特表 2025-500944 ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化合物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-15

(54)【発明の名称】ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化合物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20250107BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20250107BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250107BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

A61K51/10 100

A61K51/10 200

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537033

(86)(22)【出願日】2022-12-20

(85)【翻訳文提出日】2024-08-08

(86)【国際出願番号】 US2022082021

(87)【国際公開番号】W WO2023122588

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/291,910

(32)【優先日】2021-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524230859

【氏名又は名称】フュージョン・ファーマシューティカル・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．

(71)【出願人】

【識別番号】300022113

【氏名又は名称】アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ

【住所又は居所原語表記】１ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃｒｉｃｋ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｍｐｕｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ２ ０ＡＡ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】アゲブリアン，サダフ

(72)【発明者】

【氏名】グリンシュタイン，ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ダフィ，イアン アール

(72)【発明者】

【氏名】コステルニク，トーマス アイ

(72)【発明者】

【氏名】ブキャナン，アンドリュー グライアー

(72)【発明者】

【氏名】メイザー，ヤリブ

(72)【発明者】

【氏名】カストゥリランガン，スリナト

(72)【発明者】

【氏名】ドゥ，チュン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，チュンニン

(72)【発明者】

【氏名】コマー，フランク アーバイン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA12

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085HH03

4C085JJ02

4C085KA09

4C085KA29

4C085KB12

4C085KB15

4C085KB56

4C085KB82

4C085LL18

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA52

4H045BA71

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

(57)【要約】

キレート部分又はその金属錯体、リンカー、並びにＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方を標的とする抗体又はその抗原結合断片を含む化合物、例えば、放射性免疫抱合体。そのような化合物の医薬組成物、及びそのような化合物又は医薬組成物を使用した、病状、例えば、癌の治療方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉの構造を含む化合物、又はその薬学的に許容できる塩：
Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ
式Ｉ
（式中、
Ａは、キレート部分又はその金属錯体であり；
Ｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
Ｌ^１は、結合、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり；
ｎは、１～５の整数（両端を含む）であり；
Ｌ^２は、それぞれ独立して式ＩＩ：
－Ｘ^１－Ｌ^３－Ｚ^１－
式ＩＩ
（式中、
Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－＊、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－、－ＣＨ_２－Ｐｈ－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－ＣＨ_２－Ｐｈ－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－Ｏ－、又は－ＮＲ^１－であり、式中、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり；
Ｌ^３は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０アルキル又は任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキルであり、
Ｚ^１は、－ＣＨ_２－＃、－Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｓ）－＃、－ＯＣ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＃、－ＮＲ^２Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２－＃、又は－ＮＲ^２－＃であり、式中、「＃」は、Ｂへの接続点を示し、Ｒ^２は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである）の構造を有し、
前記抗体又はその抗原結合断片は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することが可能な第１の抗原結合ドメイン；及びｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、
ｉ：以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント；並びに
ｉｉ：以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアントを含む）。

【請求項2】

前記キレート部分が、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＯＴＭＡ（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）－α、α’、α”、α’”－テトラメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン）、ＤＯＴＰＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラプロピオン酸）、ＤＯ３ＡＭ－酢酸（２－（４，７，１０－トリス（２－アミノ－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）酢酸）、ＤＯＴＡ－ＧＡ無水物（２，２’，２”－（１０－（２，６－ジオキソテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３－イル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸、ＤＯＴＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンホスホン酸））、ＤＯＴＭＰ（１，４，６，１０－テトラアザシクロデカン－１，４，７，１０－テトラメチレンホスホン酸、ＤＯＴＡ－４ＡＭＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（アセトアミドメチレンホスホン酸）、ＣＢ－ＴＥ２Ａ（１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン－４，１１－二酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、ＮＯＴＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ（メチレンホスホン酸）、ＴＥＴＰＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－テトラプロピオン酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－テトラ酢酸）、ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアザシクロヘキサデカン－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサ酢酸）、ＰＥＰＡ（１，４，７，１０，１３－ペンタアザシクロペンタデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’’－ペンタ酢酸）、Ｈ_４ｏｃｔａｐａ（Ｎ，Ｎ’－ビス（６－カルボキシ－２－ピリジルメチル）－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸）、Ｈ_２ｄｅｄｐａ（１，２－［［６－（カルボキシ）－ピリジン－２－イル］－メチルアミノ］エタン）、Ｈ_６ｐｈｏｓｐａ（Ｎ，Ｎ’－（メチレンホスホネート）－Ｎ，Ｎ’－［６－（メトキシカルボニル）ピリジン－２－イル］－メチル－１，２－ジアミノエタン）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸）、ＤＯ２Ｐ（テトラアザシクロドデカンジメタンホスホン酸）、ＨＰ－ＤＯ３Ａ（ヒドロキシプロピルテトラアザシクロドデカン三酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、デフェロキサミン、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＴＰＡ－ＢＭＡ（ジエチレントリアミン五酢酸－ビスメチルアミド）、及びポルフィリンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記化合物が、式Ｉ－ａ：

【化1】

（式中、Ｙ^１は、－ＣＨ_２ＯＣＨ_２（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ、－Ｃ（Ｏ）（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ、又は－Ｃ（Ｓ）（Ｌ^２）_ｎ－Ｂであり、Ｙ^２は、－ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈであるか；又は
Ｙ^１は、Ｈであり、Ｙ^２は、Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂである）によって表されるか、又はその金属錯体である、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｌ^１が、

【化2】

（式中、Ｒ^Ｌは、水素又は－ＣＯ_２Ｈである）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

前記金属錯体が、Ｂｉ、Ｐｂ、Ｙ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｕ、Ｒｅ、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択される金属を含み、前記金属錯体が、^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８７Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ｉｎ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^２２７Ｔｈ、及び^２２９Ｔｈからなる群から選択される放射性核種を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項6】

Ｙ^１がＨである、請求項３～５のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｘ^１が－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊又は－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊であり、「＊」がＬ^３への接続点を示し、Ｒ^１がＨである、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項8】

Ｚ^１が－ＣＨ_２－である、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

ｎが１であり、Ｌ^３が（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２－２０を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

ｎが１であり、Ｌ^３が（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｗであり、式中、ｍ及びｗは、それぞれ独立して０～１０の整数（両端を含む）であり、ｍ及びｗの少なくとも１つは０でない、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項11】

前記化合物が、以下の構造：

【化3】

のうちの１つ、又はその金属錯体を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項12】

前記化合物が、以下の構造：

【化4】

、又はその金属錯体を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項13】

Ａがキレート部分の金属錯体であり、前記金属錯体が放射性核種を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項14】

前記放射性核種が、^６８Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、又は^２２５Ａｃである、請求項１３に記載の化合物。

【請求項15】

前記放射性核種が、^２２５Ａｃである、請求項１３に記載の化合物。

【請求項16】

前記放射性核種が、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ）、ラジウム－２２３（^２２３Ｒａ）、鉛－２１２（^２１２Ｐｂ）、トリウム－２２７（^２２７Ｔｈ）、及びテルビウム－１４９（^１４９Ｔｂ）、又はそれらの子孫からなる群から選択されるアルファ放射体である、請求項１３に記載の化合物。

【請求項17】

前記アルファ放射体が、^２２５Ａｃ又はその子孫である、請求項１６に記載の化合物。

【請求項18】

前記第１の抗原結合ドメインが、
ｉ：以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ：以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項19】

前記第１の抗原結合ドメインが、抗体ＱＤ６の前記重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列（それぞれ配列番号４７及び４８に記載）を含む抗原結合ドメインがヒトＥＧＦＲに結合することが可能な親和性よりも低い親和性で、ヒトＥＧＦＲに結合することが可能である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項20】

前記第１の抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ．配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項21】

前記第２の抗原結合ドメインが、以下：
ｉ：以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント；並びに
ｉｉ：以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント
を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項22】

前記第２の抗原結合ドメインが、
ｉ：以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ：以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む、請求項２１に記載の化合物。

【請求項23】

前記第２の抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ．配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、請求項２１又は２２に記載の化合物。

【請求項24】

前記抗体又はその抗原結合断片が、
ａ．第１の抗原結合ドメインのＶＨ領域と、第１の重鎖定常（ＣＨ）領域又はその断片とを含む、第１の重鎖；
ｂ．第１の抗原結合ドメインのＶＬ領域と、第１の軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片とを含む、第１の軽鎖；
ｃ．第２の抗原結合ドメインのＶＨ領域と、第２の重鎖定常（ＣＨ）領域又はその断片とを含む、第２の重鎖；及び
ｄ．第２の抗原結合ドメインのＶＬ領域と、第２の軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片とを含む、第２の軽鎖
を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項25】

前記第１及び第２のＣＨ領域が、それぞれ配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の化合物。

【請求項26】

前記第１及び第２の重鎖が、ヘテロ二量体を形成し、任意選択的に、前記第１及び第２の重鎖の一方が、位置３５４にシステイン（Ｃ）残基、位置３６６にトリプトファン（Ｗ）残基を含み、他方の重鎖が、位置３４９にシステイン（Ｃ）残基、位置４０７にバリン（Ｖ）残基、位置３６６にセリン（Ｓ）、及び位置３６８にアラニン（Ａ）を含み、前記定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う、請求項２４又は２５に記載の化合物。

【請求項27】

前記抗体又はその抗原結合断片が、
ａ．天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、改変ＣＨ領域；及び
ｂ．改変ＣＬが天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、対応する改変ＣＬ領域
を含み、
ｉ：第１の重鎖は改変ＣＨ領域を含み、第１の軽鎖は対応する改変ＣＬ領域を含むか；又は
ｉｉ：第２の重鎖は改変ＣＨ領域を含み、第２の軽鎖は対応する改変ＣＬ領域を含み、
改変ＣＨ領域の置換システインと、対応する改変軽鎖の置換システインとは、ジスルフィド結合を形成することができる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項28】

前記改変ＣＨ領域が、位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み；前記対応する改変ＣＬ領域が、位置１２１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、前記定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う、請求項２７に記載の化合物。

【請求項29】

前記第１及び／又は第２のＣＨ領域が、前記抗体又はその抗原結合断片の、１つ以上のＦｃγ受容体への結合を低減又は抑制する変異を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項30】

前記第１及び／又は第２のＣＨ領域が、位置２３４にフェニルアラニン、位置２３５にグルタミン酸、及び位置３３１にセリンを含み、定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項31】

ａ．前記第１のＣＨ領域が、配列番号３９に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｂ．前記第２のＣＨ領域が、配列番号４０に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｃ．前記第１のＣＬ領域が、配列番号４１に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｄ．前記第２のＣＬ領域が、配列番号３４に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項32】

前記抗体又はその抗原結合断片が、
ａ．配列番号３５に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１の重鎖；
ｂ．配列番号３６に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２の重鎖；
ｃ．配列番号３７に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖；及び
ｄ．配列番号３８に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖
を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項33】

ａ．前記第１の重鎖が、配列番号３５に記載される配列を有するアミノ酸配列を含み；
ｂ．前記第２の重鎖が、配列番号３６に記載される配列を有するアミノ酸配列を含み；
ｃ．前記第１の軽鎖が、配列番号３７に記載される配列を有するアミノ酸配列を含み；
ｄ．前記第２の軽鎖が、配列番号３８に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の化合物。

【請求項34】

ａ．ＥＧＦＲに結合することが可能な前記第１の抗原結合ドメインが、カニクイザルＥＧＦＲに結合することが可能であり；
ｂ．ＥＧＦＲに結合することが可能な前記第１の抗原結合ドメインが、マウスＥＧＦＲに結合することが可能であり；
ｃ．ｃＭＥＴに結合することが可能な前記第２の抗原結合ドメインが、カニクイザルｃＭＥＴに結合することが可能であり；
ｄ．前記第１の抗原結合ドメインが、ＥＧＦＲに特異的であり；
ｅ．前記第２の抗原結合ドメインが、ｃＭＥＴに特異的であり；
ｆ．前記抗体又はその抗原結合断片が、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに同時に会合することが可能であり；
ｇ．前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞内に内在化することが可能であり；
ｈ．前記抗体又はその抗原結合断片が、インビトロ細胞生存率アッセイで測定した場合に細胞傷害活性を有し；且つ／又は
ｉ．前記抗体又はその抗原結合断片が、ＥＧＦＲ及び／又はｃＭＥＴのリガンド依存性シグナル伝達を遮断することが可能である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項35】

（ａ）前記第１の抗原結合ドメインが、
ｉ：以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ：以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含み；
（ｂ）第２の抗原結合ドメインが、
ｉ：以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ：以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項36】

前記第１の抗原結合ドメインが、以下：
ａ．１０～１００ｎＭ；
ｂ．２０～８０ｎＭ；
ｃ．３０～７５ｎＭ；又は
ｄ．３５～５０ｎＭ
のＫｄを有する親和性でヒトＥＧＦＲに結合することが可能である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項37】

前記第２の抗原結合ドメインが、以下：
ａ．１０ｎＭ未満；又は
ｂ．５ｎＭ未満
のＫｄを有する親和性でヒトｃＭＥＴに結合することが可能である、請求項１～３６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項38】

前記親和性が、表面プラズモン共鳴によって測定される、請求項１９、３６、及び３７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項39】

前記化合物が、以下の構造：

【化5】

（式中、

【化6】

は、請求項１に定義される抗体又はその抗原結合断片である）を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項40】

前記抗体又はその抗原結合断片が、リジン残基の側鎖アミノ基を介して、Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－に連結している、請求項３９に記載の化合物。

【請求項41】

請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項42】

癌を治療する方法であって、前記方法が、治療を必要とする対象に、請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物又は請求項４１に記載の組成物を治療有効量で投与することを含む、方法。

【請求項43】

前記癌が、副腎皮質癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜腺癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、唾液腺様嚢胞癌、精母細胞性セミノーマ、及びブドウ膜黒色腫からなる群から選択される固形腫瘍癌である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記癌が、肺癌、大腸癌、膵臓癌、又は頭頚部癌である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

抗増殖剤、放射線増感剤、又は免疫変調剤を投与することをさらに含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

癌の治療方法における使用のための、請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項４１に記載の医薬組成物。

【請求項47】

癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項４１に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は２０２１年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２９１，９１０号明細書に対する優先権を主張するものであり、その全内容はあらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、依然として世界中で癌関連死亡の主な原因となっている。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の開発により、進行性ＮＳＣＬＣの予後は特定の患者では大幅に改善されたが、長期生存する転移性ＮＳＣＬＣ患者は依然としてまれである。Ｌｉｎらによる最近の研究では、エルロチニブ又はゲフィチニブで治療したＥＧＦＲ変異転移性ＮＳＣＬＣを有する患者の５年生存率は、わずか１４．６％であることが示されている。抗ＥＧＦＲ ＴＫＩは耐性の影響を受けやすく、その根本的な耐性メカニズムはＥＧＦＲ変異及びｃＭＥＴ過剰発現の共存であることが長い間知られている。臨床試験されている有望なアプローチの１つは、非小細胞肺癌の治療について承認されているヒトＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ二重特異性抗体であるアミバンタマブである。ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴ受容体を標的とすることで、癌細胞に対する治療の特異性が高まる。

【0003】

一般的に、抗体の効力は、標的細胞の数に依存する。さらに、薬剤耐性は依然として標的癌治療が直面する大きな課題であり、新規耐性及び獲得耐性が標的治療の長期的有効性を制限している。耐性のメカニズムには、二次変異、発癌性下流シグナル伝達モジュールの活性化、リガンドの上方制御、代替成長因子受容体の増幅が含まれる。

【0004】

従って、上記の欠点なしにＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方を標的とすることができる改良された治療剤（例えば、癌治療剤）の必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方を標的とする化合物（例えば、放射性免疫抱合体）、その医薬組成物、及びそのような化合物又は医薬組成物を使用して癌を治療する方法に関する。ネイキッド抗体とは異なり、放射性免疫抱合体は治療効果を得るために受容体の機能を遮断する必要はなく、代わりに限られた範囲内の周囲の腫瘍細胞を標的とする放射性粒子（例えば、アルファ放射体）を放出し、それによりオフターゲットの関連毒性を防ぐ。ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴ過剰発現癌に使用されるＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、抗体誘発性の内在化を起こすＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ複合体の能力を利用して、標的化された放射性核種を癌細胞内に特異的に送達する。正常な健康組織／細胞上のいずれかの受容体への抗体の一価結合は、内在化を生じない。

【0006】

特定の実施形態では、提供される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、治療効果を維持しながら、現在公知のいくつかの放射線治療薬と比較して、排泄率（例えば、哺乳動物に投与後）の増加を示す。いくつかの実施形態では、より速い排泄は、化合物が対象内に留まる時間を制限することで、オフターゲット毒性を制限し得る。従って、いくつかの実施形態では、提供される化合物は、オフターゲット毒性が低減されていることを示す。

【0007】

一態様では、以下の構造、又はその薬学的に許容される塩を含む化合物が提供される：
Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ
式Ｉ
（式中、
Ａは、キレート部分又はその金属錯体であり；
Ｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
Ｌ^１は、結合、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり；
ｎは、１～５の整数（両端を含む）であり；
Ｌ^２は、それぞれ独立して式ＩＩ：
－Ｘ^１－Ｌ^３－Ｚ^１－
式ＩＩ
の構造を有し、式中、
Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－＊、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－、－ＣＨ_２－Ｐｈ－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－ＣＨ_２－Ｐｈ－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－Ｏ－、又は－ＮＲ^１－であり、式中、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり；
Ｌ^３は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０アルキル又は任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキルであり、
Ｚ^１は、－ＣＨ_２－＃、－Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｓ）－＃、－ＯＣ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＃、－ＮＲ^２Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２－＃、又は－ＮＲ^２－＃であり、式中、「＃」は、Ｂへの接続点を示し、Ｒ^２は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、
抗体又はその抗原結合断片は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することが可能な第１の抗原結合ドメイン；及びｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインを含み、
第１の抗原結合ドメインは、以下を含む：
ｉ．以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント；並びに
ｉｉ．以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント）。

【0008】

いくつかの実施形態では、式Ｉの可変部Ａは、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＯＴＭＡ（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）－α、α’、α”，α’”－テトラメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン）、ＤＯＴＰＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラプロピオン酸）、ＤＯ３ＡＭ－酢酸（２－（４，７，１０－トリス（２－アミノ－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）酢酸）、ＤＯＴＡ－ＧＡ無水物（２，２’，２”－（１０－（２，６－ジオキソテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３－イル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸、ＤＯＴＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンホスホン酸））、ＤＯＴＭＰ（１，４，６，１０－テトラアザシクロデカン－１，４，７，１０－テトラメチレンホスホン酸、ＤＯＴＡ－４ＡＭＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（アセトアミドメチレンホスホン酸）、ＣＢ－ＴＥ２Ａ（１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン－４，１１－二酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、ＮＯＴＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ（メチレンホスホン酸）、ＴＥＴＰＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－テトラプロピオン酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－テトラ酢酸）、ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアザシクロヘキサデカン－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサ酢酸）、ＰＥＰＡ（１，４，７，１０，１３－ペンタアザシクロペンタデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’’－ペンタ酢酸）、Ｈ_４ｏｃｔａｐａ（Ｎ，Ｎ’－ビス（６－カルボキシ－２－ピリジルメチル）－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸）、Ｈ_２ｄｅｄｐａ（１，２－［［６－（カルボキシ）－ピリジン－２－イル］－メチルアミノ］エタン）、Ｈ_６ｐｈｏｓｐａ（Ｎ，Ｎ’－（メチレンホスホネート）－Ｎ，Ｎ’－［６－（メトキシカルボニル）ピリジン－２－イル］－メチル－１，２－ジアミノエタン）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸）、ＤＯ２Ｐ（テトラアザシクロドデカンジメタンホスホン酸）、ＨＰ－ＤＯ３Ａ（ヒドロキシプロピルテトラアザシクロドデカン三酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、デフェロキサミン、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＴＰＡ－ＢＭＡ（ジエチレントリアミン五酢酸－ビスメチルアミド）、及びポルフィリンからなる群から選択される、キレート部分である。

【0009】

特定の実施形態では、式Ｉの可変部Ａは、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸）又はその金属錯体である。

【0010】

いくつかの実施形態では、化合物は、式Ｉ－ａによって表されるか、又はその金属錯体である：

【化1】

（式中、Ｙ^１は、－ＣＨ_２ＯＣＨ_２（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ、－Ｃ（Ｏ）（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ、又は－Ｃ（Ｓ）（Ｌ^２）_ｎ－Ｂであり、Ｙ^２は、－ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈであるか；又は
Ｙ^１は、Ｈであり、Ｙ^２は、Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂである）。特定の実施形態では、Ｙ^１は、Ｈである。

【0011】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１は、

【化2】

であり、Ｒ^Ｌは、水素又は－ＣＯ_２Ｈである。

【0012】

特定の実施形態では、Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊又は－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊であり、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、Ｈである。

【0013】

特定の実施形態では、Ｚ^１はＣＨ_２である。

【0014】

いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２－２０を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｗであり、式中、ｍ及びｗは、それぞれ独立して０～１０の整数（両端を含む）であり、ｍ及びｗの少なくとも１つは０でない。

