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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-15
(54)【発明の名称】小胞中の組換え生体分子の製造のための配列および方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20250107BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250107BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250107BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250107BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250107BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250107BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250107BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250107BHJP
C07K 17/04 20060101ALI20250107BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
C12N15/12
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K17/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536402
(86)(22)【出願日】2022-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-08-19
(86)【国際出願番号】 GB2022053239
(87)【国際公開番号】W WO2023111569
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】2118435.3
(32)【優先日】2021-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510303811
【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ケント
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＫＥＮＴ
(71)【出願人】
【識別番号】508236033
【氏名又は名称】フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ ・ユーケイ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100105924
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 賢樹
(72)【発明者】
【氏名】マルビヒル、ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ベイカー、カレン
(72)【発明者】
【氏名】イーストウッド、タラ
(72)【発明者】
【氏名】レノン、クリストファー
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC15
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA05
4H045BA10
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045BA41
4H045BA61
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
生体分子を発現させる方法、および生体分子を発現させるための組換え発現系の構成部分が記載されている。特に、シヌクレインアイソフォームおよびそれらの変異体のアミノ末端に由来する両親媒性αヘリックスポリペプチドを含む単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）は、生体分子の精製を可能にするために、発現系における小胞の形成を促進、増強または増加させるために使用される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シヌクレインアイソフォームおよびそれらの変異体のアミノ末端に由来する両親媒性αヘリックスポリペプチドを含む単離した小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）。
【請求項2】
９～１４０アミノ酸、好ましくは１６～４０アミノ酸、より好ましくは約２０アミノ酸を有する請求項１に記載の単離した小胞核形成ポリペプチド。
【請求項3】
前記配列が配列番号２～２８のいずれか１つである請求項１または２に記載の単離した小胞核形成ポリペプチド。
【請求項4】
アミノ末端でアセチル化されている請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド。
【請求項5】
ロイシンジッパー配列をさらに含む請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド。
【請求項6】
前記ロイシンジッパー配列が配列番号２９の配列を有する請求項５に記載の単離した小胞核形成ポリペプチド。
【請求項7】
前記ロイシンジッパー配列が前記単離された小胞核形成ポリペプチドのカルボキシル末端にある請求項５または６に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド。
【請求項8】
プロテアーゼ切断部位をさらに含む請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド。
【請求項9】
生体分子のアミノ末端に融合した請求項１～８のいずれか１項に記載の小胞核形成ポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項10】
前記小胞核形成ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介して前記生体分子のアミノ末端に融合している請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記プロテアーゼ切断部位がウイルスプロテアーゼまたはウイルス３Ｃ様プロテアーゼのためのものである請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記プロテアーゼ切断部位が無傷のものである請求項１０または請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記プロテアーゼ切断部位が、１つ以上の膜結合または細胞質プロテアーゼに特異的である請求項１０～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記生体分子が、前記融合タンパク質を発現する発現系にて検出可能なレベルに構成的に発現していない請求項９～１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記生体分子が、膜結合タンパク質、不溶なタンパク質、または前記融合タンパク質を発現する宿主細胞に対して通常毒性があるタンパク質である請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記生体分子のサイズが、１ｋＤａ未満から１００ｋＤａの範囲内である請求項９～１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
請求項９～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列またはベクター。
【請求項18】
請求項９～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現するか、または請求項１７に記載のヌクレオチド配列またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項19】
原核生物細胞、単細胞の真核生物または培養した真核細胞株である請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
大腸菌である請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項21】
ＶＮｐ－ロイシンジッパーペプチドをさらに発現する請求項１８～２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項22】
１つ以上のＶＮｐ標識プロテアーゼをさらに発現する請求項１５～２１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項23】
組換え発現系において小胞の形成を促進、増強または増加させる方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）、請求項９～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１７に記載のヌクレオチド配列もしくはベクターを含むポリペプチドを宿主細胞で発現させることを含む方法。
【請求項24】
細胞発現系から生体分子の少なくとも１つの可溶性および／または機能的形態を製造する方法であって、前記生体分子が前記細胞発現系の宿主細胞において構成的に発現されず、宿主細胞において請求項１～１７のいずれか１項に記載の小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）、融合タンパク質、またはヌクレオチド配列もしくはベクターを発現させることを含む、細胞発現系から生体分子の少なくとも１つの可溶性および／または機能的形態の製造方法。
【請求項25】
宿主細胞が、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の宿主細胞である請求項２３または２４に記載の製造方法。
【請求項26】
前記小胞核形成ポリペプチド、前記融合タンパク質、または前記ヌクレオチド配列もしくは前記ベクターが、前記宿主細胞から前記細胞発現系の培地への小胞の放出を促進、増強または増加させる請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記宿主細胞を２０℃～４０℃で培養することを含む請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記宿主細胞を好気条件または嫌気条件下で培養することを含む請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
組換え発現系の宿主細胞内に前記小胞を保存することをさらに含む請求項２３～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
保存前に細胞培養物から前記小胞を単離するか、または精製することをさらに含む請求項２３～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記小胞を約４℃で保存する請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記小胞を少なくとも４ヶ月まで保存する請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記融合タンパク質を放出すること、および任意に、前記融合タンパク質をさらに精製することをさらに含む請求項２３～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記小胞から前記生体分子を放出すること、および任意に、前記生体分子をさらに精製することをさらに含む請求項２３～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
膜結合した小胞のカーゴとして、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）と組み合わせて生体分子を共発現および排出する方法。
【請求項36】
前記生体分子が組換えタンパク質である請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
組換え発現系の一部として宿主細胞中で発現され、任意に宿主細胞から放出される１つ以上の生体分子の製造方法であって、前記組換え発現系が、請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド、融合タンパク質、ヌクレオチド配列または宿主細胞を含む生体分子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞発現系における生体分子の生産を増強する技術に関する。特に、遺伝子操作された細胞から組換えタンパク質を誘導細胞外小胞に排出するシステムが記載されている。
【背景技術】
【0002】
大腸菌は、学術的にも工業的にも組換えタンパク質生産のための魅力的なシステムである。（Ｊａｎ，Ａ．Ｔ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，７６９２－１１；Ｇｅｒｒｉｔｚｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３５，５６５－５７４）。大腸菌は安価で簡単に高密度まで大量培養できるだけでなく、機能性タンパク質の生産を容易にするために、さまざまな菌株、試薬、プロモーター、ツールが開発されてきた。合成生物学的戦略の応用は、翻訳後修飾や複雑なタンパク質の正しい折り畳みの適用に一般的に伴う制限を克服しつつある。（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４０，９７－１０４）。すべての発現系について、タンパク質の収量を向上させ、タンパク質の精製効率を改善する必要性が常にある。
【0003】
グラム陰性菌は、細胞外とのコミュニケーションや相互作用（クオラムセンシングなど）を促進するために、外膜小胞（ＯＭＶ）を産生する。ＯＭＶは外膜から放出される小さな球状の脂質二重膜（直径－１００ｎｍ）である。詳細な質量分析とクロマトグラフィー分析により、天然のＯＭＶの組成が明らかにされ、細胞の細胞壁、ペリプラスムまたは細胞質領域からＤＮＡ／ＲＮＡ、タンパク質またはその他の分子を含むことが示された（Ｊａｎ，Ａ．Ｔ．ｓｕｐｒａ）。天然のＯＭＶは、その表面に宿主細胞との融合能力を高めるタンパク質が豊富にあり、薬剤やワクチンの送達用途に魅力的な容器となっている（Ｇｅｒｒｉｔｚｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ）。ＯＭＶは、哺乳類やグラム陽性菌のエクソソームや細胞外小胞に相当する（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ）。ＯＭＶは、膨圧、温度、または局所的なタンパク質の濃縮相互作用によって引き起こされる外膜の局所的な湾曲によってもたらされる外膜の非対称脂質二重層（ＯＭ；Ｋｏｎｏｖａｌｏｖａ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１，５３９－５５６）とペプチドグリカン（ＰＧ）層との相互作用が局所的に失われることから生じる（Ｊａｎ，Ａ．Ｔ．ｓｕｐｒａ；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ）。ＯＭＶは細菌の増殖サイクルの中で自然に低収量で生産されるが、定常期にはわずかに増加する。天然のＯＭＶにタンパク質を直接パッケージングすることは可能である。しかしながら、ＯＭＶの存在量が少ないため、これまで比較的低いタンパク質収量しか観察されていない（Ａｌｖｅｓ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（２０１５）ＡＣＳ ＡｐｐＬ Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ７，２４９６３－２４９７２）。大規模な欠失および過剰発現スクリーニングにより、外膜自体の組成を変化させ、膜タンパク質の収量を向上させ、ＯＭＶの生産を調節することが可能であることが明らかになった。（ＭｃＢｒｏｏｍ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８８，５３８５－５３９２；Ｍｉｒｏｕｘ，Ｂ．＆ Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６０，２８９－２９８；Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ ２９，７６－８４）。興味深いことに、大腸菌細胞でカベオリン－１を発現させると、各細胞の細胞質内に小さな円形の小胞（直径４０－５０ｎｍ）が蓄積し、これは細胞内膜の内方への出芽によって形成された可能性が高い。
【0004】
特定の分子を個別の膜小胞にパッケージングするように細胞を再プログラムする能力は、合成生物学の主要な目標である。この制御された膜小胞へのパッケージングにより、生物学者はバイオテクノロジーと医療産業の両方に応用可能な多くの新技術を生み出すことができる。これには、エネルギー生産のための細胞内における新しい代謝工場の生成や、毒性のあるタンパク質を、正常な代謝活動に害を及ぼす前に速やかに封じ込めた環境にパッケージングし、その後の医薬品用途に使用するために精製できるようにすること、単離が困難な生体分子を封じ込めた保護パッケージを作製し、安定した環境で保存・精製できるようにすること、さらには、患者に薬やワクチンを送達するためのシンプルな媒体を作製することなどが含まれる。
【発明の概要】
【0005】
このような背景から、本発明が考案された。
【0006】
したがって、本発明は、活性培養物から連続的に単離することができる細胞培地中へのタンパク質のような特定の膜パッケージ化生体分子の標的化放出のための単純な機構を提供するポリペプチド配列および方法を包含する。この結果、培養物からのタンパク質などの機能的可溶性分子の収量が著しく増加し、広範なバイオテクノロジー応用のための効率的な下流プロセシングが容易になる。
【0007】
特に、本発明は、シヌクレインアイソフォームおよびその変異体のアミノ末端に由来する両親媒性αヘリックスポリペプチドを含む単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）に関する。別の方法で表現すると、本発明は、シヌクレインアイソフォームのアミノ末端に基づく短い両親媒性αヘリックスポリペプチドの変異体およびその設計された変異体にある。
【0008】
シヌクレインファミリーには、α－シヌクレイン、β－シヌクレイン、γ－シヌクレインの３つのタンパク質がある。すべてのシヌクレインは、交換可能なアポリポタンパク質のクラスＡ２脂質結合ドメインに類似した、高度に保存されたαヘリカル脂質結合モチーフを共通して持っている。
完全長の内在性Ｈｓα－シヌクレインは以下の配列を持つ（ＧｅｎＢａｎｋ配列：ＡＡＬ１５４４３．１）：
完全長の内在性Ｈｓα－シヌクレインは以下の配列を持つ（ＧｅｎＢａｎｋ配列：ＡＡＬ１５４４３．１）：
【化1】
【0009】
ＶＮｐは９～１４０個のアミノ酸、例えば１５～１４０個のアミノ酸、好ましくは１６～４０個のアミノ酸、より好ましくは約２０個のアミノ酸または約３８個のアミノ酸を有し得る。
【0010】
例えば、Ｈｓ α－シヌクレインのアミノ末端は以下の配列を有する。
Ｈｓ β－シヌクレインのアミノ末端は以下の配列を有する。
Ｈｓ γ－シヌクレインのアミノ末端は以下の配列を有する。
【化2】
【化3】
【化4】
【0011】
