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▶ セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-15
(54)【発明の名称】血管新生促進増殖因子結合ポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 16/22 20060101AFI20250107BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20250107BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20250107BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250107BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250107BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250107BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20250107BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20250107BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250107BHJP
【ＦＩ】
C07K16/22 ZNA
C12N15/13
C12N15/85 Z
A61K38/18
A61P29/00
A61P37/02
A61P35/00
A61P27/02
A61P29/00 101
A61P19/02
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536293
(86)(22)【出願日】2022-10-06
(85)【翻訳文提出日】2024-07-29
(86)【国際出願番号】 CU2022050011
(87)【国際公開番号】W WO2023109982
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】CU-2021-0101
(32)【優先日】2021-12-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】304012895
【氏名又は名称】セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス モヤ、イザベル
(72)【発明者】
【氏名】ベケト ロメロ、モニカ
(72)【発明者】
【氏名】アヤラ、アビラ マルタ
(72)【発明者】
【氏名】ガビロンド コウレイ、ホルヘ、ビクトール
(72)【発明者】
【氏名】モレラ、ディアス、ヤネリス
(72)【発明者】
【氏名】ムニョス ポソ、ヤスミアナ
(72)【発明者】
【氏名】カナン － ヘイデン アヤラ、カミラ
(72)【発明者】
【氏名】ラムダン オルダス、ハンベルト
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス ブランコ、ソニア
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB21
4C076BB24
4C076CC04
4C076CC10
4C076CC27
4C076CC29
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA01
4C084AA02
4C084MA56
4C084MA58
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA961
4C084ZB071
4C084ZB111
4C084ZB151
4C084ZB261
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、アミノ酸配列中にＶＨＨシングルドメイン抗体の少なくとも１つのフラグメントを含む血管新生促進増殖因子結合ポリペプチド、及び血管新生促進増殖因子結合ポリペプチドをコードするベクターに関する。本発明はさらに、前記ポリペプチド又は血管新生促進増殖因子結合ポリペプチドをコードする前記ベクターを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、医薬を製造するための血管新生促進増殖因子結合ポリペプチドの使用、又は前記ポリペプチドをコードするベクターの使用に関する。本発明はさらに、少なくとも１つの血管新生促進増殖因子結合ポリペプチド又は前記ポリペプチドをコードするベクターを含む治療有効量の医薬組成物が投与される、治療を必要とする対象において血管新生、炎症又は免疫抑制の増加を示す病態の治療方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２３若しくは配列番号２４として特定されるアミノ酸配列、又は配列番号２３及び配列番号２４として特定されるアミノ酸配列に対して９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのシングルドメイン抗体フラグメント（ＶＨＨ）をアミノ酸配列中に含む、血管新生促進増殖因子に結合するポリペプチド。
【請求項2】
血管新生促進増殖因子がヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
２つ以上のヒトＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ分子に結合する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
少なくともｉ）２つのＶＥＧＦ分子、ｉｉ）２つのｂＦＧＦ分子、又はｉｉｉ）１つのＶＥＧＦ分子及び１つのｂＦＧＦ分子と結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項6】
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びにヒト免疫グロブリンのアルブミン結合部位又はＦｃドメインに対応するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項7】
Ｆｃドメインがヒト免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項8】
配列番号３１～配列番号３６として特定されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項9】
血管新生促進増殖因子に結合するポリペプチドをコードするベクターであって、ポリペプチドが配列番号２３～配列番号２８及び配列番号３１～配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記ベクター。
【請求項10】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載のベクター、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項11】
全身経路、粘膜経路又は硝子体内経路による投与のために製剤化される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
医薬の製造のための、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載のベクターの使用。
【請求項13】
薬物が、血管新生、炎症又は免疫抑制の増加を引き起こす病態の治療に有用である、請求項１２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項14】
薬物が癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性又は関節リウマチの治療に有用である、請求項１３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項15】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載のベクターを含む治療有効量の医薬組成物を特徴とする、治療を必要とする個体において血管新生、炎症又は免疫抑制の増加に伴って起こる病態を治療する方法。
【請求項16】
病態が癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性又は関節リウマチである、請求項１５に記載の治療方法。
【請求項17】
前記医薬組成物が、全身経路、粘膜経路又は硝子体内経路によって投与される、請求項１５に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー及びヒトの健康分野に関する。本発明は、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような血管新生促進増殖因子に結合し、それらの生物学的効果を阻害するポリペプチドを提供する。これは、血管新生、炎症、及び免疫抑制の増加に伴って起こる病態の治療に使用される、前記ポリペプチドを含む医薬組成物の生成のための基盤を提供する。
【背景技術】
【0002】
「ｄｅ ｎｏｖｏ」血管新生プロセスは、現在、複数の疾患の調査において中心的な位置を占めており、血管新生は、現在、新薬の発見における組織原理として記載されている（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、２００７：６：２７３－８６）。この１０年間で、内皮増殖阻害剤並びに血管構造の集合及び透過性の調節剤に基づく複数の治療法がヒトでの使用について承認された。これらの治療法は３つの基本的な群：Ｉ）小さいポリペプチドを使用するもの、及びチロシンキナーゼ阻害剤のタイプのもの、ＩＩ）抗体、そのフラグメント及び変異体に基づくもの、ＩＩＩ）ウイルスベクターに挿入された抗体、そのフラグメント又は変異体をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列を使用するもの（Ａｐｔｅら、Ｃｅｌｌ、０１９：１７６：１２４８－６４）に分けられる。
【0003】
完全なモノクローナル抗体及び抗原結合部位を保持するそのフラグメントは、臨床試験の進行段階で見られる。モノクローナル抗体の治療的成功にもかかわらず、製造の観点からは一連の欠点を示している。高分子量（１５０，０００Ｄａ）、ヘテロ四量体組成、及び約１５個のジスルフィド結合の存在は、細菌での生産を容易にせず、真核細胞での生産を困難にしている。加えて、分子量が高いために組織への浸透性が損なわれ、作用部位での位置にも影響を及ぼす（Ｊｏｖｃｅｖｓｋａ ｙ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２０２０：３４：１１－２６）。そのため、モノクローナル抗体の抗原結合部位を利用して、より分子サイズの小さいポリペプチドを生成する技術的プラットフォームが開発されてきた。
【0004】
この文脈では、ＶＨＨとしても知られるシングルドメイン抗体は、抗原を特異的に認識できる天然に存在する最小の抗体フラグメント（１５～１７ｋＤａ）である。これらはラクダ科の重鎖抗体の可変領域に由来する。さらに、これらのポリペプチドは高温、極端なｐＨ、及びプロテアーゼに耐性がある（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、ＦＥＢＳ Ｊ、２０２１：２８８：２０８４－１０２）。ＶＨＨのサイズが小さいことは、治療には不利であり得る。しかし、ＶＨＨの高い効率及び水性環境での高い溶解性、組織及び腫瘍への優れた浸透性、及び優れた安全性プロファイル並びに低い免疫原性により、様々な免疫学的応用において有望視されている（Ｓｕｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０２１：１６：２３３７－５６）。
【0005】
過去１０年間、ＶＨＨは様々な科学研究分野でその可能性を示してきた（Ｊｏｖｃｅｖｓｋａ ｙ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２０２０：３４：１１－２６）。最近、最初のＶＨＨがヒトへの使用承認を取得し、他の２つのポリペプチドが第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験中である（Ｓｃｕｌｌｙら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１９：３８０：３３５－４６）。他の分子は、前臨床試験及び臨床試験の様々な段階を進行中である。
【0006】
ファージディスプレイ技術は、大規模で多様なライブラリーから数週間以内に複数の高親和性ポリペプチドを回収する効率的なストリンジェント選択を可能にする（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０：３４８：５５２－４）。ＶＨＨ選択のために、ＶＨＨの３種類のライブラリー：免疫ライブラリー、非免疫（ナイーブ）ライブラリー、及び合成ライブラリーが使用できる。このうち、合成ライブラリーだけが真正のユニバーサルライブラリーを提供でき、これによりほとんど全ての抗原に特異的なＶＨＨを得ることが可能になる（Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００：２９６：５７－８６）。
【0007】
近年、血管新生プロセスのメディエーターに特異的な種々のＶＨＨ又はそれに由来するポリペプチドが作製、選択、及び評価されている。抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ薬に対する抵抗性の機構において、ｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ軸が支配的な役割を果たすとする研究が増えている。しかし、ｂＦＧＦに対する特異的ＶＨＨは今のところ存在しない（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１２：１１：８６４－７２、Ｒｏｎｃａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１５：１９：１－１７、Ｚａｈｒａら、Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）、２０２１：１３：１４２２）。
【0008】
血管新生プロセスにおけるＶＥＧＦの基本的な役割を考慮すると、ＶＥＧＦ特異的ＶＨＨはラクダ科動物の免疫ライブラリーからのみ作製されている（Ｆａｒａｊｐｏｕｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２０１４：１９：５４７－５５、Ｅｂｒａｈｉｍｉｚａｄｅｈら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１５：１７６：１９８５－９５、Ｋａｚｅｍｉ－Ｌｏｍｅｄａｓｈｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１５：６５：５８－６７）。これらのＶＨＨは内皮細胞の増殖及び管状構造の形成を抑制する効果を示し、そのうちの１つではＴＣ－１モデルにおいて抗腫瘍効果が確認されている。これらのＶＨＨは変性したコンフォメーションのＶＥＧＦを認識するため、ベバシズマブに類似した要素である線状セグメントに特異的でなければならない。（Ｋａｚｅｍｉ－Ｌｏｍｅｄａｓｈｔら、Ｉｒａｎｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１７：３９９－４９６）。
【0009】
これらのポリペプチドのさらなる治療開発にとって、放射性標識又は蛍光標識以外の基本的な欠点は、以下に関連している：
ａ）ラクダ科動物由来の配列の抗原性の可能性、
ｂ）低分子であるため、腎臓からの排出が急速であるために生物学的利用能が制限されること、
ｃ）病態が多因子性であるため、２つ以上の増殖因子／受容体系を標的とする必要があること。
ａ）ラクダ科動物由来の配列の抗原性の可能性、
ｂ）低分子であるため、腎臓からの排出が急速であるために生物学的利用能が制限されること、
ｃ）病態が多因子性であるため、２つ以上の増殖因子／受容体系を標的とする必要があること。
【0010】
ＶＥＧＦ特異的ＶＨＨのうちヒト化されているのは１つだけである（Ｋａｚｅｍｉ－Ｌｏｍｅｄａｓｈｔら、Ｉｒａｎｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１８：２１：２６０－６）。これまでのところ、このタンパク質の「ｉｎ ｖｉｖｏ」系での挙動は不明である。部分的にヒト化され、ＢＩ８３６８８０として知られる二重特異性構築物の一部である抗ＶＥＧＦ ＶＨＨが少なくとも１つ存在する（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、２０２０：３７：６３７－４８）。このＶＨＨは、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び進行固形癌の転移病変を対象とした第ＩＩ相臨床試験中である（ｗｗｗ．ｈｔｔｐ／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）。
【0011】
他の分子標的に特異的なＶＨＨのサイズを増加させるために、アルブミン又は免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４のＦｃセグメントのような血清タンパク質への結合部位も組み込んだ、二価の単特異性又は二重特異性ポリペプチドが記載されている。ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦについては、ＶＨＨ型結合部位に免疫グロブリンＦｃ又は他のタンパク質の結合部位を組み込んだ戦略は記載されていない。
【0012】
これまでのところ、ｂＦＧＦを標的にしたヒト化された単特異性又は二重特異性な多価ＶＨＨ様ポリペプチドは記載されておらず、ＶＥＧＦについては部分的にヒト化されたＶＨＨを用いた２つのアプローチのみが記載されている。加えて、上述した戦略のいずれも、ヒト化合成ライブラリーの使用によって生成され得る多様性を未だ利用していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
したがって、抗血管新生、抗腫瘍、抗転移、抗炎症、及び免疫回復効果が増強された、ヒトＶＥＧＦ及びｂＦＧＦに対する新規で特異的な結合部位を有する治療用変異体を得る必要性が依然として存在する。これによって、それらの生物学的利用能及び組織アクセスのさらなる改善が可能になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の詳細な説明
本発明は、血管新生促進増殖因子に結合するポリペプチドを提供することにより、前述の問題を解決する。これらのポリペプチドは、配列番号２３若しくは配列番号２４として特定されるアミノ酸配列、又はこれらの配列と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのシングルドメイン抗体フラグメント（ＶＨＨ）をそのアミノ酸配列中に含む。前記ポリペプチドは、本発明のフレームワーク内で生成されたサブライブラリーから得られ、薬物の製剤化及び開発の観点から魅力的な物理化学的特性を示す。本発明の一実施形態において、前記ポリペプチドが結合する血管新生促進増殖因子は、ヒトＶＥＧＦ又はｂＦＧＦである。
本発明は、血管新生促進増殖因子に結合するポリペプチドを提供することにより、前述の問題を解決する。これらのポリペプチドは、配列番号２３若しくは配列番号２４として特定されるアミノ酸配列、又はこれらの配列と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのシングルドメイン抗体フラグメント（ＶＨＨ）をそのアミノ酸配列中に含む。前記ポリペプチドは、本発明のフレームワーク内で生成されたサブライブラリーから得られ、薬物の製剤化及び開発の観点から魅力的な物理化学的特性を示す。本発明の一実施形態において、前記ポリペプチドが結合する血管新生促進増殖因子は、ヒトＶＥＧＦ又はｂＦＧＦである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の一実施形態において、ヒトＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ結合ポリペプチドは、少なくとも２つのＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ分子、又は１つのＶＥＧＦ分子及び１つのｂＦＧＦ分子に結合する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【0016】
