノムは、いかなる組み込みT-DNA配列も含まない；および／または
(b）該方法が、標的配列または標的配列（複数）に少なくとも1つの変異を含み、かつそのゲノム中にいかなる組み込みT-DNA配列も含まない、少なくとも1つの植物細胞、植物部分または植物を選択する工程をさらに含み、任意で、前記選択が遺伝子型解析を含む；および／または
(c）該方法が、選択可能形質を有する細胞、植物部分または植物を選択する工程をさらに含み、
任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、選択する工程が、除草剤耐性のある細胞、植物部分または植物を選択する工程によるものであり；任意で、標的配列がALS遺伝子であり、選択する工程が、ALS阻害剤に耐性のある細胞、植物部分または植物を選択する工程によるものである；および／または
(d）該方法から得られる集団中の植物細胞、植物部分または植物の少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％が、そのゲノム中に組み込みT-DNAを含まず、第2の遺伝子に変異を含む、
方法。

【請求項24】

請求項２０に記載の方法であって、該方法が：
d) 植物細胞に選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入する工程であって、ここで、選択可能な形質が除草剤耐性である、工程、
e) 第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入する工程、
f) 選択可能な形質を含む、植物、植物部分、植物細胞またはその集団を選択する工程であって、任意で、除草剤で処理する工程によるものである、工程、
を含み、
ここで、選択された植物、植物部分、植物細胞または集団は、第2の標的配列における変異を含むか、またはその変異が濃縮されており、任意で、選択された植物、植物部分、植物細胞または集団は、そのゲノム中に組み込みT-DNAを含まないか、またはそのゲノム中に組み込みT-DNAを含まない、植物、植物部分または植物細胞が濃縮されている、方法。

【請求項25】

請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法であって、選択された細胞、植物部分または植物から少なくとも1つの植物胚、植物部分または植物を作製する工程をさらに含む、方法。

【請求項26】

請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法であって、前記植物、植物部分または植物細胞が、バナナ、コーヒーまたは米であり、任意で、前記植物、植物部分または植物細胞が、マレーヤマバショウ、リュウキュウバショウ、バーミーズブルーバナナ、自家倍数体マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」、および自家倍数体マレーヤマバショウ 「グロスミシェル」からなる群から選択されるバナナ品種のものである、方法。

【請求項27】

請求項２０～２６のいずれかに記載の方法により作製された植物、植物部分、植物細胞またはその集団であって、
任意で、該方法から得られる集団中の植物細胞、植物部分または植物の少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％が、そのゲノム中に組み込みT-DNAを含まず、第2の遺伝子に変異を含む、植物、植物部分、植物細胞またはその集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物細胞中の標的配列に所望の変異を導入するための改変細菌、およびそのような細菌を用いて植物細胞、植物部分、植物またはそれらの集団を作製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アグロバクテリウムの植物細胞へのDNA導入能力は、植物遺伝子工学の目的で利用されてきた。リゾビウムとエンシファーは、同様のDNA導入能力と遺伝子工学能力を有している。

【0003】

アグロバクテリウムを介した植物の遺伝子形質転換には、通常、細菌のTiプラスミド上に2つの遺伝的構成要素が存在することが必要である。第一の必須成分はT-DNAで、ボーダー配列と呼ばれる保存された25bpの不完全反復によって定義される領域である。第2の遺伝的構成要素は病原性（vir）領域であり、T-DNAのプロセシングと転移を媒介する細菌タンパク質機構の構成要素をコードする少なくとも7つの主要遺伝子座（virA、virB、virC、virD、virE、virF、およびvirG）で構成される。VirAとVirGタンパク質は、Tiプラスミド上の他のVir遺伝子の発現を活性化する2成分制御因子である。残りのVirタンパク質は、T-DNAのプロセシング、転移、および組み込みに関与する。

【0004】

T-DNAの一本鎖形態（T-ストランド）とVirエフェクタータンパク質が植物細胞に転移する。転移後、T-ストランドはVirや植物タンパク質と複合体を形成し、細胞質を通って核に入る。T-DNAは植物ゲノムに組み込まれる。T-DNAがコードする遺伝子の一過性の発現は、ゲノムに組み込まれなくても起こりうるが、T-DNAがゲノムに組み込まれることにより、安定した発現を可能にする恒久的な形質転換イベントが確立される。

【0005】

外来性DNA配列は、バイナリーシステムを用いて植物ゲノムに組み込むことができる。バイナリーシステムでは、外来性DNA配列はT-バイナリープラスミド上にコードされるT-DNAにクローニングされ、一方、病原性遺伝子は別のプラスミド（「ヘルパー」プラスミドとも呼ばれる）から発現される。次に、アグロバクテリウム形質転換を用いて、外来性DNA配列を含むT-DNA領域を植物ゲノムに組み込み、植物が、組み込まれた外来性DNA配列から新しいタンパク質を発現するようにする。従って、アグロバクテリウムはトランスジェニック植物の作製に一般的に使用されている。

【0006】

目的のタンパク質を発現する外来性DNA配列は、同時に、T-DNA領域の残りの部分を伴わずに、相同組換えを介して植物ゲノムに組み込まれることもあるが、これは一般に低い頻度で起こる。例えば国際公開第2015/174514号には、T-DNA領域にクローニングされた外来遺伝子、特に例えば種子収量または環境ストレスに関連する外来遺伝子の相同組換えを介したより効率的な組込みを示す可能性のある変異アグロバクテリウムが記載されている。
植物を改変する方法の改善が求められている。

【発明の概要】

【0007】

本発明者らは、植物細胞の標的配列に所望の変異を導入するための改変細菌、およびそのような細菌を用いて植物細胞、植物部分、植物またはそれらの集団を作製する方法を開発した。

【0008】

本発明は、外来DNAの植物ゲノムへの組み込みを低下させ、あるいは全く行わずに、植物に正確な変異を導入するために使用することができる。本発明は、VirD5活性を低下させ、部位特異的DNA編集機構を有する改変細菌を使用する。実施例は、本発明の細菌が、T-DNAの組み込みを低下させながら、T-DNAからのDNA編集剤の一過性発現を介して遺伝子編集が起こることを可能にすることを示している。したがって、本発明は、外来DNAを組み込むことなく、特定の変異を有する植物を効率的に作製することを可能にする。このような植物は、そのゲノムが、特異的で標的化された変異を含んでいることから遺伝子編集植物と表現され、そのゲノムが、組み込まれた外来性DNAを含んでいないことから非トランスジェニック植物と表現される。このような植物は消費者や規制当局に好まれる。

【0009】

VirD5活性を低下させ、部位特異的DNA編集機構を担持する改変細菌は、遺伝子編集された、好ましくは非トランスジェニック植物を作製するために特に有用である。なぜなら、VirD5活性を低下させることは、植物細胞または核におけるT-DNA分子の分解を促進することが期待されず、DNA編集機構の発現を低下させることにつながるからである。本発明に従ってVirD5活性を低下させても、T-DNAの安定性や配列は全く変化しないので、より長く、より高レベルの一過性の発現が可能になる。また、VirD5活性を低下させることは、例えば、その役割が十分に理解されていないボーダー配列を変化させることと比較して、様々な異なる植物においてより予測可能な結果をもたらす。また、VirD5活性を低下させることは、例えば、NHEJによって修復される二本鎖切断での組み込みを可能にするボーダー配列の変更よりも、DNA編集装置の発現との適合性が高い。

【0010】

従って、第一の態様において、本発明は、ヌクレオチド配列を植物細胞に導入することができる細菌を提供し、該細菌は：（a）VirD5の発現および／または活性が低下したまたは破壊された、Vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列、および（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードするT-DNA配列、を含む。

【0011】

特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤は塩基エディターを含み、T-DNA配列は標的配列（複数可）に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする。塩基エディターは、ある塩基または塩基対を別の塩基に直接変換し、DNAに正確な点変異を直接発生させる。実施例は、塩基エディター、特にAPOBEC塩基エディター、および1つ以上のガイドRNAを発現するT-DNAを含む本発明の細菌が、遺伝子編集された非トランスジェニック植物を効果的に作製できることを示す。

【0012】

特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤はプライムエディターを含み、T-DNA配列は、標的配列（複数可）に特異的なpegRNAである1つ以上のガイドRNAもコードする。プライムエディターは、標的挿入、欠失および塩基変換を生成し、本発明に従って遺伝子編集された非トランスジェニック植物を作製するのに有効である。

【0013】

特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤はエンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレートも含み、そして任意で、標的配列（複数可）に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする。ドナーテンプレートを用いたHDRおよびNHEJは、DNAにおいて正確な編集を行い、本発明に従って遺伝子編集された非トランスジェニック植物を作製することを可能にする。

【0014】

本発明で使用する細菌は、ヌクレオチド配列を植物細胞に転移することができる。好ましいそのような細菌は、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、およびエンシファー属の細菌である。これらの細菌を用いて遺伝子導入を媒介する手順は、十分に特徴付けられている。好ましい実施形態において、細菌はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である。好ましい実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105株またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL1株に由来する。実施例は、本発明によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌が遺伝子編集された非トランスジェニック植物の作製に有効であることを示す。

【0015】

特定の実施形態では、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性が破壊される。実施例は、VirD5の発現および／または活性を破壊することが、遺伝子編集された非トランスジェニック植物の作製効率を改善することを示す。

【0016】

特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性の低下または破壊は、VirD5をコードする配列における少なくとも1つの変異によって媒介される。好ましい実施形態において、VirD5をコードする配列中の少なくとも1つの変異は、（a）少なくとも1つのヌクレオチド挿入；（b）少なくとも1つのヌクレオチド欠失；（c）挿入欠失（indel）；（d）逆位；（e）少なくとも1つのヌクレオチド置換；および（f）（a）～（e）の任意の組み合わせからなる群から選択され、任意で、挿入または欠失は、フレームシフト挿入またはフレームシフト欠失である。特定の実施形態において、VirD5をコードする配列中の少なくとも1つの変異は、少なくとも1つのナンセンスまたはミスセンスヌクレオチド置換である。

【0017】

特定の実施形態において、VirD5をコードする配列中の少なくとも1つの変異は挿入であり、挿入された配列は選択可能なマーカーをコードする。実施例は、このような変異がvirD5遺伝子を破壊するのに有効であり、さらに変異配列の選択を可能にすることを示す。

【0018】

特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現の低下または破壊は、VirD5を標的とするサイレンシングRNAの発現によって媒介される。

【0019】

本発明の好ましい実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列はプラスミドであり、最も好ましくはVir-ヘルパープラスミドである。特定の実施形態において、プラスミドはTiプラスミドまたはRiプラスミドである。Vir-ヘルパープラスミド、TiプラスミドおよびRiプラスミドは、植物細胞への遺伝物質の送達を媒介するのに特に有効である。いくつかの実施形態によれば、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、T-DNA配列を含まないプラスミド、例えば、T-バイナリーシステムのVir-ヘルパープラスミドなどであるが、これらに限定されない。

【0020】

特定の実施形態において、少なくとも1つの標的配列は、ACOまたはPPO、好ましくはACO1またはPPO2を含む。実施例は、本発明の細菌が、ACO1またはPPO2に変異を導入し、ACO1またはPPO2編集非トランスジェニック植物を得るために有効であることを示す。

【0021】

特定の実施形態において、植物細胞中の少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を含み、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性である。変異が選択可能な形質をもたらす場合、どの植物が変異を有するかを決定するために、植物を選択可能な形質の存在についてスクリーニングすることができる。実施例は、このようなプロセスにより、特に除草剤に対する耐性をもたらす遺伝子に変異を導入する細菌を使用して、所望の編集を有する植物を効率的に選択できることを示している。

【0022】

特定の実施形態において、植物細胞における少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異は、ALS阻害剤に対する耐性を提供する。好ましい実施形態において、ALS遺伝子は、バナナのアセト乳酸合成酵素1（ALS1）遺伝子またはアセト乳酸合成酵素2（ALS2）遺伝子であり、植物細胞はバナナ細胞である。好ましい実施形態において、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異は、コードされるアミノ酸配列に置換を導入する置換であり、好ましくはバナナALS1におけるPro-187またはALS2におけるPro-181、最も好ましくはALS1におけるPro187SerまたはALS2におけるPro181Serである。特定の実施形態において、ALS阻害剤は、スルホニルウレア（sulfonylurea）、イミダゾリノン（imidazolinone）、トリアゾロピリミジン（triazolopyrimidine）、ピリミジニルオキシベンゾエート（pyrimidinyl oxybenzoate）、またはスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン（sulfonylamino carbonyl triazolinones）であり、好ましくは、ALS阻害剤はクロルスルフロン（chlorsulfuron）である。

【0023】

特定の実施形態では、T-DNA配列は、追加の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードする。実施例は、本発明の細菌が2つ以上の標的配列を同時に共編集するのに有効であることを示す。これにより、2つ以上の特異的変異を有する植物を効果的に作製することができる。さらに、2つ以上の標的配列に変異を導入することが可能な細菌は、遺伝子編集された非トランスジェニック植物の高効率選択を可能にする。最初の標的配列で編集された植物は、2番目の配列でも編集されている可能性が高いからである。例えば、1つの変異が選択可能な形質を導入する場合、これを利用して2番目の変異が濃縮された植物を選択することができる。

【0024】

したがって、特定の実施形態において、T-DNA配列は、（a）少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ；（b）第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNA；および（c）第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNAをコードし、ここで、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。この共編集アプローチは、複数の標的配列に変異を導入することを可能にする。好ましくは、第1の標的配列に導入された少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらし、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性であり、これにより、両方の変異を有する遺伝子編集された非トランスジェニック植物を非常に効率的に選択することができる。

【0025】

特定の実施形態において、少なくとも1つの改変されたCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる1つ以上の塩基エディターであり、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができる。実施例は、塩基エディターをコードするT-DNAを有する本発明の細菌が、第1および第2の標的配列に塩基転換変異を導入して、共編集された非トランスジェニック植物を作製することができることを示す。

【0026】

特定の実施形態において、T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができるドナーテンプレートもコードする。

【0027】

特定の実施形態において、T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる第1のドナーテンプレートもコードし、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性であり、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる第2のドナーテンプレートをコードする。

【0028】

特定の実施形態において、少なくとも1つの改変されたCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、1つ以上のプライムエディターであり、第1のガイドRNAは、第1の標的配列に特異的であり、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる第1のpegRNAであり、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性であり、第2のガイドRNAは、第2の標的配列に特異的であり、少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができる第2のpegRNAである。

【0029】

特定の実施形態において、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、少なくとも2つの異なるエンドヌクレアーゼを含み、第1のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。異なるエンドヌクレアーゼを使用することにより、より強力で効率的な遺伝子編集を達成することができる。特定のそのような実施形態では、第1のエンドヌクレアーゼは第2の標的配列にいかなる変異も導入するように機能しない、および／または第2のエンドヌクレアーゼは第1の標的配列にいかなる変異も導入するように機能しない。このような配置は、望ましくない編集結果が生じる危険性なしに、第1標的配列および第2標的配列において異なる編集作用が実行されることを可能にする。このような実施形態では、第1のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNAとリボ核タンパク質複合体を形成してもよく、第2のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNAとリボ核タンパク質複合体を形成してもよい。例えば、特定のタイプのガイドRNAを組み込んだエンドヌクレアーゼを使用してもよい。例えば、Cas9はcrRNAとtrRNAの両方を使用してsgRNAを形成するが、Cas12aはcrRNAのみを必要とする。したがって、特定の実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼはCas9または改変Cas9であり、第1のガイドRNAはsgRNAであり、第2のエンドヌクレアーゼはCas12aまたは改変Cas12aであり、第2のガイドRNAはcrRNAであるか、または第1のエンドヌクレアーゼはCas12aまたは改変Cas12aであり、第1のガイドRNAはcrRNAであり、第2のエンドヌクレアーゼはCas9または改変Cas9であり、第2のガイドRNAはsgRNAである。代替的に、または組み合わせて、第1および第2のエンドヌクレアーゼは、異なるPAM配列を認識し得る。そのような実施形態において、第1および第2のエンドヌクレアーゼは、SpCas9、CjCas9およびCas12aから別々に選択され得る。

【0030】

特定の実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼおよび第2のエンドヌクレアーゼは、両方とも、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、および／または両方とも、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。このような実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼおよび／または第2のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNAおよび第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNAの両方と複合体を形成し得る。例えば、第1および第2のエンドヌクレアーゼは、同じPAM配列を認識する、および／または同じタイプのガイドRNAを組み込むことができる。このような配置は、より大きな編集多様性を生み出す。異なるエンドヌクレアーゼが使用される場合、それらは好ましくは異なる改変を導入してもよい。例えば、第一のエンドヌクレアーゼは塩基エディターであり、第二のエンドヌクレアーゼはプライムエディターであってもよいし、その逆であってもよい。あるいは、第一のエンドヌクレアーゼは塩基エディターであり、第二のエンドヌクレアーゼはCas9のようなCRISPR関連エンドヌクレアーゼであってもよいし、その逆であってもよい。したがって、T-DNAは、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第1または第2の標的配列に導入することができるドナーテンプレートをコードすることもできる。上記の実施形態のいずれかにおいて、第1の標的配列に導入された少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらし、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性であり、これにより、両方の変異を有する遺伝子編集された非トランスジェニック植物の非常に効率的な選択が可能になる。

【0031】

特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列、任意にVir-helperプラスミド、TiプラスミドまたはRiプラスミドは、T-DNAカセットを含まず、T-DNAは追加のプラスミドによってコードされる。実施例は、vir遺伝子オペロンを含むVirヘルパープラスミドと、T-DNAをコードする第2のバイナリープラスミドとを有する細菌が、遺伝子編集された非トランスジェニック植物の作製に有効であることを実証している。

【0032】

特定の実施形態において、追加プラスミドは、植物の選択可能なマーカー、細菌の選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、および少なくとも1つの細菌複製起点からなる群から選択される1つ以上の追加要素をコードする。

【0033】

特定の実施形態において、植物細胞は、懸濁培養物の細胞（胚細胞懸濁液など）、胚発生細胞（embryogenic cell）、分裂領域の細胞（cell of a meristematic region）、カルス組織の細胞（cell of a callus tissue）、葉細胞（leave cell）、根細胞、シュート細胞（shoot cell）、体細胞、花細胞、花粉細胞、小胞子、プロトプラスト、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0034】

特定の実施形態では、植物細胞はバナナ、コーヒー、または米である。

【0035】

特定の実施形態において、バナナは、以下からなる群から選択される：マレーヤマバショウ（Musa acuminata）、リュウキュウバショウ（Musa balbisiana）、バーミーズブルーバナナ（Musa itinerans）、自家3倍体のマレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ（Cavendish）」、および自家3倍体のマレーヤマバショウ「グロスミシェル（Gros Michel）」。実施例は、本発明の細菌および方法が、遺伝子編集された非トランスジェニックバナナ、特にキャベンディッシュバナナを作製するのに有効であることを示している。

【0036】

第2の態様において、本発明は、少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を含む植物、植物部分、植物細胞またはその集団を作製する方法を提供し、該方法は、植物、植物部分または植物細胞を本発明の細菌と接触させることを含み、任意で、該方法は、植物全体を得るために前記細胞または植物部分を再生させることをさらに含む。実施例は、本発明の方法が、標的配列に所望の変異を含むが非トランスジェニックである植物、植物部分、植物細胞またはその集団を効果的かつ効率的に生成することを実証する。

【0037】

特定の実施形態において、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は：(a）植物、植物部分または植物細胞において選択可能な形質をもたらす第1の標的配列における少なくとも1つの変異であって、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、第1の標的配列がALS遺伝子であり、任意で、変異がALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する、変異；および（b）第2の遺伝子における少なくとも1つの変異、を含む。実施例は、選択可能な形質をもたらす変異および第二の遺伝子における変異を導入することにより、遺伝子編集された非トランスジェニック植物の非常に効率的な選択が可能になることを示している。なぜなら、第一の標的配列で編集され、選択可能な形質を有する植物は、第二の配列でも編集されている可能性が高いからである。選択可能な形質は、実施例に示すように、第二の変異が濃縮された植物を選択するために使用することができる。実施例は、ALS遺伝子に変異を導入することがALS阻害剤に対する耐性を与えるのに有効であり、効果的な選択を可能にすることを示している。

【0038】

特定の実施形態において、標的配列における変異の少なくとも1つは、結果として植物細胞、植物部分または植物に選択可能な形質を付与する；任意で、選択可能な形質は除草剤耐性である；任意で、標的配列の少なくとも1つはALS遺伝子にあり、変異はALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する。

【0039】

好ましい実施形態において、作製される植物、植物部分または植物細胞のゲノムは、いかなる組み込みT-DNA配列も含んでいない。実施例は、本発明の方法が、いかなる組み込みT-DNA配列も有さない植物を高い頻度で生産するために使用され得ることを示す。T-DNA配列の組込みの欠如は、栽培者および消費者にとって魅力的であり、ある種の規制当局の承認を得たい栽培者にとって潜在的な問題を大幅に軽減する。

【0040】

特定の実施形態において、本方法は、標的配列（複数可）において少なくとも1つの変異を含み、かつそのゲノムにおいていかなる組み込みT-DNA配列も含まない、少なくとも1つの植物細胞、植物部分または植物を選択することをさらに含む。特定の実施形態において、前記選択は、遺伝子型解析を含む。

【0041】

特定の実施形態において、本方法は、選択可能な形質を有する細胞、植物部分または植物を選択することをさらに含む。

【0042】

好ましい実施形態において、選択可能形質は除草剤耐性であり、選択は除草剤耐性のある細胞、植物部分または植物を選択することによって行われる；任意で、標的配列はALS遺伝子であり、選択はALS阻害剤に耐性のある細胞、植物部分または植物を選択することによって行われる。

【0043】

特定の実施形態において、本方法から得られる集団中の植物細胞、植物部分または植物の少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％は、そのゲノム中に、組み込まれたT-DNAを含まず、第2の遺伝子における変異を含む。実施例は、本発明の方法が、第一の配列における変異が選択された場合に、第二の遺伝子における変異を含み、いかなる組み込みT-DNA配列も有さない、植物において高度に濃縮された集団を提供するのに有効であることを示す。

【0044】

特定の実施形態において、本方法は：(a）植物細胞において選択可能な形質をもたらす第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入する工程であって、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性である、工程と、（b）第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入する工程と、（c）前記選択可能な形質を含む、植物、植物部分、植物細胞またはその集団を選択する工程であって、任意で、除草剤で処理することによるものであって、ここで、選択された植物、植物部分、植物細胞または集団は、第2の標的配列において変異を含んでいるか、またはその変異が濃縮されており、そして任意で、選択された植物、植物部分、植物細胞または集団は、それらのゲノムにおいて組み込まれたT-DNAを含んでいないか、またはそれらのゲノムにおいて組み込まれたT-DNAを含んでいない植物、植物部分または植物細胞が濃縮されている、工程と、を含む。