【0015】

いくつかの実施形態では、金属錯体は、Ｂｉ、Ｐｂ、Ｙ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｕ、Ｒｅ、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態では、金属錯体は、^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８７Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ｉｎ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^２２７Ｔｈ、及び^２２９Ｔｈからなる群から選択される放射性核種を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、可変部Ａは、キレート部分の金属錯体である。そのようないくつかの実施形態では、金属錯体は、放射性核種を含む。いくつかの実施形態では、放射性核種は、アルファ放射体、例えば、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ）、ラジウム－２２３（^２２３Ｒａ）、鉛－２１２（^２１２Ｐｂ）、トリウム－２２７（^２２７Ｔｈ）、及びテルビウム－１４９（^１４９Ｔｂ）、又はそれらの子孫からなる群から選択されるアルファ放射体である。いくつかの実施形態では、放射性核種は、^６８Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、又は^２２５Ａｃである。いくつかの実施形態では、放射性核種は、^２２５Ａｃ又はその子孫である。

【0017】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、以下の構造のうちの１つ、又はその金属錯体を含む：

【化3】

【0018】

いくつかの実施形態では、化合物又はその薬学的に許容される塩は、以下の構造、又はその金属錯体を含む：

【化4】

【0019】

いくつかの実施形態では、式Ｉを参照すると、可変部Ａは、キレート部分の金属錯体であり、金属錯体は、放射性核種を含む。特定の実施形態では、放射性核種は、^６８Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、又は^２２５Ａｃである。特定の実施形態では、放射性核種は、^２２５Ａｃである。特定の実施形態では、放射性核種は、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ）、ラジウム－２２３（^２２３Ｒａ）、鉛－２１２（^２１２Ｐｂ）、トリウム－２２７（^２２７Ｔｈ）、及びテルビウム－１４９（^１４９Ｔｂ）、又はそれらの子孫からなる群から選択されるアルファ放射体である。特定の実施形態では、アルファ放射体は、^２２５Ａｃ又はその子孫である。

【0020】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる抗体又はその抗原結合断片を参照すると、第１の抗原結合ドメインは、以下を含む：
ｉ．以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ．以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３。

【0021】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる抗体又はその抗原結合断片を参照すると、第１の抗原結合ドメインは、以下を含む：
ａ．配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ．配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。

【0022】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる抗体又はその抗原結合断片を参照すると、第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
ｉ．以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント；並びに
ｉｉ．以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント）。

【0023】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる抗体又はその抗原結合断片を参照すると、第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
ｉ．以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ．以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３。

【0024】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる抗体又はその抗原結合断片を参照すると、第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
ａ．配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ．配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。

【0025】

いくつかの実施形態では、本抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
ａ．以下を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することが可能な第１の抗原結合ドメイン：
ｉ．以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ．以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；及び
ｂ．以下を含む、ｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメイン：
ｉ．以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
ｉｉ．以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３。

【0026】

いくつかの実施形態では、本抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
ａ．第１の抗原結合ドメインのＶＨ領域と、第１の重鎖定常（ＣＨ）領域又はその断片とを含む、第１の重鎖；
ｂ．第１の抗原結合ドメインのＶＬ領域と、第１の軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片とを含む、第１の軽鎖；
ｃ．第２の抗原結合ドメインのＶＨ領域と、第２の重鎖定常（ＣＨ）領域又はその断片とを含む、第２の重鎖；及び
ｄ．第２の抗原結合ドメインのＶＬ領域と、第２の軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片とを含む、第２の軽鎖。

【0027】

いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ領域は、それぞれ配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、第１及び第２の重鎖は、ヘテロ二量体を形成し、ここで、任意選択的に、第１及び第２の重鎖の一方は、位置３５４にシステイン（Ｃ）残基、位置３６６にトリプトファン（Ｗ）残基を含み、他方の重鎖は、位置３４９にシステイン（Ｃ）残基、位置４０７にバリン（Ｖ）残基、位置３６６にセリン（Ｓ）、及び位置３６８にアラニン（Ａ）を含み、ここで、定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0029】

いくつかの実施形態では、本抗体又はその抗原結合断片は、以下：
ａ．天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、改変ＣＨ領域；及び
ｂ．改変ＣＬが天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、対応する改変ＣＬ領域
を含み、ここで、
ｉ．第１の重鎖は改変ＣＨ領域を含み、第１の軽鎖は対応する改変ＣＬ領域を含むか；又は
ｉｉ．第２の重鎖は改変ＣＨ領域を含み、第２の軽鎖は対応する改変ＣＬ領域を含み、
ここで、改変ＣＨ領域の置換システインと、対応する改変軽鎖の置換システインとは、ジスルフィド結合を形成することができる。

【0030】

いくつかの実施形態では、改変ＣＨ領域は、位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み；対応する改変ＣＬ領域は、位置１２１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ここで、定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0031】

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＣＨ領域は、抗体又はその抗原結合断片の、１つ以上のＦｃγ受容体への結合を低減又は抑制する変異を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＣＨ領域は、位置２３４にフェニルアラニン、位置２３５にグルタミン酸、及び位置３３１にセリンを含み、ここで、定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0033】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、以下を特徴とする：
ａ．第１のＣＨ領域が、配列番号３９に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むこと；
ｂ．第２のＣＨ領域が、配列番号４０に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むこと、
ｃ．第１のＣＬ領域が、配列番号４１に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むこと；及び
ｄ．第２のＣＬ領域が、配列番号３４に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むこと。

【0034】

いくつかの実施形態では、本抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
ａ．配列番号３５に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１の重鎖；
ｂ．配列番号３６に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２の重鎖；
ｃ．配列番号３７に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖；及び
ｄ．配列番号３８に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖。

【0035】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、以下を特徴とする：
ａ．第１の重鎖が、配列番号３５に記載される配列を有するアミノ酸配列を含むこと；
ｂ．第２の重鎖が、配列番号３６に記載される配列を有するアミノ酸配列を含むこと；
ｃ．第１の軽鎖が、配列番号３７に記載される配列を有するアミノ酸配列を含むこと；及び
ｄ．第２の軽鎖が、配列番号３８に記載される配列を有するアミノ酸配列を含むこと。

【0036】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、以下を特徴とする：
ａ．ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインが、カニクイザルＥＧＦＲに結合することが可能であること；
ｂ．ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインが、マウスＥＧＦＲに結合することが可能であること；
ｃ．ｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインが、カニクイザルｃＭＥＴに結合することが可能であること；
ｄ．第１の抗原結合ドメインが、ＥＧＦＲに特異的であること；
ｅ．第２の抗原結合ドメインが、ｃＭＥＴに特異的であること；
ｆ．抗体又はその抗原結合断片が、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに同時に会合することが可能であること；
ｇ．抗体又はその抗原結合断片が、細胞内に内在化することが可能であること；
ｈ．抗体又はその抗原結合断片が、インビトロ細胞生存率アッセイで測定した場合に細胞傷害活性を有すること；並びに／又は
ｉ．抗体又はその抗原結合断片が、ＥＧＦＲ及び／又はｃＭＥＴのリガンド依存性シグナル伝達を遮断することが可能であること。

【0037】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、第１の抗原結合ドメインが、以下のＫｄを有する親和性でヒトＥＧＦＲに結合することが可能であることを特徴とする：
ａ．１０～１００ｎＭ；
ｂ．２０～８０ｎＭ；
ｃ．３０～７５ｎＭ；又は
ｄ．３５～５０ｎＭ。

【0038】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、第２の抗原結合ドメインが、以下のＫｄを有する親和性でヒトｃＭＥＴに結合することが可能であることを特徴とする：
ａ．１０ｎＭ未満；又は
ｂ．５ｎＭ未満。

【0039】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、第１の抗原結合ドメインが、抗体ＱＤ６の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列（それぞれ配列番号４７及び４８に記載）を含む抗原結合ドメインの親和性よりも低い親和性でヒトＥＧＦＲに結合することが可能であることを特徴とする。

【0040】

いくつかの実施形態では、上記の結合親和性は、表面プラズモン共鳴によって測定される。

【0041】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、以下の構造：

【化5】

を含み、式中、

【化6】

は、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方に特異的に結合することが可能である抗体又はその抗原結合断片（例えば、下記のＥＧＦＲ－ｃＭＥＴモノクローナル二重特異性抗体ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂ）である。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、リジン残基の側鎖アミノ基を介して、Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－に連結している。

【0042】

別の態様では、本開示は、上記の化合物の１つと、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物にも関する。

【0043】

さらに、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に、上記の化合物又はそのそれぞれの組成物を治療有効量で投与することを含む、癌を治療する方法も本発明の範囲内である。

【0044】

いくつかの実施形態では、癌は、副腎皮質癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜腺癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、神経膠腫、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌又はＨＮＳＣＣ）、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌又はＮＳＣＬＣ）、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、卵巣癌、膵臓癌（例えば、膵管腺癌又はＰＤＡＣ）、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、唾液腺様嚢胞癌、精母細胞性セミノーマ、及びブドウ膜黒色腫からなる群から選択される固形腫瘍癌である。

【0045】

いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、大腸癌、膵臓癌、又は頭頚部癌である。

【0046】

いくつかの実施形態では、本発明の治療方法は、抗増殖剤、放射線増感剤、免疫調節剤又は免疫変調剤を、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することをさらに含む。

【0047】

癌の治療方法における使用のための上記の化合物又は医薬組成物も、本開示の範囲内である。

【0048】

本発明はさらに、癌の治療のための医薬品の製造における、上記化合物又は医薬組成物の使用も包含する。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1A-1B】図１Ａ及び１Ｂは、それぞれＲＡＡ２２／Ｂ０９－５７及びＱＤ６／Ｂ０９－５７ ＤｕｅｔＭａｂのグラフ表示である。抗ＥＧＦＲ ＲＡＡ２２及びＱＤ６のＦａｂ、抗ｃＭＥＴＢ０９－５７のＦａｂ、及びホール及びノブ重鎖が示される。構造レンダリングは、個々のドメイン構造の合成物である。

【図2】図２は、抗原捕捉構成を使用した同時結合試験がＯｃｔｅｔ分析によって実施されたことを示す。ヒトｃＭＥＴ抗原をロードしたセンサーは、最初に抗体、次いでヒトＥＧＦＲ抗原との連続的な会合及び解離の相互作用に曝露された。Ａｓｓ＝会合；Ｄｉｓｓ＝解離；ＮＩ－ＮＴＡ＝ニッケルニトリロ三酢酸。

【図3A】図３Ａは、ＥＧＦＲとｃ－Ｍｅｔ種の交差反応性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。高親和性単一特異性ＥＧＦＲ ＩｇＧ、ＱＤ６及び一価二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ ＤｕｅｔＭＡｂ、ＱＤ６／Ｂ０９は、ヒト、カニクイザル、及びマウスＥＧＦＲに結合した。親和性が低下した単一特異性ＥＧＦＲ ＩｇＧ、ＲＡＡ２２は、ＱＤ６と比較して、ヒト、カニクイザル、及びマウスＥＧＦＲへの結合がより弱く、対応する一価二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＤｕｅｔＭＡｂ、ＲＡＡ２２／Ｂ０９は、二価親ＩｇＧ、ＲＡＡ２２と比較して、ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲへの結合がさらに弱く、マウスＥＧＦＲへの結合はわずかであった。単一特異性ｃ－Ｍｅｔ ＩｇＧ、Ｂ０９、及び全ての二重特異性バリアントは、ヒト及びカニクイザルのｃ－Ｍｅｔに対して同等の結合を示したが、マウスのｃ－Ｍｅｔに対しては検出可能な結合を示さなかった。

【図3B】図３Ｂは、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔファミリーの特異性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。試験した抗体はいずれも、ＥＧＦＲ ＨＥＲファミリータンパク質（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４）又はｃ－Ｍｅｔファミリーメンバー（Ｒｏｎ（ＣＤ１３６）又はセマフォリン３ａ）のいずれにも認識できる結合を示さなかった。

【図4】図４は、ＲＡＡ２２／Ｂ０９二重特異性ｍＡｂの内在化及び酸性化された細胞内区画への輸送が、ｐＨＡｂ ｐＨ感受性染料（Ｐｒｏｍｅｇａ）で標識された抗体を使用して可視化されたことを示す。対照抗体には、Ｒ３４７アイソタイプ対照、並びに一価二重特異性対照抗体である抗ＥＧＦＲＲＡＡ２２／Ｒ３４７及び抗ｃＭＥＴＢ０９／Ｒ３４７が含まれていた。ｐＨＡｂ標識抗体を、１．２５μｇ／ｍＬの濃度でＮＣＩ－Ｈ１９７５肺癌細胞とともに、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。蛍光画像は、Ｃｙ３フィルターを使用したＯｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇシステムで指定された時点で捕捉した。経時的な細胞蛍光強度の増加は、ｐＨ感受性蛍光によって測定される酸性細胞内区画への内在化及び輸送の証拠であるとみなされた。

【図5】図５は、ＲＡＡ２２／Ｂ０９二重特異性ｍＡｂの内在化及び酸性化された細胞内区画への輸送が、ｐＨＡｂ ｐＨ感受性染料で標識された抗体を使用して可視化されたことを示すが、細胞はより低い０．６２５μｇ／ｍＬの濃度の抗体で処理された。

【図6A】図６Ａは、Ｈ１９７５細胞におけるＱＤ６／Ｂ０９及びＲＡＡ２２／Ｂ０９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の内在化の動態を示す。（ａ）細胞質用ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣ（青）、及び２．５μｇ／ｍＬのＱＤ６／Ｂ０９－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（マゼンタ、上パネル）又は２．５μｇ／ｍＬのＲＡＡ２２／Ｂ０９ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（マゼンタ、下パネル）で標識した細胞の、内在化開始時及び１時間後の画像オーバーレイ。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣで標識し、次いで、２～８°ＣでｍＡｂｓ－ＡｌｅｘａＦｕｏｒ６４５７と結合させ、内部化条件：（３７°Ｃ、湿度７０％、５％ＣＯ２）に供した。

【図6B】図６Ｂは、Ｈ１９７５細胞におけるＱＤ６／Ｂ０９及びＲＡＡ２２／Ｂ０９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の内在化の動態を示す。アルゴリズムを使用した動態画像の定量分析（材料及び方法）によって決定されたｍＡｂ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の内在化の時間経過。５分間隔で撮影された動態画像は、細胞質内の抗体の蓄積を決定するためのアルゴリズム（Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎ，２０１５）を使用して処理された。３つの独立した実験のうちの１つについて、ＱＤ６／Ｂ０９－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（赤）対ＲＡＡ２２／Ｂ０９－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（青）の、細胞内の抗体蛍光に対して正規化された細胞質内の抗体シグナル（細胞質内の割合）を示す。内在化速度定数（ｋｉｎｔ）は、式Ｆｃｙｔ（ｔ）＝（１－ｅ^{－ｋｉｎｔ.ｔ}）Ｆｍａｘ，ｃｙｔ（式中、Ｆｍａｘ、ｃｙｔは、細胞あたりの細胞質強度と細胞あたりの総強度の最大比）による曲線フィッティングを使用して、内在化の時間経過から計算された。ｋｉｎｔから計算されたＴ1/2は、ＱＤ６／Ｂ０９では３７．５±１０．６分、ＲＡＡ２２／Ｂ０９では４３．２±１５．５分であった（ｎ＝３）。

【図7A】図７Ａは、ＱＤ６／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂ及びそのそれぞれのシングルアーム対照抗体の内在化プロファイルを示す。内部化プロファイルは、各構築物のそれぞれの膜及び細胞質シグナルの時間経過によって表示される。ＱＤ６／Ｂ０９セットは、Ｏｐｅｒａ共焦点蛍光顕微鏡を使用して取得された。

【図7B】図７Ｂは、ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂ及びそのそれぞれのシングルアーム対照抗体の内在化プロファイルを示す。内部化プロファイルは、各構築物のそれぞれの膜及び細胞質シグナルの時間経過によって表示される。このセットは、Ｚｅｉｓｓスピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡を使用して取得された。ＱＤ６／Ｂ０９とＱＤ６／ＩｇＧの同一プロファイルは、ＱＤ６／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂのＥＧＦＲアームによって駆動される内在化モードを示しているが、ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂでは、効率的な内在化のためにＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴアームの両方の会合が必要である。

【図8A】図８Ａは、中程度及び高度の標的ｃ－ＭＥＴ及びＥＧＦＲ細胞表面受容体を発現する細胞におけるＲＡＡ２２／Ｂ０９の内在化プロファイルを示す。Ｈ１９７５細胞におけるＲＡＡ２２／Ｂ０９－ＡＦ６４７の膜、細胞質、及び総シグナルを示す。２の代表的な実験を１つ示す。Ｈ１９７５細胞は、総強度及び膜強度の同時低下を示し、これは細胞表面からの抗体の解離を示す。

【図8B】図８Ｂは、ＨＣＣ８２７細胞におけるものである以外は、図８Ａと均等である。ＨＣＣ８２７細胞は、実験の経過にわたって安定した総シグナルを有する。膜シグナルの減少は、抗体の内在化に由来する。

【図9A】図９Ａは、ＨＣＣ８２７細胞におけるＲＡＡ２２／Ｂ０９シングルアーム対照抗体の内在化を示す。ＲＡＡ２２／ＩｇＧシングルアームの強度プロファイルは、シングルアーム結合によるＥＧＦＲへの結合がより弱いため、ＲＡＡ２２／Ｂ０９よりも約１０倍低い。

【図9B】図９Ｂは、Ｂ０９／ＩｇＧシングルアームが、経時的な総シグナル及び膜シグナルの同時低下によって示されるように、細胞膜から解離することを示す。

【図10A】図１０Ａは、キレート、リンカー、及び架橋基を含む二官能性キレートの一般構造を示す概略図である。

【図10B】図１０Ｂは、キレート、リンカー、及び標的化部分を含む二官能性抱合体の一般構造を示す概略図である。

【図10C-10D】図１０Ｃ及び図１０Ｄは、本明細書に開示される２つの例示的なＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ放射性免疫抱合体である、［^１７７Ｌｕ］－ＤＯＴＡ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ及び［^２２５Ａｃ］－ＤＯＴＡ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴの構造を示す概略図である。

【図11】図１１は、二官能性キレート、４－｛［１１－オキソ－１１－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）ウンデシル］カルバモイル｝－２－［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル］ブタン酸（化合物Ｂ）の合成を示す概略図である。化合物Ｂの合成は、実施例６に記載されている。

【図12】図１２は、二官能性キレート、４－｛［２－（２－｛２－［３－オキソ－３－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）プロポキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］カルバモイル｝－２－［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル］ブタン酸（化合物Ｃ）の合成を示す概略図である。化合物Ｃの合成は、実施例７に記載されている。

【図13】図１３は、［^１７７Ｌｕ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体（例えば、下記の化合物Ｅ及び化合物Ｆ）の合成のための抱合及び放射性標識を示す概略図である。実施例８を参照されたい。

【図14A-14B】図１４Ａ～１４Ｂは、４μＭの非標識抗体の不存在下（総結合）又は存在下（非特異的結合）における、ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴの発現レベルが異なる様々な細胞株への化合物Ｅの結合を示す。特異的結合は、総結合から非特異的結合を差し引いて計算された。示される値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。実施例９を参照されたい。

【図15】図１５は、ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴの発現レベルが異なるＨＣＣ８２７細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈ４４１細胞、及びＨ１９７５細胞における、化合物Ｅ（１０ｎＭ）のインキュベーション後２時間及び２４時間での内在化（又はインビトロ残留）の結果を示す。示される値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。実施例１０を参照されたい。

【図16A-16E】図１６Ａ～１６Ｅは、様々な動物モデルにおける生体内分布試験の結果を表すプロットを示し、静脈内注射後の特定の時点で皮下異種移植を受けた雌性ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に化合物Ｅ（０．７ＭＢｑ／２μｇ）を注射した。組織１グラムあたりの注入量の割合（％ＩＤ／ｇ）がｘ軸にプロットされ、４、２４、４８、９６、１６８時間での血液、骨、脳、心臓、腸、腎臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胃、皮膚、尿及び膀胱、並びに腫瘍について示される。実施例１１を参照されたい。

【図17A-17C】図１７Ａ～１７Ｃは、化合物Ｆ（５０～４００ｎＣｉ／２μｇ）、冷式抗体、及びビヒクルを静脈内注射した後の雌性ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）の様々な動物モデルにおけるインビボ有効性試験の結果を表すプロットを示す。実施例１２を参照されたい。

【発明を実施するための形態】

【0050】

放射性免疫抱合体は、疾患状態で上方制御されるタンパク質又は受容体を標的とし、放射性ペイロードを送達して対象の細胞を損傷及び死滅させるように設計されている（放射性免疫療法）。放射性ペイロードを送達すると、標的化されたアルファ、ベータ、ガンマ粒子、又はオージェ電子の放出が起こり、ＤＮＡに直接的な影響（一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの切断など）が生じ、又はバイスタンダー効果若しくはクロスファイヤー効果などの間接的な影響が生じ得る。