本発明は、ヒト及びマウスのＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体２型（ＶＥＧＦＲ２）への結合を阻害するが、ＶＥＧＦ受容体１型（ＶＥＧＦＲ１）への結合は阻害しない、Ｎｂ－Ｖ１と呼ばれるポリペプチドの取得を示す。前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１２として特定される。全長抗体とは異なり、Ｎｂ－Ｖ１は腫瘍に優先的に分布し、抗血管新生特性を有することが示された。Ｎｂ－Ｖ１はＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１への結合を阻害しないという点で他の抗ＶＥＧＦ抗体フラグメントとは異なる。この受容体は有効なシグナル伝達を持たないため、ＶＥＧＦを細胞外マトリクスに貯蔵する方法としてしばしば説明されており、また複数の恒常性維持プロセスにおいても必須である（Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｃｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、２００１：２６：２５－３５）。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ系の他の阻害剤によるその遮断は、腎臓及び肝臓の損傷の増加に関係しているため、ＶＥＧＦＲ２の選択的阻害を達成することは、毒物学的観点から利点がある（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１０：５：７－８）。ＶＥＧＦＲ２は、内皮細胞の増殖、遊走、及び管形成（Ｓｅｌｖａｒａｊら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２０１５：２７：７８０－９６）、並びにＴＲｅｇ細胞及びＭＤＳＣ細胞の誘引、並びにＴリンパ球の老化誘導に対するＶＥＧＦの効果を媒介する（Ｂｏｕｒｈｉｓら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０２１：１２：６１６８３７）。
【0017】
本発明はまた、ヒト及びマウスのｂＦＧＦに結合し、ＦＧＦＲ１への結合を阻害し、そのアミノ酸配列が配列番号１３として特定されることを特徴とするＮｂ－Ｆ３と呼ばれるＶＨＨの取得も示す。この分子は、ｂＦＧＦに対する特異性を有するＶＨＨが記載されていないため、そのクラスで特有である。Ｎｂ－Ｆ３ポリペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏで抗血管新生及び抗増殖特性を示した。
【0018】
一価及び単特異性のポリペプチドＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３は、単量体の形で得られ、７５℃で２時間処理しても、抗原認識及びそれぞれの受容体への結合遮断を７０％以上維持した。さらに、ＶＨＨの高濃度、異なるｐＨの様々な緩衝液中、及び単純及び複雑な製剤での安定性も証明された。ＶＨＨのＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３で得られた結果は、コンフォメーションと機能的観点からの熱安定性の観点から、ユニバーサルライブラリーと設計された成熟ライブラリーから、熱安定性及び溶解性の適切なプロファイルを有するポリペプチドを得ることが可能であることを示している。
【0019】
本発明によって開示されたＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３ ＶＨＨのサイズは約１５ｋＤａである。この特性は組織浸透性の観点からは有利であるが、腎臓から速やかに排出されることが条件となる（Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２００２：９８：４５６－６２）。腎排出は、反復投与の必要性を課した。
【0020】
一実施形態において、循環における保持を増加させるために、本発明のポリペプチドは、ａ）配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びにｂ）ヒト免疫グロブリンのアルブミン結合部位又はＦｃドメインに対応するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。本発明の一実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来である。
【0021】
スペーサー（リンカー）又はヒンジ領域を有する多量体の設計は、文献に広く記載されている。これらは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの多量体のような合成のものであってもよく、又はヒト由来のヒンジ及びスペーサーの配列群、又はラクダ科由来の配列群から選択することもでき、これらは前記種の免疫グロブリン内でこの機能を果たす。（Ｎｅｚｌｉｎ、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、１９９８：３－７３、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３：２７：８７－１０３、Ｓａｅｒｅｎｓら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００５：７７：７５４７－５５）。
【0022】
本発明は、ＶＥＧＦＲ２との相互作用を阻害し、配列番号２０として特定される配列を有する、Ｎｂ－ＶＶ６と呼ばれる、２つのＶＥＧＦ分子を認識するポリペプチド（ＶＥＧＦに対する２価の単特異性）の取得を明らかにする。また、ＦＧＦＲ１との相互作用を阻害し、配列番号２１として特定される配列を有する、Ｎｂ－ＦＦ２と呼ばれる、２分子のｂＦＧＦを認識するポリペプチド（ｂＦＧＦに対する２価の単特異性）の取得も明らかにされている。従来の他の分子とは異なり、Ｎｂ－ＶＶ６及びＮｂ－ＦＦ２は、単量体の形で得られ、７５℃で２時間処理しても、結合活性と受容体結合遮断活性の３０％未満しか失われなかった。この戦略により、一価の変異体と比較して、それぞれのリガンドの認識において３倍の増加が達成され、これはｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗血管新生効果の増加と相関した。生体内分布試験では、これらの単特異性二価ポリペプチドの腫瘍病巣への集積が、一価変異体で観察されたのと同様に示された。いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ研究において、黄斑又は腫瘍の新生血管モデルで解析した結果、これらの単特異性二価ポリペプチドの優れた効果が示された。
【0023】
これらのリガンド（ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦ）の一方を排他的に隔離しても、その誘導経路の冗長性のために、疾患に関連した血管新生プロセスを決定的に中和することはできない。（Ｈａｉｂｅら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０２０：１０：２２１）。２つ以上の血管新生促進因子の阻害は、黄斑疾患（Ｃａｍｐａ、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、２０２０：２１：１１９４－２００）及び肝腫瘍（Ｚａｈｒａら、Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）、２０２１：１３：１４２２）の長期管理においてより効果的である。これを考慮し、本発明は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの両方に結合し、これらの因子とＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１受容体との相互作用をそれぞれ阻害する、Ｎｂ－ＶＦ３及びＮｂ－ＦＶ１と命名された二重特異性一価ポリペプチドを提供する。これらの二重特異性ポリペプチドは、それぞれ配列番号１８及び配列番号１９として特定されるアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。興味深いことに、二重特異性ポリペプチド中の配列番号２３及び配列番号２４に対応するセグメントの順序に関係なく、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ抗原を認識し、それらの特異的受容体との相互作用を阻害することが観察された。これらの二重特異性ＶＨＨは、親分子の一価バージョンについて記述された物理化学的及び生物学的特性を保存していた。いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ研究において、黄斑又は腫瘍の新生血管モデルにおける分析から、二重特異性ポリペプチドＮｂ－ＦＶ１が単特異性変異体Ｎｂ－Ｖ１よりも優れていることが示された。
【0024】
本発明では、配列番号２３～配列番号２８として特定されるポリペプチドの配列に、ヒトＩｇＧ１型免疫グロブリンのＦｃ（ＣＨ１－ＣＨ２）フラグメントを組み込んだことに特に言及する。このエレメントは補体結合という点でエフェクター機能を組み込んでおり、これらのＶＨＨポリペプチドのサイズを６０ｋＤａ以上増加させ、腫瘍性疾患での使用に望ましいエレメントである（Ｒａｔｈ Ｔら、ＨＨＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ａｃｃｅｓｓ．２０１６；３５：２３５－２５４）。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを付加して得られたポリペプチドを、Ｎｂ－Ｖ１＿ｈＦｃ、Ｎｂ－Ｆ３＿ｈＦｃ、Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ、Ｎｂ－ＦＦ２＿ｈＦｃ、Ｎｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃ及びＮｂ－ＶＦ３＿ｈＦｃと呼び、それぞれ配列番号３１～配列番号３６として特定される配列を有する。それぞれの抗原の認識、及びそれらの受容体への結合の阻害の分析から、この末端カルボキシルセグメントの付加は、Ｆｃセグメントのない対応物について記載されたものと比較して、生物学的特性に影響を与えないことが示された。さらに、このセグメントの導入は血漿中のＶＨＨの半減期を有意に増加させることが示され、これは腫瘍モデルにおけるそれらによる治療の抗腫瘍、抗血管新生、及び免疫回復効果と相関する。同様に、補体を活性化する能力の低い他の免疫グロブリンのＣＨ２－ＣＨ３セグメントも取り込むことができ、これは、炎症現象を平行して誘導することなく、リガンド捕捉に有用であると考えられる。
【0025】
一方、トレーサーペプチドであるｃ－ｍｙｃ及びポリヒスチジンは、ＶＨＨのような低分子の機能性を損なうことが記載されている。さらに、これらのトレーサーセグメントは腎臓に優先的に存在するため、この臓器は反復投与による毒性作用の標的となる。（Ｈｕｙｖｅｔｔｅｒら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ、２０１４：４）。
【0026】
そこで、ポリペプチドＮｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－ＦＦ２、Ｎｂ－ＦＶ１、及びＮｂ－ＶＦ３のアミノ酸配列からカルボキシル末端を除去し、得られたポリペプチドをそれぞれＮｂ－Ｖ１＼ｃｍｙｃＨ６、Ｎｂ－Ｆ３＼ｃｍｙｃＨ６、Ｎｂ－ＶＶ６＼ｃｍｙｃＨ６、Ｎｂ－ＦＦ２＼ｃｍｙｃＨ６、Ｎｂ－ＦＶ１＼ｃｍｙｃＨ６、及びＮｂ－ＶＦ３＼ｃｍｙｃＨ６と命名した。これらのポリペプチドは、それぞれ配列番号２３～配列番号２８として特定されるアミノ酸配列を有する。これらのＶＨＨは、ｃ－ｍｙｃ及びポリヒスチジンの対応物と同様の生物学的特性を示した。
【0027】
本発明は、ＶＨＨを取得する、又は安定化させる特定の方法に限定されるものではない。これらは、例えばプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって取得及び分離することができ、これは組換え産物の製造のために広く受け入れられている戦略であり、さらに得られるポリペプチドの正しいフォールディングを保証するものである。同様に、ＶＨＨはその化学的及び熱的安定性から、イオン交換と組み合わせた沈殿法を用いて精製することができる。
【0028】
ヌード動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＶＨＨの抗腫瘍効果及び抗血管新生効果が示され、腫瘍病巣に優先的に局在することが示された。血管密度の研究では、ＶＨＨの様々な変異体で治療した動物において、腫瘍と転移病巣の有意な減少を示した。同種移植マウスモデルの抗腫瘍効果の解析から、免疫応答性マウスモデルと免疫不全マウスモデルを比較した場合の介入の優れた影響が示され、これは、これらの増殖因子の隔離による潜在的な免疫回復効果に関連している可能性がある。これらの効果はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで検証された。
【0029】
治療的適用のために、本発明のポリペプチドは、当業者に公知の経路で、薬学的に有効な用量で、必要な個体に投与される。
【0030】
本発明のポリペプチドの投与は、肺癌、結腸癌及び腎癌を含む種々の起源の新生物の腫瘍増殖を有意に減少させた。これらの結果は、他の抗腫瘍治療の結果の臨床への移行に関連したモデルにおいて得られたものであり、このことは、癌治療における臨床シナリオへのこの戦略の適用可能性を示している。ポリペプチドの用量は、用量の増加に伴って生物学的効果の増大が観察されているため、所望の効果に応じて、各用途に使用される。
【0031】
本発明はまた、血管新生促進増殖因子に結合するポリペプチドをコードするベクターを提供し、ここでこのポリペプチドは配列番号２３～配列番号２８及び配列番号３１～配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。この戦略は血管新生促進増殖因子に結合するこれらのポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの永続性を増加させる。この点に関して、アデノ随伴ベクターの使用が記載されており、特に、硝子体内投与において有益性が証明されているポリペプチドをコードするベクターの、脈絡膜上投与又は硝子体内投与において記載されている（Ａｎｔｏｎｉｏら、２０２１：２：１５１－７）。
【0032】
アデノ随伴ベクターＡＡＶ２の使用により、例１４に示すように、目的のポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ発現が可能になった。
【0033】
本発明は、ａ）アミノ酸配列が配列番号２３～配列番号２８、配列番号３１～配列番号３６として特定されるポリペプチド、又はｂ）配列番号２３～配列番号２８及び配列番号３１～配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするベクター；及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を開示する。
【0034】
本発明において、リン酸緩衝生理食塩水は、ポリペプチド調製物のためのビヒクルとして好ましく使用されたが、その安定性は、広範囲の添加物において確認された。ポリペプチド又はベクターは、毒性がなく、治療効果を有しない医薬的使用について認められた賦形剤中で投与することができる。
【0035】
同様に、本発明の医薬組成物は特定の投与経路に限定されるものではなく、特定の製剤を用いずに、ＶＨＨを硝子体内、静脈内、腹腔内、皮下、及び経鼻的に投与し、抗血管新生、抗腫瘍、抗炎症、及び免疫回復効果を生じさせることができることは明らかである。したがって、本発明の一実施形態において、医薬組成物は、全身経路、粘膜経路、又は硝子体内経路による投与のために製剤化される。
【0036】
本発明の他の目的は、薬物の製造のための、アミノ酸配列が配列番号２３～配列番号２８、配列番号３１～配列番号３６として特定されるポリペプチド；又は配列番号２３～配列番号２８及び配列番号３１～配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするベクターの使用である。本発明の一実施形態において、医薬は、血管新生、炎症、又は免疫抑制の増加を引き起こす病態の治療に有用である。本発明は、特定の疾患に対する医薬の使用を制限するものではない。本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた樹状細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージの活性化の調節の結果に基づいて、本発明のポリペプチド、又はベクターを含む薬物療法が他の文脈でどのように有効であるかを描写する。本発明の特定の実施形態において、医薬は、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、又は関節リウマチの治療に有用である。
【0037】
他の態様において、本発明は、治療を必要とする個体において、血管新生、炎症、又は免疫抑制の増加に伴って起こる病態を治療するための方法であって、アミノ酸配列が配列番号２３～配列番号２８、配列番号３１～配列番号３６として特定されるポリペプチド；又は配列番号２３～配列番号２８及び配列番号３１～配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを特徴とする方法を提供する。本発明の一実施形態において、前記治療方法において、病態は、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、又は関節リウマチである。本発明の特定の実施形態において、前記治療方法において、前記医薬組成物は、全身経路、粘膜経路、又は硝子体内経路によって投与される。
【実施例】
【0038】
詳細な実施形態／実現例
（例１）一般的方法
プラスミド、微生物、酵素、抗体、及び組換えタンパク質
ｐＨＧ－１ｍ、ｐＡＣＲ－１Ｋ及びｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃベクター（Ｌａｍｄａｎ，Ｈら、国際公開第２００８／０５２４８９号）、並びに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＴＧ１株（Ｋ１２＿（ｌａｃ－ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺ＿Ｍ１５）及びＢＬ２１（Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ （ｒＢ－ｍＢ－） ｇａｌ ｄｃｍ ｍｅｔ （ＤＥ３））は、ＣＩＧＢ株コレクションから入手した。ベクターｐＩＮＦＵＳＥはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＥＥ．ＵＵ．）から入手した。ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＮｏｖａｇｅｎ（ＥＥ．ＵＵ．）から入手し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、アルカリホスファターゼ、ＡｐａＬＩ、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｆｌＩＩ、ＸｂａＩ、及びＴａｑ ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＰｒｏｍｅｇａ（ＥＥ．ＵＵ．）から供給された。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＥＥ．ＵＵ．）から購入した。
（例１）一般的方法
プラスミド、微生物、酵素、抗体、及び組換えタンパク質
ｐＨＧ－１ｍ、ｐＡＣＲ－１Ｋ及びｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃベクター（Ｌａｍｄａｎ，Ｈら、国際公開第２００８／０５２４８９号）、並びに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＴＧ１株（Ｋ１２＿（ｌａｃ－ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺ＿Ｍ１５）及びＢＬ２１（Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ （ｒＢ－ｍＢ－） ｇａｌ ｄｃｍ ｍｅｔ （ＤＥ３））は、ＣＩＧＢ株コレクションから入手した。ベクターｐＩＮＦＵＳＥはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＥＥ．ＵＵ．）から入手した。ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＮｏｖａｇｅｎ（ＥＥ．ＵＵ．）から入手し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、アルカリホスファターゼ、ＡｐａＬＩ、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｆｌＩＩ、ＸｂａＩ、及びＴａｑ ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＰｒｏｍｅｇａ（ＥＥ．ＵＵ．）から供給された。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＥＥ．ＵＵ．）から購入した。
【0039】
繊維状ヘルパーファージＭ１３Ｋ０、ストレプトアビジンタンパク質及び全てが酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした、マウスで産生された抗ポリヒスチジン抗体、ウサギで産生された抗マウスＩｇＧ抗体及びヒツジで産生された抗ヒトＩｇＧ１抗体は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より供給された。（ファージＰＶＩＩＩタンパク質に対する）ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＵＳＡ）から購入した。ｍＡｂ ９Ｅ１０（ｃ－ｍｙｃペプチドに特異的）及びＨＲＰ酵素にコンジュゲートしたプロテインＡは、ＣＩＧＢ、Ｓａｎｃｔｉ－Ｓｐｉｒｉｔｕｓ（Ｃｕｂａ）より供給された。
【0040】