アミノ末端配列の変異は、膜界面の１つ以上の塩基性リジン残基を酸性残基または中性残基に変更することを含み得る。このような変更は膜との相互作用を安定化させる。このような配列の例は以下の通りであり、野生型タンパク質配列との違いは太字および下線を引いてある。
【化5】
【0012】
変異および変化はデザインされたものであってもよいが、配列変異には、例えば、培地中の特定のタンパク質またはマーカーの排出を増加させる変異を特異的に探すことによって、ランダムな変異誘発スクリーニングで生じた変異および変化が含まれ得る。
【0013】
本方法を用いて同定した変異体の例としては、以下の配列が挙げられる。
【化6】
【0014】
他の適した変異体の例は、変異配列の一つをとり、以下の配列等の更なる変異を加えたものである。
【化7】
【0015】
適したより短い変異体の例としては、以下の配列が挙げられる。
【化8】
【0016】
本発明は、記載された範囲内の任意の残基数を包含することが理解される。例えば、配列は具体的には２０、２１、２４、２８、３３または３８アミノ酸残基を有することができる。
【0017】
代替として、またはそれに加えて、アミノ末端配列は、（ａ）ヘリックス末端の安定性を変えるための、および／または（ｂ）アミノ末端のアセチル化を防ぐための修飾および／または変異を含み得る。後者の変異は、真核生物（特に哺乳動物）の発現系において特に有益であり得る。なぜなら、これらの細胞では、ノックアウト細胞株を作製することなくアミノ末端のアセチル化を防ぐことは多くの場合不可能だからである。大腸菌を用いる実施形態において、所望であれば、標的タンパク質のアミノ末端アセチル化は、Ｅａｓｔｗｏｏｄ Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５９１，８３３－４４；Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．５，ｅ１５８０１に記載されているように、多くの真核生物タンパク質の構造と機能に有益な影響を与える可能性のあるこの翻訳後修飾を誘導するためにＭｕｌｖｉｈｉｌｌ ｌａｂにおいて開発された誘導性組換えシステムを用いてもたらされ得る。
【0018】
代替として、またはそれに加えて、配列は、１つ以上の合成アミノ酸を含み得る。
【0019】
任意選択的に、ポリペプチドはそのアミノ末端でアセチル化されていてもよい。この特徴は、宿主細胞の細胞質への小胞構造の迅速な形成と内在化を促進し、それによって細胞質から毒性および／または不溶性タンパク質を隔離する。
【0020】
ＶＮｐはロイシンジッパー配列をさらに含み得る。好ましくは、ロイシンジッパー配列はポリペプチドのカルボキシル末端にある。二量体化するロイシンジッパー配列の付加は、一部の実施形態では、例えば、発現が困難な（例えば毒性または不溶性）タンパク質の排出および／または発現を促進する。適したロイシンジッパー配列の例は以下の通りである。
【化9】
【0021】
本発明はまた、組換えタンパク質のような生体分子のアミノ末端に融合した、上記の小胞核形成ポリペプチドを含む融合タンパク質にある。小胞核形成ポリペプチドと単一の生体分子とを有する融合タンパク質が本明細書で例示されるが、本発明は、例えばタンデム融合体（１つ以上の標的タンパク質とともに蛍光タンパク質を有するものなど）、または別個のＶＮｐ－タンパク質の複合体の排出（小胞における二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ蛍光）によって示される）、またはロイシンジッパー二量体化タンパク質による、小胞を介した複数のタンパク質の排出を包含する。誤解を避けるために、ＢｉＦＣ蛍光は、ｉ）蛍光タンパク質の前半分をＶＮｐに融合し、ｉｉ）蛍光タンパク質のカルボキシル半分をＶＮｐに融合し、ｉｉｉ）２つの融合体を一緒に発現させることによって得られる。蛍光タンパク質の２つの半分を一緒にすると、蛍光を発する。小胞に蛍光が見られる場合、小胞は両方の個別のタンパク質を含んでいると結論づけることができる。
【0022】
多くの実施形態において、小胞核形成ポリペプチドは生体分子に直接融合していてもよい。ＶＮｐは宿主細胞膜と相互作用して、細胞外膜に由来し、ＶＮｐ配列に融合した生体分子を含む小胞構造の形成を促進する。特定の好ましい実施形態では、ＶＮｐはプロテアーゼ切断部位を介して生体分子に融合され得る。プロテアーゼ切断部位としては、Ｔｅｖ（タバコエッチウイルス）等のエッチウイルスプロテアーゼ、ヒトライノウイルスＨＲＶ３Ｃなどのウイルス３Ｃ様プロテアーゼなどのウイルスプロテアーゼ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子およびトロンビンのための部位が挙げられる。多くの好ましい実施態様において、プロテアーゼ切断部位は、認識部位を全て除去した無傷のものであってもよい。このような切断部位の例としては、大腸菌ＬｅｐＢのようなシグナルペプチダーゼ、および特に、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬｉｃＰのような国際公開第２０１５／１７５５７６号公報に開示されたランチペプチダーゼ（ｌａｎｔｈｐｅｐｔｉｄａｓｅ）が挙げられる。また、真核生物のシグナルペプチダーゼ、あるいはＰｉｃｈｉａ Ｋｅｘ２またはＳｔｅ１３のようなさらなるプロセシング酵素を用いることもできる。膜結合型、好ましくは細胞質型プロテアーゼの切断部位を採用してもよい。多くの実施形態において、プロテアーゼ認識部位は５個または６個のアミノ酸の配列を含む。そのように整えることによって、小胞内でのタンパク質分解切断および生体分子のプロセシングが可能になる。
【0023】
一部の実施形態では、ロイシンジッパー配列を含む追加のＶＮｐは、生体分子のアミノ末端に融合したロイシンジッパー配列を含む小胞核形成ポリペプチドを含む融合タンパク質と共発現させてもよい。追加のＶＮｐは、生体分子のアミノ末端に融合した小胞核形成ポリペプチドと同じベクターから発現させてもよいし、追加のＶＮｐを異なるベクター、例えばプラスミドまたはエピソームから発現させてもよいし、染色体上で発現させてもよい。
【0024】
更なる実施形態では、ロイシンジッパー配列を含む小胞核形成ポリペプチドは、上記のプロテアーゼ切断部位に対応するように選択されたプロテアーゼのアミノ末端に融合されていてもよい。このＶＮｐは、生体分子のアミノ末端に融合した小胞核形成ポリペプチドと同じベクターから発現させてもよいし、異なるベクター、例えばプラスミドやエピソームから発現させてもよいし、染色体上で発現させてもよい。プロテアーゼは、その活性および選択された宿主細胞で発現される能力について選択されることが認識される。
【0025】
本発明に採用され得る生物分子としては、例えば、糖などの炭水化物、抗原、核酸、特に組み換えポリペプチドが挙げられる。
【0026】
ポリペプチド、特に組み換えポリペプチドとしては、治療タンパク質およびペプチドが挙げられる。治療タンパク質およびペプチドとしては、サイトカイン、増殖因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、加水分解酵素、転写因子および融合ポリペプチドが挙げられる。
【0027】
抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および生物活性を有する抗体断片が挙げられ、これらのいずれの多価および／または多重特異性形態も挙げられる。
【0028】
天然に存在する抗体は、典型的には、ジスルフィド結合で相互に連結された、４つのポリペプチド鎖と、２つの同一の重（Ｈ）鎖と、２つの同一の軽（Ｌ）鎖とを含む。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）と定常領域（ＣＨ）とを含み、ＣＨ領域は、その天然形態では３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）と、１つのドメインを含む定常領域とを含む、ＣＬを含む。
【0029】
ＶＨおよびＶ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が点在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、に分けられる。各ＶＨおよび各ＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。
【0030】
発現され得る抗体断片は、無傷の抗体の一部を含み、この部分は望ましい生物活性を有する。抗体断片は、一般に、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶｎおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ'フラグメントなどのＦａｂ誘導体であって、２つのＦａｂ誘導体間のジスルフィド架橋により二価フラグメントを形成し得るＦａｂ誘導体；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ誘導体などのＦｄ誘導体；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＬおよびＶＨドメインが共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体などの一本鎖抗体分子；（ｖｉｉ）定常領域ドメインを有するかまたは有さない別の可変ドメイン（ＶＨまたはＶドメインポリペプチド）に連結された定常領域ドメインを有さないＶＨまたはＶドメインポリペプチド（例えば、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、またはＶＬ－ＶＬ）（ｖｉｉｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるフラグメントなどのドメイン抗体フラグメント、および単離されたＣＤＲ領域などのＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかの抗原結合フラグメント；（ｉｘ）同じポリペプチド鎖中に２つの抗原結合部位、例えば軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、いわゆる「ダイアボディ」；並びに（ｘ）一対のタンデムＦｄセグメントを含み、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する、いわゆる直鎖抗体が挙げられる。
【0031】
好ましくは、生体分子または組換えタンパク質は、本発明の融合タンパク質が発現される発現系において、有意に検出可能なレベルまで構成的に発現されない。例えば、組換えタンパク質は、膜結合タンパク質、不溶性タンパク質、または融合タンパク質が発現される宿主細胞に対して通常毒性のタンパク質であり得る。多くの実施形態において、生体分子または組換えタンパク質は、宿主細胞に対して異種である。
【0032】
生体分子は、サイズによって限定される必要はないが、１ｋＤａ未満から１００ｋＤａまでの範囲内であり得る。組換えタンパク質の例としては、アキリンリピートタンパク質ｏｆｆ７（ＤＡＲＰ）、ステフィンＡ、ウリカーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、エタネルセプト、ＦＧＦ２１、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＤＮＡｓｅＩ、およびナノボディが挙げられる。排出される生体分子の大きさは、最終的には宿主細胞が産生できる小胞の大きさに依存する。一般に、直径０．１６～０．４μｍの小胞サイズが最も可能性が高く、最適な排出に適していると考えられている。
【0033】
本発明はまた、本明細書において上記の融合タンパク質をコードするヌクレオチドまたはベクター（プラスミド）配列、特に発現カセットにある。適切なプラスミドとしては、ｐＵＣ１９およびｐＢＲ３２２に基づく系統のプラスミド、ならびに国際公開第２００７／０８８３７１号公報に記載のプラスミドなどのプラスミドが挙げられる。上記の融合タンパク質は、同じベクターから発現されてもよいし、異なるベクター、例えばプラスミドまたはエピソームから発現されてもよいし、染色体発現されてもよいことが理解される。
【0034】
ヌクレオチドまたはベクター配列は好ましくはプロモーターを用い、そのようなプロモーターの例は当技術分野で周知である。プロモーターは、宿主細胞ポリメラーゼプロモーターまたは異種ポリメラーゼ依存性プロモーター、例えばファージポリメラーゼ依存性プロモーターを含み得る。適切なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ｈＥＦ１、ラムノース、アラビノース、λｐＬ、Ｔ７Ａ３、ＴａｃおよびＴ７ベースのプロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、ヌクレオチドまたはベクターは、大腸菌ポリメラーゼ依存性プロモーター、特に誘導性プロモーター、例えば、完全回文ｌａｃオペレーター配列を含むｌａｃオペレーターなどの１つ以上のオペレーターを含むプロモーターを含む。多くの好ましい実施形態において、ヌクレオチドまたはベクターは、１つの完全回文ｌａｃオペレーター配列に作動可能に連結されたλｐＬプロモーター、または２つの完全回文ｌａｃオペレーター配列に作動可能に連結されたＴ７Ａ３プロモーターを含み、１つのオペレーター配列はプロモーターの上流に位置し、１つはプロモーターの下流に位置する。最も好ましくは、オペレーターは転写開始点に重なる。
【0035】
任意選択的に、ヌクレオチドまたはプラスミド配列は、配列番号２９に示されるものなどのロイシンジッパー配列をさらに含む。
【0036】
本発明はまた、融合タンパク質を発現するか、または本明細書に記載のヌクレオチド配列もしくはプラスミドを含む宿主細胞にもある。宿主細胞は、細菌のような原核細胞、酵母のような単細胞真核生物、または培養真核細胞株であり得る。原核生物宿主細胞の特定の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株、バチルス株（サブチルス（ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）およびメガテリウム（ｍｅｇａｔａｒｉｕｍ）を含む）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｃｈｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）が挙げられる。好適な大腸菌株としては、ＢＬ２１ＤＥ３株、Ｋ１２株、その他（ＤＨ１０ｂ株、ＪＭ１０９株など）が挙げられる。原核細胞の具体例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、シュワネラ菌、セラチア菌、緑膿菌などのグラム陰性細菌細胞、枯草菌、メガタリウム菌などのグラム陽性細菌細胞が挙げられる。適切な培養真核細胞株の例としては、ＨＥＫ細胞株およびＣＨＯ細胞株が挙げられる。好ましい宿主細胞は細菌、特に腸内細菌、好ましくは大腸菌、特にそのＢ株またはＫ１２株である。特定の実施形態において、原核細胞は、少なくとも１つの天然プロテアーゼが欠損するように操作される。多くの好ましい実施形態において、原核宿主細胞はｏｍｐＴ－大腸菌株、特にＷ３１１０大腸菌株である。
【0037】
任意に、宿主細胞は、ＶＮｐ－ロイシンジッパーペプチド、または本明細書に記載のＶＮｐポリペプチドと本明細書に記載のものなどのロイシンジッパー配列とを含むペプチドをさらに発現する。この追加のペプチドは、配列番号２～２８のいずれか１つに記載される配列を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、または有することができることが理解される。あるいは、宿主細胞は、本明細書に記載のＶＮｐ－ロイシンジッパーペプチドを発現するヌクレオチド配列、または配列番号２９に記載の配列を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【0038】
一実施形態では、宿主細胞は、本発明の、本明細書に記載されるＶＮｐタグ化標的タンパク質（ＶＮｐタグ化融合タンパク質）に加えて、１つ以上のＶＮｐタグ化プロテアーゼを代替的または追加的に共発現する。このようにして、ＶＮｐからの標的タンパク質のタンパク質分解切断が小胞内で得られる。共発現したプロテアーゼは、融合タンパク質に含まれるその特定のプロテアーゼ切断部位との使用に適するように選択されることが理解される。選択されたプロテアーゼがプロテアーゼ認識部位の一部を標的タンパク質に付着させたままにする場合には、標的タンパク質のさらなるプロセシングがさらに必要となり得る。
【0039】
本発明はまた、組換え発現系の一部として宿主細胞内での小胞形成を促進、増強または増加させるための、本明細書に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）融合タンパク質またはヌクレオチド配列の使用を包含する。
【0040】
別の方法で表現すると、本発明はまた、単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）、融合タンパク質または本明細書に記載のヌクレオチド配列を含むポリペプチドを宿主細胞で発現させることによって、組換え発現系において小胞の形成を促進、増強または増加させる方法にもある。
【0041】
本発明はまた、細胞発現系から可溶性で機能的な生体分子を産生するための、本明細書に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）、融合タンパク質、ヌクレオチド配列または宿主細胞の使用を包含し、ここで生体分子は発現系の宿主細胞において構成的に発現されない。
【0042】
本発明はまた、細胞発現系からの可溶性で機能的な生体分子の収量を増強または増加させるための、本明細書に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）、融合タンパク質、ヌクレオチド配列または宿主細胞の使用を包含し、ここで生体分子は発現系の宿主細胞において構成的に発現される。
【0043】
「機能的」は、分子が生物学的に活性を持つように折り畳まれた生体分子を意味する。このような折り畳みは、分子が本質的な生物活性を有していれば、必ずしも天然の分子と同じでなくてもよいし、同じ程度でなくてもよい。
【0044】
さらなる態様で表現すると、本発明は、細胞発現系からの生体分子の可溶形態および機能的形態の（全体的な）収量を増強する方法であって、生体分子が発現系の宿主細胞において構成的に発現されず、宿主細胞において本明細書に記載の本発明のＶＮｐ、融合タンパク質またはヌクレオチド配列を発現することを含む方法にある。
【0045】
一実施形態では、ポリペプチド、融合タンパク質またはヌクレオチド配列は、宿主細胞から発現系の培養培地への小胞の放出を促進、増強または増加させる。
【0046】
好ましくは、該方法は、ヌクレオチド配列によって発現されるポリペプチド、融合タンパク質または生成物を培養培地から分離するステップをさらに含む。
【0047】
宿主細胞は、本明細書に記載の宿主細胞であり得る。
【0048】
宿主細胞内での小胞形成は、ポリペプチドのアミノ末端におけるＶＮｐのアセチル化によって、さらに可能になり、促進され、あるいは増強される。
【0049】
組換え発現系の一部として、宿主細胞における小胞形成を促進、増強または増加させるために、単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）または本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ末端アセチル化を使用することも企図されており、アセチル化は任意にまたはさらに、宿主細胞から培養（増殖）培地への小胞の放出を促進する。
【0050】
本発明の方法および使用は、本明細書に記載のＶＮｐ－ロイシンジッパーポリペプチドの追加発現をさらに含み得る。ＶＮｐと生体分子との間の二量体化ロイシンジッパー配列の付加、ならびにＶＮｐ－ロイシンジッパーポリペプチドの任意のさらなる追加発現は、そうでなければ発現が困難な（例えば、毒性または不溶性の）生体分子の発現を増強する。
【0051】
好ましくは、宿主細胞は、２０℃～４０℃、例えば２５℃～３７℃で、理想的には好気性条件下で培養される。