【0051】

放射性免疫抱合体は、典型的には、生物学的標的化部分（例えば、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方に特異的に結合することが可能な抗体又はその抗原結合断片）、放射性核種（例えば、アルファ又はベータ放射体）、及びこれら２つを結合する分子を含有する。標的親和性を維持しながら構造変化が最小限に抑えられるように、二官能性キレートが生物学的標的化部分に付加されると、抱合体が形成される。放射性標識されると、最終的な放射性免疫抱合体が形成される。

【0052】

二官能性キレートは、キレート、リンカー、及び架橋基を構造的に含有する（図１０Ａ）。新しい二官能性キレートを開発する場合、大半の取り組みは分子のキレート部分に集中する。標的化部分に抱合した様々な環状及び非環状構造を有する二官能性キレートの例がいくつか記載されている。［Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０００，１１，５１０－５１９；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１２，２３，１０２９－１０３９；Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．２０１１，１３，２１５－２２１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２，１３，１１０－１１５．］

【0053】

安全で効果的な放射性免疫抱合体を開発するための重要な要素の１つは、正常組織におけるオフターゲット毒性を最小限に抑えながら有効性を最大化することである。これは新薬開発の主要理念の１つであるが、放射免疫療法への応用には新たな課題が伴う。放射性免疫抱合体は、治療効果を得るために、治療用抗体で必要とされるように受容体を遮断する必要はなく、抗体薬物抱合体（「ＡＤＣ」）で必要とされるように細胞内に細胞傷害性ペイロードを放出する必要もない。しかし、毒性粒子の放出は一次（放射性）崩壊の結果として起こる事象であり、投与後に身体内の任意の箇所でランダムに発生し得る。放出が起こると、放出範囲内の周囲の細胞に損傷が生じ得、これによりオフターゲット毒性が生じ得る。従って、これらの放射の正常組織への曝露を制限することが、新しい治療用放射性免疫抱合体を開発するための鍵となる。

【0054】

オフターゲット曝露を低減するための１つの潜在的方法は、身体（例えば、体内の正常組織）から放射能をより効果的に除去することである。１つのメカニズムは、生物学的標的化剤のクリアランス率を増加させることである。このアプローチでは、生物学的標的化剤の半減期を短縮する方法を特定することが必要になると思われるが、これは生物学的標的化剤について十分に説明されていない。メカニズムにかかわらず、薬物クリアランスの増加は、身体からの薬物の除去がより速くなることで作用部位での有効濃度が低下し、その結果、より高い総用量が必要となり得、正常組織への総放射性用量を低減するという所望の結果が得られなくなるという点で、薬力学／有効性にも悪影響を及ぼす。

【0055】

その他の取り組みは、放射性部分を含有する分子の部分の代謝を促進することに集中している。この目的のために、「切断可能リンカー」と呼ばれるものを使用して、生物学的標的化剤からの放射能の切断速度を高めるためのいくつかの取り組みが行われてきた。しかし、切断可能なリンカーは、放射性免疫抱合体に関しては異なる意味に解釈されてきた。Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎらは、切断可能なリンカーを、還元システインを介して二官能性キレートが生物学的標的化剤に結合するものとして説明しており、一方、他の研究者らは、放射性免疫抱合体を切断剤／酵素と併用して放出する必要がある酵素切断可能なシステムの使用を説明している［ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．２０１３，１２（１１），２４７２－２４８２；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９，５３９，１９１－２１１；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００３，１４（５），９２７－３３］。これらの方法は、システイン連結の場合、生物学的標的化部分の性質を変更するか、又は、引用された記載の場合、２つの薬剤の投与を必要とするため、薬剤開発の観点（酵素切断可能なシステム）からは実用的ではない。

【0056】

本開示は、とりわけ、異化及び／又は代謝後に身体からより効果的に排出され、それによって治療効果を維持しながら身体から放射能をより効果的に排出する化合物、例えば放射性免疫抱合体を提供する。この予想外の優位性は、二官能性キレートのリンカー領域に改変を加えることによって達成される。

【0057】

開示された免疫抱合体は、いくつかの実施形態では、公知の二官能性キレートと比較した場合、例えば、完全な分子の薬物動態を維持しながら、異化／代謝産物の排泄の程度を増加させることによって、全身放射能の低減を達成し得る。いくつかの実施形態では、この放射能の減少は、結合特異性（インビトロ結合）、細胞保持、及びインビボでの腫瘍取り込みなどの他のインビトロ及びインビボ特性に影響を与えることなく、異化／代謝副産物のクリアランスによって生じる。従って、いくつかの実施形態では、提供される化合物は、オンターゲット活性を維持しながら、人体内の放射能を低減することを達成する。

【0058】

定義
本明細書で使用される場合、標的化部分の「結合（ｂｉｎｄ）」又は「結合している」という用語は、本明細書に記載される標的分子（例えば、ヒトＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ）との少なくとも一時的な相互作用又は会合を意味する。

【0059】

本明細書で使用される「二官能性キレート」という用語は、キレート、リンカー、及び架橋基を含む化合物を指す。例えば、図１０Ａを参照されたい。「架橋基」は、２つ以上の分子を結合すること、例えば、二官能性キレートと標的化部分を、共有結合によって結合することが可能な反応性基である。

【0060】

「二官能性抱合体」という用語は、本明細書で使用される場合、そのキレート又は金属錯体、リンカー、及び標的化部分、例えば、抗体又はその抗原結合断片を含む、化合物を指す。例えば、図１０Ｂを参照されたい。

【0061】

「癌」という用語は、本明細書で使用される場合、腫瘍、新生物、癌腫、肉腫、白血病、及びリンパ腫などの、悪性腫瘍細胞の増殖によって引き起こされるあらゆる癌を指す。いくつかの実施形態では、本開示の癌は、肺癌、大腸癌、膵臓癌、又は頭頸部癌などであるが、これらに限定されない、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を含む。

【0062】

本明細書で使用される「キレート」という用語は、中心金属又は放射性金属原子に２つ以上の点で結合できる有機化合物又はその一部を指す。

【0063】

「抱合体」という用語は、本明細書で使用される場合、キレート基又はその金属錯体、リンカー基を含有し、任意選択的に標的化部分、例えば、抗体又はその抗原結合断片を含有する分子を指す。

【0064】

本明細書において、別段の記載がない限り、「定常領域」という語句は、抗体又はその断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４定常領域）に関して使用される場合、野生型定常領域及びバリアント（例えば、野生型定常領域の参照配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する定常領域）の両方を包含することを意図している。

【0065】

本明細書で使用する場合、「化合物」という用語は、示される構造の全ての立体異性体、幾何異性体、及び互変異性体を含むことを意味する。

【0066】

本明細書に列挙又は記載される化合物は、非対称（例えば、１つ以上の立体中心を有する）であってもよい。別段の指定がない限り、エナンチオマー及びジアステレオマーなどの全ての立体異性体が企図される。本開示で考察される、非対称に置換された炭素原子を含有する化合物は、光学活性形態又はラセミ形態で単離することができる。光学活性出発物質から光学活性形態を調製する方法は、ラセミ混合物の分割又は立体選択的合成によるものなど、当技術分野で知られている。

【0067】

本明細書において、「検出剤」は、抗原を含有する細胞の位置を特定することによって疾患を診断するのに有用な分子又は原子を指す。検出剤によってポリペプチドを標識する様々な方法が当技術分野で知られている。検出剤の例には、放射性同位体及び放射性核種、染料（ビオチン－ストレプトアビジン複合体など）、造影剤、発光剤（フルオレセインイソチオシアネート又はＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体、シアニン、及び近赤外線染料など）、及びガドリニウムキレートなどの磁性剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0068】

本明細書で使用する場合、「放射性核種」という用語は、放射性崩壊を起こすことが可能な原子（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、^８７Ｙ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^２２７Ｔｈ、^２２９Ｔｈ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８２Ｒｂ、^１１７ｍＳｎ、^２０１Ｔｌ）を指す。放射性核種、放射性同位体、又は放射性同位体という用語も、放射性核種を説明するために使用され得る。本明細書に記載されるように、放射性核種を検出剤として使用してもよい。いくつかの実施形態では、放射性核種は、治療剤、例えば、アルファ放射体放射性核種として使用され得る。

【0069】

薬剤（例えば、前述の抱合体のいずれか）の「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、臨床結果などの有益な結果又は望ましい結果をもたらすのに十分な量であり、従って、「有効量」はそれが適用される状況によって異なる。例えば、治療用途では、「有効量」は、障害及びその合併症の症状を治癒するか、又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量、及び／又は疾患又は病状に関連する少なくとも１つの症状を実質的に改善するのに十分な量であり得る。典型的には、本開示の文脈における「有効量」は、投与された患者の一部において少なくとも何らかの測定可能な治療応答又は所望の効果を生じる、本明細書に開示される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）、例えばＡｃ－２２５放射性免疫抱合体の量である。例えば、癌の治療では、疾患又は病状の症状を軽減、予防、遅延、抑制、又は停止させる薬剤又は化合物が治療的に有効であり得る。治療有効量の薬剤又は化合物は、疾患又は病状を治癒させるために必要ではないが、例えば、疾患又は病状の発症を遅らせ、妨げ、又は予防する、疾患又は病状の症状を改善する、又は疾患又は病状の期間を変更するように、疾患又は病状に対する治療を提供し得る。例えば、疾患又は病状は、個体における重症度が軽減し得、且つ／又は回復が促進され得る。有効量は、単回用量又は複数回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は少なくとも６回）用量の投与によって投与され得る。

【0070】

「免疫抱合体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体（又はその抗原結合断片）、ナノボディ、アフィボディ、又はフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインからのコンセンサス配列などの、標的化部分を含む抱合体を指す。いくつかの実施形態では、免疫抱合体は、標的化部分あたり平均少なくとも０．１０個の抱合体（例えば、標的化部分あたり平均少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、又は８個の抱合体）を含む。

【0071】

本明細書で使用される「放射性抱合体」という用語は、本明細書に記載される放射性同位体又は放射性核種のいずれかなどの放射性同位体又は放射性核種を含む、任意の抱合体を指す。

【0072】

本明細書で使用される「放射性免疫抱合体」という用語は、本明細書に記載される放射性同位体又は放射性核種のいずれかなどの放射性同位体又は放射性核種を含む、任意の免疫抱合体を指す。本開示で提供される放射性免疫抱合体は、典型的には、放射性同位体又は放射性核種から形成された金属錯体を含む二官能性抱合体を指す。

【0073】

本明細書で使用される「放射免疫療法」という用語は、放射性免疫抱合体を使用して治療効果を生み出す方法を指す。いくつかの実施形態では、放射性免疫療法は、それを必要とする対象への放射性免疫抱合体の投与を含み、ここで、放射性免疫抱合体の投与は、対象において治療効果を生じる。いくつかの実施形態では、放射性免疫療法は、放射性免疫抱合体の細胞への投与を含み、ここで、放射性免疫抱合体の投与により、細胞が殺傷される。放射免疫療法は、細胞の選択的殺傷を伴うが、いくつかの実施形態では、細胞は癌を有する対象の癌細胞である。

【0074】

「医薬組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化された本明細書に記載される放射性免疫抱合体を含有する組成物を表す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物における疾患の治療のための治療計画の一部として、政府規制当局の承認を得て製造又は販売される。医薬組成物は、例えば、単位剤形での経口投与用（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、又はシロップ）；局所投与用（例えば、クリーム、ジェル、ローション、又は軟膏）；静脈内投与用（例えば、粒子塞栓のない滅菌溶液として、及び静脈内使用に適した溶媒系で）；又は本明細書に記載される他の任意の製剤で、製剤化することができる。

【0075】

「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載される化合物以外（例えば、活性化合物を懸濁可能又は溶解可能なビヒクル）であり、患者において無毒性及び非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、抗付着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、注入剤（希釈剤）、フィルム形成剤若しくはコーティング、香味剤、香料、流動促進剤（流動促進物質）、滑沢剤、保存剤、印刷インク、放射線防護剤、吸着剤、懸濁化若しくは分散剤、甘味料、又は水和の水が挙げられ得る。代表的な賦形剤としては、アスコルビン酸、ヒスチジン、リン酸緩衝液、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ及びキシリトールが挙げられるが限定されない。

【0076】

「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書で使用される場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、又はアレルギー反応を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した、本明細書に記載される化合物の塩を表す。薬学的に許容される塩は、当技術分野において周知である。例えば、薬学的に許容される塩は：Ｂｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６６：１－１９，１９７７及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，（Ｅｄｓ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に記載されている。塩は、本明細書に記載される化合物の最終的な単離及び精製中にその場で調製することができるか、又は遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって個別に調製することができる。

【0077】

本発明の化合物は、薬学的に許容される塩として調製することが可能であるように、イオン化可能な基を有していてもよい。これらの塩は、無機酸又は有機酸を含む酸付加塩であってもよく、又は本発明の化合物の酸性形態の場合には、塩は無機塩基又は有機塩基から調製されてもよい。多くの場合、化合物は、薬学的に許容される酸又は塩基の付加生成物として調製される薬学的に許容される塩として調製又は使用される。好適な薬学的に許容される酸及び塩基は、当技術分野で周知であり、例えば、酸付加塩を形成するための塩酸、硫酸、臭化水素酸、酢酸、乳酸、クエン酸、又は酒石酸、及び塩基性塩を形成するための水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、カフェイン、様々なアミンなどである。適切な塩を調製するための方法は、当技術分野において十分に確立されている。

【0078】

代表的な酸付加塩としては、とりわけ、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギニン酸塩、アスコルビン酸塩、アルパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンホレート、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトネート、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、硫酸ラウリル、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデンカン酸塩、吉草酸塩が挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム、並びに無毒性アンモニウム、四級アンモニウム及びアミンカチオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びエチルアミンを含むがこれらに限定されないものが挙げられる。

【0079】

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合した一連の少なくとも２つのアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは少なくとも３～５個のアミノ酸を含み、各アミノ酸は少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合している。当業者であれば、ポリペプチドには、１つ以上の「非天然」アミノ酸、又はそれにもかかわらずポリペプチド鎖に組み込むことができる他の実体が含まれ得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化されていてもよく、例えば、ポリペプチドは、１つ以上の共有結合した糖部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、単一の「ポリペプチド」（例えば、抗体ポリペプチド）は、２つ以上の個別のポリペプチド鎖を含み得、これは、場合によっては、例えば１つ以上のジスルフィド結合又は他の手段によって、互いに連結され得る。

【0080】

「対象」は、ヒト又は非ヒト動物（例えば、哺乳類）を意味する。

【0081】

「実質的同一性」又は「実質的に同一である」とは、それぞれ参照配列と同じポリペプチド配列を有するポリペプチド配列、又は、２つの配列が最適に整列されている場合に参照配列内の対応する位置でそれぞれ指定された割合のアミノ酸残基が同じであるポリペプチド配列を意味する。例えば、参照配列と「実質的に同一」なアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは通常、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、５０、７５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、又は３５０の連続したアミノ酸（例えば、全長配列）になる。配列同一性は、デフォルト設定の配列解析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７０５）。を使用して測定してもよい。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及びその他の変更について、相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列を適合させ得る。

【0082】

本明細書で使用され、当技術分野でよく理解されているように、病状（例えば、癌などの本明細書に記載される病状）を「治療すること」又は病状の「治療」とは、臨床結果などの有益な又は望ましい結果を得るためのアプローチである。有益な又は所望の臨床結果としては、限定はされないが、検出可能であれ検出不能であれ、１つ以上の症状又は病態の軽減又は改善；疾患、障害又は病態の程度の縮小、疾患、障害又は病態が安定化している（即ち悪化していない）状態、疾患、障害又は病態の広がりを防ぐこと、疾患、障害又は病態の進行の遅延又は緩徐化、疾患、障害又は病態の改善又は緩和、及び寛解（部分的であれ全面的であれ）を挙げることができる。疾患、障害、又は症状を「緩和すること」は、治療の不存在下での程度又は経過と比較して、疾患、障害、又は病状の程度及び／又は望ましくない臨床所見が軽減され、且つ／又は進行の経過が遅くなるか又は長くなることを意味する。

【0083】

本明細書で使用される場合、定量的な値に関して使用される「約」又は「およそ」という用語は、特に別段の記載がない限り、記載された定量的な値自体を含む。本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、別段の指定がない限り、又は文脈から推測されない限り、記載された定量値からの±１０％の変動を指す。

【0084】

本明細書で使用される「標的化部分」という用語は、所与の標的に結合することが可能な任意の分子又は分子の任意の部分を指す。「ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化部分」という用語は、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方に結合することが可能な標的化部分（例えば、抗体又はその抗原結合断片）、例えば抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体を指す。

【0085】

本明細書において、「断片」という用語は、ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴ断片を指すために使用される場合、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたＥＧＦＲ若しくはｃＭＥＴ、又はそのタンパク質ドメインを指す。別段の記載がない限り、本明細書に記載される実施形態に従って使用されるＥＧＦＲ又はｃＭＥＴの断片は、本開示に記載されるＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化部分によって認識及び／又は結合される全長ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴの能力を保持する。

【0086】

本開示を説明する文脈における（特に請求項の文脈における）用語「１つの」及び「その」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈すべきである。

【0087】

特に明記されていない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、包括的であり、「又は」及び「及び」の両方を包含すると理解される。

【0088】

本明細書で使用される「及び／又は」という用語は、他方を含む又は含まない指定された特徴又は成分の各々の具体的な開示と解釈されるべきである。

【0089】

用語「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」は、別途注記のない限り、非限定的用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるものである。「からなる」という用語は、限定的なものとして解釈すべきである。

【0090】

本明細書で使用される場合、「抗体」は、そのアミノ酸配列が、指定された抗原又はその断片に特異的に結合する免疫グロブリン及びその断片を含む、ポリペプチドを指す。本発明による抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）又はサブタイプ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であり得る。当業者であれば、抗体の特徴的な配列又は部分には、抗体の１つ以上の領域（例えば、可変領域、超可変領域、定常領域、重鎖、軽鎖、及びそれらの組み合わせ）に見られるアミノ酸が含まれ得ることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗体の特徴的な配列又は部分には、１つ以上のポリペプチド鎖が含まれ、同じポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖に見られる配列要素が含まれ得ることを理解するであろう。

【0091】

本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」は、親抗体の結合特性の特異性を保持する抗体の部分を指す。

【0092】

本開示の抗体又はその抗原結合断片は、単離及び／又は実質的に精製され得る。

【0093】

化合物、例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体
一態様では、本開示は、以下の構造、又はその薬学的に許容される塩を含む化合物、例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体を提供する：
Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ
式Ｉ
（式中、
Ａは、キレート部分又はその金属錯体であり、
Ｂは、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方に結合することが可能な抗体又はその抗原結合断片であり、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に開示される特徴を有し、
Ｌ^１は、結合、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり；
ｎは、１～５の整数（両端を含む）であり；
Ｌ^２は、それぞれ独立して式ＩＩ：
－Ｘ^１－Ｌ^３－Ｚ^１－
式ＩＩ
の構造を有し、式中、
Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－＊、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＣＨ_２－Ｐｈ－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－ＣＨ_２－Ｐｈ－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－Ｏ－＊、又は－ＮＲ^１－＊であり、式中、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、又は任意選択的に置換されたアリール若しくはヘテロアリールであり；
Ｌ^３は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０アルキル又は任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキルであり、
Ｚ^１は、－ＣＨ_２－＃、－Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｓ）－＃、－ＯＣ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＃、－ＮＲ^２Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２－＃、又は－ＮＲ^２－＃であり、式中、「＃」は、Ｂへの接続点を示し、Ｒ^２は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである）。

【0094】

アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はヘテロアリールの典型的な置換基としては、ハロ（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＨ、ＣＮ、ニトロ、アミノ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－８シクロアルキル、Ｃ_１－６ヘテロアルキル、Ｃ_１－６ヘテロシクロアルキル、ハロアルキル（例えば、ＣＦ_３）、アルコキシ（例えば、ＯＣＨ_３）、アルキルアミノ（例えば、ＮＨ_２ＣＨ_３）、スルホニル、アリール、及びヘテロアリールが挙げられるが、これらに限定されない。

【0095】

いくつかの実施形態では、化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）は、以下に示す構造、又はその金属錯体：

【化7】

であり、式中、Ｂは、本明細書に開示されるＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体又はその抗原結合断片である。

【0096】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、以下の構造：

【化8】

のうちの１つ、又はその金属錯体を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、提供される化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）は、最大約２５ｎＭ、最大約２０ｎＭ、最大約１５ｎＭ、最大約１２．５ｎＭ、最大約１０ｎＭ、最大約７．５ｎＭ、最大約７ｎＭ、最大約６．５ｎＭ、最大約６ｎＭ、最大約５ｎＭ、最大約４ｎＭ、最大約３．５ｎＭ、最大約３ｎＭ、又は最大約２．５ｎＭのＫｄ値で、異なるＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの発現レベルの異なる細胞株に結合することが可能である。いくつかの実施形態では、提供される化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）は、約１５ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約７．５ｎＭ、約７ｎＭ、約６．５ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｍＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、又は約２．５ｎＭのＫｄ値で、異なるＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの発現レベルの異なる細胞株に結合することが可能である。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書でさらに説明されるように、化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）は、キレート部分又はその金属錯体を含み、その金属錯体は、放射性核種を含み得る。いくつかのそのような化合物では、キレート部分とＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化部分（例えば、ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体）の平均率又は中央値比は、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、又は約１である。いくつかの化合物では、キレート部分とＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ標的化部分（例えば、ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体）の平均率又は中央値比は約１である。