組換えヒトｂＦＧＦタンパク質、及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合したＶＥＧＦ受容体１型及び２型（Ｆｌｔ１－Ｆｃ及びＫＤＲ－Ｆｃ）は、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）より入手した。マウスｂＦＧＦ及びｂＦＧＦの１型受容体は、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ（ＵＳＡ）より供給された。ＣＨＯ－ＶＥＧＦタンパク質は、ヒトＶＥＧＦ１２１分泌用に形質転換したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の上清より得た。これは、記載されているように、金属イオンとの親和性により精製した（Ｓａｎｃｈｅｚ Ｒａｍｉｒｅｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＆ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１６：３７：６３６－５８）。ＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ及びＧＳＴ－ｍＶＥＧＦタンパク質は、大腸菌で産生され、記載された手順に従って、グルタチオン親和性により精製された（Ｍｏｒｅｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６：４４：４５－５３）。抗体フラグメントｓｃＦｖ ＣＩＧＢ－１６６ａ（Ｌａｍｄａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１１：１５１：１６６－７４）及び組換えタンパク質ＶＥＧＦＫＤＲ－（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１４：３２：２２４１－５０）は、ＣＩＧＢの技術開発局（Ｈａｖａｎａ（Ｃｕｂａ））から提供された。ベバシズマブ抗体及びｓｃＦｖ ＣＩＧＢ１６６ａのビオチン化変異体は、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ｂｉｏｔ及びＣＩＧＢ１６６ａ－ｂｉｏｔと命名され、製造業者の指示に従って実験室で調製された。
【0041】
ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦに結合できるファージの選択
ライブラリーの中からＶＨＨを保有するファージを選択し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の２つの抗原に結合させ、記載されるように実行した（Ｌａｍｄａｎら、２０１１）。簡潔には、ＧＳＴ－ｈＶＥＧＦには１０μｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦには５μｇ／ｍＬの濃度を用いた。より親和性の高いクローンの選択を保証するため、コーティング中の濃度は各サイクルの間に５０％ずつ減少させた。ＶＥＧＦの場合、選択プロセス中の特異性を高めるため、遊離ＧＳＴを１ｍｇ／ｍＬの濃度でファージ混合物に添加した（Ｍｏｒｅｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６：４４：４５－５３）。選択の厳密さは、ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）による選択の各ラウンドで、洗浄回数及び洗浄時間を増やすことで確保した（４時間あたり最大２０回までの洗浄）。ラウンド２及び３から２０～４０クローンを無作為に選択し、以下に簡単に説明するファージＥＬＩＳＡによって抗原免疫反応性を評価した。抗原につき各ライブラリーから１０～２０個の陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した（Ｍｉｃｒｏｓｉｔｈ、Ａｌｅｍａｎｉａ）。
ライブラリーの中からＶＨＨを保有するファージを選択し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の２つの抗原に結合させ、記載されるように実行した（Ｌａｍｄａｎら、２０１１）。簡潔には、ＧＳＴ－ｈＶＥＧＦには１０μｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦには５μｇ／ｍＬの濃度を用いた。より親和性の高いクローンの選択を保証するため、コーティング中の濃度は各サイクルの間に５０％ずつ減少させた。ＶＥＧＦの場合、選択プロセス中の特異性を高めるため、遊離ＧＳＴを１ｍｇ／ｍＬの濃度でファージ混合物に添加した（Ｍｏｒｅｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６：４４：４５－５３）。選択の厳密さは、ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）による選択の各ラウンドで、洗浄回数及び洗浄時間を増やすことで確保した（４時間あたり最大２０回までの洗浄）。ラウンド２及び３から２０～４０クローンを無作為に選択し、以下に簡単に説明するファージＥＬＩＳＡによって抗原免疫反応性を評価した。抗原につき各ライブラリーから１０～２０個の陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した（Ｍｉｃｒｏｓｉｔｈ、Ａｌｅｍａｎｉａ）。
【0042】
ファージＥＬＩＳＡ：
ＶＥＧＦの場合、マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）をＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングし、ｂＦＧＦについては５μｇ／ｍＬ溶液を用いた。無関係な抗原：１０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によるコーティングを陰性対照として用いた。ファージ混合物を１：１０～１：１０００の間で希釈し、プレート上で２５℃で１時間インキュベートした。結合したファージは、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体を含む溶液で検出した。ペルオキシダーゼ酵素活性は基質溶液で検出し、マイクロタイタープレートリーダー（ＢＭＧ、 Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。標的抗原に対する吸光度が、無関係な抗原であるＢＳＡ及びＧＳＴに対する吸光度より２倍高いファージ混合物を陽性と考えた。
ＶＥＧＦの場合、マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）をＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングし、ｂＦＧＦについては５μｇ／ｍＬ溶液を用いた。無関係な抗原：１０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によるコーティングを陰性対照として用いた。ファージ混合物を１：１０～１：１０００の間で希釈し、プレート上で２５℃で１時間インキュベートした。結合したファージは、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体を含む溶液で検出した。ペルオキシダーゼ酵素活性は基質溶液で検出し、マイクロタイタープレートリーダー（ＢＭＧ、 Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。標的抗原に対する吸光度が、無関係な抗原であるＢＳＡ及びＧＳＴに対する吸光度より２倍高いファージ混合物を陽性と考えた。
【0043】
クローンのスクリーニング、生産及びファージの特性評価
大腸菌株ＴＧ１細菌に、選択サイクルの２サイクル目と３サイクル目から選択したファージを感染させた後、９６ウェル細胞培養プレートで、単離されたコロニーから、記載された手順に従って、ＶＨＨを保有するファージを産生した（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）。各ウェルの上清に含まれるファージディスプレイＶＨＨの免疫反応性をＥＬＩＳＡによって評価した。
大腸菌株ＴＧ１細菌に、選択サイクルの２サイクル目と３サイクル目から選択したファージを感染させた後、９６ウェル細胞培養プレートで、単離されたコロニーから、記載された手順に従って、ＶＨＨを保有するファージを産生した（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）。各ウェルの上清に含まれるファージディスプレイＶＨＨの免疫反応性をＥＬＩＳＡによって評価した。
【0044】
抗原をより高度に認識するＶＨＨを提示する繊維状ファージを産生し、記載された手順（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）に従って５０ｍＬのスケールでポリエチレングリコールで沈殿させることにより精製した。得られた調製物中のファージ濃度を測定するために、増殖指数期の大腸菌株ＴＧ１細菌にファージ調製物を感染させ、２％グルコース（ｖ／ｖ）を含む２×ＹＴＡ固体培養培地プレートにプレーティングした。３７℃で１６時間増殖させた。調製物中のファージ濃度（コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ）は、コロニー計数によって決定した。１０１１ｃｆｕ／ｍＬ濃度のファージ調製物をＥＬＩＳＡによる評価に用いた。
【0045】
ＶＨＨフラグメント及びその二価及び二重特異性構築物の発酵条件及び精製
各プラスミド構築物の代表コロニーをＬＢＫ液体培地（８ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、２．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、ｐＨ７．０－７．５）中で増殖させ、６００ｎｍでの吸光度が０．８に達した時点で、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ）を培養培地に添加し、１９時間誘導した。培養物を４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＴＥＳ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭスクロース、ｐＨ８）と１：２０の比率（ｇ：ｍＬ）で４℃で１６時間インキュベートした後、浸透圧ショックによって細胞沈殿物からペリプラズム画分を得た。培養上清又はペリプラズム抽出物を、精製プロセスを開始する前に、カップリング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８、又は１×リン酸緩衝液）で１：２の比率で希釈した。抗体フラグメントは、自動化ＡＫＴＡＰｕｒｅシステムと事前に充填されたＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５ｍＬ又はＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）カラムをそれぞれ用いて、製造業者のガイドラインに従い、金属親和性クロマトグラフィー又はプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。緩衝液をＰＢＳ １×に変更後、タンパク質濃度をＭｉｃｒｏ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＢＩＯＲＡＤ、ＵＳＡ）により評価した。
各プラスミド構築物の代表コロニーをＬＢＫ液体培地（８ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、２．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、ｐＨ７．０－７．５）中で増殖させ、６００ｎｍでの吸光度が０．８に達した時点で、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ）を培養培地に添加し、１９時間誘導した。培養物を４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＴＥＳ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭスクロース、ｐＨ８）と１：２０の比率（ｇ：ｍＬ）で４℃で１６時間インキュベートした後、浸透圧ショックによって細胞沈殿物からペリプラズム画分を得た。培養上清又はペリプラズム抽出物を、精製プロセスを開始する前に、カップリング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８、又は１×リン酸緩衝液）で１：２の比率で希釈した。抗体フラグメントは、自動化ＡＫＴＡＰｕｒｅシステムと事前に充填されたＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５ｍＬ又はＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）カラムをそれぞれ用いて、製造業者のガイドラインに従い、金属親和性クロマトグラフィー又はプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。緩衝液をＰＢＳ １×に変更後、タンパク質濃度をＭｉｃｒｏ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＢＩＯＲＡＤ、ＵＳＡ）により評価した。
【0046】
ＶＨＨの標的抗原認識についてのＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、１００μＬ／ウェルの、１×ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍＬ濃度のＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ１２１、ＧＳＴ－ｍＶＥＧＦ１２０、若しくはＧＳＴの溶液、又は１０μｇ／ｍＬ濃度のＶＥＧＦＫＤＲ－の溶液、又は５μｇ／ｍＬ濃度のｈＦＧＦ－２若しくはｍＦＧＦ－２の溶液を用いて４℃で１６時間コーティングした。プレートをＰＢＳ－５％スキムミルクで１時間ブロッキングした後、精製ＶＨＨの１：２連続希釈液をＰＢＳ－０．５％スキムミルクで２μｇ／ｍＬから開始して添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、数回洗浄した後、ｃ－ｍｙｃに特異的なモノクローナル抗体９Ｅ１０を添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、プレートを十分に洗浄した。固相中の抗原へのフラグメントの結合は、１００ μＬ／ウェルのＴＭＢを用いたペルオキシダーゼ活性によって検出した。反応は５０μＬ／ウェルの停止溶液で停止させ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで決定した。
９６ウェルプレートを、１００μＬ／ウェルの、１×ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍＬ濃度のＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ１２１、ＧＳＴ－ｍＶＥＧＦ１２０、若しくはＧＳＴの溶液、又は１０μｇ／ｍＬ濃度のＶＥＧＦＫＤＲ－の溶液、又は５μｇ／ｍＬ濃度のｈＦＧＦ－２若しくはｍＦＧＦ－２の溶液を用いて４℃で１６時間コーティングした。プレートをＰＢＳ－５％スキムミルクで１時間ブロッキングした後、精製ＶＨＨの１：２連続希釈液をＰＢＳ－０．５％スキムミルクで２μｇ／ｍＬから開始して添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、数回洗浄した後、ｃ－ｍｙｃに特異的なモノクローナル抗体９Ｅ１０を添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、プレートを十分に洗浄した。固相中の抗原へのフラグメントの結合は、１００ μＬ／ウェルのＴＭＢを用いたペルオキシダーゼ活性によって検出した。反応は５０μＬ／ウェルの停止溶液で停止させ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで決定した。
【0047】
親和性定数の決定
抗体フラグメントの親和性定数（Ｋａｆｆ）は、Ｂｅａｔｔｙら（Ｂｅａｔｔｙ ＪＤ、Ｂｅａｔｔｙ ＢＧ、Ｖｌａｈｏｓ ＷＧ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８７ Ｊｕｎ ２６；１００（１－２）：１７３－９）に記載された方法で測定し、これには以前に記載された抗原認識ＥＬＩＳＡアッセイのバリエーションが用いられた。この場合、目的の各抗原でコーティングするために２つの濃度を使用した（ＧＳＴ－ｈＶＥＧＦについては７．５μｇ／ｍＬ及び２．５μｇ／ｍＬ；並びにｂＦＧＦについては５μｇ／ｍＬ及び２．５μｇ／ｍＬ）。Ｋａｆｆは以下の式を用いて計算した：
Ｋａｆｆ＝（Ｎ－１）／２（Ｎ［Ｎｂ’］－［Ｎｂ］）
式中、Ｎ＝［Ａｇ］／［Ａｇ’］であり、［Ａｇ］ｙ［Ａｇ’］はコーティング上の抗原の最大濃度及び最小濃度に対応し、［Ｎｂ］及び［Ｎｂ’］はそれぞれ、［Ａｇ］及び［Ａｇ’］のコーティングで５０％の認識が達成されるＶＨＨの濃度に対応する。
抗体フラグメントの親和性定数（Ｋａｆｆ）は、Ｂｅａｔｔｙら（Ｂｅａｔｔｙ ＪＤ、Ｂｅａｔｔｙ ＢＧ、Ｖｌａｈｏｓ ＷＧ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８７ Ｊｕｎ ２６；１００（１－２）：１７３－９）に記載された方法で測定し、これには以前に記載された抗原認識ＥＬＩＳＡアッセイのバリエーションが用いられた。この場合、目的の各抗原でコーティングするために２つの濃度を使用した（ＧＳＴ－ｈＶＥＧＦについては７．５μｇ／ｍＬ及び２．５μｇ／ｍＬ；並びにｂＦＧＦについては５μｇ／ｍＬ及び２．５μｇ／ｍＬ）。Ｋａｆｆは以下の式を用いて計算した：
Ｋａｆｆ＝（Ｎ－１）／２（Ｎ［Ｎｂ’］－［Ｎｂ］）
式中、Ｎ＝［Ａｇ］／［Ａｇ’］であり、［Ａｇ］ｙ［Ａｇ’］はコーティング上の抗原の最大濃度及び最小濃度に対応し、［Ｎｂ］及び［Ｎｂ’］はそれぞれ、［Ａｇ］及び［Ａｇ’］のコーティングで５０％の認識が達成されるＶＨＨの濃度に対応する。
【0048】
可溶型受容体とリガンドとの間の競合ＥＬＩＳＡ
ＶＨＨがリガンドと結合する受容体を阻害する能力はＥＬＩＳＡによって評価し、ここで、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、ＵＳＡ）をＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ又はｂＦＧＦでコーティングし、前セクションで記載したようにブロッキングした。７５００ｎＭから４６．８ｎＭまでの精製ＶＨＨの連続１：２希釈液をプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。このステップでは、いくつかのウェルはＰＢＳ－ミルクのみを添加したままであった。次いで、Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ２、Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ１又はＦｃ－ＦＧＦＲ１を添加し、ＰＢＳ－ミルク中で、それぞれ最終濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈した。３７℃で４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。受容体結合を検出するため、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を、ＰＢＳ－０．５％ミルクで１：５０００に希釈して添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＴＭＢを添加した。反応は１０分後に停止させた。抗体フラグメントを添加せずに受容体とインキュベートしたウェルは、競合物質非存在下での最大結合の参照とした。このアッセイでは、陽性対照としてＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ軸の阻害の場合はＣＩＧＢ１６６ａ抗体フラグメントを使用し、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ軸の場合は抗ＦＧＦポリクローナル抗体を使用した。リガンドに対する受容体の結合阻害パーセントは以下のように計算した：
阻害％＝１００－（吸光度４５０）／（吸光度Ｕｍａｘ）×１００