【0052】
さらに、本明細書に記載の方法および使用は、組換え発現系の宿主細胞内または宿主細胞から分離した小胞を保存するステップをさらに含んでもよい。約４℃での保存が適切であると考えられる。保存は、少なくとも６ヶ月まで可能である。
【0053】
本発明の方法および使用は、生体分子を精製するステップをさらに含んでもよい。このようにして、小胞に封入された生体分子は、さらなる処理または使用のために放出および精製され得る。脂質小胞のような膜結合構造物から生体分子を放出および精製する方法は、当該技術分野において周知であり、標準的である。適切であると試験され確認された方法（これらに限定されるものではない）には、超音波処理（小胞内容物への影響が最小であるため、最も単純で最も魅力的である）、洗浄剤による処理、または浸透圧衝撃が含まれる。あるいは、生物学的精製には、小胞から放出される前に小胞内のＶＮｐから生体分子を切断すること、および必要とされ得る追加の精製が含まれる。一実施形態では、小胞内切断は、理想的にはＶＮｐタグ付き標的タンパク質と共発現したＶＮｐタグ付きプロテアーゼである適切なプロテアーゼによって行われる。
【0054】
本発明はまた、炭水化物、抗原、核酸または組換えタンパク質などの生体分子を、本明細書に記載の単離された小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）と組み合わせて、膜結合小胞中のカーゴとして共発現および排出することを包含する。その際、小胞形成はＶＮｐによって促進または増強されることが理解される。
【0055】
本発明はまた、宿主細胞中で発現され、任意に宿主細胞から放出される１つ以上の生体分子の産生のための、大腸菌などの組換え発現系の使用を企図し、ここで、発現系は、本明細書に記載の、単離された小胞核形成ポリペプチド、融合タンパク質、ヌクレオチド配列または宿主細胞を含む。
【0056】
特に、カーゴの細胞内発現、例えば大腸菌のような原核生物宿主で発現された組換えポリペプチドの多くの例が不溶形態で産生される場合に、本発明は可溶形態のカーゴの細胞からの排出を可能にする。
【0057】
以下の非限定的な実施例および図を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1-1】組換え小胞の形成を示す図である。図１ａはＯｍｐＡ－ＧＦＰＳＩＭ蛍光を示す。図１ｂおよび図１ｃは大腸菌におけるＶＮｐ誘導膜湾曲のネガティブ染色ＥＭ連続切片像を示す。図１ｄは、小胞を生成するグリッド上で培養した大腸菌細胞のＥＭを示す。図１ｅは、ＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ ＯｍｐＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現大腸菌細胞のｍＣｈｅｒｒｙ（マゼンタ）と－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（緑）のＳＩＭ蛍光を示す。図１ｆは、ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎが誘導した小胞を伴う大腸菌の連続切片の抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ免疫ＥＭ像を示す。図１ｇは、単離されたＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ含有小胞のＥＭ像を示す。図１ｈは、単離されたＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ含有小胞の蛍光像を示す。図１ｉは、ＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ発現細胞の細胞培養液および濾過培地のクマシー染色ゲルを示す。図１ｊは、ＶＮｐ誘導カーゴ含有小胞の模式図を示す。図１ｋは、ＶＮｐ２－ＤＡＲＰ、ＶＮｐ２－ウリカーゼおよびＶＮｐ２－ステフィンＡ発現細胞の非誘導培養および誘導培養、またはフィルター誘導培養のクマシー染色サンプルを示す。
【図1-2】図１ｌは、細胞抽出物（白抜き）および培地（塗りつぶし）から得られた標的タンパク質の非標識ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ標識融合体の培養１リットルあたりの平均収量を示す。図１ｍは、細胞抽出物（白抜き）と培地（塗りつぶし）から得られた標的タンパク質のＣ末端ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ標識融合体を示す。誤差は３回以上の実験的反復からのｓ.ｄ.である。
【図2】組換え小胞内でのＶＮｐ融合体の濃縮を示す図である。図２Ａは、０．１μｍフィルターで濃縮したＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ発現細胞（左上）の一晩培養の遠心培地を含むユニバーサル（右上）と、それに関連したｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ含有小胞の広視野蛍光画像である。図２Ｂは、ＢＳＡ定量コントロールと、独立した生物学的反復から得られたＶＮｐ融合誘導培養からの遠心培地画分８μｌのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。これらのサンプルはその後、トリプシン消化およびプロテオーム解析を行った。図２Ｃは、プロテオーム解析から決定されたＶＮｐｆｕｓｉｏｎ含有小胞の典型的な組成を示す円グラフである。
【図3】異なる大腸菌株とプロモーターを用いたＶＮｐ誘導組換えタンパク質パッケージ化小胞を示し、Ｔ７プロモーター（図３ａ、図３ｂ、図３ｃ）またはラムノースプロモーター（図３ｄ）からＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する、（図３ａ）Ｋ１２、（図３ｂ）λ ＤＥ３ Ｗ３１１０、（図３ｃ）ＪＭ１０９、（図３ｄ）ＢＬ２１ ＤＥ３の大腸菌株の広視野蛍光像である。
【図4】ＶＮｐタグは、大腸菌からのヘテロ二量体可溶性機能性抗体の発現と単離を可能にすることを示す図である。図４Ａ～Ｄは、大腸菌からのＶＮｐ－ｆＡｂ精製を示す。図４Ａは、ｆＡｂ Ｈｃ／Ｌｃヘテロ二量体形成の検出を可能にする二分子蛍光補完ＶＮｐ－ｆＡｂ融合体を示す。図４Ｂは、染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図４Ｃは、ＶＮｐ－Ｈｃ７ＶＮｐ－Ｌｃ＊＊発現、ニッケルアフィニティー精製およびプロテインＧ結合からのサンプルの抗Ｈｉｓウェスタンブロット（ＨＩＳ６タグ付きＬｃを認識する）を示す。図４Ｄは、細胞溶解物、ニッケル溶出物、およびその後のプロテインＧ結合画分からのＶＮｐ－Ｈｃ／Ｌｃヘテロダイマー依存ＢｉＦＣ蛍光を示す。図４Ｅ～Ｆは、ＶＮｐ－ｍＡｂの発現と大腸菌からの精製を示す。図４Ｅは、ＶＮｐ－ｍＡＢ－Ｈｃ／ＶＮｐ－ｍＡＢ－Ｌｃ発現、ニッケルアフィニティー精製、プロテインＡ結合からのサンプルの染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥと図４Ｆは、抗Ｈｉｓウェスタンブロット（ＨＩＳ６タグ付きＨｅを認識）を示す。
【図5】ＶＮｐは小胞を標的とした組換えタンパク質のタンパク質分解を可能にすることを示す図である。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ－ＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７融合体を単独で、あるいはＶＮｐ－マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－ＴＥＶプロテアーゼ融合体と組み合わせて発現させるコンストラクトを含む大腸菌細胞を培養し、一晩フラスコ培養で発現を誘導した。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ－ＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７融合体は、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎとＤＡＲＰｉｎ配列の間にＴＥＶ切断部位を含んでいた。ＶＮｐ－ｍＮＧ－ＤＡＲＰの単独発現は、全長タンパク質（５０．８ｋＤａサイズ）の発現と小胞排出をもたらした。これに対して、同じタンパク質をＴＥＶプロテアーゼ融合体と共発現させると、ＶＮｐ－ｍＮＧ－ＤＡＲＰはＴＥＶ部位で切断され、ＶＮｐ－ｍＮＧ（３２ｋＤａ）とＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７（１８．８ｋＤａ）の断片が培養液中の排出された小胞内へ排出された。予想されるタンパク質のサイズは、ＶＮｐ－ＭＢＰ－ＴＥＶが７５．４ｋＤａ、ＶＮｐ－ｍＮｇ－ＤＡＲＰが５０．８ｋＤａ、ＶＮｐ－ｍＮＧが３２ｋＤａ、ＤＡＲＰが１８．８ｋＤａである。
【図6-1】ＶＮｐ二量体融合体は細胞膜パッケージを含む融合体を生成することを示す図である。図６ａは、大腸菌においてＶＮｐ２－エタネルセプトが誘導した内向き膜湾曲のネガティブ染色ＥＭ連続切片画像である。
【図6-2】図６ｂは、大腸菌においてＶＮｐ２－エタネルセプトが誘導した内向き膜湾曲の抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ免疫染色ＥＭ連続切片画像である。図６ｃは、細胞質膜結合構造を生成するＶＮｐ２とＮａｔＢアミノ末端アセチル化複合体を共発現する大腸菌のＭｉｎＤ－ｍＳｃａｒｌｅｔ標識内膜のＳＩＭイメージングである。図６ｄは、細胞質膜結合構造を生成するＶＮｐ２とＮａｔＢアミノ末端アセチル化複合体を共発現する大腸菌のネガティブ染色ＥＭ連続切片を示す。図６ｅは、ＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎのアミノ末端アセチル化は、細胞内膜結合構造内へのｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの取り込みを促進することを示す。
【図6-3】図６ｆおよび図６ｇは、ＶＮｐ２－ＬＺ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌の連続切片の抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ免疫ＥＭ像である。図６ｈは、ＶＮｐ２－ＬＺを発現する大腸菌のＣｙｄＡＢ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ標識内膜のＳＩＭ像である。ＶＮｐ２－ＬＺ二量体が細胞質内膜結合小胞の内腔内に集中していることが示されている。
【図7】ＶＮｐタグを標的プロテアーゼで切断しても、ＶＮｐ融合体は可溶なままであることを示す図である。精製したＶＮｐｍＮＧ－ＴＥＶ－ＤＡＲＰとＶＮｐ－ｍＮＧ－ＴＥＶ－ウリカーゼをＴＥＶプロテアーゼで消化した。その結果、切断されたタンパク質はペレット画分（Ｐ）では検出されず、１３，２００ＲＣＦで遠心した後の上清（Ｓ／Ｎ）画分に残った。
【図8】ＶＮｐ融合体は様々な培養液量で培養した細胞から排出できることを示す図である。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの排出収量は、表面積対体積比（Ｘ軸）を調節するため、異なるサイズのフラスコで、様々な容量の細胞を培養して測定した。
【図9-1】二量体ＶＮｐ－ロイシン融合体は、大腸菌において細胞質ＶＮｐ－融合体充填小胞を形成することを示す図である。図９ａは、精製した組換えＶＮｐ－ｍＮＧおよびＶＮｐ－ＬＺｍＮＧタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル（挿入図）によって、ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（ｍＮＧ）融合体にロイシンジッパー（ＬＺ）モチーフを導入することで、安定な二量体形成が誘導されることを確認した。各融合タンパク質とタンパク質標準（２９ｋＤａの炭酸脱水酵素－青；６６ｋＤａのＢＳＡ－赤；４４３ｋＤａのアポフェリチン複合体－黄）は、同じ条件で実行した。図９ｂと図９ｃは、ＶＮｐ－ＬＺ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌の切片の抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ免疫ＥＭ顕微鏡像である。
【図10】α－シヌクレイン融合体を大腸菌で発現させると、培養培地中に小胞排出が誘導されることを示す図である。図１０ａは、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎとヒト成長ホルモンの両方に融合したαＳｙｎ（６０アミノ酸配列）を発現する大腸菌（αＳｙｎ－ｍＮＧ－ｈＧＨ）の広視野画像であり、αＳｙｎ融合体の細胞外小胞への排出を示す。図１０ｂは、αＳｙｎ－ｍＮＧ－ｈＧＨを発現する大腸菌のバイオリアクター培養からのサンプルの抗ＦＬＡＧウェスタン法は、４つの独立した実験において、融合タンパク質の発現と小胞への排出（＊で強調表示）を示す。図１０ｃは、空の発現ベクターまたはアンピリシリンもしくはカナマイシン耐性付与ベクターのいずれかを含む大腸菌の一晩ＩＰＴＧ誘導培養からの濾過培地のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、αＳｙｎ－ｍＮＧ－ｈＧＨの発現が認められたことを示す。αＳｙＮ－ｈＧＨは、抗生物質選択とは無関係に培地中に排出される。
【図11a】ＶＮｐは、生体内および生体外で大腸菌膜と相互作用することを示す図である。図１１ａは、ＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ単独（黒）、またはホスファチジン酸からなる１００ｎｍ小胞（赤）、または全脂質（青）もしくは極性脂質（緑）の混合物の存在下での熱シフトｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ蛍光曲線を示す。
【図11b】図１１ｂは、アクセプター蛍光色素で標識した内膜タンパク質（ＭｉｎＤ－Ｃｉｔｒｉｎｅ）または外膜タンパク質（ＯｍｐＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ）と共にＶＮｐドナー蛍光色素融合体（ＶＮｐ２－Ｃｅｒ３／ＶＮｐ２－ｍＮＧ）を発現する大腸菌細胞におけるドナー蛍光色素の蛍光寿命を示す。＊Ｎｔ－アセチル化ＶＮｐ２；☆－９９．９９％の信頼水準で異なる。データは６０倍の水浸対物レンズを使用して得られた。
【図11c】図１１ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙアクセプター蛍光標識ＣｙｄＡＢ内膜複合体と単独または組み合わせて、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎドナー蛍光標識ＶＮｐ融合体（ＶＮｐ２－ｍＮＧ）を発現する大腸菌細胞内のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ蛍光寿命のヒストグラムである。
【図11d】図１１ｄは、ＣｙｄＡＢが存在する細胞膜におけるドナー寿命の減少を示すＶＮｐ２－ｍＮＧ ＣｙｄＡＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞（図１０ｃより）のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ蛍光寿命画像である。図１１ｃおよび１１ｄは、６０倍の油浸対物レンズを用いて得られたものである。青色（２．８ｎｓ）から緑色（２．６ｎｓ）への変化に寿命の長さの減少が反映されている。
【図11e】図１１ｅは、αヘリカルＶＮｐ構造が大腸菌脂質膜によって安定化されていることを示す円偏光二色性を示す。ＶＮｐ２（黒）、全大腸菌脂質小胞（灰色）単独、またはＶＮｐ２と大腸菌脂質小胞の混合物（赤）のＣＤスペクトルである。ＶＮｐ２と大腸菌脂質膜の混合物で観測された２０８ｎｍと２２２ｎｍの相対的にブロードな負のＣＤスペクトルピークは、単一のαヘリカル構造と一致しており、ＶＮｐ２のαヘリックスが大腸菌膜脂質小胞との相互作用によって安定化されていることを示している。
【図12a】図１２ａは、同じ９６ウェルプレート上のＬＢ中３７℃で培養した、空のｐＲＳＦＤＵＥＴベクター（白抜き黒丸）、ｐＲＳＦＤＵＥＴ.ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（白抜き緑丸）、ｐＲＳＦＤＵＥＴ.ＶＮｐ２（塗りつぶし黒丸）またはｐＲＳＦＤＵＥＴ.ＶＮｐ２.ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（塗りつぶし緑丸）を含むＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞の４つの反復培養の平均から生成した増殖曲線であり、ＶＮｐまたはＶＮｐ融合体の発現が細菌の増殖に影響を与えないことを示す。
【図12b】図１２ｂは、小胞含有濾液からの生細胞の排除を示すルーチン試験を示す。ＶＮｐ２－ｍＮＧ発現大腸菌細胞の一晩培養物からの全培養物１０μｌ（ｉ）および０．４５μｍ培地濾液１ｍｌ（ｉｉ）を、ＬＢ（ｉｉ）またはカナマイシンを添加したＬＢ（ｉ）上にプレートアウトし、３７℃で一晩インキュベートした。
【図12d】図１２ｄは、ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＲＳＦＤＵＥＴ１－ＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ細胞の一晩培養の培地からフィルター精製したＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを含む小胞を４℃で保存した結果を示す。全体のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ蛍光と０．２μｍフィルター保持小胞内のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎシグナルの割合は、時間の経過とともに変化しなかったことから、小胞と折り畳まれたｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎタンパク質の安定性が示された。
【図12e】図１２ｅは、ＶｅｎｕｓＮ１５４およびＶＮｐ２－ＶｅｎｕｓＣ１５５（白）；ＶＮｐ２－ＶｅｎｕｓＮ１５４およびＶＮｐ２－ＶｅｎｕｓＣ１５５（灰色）；またはＶＮｐ２－ＬＺ－ＶｅｎｕｓＮ１５４_ＶＮｐ２－ＬＺ－ＶｅｎｕｓＣ１５５（黒）を発現するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌から単離した小胞内に含まれる複合体化二分子蛍光補完断片の蛍光（５１５ｎｍ）由来の濃度を示す。
【図12f】図１２ｆは、ＶＮｐ２－ｍＮＧ（黒）とＶＮｐ２－ＬＺ－ｍＮＧ（グレー）の溶出プロファイルを比較したゲル濾過曲線であり、ロイシンジッパーが小胞内でのＶＮｐ融合体の二量体化を誘導していることを示す。
【図13】ＶＮｐ融合体は単離された組換え小胞の内腔に含まれていることを示す図である。ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＲＳＦＤＵＥＴ１－ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ細胞の一晩培養の培地からフィルター精製したＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ含有小胞をＥＭグリッドにマウントし、抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ免疫ＥＭ分析にかけた。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎに依存した金密集の断片が、水への再懸濁から浸透圧衝撃を受けると小胞から放出された。これらは、破裂前の免疫分析、あるいは一次抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ抗体を用いない免疫分析を行ったコントロールサンプルでは観察されなかった。