【0099】

いくつかの実施形態では、放射性免疫抱合体が哺乳動物に投与された後、腸経路、腎臓経路、又はその両方によって排泄される放射線の割合（投与される放射線の総量のうち）は、参照放射性免疫抱合体が投与された同等の哺乳動物によって排泄される放射線の割合よりも大きい。「参照免疫抱合体」は、少なくとも（１）異なるリンカーを有すること；（２）異なるサイズの標的化部分を有すること；及び／又は（３）標的化部分を欠くことにおいて、本明細書に記載される放射性免疫抱合体とは異なる公知の放射性免疫抱合体を意味する。いくつかの実施形態では、参照放射性免疫抱合体は、［^９０Ｙ］－イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン（^９０Ｙ））及び［^１１１Ｉｎ］－イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン（^１１１Ｉｎ））からなる群から選択される。

【0100】

いくつかの実施形態では、所与の経路又は経路セットによって排泄される放射線の割合は、参照放射性免疫抱合体を投与された同等の哺乳動物によって同じ経路で排泄される放射線の割合よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％大きい。いくつかの実施形態では、排泄される放射線の割合は、参照放射性免疫抱合体を投与された同等の哺乳動物によって排泄される放射線の割合よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍大きい。排泄の程度は、当技術分野で知られている方法、例えば、尿及び／又は糞便中の放射能を測定すること、及び／又は一定期間にわたる全身放射能を測定することによって、測定することができる。例えば、国際公開第２０１８／０２４８６９号パンフレットも参照されたい。

【0101】

いくつかの実施形態では、排泄の程度は、投与後少なくとも又は約１２時間、投与後少なくとも又は約２４時間、投与後少なくとも又は約２日、投与後少なくとも又は約３日、投与後少なくとも又は約４日、投与後少なくとも又は約５日、投与後少なくとも又は約６日、又は投与後少なくとも又は約７日の期間に測定される。

【0102】

いくつかの実施形態では、化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）が哺乳動物に投与された後、化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）は、参照化合物（例えば、参照抱合体、例えば、参照放射性免疫抱合体などの参照免疫抱合体）と比較して、オフターゲット結合効果（例えば、毒性）の減少を示す。いくつかの実施形態では、このオフターゲット結合効果の減少は、本明細書に記載されるように、より高い排泄速度も示す化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）の特徴である。

【0103】

標的化部分
標的化部分には、所与の標的（例えば、ＥＧＦＲ若しくはｃＭＥＴ、又はＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ）に結合することが可能な（例えば、特異的に結合することが可能な、特異的に結合するなど）任意の分子又は分子の任意の部分が含まれる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、タンパク質又はポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体又はその抗原結合断片、ナノボディ、アフィボディ、及びフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（例えば、センチリン又はアドネクチン）からのコンセンサス配列からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、部分は、標的化部分及び治療部分の両方であり、すなわち、部分は、所与の標的に結合することが可能であり、治療上の利益も付与する。

【0104】

いくつかの実施形態では、標的化部分は、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも７５ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１２５ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも１７５ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２２５ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、少なくとも２７５ｋＤａ、又は少なくとも３００ｋＤａの分子量を有する。

【0105】

いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方に特異的に結合し、それらを阻害することが可能である。「阻害する」とは、標的化部分がＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ、又はその両方の１つ以上の機能を少なくとも部分的に阻害することを意味する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ、又はその両方の下流のシグナル伝達を障害し、例えば、様々なＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの発現レベルを有する腫瘍細胞の増殖を抑制する。

【0106】

標的
ＥＧＦＲ
ヒトＥＧＦＲ（プロトオンコジーンｃ－ＥｒｂＢ－１、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－１及びＥＣ２．７．１０．１としても知られる）は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ００５３３によって識別されるタンパク質である。ヒトＥＧＦＲ遺伝子（ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ１及びＨＥＲ１としても知られる）によってコードされたｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、４つのアイソフォーム：アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ００５３３－１、ｖ２（最終配列更新日：１９９７年１１月１日））；アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ００５３３－２、ｖ１）（アイソフォーム１に対して置換Ｆ４０４Ｌ及びＬ４０５Ｓを含み、アイソフォーム１の位置４０６～１２１０に対応するアミノ酸配列を欠く）；アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ００５３３－３、ｖ１）（アイソフォーム１の位置６２８～７０５に置換を含み、アイソフォーム１の位置７０６～１２１０に対応するアミノ酸配列を欠く）；及びアイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ００５３３－４）（アイソフォーム１に対して置換Ｃ６２８Ｓを含み、アイソフォーム１の位置６２９～１２１０に対応するアミノ酸配列を欠く）が生じる。

【0107】

ＥＧＦＲの構造及び機能は、例えば、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００８）３７：３５３－３７３．でレビューされている。ＥＧＦＲは、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーの受容体である膜貫通タンパク質である。受容体は、大きな細胞外領域、単一の膜貫通ドメイン、細胞内の膜近傍ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、及びＣ末端調節領域を含む。ＥＧＦＲがリガンドに結合すると、受容体の二量体化、及びＥＧＦＲのＣ末端調節領域のいくつかのチロシン残基（Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０６８、Ｙ１１４８及びＹ１１７３）の自己リン酸化が誘導される。

【0108】

異常なＥＧＦＲ発現／活性は、神経系障害及び多くの癌を含む多くの疾患に関係している。

【0109】

本明細書において、「ＥＧＦＲ」は、任意の種のＥＧＦＲを指し、任意の種のＥＧＦＲアイソフォーム、断片、バリアント、又は相同体を含む。

【0110】

ｃＭｅｔ
ヒトｃＭＥＴ（肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）又はチロシンタンパク質キナーゼＭｅｔとしても知られる）は、ＵｎｉＰｒｏｔＰ０８５８１によって特定されたタンパク質である。ヒトＭＥＴ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、３つのアイソフォーム：アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０８５８１－１、ｖ４（最終配列更新日：２００９年７月７日））；アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０８５８１－２）（アイソフォーム１の位置７５５にアミノ酸配列「ＳＴＷＷＫＥＰＬＮＩＶＳＦＬＦＣＦＡＳ」が挿入されたもの）；及び可溶性ｍｅｔバリアント４としても知られるアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０８５８１－３）（アイソフォーム１の位置７５５～７６４に対応するアミノ酸配列が「ＲＨＶＮＩＡＬＩＱＲ」に置換され、さらにアイソフォーム１の位置７６５～１３９０に対応するアミノ酸配列を欠く）が生じる。

【0111】

ｃＭＥＴの構造は、例えばＧｈｅｒａｒｄｉ，２００３でレビューされており、これは全体として参照により本明細書に組み込まれる。ｃＭＥＴは、ジスルフィド結合したアルファ鎖（５０ｋＤａ）及びベータ鎖（１４５ｋＤａ）から構成されるヘテロ二量体である。ｃＭＥＴは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）への結合を媒介するＮ末端Ｓｅｍａドメインと、細胞内キナーゼドメインを含む。細胞表面でのリガンド結合は、下流のシグナル伝達分子のドッキング部位、及びいくつかのシグナル伝達カスケードの活性化を提供する、その細胞内ドメイン上のｃＭＥＴの自己リン酸化を誘導する。

【0112】

ｃＭＥＴは上皮細胞の表面の正常組織で発現する。ｃＭＥＴの過剰発現は多くのヒトの腫瘍及び癌で観察されており、転移性表現型及び予後不良と関連することがよくある。ｃＭＥＴ発現レベルが高いことが観察されている癌の例としては、非小細胞肺癌、膵臓癌、大腸癌、頭頸部扁平上皮癌、乳癌及び食道胃癌が挙げられる。これらの癌では、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの共発現がよく観察される。

【0113】

抗体又はその抗原結合断片
「抗体」という用語は、天然に生成されたのか、又は部分的若しくは完全に合成によって生成されたのかに関わらない免疫グロブリンについて説明するものである。抗体は、ヒト又はヒト化抗体であってよい。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体の例には、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）などの免疫グロブリンのアイソタイプがあり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプのサブクラス、並びにこれらの断片がある。

【0114】

従って「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、それらが関連する標的分子に結合することが示される限り、抗体断片を含む。抗体断片の例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ_２、ダイアボディー、トリアボディー、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ミニボディー及び単一ドメイン抗体（例えば、ＶｈＨ）などが挙げられる。文脈上別の解釈を要する場合を除き、本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、従って「抗体又はその断片」に相当するものである。

【0115】

抗体及びそれらを構築する方法及びその使用は、当技術分野においてよく知られており、例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６－１１３６（２００５）に記載されている。元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を生成するために、モノクローナル抗体及び他の抗体を入手し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用することが可能である。そのような技法には、１つの抗体のＣＤＲ又は可変領域を異なる抗体に導入することが含まれ得る（欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号明細書、ＧＢ２１８８６３８Ａ号明細書、及び欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号明細書）。

【0116】

モノクローナル抗体技術に関連する現在の技法の観点から、大部分の抗原に対する抗体を調製することができる。抗原結合ドメインは、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）であってもよく、又は合成抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ））であってもよい。選択された抗原に好適なモノクローナル抗体は、公知の技法、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）、及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に記載されている技法によって調製してもよい。キメラ抗体については、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９８８で考察されている。

【0117】

本開示による抗体は、抗原結合ドメインを含む。「抗原結合ドメイン」は、標的抗原の全部又は一部と結合する分子の部分を表現する。抗原が大型である場合、抗体は抗原の特定部分のみと結合してもよく、その部分はエピトープと称される。抗体抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供されてもよい。抗体の抗原結合部位は、好ましくは、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬ領域が一緒になってＦｖ領域を構成する。

【0118】

抗原結合ドメインは、一般的に、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、つまり、ＶＨ領域に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、並びにＶＬ領域に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。６つのＣＤＲが一緒になって、抗原結合ドメインのパラトープ（標的抗原に結合する抗原結合ドメインの部分）を定義する。

【0119】

ＶＨ領域及びＶＬ領域は、各ＣＤＲの両側にフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、これによってＣＤＲに足場が提供される。Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＶＨ領域は以下の構造：Ｎ末端－［ＨＦＲ１］－［ＨＣＤＲ１］－［ＨＦＲ２］－［ＨＣＤＲ２］－［ＨＦＲ３］－［ＨＣＤＲ３］－［ＨＦＲ４］－Ｃ末端から構成され、ＶＬ領域は、以下の構造：Ｎ末端－［ＬＦＲ１］－［ＬＣＤＲ１］－［ＬＦＲ２］－［ＬＣＤＲ２］－［ＬＦＲ３］－［ＬＣＤＲ３］－［ＬＦＲ４］－Ｃ末端を含む。

【0120】

抗体のＣＤＲ及びＦＲを定義するためには、Ｋａｂａｔ，１９９１、Ｃｈｏｔｈｉａ，１９８７に記載されているもの、ＬｅＦｒａｎｃ，２０１５に記載されているＩＭＧＴ番号付け、Ｒｅｔｔｅｒ，２００５に記載されているＶＢＡＳＥ２など、いくつかの異なる規則がある。本明細書に記載される抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ及びＦＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，１９９１）に従って定義した。

【0121】

少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む抗体は、そのそれぞれが異なる標的に結合することが可能であり、「二重特異性抗体」と称し得る。対照的に、単一の標的（例えば、ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴ）にのみ結合する抗体は、「単一特異性抗体」と呼ばれる。本発明は、ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメイン、及びｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む化合物（例えば、放射性免疫抱合体）を提供する。

【0122】

抗ＥＧＦＲ抗原結合ドメイン
ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗体のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗体のＦＲをさらに含む。すなわち、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ結合抗体クローンＲＡＡ２２のＶＨ／ＶＬ領域であるか、又はそれに由来する、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗ＥＧＦＲ抗体クローンＲＡＡ２２の３つのＨＣＤＲ又は３つのＬＣＤＲ、好ましくは３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲを含む。抗体ＲＡＡ２２のＶＨ及びＶＬドメイン配列は本明細書に記載されており、従って、前記抗体の３つのＶＨ及び３つのＶＬドメインＣＤＲは、前記配列から決定され得る。

【0125】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、（１）に従うＶＨ領域を含む：
（１）以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３。

【0126】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、（１）に従うＶＨ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、下記の（２）に従うＦＲをさらに含む：
（２）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＦＲ１
配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＦＲ２
配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＦＲ３
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＨＦＲ４、
又はＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、若しくはＨＦＲ４の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント。

【0127】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（３）に従うＶＨ領域を含む：
（３）（１）に従うＣＤＲと（２）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。

【0128】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、（４）に従うＶＨ領域を含む：
（４）配列番号１５の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ領域。

【0129】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（５）に従うＶＬ領域を含む：
（５）以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記の（５）に従うＶＬ領域を含み、ここで、ＶＬ領域は、下記の（６）に従うＦＲをさらに含む：
（６）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬＦＲ１
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬＦＲ２
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬＦＲ３
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＦＲ４、
又はＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、若しくはＬＦＲ４の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記の（５）に従うＣＤＲと上記の（６）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（７）に従うＶＬ領域を含む：
（７）配列番号１６の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ領域。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記の（１）～（４）のいずれか１つに従うＶＨ領域、及び上記の（５）～（７）のいずれか１つに従うＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、（１）、（３）及び（４）のいずれか１つに従うＶＨ領域、並びに（５）及び（７）のいずれか１つに従うＶＬ領域を含む。

【0134】

抗ｃＭＥＴ抗原結合ドメイン
ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗体のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗体のＦＲをさらに含む。すなわち、いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるｃＭＥＴ結合抗体クローン（すなわち、抗ｃＭＥＴ抗体クローンＢ０９－ＧＬ）のＶＨ／ＶＬ領域であるか、又はそれに由来する、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴ結合抗体クローンＢ０９－ＧＬの３つのＨＣＤＲ又は３つのＬＣＤＲ、好ましくは３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲを含む。抗体Ｂ０９－ＧＬのＶＨ及びＶＬドメイン配列は本明細書に記載されており、従って、前記抗体の３つのＶＨ及び３つのＶＬドメインＣＤＲは、前記配列から決定され得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（８）に従うＶＨ領域を含む：
（８）以下のＣＤＲを含むＶＨ領域：
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３。

【0138】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記の（８）に従うＶＨ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、下記の（９）に従うＦＲをさらに含む：
（９）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＨＦＲ１
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＨＦＲ２
配列番号２５のアミノ酸配列を有するＨＦＲ３
配列番号２６のアミノ酸配列を有するＨＦＲ４、
又はＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、若しくはＨＦＲ４の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント。

【0139】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（１０）に従うＶＨを含む：
（１０）（８）に従うＣＤＲと（９）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。

【0140】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（１１）に従うＶＨ領域を含む：
（１１）配列番号３１の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ領域。

【0141】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（１２）に従うＶＬ領域を含む：
（１２）以下のＣＤＲを含むＶＬ領域：
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３。

【0142】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記の（１２）に従うＶＬ領域を含み、ここで、ＶＬ領域は、下記の（１３）に従うＦＲをさらに含む：
（１３）配列番号２７のアミノ酸配列を有するＬＦＲ１
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＬＦＲ２
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＬＦＲ３
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＬＦＲ４、
又はＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、若しくはＬＦＲ４の１つ以上における１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたバリアント。

【0143】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（１４）に従うＶＬ領域を含む：
（１４）（１２）に従うＣＤＲと（１３）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。

【0144】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、下記の（１５）に従うＶＬ領域を含む：
（１５）配列番号３２の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ領域。

【0145】

いくつかの実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記の（８）～（１１）のいずれか１つに従うＶＨ領域、及び上記の（１２）～（１５）のいずれか１つに従うＶＬ領域を含む。

【0146】

二重特異性抗体の抗原結合ドメイン
本発明は、放射性ペイロードに抱合した抗体（すなわち二重特異性抗体）又はその抗原結合断片を含む、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）を提供し、ここで、放射性免疫抱合体の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインのＣＤＲを含む第１の抗原結合ドメイン、及びｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインのＣＤＲを含む第２の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインのＣＤＲ及びＦＲを含み、第２の抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインのＣＤＲ及びＦＲを含む。すなわち、いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又は抗原結合断片は、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、第１の抗原結合ドメインと、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、第２の抗原結合ドメインとを含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ結合抗体クローンＲＡＡ２２のＶＨ／ＶＬ領域であるか、又はそれに由来する、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、ｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴ結合抗体クローンＢ０９－ＧＬのＶＨ／ＶＬ領域であるか、又はそれに由来する、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。このような二重特異性抗体は、「ＲＡＡ２２／Ｂ０９」又は「ＲＡＡ２２／Ｂ０９二重特異性抗体」と呼ばれ得る。

【0148】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下：
上記の（１）～（４）のいずれか１つに従うＶＨ領域、及び上記の（５）～（７）のいずれか１つに従うＶＬ領域；
を含み、第２の抗原結合ドメインは、以下：
上記の（８）～（１１）のいずれか１つに従うＶＨ領域、及び上記の（１２）～（１５）のいずれか１つに従うＶＬ領域を含む。

【0149】

特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、以下：
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することが可能な第１の抗原結合ドメイン；及び
ｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメイン
を含む、抗体又はその抗原結合断片を含み、
ここで、第１の抗原結合ドメインは、以下を含む：
（ｉ）以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；及び
（ｉｉ）以下のＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３。

【0150】

特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下：
配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び
配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含み、且つ／又は第２の抗原結合ドメインは、以下：
配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び
配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。

【0151】

定常領域
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン重鎖定常（ＣＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭの重鎖定常配列であるか、又はそれに由来する。

【0152】

いくつかの実施形態では、ＣＨ領域は、ヒト免疫グロブリンＧ１の定常領域（ＩＧＨＧ１；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８５７－１（ｖ１）；配列番号３３）又はその断片である。

【0153】

いくつかの実施形態では、ＣＨ領域は、配列番号３９又は４０の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されるＶＨ領域及び本明細書に記載されるＣＨ領域を含むか、又はそれからなる、重鎖を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬ領域は、配列番号３４に記載されるカッパＣＬ領域であるか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＬ領域は、配列番号４１に記載されるラムダＣＬ領域であるか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：配列番号３４に記載されるカッパＣＬ領域であるか、又はそれに由来する、第１のＣＬ領域；及び配列番号４１に記載されるラムダＣＬ領域であるか、又はそれに由来する、第２のＣＬ領域。

【0156】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
第１の抗原結合ドメインのＶＨ領域と、第１の重鎖定常（ＣＨ）領域又はその断片とを含む、第１の重鎖；
第１の抗原結合ドメインのＶＬ領域と、第１の軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片とを含む、第１の軽鎖；
第２の抗原結合ドメインのＶＨ領域と、第２の重鎖定常（ＣＨ）領域又はその断片とを含む、第２の重鎖；及び
第２の抗原結合ドメインのＶＬ領域と、第２の軽鎖定常（ＣＬ）領域又はその断片とを含む、第２の軽鎖。

【0157】

抗体又はその抗原結合断片が第１のＶＨ領域及び第１のＣＨ領域を含む場合、これらの領域が一緒になって抗体又はその抗原結合断片の第１の重鎖を形成し、すなわち第１のＶＨ領域と第１のＣＨ領域が互いに連結されていることが理解されるであろう。同様に、第２のＶＨ領域と第２のＣＨ領域は、抗体又はその抗原結合断片の第２の重鎖を形成し；第１のＶＬ領域と第１のＣＬ領域は、抗体又はその抗原結合断片の第１の軽鎖を形成し；第２のＶＬ領域と第２のＣＬ領域は、抗体又はその抗原結合断片の第２の軽鎖を形成する。

【0158】

いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、第１及び第２の重鎖を含み、ここで、
（ｉ）第１の重鎖は、配列番号３５に記載される重鎖の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）第２の重鎖は、配列番号３６に記載される重鎖の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されるＶＬ領域及び本明細書に記載されるＣＬ領域を含むか、又はそれからなる、軽鎖を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、第１及び第２の軽鎖を含み、ここで、
（ｉ）第１の軽鎖は、配列番号３７に記載される軽鎖の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）第２の軽鎖は、配列番号３８に記載される軽鎖の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0161】

本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片のＣＨ、ＣＬ、重鎖及び／又は軽鎖は、例えば、Ｆｃエフェクター機能を抑制又は低減するため、ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片の形成を促進するため、同族の重鎖及び軽鎖の対合の有効性を高めるため、及び／又は以下でより詳細に説明されるように抱合体の形成を補助するための、１つ以上の改変を含み得る。改変されたＣＨ、ＣＬ、重鎖、及び軽鎖は、それぞれ改変ＣＨ、ＣＬ、重鎖、及び軽鎖と称され得る。

【0162】

化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制するために、重鎖のＣＨ領域に変異を含み得る。このような変異は、Ｆｃエフェクター機能を抑制又は低下させる。抗体と１つ以上のＦｃγ受容体及び補体との結合を低減又は抑制する変異は公知であり、例えばＯｒｇａｎｅｓｙａｎ，２００８に記載されるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓの「三重変異」又は「ＴＭ」が含まれる。抗体エフェクター機能を調節することが知られている他の変異については、例えばＷａｎｇ，２０１８に記載されている。