【0045】

特定の実施形態において、前記方法は、選択された細胞、植物部分または植物から少なくとも1つの植物胚、植物部分または植物を作製することをさらに含む。

【0046】

特定の実施形態において、前記植物、植物部分または植物細胞は、バナナ、コーヒーまたは米である。

【0047】

好ましい実施形態において、前記植物、植物部分または植物細胞は、マレーヤマバショウ、リュウキュウバショウ、バーミーズブルーバナナ、自家3倍体マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」、および自家3倍体マレーヤマバショウ 「グロスミシェル」からなる群から選択されるバナナ品種のものである。

【0048】

第3の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製された植物、植物部分、植物細胞またはその集団を提供する。

【0049】

特定の実施形態において、前記方法の結果得られる集団中の植物細胞、植物部分または植物の少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％は、そのゲノム中に組み込まれたT-DNAを含まず、第2の遺伝子に変異を含む。実施例は、第一の配列の変異が選択された場合、本発明の方法から得られる植物集団は、第二の遺伝子の変異を含み、いかなる組み込みT-DNA配列も有さない、植物が高度に濃縮されることを示す。

【0050】

好ましい実施形態において、本発明は、（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの塩基エディター、および植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする、T-DNA配列を含む、アグロバクテリウム細胞を提供する。特に好ましい実施形態では、塩基エディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼとデアミナーゼ部分、好ましくはAPOBECを含む、融合ポリペプチドである。

【0051】

好ましい実施形態において、本発明は、（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が破壊されている、Vir-ヘルパープラスミドと、（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのプライムエディター、および植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的なpegRNAである1つ以上のガイドRNAをコードする、T-DNA配列と、を含むアグロバクテリウム細胞を提供する。特に好ましい実施形態では、プライムエディターは、nCas9と逆転写酵素とを含む融合ポリペプチドである。

【0052】

好ましい実施形態において、本発明は、ヌクレオチド配列を植物細胞、好ましくはアグロバクテリウム細胞に導入することができる細菌細胞であって：(a）vir遺伝子をコードするVirヘルパーであって、VirD5の発現および／または活性が破壊されている、Virヘルパーと、（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼおよび植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする、T-DNA配列と、を含み、ここで、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらす変異を含み、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性であり、任意で、少なくとも1つの変異は、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異は、ALS阻害剤に対する耐性を提供する、細菌細胞を提供する。

【0053】

好ましい実施形態において、本発明は：(a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNA、および相同性依存性修復（HDR）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレート、をコードするT-DNA配列を含む、アグロバクテリウム細胞を提供する。

【0054】

好ましい実施形態において、本発明は：(a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNA、および相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレート、をコードするT-DNA配列を含む、アグロバクテリウム細胞を提供する。

【0055】

いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：
(a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに
(b）
i) 少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、
ii） 第１の標的配列に特異的な第１のガイドRNA、
iii) 第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNA、および
iv） 相同性依存性修復（HDR）または非相同末端接合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができるドナーテンプレート、
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、前記ドナーテンプレートを介して第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる；任意で、第1の標的配列における少なくとも1つの変異が、植物細胞において選択可能な形質をもたらし、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異が、ALS阻害剤に対する耐性を提供する、T-DNA配列。

【0056】

いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：
(a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに
(b）
i) 少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、
ii） 第１の標的配列に特異的な第１のガイドRNA、
iii) 第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNA、
iv） 相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる第1のドナーテンプレート、および
v) 相同性依存性修復（HDR）または非相同末端接合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができる第2のドナーテンプレート；
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、前記第2のドナーテンプレートを介して前記第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、かつ前記第2のドナーテンプレートを介して前記第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる；任意で、第1の標的配列における少なくとも1つの変異が、植物細胞において選択可能な形質をもたらし、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異が、ALS阻害剤に対する耐性を提供する、T-DNA配列。

【0057】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）
i) 少なくとも1つの塩基エディター、
ii) 少なくとも1つのALS遺伝子に特異的な第1のガイドRNA、および
iii) 第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNA、
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つの塩基エディターは、ALS阻害剤に対する耐性を提供する少なくとも1つのALS遺伝子に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、T-DNA配列。特に好ましい実施形態では、塩基エディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼとデアミナーゼ部分、好ましくはAPOBECとを含む融合ポリペプチドである。

【0058】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）
i) 少なくとも1つの塩基エディター、
ii) 少なくとも1つのALS遺伝子に特異的な第1のガイドRNA、
iii） 第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNA、および
iv)相同性依存性修復（HDR）または非相同末端接合（NHEJ）を介してALS遺伝子に少なくとも1つの変異を導入することが可能な第1のドナーテンプレート、
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つの塩基エディターは、ALS阻害剤に対する耐性を提供する少なくとも1つのALS遺伝子に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、T-DNA配列。特に好ましい実施形態では、塩基エディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼとデアミナーゼ部分、好ましくはAPOBECとを含む融合ポリペプチドである。

【0059】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）
i) 少なくとも１つの人のプライムエディター、
ii） pegRNAであり、少なくとも1つのALS遺伝子に特異的である第1のガイドRNA、および
iii) pegRNAであり、第２の標的配列に特異的な第２のガイドRNA、
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つのプライムエディターは、ALS阻害剤に対する耐性を提供する少なくとも1つのALS遺伝子に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、T-DNA配列。特に好ましい実施形態では、プライムエディターはnCas9と逆転写酵素とを含む融合ポリペプチドである。

【0060】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）
i) 少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、
ii) 少なくとも1つのALS遺伝子に特異的な第1のガイドRNA、
iii) 第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNA、
iii) 第1のドナーテンプレート、および
iv) 第2のドナーテンプレート、
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼおよび第1のドナーテンプレートは、HDRまたはNHEJを介して、ALS阻害剤に対する耐性を提供する少なくとも1つのALS遺伝子に少なくとも1つの変異を導入することができ、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼおよび第2のドナーテンプレートは、HDRまたはNHEJを介して、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、T-DNA配列。

【0061】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）バナナ細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの塩基エディター、およびバナナ細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする、T-DNA配列であって、任意で、少なくとも1つの標的配列がALS遺伝子を含む、T-DNA配列。特に好ましい実施形態では、塩基エディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼとデアミナーゼ部分、好ましくはAPOBECとを含む融合ポリペプチドである。

【0062】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vi-rヘルパープラスミド、ならびに（b）バナナ細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのプライムエディター、およびバナナ細胞中の少なくとも1つの標的配列に特異的なpegRNAである1つ以上のガイドRNAをコードする、T-DNA配列であって、任意で、少なくとも1つの標的配列がALS遺伝子を含む、T-DNA配列。特に好ましい実施形態では、プライムエディターはnCas9と逆転写酵素とを含む融合ポリペプチドである。

【0063】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：(a）vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されている、Vir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）バナナ細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、バナナ細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNA、および相同性依存性修復（HDR）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレート、をコードする、T-DNA配列。

【0064】

好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むアグロバクテリウム細胞を提供する：（a）Vir遺伝子をコードするVir-ヘルパープラスミドであって、VirD5の発現および／または活性が破壊されたVir-ヘルパープラスミド、ならびに（b）
i)少なくとも1つの塩基エディター、
ii）バナナ細胞内の少なくとも1つのALS遺伝子に特異的な第1のガイドRNA、および
iii) バナナ細胞内の第２の標的配列に特異的な第２のガイドRNA、
をコードするT-DNA配列であって、
ここで、少なくとも1つの塩基エディターは、ALS阻害剤に対する耐性を提供する少なくとも1つのALS遺伝子に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、T-DNA配列。特に好ましい実施形態では、塩基エディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼとデアミナーゼ部分、好ましくはAPOBECとを含む融合ポリペプチドである。

【0065】

従って、本発明は、以下の番号付けされた実施形態を提供する：
1.植物細胞にヌクレオチド配列を導入することができる細菌であって：
(a) vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列であって、VirD5の発現および／または活性が低下したまたは破壊された、ヌクレオチド配列、および
(b) 植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードするT-DNA配列
を含む、細菌。

【0066】

2.部位特異的DNA編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、および改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む、実施形態1に記載の細菌。

【0067】

3.部位特異的DNA編集剤が、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列が、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする、実施形態1に記載の細菌。

【0068】

4.部位特異的DNA編集剤が、塩基エディター、プライムエディター、Cas9エンドヌクレアーゼ、またはSpCas9、xCas9、SpCas9-NG、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、CjCas9、NmCas9、StCas9、TdCas9、eSpCas9、HypaCas9、Cas9-SpRY／SpG、Cas4-Cas1-Cas2複合体およびMAD7からなる群から選択されるエンドヌクレアーゼ、からなる群から選択される、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含む、実施形態1に記載の細菌。

【0069】

5.部位特異的DNA編集剤が塩基エディターを含み、T-DNA配列が、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする、実施形態1に記載の細菌。

【0070】

6.塩基エディターが、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼおよびデアミナーゼ部分を含む融合ポリペプチドである、実施形態5に記載の細菌。

【0071】

7.改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼがnCas9またはdCas9であり、デアミナーゼ部分がシチジンデアミナーゼ部分またはアデニンデアミナーゼ部分である、実施形態6に記載の細菌。

【0072】

8.塩基エディターが：APOBEC、BE1、BE2、BE3、HF-BE3、BE4、BE4max、BE4-GAM、YE1-BE3、EE-BE3、YE-BE3、YEE-BE3、VQR-BE3、VRER-BE3、Sa-BE3、Sa-BE4、SaBE4-Gam、SaKKH-BE3、Cas12a-BE、Target-AID、Target-AID-NG、xBE3、eA3A-BE3、A3A-BE3、BE-PLUS、TAM、CRISPR-X、ABE7.9、ABE7.10、ABE7.10*、xABE、ABESa、VQR-ABE、VRER-ABE、およびSaKKH-ABEからなる群から選択される、実施形態6に記載の細菌。

【0073】

9.部位特異的DNA編集剤がプライムエディターを含み、T-DNA配列が、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的なpegRNAである1つ以上のガイドRNAもコードする、実施形態1に記載の細菌。

【0074】

10.プライムエディターが、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼと逆転写酵素とを含む融合ポリペプチドである、実施形態9に記載の細菌。

【0075】

11.改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼがnCas9である、実施形態10に記載の細菌。

【0076】

12.プライムエディターが、PE2、PE2-VQR、PE2-VRQR、PE2-VRER、PE2-NG、PE2-SpG、PE2-SpRY、PE2＊、PE4、PE5およびPE3からなる群から選択される、実施形態10に記載の細菌。

【0077】

13.部位特異的DNA編集剤が、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレートもコードし、任意で、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする、実施形態1に記載の細菌。

【0078】

14.先行する実施形態のいずれかに記載の細菌であって、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、またはエンシファー属の細菌であり、任意で：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ファブラム（Agrobacterium fabrum） str.C58、アグロバクテリウム・ジェノモスプ（Agrobacterium genomosp）、アグロバクテリウム sp.S2/73、アグロバクテリウム sp.13-2099-1-2、アグロバクテリウム sp.NCPPB925、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・サリニトレランス（Agrobacterium salinitolerans）、アグロバクテリウム・ヴィティス（Agrobacterium vitis）、アグロバクテリウム・アルセニイェビッチ（Agrobacterium arsenijevicii）、アグロバクテリウム・デルタエンセ（Agrobacterium deltaense）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Agrobacterium larrymoorei）、リゾビウム sp.AB2/73、リゾビウム sp.16-488-2b、リゾビウム sp.16-488-2a, リゾビウム sp. 16-449-1b, リゾビウム sp. L58/93, リゾビウム sp. L245/93, リゾビウム sp. E27B/91, リゾビウム sp. K1/93, リゾビウム sp.BK007、リゾビウム・チューモリジーンズ（Rhizobium tumorigenes）、リゾビウム・スキエルニウィセンス（Rhizobium skierniewicense）、リゾビウム・ルシタナム（Rhizobium lusitanum）、ネオリゾビウム sp.NCHU2750、ネオリゾビウム・ガレガエ（Neorhizobium galegae）、エンシファー sp.YR511、エンシファー・アドヘレンス（Ensifer adhaerens）からなる群から選択される、細菌。

【0079】

15.細菌がアグロバクテリウム・ツメファシエンスである、実施形態14に記載の細菌。

【0080】

16.アグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105株またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL1株に由来する、実施形態15に記載の細菌。

【0081】

17.vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性が破壊された、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0082】

18.先行する実施形態のいずれかに記載の細菌であって、vir起源をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性の前記低下または破壊が、VirD5をコードするヌクレオチド配列中の少なくとも1つの変異によって媒介される、細菌。

【0083】

19.実施形態18に記載の細菌であって、VirD5をコードする配列における前記少なくとも1つの変異が：
(a）少なくとも1つのヌクレオチド挿入；
(b）少なくとも1つのヌクレオチド欠失；
(c）挿入-欠失（indel）；
(d) 逆位；
(e）少なくとも1つのヌクレオチド置換；および
(f) (a)から(e)のいずれかの組み合わせ；
からなる群から選択され、
ここで、任意で、挿入または欠失は、フレームシフト挿入またはフレームシフト欠失である、細菌。

【0084】

20.VirD5をコードする配列中の前記少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのナンセンスまたはミスセンスヌクレオチド置換である、実施形態19に記載の細菌。

【0085】

21.VirD5をコードする配列における前記少なくとも1つの変異が挿入であり、挿入された配列が選択可能なマーカーをコードする、実施形態19に記載の細菌。

【0086】

22.vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現の前記低下または破壊が、VirD5を標的とするサイレンシングRNAの発現によって媒介される、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0087】

23.Vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、Vir-ヘルパープラスミド、TiプラスミドまたはRiプラスミドなどのプラスミドである、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0088】

24.植物細胞がバナナ細胞であり、少なくとも1つの標的配列がACOまたはPPO、好ましくはACO1またはPPO2を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0089】

25.植物細胞における少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異が、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を含み、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性である、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0090】

26.植物細胞における少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異が、ALS阻害剤に対する耐性を提供する、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0091】

27.ALS遺伝子が、バナナのアセト乳酸合成酵素1（ALS1）遺伝子またはアセト乳酸合成酵素2（ALS2）遺伝子であり、植物細胞がバナナ細胞である、実施形態26に記載の細菌。

【0092】

28.実施形態26または27に記載の細菌であって、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異が、コードされるアミノ酸配列に置換を導入する置換であり、好ましくはバナナALS1におけるPro-187またはALS2におけるPro-181、最も好ましくはALS1におけるPro187SerまたはALS2におけるPro181Serである、細菌。

【0093】

29.ALS阻害剤が、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシベンゾエート、またはスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンであり、好ましくは、ALS阻害剤がクロルスルフロンである、実施形態26～28のいずれか1つに記載の細菌。

【0094】

30.T-DNA配列が、追加の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードする、実施形態25～29のいずれか1つに記載の細菌。

【0095】

31.先行する実施形態のいずれかに記載の細菌であって、T-DNA配列が：
a)少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、
b)第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNA、および
c)第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNA、
をコードし、
ここで、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、細菌。

【0096】

32.少なくとも1つの改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、1つ以上の塩基エディターである、実施形態31に記載の細菌。

【0097】

33.実施形態31に記載の細菌であって、（a）T-DNA配列が、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができるドナーテンプレートもコードする；または（b）T-DNA配列が、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる、第1のドナーテンプレート、および相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができる第2のドナーテンプレートもコードする、細菌。

【0098】

34.実施形態31に記載の細菌であって、少なくとも1つの改変されたCRISPR関連エンドヌクレアーゼが、1つ以上のプライムエディターであり、第1のガイドRNAが、第1の標的配列に特異的であり、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、第1のpegRNAであり、第2のガイドRNAが、第2の標的配列に特異的であり、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、第2のpegRNAである、細菌。

【0099】

35.実施形態31に記載の細菌であって、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、少なくとも2つの異なるエンドヌクレアーゼを含み、第1のエンドヌクレアーゼが、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2のエンドヌクレアーゼが、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、細菌。

【0100】

36.実施形態35に記載の細菌であって、第1のエンドヌクレアーゼが、第2の標的配列に変異を導入するように機能しない、および／または第2のエンドヌクレアーゼが、第1の標的配列に変異を導入するように機能しない、細菌。

【0101】

37.第1および第2のエンドヌクレアーゼが、異なるPAM配列を認識する、実施形態36に記載の細菌。

【0102】

38.実施形態35に記載の細菌であって、第1のエンドヌクレアーゼおよび第2のエンドヌクレアーゼが、いずれも、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、および／または両方とも、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、細菌。

【0103】

39.第1および第2のエンドヌクレアーゼが、同じPAM配列を認識する、実施形態38に記載の細菌。

【0104】

40.実施形態38または39に記載の細菌であって、ここで
(i) 第1のエンドヌクレアーゼが塩基エディターであり、第2のエンドヌクレアーゼがプライムエディターであり、第2のガイドRNAがpegRNAである、または第1のエンドヌクレアーゼがプライムエディターであり、第1のガイドRNAがpegRNAであり、第2のエンドヌクレアーゼが塩基エディターである；あるいは
(ii) 第1のエンドヌクレアーゼが塩基エディターであり、第2のエンドヌクレアーゼがCas9のようなCRISPR関連エンドヌクレアーゼである、または第2のエンドヌクレアーゼがCas9のようなCRISPR関連エンドヌクレアーゼであり、第1のエンドヌクレアーゼが塩基エディターである、
細菌。

【0105】

41.実施形態31～40のいずれかに記載の細菌であって、第1の標的配列に導入された少なくとも1つの変異が、植物細胞において選択可能な形質をもたらし、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、少なくとも1つの変異が、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異が、ALS阻害剤に対する耐性を提供する、細菌。

【0106】

42.先行する実施形態のいずれかに記載の細菌であって、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列がT-DNA配列を含まず、T-DNAが追加のプラスミドによってコードされる、細菌。

【0107】

43.実施形態42に記載の細菌であって、追加プラスミドが、植物の選択可能なマーカー、細菌の選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、および少なくとも1つの細菌複製起点からなる群から選択される1つ以上の追加要素をコードする、細菌。

【0108】

44.先行する実施形態のいずれかに記載の細菌であって、植物細胞が、懸濁培養物の細胞（胚細胞懸濁液など）、胚発生細胞、分裂領域の細胞、カルス組織の細胞、葉細胞、根細胞、シュート細胞、体細胞、花細胞、花粉細胞、小胞子、プロトプラスト、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、細菌。

【0109】

45.植物細胞が、バナナ、コーヒー、または米のものである、先行する実施形態のいずれかに記載の細菌。

【0110】

46.バナナが、以下からなる群から選択される、実施形態45に記載の細菌：マレーヤマバショウ、リュウキュウバショウ、バーミーズブルーバナナ、自家3倍体マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」、および自家3倍体マレーヤマバショウ 「グロスミシェル」からなる群から選択される、実施形態45に記載の細菌。

【0111】

47.少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を含む、植物、植物部分、植物細胞またはその集団を作製する方法であって、植物、植物部分または植物細胞を、先行する実施形態のいずれか1つに記載の細菌と接触させることを含み、任意で、植物全体を得るために前記細胞または植物部分を再生することをさらに含む、方法。

【0112】

48.実施形態47に記載の方法であって、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異が：
a. 植物、植物部分または植物細胞において選択可能な形質をもたらす第1の標的配列における少なくとも1つの変異であって、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり、任意で、第1の標的配列がALS遺伝子であり、任意で、変異がALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する、変異；および
b. 第2の遺伝子における少なくとも1つの変異
を含む、方法。

【0113】

49.実施形態47に記載の方法であって、標的配列における変異の少なくとも1つが、植物細胞、植物部分または植物に選択可能な形質を付与し；任意で、選択可能な形質が除草剤耐性であり；任意で、標的配列の少なくとも1つがALS遺伝子にあり、変異がALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する、方法。

【0114】

50.作製される植物、植物部分または植物細胞のゲノムが、いかなる組み込みT-DNA配列も含まない、実施形態47～49のいずれか1つに記載の方法。

【0115】

51.実施形態47～50のいずれか1つに記載の方法であって、標的配列（複数可）に少なくとも1つの変異を含み、そのゲノムに組み込みT-DNA配列を含まない、少なくとも1つの植物細胞、植物部分または植物を選択することをさらに含む、方法。

【0116】

52.前記選択が遺伝子型解析を含む、実施形態51に記載の方法。

【0117】

53.選択可能な形質を有する、細胞、植物部分または植物を選択することをさらに含む、実施形態48～52のいずれか1つに記載の方法。

【0118】

54.実施形態53に記載の方法であって、選択可能な形質が除草剤耐性であり、選択が、除草剤耐性のある、細胞、植物部分または植物を選択することによるものであり；任意で、標的配列がALS遺伝子であり、選択が、ALS阻害剤に耐性のある、細胞、植物の部分または植物を選択することによるものである、方法。

【0119】

55.実施形態48～54のいずれか1つに記載の方法であって、前記方法から得られる集団中の、植物細胞、植物部分または植物の少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％が、そのゲノム中に組み込まれたT-DNAを含まず、第2の遺伝子における変異を含む、方法。

【0120】

56.実施形態47に記載の方法であって：
a) 植物細胞に選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入する工程であって、任意で、選択可能な形質が除草剤耐性である、工程、
b) 第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入する工程、
c) 選択可能な形質を含む植物、植物部分、植物細胞またはその集団を選択する工程であって、任意で、除草剤で処理することによる、工程、
を含み、
ここで、選択された植物、植物部分、植物細胞または集団は、第2の標的配列における変異を含むか、またはその変異が濃縮されており、任意で、選択された植物、植物部分、植物細胞または集団は、ゲノム中に組み込まれたT-DNAを含まないか、またはゲノム中に組み込まれたT-DNAを含まない、植物、植物部分または植物細胞が濃縮されている、方法。

【0121】

57.選択された細胞、植物部分または植物から少なくとも1つの植物胚、植物部分または植物を作製することをさらに含む、実施形態47～56のいずれか1つに記載の方法。

【0122】

58.前記植物、植物部分、または植物細胞が、バナナ、コーヒー、または米である、実施形態47～57のいずれか１つに記載の方法。

【0123】

59.前記植物、植物部分または植物細胞が、マレーヤマバショウ、リュウキュウバショウ、バーミーズブルーバナナ、自家倍数体マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」、および自家倍数体マレーヤマバショウ 「グロスミシェル」からなる群から選択されるバナナ品種のものである、実施形態58に記載の方法。

【0124】

60.実施形態47～59のいずれかに記載の方法によって生成された、植物、植物部分、植物細胞またはその集団。

【0125】

61.実施形態60に記載の植物、植物部分または植物細胞集団であって、前記方法から得られる集団中の植物細胞、植物部分または植物の、少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％が、そのゲノム中に組み込まれたT-DNAを含まず、第2の遺伝子に変異を含む、 植物、植物部分または植物細胞集団。