ＶＨＨがリガンドと結合する受容体を阻害する能力はＥＬＩＳＡによって評価し、ここで、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、ＵＳＡ）をＧＳＴ－ｈＶＥＧＦ又はｂＦＧＦでコーティングし、前セクションで記載したようにブロッキングした。７５００ｎＭから４６．８ｎＭまでの精製ＶＨＨの連続１：２希釈液をプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。このステップでは、いくつかのウェルはＰＢＳ－ミルクのみを添加したままであった。次いで、Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ２、Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ１又はＦｃ－ＦＧＦＲ１を添加し、ＰＢＳ－ミルク中で、それぞれ最終濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈した。３７℃で４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。受容体結合を検出するため、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を、ＰＢＳ－０．５％ミルクで１：５０００に希釈して添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＴＭＢを添加した。反応は１０分後に停止させた。抗体フラグメントを添加せずに受容体とインキュベートしたウェルは、競合物質非存在下での最大結合の参照とした。このアッセイでは、陽性対照としてＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ軸の阻害の場合はＣＩＧＢ１６６ａ抗体フラグメントを使用し、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ軸の場合は抗ＦＧＦポリクローナル抗体を使用した。リガンドに対する受容体の結合阻害パーセントは以下のように計算した：
阻害％＝１００－（吸光度４５０）／（吸光度Ｕｍａｘ）×１００
【0049】
サイトカイン及び増殖因子の組織及び血清濃度の分析
腫瘍組織及び転移組織に関連するタンパク質を溶解し、製造業者の指示に従って、ＯｃｔｏＭａｃｓ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｍチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＲＩＰＡ溶液（ＳＩＧＭＡ）に回収した。溶解液を遠心分離して残渣を除去し、ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によりタンパク質濃度を評価した。ＶＨＨ濃度は、既に記載したようにＥＬＩＳＡによって評価した。動物の溶解液中及び血清中両方の血管新生促進因子の濃度を評価するために、ＭＡＧＰＭＡＧ－２４Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）試薬セットを使用し、組織の場合、値を抽出物について以前に決定したタンパク質濃度で正規化した。ｎｕ／ｎｕヌードマウスに移植したヒト腫瘍の場合、試薬セットＤＶ００１（Ｒ＆Ｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲ＆Ｄ説明書に従ってヒトＶＥＧＦをさらに定量化した。
腫瘍組織及び転移組織に関連するタンパク質を溶解し、製造業者の指示に従って、ＯｃｔｏＭａｃｓ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｍチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＲＩＰＡ溶液（ＳＩＧＭＡ）に回収した。溶解液を遠心分離して残渣を除去し、ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によりタンパク質濃度を評価した。ＶＨＨ濃度は、既に記載したようにＥＬＩＳＡによって評価した。動物の溶解液中及び血清中両方の血管新生促進因子の濃度を評価するために、ＭＡＧＰＭＡＧ－２４Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）試薬セットを使用し、組織の場合、値を抽出物について以前に決定したタンパク質濃度で正規化した。ｎｕ／ｎｕヌードマウスに移植したヒト腫瘍の場合、試薬セットＤＶ００１（Ｒ＆Ｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲ＆Ｄ説明書に従ってヒトＶＥＧＦをさらに定量化した。
【0050】
（例２）ＣＤＲ３無作為化ヒト化合成ライブラリーの構築
ヒト化ＶＨＨ合成ライブラリーのために、Ｃｏｎｒａｔｈらによって記載されたＶＨＨｈ－ＮｂＢＣＩＩ１０核酸配列を鋳型として選択した（Ｃｏｎｒａｔｈら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００１：４５：２８０７－１２）。抗原認識能力に影響を与えず、溶解度や安定性の点でポリペプチドの物理化学的特性に変化を与えることなくＶＨＨポリペプチドをヒト化するために、１３の突然変異を組み込んだ（Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９：２８４：３２７３－８４）。所望の配列をＤＮＡＷｏｒｋｓ Ｏｎｌｉｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ（Ｈｏｏｖｅｒ、Ｄ．ｙ Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ、Ｊ．、２００２）に入力し、オーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって選択した鋳型を合成するために、コドン使用を細菌用に最適化することによって１８個のオリゴヌクレオチドセットを得た。ＣＤＲ３に変異性を導入するために、ＦＲ３及びＦＲ４フレームワーク領域のフラグメントを含む突然変異誘発オリゴヌクレオチドを設計し、ＣＤＲ３については１８アミノ酸の長さを維持した（配列番号１）。コドンはＮＮＫ配列に従って形成した（ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴの等モル混合物であり、ＫはＧ及びＴの等モル混合物である）。ＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩ消化を行うために必要な制限部位をオリゴヌクレオチドに付加し（配列番号２及び配列番号３）、さらに無作為化したＣＤＲ３を有するＤＮＡをファゴミドベクターｐＨＧ－１ｍに組み込んだ。
ヒト化ＶＨＨ合成ライブラリーのために、Ｃｏｎｒａｔｈらによって記載されたＶＨＨｈ－ＮｂＢＣＩＩ１０核酸配列を鋳型として選択した（Ｃｏｎｒａｔｈら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００１：４５：２８０７－１２）。抗原認識能力に影響を与えず、溶解度や安定性の点でポリペプチドの物理化学的特性に変化を与えることなくＶＨＨポリペプチドをヒト化するために、１３の突然変異を組み込んだ（Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９：２８４：３２７３－８４）。所望の配列をＤＮＡＷｏｒｋｓ Ｏｎｌｉｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ（Ｈｏｏｖｅｒ、Ｄ．ｙ Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ、Ｊ．、２００２）に入力し、オーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって選択した鋳型を合成するために、コドン使用を細菌用に最適化することによって１８個のオリゴヌクレオチドセットを得た。ＣＤＲ３に変異性を導入するために、ＦＲ３及びＦＲ４フレームワーク領域のフラグメントを含む突然変異誘発オリゴヌクレオチドを設計し、ＣＤＲ３については１８アミノ酸の長さを維持した（配列番号１）。コドンはＮＮＫ配列に従って形成した（ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴの等モル混合物であり、ＫはＧ及びＴの等モル混合物である）。ＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩ消化を行うために必要な制限部位をオリゴヌクレオチドに付加し（配列番号２及び配列番号３）、さらに無作為化したＣＤＲ３を有するＤＮＡをファゴミドベクターｐＨＧ－１ｍに組み込んだ。
【0051】
ＣＤＲ３のみの多様化を含む合成ライブラリーの構築には、Ｋｕｎｋｅによって記載されたプロトコルを使用し（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１９８５：８２：４８８－９２）、Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ－Ｂｅｒｎａｌら（Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ－Ｂｅｒｎａｌら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１９：１４：ｅ０２１３３９４）に従って若干の修正を加えた。ライブラリーのサイズは、エレクトロポレーション後に得られたコロニーの総数を数えることによって決定した。このために、１０－２から１０－１０までの連続希釈を行った。１２個のコロニーのサンプル中の挿入物の存在及びサイズは、クローニングされたＶＨＨ遺伝子に隣接するベクターｐＨＧ－１ｍの配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって決定した。１．６×１０１２ｃｆｕ／ｍＬのライブラリーのサイズが推定され、検出された５８．３％の多様性（１２クローン中７クローンがモールド（ｍｏｌｄ）の異なる配列を有する）を調整した後の最終サイズは９．３×１０１１ｃｆｕ／ｍＬであった。
【0052】
（例３）異なる抗原に特異的なＣＤＲ３ユニバーサルライブラリーから特異的ＶＨＨを提示するファージの選択
ライブラリーの選択には２つの抗原：ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを使用した。ファージ選択は、例１に記載したように行った。選択を行った抗原の認識において、特に選択手順のサイクル２及び３によって、有意な濃縮が観察された。ＶＨＨ提示ファージは、記載された手順に従って、３番目の選択サイクルの選択されたファージで大腸菌のＴＧ１株の細菌を感染させた後、単離されたコロニーから産生された（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）。各ウェルの上清に含まれるファージ上に発現されたＶＨＨの免疫反応性を、上記のように、ＶＥＧＦ－及びｂＦＧＦ－特異的ファージＥＬＩＳＡによって評価した。したがって、陰性対照（ＧＳＴ又はＢＳＡ上）の少なくとも４倍の光学密度を有する、それぞれ２０及び２５の陽性ＶＨＨ産生クローンが特定され、多様性を評価するために配列決定された（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、 Ｋｏｒｅａ）。
ライブラリーの選択には２つの抗原：ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを使用した。ファージ選択は、例１に記載したように行った。選択を行った抗原の認識において、特に選択手順のサイクル２及び３によって、有意な濃縮が観察された。ＶＨＨ提示ファージは、記載された手順に従って、３番目の選択サイクルの選択されたファージで大腸菌のＴＧ１株の細菌を感染させた後、単離されたコロニーから産生された（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）。各ウェルの上清に含まれるファージ上に発現されたＶＨＨの免疫反応性を、上記のように、ＶＥＧＦ－及びｂＦＧＦ－特異的ファージＥＬＩＳＡによって評価した。したがって、陰性対照（ＧＳＴ又はＢＳＡ上）の少なくとも４倍の光学密度を有する、それぞれ２０及び２５の陽性ＶＨＨ産生クローンが特定され、多様性を評価するために配列決定された（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、 Ｋｏｒｅａ）。
【0053】
ＶＨＨ保有ファージの作製及び特性評価
陽性クローンから、ＶＨＨを提示する繊維状ファージを産生し、記載された手順に従って５０ｍＬのスケールで精製した（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）。免疫反応性プロファイルのＥＬＩＳＡによる評価には、１０１１ｃｆｕ／ｍＬの濃度で使用した。その結果、それぞれ１２及び１８の陽性ＶＨＨ産生クローンが特定され、これらは陰性対照（ＧＳＴ又はＢＳＡ上）の少なくとも４倍のＯＤを示した。白色抗原に対してより高い免疫反応性を示すファージクローンを用いて試験を継続した［ＶＥＧＦについてはクローンｐＨＧ－１ｍ＿Ｎｂ－Ｅ７、及びｂＦＧＦについてはクローンｐＨＧ－１ｍ＿Ｎｂ－Ａ５］。
陽性クローンから、ＶＨＨを提示する繊維状ファージを産生し、記載された手順に従って５０ｍＬのスケールで精製した（Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１：２２２：５８１－９７）。免疫反応性プロファイルのＥＬＩＳＡによる評価には、１０１１ｃｆｕ／ｍＬの濃度で使用した。その結果、それぞれ１２及び１８の陽性ＶＨＨ産生クローンが特定され、これらは陰性対照（ＧＳＴ又はＢＳＡ上）の少なくとも４倍のＯＤを示した。白色抗原に対してより高い免疫反応性を示すファージクローンを用いて試験を継続した［ＶＥＧＦについてはクローンｐＨＧ－１ｍ＿Ｎｂ－Ｅ７、及びｂＦＧＦについてはクローンｐＨＧ－１ｍ＿Ｎｂ－Ａ５］。
【0054】
ＶＨＨのＮｂ－Ｅ７及びＮｂ－Ａ５の入手及び特性評価
ポリペプチドＮｂ－Ｅ７（配列番号４）及びＮｂ－Ａ５（配列番号５）のコード配列を、２つの選択されたファージクローン（ｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ｅ７及びｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ａ５）の精製ＤＮＡから出発して、オリゴヌクレオチド配列番号６及び配列番号７を用いたＰＣＲ反応によって増幅させた。
ポリペプチドＮｂ－Ｅ７（配列番号４）及びＮｂ－Ａ５（配列番号５）のコード配列を、２つの選択されたファージクローン（ｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ｅ７及びｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ａ５）の精製ＤＮＡから出発して、オリゴヌクレオチド配列番号６及び配列番号７を用いたＰＣＲ反応によって増幅させた。
【0055】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化した。ｐＡＣＲ１－Ｋベクターを同じ酵素で消化し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて事前に消化したバンドとライゲーションした。反応産物をコンピテントＢＬ２１ ＤＥ３細胞に形質転換した。各構築物からの代表的なコロニーを用いて、例１に記載したようにタンパク質を発現させた。ペリプラズム画分中のＶＨＨフラグメントの存在を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。その結果、見かけの分子量が（分子量標準と比較した場合）２０～１５ｋＤａのタンパク質が発現していることが示され、これは全タンパク質の３２％に相当した。カルボキシル末端の同一性及び完全性は、抗ポリヒスチジンＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）により確認した。
【0056】
ＶＨＨの精製は、例１のセクションで詳述したように、製造業者の推奨（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）に従って金属イオン親和性によって行った。そのプロセスの結果、純度９５％を超えるＮｂ－Ｅ７及びＮｂ－Ａ５と呼ばれるＶＨＨが得られた。両ポリペプチドに対する親和性を計算した結果、１０－６～１０－７Ｍの値が示されたが、これはこの種のポリペプチドとしては低いと考えられるため、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を無作為化することにより親和性を熟成させた。
【0057】
（例４）親和性成熟ライブラリーの構築
親和性成熟用合成ライブラリーの構築では、ヒトＶＥＧＦを認識するクローンｐＨＧ－１ｍ＿Ｎｂ－Ｅ７ （配列番号４）及びｂＦＧＦを認識するクローンｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ａ５（配列番号５）から精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とした。
親和性成熟用合成ライブラリーの構築では、ヒトＶＥＧＦを認識するクローンｐＨＧ－１ｍ＿Ｎｂ－Ｅ７ （配列番号４）及びｂＦＧＦを認識するクローンｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ａ５（配列番号５）から精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とした。
【0058】
ＣＤＲ３の無作為化された抗体フラグメントをコードするＤＮＡ配列は、酵素ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を用いた２ステップＰＣＲによって増幅された。反応ＡにおけるＣＤＲ１の無作為突然変異導入は、オリゴヌクレオチド配列番号２及び配列番号８を用いて行い、反応ＢにおけるＣＤＲ２の無作為化はオリゴヌクレオチド配列番号３及び配列番号９を用いて行う。これらの増幅のバンド産物（Ａ：１５０ｂｐ及びＢ：２７０ｂｐ）を１：１で混合し（それぞれ１０ｎｇ）、オリゴヌクレオチド配列番号２及び配列番号３を用いて、親ＤＮＡのそれぞれについて４００ｂｐのバンドを増幅する２回目の反応の鋳型とした。これらのバンドを、ＡｐａＬＩ及びＮｏｔＩ消化後、事前に同じ酵素で消化したｐＨＧ－１ｍベクター中でクローニングした。この産物を、２％グルコースを含む２×ＹＴＡ固体培地上のＴＧ１株にエレクトロポレーションにより形質転換した。コロニーは、２４～２６時間の増殖後、２×ＹＴ液体培養培地でフラッシュし、成熟サブライブラリーを形成し、抗体フラグメントを提示する繊維状ファージの生産源として、２０％グリセロールの存在下、－７０℃で保存した。
【0059】
サブライブラリーのサイズは、例２に記載したように決定した。Ｎｂ－Ｅ７突然変異サブライブラリーのサイズは７．５×１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、Ｎｂ－Ａ５突然変異サブライブラリーのサイズは３×１０１２ｃｆｕ／ｍＬと推定された。
【0060】
目的の抗原に対する認識力が増大したＶＨＨを発現するファージの選択、生産、取得、及び特性評価は、例３に記載したように行った。ユニバーサルライブラリーについて記載したように、抗原に特異的なＶＨＨを提示するファージの濃縮は、２回目と３回目の選択サイクルの後に観察された。３回目の選択からの独立したクローンを分析すると、各抗原について多数の陽性クローンが検出された。標的抗原に対してより大きな免疫反応性を示したファージクローンを用いて試験を継続し［ＶＥＧＦについてはクローンｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ｖ１、及びｂＦＧＦについてはクローンｐＨＧ－１ｍ ＿Ｎｂ－Ｆ３］、その核酸配列はそれぞれ配列番号１０及び配列番号１１として特定される配列に対応する。
【0061】
（例５）ＶＨＨフラグメントの大腸菌における発現、精製、及び特異的抗原の認識の特性評価。ｐＡＣＲ１－ＫベクターにおけるＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３フラグメントのクローニング及び発現
ｐＡＣＲ１－ＫベクターへのＶＨＨ配列の挿入は、例３に記載したように行った。各構築物の代表的なコロニーを液体ＬＢＫ培地で発現させた。ペリプラズム画分中のＶＨＨフラグメントの存在を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。その結果、見かけの分子量が（標準分子量と比較した場合）１５～２０ｋＤａのタンパク質が発現していることが明らかになり、これは全タンパク質の３５％に相当した。カルボキシル末端の同一性及び完全性は、抗ポリヒスチジンＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）によって確認した。このフラグメントはＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３と命名され、そのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１２及び配列番号１３として特定された。ＶＨＨは、例１に記載されたように、金属イオンへの親和性によって精製され、可溶性画分及びペリプラズム画分を処理すると、それぞれ７ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌの収量が得られた。これらの収量は、異なるヒト化戦略及び免疫ライブラリーを用いた他の著者らの報告（国際公開第２００３／０３５６９４号）を上回るものであった。
ｐＡＣＲ１－ＫベクターへのＶＨＨ配列の挿入は、例３に記載したように行った。各構築物の代表的なコロニーを液体ＬＢＫ培地で発現させた。ペリプラズム画分中のＶＨＨフラグメントの存在を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。その結果、見かけの分子量が（標準分子量と比較した場合）１５～２０ｋＤａのタンパク質が発現していることが明らかになり、これは全タンパク質の３５％に相当した。カルボキシル末端の同一性及び完全性は、抗ポリヒスチジンＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）によって確認した。このフラグメントはＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３と命名され、そのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１２及び配列番号１３として特定された。ＶＨＨは、例１に記載されたように、金属イオンへの親和性によって精製され、可溶性画分及びペリプラズム画分を処理すると、それぞれ７ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌの収量が得られた。これらの収量は、異なるヒト化戦略及び免疫ライブラリーを用いた他の著者らの報告（国際公開第２００３／０３５６９４号）を上回るものであった。