【図14a】小胞単離されたＶＮｐ融合体は機能的であることを示す図である。図１４ａは、従来の方法で細胞ペレットから単離したウリカーゼ（赤）、またはＶＮｐ誘導小胞から単離したウリカーゼ（黒）の活性を示すウリカーゼ酵素活性アッセイを示す。緩衝液のみのコントロール（灰色）は、２９３ｎｍにおけるベースライン吸光度の希釈依存的変化を示す。ウリカーゼ酵素／緩衝液は、５分間の平衡化（破線）後に基質に添加した。
【図14b】図１４ｂは、大腸菌から精製したＶＮｐ２－ｍＮＧ－エタネルセプトのジスルフィド結合依存性オリゴマー化（図６ｂ）および機能性（図６ｃ）を示す抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎウェスタンブロットを示す。図１４ｂは、ＶＮｐ２－ｍＮＧ－エタネルセプトのジスルフィド結合依存性オリゴマー（＊）は、ＤＴＴ還元剤の添加により破壊される（左側のゲル）ことを示す。
【図14c】図１４ｃは、大腸菌から精製したＶＮｐ２－ｍＮＧ－エタネルセプトのジスルフィド結合依存性オリゴマー化（図６ｂ）および機能性（図６ｃ）を示す抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎウェスタンブロットを示す。図１４ｃ：（右側のゲル）大腸菌で発現させたアフィニティー精製ＶＮｐ－ｍＮＧ－エタネルセプト－ＨｉｓｅはプロテインＡ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合し、その後結合バッファーで洗浄した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーで煮沸して結合タンパク質を遊離させた。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ－Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔの予測サイズは８３．９ｋＤａである。
【図15】培養の表面積：体積比を変えるために、異なるサイズのフラスコで培養した大腸菌からのＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ含有小胞の排出収量を示す図である。青いドットは標準三角フラスコ、赤いドットはバッフル付き三角フラスコ、黒いドットは嫌気状態を誘導するためにパラフィルムで密閉した標準三角フラスコである。酸素濃度が高いほど、小胞の排出が増加した。
【図16】２０Ｌ発酵槽の大腸菌ＶＮｐ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７誘導の例からのサンプルのクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図17】ＶＮｐ融合タンパク質は、滅菌ＰＢＳ／培地中４℃で６ヶ月以上保存しても、小胞内で活性を維持することを示す図である。図１７ａは、従来の方法で細胞ペレットから単離したウリカーゼの酵素活性（赤）、またはＶＮｐ－ウリカーゼ誘導小胞から単離したウリカーゼの酵素活性（黒）を示す。グレー＝バッファーのみのコントロール。ウリカーゼ酵素／緩衝液を５分間の平衡化後に尿酸基質に添加した（破線）。図１７ｂは、ＶＮｐ－ウリカーゼ小胞内に保存されたタンパク質からのウリカーゼ酵素活性の安定性を示す。新鮮な小胞精製ＶＮｐ－ウリカーゼ（黒）、４℃で２ヶ月間反応緩衝液中に保存された同じ小胞精製ＶＮｐ－ウリカーゼ（緑）、または４℃で２ヶ月間保存された小胞から新たに精製されたウリカーゼ（青）のいずれかのウリカーゼ活性を、ストップトフローを用いて測定した。速度は、平均化した曲線の定常状態領域（ボックスで強調表示）から求めた。
【図18】哺乳動物細胞株におけるＶＮｐの生存能力を示す図である。図１８Ａは、空のベクター、またはＣＭＶもしくはＳＶ４０プロモーターの制御下でＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎもしくはＶＮｐ６－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎのいずれかを含むプラスミドを含んで生成された哺乳動物ＨＥＫ細胞株を示す。図１８Ｂは、ＳＶ４０プロモーターの制御下でＶＮｐ６－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを有するプラスミドを含むＨＥＫ細胞は、細胞外ＶＮｐ６－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ含有小胞（矢印）の形成を誘導したことを示す。
【図19】ＶＮｐタグは嫌気培養条件下での組換えタンパク質発現を促進することを示す図である。ゲルは、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎおよびステフィンＡ単独、またはＶＮｐと融合した発現構築物を含む細胞からの発現プロフィールを示す。予想されるタンパク質サイズは、ｍＮｇが２８ｋＤａ、ＶＮｐ－ｍＮｇ－が３２．５ｋＤａ、ｍＮｇ－ステフィンＡが３９ｋＤａ、ＶＮｐ－ステフィンＡが１４．５ｋＤａである。
【発明を実施するための形態】
【0059】
配列：
配列番号 １ － 全長内因性Ｈｓ α－シヌクレイン（ＶＮｐ１）
配列番号２ － Ｈｓ α－シヌクレインのアミノ末端の３８ａａ（ＶＮｐ２）
配列番号３ － Ｈｓ β－シヌクレインのアミノ末端の３８ａａ（ＶＮｐ３）
配列番号４ － Ｈｓ γ－シヌクレインのアミノ末端の３８ａａ（ＶＮｐ４）
配列番号５ － ３Ｋ－Ｅ変異を有するＶＮｐ２（ＶＮｐ５）
配列番号６ － ２Ｋ－Ｄ変異を有するＶＮｐ４（ＶＮｐ６）
配列番号７ － ６Ｋ－Ａ変異を有するＶＮｐ４（ＶＮｐ７）
配列番号８ － Ａ２９Ｍ変異を有するＶＮｐ４（ＶＮｐ８）
配列番号９ － １１０Ａ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ９）
配列番号１０ － Ａ１１Ｐ.Ｑ２４Ｐ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１０）
配列番号１１ － Ｅ３１Ｋ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１１）
配列番号１２ － Ｄ２Ｇ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１２）
配列番号１３ － Ｄ２Ｐ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１３）
配列番号１４ － ＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ１４）
配列番号１５ － ＶＮｐ６－２５アミノ酸切断（ＶＮｐ１５）
配列番号１６ － ＶＮｐ６－３０アミノ酸切断（ＶＮｐ１６）
配列番号１７ － ＶＮｐ６－１８アミノ酸切断（ＶＮｐ１７）
配列番号１８ － ＶＮｐ６－１５アミノ酸切断（ＶＮｐ１８）
配列番号１９ － ＶＮｐ６－１１アミノ酸切断（ＶＮｐ１９）
配列番号２０ － Ｆ４Ｙ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２０）
配列番号２１ － Ｆ４Ａ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２１）
配列番号２２ － Ｄ２Ｐ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２２）
配列番号２３ － Ｋ６Ｄ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２３）
配列番号２４ － Ｋ５ＤおよびＫ６Ｄ変異を有するＶＮｐ２２（ＶＮｐ２４）
配列番号２５ － ＶＮｐ６－１０アミノ酸切断（ＶＮｐ２５）
配列番号２６ － ＶＮｐ６－９アミノ酸切断（ＶＮｐ２６）
配列番号２７ － Ｓ９Ｄ変異を有するＶＮｐ１４（ＶＮｐ２７）
配列番号２８ － Ｓ９Ｄ変異を有するＶＮｐ２（ＶＮｐ２８）
配列番号２９ － ロイシンジッパー配列
配列番号 １ － 全長内因性Ｈｓ α－シヌクレイン（ＶＮｐ１）
配列番号２ － Ｈｓ α－シヌクレインのアミノ末端の３８ａａ（ＶＮｐ２）
配列番号３ － Ｈｓ β－シヌクレインのアミノ末端の３８ａａ（ＶＮｐ３）
配列番号４ － Ｈｓ γ－シヌクレインのアミノ末端の３８ａａ（ＶＮｐ４）
配列番号５ － ３Ｋ－Ｅ変異を有するＶＮｐ２（ＶＮｐ５）
配列番号６ － ２Ｋ－Ｄ変異を有するＶＮｐ４（ＶＮｐ６）
配列番号７ － ６Ｋ－Ａ変異を有するＶＮｐ４（ＶＮｐ７）
配列番号８ － Ａ２９Ｍ変異を有するＶＮｐ４（ＶＮｐ８）
配列番号９ － １１０Ａ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ９）
配列番号１０ － Ａ１１Ｐ.Ｑ２４Ｐ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１０）
配列番号１１ － Ｅ３１Ｋ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１１）
配列番号１２ － Ｄ２Ｇ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１２）
配列番号１３ － Ｄ２Ｐ変異を有するＶＮｐ６（ＶＮｐ１３）
配列番号１４ － ＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ１４）
配列番号１５ － ＶＮｐ６－２５アミノ酸切断（ＶＮｐ１５）
配列番号１６ － ＶＮｐ６－３０アミノ酸切断（ＶＮｐ１６）
配列番号１７ － ＶＮｐ６－１８アミノ酸切断（ＶＮｐ１７）
配列番号１８ － ＶＮｐ６－１５アミノ酸切断（ＶＮｐ１８）
配列番号１９ － ＶＮｐ６－１１アミノ酸切断（ＶＮｐ１９）
配列番号２０ － Ｆ４Ｙ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２０）
配列番号２１ － Ｆ４Ａ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２１）
配列番号２２ － Ｄ２Ｐ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２２）
配列番号２３ － Ｋ６Ｄ変異を有するＶＮｐ６－２０アミノ酸切断（ＶＮｐ２３）
配列番号２４ － Ｋ５ＤおよびＫ６Ｄ変異を有するＶＮｐ２２（ＶＮｐ２４）
配列番号２５ － ＶＮｐ６－１０アミノ酸切断（ＶＮｐ２５）
配列番号２６ － ＶＮｐ６－９アミノ酸切断（ＶＮｐ２６）
配列番号２７ － Ｓ９Ｄ変異を有するＶＮｐ１４（ＶＮｐ２７）
配列番号２８ － Ｓ９Ｄ変異を有するＶＮｐ２（ＶＮｐ２８）
配列番号２９ － ロイシンジッパー配列
【0060】
本発明は、目的の多様な分子を充填できる膜パッケージを作製するように単純な細胞をプログラムする方法に関する。この方法は、標的タンパク質が充填された膜パッケージを生体内で製造する方法を提供するだけでなく、誘導可能な合成翻訳後修飾が、パッケージが細胞質内に優先的に留まるか、または細胞外に放出されるかを制御する方法についても明らかにする。
【0061】
材料
本研究で使用した大腸菌株：
ＢＬ２１ＤＥ３ Ｆ－ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ －、ｍＢ －）ｇａｌｄｃｍ（ＤＥ３）。
ＤＨ１０β Ｆ－ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ－ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫλ－ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｎｕｐＧ
Ｗ３１１０Ｆ－ λ－ＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１ｒｐｈ－１
ＣＬＤ１０４０ Ｆ－λＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１ｒｐｈ－１ＯｍｐＴ
ＪＭ１０９ Ｆ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｑｌｑＺΔＭ１５ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ －、ｍｋ ＋） ｒｅｌＡ１ ｓｕｐＥ４４ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）
本研究で使用した大腸菌株：
ＢＬ２１ＤＥ３ Ｆ－ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ －、ｍＢ －）ｇａｌｄｃｍ（ＤＥ３）。
ＤＨ１０β Ｆ－ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ－ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫλ－ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｎｕｐＧ
Ｗ３１１０Ｆ－ λ－ＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１ｒｐｈ－１
ＣＬＤ１０４０ Ｆ－λＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１ｒｐｈ－１ＯｍｐＴ
ＪＭ１０９ Ｆ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｑｌｑＺΔＭ１５ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ －、ｍｋ ＋） ｒｅｌＡ１ ｓｕｐＥ４４ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）
【0062】
プラスミド：
ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－Ｈｉｓ６； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ ＯｍｐＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ；ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ_ｍＳｃａｒｌｅｔ－ｍｉｎＤ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ_ＶＮｐ－ｍＣｈｅｒｒｙ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ_ＶＮｐ－ｍＣｈｅｒｒｙ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３_Ｃｉｔｒｉｎｅ－ｍｉｎＤ； ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１_ｎａａ２０_ｎａａ２５（ｐＮａｔＢ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ１５８０１）； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＦＧＦ２１； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＦＧＦ２１； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｈＧＨ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｈＧＨ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ－ｈＧＨ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－Ｉ ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－Ｉ ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エタネルセプト； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エタネルセプト； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エリスロポエチン； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エリスロポエチン； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ_ＶＮｐ－ＬＺ－エタネルセプト； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ_ＶＮｐ－ＬＺ－ｈＧＨ。
ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－Ｈｉｓ６； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ ＯｍｐＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ；ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ_ｍＳｃａｒｌｅｔ－ｍｉｎＤ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ_ＶＮｐ－ｍＣｈｅｒｒｙ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ_ＶＮｐ－ｍＣｈｅｒｒｙ； ｐＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３_Ｃｉｔｒｉｎｅ－ｍｉｎＤ； ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１_ｎａａ２０_ｎａａ２５（ｐＮａｔＢ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ１５８０１）； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＦＧＦ２１； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＦＧＦ２１； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｈＧＨ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｈＧＨ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ－ｈＧＨ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－Ｉ ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ウリカーゼ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－ステフィンＡ； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－Ｉ ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エタネルセプト； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エタネルセプト； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エリスロポエチン； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅＮ－エリスロポエチン； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ_ＶＮｐ－ＬＺ－エタネルセプト； ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１_ＶＮｐ－ＬＺ_ＶＮｐ－ＬＺ－ｈＧＨ。