【0126】

本明細書中の任意の実施形態と組み合わせることができる代替的な態様において、本発明は、ヌクレオチド配列を植物細胞に導入することができる細菌であって、以下のものを含む細菌を提供する：
(a) vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列であって、VirD5の発現および／または活性が低下したまたは破壊された、ヌクレオチド配列、および
(b) 少なくとも1つのDNA編集剤、形態遺伝子（morphogene）、抗生物質耐性遺伝子（antibiotic resistance genes）、亜リン酸転換酵素（phosphite converting enzymes）またはRNAiコンストラクトをコードするT-DNA配列。好ましい亜リン酸転換酵素はPtxDである。好ましい抗生物質耐性遺伝子は、NptII、HptII、Bla、Barである。好ましい形態遺伝子は、WUS、BBM、LEAFY COTYLEDON1、LEAFY COTYLEDON2、Lec1である。

【図面の簡単な説明】

【0127】

【図1】virD5オペロンの構造より：virAとvirGはTiプラスミドrepABCオペロンを活性化し、創傷から放出される化学シグナルに応答してプラスミドコピー数を増加させる。(Hongbaek Cho, Stephen C.Winans. Proceedings of the National Academy of Sciences.2005, 102 (41) 14843-14848; DOI: 10.1073/pnas.0503458102)

【図2】左上のパネルは、スペクチノマイシン耐性カセットに隣接するvirD5配列の3'および5'500bp断片を有するvirD5変異誘発性コンストラクトの性質を示す。左下のパネルは、EHA105virD5変異株の遺伝子型を検証するために使用したプライマー配列を示している。右のパネルは、アグロバクテリウムのEHA105株とEHA105virD5株の全ゲノムDNAから、オリゴ569と571、および569と570を用いて得られたPCR断片のDNAアガロースゲル（1%）である。

【図3】pMol_0630（mcherry、ALS1を標的とするシチジン塩基エディター）を有するアグロバクテリウム株（AGL1、EHA105、およびEHA105virD5）を用いた形質転換10日後に評価したmcherry蛍光を発現するバナナECS。

【図4】pMol_0630（mcherry、ALS1を標的とするシチジン塩基エディター）を有するWTアグロバクテリウムAGL1で形質転換し、25ug/Lクロルスルフロン（CSF）を用いて選択した2ヶ月齢のバナナ胚におけるmCherry蛍光。倍率20倍、明視野（BF）露光10ms、蛍光露光200ms。枠内のハイライトは無蛍光胚である。

【図5】25ug/Lクロルスルフロン（CSF）を用いて選択したpMol_0630（mcherry、ALS1を標的とするシチジン塩基エディター）を有するWTアグロバクテリウムEHA105で形質転換した2ヶ月齢のバナナ胚におけるmCherry蛍光。倍率20倍、明視野（BF）露光10ms、蛍光露光200ms。枠内は無蛍光胚。

【図6】pMol_0630（mcherry、ALS1を標的とするシチジン塩基エディター）を有するアグロバクテリウムEHA105virD5で形質転換し、25ug/Lクロルスルフロン（CSF）で選択した2ヶ月齢のバナナ胚におけるmCherry蛍光。倍率20倍、明視野（BF）露光10ms、蛍光露光200ms。

【図7】pMOL_0630で形質転換した39のバナナ小植物体におけるT-DNA検出；アグロバクテリウム株AGL1から7株、EHA105から11株、EHA105virD5から20株、およびWTシュート1株。低いΔCt値（<25）は、植物組織におけるT-DNA遺伝子の存在を示し、T-DNAの組み込み（トランスジェニック植物組織）を強く示している。個々のプライマーセットについて、WTコントロールに基づいて閾値（>25サイクル）を設定した。データは、わずかなDNA濃度の違いを考慮し、ハウスキーピング遺伝子を用いて正規化した。ΔCt値が高い／存在しない（*印）は、組織中にT-DNAが存在しないことを示す（非トランスジェニック）。

【図8】pMol_0630（mcherry、ALS1を標的とするシチジン塩基エディター）を有するアグロバクテリウムAGL1、EHA105またはEHA105virD5で形質転換し、25ug/Lクロルスルフロン（CSF）を用いて選択したバナナ植物におけるT-DNAおよびALS1編集の存在に関するデータの照合。

【図9】pMol_0926（ALS1およびPPO2を標的とするシチジン塩基エディター）およびpMOL_0931（ALS2およびACO1を標的とするシチジン塩基エディター）を有するアグロバクテリウムEHA105またはEHA105virD5で形質転換され、すべて25ug/Lクロルスルフロン（CSF）で選択したバナナ植物において検出された編集および形質導入の概要である。実施例4で遺伝子型を決定した植物のうち、以下の遺伝子型を有することが判明した植物の割合を表す：非トランスジェニックでALSと形質遺伝子の両方が編集されている（非トランスジェニック共編集）；非トランスジェニックで形質遺伝子が編集されていない（非トランスジェニックWT）；トランスジェニックでALSと形質遺伝子が共編集されている（トランスジェニック共編集）；またはトランスジェニックだが形質遺伝子が編集されていない（トランスジェニックWT）。形質遺伝子は、各再生植物の形質転換に使用されたコンストラクトに応じて、ACO1またはPPO2のいずれかである。

【図10】pMOL_1936を導入したアグロバクテリウムEHA105またはEHA105virD5で形質転換し、すべてCSFで選択したバナナ植物から回収した胚。ALS2遺伝子座の編集は、ALS2周辺のゲノム領域にアニールするプライマーを用いたHDRドナー組み込みの存在を検出するために、アンプリコンサンガーシーケンスを用いて評価した。EHA105胚はいずれもALS2遺伝子座の編集の証拠を示さなかったが、EHA105virD5胚16個中1個はHDRドナー組み込みの証拠を示した。

【図11】EHA105で形質転換したバナナ胚におけるT-DNA検出と比較した、HDRドナー組み込みの証拠を示したEHA105virD5で形質転換したバナナ胚におけるT-DNA検出。低いΔCt値（<27）は、植物組織におけるT-DNA遺伝子の存在を示し、T-DNA組み込み（トランスジェニック植物組織）を強く示している。個々のプライマーセットについて、WTコントロールに基づいて閾値（>27サイクル）を設定した。データは、わずかなDNA濃度の違いを考慮し、ハウスキーピング遺伝子を用いて正規化した。ΔCt値が高い／存在しない（*印）は、組織中にT-DNAが存在しないことを示す（非トランスジェニック）。

【0128】

シーケンス一覧
配列番号: 1 - マレーヤマバショウ由来のACO1 (Ma01_g11540.1)
配列番号: 2 - マレーヤマバショウ由来のACO (Ma07_g19730.1)
配列番号: 3 - マレーヤマバショウ由来のACS (Ma04_g31490.1)
配列番号: 4 - マレーヤマバショウ由来のACS (Ma04_g35640.1)
配列番号: 5 - マレーヤマバショウ由来のACS (Ma09_g19150.1)
配列番号: 6 - マレーヤマバショウ由来のPPO2 (Ma07_g03540)
配列番号: 7 - EHA105 virD5遺伝子配列を増幅するためのF1_D5_Fオリゴヌクレオチド
配列番号: 8 - EHA105 virD5遺伝子配列を増幅するためのF1_D5_Rオリゴヌクレオチド
配列番号: 9 - スペクチノマイシン耐性カセットを増幅するためのF2_D5_Fオリゴヌクレオチド
配列番号: 10 - スペクチノマイシン耐性カセットを増幅するためのF2_D5_Rオリゴヌクレオチド
配列番号: 11 - EHA105 virD5遺伝子配列を増幅するためのF3_D5_Fオリゴヌクレオチド
配列番号: 12 - EHA105 virD5遺伝子配列を増幅するためのF3_D5_Rオリゴヌクレオチド
配列番号: 13 - virD5遺伝子座への挿入をスクリーニングするための569オリゴヌクレオチド
配列番号: 14 - virD5遺伝子座への挿入をスクリーニングするための570オリゴヌクレオチド
配列番号: 15 - virD5遺伝子座への挿入をスクリーニングするための571オリゴヌクレオチド
配列番号: 16 - ACTINのqPCR用G0390オリゴヌクレオチド
配列番号: 17 - ACTINのqPCR用G0391オリゴヌクレオチド
配列番号: 18 - mCherryのqPCR用G0327オリゴヌクレオチド
配列番号: 19 - mCherryのqPCR用G0328オリゴヌクレオチド
配列番号: 20 - nCas9 5'のqPCR用G0418オリゴヌクレオチド
配列番号: 21 - nCas9 5'のqPCR用G0419オリゴヌクレオチド
配列番号: 22 - nCas9 3'のqPCR用G0422オリゴヌクレオチド
配列番号: 23 - nCas9 3'のqPCR用G0423オリゴヌクレオチド
配列番号: 24 - ALS1のシーケンシング用GO117オリゴヌクレオチド
配列番号: 25 - ALS1のシーケンシング用GO118オリゴヌクレオチド
配列番号: 26 - PPO2のシーケンシング用GO163オリゴヌクレオチド
配列番号: 27 - PPO2のシーケンシング用GO164オリゴヌクレオチド
配列番号: 28 - ACO1のシーケンシング用3022オリゴヌクレオチド
配列番号: 29 - ACO1のシーケンシング用1757オリゴヌクレオチド
配列番号:30-33-VirD5の活性または発現を破壊または低下させるための例示的プライマー
配列番号: 34 - ALS2のシーケンシング用GO975オリゴヌクレオチド
配列番号: 35 - ALS2のシーケンシング用GO976オリゴヌクレオチド
配列番号: 36 - nCas9 5'のqPCR用G0534オリゴヌクレオチド
配列番号: 37 - nCas9 5'のqPCR用G0535オリゴヌクレオチド
配列番号: 38 - nCas9 3'のqPCR用G1158オリゴヌクレオチド
配列番号: 39 - nCas9 3'のqPCR用G1159オリゴヌクレオチド
配列番号: 40 - TaU6のqPCR用G0989オリゴヌクレオチド
配列番号: 41 - TaU6のqPCR用G0990オリゴヌクレオチド
配列番号: 42 - nptiiのqPCR用G0390オリゴヌクレオチド
配列番号: 43 - nptiiのqPCR用G0391オリゴヌクレオチド

【発明を実施するための形態】

【0129】

発明の詳細な説明
本発明は、（a）vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列であって、VirD5の発現および／または活性が低下しているまたは破壊されているヌクレオチド配列と、（b）植物細胞中の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードするT-DNA配列とを含む、ヌクレオチド配列を植物細胞に導入することができる細菌を提供する。

【0130】

vir遺伝子をコードする塩基配列
本発明の細菌は、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列と、T-DNA配列とを含み、細菌が植物細胞にヌクレオチド配列を移入することを可能にする。特定の実施形態において、vir遺伝子は、Vir-ヘルパープラスミド、TiプラスミドまたはRiプラスミドによってコードされるが、代替的に異なるプラスミドまたはレプリコンまたは細菌染色体によってコードされてもよい。vir遺伝子は、ヌクレオチド配列の病原性領域（vir領域）に存在してもよい。特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、repABC遺伝子カセットとして知られる保存DNA領域も含む。本明細書に記載のTiプラスミドまたはRiプラスミドは、例えば、TiプラスミドまたはRiプラスミドに由来するvir遺伝子を含むが、元のTiまたはRiプラスミドに存在する他の特徴（T-DNAなど）を欠く、その改変バージョンであってもよい。いくつかの実施形態によれば、T-DNA配列およびvir遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、T-バイナリーベクターおよびT-バイナリーシステムの「virヘルパープラスミド」のような2つの別個のベクター上に存在するが、これらに限定されない。

【0131】

T-DNA配列
本発明の細菌は、T-DNA配列も含む。本明細書で使用する「T-DNA配列」とは、宿主植物細胞に移入される移入DNAを形成する特定のヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、T-DNA配列も含む。特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列はT-DNA配列を含まず、T-DNA配列は追加のプラスミドによってコードされる。付加的プラスミドは、植物の選択可能なマーカー、細菌の選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、および少なくとも1つの細菌複製起点からなる群から選択される1つ以上の付加的要素をコードし得る。T-DNA配列は、保存された25bpの不完全反復配列を含む左右の境界を含んでいてもよい。形質転換中に導入されるのは、境界の間の配列である。

【0132】

特定の実施態様において、T-DNA配列は、選択可能なマーカーなどがあるが、これらに限定されない1つ以上の付加的な要素もコードする。適切な選択可能なマーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子、亜リン酸塩変換酵素、形態遺伝子、およびRNAiコンストラクトが挙げられる。好ましい亜リン酸転換酵素はPtxDである。好ましい抗生物質耐性遺伝子は、NptII、HptII、Bla、Barである。好ましい形態遺伝子は、WUS、BBM、LEAFY COTYLEDON1、LEAFY COTYLEDON2、Lec1である。使用可能な抗生物質選択マーカーの例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）が挙げられる。本教示に従って使用できるその他のマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（accC3）耐性、ブレオマイシンおよびフレオマイシン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましいマーカーとしては：トリアジン耐性を与える変異型psbA、特にG264SおよびI219V；ならびにEPSP合成酵素阻害剤に対する耐性を与える変異型エノールピルビルシキメート-3-ホスフェート合成酵素（enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（EPSPS）、特にトリプトファン102変異、アラニン103変異およびプロリン106変異が挙げられる。

【0133】

好ましい実施形態において、T-DNA配列は、T-DNA配列を発現する細胞を同定することを可能にするマーカーもコードする。特定の実施形態において、マーカーは、mCherry、mTurquoise 2、sfGFPまたはpH-tdGFPのようなGFP、Gamillus、mNeonGreen、mEYPF、mCitrine、Citrine、またはTagRFPのような、実施例において特に有効であることが示されている蛍光タンパク質である。好ましくは、マーカーはmCherryである。

【0134】

本発明で使用されるヌクレオチド配列は、一般にプロモーターを含む。プロモーターとは、細胞内で転写を制御（開始）することができるDNA配列である。本明細書で使用される場合、T-DNA上の遺伝子発現を駆動するために使用される「プロモーター」は、植物発現可能である、すなわち、植物細胞、組織または器官において発現を誘導、付与、活性化または増強することができる。これには、植物由来のプロモーター［例えば、T-DNA遺伝子プロモーター、発生特異的プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、葉肉特異的プロモーター（mesophyll- specific promoters））、種子特異的プロモーター、構成的に活性なプロモーター（例えば、Ubil、Uepl、またはActl）、または器官特異的プロモーター（例えば、茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、走根（stolon）特異的プロモーター、トリコーム（tricome）特異的プロモーター、胚珠特異的プロモーター、葯特異的プロモーター、花粉特異的プロモーター、花粉管特異的プロモーター、萼片（sepal）特異的プロモーター、または雌しべ特異的プロモーター）］、ならびに植物細胞において転写を指示することができる非植物起源のプロモーター（例えば、CaMV35Sプロモーターのようなウイルスまたは細菌起源のプロモーター）が挙げられる。プロモーターは、構成的プロモーターを含み得、またはプロモーターは、誘導性プロモーターを含み得る。構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、またはオクトピン合成酵素プロモーターである。組織特異的または誘導性プロモーターの例は、ナピンプロモーター、ファセオリンプロモーター、PTA29プロモーター、PTA26プロモーター、PTA13プロモーター、XVEエストラジオール誘導性プロモーター、またはエタノール誘導性プロモーターである。本発明において有用なプロモーターの例としては、アクチン、CANV 35S、CaMV19S、GOS2が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいプロモーターはCsVMVである。プロモーターはPol3プロモーターであってもよい。発現される薬剤のヌクレオチド配列は、植物発現のために最適化され得る。このような配列の改変の例としては、バナナで通常見出されるものにより近づけるためにG／C含量を変更すること、および植物種では通常見出されないコドンを除去すること（コドンの最適化と呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。構造的コード配列に「作動可能に連結された」プロモーターは、構造的コード配列の発現を効果的に制御し得る。従って、構造的コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をRNAに転写することができる場合、細胞内でプロモーターに「作動可能に連結」される。特定の実施形態では、複数のプロモーターが使用される。

【0135】

追加プラスミド
特定の実施形態では、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列はT-DNAカセットを含まず、T-DNAは追加のプラスミドによってコードされる。

【0136】

T-DNAとvir遺伝子が別々のレプリコン上に存在するシステムは、T-DNAバイナリーシステムと呼ばれる。追加プラスミドはT-DNAバイナリーベクターとしても知られている。バイナリーベクターの例は、pICSL4723、pBIN19、pBHOl、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreenまたはpPZPである（Hajukiewicz、P.ら、Plant Molecular Biology、25、989（1994）、およびHellensら、Trends in Plant Science 5、446（2000））。

【0137】

特定の実施形態において、追加プラスミドは、植物の選択可能なマーカー、細菌の選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、および少なくとも1つの細菌複製起点からなる群より選択される1つ以上の追加要素をコードする。

【0138】

好適な植物の選択可能なマーカーは抗生物質選択マーカーである。使用可能な抗生物質選択マーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）である。さらに使用できるマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（accC3）耐性、ブレオマイシンおよびフレオマイシン耐性遺伝子などがある。さらに好ましいマーカーとしては：トリアジン耐性を与える変異型psbA、特にG264SおよびI219V；ならびにEPSP合成酵素阻害剤に対する耐性を与える変異型エノールピルビルシキメート-3-ホスフェート合成酵素（EPSPS）、特にトリプトファン102変異、アラニン103変異およびプロリン106変異が挙げられる。植物の選択可能なマーカーは、蛍光タンパク質、例えばmCherry、mTurquoise 2、sfGFPまたはpH-tdGFPのようなGFP、Gamillus、mNeonGreen、mEYPF、mCitrine、Citrine、またはTagRFPのような、蛍光タンパク質であり得る。

【0139】

細菌の選択可能なマーカーは、追加プラスミドを含む細菌が確実に選択されるようにし、植物は追加プラスミド（したがってT-DNA）を有する細菌でのみ形質転換されるようにする。適切なマーカーには抗生物質選択マーカーが含まれる。抗生物質選択マーカーの例としては、アンピシリン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、G418、カナマイシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、トリメトプリムおよびゼオシンのうちの1つ以上に対する耐性が挙げられる。特定の実施形態において、選択可能なマーカーは、スペクチノマイシン耐性である。

【0140】

VirD5の発現および/または活性の低下または破壊
本発明の細菌のvir遺伝子をコードするヌクレオチド配列、好ましくはvirヘルパープラスミドによってコードされるVirD5の発現および／または活性は、低下するまたは破壊される。特定の実施形態では、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性が低下する。本明細書で使用される場合、VirD5の発現の文脈における「低下した」という用語は、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または完全にVirD5の発現が低下することを指し得る。本明細書で使用される場合、VirD5の活性の文脈における「低下した」という用語は、VirD5の活性が10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または完全に低下することを指し得る。好ましい実施形態では、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性は破壊される。

【0141】

特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現および／または活性の低下または破壊は、VirD5をコードする配列における少なくとも1つの変異によって媒介される。VirD5をコードする配列における前記少なくとも1つの変異は、（a）少なくとも1つのヌクレオチド挿入；（b）少なくとも1つのヌクレオチド欠失；（c）挿入-欠失（indel）；（d）逆位；（e）少なくとも1つのヌクレオチド置換；および（f）（a）～（e）の任意の組み合わせ；からなる群から選択され得、任意で、挿入または欠失は、フレームシフト挿入またはフレームシフト欠失である。特定の実施形態において、VirD5をコードする配列における前記少なくとも1つの変異は、少なくとも1つのナンセンスまたはミスセンスヌクレオチド置換である。特定の実施形態において、VirD5をコードする配列における前記少なくとも1つの変異は、活性を低下させるまたは破壊するコードされたアミノ酸配列に置換を導入する少なくとも1つのヌクレオチド置換である。特定の実施形態において、VirD5をコードする配列における前記少なくとも1つの変異は挿入であり、挿入された配列は選択可能なマーカーをコードする。選択可能なマーカーは、VirD5配列に挿入された選択可能なマーカーを有する細菌の選択を助けることができる。適切なマーカーとしては、抗生物質選択マーカーが挙げられる。抗生物質選択マーカーの例には、アンピシリン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、G418、カナマイシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、トリメトプリムおよびゼオシンのうちの1つ以上に対する耐性が含まれる。特定の実施形態において、選択可能マーカーは、スペクチノマイシン耐性である。

【0142】

特定の実施形態において、VirD5の発現または活性を低下させるまたは破壊する変異は、内因性のVirD5遺伝子にあり、細菌は、外因的に提供されたVirD5または外因的に提供されたVirD5をコードする配列を含まない。本明細書において、「内因性」という用語は、細菌のゲノムにネイティブであることを意味する。

【0143】

特定の実施形態において、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現の低下または破壊は、VirD5を標的とするサイレンシングRNAの発現によって媒介される。本明細書で使用される場合、「サイレンシングRNA」とは、vir遺伝子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるVirD5の発現を低下させるまたは破壊する能力を有する任意のRNA分子を指す。本明細書で使用される場合、「サイレンシングRNA」には、低分子干渉RNA（siRNA）、ショートヘアピンRNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）、段階的低分子干渉RNA（phasiRNA）、トランス作用siRNA（tasiRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）、リボソームRNA（rRNA）、リピート由来RNA、自律性トランスポーザブルRNA、非自律性トランスポーザブルRNA、およびアンチセンスRNAなどの非コードRNAが挙げられるが、これらに限定されない。

【0144】

特定の実施形態において、VirD5の活性または発現の破壊または低下は、以下のプライマーを用いて変異を導入することにより達成される：
フォワード1 GCCTTTCACATTGGAATCAT（配列番号:30）
リバース1 ATGGGAAGACCTCGTTGTCA（配列番号:31）
フォワード2 AAGGTCGTCCACGATACTTT（配列番号: 32）
リバース2 GGCACTGCTGTCAAGAAATC（配列番号: 33）

【0145】

特定の実施形態では、VirD5のインフレーム欠失が使用される。このような欠失は、相補的配列を有するプライマーを用いて上流および下流の断片を取得し、そしてVirD5が実質的にまたは完全に欠失した単一断片を生成することによって生成され得る。この単一断片は、エレクトロポレーションなどによって細胞に導入することができる。

【0146】

特定の実施形態では、VirD5はその全体が欠失している。

【0147】

DNA編集剤
本発明の細菌は、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つの部位特異的DNA編集剤をコードするT-DNA配列を含む。

【0148】

特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、および改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む。