【0163】

三重変異を含むＣＨ領域の例は、配列番号３９及び４０である。従って、いくつかの実施形態では、第１及び第２の重鎖の一方は、配列番号３９に記載される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ領域を含み、他方の重鎖は、配列番号４０に記載される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ領域を含み、ＣＨ領域の一方又は両方（好ましくは両方）は、位置２３４にフェニルアラニン、位置２３５にグルタミン酸、及び位置３３１にセリンを含み、ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0164】

三重変異を含有するＣＨ領域を含む本開示の重鎖の例は、配列番号３５及び３６である。従って、いくつかの実施形態では、第１及び第２の重鎖の一方は、配列番号３５に記載される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、他方の重鎖は、配列番号３６に記載される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、重鎖（ｈａｖｅ ｃｈａｉｎ）の一方又は両方（好ましくは両方）は、位置２３４にフェニルアラニン、位置２３５にグルタミン酸、及び位置３３１にセリンを含み、ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0165】

ＶＬ及びＣＬ領域、並びに化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片のＶＨ領域及びＣＨ１領域が一緒になってＦａｂ領域を構成する。化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片の残りの部分は、Ｆｃ領域を構成する。

【0166】

特に明記しない限り、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含む定常ドメインのアミノ酸残基の位置は、ＥＵ番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎ，２００７）に従って番号が付与される。

【0167】

二重特異性構成
本発明は、本明細書に開示される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）内の非対称ＩｇＧ様二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。非対称二重特異性分子は、典型的には、各標的に対して一価である。例えば、Ｋｌｅｉｎ ２０１２に記載されているように、一価の二重特異性ＩｇＧの概念は、それらが（ｉ）受容体のホモ二量体化が生じない、（ｉｉ）それぞれの抗原の結合力を失うことによって非標的組織の毒性を潜在的に減少させている、及び（ｉｉｉ）両方の抗原が選択的に制限されるか、又は標的細胞上で豊富に発現するかのいずれかである場合に、より良好な選択性を有するという点から、独自の治療上のニッチを有するものと考えられている。従って、いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、非対称ＩｇＧ様二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。

【0168】

非対称ＩｇＧ様二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化と、同族の軽鎖及び重鎖の正確な対合とを伴う。重鎖のヘテロ二量体化は、ノブ・イントゥ・ホール、ＣＨ３の静電的ステアリング、改変ドメインとロイシンジッパーとを交換したＣＨ３鎖などの、いくつかの技術によって対処することができる。正確な軽鎖及び重鎖の対合は、共通軽鎖の使用、ＣＨ１とＣＬとの間のドメインのクロスオーバー、重鎖及び軽鎖をリンカーで結合すること、２つの個別のモノクローナルからインビトロで重鎖－軽鎖二量体を会合すること、Ｆａｂドメイン全体の界面改変、又はＣＨ１／ＣＬ界面のジスルフィド改変とともに、これらの重鎖ヘテロ二量体化技術のうちの１つを使用して確実に行うことができる。

【0169】

非対称ＩｇＧ様二重特異性抗体の特定の代表的な構成を「ＤｕｅｔＭａｂ」と称する。ＤｕｅｔＭａｂ抗体は、２つの異なる重鎖をヘテロ二量体化するためにＫＩＨ技術を使用し、ＣＨ１－ＣＬ界面のうちの１つの天然のジスルフィド結合を改変ジスルフィド結合に置き換えることによって、同族の重鎖と軽鎖とを対合する効率を増大させるものである。ＤｕｅｔＭａｂに関する開示は、例えば、その全体が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第９，５２７，９２７号明細書及びＭａｚｏｒ，２０１５に見出すことができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
（ａ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、改変重鎖；及び
（ｂ）改変ＣＬが天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、対応する改変ＣＬ領域
ここで、
（ｉ）第１の重鎖は改変ＣＨ領域を含み、第１の軽鎖は対応する改変ＣＬ領域を含むか；又は
（ｉｉ）第２の重鎖は改変ＣＨ領域を含み、第２の軽鎖は対応する改変ＣＬ領域を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換から得られる、改変ＣＨ領域の置換システインと、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換から得られる、対応する改変ＣＬ領域の置換システインとが、ジスルフィド結合を形成することができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、改変ＣＨ領域は、位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み；対応する改変ＣＬ領域は、位置１２１に天然非システインアミノ酸からシステインへの置換を含み、ここで、定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0173】

いくつかの実施形態では、改変ＣＨ領域は、位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換、及び位置２１９に天然システインアミノ酸から非システインアミノ酸、例えば、バリンへの置換を含み、対応する改変ＣＬ領域は、位置１２１に天然非システインアミノ酸からシステインへの置換、及び位置２１４に天然システインアミノ酸から非システインアミノ酸、例えば、バリンへの置換を含み、ここで、定常領域の番号付けはＥＵインデックスに従う。

【0174】

いくつかの実施形態では、本抗体又はその抗原結合断片は、第２のＣＨ領域及び対応する第２の軽鎖を含み、ここで、第２のＣＨ領域及び対応する第２のＣＬは、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含まず、天然システインから非システインアミノ酸への置換を含まない。

【0175】

化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片の機能特性
結合親和性
本明細書に記載される放射性免疫抱合体の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲに対して特定の親和性を有する、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメイン、及び／又はｃＭＥＴに対して特定の親和性を有する、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインによって特徴付けられ得る。化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片の、ヒト、マウス、又はカニクイザルのＥＧＦＲ又はｃＭＥＴなどの同族抗原への結合親和性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。結合親和性は、抗体又はその抗原結合断片、例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインとｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の一部として、決定することができる。或いは、結合親和性は、ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴに対して単一特異性の抗体又はその抗原結合断片を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、結合親和性は、本明細書で提供されるか、又は当技術分野で知られるＢＩＡＣｏｒｅを使用して決定される。

【0176】

結合親和性は、典型的にＫｄ（抗原結合ドメインとその抗原との間での平衡解離定数）によって測定する。十分に理解されているように、Ｋｄ値が低ければ低いほど、抗原結合ドメインの結合親和性が高くなる。例えば、１０ｎＭのＫｄで標的に結合することが可能な抗原結合ドメインは、１００ｎＭのＫｄで同じ標的に結合することが可能な抗原結合ドメインよりも高い親和性で前記標的に結合すると考えられる。

【0177】

ヒトＥＧＦＲへの言及は、配列番号４２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを含むポリペプチドを指し得る。マウスＥＧＦＲへの言及は、カタログ番号５１０９１－Ｍ０８ＨでＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手可能な分子から生成されたポリペプチドを指し得る。カニクイザルＥＧＦＲへの言及は、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を指し得る。ヒトｃＭＥＴへの言及は、配列番号４３に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し得る。マウスｃＭＥＴへの言及は、カタログ番号５０６２２－Ｍ０８ＨでＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手可能な分子から生成されたポリペプチドを指し得る。カニクイザルｃＭＥＴへの言及は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列を指し得る。

【0178】

ＥＧＦＲ親和性
本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、低親和性でＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインを含み得る。本明細書において、「低親和性」は、１０ｎＭ以上の解離定数（Ｋｄ）でヒトＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインを指す。このような低親和性ＥＧＦＲ抗原結合ドメインを含む、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又は抗原結合断片は、皮膚毒性などの正常組織におけるオンターゲット毒性の低下を示し得、従って、「より高い親和性」でヒトＥＧＦＲに結合することが可能なＥＧＦＲ抗原結合ドメインを含む抱合体と比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る。本明細書において、「より高い親和性」又は「高親和性」は、１０ｎＭ未満のＫｄでヒトＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインを指す。

【0179】

ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、又は４０ｎＭ以上のＫｄを有する親和性でヒトＥＧＦＲに結合し得る。或いは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１０～１００ｎＭ、２０～１００ｎＭ、３０～１００ｎＭ、４０～１００ｎＭ、１０～８０ｎＭ、２０～８０ｎＭ、３０～８０ｎＭ、４０～８０ｎＭ、１０～７０ｎＭ、２０～７０ｎＭ、３０～７０ｎＭ、４０～７０ｎＭ、１０～６０ｎＭ、２０～６０ｎＭ、３０～６０ｎＭ、４０～６０ｎＭ、１０～５０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、３０～５０ｎＭ、又は４０～５０ｎＭのＫｄでヒトＥＧＦＲに結合し得る。

【0180】

ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗体ＱＤ６の重鎖可変（ＶＨ）領域配列及び軽鎖可変（ＶＬ）領域配列（それぞれ配列番号４７及び４８に記載）を含む抗原結合ドメインの親和性よりも低い親和性で、ヒトＥＧＦＲに結合し得る。

【0181】

例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗体ＱＤ６の重鎖配列及び軽鎖配列（それぞれ配列番号４７及び４８に記載）を含む抗原結合ドメインがヒトＥＧＦＲに結合するＫｄよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、又は７倍高いＫｄを有する親和性でヒトＥＧＦＲに結合し得る。例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗体ＱＤ６の重鎖配列及び軽鎖配列（それぞれ配列番号４７及び４８に記載）を含む抗原結合ドメインがヒトＥＧＦＲに結合するＫｄよりも２～１０倍高い、３～１０倍高い、４～１０倍高い、５～１０倍高い、６～１０倍高い、７～１０倍高い、２～９倍高い、３～９倍高い、４～９倍高い、５～９倍高い、６～９倍高い、７～９倍高い、２～８倍高い、３～８倍高い、４～８倍高い、５～８倍高い、６～８倍高い、７～８倍高いＫｄを有する親和性でヒトＥＧＦＲに結合し得る。

【0182】

ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗体ＲＡＡ２２の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列（それぞれ配列番号１５及び１６に記載）を含む抗原結合ドメインの親和性と同様の親和性で、ヒトＥＧＦＲに結合し得る。例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗体ＲＡＡ２２の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１５及び１６に記載）を含む抗原結合ドメインがヒトＥＧＦＲに結合するＫｄよりも５倍差未満、４倍差未満、３倍差未満、２倍差未満、１倍差未満、又は０．５倍差未満のＫｄを有する親和性でヒトＥＧＦＲに結合し得る。

【0183】

ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、カニクイザルＥＧＦＲにも結合することが可能であり得る。例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、又は２５０ｎＭ未満のＫｄを有する親和性でカニクイザルＥＧＦＲに結合し得る。或いは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１００～７００ｎＭ、１００～６００ｎＭ、１００～５００ｎＭ、１００～４００ｎＭ、１００～３００ｎＭ、１５０～２５０ｎＭ、１００～２００ｎＭのＫｄを有する親和性でカニクイザルＥＧＦＲに結合し得る。ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインがヒトＥＧＦＲに結合するＫｄよりも１０、９、８、７、６、５、４、３倍以下高いＫｄでカニクイザルＥＧＦＲに結合し得る。

【0184】

ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、マウスＥＧＦＲにも結合することが可能であり得る。例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１μＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、又は６５０ｎＭ未満のＫｄを有する親和性でマウスＥＧＦＲに結合し得る。或いは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１００ｎＭ～１μＭ、２００～９００ｎＭ、３００～８００ｎＭ、４００～７００ｎＭ、４００～６００ｎＭ、又は４５０～５５０ｎＭのＫｄでマウスＥＧＦＲに結合し得る。

【0185】

好ましくは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲ及びカニクイザルＥＧＦＲに結合することが可能である。この交差反応性は、前臨床開発中にカニクイザルで抗体及び抱合体の投与量及び安全性の試験を実施できるため、有利である。さらに好ましくは、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲ、カニクイザルＥＧＦＲ、及びマウスＥＧＦＲに結合することが可能である。例えば、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記のＫｄ値でヒトＥＧＦＲ、カニクイザルＥＧＦＲ、及びマウスＥＧＦＲに結合することが可能であり得る（例えば、１０ｎＭ～１００ｎＭのＫｄでヒトＥＧＦＲ、１００ｎＭ～７００ｎＭのＫｄでカニクイザルＥＧＦＲ、及び１００ｎＭ～１μＭのＫｄでマウスＥＧＦＲ）。

【0186】

ｃＭＥＴ親和性
ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ又は２．５ｎＭ未満のＫｄを有する親和性でヒトｃＭＥＴに結合し得る。或いは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１～２０ｎＭ、１～１５ｎＭ、１～１０ｎＭ、１～９ｎＭ、１～８ｎＭ、１～７ｎＭ、１～６ｎＭ、１～５ｎＭ、１～４ｎＭ、１～３ｎＭ、１～２．５ｎＭ、又は２～２．５ｎＭのＫｄを有する親和性でヒトｃＭＥＴに結合し得る。

【0187】

ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、カニクイザルＥＧＦＲに結合することが可能であり得る。例えば、ｃＭＥＴに結合することが可能であり得る抗原結合ドメインは、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、又は２．５ｎＭ未満のＫｄを有する親和性でカニクイザルｃＭＥＴに結合し得る。或いは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、１～２０ｎＭ、１～１５ｎＭ、１～１０ｎＭ、１～９ｎＭ、１～８ｎＭ、１～７ｎＭ、１～６ｎＭ、１～５ｎＭ、１～４ｎＭ、１～３ｎＭ、１～２．５ｎＭ、又は２～２．５ｎＭのＫｄを有する親和性でカニクイザルｃＭＥＴに結合し得る。ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインがヒトｃＭＥＴに結合するＫｄよりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１倍以下高いＫｄを有する親和性でカニクイザルｃＭＥＴに結合し得る。

【0188】

好ましくは、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ヒトｃＭＥＴ及びカニクイザルｃＭＥＴに結合することが可能である。この交差反応性は、前臨床開発中にカニクイザルで抗体の投与量及び安全性の試験を実施できるため、有利である。例えば、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、上記のＫｄ値でヒトｃＭＥＴ及びカニクイザルｃＭＥＴに結合することが可能であり得る（例えば、１ｎＭ～２０ｎＭのＫｄでヒトｃＭＥＴ、及び１ｎＭ～２０ｎＭのＫｄでカニクイザルｃＭＥＴ）。

【0189】

特異的結合
本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲに特異的に結合することが可能な抗原結合ドメインを含み得る。本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又は抗原結合断片は、ｃＭＥＴに特異的に結合することが可能な抗原結合ドメインを含み得る。本明細書に記載される化合物の抗体又は抗原結合断片（例えば、放射性免疫抱合体）は、ＥＧＦＲに特異的に結合することが可能な第１の抗原結合ドメインである、ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインと、ｃＭＥＴに特異的に結合することが可能な第１の抗原結合ドメインである、ｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインとを含み得る。

【0190】

「特異的な」という用語は、抗原結合ドメインがその特異的な結合パートナー（ここでは、ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴ）以外の分子に任意の有意な結合を示さない状態を意味し得る。そのような分子は、「非標的分子」と呼ばれる。「特異的」という用語は、抗体又はその抗原結合断片が、複数の抗原によって輸送されるＥＧＦＲ又はｃＭＥＴ上のエピトープなどの特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用され、その場合、抗体又はその抗原結合断片は、エピトープを輸送する様々な抗原に結合することができる。

【0191】

いくつかの実施形態では、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）によって、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定したときに、非標的分子に対する結合の程度が抗体又はその抗原結合断片の標的に対する結合の程度の約１０％未満である場合、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片を非標的分子に任意の有意な結合を示さないとみなす。或いは、結合特異性は結合親和性の観点から反映され得、ここで、本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、別の非標的分子に対する親和性よりも少なくとも０．１桁大きい親和性で、ＥＧＦＲ及び／又はｃＭＥＴに結合することが可能である。いくつかの実施形態では、本開示の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、別の非標的分子に対する親和性よりも少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、又は２．０のうちの１つの桁よりも大きい親和性で、ＥＧＦＲ及び／又はｃＭＥＴに結合することが可能である。

【0192】

ＥＧＦＲは、４つの近縁受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のサブファミリーであるＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーである。ＲＡＡ２２抗原結合ドメインはＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４への結合を示さず、この抗原結合ドメインがＥＧＦＲに特異的に結合することが示された。従って、特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合することが可能な抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３若しくはＨＥＲ４に結合しないか、又は有意な結合を示さない。

【0193】

ｃＭＥＴは、Ｒｏｎ及びＳｅｍａ ４ａを含む、受容体チロシンキナーゼのサブファミリーのメンバーである。Ｂ０９－ＧＬ抗原結合ドメインはＲｏｎ及びＳｅｍａ４ａへの結合を示さず、この抗原結合ドメインがｃＭＥＴに特異的に結合することが示された。従って、特定の実施形態では、ｃＭＥＴに結合することが可能な抗原結合ドメインは、Ｒｏｎ、Ｓｅｍａ４ａに結合しないか、又は有意な結合を示さない。

【0194】

同時会合
本明細書に記載される、ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインとｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインとを含む、本開示の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、両方の抗原結合ドメインがそれぞれのＥＧＦＲ及びｃＭＥＴ標的に同時に会合する能力によって特徴付けられ得る。多数の腫瘍がＥＧＦＲ及びｃＭＥＴの両方を共発現することが知られており、従って本開示の化合物によって標的化できるため、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに同時に会合する能力を有する、本開示の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は有利であると予想される。従って、いくつかの実施形態では、本発明で開示される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに同時に会合することができる。

【0195】

同時会合を測定するこれらの方法のさらなる詳細は、実施例で見ることができる。

【0196】

抗体（又はその抗原結合断片）の内在化
本明細書に記載される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、効率的な内在化を媒介する能力によって特徴付けられ得る。

【0197】

抗体又はその抗原結合断片（又は前記抗体又はその抗原結合断片を含む化合物（例えば、放射性免疫抱合体））の細胞による内在化は、生細胞を抗体又はその抗原結合断片と接触させ、内在化に十分な時間の経過後に抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）を検出することによって分析することができる。内在化は、抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の局在化を検出することによって決定することができる。抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）が細胞表面に残留する場合（例えば、細胞表面で検出され、且つ／又は細胞内部で検出されない場合）、抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は内在化されていないと決定される。抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）が細胞内（例えば、細胞質又は細胞小器官に局在）で検出された場合、抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は内在化されたと決定される。

【0198】

抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）が効率的な内在化を媒介できるかどうかを視覚化する例示的な方法としては、酸性ｐＨで蛍光を発するｐＨ感受性染料で抗体を標識し、これらの標識された抗体又は抱合体を細胞に加えることが挙げられる。細胞への内在化は、蛍光をモニタリングすることで検出できる。観察される蛍光が、特定の期間、例えば４８時間にわたって、標識された非結合対照抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の蛍光よりも大きい場合、抗体（又はその抗原結合断片）又は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、リソソームへの内在化及び送達を媒介できるとみなされる。抗体（又はその抗原結合断片）の内在化を視覚化するこの方法の詳細は、実施例で見ることができる。

【0199】

ＥＧＦＲに結合することが可能な第１の抗原結合ドメインとｃＭＥＴに結合することが可能な第２の抗原結合ドメインとを含む、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴ 単一特異性対照と比較した場合、より効率的な内在化を媒介するその能力によって特徴付けられ得る。この特性を示す化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の抗体又はその抗原結合断片は、両方の標的を共発現する腫瘍細胞に対してより高い選択性を示し、有意なレベルの共発現を示さない正常組織における抗体又はその抗原結合断片の影響を最小限に抑えることができるため、有利であると予想される。

【0200】

いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗体又は抗原結合断片を含む化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）が本明細書に提供され、ここで、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変ドメインは、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含み、ここで、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３は、以下に示す配列付録に記載される抗体のものである。

【0201】

いくつかの実施形態では、配列付録に示される抗体のバリアントである抗体又は抗原結合断片を含む化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）が提供され、そのような抗体又は抗原結合断片は、配列付録に記載される抗体のＣＤＲ配列から、ＣＤＲあたり３つ以下のアミノ酸残基（例えば、３つ又は２つ又は１つのアミノ酸残基）だけ異なるＣＤＲ配列を有する。いくつかの実施形態では、配列付録に示される抗体のバリアントである抗体又は抗原結合断片を含む化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）が提供され、そのような抗体又は抗原結合断片は、配列付録に記載される抗体のＣＤＲから、合計で３つ以下のアミノ酸残基（例えば、３つ又は２つ又は１つのアミノ酸残基）だけ異なる配列を有する６つのＣＤＲのセットを有する。

【0202】

いくつかの実施形態では、配列付録に記載される抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変配列を含む、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗体又は抗原結合断片を含む化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）が提供される。いくつかの実施形態では、配列付録に示される抗体のバリアントである抗体又は抗原結合断片を含む化合物（例えば、免疫抱合体又は放射性免疫抱合体）が提供され、そのような抗体又は抗原結合断片は、（１）配列付録に記載される抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン；及び（２）配列付録に記載される同じ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ドメインを有する。