【0063】
プラスミド配列およびコンストラクトはａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇに寄託した。
本研究で試験したカーゴ全長タンパク質配列のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：
－ ＤＡＲＰ － アルキリンリピート タンパク質 ｏｆｆ７（アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）） － Ｂ９ＪＭＤ９
－ ＤＮａｓｅ Ｌ－ デオキシリボヌクレアーゼＩ（ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）） － Ｐ００６３９
－ ＥＰＯ － エリスロポエチン（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ０１５８８
－ エタネルセプト － 腫瘍ネクローシス因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ２０３３３
－ ＦＧＦ２１ － 線維芽細胞増殖因子２１（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｑ９ＮＳＡ１
－ ｈＧＨ － ソマトトロピン（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ０１２４１
－ ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ナメクジウオ（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）） － Ａ０Ａ１ Ｓ４ＮＹＦ２
－ ステフィンＡ － シスタチン－Ａ（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ０１０４０
－ ウリカーゼ（トルラ酵母（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ）） － Ｐ７８６０９
方法
本研究で試験したカーゴ全長タンパク質配列のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：
－ ＤＡＲＰ － アルキリンリピート タンパク質 ｏｆｆ７（アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）） － Ｂ９ＪＭＤ９
－ ＤＮａｓｅ Ｌ－ デオキシリボヌクレアーゼＩ（ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）） － Ｐ００６３９
－ ＥＰＯ － エリスロポエチン（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ０１５８８
－ エタネルセプト － 腫瘍ネクローシス因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ２０３３３
－ ＦＧＦ２１ － 線維芽細胞増殖因子２１（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｑ９ＮＳＡ１
－ ｈＧＨ － ソマトトロピン（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ０１２４１
－ ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ナメクジウオ（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）） － Ａ０Ａ１ Ｓ４ＮＹＦ２
－ ステフィンＡ － シスタチン－Ａ（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）） － Ｐ０１０４０
－ ウリカーゼ（トルラ酵母（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ）） － Ｐ７８６０９
方法
【0064】
細菌細胞の培養とタンパク質の誘導：すべての細菌細胞は、Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロス（１０ｇのトリプトン；１０ｇのＮａＣｌ；５ｇの酵母抽出物（リットル当たり）およびＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１２ｇのトリプトン；２４ｇの酵母抽出物；４ｍｌ１０％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４（リットル当たり）培地を用いて３７℃で培養した。新鮮な形質転換菌から得た５ｍｌのＬＢスターターを３７℃で飽和まで培養し、１００～５００ｍｌ容量のＴＢ培地に接種するのに使用し、フラスコ培養を３７℃で一晩、２００ｒｐｍの軌道振盪で行った。Ｔ７プロモーターからの組換えタンパク質の発現は、培養が０．８～１．０のＯＤ６００に達した時点で、イソプロピルチオ－ｐ－ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加することで誘導した（１０μｇ／ｍｌを使用したエタネルセプトを除く）。アミノ末端アセチル化ＶＮｐを作製するために、標的コンストラクトをｐＮａｔＢと共に大腸菌に共形質転換して、分裂酵母のアミノ－α－アセチルトランスフェラーゼ複合体Ｂ、Ｎａａ２０およびＮａａ２５と共発現させた（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ１５８０１）。アミノ末端アセチル化は、精製したＶＮｐ融合タンパク質のエレクトロスプレー質量分析により確認した。
【0065】
増殖曲線は、増殖分析実験の開始時にＯＤ６００が０．１ｎｍになるように新鮮な培地で希釈した対数期後期の培養から調製した９６ウェルプレート培養から作成した。ＯＤ６００吸光度値は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ｇｏ１５１０－０３１８Ｃプレートリーダーを用いて取得し、Ｓｋａｎｌｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ４．０を用いて記録した。ＯＤ６００値は実験期間中１５分ごとに測定し、４回の個々の生物学的反復の平均値から増殖曲線を作成した。
【0066】
可溶性タンパク質抽出物：５０ｍｌ培養の細胞ペレットを５ｍｌの可溶性抽出バッファー（２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、合計２分間超音波処理（６ｘ２０秒パルス）し、１８，０００ｒｐｍ（４℃）、３０分間の遠心分離で細胞残渣を除去した。標的タンパク質濃度は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合体の蛍光またはゲル濃度計を用いて決定した。等価性を判定するために、両手法を同じサンプルで直接比較した。
【0067】
組み換え小胞単離：小胞は、滅菌・界面活性剤なしの０．４５μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターに培養液を通すことで、細菌細胞培養物から直接単離した。等量の培養とフィルター通過による典型的な純度と濃度を図１に示す。濾液を含む小胞から生細胞が排除されるかどうかは、抗生物質を含まないＬＢプレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートすることで日常的に試験した（図１２に例を示す）。
【0068】
タンパク質濃度の測定：小胞含有培地および可溶性タンパク質抽出物中のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ標識タンパク質の濃度を決定するために、蛍光スキャンを用いた。吸光度はＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ（登録商標）５０Ｂｉｏ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を用いて５０６ｎｍで測定し、ベースライン補正のために同等の空のベクター培養からの測定値を用い、１１６，０００Ｍ－１ｃｍ－１の消衰係数を用いて濃度を決定した。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ標識していないタンパク質の濃度は、クマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ローディング標準と並行して行った３連サンプルのゲルデンシトメトリー分析によって決定した。ゲルはＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてスキャンし、分析した。濃度は、３つの独立したＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎサンプルについて、ＵＶとデンシトメトリーの両方で決定し、分析技術間のバリティを確認した。図１および表２の平均収量は、ＴＢ培地で培養したＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌の培養から、最低３回の独立した生物学的反復から算出した（ｍｇ可溶性標的タンパク質／１リットル培養物）。
【0069】
小胞からのタンパク質単離：精製したＶＮｐ誘導小胞を氷冷１×ＰＢＳに再懸濁した後、超音波処理して小胞膜を破壊し、ＶＮｐ融合タンパク質を遊離させた。カルボキシルＨｉｓ６タグ付き組換えＶＮｐ融合タンパク質（この研究で発現したすべての組換えタンパク質はカルボキシル末端Ｈｉｓ６アフィニティータグを含む）をさらに精製するため、この溶液を５×結合バッファー（２５０ｍＭのＴＲＩＳ、２．５ＭＮａＣｌ、５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、５０ｍＭのイミダゾールｐＨ７．８）の５分の１希釈液で混合した後、Ｎｉ２＋－アガロース樹脂グラビティカラムにかけた。細胞質組換えタンパク質は、可溶性タンパク質抽出物（イミダゾールを２０ｍＭまで添加）をＮｉ２＋－アガロース樹脂グラビティカラムに通すことにより精製した。いずれの場合も、マトリックスに結合したＨｉｓタグタンパク質を洗浄し、（イミダゾールを用いて）溶出し、適切な保存またはアッセイバッファーに透析した。単離したタンパク質の同一性とアミノ末端アセチル化は、エレクトロスプレー質量分析で確認した。
【0070】
細胞質ＶＮｐ濃度の測定：ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ発現をＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌で３７℃で４時間誘導し（細胞外小胞の産生が観察ｐされる場合）、３つの独立したサンプル調製から広視野イメージング（後述）を用いて１２０個以上の細胞の画像を取得した。平均ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ強度は、各大腸菌細胞内の５×５ピクセルの領域から求めた。細胞画像取得と同じ撮像条件を用いて、既知濃度のスライド搭載ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ溶液の複数の画像から検量線を作成した。これを用いて、測定した全細胞の平均強度の合計（１８．７６±０．１４μＭ）から平均細胞質ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ濃度を算出した。
【0071】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質のアフィニティー精製：小胞から組換えタンパク質を単離するために、ＶＮｐ標識タンパク質を発現する一晩誘導した培養物の培地を０．４５μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターに通し、その後の小胞を含む流れを超音波処理し、５×結合バッファー（２５０ｍＭのＴＲＩＳ、２．５ＭＮａＣｌ、５％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．８）の５分の１希釈液で混合した後、Ｎｉ２＋－アガロース樹脂グラビティカラムに通した。細胞質組換えタンパク質は、可溶性タンパク質抽出物（イミダゾールを２０ｍＭまで添加）をＮｉ２＋－アガロース樹脂グラビティカラムに通すことにより精製した。いずれの場合も、マトリックスに結合したＨｉｓタグ付きタンパク質を洗浄し、（イミダゾールを用いて）溶出し、適切な保存またはアッセイバッファーに透析した。単離したタンパク質の同一性とアミノ末端アセチル化は、エレクトロスプレー質量分析法を用いて確認した。
【0072】
円偏光二色性（ＣＤ）：測定は、Ｊａｓｃｏ７１５分光光度計を用い、２ｍｍの石英キュベットで行った。ＶＮｐタンパク質と１００ｎｍの押し出し小胞をＣＤバッファー（１０ｍＭリン酸カリウム、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）で希釈し、それぞれ０．４ｍｇ／ｍｌと０．２の濃度にした。２０８ｎｍおよび２２２ｎｍの幅広い負のピーク、２００ｎｍ未満の正のピークが、α－ヘリカル構造と一致した。
【0073】
タンパク質のエレクトロスプレーＬＣ－ＭＳ：エレクトロスプレー質量スペクトルは、Ｂｒｏｋｅｒ ｍｉｃｒＯＴＯＦ－Ｑ ＩＩ（商標）質量分析計で記録した。サンプルは、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００ＨＰＬＣシステムで動作するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ４カラム（５μｍ、３００Å、２．０ｍｍｘ５０ｍｍ）上で、短い水、アセトニトリル、０．０５％トリフルオロ酢酸のグラジエントを用いて、０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で逆相ＨＰＬＣによりオンラインで脱塩した。溶離液を２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターし、４．５ｋＶの正イオンモードで作動するエレクトロスプレーソースに導き、５００～３０００ｍ／ｚのマススペクトルを記録した。データはＢｒｏｋｅｒ’ｓ Ｃｏｍｐａｓｓ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで分析し、非荷電タンパク質の質量が得られるようにデコンボリューションした。
【0074】
組換え小胞のゲル内トリプシン消化とプロテオーム解析：精製ＶＮｐ－ＤＡＲＰ誘導小胞のサンプル（図７に示す）をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、その後クマシー染色し、サンプルレーン全体を切り出して小片にし、それを１．５ｍｌの微量遠心管に移し、処理するまで４℃で蒸留水に保存した。
【0075】
ゲル粒子を１５０μｌの新鮮な５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３：アセトニトリル（１：１比）で１５分間洗浄した。液体を除去し、ゲル断片を１５０μｌのアセトニトリルに１５分間再懸濁した後、再び液体を除去し、ゲル片を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｍＭのＤＴＴ１００μｌに再懸濁し、５６℃で３０分間インキュベートした。ゲル片を遠心分離し、余分な液体を除去した後、１００μｌのアセトニトリルで１分間インキュベートし、再びアセトニトリルを除去した後、ゲル断片を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中５５ｍＭクロロアセトアミド１００μｌに懸濁し、室温、暗所で２０分間インキュベートした。その後、ペレットを遠心分離し、クロロアセトアミド溶液を除去した。ゲル片はその後、１５０μｌの５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３：アセトニトリル（１：１）で１５分間洗浄した後、１５０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１５分間洗浄し、各洗浄後に遠心分離で液体を除去した。その後、ゲル片を２００μｌのアセトニトリルで１５分間洗浄し、５ｎｇ／μｌのトリプシンを含む５０μｌの消化バッファー（１２．５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３、１０％アセトニトリル）で再水和し、室温で一晩放置した。
【0076】
消化終了後、１５μｌのアセトニトリルをサンプルに加え、超音波浴で１５分間超音波処理した。ゲル断片を遠心分離で単離し、上清を０．５ｍｌの微量遠心管に回収した（Ａ）。ゲル断片のペレットを３０μｌの５％ギ酸含有５０％アセトニトリルに再懸濁し、超音波浴で１５分間超音波処理し、ペレットを再度遠心分離で単離し、上清を新しい０．５ｍｌ微量遠心管に回収した（Ｂ）。チューブＡとＢの内容物を合わせて真空乾燥し、５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ２０μｌに再懸濁した。サンプルをＰｉｅｒｃｅ Ｃ１８ Ｓｐｉｎ Ｔｉｐｓに通し、ナノ－ＬＣＭＳで分析した。
【0077】
嫌気性条件下で培養した大腸菌での組換えタンパク質の発現：気密の嫌気培養容器に、抗生物質と５０ｍＭのフマル酸ナトリウムまたは１００ｍＭの硝酸ナトリウムを添加したＬＢ培地を入れた（フマル酸塩と硝酸塩は酸素の代わりに電子受容体として働く）。培地と気密培養容器から酸素をアルゴンガスで２０分間パージした。発現コンストラクトを含む新鮮なＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌形質転換体をＬＢ＋選択抗生物質で５ｍｌ一晩培養したものを接種するのに使用した。このスターター培養の１：５０希釈液を、酸素パージした培養容器に添加した（注射器と注射針を使用）。酸素パージしたＩＰＴＧ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を添加してＴ７プロモーター依存性タンパク質発現を誘導した際に、この嫌気培養物を３７℃で２時間振盪してインキュベートした。その後、回収および分析の前に、３７℃で２４時間培養した。
【0078】
ゲル濾過アッセイ：５００μｌのタンパク質サンプルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で室温で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードし、０．７５ｍｌ／分の流速で流した。溶出したタンパク質を、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ（登録商標）ＳＥＣ－Ｍａｌｓ９およびＶｉｓｃｏｔｅｋ（登録商標）ＲＩ検出器ＶＥ３５８０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で測定した。データを、ＯｍｎｉＳＥＣ（登録商標）ソフトウェアを用いて分析した。
【0079】
