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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-15
(54)【発明の名称】包埋剤を包埋試料から除去する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20250107BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20250107BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20250107BHJP
C12Q 1/683 20180101ALN20250107BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALN20250107BHJP
C12Q 1/6872 20180101ALN20250107BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/683 Z
C12Q1/6813 Z
C12Q1/6872 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536114
(86)(22)【出願日】2022-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-08-02
(86)【国際出願番号】 US2022081719
(87)【国際公開番号】W WO2023114948
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/290,537
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
２．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517192663
【氏名又は名称】ファウンデーション・メディシン・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】マルブフ， クリスティーン マリー
(72)【発明者】
【氏名】ムナフォ， ダニエラ ベアトリス
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QS12
4B063QS13
4B063QS14
4B063QS20
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
本開示は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡなどの分析物を検出し、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡなどの分析物を抽出し、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善し、パラフィン包埋試料などの包埋試料から抽出されるＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料などの分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン中で相転移を誘導し、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、生成することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、
ｄ）前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変の検出が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変の検出が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変の検出が、前記パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変が、ａ）コピー数改変、
ｂ）点変異、
ｃ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、
ｄ）遺伝子内欠失、
ｅ）遺伝子内挿入、
ｆ）遺伝子全体の欠失、
ｇ）逆位、
ｈ）染色体間転座、
ｉ）縦列重複、
ｊ）遺伝子融合、
ｋ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又は
ｌ）遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡ中の前記改変が、コピー数改変である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン中で相転移を誘導し、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、生成することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項8】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの前記抽出が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの前記抽出が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン中で相転移を誘導し、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、生成することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、
ｄ）前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法。
【請求項11】
前記配列決定ライブラリの前記調製が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記配列決定ライブラリの前記調製が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン中で相転移を誘導し、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、生成することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、
ｄ）前記抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法。
【請求項14】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の前記パラフィンのレベルが、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の前記パラフィンのレベルが、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて低減する、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン中で相転移を誘導し、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、生成することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項17】
前記パラフィン包埋試料からの前記パラフィンの分離が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記パラフィン包埋試料からの前記パラフィンの分離が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された前記パラフィンの分離により、前記フィルタの詰まりが、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、前記改善されたパラフィンの分離により、前記フィルタの詰まりが、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて少なくなる、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
ステップｂ）が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記相転移が溶融である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ステップｂ）が、前記パラフィン包埋試料を加熱し、遠心分離させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
ステップｂ）が、前記パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記パラフィン包埋試料を、１６００～２０００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は７５℃に加熱する、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項34】
前記パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記パラフィン包埋試料を、約５０℃～約８０℃に加熱する、請求項２４又は２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、除去することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、
ｄ）前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法。
【請求項39】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変の検出が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変の検出が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変の検出が、前記パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の前記改変が、ａ）コピー数改変、
ｂ）点変異、
ｃ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、
ｄ）遺伝子内欠失、
ｅ）遺伝子内挿入、
ｆ）遺伝子全体の欠失、
ｇ）逆位、
ｈ）染色体間転座、
ｉ）縦列重複、
ｊ）遺伝子融合、
ｋ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又は
ｌ）遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡ中の前記改変が、コピー数改変である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、除去することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項45】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの前記抽出が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの前記抽出が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、除去することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、
ｄ）前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法。
【請求項48】
前記配列決定ライブラリの前記調製が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記配列決定ライブラリの前記調製が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、除去することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、
ｄ）前記抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法。
【請求項51】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の前記パラフィンのレベルが、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の前記パラフィンのレベルが、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて低減する、請求項５０に記載の方法。
【請求項53】
パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、
ｂ）パラフィンを前記パラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、前記パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記パラフィンを前記試料から分離させることにより、前記パラフィンを除去する、除去することと、
ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項54】
前記パラフィン包埋試料からの前記パラフィンの分離が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記パラフィン包埋試料からの前記パラフィンの分離が、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて改善される、請求項５３に記載の方法。
【請求項56】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された前記パラフィンの分離により、前記フィルタの詰まりが、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、前記改善されたパラフィンの分離により、前記フィルタの詰まりが、前記パラフィンを前記パラフィン包埋試料から切り離すことにより前記パラフィンを除去する方法と比べて少なくなる、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項59】
ステップｂ）が、前記パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、請求項３７～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記不混和性溶媒が鉱油である、請求項３７～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記パラフィン包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記パラフィン包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油とパラフィン包埋試料との比で接触させる、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項63】
ステップｂ）が、前記パラフィン包埋試料を、鉱油中、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートすることを含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記鉱油が、前記パラフィン包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記鉱油が、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、前記パラフィン包埋試料に接触する、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
ステップｂ）が、前記試料を不混和性溶媒と接触させ、前記パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む、請求項３７～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項69】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記試料からの前記パラフィンの前記分離が自動である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
ステップｂ）が自動である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記方法が自動である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
２つ以上のパラフィン包埋試料を並行して処理する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
１２、２４、４８、又は９６個のパラフィン包埋試料を並行して処理する、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
液体取扱ロボットを使用して行う、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
前記液体取扱ロボットが、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｔｅｃａｎ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの液体取扱ロボットであり、任意選択で、前記液体取扱ロボットが、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ、ＢｉｏＴｅｋ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、又はＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘである、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記液体取扱ロボットが、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲである、請求項７５又は７６に記載の方法。
【請求項78】
ステップｃ）が、ＲＮＡ及びＤＮＡを前記脱パラフィンした試料から抽出することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
ステップａ）が、ｉ）パラフィン包埋組織中の目的の腫瘍細胞を含む標的領域を特定することと、
ｉｉ）前記パラフィン包埋試料を前記パラフィン包埋組織から抽出することと、
ｉｉｉ）前記パラフィン包埋組織中の前記パラフィン包埋試料の場所を特定することと、
ｉｖ）前記パラフィン包埋試料の前記場所が前記目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合う場合、ＲＮＡ及び／若しくはＤＮＡを前記試料から抽出するか、又はステップｂに進むことと、を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記パラフィン包埋試料の前記場所が前記目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合わない場合、ステップｉｉ）及びｉｉｉ）を繰り返す、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
ステップｉｉ）が、針を使用して前記パラフィン包埋試料を抽出することを含む、請求項７９又は８０に記載の方法。
【請求項82】
前記針で前記パラフィン包埋組織を通して穿刺することにより、前記パラフィン包埋試料を抽出する、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記針が使い捨て針である、請求項８１又は８２に記載の方法。
【請求項84】
前記針が、１３ゲージ針、１４ゲージ針、１５ゲージ針、１６ゲージ針、１７ゲージ針、１８ゲージ針、１９ゲージ針、２０ゲージ針、又は２１ゲージ針である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記パラフィン包埋組織から抽出した前記パラフィン包埋試料が、直径約０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、又は２．３ｍｍである、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
ステップｉｉ）が、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）又はレーザーブレードを使用して前記パラフィン包埋試料を抽出することを含む、請求項７９又は８０に記載の方法。
【請求項87】
ステップｉｉｉ）が、前記パラフィン包埋組織の切片のスライドを調製することを含む、請求項７９～８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
前記パラフィン包埋組織の前記切片を染色する、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記パラフィン包埋組織の前記切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色する、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項90】
ステップｉｉｉ）を目視検査により行う、請求項７９～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
ステップｉｉｉ）をコンピュータシステムにより行う、請求項７９～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項92】
ステップｉｉｉ）を、画像分析システムを使用して行う、請求項７９～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
前記パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記パラフィン包埋試料が、生検、任意選択で腫瘍生検に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
前記パラフィン包埋試料が固定パラフィン包埋試料である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項96】
前記固定パラフィン包埋試料が、ホルマリン固定試料、エタノール固定試料、及びメタノール固定試料からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
前記パラフィン包埋試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項98】
前記パラフィン包埋試料が、凍結保存組織から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項99】
前記パラフィン包埋試料が、新鮮凍結組織から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項100】
前記新鮮凍結組織が、最適切断温度（ＯＣＴ）の化合物中で凍結する、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
前記ＤＮＡを抽出する前に、前記ＲＮＡを抽出する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項102】
前記パラフィン包埋試料をステップｂ）の前に消化させることを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
プロテイナーゼを使用して、前記パラフィン包埋試料を消化させる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して、前記パラフィン包埋試料を消化させる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記パラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、又は約６２℃でインキュベートする、請求項１０３～１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項107】
前記パラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間インキュベートする、請求項１０３～１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項108】
前記パラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする、請求項１０３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項109】
前記パラフィン包埋試料を部分的に消化させる又は完全に消化させる、請求項１０２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項110】
前記消化させた試料をステップｂ）の後に脱架橋することを更に含む、請求項１０２～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項111】
脱架橋することが、前記消化させた試料を８０～９０℃に加熱することを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項112】
前記消化させた試料を、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間加熱する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
ステップｃ）が、ＲＮＡを含む試料溶解物を、前記消化させたパラフィン包埋試料から収集し、前記ＲＮＡを、前記ＲＮＡを含む試料溶解物から精製することを含む、請求項１０２～１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項114】
前記消化させたパラフィン包埋試料を完全に消化させることを更に含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項115】
前記完全な消化を、プロテイナーゼを使用して行う、請求項１１４に記載の方法。
【請求項116】
前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項117】
約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して、前記消化させたパラフィン包埋試料を消化させる、請求項１１６，に記載の方法。
【請求項118】
前記消化させたパラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする、請求項１１４～１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項119】
前記消化させたパラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする、請求項１１４～１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項120】
前記消化させたパラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする、請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項121】
ＤＮＡを含む試料溶解物を、前記完全に消化させたパラフィン包埋試料から収集することを更に含む、請求項１１４～１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項122】
前記ＤＮＡを含む試料溶解物から前記ＤＮＡを精製することを更に含む、請求項１１４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項123】
前記ＲＮＡを抽出する前に、前記ＤＮＡを抽出する、請求項１～１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項124】
前記パラフィン包埋試料をステップｂ）の後に完全に消化させることを更に含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項125】
前記完全な消化を、プロテイナーゼを使用して行う、請求項１２４に記載の方法。
【請求項126】
前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項127】
約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して、前記パラフィン包埋試料を消化させる、請求項１２６に記載の方法。
【請求項128】
前記パラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項129】
前記パラフィン包埋試料を、前記プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする、請求項１２５～１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項130】
前記ＤＮＡを前記完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む、請求項１２４～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項131】
前記ＲＮＡを前記完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項132】
前記パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量を測定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項133】
前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量が、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇ、約６０ｎｇ、約７０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０μｇ、又は約５０ｍｇである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項134】
前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項135】
前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡを次世代配列決定により分析することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項136】
前記方法が、ｅ）任意選択で、１つ以上のアダプターを前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡにライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、
ｄ）任意選択で、核酸を前記ライゲーションした核酸から増幅することと、
ｆ）任意選択で、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を捕捉することと、
ｇ）配列決定装置によって、前記複数の核酸を配列決定して、前記１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、
ｈ）前記複数の配列リードを分析することと、
ｉ）前記分析に基づいて、目的の遺伝子中の１つ以上の変異を検出することと、を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項137】
前記１つ以上の目的の遺伝子に対応する前記複数の核酸を、ベイト分子とのハイブリダイゼーションにより、前記増幅した核酸から捕捉する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項138】
前記１つ以上の目的の遺伝子に対応する前記複数の核酸を、前記増幅した核酸から富化し、任意選択で、前記１つ以上の目的の遺伝子に対応する前記複数の核酸を、ビオチン／ストレプトアビジンタグ付けにより、前記増幅した核酸から富化する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項139】
１３８ステップｅ）の前に、前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを断片化し、任意選択で、前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、超音波処理により断片化する、請求項１３６～１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項140】
１３９前記断片化した前記パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを末端修復する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項141】
１４０前記末端修復し断片化した、前記試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、ｄＡテール状又はｄＴテール状である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項142】
前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＤＮＡを分析して、ｉ）点変異、
ｉｉ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、
ｉｉｉ）遺伝子内欠失、
ｉｖ）遺伝子内挿入、
ｖ）遺伝子全体の欠失、
ｖｉ）逆位、
ｖｉｉ）染色体間転座、
ｖｉｉｉ）縦列重複、
ｉｘ）遺伝子融合、
ｘ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又は
ｘｉ）遺伝子増幅又は重複、からなる群から選択される体細胞変異を検出することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項143】
前記体細胞変異が、遺伝子中にあり、前記遺伝子が、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、又はＴＰ５３である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
前記体細胞変異が、遺伝子中にあり、前記遺伝子が、ＡＢＬ２、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ６、ＬＴＫ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＫ、ＴＮＫＳ２、ＴＯＰ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、又はＷＴ１である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項145】
前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡを分析して、ｉ）遺伝子融合、
ｉｉ）エクソンスキッピング事象、
ｉｉｉ）スプライスバリアント、及び／又は
ｉｖ）改変された遺伝子発現、からなる群から選択される改変を検出することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項146】
前記パラフィン包埋試料中の１つ以上の目的の遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）の検出を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項147】
前記パラフィン包埋試料中のＳＴ７／ＲＡＹ１、ＡＲＨ１／ＮＯＥＹ２、ＴＳＬＣ１、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＤＣＣ、ＴＰ５３、ＡＴＭ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ＮＡＴ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＯＧＧ１、ＣＤＨ１、ＩＧＦ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／Ｐ５７、ＭＥＮ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、Ｈ１９、ＫＲＡＳ、ＢＡＰ１、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＵＦＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＰＰ６Ｃ、ＬＡＴＳ１、ＣＡＳＰ８、ＰＴＰＮ１４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＢＸＷ７、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮ－α、嗅覚受容体遺伝子、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＤＵＴＴ１、ＦＨＩＴ、ＡＰＣ、Ｐ１６、ＦＣＭＤ、ＴＳＣ２、ｍｉＲ－３４、ｃ－ＭＰＬ、ＲＵＮＸ３、ＤＩＲＡＳ３、ＮＲＡＳ、ｍｉＲ－９、ＦＡＭ５０Ｂ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＲ、ＦＬＴ３、ＺＤＢＦ２、ＧＰＲ１、ｃ－ＫＩＴ、ＮＡＰ１Ｌ５、ＧＲＢ１０、ＥＧＦＲ、ＰＥＧ１０、ＢＲＡＦ、ＭＥＳＴ、ＪＡＫ２、ＤＡＰＫ１、ＬＩＴ１、ＷＴ１、ＮＦ－１、ＰＲ、ｃ－ＣＢＬ、ＤＬＫ１、ＡＫＴ１、ＳＮＵＲＦ、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）、ＺＮＦ５８７、ＳＯＣＳ１、ＴＩＭＰ２、ＲＵＮＸ１、ＡＲ、ＣＥＢＰＡ、Ｃ１９ＭＣ、ＥＭＰ３、ＺＮＦ３３１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＥＧ３、ＮＮＡＴ、ＧＮＡＳ、及び／又はＧＡＴＡ５のＬＯＨを検出することを更に含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項148】
前記パラフィン包埋試料中のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のＬＯＨを検出することを更に含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項149】
１つ以上のアダプターを前記パラフィン包埋試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡのうちの１つ以上にライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、前記ライゲーションした核酸を増幅することと、
前記増幅した核酸から前記ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の核酸を、ベイト分子を使用して捕捉することと、
前記捕捉した核酸を配列決定して、前記ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、
１つ以上のプロセッサによって、前記複数の配列リードのうちの１つ以上に関連する１つ以上の値をモデルに適合させることと、
前記モデルに基づいて、前記ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び前記ＨＬＡ遺伝子のＨＬＡアレルについての相対的な結合傾向を検出することと、を更に含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項150】
前記ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び前記ＨＬＡ遺伝子のＨＬＡアレルについての相対的な結合傾向が、ａ）ＨＬＡアレルについて観察されたアレル頻度を取得することであって、観察されたアレル頻度が、前記ＨＬＡ遺伝子に対応する前記複数の配列リード間で検出された前記ＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸の頻度に対応する、取得することと、
ｂ）前記ＨＬＡアレルの前記ベイト分子に対する相対的な結合傾向を取得することであって、前記ＨＬＡアレルの前記相対的な結合傾向は、１つ以上の他のＨＬＡアレルの一部をコードする核酸の存在下、前記ＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸が前記ベイト分子に結合する傾向に対応する、取得することと、
ｃ）目的関数を適用して、前記ＨＬＡアレルの前記相対的な結合傾向と前記観察されたアレル頻度との間の差を測定することと、
ｄ）最適化モデルを適用して、前記目的関数を最小化することと、
ｅ）前記最適化モデル及び前記観察されたアレル頻度に基づいて、前記ＨＬＡアレルの調整されたアレル頻度を決定することと、
ｆ）前記ＨＬＡアレルの前記調整されたアレル頻度が所定の閾値よりも小さい場合、ＬＯＨが発生したと決定することと、によって検出される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項151】
前記パラフィン包埋試料が、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、前記ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）以外の有効量の治療を前記個体に投与することを更に含む、請求項１４９又は１５０に記載の方法。
【請求項152】
前記ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）以外の治療を推奨することを更に含む、請求項１４９又は１５０に記載の方法。
【請求項153】
前記パラフィン包埋試料における高い腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）を検出すること、又はその知識を得ることを更に含む、請求項１４９又は１５０に記載の方法。
【請求項154】
前記パラフィン包埋試料が、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、前記ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び高いＴＭＢの検出に少なくとも部分的に基づいて、有効量の免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を前記個体に投与することを更に含む、請求項１５３に記載の方法。
【請求項155】
前記パラフィン包埋試料が、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、前記ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び高いＴＭＢの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む治療を前記個体に推奨することを更に含む、請求項１５３に記載の方法。
【請求項156】
前記ＨＬＡ遺伝子が、ヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子である、請求項１４８～１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項157】
前記ＴＭＢが、配列決定したゲノムの１メガベース当たりの非ドライバー体細胞性コード変異の数に基づいて決定される、請求項１５３～１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項158】
前記パラフィン包埋試料中のホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）遺伝子における機能喪失型変異を検出することを更に含む、請求項１～１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項159】
ＰＴＥＮ遺伝子中の前記機能喪失型変異が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、若しくは置換、ゲノム再編成、プロモーター中の改変、遺伝子融合、又はコピー数改変のうちの１つ以上を含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項160】
ＰＴＥＮ遺伝子中の前記機能喪失型変異を、前記パラフィン包埋試料中で、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定のうちの１つ以上により検出する、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
【請求項161】
前記パラフィン包埋試料中の腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）のレベルを測定することを更に含む、請求項１～１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項162】
少なくとも約１０変異／メガベース（Ｍｂ）又は少なくとも約２０ｍｕｔ／ＭｂのＴＭＢを検出する、請求項１６１に記載の方法。
【請求項163】
ＴＭＢを、前記パラフィン包埋試料由来の前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定により測定する、請求項１６１又は１６２に記載の方法。
【請求項164】
ＴＭＢを、約０．８０Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項165】
ＴＭＢを、約０．８３Ｍｂ～約１．１４Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項166】
ＴＭＢを、約１．１Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項167】
ＴＭＢを、最大約１．１Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに基づいて測定する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項168】
前記パラフィン包埋試料中のホモ接合性単一エクソン喪失を検出することを更に含む、請求項１～１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項169】
前記ホモ接合性単一エクソン喪失を、前記パラフィン包埋試料由来の前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定によって検出する、請求項１６８に記載の方法。
【請求項170】
分析物を検出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を前記包埋剤中で誘導し、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、
ｄ）前記分析物を分析して、前記分析物を検出することと、を含む、方法。
【請求項171】
前記分析物の前記検出が、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項172】
前記分析物の前記検出が、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて改善される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項173】
前記分析物の前記検出が、前記包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項174】
分析物を抽出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を前記包埋剤中で誘導し、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項175】
前記分析物の前記抽出が、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項176】
前記分析物の前記抽出が、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて改善される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項177】
包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を前記包埋剤中で誘導し、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、
ｄ）抽出した前記分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法。
【請求項178】
前記分析物試料中の包埋剤のレベルが、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、請求項１７７に記載の方法。
【請求項179】
前記分析物試料中の包埋剤のレベルが、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて低減する、請求項１７７に記載の方法。
【請求項180】
包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を前記包埋剤中で誘導し、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項181】
前記包埋試料からの前記包埋剤の分離が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項182】
前記包埋試料からの前記包埋剤の分離が、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて改善される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項183】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された前記包埋剤の分離により、前記フィルタの詰まりが、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、請求項１８０～１８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項184】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、前記改善された包埋剤の分離により、前記フィルタの詰まりが、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる、請求項１８０～１８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項185】
前記フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、請求項１８３又は１８４に記載の方法。
【請求項186】
ステップｂ）が、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、請求項１７０～１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項187】
前記相転移が、溶融、凍結、気化、凝結、昇華、及び沈着からなる群から選択される、請求項１７０～１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項188】
前記相転移が溶融である、請求項１７０～１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項189】
ステップｂ）が、前記包埋試料の加熱、冷却、圧力増加、又は圧力減少を含む、請求項１７０～１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項190】
ステップｂ）が、前記包埋試料を加熱することを含む、請求項１７０～１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項191】
前記包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱することを含む、請求項１９０に記載の方法。
【請求項192】
前記包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、請求項１９０又は１９１に記載の方法。
【請求項193】
ステップｂ）が、前記包埋試料を遠心分離させ、濾過して、前記包埋を前記試料から分離させることを含む、請求項１７０～１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項194】
前記包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項１９３に記載の方法。
【請求項195】
前記パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、請求項１９３又は１９４に記載の方法。
【請求項196】
前記包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、請求項１９３～１９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項197】
ステップｂ）が、前記包埋試料を加熱し、遠心分離させ、濾過して、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む、請求項１７０～１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項198】
ステップｂ）が、前記包埋試料を加熱し、遠心分離させて、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む、請求項１７０～１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項199】
分析物を検出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、前記包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、
ｄ）前記分析物を分析して、前記分析物を検出することと、を含む、方法。
【請求項200】
前記分析物の前記検出が、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項１９９に記載の方法。
【請求項201】
前記分析物の前記検出が、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて改善される、請求項１９９に記載の方法。
【請求項202】
前記分析物の前記検出が、前記包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される、請求項１９９に記載の方法。
【請求項203】
分析物を抽出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、前記包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項204】
前記分析物の前記抽出が、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項205】
前記分析物の前記抽出が、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて改善される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項206】
包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、前記包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、
ｄ）抽出した前記分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法。
【請求項207】
前記分析物試料中の包埋剤のレベルが、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項208】
前記分析物試料中の包埋剤のレベルが、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて低減する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項209】
包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、前記試料が包埋剤に包埋される、提供することと、
ｂ）前記包埋剤を前記包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、前記包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、前記包埋剤を前記試料から分離させることにより、前記包埋剤を除去する、生成することと、
ｃ）前記分析物を前記脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【請求項210】
前記包埋試料からの前記包埋剤の分離が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、請求項２０９に記載の方法。
【請求項211】
前記包埋試料からの前記包埋剤の分離が、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて改善される、請求項２０９に記載の方法。
【請求項212】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された前記包埋剤の分離により、前記フィルタの詰まりが、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、請求項２０９～２１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項213】
前記方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、前記改善された包埋剤の分離により、前記フィルタの詰まりが、前記包埋剤を前記包埋試料から切り離すことにより前記包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる、請求項２０９～２１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項214】
前記フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、請求項２１２又は２１３に記載の方法。
【請求項215】
ステップｂ）が、前記包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、前記混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、請求項１９９～２１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項216】
前記不混和性溶媒の密度が、水より軽く、前記包埋剤が液体形態である場合には前記包埋剤より重い、請求項１９９～２１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項217】
前記不混和性溶媒の前記密度が、流動パラフィンより重い、請求項２１６に記載の方法。
【請求項218】
前記不混和性溶媒が植物油である、請求項１９９～２１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項219】
前記不混和性溶媒が鉱油である、請求項１９９～２１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項220】
前記包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる、請求項２１９に記載の方法。
【請求項221】
前記包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油と包埋試料との比で接触させる、請求項２１９又は２２０に記載の方法。
【請求項222】
前記鉱油が、前記包埋試料に、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃で接触する、請求項２１９～２２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項223】
前記鉱油が、前記包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する、請求項２１９～２２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項224】
前記鉱油が、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、前記包埋試料に接触する、請求項２１９～２２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項225】
ステップｂ）が、前記試料を不混和性溶媒と接触させ、前記包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む、請求項１９９～２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項226】
前記包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項２２５に記載の方法。
【請求項227】
前記包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、請求項２２５又は２２６に記載の方法。
【請求項228】
前記包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、請求項２２５～２２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項229】
前記分析物が、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子、脂質、多糖、エクソソーム、ミトコンドリア、及び核からなる群から選択される、請求項１７０～２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項230】
前記包埋剤が、パラフィン、樹脂、セロイジン、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）、ゼラチン、エステルワックス、ワックス、ポリエチレングリコール、及びニトロセルロースからなる群から選択される、請求項１７０～２２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項231】
前記包埋剤がパラフィンである、請求項２３０に記載の方法。
【請求項232】
ＲＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｂ）前記試料を５０℃～７５℃で１～４０分間インキュベートすることと、
ｃ）前記試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、前記ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、
ｄ）前記ＲＮＡを含む前記溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【請求項233】
ステップｃ）の後、ステップｄ）の前に、前記試料を室温に冷却することを更に含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項234】
前記試料を室温に冷却した後に、前記試料を遠心分離させて、前記溶解物を濾過することを更に含む、請求項２３３に記載の方法。
【請求項235】
前記試料を前記プロテアーゼとともにインキュベートすることが、５０℃～６０℃でのインキュベーションを含む、請求項２３２～２３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項236】
前記試料を前記プロテアーゼとともにインキュベートすることが、１～２０分間のインキュベーションを含む、請求項２３２～２３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項237】
前記試料を高速で遠心分離させることが、前記試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、請求項２３２～２３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項238】