【0149】

特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列は、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする。特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤は：塩基エディター、プライムエディター、Cas9エンドヌクレアーゼ、またはSpCas9、xCas9、SpCas9-NG、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、CjCas9、NmCas9、StCas9、TdCas9、eSpCas9、HypaCas9、Cas9-SpRY／SpG、Cas4-Cas1-Cas2複合体およびMAD7からなる群から選択されるCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含む。

【0150】

エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷することなく特定の部位でDNAを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼには、I型、II型、III型、IV型エンドヌクレアーゼがあり、さらにサブタイプがある。I型およびIII型のシステムでは、メチラーゼ活性と制限酵素活性の両方が単一の複合体に含まれている。エンドヌクレアーゼには、ホーミングエンドヌクレアーゼ（HEase）としても知られるメガヌクレアーゼも含まれ、制限エンドヌクレアーゼと同様に、特定の認識部位に結合して切断する。エンドヌクレアーゼは、植物ゲノムなどの真核生物ゲノムの精密な遺伝子工学を可能にする。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、以下にさらに議論するように、dCas9のように不活性化され、触媒的に死滅している。

【0151】

本明細書で使用する場合、「メガヌクレアーゼ」は一般的に4つのファミリーに分類される：LAGLIDADGファミリー、GIY-YIGファミリー、His-Cysボックスファミリー、HNHファミリー。これらのファミリーは、触媒活性や認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴づけられる。例えば、LAGLIDADGファミリーのメンバーは、保存されたLAGLIDADGモチーフを1つまたは2つ持っていることが特徴である。メガヌクレアーゼの4つのファミリーは、保存された構造要素、ひいてはDNA認識配列特異性と触媒活性に関して、互いに大きく異なっている。メガヌクレアーゼは微生物種に共通して見られ、非常に長い認識配列（>14bp）を持つというユニークな性質を持っているため、所望の位置での切断について天然で非常に特異的である。この性質を利用して、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断を行うことができる。当業者であれば、このような天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、変異誘発法やハイスループットスクリーニング法を用いて、ユニークな配列を認識するメガヌクレアーゼの変異体を作成してきた。例えば、様々なメガヌクレアーゼを融合して、新しい配列を認識するハイブリッド酵素を作成してきた。あるいは、配列特異的なメガヌクレアーゼを設計するために、メガヌクレアーゼのDNA相互作用アミノ酸を変化させることもできる（例えば、米国特許第8,021,867号参照）。メガヌクレアーゼは、例えばCerto, MT ら、 Nature Methods (2012) 9:073-975；米国特許第8,304,222号；第8,021,867号；第8,119,381号；第8,124,369号；第8,129,134号；第8,133,697号；第8,143,015号；第8,143,016号；第8,148,098号；または第8,163,514号に記載されている方法を用いて設計することができる。あるいは、部位特異的切断特性を有するメガヌクレアーゼは、市販の技術、例えばPrecision Biosciences社のDirected Nuclease Editor^TMゲノム編集技術を用いて得ることができる。

【0152】

本明細書で使用する「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（または「ZFN」）および「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」（または「TALEN」）は、標的化二本鎖切断の生成に有効であることが証明されている（Christian M, Cermak T, Doyle ELら、Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.Genetics.2010;186(2):757-761. doi:10.1534/genetics.110.120717を参照)。ZFNおよびTALEN制限酵素技術は、特定のDNA結合ドメイン（それぞれ一連のジンクフィンガードメインまたはTALEリピートのいずれか）に結合した非特異的DNA切断酵素を利用する。通常、DNA認識部位と切断部位が互いに分離している制限酵素が選択される。切断部位は分離され、次にDNA結合ドメインに連結され、それによって所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような性質を持つ制限酵素の代表的なものはFokIである。さらに、FokIはヌクレアーゼ活性を持つために二量体化を必要とするという利点があり、これは各ヌクレアーゼパートナーがユニークなDNA配列を認識するため、特異性が高まることを意味する。この効果を高めるために、FokIヌクレアーゼはヘテロ二量体としてのみ機能し、触媒活性が増大するように設計されてきた。このようなヌクレアーゼは、不要なホモ二量体活性の可能性を回避し、二本鎖切断の特異性を高める。このように、特定の部位を標的とするために、ZFNとTALENはヌクレアーゼのペアとして構築され、ペアの各メンバーは標的部位の隣接配列に結合するように設計されている。細胞内で一過性に発現させると、ヌクレアーゼは標的部位に結合し、FokIドメインがヘテロ二量体化して二本鎖切断を起こす。非相同末端結合（NHEJ）経路を介したこれらの二本鎖切断の修復は、しばしば小さな欠失や小さな配列の挿入をもたらす。NHEJによる修復はそれぞれユニークであるため、一つのヌクレアーゼ対を用いると、標的部位に様々な欠失を持つ対立遺伝子の系列ができる。欠失の長さは通常数塩基対から数百塩基対の範囲であるが、2対のヌクレアーゼを同時に使うことによって、より大きな欠失を細胞培養で作り出すことに成功している（Carlson DF, Fahrenkrug SC, Hackett PB. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Mol Ther Nucleic Acids. 2012;1(1):e3. Published 2012 Jan 24. doi:10.1038/mtna.2011.5)。さらに、標的領域と相同性を持つDNA断片をヌクレアーゼ対と一緒に導入すると、相同組換え（HR）を介して二本鎖切断や二本鎖切断が修復され、特異的な改変を生成することができる（Urnov, F., Miller, J., Lee, Y.ら、. Designed zinc-finger nucleases using Highly efficient endogenous human gene correction.Nature 435, 646-651 (2005)。https://doi.org/10.1038/nature03556）。ZFNとTALENのヌクレアーゼ部分は類似した性質を持っているが、これらの人工ヌクレアーゼの違いはDNA認識ペプチドにある。ZFNはCys2-His2ジンクフィンガーに依存し、TALENはTALEに依存する。これらのDNA認識ペプチドドメインはどちらも、タンパク質中に自然に存在する組み合わせであるという特徴を持っている。Cys2-His2ジンクフィンガーは通常、3bp離れた繰り返しで見つかり、様々な核酸相互作用タンパク質に多様な組み合わせで存在する。一方、TALEは、アミノ酸と認識されるヌクレオチド対との認識比が1対1の繰り返しで見られる。ジンクフィンガーもTALEも繰り返しパターンで存在するため、様々な組み合わせを試すことで、多種多様な配列特異性を作り出すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作るためのアプローチには、例えばモジュラーアセンブリー（三重鎖配列と相関するジンクフィンガーを必要な配列をカバーするように一列に取り付ける）、OPEN（細菌系において、ペプチドドメイン対三重鎖ヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択に続いてペプチドの組み合わせ対最終ターゲットの高ストリンジェンシー選択を行う）、ジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングなどがある。ZFNは、例えばSangamo Biosciences（登録商標）（カリフォルニア州リッチモンド）から商業的に設計・入手することもできる。TALENを設計し入手する方法は、Reyonら, Nature Biotechnology (2012) 30(5)：460-465；Millerら、Nature Biotechnology (2011) 29: 143-148；Cermakら、Nucleic Acids Research (2011) 39(12): e82、およびZhangら、Nature Biotechnology (2011) 29(2)：149-153に記載されている。「Mojo Hand」と名付けられた最近開発されたウェブベースのプログラムは、ゲノム編集アプリケーション用のTALおよびTALENコンストラクトを設計するためにMayo Clinicによって導入された（www.talendesign.org からアクセス可能）。

【0153】

本明細書で使用する「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、大きな非対称認識部位（12～40塩基対（bp））と、通常イントロンまたはインテインのいずれかに組み込まれたコード配列とを有する二本鎖DNアーゼである（Belfort, M. and Roberts, R.J. (1997) Nucleic Acids Research, 25, 3379-3388）。イントロンは前駆体RNAからスプライシングされるが、インテインは前駆体タンパク質からスプライシングされる（Dujon, B.ら、 (1989) Gene, 82, 115-118; Perler, F.B. et al. (1994) Nucleic Acids Research, 22, 1125-1127）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼは接頭辞「I-」を、インテインエンドヌクレアーゼは接頭辞「PI-」を含む制限エンドヌクレアーゼのものと同様の慣例を使って命名される（Belfort, M. and Roberts, R.J. (1997) Nucleic Acids Research, 25, 3379-3388; Roberts, R.J. ら、(2003) Nucleic Acids Research, 31, 1805-1812）。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位はまれである。例えば、18塩基対（bp）の認識配列は、7 x 10¹⁰ 塩基対のランダム配列に1回しか起こらない。しかしながら、制限エンドヌクレアーゼとは異なり、ホーミングエンドヌクレアーゼはその認識配列内のある程度の配列縮重を許容する（Gimble, F.S. and Wang, J. (1996) Journal of Molecular Biology, 263, 163-180; Argast, M.G.ら、(1998) Journal of Molecular Biology, 280, 345-353）。すなわち、一塩基の変化は切断を無効にするのではなく、その効率を様々な程度まで低下させる。その結果、観察される配列特異性は通常10～12塩基対の範囲にある。

【0154】

本明細書で使用される場合、「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」（または「Cas」）は、RNAガイドポリヌクレオチド編集活性を有するエンドヌクレアーゼを指し、少なくとも1つの追加の構成要素である「ガイドRNA」（gRNA）を使用する、ゲノム編集のためのCRISPR／Casシステムの構成要素の1つである。本発明のいくつかの実施形態において、「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」は、「Cas9エンドヌクレアーゼ」（または「Cas9」）である。いくつかの実施形態によれば、「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」は、SpCas9、SaCas9、FnCas9、NmCas9、St1Cas9、BlatCas9（Shota Nakade, Takashi Yamamoto & Tetsushi Sakuma (2017), Cas9, Cpf1 and C2c1/2/3-What's next?, Bioengineered, 8:3, 265-273、およびその中の参考文献）など、当技術分野で知られている任意のCas9であってもよいが、これらに限定されない。他の実施形態では、「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」は、AsCpf1またはLbCpf1などのCpf1であってもよいが、これらに限定されない（Shota Nakade, Takashi Yamamoto & Tetsushi Sakuma (2017), Cas9, Cpf1 and C2c1/2/3-What's next?, Bioengineered, 8:3, 265-273、およびその中の参考文献）。

【0155】

本明細書で使用される場合、「改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」（または「改変Cas」）は、触媒ドメインが改変された、および／または追加のドメインに融合されたCasを指す。いくつかの実施形態によれば、「改変Cas」は、不活性触媒ドメイン（dead Cas、またはdCas）を含み、ヌクレアーゼ活性を有さない一方で、gRNA特異性に基づいてDNAに結合することができるCasを指す。いくつかの実施形態によれば、「改変Cas」は、ニッカーゼ活性を有するCas（「nCas9」）を指し、したがって、一本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態において、改変されたCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、「改変されたCas9エンドヌクレアーゼ」であり、場合によっては触媒不活性Cas9（または「dCas9」）またはニッカーゼCas9（「nCas9」）である。dCasは、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合させることにより、遺伝子発現を活性化または抑制するDNA転写調節因子のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムDNA中の標的配列にdCasを単独で結合させることで、遺伝子の転写を阻害することができる。Feng Zhang研究室のターゲットファインダー、Michael Boutros研究室のターゲットファインダー「E-CRISP」、RGEN ツール：「Cas-OFFinder」、CasFinder：ゲノム中の特定のCas9ターゲットを同定するための柔軟なアルゴリズムとCRISPR Optimal Target Finder、のような、標的配列を選択および／または設計する助けとなるたくさんの公開ツールならびに異なる種の異なる遺伝子について生物情報学的に決定されたユニークなｇRNAのリストがある。

【0156】

RuvC-またはHNH-という単一の不活性触媒ドメインを含むCas酵素の改変
バージョンは「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインが1つしかないため、Casニッカーゼは標的DNAの1本鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作る。一本鎖切断や一本鎖切断、あるいはニックはたいてい、PARP（センサー）やXRCCl/LIG III複合体（ライゲーション）などのタンパク質が関与する一本鎖切断修復メカニズムによって修復されるが、それに限られない。もし一本鎖切断（SSB）が、トポイソメラーゼI毒、または自然に生じるSSB上にPARP1を捕捉する薬物によって生じた場合、これらは持続する可能性があり、細胞がS期に入り、複製フォークがこのようなSSBに遭遇すると、HRによってのみ修復可能な一本鎖切断DSBとなる。しかし、Casニッカーゼによって導入された2つの近接した反対鎖のニックは、しばしば「ダブルニック」CRISPRシステムと呼ばれるように、二本鎖切断として扱われる。基本的に非平行なDSBであるダブルニックは、遺伝子標的に対する望ましい効果、ドナー配列の存在、細胞周期のステージ（HRは存在量が非常に少なく、細胞周期のSとG2ステージでのみ起こりうる）に応じて、他のDSBと同様にHRまたはNHEJによって修復される。したがって、特異性とオフターゲット効果の低下が重要であるならば、Casニッカーゼを使って、標的配列が近接し、ゲノムDNAの反対鎖上にある2つのgRNAを設計してダブルニックを作れば、このようなイベントが不可能ではないにせよ、どちらか一方のgRNAだけではゲノムDNAを変化させる可能性のないニックが生じるため、オフターゲット効果を低減することができる。

【0157】

特定の実施形態において、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、塩基エディターまたはプライムエディターである。

【0158】

特定の実施形態では、部位特異的DNA編集剤は塩基編集剤を含み、T-DNA配列は標的配列（複数可）に特異的な1つ以上のガイドRNAもコードする。塩基編集は、CRISPRシステムの構成要素を他の酵素とともに用いて、二本鎖DNA切断を生じることなく細胞DNAまたはRNAに点変異を直接導入するゲノム編集アプローチである。特に、dCas9またはnCas9のような改変Casは、塩基編集のために他の酵素とともに（一般に融合タンパク質として）使用することができる。DNA塩基エディターは、核酸塩基デアミナーゼ酵素と融合した触媒作用のないヌクレアーゼと、場合によってはDNAグリコシラーゼ阻害剤を含む。RNA塩基エディターは、RNAを標的とする成分を用いて類似の変化を達成する。塩基エディターは、ある塩基または塩基対を別の塩基に直接変換し、過剰な望ましくない編集副生成物を生成することなく、非分裂細胞における点変異の効率的な設置を可能にする（Rees and Liu (2018), 「Base Editing：Precision Chemistry on the Genome and Transcriptome of Living Cells」, Nature Reviews Genetics, 19(12)：770-788)。特定の実施形態において、塩基エディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼとデアミナーゼ部分とを含む融合ポリペプチドである。好ましい実施形態において、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、nCas9またはdCas9であり、デアミナーゼ部分は、シチジンデアミナーゼ部分またはアデニンデアミナーゼ部分である。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、任意でDNAグリコシラーゼ阻害剤を含んでもよい。好ましい塩基エディターは、nCas9（D10A）、シチジンデアミナーゼAPOBECおよびウラシルグリコシラーゼ阻害剤を含む融合体である。例示的な適切な塩基エディターは、Zongら、Nat Biotechnol.2017, 35(5):438-440)に提供されている。特定の実施形態において、塩基エディターは、アデニンおよびシチジンデアミナーゼ活性の両方を有し、デュアルデアミナーゼ塩基エディターである（Grunewaldら、2020、Nature Biotechnology、38：861-864）。意図される塩基エディターには、APOBEC、BE1、BE2、BE3、HF-BE3、BE4、BE4max、BE4-GAM、YE1-BE3、EE-BE3、YE-BE3、YEE-BE3、VQR-BE3、VRER-BE3、Sa-BE3、Sa-BE4、SaBE4-Gam、SaKKH-BE3、Cas12a-BE、Target-AID、Target-AID-NG、xBE3、eA3A-BE3、A3A-BE3、BE-PLUS、TAM、CRISPR-X、ABE7.9、ABE7.10、ABE7.10*、xABE、ABESa、VQR-ABE、VRER-ABE、およびSaKKH-ABEが挙げられる（Rees and Liu (2018),「Base Editing：Precision Chemistry on the Genome and Transcriptome of Living Cells」, Nature Reviews Genetics, 19(12)：770-788、およびその中の参考文献）。さらなる意図される塩基エディターには、dCas12、dCas13、dCas12a、dCas12b、dCas13a、dCas13b、dCas13c、またはdCas13dのような改変Cas12またはCas13が挙げられる。

【0159】

特定の実施形態では、部位特異的DNA編集剤はプライムエディターを含み、T-DNA配列は標的配列（複数可）に特異的なpegRNAである1つ以上のガイドRNAもコードする。プライム編集は、標的挿入、欠失、および点変異を生成することができるゲノム編集アプローチである。プライム編集は、逆転写酵素と融合したCas9ニッカーゼを使用し、標的部位と所望の編集を特定するpegRNAでプログラムされる。特定の実施形態において、プライムエディターは、改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはnCas9と逆転写酵素とを含む、融合ポリペプチドである。プライムエディターは、PE2、PE2-VQR、PE2-VRQR、PE2-VRER、PE2-NG、PE2-SpG、PE2-SpRY、PE2＊、PE3、PE3b、PE3b-CaMV、PE3b-retron、PE4、PE5、およびPE＋セリン組換え酵素-Bxb1インテグラーゼからなる群から選択され得る（Linら、Nat Biotechnol 38, 582-585 (2020), Anzaloneら., Nature 576, 149-157 (2019), Chenら, Cell.2021, 184(22):5635-5652)。これらのプライムエディターの誘導体も使用できる。

【0160】

CRISPR指向性インテグラーゼによるDNA切断を伴わないドラッグ＆ドロップによるゲノム挿入
Eleonora I. Ioannidi, Matthew T. N. Yarnall, Cian Schmitt-Ulms, Rohan N. Krajeski, Justin Lim, Lukas Villiger, Wenyuan Zhou, Kaiyi Jiang, Nathaniel Roberts, Liyang Zhang, Christopher A. Vakulskas, John A. Walker II, Anastasia P. Kadina, Adrianna E. Zepeda, Kevin Holden, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh
bioRxiv 2021.11.01.466786; doi: https://doi.org/10.1101/2021.11.01.466786 Anzalone, A.V., Gao, X.D., Podracky, C.J.ら、 Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/e10.1038/s41587-021-01133-w)。

【0161】

特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼはプライム-リコンビナーゼ融合体である。

【0162】

特定の実施形態において、部位特異的DNA編集剤は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼを含み、T-DNA配列は、標的配列（複数可）に特異的な1つ以上のガイドRNA、および相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレートもコードする。

【0163】

好ましくは、エンドヌクレアーゼおよび任意のガイドRNAおよびドナーテンプレートはT-DNAによってコードされ、T-DNAは植物細胞に移され、次いで遺伝子編集機構が変異の導入を媒介するために一過性に発現される。特定の実施形態では、遺伝子編集機構は細菌細胞によって発現され、植物細胞に送達されるリボ核タンパク質複合体を形成する。

【0164】

特定の実施形態において、T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができる少なくとも1つのドナーテンプレートを含む。T-DNA配列は、ガイドRNA部位またはCRISPR-Cas9部位としても知られるガイドRNAによって認識され得る配列に隣接する少なくとも1つのドナーテンプレートを含み得る。好ましくは、T-DNA配列は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼと、標的配列に特異的であり、ドナーテンプレートに隣接するガイドRNA部位に特異的である1つ以上のガイドRNAとをコードし、それによってT-DNA配列の発現時にドナー遊離が生じる。

【0165】

共同編集
実施例は、本発明の細菌が2つ以上の標的配列を同時に共編集するのに有効であることを示している。これにより、2つ以上の特定の変異を有する植物を効果的に作製することができる。さらに、2つ以上の標的配列に変異を導入することができる細菌は、遺伝子編集された非トランスジェニック植物の高効率選択を可能にする。最初の標的配列で編集された植物は、2番目の配列でも編集されている可能性が高いからである。例えば、1つの変異が選択可能な形質を導入する場合、これを利用して2番目の変異が濃縮された植物を選択することができる。

【0166】

特定の実施形態において、T-DNA配列は：（a）少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、（b）第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNA、および（c）第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNAをコードし、ここで、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。

【0167】

特定の実施形態において、少なくとも1つの改変されたCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、1つ以上の塩基エディターである。

【0168】

特定の実施形態において、T-DNA配列は：（a）少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、（b）第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNA、および（c）第1の標的配列以外の少なくとも1つの追加の標的配列に特異的な少なくとも1つの追加のガイドRNAをコードし、ここで、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、少なくとも1つの追加の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。

【0169】

特定の実施形態において、少なくとも1つの改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、かつ少なくとも1つの追加の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、1つ以上の塩基エディターである。特定の実施形態によれば、同じ塩基エディターは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第1の標的配列および少なくとも1つの追加の標的配列に特異的に向けられたガイドRNA配列を介して、少なくとも1つの追加の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。

【0170】

特定の実施形態において、（a）T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができるドナーテンプレートもコードする；または（b）T-DNA配列は、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第1の標的配列に導入することができる第1のドナーテンプレート、および相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を第2の標的配列に導入することができる第2のドナーテンプレートもコードする。

【0171】

特定の実施形態において、少なくとも1つの改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、1つ以上のプライムエディターであり、第1のガイドRNAは、第1の標的配列に特異的であり、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、第1のpegRNAであり、第2のガイドRNAは、第2の標的配列に特異的であり、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、第2のpegRNAである。

【0172】

特定の実施形態において、少なくとも1つのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、少なくとも2つの異なるエンドヌクレアーゼを含み、第1のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができ、第2のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。第1のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列にいかなる変異も導入するように機能しなくてもよい、および／または第2のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列にいかなる変異も導入するように機能しなくてもよい。第1のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に特異的な第1のガイドRNAとリボ核タンパク質複合体を形成してもよく、第2のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列に特異的な第2のガイドRNAとリボ核タンパク質複合体を形成してもよい。例えば、特定のタイプのガイドRNAを組み込んだエンドヌクレアーゼを使用してもよい。例えば、Cas9はcrRNAとtrRNAの両方を使用してsgRNAを形成するが、Cas12aはcrRNAのみを必要とする。したがって、特定の実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼはCas9または改変Cas9であり、第1のガイドRNAはsgRNAであり、第2のエンドヌクレアーゼはCas12aまたは改変Cas12aであり、第2のガイドRNAはcrRNAであるか、または第1のエンドヌクレアーゼはCas12aまたは改変Cas12aであり、第1のガイドRNAはcrRNAであり、第2のエンドヌクレアーゼはCas9または改変Cas9であり、第2のガイドRNAはsgRNAである。代替的に、または組み合わせて、第1および第2のエンドヌクレアーゼは、異なるPAM配列を認識し得る。そのような実施形態において、第1および第2のエンドヌクレアーゼは、SpCas9、CjCas9およびCas12aから別々に選択され得る。