脂質結合アッセイ：大腸菌膜脂質に対するＶＮｐの親和性は、Ｎｊｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１８）９，４２５３－１２）を応用した熱シフト蛍光結合アッセイを用いて確立した。等価アッセイサンプル：６５μｌの３ｍｇ／ｍｌのＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ、試験する脂質混合物からなる１ｍＭの１００ｎｍの押し出し小胞６５μｌ、１０％のＮ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ）１５μｌ、および５μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０からなる等価アッセイサンプルをＰＣＲチューブに調製し、グラジエントＰＣＲ装置で規定温度に１０分間保持した。サンプルを１８，０００ｘｇで遠心し、上清の蛍光を、黒色９６ウェルプレート（ＢＲＡＮＤ（登録商標）、ドイツ）にて、ＢＭＧ Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いてＢＭＧ Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。蛍光測定値は正規化され、融解曲線の作成に使われ、融解温度（Ｔｍ）をＯｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を用いて求めた。最終的なＴｍ値は、３回の独立したサンプルの繰り返しから計算された平均値（±ｓ．ｄ）であった。
【0080】
ウリカーゼアッセイ：５００μｌの２００ｍＭ尿酸入り１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５をキュベットに入れ、ＯＤ２９３測定を４分間または５分間行った。その後、５００μｌの４．２ｍｇ／ｍｌ精製ＶＮｐ２－ウリカーゼ（０．１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５に透析）または透析バッファーだけをキュベットに加え、２５分間ＯＤ２９３を測定した。（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．－Ｈ．＆ Ｗｕ，Ｔ．－Ｋ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１，５１７－５２３から適合させた）。
【0081】
広視野蛍光顕微鏡検査：細胞を厚さ１ｍｍ未満の円形ＬＢ－アガロース（２％）パッドの下のカバースリップにマウントし、適切なスペーサーでスライドガラスに貼り付けた後、倒立顕微鏡で観察した。（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ，Ｄ．Ｐ．（２０１７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１７，７６１－７７３）。各サンプルの生細胞イメージングを、細胞サンプルをカバースリップにマウントしてから３０分以内に完了した。
【0082】
構造化照明顕微鏡検査（ＳＩＭ）を、１００ｘＮＡ１．４６油浸漬対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ ａ Ｐｌａｎ －Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を備えるＺｅｉｓｓ Ｅｌｙｒａ ＰＳ．１顕微鏡を用いて、既報の通り（Ｐｅｒｉｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１－１６；Ｑｉｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，６９７－７０１）行った。簡単に説明すると、細胞を薄いＬＢ－アガロースパッドの下、高精度１．５号カバースリップ（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントした。４８８ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザーをそれぞれｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびｍＣｈｅｒｒｙ／ｍＳｃａｒｌｅｔ融合体に照射した。光学フィルターセットは，ダイクロイックミラーとしてレーザー遮断フィルターＭＢＳ４０５／４８８／５６１、デュアルバンド発光フィルターＬＢＦ－４８８／５６１で構成されている。二次元情報を得るために、照明パターンの合計３回転が実施された。超解像ＳＩＭ画像処理は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎソフトウェアを用いて行った。予めマウントされたＭｕｌｔｉＳｐｅｃ（商標）ビーズサンプルを用いたキャリブレーション後、同じソフトウェアを用いて２つのカラー画像を位置合わせした。
【0083】
蛍光寿命イメージング顕微鏡検査（ＦＬＩＭ）：本研究で用いた１光子系および２光子系については既報の通りである（Ｂｏｔｃｈｗａｙ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．２５８，６８－７８）。データの取得に先立ち、共焦点顕微鏡を用いてタンパク質の発現量を確認した。ここでは、倒立型Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００またはＴｉ－Ｅ顕微鏡に取り付けたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｃ２－Ｓｉ共焦点スキャンヘッドを使用した。ＮＫＴスーパーコンティニウムレーザーを用い、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎは４９１ｎｍ（発光波長５２０／３５ｎｍ）、ｍＣｈｅｒｒｙは５６１ｎｍ（発光波長６３０／５０ｎｍ）で励起した。ＦＬＩＭ画像は以下のように得られた。モード同期チタンサファイアレーザー（Ｍｉｒａ Ｆ９００、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｌａｓｅｒ Ｌｔｄ）により２光子（９５０ｎｍ）の波長光を発生させ、７６ＭＨｚで１８０ｆｓのパルスを発生させた。このレーザーは、固体連続波５３２ｎｍレーザー（Ｖｅｒｄｉ １８，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｌａｓｅｒｓ Ｌｔｄ）によって励起された。蛍光は、ドナー蛍光体用のＢＧ３９フィルターを通して収集された。アクセプターは励起されなかった。
【0084】
１光子励起ＦＬＩＭでは、システムは、８０ＭＨｚの繰り返し周波数、７０ｐｓのパルス幅で発振するＳｕｐｅｒＫ ＥＸＴＲＥＭＥ ＮＫＴ－ＳＣ ４７０－２０００ｎｍスーパーコンティニウムレーザー（ＮＫＴ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を備えた。望ましい波長は、ＳｕｐｅｒＫ ＳＥＬＥＣＴ ２９ ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅ ｔｕｎａｂｌｅ ｆｉｌｔｅｒ（ＮＫＴ ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いて選択される。画像は、６０Ｘ１．２ＮＡ水浸レンズ（図１１ｂおよび図１４ｂ）または６０Ｘ１．４９ＮＡ油浸レンズ（図１１ｃ）のいずれかを通して収集した。１光子励起と２光子励起の両方で、発光はフィルター（上記）を通して同じ対物レンズで収集し、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）モジュール（ＳＰＣ８３０、ＢｅｃｋｅｒおよびＨｉｃｋｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結した外部ハイブリッドＧａＡｓＰ（ＨＰＭ－１００－４０、Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｈｉｃｋｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出した。多次指数関数的解析には少なくとも１０００の光子計数を使用した。ＳＰＣＩｍａｇｅソフトウェアｖ．６．９（Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｈｉｃｋｌ，ＧｍｂＨ）を用いて、画像の各ピクセル（２５６ｘ２５６またはそれ以上）における生の時間相関単一光子計数減衰曲線を解析した。減衰曲線のフィッティングには、レーザー繰返し時間値１２．５ｎｓの不完全単一指数フィットモデルを用いた。χ２が０．８から１．３の間の寿命値を良好な指数関数的減衰フィットとした。寿命は最低１５視野の平均値から計算され、５視野以上は別々に準備された３つのスライドサンプルから採取された。
【0085】
細胞および単離小胞の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析：一晩培養からのＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌細胞１０μｌを、フォルムバール／炭素で被覆した４００メッシュの金グリッド上に置き、３７℃の加湿チャンバー内でインキュベートして小胞を形成させた。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌の培養物から単離した組換え小胞を、フォルムバール／炭素で被覆した４００メッシュの金グリッド上に置き、３７℃の加湿チャンバーでインキュベートして小胞を形成させた。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌の培養物から単離した組換え小胞を、フォルムバール／炭素で被覆した６００メッシュの銅グリッド上に置き、室温で５分間静置して小胞を表面に沈降させた。その後、両サンプルを１００ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２（ＣＡＢ）中２．５％グルタルアルデヒドで１０分間固定した。その後、グリッドを１００ｍＭのＣＡＢとｍｉｌｌｉＱ（登録商標）水で洗浄した。その後、グリッドを乾燥させ、２％酢酸ウラニル水溶液で５秒間ネガティブ染色した。
【0086】
大腸菌細胞のＴＥＭ薄切片分析：ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌を上記のように培養し、３，０００ｇで１０分間遠心分離して回収した。細胞ペレット（約１００μＩ）を、ＣＡＢ中の２．５％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド２ｍｌに再懸濁し、穏やかに回転（２０ｒｐｍ）させながら室温で２時間固定した。細胞を６，０００ｇで２分間遠心分離してペレット化し、１００ｍＭのＣＡＢで１０分間２回洗浄した。細胞を１００ｍＭのＣＡＢ中１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウムで２時間後固定し、その後ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した。５０％ＥｔＯＨで１０分間、７０％ＥｔＯＨで一晩、９０％ＥｔＯＨで１０分間のエタノール勾配でインキュベートした後、１００％乾燥ＥｔＯＨで１０分間洗浄を３回行い、細胞を脱水した。その後、細胞をプロピレンオキシドで１５分間２回洗浄した。細胞ペレットをプロピレンオキシドとアガーＬＶレジンの１：１混合液１ｍｌに再懸濁し、回転させながら３０分間インキュベートした。細胞ペレットを１００％アガーＬＶ樹脂に２回浸潤した（２ｘ２ｈ）。細胞ペレットを新鮮な樹脂に再懸濁し、１－ｍＬ ＢＥＥＭ包埋カプセルに移し、スイングアウトローターで１１００ｒｐｍ、５分間遠心してカプセルの先端に細胞を濃縮し、サンプルを６０℃で２０時間重合した。
【0087】
超薄切片は、ダイヤモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ ４５°）を装備したＬｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ７ウルトラミクロトームを用いて切り出した。切片（７０ｎｍ）はコーティングされていない４００メッシュの銅グリッド上に集めた。グリッドを１％（ｖ／ｖ）の酢酸中４．５％（ｗ／ｖ）の酢酸ウラニルで４５分間インキュベートした後、ｄｄＨ２Ｏの流れで洗浄した。グリッドをレイノルズクエン酸鉛で７分間染色した後、ｄｄＨ２Ｏで洗浄した。電子顕微鏡観察は、Ｇａｔａｎ Ｏｎｅ Ｖｉｅｗデジタルカメラを装備した加速電圧８０ｋＶのＪＥＯＬ－１２３０透過電子顕微鏡を用いて行った。
【0088】
単離した小胞の免疫ＥＭ：ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌の培養物からの組換え小胞を含む２μｌの濾過培地を、フォルムバール／炭素で被覆した６００メッシュの銅グリッド上に置き、室温で５分間静置して小胞を沈降させた。グリッドを２０μｌのｍｉｌｌｉＱ水２滴に移し、室温で１０分間、浸透圧衝撃を与えて小胞を破裂させた。その後、サンプルをＣＡＢ中２％ホルムアルデヒドおよび０．５％グルタルアルデヒドで室温で１５分間固定した。次に、グリッドを６滴の２０μｌのＣＡＢと６滴の２０μｌのＴＢＳＴ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡｐＨ７．４）で洗浄した。サンプルを、ＴＢＳＴ中の２％ＢＳＡ２０μｌの滴で３０分間室温でブロッキングした。次に、グリッドを、ＴＢＳＴで１：１００に希釈した抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎウサギポリクローナル一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２０μｌの滴に直接移し、１時間インキュベートした。グリッドを６滴の２０μｌのＴＢＳＴで洗浄した。その後、グリッドを１：５０に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ ５ｎｍ ｇｏｌｄ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の滴に移し、次いで同じ抗体の新しい滴に移して３０分間インキュベートした。過剰の抗体は、６滴の２０μｌのＴＢＳＴ溶液と６滴の２０μｌのｍｉｌｌｉＱ水で洗浄し、乾燥させた。
【0089】
グリッドを２％酢酸ウラニル水溶液で５秒間ネガティブ染色した。電子顕微鏡観察は、Ｇａｔａｎ Ｏｎｅ Ｖｉｅｗデジタルカメラを装備した加速電圧８０ｋＶのＪＥＯＬ－１２３０透過電子顕微鏡で行った。
【0090】
大腸菌細胞の免疫電子顕微鏡（ＥＭ）：ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現する大腸菌を上記のように培養し、３，０００ｇで１０分間遠心分離して回収した。細胞ペレット（約１００μｌ）を２ｍｌの２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドとＣＡＢ中０．５％グルタルアルデヒドに再懸濁し、室温で２時間固定した。サンプルをＣＡＢで２ｘ１０分間洗浄した。５０％ＥｔＯＨで１０分間、７０％ＥｔＯＨで一晩、９０％ＥｔＯＨで１０分間のエタノール勾配でインキュベートした後、１００％乾燥ＥｔＯＨで１０分間洗浄を３回行い、細胞を脱水した。その後、細胞をＬＲ Ｗｈｉｔｅ ｒｅｓｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｇｒａｄｅ（Ｌｏｎｄｏｎ Ｒｅｓｉｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）に４時間懸濁し、新鮮なＬＲＷｈｉｔｅ樹脂に一晩懸濁した。新鮮なＬＲ Ｗｈｉｔｅ ｒｅｓｉｎで４時間×２回交換した後、サンプルを密封したゼラチンカプセルに入れ、スイングアウトローターで１１００ｒｐｍで回転させ、細胞を濃縮した。細胞ペレットを含むゼラチンカプセルを６０℃で２０時間直立重合した。ダイヤモンドナイフ（ＤｉＡＴＯＭＥ４５°）を装着したＬｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ７ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅを用いて、超薄切片を切り出した。切片（８０ｎｍ）は、コーティングされていない４００メッシュの金グリッド上に集めた。
【0091】
サンプルをＴＢＳＴ中２％ＢＳＡの２０μｌの滴で３０分間室温でブロッキングした。次にグリッドを、ＴＢＳＴで１：１０に希釈した抗ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎウサギポリクローナル一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の２０μｌの滴に直接移し、１時間インキュベートした。グリッドを６ｘＴＢＳＴで洗浄した。次にグリッドを、１：５０に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ ５ｎｍ ｇｏｌｄ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の滴に移し、同じ抗体の新しい滴に移して３０分間インキュベートした。過剰の抗体は、６滴の２０μｌのＴＢＳＴと６滴の２０μｌのｍｉｌｌｉＱ水で洗浄して除去し、乾燥させた。
【0092】
グリッドを１％酢酸溶液中の４．５％酢酸ウラニルで１５分間染色した後、ｍｉｌｌｉＱ水６ｘ２０μｌ滴で洗浄した。その後、グリッドをレイノルズクエン酸鉛で３分間染色し、ｍｉｌｌｉＱ水６ｘ２０μｌ滴で洗浄した。電子顕微鏡観察は、Ｇａｔａｎ Ｏｎｅ Ｖｉｅｗデジタルカメラを装備し、加速電圧８０ｋＶで動作するＪＥＱＬ－１２３０透過電子顕微鏡を用いて行った。
【0093】
動的光散乱試験：すべての試験はＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ（商標）５００を使用し、ＫａｌｌｉｏｐｅＴＭ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌで処理した。サンプル調製に使用したすべてのバイアル／キュベット／微量遠心管は、清潔で乾燥したものである。使用した溶媒系はすべて濾過し、得られた結果に干渉する可能性のある微粒子を除去した。
【0094】
発酵培養によるＶＮｐ融合体排出：２Ｌバッフル付きフラスコで一晩培養したｐＡＶＥ０１１－ＶＮｐＤＡＲＰｉｎＯＦＦ７を含む大腸菌のＬＢ（１％ｗ／ｖグルコースおよび１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリン添加）４５０ｍｌの一晩前培養した培養物１６０ｍｌを、３７℃、２００ｒｐｍ（２．５ｃｍスロー）の振盪培養器で、１６ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス基礎培地（グルコースまたはグリセロール無添加、テトラサイクリン添加）発酵槽培養液に接種した。
【0095】
発酵槽の培養条件：ｐＨを７．０に設定（２５％アンモニア水溶液または８．５％ｗ／ｖオルトリン酸水溶液で制御）；ｐＯ２設定値３０％（撹拌機にカスケード接続し、入口ガスに酸素を補充）；通気速度：１．０ｖ／ｖ／ｍ；撹拌速度：２００～６３０ｒｐｍ；グルコース／酵母エキスの発現供給速度：６ｇ／Ｌ／ｈを上限とした。４００ｇ／Ｌのグルコースと２００ｇ／Ｌの酵母エキスからなる供給培地を９６ｇ／ｈでバッチ培養に供給した。ＶＮｐ２－ＤＡＲＰの予測サイズは２２．５ｋＤａである。
【0096】
ＶＮｐ－ＤＡＲＰの発現は、５．３時間（発酵経過時間）の溶存酸素張力の最初のスパイクで示されるように、バッチ段階でのＩＰＴＧ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）の添加によって誘導された。６．６時間の枯渇後、直線供給を開始した。
【0097】
発酵期間：ＩＰＴＧ誘導から１８．９５ｈ（ｓｔａｒｔｏｆ直線供給速度の開始から１７．６５ｈ）。
【0098】
３，０００ＲＣＦ、１０℃で２０分間の遠心分離により細胞ペレットを回収した。ＳＮ回収物のアリコートを分析のために０．４５μｍＰＥＳフィルターに通した。
【0099】
結果
本発明は、ヒトシヌクレインのアミノ末端の一部または全部の組換え発現が、大腸菌細胞から培地中への細胞外小胞の連続的な形成と放出をもたらすという発見にある（図１ａ）。特にαシヌクレインについて調べたところ、配列の最初の６０残基はα－ヘリカル膜相互作用ドメイン全体を表し、最初の３８残基はこのドメインの前半部分であり、予測されるループ領域で切断されていた。これらの配列はどちらも同じ程度にｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ小胞の排出を促進した。