前記ＲＮＡを前記溶解物から単離する、請求項２３２～２３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項239】
前記ＲＮＡを抽出する方法が、ハイスループット法に使用される、請求項２３２～２３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項240】
前記ＲＮＡを分析することを更に含む、請求項２３２～２３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項241】
前記プロテアーゼとの前記インキュベーションを、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う、請求項２３２～２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項242】
５０℃～８０℃での前記インキュベーションを、振盪せずに行う、請求項２３２～２４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項243】
ステップｃ）の後に、前記試料を２５０ＲＣＦ～７５０ＲＣＦで遠心分離させることを更に含む、請求項２３２～２４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項244】
ｃＤＮＡを前記ＲＮＡから調製することを更に含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項245】
ＤＮＡを試料から抽出する方法であって、ａ）前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｂ）前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、
ｃ）前記試料を高速で遠心分離させて、前記ＤＮＡを含む溶解物を生成することと、
ｄ）前記ＤＮＡを含む前記溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【請求項246】
前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う、請求項２４５に記載の方法。
【請求項247】
ステップｂ）の直後に、前記試料を２～２０分間１０００ＲＣＦ～４０００ＲＣＦで遠心分離させる、請求項２４５又は２４６に記載の方法。
【請求項248】
２～２０分間１０００ＲＣＦ～４０００ＲＣＦでの遠心分離の後に、前記試料を少なくとも４０分間冷蔵する、請求項２４７に記載の方法。
【請求項249】
前記試料を冷蔵した後に、ステップｃ）を実行する、請求項２４８に記載の方法。
【請求項250】
前記試料を高速で遠心分離させることが、前記試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、請求項２４５～２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項251】
ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｂ）前記試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、
ｃ）前記試料を高速で遠心分離させて、前記パラフィンを、前記ＲＮＡを含む第１の溶解物から分離させることと、
ｄ）前記ＲＮＡを含む前記第１の溶解物を吸引することと、
ｅ）前記ＲＮＡを前記第１の溶解物から単離することと、
ｆ）ステップｃ）からの前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｇ）ステップｆ）からの前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、
ｈ）前記試料を高速で遠心分離させることと、
ｉ）前記ＤＮＡを含む第２の溶解物を吸引することと、
ｊ）前記ＤＮＡを前記第２の溶解物から単離することと、を含む、方法。
【請求項252】
前記試料を高速で遠心分離させることが、前記試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、請求項２５１に記載の方法。
【請求項253】
前記プロテアーゼとのインキュベーションを、ステップａ及び／又はステップｆにおいて、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う、請求項２５１又は２５２に記載の方法。
【請求項254】
前記試料を前記プロテアーゼとともにインキュベートすることが、５０℃～６０℃でのインキュベーションを含む、請求項２５１～２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項255】
前記試料を前記プロテアーゼとともにインキュベートすることが、１～２０分間のインキュベーションを含む、請求項２５１～２５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項256】
前記試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることを、振盪せずに行う、請求項２５１～２５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項257】
ＲＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を前記試料に加えることと、
ｂ）前記試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、
ｃ）前記試料を室温に冷却することと、
ｄ）前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｆ）前記試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、
ｇ）前記試料を高速で遠心分離させて、前記パラフィン及び前記鉱油を、前記ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、
ｈ）前記ＲＮＡを含む前記溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【請求項258】
５０℃～８０℃で１～２０分間の前記インキュベーションを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う、請求項２５７に記載の方法。
【請求項259】
前記試料を高速で遠心分離させることが、前記試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、請求項２５７又は２５８に記載の方法。
【請求項260】
高速での遠心分離の後に、前記試料を室温でインキュベートする、請求項２５６～２５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項261】
室温でのインキュベーションの後に、前記試料を遠心分離させることを更に含む、請求項２６０に記載の方法。
【請求項262】
ＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を前記試料に加えることと、
ｂ）前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｃ）前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、
ｄ）前記試料を高速で遠心分離させて、前記パラフィンを、前記ＤＮＡを含む溶解物から分離させることと、
ｅ）前記ＤＮＡを含む前記溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【請求項263】
ステップｂ）の前に、前記鉱油を除去する、請求項２６２に記載の方法。
【請求項264】
前記試料を高速で遠心分離させることが、前記試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、請求項２６２又は２６３に記載の方法。
【請求項265】
前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う、請求項２６２～２６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項266】
前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートした後、ステップｄ）の前に、即座に、前記試料を２０００～５０００ＲＣＦで遠心分離させる、請求項２６２～２６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項267】
ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を前記試料に加えることと、
ｂ）前記試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることにより、前記パラフィンを溶融させることと、
ｃ）前記試料を室温に冷却することと、
ｄ）前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｅ）前記試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、
ｆ）前記試料を高速で遠心分離させて、前記パラフィン及び前記鉱油を、前記ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、
ｇ）前記ＲＮＡを含む前記溶解物を吸引することと、
ｈ）前記ＲＮＡを前記溶解物から単離することと、
ｉ）ステップｇ）からの前記溶解物を高速で遠心分離させて、前記溶解物を前記鉱油から分離させることと、
ｊ）ステップｉ）からの前記試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、
ｋ）ステップｊ）からの前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、
ｌ）前記試料を高速で遠心分離させることと、
ｍ）前記ＤＮＡを含む第２の溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【請求項268】
前記試料を高速で遠心分離させることが、前記試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、請求項２６７に記載の方法。
【請求項269】
前記試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う、請求項２６７又は２６８に記載の方法。
【請求項270】
前記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項２３２～２６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項271】
前記試料が、サイズ約３０μｍ３未満である、請求項１～２７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項272】
前記試料が、サイズ約０．３μｍ３～約５．５μｍ３である、請求項１～２７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項273】
前記試料から抽出した前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析することを更に含む、請求項２３２～２７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項274】
前記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析することが、次世代配列決定を含む、請求項２７３に記載の方法。
【請求項275】
前記ＲＮＡ及び／又は前記ＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することを更に含む、請求項２３２～２７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項276】
前記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、ハイブリッド捕捉ベースの配列決定を使用して配列決定することを更に含む、請求項２３２～２７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項277】
前記試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する、請求項２３２～２７６のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２９０，５３７号の優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２９０，５３７号の優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、パラフィンなどの包埋剤を包埋試料から除去する方法に関する。本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡなどの分析物を検出し、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡなどの分析物を抽出し、包埋試料からの核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善するために使用してもよく、同様に、がんなどの疾患の診断、評価、及び治療の方法である。
【背景技術】
【0003】
がんは、腫瘍形成に必要な幅広い生物学的特性を細胞に授ける複数の遺伝子病変の表現型エンドポイントを示す。実際に、多くのがんの顕著なゲノム特徴は、多数の複雑な染色体構造異常の存在であり、これらには、なかでも、転座、染色体内逆位、点変異、欠失、遺伝子コピー数の変化、遺伝子発現レベルの変化、遺伝子融合、及び生殖細胞変異が含まれる。これらの顕著なゲノム特徴の存在は、がんのバイオマーカーとして機能し得る。
【0004】
こうしたバイオマーカーを検出する一方法は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織などの組織試料中の腫瘍細胞から抽出した核酸の分析である。特に、ＲＮＡとＤＮＡとの両方を単一の組織試料から抽出することが望ましい。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡをパラフィン包埋組織試料から抽出する方法は、核酸抽出の前にパラフィンを除去するステップを伴う。パラフィンを包埋試料から除去する一方法は、パラフィンを、キシレンなどの有害な有機溶媒、又は別の混和性溶媒に溶解させることを伴う。こうした溶媒ベースのパラフィン除去の方法は、例えば核酸試料調製を多重化することを目的とした、ロボットによる自動化には適していない。したがって、パラフィンなどの包埋剤を包埋試料から除去する方法、特に、ロボットによる自動化及びハイスループット試料調製に適した方法が当該技術分野で求められている。
【0005】
特許、特許出願、及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により援用される参考文献が本開示と矛盾する限り、本開示が優先するものとする。
【発明の概要】
【0006】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変は、ａ）コピー数改変、ｂ）点変異、ｃ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｄ）遺伝子内欠失、ｅ）遺伝子内挿入、ｆ）遺伝子全体の欠失、ｇ）逆位、ｈ）染色体間転座、ｉ）縦列重複、ｊ）遺伝子融合、ｋ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｌ）遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変はコピー数改変である。
【0007】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。
【0008】
核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。
【0009】
パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて低減する。
【0010】
パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。
【0011】
先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。先行方法のいくつかの実施形態では、相転移は溶融である。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を加熱することを含む。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を加熱し、遠心分離させることを含む。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を加熱し、遠心分離させ、濾過することを含む。
【0012】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変は、ａ）コピー数改変、ｂ）点変異、ｃ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｄ）遺伝子内欠失、ｅ）遺伝子内挿入、ｆ）遺伝子全体の欠失、ｇ）逆位、ｈ）染色体間転座、ｉ）縦列重複、ｊ）遺伝子融合、ｋ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｌ）遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変はコピー数改変である。
【0013】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。
【0014】
核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。
【0015】
パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて低減する。
【0016】
パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。
【0017】
先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。先行方法のいくつかの実施形態では、不混和性溶媒は鉱油である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油とパラフィン包埋試料との比で接触させる。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を、鉱油中、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、鉱油は、パラフィン包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する。いくつかの実施形態では、鉱油は、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、パラフィン包埋試料に接触する。
【0018】
先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。
【0019】
先行方法のいくつかの実施形態では、試料からのパラフィンの分離は自動である。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は自動である。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は自動である。先行方法のいくつかの実施形態では、２つ以上のパラフィン包埋試料を並行して処理する。いくつかの実施形態では、１２、２４、４８、又は９６個のパラフィン包埋試料を並行して処理する。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、液体取扱ロボットを使用して行う。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｔｅｃａｎ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの液体取扱ロボットであり、任意選択で、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ、ＢｉｏＴｅｋ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、又はＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲである。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ＲＮＡ及びＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを含む。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップａ）は、ｉ）パラフィン包埋組織中の目的の腫瘍細胞を含む標的領域を特定することと、ｉｉ）パラフィン包埋試料をパラフィン包埋組織から抽出することと、ｉｉｉ）パラフィン包埋組織中のパラフィン包埋試料の場所を特定することと、ｉｖ）パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合う場合、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを試料から抽出することと、を含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合わない場合、ステップｉｉ）及びｉｉｉ）を繰り返す。いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、針を使用してパラフィン包埋試料を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、針でパラフィン包埋組織を通して穿刺することにより、パラフィン包埋試料を抽出する。いくつかの実施形態では、針は使い捨て針である。いくつかの実施形態では、針は、１３ゲージ針、１４ゲージ針、１５ゲージ針、１６ゲージ針、１７ゲージ針、１８ゲージ針、１９ゲージ針、２０ゲージ針、又は２１ゲージ針である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織から抽出したパラフィン包埋試料は、直径約０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、又は２．３ｍｍである。いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）又はレーザーブレードを使用してパラフィン包埋試料を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）は、パラフィン包埋組織の切片のスライドを調製することを含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織の切片を染色する。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色する。いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）を目視検査により行う。いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）をコンピュータシステムにより行う。いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）を、画像分析システムを使用して行う。
【0020】
先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、生検、任意選択で腫瘍生検に由来する。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は固定パラフィン包埋試料である。いくつかの実施形態では、固定パラフィン包埋試料は、ホルマリン固定試料、エタノール固定試料、及びメタノール固定試料からなる群から選択される。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から得られる。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、凍結保存組織から得られる。先行方法のいくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、新鮮凍結組織から得られる。いくつかの実施形態では、新鮮凍結組織は、最適切断温度（ＯＣＴ）の化合物中で凍結する。先行方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡを抽出する前に、ＲＮＡを抽出する。いくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料をステップｂ）の前に消化させることを更に含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、又は約６２℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、部分的に消化させる又は完全に消化させる。いくつかの実施形態では、本方法は、消化させた試料をステップｂ）の後に脱架橋することを更に含む。いくつかの実施形態では、脱架橋することは、消化させた試料を８０～９０℃に加熱することを含む。いくつかの実施形態では、消化させた試料を、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間加熱する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ＲＮＡを含む試料溶解物を、消化させたパラフィン包埋試料から収集し、ＲＮＡを、ＲＮＡを含む試料溶解物から精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、消化させたパラフィン包埋試料を完全に消化させることを更に含む。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼを使用して、完全な消化を行う。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡを含む試料溶解物を、完全に消化させたパラフィン包埋試料から収集することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡを含む試料溶解物からＤＮＡを精製することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを抽出する前に、ＤＮＡを抽出する。いくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料をステップｂ）の後に完全に消化させることを更に含む。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼを使用して、完全な消化を行う。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡを完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡを完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む。
【0021】
先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量を測定することを更に含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量は、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇ、約６０ｎｇ、約７０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０μｇ、又は約５０ｍｇである。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析することを更に含む。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを次世代配列決定により分析することを更に含む。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、ｅ）任意選択で、１つ以上のアダプターを、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡにライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、ｄ）任意選択で、核酸を、ライゲーションした核酸から増幅することと、ｆ）任意選択で、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を捕捉することと、ｇ）配列決定装置によって、複数の核酸を配列決定して、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、ｈ）複数の配列リードを分析することと、ｉ）分析に基づいて、目的の遺伝子中の１つ以上の変異を検出することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸は、ベイト分子とのハイブリダイゼーションによって、増幅された核酸から捕捉される。いくつかの実施形態では、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を、増幅した核酸から富化し、任意選択で、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を、ビオチン／ストレプトアビジンタグ付けにより、増幅した核酸から富化する。いくつかの実施形態では、ステップｅ）の前に、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを断片化し、任意選択で、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、超音波処理により断片化する。いくつかの実施形態では、断片化したパラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを末端修復する。いくつかの実施形態では、末端修復し断片化した、試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、ｄＡテール状又はｄＴテール状である。
【0022】
先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＤＮＡを分析して、ｉ）点変異、ｉｉ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｉｉｉ）遺伝子内欠失、ｉｖ）遺伝子内挿入、ｖ）遺伝子全体の欠失、ｖｉ）逆位、ｖｉｉ）染色体間転座、ｖｉｉｉ）縦列重複、ｉｘ）遺伝子融合、ｘ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｘｉ）遺伝子増幅若しくは重複、からなる群から選択される体細胞変異を検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、体細胞変異は、遺伝子中にあり、遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、又はＴＰ５３である。いくつかの実施形態では、体細胞変異は、遺伝子中にあり、この遺伝子は、ＡＢＬ２、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ６、ＬＴＫ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＫ、ＴＮＫＳ２、ＴＯＰ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、又はＷＴ１である。
【0023】
先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡを分析して、ｉ）遺伝子融合、ｉｉ）エクソンスキッピング事象、ｉｉｉ）スプライスバリアント、及び／又はｉｖ）改変された遺伝子発現、からなる群から選択される改変を検出することを更に含む。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料中の１つ以上の目的の遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）の検出を更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料中のＳＴ７／ＲＡＹ１、ＡＲＨ１／ＮＯＥＹ２、ＴＳＬＣ１、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＤＣＣ、ＴＰ５３、ＡＴＭ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ＮＡＴ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＯＧＧ１、ＣＤＨ１、ＩＧＦ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／Ｐ５７、ＭＥＮ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、Ｈ１９、ＫＲＡＳ、ＢＡＰ１、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＵＦＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＰＰ６Ｃ、ＬＡＴＳ１、ＣＡＳＰ８、ＰＴＰＮ１４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＢＸＷ７、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮ－α、嗅覚受容体遺伝子、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＤＵＴＴ１、ＦＨＩＴ、ＡＰＣ、Ｐ１６、ＦＣＭＤ、ＴＳＣ２、ｍｉＲ－３４、ｃ－ＭＰＬ、ＲＵＮＸ３、ＤＩＲＡＳ３、ＮＲＡＳ、ｍｉＲ－９、ＦＡＭ５０Ｂ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＲ、ＦＬＴ３、ＺＤＢＦ２、ＧＰＲ１、ｃ－ＫＩＴ、ＮＡＰ１Ｌ５、ＧＲＢ１０、ＥＧＦＲ、ＰＥＧ１０、ＢＲＡＦ、ＭＥＳＴ、ＪＡＫ２、ＤＡＰＫ１、ＬＩＴ１、ＷＴ１、ＮＦ－１、ＰＲ、ｃ－ＣＢＬ、ＤＬＫ１、ＡＫＴ１、ＳＮＵＲＦ、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）、ＺＮＦ５８７、ＳＯＣＳ１、ＴＩＭＰ２、ＲＵＮＸ１、ＡＲ、ＣＥＢＰＡ、Ｃ１９ＭＣ、ＥＭＰ３、ＺＮＦ３３１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＥＧ３、ＮＮＡＴ、ＧＮＡＳ、及び／又はＧＡＴＡ５のＬＯＨを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料中のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のＬＯＨを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のアダプターをパラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡのうちの１つ以上にライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、ライゲーションした核酸を増幅することと、増幅した核酸からＨＬＡ遺伝子に対応する複数の核酸を、ベイト分子を使用して捕捉することと、捕捉した核酸を配列決定して、ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、１つ以上のプロセッサによって、複数の配列リードのうちの１つ以上に関連する１つ以上の値をモデルに適合させることと、モデルに基づいて、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及びＨＬＡ遺伝子のＨＬＡアレルについての相対的な結合傾向を検出することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及びＨＬＡ遺伝子のＨＬＡアレルについての相対的な結合傾向は、ａ）ＨＬＡアレルについて観察されたアレル頻度を取得することであって、観察されたアレル頻度が、ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の配列リード間で検出されたＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸の頻度に対応する、取得することと、ｂ）ＨＬＡアレルのベイト分子に対する相対的な結合傾向を取得することであって、ＨＬＡアレルの相対的な結合傾向は、１つ以上の他のＨＬＡアレルの一部をコードする核酸の存在下、ＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸がベイト分子に結合する傾向に対応する、取得することと、ｃ）目的関数を適用して、ＨＬＡアレルの相対的な結合傾向と観察されたアレル頻度との間の差を測定することと、ｄ）最適化モデルを適用して、目的関数を最小化することと、ｅ）最適化モデル及び観察されたアレル頻度に基づいて、ＨＬＡアレルの調整されたアレル頻度を決定することと、ｆ）ＨＬＡアレルの調整されたアレル頻度が所定の閾値よりも小さい場合、ＬＯＨが発生したと決定することと、によって検出される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）以外の有効量の治療を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）以外の治療を推奨することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料における高い腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）を検出すること、又はその知識を得ることを更に含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び高いＴＭＢの検出に少なくとも部分的に基づいて、有効量の免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び高いＴＭＢの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む治療を個体に推奨することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子は、ヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＴＭＢは、配列決定されたゲノムの１メガベース当たりの非ドライバー体細胞性コード変異の数に基づいて決定される。
【0024】
先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料中のホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）遺伝子における機能喪失型変異を検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、若しくは置換、ゲノム再編成、プロモーター中の改変、遺伝子融合、又はコピー数改変のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異を、パラフィン包埋試料中で、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定のうちの１つ以上により検出する。
【0025】
先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料中の腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）のレベルを測定することを更に含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０変異／メガベース（Ｍｂ）又は少なくとも約２０ｍｕｔ／ＭｂのＴＭＢが検出される。いくつかの実施形態では、ＴＭＢを、パラフィン包埋試料由来のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定により測定する。いくつかの実施形態では、ＴＭＢを、約０．８０Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する。いくつかの実施形態では、ＴＭＢを、約０．８３Ｍｂ～約１．１４Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する。いくつかの実施形態では、ＴＭＢを、約１．１Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する。いくつかの実施形態では、ＴＭＢを、最大約１．１Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する。
【0026】
先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料中のホモ接合性単一エクソン喪失を検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、ホモ接合性単一エクソン喪失を、パラフィン包埋試料由来のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定によって検出する。
【0027】
分析物を検出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される。
【0028】
分析物を抽出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。
【0029】
包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて低減する。
【0030】
包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。
【0031】
先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。先行方法のいくつかの実施形態では、相転移は、溶融、凍結、気化、凝結、昇華、及び沈着からなる群から選択される。先行方法のいくつかの実施形態では、相転移は溶融である。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料の加熱、冷却、圧力増加、又は圧力減少を含む。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を遠心分離させ、濾過して、包埋を試料から分離させることを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を加熱し、遠心分離させ、濾過して、包埋剤を試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む。先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を加熱し、遠心分離させて、包埋剤を試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む。
【0032】
分析物を検出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される。
【0033】
分析物を抽出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。
【0034】
包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて低減する。
【0035】
包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。
【0036】
先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。先行方法のいくつかの実施形態では、不混和性溶媒の密度は、水より軽く、包埋剤が液体形態である場合には包埋剤より重い。いくつかの実施形態では、不混和性溶媒の密度は、流動パラフィンより重い。先行方法のいくつかの実施形態では、不混和性溶媒は植物油である。先行方法のいくつかの実施形態では、不混和性溶媒は鉱油である。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油と包埋試料との比で接触させる。いくつかの実施形態では、鉱油は、包埋試料に、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃で接触する。いくつかの実施形態では、鉱油は、包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する。いくつかの実施形態では、鉱油は、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、包埋試料に接触する。
【0037】
先行方法のいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。
【0038】
先行方法のいくつかの実施形態では、分析物は、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子、脂質、多糖、エクソソーム、ミトコンドリア、及び核からなる群から選択される。先行方法のいくつかの実施形態では、包埋剤は、パラフィン、樹脂、セロイジン、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）、ゼラチン、エステルワックス、ワックス、ポリエチレングリコール、及びニトロセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。
【0039】
ＲＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｂ）試料を５０℃～７５℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｃ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｄ）ＲＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）の後、ステップｄ）の前に、試料を室温に冷却することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、試料を室温に冷却した後に、試料を遠心分離させて、溶解物を濾過することを更に含む。いくつかの実施形態では、試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることは、５０℃～６０℃でのインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることは、１～２０分間のインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、試料を高速で遠心分離させることは、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを溶解物から単離する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを抽出する方法が、ハイスループット法に使用される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡを分析することを更に含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼとのインキュベーションを、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う。いくつかの実施形態では、５０℃～８０℃でのインキュベーションを、振盪せずに行う。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）の後に、試料を２５０ＲＣＦ～７５０ＲＣＦで遠心分離させることを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡをＲＮＡから調製することを更に含む。
【0040】
ＤＮＡを試料から抽出する方法であって、ａ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｃ）試料を高速で遠心分離させて、ＤＮＡを含む溶解物を生成することと、ｄ）ＤＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う。いくつかの実施形態では、ステップｂ）の直後に、試料を２～２０分間１０００ＲＣＦ～４０００ＲＣＦで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、２～２０分間１０００ＲＣＦ～４０００ＲＣＦでの遠心分離の後に、試料を少なくとも４０分間冷蔵する。いくつかの実施形態では、試料を冷蔵した後に、ステップｃ）を実行する。いくつかの実施形態では、試料を高速で遠心分離させることは、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む。
【0041】
ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｃ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、ＲＮＡを含む第１の溶解物から分離させることと、ｄ）ＲＮＡを含む第１の溶解物を吸引することと、ｅ）ＲＮＡを第１の溶解物から単離することと、ｆ）ステップｃ）からの試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｇ）ステップｆ）からの試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｈ）試料を高速で遠心分離させることと、ｉ）ＤＮＡを含む第２の溶解物を吸引することと、ｊ）ＤＮＡを第２の溶解物から単離することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、試料を高速で遠心分離させることは、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼとのインキュベーションを、ステップａ及び／又はステップｆにおいて、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う。いくつかの実施形態では、試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることは、５０℃～６０℃でのインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることは、１～２０分間のインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることを、振盪せずに行う。
【0042】
ＲＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を試料に加えることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｃ）試料を室温に冷却することと、ｄ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｆ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｇ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィン及び鉱油を、ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｈ）ＲＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、５０℃～８０℃で１～２０分間のインキュベーションを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う。いくつかの実施形態では、試料を高速で遠心分離させることは、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む。いくつかの実施形態では、高速での遠心分離の後に、試料を室温でインキュベートする。いくつかの実施形態では、本方法は、室温でのインキュベーションの後に、試料を遠心分離させることを更に含む。
【0043】
ＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を試料に加えることと、ｂ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｃ）試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｄ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、ＤＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｅ）ＤＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ステップｂ）の前に鉱油を除去する。いくつかの実施形態では、試料を高速で遠心分離させることは、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む。いくつかの実施形態では、試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う。いくつかの実施形態では、試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートした後、ステップｄ）の前に、即座に、試料を２０００～５０００ＲＣＦで遠心分離させる。
【0044】
ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を試料に加えることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることにより、パラフィンを溶融させることと、ｃ）試料を室温に冷却することと、ｄ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｅ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｆ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィン及び鉱油を、ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｇ）ＲＮＡを含む溶解物を吸引することと、ｈ）ＲＮＡを溶解物から単離することと、ｉ）ステップｇ）からの溶解物を高速で遠心分離させて、溶解物を鉱油から分離させることと、ｊ）ステップｉ）からの試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｋ）ステップｊ）からの試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｌ）試料を高速で遠心分離させることと、ｍ）ＤＮＡを含む第２の溶解物を吸引することと、を含む、方法が、更に本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、試料を高速で遠心分離させることは、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む。いくつかの実施形態では、試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う。
【0045】
先行方法のいくつかの実施形態では、プロテアーゼはプロテイナーゼＫである。先行方法のいくつかの実施形態では、試料は、サイズ約３０μｍ３である。先行方法のいくつかの実施形態では、試料は、サイズ約０．３μｍ３～約５．５μｍ３である。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析することは、次世代配列決定を含む。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することを更に含む。先行方法のいくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、ハイブリッド捕捉ベースの配列決定を使用して配列決定することを更に含む。先行方法のいくつかの実施形態では、試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する。
【図面の簡単な説明】
【0046】
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許又は特許出願のコピーは、要求及び必要な費用の支払いに応じて、庁により提供される。
【0047】
【図1】ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する、例示的なＲＮＡ優先方法（上）及びＤＮＡ優先方法（下）の概要を提供する。
【図2】１０，０００ｒｃｆで２分間遠心分離させた後のパラフィン包埋組織から抽出した混濁した核酸試料の代表的な画像を示す。矢印は、ワックス（パラフィン）汚染を含むペレットを指す。
【図3A】ＲＮＡ優先抽出のワークフローを試験するために使用した実験の３つのアームを示す概略図を示す。アーム２は標準プロトコル（左の縦列）であり、アーム３は油法（中央の縦列）であり、アーム４は温溶解物スピン法（右の縦列）である。
【図3B】ＤＮＡ優先抽出のワークフローを試験するために使用した実験の３つのアームを示す概略図を示す。アーム２は標準プロトコル（左の縦列）であり、アーム３は油法（中央の縦列）であり、アーム４は温溶解物スピン法（右の縦列）である。
【図4】ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックからの病理標本の精密富化を行うための例示的な方法の概要を示す。
【図5A-5B】例示的な包括的ゲノムプロファイリング（ＣＧＰ）法の概要を提供する。
【図6】いくつかの実施形態による例示的なデバイス「デバイス１１００」を図示する。
【図7】いくつかの実施形態による例示的なシステム「システム１２００」を図示する。
【図8】いくつかの実施形態によるパラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析するための例示的なプロセスのブロック図を図示する。
【発明を実施するための形態】
【0048】
本開示は、富化プロセスを評価するために組織学的品質保証／品質管理ステップを伴う、核酸を組織から抽出するための方法の開発に少なくとも部分的に基づく。本明細書に記載の方法により、以前の富化方法では腫瘍内容物の分析に不十分なレベルの組織しか別様には得られなかったであろう標本の試験が可能になる。
【0049】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを、３０μＭ２以下ほどなどの小さい試料から抽出することができるという利点を有する。更に、いくつかの実施形態では、本方法を使用して、ＤＮＡ及びＲＮＡを同じ試料から抽出することができる。そのうえ、いくつかの実施形態では、本方法は、特にハイスループット法においてより効率的な下流処理を可能にする、試料からのパラフィンの除去に関する。例えば、いくつかの実施形態では、本方法を使用したパラフィンの除去により、ハイスループット試料処理法に使用されるロボットの詰まりが減少し得る。
【0050】
定義
本発明を詳細に説明する前に、この発明は、特定の組成物又は生体系に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定することを意図していない。
本発明を詳細に説明する前に、この発明は、特定の組成物又は生体系に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定することを意図していない。
【0051】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」との言及は、任意選択で、２つ以上のこうした分子の組み合わせなどを含む。
【0052】
「又は」という用語は、文脈上他に明らかに示されない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書で使用され、それと互換的に使用される。
【0053】
「約」又は「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者であれば容易に分かるそれぞれの値の通常の誤差範囲、例えば、測定の性質又は精度を所与とした測定された量についての許容程度の誤差又は逸脱を指す。本明細書における「約」又は「およそ」の値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び説明する）。
【0054】
本明細書で使用される場合、「包埋剤」という用語は、組織試料などの試料を包埋するために使用されてもよい任意の薬剤を指す。例示的な包埋剤には、パラフィン、樹脂セロイジン、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）、ゼラチン、エステルワックス、ワックス、ポリエチレングリコール、及びニトロセルロースが含まれる。特定の実施形態では、包埋剤はパラフィンである。
【0055】
本明細書で使用される場合、「包埋試料」という用語は、包埋剤に包埋した任意の試料を指す。いくつかの実施形態では、包埋試料は、包埋組織試料、例えば、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体から抽出した包埋組織試料である。特定の実施形態では、包埋試料はパラフィン包埋試料である。
【0056】
本明細書で使用される場合、「分析物」という用語は、包埋試料から抽出してもよい任意の分子を指す。例示的な分析物には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、小分子、脂質、多糖、エクソソーム、ミトコンドリア、及び核が含まれる。
【0057】
本明細書で使用される場合、「にハイブリダイズするように構成された」は、核酸分子を、例えば、少なくとも６５℃のＴｍで、１倍ＳＣＣ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）と０．１％ ＳＤＳとの水溶液中で、標的核酸にハイブリダイズさせるように、十分な長さと標的核酸のヌクレオチド配列に対する配列相補性とを有するヌクレオチド配列を核酸分子が有することを示す。例えば、記載の方法の文脈において、核酸分子を標的核酸分子にハイブリダイズさせるときに、他のハイブリダイゼーション条件を使用してもよい。
【0058】
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯動物（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、個体又は対象はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、ヒト患者、例えば、本明細書に記載のがんを有するヒト患者である。
【0059】
薬剤、例えば、抗がん剤、又は医薬製剤の「有効量」又は「治療有効量」は、例えば、がんの治療又は管理において、所望される治療的又は予防的結果、例えば、がんと関連付けられる１つ以上の症状を遅延させる又は最小限に抑えることを達成するために、必要とされる投薬量及び期間で有効な量を指す。いくつかの実施形態では、薬剤の有効量又は治療有効量は、単剤での、又はがんなどの疾患の治療又は管理において治療的又は予防的利益を提供する他の治療剤と組み合わせた、必要とされる投薬量及び期間での薬剤の量を指す。いくつかの実施形態では、薬剤の有効量又は治療有効量は、別の治療薬又は別の治療モダリティの治療的又は予防的効能を増強するものである。
【0060】
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的な変形語）は、治療される個体の自然の経過を改変しようとする臨床的介入を指し、予防のため、又は一連の臨床病理学の間のいずれかに行われ得る。望ましい治療の効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発を予防すること、疾患の進行を遅延させること、症状の軽減、疾患の何らかの直接的又は間接的な病理学的帰結の減退、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の向上又は緩和、及び寛解した又は改善された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、「治療」、「治療する」、又は「治療すること」という用語には、例えば、個体が、がんに、又はがんの再増殖若しくは再発に罹患し始める前に、がんなどの疾患を予防することが含まれる。いくつかの実施形態では、「治療」、「治療する」、又は「治療すること」という用語には、がんなどの疾患を阻害する又はその重症度を低減させることが含まれる。
【0061】
「する可能性が高い」又は「高い確率」は、事象、品物、対象物、物、又は人が生じる可能性が高いことを指す。このため、一例では、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法を単独で又は組み合わせで用いる治療に応答する可能性が高い個体は、参照個体又は個体群と比べて、抗がん療法を単独で又は組み合わせで用いる治療に応答する確率が高い。「可能性が低い」とは、事象、物品、対象物、物、又は人が生じる確率が、参照個体又は個体群と比べて低いことを指す。このため、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法を単独で又は組み合わせで用いる治療に応答する可能性が低い個体は、参照個体又は個体群と比べて、抗がん療法を単独で又は組み合わせで用いる治療に応答する確率が低い。