【0173】

さらなる実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に特異的なsgRNAとリボ核タンパク質複合体を形成してもよく、第2のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列に特異的なpegRNAとリボ核タンパク質複合体を形成するプライムエディターであってもよい。さらなる実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼは、第1の標的配列に特異的なpegRNAとリボ核タンパク質複合体を形成するプライムエディターであってもよく、第2のエンドヌクレアーゼは、第2の標的配列に特異的なsgRNAとリボ核タンパク質複合体を形成してもよい。

【0174】

したがって、いくつかの実施形態において、第1および第2のエンドヌクレアーゼは、異なるPAM配列を認識し得る。いくつかの実施形態において、第1のエンドヌクレアーゼおよび第2のエンドヌクレアーゼはいずれも、第1の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる、および／または両方とも、第2の標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。第1および第2のエンドヌクレアーゼは、同じPAM配列を認識してもよい。いくつかの実施形態では、（i）第1のエンドヌクレアーゼが塩基エディターであり、第2のエンドヌクレアーゼがプライムエディターであり、第2のガイドRNAがpegRNAである、または第1のエンドヌクレアーゼがプライムエディターであり、第1のガイドRNAがpegRNAであり、第2のエンドヌクレアーゼが塩基エディターである；または（ii）第1のエンドヌクレアーゼが塩基エディターであり、第2のエンドヌクレアーゼがCas9などのCRISPR関連エンドヌクレアーゼであるか、または第1のエンドヌクレアーゼがCas9などのCRISPR関連エンドヌクレアーゼであり、第2のエンドヌクレアーゼが塩基エディターである。Cas9などのCRISPR関連エンドヌクレアーゼを採用する実施形態では、一般に、相同性依存性修復（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して少なくとも1つの変異を導入することができるドナーテンプレートが使用される。

【0175】

好ましい実施形態において、第1の標的配列に導入された少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらす。選択可能な形質は、除草剤耐性であってもよく、任意で、少なくとも1つの変異は、少なくとも1つのアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子における少なくとも1つの変異を含み、ALS遺伝子における少なくとも1つの変異は、ALS阻害剤に対する耐性を提供する。理論または機構に拘束されることを望むものではないが、選択可能な形質は、第2の標的配列または少なくとも1つの追加の標的配列において編集された、細胞、植物部分または植物の選択を可能にする。

【0176】

ガイドRNA
T-DNAは任意に、標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードすることができる。

【0177】

本明細書で使用する「ガイドRNA」という用語は、細胞内のゲノム配列またはエピソーム配列などの標的配列へのCRISPR関連エンドヌクレアーゼまたは改変CRISPR関連エンドヌクレアーゼの特異的標的化を促進するポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態によれば、ガイドRNAは、キメラ／単一分子（単一のRNA分子を含み、単一ガイドRNAまたはsgRNAとも呼ばれる）またはモジュール（2つ以上の別個のRNA分子を含み、典型的には、例えば二重鎖形成によって連結され得るcrRNAおよびtracrRNA）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、ガイドRNAはsgRNAであり、これはtracrRNAとcrRNAの両方（および連結ループ）を含むRNA分子である。sgRNAは、標的相同配列（crRNA）をコードするヌクレオチド配列と、crRNAをCasヌクレアーゼ（tracrRNA）に連結する内在性細菌RNAとを単一のキメラ転写物中に含む。可変領域として知られるcrRNAのこの領域は、関連するエンドヌクレアーゼの切断特異性を与え、通常20ヌクレオチド長である。ガイドRNA/Cas複合体は、gRNA配列と相補体ゲノムDNAとの塩基対形成によって標的配列にリクルートされる。Cas9のようないくつかのCas分子の結合を成功させるためには、ゲノム標的配列が標的配列の直後に正しいPAM（Protospacer Adjacent Motif）配列を含んでいなければならない。ガイドRNA／Cas複合体の結合は、Casをゲノム標的配列に局在させる。野生型Cas9はDNAの両鎖を切断し、二本鎖または二本鎖切断を引き起こす。ニッカーゼのようなCas9の変異体は一本鎖のみを切断する。塩基エディター（ニッカーゼ、またはデアミナーゼと融合した触媒的に死んだCas9）のためのガイド配列は、sgRNA配列内の活性ウィンドウにおいて特定のヌクレオチドが編集されるゲノムの特定の領域に対するデアミナーゼをターゲットする。ZFNやTALENと同様に、CRISPR/Casによって生産された二本鎖切断は、HR（相同組換え）またはNHEJ（非相同末端結合）によって修復され、DNA修復の際に特定の配列改変を受けやすい。Casヌクレアーゼには2つの機能ドメインがある：RuvCとHNHで、それぞれが異なるDNA鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性化すると、CasはゲノムDNAの二本鎖切断を引き起こす。 CRISPR/Casの大きな利点は、このシステムの効率の高さと、合成ガイドRNAを簡単に作成できることである。これにより、異なるゲノム部位を標的にする、および／または同じ部位の異なる改変を標的にするために、容易に改変できるシステムが構築される。さらに、複数の遺伝子を同時に標的にできるプロトコールも確立されている。変異を持つ細胞の大部分は、標的遺伝子に両アレル変異を持つ。しかしながら、ガイドRNA配列とゲノムDNA標的配列との間の塩基対相互作用には明らかな柔軟性があるため、標的配列との不完全なマッチングをCasによって切断することができる。

【0178】

いくつかの実施形態によれば、ガイドRNAはプライム編集RNA（pegRNA）である。pegRNAは、標的部位を同定することが可能であり、標的DNAヌクレオチドを置換するための新たな遺伝情報を提供することが可能である。pegRNAは、所望の編集を含む拡張sgRNA配列、プライマー結合部位および逆転写酵素テンプレート配列を含み得る。ゲノム編集の際、プライマー結合部位はニックのついたDNA鎖の3'末端をpegRNAにハイブリダイズさせ、逆転写酵素テンプレートは編集された遺伝情報の合成のためのテンプレートとして機能する。

【0179】

特定の実施形態において、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に特異的な1つ以上のガイドRNAをコードする配列は、Pol3プロモーターに作動可能に連結され得る。Pol3プロモーターの例としては、AtU6-29、AtU626、AtU3B、AtU3d、およびTaU6が挙げられるが、これらに限定されない。

【0180】

ドナーテンプレート
本明細書において、「ドナーオリゴヌクレオチド」または「ドナーテンプレート」という用語は、外因性ヌクレオチド、すなわち、ゲノムに正確な変化を生じさせるために植物細胞に外部から導入されるヌクレオチドを指す。ドナーオリゴヌクレオチドは合成でもよい。好ましくは、ドナーオリゴヌクレオチドは、T-DNA配列によってコードされる。特定の実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドはRNAオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）、二本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（dsODN）、二本鎖DNA（dsDNA）、二本鎖DNA-RNA二重鎖（DNA-RNA duplex）二本鎖DNA-RNAハイブリッド、一本鎖DNA-RNAハイブリッド、一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、一本鎖RNA（ssRNA）を含む。特定の実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドは、非発現ベクターフォーマットまたはオリゴで提供される。特定の実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドは、DNAドナープラスミド（例えば、環状または線状化プラスミド）を含む。いくつかの実施形態によれば、ドナーテンプレートは、プライムエディター（例えば、pegRNAのプライマー配列の少なくとも一部）とともに使用されるpegRNAの一部としてコードされ、任意で、pegRNAはT-DNA配列によってコードされる。

【0181】

いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、標的配列に最小限の変化のみを導入する。特定の実施形態において、ドナーテンプレートは、標的配列に対して1～40、例えば5～40、5～30、5～20、3～40、3～30、3～20、5～15、3～10、10～30、または10～20のヌクレオチドの付加、欠失、および置換を含む。

【0182】

いくつかの実施形態によると、ドナーテンプレートは、相同性依存性修復（HDR）機構によってゲノムに正確な変化を導入するように設計されている。HDRドナーテンプレートのための任意の適切な設計が使用され得る。特定の実施形態において、ドナーテンプレートは、それぞれが100～1000、200～1000、200～800、300～800、300～700、400～600ヌクレオチドのような、長さ10～1000ヌクレオチドの2つの相同性アームなどの相同性アームを含む。いくつかの実施形態によれば、HDRドナーテンプレートはT-DNAから放出される。ドナーに隣接するガイドRNA部位は、T-DNAからのドナーの放出を促進するために、植物細胞核に送達されるDNA上にコードされ得る。

【0183】

他の実施形態によると、ドナーテンプレートは、非相同末端接合（NHEJ）機構を介してゲノムに正確な変化を導入するように設計されている。NHEJドナーテンプレートのための任意の適切な設計が使用され得る。NHEJドナーは二本鎖切断部位でゲノムに挿入されるため、相同性アームは必要ない。この機構は、NHEJドナーがT-DNAから放出されることを必要とし、従って、植物細胞核に送達されるDNA上にコードされた、ドナーに隣接するガイドRNA部位を必要とする。

【0184】

ある実施形態では、テンプレ～トはホスホロチオエ～ト修飾などの化学修飾を含んでいる。修飾は、線状ドナ～のライゲ～ションを防止する、および／またはその安定性を増強し得る。一実施形態によれば、ドナ～オリゴヌクレオチドは、約50～5000、約100～5000、約250～5000、約500～5000、約750～5000、約1000～5000、約1500～5000、約2000～5000、約2500～5000、約3000～5000、約4000～5000、約50～4000、約100～4000、約250～4000、約500～4000、約750～4000、約1000～4000、約1500～4000、約2000～4000、約2500～4000、約3000～4000、約50～3000、約100～3000、約250～3000、約500～3,000、約750～3,000、約1000～3000、約1500～3000、約2000～3000、約50～2000、約100～2000、約250～2000、約500～2000、約750～2000、約1000～2000、約1500～2000、約50～1000、約100～1000、約250～1000、約500～1000、約750～1000、約50～750、約150～750、約250～750、約500～750、約50～500、約150～500、約200～500、約250～500、約350～500、約50～250、約150～250、または約200～250のヌクレオチドを含む。特定の実施形態によれば、ssODNを含むドナーオリゴヌクレオチド（例えば、ssDNAまたはssRNA）は、約200～500ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態によれば、ssODN（例えば、ssDNAまたはssRNA）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約300～500ヌクレオチドまたは約400～500ヌクレオチドを含む。特定の実施形態によれば、dsODN（例えば、dsDNAまたはdsRNA）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約250～5000ヌクレオチドを含む。

【0185】

特定の実施形態において、ドナーテンプレートは、50～180、60～150、60～120、70～120、70～110、80～110または80～100ヌクレオチドなど、40～200ヌクレオチドの長さである。

【0186】

細菌
本発明の細菌は、ヌクレオチド配列を植物細胞核に転移することができる。特定の実施形態において、この能力は、そうでなければ植物にDNAを移入することができない細菌に病原性遺伝子およびT-DNAを移入することによって達成され得る。あるいは、細菌は、それらが天然に病原性遺伝子を含んでいる場合、ヌクレオチド配列を植物に移入することができる。本発明で使用する細菌は、好ましくはIV型分泌系を含む。

【0187】

特定の実施形態において、細菌は、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、エンシファー属、アロリゾビウム属、ネオリゾビウム属（Neorhizobium）、またはシネラ属（Shinella）のものである。これらの分類群は出願日現在のものである。今後、分類群の改訂が行われた場合、変更される可能性があります。アグロバクテリウムの病原性タンパク質のホモログは、リゾビウム属に属するいくつかの共生植物関連細菌種で見つかっている。例えば、Rhizobium etliは、病原性タンパク質の完全なセットをコードしており、T-DNAが与えられると、宿主植物細胞ゲノムへのDNAの転移および組み込みを媒介することができる。好ましくは、細菌はアグロバクテリウム属である。いくつかの実施形態において、細菌は：アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ファブラム str.C58、アグロバクテリウム・ジェノモスプ、アグロバクテリウム sp.S2／73、アグロバクテリウム sp.13-2099-1-2、アグロバクテリウムsp.NCPPB925、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・サリニトレランスs、アグロバクテリウム・ヴィティス、アグロバクテリウム・アルセニイェビッチ、アグロバクテリウム・デルタエンセ、アグロバクテリウム・ラリームーレイ、リゾビウム sp.AB2／73、リゾビウム sp.16-488-2b、リゾビウム sp.16-488-2a, リゾビウム sp. 16-449-1b, リゾビウム sp. L58/93, リゾビウム sp. L245/93, リゾビウム sp. E27B/91, リゾビウム sp. K1/93, リゾビウム sp.BK007、リゾビウム・チューモリジーンズ、リゾビウム・スキエルニウィセンス、リゾビウム・ルシタナム、ネオリゾビウムsp.NCHU2750、ネオリゾビウム・ガレガエ、エンシファー sp.YR511、およびエンシファー・アドヘレンスからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細菌は：エンシファー・アドヘレンス、エンシファー・アドヘレンス OV14、エンシファー・アルカリソリ（Ensifer alkalisoli）、エンシファー・アリディ（Ensifer aridi）、エンシファー・グリシニス（Ensifer glycinis）、エンシファー・プソラレア（Ensifer psoraleae）、エンシファー・セスバニア（Ensifer sesbaniae）、エンシファー・ショフィナエ（Ensifer shofinae）、エンシファー・ソジェ（Ensifer sojae） CCBAU 05684、エンシファー sp. 1H6、エンシファー sp.AP48, エンシファー sp. BR816, エンシファー sp. LC11, エンシファー sp. LC13, エンシファー sp. LC14, エンシファー sp. LC163, エンシファー sp. LC384, エンシファー sp. LC499, エンシファー sp. LC54, エンシファー sp. LCM 4579, エンシファー sp. M14, エンシファー sp.MMN_5, エンシファー sp. NM-2, エンシファー sp. OV372, エンシファー sp. Root1252, エンシファー sp. Root127, エンシファー sp. Root1298, エンシファー sp. Root1312, エンシファー sp. Root142, エンシファー sp. Root231, エンシファー sp. Root258, エンシファー sp.Root278, エンシファー sp. Root31, エンシファー sp. Root423, エンシファー sp. Root558, エンシファー sp. Root74, エンシファー sp. Root954, エンシファー sp. T2_8, エンシファー sp. USDA 6670, エンシファー sp. WSM1721, エンシファー sp. YR511, エンシファー sp. ZNC0028、からなる群から選択される。

【0188】

好ましい実施形態において、細菌はアグロバクテリウム・ツメファシエンスである。アグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105株またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL1株に由来し得る。

【0189】

標的配列とその変異
部位特異的DNA編集剤は、植物細胞内の少なくとも1つの標的配列に少なくとも1つの変異を導入することができる。

【0190】

本明細書で使用する「変異」とは、少なくとも1つのヌクレオチド挿入、少なくとも1つのヌクレオチド欠失、挿入-欠失（indel）、逆位、少なくとも1つのヌクレオチド置換、または前述の任意の組み合わせを意味し得る。改変は、標的配列においてフレームシフト、ミスセンス変異、機能喪失変異、ナンセンス変異または機能獲得変異をもたらし得る。所望の変異を導入することができる薬剤は、標準的な技術を用いて、必要とされる変異のタイプに応じて設計することができる。

【0191】

特定の実施形態では、ガイドRNAまたはpegRNAは少なくとも1つの標的配列に特異的である。

【0192】

少なくとも1つの標的配列は、遺伝子内に存在し得る。少なくとも1つの標的配列は、サイレンシングRNAをコードする遺伝子座にあってもよい。

【0193】

特定の実施形態において、少なくとも1つの標的配列は、除草剤耐性を付与する、害虫に対する感受性を付与する、病原体に対する感受性を付与する、またはストレス耐性、収量、成長速度、もしくは収量品質に関与する、タンパク質をコードし得る。

【0194】

本明細書で使用される「ストレス耐性」という語句は、代謝、成長、生産性および／または生存率に実質的な変化を被ることなく、生物学的ストレスまたは非生物学的ストレスに耐える植物の能力を指す。本明細書で使用する「生物学的ストレス」とは、植物、植物細胞などが、植物の代謝、成長、発生、増殖、または生存（総称して「成長」）に悪影響を及ぼす非生物の（「非生物的」）環境的、物理的、または化学的要因に曝されることを指す。非生物的ストレスは、例えば、水（例えば、洪水、干ばつ、または脱水）、嫌気条件（例えば、低レベルの酸素または高レベルのCO2）、異常浸透圧条件（例えば、浸透圧ストレス）、塩分、または温度（例えば、暑熱、寒冷、凍結、霜）、汚染物質への暴露（重金属毒性など）、嫌気性生物、栄養欠乏（窒素欠乏、または窒素制限）、大気汚染、紫外線照射などである。本明細書で使用する「生物学的ストレス」という語句は、植物、植物細胞などが、植物の代謝、成長、発生、増殖、収量または生存（総称して「成長」）に悪影響を及ぼす、生きている（「生物学的」）生物（なおウイルスを含む）に暴露されることを指す。生物的ストレスは、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、有益および有害な昆虫、雑草、ならびに栽培植物または在来植物によって引き起こされる可能性がある。本明細書で使用される「収量」または「植物収量」という語句は、植物成長（成長速度）の増加、作物成長の増加、バイオマスの増加、および／または植物産物生産（穀物、果実、種子などを含む）の増加を指す。本明細書で使用される「害虫」という用語は、直接または間接的に植物に害を与える生物を指す。直接的な影響としては、例えば、植物の葉を食害することが挙げられる。間接的影響には、例えば、植物への病害物質（例えば、ウイルス、細菌など）の伝播が含まれる。後者の場合、害虫は病原体伝播のための媒介動物として機能する。一実施形態によれば、害虫は無脊椎動物生物である。例示的な害虫としては、昆虫、線虫、カタツムリ、ナメクジ、クモ、イモムシ、サソリ、ダニ、マダニ、真菌などが挙げられるが、これらに限定されない。変異させる植物または病原体の標的遺伝子の同定は、日常的なバイオインフォマティクス分析など、当技術分野で知られている任意の方法を用いて達成することができる。

【0195】

特定の実施形態では、標的配列の変異は遺伝子を不活性化するか、その発現または活性を低下させる。

【0196】

増加したストレス耐性を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。増加したストレス耐性を評価する例示的な方法としては、Yoon, SK., Bae, EK., Lee, H.ら、 Trees (2018) 32: 823.)に記載されているような、塩ストレス耐性を増加させるためのポプラにおけるPagSAP1の発現低下、およびSlbZIP38の発現低下によるトマトにおける乾燥耐性の増加（Pan Yら、 Genes 2017, 8, 402; doi:10.3390/genes8120402が挙げられるが、これらに限定されない。収量の増加を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。収量の増加を評価する例示的な方法には、Ar-Rafi Md.Faisal,ら、 AJPS> Vol.8 No.9, August 2017 DOI: 10.4236/ajps.2017.89149に記載されている、米におけるDST発現の低下；およびWang Yら、 Mol Plant.2009 Jan; 2(1)：191-200.doi:10.1093/mp/ssn088に記載されている、キャノーラにおけるBnFTAの発現低下による収量の増加が挙げられるが、これらに限定されない。成長速度の増加を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。成長速度の増加を評価する例示的な方法としては、Marcelo de Freitas Limaら、 Biotechnology Research and Innovation (2017)1,14---25に記載されているような、シロイヌナズナにおけるBIG BROTHER、またはGA2-OXIDASEの発現の低下の結果、成長およびバイオマスが増強されることが挙げられるが、これらに限定されない。増加した収量品質を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法が、本発明に従って使用され得る。増加した収量品質を評価する例示的な方法としては、Yeh S_Yら、 Rice (N Y).2015; 8: 36;に記載されているように、米におけるOsCKX2の発現低下は、より多くの分蘖、より多くの穀粒の生産をもたらし、穀粒はより重くなること、およびVerma SR and Dwivedi UN, South African Journal of Botany Volume 91, March 2014, Pages 107-125.に記載されているように、多くの植物においてOMTレベルの低下が、改変リグニンの蓄積をもたらし、商業目的の材料の消化性を増加させることが挙げられるが、これらに限定されない。

【0197】

特定の実施形態において、少なくとも1つの標的配列は、成熟、代謝物レベル、デンプン含量、糖含量などがあるがこれらに限定されない植物の形質または果実の形質に関与するRNAまたはタンパク質をコードし得る。特定の実施形態において、少なくとも1つの標的配列は、果実の甘味、果実の糖度、果実の風味、果実の成熟制御、水ストレス耐性、熱ストレス耐性、または塩耐性に関与する、RNAまたはタンパク質をコードし得る。

【0198】

いくつかの実施形態において、標的配列は、果実の成熟に関与するタンパク質、例えば、エチレンの生産に関与するタンパク質をコードする。植物がバナナである場合、いくつかの実施形態において、標的配列は、ACO（1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸オキシダーゼ）および／またはACS（ACC-シンターゼ）をコードし得る。ACOおよびACSは、エチレンの生産に関与する。特定の実施形態において、所望の変異は、ACOおよび／またはACSの発現または活性を低下させ、バナナ果実の成熟を遅延させ得る。好ましい実施形態において、所望の変異は、ACOもしくはACSまたは両方をコードする配列に停止コドンを導入する。好ましい実施形態において、標的配列は、ACO1（例えば、配列番号：1、または配列番号：1に対して少なくとも90、95、98もしくは99％の配列同一性を有する配列）である。特定の実施形態において、標的はACOであり、標的配列は、配列番号: 1および配列番号: 2、または配列番号: 1もしくは配列番号: 2に対して少なくとも90、95、98もしくは99％の配列同一性を有する配列から選択される。特定の実施形態において、標的配列はACSであり、標的配列は、配列番号: 3、配列番号: 4および配列番号: 5、または配列番号: 3、配列番号: 4もしくは配列番号: 5に対して少なくとも90、95、98もしくは99％の配列同一性を有する配列から選択される。また、例示的な標的配列は、国際公開第2018/220581号に提供される。

【0199】

特定の実施形態において、標的配列は、果実の褐変に関与するタンパク質をコードする。 植物がバナナである場合、いくつかの実施形態において、標的配列はPPO（ポリフェノールオキシダーゼ）をコードし得る。PPOは、バナナの褐変に関与すると考えられている酵素である。好ましい実施形態において、標的配列は、PPO2（例えば、配列番号：6、または配列番号：6に対して少なくとも90、95、98もしくは99％の配列同一性を有する配列）である。また、例示的な標的配列は、国際公開第2018/220581号に提供されている。特定の実施形態において、所望の変異は、PPOの発現または活性を低下させ、バナナ果実の成熟を遅延させ得る。好ましい実施形態において、所望の変異は、PPOをコードする配列中に停止コドンを導入する。