【0062】
精製ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３フラグメントの免疫化学的特性評価
ヒト及びマウスＶＥＧＦの特異的認識
抗体及びその派生フラグメントの主な特性は抗原の認識であり、これが特異性及び親和性を決定する。ＶＥＧＦに対する特異的結合は、「ＶＨＨの標的抗原認識についてのＥＬＩＳＡ」（例１）のセクションで記載したように評価した。Ｎｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｅ７と呼ばれるＶＨＨフラグメントの異なるＶＥＧＦ－Ａによる認識能を比較するために、５０％の認識を生じるＶＨＨの濃度値を表すＥＣ５０（ｎＭ）を用いた。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１は、ヒトＶＥＧＦに対して４．７３４ｎＭのＥＣ５０を示し、これは、Ｎｂ－Ｅ７（１２．９ｎＭ）で検出されたものよりも３倍低い値であった。この結果は、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｅ７と比較して、Ｎｂ－Ｖ１によるＶＥＧＦの特異的な認識が向上していることを示すものであり、これは親和性成熟プロセスの間、ＣＤＲ１及び２に使用された無作為化手順と関連する要素である。この結果により、ベバシズマブ及びＣＩＧＢ－１６６ａのような開発中の他のポリペプチドとは異なり、Ｎｂ－Ｖ１は４，０７５ｎＭのＥＣ５０でマウス増殖因子を認識することも示された。Ｎｂ－Ｖ１はまた、いわゆる８０’ループにおいてアミノ酸Ｒ８２、Ｋ８４、及びＨ８６がＥ８２、Ｅ８４、及びＥ８６に置換された突然変異型変異体ＶＥＧＦ１２１をＥＬＩＳＡ系において認識した。この特性はＣＩＧＢ１６６ａと共通であるが、ベバシズマブとは異なる。加えて、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１は同様のＥＬＩＳＡフォーマットでは他の抗原（ＧＳＴ、ｂＦＧＦ）を認識せず、この事実はその抗原特異性を示している。
ヒト及びマウスＶＥＧＦの特異的認識
抗体及びその派生フラグメントの主な特性は抗原の認識であり、これが特異性及び親和性を決定する。ＶＥＧＦに対する特異的結合は、「ＶＨＨの標的抗原認識についてのＥＬＩＳＡ」（例１）のセクションで記載したように評価した。Ｎｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｅ７と呼ばれるＶＨＨフラグメントの異なるＶＥＧＦ－Ａによる認識能を比較するために、５０％の認識を生じるＶＨＨの濃度値を表すＥＣ５０（ｎＭ）を用いた。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１は、ヒトＶＥＧＦに対して４．７３４ｎＭのＥＣ５０を示し、これは、Ｎｂ－Ｅ７（１２．９ｎＭ）で検出されたものよりも３倍低い値であった。この結果は、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｅ７と比較して、Ｎｂ－Ｖ１によるＶＥＧＦの特異的な認識が向上していることを示すものであり、これは親和性成熟プロセスの間、ＣＤＲ１及び２に使用された無作為化手順と関連する要素である。この結果により、ベバシズマブ及びＣＩＧＢ－１６６ａのような開発中の他のポリペプチドとは異なり、Ｎｂ－Ｖ１は４，０７５ｎＭのＥＣ５０でマウス増殖因子を認識することも示された。Ｎｂ－Ｖ１はまた、いわゆる８０’ループにおいてアミノ酸Ｒ８２、Ｋ８４、及びＨ８６がＥ８２、Ｅ８４、及びＥ８６に置換された突然変異型変異体ＶＥＧＦ１２１をＥＬＩＳＡ系において認識した。この特性はＣＩＧＢ１６６ａと共通であるが、ベバシズマブとは異なる。加えて、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１は同様のＥＬＩＳＡフォーマットでは他の抗原（ＧＳＴ、ｂＦＧＦ）を認識せず、この事実はその抗原特異性を示している。
【0063】
可溶性形態ＶＥＧＦ受容体１及び２（それぞれＦｃ－ＶＥＧＦＲ１及びＦｃ－ＶＥＧＦＲ２）とＮｂ－Ｖ１との競合ＥＬＩＳＡ
ＶＥＧＦの生物学的効果は、２つの基本的な受容体（ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２）への結合の結果であるため、ＶＥＧＦに結合するポリペプチドが治療の場で有効であるためには、これらの相互作用を遮断しなければならない（Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、２００１：２６：２５－３５）。Ｎｂ－Ｖ１がリガンド（ＶＥＧＦ）との結合において受容体１及び２と競合する能力は、上記のように固相リガンド競合ＥＬＩＳＡによって評価された。このアッセイの結果は、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１によるＶＥＧＦへのＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ結合の用量依存的阻害を示し、シグナルの５０％阻害（ＩＣ５０）は２８．５７ｎＭの濃度で達成された。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｅ７は同様の試験でＩＣ５０が４倍低かったため、親和性成熟後のこのパラメーターでも改善が検出された。
ＶＥＧＦの生物学的効果は、２つの基本的な受容体（ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２）への結合の結果であるため、ＶＥＧＦに結合するポリペプチドが治療の場で有効であるためには、これらの相互作用を遮断しなければならない（Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、２００１：２６：２５－３５）。Ｎｂ－Ｖ１がリガンド（ＶＥＧＦ）との結合において受容体１及び２と競合する能力は、上記のように固相リガンド競合ＥＬＩＳＡによって評価された。このアッセイの結果は、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１によるＶＥＧＦへのＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ結合の用量依存的阻害を示し、シグナルの５０％阻害（ＩＣ５０）は２８．５７ｎＭの濃度で達成された。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｅ７は同様の試験でＩＣ５０が４倍低かったため、親和性成熟後のこのパラメーターでも改善が検出された。
【0064】
ベバシズマブ及びＣＩＧＢ１６６ａについて報告されたものとは異なり、Ｎｂ－Ｖ１と呼ばれるＶＨＨはＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦ相互作用の場合において用量依存的な阻害を示さなかった。同様の特性（ＶＥＧＦＲ２に選択的に結合する）を有する抗体は、バリサクマブ又はｒ８４と呼ばれる抗体しか報告されていない。ｒ８４抗体の長期使用では腎損傷は観察されず、この腎毒性がないことの原因要素はまさにＶＥＧＦＲ１を阻害しないことにあることが示唆されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＬｏｓ ＯＮＥ ２０１０：５：７－８）。このことを考慮すると、本発明で開発されたＶＨＨは、市販されている他の類似薬物よりも誘導する副作用が少ない可能性がある。
【0065】
ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１とＶＥＧＦ特異的抗体又は抗体フラグメントとの競合ＥＬＩＳＡ
モノクローナル抗体であるベバシズマブ及びｓｃＦｖ ＣＩＧＢ１６６ａは、ＶＥＧＦ内の異なるエピトープを認識し、様々な実験モデルにおいて抗血管新生効果を示している。ＶＥＧＦとの結合からの置換は、新しいポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで所望の効果を媒介する可能性を示している可能性がある。抗ＶＥＧＦ ＶＨＨがベバシズマブ抗体及びＣＩＧＢ１６６ａ抗体フラグメントとそのリガンドへの結合を競合する能力は、記載されているように固相リガンド競合ＥＬＩＳＡ法のバリエーションによって評価した。９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＣＨＯ細胞系で産生された１μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦ１２１を用いてコーティングした。１５，０００ｎＭから１，２００ｎＭまでの精製ＶＨＨの連続希釈液を添加した。次にビオチン化ベバシズマブ又はビオチン化ＣＩＧＢ１６６ａを添加し、それぞれ最終濃度が２．３ｎｇ／ｍＬ及び１４．３ｎｇ／ｍＬになるようにブロッキング溶液で希釈した。ビオチン化抗体の結合を検出するために、ＨＲＰにコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加した。抗体フラグメントを添加せず、ビオチン化ベバシズマブ又はビオチン化ＣＩＧＢ１６６ａとインキュベートしたウェルを、競合抗体非存在下での最大結合の参照とした。このアッセイでは、Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ２受容体キメラを陽性対照として用いた。ベバシズマブ、ＣＩＧＢ１６６ａ又はＶＥＧＦＲ２のリガンドへの結合の阻害パーセントは、上記の例１と同様に計算した。この試験の結果、Ｎｂ－Ｖ１と呼ばれる新規ＶＨＨは、ベバシズマブ及びＣＩＧＢ１６６ａのＶＥＧＦへの結合を用量依存的に阻害することが示された。ＶＥＧＦ／ベバシズマブ又はＣＩＧＢ１６６ａの相互作用の５０％阻害は、それぞれ９３０．９ｎＭ及び６７．４８ｎＭで観察された。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１はベバシズマブとは異なるエピトープを認識することが示されたが、これらの結果は、認識するＶＥＧＦ配列内のいくつかのアミノ酸残基を共有している可能性を示している。
モノクローナル抗体であるベバシズマブ及びｓｃＦｖ ＣＩＧＢ１６６ａは、ＶＥＧＦ内の異なるエピトープを認識し、様々な実験モデルにおいて抗血管新生効果を示している。ＶＥＧＦとの結合からの置換は、新しいポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで所望の効果を媒介する可能性を示している可能性がある。抗ＶＥＧＦ ＶＨＨがベバシズマブ抗体及びＣＩＧＢ１６６ａ抗体フラグメントとそのリガンドへの結合を競合する能力は、記載されているように固相リガンド競合ＥＬＩＳＡ法のバリエーションによって評価した。９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＣＨＯ細胞系で産生された１μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦ１２１を用いてコーティングした。１５，０００ｎＭから１，２００ｎＭまでの精製ＶＨＨの連続希釈液を添加した。次にビオチン化ベバシズマブ又はビオチン化ＣＩＧＢ１６６ａを添加し、それぞれ最終濃度が２．３ｎｇ／ｍＬ及び１４．３ｎｇ／ｍＬになるようにブロッキング溶液で希釈した。ビオチン化抗体の結合を検出するために、ＨＲＰにコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加した。抗体フラグメントを添加せず、ビオチン化ベバシズマブ又はビオチン化ＣＩＧＢ１６６ａとインキュベートしたウェルを、競合抗体非存在下での最大結合の参照とした。このアッセイでは、Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ２受容体キメラを陽性対照として用いた。ベバシズマブ、ＣＩＧＢ１６６ａ又はＶＥＧＦＲ２のリガンドへの結合の阻害パーセントは、上記の例１と同様に計算した。この試験の結果、Ｎｂ－Ｖ１と呼ばれる新規ＶＨＨは、ベバシズマブ及びＣＩＧＢ１６６ａのＶＥＧＦへの結合を用量依存的に阻害することが示された。ＶＥＧＦ／ベバシズマブ又はＣＩＧＢ１６６ａの相互作用の５０％阻害は、それぞれ９３０．９ｎＭ及び６７．４８ｎＭで観察された。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１はベバシズマブとは異なるエピトープを認識することが示されたが、これらの結果は、認識するＶＥＧＦ配列内のいくつかのアミノ酸残基を共有している可能性を示している。
【0066】
ヒト及びマウスＦＧＦの塩基性アイソフォームの特異的認識
ｂＦＧＦに対する特異的結合は、例１のｂＦＧＦ認識ＥＬＩＳＡに記載したように評価した。ポリペプチドＮｂ－Ａ５及びＮｂ－Ｆ３について、ヒト由来のｂＦＧＦに対する結合の５０％を生じるのに必要な濃度は、それぞれ５８．６１ｎＭ及び１１．２６ｎＭであることが見出された。Ｎｂ－Ｖ１の場合と同様に、親和性成熟プロセスに対応して、５倍の認識増加が達成された。このＶＨＨはＥＬＩＳＡ系でもマウスｂＦＧＦを１１．５２ｎＭのＥＣ５０で認識し、これは両種のポリペプチド間の高い相同性により、ヒトｂＦＧＦで得られたものと有意な違いはなかった。Ｎｂ－Ｖ１の場合と同様に、ＧＳＴ又はＶＥＧＦタンパク質の認識は観察されなかったため、Ｎｂ－Ｆ３フラグメントの抗原への結合の特異性の根拠が補強された。
ｂＦＧＦに対する特異的結合は、例１のｂＦＧＦ認識ＥＬＩＳＡに記載したように評価した。ポリペプチドＮｂ－Ａ５及びＮｂ－Ｆ３について、ヒト由来のｂＦＧＦに対する結合の５０％を生じるのに必要な濃度は、それぞれ５８．６１ｎＭ及び１１．２６ｎＭであることが見出された。Ｎｂ－Ｖ１の場合と同様に、親和性成熟プロセスに対応して、５倍の認識増加が達成された。このＶＨＨはＥＬＩＳＡ系でもマウスｂＦＧＦを１１．５２ｎＭのＥＣ５０で認識し、これは両種のポリペプチド間の高い相同性により、ヒトｂＦＧＦで得られたものと有意な違いはなかった。Ｎｂ－Ｖ１の場合と同様に、ＧＳＴ又はＶＥＧＦタンパク質の認識は観察されなかったため、Ｎｂ－Ｆ３フラグメントの抗原への結合の特異性の根拠が補強された。
【0067】
ｈＦＧＦ塩基性アイソフォーム受容体１の可溶性形態（Ｆｃ－ＦＧＦＲ１）とＶＨＨ Ｎｂ－Ｆ３との間の競合ＥＬＩＳＡ
ＦＧＦは、内皮細胞及び腫瘍細胞の表面に存在する、ＦＧＦＲ１～４と呼ばれる受容体チロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合することで生物学的作用を媒介する。ＦＧＦＲ１は内皮細胞表面に頻繁に見出されるものであり、ｉｎ ｖｉｖｏでのその阻害は腫瘍負担と血管系を有意に減少させることが示されている（Ｒｏｎｃａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１５：１９：１－１７）。抗ｂＦＧＦ Ｎｂ－Ｆ３ ＶＨＨのリガンドへの結合について受容体１と競合する能力を、固相リガンド競合ＥＬＩＳＡにより評価した。このアッセイの結果により、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｆ３が、Ｆｃ－ＦＧＦＲ１のｂＦＧＦへの結合を用量依存的に阻害することが示され、１３４．４ｎＭのＩＣ５０が観察された。対照としてＮｂ－Ａ５を用いた結果、ＩＣ５０は５倍高く、これは使用した手順による親和性成熟を裏付ける要素である。
ＦＧＦは、内皮細胞及び腫瘍細胞の表面に存在する、ＦＧＦＲ１～４と呼ばれる受容体チロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合することで生物学的作用を媒介する。ＦＧＦＲ１は内皮細胞表面に頻繁に見出されるものであり、ｉｎ ｖｉｖｏでのその阻害は腫瘍負担と血管系を有意に減少させることが示されている（Ｒｏｎｃａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１５：１９：１－１７）。抗ｂＦＧＦ Ｎｂ－Ｆ３ ＶＨＨのリガンドへの結合について受容体１と競合する能力を、固相リガンド競合ＥＬＩＳＡにより評価した。このアッセイの結果により、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｆ３が、Ｆｃ－ＦＧＦＲ１のｂＦＧＦへの結合を用量依存的に阻害することが示され、１３４．４ｎＭのＩＣ５０が観察された。対照としてＮｂ－Ａ５を用いた結果、ＩＣ５０は５倍高く、これは使用した手順による親和性成熟を裏付ける要素である。
【0068】
（例６）ＶＨＨへの修飾の導入。ＶＨＨ Ｖ１及びＦ３フラグメントを用いた二重特異性及び二価ポリペプチドの構築
二重特異性ポリペプチド及び二価ポリペプチドを構築するために、酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）及び対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、２ステップＰＣＲを行った。オリゴヌクレオチドは最初のＰＣＲで、２つのＶＨＨ間のスペーサーとしてγ２Ｃと呼ばれる免疫グロブリンのヒンジ領域を組み込むように設計された。この領域では、望ましくない構造の形成を避けるために、システインをアラニンに置換した（Ｈｍｉｌａら、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１０：２４：３４７９－８９）。セグメント１の増幅にはオリゴヌクレオチド配列番号１４及び配列番号１５を用い、セグメント２の増幅にはオリゴヌクレオチド配列番号１６及び配列番号１７を用いた。最初のＰＣＲの産物を鋳型として第２のＰＣＲを行い、二重特異性及び二価構築物を組み立てた。上述の酵素、並びに配列番号１４及び配列番号１７のプライマーを使用した。ＰＣＲ産物を精製し、製造業者の指示に従ってＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化した。ｐＡＣＲ１－Ｋベクターを同じ酵素で消化し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて事前に消化したバンドとライゲーションした。構築物のヌクレオチド配列は、自動配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。
二重特異性ポリペプチド及び二価ポリペプチドを構築するために、酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）及び対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、２ステップＰＣＲを行った。オリゴヌクレオチドは最初のＰＣＲで、２つのＶＨＨ間のスペーサーとしてγ２Ｃと呼ばれる免疫グロブリンのヒンジ領域を組み込むように設計された。この領域では、望ましくない構造の形成を避けるために、システインをアラニンに置換した（Ｈｍｉｌａら、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１０：２４：３４７９－８９）。セグメント１の増幅にはオリゴヌクレオチド配列番号１４及び配列番号１５を用い、セグメント２の増幅にはオリゴヌクレオチド配列番号１６及び配列番号１７を用いた。最初のＰＣＲの産物を鋳型として第２のＰＣＲを行い、二重特異性及び二価構築物を組み立てた。上述の酵素、並びに配列番号１４及び配列番号１７のプライマーを使用した。ＰＣＲ産物を精製し、製造業者の指示に従ってＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化した。ｐＡＣＲ１－Ｋベクターを同じ酵素で消化し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて事前に消化したバンドとライゲーションした。構築物のヌクレオチド配列は、自動配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。
【0069】
配列番号１８及び配列番号１９として特定される配列を有する二重特異性Ｎｂ－ＶＦ３及びＮｂ－ＦＶ１ポリペプチド、並びに配列番号２０及び配列番号２１として特定される配列を有する二価のＮｂ－ＶＶ６及びＮｂ－ＦＦ２は、例１に記載されたように発現及び精製された。全ての場合において、タンパク質の純度及び同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ １２％及び抗ポリヒスチジンＷｅｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによって確認された。４つのポリペプチド調製物において、重量標準と比較すると、３０～４０ｋＤａの間を移動する、純度９５％を超えるバンドが特定された。ポリペプチドの実験的質量及びジスルフィド結合の配置をＥＳＩ／ＭＳ－ＭＳにより確認した。各ポリペプチドの実験的質量及び理論的質量は、全ての場合で誤差０．００１５％未満で一致し、Ｃ２２～Ｃ１０１とＣ１６８～Ｃ２４７の間の分子内架橋の形成が確認された。アミノ末端の自動エドマン配列決定解析により、その完全性が実証された。ポリペプチドの生物学的活性は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ抗原を認識についてのＥＬＩＳＡ、及びそれぞれのＶＥＧＦＲ２とＦＧＦＲ１受容体に結合するＶＥＧＦとｂＦＧＦを置換する能力によって評価された。Ｎｂ－ＦＶ１及びＮｂ－ＶＦ３と命名された二重特異性ポリペプチドの場合、親ＶＨＨであるＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３と比較すると、各抗原に対するＥＣ５０は変化しないことが示された。同様に、抗原の受容体による結合を置換する能力にも影響がないことが示された。一方、二価のポリペプチドＮｂ－ＶＶ６及びＮｂ－ＦＦ２については、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦに対するＥＣ５０が、それぞれＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－Ｆ３で得られた値に比べて２倍低下した（表１）。Ｂｅａｔｔｙら（Ｂｅａｔｔｙ ＪＤ、Ｂｅａｔｔｙ ＢＧ、Ｖｌａｈｏｓ ＷＧ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８７ Ｊｕｎ ２６；１００（１－２）：１７３－９）により記載される方法論に従って計算すると、認識能の向上と一致して、フラグメントのＫＤの低下が観察された。二価のポリペプチドの親和性がこのように明らかに増加したのは、第２のドメインが付加された際にそのアビディティが増加したためと考えられる。