【0062】
Ｉ．包埋試料からの包埋剤の除去
いくつかの態様では、分析物を検出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。また、分析物を抽出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、分析物を検出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、分析物を抽出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。また、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。
いくつかの態様では、分析物を検出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。また、分析物を抽出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、分析物を検出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、分析物を抽出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。また、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。また、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。
【0063】
本開示は、包埋試料を包埋剤から分離させるための方法の開発に部分的に基づく。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、パラフィンを、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織などのパラフィン包埋試料から分離させてもよい。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、包埋剤を包埋試料から除去した後で、包埋剤の分離不良により、試料から抽出した分析物の後続の分析の間に浮上する様々な問題が提示される。例えば、脱包埋から抽出した試料からの包埋剤の分離不良は、脱包埋試料から抽出した分析物試料中の不純物であり得る。パラフィンの場合、これにより、分析物試料の混濁した調製物、及び分析物試料を処理するために使用される液体取扱ロボットの詰まりが生じ得る。脱パラフィン試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の場合、パラフィンの除去不良により、次世代配列決定分析のためのライブラリ構築が失敗し得る。
【0064】
重要なことに、本明細書に記載の方法は、キシレンなどの毒性溶媒の使用に依存せず、したがって、自動化可能なハイスループット分析、例えば、核酸を配列決定するためのライブラリのハイスループット調製に適している。
【0065】
包埋剤への相転移の誘導
いくつかの実施形態では、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成するために、相転移を包埋剤に誘導することを伴う方法が、本明細書に提供される。包埋剤は、本明細書に記載の包埋剤のうちの任意の１つであってよい。本明細書に記載の方法を使用して、包埋剤を包埋試料を分離させてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、分析物を脱包埋試料から抽出することを更に含む。分析物は、本明細書に記載の分析物のうちの任意の１つであってよい。
いくつかの実施形態では、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成するために、相転移を包埋剤に誘導することを伴う方法が、本明細書に提供される。包埋剤は、本明細書に記載の包埋剤のうちの任意の１つであってよい。本明細書に記載の方法を使用して、包埋剤を包埋試料を分離させてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、分析物を脱包埋試料から抽出することを更に含む。分析物は、本明細書に記載の分析物のうちの任意の１つであってよい。
【0066】
いくつかの実施形態では、分析物を検出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の検出は、包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される。
【0067】
いくつかの実施形態では、分析物を抽出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。
【0068】
いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて低減する。分析物試料中の包埋剤のレベルは、例えば、分析物試料の濁度を測定することにより、測定してもよい。いくつかの実施形態では、分析物試料の濁度は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させる方法と比べて、及び／又は包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて、低減する。
【0069】
いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて少なくなる。上記のように、分析物試料中の包埋剤のレベルは、例えば、分析物試料の濁度を測定することにより、測定してもよい。いくつかの実施形態では、分析物試料の濁度は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させる方法と比べて、及び／又は包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて、低減する。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲであり、スピンカラムは、ＡｕｔｏＬｙｓチューブである。
【0070】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まない。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。
【0071】
いくつかの実施形態では、相転移は、溶融、凍結、気化、凝結、昇華、及び沈着からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料の加熱、冷却、圧力増加、又は圧力減少を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、相転移は溶融である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋剤を溶融させることにより包埋剤を包埋試料から除去することで、脱包埋試料を生成することを含む。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋剤を溶融させ、包埋剤を試料から分離させることを含む。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する。
【0073】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を遠心分離させ、濾過して、包埋を試料から分離させることを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、遠心分離させ濾過することは、液体取扱ロボット、例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲにおいて行う。
【0074】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋試料を加熱し、遠心分離させ、濾過して、包埋剤を試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む。いくつかの実施形態では、加熱し、遠心分離させ、濾過することは、上記のとおりに行う。いくつかの実施形態では、加熱し、遠心分離させ、濾過することは、液体取扱ロボット、例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲにおいて行う。
【0075】
パラフィン包埋試料を伴う方法
いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。したがって、いくつかの実施形態では、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う方法が本明細書に提供される。相転移を伴う方法を使用してパラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う例示的な方法を、実施例で本明細書に記載する。
いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。したがって、いくつかの実施形態では、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う方法が本明細書に提供される。相転移を伴う方法を使用してパラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う例示的な方法を、実施例で本明細書に記載する。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変は、コピー数改変、点変異、１つ以上のコドンのインフレーム欠失、遺伝子内欠失、遺伝子内挿入、遺伝子全体の欠失、逆位、染色体間転座、縦列重複、遺伝子融合、イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又は遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変はコピー数改変である。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法は、以下で詳述する。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法は、以下で詳述する。
【0078】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法も、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。
【0079】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、混和性溶媒に溶解させる方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて低減する。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度を測定することによって、測定してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて、及び／又はパラフィンを包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて、低減する。いくつかの実施形態では、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法及び／又はパラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法によって調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度は、相転移をパラフィン中で誘導し、パラフィンを試料から分離させることによって、パラフィンを除去する方法を使用して調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度の２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、又は５０倍である。
【0080】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。上記のように、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度を測定することによって、測定してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度の測定は、パラフィンの分離が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて及び／又はパラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて、改善されることを示す。いくつかの実施形態では、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法及び／又はパラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法によって調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度は、相転移をパラフィン中で誘導し、パラフィンを試料から分離させることによって、パラフィンを除去する方法を使用して調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度の２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、又は５０倍である。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲであり、スピンカラムは、ＡｕｔｏＬｙｓチューブである。
【0081】
包埋試料がパラフィン包埋試料である先行方法のうちの任意の１つのいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まない。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。包埋試料がパラフィン包埋試料である先行方法のうちの任意の１つのいくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィンを毒性溶媒に溶解させることを含まない。
【0082】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する。
【0083】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む。概して、試料は、パラフィン及び試料の相対密度及び試料中の粒子の存在に基づいて、パラフィンを包埋試料から分離させるように、遠心分離させ、濾過する。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。
【0084】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を加熱し、遠心分離させることを含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する。パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、請求項３１又は３２に記載の方法。パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【0085】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィン包埋試料を加熱し、遠心分離させ、濾過することを含む。加熱し、遠心分離させ、濾過することは、上記のように行ってもよい。
【0086】
包埋試料の不混和性溶媒との接触
いくつかの実施形態では、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成するために、包埋試料を不混和性溶媒と接触させることを伴う方法が、本明細書に提供される。包埋剤は、本明細書に記載の包埋剤のうちの任意の１つであってよい。本明細書に記載の方法を使用して、包埋剤を包埋試料を分離させてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、分析物を脱包埋試料から抽出することを更に含む。分析物は、本明細書に記載の分析物のうちの任意の１つであってよい。
いくつかの実施形態では、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成するために、包埋試料を不混和性溶媒と接触させることを伴う方法が、本明細書に提供される。包埋剤は、本明細書に記載の包埋剤のうちの任意の１つであってよい。本明細書に記載の方法を使用して、包埋剤を包埋試料を分離させてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、分析物を脱包埋試料から抽出することを更に含む。分析物は、本明細書に記載の分析物のうちの任意の１つであってよい。
【0087】
いくつかの実施形態では、分析物を抽出する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、分析物の抽出は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。
【0088】
いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、分析物試料中の包埋剤のレベルは、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて低減する。分析物試料中の包埋剤のレベルは、例えば、分析物試料の濁度を測定することにより、測定してもよい。いくつかの実施形態では、分析物試料の濁度は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させる方法と比べて、及び／又は包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて、低減する。
【0089】
いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、包埋試料からの包埋剤の分離は、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲであり、スピンカラムは、ＡｕｔｏＬｙｓチューブである。
【0090】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まない。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。
【0091】
理論に束縛されるものではないが、水よりも低密度であり、包埋剤が形態形態であるときに包埋剤よりも高密度であるいずれの不混和性溶媒も、本明細書に記載の方法に使用することができると考えられる。例えば、パラフィン密度の密度は、およそ０．８ｇ／ｃｍ３であり、鉱油の密度はおよそ０．８７ｇ／ｃｍ３であり、水の密度は１ｇ／ｃｍ３である。鉱油は、水性試料をパラフィンから分離させるのに好適な不混和性溶媒の例である。理論に束縛されるものではないが、不混和性溶媒は、中間層を創出することにより包埋剤（例えば、パラフィン）と試料（例えば、溶解物）との間の相分離を促進すると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、不混和性溶媒の密度は、水より軽く、包埋剤が液体形態であると場合には包埋剤より重い。いくつかの実施形態では、不混和性溶媒の密度は、流動パラフィンより重い。いくつかの実施形態では、不混和性溶媒は植物油である。
【0092】
いくつかの実施形態では、不混和性溶媒は鉱油である。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油と包埋試料との比で接触させる。いくつかの実施形態では、鉱油は、包埋試料に、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃で接触する。鉱油が、包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する、請求項２１８～２２１のいずれか一項に記載の方法。いくつかの実施形態では、鉱油は、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、包埋試料に接触する。特定の実施形態では、不混和性溶媒は鉱油であり、包埋剤はパラフィンである。
【0093】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。
【0094】
パラフィン包埋試料を伴う方法
いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。したがって、いくつかの実施形態では、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う方法が本明細書に提供される。パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させることを伴う方法を使用してパラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う例示的な方法を、実施例で本明細書に記載する。
いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。したがって、いくつかの実施形態では、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う方法が本明細書に提供される。パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させることを伴う方法を使用してパラフィンをパラフィン包埋試料から除去することを伴う例示的な方法を、実施例で本明細書に記載する。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンを混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出は、パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変は、コピー数改変、点変異、１つ以上のコドンのインフレーム欠失、遺伝子内欠失、遺伝子内挿入、遺伝子全体の欠失、逆位、染色体間転座、縦列重複、遺伝子融合、イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又は遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変はコピー数改変である。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法は、以下で詳述する。
【0096】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンを混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法は、以下で詳述する。
【0097】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンを混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリの調製は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。
【0098】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンを混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて低減する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて低減する。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度を測定することによって、測定してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて、及び／又はパラフィンを包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて、低減する。いくつかの実施形態では、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法及び／又はパラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法によって調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度は、相転移をパラフィン中で誘導し、パラフィンを試料から分離させることによって、パラフィンを除去する方法を使用して調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度の２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、又は５０倍である。
【0099】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、パラフィン包埋試料を提供することと、パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からパラフィンの分離は、パラフィンを混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離は、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒（例えば、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標））に溶解させる方法と比べて少なくなる。上記のように、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルは、例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度を測定することによって、測定してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度の測定は、パラフィンの分離が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて及び／又はパラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて、改善されることを示す。いくつかの実施形態では、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法及び／又はパラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法によって調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度は、相転移をパラフィン中で誘導し、パラフィンを試料から分離させることによって、パラフィンを除去する方法を使用して調製したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料の濁度の２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、又は５０倍である。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させる方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。いくつかの実施形態では、本方法は、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて少なくなる。いくつかの実施形態では、フィルタは、スピンカラム中のフィルタである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲであり、スピンカラムは、ＡｕｔｏＬｙｓチューブである。
【0100】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒は、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である。
【0101】
上記のように、パラフィン密度の密度は、およそ０．８ｇ／ｃｍ３であり、鉱油の密度はおよそ０．８７ｇ／ｃｍ３であり、水の密度は１ｇ／ｃｍ３である。したがって、鉱油は、水性試料をパラフィンから分離させるのに好適な不混和性溶媒の例であると考えられる。理論に束縛されるものではないが、不混和性溶媒は、中間層を創出することにより包埋剤（例えば、パラフィン）と試料（例えば、溶解物）との間の相分離を促進すると考えられる。いくつかの実施形態では、不混和性溶媒は植物油である。いくつかの実施形態では、不混和性溶媒は鉱油である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油とパラフィン包埋試料との比で接触させる。いくつかの実施形態では、鉱油は、パラフィン包埋試料に、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃で接触する。いくつかの実施形態では、鉱油は、パラフィン包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する。いくつかの実施形態では、鉱油は、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、パラフィン包埋試料に接触する。
【0102】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる。
【0103】
いくつかの実施形態では、試料からのパラフィンの分離は自動である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は自動である。いくつかの実施形態では、本方法は自動である。いくつかの実施形態では、２つ以上のパラフィン包埋試料を並行して処理する。いくつかの実施形態では、１２、２４、４８、又は９６個のパラフィン包埋試料を並行して処理する。
【0104】
いくつかの実施形態では、本方法は、液体取扱ロボットを使用して行う。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｔｅｃａｎ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの液体取扱ロボットであり、任意選択で、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ、ＢｉｏＴｅｋ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、又はＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲである。
【0105】
いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ＲＮＡ及びＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを含む。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法は、以下で詳述する。
【0106】
ＩＩ．包埋試料
本明細書に記載の方法を使用して、包埋剤を包埋試料から除去してもよい。包埋剤は、本明細書に記載の包埋剤のうちの任意の１つであってよい。いくつかの実施形態では、包埋剤は、パラフィン、樹脂、セロイジン、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）、ゼラチン、エステルワックス、ワックス、ポリエチレングリコール、及びニトロセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、包埋剤はＰａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。
本明細書に記載の方法を使用して、包埋剤を包埋試料から除去してもよい。包埋剤は、本明細書に記載の包埋剤のうちの任意の１つであってよい。いくつかの実施形態では、包埋剤は、パラフィン、樹脂、セロイジン、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）、ゼラチン、エステルワックス、ワックス、ポリエチレングリコール、及びニトロセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、包埋剤はＰａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、包埋剤はパラフィンである。
【0107】
いくつかの実施形態では、試料は、細胞及び／又は組織を含む試料などの生体試料である。いくつかの実施形態では、試料は、個体から得られる。いくつかの実施形態では、試料は哺乳動物試料である。いくつかの実施形態では、試料はヒト試料である。
【0108】
パラフィン包埋試料
いくつかの実施形態では、パラフィをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成するための方法が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、パラフィをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成するための方法が、本明細書に提供される。
【0109】
様々なパラフィン包埋試料が当該技術分野で既知であり、本明細書に記載の方法での使用に好適である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記載のがんのうちのいずれか１つを有することが疑われる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、生検、任意選択で腫瘍生検に由来する。
【0110】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は固定パラフィン包埋試料である。いくつかの実施形態では、固定パラフィン包埋試料は、ホルマリン固定試料、エタノール固定試料、及びメタノール固定試料からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から得られる。
【0111】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、凍結保存組織から得られる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、新鮮凍結組織から得られる。いくつかの実施形態では、新鮮凍結組織は、最適切断温度（ＯＣＴ）の化合物中で凍結する。
【0112】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接取得した一次試料から得られる。例えば、いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、生検（例えば、微細針吸引又は組織生検）及び手術から選択される方法によって取得した組織から得られる。一実施形態では、パラフィン包埋試料は、腫瘍に関連する１つ以上の細胞、例えば腫瘍細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む組織から得られる。一実施形態では、パラフィン包埋試料は、１つ以上の前悪性細胞又は悪性細胞を含む組織から得られる。一実施形態では、パラフィン包埋試料は、血液悪性腫瘍（又は前悪性腫瘍）、例えば本明細書に記載の血液悪性腫瘍（又は前悪性腫瘍）から取得した組織から得られる。一実施形態では、パラフィン包埋試料は、本明細書に記載のがんなどのがんから取得した組織から得られる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移性病変から得られる。他の実施形態では、パラフィン包埋試料は、手術縁からの組織又は細胞を含む組織から得られる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、目的の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、非腫瘍細胞を更に含む。パラフィン包埋試料を、がんを有することが疑われる個体に由来する組織から抽出することを含む方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組織は、目的の腫瘍細胞を含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記載のがんのうちのいずれか１つを有することが疑われる。いくつかの実施形態では、目的の腫瘍細胞は、本明細書に記載のがんのうちのいずれか１つと関連付けられる腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）、急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）、腺がん、肺の腺がん、副腎皮質がん（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、副腎皮質がん腫（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門がん、虫垂がん、Ｂ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）又は非トリプルネガティブ乳がん）、卵管のがん、睾丸のがん、上皮性悪性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脳腫瘍（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん、胆管がん、絨毛がん、慢性骨髄性白血病、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、ＣＮＳがん、結腸がん、大腸がん（例えば、結腸腺がん）、びまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（「ＤＬＢＣＬ」）、胎児性横紋筋肉腫（ＥＲＭＳ）、子宮内膜がん、上皮がん、上皮性新生物、胸腺腫、食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、ユーイング肉腫、眼がん（例えば、ぶどう膜メラノーマ）、眼瞼がん、濾胞性リンパ腫（「ＦＬ」）、胆嚢がん、胃がん、消化管がん、膠芽腫、真性赤血球増加症、多形性膠芽腫、神経膠腫（例えば、軽度神経膠腫）、食道がん（ｇｕｌｌｅｔ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、血液がん、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞がん腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、重鎖疾患、直腸がん、腎がん（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、腎明細胞がん、腎嫌色素細胞がん、腎明細胞がん、腎乳頭がん）、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大腸がん（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭がん、白血病（ｌｅｕｃｏｓｉｓ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、肝臓がん、肺がん（例えば、肺腺がん、又は非小細胞肺がん）、リンパ腫、乳腺がん、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、ホジキン病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、メルケル細胞がん、中皮腫、単球性白血病、多発性骨髄腫、骨髄腫、筋原性肉腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経芽細胞腫（ＮＢ））、神経腫、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、未分化星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、前庭神経鞘腫、腺腫、転移性脳腫瘍、脊髄腫瘍、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、口がん、口腔がん、骨肉腫、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん腫（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓腺がん、膵臓がん、腹膜がん、褐色細胞腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺がん）、直腸がん（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）（直腸がん腫（ｒｅｃｔｕｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、再発性又は抵抗性古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、唾液腺がん（例えば、唾液腺腫瘍）、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、扁平上皮細胞がん（例えば、肛門性器部の扁平上皮細胞がん、肛門の扁平上皮細胞がん、子宮頸部の扁平上皮細胞がん、食道の扁平上皮細胞がん、頭頸部の扁平上皮細胞がん（ＳＣＨＮＣ）、肺の扁平上皮細胞がん、陰茎の扁平上皮細胞がん、膣の扁平上皮細胞がん、又は外陰部の扁平上皮細胞がん）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞由来白血病、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、精巣腫瘍、胸腺がん、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）（甲状腺がん腫（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、舌がん、結膜がん、膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、尿路上皮細胞がん、子宮がん（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、子宮内膜がん、又は子宮がん肉腫などの子宮肉腫）、子宮内膜がん、子宮（ｕｔｅｒｕｓ ｃａｎｃｅｒ）、膣がん、外陰部がん、又はウィルムス腫瘍である。
【0114】
いくつかの実施形態では、がんは、血液がん（例えば、血液悪性腫瘍）、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（「ＤＬＢＣＬ」）、ホジキンリンパ腫（「ＨＬ」）、非ホジキンリンパ腫（「ＮＨＬ」）、濾胞性リンパ腫（「ＦＬ」）、急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）、急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）、多発性骨髄腫（「ＭＭ」）、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病（「ＡＰＬ」）、急性単芽球性白血病、急性赤白血病性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄性白血病（「ＣＭＬ」）、慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）、又は有毛細胞白血病白血病である。いくつかの実施形態では、本開示の血液がんは、急性又は慢性白血病、例えば、リンパ芽球性、骨髄性、リンパ球性、又は骨髄球性白血病である。いくつかの実施形態では、本開示の血液がんは、リンパ腫（例えば、再発性又は抵抗性ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）などのホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は前駆体Ｔ－リンパ芽球性リンパ腫）、リンパ上皮がん、又は悪性組織球増殖症である。
【0115】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、固形悪性腫瘍）、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、骨がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、口がん、鼻がん、咽頭がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛腫、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、膀胱がん、肺がん、上皮がん、皮膚がん、メラノーマ、神経芽細胞腫（ＮＢ）、又は網膜芽細胞腫である。
【0116】
ある特定の実施形態では、がんは、副腎のがん（神経芽細胞腫など）、膀胱がん（尿路上皮（移行上皮）がんなど）、脳腫瘍（未分化星細胞腫又は膠芽細胞腫など）、骨がん（骨肉腫など）、骨髄がん（Ｂ細胞急性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）又は多発性骨髄腫など）、乳がん（浸潤性乳管がんなど）、頭頸部がん（腺がん、粘膜表皮がん、扁平上皮細胞がんなど）、リンパ節がん、肺がん（例えば、粘膜表皮がん、肉腫、小細胞未分化がん、腺がん、腺扁平上皮がん、大細胞がん、大細胞神経内分泌がん、非小細胞肺がん、特定不能の非小細胞がん、又は扁平上皮細胞がんなど）、女性生殖器がん（例えば、卵管漿液性がんなどの卵管のがん；上皮がん、特定不能の上皮がん、抗悪性度漿液性がん、低悪性度漿液性がん、漿液性がんなどの卵巣がん；及び子宮がん、例えば、がん肉腫、子宮内膜腺がん、特定不能の子宮内膜腺がん、乳頭状漿液性子宮内膜腺がん、平滑筋肉腫、肉腫、特定不能の肉腫、又は悪性度不明な平滑筋腫瘍（ＳＴＵＭＰ））、胆嚢がん（腺がんなど）、胃食道接合部のがん（腺がんなど）、リンパ節がん（未分化大細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、特定不能のＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、特定不能の非ホジキンリンパ腫など）、結腸がん（腺がんなど）、大腸がん、皮膚がん（メラノーマ又は扁平上皮細胞がんなど）、小腸がん（腺がん）、軟部組織がん（ユーイング肉腫、線維肉腫、組織球増殖症、特定不能の組織球増殖症、若年性黄色肉芽腫若しくは非ランゲルハンス細胞組織球増加症、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、平滑筋肉腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、特定不能の肉腫、肉腫、未分化肉腫、又は未分化軟部組織がんなど）、膵臓がん（がん腫、特定不能のがん腫、導管腺がん、又は粘液性嚢胞腺がんなど）、前立腺（腺房腺がんなど）、心膜がん（中皮腫など）、腹膜がん（中皮腫など）、唾液腺がん（がん腫又は特定不能のがん腫など）、胃がん（腺がん、特定不能の腺がん、又はびまん型がんなど）、腎臓がん（腎細胞がん又は特定不能の腎細胞がんなど）、甲状腺がん（がん腫、特定不能のがん腫、又は乳頭がんなど）、あるいは原発不明がん（腺がん、がん腫、特定不能のがん腫、平滑筋肉腫、悪性新生物、特定不能の悪性新生物、メラノーマ、筋上皮がん、扁平上皮細胞がん（ＳＣＣ）、又は未分化神経内分泌がんなど）である。
【0117】
いくつかの実施形態では、がんは、１つ以上の以前の抗がん療法に対して再発性又は不応性であるがんである。
【0118】
いくつかの実施形態では、がんは、参照により本明細書に組み込まれるＲｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ（２０１７）２２（１２）：１４４４－１４５０に提供されている任意のがん型である。
【0119】
パラフィン包埋試料の精密富化を伴う方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精密富化をベースとする方法から得た試料を使用して行ってもよい。精密富化を伴う方法は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６３／１８９，６０２号に記載されている。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ステップａ）は、ｉ）パラフィン包埋組織中の目的の腫瘍細胞を含む標的領域を特定することと、ｉｉ）パラフィン包埋試料をパラフィン包埋組織から抽出することと、ｉｉｉ）パラフィン包埋組織中のパラフィン包埋試料の場所を特定することと、ｉｖ）パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合う場合、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを試料から抽出することと、を含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合わない場合、ステップｉｉ）及びｉｉｉ）を繰り返す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精密富化をベースとする方法から得た試料を使用して行ってもよい。精密富化を伴う方法は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６３／１８９，６０２号に記載されている。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ステップａ）は、ｉ）パラフィン包埋組織中の目的の腫瘍細胞を含む標的領域を特定することと、ｉｉ）パラフィン包埋試料をパラフィン包埋組織から抽出することと、ｉｉｉ）パラフィン包埋組織中のパラフィン包埋試料の場所を特定することと、ｉｖ）パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合う場合、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを試料から抽出することと、を含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合わない場合、ステップｉｉ）及びｉｉｉ）を繰り返す。
【0120】
本開示のこの様態は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織などの目的の腫瘍細胞を含む組織から核酸を抽出するための方法の開発に少なくとも部分的に基づく。組織は、がんを有することが疑われる又はがんを有することが分かっている対象に由来してもよい。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、試料を抽出した後に組織を分析するステップを含めると、試料を目的の腫瘍細胞について富化することに成功したかどうか、又は更なる試料を組織から抽出すべきかどうかについての情報を得ることができる。例えば、試料と目的の腫瘍細胞との重なり合いの度合を決定するために、試料を抽出した後に、組織のスライドを調製してもよい。こうした組織学的品質保証／品質管理ステップにより、腫瘍内容物富化プロセスの評価が可能になると考えられる。こうした品質保証／品質管理ステップがないと、組織から抽出した試料は、腫瘍純度が低いことを理由に、配列決定分析中に機能しないことがあった。これらの試料は、使用できず、「富化に失敗した可能性」に起因して使い物にならないとみなされた。したがって、本明細書に記載の方法により、以前の富化方法では腫瘍内容物の分析に不十分なレベルの組織しか別様には得られなかったであろう標本の試験が可能になり、富化に失敗した可能性に起因して使い物にならない試料の発生が低減する。腫瘍内容物の富化の成功は、がんの存在を示し、バイオマーカーを測定するために比較的高いレベルの腫瘍内容物を必要とし得る、ある特定のバイオマーカーの評価に特に重要である。したがって、本明細書に記載の方法は、別様には検出可能でなかった可能性のあるバイオマーカーの存在を検出するために使用してもよい。これにより、バイオマーカーの後続の配列決定分析の特異性及び精度が改善されると考えられる。本明細書に記載の方法は、目的の腫瘍細胞、したがって腫瘍内容物、及び腫瘍細胞から得た核酸の精密富化を伴うので、「精密富化」方法と称されてもよい。精密富化を伴う方法は、上記の方法のうちのいずれと組み合わせて使用してもよい。
【0121】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、針を使用してパラフィン包埋試料をパラフィン包埋組織から抽出することを含む。いくつかの実施形態では、針でパラフィン包埋組織を通して穿刺することにより、試料を抽出する。いくつかの実施形態では、針は使い捨て針である。いくつかの実施形態では、針は薄肉針である。いくつかの実施形態では、針は鈍端針である。いくつかの実施形態では、針はステンレス鋼針である。いくつかの実施形態では、針は皮下注射針である。いくつかの実施形態では、針は、Ｌｕｅｒ適合性ハブを備える。いくつかの実施形態では、針は、１３ゲージ針、１４ゲージ針、１５ゲージ針、１６ゲージ針、１７ゲージ針、１８ゲージ針、１９ゲージ針、２０ゲージ針、又は２１ゲージ針である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織から抽出したパラフィン包埋試料は、直径約０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、又は２．３ｍｍである。
【0122】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）を使用してパラフィン包埋試料を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、レーザーブレードを使用してパラフィン包埋試料を抽出することを含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のステップｃ）は、パラフィン包埋組織の切片のスライドを調製することを含む。概して、パラフィン包埋組織の切片のスライドの調製により、パラフィン包埋試料（例えば、上記のように針で抽出したパラフィン包埋試料）を目的の腫瘍細胞について富化することに成功したかどうかの評価が可能になると考えられる。例えば、パラフィン包埋組織の切片のスライドにより、パラフィン包埋試料の位置（例えば、試料を抽出した針穿刺の位置）が目的の腫瘍細胞の位置と重なり合うことが明らかになり得る。パラフィン包埋組織の切片のスライドの例示的な画像を、図４に提供する。図４に示されるように、針穿刺の位置は、パラフィン包埋組織の切片中で目に見える。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織の切片を染色する。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織中で目的の腫瘍細胞を他の細胞と区別するように、パラフィン包埋組織の切片を染色する。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色する。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋組織の切片を、例えば検出可能なように標識した抗体を使用して、免疫染色する。いくつかの実施形態では、検出可能なように標識した抗体は、目的の腫瘍細胞中で発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）を目視検査により行う。例えば、いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、病理学者により行われ、この病理学者が、パラフィン包埋組織の切片のスライドを目視検査し、パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞と重なり合うかどうかを決定する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）をコンピュータシステムにより行う。例えば、いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、コンピュータシステムを使用して行われ、このコンピュータシステムにより、パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞と重なり合うかどうかが評価される。いくつかの実施形態では、ステップｃ）を、画像分析システムを使用して行う。
【0124】
いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料中の目的の腫瘍細胞の富化のレベルは、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％以上である。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料中の目的の腫瘍細胞の富化のレベルは、残りのパラフィン包埋試料中の目的の腫瘍細胞のレベルより少なくとも１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、又は２倍高い。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％以上の目的の腫瘍細胞を含む細胞を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、パラフィン包埋試料を検査することと、任意選択で、余剰組織をパラフィン包埋試料から除去することとを更に含む。
【0126】
ＩＩＩ．脱包埋試料からの分析物の抽出
本明細書の方法は、脱包埋試料からの分析物の抽出を伴う。脱包埋試料が生体試料であるいくつかの実施形態では、分析物は、生体試料から抽出することができるいずれの高分子又は小分子であってもよい。いくつかの実施形態では、分析物は、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子、脂質、多糖、エクソソーム、ミトコンドリア、及び核からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分析物はオルガネラである。いくつかの実施形態では、２個以上の分析物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の分析物を、脱包埋試料から抽出してもよい。
本明細書の方法は、脱包埋試料からの分析物の抽出を伴う。脱包埋試料が生体試料であるいくつかの実施形態では、分析物は、生体試料から抽出することができるいずれの高分子又は小分子であってもよい。いくつかの実施形態では、分析物は、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子、脂質、多糖、エクソソーム、ミトコンドリア、及び核からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分析物はオルガネラである。いくつかの実施形態では、２個以上の分析物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の分析物を、脱包埋試料から抽出してもよい。
【0127】
いくつかの実施形態では、分析物は１つ以上の核酸である。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、分析物はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、分析物はＤＮＡである。
【0128】
脱パラフィンした試料からのＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出
ＲＮＡ優先抽出法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを伴う。特定の実施形態では、ＤＮＡを抽出する前に、ＲＮＡを抽出する。ＤＮＡを抽出する前にＲＮＡを抽出する例示的な方法を、実施例で詳述し、図１及び図３Ａで略図にする。
ＲＮＡ優先抽出法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを伴う。特定の実施形態では、ＤＮＡを抽出する前に、ＲＮＡを抽出する。ＤＮＡを抽出する前にＲＮＡを抽出する例示的な方法を、実施例で詳述し、図１及び図３Ａで略図にする。
【0129】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出する方法は、ステップｂ）の前にパラフィン包埋試料を消化させることを更に含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、又は約６２℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、部分的に消化させる又は完全に消化させる。
【0130】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出する方法は、ステップｂ）の後に、消化させた試料を脱架橋することを更に含む。いくつかの実施形態では、脱架橋することは、消化させた試料を８０～９０℃に加熱することを含む。いくつかの実施形態では、消化させた試料を脱架橋するために、消化させた試料を、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間加熱する。
【0131】
いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ＲＮＡを含む試料溶解物を、消化させたパラフィン包埋試料から収集し、ＲＮＡを、ＲＮＡを含む試料溶解物から精製することを含む。ＲＮＡを含む試料溶解物からＲＮＡを精製する方法は、当該技術分野で既知である。
【0132】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出する方法は、消化させたパラフィン包埋試料を完全に消化させることを更に含む。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼを使用して、完全な消化を行う。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して消化させる。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
【0133】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出する方法は、ＤＮＡを含む試料溶解物を、完全に消化させたパラフィン包埋試料から収集することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡを含む試料溶解物からＤＮＡを精製することを更に含む。ＤＮＡを含む試料溶解物からＤＮＡを精製する方法は、当該技術分野で既知である。
【0134】
ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出する本明細書に記載の方法は、自動化及び／又はハイスループット分析に適している。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出する本明細書に記載の方法は、液体取扱ロボットを使用して行う。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｔｅｃａｎ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの液体取扱ロボットであり、任意選択で、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ、ＢｉｏＴｅｋ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、又はＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの前にＲＮＡを抽出することを、並行して処理した２つ以上の試料について実行する。いくつかの実施形態では、２、４、８、１６、２４、４８、９６個以上の試料を並行して処理する。
【0135】
ＤＮＡ優先抽出法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを伴う。特定の実施形態では、ＲＮＡを抽出する前に、ＤＮＡを抽出する。ＤＮＡを抽出する前にＲＮＡを抽出する例示的な方法を、実施例で詳述し、図１及び図３Ｂで略図にする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを伴う。特定の実施形態では、ＲＮＡを抽出する前に、ＤＮＡを抽出する。ＤＮＡを抽出する前にＲＮＡを抽出する例示的な方法を、実施例で詳述し、図１及び図３Ｂで略図にする。
【0136】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡの前にＤＮＡを抽出する方法は、ステップｂ）の後にパラフィン包埋試料を完全に消化させることを更に含む。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼを使用して、完全な消化を行う。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して消化させる。パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする。