【0200】

任意で、複数の配列を変異の標的とすることができ（例えば、ACO、ACSおよびPPO遺伝子の任意の組み合わせを同時に標的とすることができる）、各配列の標的について、1つまたは複数の変異を導入することができる。本発明は、様々な効果を達成するために、非常に多くの異なる遺伝子を変異させるために使用することができる。本発明は、改良された形質を提供し、例えば癌、ウイルス、昆虫、真菌、線虫、熱、干ばつ、飢餓などのような異なる生物的および非生物的ストレスから生物を保護するための内因性遺伝子の調節に特に有用である。好ましくは、所望の変異は、遺伝子の発現または発現されたタンパク質の活性を低下させる。好ましくは、変異は停止コドンの導入である。

【0201】

特定の実施形態において、植物細胞における少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を含み、任意で、選択可能な形質は除草剤耐性である。

【0202】

いくつかの実施形態において、植物細胞中の少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は、植物細胞において選択可能な形質をもたらす少なくとも1つの変異を含む。本明細書で使用される「選択可能な形質」とは、例えば、植物を特定の化合物に曝露する場合、または植物を特定の環境に曝露する場合、または観察され得る植物における編集の物理的特性が存在する場合に、選択され得る形質を指す。このような選択により、所望の変異を有する植物を同定することができる。好ましくは、選択可能な形質は、一過性の選択を可能にする、すなわち、選択は、植物を特定の化合物に暴露するような特定の一時的な条件が存在する場合にのみ起こり得る。好ましい実施形態において、選択可能な形質は除草剤耐性である。他の選択可能な形質の例としては、抗生物質耐性および亜リン酸塩選択が挙げられる。特定の実施形態において、「選択可能な形質」は、例えば視覚的選択による形質転換のマーカーとして機能し得る表現型の結果である。例えば、一過性のPDS遺伝子編集は、選択可能なアルビノ植物を作製する。

【0203】

特定の実施形態において、標的配列はアセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子である。ALS遺伝子における少なくとも1つの変異は、ALS阻害剤に対する耐性を提供し得る。ALS遺伝子は、バナナのアセト乳酸合成酵素1（ALS1）遺伝子またはアセト乳酸合成酵素2（ALS2）遺伝子であってもよく、ここで植物細胞はバナナ細胞である。ALS遺伝子における少なくとも1つの変異は、コードされるアミノ酸配列に置換を導入する置換であり、好ましくはバナナALS1におけるPro-187またはALS2におけるPro-181、最も好ましくはALS1におけるPro187SerまたはALS2におけるPro181Serにおいて置換を導入する置換であり得る。特定の実施形態において、ALS阻害剤はスルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシベンゾエート、またはスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンであり、好ましくはALS阻害剤はクロルスルフロンである。ALS阻害剤の他の例としては、ピリミジニルチオベンゾエート（a pyrimidinylthiobenzoate）、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン（a sulfonylaminocarbonyltriazolinone）およびスルホニルウレアが挙げられる。好ましいイミダゾリノンとしては、イマザメタベンズメチル（imazamethabenz-methyl）、イマザモックス（imazamox）、イマザピック（imazapic）、イマザピル（imazapyr）、イマザキン（imazaquin）およびイマゼタピル（imazethapyr）が挙げられる。好ましいピリミジニルチオベンゾエートとしては、ビスピリバックナトリウム（bispyribac-sodium）およびピリチオバックナトリウム（pyrithiobac-sodium）が挙げられる。好ましいスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン類としては、フルカルバゾンナトリウム（flucarbazone-sodium）およびプロポキシカルバゾンナトリウム（propoxycarbazone-sodium）が挙げられる。好ましいスルホニルウレア類としては、ベンスルフロン-メチル（bensulfuron-methyl）、クロリムロン-エチル（chlorimuron-ethyl）、クロルスルフロン、フォラムスルフロン（foramsulfuron）、ハロスルフロン-メチル（halosulfuron-methyl）、メソスルフロン-メチル（mesosulfuron-methyl）、メツスルフロン-メチル（metsulfuron-methyl）、ニコスルフロン（nicosulfuron）、プリミスルフロン-メチル（primisulfuron-methyl）、プロスルフロン（prosulfuron）、リムスルフロン（rimsulfuron）、スルホメツロン-メチル（sulfometuron-methyl）、スルホスルフロン（sulfosulfuron）、チフェンスルフロン-メチル（thifensulfuron-methyl）、トリアスルフロン（triasulfuron）、トリベヌロン-メチル（tribenuron-methyl）、トリフロキシスルフロン-ナトリウム（trifloxysulfuron-sodium）およびトリフルスルフロン-メチル（triflusulfuron-methyl）が挙げられる。好ましいトリアゾロピリミジンとしては、クロランスラムメチル（cloransulam-methyl）、ジクロスラム（diclosulam）、フロラスラム（florasulam）、フルメツラム（flumetsulam）、ペノキススラム（penoxsulam）、およびピロキススラム（pyroxsulam）が挙げられる。導入されたALS変異（複数可）は、1つ以上の任意のALS阻害剤に対する耐性を提供することができる。例えば、単一の変異は複数の阻害剤に対する耐性を提供することができ、複数の変異は異なる阻害剤に対する耐性を提供することができる。

【0204】

植物
ある実施形態では、植物細胞はバナナ、コーヒー、または米である。

【0205】

好ましい実施形態において、植物細胞はバナナである。本明細書で使用される場合、用語「バナナ」は、オオバコを含むムサ属の植物を指す。これらには、マレーヤマバショウ（例えば、マレーヤマバショウ・バンクシア（Musa acuminata banksia）、マレーヤマバショウ・カルカッタ（Musa acuminata Calcutta）、およびマレーヤマバショウ・DH-パハン（Musa acuminata DH-Pahang））、リュウキュウバショウ、バーミーズブルーバナナ、および自家倍数体マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」および「グロスミシェル」が含まれる。特定の実施形態によれば、バナナは自家3倍体マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」である。特定の実施形態によれば、バナナは、マレーヤマバショウ 「キャベンディッシュ」のグランドナイン（Grand Nain）品種、好ましくはGN236である。栽培バナナは、前駆種マレーヤマバショウ（ゲノムAA）に由来する不稔性自家三倍体（AAA）である。さらに、オオバコ（AABまたはABB）は、マレーヤマバショウ（AA）とリュウキュウバショウ（ゲノムBB）の雑種に由来する不稔性種間異質3倍体である。栽培バナナおよびオオバコの3倍体の性質により、生存可能な種子を生産することができないが、野生種は2倍体であり、生存可能な種子を生産することができる。特定の実施形態では、バナナ植物は3倍体である。二倍体や四倍体を含む他の倍数体も考えられる。

【0206】

特定の実施形態において、植物細胞はコーヒーのものである。本明細書で使用される場合、用語「コーヒー」は、コーヒーノキ属の植物を指す。これらには、アラビカコーヒーノキ（Coffea arabica）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、リベリカコーヒーノキ（Coffea liberica）、シャリエコーヒーノキ（Coffea charrieriana）およびユージノイデスコーヒーノキ（Coffea eugenioides）が含まれる。

【0207】

特定の実施形態において、植物細胞は米である。本明細書で使用される場合、「米」という用語は、イネ属（Oryza）およびマコモ属（Zizania）の植物を指す。これらには、オリザ・サティバ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrim）、オリザ・ルフィポゴン（Oryza rufipogon）、オリザ・バルシー（Oryza barthii）およびオリザ・ニヴァラ（Oryza nivara）が含まれる。

【0208】

植物細胞と植物部分
植物細胞には、分裂領域の細胞、カルス組織の細胞、葉細胞、根細胞、シュート細胞、体細胞、花細胞、花粉細胞、小胞子、種子細胞、胚細胞、胚発生細胞、配偶体細胞、胞子体細胞、体細胞、および前述の組み合わせが挙げられる。プロトプラストは、任意の植物組織に由来し得る。いくつかの実施形態によれば、植物細胞は、胚細胞懸濁液（ECS）のような懸濁培養物の細胞である。

【0209】

本明細書で使用される「植物部分」としては、根（塊茎を含む）、台木、茎、穂木、芽、果実、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、胚発生細胞、胚細胞、分裂領域の細胞、カルス組織の細胞、葉細胞、根細胞、シュート細胞、体細胞、花細胞、花粉細胞、小胞子、プロトプラスト、および前述の組み合わせ）を含むがこれらに限定されない分化組織および未分化組織が挙げられる。植物組織は、植物体内であってもよいし、植物器官、組織または細胞培養物中であってもよい。特定の実施形態において、「植物部分」は、果実、葉、根、または植物の脈管（例えば、木部）である。果実は、果肉や果皮などの組織を含む。他の実施形態では、「植物部分」は種子である。本明細書で使用される用語「種子」は、別のそのような植物に発生することができる顕花植物の生殖単位を指す。

【0210】

方法
本発明は、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異を含む、植物、植物部分、植物細胞またはそれらの集団を作製する方法を提供し、該方法は、植物、植物部分または植物細胞を本発明の細菌と接触させることを含み、任意で、該方法は、植物全体を得るために前記細胞または植物部分を再生させることをさらに含む。好ましい実施形態によれば、本方法は、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異を含む、非トランスジェニック植物、植物部分、植物細胞またはそれらの集団を提供する。いくつかの実施形態によれば、接触した植物、植物部分または植物細胞の少なくとも50％、任意で少なくとも60％、または70％、好ましくは少なくとも80％が非トランスジェニックであり、少なくとも1つの標的配列において少なくとも1つの変異を含む。

【0211】

好ましくは、本明細書に記載の細胞、植物、および植物部分は非トランスジェニックである。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される方法は、非トランスジェニックである細胞、植物または植物細胞をもたらす。植物およびその部分ならびに細胞の文脈において、「トランスジェニック」とは、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に有することを意味する。異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが次の世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定に組み込まれ得る。異種ポリヌクレオチドは単独で、または組換えDNAコンストラクトの一部としてゲノムに組み込まれ得る。非トランスジェニック植物は、そのゲノム内にそのような異種ポリヌクレオチドを含まない。対照的に、本明細書で議論されるような遺伝子編集によってなされる変化は、内因性配列に対してなされる。本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、植物または植物細胞のゲノムにネイティブであり、ゲノム内のネイティブな位置にあることを意味する。本明細書中で使用される場合、「異種」ポリヌクレオチドは、外来種由来である。いくつかの好ましい実施形態において、特に内因性配列が遺伝子編集された場合、本発明の植物は異種DNAを含まない。

【0212】

本明細書で使用される「接触」は、形質転換を包含し、それによって細菌は核酸コンストラクトを細胞に導入する。好ましい実施形態では、アグロバクテリウム細胞の懸濁液をECSと混合する。次いで、混合物をインキュベートし、次いで細菌懸濁液を除去して、培養可能なECS細胞を提供することができる。特定の実施形態では、熱ショック処理が施される（例えば、45℃で5分間）。バナナに適した方法は、例えば、Shivani and Tiwari, Scientia Horticulturae, 246:675-685）に記載されている。別の実施形態では、植物の葉への浸透が使用される。

【0213】

好ましい実施形態において、作製される植物、植物部分または植物細胞のゲノムは、いかなる組み込みT-DNA配列も含まない。いくつかの実施形態において、本方法は、標的配列（複数可）において少なくとも1つの変異を含み、そのゲノムにおいていかなる組み込みT-DNA配列も含まない、少なくとも1つの植物細胞、植物部分または植物を選択することをさらに含む。前記選択は、遺伝子型解析を含み得る。

【0214】

特定の実施形態において、標的配列における変異の少なくとも1つは、植物細胞、植物部分または植物に選択可能な形質を付与する。特定の実施形態において、少なくとも1つの標的配列における少なくとも1つの変異は：(a）植物、植物部分または植物細胞に選択可能な形質をもたらす第1の標的配列における少なくとも1つの変異；および（b）第2の遺伝子における少なくとも1つの変異を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、選択可能な形質を有する、細胞、植物部分または植物を選択することをさらに含む。このような実施形態は、細胞、植物部分または植物を選択剤で処理することを含み得る。好ましい実施形態において、選択可能な形質は除草剤耐性である。前記実施形態において、前記選択は、除草剤耐性のある細胞、植物部分または植物を選択することによるものである。そのような実施形態は、除草剤で細胞、植物部分または植物を処理することを含み得る。好ましい実施形態において、標的配列または第1の標的配列はALS遺伝子であり、任意で、変異はALS阻害剤に対する除草剤耐性を提供する。前記実施形態において、前記選択は、ALS阻害剤に対して耐性を有する細胞、植物部分または植物を選択することによるものである。

【0215】

特定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのALS阻害剤は、イミダゾリノン、ピリミジニルチオベンゾエート、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、スルホニルウレア、またはトリアゾロピリミジンである。好ましくは、ALS阻害剤はスルホニルウレアである。好ましいイミダゾリノンとしては、イマザメタベンズメチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキンおよびイマゼタピルが挙げられる。好ましいピリミジニルチオベンゾエートとしては、ビスピリバックナトリウムおよびピリチオバックナトリウムが挙げられる。好ましいスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン類としては、フルカルバゾンナトリウムおよびプロポキシカルバゾンナトリウムが挙げられる。好ましいスルホニルウレア類としては、ベンスルフロン-メチル、クロリムロン-エチル、クロルスルフロン、フォラムスルフロン、ハロスルフロン-メチル、メソスルフロン-メチル、メツスルフロン-メチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン-メチル、プロスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン-メチル、スルホスルフロン、チフェンスルフロン-メチル、トリアスルフロン、トリベヌロン-メチル、トリフロキシスルフロン-ナトリウムおよびトリフルスルフロン-メチルが挙げられる。好ましいトリアゾロピリミジンとしては、クロランスラムメチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、ペノキススラムおよびピロキススラムが挙げられる。最も好ましくは、本発明の方法で使用するALS阻害剤はクロルスルフロンである。導入されたALS変異（複数可）は、1つ以上の任意のALS阻害剤に対する耐性を提供することができ、例えば、単一の変異は複数の阻害剤に対する耐性を提供することができ、複数の変異は異なる阻害剤に対する耐性を提供することができる。

【0216】

好ましい実施形態において、本方法は、ALS阻害剤を含む胚発生培地上で胚を培養するような、胚、または胚の集団の処理を含む。本明細書で使用される「胚を培養する」、「胚をインキュベートする」、および「胚を処理する」は、胚発生細胞から胚を作製すること、および発生中の胚をインキュベートすることを包含する。このような実施形態において、胚は好ましくはALS阻害剤を含む胚発生培地上でインキュベートされる。これは、胚発生細胞が胚に発生する際に胚発生培地上で培養されることを意味する。特定の実施形態では、胚は完全に発達した胚が観察されるまで培養される。特定の実施形態において、胚はALS阻害剤を含む胚発生培地上で8～20週間、例えば8～16週、10～16週、10～14週、12～14週または13週前後培養される。特定の実施形態において、胚は、10～80μg／L、例えば10～70、15～65、15～55、20～55、20～50、20～40、20～30または約25μg／L程度の濃度のALS阻害剤を含む胚発生培地上でインキュベートされる。特定の実施形態において、胚は、10～80μg／L、例えば20～70、25～65、30～60、40～60、40～55、45～55または約50μg／Lの濃度のALS阻害剤を含む胚発生培地上でインキュベートされる。特定の実施形態では、胚は、10～80μg／L、例えば10～70、15～65、15～55、20～55、20～50、20～40、20～30もしくは約25μg／L程度、または10～80μg／L、例えば20～70、25～65、30～60、40～60、40～55、45～55もしくは約55μg／Lの濃度の濃度のALS阻害剤を含む胚発生培地上で8～20週間、例えば8～16週、10～16週、10～14週、12～14週もしくは13週前後インキュベートされる。特定の実施形態において、胚または胚形成細胞懸濁液は、形質転換後、ALS阻害剤選択の前に、1～14日、3～10日、5～10日または7日前後など、回復させる。同様の方法は、他の選択可能なマーカーや選択剤についても適切であろう。

【0217】

特定の実施形態において、本方法は、胚発生細胞懸濁液の処理を含む。特定の実施形態において、胚発生細胞懸濁液は、ALS阻害剤の存在下で、少なくとも3日間、例えば少なくとも5日間、10日間または15日間、任意で30日間未満、例えば25日間未満、20日間未満、15日間未満または10日間未満インキュベートされる。特定の実施形態において、胚発生細胞懸濁液は、少なくとも500μg／L、例えば少なくとも1、2、3、4、または5mg／Lの濃度のALS阻害剤の存在下でインキュベートされる。特定の実施形態において、胚発生細胞懸濁液は、少なくとも1、2、3、4、または5mg／Lなど、少なくとも500μg／Lの濃度のALS阻害剤の存在下で、少なくとも3日間、例えば少なくとも5、10、または15日間、任意で30日間未満、例えば25、20、15、または10日間未満インキュベートされる。特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤を含む胚発生培地中で胚を、例えばECSからの細胞から開始して培養することにより、ALS阻害剤でバナナ胚を処理することを含む。特定のそのような実施形態において、本方法は、その後、ALS阻害剤を含まない胚発生培地に胚を移すことを含む。特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤を含む胚発生培地中で細胞懸濁液、細胞集団または細胞塊から胚を培養すること、ALS阻害剤に耐性のある胚の発生を観察すること、およびそれらの胚を、発生が少ないかまたは発生しない残りの細胞から物理的に分離することを含む。特定の実施形態では、発生した胚をALS阻害剤を含まない胚発生培地に移す。同様の方法は、他の選択可能なマーカーや選択剤についても適切であろう。

【0218】

特定の実施形態において、本発明は、ALS阻害剤による処理に耐性を有する胚などの植物細胞、植物組織または植物を少なくとも1つ選択することと、それらを耐性を有さない細胞、組織または植物から物理的に分離することとを含む。特定の実施形態では、少なくとも1つの選択された細胞、組織または植物を、好ましくはALS阻害剤を含まない別のプレートまたは増殖培地に移す。

【0219】

特定の実施形態において、ALS阻害剤の存在下で胚を培養するようなALS阻害剤による細胞の処理は、内因性ALS遺伝子において編集され、標的配列においても編集され、所望の変異を含む、細胞または胚の集団を提供する。特定の実施形態では、細胞または胚の少なくとも1％、2％、3％、4％または5％が内因性アセト乳酸合成酵素遺伝子に変異を含み、標的配列に所望の変異を含む。

【0220】

特定の実施形態において、本方法は、植物または植物体の処理を含む。特定の実施形態において、本方法は、植物または植物体にALS阻害剤を散布することを含む。特定の実施形態において、散布は、Silwett L-77などのアジュバントをさらに含む。特定の実施形態において、植物または植物体は、少なくとも1mg／L、例えば少なくとも2、3、4もしくは5mg／L、または1～10mg／L、または2～7mg／Lの濃度でALS阻害剤を散布される。特定の実施形態において、植物または植物体は、約1週間に1回散布される。特定の実施形態において、植物または植物体は、4週間にわたって毎週散布される。特定の実施形態において、最初の週1回の散布は、最初の週の開始時である。特定の実施形態において、植物または植物体は4回、好ましくは週に1回散布される。特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤が添加された発根培地中で植物または植物体を生育させることを含む。特定の実施形態において、発根培地は、1mg/L未満、例えば0.5mg/L未満または0.1mg/L未満、例えば0.01～0.09mg/Lまたは0.002～0.06mg/Lまたは約0.005mg/LのALS阻害剤を含む。特定の実施形態において、植物体はALS阻害剤含有発根培地中で2～6週間、例えば3～5週間、1ヶ月前後、または4週間生育される。特定の実施形態において、処理は、植物または植物体に散布することと、ALS阻害剤を含む発根培地でそれらを生育させることとを含む。特定の実施形態において、植物または植物体は、2～6週間、例えば3～5週間、1ヶ月前後、または4週間、ALS阻害剤に曝露される。特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤の存在下、好ましくは上記に示した濃度および／または期間を用いて胚を培養することを含み、ALS阻害剤による他の処理を含まない。このような実施形態において、本方法は植物または植物体をALS阻害剤で処理することを含まず、ECSをALS阻害剤でインキュベートすることを含まない。そのような実施形態において、形質転換後のECSはALS阻害剤を含まない培地中でインキュベートされ、植物および植物体はALS阻害剤を含まない培地中で生育される。

【0221】

特定の実施形態では、形質転換される植物細胞はプロトプラストである。好ましい実施形態では、形質転換される植物細胞は胚細胞、例えば胚形成細胞懸濁液中の細胞である。

【0222】

特定の実施形態において、本方法から得られる集団中の植物細胞、植物部分または植物の少なくとも40％、任意で少なくとも55％、好ましくは少なくとも65％は、ゲノム中に組み込まれたT-DNAを含まず、第2の遺伝子に変異を含む。

【0223】

特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤を用いた処理などの選択剤による選択に続く、追加の選択工程を含む。特に、ゲノムに組み込まれた異種DNAを含んでいない胚または植物、および標的配列において少なくとも1つの所望の変異を含んでいることが確認された胚または植物を選択することが有用であり得る。上述したように、本発明の細菌および方法は、そのような植物および植物細胞を濃縮するのに有用である。

【0224】

特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤または他の選択剤を用いた選択に続いて、標的配列において少なくとも1つの所望の変異を含む少なくとも1つの細胞または植物を選択することを含む。変異は、少なくとも1つのヌクレオチド挿入；少なくとも1つのヌクレオチド欠失；少なくとも1つのヌクレオチド置換；および前述の任意の組み合わせであり得る。標的配列中の少なくとも1つの所望の変異を含む少なくとも1つの細胞または植物の選択は、変異したゲノム配列の存在を検出することを含み得る。

【0225】

特定の実施形態において、本方法は、ALS阻害剤または他の選択剤を用いた選択に続いて、異種DNA、特に変異を導入することができる薬剤をコードする組み込み核酸コンストラクトを含まない、少なくとも1つの細胞または植物を選択することを含む。このような少なくとも1つの細胞または植物の選択は、細胞または植物のゲノム中に核酸コンストラクト配列が存在しないことを確認することを含む。

【0226】

これは、DNAシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、およびPCR、RT-PCR、RNase保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット分析などのハイブリダイゼーションアッセイなどがあるが、これらに限定されない、改変または編集イベントを検出することができる当該技術分野で公知の任意の技術を用いて達成することができる。一塩基多型(SNP)の検出には、PCR塩基のT7エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二本鎖、およびサンガーシーケンシングなど、様々な方法を用いることができる。高分解能融解分析は、編集イベントの存在を検証するもう一つの方法である。さらにもう一つの方法はヘテロ二重鎖移動度アッセイである。変異は、リハイブリダイズしたPCR断片をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で直接分析することによっても検出できる。この方法はポリアクリルアミドゲル中でのヘテロ二重鎖DNAとホモ二重鎖DNAの遊走の違いを利用する。編集イベントの存在を検証する他の方法は、Zischewski (2017), Biotechnology Advances 1(1):95-104に詳しく述べられている。