【表1】
【0070】
ｃ－ｍｙｃトレーサーペプチド及びヒスチジンタグの除去
ｃ－ｍｙｃトレーサーペプチド及びヒスチジンテールを除去するために、各ＶＨＨ、又はそれらの二重特異性若しくは二価の構築物に対応するバンドを、酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びポリペプチドの３’末端に向かって酵素ＢｇｌＩＩの制限部位を導入する配列番号１５及び配列番号２２で定義されるプライマーのセットを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。ｐＡＣＲ１－Ｋベクターを同じ酵素で消化し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて事前に消化したバンドとライゲーションした。ＶＨＨのヌクレオチド配列は、自動配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。ｃ－ｍｙｃトレーサー配列がなく、ヒスチジンタグがないポリペプチドをＮｂ－Ｖ１＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２３）、Ｎｂ－Ｆ３＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２４）、Ｎｂ－ＶＶ６＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２５）、Ｎｂ－ＦＦ２＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２６）、Ｎｂ－ＦＶ１＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２７）及びＮｂ－ＶＦ３＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２８）と命名した。
ｃ－ｍｙｃトレーサーペプチド及びヒスチジンテールを除去するために、各ＶＨＨ、又はそれらの二重特異性若しくは二価の構築物に対応するバンドを、酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びポリペプチドの３’末端に向かって酵素ＢｇｌＩＩの制限部位を導入する配列番号１５及び配列番号２２で定義されるプライマーのセットを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。ｐＡＣＲ１－Ｋベクターを同じ酵素で消化し、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて事前に消化したバンドとライゲーションした。ＶＨＨのヌクレオチド配列は、自動配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。ｃ－ｍｙｃトレーサー配列がなく、ヒスチジンタグがないポリペプチドをＮｂ－Ｖ１＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２３）、Ｎｂ－Ｆ３＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２４）、Ｎｂ－ＶＶ６＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２５）、Ｎｂ－ＦＦ２＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２６）、Ｎｂ－ＦＶ１＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２７）及びＮｂ－ＶＦ３＼ｃｍｙｃＨ６（配列番号２８）と命名した。
【0071】
これらのポリペプチドの発現は、記載したように行った。精製には、ＶＨＨ抗体フラグメントがこのタンパク質に結合する能力を保持しているという事実を利用して、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いた（Ｃｒａｕｗｅｌｓ Ｍ、Ｖａｎ Ｖａｅｒｅｎｂｅｒｇｈ Ｎ、Ｋｕｌａｙａ ＮＢら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０２０；５７：２０－２８）。培養上清又はペリプラズム抽出物をＰＢＳ １×中で、１：２の比率で希釈し、事前に充填したＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。残りの精製は、製造業者の推奨に従って行った。このプロセスの結果、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量標準と比較すると、１５～２０ｋＤａ（Ｎｂ－Ｖ１＼ｃｍｙｃＨ６及びＮｂ－Ｆ３＼ｃｍｙｃＨ６の場合）及び３０～４０ｋＤａ（Ｎｂ－ＶＶ６＼ｃｍｙｃＨ６、Ｎｂ－ＦＦ２＼ｃｍｙｃＨ６、Ｎｂ－ＦＶ１＼ｃｍｙｃＨ６及びＮｂ－ＶＦ３＼ｃｍｙｃＨ６の場合）移動する、純度９５％を超えるポリペプチドが得られた。トレーサー配列の正確な除去は、抗ポリヒスチジン及び抗ｃ－ｍｙｃ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによって実証され、プロテインＡ－ＨＲＰが陽性対照として用いられた。アミノ末端の完全性の分析では、同じものの分解は検出されなかった。ＥＳＩ／ＭＳ－ＭＳの結果は、ポリペプチドの理論的サイズと実験的サイズの一致を示し、誤差は０．００１９％以下であった。さらに、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－ＦＦ２、Ｎｂ－ＦＶ１、及びＮｂ－ＶＦ３について観察されたのと同様のジスルフィド結合配置が示された。ｃ－ｍｙｃトレーサー配列がなく、ヒスチジンタグがないポリペプチドの生物学的活性は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ抗原の認識、及びそれぞれのＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１受容体への結合の置換についてＥＬＩＳＡによって評価した。表２は、５０％の抗原認識又は５０％の抗原／受容体複合体形成阻害を達成するのに必要なＶＨＨ＼ｃｍｙｃＨ６の濃度値として表した結果である。トレーサーペプチドを欠失したＶＨＨとその相同なＶＨＨとの間に、結合又は阻害の点で差異は検出されなかった。
【表2】
【0072】
ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域への融合
抗体のＦｃ画分は、抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性などのエフェクター機能を媒介する。エフェクター活性を促進するポリペプチドの可能性を解析するために、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、及びそれらの二重特異性及び二価構築物をｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃベクター（国際公開第２０１２／０８９１７６号）に挿入した。このプラスミドは、ヒト由来のＦｃ領域との融合ポリペプチドとしてタンパク質を取得するように設計された。ＶＨＨのオリゴヌクレオチド配列は、酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及びｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃ用の配列番号２９及び配列番号３０のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。ＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩ酵素制限部位を組み込んだ。精製したＰＣＲ産物をｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃベクターと同様にこれらの酵素で消化した。事前に消化したバンド及びベクターを酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。ヌクレオチド配列は自動配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認され、新しいポリペプチドはＮｂ－Ｖ１＿ｈＦｃ（配列番号３１）、Ｎｂ－Ｆ３＿ｈＦｃ（配列番号３２）、Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ（配列番号３３）、Ｎｂ－ＦＦ２＿ｈＦｃ（配列番号３４）、Ｎｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃ（配列番号３５）、及びＮｂ－ＶＦ３＿ｈＦｃ（配列番号３６）と命名した。正しい配列を有するプラスミド構築物を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で選択した後、上清中の発現量が最も高いクローンを、抗ヒトＩｇＧの検出コンジュゲートのみを変更した、既に記載したものと同様の抗原認識ＥＬＩＳＡによって選択した。
抗体のＦｃ画分は、抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性などのエフェクター機能を媒介する。エフェクター活性を促進するポリペプチドの可能性を解析するために、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、及びそれらの二重特異性及び二価構築物をｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃベクター（国際公開第２０１２／０８９１７６号）に挿入した。このプラスミドは、ヒト由来のＦｃ領域との融合ポリペプチドとしてタンパク質を取得するように設計された。ＶＨＨのオリゴヌクレオチド配列は、酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及びｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃ用の配列番号２９及び配列番号３０のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。ＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩ酵素制限部位を組み込んだ。精製したＰＣＲ産物をｐＶＳＪＧ－ｈｕＦｃベクターと同様にこれらの酵素で消化した。事前に消化したバンド及びベクターを酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。ヌクレオチド配列は自動配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認され、新しいポリペプチドはＮｂ－Ｖ１＿ｈＦｃ（配列番号３１）、Ｎｂ－Ｆ３＿ｈＦｃ（配列番号３２）、Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ（配列番号３３）、Ｎｂ－ＦＦ２＿ｈＦｃ（配列番号３４）、Ｎｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃ（配列番号３５）、及びＮｂ－ＶＦ３＿ｈＦｃ（配列番号３６）と命名した。正しい配列を有するプラスミド構築物を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で選択した後、上清中の発現量が最も高いクローンを、抗ヒトＩｇＧの検出コンジュゲートのみを変更した、既に記載したものと同様の抗原認識ＥＬＩＳＡによって選択した。
【0073】
精製にはプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いた。その結果、純度が９５％を超え、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で、重量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＥＥ． ＵＳＡ）と比較した場合、見かけのサイズが４０～６０ｋＤａのポリペプチドが得られた。その同一性はＥＬＩＳＡによって確認した。アミノ末端の同一性の分析により、その分解は検出されず、ＥＳＩ／ＭＳ－ＭＳの結果、各ポリペプチドの実験的質量と理論的質量は一致し、全ての場合について誤差は０．００１２％未満であった。ｈＦｃ領域に融合したポリペプチドの生物学的活性を、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ抗原の認識、並びにそれぞれのＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１受容体への結合の置換についてＥＬＩＳＡにより評価した。表３は、これらの試験の結果を、抗原認識の５０％、又はＥＬＩＳＡ型のアッセイにおける抗原／受容体複合体形成の阻害の５０％を表すＶＨＨ＿ｈＦｃの濃度値として表したものである。この場合、融合ポリペプチドのＥＣ５０は相同なＶＨＨと比較して２～４倍低下することが観察された。モノクローナル抗体のように、これらのポリペプチドはホモ二量体として組織化されているため、この認識の増加は価数の増加に対応している。抗原認識の増加と同程度に、抗原／受容体相互作用のＩＣ５０の低下が検出された。
【表3】
【0074】
（例７）ＶＨＨの熱安定性試験
ＶＨＨは、Ｆａｂ又はｓｃＦｖなどの他の抗体フラグメントとは異なり、高温に耐性を持つことが知られている。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－Ｆ３、及びＮｂ－ＦＶ１の異なる温度における耐性を決定するため、各フラグメント１３μｇを４、３７、５０、及び７５℃でインキュベートする試験を行った。これらの免疫反応性は、２時間のインキュベート後にＥＬＩＳＡによって評価し、４℃のインキュベート条件で得られたものを最大認識とした。このアッセイでは、ＣＩＧＢ－１６６ａ ｓｃＦｖフラグメントを対照として用いた。表４は、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ抗原による異なるフラグメントの認識能を、それぞれ－２０℃で保存したタンパク質で得られた値を参照として、回復された活性のパーセントの点から示したものである。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、及びＮｂ－ＦＶ１によるＶＥＧＦの特異的認識は、７５℃で２時間インキュベートした後でも７０％近くを維持していることが観察された。この挙動は、抗原認識を失ったｓｃＦｖ ＣＩＧＢ－１６６ａでは観察されなかった。ｂＦＧＦの認識についてであるが、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＦＦ２、及びＮｂ－ＦＶ１についても、温度上昇に対して同じ耐性が検出された。
ＶＨＨは、Ｆａｂ又はｓｃＦｖなどの他の抗体フラグメントとは異なり、高温に耐性を持つことが知られている。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－Ｆ３、及びＮｂ－ＦＶ１の異なる温度における耐性を決定するため、各フラグメント１３μｇを４、３７、５０、及び７５℃でインキュベートする試験を行った。これらの免疫反応性は、２時間のインキュベート後にＥＬＩＳＡによって評価し、４℃のインキュベート条件で得られたものを最大認識とした。このアッセイでは、ＣＩＧＢ－１６６ａ ｓｃＦｖフラグメントを対照として用いた。表４は、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ抗原による異なるフラグメントの認識能を、それぞれ－２０℃で保存したタンパク質で得られた値を参照として、回復された活性のパーセントの点から示したものである。ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、及びＮｂ－ＦＶ１によるＶＥＧＦの特異的認識は、７５℃で２時間インキュベートした後でも７０％近くを維持していることが観察された。この挙動は、抗原認識を失ったｓｃＦｖ ＣＩＧＢ－１６６ａでは観察されなかった。ｂＦＧＦの認識についてであるが、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＦＦ２、及びＮｂ－ＦＶ１についても、温度上昇に対して同じ耐性が検出された。
【表4】
【0075】
（例８）異なる緩衝液中及びチンチラウサギの硝子体液中におけるＶＨＨフラグメントの溶解性のｅｘ ｖｉｖｏ試験
抗体の硝子体内投与又は全身投与のいずれかにおいて凝集体を避けることが臨床的に重要であることを考慮し、異なる緩衝液中で予備的な安定性試験を行った。合計６種類を試験した。この緩衝液のうち３つは現在、硝子体内投与が承認されている（Ｇｉａｎｎｏｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８：１－１５）：
ｉ． ラニビズマブ薬物保存製剤（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ Ｂ．）：１０％α（＋）トレハロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０及び１．９８ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ヒスチジナ、ｐＨ５．５。
ｉｉ． 製剤Ａ：１０％α（＋）トレハロース、１００ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭ Ｌ－アルギニナ、０．３％ＮａＣｌ及び０．０４％、Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．７８。
ｉｉｉ． 製剤Ｂ：７．５％α（＋）トレハロース、１００ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭ Ｌ－アルギニナ、０．３％ＮａＣｌ及び０．０４％、Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．７８。
抗体の硝子体内投与又は全身投与のいずれかにおいて凝集体を避けることが臨床的に重要であることを考慮し、異なる緩衝液中で予備的な安定性試験を行った。合計６種類を試験した。この緩衝液のうち３つは現在、硝子体内投与が承認されている（Ｇｉａｎｎｏｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８：１－１５）：
ｉ． ラニビズマブ薬物保存製剤（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ Ｂ．）：１０％α（＋）トレハロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０及び１．９８ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ヒスチジナ、ｐＨ５．５。
ｉｉ． 製剤Ａ：１０％α（＋）トレハロース、１００ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭ Ｌ－アルギニナ、０．３％ＮａＣｌ及び０．０４％、Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．７８。
ｉｉｉ． 製剤Ｂ：７．５％α（＋）トレハロース、１００ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭ Ｌ－アルギニナ、０．３％ＮａＣｌ及び０．０４％、Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．７８。
【0076】
他の３つは、良好なＶＨＨ安定性が期待される緩衝液である（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１３：８２：１７．１－．２３）：
ｉｖ． ＰＢＳ １×、ｐＨ７．２
ｖ． Ｔｒｉｓ ２００ｍＭ、ｐＨ８．０
ｖｉ． Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ｐＨ８．０。
ｉｖ． ＰＢＳ １×、ｐＨ７．２
ｖ． Ｔｒｉｓ ２００ｍＭ、ｐＨ８．０
ｖｉ． Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ｐＨ８．０。
【0077】