【0137】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡの前にＤＮＡを抽出する方法は、ＤＮＡを、完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、抽出したＤＮＡを精製することを更に含む。抽出したＤＮＡを精製する方法は、当該技術分野で既知である。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡの前にＤＮＡを抽出する方法は、ＲＮＡを、完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、抽出したＲＮＡを精製することを含む。抽出したＲＮＡからＲＮＡを精製する方法は、当該技術分野で既知である。
【0139】
ＲＮＡの前にＤＮＡを抽出する本明細書に記載の方法は、自動化及び／又はハイスループット分析に適している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの前にＤＮＡを抽出する本明細書に記載の方法は、液体取扱ロボットを使用して行う。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｔｅｃａｎ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの液体取扱ロボットであり、任意選択で、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ、ＢｉｏＴｅｋ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、又はＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘである。いくつかの実施形態では、液体取扱ロボットは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの前にＤＮＡを抽出することを、並行して処理した２つ以上の試料について実行する。いくつかの実施形態では、２、４、８、１６、２４、４８、９６個以上の試料を並行して処理する。
【0140】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡをＲＮＡの前に抽出するか、又はＲＮＡをＤＮＡの前に抽出するかに関係なく、本方法は、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量を測定することを更に含む。いくつかの実施形態では、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量は、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇ、約６０ｎｇ、約７０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０μｇ、又は約５０ｍｇである。
【0141】
ＩＶ．脱包埋試料から抽出した分析物の分析
上記のように脱包埋試料から抽出した分析物を更に分析してもよい。本明細書に記載の分析物を分析するのに好適な方法は、当該技術分野で既知である。
上記のように脱包埋試料から抽出した分析物を更に分析してもよい。本明細書に記載の分析物を分析するのに好適な方法は、当該技術分野で既知である。
【0142】
ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの分析
包埋試料から抽出したＤＮＡを分析して、ｉ）点変異、ｉｉ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｉｉｉ）遺伝子内欠失、ｉｖ）遺伝子内挿入、ｖ）遺伝子全体の欠失、ｖｉ）逆位、ｖｉｉ）染色体間転座、ｖｉｉｉ）縦列重複、ｉｘ）遺伝子融合、ｘ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｘｉ）遺伝子増幅若しくは重複、からなる群から選択される体細胞変異を検出することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
包埋試料から抽出したＤＮＡを分析して、ｉ）点変異、ｉｉ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｉｉｉ）遺伝子内欠失、ｉｖ）遺伝子内挿入、ｖ）遺伝子全体の欠失、ｖｉ）逆位、ｖｉｉ）染色体間転座、ｖｉｉｉ）縦列重複、ｉｘ）遺伝子融合、ｘ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｘｉ）遺伝子増幅若しくは重複、からなる群から選択される体細胞変異を検出することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【0143】
いくつかの実施形態では、体細胞変異は、遺伝子中にあり、遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、又はＴＰ５３である。いくつかの実施形態では、体細胞変異は、遺伝子中にあり、この遺伝子は、ＡＢＬ２、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ６、ＬＴＫ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＫ、ＴＮＫＳ２、ＴＯＰ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、又はＷＴ１である。
【0144】
いくつかの実施形態では、本方法は、包埋試料から抽出したＲＮＡを分析して、ｉ）遺伝子融合、ｉｉ）エクソンスキッピング事象、ｉｉｉ）スプライスバリアント、及び／又はｉｖ）改変された遺伝子発現、からなる群から選択される改変を検出することを更に含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析する。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを次世代配列決定により分析する。次世代配列決定の例示的な方法は、例えば、Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：１０２３－１０３１に記載されている。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、図５Ａ～５Ｂで略図にするとおりの方法に従って分析する。
【0146】
いくつかの実施形態では、本方法は、ｅ）任意選択で、１つ以上のアダプターを、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡにライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、ｄ）任意選択で、核酸を、ライゲーションした核酸から増幅することと、ｆ）任意選択で、目的の遺伝子に対応する複数の核酸を捕捉することと、ｇ）配列決定装置によって、複数の核酸を配列決定して、目的の遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、ｈ）複数の配列リードを分析することと、ｉ）分析に基づいて、目的の遺伝子中の１つ以上の変異を検出することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子に対応する複数の核酸は、ベイト分子とのハイブリダイゼーションによって、増幅された核酸から捕捉される。
【0147】
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、当該技術分野で既知の任意の好適な方法、例えば、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）、ＰＣＲ－ＲＦＬＰアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定（例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定又は次世代配列決定）、スクリーニング分析（例えば、スペクトル核型分析を使用する）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ブレークアウェイＦＩＳＨ、スペクトル核型分析、多重ＦＩＳＨ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ＳＳＰ－ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定を使用して検出する。試料を分析して、例えば、核酸分子を検出する方法は、米国特許第９，３４０，８３０号及びＷＯ２０１２／０９２４２６（Ａ１）に記載され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0148】
インサイチュハイブリダイゼーション法
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法などのインサイチュハイブリダイゼーション法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法などのインサイチュハイブリダイゼーション法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＦＩＳＨ分析を使用して、本明細書に記載の変異を生じる染色体再配置を特定する。いくつかの実施形態では、ＦＩＳＨ分析を使用して、本明細書に記載のバイオマーカー核酸を含むＲＮＡ分子を特定する。ＦＩＳＨを行うための方法は、当該技術分野で既知であり、ほぼあらゆるタイプの組織で使用することができる。ＦＩＳＨ分析では、検出可能に標識される、例えば蛍光標識される核酸プローブを、ＤＮＡ、例えば染色体、又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの特定の領域に結合させ、次いで、例えば顕微鏡によって検査する。例えば、米国特許第５，７７６，６８８号を参照されたい。まず、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子をスライド上に固定し、次いで、標識したプローブをＤＮＡ又はＲＮＡ分子にハイブリダイズさせ、次いで、例えば、当該技術分野で既知の酵素結合した標識ベースの検出方法を使用して、可視化を達成する。概して、ＦＩＳＨ分析の分解能は、６０～１０００００ヌクレオチド、例えば、６０塩基対（ｂｐ）から最大１００キロベース対ほどのＤＮＡの検出である。ＦＩＳＨ分析で使用される核酸プローブは、一本鎖核酸を含む。こうしたプローブは、典型的には、少なくとも約５０個のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１００～約５００ヌクレオチドを含む。セントロメアＤＮＡ及び遺伝子座特異的ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズするプローブは、例えば、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）又はＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から市販されている。あるいは、プローブは、染色体若しくはゲノムＤＮＡ又は核酸の他の供給源から、標準的な技法によって非商業的に作製してもよい。プローブ、標識化、及びハイブリダイゼーションの方法の例は、当該技術分野で既知である。
【0150】
ＦＩＳＨ方法のいくつかの変形は、当該技術分野で既知であり、単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨ、Ｆｉｂｅｒ ＦＩＳＨ、Ｑ－ＦＩＳＨ、Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨ、ＭＡ－ＦＩＳＨ、ブレークアウェイＦＩＳＨ、ハイブリッド融合－ＦＩＳＨ、及び多色蛍光（ｍｕｌｔｉ－ｆｌｕｏｒ）ＦＩＳＨ、又はｍＦＩＳＨを含む、本開示の方法に従って使用するのに好適である。いくつかの実施形態では、「ブレークアウェイＦＩＳＨ（ｂｒｅａｋ－ａｗａｙ ＦＩＳＨ）」を本明細書に提供される方法に使用する。ブレークアウェイＦＩＳＨでは、融合接合部又は分断点を標的とする少なくとも１つのプローブと、融合物の個々の遺伝子を例えば遺伝子の１つ以上のエクソン及びイントロンで標的とする少なくとも１つのプローブとを利用する。正常な細胞（すなわち、本明細書に記載の融合核酸分子を有する細胞）では、両方のプローブが観察され（又は遺伝子融合物の２つの遺伝子が近接していることに起因して、２番目の色が観察され）、本明細書に記載の融合核酸分子を有する細胞では、融合核酸分子を生じる再配置の存在に起因して、１つの遺伝子プローブのみが観察される。
【0151】
アレイベースの方法
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法などのアレイベースの方法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。アレイベースのＣＧＨ法では、（例えば、腫瘍由来などの試料由来の）核酸の第１の試料を第１の標識で標識し、一方、（例えば、健康な細胞／組織由来などの対照由来の）核酸の第２の試料を第２の標識で標識する。いくつかの実施形態では、等量のこの２つの試料を、混合し、数千の均一に空間をあけたクローンＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドのＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせ、アレイに三連でスポッティングした。ハイブリダイゼーションの後、デジタル撮像システムを使用して、ハイブリダイズされたフルオロフォアの各々の相対蛍光強度を捕捉し、定量化する。得られた蛍光強度の比は、この２つの試料におけるＤＮＡ配列のコピー数の比に比例する。いくつかの実施形態では、染色体の欠失又は重複が存在する場合、２つの標識からのシグナルの比の差を検出し、この比により、コピー数の尺度が得られる。アレイベースのＣＧＨは、単色標識化により行うこともできる。単色ＣＧＨでは、対照（例えば、健康な細胞／組織由来のものなどの対照核酸試料）を標識し、１つのアレイにハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取り、試験試料（例えば、個体から又は腫瘍から得られた核酸試料）を標識し、第２のアレイ（同一の内容物を有する）にハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取る。コピー数の差は、２つのアレイからの絶対シグナルに基づいて計算される。
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法などのアレイベースの方法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。アレイベースのＣＧＨ法では、（例えば、腫瘍由来などの試料由来の）核酸の第１の試料を第１の標識で標識し、一方、（例えば、健康な細胞／組織由来などの対照由来の）核酸の第２の試料を第２の標識で標識する。いくつかの実施形態では、等量のこの２つの試料を、混合し、数千の均一に空間をあけたクローンＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドのＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせ、アレイに三連でスポッティングした。ハイブリダイゼーションの後、デジタル撮像システムを使用して、ハイブリダイズされたフルオロフォアの各々の相対蛍光強度を捕捉し、定量化する。得られた蛍光強度の比は、この２つの試料におけるＤＮＡ配列のコピー数の比に比例する。いくつかの実施形態では、染色体の欠失又は重複が存在する場合、２つの標識からのシグナルの比の差を検出し、この比により、コピー数の尺度が得られる。アレイベースのＣＧＨは、単色標識化により行うこともできる。単色ＣＧＨでは、対照（例えば、健康な細胞／組織由来のものなどの対照核酸試料）を標識し、１つのアレイにハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取り、試験試料（例えば、個体から又は腫瘍から得られた核酸試料）を標識し、第２のアレイ（同一の内容物を有する）にハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取る。コピー数の差は、２つのアレイからの絶対シグナルに基づいて計算される。
【0152】
増幅ベースの方法
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、増幅ベースの方法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。当該技術分野で既知であるように、こうした増幅ベースの方法では、核酸の試料、例えば、個体又は腫瘍から得た試料は、例えば本明細書で提供される１つ以上のオリゴヌクレオチド又はプライマーなどの１つ以上のオリゴヌクレオチド又はプライマーを使用して、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において、テンプレートとして使用される。試料中の本開示のバイオマーカー核酸分子の存在は、増幅産物の存在又は非存在に基づいて決定することができる。定量的増幅方法も、当該技術分野で既知であり、本明細書で提供される方法に従って使用され得る。定量的ＰＣＲ分析を使用する、マイクロサテライト遺伝子座におけるＤＮＡコピー数の測定方法は、当該技術分野で既知である。遺伝子の既知のヌクレオチド配列は、当業者が遺伝子のいずれかの部分を増幅するためにプライマーを日常的に選択することを可能にするのに事足りる。蛍光原性定量的ＰＣＲも使用することができる。蛍光原性定量的ＰＣＲでは、定量化は、例えば、ＴａｑＭａｎ及びＳｙｂｒグリーンなどの蛍光シグナルの量に基づく。
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、増幅ベースの方法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。当該技術分野で既知であるように、こうした増幅ベースの方法では、核酸の試料、例えば、個体又は腫瘍から得た試料は、例えば本明細書で提供される１つ以上のオリゴヌクレオチド又はプライマーなどの１つ以上のオリゴヌクレオチド又はプライマーを使用して、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において、テンプレートとして使用される。試料中の本開示のバイオマーカー核酸分子の存在は、増幅産物の存在又は非存在に基づいて決定することができる。定量的増幅方法も、当該技術分野で既知であり、本明細書で提供される方法に従って使用され得る。定量的ＰＣＲ分析を使用する、マイクロサテライト遺伝子座におけるＤＮＡコピー数の測定方法は、当該技術分野で既知である。遺伝子の既知のヌクレオチド配列は、当業者が遺伝子のいずれかの部分を増幅するためにプライマーを日常的に選択することを可能にするのに事足りる。蛍光原性定量的ＰＣＲも使用することができる。蛍光原性定量的ＰＣＲでは、定量化は、例えば、ＴａｑＭａｎ及びＳｙｂｒグリーンなどの蛍光シグナルの量に基づく。
【0153】
本明細書で提供される方法に従って使用するのに好適な他の増幅方法としては、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製、ドットＰＣＲ、及びリンカーアダプターＰＣＲが挙げられる。
【0154】
配列決定
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、配列決定法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。当該技術分野で既知の配列決定のいずれかの方法を使用して、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出することができる。本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出するために使用してもよい例示的な配列決定法には、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ又はＳａｎｇｅｒによって開発された技法に基づくものが含まれる。例えば、質量分析による配列決定を含む、自動配列決定手順も使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、配列決定法を使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。当該技術分野で既知の配列決定のいずれかの方法を使用して、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出することができる。本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出するために使用してもよい例示的な配列決定法には、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ又はＳａｎｇｅｒによって開発された技法に基づくものが含まれる。例えば、質量分析による配列決定を含む、自動配列決定手順も使用することができる。
【0155】
いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、ハイブリッド捕捉ベースの配列決定（ハイブリッド捕捉ベースのＮＧＳ）を使用して、例えば、アダプターライゲーションベースのライブラリを使用して、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出する。例えば、Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：１０２３－１０３１を参照されたい。いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカー核酸分子を、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して決定する。次世代配列決定は、個々の核酸分子、又は高度に並行な様式で（例えば、１０５個より多い分子が同時に配列決定され得る）個々の核酸分子のためのクローン的に増殖させたプロキシのいずれかのヌクレオチド配列を決定する任意の配列決定法を含む。本明細書に提供される発明に従って使用するのに好適な次世代配列決定方法は、当該技術分野で既知であり、限定されないが、大規模並列処理ショートリード配列決定、テンプレートベースの配列決定、パイロシーケンシング、ＤＮＡ合成中に色素標識ヌクレオチドの連続組み込みの撮像を含むリアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノトランジスタアレイベースの配列決定、ポロニー配列決定、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）ベースの配列決定、又はナノワイヤ分子センサベースの配列決定を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：３１－４６を参照されたい。本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出するために使用してもよい例示的なＮＧＳ法及びプラットフォームとしては、限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ．，ＵＳＡ）製のＨｅｌｉＳｃｏｐｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＰａｃＢｉｏ ＲＳシステム、Ｓｏｌｅｘａシーケンサーなどの大規模並列処理ショートリード配列決定、及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）製の他の方法及びプラットフォーム、４５４ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）製の４５４配列決定、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）製のＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定、又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＳＯＬｉＤシーケンサーが挙げられる。本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出するために使用してもよい追加の例示的な方法及びプラットフォームとしては、限定されないが、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、ＣＨＥ）製のＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）ＦＬＸ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇ．００７ポロネーターシステム、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＨｉＳｅｑ ２５００、ＨｉＳｅｑ３０００、ＨｉＳｅｑ ４０００、及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＮｏｖａＳｅｑ ６０００プラットフォームが挙げられる。
【0156】
いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡから抽出した１つ以上の核酸を次世代配列決定により分析する。いくつかの実施形態では、本方法は、ｅ）任意選択で、１つ以上のアダプターを、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡにライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、ｄ）任意選択で、核酸を、ライゲーションした核酸から増幅することと、ｆ）任意選択で、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を捕捉することと、ｇ）配列決定装置によって、複数の核酸を配列決定して、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、ｈ）複数の配列リードを分析することと、ｉ）分析に基づいて、目的の遺伝子中の１つ以上の変異を検出することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、ステップｅ）の前に、試料から抽出した１つ以上の核酸を断片化し、任意選択で、試料から抽出した１つ以上の核酸を超音波処理により断片化する。いくつかの実施形態では、断片化した、試料から抽出した１つ以上の核酸を、末端修復する。いくつかの実施形態では、末端修復し断片化した、試料から抽出した１つ以上の核酸は、ｄＡテール状又はｄＴテール状である。いくつかの実施形態では、試料から抽出した１つ以上の核酸を、Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：１０２３－１０３１に記載されている方法に従って、配列決定のために調製する。
【0157】
バイオマーカー検出
いくつかの態様では、本明細書に記載されるように、本開示のバイオマーカー核酸分子又はその断片を、例えば、脱包埋試料から抽出した核酸（すなわち、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）中で検出するための試薬が本明細書に提供される。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるように、本開示のバイオマーカー核酸分子又はその断片を、例えば、脱包埋試料から抽出した核酸（すなわち、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）中で検出するための試薬が本明細書に提供される。
【0158】
概して、がんのバイオマーカーなどの核酸バイオマーカーの存在を決定するために、本明細書に記載の方法により脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を分析してもよい。特定の核酸バイオマーカーの存在を決定するための方法は、例えば、各々全体が参照組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０２１／０９６８８８号、米国特許第９，８８４，０６０号、米国特許第９，２９７，０１１号、米国特許第１０，０００，８１４号、米国特許第８，６７３，９７２号、米国特許第９，４１０，９５４号、米国特許第９，９０７，７９８号、米国特許公開第２０１６／０００９７８５（Ａ１）号、米国特許公開第２０２０／０２９９７７５（Ａ１）号、米国特許第１０，９８０，８０４号、米国特許第９，８６１，６３３号、米国特許公開第２０１８／０３６３０６６（Ａ１）号、米国特許公開第２０１７／０３５６０５３（Ａ１）号、米国特許公開第２０１９／００８５４０３（Ａ１）号、米国特許公開第２０１９／０２１９５８６（Ａ１）号、国際公開第ＷＯ２０２０／２４３０２１号、国際公開第ＷＯ２０２１／０４２０６６号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２０７５２号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９９８２号、国際公開第ＷＯ２０１８００９９３９号、米国仮特許出願第６３／１２９，２８６号、米国仮特許出願第６３／１３２，０８５号、米国仮特許出願第６３／１４３，６１９号、米国仮特許出願第６３／１７１，４２３号、米国仮特許出願第６３／１２２，４３１号、米国仮特許出願第６３／２１５，２８１号、米国仮特許出願第６３／１４８，１１６号、米国仮特許出願第６３／１８９，０２５号、米国仮特許出願第６３／１８８，７１９号、及び米国仮特許出願第６３／２１５，３５６号に記載されている。
【0159】
更に、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出され得る例示的な核酸バイオマーカーには、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のＬＯＨ（ＨＬＡ ＬＯＨ）、ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）遺伝子の機能喪失（ＰＴＥＮ ＬＯＦ）、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）、並びにホモ接合性単一エクソン喪失が含まれ、これらは以下で詳述する。
【0160】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される検出試薬は、標的核酸分子、例えば、本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子又はその断片若しくは一部分を含む核酸上のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を含む。本開示のバイオマーカー核酸分子の検出に好適なベイトが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ベイトは、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子又はその断片若しくは一部分を含む標的核酸分子にハイブリダイズするように構成された捕捉核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、捕捉核酸分子は、標的核酸分子のバイオマーカー核酸分子にハイブリダイズするように構成される。本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の検出に好適なプローブ、例えば、核酸分子も、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるプローブは、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子又はその断片若しくは一部分を含む標的核酸分子にハイブリダイズするように構成された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的核酸分子のバイオマーカー核酸分子又はその断片若しくは一部分にハイブリダイズするように構成された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的核酸分子のバイオマーカー核酸分子の断片又は一部分にハイブリダイズするように構成された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、断片又はその一部分は、約５～約２５ヌクレオチド、約５～約３００ヌクレオチド、約１００～約３００ヌクレオチド、約１３０～約２３０ヌクレオチド、又は約１５０～約２００ヌクレオチドを含む。
【0161】
１つ以上の目的の遺伝子、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、１つ以上の目的の遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のＬＯＨを脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨを検出する例示的な方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９９８２号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、１つ以上の目的の遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のＬＯＨを脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨを検出する例示的な方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９９８２号に記載されている。
【0162】
他の実施形態では、目的の遺伝子は、ＳＴ７／ＲＡＹ１、ＡＲＨ１／ＮＯＥＹ２、ＴＳＬＣ１、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＤＣＣ、ＴＰ５３、ＡＴＭ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ＮＡＴ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＯＧＧ１、ＣＤＨ１、ＩＧＦ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／Ｐ５７、ＭＥＮ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、Ｈ１９、ＫＲＡＳ、ＢＡＰ１、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＵＦＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＰＰ６Ｃ、ＬＡＴＳ１、ＣＡＳＰ８、ＰＴＰＮ１４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＢＸＷ７、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮ－α、嗅覚受容体遺伝子、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＤＵＴＴ１、ＦＨＩＴ、ＡＰＣ、Ｐ１６、ＦＣＭＤ、ＴＳＣ２、ｍｉＲ－３４、ｃ－ＭＰＬ、ＲＵＮＸ３、ＤＩＲＡＳ３、ＮＲＡＳ、ｍｉＲ－９、ＦＡＭ５０Ｂ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＲ、ＦＬＴ３、ＺＤＢＦ２、ＧＰＲ１、ｃ－ＫＩＴ、ＮＡＰ１Ｌ５、ＧＲＢ１０、ＥＧＦＲ、ＰＥＧ１０、ＢＲＡＦ、ＭＥＳＴ、ＪＡＫ２、ＤＡＰＫ１、ＬＩＴ１、ＷＴ１、ＮＦ－１、ＰＲ、ｃ－ＣＢＬ、ＤＬＫ１、ＡＫＴ１、ＳＮＵＲＦ、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）、ＺＮＦ５８７、ＳＯＣＳ１、ＴＩＭＰ２、ＲＵＮＸ１、ＡＲ、ＣＥＢＰＡ、Ｃ１９ＭＣ、ＥＭＰ３、ＺＮＦ３３１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＥＧ３、ＮＮＡＴ、ＧＮＡＳ、又はＧＡＴＡ５である。
【0163】
いくつかの実施形態では、上記の方法のうちのいずれか１つは、本明細書に記載されるように、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを更に含む。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ分子をコードする。いくつかの実施形態では、本方法は、調整したアレル頻度を決定した後、調整したアレル頻度に少なくとも部分的に基づいて、遺伝子がヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を受けたと決定することを更に含む。
【0164】
更にいくつかの他の態様では、本明細書に記載されるように、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出するための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）ＨＬＡアレルについて観察されたアレル頻度を取得することであって、観察されたアレル頻度が、ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の配列リード間で検出されたＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸の頻度に対応し、複数の配列リードが、ベイト分子とのハイブリダイゼーションによって捕捉された遺伝子又はその一部分をコードする核酸を配列決定することによって得られた、取得することと、ｂ）ＨＬＡアレルのベイト分子に対する相対的な結合傾向を取得することであって、ＨＬＡアレルの相対的な結合傾向が、１つ以上の他のＨＬＡアレルの一部分をコードする核酸の存在下、ＨＬＡアレルの少なくとも一部分をコードする核酸がベイト分子に結合する傾向に対応する、取得することと、ｃ）目的関数を適用して、ＨＬＡアレルの相対的な結合傾向と観察されたアレル頻度との間の差を測定することと、ｄ）最適化モデルを適用して、目的関数を最小化することと、ｅ）最適化モデル及び観察されたアレル頻度に基づいて、ＨＬＡアレルの調整したアレル頻度を決定することと、ｆ）ＨＬＡアレルの調整したアレル頻度が所定の閾値よりも小さい場合、ＬＯＨが発生したと決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。いくつかの実施形態では、複数の配列リードを、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡから取得した核酸を配列決定すすることにより取得した。いくつかの実施形態では、本方法は、目的の多型遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出するためのものである。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）目的の遺伝子のアレルについて観察されたアレル頻度を取得することであって、観察されたアレル頻度が、遺伝子に対応する複数の配列リード間で検出されたアレルの少なくとも一部分をコードする核酸の頻度に対応し、複数の配列リードが、ベイト分子とのハイブリダイゼーションによって捕捉された遺伝子又はその一部分をコードする核酸を配列決定することによって得られた、取得することと、ｂ）アレルのベイト分子に対する相対的な結合傾向を取得することであって、アレルの相対的な結合傾向が、１つ以上の他のアレルの一部をコードする核酸の存在下、アレルの少なくとも一部分をコードする核酸がベイト分子に結合する傾向に対応する、取得することと、ｃ）目的関数を適用して、アレルの相対的な結合傾向と観察されたアレル頻度との間の差を測定することと、ｄ）最適化モデルを適用して、目的関数を最小化することと、ｅ）最適化モデル及び観察されたアレル頻度に基づいて、アレルの調整したアレル頻度を決定することと、ｆ）アレルの調整したアレル頻度が所定の閾値よりも小さい場合、ＬＯＨが発生したと決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、多型遺伝子は、ＳＴ７／ＲＡＹ１、ＡＲＨ１／ＮＯＥＹ２、ＴＳＬＣ１、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＤＣＣ、ＴＰ５３、ＡＴＭ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ＮＡＴ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＯＧＧ１、ＣＤＨ１、ＩＧＦ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／Ｐ５７、ＭＥＮ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、Ｈ１９、ＫＲＡＳ、ＢＡＰ１、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＵＦＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＰＰ６Ｃ、ＬＡＴＳ１、ＣＡＳＰ８、ＰＴＰＮ１４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＢＸＷ７、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮ－α、嗅覚受容体遺伝子、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＤＵＴＴ１、ＦＨＩＴ、ＡＰＣ、Ｐ１６、ＦＣＭＤ、ＴＳＣ２、ｍｉＲ－３４、ｃ－ＭＰＬ、ＲＵＮＸ３、ＤＩＲＡＳ３、ＮＲＡＳ、ｍｉＲ－９、ＦＡＭ５０Ｂ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＲ、ＦＬＴ３、ＺＤＢＦ２、ＧＰＲ１、ｃ－ＫＩＴ、ＮＡＰ１Ｌ５、ＧＲＢ１０、ＥＧＦＲ、ＰＥＧ１０、ＢＲＡＦ、ＭＥＳＴ、ＪＡＫ２、ＤＡＰＫ１、ＬＩＴ１、ＷＴ１、ＮＦ－１、ＰＲ、ｃ－ＣＢＬ、ＤＬＫ１、ＡＫＴ１、ＳＮＵＲＦ、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）、ＺＮＦ５８７、ＳＯＣＳ１、ＴＩＭＰ２、ＲＵＮＸ１、ＡＲ、ＣＥＢＰＡ、Ｃ１９ＭＣ、ＥＭＰ３、ＺＮＦ３３１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＥＧ３、ＮＮＡＴ、ＧＮＡＳ、又はＧＡＴＡ５である。
【0165】
更に別の態様では、本開示の方法のうちのいずれかは、ＴＭＢを、例えば、本明細書に記載されるように、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で測定することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＬＯＨを決定し、ＴＭＢを、例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で評価することを含む。本明細書で示されるように、ＨＬＡ ＬＯＨ及び高ＴＭＢ（及び任意選択でインタクトのＨＬＡ遺伝子）は、例えば、高ＴＭＢを有しないＨＬＡ ＬＯＨと比較した場合、全生存期間の増加、より高い生存確率の増加、及び／又はＩＣＩ療法に対して応答する可能性の増加を予測するものであり得る。いくつかの実施形態では、高ＴＭＢは、１０変異／Ｍｂ以上又は１３変異／Ｍｂ以上のＴＭＢを指す。いくつかの実施形態では、ＴＭＢは、複数の配列リード、例えば、ゲノムの少なくとも一部分（富化した試料又は富化していない試料由来など）の核酸を配列決定することによって取得した複数の配列リードから取得される。いくつかの実施形態では、ＴＭＢは、配列決定したゲノムの１メガベース当たりの非ドライバー体細胞性コード変異の数に基づいて決定される。
【0166】
いくつかの実施形態では、本開示の方法のうちのいずれかは、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの知識（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の）を得ること、及びＴＭＢの知識（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法のうちのいずれかは、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨを（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で）検出すること、及びＴＭＢの知識（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法のうちのいずれかは、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの知識（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の）を得ること、及びＴＭＢを（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で）検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法のうちのいずれかは、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨを（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で）検出すること、及びＴＭＢを（例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で）検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＬＯＨ及びＴＭＢを検出／決定するために使用する試料は同じである。いくつかの実施形態では、ＬＯＨ及びＴＭＢを検出／決定するために使用する試料は異なる。
【0167】
ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）
１０番染色体で欠失しているホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）は、がんにおいて最も頻繁に破壊されている腫瘍抑制因子のうちの１つである。ＰＴＥＮの脂質ホスファターゼ活性は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路に拮抗して、腫瘍細胞の成長及び生存を抑制する。したがって、ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異は、がんのためのバイオマーカーとして機能し得る。
１０番染色体で欠失しているホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）は、がんにおいて最も頻繁に破壊されている腫瘍抑制因子のうちの１つである。ＰＴＥＮの脂質ホスファターゼ活性は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路に拮抗して、腫瘍細胞の成長及び生存を抑制する。したがって、ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異は、がんのためのバイオマーカーとして機能し得る。
【0168】
いくつかの実施形態では、ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）遺伝子中の機能喪失型変異を、本明細書に記載されるように脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、若しくは置換、ゲノム再編成、プロモーター中の改変、遺伝子融合、又はコピー数改変のうちの１つ以上を含む。
【0169】
腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）のレベルを、本明細書に記載されるように脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で測定することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有するという知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有するという知識を得ることは、腫瘍変異負荷のレベルを、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で測定することを含み、包埋試料は個体から得たものであった。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有するという知識に応じて、有効量の免疫療法を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、レポートを関係者に提供することを含む。
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）のレベルを、本明細書に記載されるように脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で測定することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有するという知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有するという知識を得ることは、腫瘍変異負荷のレベルを、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、例えば、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で測定することを含み、包埋試料は個体から得たものであった。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂ又は少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有するという知識に応じて、有効量の免疫療法を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、レポートを関係者に提供することを含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、個体から得た脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で評価する。いくつかの実施形態では、個体由来の試料は、腫瘍生検を含む。いくつかの実施形態では、個体由来の包埋試料は、核酸を含む。
【0171】
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して評価する。例えば、腫瘍変異負荷を、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、次世代配列決定、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、遺伝子ターゲット配列決定、又は遺伝子のパネル、例えば、がん関連遺伝子を含むパネルの配列決定を使用して測定してもよい。例えば、Ｍｅｌｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１８）７（６）：６６１－６６７を参照されたい。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、遺伝子を標的とした配列決定を使用して、例えば、核酸ハイブリダイゼーション捕捉方法を、例えば配列決定と組み合わせて使用して、測定する。例えば、Ｆａｎｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）７：１８３を参照されたい。
【0172】
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１５１５２４（Ａ１）に提供される方法に従って測定する。
【0173】
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定により測定する。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、次世代配列決定を使用して測定する。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全ゲノム配列決定を使用して測定する。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、遺伝子標的化配列決定により測定する。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、約０．８Ｍｂ～約１．１Ｍｂの配列決定したＤＮＡに対して測定する。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、約０．８Ｍｂ、約０．８１Ｍｂ、約０．８２Ｍｂ、約０．８３Ｍｂ、約０．８４Ｍｂ、約０．８５Ｍｂ、約０．８６Ｍｂ、約０．８７Ｍｂ、約０．８８Ｍｂ、約０．８９Ｍｂ、約０．９Ｍｂ、約０．９１Ｍｂ、約０．９２Ｍｂ、約０．９３Ｍｂ、約０．９４Ｍｂ、約０．９５Ｍｂ、約０．９６Ｍｂ、約０．９７Ｍｂ、約０．９８Ｍｂ、約０．９９Ｍｂ、約１Ｍｂ、約１．０１Ｍｂ、約１．０２Ｍｂ、約１．０３Ｍｂ、約１．０４Ｍｂ、約１．０５Ｍｂ、約１．０６Ｍｂ、約１．０７Ｍｂ、約１．０８Ｍｂ、約１．０９Ｍｂ、又は約１．１Ｍｂのうちのいずれかの配列決定したＤＮＡに対して測定する。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を、約０．８Ｍｂの配列決定したＤＮＡに対して測定する。
【0174】
いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、例えば少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂの、高い腫瘍変異負荷を有する。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、少なくとも約１０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有する。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、少なくとも約２０ｍｕｔ／Ｍｂの腫瘍変異負荷を有する。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、約１０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１５ｍｕｔ／Ｍｂ、約１５ｍｕｔ／Ｍｂ～約２０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２５ｍｕｔ／Ｍｂ、約２５ｍｕｔ／Ｍｂ～約３０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３５ｍｕｔ／Ｍｂ、約３５ｍｕｔ／Ｍｂ～約４０ｍｕｔ／Ｍｂ、約４０ｍｕｔ／Ｍｂ～約４５ｍｕｔ／Ｍｂ、約４５ｍｕｔ／Ｍｂ～約５０ｍｕｔ／Ｍｂ、約５０ｍｕｔ／Ｍｂ～約５５ｍｕｔ／Ｍｂ、約５５ｍｕｔ／Ｍｂ～約６０ｍｕｔ／Ｍｂ、約６０ｍｕｔ／Ｍｂ～約６５ｍｕｔ／Ｍｂ、約６５ｍｕｔ／Ｍｂ～約７０ｍｕｔ／Ｍｂ、約７０ｍｕｔ／Ｍｂ～約７５ｍｕｔ／Ｍｂ、約７５ｍｕｔ／Ｍｂ～約８０ｍｕｔ／Ｍｂ、約８０ｍｕｔ／Ｍｂ～約８５ｍｕｔ／Ｍｂ、約８５ｍｕｔ／Ｍｂ～約９０ｍｕｔ／Ｍｂ、約９０ｍｕｔ／Ｍｂ～約９５ｍｕｔ／Ｍｂ、又は約９５ｍｕｔ／Ｍｂ～約１００ｍｕｔ／Ｍｂのうちのいずれかの腫瘍変異負荷を有する。いくつかの実施形態では、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、約１００ｍｕｔ／Ｍｂ～約１１０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１１０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１２０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１２０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１３０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１３０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１４０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１４０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１５０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１５０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１６０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１６０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１７０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１７０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１８０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１８０ｍｕｔ／Ｍｂ～約１９０ｍｕｔ／Ｍｂ、約１９０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２００ｍｕｔ／Ｍｂ、約２１０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２２０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２２０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２３０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２３０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２４０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２４０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２５０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２５０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２６０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２６０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２７０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２７０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２８０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２８０ｍｕｔ／Ｍｂ～約２９０ｍｕｔ／Ｍｂ、約２９０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３００ｍｕｔ／Ｍｂ、約３００ｍｕｔ／Ｍｂ～約３１０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３１０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３２０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３２０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３３０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３３０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３４０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３４０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３５０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３５０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３６０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３６０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３７０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３７０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３８０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３８０ｍｕｔ／Ｍｂ～約３９０ｍｕｔ／Ｍｂ、約３９０ｍｕｔ／Ｍｂ～約４００ｍｕｔ／Ｍｂ、又は４００ｍｕｔ／Ｍｂより大きいうちのいずれかの腫瘍変異負荷を有する。
【0175】
いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を測定することは、変異を、個体中のがんから誘導した脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で評価することを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍変異負荷を測定することは、変異を、個体中のがんから誘導した脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ、並びに対応させた正常な試料、例えば、がんを含まない組織又は他の供給源から誘導した個体からの脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で評価することを含む。
【0176】
ホモ接合性単一エクソン喪失
概して、ホモ接合性単一エクソン喪失は、所与のエクソンの両コピーの欠失を指す。いくつかの実施形態では、ホモ接合性単一エクソン喪失を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ホモ接合性単一エクソン喪失を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定によって検出する。
概して、ホモ接合性単一エクソン喪失は、所与のエクソンの両コピーの欠失を指す。いくつかの実施形態では、ホモ接合性単一エクソン喪失を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で検出することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ホモ接合性単一エクソン喪失を、脱包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定によって検出する。
【0177】
システム、ソフトウェア、及びデバイス
いくつかの他の態様では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体は、デバイスの１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムを含み、１つ以上のプログラムが、１つ以上のプロセッサによって実行された場合、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる方法をデバイスに実行させる命令を含む。
いくつかの他の態様では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体は、デバイスの１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムを含み、１つ以上のプログラムが、１つ以上のプロセッサによって実行された場合、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる方法をデバイスに実行させる命令を含む。
【0178】
図６は、一実施形態によるコンピューティングデバイスの例を図示する。デバイス１１００は、ネットワークに接続されたホストコンピュータとし得る。デバイス１１００は、クライアントコンピュータ又はサーバとし得る。図６に示されるように、デバイス１１００は、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバ、又はハンドヘルド計算デバイス（携帯電子デバイス、例えば、電話又はタブレット）などの任意の好適なタイプのマイクロプロセッサベースのデバイスであり得る。デバイスは、例えば、プロセッサ１１１０、入力デバイス１１２０、出力デバイス１１３０、ストレージ１１４０、通信デバイス１１６０、電源１１７０、オペレーションシステム１１８０、及びシステムバス１１９０のうちの１つ以上を備えていてもよい。入力デバイス１１２０及び出力デバイス１１３０は、概して、本明細書に記載のものに対応していてもよく、コンピュータと接続可能であってもよく、又はコンピュータと一体化していてもよい。