【0227】

好ましい実施形態では、T-DNA配列はさらに、mCherryのような蛍光マーカーなどの選択可能なマーカーをコードする。このようなマーカーは、例えば、T-DNA配列がゲノムに組み込まれず、編集剤を一過性に発現しただけの非トランスジェニック細胞は、実施例で示されるように、選択可能なマーカーを発現しないので、その選択を助けることができる。

【0228】

適切なマーカーとしては、抗生物質選択マーカーが挙げられる。使用できる抗生物質選択マーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）である。本教示に従って使用できるその他のマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（accC3）耐性、ブレオマイシンおよびフレオマイシン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましいマーカーとしては：トリアジン耐性を与える変異psbA、特にG264SおよびI219V；ならびにEPSP合成酵素阻害剤に対する耐性を与える変異エノールピルビルシキメート-3-ホスフェート合成酵素（EPSPS）、特にトリプトファン102変異、アラニン103変異およびプロリン106変異が挙げられる。好ましい実施形態において、選択可能マーカーは、実施例において特に有効であることが示されている蛍光タンパク質、例えばmCherry、mTurquoise 2、例えばsfGFPまたはpH-tdGFPなどのGFP、Gamillus、mNeonGreen、mEYPF、mCitrine、Citrine、またはTagRFPである。好ましくは、選択可能なマーカーはmCherryである。したがって、本発明の方法は、このようなマーカーを検出し、マーカーを発現しない細胞または植物を選択する工程を組み込むことができる。

【0229】

一般
開示された製品および方法の異なる用途は、当該技術分野における特定のニーズに合わせて調整され得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。

【0230】

さらに、本明細書および添付の実施形態で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、内容が明確に指示しない限り、複数の参照語を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、「ポリペプチド（複数）」などを含む。

【0231】

特に禁止されていない限り、本明細書に開示された方法の工程は、任意の適切な順序で実行することができ、工程が列挙されている順序は限定的であるとみなされるべきではない。

【0232】

本明細書において特定の配列に言及する場合、これらは、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変に起因する軽微な配列差異を含むものとして、その相補配列に実質的に対応する配列も包含し得る。そのような差異の頻度は、50ヌクレオチドに1個未満、あるいは、100ヌクレオチドに1個未満、あるいは、200ヌクレオチドに1個未満、あるいは、500ヌクレオチドに1個未満、あるいは、1000ヌクレオチドに1個未満、あるいは、5000ヌクレオチドに1個未満、あるいは、10000ヌクレオチドに1個未満であることを条件とする。

【0233】

本明細書で使用される場合、「同定」は、DNAシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、およびPCR、RT-PCR、RNase保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロット、およびドットブロット分析などのハイブリダイゼーションアッセイなどがあるが、これらに限定されない1つ以上のサイレンシング分子の存在を検出することができる当該分野で公知の任意の技術を含み得る。

【0234】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、例示的な方法および／または材料が記載される。 材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

【0235】

用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（having）」、およびそれらの共役語は、「～を含むが、～に限定されない」を意味する。「からなる（consisting of）」という用語は、「～を含み、～に限定される」という意味である。「本質的にからなる（consisting essentially of）」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含んでもよいが、追加の成分、工程および／または部分が請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。

【0236】

本明細書で引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0237】

実施例1：アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105におけるvirD5変異体の作製
この実施例は、変異virD5アグロバクテリウム株の作製を示している。
アグロバクテリウムVirD5^- 株の、植物形質転換、および非トランスジェニックバナナ植物の再生に及ぼす影響を調べるため、アグロバクテリウムEHA105のvirD5の変異体を作製することになった。幸いなことに、virD5の転写単位は、virD5が最終的にコードされる遺伝子である、オペロン（virD1, D2, D3, D4, D5）によってコードされており、下流の遺伝子の発現に影響を与えることなく、この遺伝子を破壊することが可能であった。

【0238】

A. tumefaciens EHA105のVirD5タンパク質の機能を効果的にノックアウトするために、スペクチノマイシン耐性カセットでvirD5遺伝子を破壊する戦略を採用した。変異原性プラスミドコンストラクトを作製するために、EHA105のvirD5遺伝子配列1000bpを、プライマーF1_D5_FとF1_D5_R（5'断片）、およびF3_D5_FとF3_D5_R（3'断片）を用いて500bpずつ2つに分けて増幅した。これらを、細菌耐性のためのスペクチノマイシン耐性カセット（プライマーF2_D5_FとF2_D5_Fで増幅）に隣接させ、Clontech社のin-fusionを用いてレシピエントベクターpJQ200SKに組み込んだ。

【0239】

【表1】

【0240】

【表2】

【0241】

得られたプラスミド（pVIRD5specKO）はアグロバクテリウム中で複製できないため、スペクチノマイシン耐性を選択するには、プラスミドが組換えによってアグロバクテリウムゲノムに組み込まれる必要がある。プラスミドをエレクトロポレーションによってWT EHA105細胞に導入し、組換えイベントをスペクチノマイシン（100μg/ml）を用いて選択した。単一コロニーを摘出し、抗生物質を含まないLB培地で増殖させ、二次組換えが起こるようにした。これらの細胞を希釈し、20%(w/v)のスクロースと100μg/mlのスペクチノマイシンを添加した最小培地（AB最小培地＋1.5%w/v寒天）にプレーティングした。得られたいくつかのコロニーを、新しいスクロース／スペクチノマイシンプレート上の単一コロニーにストリークした。それぞれの新しい単一コロニーをPCR（プライマー569+571および569+570）でスクリーニングし、いずれのプライマーセットでもWTバンドがもはや存在しない株を同定した。この株は、プラスミド上のvirD5遺伝子座のすべてのコピーにスペクチノマイシン耐性カセットが完全に挿入されていることを示している。結果得られたこの株はEHA105virD5と命名された（図2）。

【0242】

実施例2：EHA105virD5株は、バナナECS細胞の形質転換後のmcherryの一過性発現において、WT EHA105と比較して障害を受けない。
この実施例は、EHA105virD5株が、「一過性発現」と呼ばれる、アグロバクテリウムを介した形質転換後の最初の数日間におけるT-DNA由来の遺伝子の発現において障害を受けないことを示している。形質転換後7日目の発現を評価するために、mCherry蛍光マーカーを用いた。バナナ品種 ECS グランドナイン GN236を生殖質としてこれらの実験に使用した。

【0243】

アグロバクテリウム・ツメファシエンス調製
バイナリープラスミドpMol_0628およびpMol_0630を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL1、EHA105およびEHA105virD5を、リファンピシン50mg/L、カナマイシン100mg/Lおよびカルベニシリン50mg/Lを添加したLB固体培地中でグリセロールからストリークし、28℃で2日間インキュベートした。2日目に、同じ抗生物質を添加したMG/L培地（Sarkarら、 Methods Mol Biol. 2013; 966: 187-204に記載されている）に細菌を播種し、28℃で一晩インキュベートした。翌日、培養物を4000rpmで10分間スピンダウンして細胞をペレット化した後、ABIM（アグロバクテリウム誘導培地；Sarkarら、 Methods Mol Biol. 2013; 966: 187-204に記載）に再懸濁してビルレンスを誘導し、暗所、室温で一晩インキュベートした。細菌のOD_600nm をNanoDrop2000で測定し、アセトシリンゴン（100 μM）を添加したCS液体培地で0.6に正規化した。

【0244】

バナナECSのアグロ形質転換
バナナECSの3日齢の培養物をペレット化し、CS培地に再懸濁した。0.5 mL の懸濁液（ECS の沈降細胞約 0.1 mL）を形質転換の数に応じて小さなエッペンドルフチューブに分注した。45℃で5分間、その後室温でさらに5分間インキュベートした。これにアグロバクテリウム懸濁液 1 mL を各バナナ ECS サンプルに加えた。混合物をよく混合し、1000rpmで5分間スピンダウンした後、室温で25分間インキュベートした。バナナ細胞をプールし、細菌懸濁液を除去した。この細胞を、アセトシリンゴン100 μMを添加したCSプレートに接種し、室温で3日間培養して形質転換を促進させるのに使用した。

【0245】

蛍光顕微鏡分析
形質転換3日後のバナナECSにmCherry一過性発現の存在を、蛍光顕微鏡を用いて確認した（図3）。すべての画像の撮影には等しいゲインを用い、2種類の倍率（8倍と50倍）を記録した。

【0246】

mCherryの発現はEHA105 WTとEHA105virD5の両方で観察され、形質転換細胞の個々のクラスターはコントロール（AGL1）に匹敵する明るい発現を両系統で示した。このことから、EHA105virD5は形質転換直後のT-DNAからの要素の一過性発現において、WT EHA105と比較して損なわれていないと結論づけられた。

【0247】

実施例3：EHA105virD5株によるキャベンディッシュバナナの形質転換は、WT EHA105と比較して非トランスジェニック編集イベントを濃縮する
この実施例は、EHA105virD5株が、非トランスジェニック（ゲノムが、組み込まれた外来性DNAを含まない）遺伝子編集イベントを高い割合で含む再生植物の集団を濃縮できることを示している。

【0248】

胚および植物におけるバナナのALSタンパク質（アセト乳酸合成酵素）のプロリンからセリンへの変異（Pro187Ser）は、スルホニルウレア化合物クロルスルフロンに耐性である。Zongら、Nat Biotechnol.2017, 35(5):438-440）に記載されたシチジン塩基エディターAPOBECは、バナナゲノムにおけるこれらの変化を実行するために使用することができ、T-DNAベースの送達システムを用いてバナナ細胞に送達することができる。重要なことは、T-DNAにコードされた塩基エディターは、T-DNAを組み込む前でも後でもALS遺伝子座を編集できることである。通常、WTアグロバクテリウム株を用いてこのシステムを使用した場合、10％の非トランスジェニックバナナ、ALS編集、植物頻度が観察される。本発明者らは、T-DNAが存在すると植物核にVirD5タンパク質が存在しない場合、T-DNAの迅速な分解が達成され、その結果、組み込みイベントが少なくなり、各形質転換から生じるトランスジェニック植物が少なくなると判断した。しかし、重要なことに、非トランスジェニック、すなわち一過性の編集率には影響がないと予想されました。これにより、EHA105virD5株を形質転換に用いた場合、WT EHA105株と比較して、非トランスジェニック、ALS編集バナナ植物の割合が増加することになる。

【0249】

キャベンディッシュバナナ品種ECS グランドナイン GN236 に実施例 2 に記載した形質転換を行った。胚および植物は、いずれも選択なしで、胚発生中は、培地に25μg/Lのクロルスルフロンを添加した、プラスミドpMol_0628（APOBEC塩基エディタを発現するT-DNA、ノンターゲッティングガイドコントロールおよびmCherryを含む）およびpMol_0630（APOBEC塩基エディタを発現するT-DNA、バナナALS1遺伝子におけるPro187Ser変異を実行するASL1ガイドRNAおよびmCherryを含む）で形質転換したバナナECS材料から生産した。

【0250】

バナナ胚の発生と発芽
3日後、バナナECSを前の培地から回収し、セフォタキシム300mg/L添加CS培地に移した。1週間後、バナナ細胞をcefo（セフォタキシム）300mg/Lを添加したEDMプレート（コントロール）、またはcefo 300mg/LおよびCSF 25μg/Lを添加したEDMプレート、またはcefo 300mg/LおよびCSF 50μg/Lを添加したEDMプレートに移した。培地は胚が発生するまで2週間ごとにリフレッシュした。その後、バナナ胚をCSFを含まない成熟培地（EMM - embryo maturation medium）に1ヶ月間移し、さらにCSFを含まない発芽培地（GM4）にシュートが発生するまで移した。

【0251】

植物発生
胚発生細胞懸濁液（ECS）を、nCas9機構をコードし、sgRNAを発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウム株で形質転換した。アグロバクテリウム形質転換はKannaら、Molecular Breeding October 2004、Volume 14, Issue 3, pp 239-252に従って行った。胚発生細胞はアグロバクテリウムと 1～3 日間共培養し、その後 CSF を含む胚発生培地（EDM）、および CSF を含まない成熟培地に移植する（関連培地は、例えば Strosse H., R. Domergue, B. Panis, J.V. Escalant and F. Cote, 2003, Banana and plantain 15 embryogenic cell suspensions (A. Vezina and C. Picq, eds). INIBAP Technical Guidelines 8, The International Network for the Improvement of Banana and Plantain, Montpellier, Franceに記載されている）。成熟胚は発芽培地で発芽させ（Strosse H., R. Domergue, B. Panis, J.V. Escalant and F. Cote.2003.Banana and plantain embryogenic cell suspensions (A. Vezina and C. Picq, eds).INIBAP Technical Guidelines 8.The International 20 Network for the Improvement of Banana and Plantain, Montpellier, France）、若いシュートを高さ約 1cm になるまでシュート成熟培地に移す。植物体を発生させるためにシュートを発根培地に移す。

【0252】

図4から図6に示したmcherry蛍光は、アグロバクテリウムのEHA105株とAGL1 WT株の両方と比較して、EHA105virD5の蛍光性（推定トランスジェニック）と非蛍光性（推定非トランスジェニック）の比率が著しく低下していることを示している。

【0253】

3種のアグロバクテリウム株による形質転換後に発生したCSF耐性胚の数を調べた（表3）。

【0254】

【表3】

【0255】

CSF選択を行わなかった場合、3つのアグロバクテリウム株（AGL1、EHA105、および耐性プラスミドと非耐性プラスミド（pMOL_0628とpMOL_0630）のすべてから、一貫した数の再生胚が観察された。CSF選択を適用した場合、コントロールコンストラクト（ALS sgRNAなし-pMOL_0628）は、予想通り、CSF耐性、ALS塩基編集胚の再生をサポートしなかった。アグロバクテリウムのWT株（AGL1およびEHA105）はいずれも、～200個のCSF耐性塩基編集胚の再生をサポートしたが、EHA105virD5で形質転換したバナナ細胞では、CSF耐性塩基編集胚の収量が低下した。これは、EHA105virD5株を用いた形質転換細胞の集団におけるトランスジェニック編集の低下と一致する。EHA105virD5株由来の胚は、ほとんどがALS編集された非トランスジェニック胚であるという仮説が立てられた。
これらのデータをサポートするために、この実験から得られた植物をALS遺伝子編集について、およびT-DNA遺伝子の存在について、遺伝子型に再現した。

【0256】

植物の遺伝子型解析
組織培養の葉組織から植物組織をサンプリングした。簡単に言うと、葉の一片を5mm四方サンプリングし、Qiagen collection microtubes (Cat. No. 19560)に入れた。LGC sbeadex plant kitを用い、Oktapure自動プラットフォームでDNAを抽出した。

【0257】

バナナ植物ゲノムDNA中の導入遺伝子の存在を検出するために、T-DNAに結合するプライマーセットを用いたqPCRが用いられた。プライマーペアG0418、G0419およびG0422、G0423は、nCas9- PBE融合体を検出するために使用され、プライマーペアG0327、G0328は、mCherryを検出するために使用された。ACTINはすべてのサンプルからプライマーG0390とG0391を用いて増幅し、このアンプリコンの増幅Ct値をコントロール（ゲノムコピー数の正規化）として用いた。

【0258】

【表4】

【0259】

反応はすべて5μlのテンプレートDNAでセットアップした。2つのWT胚DNAコントロールと水コントロールを用いた。 Applied PowerUp SYBR Green master mixを使用し、メーカーの推奨に従ってRoche LightCycler96でPCRを行った。

【0260】

【表5】

【0261】

生データをRoche Lightcycler 96ソフトウェアで分析し、各サンプルのCt値を収集し、MS excelにエクスポートした。T-DNAアンプリコンのCt値は、ACTINのCtレベルを用いて正規化した。正規化後、データをプロットした（図7）。

【0262】

ALS1遺伝子座の編集は、シチジン塩基エディターによって誘導された変異の存在を検出するために、アンプリコン・サンガーシーケンシングを用いて評価された。

【0263】

【表6】

【0264】

【表7】

【0265】

アンプリコンはサンガーシーケンシングのため Genewiz に送られた。Geneiousを用いて、各サンプルにおけるsgRNAターゲット内のC-T編集の存在を評価した。T-DNAおよびALS1編集の存在に関するデータを図8にまとめた。EHA105virD5形質転換株は、EHA105株（11%）またはAGL1株（14%）のWT株で形質転換した株と比較して、ALS1の非遺伝子組換え編集の比率が著しく異なる（84%）。

【0266】

したがって、EHA105virD5株は、ALS塩基編集を選択手段として用いた場合、非トランスジェニック遺伝子編集を高い割合で含む再生植物の集団を濃縮することができる。

【0267】

実施例4：アグロバクテリウムのEHA105virD5株は、非トランスジェニック、ALSおよび形質遺伝子編集バナナ植物の濃縮を促進する
この実施例は、EHA105virD5株が、ALSおよび形質遺伝子座における非トランスジェニック遺伝子編集イベントを高い割合で含む再生植物の集団を濃縮できることを示している。

【0268】

バナナECS形質転換、および植物の再生は、これまでの実施例で詳述したように行った。表8は本実施例で使用したプラスミドコンストラクトの詳細である。プラスミドpMOL0628は、非耐性変異コントロール（ALS編集はないが、シチジン塩基エディターを含む）である。プラスミドpMOL0630およびpMOL0632は、それぞれALS1およびALS2のCSF耐性エディットを作製するためのシチジン塩基エディターおよびsgRNAをコードする。これらはCSF耐性とALS塩基編集が期待通りに機能することを示すためのコントロールコンストラクトである。この実施例の実験コンストラクトはpMOL0926（pMOL0630のALS1塩基編集sgRNAとPPO2 sgRNAでMaPPO2のナンセンス、早発停止コドン変異を生成）およびpMOL0931（pMOL0632のALS2塩基編集sgRNAとACO1 sgRNAでMaACO1のナンセンス、早発停止コドン変異を生成）である。バナナ系統GN236 ECSを、アグロバクテリウムEHA105株WTおよびEHA105virD5を用いて形質転換し、胚発生中のみ25ng/mL CSF選択を用いて植物を再生した（EDM培地）。

【0269】

【表8】

【0270】

これらの形質転換から再生した最初の44個の植物は、実施例3で詳述したのと同じ方法を用いて遺伝子型を決定した。そこでは、組織サンプルを単一の葉からサンプリングし、LGC Oktapure sbeadex技術を用いてDNAを抽出し、先に詳述したようにALS1およびALS2についてサンガーシーケンシングからアンプリコンを生成し、サンガーシーケンシングに供した。トランスジェニック植物は、実施例3で詳述したように、gDNA T-DNA qPCRを用いて同定した。PPO2およびACO1について追加のアンプリコンPCRシーケンシングを行った。結果を図９に示す。アグロバクテリウムのEHA105virD5株を用いた場合、88％の非トランスジェニック、共編集（ALS1/2および形質遺伝子；ACO1またはPPO2のいずれか）植物頻度が観察された。ALS単独では、84％の非トランスジェニック、ALS編集植物体頻度が観察された。これはロバストで再現性があると思われる。

【0271】

【表9】

【0272】

【表10】

【0273】

【表11】

【0274】

実施例5：EHA105virD5株を用いたコーヒーALSの編集
EHA105virD5アグロバクテリウムは、通常のEHA105株に加えて、以下に詳述するT-DNAプラスミドを用いてコーヒー胚形成cali材料を形質転換するために使用される。

【0275】

実施例6：キャベンディッシュバナナのEHA105virD5株による形質転換は、胚における非トランスジェニックHDR編集イベントを可能にする
この実施例は、EHA105virD5株が、非トランスジェニック（ゲノムが、組み込まれた外来性DNAを含まない）HDR編集胚の生産を促進する一方で、非編集胚の全体数を低下させることを示している。ドナーリリースHDR戦略が用いられた。

【0276】

胚および植物におけるバナナALS2タンパク質（アセト乳酸合成酵素2）のプロリンからセリンへの変異（Pro181Ser）は、スルホニルウレア化合物クロルスルフロンに耐性である。これらの変異は、T-DNA塩基の送達システムを用いてバナナ細胞に送達されたドナー分子を用いて導入することができる。ドナー分子は1,088bpのサイズで、Pro181Serの変化とPro181Ser部位から71bp以内の11のサイレント変異を除けばALS2の配列と相同性を有する。T-DNA内のドナーモジュールの両側にはCRISPR-Cas9部位があり、T-DNAからのドナーの「放出」を促進する。

【0277】

キャベンディッシュバナナ品種 ECS グランドナイン GN218 に実施例 2 に記載の形質転換を行った。胚は、4つのプラスミドで形質転換したバナナECS材料から生産した：pMOL_0628（APOBEC塩基エディターを発現するT-DNA、ノンターゲッティングガイドコントロールおよびmCherryを含む）；pMOL_0630（APOBEC塩基エディターを発現するT-DNA、バナナALS1遺伝子におけるPro197Ser変異を実行するALS1ガイドRNAおよびmCherryを含む）；pMOL_1935（mCherryを発現するT-DNA、Cas9(D10A)ニッカーゼ、ALS2 P181Sドナー、ALS2を標的とする2xsgRNAを含む）；pMOL_1936（mCherryを発現するT-DNA、Cas9(D10A)ニッカーゼ、sgRNA部位に隣接したALS2 P181Sドナー、ALS2を標的とする2xsgRNAおよびドナー隣接部位を含む）。すべて選択なしで、胚発生中は培地に50μg/Lのクロルスルフロンを添加して試験した。

【0278】

バナナ胚の発生とサンプリング
3日後、バナナECSを前の培地から回収し、セフォタキシム 300mg/L添加CS培地に移した。3週間後、バナナ細胞をcefo（セフォタキシム）300mg/Lを添加したEDMプレート（コントロール）、またはcefo 300mg/LおよびCSF 50μg/Lを添加したEDMプレートに移した。培地は8週間にわたり2週間ごとにリフレッシュされ、最後の2週間はcefo 300mg/LとCSF 25μg/Lを添加したEDMプレートに移された。その後、バナナ胚を数え、サンプリングし、ゲノムDNAを抽出した。

【0279】

胚の遺伝子型解析
組織培養から胚をサンプリングし、Qiagen collection microtubes (Cat. No. 19560)に入れた。LGC sbeadex plant kitを用い、Oktapure自動プラットフォームでDNAを抽出した。

【0280】

CSF選択では、31個の胚がEHA105アグロバクテリウム形質転換から回収され、16個の胚がEHA105VirD5アグロバクテリウム形質転換から回収された。いずれも、ドナーリリース戦略を用いた。

【0281】

ALS2遺伝子座における編集は、ALS2周辺のゲノム領域にアニーリングするプライマーを用いてHDRドナーの組み込みの存在を検出するため、アンプリコン・サンガーシーケンシングを用いて評価した。