本発明は、ヒトシヌクレインのアミノ末端の一部または全部の組換え発現が、大腸菌細胞から培地中への細胞外小胞の連続的な形成と放出をもたらすという発見にある（図１ａ）。特にαシヌクレインについて調べたところ、配列の最初の６０残基はα－ヘリカル膜相互作用ドメイン全体を表し、最初の３８残基はこのドメインの前半部分であり、予測されるループ領域で切断されていた。これらの配列はどちらも同じ程度にｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ小胞の排出を促進した。
【0100】
最初の３８残基を有する配列（ＶＮｐ２）は細胞膜と相互作用し（図１０および図１１）、４時間後からＶＮｐ発現（細胞質ＶＮｐ２濃度は１８．８±０．１４μＭに達した）により、菌体膜の局所的な湾曲が誘導され、別個の小胞が形成されるまで外側に伸びて、膜が切断されると増殖培地中に放出された（図１ｂ～ｄ）。このプロセスは細胞生存率に影響を与えることなく繰り返し起こり、同一細胞から小胞を大量生産することができた（図１ｄおよび図１２）。
【0101】
ＶＮｐをコードする配列と単量体蛍光タンパク質ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎをコードする配列（Ｓｈａｎｅｒ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｔｈ，４０７－４０９）を融合すると、大きいＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを含む蛍光小胞が産生され、培養液中に排出された（図１ｅ、１ｆ）。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎカーゴは小胞の内腔にのみ存在することが、免疫ＥＭ分析で確認された（図１ｅ～１ｆ）。免疫電子顕微鏡でも、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎカーゴが小胞の内腔内にのみ局在していることが確認され（図１ｆ、図１３）、ＶＮｐが内膜の脂質と相互作用して、膜の局所的な外向きの湾曲とそれに続く小胞形成を誘導する臨界濃度まで蓄積するという解釈が支持された。その後、ＶＮｐは内側に湾曲した膜から、形成された小胞の内腔に放出され、細胞膜の切断と再閉鎖に伴って、今度は培地中に放出される（図１ｊ）。
【0102】
遠心分離によって大部分の細菌細胞から小胞が分離された一方で、滅菌した０．４５μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いた迅速な一段階濾過によって、細菌から小胞が効率的かつ効果的に分離された（図１ｇ～ｈ、図１１）。驚くべきことに、これらの単離された小胞はサイズが均一で、機能的に折り畳まれた組換えタンパク質の効果的な長期タンパク質保存のための安定した環境をもたらした（図１１）。組換え小胞の内容物のプロテオミクスとデンシトメトリー分析から、組換えタンパク質の相対的な純度が示され、プロテオミクスとゲル分析から総数の－４０～６０％であった（図２参照）。一段階濾過で得られた融合タンパク質の純度は、非常に幅広い用途に十分である可能性が高く（図１ｉ）、必要に応じて小胞を超音波処理した後の精製をサポートする。
【0103】
このシステムは、組換えタンパク質の生産とその後の処理を促進するために、膜にパッケージされた組換えタンパク質を培地に放出するためのシンプルで魅力的なメカニズムを提供する。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎは、異なる物理的性質と発現上の課題（膜結合性、ジスルフィド結合を含む、あるいは不溶性または有毒なタンパク質など）を持つ培地に排出された可溶性標的タンパク質の迅速な定量を提供し、ライフサイエンス・コミュニティーが要求する様々な分子の発現に対するこの技術の適用性を試験した。各タンパク質の発現をＶＮｐ、またはＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎアミノ末端融合体として試験し、同等の非ＶＮｐ融合タンパク質の発現と比較した（図１ｋ～ｍ、表２）。
【0104】
また、この技術は、さまざまな誘導性・構成性プロモーターからの発現を利用して、幅広い大腸菌株（ＢＬ２１株、ＪＭ１０９株、Ｋ１２株など）に応用できることも実験で示されている。ＶＮｐシステムはＷ３１１０細胞で機能し、免疫原性反応を低減した組換えタンパク質充填小胞の作製を可能にする。ＶＮｐ融合体は様々なプラスミド（ｐＵＣ１９やｐＢＲ３２２ベースの誘導体を含む）から発現させることができ、多様なプロモーター（Ｔ７、ラムノースなど）や誘導レベルからＶＮｐ融合体の発現を調節することができる（図３および表１を参照）。
表１：Ｗ３１１０λＤＥ３大腸菌細胞排出したタンパク質の収量：
表１：Ｗ３１１０λＤＥ３大腸菌細胞排出したタンパク質の収量：
【表1】
【0105】
本発明者らはまた、目的のタンパク質が小胞から放出されると、プロテアーゼ消化物を用いてＶＮｐタグを除去しても、目的のタンパク質は可溶性のままである（すなわち、タンパク質の溶解性を維持するためにＶＮｐは必要ない）ことを実証した。図７に示すように、精製したＶＮｐｍＮＧ－ＴＥＶ－ＤＡＲＰとＶＮｐ－ｍＮＧ－ＴＥＶ－ＵｒｉｃａｓｅをＴＥＶプロテアーゼで消化した。その結果、切断されたタンパク質はペレット画分（Ｐ）では検出されず、１３，２００ＲＣＦで遠心した後の上清（Ｓ／Ｎ）画分に残った。
【0106】
蛍光タンパク質を用いれば、培地中に排出された可溶性標的タンパク質を迅速に定量することができるが、この技術を検証するために、物理的性質や発現の課題が異なる、より広範な標的タンパク質を選択した。試験対象タンパク質には、設計したアンキリン反復タンパク質ｏｆｆ７（ＤＡＲＰ）、ステフィンＡ、ウリカーゼ（図１ｋ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、エタネルセプト、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）およびヒト増殖ホルモン（ｈＧＨ）が含まれる。このように、これらのタンパク質は、大腸菌では通常検出可能なレベルまで発現されない、異なる物理的特性および発現上の課題（膜結合性、二量体、ジスルフィド結合を含む、または不溶性タンパク質など）を代表するものであり、したがってこの技術の幅広い応用可能性を示すものである。各タンパク質の発現をＶＮｐ、またはＶＮｐｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎアミノ末端融合タンパク質として試験し、同等の非ＶＮｐ融合タンパク質の発現と比較した（表２）。
【0107】
表２：可溶性タンパク質収量の概要。
【表2-1】
【表2-2】
【0108】
平均収量±ｓ.ｄ．は＞３独立した生物学的反復から計算した。収量はｍｇ可溶な標的タンパク質／Ｌとして測定した。特に断りのない限り、Ｔ７プロモーターを２０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧで誘導し、３７℃で細菌の振盪フラスコ培養を行った。
ｎ．ｄ．：検出不能；ＬＺ＝ロイシンジッパー配列；ｍＮＧ＝ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ
ｎ．ｄ．：検出不能；ＬＺ＝ロイシンジッパー配列；ｍＮＧ＝ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ
【0109】
小胞核形成ペプチド配列の範囲を広げたｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ融合体の相対的な排出収量を測定した。表３からわかるように、ＶＮｐの長さが短くなると、排出収量が低下した。９アミノ酸のペプチド長でもある程度の排出が観察されたが、この短い長さでは小胞形成活性が著しく低下した。
表３：
表３：
【表3-1】
【表3-2】
【0110】
ＶＮｐとの融合は、各標的タンパク質のタンパク質発現と分泌を非常に効果的に増強した。このように、ＶＮｐタンパク質発現は、１ｋＤａ未満（ＶＮｐ－Ｈｉｓ６）から８５ｋＤａ（ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ－エタネルセプト）までのサイズの個々のタンパク質の発現をサポートするだけでなく、排出された小胞内の二分子蛍光補完ＶＮｐ融合体のペアからの蛍光によって示されるように、タンパク質複合体の発現もサポートする（図１１）（Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．＆ Ｈｕ，Ｃ．－Ｄ．（２０１０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４９，７９３－８０５）。重要なことは、ＶＮｐ融合によって、調べた各ターゲットタンパク質の可溶型の全体の収量が向上したことで、ＤＡＲＰの場合、振盪フラスコ培養１リットル当たりほぼ１ｇの可溶型タンパク質の収量が得られた（表２）。膜結合タンパク質（ＦＧＦ２１）と完全な酵素活性を持つＶＮｐ－ウリカーゼの生産により、このシステムの多様性が示された。さらに、ＶＮｐ－エタネルセプトは適切なリガンド結合特性を示し（図１３）、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ蛍光は、ＶＮｐ誘導小胞パッケージングに伴う機能的タンパク質折り畳みが、単離された小胞内でどのように維持されているかを示している。
【0111】
ＶＮｐ融合により、他の方法では不溶性であったり、細菌細胞の生存能力を低下させる可溶性折り畳みタンパク質（例えば、ＤＮａｓｅ、エタネルセプト、ＥＰＯ、ｈＧＨ）の生産が可能になる。ジスルフィド結合を含むタンパク質エタネルセプトとｈＧＨの場合（Ｇｏｆｆｅ，Ｂ．＆ Ｇａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｃ．（２００３）Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ４９，Ｓ１０５－Ｓ１１１；Ｕｌｔｓｃｈ，Ｍ．Ｈ．＆ Ｓｏｍｅｒｓ，Ｗ．Ｊ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６，２８６－２９９）、可溶性組換えタンパク質の大部分は細胞内に留まっていた。ＥＭのデータは、ＶＮｐ－ｍＮＧ－エタネルセプトがＶＮｐの内膜のリモデリングに影響を与えて、内在化した細胞質膜構造を含むＶＮｐ融合体を誘導することを示している（図６ａ～ｂ）。同様に、組換えＮａｔＢ複合体によるＶＮｐのアミノ末端アセチル化（Ｅａｓｔｗｏｏｄ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０６，８１５７－９）は、ＶＮｐ－エタネルセプトと同様に、大腸菌内で膜内部構造を形成し（図６ｃ～ｄ）、細胞内のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの割合を増加させた（図６ｅ、表２）。
【0112】
ＶＮｐ２タグは、大腸菌からのヘテロ二量体可溶性機能性抗体の発現と単離も可能にする。重鎖と軽鎖のヘテロ二量体（ジスルフィド結合で連結）からなるＦａｂ（フラグメント抗原結合；折り畳まれた鶏卵リゾチーム）とｍＡＢ（モノクローナル抗体；Ｍｕｃ１）抗体は可溶性であり、正しい構造、複合体形成、機能性を示すプロテインＧ／Ａと結合できることがわかった（図４参照）。
【0113】
ＶＮｐとカーゴの間にロイシンジッパー配列を導入することで、安定なα－ヘリカルＶＮｐ二量体が作製され（図１２）、以前の二量体ＶＮｐ融合体と一致して、細菌細胞質内で内膜に関連した小胞構造を含むｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの形成を誘導した（図６ｆ～ｈ）。特に、ＶＮｐのカルボキシル末端にロイシンジッパー配列を付加すると、ＶＮｐ二量体が形成され、細胞質内小胞が主に生成される。図９に見られるように、ＶＮｐ－ｍＮＧ（黒）の溶出プロフィールは単量体タンパク質と一致していたが、ＶＮｐ－ＬＺ－ｍＮＧ（灰色）はより早い画分でカラムから溶出し、主に二量体として存在していた。したがって、本発明は、大腸菌から毒性タンパク質および／またはジスルフィド結合を含むタンパク質を発現させるための魅力的な簡単な系を提供する（図６ｉ）。
【0114】
ＶＮｐはまた、組換えタンパク質の小胞内標的タンパク質分解切断を可能にするために作製された。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ－ＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７融合体を単独で、またはＶＮｐ－マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－ＴＥＶプロテアーゼ融合体と組み合わせて発現させるコンストラクトを含む大腸菌細胞を培養し、一晩フラスコ培養で発現を誘導した。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ－ＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７融合体は、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎとＤＡＲＰｉｎ配列の間にＴＥＶ切断部位を含んでいた。図５に見られるように、ＶＮｐ－ｍＮＧ－ＤＡＲＰの単独発現は、全長タンパク質（５０．８ｋＤａサイズ）の発現と小胞排出をもたらした。一方、同じタンパク質をＴＥＶプロテアーゼ融合体と共発現させると、ＶＮｐ－ｍＮＧ－ＤＡＲＰはＴＥＶ部位で切断され、ＶＮｐ－ｍＮＧ（３２ｋＤａ）とＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７（１８．８ｋＤａ）の断片が培養液中に排出された。
したがって、本発明は、ジスルフィド結合を含有する、不溶性（例えば、エタネルセプト、ｈＧＨおよび抗体複合体）、または毒性（例えば、ＤＮａｓｅ）を有するタンパク質の発現およびコンパートメント化のために、内部膜結合構造を含有する組換えタンパク質を生成するための魅力的な方法を提供する。しかしながら、ＶＮｐ－ＬＺ二量体カーゴ融合体をＶＮｐ－ＬＺペプチドと共発現させると（細胞外小胞の生産量を増やすため）、コンパートメント内部に結合したタンパク質が、培地から分離された可溶性カーゴパッケージ小胞として、排出ルートに再方向付けされ（表２）、これらのタンパク質の特定の下流プロセスを促進した。このように、ＶＮｐシステムは、融合タンパク質を培地から即座に単離することをサポートするだけでなく、複合体合成のための酵素カスケードの生成や、合成生物学の他の側面など、特定の分野において有利とな、代替的な内部発現システムを提供する
したがって、本発明は、ジスルフィド結合を含有する、不溶性（例えば、エタネルセプト、ｈＧＨおよび抗体複合体）、または毒性（例えば、ＤＮａｓｅ）を有するタンパク質の発現およびコンパートメント化のために、内部膜結合構造を含有する組換えタンパク質を生成するための魅力的な方法を提供する。しかしながら、ＶＮｐ－ＬＺ二量体カーゴ融合体をＶＮｐ－ＬＺペプチドと共発現させると（細胞外小胞の生産量を増やすため）、コンパートメント内部に結合したタンパク質が、培地から分離された可溶性カーゴパッケージ小胞として、排出ルートに再方向付けされ（表２）、これらのタンパク質の特定の下流プロセスを促進した。このように、ＶＮｐシステムは、融合タンパク質を培地から即座に単離することをサポートするだけでなく、複合体合成のための酵素カスケードの生成や、合成生物学の他の側面など、特定の分野において有利とな、代替的な内部発現システムを提供する
【0115】
続いて、脂質相互作用を調節するためにＶＮｐタンパク質に単純な修飾を加えるだけで、排出タンパク質の収量が向上するかどうかを確認するための調査を行った。一連のＶＮｐ変異体を試験し、ヘリックス表面に沿って標的残基の電荷と側鎖の長さを変更することで、広い培養温度範囲で小胞排出が促進されるだけでなく（例えばＶＮｐ６）、ＶＮｐのサイズを９残基の長さまで縮小できることがわかった（例えばＶＮｐ２６）（表２）。
【0116】
ＶＮｐが膜動態に影響を与えることと一致し、ＶＮｐ２の場合、細胞を高温で培養すると最適な小胞生成が観察された（表２および表４参照）。しかしながら、ＶＮｐ６の変異体は、広い培養温度範囲（２５℃～３７℃）で高い効率で小胞生成を誘導した。
表４：２５℃、３０℃および３７℃のＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合体の収量
表４：２５℃、３０℃および３７℃のＶＮｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合体の収量
【表4】
【0117】
酸素濃度の影響も調べた。細胞は、同じ体積の培地中で、フラスコのサイズを大きくし（したがって表面積を大きくする）、±パラフィルム（±嫌気性）、±バッフル（培養の攪拌性を高める）を用いて培養した。図１６に示され、表５に示されているように、表面積：容積比の増加は、小胞にパッケージされたタンパク質の排出に直接影響することがわかった。パラフィルム（登録商標）の添加（すなわち嫌気条件）は、小胞形成に劇的な悪影響を及ぼし、撹拌はわずかではあるが有意な悪影響を及ぼした。
【0118】
表５：細胞外小胞形成は細胞培養酸素供給を必要とする。
【表5-1】
【表5-2】
【0119】
本発明者らはまた、本明細書に記載のＶＮｐ技術を、表面積：容積比を維持するために５Ｌフラスコで培養する場合、１Ｌ容量の振盪フラスコ培養量に適用できることを確立した（図８および表６参照）。
【0120】
表６：様々な培養量とフラスコサイズにおける排出したＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの収量。
【表6】
【0121】
小胞形成に最適な条件を特定するためには、発現されるカーゴに応じて発現レベルを調節する必要があることが理解される。ＶＮｐが膜の動態に影響を与えることと一致し、最適な小胞の生成は、膜がより動的である高温で細胞を培養したときに観察された。しかしながら、ｐＵＣ１９またはｐＢＲ３２２ベースの誘導体を含む様々なプラスミドにおいて、様々なプロモーター（例えばＴ７、ラムノース、アラビノース、Ｔａｃ）から発現を支持することができるので、特定の発現レベルを様々な発現系で容易に試験することができる。
【0122】
図１５は、ＶＮｐ２－ＤＡＲＰコンストラクトが２０Ｌの発酵槽／バイオリアクターでタンパク質の排出に成功したことを示している。タンパク質は細胞ペレットと上清の両方に見られ、上清に最も高濃度のタンパク質が認められた。
【0123】
実験により、組換え小胞とその中の融合タンパク質は、４℃で保存した場合に安定であることが確認された（図１７参照）。動的光散乱（ＤＬＳ）により、溶液中に異なる強度分布の極大値を持つ２つの種が存在することが確認された。１つ目は流体力学的直径１６６ｎｍを示し、単離された小胞に起因し、ＥＭ画像に存在する種と相関する。２つ目は流体力学的直径～１０ｎｍを示し、小胞の断片に起因する。各サンプルの平均多分散性指数は１以上であり、培地中に幅広いサイズ分布を持つ小胞を示した。小胞の平均流体力学的直径は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４℃で６ヶ月間保存した後も変化しなかった（流体力学的直径＝１６９ｎｍ）。さらに、日齢の小胞（－１０．５ｍＶ）のゼータ電位（ピーク最大値から算出）には、４ヶ月齢の小胞（－１１．１ｍＶ）と比べて有意な差はなく、小胞に含まれるＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの３ヶ月間の観察可能な有意な損失もなかった。したがって、単離された小胞は、可溶性組換えタンパク質の効果的な長期タンパク質保存に安定した環境を提供する。小胞から単離されたＶＮｐ－ウリカーゼは、細胞ペレットから精製されたウリカーゼと同程度に酵素活性を示しただけでなく、この活性は、単離された小胞内で４℃で２ヶ月間保存されたＶＮｐ－ウリカーゼが、同じ期間バッファー中で４℃で保存された精製タンパク質と比較して、より高い程度に維持され（図１７）、小胞がそれらのタンパク質カーゴを提供する安定した環境を強調する。