【0179】
入力デバイス１１２０は、タッチスクリーン、キーボード若しくはキーパッド、マウス、又は音声認識デバイスなどの入力を提供する任意の好適なデバイスであってもよい。出力デバイス１１３０は、タッチスクリーン、触覚デバイス、又はスピーカなど、出力を提供する任意の好適なデバイスであってもよい。
【0180】
ストレージ１１４０は、ストレージ（例えば、ＲＡＭ（揮発性及び不揮発性）、キャッシュ、ハードドライブ、又はリムーバブルストレージディスクを含む、電気的、磁気的、又は光学的メモリ）を提供する任意の好適なデバイスであり得る。通信デバイス１１６０は、ネットワークインターフェースチップ又はデバイスなどのネットワークを介してシグナルを送受信し得る任意の好適なデバイスを含み得る。コンピュータの構成要素は、例えば、有線メディア（例えば、物理バス、イーサネット、若しくは任意の他の有線転送技術）を介して、又は無線（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、又は任意の他の無線技術）で、任意の好適な様式で接続することができる。例えば、図６では、構成要素は、システムバス１１９０によって接続される。
【0181】
検出モジュール１１５０は、ストレージ１１４０に実行可能な命令として格納され、プロセッサ１１１０によって実行されることができ、例えば、本開示の機能を具現化するプロセスを含むことができる（例えば、上記のデバイスに具現化される）。
【0182】
検出モジュール１１５０はまた、命令実行システム、装置、若しくはデバイス（例えば、本明細書に記載のもの）によって、又はそれらと接続して使用するための任意の非一時的コンピュータ可読記憶媒体内に記憶及び／又は転送することができ、命令実行システム、装置、若しくはデバイスからの、ソフトウェアに関連付けられた命令をフェッチし、命令を実行することができる。本開示の文脈において、コンピュータ可読記憶媒体は、ストレージ１１４０などの任意の媒体であり得、命令実行システム、装置、若しくはデバイスによって、又はそれらと接続して使用するためのプロセスを含む若しくは記憶することができる。コンピュータ可読記憶媒体の例としては、単一の機能ユニットとして動作するハードドライブ、フラッシュドライブ、及び配信モジュールなどのメモリユニットを挙げることができる。また、本明細書に記載の様々なプロセスは、上記の実施形態及び技法に従って動作するように構成されたモジュールとして具現化され得る。更に、プロセスは別個に示され、かつ／又は説明され得るが、当業者は、上記のプロセスが他のプロセス内のルーチン又はモジュールであり得ることを理解するであろう。
【0183】
検出モジュール１１５０はまた、命令実行システム、装置、若しくはデバイス（例えば、上記のもの）によって、又はそれらと接続して使用するための任意の伝送媒体内に伝播することができ、命令実行システム、装置、若しくはデバイスからの、ソフトウェアに関連付けられた命令をフェッチし、命令を実行することができる。本開示の文脈において、伝送媒体は、任意の媒体とし得、命令実行システム、装置、若しくはデバイスによって、又はそれらと接続して使用するための伝送プログラミングを通信、伝播、又は伝送し得る。伝送可読媒体は、電子、磁気、光学、電磁気、若しくは赤外線の有線又は無線伝播媒体を含み得るが、これらに限定されない。
【0184】
デバイス１１００は、任意の好適なタイプの相互接続された通信システムであり得る、ネットワーク（例えば、図７に示す、及び／又は以下に記載する、ネットワーク１２０４）に接続されてもよい。ネットワークは、任意の好適な通信プロトコルを実装し得、任意の好適なセキュリティプロトコルによって保護され得る。ネットワークは、無線ネットワーク接続（Ｔ１若しくはＴ３回線）、ケーブルネットワーク、ＤＳＬ、又は電話回線などの、ネットワークシグナルの送受信を実装し得る任意の好適な配置のネットワークリンクを含み得る。
【0185】
デバイス１１００は、ネットワーク上で動作するのに好適な任意のオペレーティングシステム（例えば、オペレーティングシステム１１８０）を実装することができる。検出モジュール１１５０は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ、又はＰｙｔｈｏｎなどの任意の好適なプログラミング言語で書くことができる。様々な実施形態では、本開示の機能を具現化するアプリケーションソフトウェアは、異なる構成で（例えば、クライアント／サーバ配置で、又はウェブベースのアプリケーション若しくはウェブサービスとしてのウェブブラウザを介して）展開され得る。いくつかの実施形態では、オペレーティングシステム１１８０は、１つ以上のプロセッサ、例えば、プロセッサ１１１０によって実行される。
【0186】
デバイス１１００は、電源１１７０を更に備えていてもよく、任意の好適な電源であり得る。
【0187】
図７は、一実施形態によるコンピューティングシステムの例を例示する。システム１２００では、デバイス１１００（例えば、上に記載し、図６に図示する）は、ネットワーク１２０４に接続され、これはまた、デバイス１２０６にも接続されている。いくつかの実施形態では、デバイス１２０６は、配列決定装置である。例示的な配列決定装置は、限定されないが、Ｒｏｃｈｅ／４５４のＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）ＦＬＸ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ ２５００、ＨｉＳｅｑ ３０００、ＨｉＳｅｑ ４０００、及びＮｏｖａＳｅｑ ６０００配列決定システム、Ｌｉｆｅ／ＡＰＧのＳｕｐｐｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システム、ＰｏｌｏｎａｔｏｒのＧ．００７システム、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉＳｃｏｐｅ Ｇｅｎｅ配列決定システム、又はＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰａｃＢｉｏ ＲＳシステムを含み得る。デバイス１１００とデバイス１２０６とは、例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、仮想プライベートネットワーク（ＶＰＮ）、又はインターネットなどのネットワーク１２０４を介して、好適な通信インターフェースを使用して通信してもよい。いくつかの実施形態では、ネットワーク１２０４は、例えば、インターネット、イントラネット、仮想プライベートネットワーク、クラウドネットワーク、有線ネットワーク、又は無線ネットワークであり得る。デバイス１１００とデバイス１２０６とは、イーサネット、ＩＥＥＥ８０２．１１ｂ無線などの無線又は有線通信を介して、部分的又は全体的に通信することができる。加えて、デバイス１１００及びデバイス１２０６は、例えば、好適な通信インターフェースを使用して、モバイル／セルラーネットワークなどの第２のネットワークを介して通信することができる。デバイス１１００と１２０６との間の通信は、メールサーバ、モバイルサーバ、メディアサーバ、電話サーバなどの様々なサーバを更に含むか、それらと通信することができる。いくつかの実施形態では、デバイス１１００とデバイス１２０６とは、（ネットワーク１２０４を介した通信の代わりに、又はそれに加えて）、例えば、イーサネット、ＩＥＥＥ８０２．１１ｂ無線などの無線又は有線通信を介して、直接通信することができる。いくつかの実施形態では、デバイス１１００とデバイス１２０６とは、直接接続とすることができるか、又はネットワーク（例えば、ネットワーク１２０４）を介して発生することができる通信１２０８を介して通信する。
【0188】
デバイス１１００及び１２０６の１つ又は全ては、概して、本明細書に記載の様々な実施例に従って、ネットワーク１２０４を介して情報を提供及び／又は受信するために、ロジック（例えば、ｈｔｔｐウェブサーバロジック）を含むか、あるいはローカル若しくはリモートデータベース又はデータ及びコンテンツの他のソースからアクセスされるデータをフォーマットするようにプログラムされる。
【0189】
図８は、いくつかの実施形態に従う、包埋試料から抽出した分析物試料中で検出するための例示的なプロセス１３００を図示する。プロセス１３００は、例えば、ソフトウェアプログラムを実装する１つ以上の電子デバイスを使用して実行される。いくつかの例では、プロセス１３００は、クライアント－サーバシステムを使用して実施され、プロセス１３００のブロックは、サーバとクライアントデバイスとの間で、任意の方法で分割される。他の例では、プロセス１３００のブロックは、サーバと複数のクライアントデバイスとの間で分割される。したがって、プロセス１３００の一部は、クライアント－サーバシステムの特定のデバイスによって実施されるものとして本明細書に記載されているが、プロセス１３００はそのように限定されないことを理解されたい。いくつかの実施形態では、実行されるステップは、多くのシステムを介して、例えば、クラウド環境で実行され得る。他の例では、プロセス１３００は、クライアントデバイスのみ、又は複数のクライアントデバイスのみを使用して実施される。プロセス１３００では、いくつかのブロックが、任意選択で結合され、いくつかのブロックの順序が、任意選択で変更され、いくつかのブロックが、任意選択で省略される。いくつかの例では、プロセス１３００と組み合わせて追加のステップを実施することができる。したがって、図示されている（及び以下により詳細に説明されている）動作は、本質的に例示的なものであり、したがって、限定するものとみなされるべきではない。
【0190】
ブロック１３０２で、１つ以上の核酸の複数の配列リードを取得し、この１つ以上の核酸は、個体から得た脱包埋試料から誘導する。いくつかの実施形態では、試料は、がん（例えば、本明細書に記載のがん）を有する個体から取得する。いくつかの実施形態では、配列リードは、配列決定装置（例えば、本明細書に記載されるか、又は当該技術分野で既知のその他のもの）を使用して取得する。いくつかの実施形態では、核酸は、本開示のバイオマーカーに対応する１つ以上の核酸、又はその一部分を含む。任意選択で、配列リードを取得する前に、試料を精製し、濃縮し（例えば、本開示のバイオマーカーに対応する核酸、又はその一部分について）、かつ／又はＰＣＲ増幅を行う。ブロック１３０４では、例示的なシステム（例えば、１つ以上の電子デバイス）は、バイオマーカー又はその一部分中の１つ以上の変異の存在について、複数の配列リードを分析する。ブロック１３０６で、システムは、（例えば、分析に基づいて）バイオマーカー又はその一部分中の１つ以上の変異を試料中で検出する。
Ｖ．診断及び治療の方法及びキット
Ｖ．診断及び治療の方法及びキット
【0191】
診断、評価、スクリーニング、モニタリング、又は予測の方法
いくつかの態様では、個体中の本明細書に提供されるがんなどのがんにおけるバイオマーカーを診断又は評価する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供される核酸分子の存在の知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカー核酸分子を、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で、本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子を検出する方法のうちの１つ以上など、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して検出する。いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカー核酸分子の診断又は評価を提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在又は非存在が特定される。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、本明細書に提供されるがんなどのがんが、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在により、がんが、抗がん療法、例えば．、本明細書に提供される抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料は、本明細書に記載の試料である。いくつかの実施形態では、包埋試料は、がんに由来する細胞を含むか、又はがんに由来する細胞から取得される。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有するか、がんを有することが疑われるか、がんの検査を受けているか、がんの治療を受けているか、又はがんに対する感受性の検査を受けており、がんは、例えば、本明細書に記載のがんである。
いくつかの態様では、個体中の本明細書に提供されるがんなどのがんにおけるバイオマーカーを診断又は評価する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供される核酸分子の存在の知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカー核酸分子を、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で、本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子を検出する方法のうちの１つ以上など、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して検出する。いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカー核酸分子の診断又は評価を提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在又は非存在が特定される。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、本明細書に提供されるがんなどのがんが、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在により、がんが、抗がん療法、例えば．、本明細書に提供される抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料は、本明細書に記載の試料である。いくつかの実施形態では、包埋試料は、がんに由来する細胞を含むか、又はがんに由来する細胞から取得される。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有するか、がんを有することが疑われるか、がんの検査を受けているか、がんの治療を受けているか、又はがんに対する感受性の検査を受けており、がんは、例えば、本明細書に記載のがんである。
【0192】
いくつかの態様では、個体におけるがん、例えば、本明細書に提供されるがんを診断又は評価する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、がんを診断又は評価する方法は、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を、個体から取得した包埋試料、例えば、がんに由来する細胞を含む包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子を、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で、本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子を検出する方法のうちの１つ以上など、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子又はその断片を、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出することで、がんが、抗がん療法、例えば、本明細書に記載の抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、個体から取得した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子又はその断片の存在により、がんが、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、本方法は、がん又は融合核酸分子の診断又は評価を提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、がんが、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法に応答する可能性が高いことが特定される。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在又は非存在が特定される。
【0193】
いくつかの態様では、がん、例えば、本明細書に提供されるがんを有する個体の生存期間を予測する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記載の抗がん療法などの抗がん療法による治療を受けている。いくつかの実施形態では、本方法は、個体に由来する包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の存在の知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を、個体に由来する包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の知識を得ることに応じて、個体は、例えば、がんがバイオマーカー核酸分子を呈しない個体と比較して、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法による治療の後により長い生存期間を有することが予測される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の検出に応じて、個体は、例えば、がんがバイオマーカー核酸分子を呈しない個体と比較して、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法による治療の後により長い生存期間を有することが予測される。いくつかの実施形態では、本方法は、診断又は評価を提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在又は非存在が特定される。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、個体は、例えば、がんがバイオマーカー核酸分子を呈しない個体と比較して、抗がん療法、例えば、本明細書に提供される抗がん療法による治療の後により長い生存期間を有することが予測されると特定される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料は、本明細書に記載される試料である。いくつかの実施形態では、包埋試料は、がんに由来する細胞を含む。
【0194】
いくつかの態様では、がんを有するか、がんを有することが疑われるか、がんの検査を受けているか、がんの治療を受けているか、又はがんに対する感受性の検査を受けている個体をスクリーニングする方法が、本明細書に提供され、がんは、例えば、本明細書に提供されるがんである。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記載の抗がん療法などの抗がん療法による治療を受けている。いくつかの実施形態では、本方法は、個体に由来する包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の存在の知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を、個体に由来する包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出することを含む。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の知識を得ることに応じて、個体は、例えば、がんがバイオマーカー核酸分子を呈しない個体と比較して、がん再発、侵襲性がん、抗がん療法抵抗性、又は予後不良のリスクが増加していると予測される。いくつかの実施形態では、組織から抽出した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中の本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の検出に応じて、個体は、例えば、がんがバイオマーカー核酸分子を呈しない個体と比較して、がん再発、侵襲性がん、抗がん療法抵抗性、又は予後不良のリスクが増加していると予測される。いくつかの実施形態では、本方法は、診断又は評価を提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、組織から抽出した包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のバイオマーカー核酸分子の存在又は非存在が特定される。いくつかの実施形態では、診断又は評価により、個体が、例えば、がんがバイオマーカー核酸分子を呈しない個体と比較して、がん再発、侵襲性がん、抗がん療法抵抗性、又は予後不良のリスクが増加していると予測されることが特定される。いくつかの実施形態では、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料は、本明細書に記載されるものである。いくつかの実施形態では、包埋試料は、がんに由来する細胞を含む。
【0195】
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、当該技術分野で既知の又は本明細書に提供される試薬、例えば、本明細書に記載のベイト、プローブ、又はオリゴヌクレオチドを使用して、バイオマーカーヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を選択的に富化し、富化試料を生成することを更に含む。
【0196】
抗がん療法がん
本開示の特定の態様は、抗がん療法、及び抗がん療法による治療から利益を受け得る個体を特定するための方法、個体を治療するための抗がん療法を選択するための方法、治療選択肢としての抗がん療法を特定するための方法、抗がん療法の投与を含む、がんを治療する方法若しくはがんの進行を遅らせるための方法、（例えば、個体におけるがんを治療する方法若しくはがんの進行を遅らせるための方法における、又はがんを治療するか、若しくはがんの進行を遅らせるための医薬の製造のための方法における）抗がん療法のための使用などに関する。これらの方法及び使用は、上記のように、包埋試料中の目的の腫瘍細胞からのバイオマーカーの検出に少なくとも部分的に基づく。理論に束縛されるものではないが、これらのバイオマーカーにより、小分子阻害剤、化学療法剤、がん免疫療法、抗体、細胞療法、核酸、手術、放射線療法、抗血管新生療法、抗ＤＮＡ修復療法、抗炎症療法、抗新生物剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上などの適切な抗がん療法から利益を受け得る患者を特定することができると考えられる。
本開示の特定の態様は、抗がん療法、及び抗がん療法による治療から利益を受け得る個体を特定するための方法、個体を治療するための抗がん療法を選択するための方法、治療選択肢としての抗がん療法を特定するための方法、抗がん療法の投与を含む、がんを治療する方法若しくはがんの進行を遅らせるための方法、（例えば、個体におけるがんを治療する方法若しくはがんの進行を遅らせるための方法における、又はがんを治療するか、若しくはがんの進行を遅らせるための医薬の製造のための方法における）抗がん療法のための使用などに関する。これらの方法及び使用は、上記のように、包埋試料中の目的の腫瘍細胞からのバイオマーカーの検出に少なくとも部分的に基づく。理論に束縛されるものではないが、これらのバイオマーカーにより、小分子阻害剤、化学療法剤、がん免疫療法、抗体、細胞療法、核酸、手術、放射線療法、抗血管新生療法、抗ＤＮＡ修復療法、抗炎症療法、抗新生物剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上などの適切な抗がん療法から利益を受け得る患者を特定することができると考えられる。
【0197】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４を阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、サイクリンＤ／ＣＤＫ４を阻害する。いくつかの実施形態では、抗がん療法／ＣＤＫ阻害剤は、（ａ）ＣＤＫ４の１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）ＣＤＫ４の１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、ＣＤＫ４に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、ＣＤＫ４に結合し、その発現を阻害することによる、及び／又はＣＤＫ４を発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）ＣＤＫ４の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４の小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。ＣＤＫ阻害剤の非限定的な例としては、パルボシクリブ、リボシクリブ、及びアベマシクリブ、並びにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【0198】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、抗がん療法／ＭＤＭ２阻害剤は、（ａ）ＭＤＭ２の１つ以上の酵素活性を阻害する小分子（例えば、ｐ５３に結合する）、（ｂ）ＭＤＭ２の１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、ＭＤＭ２に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、ＭＤＭ２に結合し、その発現を阻害することによる、及び／又はＭＤＭ２を発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）ＭＤＭ２の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＭＤＭ２の小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。ＭＤＭ２阻害剤の非限定的な例としては、ヌトリン－３ａ、ＲＧ７１１２、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８）、ＡＭＧ－２３２、ＭＩ－６３、ＭＩ－２９１、ＭＩ－３９１、ＭＩ－７７３０１（ＳＡＲ４０５８３８）、ＡＰＧ－１１５、ＤＳ－３０３２ｂ、ＮＶＰ－ＣＧＭ０９７、及びＨＤＭ－２０１（シレマドリン（ｓｉｒｅｍａｄｌｉｎ））、並びにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＭＤＭ２とｐ５３との間の相互作用を阻害するか、又は破壊する。
【0199】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、代謝拮抗物質、ＤＮＡ損傷剤、又は白金含有療法薬（例えば、５－アザシタジン（ａｚａｃｉｔａｄｉｎｅ）、５－フルオロウラシル、アカデシン、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、クロラムブシル、ＣＰＴ－１１、シタラビン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、イダルビシン、放射線、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカン、トラベクテジン、ＧＳＫ２８３０３７１、又はルカパリブ）；アポトーシス促進剤（例えば、ＢＣＬ２阻害剤若しくは下方調節剤、ＳＭＡＣ模倣物、又はＴＲＡＩＬアゴニスト、例えば、ＡＢＴ－２６３、ＡＢＴ－７３７、オリドニン、ベネトクラクス、ベネトクラクスと抗ＣＤ２０抗体、例えば、オビヌツズマブ若しくはリツキシマブとの組み合わせ、１３９６－１１、ＡＢＴ－１０、ＳＭ－１６４、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ、又はｒｈＴＲＡＩＬ）；チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、本明細書に記載されるもの）；ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、又はＭＡＰＫ経路の阻害剤（例えば、ＡＺＤ６２４４、ダブラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＤ０３２５９０１、ピマセルチブ、トラメチニブ、又はベムラフェニブ）；ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、又はＡｋｔの阻害剤（例えば、本明細書に記載されるもの）；ＣＤＫ阻害剤（例えば、本明細書に記載されるもの）；ＰＫＣ阻害剤（例えば、ＬＸＳ１９６又はソトラスタウリン）；抗体ベースの療法薬（例えば、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤＬ１抗体、例えば、アテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、又はスパルタリズマブ；抗ＣＤ２０抗体、例えば、オビヌツズマブ又はリツキシマブ；又は抗ＤＲ５抗体、例えば、ドロジツマブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、又はＭＧ－１３２）；ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＳＡＨＡ又はＶＰＡ）；抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ）；亜鉛含有療法薬（例えば、亜鉛又はＺＭＣ１）；ＨＳＰ阻害剤（例えば、ゲルダナマイシン）；ＡＴＰアーゼ阻害剤（例えば、アルカゾリド）；有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル又はビンクリスチン）；メトホルミン；メトトレキサート；タンシノンＩＩＡ；並びに／あるいはＰ５０９１のうちの１つ以上を含む。
【0200】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、チロシンキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、抗がん療法／チロシンキナーゼ阻害剤は、（ａ）チロシンキナーゼの１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）チロシンキナーゼの１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、チロシンキナーゼに結合し、チロシンキナーゼの１つ以上の活性を阻害することによる、チロシンキナーゼに結合し、チロシンキナーゼの発現（例えば、細胞表面発現）を阻害することによる、及び／又はチロシンキナーゼを発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）チロシンキナーゼの発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、チロシンキナーゼの小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。チロシンキナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、イマチニブ、クレノラニブ、リニファニブ、ニネテダニブ（ｎｉｎｅｔｅｄａｎｉｂ）、アキシチニブ、ダサチニブ、イメテルスタット、ミドスタウリン、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、モテサニブ、マシチニブ、バタラニブ、カボザニチニブ（ｃａｂｏｚａｎｉｔｉｎｉｂ）、チボザニブ、ＯＳＩ－９３０、Ｋｉ８７５１、テラチニブ、ドビチニブ、チルホスチンＡＧ １２９６、及びアムバチニブ、並びにその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【0201】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２の１つ以上の活性を阻害する。いくつかの実施形態では、抗がん療法／ＭＥＫ阻害剤は、（ａ）ＭＥＫの１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）ＭＥＫの１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、ＭＥＫに結合し、ＭＥＫの１つ以上の活性を阻害することによる、ＭＥＫに結合し、ＭＥＫの発現を阻害することによる、及び／又はＭＥＫを発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）ＭＥＫの発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫの小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。ＭＥＫ阻害剤の非限定的な例としては、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３２５９０１、セルメチニブ、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ－７３３、ＧＤＣ－０６２３、レファメチニブ、ピマセルチブ、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５１２６７６６、ＷＸ－５４４、及びＨＬ－０８５、並びにその薬学的に許容される塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、Ｒａｆ、ＭＥＫ、及び／又はＥＲＫの阻害剤を含む、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の１つ以上の活性を阻害する。
【0202】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、抗がん療法／ｍＴＯＲ阻害剤は、（ａ）ｍＴＯＲの１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）ｍＴＯＲの１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、ｍＴＯＲに結合し、ｍＴＯＲの１つ以上の活性を阻害することによる、ｍＴＯＲに結合し、ｍＴＯＲの発現を阻害することによる、及び／又はｍＴＯＲを発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）ｍＴＯＲの発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲの小分子阻害剤である（例えば、競争的阻害剤、例えば、ＡＴＰ競争的阻害剤、又は非競争的阻害剤、例えば、ラパマイシン類似体）。ｍＴＯＲ阻害剤の非限定的な例としては、テムシロリムス、エベロリムス、リダホロリムス、ダクトリシブ、ＧＳＫ２１２６４５８、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＭＬＮ１２８、ＰＰ２４２、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＬＹ３０２３４１４、ＰＱＲ３０９、ＰＫＩ５８７、及びＯＳＩ０２７、並びにその薬学的に許容される塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、Ａｋｔ及び／又はｍＴＯＲの阻害剤を含む、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の１つ以上の活性を阻害する。
【0203】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤又はＡｋｔ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの１つ以上の活性を阻害する。いくつかの実施形態では、抗がん療法／ＰＩ３Ｋ阻害剤は、（ａ）ＰＩ３Ｋの１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）ＰＩ３Ｋの１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、ＰＩ３Ｋに結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、ＰＩ３Ｋに結合し、その発現を阻害することによる、及び／又はＰＩ３Ｋを発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）ＰＩ３Ｋの発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。ＰＩ３Ｋ阻害剤の非限定的な例としては、ＧＳＫ２６３６７７１、ブパルリシブ（ＢＫＭ１２０）、ＡＺＤ８１８６、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＬＹ２９４００２、ＰＸ－８６６、ＴＧＸ１１５、ＴＧＸ１２６、ＢＥＺ２３５、ＳＦ１１２６、イデラリシブ（ＧＳ－１１０１、ＣＡＬ－１０１）、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４）、ＧＤＣ００３２、ＩＰＩ１４５、ＩＮＫ１１１７（ＭＬＮ１１１７）、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ６４８２）、デュベリシブ、ＧＳ－９８２０、ＧＳＫ２６３６７７１、ＧＤＣ－０９８０、ＡＭＧ３１９、パゾバニブ、及びアルペリシブ（ＢＹＬ７１９、Ｐｉｑｒａｙ）、並びにその薬学的に許容される塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１）の１つ以上の活性を阻害する。いくつかの実施形態では、抗がん療法／ＡＫＴ阻害剤は、（ａ）ＡＫＴ１の１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）ＡＫＴ１の１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、ＡＫＴ１に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、ＡＫＴ１に結合し、その発現を阻害することによる、及び／又はＡＫＴ１を発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）ＡＫＴ１の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ１阻害剤は、ＡＫＴ１の小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。ＡＫＴ１阻害剤の非限定的な例としては、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＳＫ２１４１７９５（ウプロセルチブ）、ＧＳＫ２１１０１８３（アフレセルチブ）、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ－００６８（イパタセルチブ）、ＡＴ７８６７、ＣＣＴ１２８９３０、ＭＫ－２２０６、ＢＡＹ １１２５９７６、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２－ＩＮ－１、ペリフォシン、及びＶＩＩＩ、並びにその薬学的に許容される塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ１阻害剤は、汎Ａｋｔ阻害剤である。
【0204】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ハリネズミ（Ｈｈ）阻害剤である。いくつかの実施形態では、抗がん療法／Ｈｈ阻害剤は、（ａ）Ｈｈの１つ以上の酵素活性を阻害する小分子、（ｂ）Ｈｈの１つ以上の活性を阻害する抗体（例えば、Ｈｈに結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、Ｈｈに結合し、その発現を阻害することによる、及び／又はＨｈを発現する細胞に結合し、その１つ以上の活性を阻害することによる、例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ、又は食作用、ＡＤＣＰを誘導することによる）、あるいは（ｃ）Ｈｈの発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ、ＣＲＩＳＰＲベースの療法など）である。いくつかの実施形態では、Ｈｈ阻害剤は、Ｈｈの小分子阻害剤である（例えば、競争的又は非競争的阻害剤）。Ｈｈ阻害剤の非限定的な例としては、ソニデジブ、ビスモデギブ、エリスモデギブ、サリデギブ、ＢＭＳ８３３９２３、ＰＦ－０４４４９９１３、及びＬＹ２９４０６８０、並びにその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【0205】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）阻害剤、ＭＹＣ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、免疫療法、ネオ抗原、ワクチン、又は細胞療法を含む。
【0206】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法、ＶＥＧＦ阻害剤、インテグリンβ３阻害剤、スタチン、ＥＧＦＲ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、又はＣＤＫ４／６阻害剤のうちの１つ以上を含む。
【0207】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、キナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、キナーゼ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、クリゾチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、ロルラチニブ、ブリグチニブ、エンサルチニブ（Ｘ－３９６）、レポトレクチニブ（ＴＰＸ－００５）、エントレクチニブ（ＲＸＤＸ－１０１）、ＡＺＤ３４６３、ＣＥＰ－３７４４０、ベリザチニブ（ＴＳＲ－０１１）、ＡＳＰ３０２６、ＫＲＣＡ－０００８、ＴＱ－Ｂ３１３９、ＴＰＸ－０１３１、又はＴＡＥ６８４（ＮＶＰ－ＴＡＥ６８４）である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５０１６８９４の実施例３～３９に記載されるような、ＡＬＫキナーゼ阻害剤である。
【0208】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ＨＳＰ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ阻害剤は、ＫＮＫ４２３などの汎ＨＳＰ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ阻害剤は、ｃｍＨｓｐ７０．１、ケルセチン、ＶＥＲ１５５００８、又は１７－ＡＡＤなどのＨＳＰ７０阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ阻害剤は、ＨＳＰ９０阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、１７－ＡＡＤ、Ｄｅｂｉｏ０９３２、ガネテスピブ（ＳＴＡ－９０９０）、レタスピマイシン塩酸塩（レタスピマイシン、ＩＰＩ－５０４）、ＡＵＹ９２２、アルベスピマイシン（ＫＯＳ－１０２２、１７－ＤＭＡＧ）、タネスピマイシン（ＫＯＳ－９５３、１７－ＡＡＧ）、ＤＳ ２２４８、又はＡＴ１３３８７（オナレスピブ）である。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ阻害剤は、アパトルセン（ＯＧＸ－４２７）などのＨＳＰ２７阻害剤である。
【0209】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ＭＹＣ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ＭＹＣ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＣ阻害剤は、ＭＹＣｉ３６１（ＮＵＣＣ－０１９６３６１）、ＭＹＣｉ９７５（ＮＵＣＣ－０２００９７５）、Ｏｍｏｍｙｃ（ドミナントネガティブペプチド）、ＺＩＮＣ１６２９３１５３（Ｍｉｎ９）、１００５８－Ｆ４、ＪＫＹ－２－１６９、７５９４－００３５、又はＭＹＣ／ＭＡＸ二量体化及び／若しくはＭＹＣ／ＭＡＸ／ＤＮＡ複合体形成の阻害剤である。
【0210】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ＨＤＡＣ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、ベレオダック（登録商標））、ＳＡＨＡ（ボリノスタット、スベロイルアニリドヒドロキサミン、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標））、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９、ＬＡＱ－８２４）、ＡＣＹ１２１５（Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ）、キシノスタット（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、プラシノスタット（ＳＢ９３９）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、レスミノスタット（４ＳＣ－２０１）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＭＳ－２７５（エチノスタット）、ロミデプシン（デプシペプチド、ＦＫ２２８）、ＭＧＣＤ０１０３（モセチノスタット）、ＢＭＬ－２１０、ＣＡＹ１０６０３、バルプロ酸、ＭＣ１５６８、ＣＵＤＣ－９０７、ＣＩ－９９４（タセジナリン）、Ｐｉｖａｎｅｘ（ＡＮ－９）、ＡＲ－４２、チダミド（ＣＳ０５５、ＨＢＩ－８０００）、ＣＵＤＣ－１０１、ＣＨＲ－３９９６、ＭＰＴ０Ｅ０２８、ＢＲＤ８４３０、ＭＲＬＢ－２２３、アピシジン、ＲＧＦＰ９６６、ＢＧ４５、ＰＣＩ－３４０５１、Ｃ１４９（ＮＣＣ１４９）、ＴＭＰ２６９、Ｃｐｄ２、Ｔ２４７、Ｔ３２６、ＬＭＫ２３５、Ｃ１Ａ、ＨＰＯＢ、ネクスツラスタットＡ、Ｂｅｆｅｘａｍａｃ、ＣＢＨＡ、フェニル酪酸、ＭＣ１５６８、ＳＮＤＸ２７５、スクリプタイド、Ｍｅｒｃｋ６０、ＰＸ０８９３４４、ＰＸ１０５６８４、ＰＸ１１７７３５、ＰＸ１１７７９２、ＰＸ１１７２４５、ＰＸ１０５８４４、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ（２０１６）６（１０）：ａ０２６８３１に記載されている化合物１２、又はＰＸ１１７４４５である。
【0211】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ＶＥＧＦ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ＶＥＧＦ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ＢＭＳ－６９０５１４、ラムシルマブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ゴルバチニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、レバンチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、チボザニブ、ルシタニブ、セマキサニブ、ニンデンタニブ、レゴラフィニブ、又はアフリベルセプトである。
【0212】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、インテグリンβ３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、インテグリンβ３阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、インテグリンβ３阻害剤は、抗ａｖｂ３（クローンＬＭ６０９）、シレンギチド（ＥＭＤ１２１９７４、ＮＳＣ、７０７５４４）、ｓｉＲＮＡ、ＧＬＰＧ０１８７、ＭＫ－０４２９、ＣＮＴＯ９５、ＴＮ－１６１、エタラシズマブ（ＭＥＤＩ－５２２）、インテツムマブ（ＣＮＴＯ９５）（抗αＶサブユニット抗体）、アビツズマブ（ＥＭＤ５２５７９７／ＤＩ１７Ｅ６）（抗αＶサブユニット抗体）、ＪＳＭ６４２７、ＳＪ７４９、ＢＣＨ－１５０４６、ＳＣＨ２２１１５３、又はＳＣ５６６３１である。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、αＩＩｂβ３インテグリン阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、αＩＩｂβ３インテグリン阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、αＩＩｂβ３インテグリン阻害剤は、アブシキシマブ、エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ（登録商標））、又はチロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ（登録商標））である。
【0213】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、スタチン又はスタチンベースの薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、スタチン又はスタチンベースの薬剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、スタチン又はスタチンベースの薬剤は、シンバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、又はセリバスタチンである。
【0214】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ＭＡＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ＭＡＰＫ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫ阻害剤は、ＳＢ２０３５８０、ＳＫＦ－８６００２、ＢＩＲＢ－７９６、ＳＣ－４０９、ＲＪＷ－６７６５７、ＢＩＲＢ－７９６、ＶＸ－７４５、ＲＯ３２０１１９５、ＳＢ－２４２２３５、又はＭＷ１８１である。
【0215】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ＥＧＦＲ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ＥＧＦＲ阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブ、パニツムマブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ダコミチニブ、イコチニブ、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１）、アファタニブ、オルムチニブ、ＥＧＦ８１６（ナザルチニブ）、アビチニブ（ＡＣ００１０）、ロシレチニブ（ＣＯ－１６８６）、ＢＭＳ－６９０５１４、ＹＨ５４４８、ＰＦ－０６７４７７７５、ＡＳＰ８２７３、ＰＦ２９９８０４、ＡＰ２６１１３、又はエルロチニブである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ又はセツキシマブである。
【0216】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、チェックポイント阻害剤、がんワクチン、細胞ベースの療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの療法、アジュバント免疫療法、サイトカイン免疫療法、及び腫瘍溶解性ウイルス療法などのがん免疫療法を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、チェックポイント阻害剤、がんワクチン、細胞ベースの療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの療法、アジュバント免疫療法、サイトカイン免疫療法、及び腫瘍溶解性ウイルス療法などのがん免疫療法を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、毒素、細胞ベースの薬剤、又は細胞結合剤を含む。がん免疫療法の例は、本明細書により詳細に記載されているが、限定することを意図するものではない。いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、免疫系の１つ以上の側面を活性化して、ネオ抗原、例えば、本開示のがんによって発現されるネオ抗原を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を攻撃する。本開示のがん免疫療法は、医学的判断の対象となる、単剤療法としての使用、又は任意の組み合わせ若しくは数の２つ以上を含む組み合わせアプローチでの使用が企図される。がん免疫療法のいずれも（任意選択で、単独療法として、又は本明細書に記載の別のがん免疫療法又は他の治療剤と組み合わせて）、本明細書に記載の方法のうちのいずれにも使用することができる。
【0217】
いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、がんワクチンを含む。がんに対する免疫応答を促進するための異なるアプローチを用いた様々ながんワクチンが試験されている（例えば、Ｅｍｅｎｓ Ｌ Ａ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｅｍｅｒｇ Ｄｒｕｇｓ １３（２）：２９５－３０８（２００８）及びＵＳ２０１９０３６７６１３を参照されたい）。アプローチは、腫瘍に対するＢ細胞、Ｔ細胞、又は専門的な抗原提示細胞の応答を増強するように設計されてきた。がんワクチンの例示的なタイプとしては、ＤＮＡベースのワクチン、ＲＮＡベースのワクチン、ウイルス形質導入ワクチン、ペプチドベースのワクチン、樹状細胞ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、全腫瘍細胞ワクチン、腫瘍抗原ワクチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、予防的又は治療的であり得る。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ペプチドベースのワクチン、核酸ベースのワクチン、抗体ベースのワクチン、又は細胞ベースのワクチンとして製剤化される。例えば、ワクチン組成物には、カチオン性脂質製剤中の裸のｃＤＮＡ、リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、例えばポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロスフェアに封入された裸のｃＤＮＡ若しくはペプチド（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ ａｈ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７－２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９－３０６，１９９４、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５－６８１，１９９５を参照されたい）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）中に含まれるペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３－８７５，１９９０、Ｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５－２４３，１９９８）、又は複数抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９－５４１３，１９８８、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７－３２，１９９６参照されたい）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ペプチドベースのワクチン又は核酸ベースのワクチン（核酸がポリペプチドをコードする）として製剤化される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、抗体ベースのワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、細胞ベースのワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ペプチドがんワクチンであり、いくつかの実施形態では個別化ペプチドワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、多価長鎖ペプチド、複数ペプチド、ペプチド混合物、ハイブリッドペプチド、又はペプチドパルス樹状細胞ワクチンである（例えば、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，１０４：１４－２１），２０１３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、こうしたがんワクチンは、抗がん応答を増強する。
【0218】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ネオ抗原、例えば、本開示のがんによって発現されるネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ネオ抗原、例えば、本開示のがんによって発現されるネオ抗原をコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ネオ抗原、例えば、本開示のがんによって発現されるネオ抗原をコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ネオ抗原、例えば、本開示のがんによって発現されるネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、抗原提示及び／又は免疫応答を促進する１つ以上の追加の抗原、ネオ抗原、又は他の配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、リポソーム又はリポプレックスなどの１つ以上の追加の薬剤と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれて翻訳され、次いで、ＡＰＣ細胞表面上のＭＨＣクラスＩを介してネオ抗原を提示する。
【0219】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ／Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（無症候性又は最小限の症候性転移性去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）前立腺がんの治療に承認されている）及びｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）、ＢｉｏＶｅｘ／Ａｍｇｅｎ、以前はＴ－ＶＥＣとして知られていた）（黒色腫における切除不能な皮膚、皮下、及びリンパ節病変の治療に承認された遺伝子改変腫瘍溶解性ウイルス療法である）から選択される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ｐｅｘａｓｔｉｍｏｇｅｎｅ ｄｅｖａｃｉｒｅｐｖｅｃ（ＰｅｘａＶｅｃ／ＪＸ－５９４、ＳｉｌｌａＪｅｎ／旧Ｊｅｎｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（肝細胞がん（ＮＣＴ０２５６２７５５）及び黒色腫（ＮＣＴ００４２９３１２）に対してＧＭ－ＣＳＦを発現するように操作されたチミジンキナーゼ－（ＴＫ－）欠損ワクシニアウイルスである）、ｐｅｌａｒｅｏｒｅｐ（Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（大腸がん（ＮＣＴ０１６２２５４３）、前立腺がん（ＮＣＴ０１６１９８１３）、頭頸部扁平上皮がん（ＮＣＴ０１１６６５４２）、膵臓腺がん（ＮＣＴ００９９８３２２）、及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（ＮＣＴ００８６１６２７）を含む多くのがんにおいてＲＡＳが活性化されていない細胞では複製しない呼吸器腸内オーファンウイルス（レオウイルス）のバリアントである）、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＮＧ－３４８、ＰｓｉＯｘｕｓ、以前はＣｏｌｏＡｄｌとして知られていた）（卵巣がん（ＮＣＴ０２０２８１１７）、転移性若しくは進行性上皮腫瘍（例えば、大腸がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん、及び唾液腺がん（ＮＣＴ０２６３６０３６））において完全長ＣＤ８０及びＴ細胞受容体ＣＤ３タンパク質に特異的な抗体断片を発現するように操作されたアデノウイルスである）、ＯＮＣＯＳ－１０２（Ｔａｒｇｏｖａｘ／旧Ｏｎｃｏｓ）（黒色腫（ＮＣＴ０３００３６７６）、及び腹膜疾患、大腸がん、若しくは卵巣がん（ＮＣＴ０２９６３８３１）においてＧＭ－ＣＳＦを発現するように設計されたアデノウイルスである）、ＧＬ－ＯＮＣ１（ＧＬＶ－１ｈ６８／ＧＬＶ－１ｈ１５３、Ｇｅｎｅｌｕｘ ＧｍｂＨ）（腹膜がん腫症（ＮＣＴ０１４４３２６０）、卵管がん、卵巣がん（ＮＣＴ０２７５９５８８）で研究されたそれぞれβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）／β－グルコロニダーゼ若しくはβ－ｇａｌ／ヒトナトリウムヨウ素共輸送体（ｈＮＩＳ）を発現するように操作されたワクシニアウイルスである）、又はＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ Ｇｅｎｅｓｙｓ）（膀胱がん（ＮＣＴ０２３６５８１８）においてＧＭ－ＣＳＦを発現するように設計されたアデノウイルスである）、抗ｇｐ１００、ＳＴＩＮＧＶＡＸ、ＧＶＡＸ、ＤＣＶａｘＬ、及びＤＮＸ－２４０１などの腫瘍溶解性ウイルス療法から選択される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＪＸ－９２９（ＳｉｌｌａＪｅｎ／以前のＪｅｎｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（プロドラッグ５－フルオロシトシンを細胞傷害性薬物５－フルオロウラシルに変換することができるシトシンデアミナーゼを発現するように設計されたＴＫ欠損及びワクシニア増殖因子欠損ワクシニアウイルスである）、ＴＧＯ１及びＴＧ０２（Ｔａｒｇｏｖａｘ／旧Ｏｎｃｏｓ）（治療が困難なＲＡＳ変異を標的とするペプチドベースの免疫療法剤である）、ＴＩＬＴ－１２３（ＴＩＬＴ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－δ２４－ｈＴＮＦα－ＩＲＥＳ－ｈＩＬ２０と称される操作されたアデノウイルスである）、ＶＳＶ－ＧＰ（ＶｉｒａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（抗原特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を引き起こすように設計された抗原を発現するように更に操作することができる、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質（ＧＰ）を発現するように操作された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である）から選択される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ベクターベースの腫瘍抗原ワクチンを含む。ベクターベースの腫瘍抗原ワクチンは、抗腫瘍免疫応答を刺激するための抗原の安定した供給を提供する方法として使用することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原をコードするベクターを個体に注射し（おそらく、炎症促進剤又はＧＭ－ＣＳＦなどの他の誘引剤物質とともに）、インビボで細胞に取り込まれて特定の抗原を生成し、次いで、所望の免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、ベクターを使用して一度に１つより多い腫瘍抗原を送達して、免疫応答を増加させることができる。更に、組換えウイルス、細菌、又は酵母ベクターは、それ自体免疫応答を引き起こす可能性があり、これが全体的な免疫応答を強化する可能性もある。