【0282】

【表12】

【0283】

【表13】

【0284】

アンプリコンはサンガーシーケンシングのためにGenewizに送られた。Geneiousを用いて、各サンプルのALS2標的領域内のHDR編集の存在を評価した。31個のEHA105胚のいずれにも編集の証拠は見られなかったが、図10に示すように、16個のEHA105VirD5胚のうち1個にHDRの証拠（10/12個の特定の塩基が編集されている）が見られた。EHA105VirD5がトランスジェニック胚の回収を低下させるという以前の証拠のため、胚がトランスジェニックであるかどうかを決定するためにqPCR法が用いられた。

【0285】

バナナ植物ゲノムDNA中の導入遺伝子の存在を検出するために、T-DNAに結合するプライマーセットを用いたqPCRが用いられた。プライマーペアG0327、G0328はmCherryの検出に、G0534、G0535、G1158、G1159はnCas9(D10A)の検出に、G0989、G0990はプロモーターTaU6の検出に、G1001、G1002はnptiiの検出に使用した。各サンプルからプライマーG0390とG0391を用いてACTINを増幅し、このアンプリコンの増幅Ct値をコントロール（ゲノムコピー数の正規化）として用いた。

【0286】

【表14】

【0287】

反応はすべて1μlのテンプレートDNAでセットアップした。WT胚DNAコントロールと水コントロールを用いた。Applied PowerUp SYBR Green master mixを使用し、メーカーの推奨に従ってRoche LightCycler96でPCRを行った。

【0288】

【表15】

【0289】

生データをRoche Lightcycler 96ソフトウェアで分析し、各サンプルのCt値を収集し、MS excelにエクスポートした。T-DNAアンプリコンのCt値は、ACTINのCtレベルを用いて正規化した。正規化後、データをプロットした（図11）。T-DNAの一部を増幅するプライマーは、ACTINゲノムコントロールよりも有意に低い値を返した。この結果は、EHA105VirD5を用いた非トランスジェニック、部分的HDR陽性胚を示している。

【0290】

さらなるシーケンス
配列番号: 1
ACO1 - マレーヤマバショウ
>Ma01_g11540.1
ggctatatat aagtagcaac gtggagtgac gagtgggaat agacaaagga aatggcgtgc 60
tccttcccgg tcctcgactt ggagaagctc cgtggagagg agagagagca gtccatggac 120
ctccttcgtg acgcttgcga gaaatggggc ttctttgagg tgctctcatt cttttacgtg 180
aacaagttga tgcccacgag catttgaagc taattatcat ggctttccat ttgcttgctg 240
atgtagctgc tcaaccatgg gatctcgcat gagctgatgg acgaggtgga gaggcggacc 300
aaagcgcact acgagcaatg caggaagcaa aagttcaaac agttggcgtg caaggctctc 360
aagagcggac ccgggacgga tgtcaccgac atggactggg agagcacctt cttcctgcgc 420
catctccccg tctccaacat gtccgacttc ccagacatgg acgaggagta ccggtaccgc 480
ttcgatttcc ttcgttacag cgcacccccc accaccatcg actgtagtct gccccgacta 540
accttcgcct tcaggaaggc gatgacggaa ttcgcgacgg ggttagagaa gctggcggag 600
cgtcttctcg atctgctctg cgagaacctc ggcctggagg agggttacct caagaacgcc 660
ttctacggat ccaaaggtcc gaactttggc accaaggtga gcaactaccc gccatgccct 720
cgcccggagc tgatccacgg cctgcgagcc cacaccgacg ccggcggcat catcttgctc 780
ttccaagacg accgcgtcag cggcctccag cttctcaagg atggccagtg gatcgacgtg 840
ccgcccatgc accactccat cgtggtcaac ctcggagatc agatagaggt cctctctctc 900
tctctctctc tctctctttc tctctctgcg ggacaaaaga tcaaacaaca tgagggcgtt 960
catgcaggtg atcacgaacg gcaagtacaa gagcgtgctg caccgggtgg tggctcggag 1020
cgacggcaac aggatgtcga tcgcctcctt ctacaacccg agcggcgacg ccgtcatcta 1080
ccccgcgccc tccctggtcc agaaggaagc ggaggcgtac ccgaggtttg tgttcgagga 1140
ctatatgaag ctctacgtca cgcaaaagtt tcaagcgaag cagcccaggt ttgaagcaat 1200
gaaggccacg gtaacagtca atggccaacc tacgcctaca ccttaggaca ccacgacgtc 1260
tcacgtggag atgccaccat ctattagaat gtggcatcca attgtggaaa taataagcga 1320
agcactatga acgtggcttt ttttagtctc gagggttatg tcgtcgatcc aattttccac 1380
ttct 1384

配列番号: 2
ACO - マレーヤマバショウ
>Ma07_g19730.1
acactccaga tagaaagcac aagtgcaatc agggaagaaa gagcgtgtca tggattcctt 60
tccggttatc gacatggaga agcttttggg aagggagaga ggagaagcca tggagatcct 120
ccgagatgct tgcgagaaat ggggcttctt tgaggtgctg aagcatacat aactggtttt 180
gcttctttga actatatata tattgctaaa atgtactatt tgcacatgca atctgtgtgt 240
agattttaaa ccatggcatc tcacatgacc tcatggatga agtggagaag gtgaacaaag 300
accagtacaa caaatgcagg gagcaaaagt tcaacgagtt cgccaacaaa gcactggaaa 360
acgccgactc agaaatcgac cacctcgact gggaaagcac ctttttcctg cgtcatctcc 420
ccgtctccaa catttctgag atccccgatc ttgatgacca gtataggttg cacgatctga 480
tcatgatgtc atcttctggc ctggtctttt caccttgctc atcgtttcgt ttcttgggac 540
gatgactgcg tgcaggaagg cgatgaagga atttgcggca gagatggaga agctggcaga 600
gcggctgctc gacttgctgg gtgagaacct ggggctggag aaggggtacc tgaagaaagc 660
cttctctaat ggatccaagg ggccaacctt tgggaccaag gtcagcagct acccgccatg 720
cccgcgcccg gacctggtga agggcctgag ggcgcacacc gacgccggag gcatcatctt 780
gctcttccag gacgaccagg tcagcggcct gcagttcctc aaggacggcg agtggctgga 840
cgtgcccccc atgcgccacg ccatcgtcgt caacctcggc gaccagctcg aggtttgggt 900
cctctttgct ctcgtttccg ctgcccgtcg tctgtgatgt tgaatgcaac gaggtctgca 960
ggtaatcacc aatggcaagt acaagagcgt ggtgcaccgc gtggtggctc agactgatgg 1020
caacaggatg tcgattgcct ccttctacaa ccccgggagc gacgctgtga tcttcccggc 1080
ccccgctctt gtggagaagg aagcggagga gaagaaggag gtctatccga agttcgtgtt 1140
cgaggattac atgaagctct acgtcgggca taagttccag gccaaggagc caagattcga 1200
agccatgaaa gccatggaag cagttgccac ccacccaatc gctacctctt aagtgacagc 1260
ccccaagtta gtgcatgtcg ctgtacttcg cgttaggaag ctgtcgtcta tgtctatgta 1320
acccgatgga tgtgtggtat gtacgtgtgt gagccttttc taatgaagca aatcatataa 1380
tatatatata tatatatata ta 1402

配列番号: 3
ACS - マレーヤマバショウ
>Ma04_g31490.1
atggggattc ccggtgacga gatcctctcc agggtcgcta cgggcgatgg ccacggtgag 60
aacacctcgt acttcgatgg ctggaaggcc tacgataatg atcctttcca cccgattcat 120
aatcccaatg gtgtcatcca aatgggactc gcagaaaacc aggtaatgct tgtttctggc 180
tctgtccatt actttctcct cctcctgctg ctgctgctgc taatgggttt cggtctgcct 240
ttcctcagct ctgcttggac ttgatgcgag attggatcag gaagaatcca caggcttcta 300
tatgcaccaa ggagggcgtt tcagagttcg aagccatcgc taacttccag gactaccatg 360
gcctgccgga cttccgtaag gtaatcaccg tctgcagcca taatgcagct cctcgatccc 420
ttactcatgc gtgccatgaa cgatgagggc acagttggat cgatatgcgt tgctatagcc 480
gaaaggtaat gacgcgatca tctatggaaa tgcacaggcc attgccaagt tcatggagaa 540
agcgagagga ggacgagcca ggttcgaccc ggagcgcata gtgatgagcg gtggagccac 600
cggagctcaa gaaacgatcg cattttgtct ggccaatccc ggggacgcct tcctcattcc 660
gacgccatac tacccagcgt acgtatgcct gttgagtcaa cattctgatc tctcaagtaa 720
ttgcgtcgtc aacttccccg ttcgaacaaa tgttccagcc gaccaatcag tcgtgcaatg 780
acccaaacga cagtcaaact tttatctgcc tgagcattga ccaaaaccac accattcaac 840
gtaattgtgg tcatgcaatc cgacactaaa gaacgacatt tggttcttct caggttcgat 900
cgagacttca ggtggagaac tggagttcag ctcctcccta ttcgctgcca cagtcacgac 960
aacttcaaga tcaccgaagc cgagcttgct gctgcctacc ggaaggcgcg cgactctaag 1020
atcagggtta aaggaatact aataaccaac ccgtcgaatc ctctgggcac aaccatggac 1080
agggagacgc taagaaccct agtaagattc gcgaacgagg aaaggatcca cctagtctgc 1140
gacgagatct tctccggcac agtcttcgac gggccggaat atgtcagtgt ggcggagata 1200
ttgcaagagg atccgtcgac ctgcgacgga gacctaatcc acatcgtcta cagcctgtcg 1260
aaggacctcg gcgtccccgg attccgtgtc ggcatcatat actcgttcaa cgacgcggtg 1320
gtcagctgcg ctcggaggat gtccagcttc ggactggtct cgacgcagac tcaacgcctg 1380
cttgcttcca tgctgggaga cgacgacttc accaccgacc tcttggcgga gagcaggagg 1440
agattaatgc acaggcacag gacgtttact gccggcctcg aaggcgtcgg cattcgttgc 1500
ttacagagca acgccggact attctgctgg atgagcttga agcctctgct gaaagacgcc 1560
acggcggagg gcgaggtcga gctgtggcgg gtgatagtga acgaggtgaa gctcaacatc 1620
tctccggggt cctcgttcca ctgcaccgag ccggggtggt tcagggcgtg ctttgccaac 1680
atggacgagg agaccatgga gacggccctg cggcggatca ggacgttcgt gcgccgggcg 1740
aacgacgcag ctactgccgc caagaccaag aagaggtggg acacatcgct tcgcctgagc 1800
ttgccacgaa ggttcgagga gatgaccgtc ctgacaccgc gtctgatgtc tcctcgctct 1860
ccgctcgttc aggccgccac ctga 1884

配列番号: 4
ACS - マレーヤマバショウ
>Ma04_g35640.1
gcagcagctg cttctccttc ttctctgctc gcttcagcct tttccggtac gtacctgaga 60
taacgggtca catgaggatc tacggcgagg agcacccaaa tcagcagatc ctctctcgga 120
tcgcgaccaa cgacggccat ggcgagaact cctcctactt cgatgggtgg aaggcctacg 180
agaaggatcc tttccacctc accgacaacc ccacgggggt catccaaatg ggactcgcag 240
aaaaccaggt tagagttcct tcatggtgat gattaatcgc acatgccttc cgtcaattgc 300
cactccctgc ggttgctaat ctaatctgta tgtgggtttt gggtctttct ttcctcagct 360
ttccctcgac ttgatccgag actggatgaa gaagaacccg caggcttcga tctgcaccga 420
agaaggggtc tcagagttca aagcaattgc caactttcag gactatcatg gcctcccagc 480
cttccgaaag gtaatgattt caacccaaaa cgcagcgctg cagctgcttg tcctcactgt 540
ccaagtagct acatacgtcc aatatgataa agctgggact gacagccact tacggcccga 600
gccctgcctg ctcaccctgg ataagggata agctaatgat ggtgtgattt gctgacacgc 660
gcaggccatc gcccagttca tggagaaggt gagaggggga cgagccagat ttgacccaga 720
ccgcatcgtg atgagcggtg gagccaccgg tgctcaggaa accatcgcct tttgcctggc 780
tgatcctggc gaggccttct tgattccaac gccatattat ccggggtaag tgttcaggtg 840
tactaatcta ccgagttctt tatccggcag aggatctaat ggcatctgca tggtttccag 900
attcgatcga gacttcaggt ggaggacagg agttcagctc ctccccattc actgccacag 960
ttccaacaag ttcaagatca cccaagccgc actggagact gcttacagga aggctcgaaa 1020
ctcacacatt agagtcaaag gaatactggt gaccaaccca tcgaaccctc tgggcacaac 1080
catggacaga gagacgctga gaaccctagt cagcttcgtc aacgagaaaa ggatgcactt 1140
ggtgtgcgac gagatcttct ccggaaccgt cttcgacaag ccgagttacg tgagcgtctc 1200
cgaggtgatc gaagacgatc cctactgcga cagggatctg attcacatcg cctacagcct 1260
ctccaaggac ctgggcgtcc ctggcttccg cgtcggcgtc atatactcct acaacgacgc 1320
cgtggtcagc tgcgcgagga agatgtcgag ctttggactg gtctcgtcgc agacgcagca 1380
cctgctcgct tccatgttgg gagacgagga gttcaccacg agtttcttag cgacgagccg 1440
gacgaggttg tgcgggcggc gcagggtctt tacggacggc ctcaagcgag tcgggattca 1500
ttgcttggac ggcaacgcgg ggctgttctg ctggatggac ttgaggccgt tgctgaagga 1560
agcgacggtg gaggcggagc tccggctgtg gcgggtgatc atcaacgacg tgaagctcaa 1620
catctcgccg gggtcgtcct tccactgctc ggagccgggg tggttcaggg tatgcttcgc 1680
caacatggac gacacggcca tgaagatagc gctgaggagg atcgagagtt tcgtgtaccg 1740
ggagaacgac gccgctgtgc aggcgaagaa caagaggagg tgggacgaag cgctgcggct 1800
gagcttgcct cgtcggaggt tcgaggatcc gaccatcatg acaccacatc tgatgtctcc 1860
ccactcgcct ctcgttcaag ccgccacctg aaacatcgac agcggcgtgt ctgatgtcaa 1920
cgaaggttaa ttaccgtctg atatgttgca catttctttg ttctttggat tatttatttt 1980
tttttttttg ggaaaaatgg gttgaatgtt cccactaagt tatattagat tgttgttcgg 2040
tctcattcat gttataggaa acgaggatag aattgcttgc ctctctcttt cttttatata 2100
tggaaatatg ttacaattgg cctaagctta tttgatgaca ttaatttcac aagacaaagc 2160
cttctaatta atgtttcgga ccaaatgcag gagctcacta catacatttg ttacacttca 2220
tatgttcaaa attagtccag tttaccggtg actcagtttt aaaggttata aatggttctg 2280
attcaagtac ttatctttgg ttctgttaat tggttcaaac cgaatcgatt ttaatttaaa 2340
caatattaat ttaattaaat tttttaattg gtttaaatcg attaatcaaa tcagttgatc 2400
agggaaaata ttattgatgt cttactcaac tcgatatggt ctatactcac gtgcgtagga 2460
atgtccgaga tgtctctgag ataaaaacat cgtgctttcg tgat 2504

配列番号: 5
ACS - マレーヤマバショウ
>Ma09_g19150.1
tagctcgtgt tctcccttct ccccaggctt cccagtactc gcctaagatc gtaacgtcgg 60
caatggggct ccacgttgat gaacactcaa attacaatgt cctctccagc atcgcaacga 120
gcgatggcca cggggagaac tcctcatact tcgatggctg gaaggcctac gataatgatc 180
ctttccaccc catcgacaat cctcaggggg tcatccaaat gggacttgca gaaaaccagg 240
taaatgctgt ttcacaacta gttcggtaat tatggtagtt ttttcatggc ctatggccaa 300
aaatatgcct tccgtattct cctactactt ggaatgctaa cgggtgctgc gttttcctta 360
tctcagctct gcctggactt gatgcagcag tggatcaagc agaacccaca ggcttccatt 420
tgcaccggcg agggcgtttc cgagtttaag gacgtcgcga acttccaaga ctaccacggc 480
ctgccagact tccgaaaggt aataaccatc acagtgcagc tctttagtta gtccttatca 540
tgtcataaac tgtggaccct cgagaataga ttacatcact cagataaaag atgtgcgcat 600
tatgactcac gtacatgagt ccagaacttg tatctacttg taacgacgtc aagaggattc 660
tggaaatggt gcctgctggg ctagggacaa cctcactaga ttgctttgct gtttctgaaa 720
ggctaatgat gtgatttgtg gaaacacgca ggcgattgct aggttcatgg ggaaagcgag 780
aggaggagga gctacgttcg acccggagcg cattgtaatg agcggcggag ccaccggagc 840
tcaggaaacc atcgcatttt gtctagcgaa tcctggggag gccttcctga ttccaacgcc 900
atattatcca gggtacgtag acctatccta catcaagatt ttatgtttta tgtatatttc 960
acagtgacac taatctgttt taaagaaaac tgtttgagga tgagccgatc gaactacgga 1020
ggcaacatta atataatcca gcttactggt ataaccaaaa aattagtagt caatatttgc 1080
catcgcacga ctgtgacgtc gacaagacag tctcagtata ttatatttct taattaataa 1140
cgctacacca aaaccataac cgacctaccg gccgcttgag gtttctgcac tctccggcct 1200
cattatggat ctatcggttg atatatatat atatatatat gacagcgatt tcacatttcc 1260
tgcagcttcg atcgagactt tcggtggaga actggagttc aactcctccc tattcagtgc 1320
cacagcttcg acaacttcaa gatcaccgaa cccgcgctag ttactgccta tcaaagggca 1380
caaacagcta acatcagggt taaaggaatc ctggtaacca acccttcaaa ccctctgggt 1440
acaaccttgg acagagagac actgagaacc ttagtgagct tcgccaacga gaaacggatc 1500
cacttggtgt gcgacgagat attctcgggc accgtcttcg acaagcctac ctacgtcagc 1560
gtctccgaga tcgtggaaga ggaaccatac tacgacaggg acctaattca catcgtctac 1620
agtctgtcca aggatctcgg cgtccctgga ttccgcgtgg gtgtcattta ctcgtacaat 1680
gatgcagtgg tcagctgtgc tcggaagatg tccagctttg gactggtctc gactcaaacg 1740
cagcacctac tggcttccat gctgggagat gatgacttca caaccaaatt tttggcggag 1800
agcaggagga gattgtcgcg caggcacaaa tattttactg ctggcctcca cagagttgat 1860
atcaaatgtt tggagagcaa tgcggggcta ttctgctgga tgaacttgac gcatctgcta 1920
aacgaagcca cggtggaggc ggaactcaag ctgtggcgag tgataattaa ggaggtgaag 1980
ctcaacattt caccggggtc ttcgttccac tgctctgagc cggggtggtt cagggtgtgc 2040
ttcgccaaca tggacgataa caccatggaa accgcattga agaggatcag gaagtttgtg 2100
tcccccggga atcacactgc ggctgcgcaa gccaagaaga agaacaagag gtgggacgcg 2160
gcgctccgcc taagtttgcc tcgtcggttc gaggaactga gcatcatgac acctcgcctc 2220
atgtctcctc actcgcccct tgttcaggcc gccaactgat ggtgatggat gagcgtgggc 2280
gatattaacc gacg

配列番号: 6
PPO2 - マレーヤマバショウ
>Ma07_g03540
atggccggcc ttccttattc agctcctcac cctgccacca tctccgcttc ctccaactcc 60
tttgcatgcc ccttccgcag caaggggctt gtcttcccct accctaccag aagagcactc 120
catgttcgtc ccaacatcgc atgcaaggca ggcgaggagc acgagatcgc tgctaaggtc 180
gaccgacgcg acgtactcgt gggcctcggt gggctctgcg gagccgccgc tggccttggc 240
gggttcgata aagccgccct cgctaacccc attcaggccc ctgatctctc caagtgcggc 300
cctgccgacc tccccaccgg cgtgccagtc gtcaactgct gcccgcccta ccgtcccggt 360
gcgaagattg tggatttcaa gcggccgtcg ccgtcctccc cactccgcgt ccgccccgcc 420
gcccacttgg ttgaccccga gtacctggcc aagtacaaga aggccatcga gctcatgaag 480
gcgctcccgg ccgatgaccc tcgcaacttc atgcagcagg ccgacgtcca ctgcgcctac 540
tgcgacggcg cttacgacca gatcggcttc cccaaccttg agatccaagt ccacaacagc 600
tggctcttct tcccctggca ccgcttgtac ctctacttca acgagaggat cctcggcaag 660
ctcatcggcg acgacacctt ctcgctccct ttctggaact gggacgcacc cggcggaatg 720
atgctgcctt cgatctacgc cgatccttcg tcacccctct acgacaaact tcgcgacgcc 780
aagcaccaac ctcctgtcct tgtcgacctc gactacaatg gaaccgaccc aaccttcccc 840
gacgcccagc aaatcgatca caacctcaag atcatgtacc gccaagtctt ctccaacggc 900
aagacgccgt tgctgttctt aggctcagct taccgtgccg gtgaacagcc taaccctggc 960
gcgggctccg tcgagaacat gccgcacaac aacgtgcact tgtggaccgg cgaccgcacc 1020
cagcccaact tcgagaacat gggcaccttc tacgccgcgg cgcgcgaccc catcttcttc 1080
gcccaccacg ccaacatcga ccgcatgtgg tacctgtgga agaagctcag caggaagcac 1140
caggacttca atgactcgga ctggctcaaa gcttccttcc ttttctacga cgagaacgcc 1200
gacttagttc gggtcacggt caaggactgc ttggagaccg attggctgcg ctacacgtac 1260
caagacgtga agatcccatg ggtgaacgcc cgaccgactc ccaagctcgc caaggcgagg 1320
aaagccgcca gcagttcgct gaaagccacc gcggaggtgc agttccctgt gacgctggaa 1380
tccccggtca aagcgacggt gaagaggccc aaggtgggga ggagcggcaa ggagaaggaa 1440
gatgaggagg agatactcat agtggagggg atcgagttcg accgcgacta cttcatcaag 1500
ttcgacgtct tcgtgaacgc gacggagggc gacggcatca cggccggggc cagcgagttc 1560
gccggcagct tcgtgaacgt cccgcacaag cacaagcacc gcaaggatga gaataagctg 1620
aagacgaggc tgtgtcttgg aatcaccgac ctgctcgagg acatcggcgc ggaggacgac 1680
gacagcgtgc tcgtcaccat cgtgccgaag gcgggcaaag gaaaggtgtc cgtcggcggt 1740
cttcggattg acttttccaa g 1761

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】