ＶＨＨは最大２８ｍｇ／ｍＬまで濃縮され、その後５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整された。ＶＨＨは最大１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬの濃度になるように異なる緩衝液中で希釈し、４℃で５日間インキュベートした。この期間後、その免疫反応性を測定した。ＣＩＧＢ－１６６ａ ｓｃＦｖフラグメントを対照として用いた。試験下の全てのポリペプチドについて、６種類の緩衝液で１００％の活性が回復されたが、ｓｃＦｖ ＣＩＧＢ－１６６ａについてはラニビズマブ緩衝液でのみ１００％の回復が観察され、残りの実験条件ではラニビズマブ緩衝液で２０％を超える損失が観察された。
【0078】
ＶＨＨフラグメントの硝子体液中への溶解性は、黄斑及び角膜状態の治療で使用される用量が硝子体液中の最終濃度０．１２５～０．５ｍｇ／ｍＬに対して０．５～２ｍｇの範囲であることを考慮し、ｅｘ ｖｉｖｏモデルで評価した（Ｇｉａｎｎｏｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８：１－１５）。３７℃での速度論的試験では、光学顕微鏡（４００×）での検査で沈殿現象の存在は示されなかった。６０００ｒｐｍで遠心分離した後の上清の分析では、リガンド認識に関して生物学的活性の損失は認められなかった（リン酸緩衝液中のポリペプチドが最大の認識を示したのと比較して、全てのＶＨＨ製剤について、活性の９５～１００％の回復）。ベバシズマブ（Ｂｅｖ）及びＣＩＧＢ－１６６ａ ｓｃＦｖフラグメントをこのアッセイにおける対照として用いた。沈殿に起因し得る、活性の５０％損失が観察されたｓｃＦｖ ＣＩＧＢ－１６６ａを除き、試験下の全てのポリペプチドについて活性の１００％が回復された。
【0079】
（例９）ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ系への異なるポリペプチドの添加効果の評価
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２又はｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ１依存的な方法で、細胞増殖、管状ネットワークの形成及び細胞遊走を複製する、以前に確立された条件において、連続希釈のポリペプチドの添加の影響を分析した。
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２又はｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ１依存的な方法で、細胞増殖、管状ネットワークの形成及び細胞遊走を複製する、以前に確立された条件において、連続希釈のポリペプチドの添加の影響を分析した。
【0080】
内皮細胞における増殖試験：
簡潔には、９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、１０％血清を添加したＭＣＤＢ１３１培地（ＳＩＧＭＡ）１００μＬに、１ウェルあたり６０００個のＨＤＭＥＣ細胞を播種した。１２時間後、洗浄により培養培地から血清を除去し、ＭＣＤＢ１３１培地１００μＬを２４時間添加した。ＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、又はＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ（それぞれ２．５ｎｇ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬ）の添加により、培養７２時間後に有意な細胞増殖が誘導された。ＶＨＨは、ＭＣＤＢ１３１培地中の増殖活性化剤に最終濃度３００～０．５ｎＭで３７℃で１時間添加し、最終体積２００μＬで細胞に添加した。細胞増殖はＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ代謝から推定した。表５に示す濃度について、増殖の５０％低下が観察された（ＩＣ５０）。
簡潔には、９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、１０％血清を添加したＭＣＤＢ１３１培地（ＳＩＧＭＡ）１００μＬに、１ウェルあたり６０００個のＨＤＭＥＣ細胞を播種した。１２時間後、洗浄により培養培地から血清を除去し、ＭＣＤＢ１３１培地１００μＬを２４時間添加した。ＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、又はＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ（それぞれ２．５ｎｇ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬ）の添加により、培養７２時間後に有意な細胞増殖が誘導された。ＶＨＨは、ＭＣＤＢ１３１培地中の増殖活性化剤に最終濃度３００～０．５ｎＭで３７℃で１時間添加し、最終体積２００μＬで細胞に添加した。細胞増殖はＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ代謝から推定した。表５に示す濃度について、増殖の５０％低下が観察された（ＩＣ５０）。
【表5】
【0081】
Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＦＦ２、Ｎｂ－ＦＶ１、及びＮｂ－ＶＦ３を添加した結果、微小血管内皮細胞系ＨＤＭＥＣのＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ依存性増殖が減少した。両方の刺激を用いる場合、ＶＥＧＦ系及びｂＦＧＦ系の二重標的化は協同効果を示した。これらの解析は、不死化マウス内皮細胞（Ｈ５Ｖ）及び初代内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で再現され、同様の結果が得られた。
【0082】
不死化３Ｔ３Ａ３１及びＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、並びにＡ５４９及びＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞の増殖試験：
この場合、３Ｔ３Ａ３１及びＮＩＨ３Ｔ３細胞は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地１００μＬにウェルあたり６０００細胞の密度で播種し、Ａ５４９及びＢ１６Ｆ１０細胞はウェルあたり２０００細胞で使用した。ＶＥＧＦ活性化は陰性対照として用いた。アッセイは、最大増殖を生じるｂＦＧＦ濃度（３Ｔ３Ａ３１及びＮＩＨ３Ｔ３は１００ｎｇ／ｍＬ、Ａ５４９及びＢ１６Ｆ１０は２０ｎｇ／ｍＬ）の点で異なって展開された。ｂＦＧＦに応答する増殖の有意な減少は、この増殖因子に特異性を有するポリペプチドを含む実験条件で観察され、増殖の５０％阻害についての用量を表６に詳述する。
この場合、３Ｔ３Ａ３１及びＮＩＨ３Ｔ３細胞は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地１００μＬにウェルあたり６０００細胞の密度で播種し、Ａ５４９及びＢ１６Ｆ１０細胞はウェルあたり２０００細胞で使用した。ＶＥＧＦ活性化は陰性対照として用いた。アッセイは、最大増殖を生じるｂＦＧＦ濃度（３Ｔ３Ａ３１及びＮＩＨ３Ｔ３は１００ｎｇ／ｍＬ、Ａ５４９及びＢ１６Ｆ１０は２０ｎｇ／ｍＬ）の点で異なって展開された。ｂＦＧＦに応答する増殖の有意な減少は、この増殖因子に特異性を有するポリペプチドを含む実験条件で観察され、増殖の５０％阻害についての用量を表６に詳述する。
【表6】
【0083】
内皮ネットワーク形成試験：
これらの評価には、三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリクスに播種したＨＤＭＥＣ細胞を用いた（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｒ．、Ｐｅｐｐｅｒ、Ｍ．Ｓ．、１９９８．Ｅｎ：Ｌｉｔｔｌｅ、Ｃ．Ｄ．、Ｍｉｒｏｎｏｖ、Ｖ．、Ｓａｇｅ、Ｅ．Ｈ．（Ｅｄｓ．）、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｉｎ ｖｉｖｏ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｍｅｎｔｅ．Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ｐｐ．７９－１１０）。簡潔には、１ウェル（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）あたりＭＡＴＲＩＧＥＬ ２．５μＬをＴＥＲＡＳＡＫＩプレートに４℃で添加し、３７℃でゲル化させた。１ウェルあたり２０００細胞のＣＦＳＥ標識ＨＤＭＥＣ細胞を１０μｌのＭＣＤＢ１３１上に添加し、表７に示すように処理液を同体積で添加した。結果は６時間後及び２４時間後に評価し、倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で、位相差で得られた画像から定量化した。定量化は、既に記載した手順に従い、ＩｍａｇｅＪプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ； ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＥＥ．ＵＵ．）を使用して行った（Ｄ． Ｇｕｉｄｏｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（２００４）１１７－１２４）。表７は、２．５％血清、１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ又は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦの存在下、固定濃度の１０μｇ／ｍＬのＶＨＨに応答した、視野（１００×）あたり検出された結節の平均を示している。
これらの評価には、三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリクスに播種したＨＤＭＥＣ細胞を用いた（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｒ．、Ｐｅｐｐｅｒ、Ｍ．Ｓ．、１９９８．Ｅｎ：Ｌｉｔｔｌｅ、Ｃ．Ｄ．、Ｍｉｒｏｎｏｖ、Ｖ．、Ｓａｇｅ、Ｅ．Ｈ．（Ｅｄｓ．）、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｉｎ ｖｉｖｏ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｍｅｎｔｅ．Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ｐｐ．７９－１１０）。簡潔には、１ウェル（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）あたりＭＡＴＲＩＧＥＬ ２．５μＬをＴＥＲＡＳＡＫＩプレートに４℃で添加し、３７℃でゲル化させた。１ウェルあたり２０００細胞のＣＦＳＥ標識ＨＤＭＥＣ細胞を１０μｌのＭＣＤＢ１３１上に添加し、表７に示すように処理液を同体積で添加した。結果は６時間後及び２４時間後に評価し、倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で、位相差で得られた画像から定量化した。定量化は、既に記載した手順に従い、ＩｍａｇｅＪプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ； ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＥＥ．ＵＵ．）を使用して行った（Ｄ． Ｇｕｉｄｏｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（２００４）１１７－１２４）。表７は、２．５％血清、１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ又は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦの存在下、固定濃度の１０μｇ／ｍＬのＶＨＨに応答した、視野（１００×）あたり検出された結節の平均を示している。
【表7】
【0084】
（例１０）チンチラウサギにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験
既に記載したように、本発明の対象となるＶＨＨの潜在的な用途の１つは、黄斑の血管状態の治療における使用である。増殖因子ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦに依存する血管過多の治療におけるそれらの一部の使用の実現可能性を分析するために、Ｍｏｒｅｒａら（Ｍｏｒｅｒａら、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、２０１４：１２２：１０２－９）によって記載されたように、チンチラウサギが使用された。５０μＬ中２．５μｇのＶＥＧＦ又はｂＦＧＦの単回注射を用いて、血管損傷を誘導した。この手法は、１０日間で異常な血管形成パターンを誘導するのに十分であることが証明されている。注射から７２時間後、動物に５０μＬの生理食塩液中のＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＶＶ６、及びＮｂ－ＦＶ１を単回硝子体内注射した。血管新生促進因子の最初の硝子体内注射の１週間前と１０日後に、手術用顕微鏡検査、カラー眼底写真、及びフルオレセイン血管造影（ＦＡ）を行った。全ての場合においてウサギは麻酔され、瞳孔は前述のように拡張された。各眼で少なくとも５枚の写真を撮った：視神経円板、側頭髄質翼、鼻髄質翼、円板上の網膜上方、及び円板下の網膜下方。耳縁静脈に静脈ラインを配置し、１０％フルオレセインを０．２ｍＬ注射した。フルオレセイン注射直後に連続眼底写真を撮影した。後半の写真は実験開始１０分後に撮影した。選択されたいくつかの場合では、前部セグメントの写真も撮影した。画像はＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｙｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアで処理した。
既に記載したように、本発明の対象となるＶＨＨの潜在的な用途の１つは、黄斑の血管状態の治療における使用である。増殖因子ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦに依存する血管過多の治療におけるそれらの一部の使用の実現可能性を分析するために、Ｍｏｒｅｒａら（Ｍｏｒｅｒａら、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、２０１４：１２２：１０２－９）によって記載されたように、チンチラウサギが使用された。５０μＬ中２．５μｇのＶＥＧＦ又はｂＦＧＦの単回注射を用いて、血管損傷を誘導した。この手法は、１０日間で異常な血管形成パターンを誘導するのに十分であることが証明されている。注射から７２時間後、動物に５０μＬの生理食塩液中のＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＶＶ６、及びＮｂ－ＦＶ１を単回硝子体内注射した。血管新生促進因子の最初の硝子体内注射の１週間前と１０日後に、手術用顕微鏡検査、カラー眼底写真、及びフルオレセイン血管造影（ＦＡ）を行った。全ての場合においてウサギは麻酔され、瞳孔は前述のように拡張された。各眼で少なくとも５枚の写真を撮った：視神経円板、側頭髄質翼、鼻髄質翼、円板上の網膜上方、及び円板下の網膜下方。耳縁静脈に静脈ラインを配置し、１０％フルオレセインを０．２ｍＬ注射した。フルオレセイン注射直後に連続眼底写真を撮影した。後半の写真は実験開始１０分後に撮影した。選択されたいくつかの場合では、前部セグメントの写真も撮影した。画像はＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｙｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアで処理した。
【0085】
右眼の硝子体にヒトＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦを注射すると、１０日以内に網膜新生血管が形成され、円板の充血、血管の拡張及び湾曲、並びに視神経円板、髄質翼、及び前房（ＡＣ）におけるフルオレセインの漏出を伴った。ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦの非存在下でＶＨＨ製剤のみを注射した左眼、及び処置開始時の対応する画像を対照として使用した。これらの効果の半定量的評価を、ベースライン及び血管新生促進刺激とＶＨＨを受けなかった眼と比較して各動物及び処置について表８に示す。ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦによって誘導された効果は、高い血管漏出で要約され、これは特定のＶＨＨを単回投与によって処置した動物では消失し、視神経円板又は前房では漏出を示さなかった。網膜血管は、全ての場合について対照群の動物と比較して、拡張及び湾曲が減少し、網膜毛細血管は減少した。ＶＨＨのみを投与した眼球の分析によって、注射に関連した炎症現象が観察されなかったことから、処置の無害性が示された。
【表8】
【0086】
動物Ａ１＿Ｎｂ－ＶＶ６、Ａ３＿Ｎｂ－ＶＶ６、Ａ１＿Ｎｂ－ＦＶ１、Ａ２＿Ｎｂ－ＦＶ１、Ａ３＿Ｎｂ－ＦＶ１の場合、いかなる種類の血管損傷も検出されなかった。
【0087】
（例１１）生体内分布
Ａ６７３細胞又はＡ５４９細胞の接種によって生成した腫瘍に局在するＶＨＨの能力を、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦとの結合について陰性クローンから精製したＶＨＨと比較して評価した。ヒトＡ６７３腫瘍細胞はヒトＶＥＧＦを発現し、Ａ５４９細胞はＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの両方を発現する。ポリペプチドをＩ１３１（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）で標識し、ｌｏｄｏｇｅｎ法（Ｆｒａｋｅｒ ＰＪ、Ｓｐｅｃｋ ＪＣ Ｊｒ．１９７８ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ８０：８４９－８５７）を用いて、それぞれ１．５１ＭＢｑ／５μｇ及び１．５５ＭＢｑ／５μｇの比活性を得た。放射性標識生成物を薄層クロマトグラフィーで分析し、タンパク質の取り込みを決定し、全ての場合で９２～９５％の放射活性の値が検出された。放射性標識生成物が対応する抗原（ＶＥＧＦ及びヒトｂＦＧＦ）を検出する能力は、ポリスチレンイムノチューブを組換えヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１（５μｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）又は組換えｂＦＧＦ（５μｇ／ｍＬ；ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＵＳＡ）でコーティングした系で試験した。その後、ブロッキングし、対応する特異性の放射性標識フラグメントのサンプルを、その固相で捕捉できる量に調整して添加した。インキュベート及び洗浄の後、固相は全ての場合において放射活性の８４．２％～８７．３％を結合していることが確認され、放射性標識手順はＶＨＨの生物学的活性に有意な影響を及ぼさないことが示された。
Ａ６７３細胞又はＡ５４９細胞の接種によって生成した腫瘍に局在するＶＨＨの能力を、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦとの結合について陰性クローンから精製したＶＨＨと比較して評価した。ヒトＡ６７３腫瘍細胞はヒトＶＥＧＦを発現し、Ａ５４９細胞はＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの両方を発現する。ポリペプチドをＩ１３１（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）で標識し、ｌｏｄｏｇｅｎ法（Ｆｒａｋｅｒ ＰＪ、Ｓｐｅｃｋ ＪＣ Ｊｒ．１９７８ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ８０：８４９－８５７）を用いて、それぞれ１．５１ＭＢｑ／５μｇ及び１．５５ＭＢｑ／５μｇの比活性を得た。放射性標識生成物を薄層クロマトグラフィーで分析し、タンパク質の取り込みを決定し、全ての場合で９２～９５％の放射活性の値が検出された。放射性標識生成物が対応する抗原（ＶＥＧＦ及びヒトｂＦＧＦ）を検出する能力は、ポリスチレンイムノチューブを組換えヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１（５μｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）又は組換えｂＦＧＦ（５μｇ／ｍＬ；ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＵＳＡ）でコーティングした系で試験した。その後、ブロッキングし、対応する特異性の放射性標識フラグメントのサンプルを、その固相で捕捉できる量に調整して添加した。インキュベート及び洗浄の後、固相は全ての場合において放射活性の８４．２％～８７．３％を結合していることが確認され、放射性標識手順はＶＨＨの生物学的活性に有意な影響を及ぼさないことが示された。
【0088】