【0220】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＤＮＡベースのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベースのワクチンを用いて、抗腫瘍応答を刺激することができる。抗原タンパク質をコードするＤＮＡを直接注射して防御免疫応答を誘発する能力は、多数の実験系で実証されている。抗原タンパク質をコードするＤＮＡを直接注射して防御免疫応答を誘発することによるワクチン接種は、多くの場合、細胞性応答と体液性応答の両方を引き起こす。更に、様々な抗原をコードするＤＮＡに対する再現性のある免疫応答がマウスで報告されており、これは本質的に動物の生涯にわたって持続する（例えば、Ｙａｎｋａｕｃｋａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２：７７１－７７６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、遺伝子発現に必要な調節エレメントに作動可能に結合されたタンパク質をコードする配列を含むプラスミド（又は他のベクター）ＤＮＡが、個体（例えば、ヒト患者、非ヒト哺乳動物など）に投与される。いくつかの実施形態では、個体の細胞が、投与されたＤＮＡを取り込み、コード配列が発現される。いくつかの実施形態では、そのように産生された抗原は、免疫応答の対象となる標的になる。
【0221】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＲＮＡベースのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのワクチンを用いて、抗腫瘍応答を刺激することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのワクチンは、自己複製ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス由来のＲＮＡレプリコンであってもよい。自己複製ＲＮＡ（又は「ＳＡＭ」）分子は、当該技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製要素を使用し、構造ウイルスタンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置き換えることによって生成することができる。自己複製ＲＮＡ分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得る＋鎖分子であり、この翻訳により、送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物とセンス転写物の両方を生成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが提供される。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生につながる。これらの娘ＲＮＡ、並びに同一鎖上の（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）サブゲノム転写物は、それ自体翻訳されて、コードされたポリペプチドのインサイチュ発現を提供するか、又は転写されて、送達されたＲＮＡと同じセンス鎖の更なる転写物（翻訳されて抗原のインサイチュ発現を提供する）を提供することができる。
【0222】
いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、細胞ベースの療法を含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、Ｔ細胞ベースの療法を含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、養子療法、例えば、養子Ｔ細胞ベースの療法を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、レシピエントに対して自己又は同種である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。養子免疫療法とは、がん又は感染症を治療するための治療的アプローチを指し、細胞ががん細胞に対して直接的又は間接的な特異的免疫を媒介する（すなわち、それに対する免疫応答を開始する）ことを目的として、免疫細胞が宿主に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、腫瘍細胞及び／又は転移細胞の成長及び／又は増殖の阻害をもたらし、関連する実施形態では、腫瘍細胞の死及び／又は再吸収をもたらす。免疫細胞は、異なる生物／宿主に由来し得るか（外因性免疫細胞）、又は対象生物から得られた細胞であり得る（自己免疫細胞）。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、自己又は同種Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はγδＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞）は、操作されたＴＣＲ及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、宿主細胞（例えば、自己又は同種Ｔ細胞）は、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＴＣＲを発現するように操作される。ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように更に操作されてもよい。異なる抗原などに対する複数のＣＡＲ及び／又はＴＣＲを、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの単一の細胞型に加えることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の抗原受容体をコードする遺伝子工学を介して導入された１つ以上の核酸／発現構築物／ベクター、及びこうした核酸の遺伝子操作された産物を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、異種である。すなわち、別の生物又は細胞から得られたものなど、細胞又は細胞から得られる試料には通常存在せず、例えば、操作される細胞及び／又はこうした細胞が由来する生物には通常見出されない。いくつかの実施形態では、核酸は、天然には見出されない核酸（例えば、キメラ）など、天然には存在しない。いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団は、療法を必要とする対象、又は免疫細胞の活性の低下に関連する疾患に罹患している対象から得ることができる。したがって、細胞は、療法を必要とする対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態では、ドナー（例えば、組織適合性が一致したドナー）から免疫細胞の集団を得ることができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、当該対象又はドナーにおいて免疫細胞が存在する末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、又は任意の他の臓器／組織から採取することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、対象及び／又はドナーのプール（例えば、プールされた臍帯血）から単離することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団が対象とは異なるドナーから得られる場合、得られた細胞が対象に導入され得るという点で対象適合性である限り、ドナーは同種であり得る。いくつかの実施形態では、同種ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性である場合もそうでない場合もある。いくつかの実施形態では、対象適合性にするために、同種細胞を処理して免疫原性を低下させることができる。
【0223】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの治療は、Ｔ細胞ベースの療法を含み、自己細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）；自己ＤＣ、リンパ球、人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）若しくはＴ細胞リガンド及び活性化抗体でコーティングされたビーズ、又は標的細胞膜を捕捉することによって単離された細胞を使用してエクスビボで活性化されたＴ細胞；抗宿主腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を自然に発現する同種細胞；並びに腫瘍反応性ＴＣＲ若しくはキメラＴＣＲ分子（「Ｔボディ」として知られ、抗体様腫瘍認識能を示す）を発現するように遺伝的に再プログラム若しくは「リダイレクト」された非腫瘍特異的自己又は同種細胞などを含む。機能的な抗腫瘍エフェクター細胞の単離、誘導、操作又は改変、活性化、及び増殖のためのいくつかのアプローチが過去２０年間に記載されており、本明細書に提供される方法のうちのいずれかに従って使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ、臍帯、又はリンパ器官に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から直接単離された細胞及び／又は対象から単離されて凍結された細胞などの初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、機能、活性化状態、成熟度、分化の潜在能力、増殖能、再循環能、局在化能、及び／若しくは持続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官若しくは区画における存在、マーカー若しくはサイトカイン分泌プロファイル、並びに／又は分化の程度によって定義されるものなど、Ｔ細胞又は他の細胞型、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びその亜集団のうちの１つ以上のサブセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、同種及び／又は自己であってもよい。既製の技術などのいくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞など、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）及び／又は多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）である。
【0224】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ベースの療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞ベースの療法を含む。このアプローチには、ＣＡＲの操作が含まれる。ＣＡＲは、目的の抗原に特異的に結合し、Ｔ細胞活性化のための１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、次いで、操作されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の表面に発現され、患者に投与され、抗原を発現するがん細胞に対するＴ細胞特異的な免疫応答をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ネオ抗原に特異的に結合する。
【0225】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ベースの療法は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞を含む。このアプローチには、目的の抗原に特異的に結合するＴＣＲの特定が含まれる。次いで、これを使用して、操作されたＴ細胞の表面の内在性又は天然のＴＣＲを置き換える。これを患者に投与すると、抗原を発現しているがん細胞に対して、Ｔ細胞特異的な免疫応答がもたらされる。いくつかの実施形態では、組み換えＴＣＲは、ネオ抗原に特異的に結合する。
【0226】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ベースの療法は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。例えば、ＴＩＬは、本開示の腫瘍又はがんから単離することができ、次いで、単離し、インビトロで増殖させることができる。これらのＴＩＬの一部又は全部は、本開示の腫瘍又はがんによって発現される抗原を特異的に認識することができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、インビトロで単離された後、１つ以上のネオ抗原、例えば、１つのネオ抗原に曝露される。次いで、ＴＩＬが患者に投与される（任意選択で、１つ以上のサイトカイン又は他の免疫刺激物質と組み合わせて）。
【0227】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの療法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ベースの療法を含む。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、様々な腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、並びに骨髄及び胸腺の一部の正常細胞に対して自発的な細胞傷害性を有するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、形質転換細胞及びウイルス感染細胞に対する初期の自然免疫応答の重要なエフェクターである。ＮＫ細胞は、ヒトのＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ８などの特定の表面マーカーによって検出することができる。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体、汎ＴマーカーＣＤ３、又は表面免疫グロブリンＢ細胞受容体を発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、当該技術分野で周知の方法によって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、未刺激白血球除去産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄、又は臍帯血から得られる。
【0228】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの治療は、樹状細胞（ＤＣ）ベースの療法、例えば、樹状細胞ワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ＤＣワクチンは、患者又はドナーから採取される、特異的Ｔ細胞免疫を誘導することができる抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態では、次いで、ＤＣワクチンをインビトロでペプチド抗原に曝露することができ、そのためのＴ細胞が患者において生成される。いくつかの実施形態では、抗原が負荷された樹状細胞は、次いで、患者に注射して戻される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、免疫化を複数回繰り返すことができる。樹状細胞を、採取、増殖、及び投与する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＷＯ２０１９／１７８０８１を参照されたい。樹状細胞ワクチン（例えば、ＡＰＣ８０１５及びＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）としても知られているＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ）は、患者の免疫系に１つ以上のがん特異的抗原を提示するＡＰＣとして機能する樹状細胞の投与を伴うワクチンである。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、レシピエントにとって自己又は同種である。
【0229】
いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、ＴＣＲベースの療法を含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、本開示のがんによって発現される抗原に特異的に結合する１つ以上のＴＣＲ又はＴＣＲベースの治療薬の投与を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲベースの治療薬は、Ｔ細胞表面タンパク質又は受容体に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片（例えば、抗ＣＤ３抗体若しくは抗体断片）などの、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に結合する部分を更に含み得る。
【0230】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、アジュバント免疫療法を含む。アジュバント免疫療法は、自然免疫系の構成要素を活性化する１つ以上の薬剤、例えば、ＴＬＲ７経路を標的とするＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標）（イミキモド）の使用を含む。
【0231】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、サイトカイン免疫療法を含む。サイトカイン免疫療法は、免疫系の構成要素を活性化する１つ以上のサイトカインの使用を含む。例としては、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、インターロイキン－２）、インターフェロンα－２ａ（ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）－Ａ）、インターフェロンα－２ｂ（ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）－Ａ）、及びＰＥＧインターフェロンα－２ｂ（ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0232】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、腫瘍溶解性ウイルス療法を含む。腫瘍溶解性ウイルス療法では、遺伝子改変ウイルスを使用してがん細胞で複製し、それを殺傷して、免疫応答を刺激する抗原を放出する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原を発現する複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、任意の天然に存在する（例えば、「フィールドソース」からの）又は改変された複製可能な腫瘍溶解性ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原を発現することに加えて、がん細胞に対するウイルスの選択性を高めるために改変されてもよい。いくつかの実施形態では、複製能力のある腫瘍溶解性ウイルスには、限定されないが、ミオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、テシウイルス科、コルチコウイルス科、プラズマウイルス科、リポスリクスウイルス科、フセロウイルス科、ポキシイリダ科、イリドウイルス科、フィコドナウイルス科、バキュロウイルス科、ヘルペスウイルス科、アドノウイルス科、パポバウイルス科、ポリドナウイルス科、イノウイルス科、ミクロウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科、レトロウイルス科、サイトウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レビウイルス科、ピコルナウイルス科、セキウイルス科、コモウイルス科、ポティウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、ノダウイルス科、テトラウイルス科、トンブスウイルス科、コロナウイルス科、グラビウイルス科、トガウイルス科、及びバルナウイルス科のメンバーである腫瘍溶解性ウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、複製能力のある腫瘍崩壊ウイルスには、アデノウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポリオーマウイルス、ワクシニアウイルス（ＶａｃＶ）、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、及びパルボウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原を発現する複製性の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ウイルスのがん選択性を高めるために、１つ以上の機能的な遺伝子を欠くように操作されてもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を欠くように操作される。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）を欠くように操作されてもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＴＫ活性の両方を欠くように操作されてもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｂ１８Ｒ、又はＢ８Ｒなどの宿主インターフェロン（ＩＦＮ）応答の回避に関与する１つ以上の遺伝子を欠くように操作されてもよい。いくつかの実施形態では、複製性の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株、又はＷｙｅｔｈ株であり、機能的なＴＫ遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能的なＢ１８Ｒ及び／又はＢ８Ｒ遺伝子を欠くＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株、又はＷｙｅｔｈ株である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原を発現する複製性の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、例えば、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、頭蓋内、皮下、又は鼻腔内投与を介して、対象に、局所的又は全身的に投与されてもよい。
【0233】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、免疫チェックポイント阻害剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、有効量の免疫チェックポイント阻害剤を個体に投与することを含む。当該技術分野で既知であるように、チェックポイント阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を標的として、免疫応答の調節を変化させる。免疫チェックポイントタンパク質には、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＥＡＣＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬＳ、アデノシン、ＴＧＦＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＭＩＣＡ／Ｂ、アルギナーゼ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰα（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＯＸ４０、及びＡ２ａＲが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントの調節に関与する分子には、限定されないが、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４）、ＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＣＤ、ＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＴＩＭ－３（ＨＡＶＣＲ２）、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ－１Ｈ）、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲβ、Ａ２ＡＲ、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＶＴＣＮＩ（Ｂ７－Ｈ４）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬＳ、アデノシン、ＴＧＦＲ、Ｂ７－Ｈ１、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ９４（ＫＬＲＤ１）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢＬ）、ＣＤ４０、ＩＤＯ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ２２６、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（ＣＤ２７５）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４、ＣＤ２５８）、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）、ＰＶＲ（ＮＥＣＬ５、ＣＤ１５５）、ＳＩＲＰａ、ＭＩＣＡ／Ｂ、及び／又はアルギナーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤（すなわち、チェックポイント阻害剤）は、例えば、Ｔ細胞活性化及び／又は抗がん免疫応答を増強するために、免疫細胞機能を負に調節するチェックポイントタンパク質の活性を減少させる。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、例えば、Ｔ細胞活性化及び／又は抗がん免疫応答を増強するために、免疫細胞機能を正に調節するチェックポイントタンパク質の活性を増加させる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体である。チェックポイント阻害剤の例としては、限定されないが、ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ））、共抑制分子に対するアンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、若しくはＬＡＧ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体））、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え形態のリガンド若しくは受容体、又は抗体（例えば、ヒト抗体）などの薬物を含む（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１６７１８号、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６４，２０１２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の既知の阻害剤を使用することができ、特に、キメラ化、ヒト化、又はヒト形態の抗体を使用することができる。
【0234】
いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト（例えば、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、又はＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）である。ＰＤ－１（プログラム死１）は、当該技術分野では「プログラム細胞死１」、「ＰＤＣＤ１」、「ＣＤ２７９」、及び「ＳＬＥＢ２」とも称される。例示的なヒトＰＤ－１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ１５１１６に示されている。ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）は、当該技術分野では「プログラム細胞死１リガンド１」、「ＰＤＣＤ １ＬＧ１」、「ＣＤ２７４」、「Ｂ７－Ｈ」、及び「ＰＤＬ１」とも称される。例示的なヒトＰＤ－Ｌ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７．１に示されている。ＰＤ－Ｌ２（プログラム死リガンド２）は、当該技術分野では「プログラム細胞死１リガンド２」、「ＰＤＣＤ１ ＬＧ２」、「ＣＤ２７３」、「Ｂ７－ＤＣ」、「Ｂｔｄｃ」、及び「ＰＤＬ２」とも称される。例示的なヒトＰＤ－Ｌ２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＢＱ５１に示されている。場合によっては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２は、ヒトのＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２である。
【0235】
場合によっては、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２である。別の例では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のその結合リガンドへの結合を阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の例では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合リガンドパートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、小分子、核酸、ポリペプチド（例えば、抗体）、炭水化物、脂質、金属、又は毒素である。
【0236】
場合によっては、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、例えば、下記の抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＭＧＡ－０１２、ＪＮＪ－６３７２３２８３、ＢＩ ７５４０９１、又はＢＧＢ－１０８のうちの１つ以上である。他の実施例では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシンである）。場合によっては、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。抗ＰＤ－１抗体の他の例としては、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＤＲ００１（ＣＡＳ登録番号１８５９０７２－５３－９；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＲＥＧＮ２８１０（ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標）又はセミプリマブ－ｒｗｌｃ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＢＧＢ－１０８（ＢｅｉＧｅｎｅ）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ－００１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｕｎｓｈｉ）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）、ＩＮＣＳＨＲ－１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）、ＰＦ－０６８０１５９１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＴＳＲ－０４２（ＡＮＢ０１１としても知られている；Ｔｅｓａｒｏ／ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ）、ＡＭ０００１（ＡＲＭＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＮＵＭ２４４Ｃ８（Ｅｎｕｍｅｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）、又はＥＮＵＭ３８８Ｄ４（Ｅｎｕｍｅｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、ＢＧＢ－１０８、ＳＴＩ－Ａ１１１０、ＡＭ０００１、ＢＩ７５４０９１、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、セトレリマブ（ＪＮＪ－６３７２３２８３）、トリパリマブ（ＪＳ－００１）を、カムレリズマブ（ＳＨＲ－１２１０、ＩＮＣＳＨＲ－１２１０、ＨＲ－３０１２１０）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＭＧＡ－０１２（ＩＮＣＭＧＡ００１２）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００ｌ）、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ９００４７５、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ＰＦ－０６８０１５９１、セミプリマブ（ＲＥＧＮ－２８１０、ＲＥＧＥＮ２８１０）、ドスタルリマブ（ＴＳＲ－０４２、ＡＮＢ０１１）、ＦＩＴＣ－ＹＴ－１６（ＰＤ－１結合ペプチド）、ＡＰＬ－５０１若しくはＣＢＴ－５０１若しくはゲノリムズマブ（ＧＢ－２２６）、ＡＢ－１２２、ＡＫ１０５、ＡＭＧ４０４、ＢＣＤ－１００、Ｆ５２０、ＨＬＸ１０、ＨＸ００８、ＪＴＸ－４０１４、ＬＺＭ００９、Ｓｙｍ０２１、ＰＳＢ２０５、ＡＭＰ－２２４（ＰＤ－１を標的とする融合タンパク質）、ＣＸ－１８８（ＰＤ－１プロボディ）、ＡＧＥＮ－２０３４、ＧＬＳ－０１０、ブジガリマブ（ＡＢＢＶ－１８１）、ＡＫ－１０３、ＢＡＴ－１３０６、ＣＳ－１００３、ＡＭ－０００１、ＴＩＬＴ－１２３、ＢＨ－２９２２、ＢＨ－２９４１、ＢＨ－２９５０、ＥＮＵＭ－２４４Ｃ８、ＥＮＵＭ－３８８Ｄ４、ＨＡＢ－２１、Ｈ ＥＩＳＣＯＩ１１－００３、ＩＫＴ－２０２、ＭＣＬＡ－１３４、ＭＴ－１７０００、ＰＥＧＭＰ－７、ＰＲＳ－３３２、ＲＸＩ－７６２、ＳＴＩ－１１１０、ＶＸＭ－１０、ＸｍＡｂ－２３１０４、ＡＫ－１１２、ＨＬＸ－２０、ＳＳＩ－３６１、ＡＴ－１６２０１、ＳＮＡ－０１、ＡＢ１２２、ＰＤ１－ＰＩＫ、ＰＦ－０６９３６３０８、ＲＧ－７７６９、ＣＡＢＰＤ－１Ａｂｓ、ＡＫ－１２３、ＭＥＤＩ－３３８７、ＭＥＤＩ－５７７１、４Ｈ１１２８Ｚ－Ｅ２７、ＲＥＭＤ－２８８、ＳＧ－００１、ＢＹ－２４．３、ＣＢ－２０１、ＩＢＩ－３１９、ＯＮＣＲ－１７７、Ｍａｘ－１、ＣＳ－４１００、ＪＢＩ－４２６、ＣＣＣ－０７０１、若しくはＣＣＸ－４５０３、又はそれらの誘導体を含む。
【0237】
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１を阻害する小分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１を阻害する小分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１及びＶＩＳＴＡ又はＰＤ－Ｌ１及びＴＩＭ３を阻害する小分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＣＡ－１７０（ＡＵＰＭ－１７０としても知られている）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７．１に示されるヒトＰＤ－Ｌ１、又はそのバリアントに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、小分子、核酸、ポリペプチド（例えば、抗体）、炭水化物、脂質、金属、又は毒素である。
【0238】
場合によっては、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、例えば、下記の抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。場合によっては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の結合、及び／又はＰＤ－Ｌ１とＢ７－１との間の結合を阻害することができる。場合によっては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体である。場合によっては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は（Ｆａｂ’）２断片から選択される抗体断片である。場合によっては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒト化抗体である。場合によっては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒト抗体である。場合によっては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＤＸ－１ １０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、又はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストは、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ（イミフィンジ）、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＳＨＲ－１３１６（ＨＴＩ－１０８８）、ＣＫ－３０１、ＢＭＳ－９３６５５９、エンバフォリマブ（ＫＮ０３５、ＡＳＣ２２）、ＣＳ１００１、ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＬＹ３３０００５４、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＦＡＺ０５３、ＣＸ－０７２、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＧＮＳ－１４８０、ＣＡ－１７０、ＣＫ－３０１、Ｍ－７８２４、ＨＴＩ－１０８８（ＨＴＩ－１３１、ＳＨＲ－１３１６）、ＭＳＢ－２３１１、ＡＫ－１０６、ＡＶＡ－００４、ＢＢＩ－８０１、ＣＡ－３２７、ＣＢＡ－０７１０、ＣＢＴ－５０２、ＦＰＴ－１５５、ＩＫＴ－２０１、ＩＫＴ－７０３、１０－１０３、ＪＳ－００３、ＫＤ－０３３、ＫＹ－１００３、ＭＣＬＡ－１４５、ＭＴ－５０５０、ＳＮＡ－０２、ＢＣＤ－１３５、ＡＰＬ－５０２（ＣＢＴ－４０２又はＴＱＢ２４５０）、ＩＭＣ－００１、ＫＤ－０４５、ＩＮＢＲＸ－１０５、ＫＮ－０４６、ＩＭＣ－２１０２、ＩＭＣ－２１０１、ＫＤ－００５、ＩＭＭ－２５０２、８９Ｚｒ－ＣＸ－０７２、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－６Ｅ１１、ＫＹ－１０５５、ＭＥＤＩ－１１０９、ＭＴ－５５９４、ＳＬ－２７９２５２、ＤＳＰ－１０６、Ｇｅｎｓｃｉ－０４７、ＲＥＭＤ－２９０、Ｎ－８０９、ＰＲＳ－３４４、ＦＳ－２２２、ＧＥＮ－１０４６、ＢＨ－２９ｘｘ、若しくはＦＳ－１１８、又はその誘導体を含む。
【0239】
いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４のアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４の小分子アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体である。ＣＴＬＡ４は、免疫チェックポイント分子のＣＤ２８－Ｂ７免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であり、Ｔ細胞の活性化（特に、ＣＤ２８依存性Ｔ細胞応答）を負に調節するように作用する。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８０（Ｂ７－１）及びＣＤ８６（Ｂ７－２）などのＣＤ２８と共通のリガンドへの結合に対して競合し、ＣＤ２８よりも高い親和性でこれらのリガンドに結合する。ＣＴＬＡ４活性の遮断は（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体を使用して）、ＣＤ２８媒介性共刺激（Ｔ細胞の活性化／プライミングの増加につながる）を増強し、Ｔ細胞の発生に影響し、かつ／又はＴｒｅｇ（例えば、腫瘍内Ｔｒｅｇ）を枯渇させると考えられている。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４アンタゴニストは、小分子、核酸、ポリペプチド（例えば、抗体）、炭水化物、脂質、金属、又は毒素である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ（ＩＢＩ３１０、ＢＭＳ－７３４０１６、ＭＤＸ０１０、ＭＤＸ－ＣＴＬＡ４、ＭＥＤＩ４７３６）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５、ＣＰ－６７５、２０６）、ＡＰＬ－５０９、ＡＧＥＮ１８８４、ＣＳ１００２、ＡＧＥＮ１１８１、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ、ＢＭＳ－１８８６６７、ＲＧ２０７７）、ＢＣＤ－１４５、ＯＮＣ－３９２、ＡＤＵ－１６０４、ＲＥＧＮ４６５９、ＡＤＧ１１６、ＫＮ０４４、ＫＮ０４６、又はその誘導体を含む。
【0240】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体又は抗体断片は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＭＧＡ－０１２、ＪＮＪ－６３７２３２８３、ＢＩ ７５４０９１、ＢＧＢ－１０８、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＪＳ－００１、ＳＴＩ－Ａ１１１０、ＩＮＣＳＨＲ－１２１０、ＰＦ－０６８０１５９１、ＴＳＲ－０４２、ＡＭ０００１、ＥＮＵＭ２４４Ｃ８、又はＥＮＵＭ３８８Ｄ４である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１イムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１イムノアドヘシンは、ＡＭＰ－２２４である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗体断片は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）、ＬＹ３３０００５４、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＫＮ０３５、ＦＡＺ０５３、又はＣＸ－０７２である。
【0241】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ－３阻害剤（例えば、抗体、抗体コンジュゲート、又はその抗原結合断片）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ－３阻害剤は、小分子、核酸、ポリペプチド（例えば、抗体）、炭水化物、脂質、金属、又は毒素を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ－３阻害剤は、小分子を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ－３阻害剤は、ＬＡＧ－３結合剤を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ－３阻害剤は、抗体、抗体コンジュゲート、又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ－３阻害剤は、エフチラギモドα（ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ－３２１、ＥＤＤＰ－２０２、ＥＯＣ－２０２）、レラトリマブ（ＢＭＳ－９８６０１６）、ＧＳＫ２８３１７８１（ＩＭＰ－７３１）、ＬＡＧ５２５（ＩＭＰ７０１）、ＴＳＲ－０３３、ＥＶＩＰ３２１（可溶性ＬＡＧ－３タンパク質）、ＢＩ７５４１１１、ＩＭＰ７６１、ＲＥＧＮ３７６７、ＭＫ－４２８０、ＭＧＤ－０１３、ＸｍＡｂ２２８４１、ＩＮＣＡＧＮ－２３８５、ＥＮＵＭ－００６、ＡＶＡ－０１７、ＡＭ－０００３、ｉＯｎｃｔｕｒａ抗ＬＡＧ－３抗体、Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＡＧ－３抗体、Ｓｙｍ０２２、その誘導体、又は前述のいずれかと競合する抗体を含む。
【0242】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、免疫調節分子又はサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、免疫調節分子又はサイトカインを個体に投与することを含む。免疫調節プロファイルは、効率的な免疫応答を誘発し、対象の免疫のバランスをとるために必要である。好適な免疫調節サイトカインの例としては、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－２０）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα及びＴＮＦβ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ－３リガンド、ｇＩｐ１０、ＴＣＡ－３、ＭＣＰ－１、ＭＩＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、並びにそれらの機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ケモカイン受容体、すなわち、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、又はＣＸ３Ｃケモカイン受容体に結合する任意の免疫調節性ケモカインを、本開示との関連で使用することができる。ケモカインの例としては、限定されないが、ＭＩＰ－３α（Ｌａｘ）、ＭＩＰ－３β、Ｈｃｃ－１、ＭＰＩＦ－１、ＭＰＩＦ－２、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＣＰ－５、エオタキシン、Ｔａｒｃ、Ｅｌｃ、Ｉ３０９、ＩＬ－８、ＧＣＰ－２ Ｇｒｏα、Ｇｒｏ－β、Ｎａｐ－２、Ｅｎａ－７８、Ｉｐ－１０、ＭＩＧ、Ｉ－Ｔａｃ、ＳＤＦ－１、又はＢＣＡ－１（Ｂｌｃ）、並びにそれらの機能的断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫調節分子は、本明細書に提供される治療のいずれかに含まれる。
【0243】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、一価及び／又は単一特異性である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、多価及び／又は多特異性である。
【0244】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどの核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどの核酸分子を個体に投与することを含む。当該技術分野で既知であるように、二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導するときに効果的である。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を含む。ｄｓＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における遺伝子発現をサイレンシングすることができる。いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、約５～約１０個の塩基対、約１０～約１２個の塩基対、約１２～約１５個の塩基対、約１５～約２０個の塩基対、約２０～２３個の塩基対、約２３～約２５個の塩基対、約２５～約２７個の塩基対、又は約２７～約３０個の塩基対のうちのいずれかを含む。当該技術分野で既知であるように、ｓｉＲＮＡは、任意選択でオーバーハングを含む低分子ｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域は、約１８～２５個のヌクレオチド、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドのうちのいずれかである。ｓｉＲＮＡはまた、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、例えば、およそ２９塩基対のステムと、２－ヌクレオチドの３’オーバーハングとを有するものである。ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを設計し、最適化し、産生し、使用するための方法は、当該技術分野で既知である。
【0245】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、化学療法を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、化学療法を個体に施すことを含む。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパ及びシクロホスファミド）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン）、アジリジン（例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ）、エチレンイミン及びメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミンを含む）、アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）、カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５（アドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）、クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード）、ニトロソウレア（カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン）、抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌｌ及びカリケアマイシンオメガｌｌなど）、ダイネミシン（例えば、ダイネミシンＡを含む）、ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）、エスペラミシン、並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン））、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））、葉酸類似体（例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサート）、プリン類似体（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）、ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン）、アンドロゲン（例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン）、抗副腎剤（例えば、ミトタン及びトリロスタン）、葉酸補充剤（例えば、葉酸）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォアミン、デメコルシン、ジアジコン、エルホルミチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、マイタンシノイド（例えば、マイタンシン及びアンサマイトシン）、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ多糖複合体、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、シクロホスファミド、タキソイド（例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、白金配位錯体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン）、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－ｌ ｌ）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイド（例えば、レチノイン酸）、カペシタビン、カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【0246】
本開示の抗がん療法と組み合わせることができる化学療法薬のいくつかの非限定的な例は、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ）、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ、Ｍｅｘａｔｅ、Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ、Ａｂｒａｘａｎｅ）、ソラフィニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）、及びビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）である。
【0247】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、キナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、キナーゼ阻害剤を個体に投与することを含む。キナーゼ阻害剤の例としては、１つ以上の受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂ－Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２／ＥｒｂＢ２、ＩＧＦ－ＩＲ、ＰＤＧＦＲ－ａ、ＰＤＧＦＲ－β、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ－４、Ｆｌｔ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ｃ－Ｒｅｔ、若しくはＡＬＫを標的とするもの、１つ以上の細胞質チロシンキナーゼ、例えば、ｃ－ＳＲＣ、ｃ－ＹＥＳ、Ａｂｌ、若しくはＪＡＫ－２を標的とするもの、１つ以上のセリン／スレオニンキナーゼ、例えば、ＡＴＭ、Ａｕｒｏｒａ Ａ及びＢ、ＣＤＫ、ｍＴＯＲ、ＰＫＣｉ、ＰＬＫ、ｂ－Ｒａｆ、Ｓ６Ｋ、若しくはＳＴＫ１１／ＬＫＢ１を標的とするもの、又は１つ以上の脂質キナーゼ、例えば、ＰＩ３Ｋ若しくはＳＫＩを標的とするものが挙げられる。小分子キナーゼ阻害剤には、ＰＨＡ－７３９３５８、ニロチニブ、ダサチニブ、ＰＤ１６６３２６、ＮＳＣ７４３４１１、ラパチニブ（ＧＷ－５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、スーテント（ＳＵ１ １２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）、又はレフルノミド（ＳＵ１０１）が含まれる。チロシンキナーゼ阻害剤の追加の非限定的な例としては、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ／Ｇｌｉｖｅｃ）及びゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）が挙げられる。
【0248】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、抗血管新生剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、抗血管新生剤を個体に投与することを含む。血管新生阻害剤は、腫瘍が生存するために必要な血管の広範な増殖（血管新生）を防ぐ。本開示の方法で使用され得る血管新生媒介分子又は血管新生阻害剤の非限定的な例としては、可溶性ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦアイソフォーム（例えば、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５）、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２）、及び共受容体（例えば、ニューロピリン－１及びニューロピリン－２））、ＮＲＰ－１、アンジオポエチン２、ＴＳＰ－１及びＴＳＰ－２、アンジオスタチン及び関連分子、エンドスタチン、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子－４、ＴＩＭＰ及びＣＤＡＩ、Ｍｅｔｈ－１及びＭｅｔｈ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－γ、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１８、プロトロンビン（クリングルドメイン－２）、アンチトロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質、レスチン、及び薬物（例えば、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ－４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ－ａ、血小板因子－４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、血管新生抑制ステロイド、及びヘパリン）、軟骨由来血管新生抑制因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、２－メトキシエストラジオール、テコガラン、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチナνβ３阻害剤、リノミド、又はタスキニモドが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って使用され得る既知の治療薬候補には、天然に存在する血管新生阻害剤が含まれ、天然に存在する血管新生阻害剤には、限定されないが、アンジオスタチン、エンドスタチン、又は血小板因子－４が含まれる。別の実施形態では、本開示の方法に従って使用され得る治療薬候補には、限定されない、ＴＮＰ－４７０、サリドマイド、及びインターロイキン－１２などの内皮細胞の増殖の特異的阻害剤が含まれる。本開示の方法に従って使用され得る更に他の抗血管新生剤としては、限定されないが、血管新生分子を中和するものが挙げられ、線維芽細胞増殖因子に対する抗体、血管内皮増殖因子に対する抗体、血小板由来増殖因子に対する抗体、あるいはＥＧＦ、ＶＥＧＦ、若しくはＰＤＧＦの受容体の抗体又は他のタイプの阻害剤が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って使用され得る抗血管新生剤には、限定されないが、スラミン及びその類似体、並びにテコガランが含まれる。他の実施形態では、本開示の方法に従って使用され得る抗血管新生剤としては、限定されないが、血管新生因子の受容体を中和する薬剤、又は血管基底膜及び細胞外マトリックスを妨害する薬剤が挙げられ、限定されないが、メタロプロテアーゼ阻害剤及び血管新生抑制ステロイドが含まれる。本開示の方法に従って使用され得る抗血管新生化合物の別の群には、限定されないが、インテグリンαｖβ３に対する抗体などの抗接着分子が含まれる。本開示の方法に従って使用され得る更に他の抗血管新生化合物又は組成物には、キナーゼ阻害剤、サリドマイド、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１２、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、軟骨由来血管新生抑制因子、２－メトキシエストラジオール、テトラチオモリブデート、トロンボスポンジン、プロラクチン、及びリノミドが含まれる。１つの特定の実施形態では、本開示の方法に従って使用され得る抗血管新生化合物は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）／ベバシズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などのＶＥＧＦに対する抗体である。
【0249】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、抗ＤＮＡ修復療法を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、抗ＤＮＡ修復療法を個体に施すことを含む。いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ修復療法は、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、タラゾパリブ、ルカパリブ、オラパリブ）、ＲＡＤ５１阻害剤（例えば、ＲＩ－１）、又はＤＮＡ損傷応答キナーゼの阻害剤（例えば、ＣＨＣＫ１（例えば、ＡＺＤ７７６２）、ＡＴＭ（例えば、ＫＵ－５５９３３、ＫＵ－６００１９、ＮＵ７０２６、若しくはＶＥ－８２１）、及びＡＴＲ（例えば、ＮＵ７０２６））である。
【0250】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、放射線増感剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、放射線増感剤を方法は、個体に投与することを含む。例示的な放射線増感剤には、低酸素放射線増感剤（例えば、ミソニダゾール、メトロニダゾール）、及び低酸素腫瘍組織への酸素の拡散を増加させるのに役立つ化合物であるトランス－クロセチン酸ナトリウムが含まれる。放射線増感剤はまた、相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び直接修復機構を含む、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）を妨害するＤＮＡ損傷応答阻害剤であり得る。一本鎖切断（ＳＳＢ）修復機序には、ＢＥＲ、ＮＥＲ、又はＭＭＲ経路が含まれるが、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機序は、ＨＲ及びＮＨＥＪ経路で構成される。放射線は、修復されなければ致命的なＤＮＡ切断を引き起こす。ＳＳＢは、インタクトのＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用して、ＢＥＲ、ＮＥＲ、及びＭＭＲ機序の組み合わせを介して修復される。ＳＳＢ修復の主な経路はＢＥＲであり、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）と呼ばれる関連酵素のファミリーを利用する。したがって、放射線増感剤は、ＰＡＲＰ阻害剤などのＤＮＡ損傷応答阻害剤を含むことができる。