【0203】

配列付録
抗ＥＧＦＲ抗体クローンＲＡＡ２２のＣＤＲ配列
ＨＣＤＲ１－ＤＮＤＦＳ（配列番号１）
ＨＣＤＲ２－ＡＩＶＡＶＦＲＴＥＴＹＡＱＫＦＱＤ（配列番号２）
ＨＣＤＲ３－ＲＬＭＳＡＩＳＧＰＧＡＰＬＬＭ（配列番号３）
ＬＣＤＲ１－ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（配列番号４）
ＬＣＤＲ２－ＤＶＳＫＲＰＳ（配列番号５）
ＬＣＤＲ３－ＳＳＹＴＳＳＤＴＬＥＩ（配列番号６）
抗ＥＧＦＲ抗体クローンＲＡＡ２２のＦＲ配列
ＨＦＲ１－ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ（配列番号７）
ＨＦＲ２－ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ（配列番号８）
ＨＦＲ３－ＲＶＫＩＴＡＤＩＳＴＲＴＴＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号９）
ＨＦＲ４－ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
ＬＦＲ１－ＱＳＡＬＴＱＰＲＳＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣ（配列番号１１）
ＬＦＲ２－ＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹ（配列番号１２）
ＬＦＲ３－ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１３）
ＬＦＲ４－ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１４）
抗ＥＧＦＲ抗体クローンＲＡＡ２２の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列（配列番号１５）

【化9】

抗ＥＧＦＲ抗体クローンＲＡＡ２２の軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列（配列番号１６）：

【化10】

抗ｃ－Ｍｅｔ抗体クローンＢ０９－ＧＬのＣＤＲ配列
ＨＣＤＲ１－ＤＹＹＩＨ（配列番号１７）
ＨＣＤＲ２－ＷＭＮＰＮＳＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１８）
ＨＣＤＲ３－ＧＱＧＹＴＨＳ（配列番号１９）
ＬＣＤＲ１－ＲＡＳＥＧＩＹＨＷＬＡ（配列番号２０）
ＬＣＤＲ２－ＫＡＳＳＬＡＳ（配列番号２１）
ＬＣＤＲ３－ＱＱＹＳＮＹＰＰＴ（配列番号２２）
抗ｃ－Ｍｅｔ抗体クローンＢ０９－ＧＬのＦＲ配列
ＨＦＲ１－ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号２３）
ＨＦＲ２－ＷＶＲＱＡＴＧＱＧＬＥＷＭＧ（配列番号２４）
ＨＦＲ３－ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２５）
ＨＦＲ４－ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号２６）
ＬＦＲ１－ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２７）
ＬＦＲ２－ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２８）
ＬＦＲ３－ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２９）
ＬＦＲ４－ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３０）
抗ｃ－Ｍｅｔ抗体クローンＢ０９－ＧＬの重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列（配列番号３１）：

【化11】

抗ｃ－Ｍｅｔ抗体クローンＢ０９－ＧＬの軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列（配列番号３２）：

【化12】

ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖定常（ＣＨ）領域のアミノ酸配列（配列番号３３）：

【化13】

野生型ヒト免疫グロブリンカッパ定常領域のアミノ酸配列（配列番号３４）：

【化14】

「ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ ＴＭ」抗体における抗ＥＧＦＲの重鎖のアミノ酸配列（配列番号３５）：
以下の置換は太字及び下線で示される：
三重変異（ＴＭ；Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓ）、「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ）；鎖間システイン変異（Ｆ１２６Ｃ及びＣ２１９Ｖ）；安定化システイン変異（Ｓ３５４Ｃ）（残基の番号付けはＥＵインデックスに従う）。

【化15】

「ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ ＴＭ」抗体における抗ｃＭＥＴの重鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）：
以下の置換は太字及び下線で示される：
三重変異（ＴＭ；Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓ）；「ホール」変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）及び安定化システイン変異（Ｙ３４９Ｃ）（残基の番号付けはＥＵインデックスに従う）。

【化16】

「ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ ＴＭ」抗体における抗ＥＧＦＲの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３７）：
以下の置換は太字及び下線で示される：
Ｓ１２１Ｃ及びＣ２１４Ｖ（番号付けはＥＵインデックスに従う）。

【化17】

「ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ ＴＭ」抗体における抗ｃＭＥＴの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３８）：

【化18】

システイン挿入を伴わず、ＴＭによって、「ノブ」変異、安定化ジスルフィド架橋を形成するシステインを含むように改変された、ヒト免疫グロブリンＧ１ ＣＨ領域のアミノ酸配列（配列番号３９）：
以下の置換は太字及び下線で示される：
三重変異（ＴＭ；Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓ）、「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ）；鎖間システイン変異（Ｆ１２６Ｃ及びＣ２１９Ｖ）；安定化システイン変異（Ｓ３５４Ｃ）（残基の番号付けはＥＵインデックスに従う）。

【化19】

システイン挿入を伴わず、ＴＭによって、「ホール」変異、安定化ジスルフィド架橋を形成するシステインを含むように改変された、ヒト免疫グロブリンＧ１ ＣＨ領域のアミノ酸配列（配列番号４０）：
以下の置換は太字及び下線で示される：
三重変異（ＴＭ；Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓ）；「ホール」変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）及び安定化システイン変異（Ｙ３４９Ｃ）（残基の番号付けはＥＵインデックスに従う）。

【化20】

Ｓ１２１Ｃ及びＣ２１４Ｖ置換を含むように改変されたヒト免疫グロブリンラムダ定常領域のアミノ酸配列（配列番号４１）：

【化21】

ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号４２）：

【化22】

ヒトｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号４３）：

【化23】

カニクイザルｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号４４）：

【化24】

カニクイザルＥＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号４６）：

【化25】

抗ＥＧＦＲ抗体クローンＱＤ６のＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号４７）：

【化26】

抗ＥＧＦＲ抗体クローンＱＤ６のＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号４８）：

【化27】

【0204】

キレート部分又はその金属錯体
キレート部分
好適なキレート部分の例としては、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＯＴＭＡ（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）－α、α’、α”、α’”－テトラメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン）、ＤＯＴＰＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラプロピオン酸）、ＤＯ３ＡＭ－酢酸（２－（４，７，１０－トリス（２－アミノ－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）酢酸）、ＤＯＴＡ－ＧＡ無水物（２，２’，２”－（１０－（２，６－ジオキソテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３－イル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸、ＤＯＴＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンホスホン酸））、ＤＯＴＭＰ（１，４，６，１０－テトラアザシクロデカン－１，４，７，１０－テトラメチレンホスホン酸、ＤＯＴＡ－４ＡＭＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（アセトアミドメチレンホスホン酸）、ＣＢ－ＴＥ２Ａ（１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン－４，１１－二酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、ＮＯＴＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ（メチレンホスホン酸）、ＴＥＴＰＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－テトラプロピオン酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－テトラ酢酸）、ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアザシクロヘキサデカン－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサ酢酸）、ＰＥＰＡ（１，４，７，１０，１３－ペンタアザシクロペンタデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’’－ペンタ酢酸）、Ｈ_４ｏｃｔａｐａ（Ｎ，Ｎ’－ビス（６－カルボキシ－２－ピリジルメチル）－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸）、Ｈ_２ｄｅｄｐａ（１，２－［［６－（カルボキシ）－ピリジン－２－イル］－メチルアミノ］エタン）、Ｈ_６ｐｈｏｓｐａ（Ｎ，Ｎ’－（メチレンホスホネート）－Ｎ，Ｎ’－［６－（メトキシカルボニル）ピリジン－２－イル］－メチル－１，２－ジアミノエタン）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸）、ＤＯ２Ｐ（テトラアザシクロドデカンジメタンホスホン酸）、ＨＰ－ＤＯ３Ａ（ヒドロキシプロピルテトラアザシクロドデカン三酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、デフェロキサミン、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＴＰＡ－ＢＭＡ（ジエチレントリアミン五酢酸－ビスメチルアミド）、八配位ＨＯＰＯ（八配位ヒドロキシピリジノン）、又はポルフィリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0205】

好ましくは、キレート部分は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＯＴＭＡ（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）－α、α’、α”、α’”－テトラメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン）、ＤＯ３ＡＭ－酢酸（２－（４，７，１０－トリス（２－アミノ－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）酢酸）、ＤＯＴＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンホスホン酸））、ＤＯＴＡ－４ＡＭＰ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（アセトアミドメチレンホスホン酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、及びＨＰ－ＤＯ３Ａ（１０－（２－ヒドロキシプロピル）－１，４，７－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－三酢酸）からなる群から選択される。

【0206】

いくつかの実施形態では、キレート部分は、ＤＯＴＡである。

【0207】

いくつかの実施形態では、化合物は、キレート部分の金属錯体を含む。例えば、キレート基は、マンガン、鉄、及びガドリニウムなどの金属、及び本明細書で考察される放射性同位体及び放射性核種のいずれかなどの同位体（例えば、一般的なエネルギー範囲６０～１０，０００ｋｅＶの同位体）との、金属キレートの組み合わせにおいて使用され得る。

【0208】

いくつかの実施形態では、キレート部分は検出剤として有用であり、従って、そのような検出可能なキレート部分を含む化合物は、診断剤又は治療剤として使用することができる。

【0209】

放射性同位体及び放射性核種
いくつかの実施形態では、金属錯体は、放射性核種を含む。好適な放射性同位体及び放射性核種の例としては、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、^８７Ｙ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１１７ｍＳｎ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^{２２７Ｔｈ}、及び^{２２９Ｔｈ}が挙げられるが、これらに限定されない。

【0210】

いくつかの実施形態では、金属錯体は、^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８７Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ｉｎ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^{２２７Ｔｈ}、及び^{２２９Ｔｈ}から選択される放射性核種を含む。

【0211】

特定の実施形態では、金属錯体は、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、及び^２２５Ａｃから選択される放射性核種を含む。特定の実施形態では、金属錯体は、^１７７Ｌｕ又は^２２５Ａｃの放射性核種を含む。

【0212】

いくつかの実施形態では、放射性核種は、アルファ放射体、例えば、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ）、ラジウム－２２３（^２２３Ｒａ）、鉛－２１２（^２１２Ｐｂ）、トリウム－２２７（^{２２７Ｔｈ}）、若しくはテルビウム－１４９（^１４９Ｔｂ）、又はそれらの子孫である。いくつかの実施形態では、アルファ放射体は、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ）又はその子孫である。

【0213】

特定の実施形態では、金属錯体は、^２２５Ａｃのアルファ放射体又はその子孫を含む。

【0214】

リンカー
本発明の化合物は、以下の式Ｉの構造：
Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ
式Ｉ
を含み、ここで、各変数は、上記の概要セクションで定義される。

【0215】

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－としてのリンカー部分を含み、式中、
Ｌ^１は、結合、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり；
ｎは、１～５の整数（両端を含む）であり；
各Ｌ^２は、独立して式：
－Ｘ^１－Ｌ^３－Ｚ^１－
式ＩＩ
の構造を有し、式中、
Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－＊、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＣＨ_２－Ｐｈ－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－ＣＨ_２－Ｐｈ－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－Ｐｈ－ＣＨ_２－＊、－Ｏ－＊、又は－ＮＲ^１－＊であり、式中、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、又は任意選択的に置換されたアリール若しくはヘテロアリールであり；
Ｌ^３は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０アルキル又は任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキル（例えば、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２－２０）であり、
Ｚ^１は、－ＣＨ_２－＃、－Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｓ）－＃、－ＯＣ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＃、－ＮＲ^２Ｃ（Ｏ）－＃、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２－＃、又は－ＮＲ^２－＃であり、式中、「＃」は、Ｂへの接続点を示し、Ｒ^２は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである。

【0216】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル又は任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキルである。特定の実施形態では、Ｌ^１は、置換Ｃ_１－Ｃ_６アルキル又は置換Ｃ_１－Ｃ_６ヘテロアルキルであり、置換基は、ヘテロアリール基（例えば、窒素含有６員ヘテロアリール）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル（ａｌｋｙ）である。例えば、Ｌ^１は、－ＣＨ_２ＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ^１は、結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ^１は、

【化28】

であり、式中、Ｒ^Ｌは、水素又は－ＣＯ_２Ｈである。

【0217】

いくつかの実施形態では、Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊、－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）－＊、又は－ＮＲ^１－であり、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、Ｘ^１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１－＊であり、「＊」は、Ｌ^３への接続点を示し、Ｒ^１は、水素である。

【0218】

いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０アルキル（例えば、Ｃ_３－Ｃ_３０アルキル、Ｃ_３－Ｃ_２５アルキル、Ｃ_３－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_３－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_５－Ｃ_３０アルキル、Ｃ_５－Ｃ_２５アルキル、Ｃ_５－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_５－Ｃ_１５アルキル、及びＣ_５－Ｃ_１０アルキル）又は任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキル（例えば、Ｃ_３－Ｃ_３０ヘテロアルキル、Ｃ_３－Ｃ_２５ヘテロアルキル、Ｃ_３－Ｃ_２０ヘテロアルキル、Ｃ_３－Ｃ_１５ヘテロアルキル、Ｃ_３－Ｃ_１０ヘテロアルキル、Ｃ_５－Ｃ_３０ヘテロアルキル、Ｃ_５－Ｃ_２５ヘテロアルキル、Ｃ_５－Ｃ_２０ヘテロアルキル、Ｃ_５－Ｃ_１５ヘテロアルキル、及びＣ_５－Ｃ_１０ヘテロアルキル）である。例示的なＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキルは、Ｃ_５－Ｃ_３０ポリエチレングリコール（例えば、Ｃ_５－Ｃ_２５ポリエチレングリコール、Ｃ_５－Ｃ_２０ポリエチレングリコール、Ｃ_５－Ｃ_１５ポリエチレングリコール）である。特定の実施形態では、Ｌ^３は、Ｃ_５－Ｃ_２５ポリエチレングリコール、Ｃ_５－Ｃ_２０ポリエチレングリコール、又はＣ_５－Ｃ_１５ポリエチレングリコールである。

【0219】

いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキル（例えば、Ｃ_１－Ｃ_４０ヘテロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３０ヘテロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_２０ヘテロアルキル、Ｃ_２－Ｃ_１８ヘテロアルキル、Ｃ_３－Ｃ_１６ヘテロアルキル、Ｃ_４－Ｃ_１４ヘテロアルキル、Ｃ_５－Ｃ_１２ヘテロアルキル、Ｃ_６－Ｃ_１０ヘテロアルキル、Ｃ_８－Ｃ_１０ヘテロアルキル、Ｃ_４ヘテロアルキル、Ｃ_６ヘテロアルキル、Ｃ_８ヘテロアルキル、Ｃ_１０ヘテロアルキル、Ｃ_１２ヘテロアルキル、Ｃ_１６ヘテロアルキル、Ｃ_２０ヘテロアルキル、又はＣ_２４ヘテロアルキル）である。

【0220】

いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、１～２０個のオキシエチレン（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）単位を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（例えば、２オキシエチレン単位（ＰＥＧ２）、３オキシエチレン単位（ＰＥＧ３）、４オキシエチレン単位（ＰＥＧ４）、５オキシエチレン単位（ＰＥＧ５）、６オキシエチレン単位（ＰＥＧ６）、７オキシエチレン単位（ＰＥＧ７）、８オキシエチレン単位（ＰＥＧ８）、９オキシエチレン単位（ＰＥＧ９）、１０オキシエチレン単位（ＰＥＧ１０）、１２オキシエチレン単位（ＰＥＧ１２）、１４オキシエチレン単位（ＰＥＧ１４）、１６オキシエチレン単位（ＰＥＧ１６）、又は１８オキシエチレン単位（ＰＥＧ１８））を含む、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキルである。

【0221】

特定の実施形態では、Ｌ^３は、１～２０個のオキシエチレン（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）単位又はその一部を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、任意選択的に置換されたＣ_１－５０ヘテロアルキルである。例えば、Ｌ^３は、以下：

【化29】

に示すようにＰＥＧ３を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｗであり、式中、ｍ及びｗは、それぞれ独立して０～１０の整数（両端を含む）であり、ｍ及びｗの少なくとも１つは０でない。

【0223】

いくつかの実施形態では、Ｌ^３は、置換Ｃ_１－Ｃ_５０アルキル又は置換Ｃ_１－Ｃ_５０ヘテロアルキルであり、置換基は、ヘテロアリール基（例えば、窒素含有６員ヘテロアリール）を含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、Ｚ^１は、ＣＨ_２、Ｃ＝Ｏ、又はＮＲ^１であり、式中、Ｒ^１は、水素、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである。

【0225】

特定の実施形態では、Ａ－Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂは、式Ｉ－ａ：

【化30】

によって表されるか、又はその金属錯体であり得、式中、Ｙ^１は、－ＣＨ_２ＯＣＨ_２（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ、－Ｃ（Ｏ）（Ｌ^２）_ｎ－Ｂ、又は－Ｃ（Ｓ）（Ｌ^２）_ｎ－Ｂであり、Ｙ^２は、－ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈであるか；又はＹ^１は、Ｈであり、Ｙ^２は、Ｌ^１－（Ｌ^２）_ｎ－Ｂである。

【0226】

架橋基
いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、キレート、リンカー、及び架橋基を含む、二官能性キレートを使用して合成される。化合物（例えば、放射性免疫抱合体）が形成されると、架橋基は化合物（例えば、放射性免疫抱合体）から存在しなくなり得る。

【0227】

いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、標的化部分の代わりに、又は標的化部分に加えて、架橋基を含む（例えば、いくつかの実施形態では、式ＩのＢは架橋基を含む）。

【0228】

架橋基は、２つ以上の分子を共有結合によって連結できる反応性基である。架橋基は、リンカー及びキレート部分を治療部分又は標的化部分に結合するために使用され得る。架橋基は、リンカー及びキレート部分をインビボで標的に結合するためにも使用され得る。いくつかの実施形態では、架橋基は、アミノ反応性、メチオニン反応性又はチオール反応性架橋基であるか、又はソルターゼ認識配列を含む。いくつかの実施形態では、アミノ反応性又はチオール反応性の架橋基は、ヒドロキシコハク酸イミドエステル、２，３，５，６－テトラフルオロフェノールエステル、４－ニトロフェノールエステル又はイミデート、無水物、チオール、ジスルフィド、マレイミド、アジド、アルキン、歪みアルキン、歪みアルケン、ハロゲン、スルホネート、ハロアセチル、アミン、ヒドラジド、ジアジリン、ホスフィン、テトラジン、イソチオシアネート、又はオキサジリジンなどの活性エステルを含む。いくつかの実施形態では、ソルターゼ認識配列は、末端グリシン－グリシン－グリシン（ＧＧＧ）及び／又はＬＰＴＸＧアミノ酸配列で構成され、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。当業者であれば、架橋基の使用は本明細書に開示される特定の構成に限定されず、他の公知の架橋基も含まれ得ることを理解するであろう。

【0229】

医薬組成物
一態様では、本開示は、本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用のために製剤化することができる。適切な製剤のために、１つ以上の生理学的に許容される賦形剤又は担体を医薬組成物に含めることもできる。本開示での使用に適合する好適な製剤の非限定的な例としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版，１９８５に記載されているものが挙げられる。薬物送達のための方法の簡潔なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。

【0230】

医薬組成物は、本明細書で考察される様々な投与経路のいずれかについて製剤化され得る（例えば、本明細書の「投与及び投与量」サブセクションを参照）。持続放出投与は、デポ注射又は侵食性のインプラント若しくは成分などの手段によって企図される。従って、本開示は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝水、生理食塩水、又はＰＢＳなどに溶解又は懸濁された、本明細書に開示される薬剤（例えば、放射性免疫抱合体）を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、とりわけ、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、又は界面活性剤などの、生理学的条件に近づけるための薬学的に許容される補助物質が含有される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口送達用に製剤化され、錠剤又はカプセルなどの単位剤形の製剤化のために、結合剤又は充填剤などの不活性成分を任意選択的に含有し得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与用に製剤化され、クリーム、軟膏、ジェル、ペースト、又は点眼剤の製剤化のために、溶媒又は乳化剤などの不活性成分を任意選択的に含有し得る。

【0231】

いくつかの実施形態では、提供される医薬組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され、例えば、滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装してもよく、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥製剤は、例えば、投与前に滅菌水性担体と組み合わせることができる。製剤のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９又は６～８、最も好ましくは６～７、例えば６～６．５である。得られた固形の組成物は、例えば、錠剤又はカプセルの密封包装のように、それぞれが一定量の上記薬剤を含有する複数の単回用量単位で包装され得る。固形の医薬組成物は、局所適用できるクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなど、柔軟な量のための容器に包装することもできる。

【0232】

治療方法
一態様では、本開示は、本明細書に開示される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）を、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。

【0233】

対象
いくつかの開示された方法では、治療（例えば、治療剤を含む）が対象者に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。

【0234】

いくつかの実施形態では、対象は、癌を有するか又は癌を発症するリスクを有する。例えば、対象は、癌があると診断されている者であり得る。例えば、癌は、原発性癌であってもよく、転移性癌であってもよい。対象は、リンパ節関与を伴う又は伴わない、また、転移を伴う又は伴わない、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶなど、あらゆるステージの癌を有し得る。提供される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）及び組成物は、癌のさらなる増殖を予防又は軽減し、且つ／又は癌を改善（例えば、転移を予防又は軽減）し得る。いくつかの実施形態では、対象は癌を有しないが、例えば、環境曝露、１つ以上の遺伝子変異又はバリアントの存在、家族歴などの１つ以上のリスク要因の存在により、癌を発症するリスクがあると決定されている。いくつかの実施形態では、対象は癌と診断されていない。