【0124】
ＶＮｐ配列は、培養中の哺乳類細胞発現系から細胞外ＶＮｐ融合体含有小胞の形成を誘導するために用いることができる（図１８参照）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターのいずれかの制御下にあるＶＮｐ２－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎおよびＶＮｐ６発現構築物で一過性に形質転換した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００媒介トランスフェクション）。発現と相対的誘導レベルはウェスタンブロットで確認した（図１８Ａ）。ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中でカバースリップ上で増殖させた。細胞を広視野顕微鏡で撮像し、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ発現を可視化した。図１８の矢印は、ＶＮｐ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを含む組換え小胞を強調している。ＳＶ４０プロモーターの制御下でＶＮｐ６－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを発現させると、ＣＨＯ－Ｓ細胞で同様の結果が観察された。
【0125】
本発明者らはまた、ＶＮｐタグ技術が、嫌気性条件下で培養した大腸菌の組換えタンパク質発現を劇的に促進することを立証した。ＶＮｐ配列とｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎまたはＤＡＲＰｉｎｏｆｆ７との間のＶＮｐ融合体の細胞質コンパートメント化を促進する条件が特定された。図１９は、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎおよびＳｔｅｆｉｎＡ単独、またはＶＮｐと融合した発現コンストラクトを含む細胞からの発現プロフィールのゲルを示しており、いずれの場合も、ＶＮｐの添加により、嫌気性増殖条件下で培養した細胞でこれらの組換えタンパク質の発現が促進されることを示している。
考察
考察
【0126】
実証されているように、本明細書に記載されている単純なペプチド融合は、大腸菌からの広範な組換えタンパク質の収量を増加させ、下流の処理を単純化する。重要なことは、不溶性または有毒なタンパク質をミリグラムまたはグラム単位で単離することが容易であることから、この方法は、目的の組換えタンパク質を発現させるための魅力的な出発点であるということである。この生産システムの非常に魅力的な点は、小胞を４℃に維持したときのタンパク質の安定性と酵素活性の維持である。その結果、この汎用性の高いシステムは、高スループット発現スクリーニング、タンパク質の貯蔵、組換えバイオリアクターの作製、生体分子の環境分散、マイクロ小胞治療、ワクチンと並ぶナノボディ生産、およびウイルス療法の送達など、幅広い下流プロセスおよび応用に適している。
【0127】
最初の研究では、ヒト神経細胞の必須タンパク質であるα－シヌクレイン（αＳｙｎ）のアミノ末端アセチル化の影響が（Ｍａｌｔｓｅｖ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１，５００４－５０１３）大腸菌で観察された。その結果、オリゴマー化状態の違いを細菌細胞内で追跡できることが発見された（Ｅａｓｔｗｏｏｄ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０６，８１５７－９）のに加えて、大腸菌膜から形成される大量の細胞外小胞の形成をもたらした（未発表）。蛍光イメージングにより、膜に結合したαＳｙｎが臨界レベルに達すると、菌体膜の外向きの湾曲が誘導され、αＳｙｎ－蛍光タンパク質融合体を含む細胞外小胞（天然の外膜小胞よりかなり大きい）が形成されることが明らかになった。
【0128】
ＶＮｐ誘導小胞形成には、小胞形成を促進する臨界濃度のＶＮｐ融合タンパク質が必要である。小胞核形成ペプチドは細胞膜と相互作用し、４時間以降、ＶＮｐの発現（細胞質ＶＮｐ濃度は通常１８．８±０．１４μＭ）は菌膜の局所的な湾曲を誘導し、それは明瞭な小胞が形成されるまで外側に広がり、膜が切断されると増殖培地中に放出された。目的のタンパク質を発現させると、細胞に対して毒性を示したり、細胞膜と相互作用したり、中程度の細胞質濃度でも正しく折り畳まれなかったりすることがある。そこで、二量体化ロイシンジッパー（ＬＺ）ペプチドをＶＮｐと目的のタンパク質配列の間に導入した。その結果、このコンストラクトを単独で、あるいは追加のＶＮｐ－ＬＺペプチドと一緒に発現させると、通常では発現が困難なタンパク質のパッケージングと排出が促進されることが示された（例として、エタネルセプトとｈＧＨが挙げられる）。
【0129】
さらに、ＶＮｐの細菌細胞内での生体内アミノ末端アセチル化（Ｅａｓｔｗｏｏｄ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０６，８１５７－９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ１５８０１参照）は、細菌の細胞質内で内在化したＶＮｐ－融合小胞構造の形成を促進し、目的のタンパク質の発現を改善した。
【0130】
これらの最初の観察から、大腸菌細胞内でαＳｙｎとヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の融合体を発現させると、振盪フラスコと市販のバイオリアクター細胞培養システムの両方で、αＳｙｎ－ｈＧＨを含む小胞が培養液中に放出されることが確立された。このことから、目的の組換えタンパク質を含む小胞が増殖培地中に放出され、目的のタンパク質の下流での精製やプロセシングが容易になることが示された。
【0131】
１５ｋＤａ（１４０アミノ酸）のαＳｙｎタンパク質全体ではなく、αＳｙｎの特定の領域が小胞形成をもたらすかどうかを確かめるための調査が行われた。その結果、αＳｙｎのアミノ末端から３８アミノ酸の短い両親媒性αヘリカルポリペプチドが、細胞膜と相互作用して小胞構造の形成を促進するのに十分であることがわかった。その後、この３８アミノ酸の小胞核形成ポリペプチド（ＶＮｐ）が大腸菌細胞膜の内側と相互作用し、膜の形状に影響を与えることがわかった。分光法、ＥＭ、ＤＬＳ、質量分析、生細胞イメージングのデータから、ＶＮｐ－蛍光タンパク質（ＦＰ）融合体の発現により、ＶＮｐ－ＦＰを含む小胞の培地への排出が誘導されることが確認された。これらの現象は、ＶＮｐアミノ末端融合を欠くＦＰを単独で発現させた場合には観察されなかった。
【0132】
その後、他のシヌクレインタンパク質の同等ポリペプチドを用いて、同等レベルの蛍光ＶＮｐ－ＦＰ含有小胞を生成できることがわかった。現在進行中の系統的な生体外での分子進化アプローチ（γ－シヌクレインの最初の３８アミノ酸を出発点として使用）において、天然のペプチド配列と比較して、小胞にパッケージされたＶＮｐ融合体の大腸菌細胞からの排出を有意に促進する（そして減少させる）より多くの修飾ＶＮｐ配列が同定された。表７は、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（ｍＮＧ）の排出に対する変異体と各配列の効果をまとめたものである。
表７：
表７：
【表7-1】
【表7-2】
【0133】
ＶＮｐ６の短いバージョンは特にうまく機能し、組換えタンパク質の９５％が培地中に排出されることがわかる。ＶＮｐのαヘリカル構造は、特定の脂質との相互作用によって強化され、ＶＮｐは細菌内膜と相互作用し、目的のタンパク質の発現と宿主細胞から培地への排出を可能にする。
【0134】
ＶＮｐ配列そのものを最適化するだけでなく、膜パッケージ化標的タンパク質の産生に最適な条件を特定するために、様々な大腸菌株および培養条件を試験し、比較した。Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）のような標準的な大腸菌培養培地、特にＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）のようなリッチな培地はすべてうまく機能するようで、ＴＢで培養した場合、ＬＢに比べて約４倍多くのＶＮｐ融合タンパク質が放出された。培地中で生産された組換えタンパク質全体が多かっただけでなく、そのより高い割合がＴＢでは培地中に放出された。対照的に、最小／複合培地で細胞を培養した場合、ＶＮｐ誘導小胞パッケージは得られたが、それは有意に低いレベルであった。
クエン酸のようないくつかの特定の培地成分は放出に影響を与え、減少させ、または阻害することが見出されたが、リン酸イオン濃度のような他のものは小胞放出に影響を与えなかった。いくつかの実施形態では、以下の１つ以上、好ましくはすべてが有利であることが見出されている：
・４ｇ／ｌ未満の最終Ｋ２ＳＯ４濃度；
・１０ｍＭ未満の最終ＭｇＳＯ４濃度；
・０．０３ｇ／ｌ未満の最終ＣａＣｌ２濃度；
・最大５ｇ／ｌのＮａＣｌ濃度；
・０．０４％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール濃度；および
クエン酸のようないくつかの特定の培地成分は放出に影響を与え、減少させ、または阻害することが見出されたが、リン酸イオン濃度のような他のものは小胞放出に影響を与えなかった。いくつかの実施形態では、以下の１つ以上、好ましくはすべてが有利であることが見出されている：
・４ｇ／ｌ未満の最終Ｋ２ＳＯ４濃度；
・１０ｍＭ未満の最終ＭｇＳＯ４濃度；
・０．０３ｇ／ｌ未満の最終ＣａＣｌ２濃度；
・最大５ｇ／ｌのＮａＣｌ濃度；
・０．０４％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール濃度；および
【0135】
・最大１ｍＭ（好ましくは最大０．１ｍＭ）の最終ソルビトール濃度。
【0136】
細胞培養温度もまた、特定のＶＮｐ変異体に依存した排出の効率に影響を与え得る。例えば、配列番号２は温度依存性であり、３７℃でより良好に放出される。一方、いくつかの実施形態では、ＶＮｐ６およびＶＮｐ１５変異体について、細胞を２５℃から３７℃の範囲で培養すると、小胞にパッケージされたタンパク質の排出が改善される。
【0137】
また、呼吸／代謝を最大にするために酸素濃度を高くすると、小胞にパッケージされたタンパク質の培地中への放出に大きな好影響を与えることもわかった。
【0138】
この実験から、ＶＮｐ融合タンパク質の発現レベルが、最適な小胞放出を確保するために重要であることが示された。核となるＶＮｐ構築物について、様々な誘導レベルでの細胞生存率、標的タンパク質の発現および排出を調べ、比較した。最良の収量が得られたのは、細胞増殖に検出可能な程度の影響しか与えないレベルで発現を誘導することで、ＶＮｐによる細菌の細胞膜への全体的なストレスおよび生存率に対して、小胞産生のバランスをとったものであった。ＶＮｐ融合体の合計収量は、誘導率が高くなると著しく低下するだけでなく、生産された標的タンパク質のうち培地中に排出される割合も低下した。ＶＮｐ配列番号２融合体の場合、大部分のタンパク質に最適な誘導は２０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧと特定された。しかし、いくつかの有毒な標的タンパク質の最適収量は、１０～１５μｇ／ｍｌのＩＰＴＧで達成された（例えば、エタネルセプト、ｈＧＨ）。
【0139】
ＶＮｐ融合体の発現は、プロモーターおよび／またはインデューサーを調節することで制御した（例えば、Ｔ７プロモーター発現は１０～１００μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを用いて制御；ラムノースプロモーター発現は０．００１％～０．２％（最終Ｗ／Ｖ）のラムノースを培地に添加することで制御）。当然のことながら、発現レベルが高すぎると、過剰な膜破壊（増殖曲線、死細胞の顕微鏡同定、および／またはＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって観察される溶解した死細胞から培地中に放出された追加タンパク質の出現から判断される）が起こり、一過性の高レベルの小胞産生につながるが、これが細胞膜に与える影響により、細胞が破裂し、培養の衰退期が始まる。対照的に、ＶＮｐ融合体の発現が低すぎると（すなわち、≦２μｇ／ｍｌＩＰＴＧ）、ＶＮｐが十分に細胞膜と相互作用できず、小胞が形成されなかった。新しいＶＮｐ融合体の出発点として、Ｔ７プロモーターのＩＰＴＧ誘導で許容される最大発現量の約５～１０倍低い発現量を用いた。
【0140】
タンパク質を小胞にターゲティングするための様々な戦略や試薬が評価された。これには、標的タンパク質をＶＮｐ誘導小胞に送達する方法の比較も含まれ、ＶＮｐとの直接融合（上記のＶＮｐ－ＦＰ融合体について説明したように）、ＶＮｐと目的の細胞質組換えタンパク質の共発現、ＶＮｐと膜標的組換えタンパク質の共発現、さらにオプトジェネティクス・アプローチ（特定の波長の光に反応してＶＮｐと標的タンパク質の相互作用を誘導する）が含まれる：
－ 標的タンパク質と細菌の膜タンパク質（ＯｍｐＡ、ＣｙｄＡＢ、ＭｉｎＤ）との融合体が作製された。しかし、この方法は直接融合ほど効率的ではなく、膜タンパク質は大きく、膜タンパク質－標的タンパク質融合体の過剰発現は細胞の生存能力を破壊する可能性があった。
－ 標的タンパク質の過剰発現（すなわち細胞質局在化）により、小胞に取り込まれる割合が増加した。しかしながら、これは直接融合に比べて全く効率的ではなかった。また、ＶＮｐによる、発現が困難な、または毒性のある標的タンパク質を用いた増殖促進効果は見られなかった。
－ オプトジェネティクスは、上記のいずれよりも効率的に機能した。しかし、オプトジェネティクスのタグは大きく、標的タンパク質の相対収量は大幅に減少した。
－ 標的タンパク質と細菌の膜タンパク質（ＯｍｐＡ、ＣｙｄＡＢ、ＭｉｎＤ）との融合体が作製された。しかし、この方法は直接融合ほど効率的ではなく、膜タンパク質は大きく、膜タンパク質－標的タンパク質融合体の過剰発現は細胞の生存能力を破壊する可能性があった。
－ 標的タンパク質の過剰発現（すなわち細胞質局在化）により、小胞に取り込まれる割合が増加した。しかしながら、これは直接融合に比べて全く効率的ではなかった。また、ＶＮｐによる、発現が困難な、または毒性のある標的タンパク質を用いた増殖促進効果は見られなかった。
－ オプトジェネティクスは、上記のいずれよりも効率的に機能した。しかし、オプトジェネティクスのタグは大きく、標的タンパク質の相対収量は大幅に減少した。
【0141】
上記のいずれも、ＶＮｐと目的のタンパク質との直接融合ほど効率的ではなかった。この直接融合はタンパク質を小胞に標的化するだけでなく、折り畳みとタンパク質の収量を向上させ、細菌の細胞質から除去されるため、有毒タンパク質の発現を可能にした。
【0142】
ＶＮｐとカーゴ分子の間にタンパク質分解切断（ＴＥＶ）部位を導入することで、小胞からタグのない、標識されていない目的のタンパク質を精製できるようにした。実験の結果、ＶＮｐタグを除去してもエタネルセプトは可溶性のままであることが示された。
【0143】
短いＶＮｐ配列を用い、最適化された条件下では、蛍光タンパク質カーゴのかなりの割合が培地中に排出されただけでなく、アミノ末端ＶＮｐ融合体を欠く同等のタンパク質（すなわち、細胞中の収量のみで）と比較して、培養中の標的タンパク質の全体的な収量（すなわち、細胞中と培地への放出の両方）も有意に改善された（表２）。試験した全てのＶＮｐ配列は排出を促進し、排出されたタンパク質の割合は配列番号１０の方が大きかった。
【0144】
最適な増殖条件（ＴＢ培地、３７℃、良好な酸素供給、１０～２０（通常２０）μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（カーゴによる））では、カーゴ含有小胞は、その形成開始から１０分以内に細菌細胞から放出された。したがって、連続培養から比較的短時間で大量のカーゴ含有小胞を放出できる可能性がある。遠心分離による精製戦略は、培養から培地だけでなく、かなりの数の細胞を採取する必要があり、時間がかかり、多くの人手を必要とする。簡単な細胞濾過プロトコールが開発され、細胞培養の一部を除去し（そして新鮮な培地と交換する）、０．４５μｍのフィルターを通すことで、小胞を含む培地から細胞を分離することができる（上記の「方法」を参照）。試験したすべての実験から、１ｍｌの小胞含有培地濾液中にコロニー形成単位は検出されなかった。このように、この方法はシンプルで効率的、自動化可能なハイスループット精製法を提供する。
【0145】
この方法で培地中に単離されたＶＮｐ誘導小胞およびパッケージ化タンパク質は、４℃で数ヶ月間安定であった。小胞から単離されたＶＮｐ－ウリカーゼは、細胞ペレットから精製されたウリカーゼと同程度に酵素活性があるだけでなく、この活性は、同じ期間、同じ条件で保存された精製タンパク質と比較すると、４℃で２ヶ月間保存された単離小胞内のＶＮｐ－ウリカーゼによってより高い程度に維持された（図１２ｄ参照）。この結果からも、小胞がそのタンパク質カーゴに安定した環境を与えていることがわかる。
【0146】
本発明のＶＮｐ依存標的化排出技術は、生物物理学的特性や機能が異なる、バイオ産業関連の様々なタンパク質を用いて試験された。これらのタンパク質の大きさは、１０アミノ酸未満からほぼ１００ｋＤａのものまで様々である。）ＶＮｐと目的のタンパク質を直接融合させ、上記の条件で細胞を培養した。検討された各タンパク質について、ＶＮｐ融合は、カーゴのかなりの割合が培養液中に排出されただけでなく、各ターゲットタンパク質の可溶型の全体収量が著しく向上した（表２）。いくつかのタンパク質の機能性（例えばＦＰの蛍光、ウリカーゼの酵素活性、エタネルセプトのプロテインＡ結合能）を試験したところ、それぞれ測定可能な活性が期待された。
【0147】
ＶＮｐ技術は、異なるタイプのプロモーター（ＣＭＶ、ラムノース、アラビノース、Ｔａｃ、異なる強度のＴ７プロモーターなど）やバックボーンプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２ベースなど）で機能することが確認されたほか、さまざまな大腸菌株（ＢＬ２１ＤＥ３、Ｗ３１１０＋－ＤＥ３、Ｋ１２、ＤＨ１０ｂ、ＪＭ１０９など）を用いて検証された。
【0148】
最後に、小胞排出システムのスケールアップも成功裏に実証され、この技術が工業規模のタンパク質製造に適していることが示唆された。
【0149】
結論として、本発明は、単純なペプチド融合を用いて、大腸菌からの広範な組換えタンパク質の収量を増加させ、下流処理を簡略化する技術を提供する。これは、活性培養中の連続的なタンパク質精製を可能にし、また、大腸菌からの広範な組換えタンパク質の簡略化されたタンパク質単離および下流処理（すなわち、細胞を破壊する必要がない）を可能にする。その結果、このシステムは、組換えタンパク質の生産とその後の処理を強化するために、膜にパッケージされた組換えタンパク質を培地に放出するためのシンプルで魅力的なメカニズムを提供する。
【0150】
重要なことは、不溶性または有毒なタンパク質をミリグラムまたはグラム単位で容易に単離できることから、この方法は、目的のいずれの組換えタンパク質を発現させるための魅力的な出発点であるということである。この生産システムの非常に魅力的な点は、小胞を４℃に維持したときのタンパク質の安定性と酵素活性の保持である。この技術はまた、高スループット発現スクリーニング、タンパク質保存、組換えバイオリアクターの作製、生体分子の環境分散、マイクロ小胞治療、ワクチンと並ぶナノボディ生産、およびウイルス療法送達など、幅広い下流プロセスおよび応用に適している。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図12e】
【図12f】
【図13】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図14e】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】