【0251】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、抗炎症剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、抗炎症剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、炎症又は炎症性シグナル伝達経路からのシグナル伝達を遮断、阻害、又は低減する薬剤である。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、以下のいずれかの１つ以上の活性を阻害又は低減する：ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、インターフェロン（ＩＦＮ）、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮ－γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、形質転換増殖因子－α（ＴＧＦ－α）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＮＦ－ＲＩ、ＴＮＦ－ＲＩＩ）、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＩＫＫ、ＮＦ－κＢ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、及び／又はそれらの同族受容体。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、ＩＬ－１又はＩＬ－１受容体アンタゴニスト、例えば、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、リロナセプト、若しくはカナキヌマブである。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体アンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ－６抗体又は抗ＩＬ－６受容体抗体（トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、サリルマブ、シルクマブ、シルツキシマブ、又はＡＬＸ－００６１など）である。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、ＴＮＦ－αアンタゴニスト、例えば、抗ＴＮＦα抗体（インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、又はエタネルセプトなど）である。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、コルチコステロイドである。コルチコステロイドの例としては、限定されないが、コルチゾン（ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、Ａｌａ－Ｃｏｒｔ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）、ヒドロコルトンリン酸塩Ｌａｎａｃｏｒｔ（登録商標）、Ｓｏｌｕ－Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標））、デカドロン（デキサメタゾン、デキサメタゾン酢酸塩、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、Ｄｅｘａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｄｉｏｄｅｘ（登録商標）、Ｈｅｘａｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））、メチルプレドニゾロン（６－メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン酢酸塩、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、Ｄｕｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍ－Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）、Ｓｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、プレドニゾロン（Ｄｅｌｔａ－Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、ＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｐｒｅｚｏｎｅ（登録商標））、及びプレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｅｄ（登録商標）、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）、Ｏｒａｓｏｎｅ（登録商標））、及びビスホスホネート（例えば、パミドロネート（Ａｒｅｄｉａ（登録商標））、及びゾレドロン酸（Ｚｏｍｅｔａｃ（登録商標）））が挙げられる。
【0252】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、抗ホルモン剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、抗ホルモン剤を個体に投与することを含む。抗ホルモン剤は、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する薬剤である。抗ホルモン剤の例としては、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）が挙げられ、これらには、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）、トレミフェン、アロマターゼ阻害剤（副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害する）（例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）メゲストロール酢酸塩、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール））、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、ゴセレリン）、トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子（例えば、ＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）など）の発現を阻害するオリゴヌクレオチド）、遺伝子療法ワクチンなどのワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が含まれる。
【0253】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、代謝拮抗化学療法剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、代謝拮抗化学療法剤を個体に投与することを含む。代謝拮抗化学療法剤は、代謝産物に構造的に類似しているが、体内で生産的に使用することができない薬剤である。多くの代謝拮抗化学療法剤は、ＲＮＡ又はＤＮＡの生成を妨げる。代謝拮抗化学療法剤の例としては、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（商標））、６－メルカプトプリン、メトトレキセート、６－チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシン、ＡＲＡ－Ｃ、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ－Ｕ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－ＤＯＭＥＤ）、アゾシトシン、デオキシシトシン、ピリドミデン、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、クラドラビン、及び２－デオキシ－Ｄ－グルコースが挙げられる。いくつかの実施形態では、代謝拮抗化学療法剤は、ゲムシタビンである。ゲムシタビン塩酸塩は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙから商標ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）で販売されている。
【0254】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、白金ベースの化学療法剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、別の抗がん療法と組み合わせて、白金ベースの化学療法剤を個体に投与することを含む。白金ベースの化学療法剤は、分子の不可欠な部分として白金を含有する有機化合物を含む化学療法剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、白金剤である。いくつかのこうした実施形態では、白金剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、フェナントリプラチン、ピコプラチン、又はサトラプラチンから選択される。
【0255】
いくつかの態様では、本明細書で提供される抗がん療法と、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と、を含む、治療用製剤が本明細書で提供される。本明細書で提供される製剤は、１つより多い活性化合物、例えば、本明細書で提供される抗がん療法及び１つ以上の追加の薬剤（例えば、抗がん剤）を含んでもよい。
【0256】
許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、又は他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、又はｍ－クレゾール；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０個未満の残基）；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤；又はポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のうちの１つ以上を含む。
【0257】
活性成分は、マイクロカプセルに包まれていてもよい。こうしたマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技法によって、又は例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン－マイクロカプセル、及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの界面重合によって；コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）で；又はマクロエマルションで、調製されてもよい。こうした技法は、当該技術分野で既知である。
【0258】
持続放出組成物を調製してもよい。持続放出組成物の好適な例としては、本開示の抗がん療法を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。こうしたマトリックスは、成形された物品、例えば、膜、又はマイクロカプセルの形態であってもよい。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能な微小球）、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【0259】
本明細書で提供される製剤はまた、１つより多い活性化合物、例えば、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでもよい。こうした医薬のタイプ及び有効量は、例えば、製剤中に存在する活性化合物の量及びタイプ、並びに対象の臨床パラメータに依存する。
【0260】
製剤に関する一般的な情報については、例えば、Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０、Ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０、及びＷａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ １ １９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，２００２を参照されたい。
【0261】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌である。このことは、滅菌濾過膜による濾過、又は当該技術分野で既知の他の方法によって容易に達成される。
【0262】
いくつかの実施形態では、抗がん療法は、単剤療法として投与される。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、１つ以上の追加の抗がん療法又は治療と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の抗がん療法又は治療は、本明細書に記載の１つ以上の抗がん療法を含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書で提供される抗がん療法のうちのいずれかの任意の組み合わせの投与を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗がん療法は、手術、放射線療法、化学療法、抗血管新生療法、抗ＤＮＡ修復療法、及び抗炎症療法のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗がん療法は、抗新生物剤、化学療法剤、成長阻害剤、抗血管新生療法、放射線療法、細胞傷害性剤、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、化学療法又は化学療法剤と組み合わせて投与されてもおい。いくつかの実施形態では、化学療法又は化学療法剤は、白金ベースの薬剤（限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、及びスタラプラチンを含む）である。いくつかの実施形態では、抗がん療法は、放射線療法と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおいて使用するための抗がん療法（例えば、単剤療法として、又は別の療法若しくは治療と組み合わせて）は、参照により本明細書に組み込まれるＰｉｅｔｒａｎｔｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０１７）１０９（１２）及び／又はＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（２０２０）１２（２）：４２６によって記載されている抗がん療法又は治療である。
【0263】
キット
本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つに従って核酸の配列決定分析及び／又は抽出を改善するためのキットも、本明細書に提供される。
本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つに従って核酸の配列決定分析及び／又は抽出を改善するためのキットも、本明細書に提供される。
【0264】
いくつかの実施形態では、本キットには、本開示の方法を行うための試薬及び説明書が含まれる。
【0265】
本開示のバイオマーカー核酸分子を、例えば、本明細書に記載のように、包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中で検出するためのキットも、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキットには、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を検出するための試薬（例えば、本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、又はベイト）が含まれる。いくつかの実施形態では、キットには、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の野生型対応物を検出するための試薬（例えば、本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ又はベイト）が含まれる。いくつかの実施形態では、試薬には、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子又は本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の野生型対応物にハイブリダイズすることができる、本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、又はベイトが含まれる。いくつかの実施形態では、試薬には、本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子を本明細書に提供されるバイオマーカー核酸分子の野生型対応物と区別することができる、本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、又はベイトが含まれる。いくつかの実施形態では、キットは、配列決定、ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション方法、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、ＦＩＳＨ、スペクトル核型分析、ＭＦＩＳＨ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、ＨＰＬＣ、及び質量分析遺伝子型決定などの当該技術分野で既知の又は本明細書に記載のバイオマーカー核酸分子を検出する任意の方法に従って使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキットには、例えば、本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、又はベイトを使用して、本開示のバイオマーカー核酸分子を検出するための説明書が更に含まれる。
【0266】
例示的な実施形態
以下の例示的な実施形態は、本発明のいくつかの態様を代表するものである。
以下の例示的な実施形態は、本発明のいくつかの態様を代表するものである。
【0267】
実施形態１．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法。
【0268】
実施形態２．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１に記載の方法。
【0269】
実施形態３．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態１に記載の方法。
【0270】
実施形態４．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出が、パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される、実施形態１に記載の方法。
【0271】
実施形態５．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変が、ａ）コピー数改変、ｂ）点変異、ｃ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｄ）遺伝子内欠失、ｅ）遺伝子内挿入、ｆ）遺伝子全体の欠失、ｇ）逆位、ｈ）染色体間転座、ｉ）縦列重複、ｊ）遺伝子融合、ｋ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｌ）遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0272】
実施形態６．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変が、コピー数改変である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
【0273】
実施形態７．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【0274】
実施形態８．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態７に記載の方法。
【0275】
実施形態９．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態７に記載の方法。
【0276】
実施形態１０．核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法。
【0277】
実施形態１１．配列決定ライブラリの調製が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１０に記載の方法。
【0278】
実施形態１２．配列決定ライブラリの調製が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態１０に記載の方法。
【0279】
実施形態１３．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法。
【0280】
実施形態１４．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、実施形態１３に記載の方法。
【0281】
実施形態１５．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて低減する、実施形態１３に記載の方法。
【0282】
実施形態１６．パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン中で相転移を誘導し、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【0283】
実施形態１７．パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１６に記載の方法。
【0284】
実施形態１８．パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態１６に記載の方法。
【0285】
実施形態１９．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0286】
実施形態２０．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて少なくなる、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載の方法。
【0287】
実施形態２１．フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、実施形態１９又は実施形態２０に記載の方法。
【0288】
実施形態２２．ステップｂ）が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0289】
実施形態２３．相転移が溶融である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0290】
実施形態２４．ステップｂ）が、パラフィン包埋試料を加熱し、遠心分離させることを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0291】
実施形態２５．パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する、実施形態２４に記載の方法。
【0292】
実施形態２６．パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、実施形態２４又は実施形態２５に記載の方法。
【0293】
実施形態２７．ステップｂ）が、パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0294】
実施形態２８．パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態２７に記載の方法。
【0295】
実施形態２９．パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、実施形態２７又は実施形態２８に記載の方法。
【0296】
実施形態３０．パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の方法。
【0297】
実施形態３１．パラフィン包埋試料を、１６００～２０００ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
【0298】
実施形態３２．パラフィン包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する、実施形態３１に記載の方法。
【0299】
実施形態３３．パラフィン包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、実施形態３１又は実施形態３２に記載の方法。
【0300】
実施形態３４．パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。
【0301】
実施形態３５．パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0302】
実施形態３６．パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
【0303】
実施形態３７．パラフィン包埋試料を、約５０℃～約８０℃に加熱する、実施形態２４又は２７～３１のいずれか１つに記載の方法。
【0304】
実施形態３８．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変を検出することと、を含む、方法。
【0305】
実施形態３９．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態３８に記載の方法。
【0306】
実施形態４０．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態３８に記載の方法。
【0307】
実施形態４１．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変の検出が、パラフィン包埋試料を脱パラフィンしない方法と比べて改善される、実施形態３８に記載の方法。
【0308】
実施形態４２．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変が、ａ）コピー数改変、ｂ）点変異、ｃ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｄ）遺伝子内欠失、ｅ）遺伝子内挿入、ｆ）遺伝子全体の欠失、ｇ）逆位、ｈ）染色体間転座、ｉ）縦列重複、ｊ）遺伝子融合、ｋ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｌ）遺伝子増幅若しくは重複からなる群から選択される、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法。
【0309】
実施形態４３．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の改変が、コピー数改変である、実施形態３８～４２のいずれか１つに記載の方法。
【0310】
実施形態４４．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを抽出する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【0311】
実施形態４５．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態４４に記載の方法。
【0312】
実施形態４６．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態４４に記載の方法。
【0313】
実施形態４７．核酸配列決定のためのライブラリ構築を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することと、を含む、方法。
【0314】
実施形態４８．配列決定ライブラリの調製が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態４７に記載の方法。
【0315】
実施形態４９．配列決定ライブラリの調製が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態４７に記載の方法。
【0316】
実施形態５０．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルを低減させる方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、ｄ）抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを精製して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料を提供することと、を含む、方法。
【0317】
実施形態５１．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、実施形態５０に記載の方法。
【0318】
実施形態５２．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ試料中のパラフィンのレベルが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて低減する、実施形態５０に記載の方法。
【0319】
実施形態５３．パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離を改善する方法であって、ａ）パラフィン包埋試料を提供することと、ｂ）パラフィンをパラフィン包埋試料から除去することにより、脱パラフィンした試料を生成することであって、パラフィン包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィンを試料から分離させることにより、パラフィンを除去する、生成することと、ｃ）ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することと、を含む、方法。
【0320】
実施形態５４．パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態５３に記載の方法。
【0321】
実施形態５５．パラフィン包埋試料からのパラフィンの分離が、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて改善される、実施形態５３に記載の方法。
【0322】
実施形態５６．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンを混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載の方法。
【0323】
実施形態５７．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善されたパラフィンの分離により、フィルタの詰まりが、パラフィンをパラフィン包埋試料から切り離すことによりパラフィンを除去する方法と比べて少なくなる、実施形態５３～５６のいずれか１つに記載の方法。
【0324】
実施形態５８．フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、実施形態５６又は実施形態５７に記載の方法。
【0325】
実施形態５９．ステップｂ）が、パラフィンを混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、実施形態３８～５７のいずれか１つに記載の方法。
【0326】
実施形態６０．不混和性溶媒が鉱油である、実施形態３８～５９のいずれか１つに記載の方法。
【0327】
実施形態６１．パラフィン包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる、実施形態６０に記載の方法。
【0328】
実施形態６２．パラフィン包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油とパラフィン包埋試料との比で接触させる、実施形態６０又は実施形態６１に記載の方法。
【0329】
実施形態６３．ステップｂ）が、パラフィン包埋試料を、鉱油中、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートすることを含む、実施形態６０～６２のいずれか１つに記載の方法。
【0330】
実施形態６４．鉱油が、パラフィン包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載の方法。
【0331】
実施形態６５．鉱油が、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、パラフィン包埋試料に接触する、実施形態６０～６４のいずれか１つに記載の方法。
【0332】
実施形態６６．ステップｂ）が、試料を不混和性溶媒と接触させ、パラフィン包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む、実施形態３８～６５のいずれか１つに記載の方法。
【0333】
実施形態６７．パラフィン包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態６６に記載の方法。
【0334】
実施形態６８．パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、実施形態６６又は実施形態６７に記載の方法。
【0335】
実施形態６９．パラフィン包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態６６～６８のいずれか１つに記載の方法。
【0336】
実施形態７０．試料からのパラフィンの分離が自動である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0337】
実施形態７１．ステップｂ）が自動である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0338】
実施形態７２．方法が自動である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0339】
実施形態７３．２つ以上のパラフィン包埋試料を並行して処理する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0340】
実施形態７４．１２、２４、４８、又は９６個のパラフィン包埋試料を並行して処理する、実施形態７３に記載の方法。
【0341】
実施形態７５．液体取扱ロボットを使用して行う、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0342】
実施形態７６．液体取扱ロボットが、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｔｅｃａｎ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの液体取扱ロボットであり、任意選択で、液体取扱ロボットが、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ、ＢｉｏＴｅｋ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、又はＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘである、実施形態７５に記載の方法。
【0343】
実施形態７７．液体取扱ロボットが、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡｕｔｏＬｙｓ ＳＴＡＲである、実施形態７５又は７６に記載の方法。
【0344】
実施形態７８．ステップｃ）が、ＲＮＡ及びＤＮＡを脱パラフィンした試料から抽出することを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0345】
実施形態７９．ステップａ）が、ｉ）パラフィン包埋組織中の目的の腫瘍細胞を含む標的領域を特定することと、ｉｉ）パラフィン包埋試料をパラフィン包埋組織から抽出することと、ｉｉｉ）パラフィン包埋組織中のパラフィン包埋試料の場所を特定することと、ｉｖ）パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合う場合、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを試料から抽出するか、又はステップｂに進むことと、を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0346】
実施形態８０．パラフィン包埋試料の場所が目的の腫瘍細胞を含む標的領域と重なり合わない場合、ステップｉｉ）及びｉｉｉ）を繰り返す、実施形態７９に記載の方法。
【0347】
実施形態８１．ステップｉｉ）が、針を使用してパラフィン包埋試料を抽出することを含む、実施形態７９又は実施形態８０に記載の方法。
【0348】
実施形態８２．針でパラフィン包埋組織を通して穿刺することにより、パラフィン包埋試料を抽出する、実施形態８１に記載の方法。
【0349】
実施形態８３．針が使い捨て針である、実施形態８１又は実施形態８２に記載の方法。
【0350】
実施形態８４．針が、１３ゲージ針、１４ゲージ針、１５ゲージ針、１６ゲージ針、１７ゲージ針、１８ゲージ針、１９ゲージ針、２０ゲージ針、又は２１ゲージ針である、実施形態８１～８３のいずれか１つに記載の方法。
【0351】
実施形態８５．パラフィン包埋組織から抽出したパラフィン包埋試料が、直径約０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、又は２．３ｍｍである、実施形態７９～８４のいずれか１つに記載の方法。
【0352】
実施形態８６．ステップｉｉ）が、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）又はレーザーブレードを使用してパラフィン包埋試料を抽出することを含む、実施形態７９又は実施形態８０に記載の方法。
【0353】
実施形態８７．ステップｉｉｉ）が、パラフィン包埋組織の切片のスライドを調製することを含む、実施形態７９～８６のいずれか１つに記載の方法。
【0354】
実施形態８８．パラフィン包埋組織の切片を染色する、実施形態８７に記載の方法。
【0355】
実施形態８９．パラフィン包埋組織の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色する、実施形態８７又は実施形態８８に記載の方法。
【0356】
実施形態９０．ステップｉｉｉ）を目視検査により行う、実施形態７９～８９のいずれか１つに記載の方法。
【0357】
実施形態９１．ステップｉｉｉ）をコンピュータシステムにより行う、実施形態７９～８９のいずれか１つに記載の方法。
【0358】
実施形態９２．ステップｉｉｉ）を、画像分析システムを使用して行う、実施形態７９～８９のいずれか１つに記載の方法。
【0359】
実施形態９３．パラフィン包埋試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0360】
実施形態９４．パラフィン包埋試料が、生検、任意選択で腫瘍生検に由来する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0361】
実施形態９５．パラフィン包埋試料が固定パラフィン包埋試料である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0362】
実施形態９６．固定パラフィン包埋試料が、ホルマリン固定試料、エタノール固定試料、及びメタノール固定試料からなる群から選択される、実施形態９５に記載の方法。
【0363】
実施形態９７．パラフィン包埋試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から得られる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0364】
実施形態９８．パラフィン包埋試料が、凍結保存組織から得られる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0365】
実施形態９９．パラフィン包埋試料が、新鮮凍結組織から得られる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0366】
実施形態１００．新鮮凍結組織が、最適切断温度（ＯＣＴ）の化合物中で凍結する、実施形態９９に記載の方法。
【0367】
実施形態１０１．ＤＮＡを抽出する前に、ＲＮＡを抽出する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0368】
実施形態１０２．パラフィン包埋試料をステップｂ）の前に消化させることを更に含む、実施形態１０１に記載の方法。
【0369】
実施形態１０３．プロテイナーゼを使用して、パラフィン包埋試料を消化させる、実施形態１０２に記載の方法。
【0370】
実施形態１０４．プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、実施形態１０３に記載の方法。
【0371】
実施形態１０５．約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して、パラフィン包埋試料を消化させる、実施形態１０４に記載の方法。
【0372】
実施形態１０６．パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、又は約６２℃でインキュベートする、実施形態１０３～１０５のいずれか１つに記載の方法。
【0373】
実施形態１０７．パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間インキュベートする、実施形態１０３～１０６のいずれか１つに記載の方法。
【0374】
実施形態１０８．パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする、実施形態１０３～１０７のいずれか１つに記載の方法。
【0375】
実施形態１０９．パラフィン包埋試料を部分的に消化させる又は完全に消化させる、実施形態１０２～１０８のいずれか１つに記載の方法。
【0376】
実施形態１１０．消化させた試料をステップｂ）の後に脱架橋することを更に含む、実施形態１０２～１０９のいずれか１つに記載の方法。
【0377】
実施形態１１１．脱架橋することが、消化させた試料を８０～９０℃に加熱することを含む、実施形態１１０に記載の方法。
【0378】
実施形態１１２．消化させた試料を、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分間加熱する、実施形態１１１に記載の方法。
【0379】
実施形態１１３．ステップｃ）が、ＲＮＡを含む試料溶解物を、消化させたパラフィン包埋試料から収集し、ＲＮＡを、ＲＮＡを含む試料溶解物から精製することを含む、実施形態１０２～１１２のいずれか１つに記載の方法。
【0380】
実施形態１１４．消化させたパラフィン包埋試料を完全に消化させることを更に含む、実施形態１１３に記載の方法。
【0381】
実施形態１１５．完全な消化を、プロテイナーゼを使用して行う、実施形態１１４に記載の方法。
【0382】
実施形態１１６．プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、実施形態１１５に記載の方法。
【0383】
実施形態１１７．約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して、消化させたパラフィン包埋試料を消化させる、実施形態１１６に記載の方法。
【0384】
実施形態１１８．消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする、実施形態１１４～１１７のいずれか１つに記載の方法。
【0385】
実施形態１１９．消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする、実施形態１１４～１１８のいずれか１つに記載の方法。
【0386】
実施形態１２０．消化させたパラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、７００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、１１００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１３００ｒｐｍ、１４００ｒｐｍ、又は１５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする、実施形態１１４～１１９のいずれか１つに記載の方法。
【0387】
実施形態１２１．ＤＮＡを含む試料溶解物を、完全に消化させたパラフィン包埋試料から収集することを更に含む、実施形態１１４～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0388】
実施形態１２２．ＤＮＡを含む試料溶解物からＤＮＡを精製することを更に含む、実施形態１１４～１２１のいずれか１つに記載の方法。
【0389】
実施形態１２３．ＲＮＡを抽出する前に、ＤＮＡを抽出する、実施形態１～１００のいずれか１つに記載の方法。
【0390】
実施形態１２４．パラフィン包埋試料をステップｂ）の後に完全に消化させることを更に含む、実施形態１２３に記載の方法。
【0391】
実施形態１２５．完全な消化を、プロテイナーゼを使用して行う、実施形態１２４に記載の方法。
【0392】
実施形態１２６．プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、実施形態１２５に記載の方法。
【0393】
実施形態１２７．約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、又は約３５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを使用して、パラフィン包埋試料を消化させる、実施形態１２６に記載の方法。
【0394】
実施形態１２８．パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃でインキュベートする、実施形態１２５～１２７のいずれか１つに記載の方法。
【0395】
実施形態１２９．パラフィン包埋試料を、プロテイナーゼとともに、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、又は約２２時間インキュベートする、実施形態１２５～１２８のいずれか１つに記載の方法。
【0396】
実施形態１３０．ＤＮＡを完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の方法。
【0397】
実施形態１３１．ＲＮＡを完全に消化させたパラフィン包埋試料から抽出することを更に含む、実施形態１３０に記載の方法。
【0398】
実施形態１３２．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量を測定することを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0399】
実施形態１３３．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量が、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇ、約６０ｎｇ、約７０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０μｇ、又は約５０ｍｇである、実施形態１３２に記載の方法。
【0400】
実施形態１３４．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析することを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0401】
実施形態１３５．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを次世代配列決定により分析することを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0402】
実施形態１３６．ｅ）任意選択で、１つ以上のアダプターを、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡにライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、ｄ）任意選択で、核酸を、ライゲーションした核酸から増幅することと、ｆ）任意選択で、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を捕捉することと、ｇ）配列決定装置によって、複数の核酸を配列決定して、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、ｈ）複数の配列リードを分析することと、ｉ）分析に基づいて、目的の遺伝子中の１つ以上の変異を検出することと、を更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0403】
実施形態１３７．１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を、ベイト分子とのハイブリダイゼーションにより、増幅した核酸から捕捉する、実施形態１３６に記載の方法。
【0404】
実施形態１３８．１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を、増幅した核酸から富化し、任意選択で、１つ以上の目的の遺伝子に対応する複数の核酸を、ビオチン／ストレプトアビジンタグ付けにより、増幅した核酸から富化する、実施形態１３６に記載の方法。
【0405】
実施形態１３９．ステップｅ）の前に、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを断片化し、任意選択で、パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、超音波処理により断片化する、実施形態１３６～１３８のいずれか１つに記載の方法。
【0406】
実施形態１４０．断片化したパラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを末端修復する、実施形態１３９に記載の方法。
【0407】
実施形態１４１．末端修復し断片化した、試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、ｄＡテール状又はｄＴテール状である、実施形態１４０に記載の方法。
【0408】
実施形態１４２．パラフィン包埋試料から抽出したＤＮＡを分析して、ｉ）点変異、ｉｉ）１つ以上のコドンのインフレーム欠失、ｉｉｉ）遺伝子内欠失、ｉｖ）遺伝子内挿入、ｖ）遺伝子全体の欠失、ｖｉ）逆位、ｖｉｉ）染色体間転座、ｖｉｉｉ）縦列重複、ｉｘ）遺伝子融合、ｘ）イントロン配列を含むゲノム再編成、及び／又はｘｉ）遺伝子増幅若しくは重複、からなる群から選択される体細胞変異を検出することを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0409】
実施形態１４３．体細胞変異が、遺伝子中にあり、遺伝子が、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、又はＴＰ５３である、実施形態１４２に記載の方法。
【0410】
実施形態１４４．体細胞変異が、遺伝子中にあり、遺伝子が、ＡＢＬ２、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ６、ＬＴＫ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＫ、ＴＮＫＳ２、ＴＯＰ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、又はＷＴ１である、実施形態１４２に記載の方法。
【0411】
実施形態１４５．パラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡを分析して、ｉ）遺伝子融合、ｉｉ）エクソンスキッピング事象、ｉｉｉ）スプライスバリアント、及び／又はｉｖ）改変された遺伝子発現、からなる群から選択される改変を検出することを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0412】
実施形態１４６．パラフィン包埋試料中の１つ以上の目的の遺伝子のヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）の検出を更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0413】
実施形態１４７．パラフィン包埋試料中のＳＴ７／ＲＡＹ１、ＡＲＨ１／ＮＯＥＹ２、ＴＳＬＣ１、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＤＣＣ、ＴＰ５３、ＡＴＭ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ＮＡＴ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＯＧＧ１、ＣＤＨ１、ＩＧＦ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／Ｐ５７、ＭＥＮ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、Ｈ１９、ＫＲＡＳ、ＢＡＰ１、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＵＦＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＰＰ６Ｃ、ＬＡＴＳ１、ＣＡＳＰ８、ＰＴＰＮ１４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＢＸＷ７、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮ－α、嗅覚受容体遺伝子、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＤＵＴＴ１、ＦＨＩＴ、ＡＰＣ、Ｐ１６、ＦＣＭＤ、ＴＳＣ２、ｍｉＲ－３４、ｃ－ＭＰＬ、ＲＵＮＸ３、ＤＩＲＡＳ３、ＮＲＡＳ、ｍｉＲ－９、ＦＡＭ５０Ｂ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＲ、ＦＬＴ３、ＺＤＢＦ２、ＧＰＲ１、ｃ－ＫＩＴ、ＮＡＰ１Ｌ５、ＧＲＢ１０、ＥＧＦＲ、ＰＥＧ１０、ＢＲＡＦ、ＭＥＳＴ、ＪＡＫ２、ＤＡＰＫ１、ＬＩＴ１、ＷＴ１、ＮＦ－１、ＰＲ、ｃ－ＣＢＬ、ＤＬＫ１、ＡＫＴ１、ＳＮＵＲＦ、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）、ＺＮＦ５８７、ＳＯＣＳ１、ＴＩＭＰ２、ＲＵＮＸ１、ＡＲ、ＣＥＢＰＡ、Ｃ１９ＭＣ、ＥＭＰ３、ＺＮＦ３３１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＥＧ３、ＮＮＡＴ、ＧＮＡＳ、及び／又はＧＡＴＡ５のＬＯＨを検出することを更に含む、実施形態１４６に記載の方法。
【0414】
実施形態１４８．パラフィン包埋試料中のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子のＬＯＨを検出することを更に含む、実施形態１４６に記載の方法。
【0415】
実施形態１４９．１つ以上のアダプターをパラフィン包埋試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡのうちの１つ以上にライゲーションすることで、ライゲーションした核酸を生成することと、ライゲーションした核酸を増幅することと、増幅した核酸からＨＬＡ遺伝子に対応する複数の核酸を、ベイト分子を使用して捕捉することと、捕捉した核酸を配列決定して、ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の配列リードを取得することと、１つ以上のプロセッサによって、複数の配列リードのうちの１つ以上に関連する１つ以上の値をモデルに適合させることと、モデルに基づいて、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及びＨＬＡ遺伝子のＨＬＡアレルについての相対的な結合傾向を検出することと、を更に含む、実施形態１４８に記載の方法。
【0416】
実施形態１５０．ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及びＨＬＡ遺伝子のＨＬＡアレルについての相対的な結合傾向が、ａ）ＨＬＡアレルについて観察されたアレル頻度を取得することであって、観察されたアレル頻度が、ＨＬＡ遺伝子に対応する複数の配列リード間で検出されたＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸の頻度に対応する、取得することと、ｂ）ＨＬＡアレルのベイト分子に対する相対的な結合傾向を取得することであって、ＨＬＡアレルの相対的な結合傾向は、１つ以上の他のＨＬＡアレルの一部をコードする核酸の存在下、ＨＬＡアレルの少なくとも一部をコードする核酸がベイト分子に結合する傾向に対応する、取得することと、ｃ）目的関数を適用して、ＨＬＡアレルの相対的な結合傾向と観察されたアレル頻度との間の差を測定することと、ｄ）最適化モデルを適用して、目的関数を最小化することと、ｅ）最適化モデル及び観察されたアレル頻度に基づいて、ＨＬＡアレルの調整されたアレル頻度を決定することと、ｆ）ＨＬＡアレルの調整されたアレル頻度が所定の閾値よりも小さい場合、ＬＯＨが発生したと決定することと、によって検出される、実施形態１４９に記載の方法。
【0417】
実施形態１５１．パラフィン包埋試料が、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）以外の有効量の治療を個体に投与することを更に含む、実施形態１４９又は実施形態１５０に記載の方法。
【0418】
実施形態１５２．ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）以外の治療を推奨することを更に含む、実施形態１４９又は１５０に記載の方法。
【0419】
実施形態１５３．パラフィン包埋試料における高い腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）を検出すること、又はその知識を得ることを更に含む、実施形態１４９又は実施形態１５０に記載の方法。
【0420】
実施形態１５４．パラフィン包埋試料が、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び高いＴＭＢの検出に少なくとも部分的に基づいて、有効量の免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を個体に投与することを更に含む、実施形態１５３に記載の方法。
【0421】
実施形態１５５．パラフィン包埋試料が、がんを有することが分かっている又はがんを有することが疑われる個体に由来し、ＨＬＡ遺伝子のＬＯＨ及び高いＴＭＢの検出に少なくとも部分的に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む治療を個体に推奨することを更に含む、実施形態１５３に記載の方法。
【0422】
実施形態１５６．ＨＬＡ遺伝子が、ヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子である、実施形態１４８～１５５のいずれか１つに記載の方法。
【0423】
実施形態１５７．ＴＭＢが、配列決定されたゲノムの１メガベース当たりの非ドライバー体細胞性コード変異の数に基づいて決定される、実施形態１５３～１５６のいずれか１つに記載の方法。
【0424】
実施形態１５８．パラフィン包埋試料中のホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）遺伝子における機能喪失型変異を検出することを更に含む、実施形態１～１４４のいずれか１つに記載の方法。
【0425】
実施形態１５９．ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、若しくは置換、ゲノム再編成、プロモーター中の改変、遺伝子融合、又はコピー数改変のうちの１つ以上を含む、実施形態１５８に記載の方法。
【0426】
実施形態１６０．ＰＴＥＮ遺伝子中の機能喪失型変異を、パラフィン包埋試料中で、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定のうちの１つ以上により検出する、実施形態１５８又は実施形態１５９に記載の方法。
【0427】
実施形態１６１．パラフィン包埋試料中の腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）のレベルを測定することを更に含む、実施形態１～１４４のいずれか１つに記載の方法。
【0428】
実施形態１６２．少なくとも約１０変異／メガベース（Ｍｂ）又は少なくとも約２０ｍｕｔ／ＭｂのＴＭＢを検出する、実施形態１６１に記載の方法。
【0429】
実施形態１６３．ＴＭＢを、パラフィン包埋試料由来のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定により測定する、実施形態１６１又は実施形態１６２に記載の方法。
【0430】
実施形態１６４．ＴＭＢを、約０．８０Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、実施形態１６３に記載の方法。
【0431】
実施形態１６５．ＴＭＢを、約０．８３Ｍｂ～約１．１４Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、実施形態１６３に記載の方法。
【0432】
実施形態１６６．ＴＭＢを、約１．１Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、実施形態１６３に記載の方法。
【0433】
実施形態１６７．ＴＭＢを、最大約１．１Ｍｂの配列決定されたＤＮＡに対して測定する、実施形態１６３に記載の方法。
【0434】
実施形態１６８．パラフィン包埋試料中のホモ接合性単一エクソン喪失を検出することを更に含む、実施形態１～１４４のいずれか１つに記載の方法。
【0435】
実施形態１６９．ホモ接合性単一エクソン喪失を、パラフィン包埋試料由来のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中で、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又は遺伝子標的化配列決定によって検出する、実施形態１６８に記載の方法。
【0436】
実施形態１７０．分析物を検出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法。
【0437】
実施形態１７１．分析物の検出が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１７０に記載の方法。
【0438】
実施形態１７２．分析物の検出が、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される、実施形態１７０に記載の方法。
【0439】
実施形態１７３．分析物の検出が、包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される、実施形態１７０に記載の方法。
【0440】
実施形態１７４．分析物を抽出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【0441】
実施形態１７５．分析物の抽出が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１７４に記載の方法。
【0442】
実施形態１７６．分析物の抽出が、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される、実施形態１７４に記載の方法。
【0443】
実施形態１７７．包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法。
【0444】
実施形態１７８．分析物試料中の包埋剤のレベルが、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、実施形態１７７に記載の方法。
【0445】
実施形態１７９．分析物試料中の包埋剤のレベルが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて低減する、実施形態１７７に記載の方法。
【0446】
実施形態１８０．包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、相転移を包埋剤中で誘導し、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【0447】
実施形態１８１．包埋試料からの包埋剤の分離が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１８０に記載の方法。
【0448】
実施形態１８２．包埋試料からの包埋剤の分離が、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される、実施形態１８０に記載の方法。
【0449】
実施形態１８３．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、実施形態１８０～１８２のいずれか１つに記載の方法。
【0450】
実施形態１８４．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる、実施形態１８０～１８３のいずれか１つに記載の方法。
【0451】
実施形態１８５．フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、実施形態１８３又は実施形態１８４に記載の方法。
【0452】
実施形態１８６．ステップｂ）が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、実施形態１７０～１８４のいずれか１つに記載の方法。
【0453】
実施形態１８７．相転移が、溶融、凍結、気化、凝結、昇華、及び沈着からなる群から選択される、実施形態１７０～１８６のいずれか１つに記載の方法。
【0454】
実施形態１８８．相転移が溶融である、実施形態１７０～１８７のいずれか１つに記載の方法。
【0455】
実施形態１８９．ステップｂ）が、包埋試料の加熱、冷却、圧力増加、又は圧力減少を含む、実施形態１７０～１８８のいずれか１つに記載の方法。
【0456】
実施形態１９０．ステップｂ）が、包埋試料を加熱することを含む、実施形態１７０～１８９のいずれか１つに記載の方法。