【0235】

いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴを発現する細胞を含む任意の癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌、大腸癌、膵臓癌、又は頭頚部癌である。

【0236】

投与及び投与量
本明細書に開示される化合物（例えば、放射性免疫抱合体）及びその医薬組成物は、全身投与経路及び局所投与経路を含む、様々な投与経路のいずれかによって投与され得る。

【0237】

全身投与経路には、非経口経路と及び経腸経路が含まれる。いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）又はその医薬組成物は、非経口経路、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、又は皮内で投与される。いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）又はその医薬組成物が静脈内投与される。いくつかの実施形態では、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）又はその医薬組成物は、経腸投与経路、例えば、経胃腸投与、又は経口投与によって投与される。

【0238】

局所投与経路としては、腫瘍周囲注射及び腫瘍内注射が挙げられるが、これらに限定されない。

【0239】

医薬組成物は、放射線治療計画、診断、及び／又は治療のために投与することができる。放射線治療計画又は診断の目的で投与される場合、化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、診断上有効な用量及び／又は治療有効量を決定するのに有効な量で対象に投与され得る。治療用途では、すでにある病状（例えば、癌）に罹患している対象（例えば、ヒト）に、疾患及びその合併症の症状を治癒するか、又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量の医薬組成物が投与され得る。この目的を達成するのに十分な量は、「治療有効量」と定義され、疾患又は病状に関連する少なくとも１つの症状を実質的に改善するのに十分な化合物の量である。例えば、癌の治療では、疾患又は病状の症状を軽減、予防、遅延、抑制、又は停止させる薬剤又は化合物が治療的に有効であり得る。治療有効量の薬剤又は化合物は、疾患又は病状を治癒させるために必要ではないが、例えば、疾患又は病状の発症を遅らせ、妨げ、又は予防する、疾患又は病状の症状を改善する、又は疾患又は病状の期間を変更するように、疾患又は病状に対する治療を提供し得る。例えば、疾患又は病状は、個体における重症度が軽減し得、且つ／又は回復が促進され得る。いくつかの実施形態では、対象は、放射線治療計画に有効な量の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）又は組成物の第１の用量が投与され、次いで、治療有効量の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）又は組成物の第２の用量又は用量のセットが投与される。

【0240】

ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴを発現する細胞を含む癌を治療するために、本発明の方法は、典型的には、放射線治療計画に有効な量の上記化合物又は組成物の初回用量を、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与し、続いて、治療有効量の上記化合物又は組成物のその後の用量を投与することを含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、第１の投与で投与される化合物又は組成物と第２の投与で投与される化合物又は組成物は、同じである。

【0242】

いくつかの実施形態では、第１の投与で投与される化合物又は組成物と第２の投与で投与される化合物又は組成物は、異なる。

【0243】

治療有効量は、疾患又は病状の重症度及び対象のその他の特性（体重など）によって異なり得る。開示された化合物（例えば、放射性免疫抱合体）及び組成物の対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に対する治療有効量は、個体差（例えば、対象の年齢、体重、及び病状の差）を考慮して、当業者によって決定することができる。

【0244】

いくつかの実施形態では、開示された化合物（例えば、放射性免疫抱合体）は、癌細胞を標的とする強化された能力を示す。いくつかの実施形態では、開示された化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の有効量は、非抱合及び／又は非放射性標識標的化部分の治療効果に対する同等の投与量よりも低い（例えば、約９０％、７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１２％、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．１％以下）。

【0245】

有効量を含む本明細書に開示された医薬組成物の単回又は複数回の投与は、治療医が選択した用量レベル及びパターンで実行することができる。投与量及び投与スケジュールは、対象の疾患又は病状の重症度に基づいて決定及び調整することができ、臨床医によって一般的に実施されている方法又は本明細書に記載されている方法に従って、治療過程全体にわたってモニタリングされ得る。

【0246】

以下の具体的な例は、単に例示として解釈されるべきであり、いかなる意味においても開示の残りの部分を制限するものではない。

【実施例】

【0247】

実施例１－ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂの設計及び構築
この例は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの両方に結合することが可能な二重特異性抗体分子の生成について説明する。

【0248】

１．１ 抗ｃＭＥＴ抗体００２１Ｕ３－Ｂ０９の単離及び同定
ｃＭＥＴ特異的ｓｃＦｖ抗体は、基本的に記載されているとおり（Ｖａｕｇｈａｎ，１９９６）、組換え哺乳動物発現ビオチン化モノマーヒトｃＭＥＴ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）に対する一連の反復パニング選択サイクルで、大規模なナイーブヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリから単離された。選択アウトプットのラウンド２からのｓｃＦｖは、細菌の周辺質で発現され、ヒトｃＭＥＴ受容体の結合を阻害する能力について、ＨＧＦ：ｃＭＥＴ ＨＴＲＦ（登録商標）（均一系時間分解蛍光）リガンド受容体阻害性結合アッセイにおいて、ＨＧＦリガンドを用いてスクリーニングされた。強い阻害効果を示す上位ヒットが選択され、ＤＮＡ配列決定に供された。次いで、固有の遺伝子がヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）抗体に変換され、基本的に説明される通りに哺乳動物細胞で生成された（Ｐｅｒｓｉｃ；１９９７）。次いで、精製された抗体は、ＨＧＦ：ｃＭＥＴ ＨＴＲＦ（登録商標）結合アッセイにおける阻害効果に基づいてランク付けされた。最も強力な抗体００２１Ｕ３－Ｂ０９が、さらなる特性評価のために選択された。

【0249】

１．２ 抗ｃＭＥＴ抗体００２１Ｕ３－Ｂ０９の最適化。
潜在的な免疫原性を最小限に抑えるために、００２１Ｕ３－Ｂ０９の可変フレームワーク領域内の非Ｖｅｒｎｉｅｒフレームワーク残基（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９２）が特に標的とされ、最も近いヒト生殖細胞系列配列と一致するように改変された。ＶＨ領域では、参照ヒト生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１－８＊０１とマッチするように７つのアミノ酸残基が変異した。ＶＬ領域では、参照ヒト生殖細胞系列配列ＩＧＫＶ１－５＊０３とマッチするように３つの残基が変異した。ＶＨ及びＶＬ領域の全ての残基は、活性を失うことなく生殖細胞系列残基への変更に成功した。００２１Ｕ３－Ｂ０９は、基本的に記載されているように（Ｋｕｎｋｅｌ １９８５）、ハイブリダイゼーションベースの変異誘発法を使用して親和性を最適化した。００２１Ｕ３－Ｂ０９配列から得られた大規模ｓｃＦｖライブラリは、標準的な分子生物学技術を使用して、ＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のオリゴヌクレオチド誘導変異誘発によって作成された。ライブラリは親和性に基づく溶液相選択に供されて、ヒト及びカニクイザルのｃＭＥＴ抗原に対してより高い親和性を有するバリアントが選択された。ＣＤＲ標的選択アウトプットからの粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を、ＨＧＦ：ｃＭＥＴ ＨＴＲＦ（登録商標）結合アッセイにおける阻害活性の改善についてスクリーニングした。親００２１Ｕ３－Ｂ０９と比較して有意に改善された阻害効果を示すバリアントは、ＤＮＡ配列決定に供され、固有の遺伝子がヒトＩｇＧ２に変換された。次いで、精製された抗体は、その阻害効果に基づいてランク付けされた。最も強力な抗体Ｂ０９－５７が、さらなる特性評価のために選択された。

【0250】

１．３ 抗ＥＧＦＲ抗体Ｔｄｅｖ－０００４の単離及び同定。
ＥＧＦＲ特異的ｓｃＦｖ抗体は、基本的に記載されているとおり（Ｖａｕｇｈａｎ，１９９６）、組換え哺乳動物発現ビオチン化モノマーヒトＥＧＦＲ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）に対する一連の反復パニング選択サイクルで、大規模なナイーブヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリから単離された。選択アウトプットのラウンド３からのＳｃＦｖ表示ファージは、ＥＬＩＳＡで、ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲへのその結合についてスクリーニングされた。交差反応性を示す上位ヒットが選択され、ＤＮＡ配列決定に供された。次いで、固有の遺伝子がヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗体に変換され、基本的に記載されているように（Ｐｅｒｓｉｃ；１９９７）、哺乳動物細胞で生成された。次いで、精製された抗体は、フローサイトメトリーによってＥＧＦＲ発現細胞株Ａ４３１への結合に基づいてランク付けされた。特異的な細胞結合を示す抗体Ｔｄｅｖ－０００４が、さらなる特性評価のために選択された。

【0251】

１．４ 抗ＥＧＦＲ抗体Ｔｄｅｖ－０００４の最適化。
バリアントＲＡＡ２２及びＱＤ６は、抗ＥＧＦＲ Ｔｄｅｖ－０００４ｍＡｂを最適化することによって得られた。Ｔｄｅｖ－０００４のＶＬフレームワークは、参照ヒト生殖細胞系列配列ＩＧＬＶ２－１１＊０１／ＩＧＬＪ２と１００％マッチしたが（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／Ｉｄｌｉｎｋ．ｃｇｉ？ｓｅｑｎａｍｅ＝ＩＧＬＶ２－１１＊０１＆ｔａｘｉｄ＝９６０６＆ｄｂｎａｍｅ＝ＩＧ＿ＤＢ％２Ｆｉｍｇｔ．Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．Ｖ．ｆ．ｏｒｆ．ｐを参照）、ＶＨフレームワークは、最も近いヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ１－６９＊０１／ＪＨ４と７９％の相同性を示した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／Ｉｄｌｉｎｋ．ｃｇｉ？ｓｅｑｎａｍｅ＝ＩＧＨＶ１－６９＊０１＆ｔａｘｉｄ＝９６０６＆ｄｂｎａｍｅ＝ＩＧ＿ＤＢ％２Ｆｉｍｇｔ．Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．Ｖ．ｆ．ｏｒｆ．ｐを参照）。潜在的な免疫原性を最小化するために、ＶＨ領域は、１３個の非生殖細胞系列フレームワーク残基全てを変異させることによって、最初に完全に生殖細胞系列化された。生殖細胞系列化により、完全に生殖細胞系列化されたバリアントの、カニクイザルＥＧＦＲへの結合は有意に障害された。カニクイザルＥＧＦＲへの結合を回復させるために、４つの非生殖細胞系列残基、Ｋ６８、Ｉ７３、Ｒ７６及びＴ７８が選択的に逆変異された。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｗｕ １９９１）によって番号付けされる。得られた部分的に生殖細胞系列化されたバリアント（Ｈ４と名付けた）は、親和性最適化のテンプレート配列として使用した。バリアントＨ４は、製造元の指示に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して６つのＣＤＲ全てを簡素に変異誘発させることにより親和性が最適化された。単一アミノ酸変異ＶＨ及びＶＬライブラリを細菌内でＦａｂ断片として発現させ、ＥＬＩＳＡでヒト及びカニクイザルＥＧＦＲへの結合の改善についてスクリーニングした。親Ｈ４と比較して結合の向上を示すバリアントはＤＮＡ配列決定に供され、固有の遺伝子がヒトＩｇＧ１に変換された。バリアントＲＡＡ２２は、ＣＤＲＨ３における単一の変異によって同定された。親和性をさらに向上させるために、個々の陽性変異を組み合わせて、ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲへの結合が強化されたバリアントをスクリーニングするコンビナトリアルライブラリを作成した。バリアントＱＤ６は、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３の４つの組み合わせ変異によって同定された。

【0252】

１．５ 一価二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ ＤｕｅｔＭａｂ抗体の生成。
抗ｃＭＥＴ ｍＡｂ Ｂ０９－５７及び抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ ＲＡＡ２２並びにＱＤ６の可変ドメインは、ＤｕｅｔＭａｂプラットフォーム（Ｍａｚｏｒ，２０１５）の骨格上での一価二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ抗体の構築に利用された。具体的には、抗ｃＭＥＴ Ｂ０９－５７のＶＨ遺伝子が、「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ）と代替鎖間システイン変異（Ｆ１２６Ｃ及びＣ２１９Ｖ）を保有するヒトガンマ１定常重鎖に挿入された。Ｂ０９－５７のＶＬ遺伝子は、「ノブ」重鎖と対になるように設計された、対応する代替鎖間システイン変異（Ｓ１２１Ｃ及びＣ２１４Ｖ）を保有するヒトカッパ定常ドメインにインフレームで挿入された。同様に、抗ＥＧＦＲ ＲＡＡ２２及び親和性最適化ＱＤ６のＶＨ遺伝子は、「ホール」変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）を保有するヒトガンマ１定常重鎖に挿入され、ＲＡＡ２２及びＢ０９－５７のＶＬ遺伝子は、「ホール」重鎖と対になるように設計されたヒトラムダ定常ドメインにインフレームで挿入された。さらに、「ノブ」及び「ホール」重鎖のＣＨ３ドメインの２つの残基がシステインに変異して（「ノブ」ではＳ３５４Ｃ、「ホール」ではＹ３４９Ｃ）、安定化ジスルフィド架橋が形成された。Ｆｃドメインは、マレイミド保有細胞傷害性薬の部位特異的抱合を可能にするために、セリン２３９の後にシステイン挿入を行うようにさらに設計された（Ｃ２３９ｉ／「Ｍａｉａ」）（Ｄｉｍａｓｉ，２０１７）。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｗｕ １９９１）によって番号付けされる。組み立てられた一価二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ ＤｕｅｔＭａｂ抗体は、ＲＡＡ２２／Ｂ０９－５７及びＱＤ６／Ｂ０９－５７と名付けた（図１）。ＤｕｅｔＭａｂ抗体は、以前に説明されたように、哺乳動物細胞から生成された（Ｍａｚｏｒ，２０１７）。

【0253】

また、Ｆｃ骨格のエフェクター機能を低減又は除去すると、免疫毒性を軽減し、薬物動態を改善する可能性があり得ることも認識された。そのため、本発明者らは、抗体分子のＦｃエフェクター機能を低下させることが以前に示されたＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＥＵ番号）の「トリプル変異体（ＴＭ）」も導入した（Ｏｒｇａｎｅｓｙａｎ，２００８；Ｈａｙ，２０１６）。これらのＴＭ構築物は、ｃ－ＭＥＴアームが「ホール」変異が、ＥＧＦＲアームが「ノブ」変異を保有するように設計された。

【0254】

生成された「ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴＴＭ」ＤｕｅｔＭａｂは、ＴＭが導入されたＲＡＡ２２及びＢ０９の可変領域を含み、次の表に示すアミノ酸配列を有する。

【0255】

【表1】

【0256】

実施例２－生化学的及び生物物理学的特性
この実施例では、ＲＡＡ２２、ＱＤ６及びＢ０９－５７モノクローナル抗体とＲＡＡ２２／Ｂ０９－５７及びＱＤ６／Ｂ０９－５７二重特異性抗体分子の様々な生化学的及び生物物理学的特性（それぞれＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔへの結合親和性、及び両方の抗原に同時に結合するその能力を含む）を試験する。

【0257】

２．１ ＤｕｅｔＭａｂ及び親ｍＡｂｓのＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに対する結合親和性。
組換えヒト、カニクイザル、及びマウスＥＧＦＲ及びｃＭＥＴ抗原に対するＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ ＤｕｅｔＭＡｂｓの運動速度定数（ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆ）及び平衡解離定数（Ｋｄ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の抗体捕捉アッセイを使用して、ＳＰＲによって２５℃で測定した。最終表面密度が約２０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のＣＭ４センサーチップ上に、マウス抗ヒトＩｇＧを固定化した。同一固定化プロトコルを使用して、標準フローセル表面もまた、このセンサーチップ上で調製された。試験及び対照品抗体は、装置緩衝液中の精製ＥＧＦＲ（ヒト０．２７～２００ｎＭ、カニクイザル０．４～９００ｎＭ、及びマウス４～１０００ｎＭ）又はｃＭＥＴタンパク質（ヒト０．２７～６６ｎＭ、カニクイザル０．２７～２２ｎＭ）の３倍連続希釈液とともに、装置緩衝液（ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液；０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．００５％Ｐ－２０）中で５～２０ｎＭに調製された。動態測定には逐次的手法を利用した。まず、抗体を１０μＬ／分の流速で捕捉表面に注入した。捕捉された抗体の結合が安定したところで、単一濃度の分析物を７５μＬ／分の流量で捕捉表面及び参照表面の両方に注入した。得られた結合反応曲線から会合相データを得た。分析物の注入後、次にフローを機器緩衝液に１５分間戻して解離相データの収集を可能にし、続いて１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の１分間パルスによりチップ上の抗体捕捉表面を再生させた。試験及び対照物質抗体に対する結合反応は、各濃度の分析物の二重注入から記録した。さらに、注入系列の全体にわたりいくつかの緩衝液注入を分散させた。選択緩衝液注入を参照細胞応答とともに使用して、生データセットの注入アーティファクト及び／又は非特異的結合相互作用を修正した（一般に「二重参照」と呼ばれる）。修正された結合データは、１：１結合モデルに全体的に適合した（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア２．０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）。計算された動態パラメータ（ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆ）及びｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして決定されたＫｄを表１に示す。

【0258】

【表2】

【0259】

【表3】

【0260】

上記のデータから見られるように、二重特異性抗体分子ＱＤ６／Ｂ０９－５７は、ヒトｃＭｅｔに高い親和性（約２ｎＭ Ｋｄ）で結合し、ヒトＥＧＦＲに高い親和性（約６ｎＭ Ｋｄ）で結合する一方、二重特異性抗体分子ＲＡＡ２２／Ｂ０９－５７は、ヒトｃ－Ｍｅｔに同様に高い親和性（約２ｎＭ Ｋｄ）で結合するが、ＱＤ６／Ｂ０９－５７と比較して低い親和性（約４５ｎＭ Ｋｄ）でヒトＥＧＦＲに結合する。

【0261】

２．２ ＤｕｅｔＭａｂのＥＧＦＲ及びｃＭＥＴへの同時結合。
組み換えヒトＥＧＦＲ及びｃＭＥＴタンパク質への同時結合試験は、基本的に記載されているように（Ｍａｚｏｒ、２０１５）、Ｏｃｔｅｔ３８４装置でのバイオレイヤー干渉法によって測定された。簡潔には、アッセイ緩衝液［ＰＢＳ ｐＨ７．２、３ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］中の５μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きｃＭＥＴ抗原が最初にＮＩ－ＮＴＡバイオセンサーで捕捉された。結合していないタンパク質を除去するための洗浄ステップの後、それぞれのロードされたバイオセンサーは、最初に６６ｎＭの抗体、次いで５００ｎＭのＥＧＦＲ抗原との、連続的な会合及び解離の相互作用に曝露された。会合及び解離曲線は、Ｏｃｔｅｔ３８４ソフトウェアｖ．９．０を使用してデータの非線形適合から計算された。図２に示すように、ＤｕｅｔＭａｂは両方の抗原に同時に結合することが示されたが、親抗ｃＭＥＴＩｇＧはｃＭＥＴにのみ特異的な結合を示し、２つの抗ＥＧＦＲＩｇＧはｃＭＥＴをロードしたセンサーに結合を示さなかった。

【0262】

２．３ ＥＧＦＲ及びｃＭｅｔの特異性
ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴ種のパラログ及び近縁ファミリーメンバーに対する特異性は、ＥＬＩＳＡによって決定された。簡潔には、抗原溶液をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製し、５０マイクロリットルをＥＬＩＳＡアッセイプレートの半分の面積にコーティングした。プレートを洗浄し、０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）を含有するＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄した。図３に示されるように、使用した一次抗体は、Ｒ３７４（非結合ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）、Ｂ０９（抗ｃＭＥＴ抗体）、ＱＤ６（抗ＥＧＦＲ抗体）、ＲＡＡ２２（抗ＥＧＦＲ抗体）、ＱＤ６／Ｂ０９（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－ＭＥＴ ＤｕｅｔＭＡｂ）、ＲＡＡ２２／Ｂ０９（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－ＭＥＴ ＤｕｅｔＭＡｂ）、ＰａｎｉＸ（抗ＥＧＦＲ抗体）、ＭｅｔＭａｂ（抗ｃＭＥＴ抗体）、及びＭａｂ１１３１１（抗ＨＥＲ４抗体）である。ウェルは、１０μｇ／ｍＬで開始し０．００２μｇ／ｍＬで終了する１：３希釈系列でＰＢＳ－Ｔ中に希釈した、指定の一次抗体５０μＬでインキュベートした。ただし、ＨＥＲ４結合ｍＡｂ対照であるＭＡＢ１１３１については、系列は１μｇ／ｍＬで開始した。ウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、次いで、ＰＢＳ－Ｔで１：５０００に希釈したヤギ抗ヒトＦａｂ ＨＲＰ標識二次抗体５０μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。５０マイクロリットルのＴＭＢ基質溶液を全てのウェルに加え、陽性対照ウェルで強いシグナルが観察されるまで、室温で５～３０分間インキュベートした。５０マイクロリットルのＴＭＢ停止溶液を全てのウェルに加え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取った。データをＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５ソフトウェアで分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７グラフ作成ソフトウェアを使用してプロットした。