生体内分布を調べるために、１２６匹のｎｕ／ｎｕマウスを用いた。この動物にＡ６７３又はＡ５４９株のヒト腫瘍細胞５×１０６個を右背側領域に皮下接種した。腫瘍が２８０±２０ｍｍ３の体積に達した時点で、各腫瘍モデルについて９匹ずつ６群に無作為化し、処置を開始した。マウスは尾静脈から当該放射性標識製剤を注射され、２４時間、４８時間、及び７２時間後に３群ずつ屠殺され、腫瘍と以下の正常組織：脾臓、肝臓、腎臓、腸、筋肉、骨髄及び血液が外科的に除去された。放射活性の蓄積は、組織１ｇあたりの注入線量に対するパーセントで表した。較正は、注入線量の標準サンプルを用いて行った。放射活性はガンマシンチレーションカウンターを用いて測定した。
【0089】
表９は、これらの組織で行われた測定から計算された腫瘍中の放射活性値：血液中の放射活性値の比を示す。この試験によって、２４時間から７２時間の間に、ＶＨＨは腫瘍組織に優先的に局在することが示され、これは非特異的Ｎｂ－Ｎｅｇには当てはまらない。Ａ６７３腫瘍ではＮｂ－Ｖ１及びＮｂ－ＶＶ６ポリペプチドのより大きな集積、Ａ５４９細胞の移植によって引き起こされる腫瘍ではＮｂ－Ｆ３及びＮｂ－ＦＦ２ポリペプチドのより大きな集積が観察され、これは、Ａ６７３におけるＶＥＧＦの高発現、及びＡ５４９におけるｂＦＧＦの高発現に対応している。二重特異性構築物は、両方の種類の腫瘍で同程度のパーセントで、単特異性の一価及び二価の変異体よりも高い割合で蓄積した。ＶＨＨ注射の４８時間後、腫瘍以外の組織では放射性標識ＶＨＨの特異的沈着は見られなかった。
【表9】
【0090】
処置動物の血清中のＶＨＨ濃度を分析した結果、１５ｍｇ／ｋｇに相当する３００μｇの単回投与の２４時間後では、Ｆｃに融合していないＶＨＨ（Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－ＦＦ２、及びＮｂ－ＦＶ１）の濃度は５μｇ／ｍＬ未満であることが示された。Ｎｂ－ＦＶ１＿Ｆｃの場合、１３２μｇ／ｍＬが検出され、ＶＨＨの全身レベルを高く維持する上で、この構築物の血漿安定性が優れていることが示された。
【0091】
（例１２）樹状細胞の成熟及びＴリンパ球の活性化に対するＶＨＨの効果
ＶＥＧＦは樹状細胞及びＴ細胞の成熟及び表現型をそれぞれ調節する（Ｂｏｕｒｈｉｓら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０２１：１２：６１６８３７）。これらの系列の細胞に対するＶＨＨの潜在的な免疫調節効果を示すために、（Ａ）２０週齢のＣ５７Ｂｌ／６動物の脾臓から、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた陰性選択プロセスから単離したＣＤ８＋細胞、及び（Ｂ）同じ動物の骨髄採取物から単離した１週齢のｍＦＬＴ３分化未熟樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。
ＶＥＧＦは樹状細胞及びＴ細胞の成熟及び表現型をそれぞれ調節する（Ｂｏｕｒｈｉｓら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０２１：１２：６１６８３７）。これらの系列の細胞に対するＶＨＨの潜在的な免疫調節効果を示すために、（Ａ）２０週齢のＣ５７Ｂｌ／６動物の脾臓から、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた陰性選択プロセスから単離したＣＤ８＋細胞、及び（Ｂ）同じ動物の骨髄採取物から単離した１週齢のｍＦＬＴ３分化未熟樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。
【0092】
ＣＤ８＋リンパ球を１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３でコーティングしたプレートに添加し、ＶＨＨの濃度を低下させながら２時間プレインキュベートし、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と共に４８時間インキュベートした。この時間後、Ｖｏｒｏｎら（Ｖｏｒｏｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１５：２１２：１３９－４８）の記載に従って細胞を標識し、その結果をＳＹＳＭＥＸフローサイトメーター（Ｇｅｒｍａｎｙ）で解析した。濃度を増加させたＶＨＨで処置した結果、表１０Ａに示すように、ＣＤ８＋細胞における老化マーカーＰＤ１の発現が全ての場合において有意に低下した（ｐ＜０．０５、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定）。
【表10A】
【0093】
ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）中のヒトＶＥＧＦとＶＨＨとの混合物を、ＶＥＧＦの最終濃度が２５ｎｇ／ｍＬ、及びＶＨＨの最終濃度が１０、５、及び１μｇ／ｍＬとなるように２時間プレインキュベートした。これらの混合物１５マイクロリットルを、９６ウェルプレートで１ウェルあたりＦＬＴ３で分化させた合計１０５個の樹状細胞に添加した。４時間のインキュベート後、５０μＬのリポ多糖（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）を添加し、最終濃度を２５０ｎｇ／ｍＬとした。１８時間後、細胞を洗浄し、抗ＣＤ８６ ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）及び抗ＭＨＣＩＩ Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－Ｖ５００（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、ＵＳＡ）で標識し、固定数の２０，０００個の細胞をフローサイトメトリー（ＳＹＳＭＥＸ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。樹状細胞の培養物に濃度を増加させながらＶＨＨを添加し、表１０Ｂに見られるように、ＶＥＧＦの存在下、リポ多糖での刺激に対するこれらの細胞の応答は、全ての場合において有意及び用量依存的に回復した（ｐ＜０．０５、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定）。
【表10B】
【0094】
（例１３）マウスの固形腫瘍の処置におけるＦｃフラグメントのあり又はなしのＮｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、Ｎｂ－Ｆ３、Ｎｂ－ＶＦ３による処置の抗腫瘍効果
抗腫瘍効果を評価するために、ＶＨＨの同位体標識の非存在下、例１１に示した試験の複製を行った。全ての場合において５匹のマウス群を用いた。動物は腫瘍チャレンジを受け、モデルの特性に従って、３日～７日後に処置を開始した。５ｍｇ／ｋｇの用量のＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、及びＮｂ－ＦＶ１を７２時間ごとに使用して２週間処置した。最初の投与から１５分後、２時間後、及び７２時間後に、生体内分布解析のために約５０μＬの血液を採取した。投与開始から２２日後、全血液サンプルを得るため、動物を致死量のケタミンで麻酔し、右心房のＰＢＳによる灌流へと進んだ。血清を分離し、モデルによって原発性腫瘍、肝臓、腎臓、及び肺の重量を別々に測定した。全ての場合において直径１０ｍｍ未満の原発性腫瘍、及び転移を有する組織を、全ての腫瘍層を含む３つの切片に分割した。それぞれの場合において、腫瘍又は転移を以下の方法で分析した：（ａ）ＣＤ３４選択的標識による血管密度を分析するための免疫組織化学、（ｂ）腫瘍組織中の白血球浸潤を定量化及び特性評価するためのフローサイトメトリー、及び（ｃ）例１に記載する通りの、ＲＩＰＡ組織溶解液及び血漿中のＶＨＨ、サイトカイン、及び増殖因子を定量化するためのＥＬＩＳＡ。
抗腫瘍効果を評価するために、ＶＨＨの同位体標識の非存在下、例１１に示した試験の複製を行った。全ての場合において５匹のマウス群を用いた。動物は腫瘍チャレンジを受け、モデルの特性に従って、３日～７日後に処置を開始した。５ｍｇ／ｋｇの用量のＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６、及びＮｂ－ＦＶ１を７２時間ごとに使用して２週間処置した。最初の投与から１５分後、２時間後、及び７２時間後に、生体内分布解析のために約５０μＬの血液を採取した。投与開始から２２日後、全血液サンプルを得るため、動物を致死量のケタミンで麻酔し、右心房のＰＢＳによる灌流へと進んだ。血清を分離し、モデルによって原発性腫瘍、肝臓、腎臓、及び肺の重量を別々に測定した。全ての場合において直径１０ｍｍ未満の原発性腫瘍、及び転移を有する組織を、全ての腫瘍層を含む３つの切片に分割した。それぞれの場合において、腫瘍又は転移を以下の方法で分析した：（ａ）ＣＤ３４選択的標識による血管密度を分析するための免疫組織化学、（ｂ）腫瘍組織中の白血球浸潤を定量化及び特性評価するためのフローサイトメトリー、及び（ｃ）例１に記載する通りの、ＲＩＰＡ組織溶解液及び血漿中のＶＨＨ、サイトカイン、及び増殖因子を定量化するためのＥＬＩＳＡ。
【0095】
ＭＣ－３８結腸癌肝転移モデル：Ｃ５７ＢＬ／６動物にＭＣ－３８マウス転移性結腸直腸癌細胞を肝内投与してチャレンジした。麻酔下で開腹手術を行い、上肝葉を露出させ、そこに２０μＬで合計１０，０００個の細胞を接種した。チャレンジの７２時間後にポリペプチドを腹腔内投与した。
【0096】
ＲＥＮＣＡ転移性腎腫瘍モデル：ＢＡＬＢ／ｃ動物に２０，０００個のＲＥＮＣＡマウス転移性腎癌細胞を投与してチャレンジした。麻酔下で開腹手術を行い、腎臓を露出させ、被膜下領域に極細針を用いて２０μＬの細胞を接種した。ポリペプチドはチャレンジの７２時間後に腹腔内投与した。
【0097】
ＣＴ２６皮下腫瘍モデル：ＢＡＬＢ／ｃ又はｎｕ／ｎｕ動物に、２０，０００個のＣＴ２６マウス結腸癌細胞を皮下投与してチャレンジした。処置は腫瘍径が７～８ｍｍに達した際に腫瘍周囲から開始した。処置は７２時間ごとに２週間行った。
【0098】
皮下Ａ６７３又はＡ５４９腫瘍モデル：Ｎｕ／ｎｕ動物に５×１０６個のヒトＡ６７３又はＡ５４９細胞を皮下投与してチャレンジした。処置は腫瘍径が７～８ｍｍに達した際に腫瘍周囲から開始した。７２時間ごとに２週間投与を行った。これらのモデルでは、特にＶＨＨ変異体Ｎｂ－ＦＶ１－ｈＦｃが同じ用量及び経路で評価された。
【0099】
ＣＴ２６肺移植モデル：ＢＡＬＢ／ｃ動物に、極細針で２０μＬ中２０，０００個のＣＴ２６細胞を後眼窩投与してチャレンジした。チャレンジの７２時間後に経鼻投与によって、１鼻孔あたり２５μＬ、総用量１５ｍｇ／ｋｇを用いて処置を開始した。
【0100】
病理組織学的解析
ＶＨＨ処置が腫瘍の血管新生及び腫瘍細胞の生存に影響を及ぼすかどうかを調べるため、腫瘍切片を、Ａｄｉｎｏｌｆｉら（Ａｄｉｎｏｌｆｉら、２０１２：２９５７－６９）によって記載されているように、ヘマトキシリン／エオジン染色及びマウス抗ＣＤ３４抗体による免疫蛍光法により分析した。結果は、１ｍｍ２あたりの血管数の関数として平均血管密度（ＭＶＤ）で表した。
ＶＨＨ処置が腫瘍の血管新生及び腫瘍細胞の生存に影響を及ぼすかどうかを調べるため、腫瘍切片を、Ａｄｉｎｏｌｆｉら（Ａｄｉｎｏｌｆｉら、２０１２：２９５７－６９）によって記載されているように、ヘマトキシリン／エオジン染色及びマウス抗ＣＤ３４抗体による免疫蛍光法により分析した。結果は、１ｍｍ２あたりの血管数の関数として平均血管密度（ＭＶＤ）で表した。
【0101】
表１１、１２、及び１３は、陰性対照に対する腫瘍増殖阻害、腫瘍血管形成の病理組織学的試験、腫瘍溶解液中の濃度、特にＶＥＧＦの濃度の結果の要約を示す。
【表11】
【表12】
【表13】
【0102】
Ｎｂ－Ｖ１を異なる投与経路（腹腔内、腫瘍周囲、及び経鼻）によって使用した後、試験した腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効果が観察された（ｐ＜０．０５ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）（表１１）。この効果は、免疫応答性動物におけるマウスＶＥＧＦの血管性及び組織レベルの低下と相関し、ヌード動物ではヒトと相関していた（ｐ＜０．０５；全ての場合についてＰｅａｒｓｏｎ検定）（表１２及び表１３）。同様の用量のＮｂ－ＶＶ６を使用した結果、Ｎｂ－Ｖ１と比較して有意に優れた効果が得られたが、これはこのＶＨＨのＶＥＧＦに対する高い親和性及びアビディティ、並びにより長い全身半減期と一致している（ｐ＜０．０５；全ての場合でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。一方、Ｎｂ－ＦＶ１の使用は、Ｎｂ－Ｖ１及びＮｂ－ＶＶ６に対して抗腫瘍効果及び抗血管新生効果の増加をもたらしたが、これは第２の分子標的が組み込まれたこと、及び血管新生事象の誘導におけるＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ及びｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ系の阻害の公知の協同性によるものであった（Ａｓａｈａｒａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９５：９２：ＩＩ３６５－７１）。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３セグメントをＮｂ－ＦＶ１に組み込んだ結果、試験された皮下腫瘍モデルにおけるＮｂ－ＦＶ１の使用に関して、抗腫瘍効果及び抗血管新生効果が増加した（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【0103】
免疫応答性動物におけるＣＴ２６皮下モデルにおける処置を免疫不全動物と比較したところ、前者の方が優れた抗腫瘍効果を示した。この事実は、抗ＶＥＧＦ及び抗ｂＦＧＦ処置について記載された免疫増強及び抗炎症効果と関連している可能性がある。以前、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－Ｆ３及びＮｂ－ＦＶ１を、Ｔ細胞及び樹状細胞の表現型解析のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系に添加すると、これらの白血球の機能性に対するＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの効果が阻害されることが示された（例１２）。
【0104】
ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍浸潤ＣＤ３＋細胞の分析から、ＶＨＨ処置はＴ細胞の免疫回復に有意に成功したことが示された（表１４Ａ）。この同じサンプルにおいて、Ｆ４／８０＋ＧＲ１－マクロファージの集団もＭ１表現型マーカー：ＭＨＣ ＩＩ（ＭＦＩとして表示）の発現の観点から分析した。その結果、各実験モデルでＮｂ－Ｎｅｇで処置した群と比較して、全ての処置でＭ１型マクロファージの機能性が上昇した（ｐ＜０．０５ Ｄｕｎｎｅｔの事後検定）（表１４Ｂ）。Ｎｂ－ＦＶ１を処置として用いた群ではより高い上昇が検出されたが、これはＩｍら（Ｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０２０：１１：１－１４）によって報告されたように、ｂＦＧＦ阻害が免疫抑制のレスキューに追加的に寄与するという事実と関連し得る要素であった。
【表14A】
【表14B】
【0105】
腫瘍周囲経路で処置したＢＡＬＢ／ｃ及びヌード動物の血清中のＶＨＨ濃度を解析した結果、ＶＨＨ Ｎｂ－Ｖ１、Ｎｂ－ＶＶ６及びＮｂ－ＦＶ１の半減期は２時間より短いことが示され、Ｎｂ－Ｖ１と比較して二価又は二重特異性のＶＨＨについては血漿中の残存濃度が有意に増加した。一方、Ｎｂ－ＦＶ１のｈＦｃ融合変異体の解析では、３日を超える血漿中の安定性が示されたため、その濃度は複数回の投与により上昇した（表１５）。
【表15】
【0106】
（例１４）ウイルスベクターによるＶＨＨの遺伝子導入のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能評価
ＡＭＤ及び癌に対する現在の治療法の臨床試験に含まれる送達戦略の１つは、治療用ポリペプチドの一時的な遺伝子導入である。この目的のために、Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ及びＮｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃに対応する配列を、既に記載したプロトコルに従った、配列番号３７及び配列番号３８のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって増幅させた。ＮｏｔＩ／ＰｍｅＩ消化後、ｐＡＡＶＫ－ＥＩＦ２－ＭＣＳベクター及びバンドの両方をライゲーションし、ＤＨ５α株に形質転換した。新しいベクター：ｐＡＡＶＫ－ＥＩＦ２－Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ及びｐＡＡＶＫ－ＥＩＦ２－Ｎｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃの配列を確認した後、これらを使用して、製造業者の指示に従って（ＧＥＮＥＭＥＤＩ、Ｃｈｉｎａ）、ＨＥＫ－２９３細胞においてＡＶＶ２系でウイルス粒子をパッケージ化した。ウイルス粒子は、Ｈｕｇｈｅｓら（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１９：１３：８６－９８）によって記載されているように、７２時間の培養によってコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から単離及び濃縮した。ｑＰＣＲによる滴定後、使用するまで－８０℃で保存した（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２：２３：１８－２８）。
ＡＭＤ及び癌に対する現在の治療法の臨床試験に含まれる送達戦略の１つは、治療用ポリペプチドの一時的な遺伝子導入である。この目的のために、Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ及びＮｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃに対応する配列を、既に記載したプロトコルに従った、配列番号３７及び配列番号３８のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって増幅させた。ＮｏｔＩ／ＰｍｅＩ消化後、ｐＡＡＶＫ－ＥＩＦ２－ＭＣＳベクター及びバンドの両方をライゲーションし、ＤＨ５α株に形質転換した。新しいベクター：ｐＡＡＶＫ－ＥＩＦ２－Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ及びｐＡＡＶＫ－ＥＩＦ２－Ｎｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃの配列を確認した後、これらを使用して、製造業者の指示に従って（ＧＥＮＥＭＥＤＩ、Ｃｈｉｎａ）、ＨＥＫ－２９３細胞においてＡＶＶ２系でウイルス粒子をパッケージ化した。ウイルス粒子は、Ｈｕｇｈｅｓら（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１９：１３：８６－９８）によって記載されているように、７２時間の培養によってコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から単離及び濃縮した。ｑＰＣＲによる滴定後、使用するまで－８０℃で保存した（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２：２３：１８－２８）。
【0107】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイで、感染性及びポリペプチドの産生に成功する能力を評価した。６ウェルプレートフォーマットでウェルあたり５×１０５個の細胞の密度でＨＥＫ－２９３細胞を播種した。２４時間後、２００ｎＭのグルタミンを添加した無血清培地１ｍＬ中の８×１０８のＵＧ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｕｎｉｔｓ）を添加した。１時間接触させた後、２０％ＦＢＳ及びグルタミンを添加した培地１ｍＬを培養物に添加した。培養上清は、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後に回収した。Ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を評価するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに８×１０８ ＵＧを筋肉内経路によって単回注射した。チャレンジの１４日後、組織中のＶＨＨ＿ｈＦｃの総量を、ＣＨＯ細胞から精製及び特性評価した各ＶＨＨ＿ｈＦｃの標準曲線を用いて、一般的方法に記載されているように、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【0108】
Ｎｂ－ＶＶ６＿ｈＦｃ及びＮｂ－ＦＶ１＿ｈＦｃポリペプチドの発現は、感染させたＨＥＫ－２９３細胞の培養上清で検出した（それぞれ１２５μｇ／ｍＬ及び２２０μｇ／ｍＬ）。筋肉組織では、処理１グラムあたり５０～１００μｇのＶＨＨ濃度が検出された。両発現フォーマットで検出された濃度は、ＡＶＶ２系に充填されたウイルス粒子について文献で報告されているそれぞれの場合の濃度と一致しており、全ての場合において、特異的抗原への結合及び受容体への結合の遮断という点でその機能性を示した。
【配列表】
【国際調査報告】