【0457】
実施形態１９１．包埋試料を、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃に加熱する、実施形態１９０に記載の方法。
【0458】
実施形態１９２．包埋試料を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間加熱する、実施形態１９０又は実施形態１９１に記載の方法。
【0459】
実施形態１９３．ステップｂ）が、包埋試料を遠心分離させ、濾過して、包埋を試料から分離させることを含む、実施形態１７０～１９２のいずれか１つに記載の方法。
【0460】
実施形態１９４．包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態１９３に記載の方法。
【0461】
実施形態１９５．包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、実施形態１９３又は実施形態１９４に記載の方法。
【0462】
実施形態１９６．包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態１９３～１９５のいずれか１つに記載の方法。
【0463】
実施形態１９７．ステップｂ）が、包埋試料を加熱し、遠心分離させ、濾過して、包埋剤を試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む、実施形態１７０～１９６のいずれか１つに記載の方法。
【0464】
実施形態１９８．ステップｂ）が、包埋試料を加熱し、遠心分離させて、包埋剤を試料から分離させることにより、脱包埋試料を生成することを含む、実施形態１７０～１９６のいずれか１つに記載の方法。
【0465】
実施形態１９９．分析物を検出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）分析物を分析して、分析物を検出することと、を含む、方法。
【0466】
実施形態２００．分析物の検出が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態１９９に記載の方法。
【0467】
実施形態２０１．分析物の検出が、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される、実施形態１９９に記載の方法。
【0468】
実施形態２０２．分析物の検出が、包埋試料を脱包埋しない方法と比べて改善される、実施形態１９９に記載の方法。
【0469】
実施形態２０３．分析物を抽出する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【0470】
実施形態２０４．分析物の抽出が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態２０３に記載の方法。
【0471】
実施形態２０５．分析物の抽出が、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される、実施形態２０３に記載の方法。
【0472】
実施形態２０６．包埋試料から抽出した分析物試料中の包埋剤のレベルを低減させる方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、ｄ）抽出した分析物を精製して、分析物試料を提供することと、を含む、方法。
【0473】
実施形態２０７．分析物試料中の包埋剤のレベルが、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて低減する、実施形態２０６に記載の方法。
【0474】
実施形態２０８．分析物試料中の包埋剤のレベルが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて低減する、実施形態２０６に記載の方法。
【0475】
実施形態２０９．包埋試料からの包埋剤の分離を改善する方法であって、ａ）分析物を含む包埋試料を提供することであって、試料が包埋剤に包埋される、提供することと、ｂ）包埋剤を包埋試料から除去することにより、脱包埋試料を生成することであって、包埋試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋剤を試料から分離させることにより、包埋剤を除去する、生成することと、ｃ）分析物を脱包埋試料から抽出することと、を含む、方法。
【0476】
実施形態２１０．包埋試料からの包埋剤の分離が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて改善される、実施形態２０９に記載の方法。
【0477】
実施形態２１１．包埋試料からの包埋剤の分離が、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて改善される、実施形態２０９に記載の方法。
【0478】
実施形態２１２．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を混和性溶媒に溶解させ、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である方法と比べて少なくなる、実施形態２０９～２１１のいずれか１つに記載の方法。
【0479】
実施形態２１３．方法が、フィルタを備える液体取扱ロボットにおいて行われ、改善された包埋剤の分離により、フィルタの詰まりが、包埋剤を包埋試料から切り離すことにより包埋剤を除去する方法と比べて少なくなる、実施形態２０９～２１２のいずれか１つに記載の方法。
【0480】
実施形態２１４．フィルタが、スピンカラム中のフィルタである、実施形態２１２又は実施形態２１３に記載の方法。
【0481】
実施形態２１５．ステップｂ）が、包埋剤を混和性溶媒に溶解させることを含まず、任意選択で、混和性溶媒が、キシレン、酢酸エチル、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）、又はＵｌｔｒａＣｌｅａｒ（商標）である、実施形態１９９～２１３のいずれか１つに記載の方法。
【0482】
実施形態２１６．不混和性溶媒の密度は、水より軽く、包埋剤が液体形態である場合には包埋剤より重い、実施形態１９９～２１５のいずれか１つに記載の方法。
【0483】
実施形態２１７．不混和性溶媒の密度が、流動パラフィンより重い、実施形態２１６に記載の方法。
【0484】
実施形態２１８．不混和性溶媒が植物油である、実施形態１９９～２１７のいずれか１つに記載の方法。
【0485】
実施形態２１９．不混和性溶媒が鉱油である、実施形態１９９～２１７のいずれか１つに記載の方法。
【0486】
実施形態２２０．包埋試料を、約３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０μＬの鉱油と接触させる、実施形態２１９に記載の方法。
【0487】
実施形態２２１．包埋試料を、鉱油と、約１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、又は５０：１の鉱油と包埋試料との比で接触させる、実施形態２１９又は実施形態２２０に記載の方法。
【0488】
実施形態２２２．鉱油が、包埋試料に、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃で接触する、実施形態２１９～２２１のいずれか１つに記載の方法。
【0489】
実施形態２２３．鉱油が、包埋試料に、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、又は約３５分間接触する、実施形態２１９～２２２のいずれか１つに記載の方法。
【0490】
実施形態２２４．鉱油が、約２５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、又は約１１００ｒｐｍで振盪している間に、包埋試料に接触する、実施形態２１９～２２３のいずれか１つに記載の方法。
【0491】
実施形態２２５．ステップｂ）が、試料を不混和性溶媒と接触させ、包埋試料を遠心分離させ、濾過することを含む、実施形態１９９～２２４のいずれか１つに記載の方法。
【0492】
実施形態２２６．包埋試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態２２５に記載の方法。
【0493】
実施形態２２７．包埋試料を、１，８１１ｒｃｆ以上で遠心分離させる、実施形態２２５又は実施形態２２６に記載の方法。
【0494】
実施形態２２８．包埋試料を、１，８１１ｒｃｆで遠心分離させる、実施形態２２５～２２７のいずれか１つに記載の方法。
【0495】
実施形態２２９．分析物が、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子、脂質、多糖、エクソソーム、ミトコンドリア、及び核からなる群から選択される、実施形態１７０～２２８のいずれか１つに記載の方法。
【0496】
実施形態２３０．包埋剤が、パラフィン、樹脂、セロイジン、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）、ゼラチン、エステルワックス、ワックス、ポリエチレングリコール、及びニトロセルロースからなる群から選択される、実施形態１７０～２２９のいずれか１つに記載の方法。
【0497】
実施形態２３２．ＲＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｂ）試料を５０℃～７５℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｃ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｄ）ＲＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【0498】
実施形態２３３．ステップｃ）の後、ステップｄ）の前に、試料を室温に冷却することを更に含む、実施形態２３２に記載の方法。
【0499】
実施形態２３４．試料を室温に冷却した後に、試料を遠心分離させて、溶解物を濾過することを更に含む、実施形態２３３に記載の方法。
【0500】
実施形態２３５．試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることが、５０℃～６０℃でのインキュベーションを含む、実施形態２３２～２３４のいずれか１つに記載の方法。
【0501】
実施形態２３６．試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることが、１～２０分間のインキュベーションを含む、実施形態２３２～２３５のいずれか１つに記載の方法。
【0502】
実施形態２３７．試料を高速で遠心分離させることが、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、実施形態２３２～２３６のいずれか１つに記載の方法。
【0503】
実施形態２３８．ＲＮＡを溶解物から単離する、実施形態２３２～２３７のいずれか１つに記載の方法。
【0504】
実施形態２３９．ＲＮＡを抽出する方法が、ハイスループット法に使用される、実施形態２３２～２３８のいずれか１つに記載の方法。
【0505】
実施形態２４０．ＲＮＡを分析することを更に含む、実施形態２３２～２３９のいずれか１つに記載の方法。
【0506】
実施形態２４１．プロテアーゼとのインキュベーションを、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う、実施形態２３２～２４０のいずれか１つに記載の方法。
【0507】
実施形態２４２．５０℃～８０℃でのインキュベーションを、振盪せずに行う、実施形態２３２～２４１のいずれか１つに記載の方法。
【0508】
実施形態２４３．ステップｃ）の後に、試料を２５０ＲＣＦ～７５０ＲＣＦで遠心分離させることを更に含む、実施形態２３２～２４２のいずれか１つに記載の方法。
【0509】
実施形態２４４．ｃＤＮＡをＲＮＡから調製することを更に含む、実施形態２３２に記載の方法。
【0510】
実施形態２４５．ＤＮＡを試料から抽出する方法であって、ａ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｃ）試料を高速で遠心分離させて、ＤＮＡを含む溶解物を生成することと、ｄ）ＤＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【0511】
実施形態２４６．試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う、実施形態２４５に記載の方法。
【0512】
実施形態２４７．ステップｂ）の直後に、試料を２～２０分間１０００ＲＣＦ～４０００ＲＣＦで遠心分離させる、実施形態２４５又は２４６に記載の方法。
【0513】
実施形態２４８．２～２０分間１０００ＲＣＦ～４０００ＲＣＦでの遠心分離の後に、試料を少なくとも４０分間冷蔵する、実施形態２４７に記載の方法。
【0514】
実施形態２４９．試料を冷蔵した後に、ステップｃ）を実行する、実施形態２４８に記載の方法。
【0515】
実施形態２５０．試料を高速で遠心分離させることが、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、実施形態２４５～２４９のいずれか１つに記載の方法。
【0516】
実施形態２５１．ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｃ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、ＲＮＡを含む第１の溶解物から分離させることと、ｄ）ＲＮＡを含む第１の溶解物を吸引することと、ｅ）ＲＮＡを第１の溶解物から単離することと、ｆ）ステップｃ）からの試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｇ）ステップｆ）からの試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｈ）試料を高速で遠心分離させることと、ｉ）ＤＮＡを含む第２の溶解物を吸引することと、ｊ）ＤＮＡを第２の溶解物から単離することと、を含む、方法。
【0517】
実施形態２５２．試料を高速で遠心分離させることが、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、実施形態２５１に記載の方法。
【0518】
実施形態２５３．プロテアーゼとのインキュベーションを、ステップａ及び／又はステップｆにおいて、５００～２０００ｒｐｍで振盪しながら行う、実施形態２５１又は２５２に記載の方法。
【0519】
実施形態２５４．試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることが、５０℃～６０℃でのインキュベーションを含む、実施形態２５１～２５３のいずれか１つに記載の方法。
【0520】
実施形態２５５．試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることが、１～２０分間のインキュベーションを含む、実施形態２５１～２５４のいずれか１つに記載の方法。
【0521】
実施形態２５６．試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることを、振盪せずに行う、実施形態２５１～２５５のいずれか１つに記載の方法。
【0522】
実施形態２５７．ＲＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を試料に加えることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｃ）試料を室温に冷却することと、ｄ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｆ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｇ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィン及び鉱油を、ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｈ）ＲＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【0523】
実施形態２５８．５０℃～８０℃で１～２０分間のインキュベーションを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う、実施形態２５７に記載の方法。
【0524】
実施形態２５９．試料を高速で遠心分離させることが、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、実施形態２５７又は２５８に記載の方法。
【0525】
実施形態２６０．高速での遠心分離の後に、試料を室温でインキュベートする、実施形態２５６～２５９のいずれか１つに記載の方法。
【0526】
実施形態２６１．室温でのインキュベーションの後に、試料を遠心分離させることを更に含む、実施形態２６０に記載の方法。
【0527】
実施形態２６２．ＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を試料に加えることと、ｂ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｃ）試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｄ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィンを、ＤＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｅ）ＤＮＡを含む溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【0528】
実施形態２６３．ステップｂ）の前に、鉱油を除去する、実施形態２６２に記載の方法。
【0529】
実施形態２６４．試料を高速で遠心分離させることが、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、実施形態２６２又は２６３に記載の方法。
【0530】
実施形態２６５．試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う、実施形態２６２～２６４のいずれか１つに記載の方法。
【0531】
実施形態２６６．試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートした後、ステップｄ）の前に、即座に、試料を２０００～５０００ＲＣＦで遠心分離させる、実施形態２６２～２６５のいずれか１つに記載の方法。
【0532】
実施形態２６７．ＲＮＡ及びＤＮＡをパラフィン包埋試料から抽出する方法であって、ａ）鉱油を試料に加えることと、ｂ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることにより、パラフィンを溶融させることと、ｃ）試料を室温に冷却することと、ｄ）試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｅ）試料を５０℃～８０℃で１～４０分間インキュベートすることと、ｆ）試料を高速で遠心分離させて、パラフィン及び鉱油を、ＲＮＡを含む溶解物から分離させることと、ｇ）ＲＮＡを含む溶解物を吸引することと、ｈ）ＲＮＡを溶解物から単離することと、ｉ）ステップｇ）からの溶解物を高速で遠心分離させて、溶解物を鉱油から分離させることと、ｊ）ステップｉ）からの試料をプロテアーゼとともにインキュベートすることと、ｋ）ステップｊ）からの試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることと、ｌ）試料を高速で遠心分離させることと、ｍ）ＤＮＡを含む第２の溶解物を吸引することと、を含む、方法。
【0533】
実施形態２６８．試料を高速で遠心分離させることが、試料を、約１，７００ｒｃｆ、約１，７５０ｒｃｆ、約１，８００ｒｃｆ、約１，８５０ｒｃｆ、又は約１，９００ｒｃｆで遠心分離させることを含む、実施形態２６７に記載の方法。
【0534】
実施形態２６９．試料を５０℃～８０℃で２～４８時間インキュベートすることを、５００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで振盪しながら行う、実施形態２６７～２６８のいずれか１つに記載の方法。
【0535】
実施形態２７０．プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、実施形態２３２～２６９のいずれか１つに記載の方法。
【0536】
実施形態２７１．試料が、サイズ約３０μｍ３未満である、実施形態１～２７０のいずれか１つに記載の方法。
【0537】
実施形態２７２．試料が、サイズ約０．３μｍ３～約５．５μｍ３である、実施形態１～２７１のいずれか１つに記載の方法。
【0538】
実施形態２７３．試料から抽出したＲＮＡ及び／又はＤＮＡを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅ベースのアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、次世代配列決定、スクリーニング分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、スペクトル核型分析、マルチカラーＦＩＳＨ（ｍＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析遺伝子型決定からなる群から選択される１つ以上の方法により分析することを更に含む、実施形態２３２～２７２のいずれか１つに記載の方法。
【0539】
実施形態２７４．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを分析することが、次世代配列決定を含む、実施形態２７３に記載の方法。
【0540】
実施形態２７５．ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを配列決定するための配列決定ライブラリを調製することを更に含む、実施形態２３２～２７４のいずれか１つに記載の方法。
【0541】
実施形態２７６．ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、ハイブリッド捕捉ベースの配列決定を使用して配列決定することを更に含む、実施形態２３２～２７５のいずれか１つに記載の方法。
【0542】
実施形態２７７．試料は、がんを有することが分かっている又はがんを有する疑いがある個体に由来する、実施形態２３２～２７６のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【0543】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解される。しかしながら、実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載される例及び実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正又は変更が当業者に提案され、本出願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれることが理解される。
【0544】
実施例１．共抽出 熱／クリーミング「温溶解物スピン」法
この実施例は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ供抽出を、図３Ａ（右の縦列）及び図３Ｂ（右の縦列）に概説するように説明し、これは、「温溶解スピン」、「温溶解物法」、又は「温溶解物プロセス」と称される。本方法は、「標準的溶解」プロセスと比較することができ、このプロセスは、図３Ａ（左の縦列）及び図３Ｂ（左の縦列）に概説する。
この実施例は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ供抽出を、図３Ａ（右の縦列）及び図３Ｂ（右の縦列）に概説するように説明し、これは、「温溶解スピン」、「温溶解物法」、又は「温溶解物プロセス」と称される。本方法は、「標準的溶解」プロセスと比較することができ、このプロセスは、図３Ａ（左の縦列）及び図３Ｂ（左の縦列）に概説する。
【0545】
１Ａ．ＲＮＡ ＡｕｔｏＬｙｓ共抽出及び精製のためのプロトコル。試薬は、Ｏｍｅｇａ ＭＡＧ－ＢＩＮＤ（登録商標）ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｍ２５５１）から入手し、これには、ＲＭＬ緩衝液、プロテイナーゼＫ溶液、ＭＦＢ緩衝液、ＭＡＧ－ＢＩＮＤ（登録商標）粒子ＳＣ、ＲＮＡ洗浄緩衝液ＩＩ、ＧＦＣ緩衝液、ＤＮａｓｅ消化緩衝液、及びＭＡＧ－ＢＩＮＤ（登録商標）ＤＮａｓｅ Ｉが含まれる。
【0546】
（１）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）カールを、ＡｕｔｏＬｙｓチューブの中に置く。最大２００μｍのＦＦＰＥパラフィン化カールを一本のチューブで抽出することができる。細胞スメアのために、カバースリップを取り外し（以下の実施例３で説明する方法のとおり）、組織をＡｕｔｏＬｙｓチューブの中に擦り取る。（２）ＡｕｔｏＬｙｓチューブに蓋をし、組織消化に進む前に、ＡｕｔｏＬｙｓチューブが「下」位置にあること（内側チューブが外側チューブの中に完全に下げられている状態）を確認する。（３）チューブをＡｕｔｏＬｙｓラックの中に整列させる。（４）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを含むラックを３分間３，０００ＲＰＭで遠心分離させて、組織をチューブの上部から引き離す。（５）３１５μＬのＯｍｅｇａ ＲＭＬ緩衝液と３５μＬのＯｍｅｇａプロテイナーゼ溶液とを組み合わせて、ＲＮＡ消化ミックスを調製する。試料当たり合計３５０μＬのミックスを使用する。ミックスを少なくとも１５回逆さにして、混合する。（６）チューブの蓋を外し、３５０μＬのＲＮＡ消化ミックスで各チューブにピペッティングする。チューブに再度蓋をする。（７）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを含むラックを、ＶｏｒＴｅｍｐインキュベーターを使用し、１５分間５６℃で（ＶｏｒＴｅｍｐは５６℃に予熱する）、１，０００ＲＰＭで振盪しながらインキュベートする。（８）ステップ（７）の後、ラックを、７０℃に予熱した異なるＶｏｒＴｅｍｐに移動させ、振盪せずに５分間インキュベートする。このステップにより、パラフィンの全てが溶融し、エマルションとなったことが確実となる。（９）（８）のインキュベーションが完了したら、ラックを取り出し、即座に、試料を、内側チューブが下側位置にある状態で、３分間１，８１１ＲＣＦで遠心分離させる。このステップにより、相の分離が確実となり、溶融したパラフィンがＡｕｔｏＬｙｓチューブ中の液体の上部に浮き上がるようになる。（１０）遠心分離の後、チューブラックを遠心分離から取り出し、５分間室温で冷却する。このステップにより、溶融したパラフィンが液体カラムの上部で環を形成するようになる。（１１）チューブを含むラックを遠心分離から取り出す。（１２）内側ＡｕｔｏＬｙｓチューブを持ち上げ、ロックし、ラックに戻す。（１３）ラックを２分間５００ＲＣＦで遠心分離させる。（１４）ピペットを使用して、溶解物を収集チューブから吸引し、「溶解物」とラベル付けした空の９６ディープウェルのＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックに分注する。試料を即座にＤＮＡ消化に進めない場合、内側チューブを伴うＡｕｔｏＬｙｓチューブを底位置に戻し、４℃で２０時間まで貯蔵する。（１５）即座の脱架橋のために、９６ディープウェルＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックを封止する（ＭｉｃｒｏＡＭＰ Ｃｌｅａｒ接着フィルムを使用）。（１６）ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックをＶｏｒＴｅｍｐに置く。（１７）ＲＮＡを、１，０００ＲＰＭで振盪しながら、８０℃で６０分間脱架橋する。（１８）インキュベートしている間に、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ試薬プレートを調製する。（１９）脱架橋が完了したら、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックを氷上に少なくとも５分間置いて、溶解物を冷却する。（２０）次に、このプロセスを、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒでのＲＮＡ抽出に直接進める。
【0547】
（２１）Ｏｍｅｇａ ＭＡＧ－ＢＩＮＤ（登録商標）粒子ＳＣを、その４℃での貯蔵から取り出す。（２２）冷却したＲＮＡ溶解物プレートを、１分間２，０００ＲＰＭで遠心分離させる。（２３）ＭＦＢ緩衝液及びＭＡＧ－ＢＥＡＤ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを調製する。ＭＡＧ－ＢＩＮＤ粒子ＳＣを加える前に、ボトルを１０回逆さにし、１０秒間ボルテックスして、ビーズ溶液が完全に均質であることを確実にする。１０秒後にビーズが完全に均質でない場合、必要に応じて混合を繰り返す。（２４）３５０μＬのＯｍｅｇａ ＭＦＢ緩衝液、３５μＬのＭａｇビーズＳＣ、及び６５０μＬの１００％エタノールを溶解物ブロックのウェルに加える。ピペットを使用して、溶液を１５～２０回混合する。（２５）体積の半分を、「溶解物２」とラベル付けした第２の９６ディープウェルＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックにピペッティングすることにより、溶液を分割する。
【0548】
（２６）以下のように、残りの試薬ブロックをラベル付けし、調製し、手短に遠心分離させる：（２７）「洗浄１」８００μＬのＲＮＡ洗浄緩衝液ＩＩ、ディープウェル、（２８）「洗浄２」４００μＬのＲＮＡ洗浄緩衝液ＩＩ、（２９）「洗浄３」４００μＬのＲＮＡ洗浄緩衝液ＩＩ、ディープウェル、（３０）「ＤＮａｓｅ混合物」１．５μＬのＤＮａｓｅを含む７３．５μＬのＤＮａｓｅ緩衝液、ディープウェル、（３１）ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｔｉｐ Ｃｏｍｂ、ディープウェル（遠心分離不要）、（３２）「溶出」６５μＬのＤＥＰＣ水、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ ９６ ＫＦマイクロプレート（２００μＬ）。
【0549】
（３３）ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒマシンにロードし、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ ＲＮＡ抽出を、カスタムプロトコルを使用して実行する。
【0550】
（３４）完了したら、マイクロプレートからのＲＮＡ溶出液を、個々のチューブに移し、－８０℃で貯蔵する。試料を即座にＤＮＡ消化に進めない場合、ＡＬラックを４℃で２０時間まで貯蔵してもよい。
【0551】
１Ｂ ＤＮＡ ＡｕｔｏＬｙｓ共抽出及び精製のためのプロトコル。使用した試薬には、Ｐｒｏｍｅｇａインキュベーション緩衝液、ＰｒｏｍｅｇａプロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）凍結乾燥状態、ヌクレアーゼ不含水、Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ洗浄緩衝液、エチルアルコール２００プルーフ、イソプロピルアルコール、Ｏｍｅｇａ ＭＡＧ－ＢＩＮＤ（登録商標）粒子ＣＨ、Ｏｍｅｇａ ＭＢ４緩衝液、Ｏｍｅｇａ ＭＰＷ緩衝液、及び１倍Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）が含まれる。
【0552】
（３５）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを４℃の貯蔵から取り出す。チューブを２分間８００ＲＣＦで遠心分離させて、組織及び／又は結露をチューブの上部から引き離す。（３６）３１５μＬのＰｒｏｍｅｇａインキュベーション緩衝液及び３５μＬのＰｒｏｍｅｇａ ＰｒｏＫ（新たなプロテイナーゼＫを５ｍＬのヌクレアーゼ不含水で水和させた後）を用いて、マスターミックスを調製する。３５０μＬを、内側チューブが下位置にある状態で、各ＡｕｔｏＬｙｓチューブにピペッティングする。（３７）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを、ＶｏｒＴｅｍｐ中、１，０００ＲＰＭで振盪しながら、８～２０時間７０℃でインキュベートする。（３８）ＶｏｒＴｅｍｐインキュベーションの後、ラックをＶｏｒＴｅｍｐから取り出し、即座に１０分間３，０００ＲＣＦで遠心分離させる。（３９）ラックを遠心分離から取り出し、４℃の冷蔵庫に少なくとも４０分間貯蔵する。（４０）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを持ち上げ、ロックし、ラックに戻す。（４１）ラックを２分間１，８１１ＲＣＦで遠心分離させる。（４２）ピペットを使用して、溶解物を収集チューブから吸引し、「溶解物」とラベル付けした空の９６ディープウェルのＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックに分注する。次に、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒでのＤＮＡ精製に直接進む。（４３）５０μＬのＭａｇＢｉｎｄ ＣＨビーズを加える。（４４）８７５μＬのＭＢ４緩衝液を５０μＬのＭａｇＢｉｎｄビーズに加え、ピペットを使用して、１５～２０回混合する。体積の半分（約６４０μＬ）を、「溶解物２」とラベル付けした第２の９６ディープウェルＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒブロックにピペッティングすることにより、溶液を分割する。
【0553】
（４５）以下のように、残りの試薬ブロックをラベル付けし、調製し、手短に遠心分離させる：１．「洗浄１」８００μＬのＤＮＡ洗浄緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）、ディープウェル、２．「洗浄２」４００μＬのＤＮＡ洗浄緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）、ディープウェル、３．「ＭＰＷ」４００μＬのＭＰＷ緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）、ディープウェル、４．ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｔｉｐ Ｃｏｍｂ、ディープウェル（遠心分離不要）、及び５．「溶出」７５μＬの１倍ＴＥ、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ ９６ ＫＦマイクロプレート（２００μＬ）。
【0554】
（４６）カスタムプロトコルをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒで使用し、ブロックをロードし、プログラムを実行する。完了したら、マイクロプレートからのＤＮＡ溶出液をマトリックスチューブに移し、２０℃で貯蔵する。
【0555】
実施例２．共抽出 鉱油法（ＦＦＰＥ組織）
この実施例は、油法を使用するＲＮＡ及び／又はＤＮＡ供抽出を、３Ａ（中央の縦列）及び図３Ｂ（中央の縦列）に概説するように説明する。
この実施例は、油法を使用するＲＮＡ及び／又はＤＮＡ供抽出を、３Ａ（中央の縦列）及び図３Ｂ（中央の縦列）に概説するように説明する。
【0556】
Ａ．ＲＮＡ ＡｕｔｏＬｙｓ共抽出及び精製のためのプロトコル。（１）ＦＦＰＥ １０～２００μｍのカールをＡｕｔｏＬｙｓチューブ中にプレーティングする。最大２００μｍのＦＦＰＥパラフィン化カールを一本のチューブで抽出することができる。（２）ＡｕｔｏＬｙｓチューブに蓋をし、組織消化に進む前に、ＡｕｔｏＬｙｓチューブが「下」位置にあること（内側チューブが外側チューブの中に完全に下げられている状態）を確認する。（３）チューブをＡｕｔｏＬｙｓラック中に整列させる。（４）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを含むラックを２分間８００ＲＰＭで遠心分離させて、組織をチューブの上部から引き離す。（５）チューブに蓋をする。（６）３００μＬの鉱油を各チューブに加える。（７）チューブに再度蓋をする。（８）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを含むラックを、１，０００ｒｐｍで振盪してパラフィンを溶融させながら、予熱したＶｏｒＴｅｍｐを使用して２０分間６５℃でインキュベートする。このステップにより、全てのパラフィンが溶融したことが確実となる。（９）インキュベーションが完了したら、ラックをＶｏｒＴｅｍｐから取り出し、室温で１０分間インキュベートする。（１０）試料を冷却させている間に、３１５μＬのＯｍｅｇａ ＲＭＬ緩衝液と３５μＬのＯｍｅｇａプロテイナーゼ溶液とを組み合わせて、ＲＮＡ消化ミックスを調製する。試料当たり３５０μＬのＲＮＡ消化ミックスを調製する。ＲＮＡ消化ミックスを、少なくとも１５回、ボルテックスではなく逆さにして混合する。（１１）チューブの蓋を外し、３５０μＬのＲＮＡ消化ミックスを各チューブにピペッティングする。チューブに蓋をする。（１２）ラックを１，８１１ＲＣＦで２分間スピンさせる。（１３）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを含むラックを、１，０００ｒｐｍで振盪しながら、ＶｏｒＴｅｍｐを使用して１５分間５６℃でインキュベートする。（１４）インキュベーションが完了したら、ＡｕｔｏＬｙｓチューブを含むラックを取り出し、即座に次に進めて、内側チューブが下位置にある状態で、試料を８分間１，８１１ＲＣＦで遠心分離させる。このステップにより、相が分離するようになり、溶融したパラフィン及び油がＡｕｔｏＬｙｓチューブ中の液体の上部に浮き上がるようになる。（１５）チューブを５分間室温に置く。（１６）内側ＡｕｔｏＬｙｓチューブを持ち上げ、ロックし、チューブをラックに戻す。（１７）ラックを２分間５００ＲＣＦで遠心分離させる。（１８）ピペットを使用して、溶解物を収集チューブから吸引し、「溶解物」とラベル付けした空の９６ディープウェルのＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒブロックに分注する。試料を即座にＤＮＡ消化に進めない場合、内側チューブを伴うＡｕｔｏＬｙｓチューブを底位置に戻し、４℃で２０時間まで貯蔵することができる。（１９）ＲＮＡ溶解物を含む９６ディープウェルＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックを封止し（ＭｉｃｒｏＡＭＰ Ｃｌｅａｒ接着フィルムを使用）、脱架橋ステップに即座に進める。（２０）ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックをＶｏｒＴｅｍｐに置く。（２１）ＲＮＡを、１，０００ｒｐｍで振盪しながら、８０℃で６０分間脱架橋する。（２２）インキュベートしている間に、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ試薬プレートを調製する。（２３）脱架橋が完了したら、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒプレートを氷上に少なくとも５分間置いて、溶解物を冷却する。（２４）ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒでのＲＮＡ抽出を、先行実施形態に記載のように行う。
【0557】
Ｂ．ＤＮＡ ＡｕｔｏＬｙｓ共抽出及び精製のためのプロトコル。（１）ＲＮＡ抽出からの部分的に消化させた組織を含むＡｕｔｏＬｙｓチューブを、４℃での貯蔵から取り出す。（２）内側チューブを持ち上げ、ロックする。（３）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを２分間１，８１１ＲＣＦで遠心分離させる。（４）油を外側チューブから除去する。（５）組織消化に進む前に、内側チューブを「下」位置に置く（内側チューブが外側チューブの中に完全に下げられている状態）。（６）３１５μＬのＰｒｏｍｅｇａインキュベーション緩衝液及び３５μＬのＰｒｏｍｅｇａ ＰｒｏＫ（使用前に、新たなＰｒｏＫを５ｍＬのヌクレアーゼ不含水で水和させる）を含むマスターミックスを調製する。３５０μＬのミックスを、内側チューブが「下」位置にある状態で、各ＡｕｔｏＬｙｓチューブにピペッティングする。（７）ＡｕｔｏＬｙｓチューブを、ＶｏｒＴｅｍｐ中、１，０００ｒｐｍで振盪しながら、８～２０時間７０℃でインキュベートする。（８）遠心分離の準備ができたら、ＶｏｒＴｅｍｐインキュベーションを停止する。ラックをＶｏｒＴｅｍｐから取り出し、即座に１０分間３，０００ＲＣＦで遠心分離させる。（９）ラックを遠心分離から取り出し、４℃の冷蔵庫に少なくとも４０分間貯蔵する。（１０）内側ＡｕｔｏＬｙｓチューブを持ち上げ、ロックし、ラックに戻す。（１１）ラックを２分間１，８１１ＲＣＦで遠心分離させる。（１２）ピペットを使用して、溶解物を収集チューブから吸引し、「溶解物」とラベル付けした空の９６ディープウェルのＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックに分注する。次に、試料を、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒでのＤＮＡ精製に直接進める。
【0558】
（１３）５０μＬのＭＡＧ－ＢＩＮＤ（登録商標）ＣＨビーズを加える。（１４）８７５μＬのＭＢ４緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）を５０μＬのＭＡＧ－ＢＩＮＤビーズに加え、ピペットを使用して、溶液を１５～２０回混合する。体積の半分（約６４０μＬ）を、「溶解物２」とラベル付けした第２の９６ディープウェルＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒブロックにピペッティングすることにより、溶液を分割する。
【0559】
（１５）以下のように、残りの試薬ブロックをラベル付けし、調製し、手短に遠心分離させる：ｉ．「洗浄１」８００μＬのＤＮＡ洗浄緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）、ディープウェル、ｉｉ．「洗浄２」４００μＬのＤＮＡ洗浄緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）、ディープウェル、ｉｉｉ．「ＭＰＷ」４００μＬのＭＰＷ緩衝液（Ｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ）、ディープウェル、ｉｖ．ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｔｉｐ Ｃｏｍｂ、ディープウェル（遠心分離不要）、ｖ．「溶出」７５μＬの１倍ＴＥ、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ ９６ ＫＦマイクロプレート（２００μＬ）。
【0560】
（１６）ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒを、カスタムプログラムを使用して実行する。完了したら、ＤＮＡ溶出液をマトリックスチューブに移し、２０℃で貯蔵する。
【0561】
実施例３．カバースリップを外す方法
（１）Ｃｏｐｌｉｎ瓶に新鮮なキシレンを充填する。カバースリップを外したいスライドを瓶に挿入し、カバースリップが落ちるように溶液に少なくとも３０分間浸漬する。（２）カバースリップのないスライドを更に３０分間キシレンに再浸漬して、あらゆる残留封入媒体を標本表面から除去する。（３）スライドを瓶から取り出し、新鮮で清潔な吸収パッドに置く。（４）Ｃｏｐｌｉ瓶を空にし、９５％ ＥｔＯＨを充填して、あらゆる残留封入媒体／キシレンを除去する。（５）瓶を１５～３０秒間インキュベートした後、溶液を廃棄する。（６）新鮮な９５％ ＥｔＯＨを瓶に加え、スライドを沈める。物質を、少なくとも５分であるが１５分以下の間インキュベートさせる。（７）スライドを瓶から取り出し、試料側を上にして清潔なＫｉｍＷｉｐｅに置く。（８）スライドを第２のＫｉｍＷｉｐｅでカバーする。（９）ＲＮＡ／ＤＮＡ共抽出のために、組織をＡｕｔｏＬｙｓチューブに擦り取る。
（１）Ｃｏｐｌｉｎ瓶に新鮮なキシレンを充填する。カバースリップを外したいスライドを瓶に挿入し、カバースリップが落ちるように溶液に少なくとも３０分間浸漬する。（２）カバースリップのないスライドを更に３０分間キシレンに再浸漬して、あらゆる残留封入媒体を標本表面から除去する。（３）スライドを瓶から取り出し、新鮮で清潔な吸収パッドに置く。（４）Ｃｏｐｌｉ瓶を空にし、９５％ ＥｔＯＨを充填して、あらゆる残留封入媒体／キシレンを除去する。（５）瓶を１５～３０秒間インキュベートした後、溶液を廃棄する。（６）新鮮な９５％ ＥｔＯＨを瓶に加え、スライドを沈める。物質を、少なくとも５分であるが１５分以下の間インキュベートさせる。（７）スライドを瓶から取り出し、試料側を上にして清潔なＫｉｍＷｉｐｅに置く。（８）スライドを第２のＫｉｍＷｉｐｅでカバーする。（９）ＲＮＡ／ＤＮＡ共抽出のために、組織をＡｕｔｏＬｙｓチューブに擦り取る。
【0562】
実施例４．標準プロセスと温溶解物プロセスとの比較
標準ＡｕｔｏＬｙｓ法では、遠心分離後にワックス層が生じることが分かった（図２、並びに図３Ａの左の縦列及び図３Ｂの左の縦列にあるプロセスの説明を参照されたい）。標準法を、上の実施例１で説明し、図３Ａの右の縦列及び図３Ｂの右の縦列に概説する温溶解物法と比較した。
標準ＡｕｔｏＬｙｓ法では、遠心分離後にワックス層が生じることが分かった（図２、並びに図３Ａの左の縦列及び図３Ｂの左の縦列にあるプロセスの説明を参照されたい）。標準法を、上の実施例１で説明し、図３Ａの右の縦列及び図３Ｂの右の縦列に概説する温溶解物法と比較した。
【0563】
図９Ａ及び図９Ｂに示すように、温溶解物プロセスにより、内側チューブ内に留まるパラフィン層が生じた（図９Ａと図９Ｂとの両方において白色の矢印で示す；図２の標準プロセス結果と比較）。温溶解物プロセスでは、透明な溶出液が残り、溶解物収集チューブに残留したパラフィンが最小限であった（図９Ａと図９Ｂとの両方において黒色の矢印で示す）。結果は、改善された温溶解物プロセスにより、パラフィン部分を溶解物部分から効率的に分離できることを示し、これは、遠心分離後にワックス（パラフィン）層が残る標準プロセスとは対照的である（図２に示す）。
【0564】
ＲＮＡラボメトリクスを、標準プロセス（アーム２）、温溶解物プロセス（アーム４）により調製したＲＮＡについて、及びベースライン抽出法（アーム６、ＡｕｔｏＬｙｓプロセスのように自動化されていない手動のＲＮＡ抽出プロセス）について収集した。結果を以下の表１に示す。
【表1】
【0565】
詰まり率は、十分な溶解物の回収を損なう、内側ＡｕｔｏＬｙｓチューブのパラフィンによる詰まりの頻度の尺度である。ＲＮＡ抽出（ＲＮＡｘ）は、１９２ｎｇ超のＲＮＡを収集した頻度の尺度である。ライブラリ構築（ＬＣ）通過率は、７５０ｎｇ超のｃＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリが生成された頻度の尺度である。ハイブリッド捕捉（ＨＣ）は、配列決定のための０．１ｎｇ超のＤＮＡを有する捕捉ライブラリが得られる頻度の尺度である。温溶解物プロセスは、標準プロセスと比べた改善を示し、詰まりが顕著に改善し（０％対９．４％）、ＬＣ通過率が改善した（８５．２６％対７４．７４％）。更に、手動の抽出プロセスと比較して、温溶解物プロセスは自動であり、全体的なＲＮＡ収量を顕著に改善させた。手動の抽出と温溶解物プロセスとの間のＬＣ通過率の差は、統計的に有意ではなかった。
【0566】
ＲＮＡ配列決定メトリクスも、標準プロセス、温溶解物プロセスにより、及びベースライン手動ＲＮＡ抽出プロセスにより調製したＲＮＡについて収集した。結果を以下の表２に示す。
【表2】
【0567】
重複前％選択は、ハイブリッド捕捉ベイトが標的とする領域にマッピングするリードのパーセントである。オンターゲット％重複は、オンターゲット別個対のパーセントである。オンターゲット別個対通過率は、３００万超である別個対のパーセントである。インサートサイズ中央値は、アダプター間の核酸断片のサイズである。インサートサイズ通過率は、長さ７０ｎｔ超であるインサートのパーセントである。キメラ％は、リードキメラの百分率である。配列決定メトリクス性能（重複前％選択、オンターゲット％選択、オンターゲット別個対の中央値、オンターゲット別個対通過率、インサートサイズ中央値、インサートサイズ通過率、及びキメラ％）は、全てのプロセスにわたって同等であった。これらのデータにより、温溶解物プロセスが、手動プロセス抽出法と比較して配列決定メトリクスについて高い性能を維持したことが示される。
【0568】
各プロセスにより抽出したＲＮＡからの既知の融合物を検出する能力を評価した。
【表3】
【0569】
表３は、各プロセスにより抽出したＲＮＡからの既知の融合物を検出する能力の評価を示す。３つの既知の融合物ＡＬＫ－ＥＭＬ４、ＲＥＴ－ＣＣＤＣ６、及びＲＯＳ－ＳＬＣ３４Ａ２を評価した。各結果に対する数字は、各融合物を支持する検出したリード数を示す。温溶解物プロセスは、標準法に匹敵するレベルで融合物を検出することができ、手動ＲＮＡ抽出よりも高いレベルで融合物を検出することができた。
【0570】
ＤＮＡラボメトリクスを、標準プロセス（アーム２）、温溶解物プロセス（アーム４）により、及び手動ＤＮＡ抽出プロセス（アーム１、これは複製して行い、ＡｕｔｏＬｙｓプロセスのように自動化されていない）により調製したＤＮＡについて収集した。．結果を以下の表４に示す。
【表4】
【0571】
詰まり％は、回収した溶出液が２５０μＬ未満となるように回収を損なう、内側ＡｕｔｏＬｙｓチューブのパラフィンによる詰まりの頻度の尺度である。ＤＮＡ抽出（ＤＮＡｘ）通過率は、収集したＤＮＡが５５ｎｇ超である頻度の尺度である。ライブラリ構築（ＬＣ）通過率は、５４５ｎｇ超のｃＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリが生成された頻度の尺度である。ハイブリッド捕捉（ＨＣ）通過率は、配列決定のための１４０ｎｇ超のＤＮＡを有する捕捉ライブラリが得られる頻度の尺度である。温溶解物プロセスは、標準プロセスと比べた改善を示し、詰まりが改善した（０％対２％）。更に、温溶解物プロセスは、高い試料成功率（各カテゴリーで９０％超）を有し、２つの手動抽出実験と大きく異ならなかった（ＤＮＡｘ通過率、ＬＣ通過率、及びＨＣ通過率）。
【0572】
ＤＮＡ配列決定メトリクスも、標準プロセス、温溶解物プロセスにより、及び手動ＤＮＡ抽出プロセスにより調製したＤＮＡについて収集した。結果を以下の表５に示す。
【表5】
【0573】
ＣＮＡは、プロセスに対応させた正常参照試料と比較した正規化標的カバレッジであるコピー数改変を表す。重複前％選択は、ハイブリッド捕捉ベイトが標的とする領域にマッピングするリードのパーセントである。インサートサイズ中央値は、アダプター間の核酸断片のサイズである。キメラ％は、リードキメラの百分率である。エクソンカバレッジ中央値について、配列カバレッジは、エクソン領域にある各塩基が配列データにカバーされる回数であり、平均配列カバレッジを各エクソンにおいて計算し、次に、３つの値の中央値（すなわち、エクソンカバレッジ中央値）を使用する。エクソンカバレッジ通過率は、２５０回超のカバレッジ及び５００超のカバレッジで評価した。ＣＮＡノイズスコアは、コピー数プロットにおけるノイズを測定するためのスコアである。「ＣＮＡノイズについて適格」については、ＧＣバイアスが高い又はデータにノイズが多い場合、ＣＮＡコールは、ノイズのレベル内にあるので分解することができず、したがって、ＣＮＡは「適格」とマークされ、非曖昧増幅又は喪失が、ノイズに起因して除去される。配列決定メトリクスデータにより、性能（重複前％選択、インサートサイズ中央値、キメラ％、ＣＮＡノイズ、及びＣＮＡノイズスコア）がプロセスにわたって同等であったことが示される。カバレッジ（２５０回超）についての試料成功率は、自動の方法（標準及び温溶解物）について９８％超であった。標準ＡｕｔｏＬｙｓプロセスと比較して、温溶解物プロセスで、より小さいコピー数ノイズ、及びより少ないＣＮＡに適格な試料の数が観察された。
【0574】
統計分析。標準ＳＯＰ（ＱＳＲ－ＬＡＢ－ＯＰ－０５８）に従い、試料キュレーションの後、バリアントタイプの一致分析（置換、インデル、コピー数改変、融合／再配置）を実施した。あらゆる不一致を調査して、差がキュレーションに依存しなかったことを確実にした。ＣＮＡ一致分析のための追加のビニングを行った。バリアントコールの一致を、２つの手動プロセス複製対である、標準プロセス対各手動プロセス複製と温溶解物対各標準プロセス複製とについて評価した。陽性一致率（ＰＰＡ）、陰性一致率（ＮＰＡ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、及び陰性予測値（ＮＰＶ）の４つのメトリクスを使用して、短ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、改変のコピー数（ＣＮＡ）、及び再配置（ＲＥ）、並びに複合バイオマーカーにより、バリアントコールの一致を評価した。ＣＮＡの一致をコピー数ビンにより更に評価した。４つのメトリクスを以下のように定義した。
【数1】
【0575】
ＮＰＡ及びＮＰＶを計算するために、あらゆる以前のＡＶ試験で検出した全てのバリアント及び試験中の新たなバリアントを含むユニバーサルセットを、各バリアントクラス（ＳＮＶ、ＲＥ、ＣＮＡ）に使用した。
【0576】
結果を以下の表６～１０に要約する。
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【0577】
手動プロセス複製によるＤＮＡ抽出と各複製を用いた標準ＡｕｔｏＬｙｓプロセス及び温溶解物プロセスとの間のインデル及び置換（フィルタなし）の一致率（ＰＰＡ値及びＰＰＶ値）は、９０％より高いことが分かった。これにより、自動抽出法と手動ＤＮＡ抽出法との間でＳＶについて高い一致が示される。手動ＤＮＡ抽出複製間、及び自動共抽出法と手動ＤＮＡ抽出法との間のＳＮＶについてのＮＰＡ及びＮＰＶは、９９．９９％より大きかった。
【表11】
【0578】
上の表１１に示すように、手動ＤＮＡプロセス複製Ａを用いた、標準抽出プロセス（９０．４８％）及び温溶解物プロセス（９０．９１％）についての再配置ＰＰＡは、手動ＤＮＡプロセス複製（８１．８２％）間のＰＰＡよりも大きかった。手動ＤＮＡ抽出複製Ｂを用いた、標準プロセス（８５．７１％）及び温溶解物プロセス（８１．８２％）についてのＰＰＡは、手動ＤＮＡ抽出複製（８１．８２％）間のＰＰＡに類似していた。手動ＤＮＡ抽出複製を用いた標準及び温溶解物についてのＰＰＶは、７５％であることが分かった手動ＤＮＡ抽出複製Ｂを用いた温溶解物一致を除き、手動ＤＮＡ抽出複製（８１．８２％）間の一致よりも高かった（８３％超）。温溶解物プロセスのうちの１つについての低い一致率は、試料セットに見られた再配置の数が少なかったことに起因する低い統計的検出力が原因であり得る。手動ＤＮＡ抽出複製間、及び自動共抽出法（標準及び温溶解物）と手動ＤＮＡ抽出との間の再配置についてのＮＰＡ及びＮＰＶは、９９．９９％より大きかった。
【表12】
【表13】
【表14】
【0579】
非曖昧及び非ＶＵＳコピー数増幅については、各手動ＤＮＡ抽出複製と比較した標準プロセス及び温溶解物プロセスのＰＰＡは、８８％より高く、２つの手動ＤＮＡ抽出複製間のＰＰＡより優れていた。しかし、標準プロセス（約１０５）及び手動ＤＮＡ抽出（約１１８）より多くの非曖昧及び非ＶＵＳコピー数増幅が温溶解物プロセス（１３０超）から検出されたので、温溶解物抽出はＰＰＶが低い。非曖昧及び非ＶＵＳコピー数喪失の標準プロセスＰＰＡは、手動ＤＮＡ抽出複製Ａと比較してわずか６８．４２％（２６／３８）、手動ＤＮＡ抽出プロセス複製Ｂでは６１．５４％（２４／３９）であり、一方で、ＰＰＡは、２つのＤＮＡ抽出複製間、及び温溶解物プロセスと手動ＤＮＡ抽出との間で８０％を上回る。更にいくつかのコピー数喪失が、標準プロセスでは見逃されたが、手動ＤＮＡ抽出及び温溶解物プロセスでは検出された。全体として、コピー数増幅と喪失とを組み合わせると、温溶解物は、ＰＰＡが標準及び２つの手動ＤＮＡ抽出複製よりも高かったが、標準プロセスは、温溶解物及び２つの手動ＤＮＡ抽出プロセスよりも高いＰＰＶを呈した。
【0580】
結論として、温溶解物法（アーム４）は、全体的なＰＰＡが標準ＡｕｔｏＬｙｓ法（アーム２）よりも高く、ＤＮＡ及びＲＮＡ両方の抽出について詰まりを軽減させ、ＲＮＡのＬＣ通過率を増加させた。温溶解物法は、詰まりを軽減しながら、ベースラインＲＮＡ法及びベースラインＤＮＡ法と同程度に高い配列決定及びバリアント検出性能を維持するので、標準ＡｕｔｏＬｙｓ法に対する改善である。自動温溶解物法を使用して、２つの４０ミクロンのＦＦＰＥカール（ＤＮＡ抽出に１つの４０ミクロンのカール及びＲＮＡ抽出に１つの４０ミクロンのカール）からの手動ＤＮＡ単独抽出（ＤＮＡベースライン法）及びＲＮＡ単独抽出（ＲＮＡベースライン法）と同程度のレベルで、単一の４０ミクロンのＦＦＰＥカールからＲＮＡ及びＤＮＡを抽出することができる。
【0581】
実施例５．標準プロセスと鉱油抽出プロセスとの比較
標準ＡｕｔｏＬｙｓ法は、先行する節で考察したとおり、遠心分離後にワックス層を生じることが分かった。標準法を、上の実施例２で説明し、図３Ａの中央の縦列及び図３Ｂの中央の縦列に概説する鉱油抽出プロセスと比較した。
標準ＡｕｔｏＬｙｓ法は、先行する節で考察したとおり、遠心分離後にワックス層を生じることが分かった。標準法を、上の実施例２で説明し、図３Ａの中央の縦列及び図３Ｂの中央の縦列に概説する鉱油抽出プロセスと比較した。
【0582】
図１０Ａに示すように、鉱油抽出プロセスにより、内側チューブ内に留まるパラフィン層が生じ（図１０Ａにおいて白色の矢印で示す）、透明な溶出液が残り、溶解物チューブに残留しているパラフィンは最小限であった（図１０Ａの黒色の矢印を参照されたい）。図１０Ａの左の２つの縦列に示すように、鉱油プロセスを用いて抽出した試験試料は、透明な溶出液を有した。対照的に、標準プロセスを使用すると（図１０Ｂの右の２つの縦列）、混濁した溶出液が生じ、これは、溶出液にパラフィンが存在することを示す。結果は、改善された鉱油抽出プロセスにより、パラフィン部分を溶解物部分から効率的に分離できることを示し、これは、遠心分離後にワックス（パラフィン）層が残る標準プロセスとは対照的である（図２、及び図１０Ｂの右の２つの縦列に示す）。
【0583】
実施例６．温溶解物法による低組織体積試料
この実験は、低組織体積試料を実施例１で説明した温溶解物共抽出法で処理することの実現可能性を評価するために実施した（図３Ａ及び図３Ｂの右の縦列も参照されたい）。１０個の異なる腫瘍タイプ（膀胱、肺、皮膚、乳房、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓、肝臓、及び結腸）を表す２０個の固有のＦＦＰＥブロックから、ＦＦＰＥ組織カール（合計４０ｕｍの２×２０ｕｍカール）、ＦＦＰＥ組織スライド（合計４０ｕｍの８×５ｕｍスライド、２個の複製）、及び低体積１４ゲージ針穿刺（１×１ｍｍの深さ）という３個の異なる試料タイプを調製した。全ての試料を、温溶解物共抽出法を使用して抽出し、標準ライブラリ調製、ハイブリッド捕捉、及び配列決定プロセスに供した。以下の表１５は、各インプットタイプについての組織体積中央値、最低組織体積、及び最大組織体積を示す。
この実験は、低組織体積試料を実施例１で説明した温溶解物共抽出法で処理することの実現可能性を評価するために実施した（図３Ａ及び図３Ｂの右の縦列も参照されたい）。１０個の異なる腫瘍タイプ（膀胱、肺、皮膚、乳房、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓、肝臓、及び結腸）を表す２０個の固有のＦＦＰＥブロックから、ＦＦＰＥ組織カール（合計４０ｕｍの２×２０ｕｍカール）、ＦＦＰＥ組織スライド（合計４０ｕｍの８×５ｕｍスライド、２個の複製）、及び低体積１４ゲージ針穿刺（１×１ｍｍの深さ）という３個の異なる試料タイプを調製した。全ての試料を、温溶解物共抽出法を使用して抽出し、標準ライブラリ調製、ハイブリッド捕捉、及び配列決定プロセスに供した。以下の表１５は、各インプットタイプについての組織体積中央値、最低組織体積、及び最大組織体積を示す。
【表15】
【表16】
【0584】
上の表１６は、異なる組織インプットからの抽出についてのＤＮＡラボメトリクスの要約を示す。単位組織体積当たりの抽出は、どれくらいの数のｎｇのＤＮＡが組織１ｍｍ３当たり抽出されたかの尺度である。ＤＮＡ抽出（ＤＮＡｘ）通過率は、収集したＤＮＡが５５ｎｇ超である頻度の尺度である。ライブラリ構築（ＬＣ）通過率は、５４５．４５ｎｇ超のｃＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリが生成された頻度の尺度である。ハイブリッド捕捉（ＨＣ）通過率は、配列決定のための１４０～１７８２ｎｇ超のＤＮＡを有する捕捉ライブラリが得られる頻度の尺度である。温溶解物プロセスを使用すると、全ての組織インプット量について、ＤＮＡｘ、ＬＣ収量、及びＨＣ収量の成功率が高かった。予想どおり、低組織体積針穿刺の全ＤＮＡ収量は、４０μｍの対照カール及びスライドよりも低いが、インプット組織の単位当たりの収量は同等である。分析により、温溶解物プロセスを使用して、核酸を少量の組織から効率的に抽出できることが示される。
【表17】
【0585】
上の表１７は、各抽出法のＤＮＡ配列決定メトリクスの要約を示す。重複前％選択は、ハイブリッド捕捉ベイトが標的とする領域にマッピングするリードのパーセントである。インサートサイズ中央値は、アダプター間の核酸断片のサイズである。キメラ％は、リードキメラの百分率である。エクソンカバレッジ中央値について、配列カバレッジは、エクソン領域にある各塩基が配列データにカバーされる回数であり、平均配列カバレッジを各エクソンについて計算し、次に、３つの値の中央値を使用する。エクソンカバレッジ通過率は、２５０回超のカバレッジ及び５００回超のカバレッジで評価した。ＣＮＡノイズスコアは、コピー数プロットにおけるノイズを測定するためのスコアである。これらの分析により、配列決定メトリクス性能は、全ての試料インプットタイプにわたって同等であったこと、及びカバレッジ（２５０回超）についての試料成功率は、全ての試料について９９％超であったことが示される。温溶解物法を使用して、少量の組織から高品質の核酸を効率的に抽出することができる。
【0586】
実施例７．温溶解物法による追加の低組織体積試料
この実験は、低組織体積試料を温溶解物共抽出法で処理することの実現可能性を評価するために実施した（実施例１、並びに図３Ａ及び図３Ｂの右の縦列を含めて、上で説明した）。２個の異なる低体積試料タイプを調製した：８個の異なる腫瘍タイプ（膀胱、肺、乳房、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓、及び肝臓）を表す１０個の固有のＦＦＰＥブロックからの、０．６２５ｍｍ３のＦＦＰＥ組織体積のスライド（２個の複製）及び０．３７７ｍｍ３のＦＦＰＥ組織体積のカール（２個の複製）。全ての試料を、温溶解物共抽出法を使用して抽出し、標準ライブラリ調製、ハイブリッド捕捉、及び配列決定プロセスに供した。以下の表１８は、各インプットタイプについての組織体積中央値、最低組織体積、及び最大組織体積を示す。
この実験は、低組織体積試料を温溶解物共抽出法で処理することの実現可能性を評価するために実施した（実施例１、並びに図３Ａ及び図３Ｂの右の縦列を含めて、上で説明した）。２個の異なる低体積試料タイプを調製した：８個の異なる腫瘍タイプ（膀胱、肺、乳房、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓、及び肝臓）を表す１０個の固有のＦＦＰＥブロックからの、０．６２５ｍｍ３のＦＦＰＥ組織体積のスライド（２個の複製）及び０．３７７ｍｍ３のＦＦＰＥ組織体積のカール（２個の複製）。全ての試料を、温溶解物共抽出法を使用して抽出し、標準ライブラリ調製、ハイブリッド捕捉、及び配列決定プロセスに供した。以下の表１８は、各インプットタイプについての組織体積中央値、最低組織体積、及び最大組織体積を示す。
【表18】
【表19】
【0587】
上の表１９は、異なる組織インプットからの抽出についてのＤＮＡラボメトリクスの要約を示す。ＤＮＡ抽出（ＤＮＡｘ）通過率は、収集したＤＮＡが５０ｎｇ超である頻度の尺度である。ライブラリ構築（ＬＣ）通過率は、５４５．ｎｇ超のｃＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリが生成された頻度の尺度である。ハイブリッド捕捉（ＨＣ）通過率は、配列決定のための１４０ｎｇ超のＤＮＡを有する捕捉ライブラリが得られる頻度の尺度である。温溶解物プロセスを使用すると、ＤＮＡ抽出、ＬＣ、及びＨＣ収量の試料成功率が高かった（１００％の通過率）。分析により、温溶解物法を使用して、核酸を少量の組織から効率的に抽出できることが示される。
【表20】
【0588】
上の表２０は、各抽出法のＤＮＡ配列決定メトリクスの要約を示す。推定ライブラリサイズは、ライブラリ中の固有の断片の数である。重複前％選択は、ハイブリッド捕捉ベイトが標的とする領域にマッピングするリードのパーセントである。インサートサイズ中央値は、アダプター間の核酸断片のサイズである。キメラ％は、リードキメラの百分率である。エクソンカバレッジ中央値について、配列カバレッジは、エクソン領域にある各塩基が配列データにカバーされる回数であり、平均配列カバレッジを各エクソンにおいて計算し、次に、３つの値の中央値を使用する。エクソンカバレッジ通過率は、２５０回超のカバレッジ及び５００回超のカバレッジで評価した。ＣＡＮノイズスコアは、コピー数プロットにおけるノイズを測定するためのスコアである。これらの分析により、高い配列決定性能（カバレッジ、インサートサイズ、重複前％選択、エラー率、キメラ、ＣＮノイズ）が、０．３７７ｍ３カールと０．６２５ｍｍ３スライドとの両方について観察されたことが示される。９９％超の試料が２５０回超を有した。これらの結果により、温溶解物プロセスを使用して、核酸を少量の組織から効率的に抽出できることが示される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【国際調査報告】