【0263】

種の交差反応性を決定するために、上記のようにＥＬＩＳＡアッセイを実行した。図３Ａに示すように、高親和性ＥＧＦＲ ＩｇＧ、ＱＤ６及び一価二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ ＤｕｅｔＭＡｂ、ＱＤ６／Ｂ０９は、ヒト、カニクイザル、及びマウスＥＧＦＲに結合し、ＥＬＩＳＡアッセイで強力なシグナルを示した。対照的に、親和性が低下したＥＧＦＲ ＩｇＧ、ＲＡＡ２２は、ＱＤ６と比較して、ヒト、カニクイザル、及びマウスＥＧＦＲへの結合がより弱かった。マウスＥＧＦＲへの結合は弱いが、検出可能であった。対応する一価二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ ＤｕｅｔＭＡｂ、ＲＡＡ２２／Ｂ０９は、二価親ＩｇＧ、ＲＡＡ２２と比較して、ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲへの結合がさらに弱く、マウスＥＧＦＲへの結合はわずかであった。ｃＭＥＴ ＩｇＧ、Ｂ０９、及び全ての二重特異性バリアントは、ヒト及びカニクイザルｃＭＥＴに対して同等の結合を示した。いずれの抗体もマウスｃＭＥＴへの結合は検出されなかった。これらの結果は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置による表面プラズモン共鳴測定によって決定された結合速度と一致している（上記の表１）。

【0264】

図３Ｂに示すように、親ＩｇＧ又は派生二重特異性抗体はいずれも、ＥＧＦＲ ＨＥＲファミリータンパク質、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４のいずれに対しても認識できる結合を示さなかった。同様に、いずれの抗体も、ｃＭＥＴファミリーメンバー、Ｒｏｎ（ＣＤ１３６）、又はセマフォリン３ａに対して有意な結合を示さなかった。

【0265】

これらの結果は、親ＩｇＧ及び得られた二重特異性抗体が、その同族標的に特異的に結合し、近縁ファミリー種への結合は検出されないことを示す。

【0266】

実施例３－ｐＨ感受性色素を使用した抗体の内在化及び酸性化区画への輸送のモニタリング
正常な非腫瘍組織における標的発現は、標的組織へのペイロード送達を減少させることで抗体抱合体の治療域を減少させる毒性をもたらし得る。本開示の化合物（例えば、放射性免疫抱合体）の二重特異性抗体又はその抗原結合断片の設計は、標的の共発現がほとんど又は全くない正常組織における抱合体の影響を最小限に抑えながら、２つの標的を共発現する腫瘍細胞への抗体分子（すなわち、ペイロード送達ビヒクル）の送達を最大化することを意図している。ＥＧＦＲ親和性が低下した二重特異性抗体ＲＡＡ２２／Ｂ０９を使用した二重標的化が、単一標的会合と比較して選択性の利点を提供するかどうかを評価するために、本発明者らは、ｐＨ感受性染料で標識された抗体を使用して、二重特異性ｍＡｂと二重特異性を含む一価親抗体の内在化効率を比較する試験を実行した。

【0267】

ｐＨＡｂ ｐＨ感受性染料（Ｐｒｏｍｅｇａ）で標識された抗体を使用することで、リソソーム及びエンドソームなどの酸性化細胞内区画への抗体の内在化及び輸送の可視化が容易になった。この染料はｐＨ＞７では非常に弱い蛍光を示すが、酸性ｐＨでは強い蛍光を示し、およそｐＨ５で最大に達する。簡潔には、抗体は、製造元の推奨に従ってｐＨＡｂアミン反応性染料で標識された。標識された抗体は、Ｒ３４７ ＩｇＧ１アイソタイプ対照、一価二重特異性対照抗体 抗ＥＧＦＲ抗体ＲＡＡ２２／Ｒ３４７及び抗ｃＭＥＴ Ｂ０９／Ｒ３４７、並びにＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ一価二重特異性抗体ＲＡＡ２２／Ｂ０９であった。中程度のレベルのＥＧＦＲ（相対受容体密度約３３，０００）及びｃＭＥＴ（相対受容体密度約５０，０００）を共発現するＮＣＩ－Ｈ１９７５肺癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ成長培地中、２×１０^５細胞／ｍＬの密度で、１００マイクロリットル容量で、底が透明で壁が黒い９６ウェルアッセイプレートに播種した。プレートを加湿インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した。次いで、プレートを氷上で３０分間冷却し、その後、予め冷却された成長培地に様々な濃度のｐＨＡｂ標識二重特異性抗体及び一価対照抗体を加えた。培養物をさらに３０分間氷上で冷却し、次いで、Ｃｙ３フィルターを使用してＯｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ ＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇシステムで蛍光を読み取り、この最初の読み取りを時間０と指定した。プレートを３７℃のインキュベーターに戻し、３、６、２４、３０及び４８時間後に追加の読み取りを行った。

【0268】

ＮＣＩ Ｈ１９７５細胞を処理するために１．２５μｇ／ｍＬのｐＨＡｂ標識ｍＡｂｓを使用した代表的な内在化実験を図４に示す。非結合ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体Ｒ３４７は、どの時点においても、検出可能な蛍光を示さなかった。ＥＧＦＲ／ｃＭＥＴ二重特異性抗体ＲＡＡ２２／Ｂ０９は、３時間までに細胞内蛍光を示し、蛍光強度は処理後４８時間まで増加し続けた。一価ＥＧＦＲ結合対照抗体ＲＡＡ２２／Ｒ３４７は、２４時間の時点から非常に弱い蛍光を示したが、これは４８時間の時点まで劇的に増加しなかった。一価単一特異性ｃＭＥＴ結合対照抗体Ｂ０９／Ｒ３４７は、２４時間で中程度の蛍光を示し、４８時間までにさらに増加した。それにもかかわらず、単一特異性ｃＭＥＴ抗体の蛍光シグナルの強度は二重特異性ＲＡＡ２２／Ｂ０９と比較して中程度であり、これは、ここで試験した二重標的発現細胞株において、二重特異性抗体は単一特異性親抗体よりも高い内在化効率を有することを示唆している。細胞を０．６２５μｇ／ｍＬのｐＨＡｂ標識ｍＡｂｓで処理した場合、二重特異性抗体と単一特異性対照の差はさらに顕著になった（図５）。単一特異性抗体は４８時間後でもほとんど蛍光を示さなかったが、二重特異性ＲＡＡ２２／Ｂ０９抗体は３時間後までに再び細胞内蛍光を示し、蛍光強度は処理後４８時間まで増加し続けた。これらの結果は、二重標的化二重特異性抗体がＥＧＦＲとｃＭＥＴの両方を共発現する細胞への効率的な内在化を媒介するという仮説と一致している。同時に、単一特異性親抗体は、二重特異性抗体と比較して、取り込み及び蛍光強度が低下する。これらの結論を論理的に拡張すると、二重特異性抗体は、両方の標的ではなく１つの標的のみを発現する組織では、単一特異性抗体のように挙動し得ることが示唆され、これは、ＥＧＦＲとｃＭＥＴの場合に一般的に当てはまる。特に注目すべきは、ｐＨＡｂで標識された親和性が低下したＥＧＦＲ対照ｍＡｂ、ＲＡＡ２２／Ｒ３４７が、ごくわずかな取り込み及び蛍光を示したことである。ＥＧＦＲへの結合の減少により、有意なレベルのＥＧＦＲを発現しているがｃＭＥＴはほとんど又は全く発現していない、皮膚などの正常組織における抗体抱合体の影響が最小限に抑えられ得る。

【0269】

実施例４－共焦点顕微鏡を使用した抗体内在化のモニタリング
標識されたＤｕｅｔＭａｂの内在化動態：ＲＡＡ２２／Ｂ０９及びＱＤ６／Ｂ０９抗体は、生細胞共焦点蛍光顕微鏡を使用してインビトロで評価した。

【0270】

４．１ 材料及び方法
Ｈ１９７５及びＨＣＣ８２７細胞は、ＡＴＣＣから入手した。ＲＡＡ２２／Ｂ０９、ＱＤ６／Ｂ０９、及びシングルアーム誘導体は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅから入手した。ＩｇＧ Ｆａｂアームを有する、ＱＤ６／Ｂ０９並びにシングルアーム特異的対照ＱＤ６／ＩｇＧ及びＢ０９／ＩｇＧは、非特異的ヒトＩｇＧ１ ＮＭＧＣから得られ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅから入手した。ＲＡＡ２２／Ｂ０９並びに非特異的ヒトＩｇＧ１ Ｒ３４７由来のシングルアーム特異的対照ＲＡＡ２２／ＩｇＧ及びＢ０９／ＩｇＧは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅから入手した。ＲＰＭＩ（１１８７５－０９３）、ＨＥＰＥＳ（１５６３０１０６）、ピルビン酸ナトリウム（１１３６００７０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ａ－２０１８６）モノクローナル抗体標識キット、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（８７７６７）、及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣ（Ｃ２１１０）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４２３２０１）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ＨｙＣｌｏｎｅ熱不活化ウシ胎児血清（ＳＨ３００７１．０３ＨＩ）は、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）から入手した。ＰＢＳ（２１－０４０）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から入手した。ＦｃＲブロッキング試薬（１３０－０５９－９０１）は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から入手した。ポリプロピレン丸底チューブ（３５２０６３）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手した。ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ３８４ウェルマイクロプレートは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．（カタログ番号６００７５５０，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。

【0271】

ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ抱合体の調製
モノクローナル抗体は、製造元の指示に従って抗体標識キットを使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７染料と抱合させた。簡潔には、ｐＨ＝８．３の重炭酸ナトリウム緩衝液中の抗体５０～１００マイクログラムを、室温で１時間穏やかに撹拌しながら反応性色素試薬とともにインキュベートした。取り込まれなかった色素は、製造元の指示に従って１Ｘ ＰＢＳで平衡化した４０Ｋ ＭＷＣＯでＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。

【0272】

染色のための細胞の培養及び調製
接着性Ｈ１９７５又はＨＣＣ８２７細胞は、最初の播種後、ＣＯ_２インキュベーター内のＴ－７５フラスコで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地ＲＰＭＩ－１６４０を使用して８０～９０％の集密度になるまで培養した。実験の日に、Ｔ－７５フラスコで増殖した接着単層を、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞懸濁液に分離した。剥離した細胞を１×ＰＢＳで、３００×ｇで５分間の遠心分離を使用して２回洗浄した。次いで、細胞をフェノールフリーＲＰＭＩに２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、染色に使用した。

【0273】

イメージングのための細胞染色
２×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を、フェノールフリーＲＰＭＩで調製した１μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣとともに、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３０分間インキュベートした。取り込まれなかったＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣ染料は、フェノールフリーＲＰＭＩにより、４℃で５分間、３００ｘｇの遠心分離を使用して２回洗浄することで除去した。次いで、細胞を氷上で冷却し、１×１０６細胞あたり１０ｕｌのＦｃＲブロッキング試薬で１５分間ブロッキングした。２×１０^５個の細胞を５ｍＬ丸底チューブに分注し、最終濃度２．５μｇ／ｍＬの蛍光抗体とともにインキュベートした。４℃で遠心分離することによって結合していない蛍光試薬を除去した後、細胞を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１％ＦＢＳを含有するフェノールフリーＲＰＭＩに再懸濁した。細胞は、３８４ウェルイメージングプレートの複数のウェルに１ウェルあたり５，０００個の密度で移され、画像取得前に４℃で２分間、２，２００ｒｐｍで短時間遠心分離した。

【0274】

共焦点蛍光顕微鏡を使用した細胞画像の取得
イメージングプレート（３８４ウェル形式）内の染色細胞は、以前に記載される（Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎ，２０１５）ようにＯｐｅｒａ共焦点蛍光イメージングシステムでイメージングしたか、又は４０Ｘ／１．２ＮＡ ＬＣＩＰｌａｎ Ａｐｏ対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）に移した。Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用した実験では、インキュベーターＸＬｍｕｌｔｉ Ｓ ＤＡＲＫ（ＰｅＣｏｎ Ｇｍｂｈ，Ｅｒｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、イメージング環境を３７℃、５％ＣＯ_２、７０％湿度に維持した。サンプルは、４０５、４８８、５６１、及び６３ｎｍの固体レーザー（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で照射された。一連の画像は、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ－Ｘ１ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｕｎｉｔ（横河電機株式会社、東京）とＥｖｏｌｖｅ ５１２ ＥＭＣＣＤ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）を使用して、指定の時間に取得された。画像を取得する前に、染色した細胞のアリコートを使用して、レーザー出力、露出時間、カメラゲインなどの露出パラメータを決定した。画像はＺＥＮ ２．３（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を使用して処理され、Ｃｏｌｕｍｂｕｓソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析された。

【0275】

内在化の画像解析のためのアルゴリズム
抗体の内在化の定量化に使用されるアルゴリズムは、以前に説明されている（Ｖａｉｎｓｔｈｅｉｎ，２０１５）が、以下の更新及び変更を伴う。反復画像処理に使用される参照チャネルは、細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣ（ＣＴＢ）染色から生成された。シグナルチャネルは、イメージャーの抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７チャネルからさらに得られる。画像は、アルゴリズム定義のパラメータを使用してアルゴリズムによって処理された。これらのパラメータは、最初にデフォルト値として設定され、次いで各細胞タイプ及び実験について最適化された。画像のＣＴＢ染色を使用して、閾値以下の蛍光強度シグナルを有する領域を除外することで、周囲よりも強度が高い画像上の領域を検出する閾値設定を使用して、細胞を識別した。残りの同定された細胞オブジェクトは、「ＴｏｔａｌＣｅｌｌ」とした。細胞は、形態特性領域（１２０～６００μｍ^２のオブジェクト）及び真円度（＞０．５）についてフィルタリングされてさらに選択された。次いで、アルゴリズムで定義されたパラメータを使用して、許容された細胞内の「膜領域」及び「細胞質領域」がオブジェクトの境界の周囲に構築された。各領域の蛍光強度を使用して、抗体関連ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７シグナルをモニタリングした。各領域の蛍光強度は、許容された細胞内の全てのピクセルの合計の平均として報告された。

【0276】

細胞質中の抗体関連蛍光の蓄積を利用して、抗体内在化の動態を定量化した。細胞染色及び蛍光強度の変動による結果の比較可能性を確保するために、細胞質シグナルは各時点での総細胞シグナルによって正規化され、次の式を使用して内在化率として指定された：内在化率＝強度（細胞質）／（強度（細胞質）＋強度（膜））。内在化速度定数ｋｉｎｔは、次の式を使用してデータの曲線フィッティングによって内在化の時間経過から計算された：Ｆｃｙｔ（ｔ）＝（１－ｅ－ｋｉｎｔ・ｔ）・Ｆｍａｘ，ｃｙｔ（式中、Ｆｍａｘ、ｃｙｔは、細胞あたりの細胞質強度と細胞あたりの総強度の最大比）。データの曲線フィッティングは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施した。内在化の半減期（Ｔ1/2）は、ｌｎ（２）とｋｉｎｔの比として計算された。

【0277】

４．２ ＲＡＡ２２／Ｂ０９及びＱＤ６／Ｂ０９のインビトロ内在化
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）一次標識ＤｕｅｔＭａｂの内在化動態：ＲＡＡ２２／Ｂ０９及びＱＤ６／Ｂ０９抗体は、ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴ発現細胞株Ｈ１９７５を使用してインビトロで評価した。各抗体を細胞に予め結合し、生細胞共焦点蛍光顕微鏡を使用して細胞表面から細胞質への抗体の転移をモニタリングした。図６は、両方の抗体が、内在化条件に供される前（Ｔ＝０）には主に細胞表面に局在し、１時間後（Ｔ＝１ｈ）には細胞質領域（青）に移行したことを示す。動態画像は、内在化の経過にわたって５分ごとに撮影され、定量アルゴリズム（上記参照）を使用して処理されて、内在化の運動定数及び半減期が決定された。図６Ｂは、ＱＤ６／Ｂ０９及びＲＡＡ２２／Ｂ０９の非常に類似した内在化速度を示しており、半減期はそれぞれ３７．５±１０．６分及び４３．２±１５．５分である。

【0278】

抗体内在化のモードを評価し、各アームのＤｕｅｔＭａｂの全体的な内在化への寄与を調査するために、本発明者らは、ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴの両方を発現するＨ１９７５細胞において、デュエットＱＤ６／Ｂ０９に対するシングルアーム特異的対照抗体分子ＱＤ６／ＩｇＧ及びＢ０９／ＩｇＧ、並びにデュエットＲＡＡ２２／Ｂ０９に対するＲＡＡ２２／ＩｇＧ及びＢ０９／ＩｇＧの内在化を評価した。１つのアームのみが標的受容体に特異的であるため、対照抗体は１つの受容体を介してのみ内在化することができ、内在化のモードとして二重受容体標的化及び架橋が排除される。

【0279】

ＱＤ６／Ｂ０９（図７Ａ）及びＲＡＡ２２／Ｂ０９（図７Ｂ）の内在化プロファイルは、細胞質におけるｍＡｂ－ＡＦ６４７シグナルの増加を伴う、膜ｍＡｂ－Ｆｌ６４７シグナルの一致した減少という非常に類似したパターンを示しており、これは内在化の典型的なプロファイルである。しかし、それらのシングルアーム構築物は、非常に異なる内在化プロファイルを示した。シングルアームＱＤ６／ＩｇＧは、ＱＤ６／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂとほぼ同一の内在化時間経過を有しており（図７Ａ、左及び中央）、これは、ＱＤ６／Ｂ０９デュエットの内在化は主に分子のＥＧＦＲアームによって促進され、Ｂ０９アームの寄与は最小限であることを示す。実際に、Ｂ０９／ＩｇＧ構築物は、非常に低いレベルの内在化を示した（図７Ｂ、右）。膜シグナルの急速且つ広範な減少は、細胞質シグナルの非常に緩やかな増加に対応しており、これはおそらく、細胞表面のｃ－ＭＥＴ受容体から予め結合したＢ０９／ＩｇＧが広範囲に解離したことによるものと考えられる。その後、抗体の解離により、Ｂ０９／ＩｇＧの中程度の内在化が生じた。これらの結果から、ＱＤ６／Ｂ０９デュエットの内在化は主に分子のＥＧＦＲアームによって促進され、Ｂ０９アームの寄与は最小限であることが明らかになった。

【0280】

対照的に、ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂは、そのシングルアーム対照抗体と比較した場合、非常に異なる内在化プロファイルを示した。図７Ｂに示すように、ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂの細胞質強度値は、ＲＡＡ２２－ＩｇＧ及びＢ０９－ＩｇＧよりもそれぞれ１０．９８倍及び４．７０倍高かった。Ｂ０９／ＩｇＧの非効率的な内在化は、その顕著な解離（上記で説明）に起因し得るが、ＲＡＡ２２／ＩｇＧは急速に内在化した。しかし、ＥＧＦＲアームの親和性が低いため、ＲＡＡ２２／ＩｇＧ分子の数はＲＡＡ２２－Ｂ０９ＤｕｅｔＭａｂよりも１０．９８倍少なくなっている（蛍光強度に基づく）。シングルアーム構築物とは対照的に、細胞質に入るデュエットＲＡＡ２２／Ｂ０９ ｍＡｂの量が著しく増加したことから、内在化を促進するには両方の抗体アームが標的受容体と会合する必要があることが示された。この発見は、ＱＤ６／Ｂ０９とＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂｓの内在化のメカニズムが異なり、ＱＤ６／Ｂ０９は主にＥＧＦＲアームによって駆動されるのに対し、ＲＡＡ２２／Ｂ０９は会合にＥＧＦＲアーム及びｃ－ＭＥＴアームの両方を必要とすることを示す。

【0281】

４．３ 異なるレベルの標的受容体を有する細胞株におけるＲＡＡ２２／Ｂ０９の内在化
ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴの両方のアームが標的受容体に結合すると、Ｈ１９７５細胞におけるＲＡＡ２２／Ｂ０９受容体の内在化が促進されたため、ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴ受容体の数の増加が内在化特性に影響を与えるかどうかを調べた。ウエスタンブロット法で決定したそれぞれの受容体レベルは、Ｈ１９７５細胞ではＥＧＦＲが約３３，０００、ｃ－ＭＥＴが約５０，０００、ＨＣＣ８２７細胞ではＥＧＦＲが約７９０，０００、ｃ－ＭＥＴが約５２３，０００であった。Ｈ１９７５（中受容体）及びＨＣＣ８２７（高受容体）細胞におけるＲＡＡ２２／Ｂ０９の内在化プロファイルは、ＨＣＣ８２７細胞における内在化の顕著な増加を示す（図８）。

【0282】

予想通り、ＥＧＦＲ及びｃ－ＭＥＴ ＲＡＡ２２／Ｂ０９の全体レベルがそれぞれ２３．９倍及び１０．４倍増加したことに対応して、ＨＣＣ８２７細胞への結合はＨ１９７５よりも平均８．９倍高かった（Ｔ＝０、３．１ｘ１０^７ＭＦＩ対３．５ｘ１０^６ＭＦＩ）。内在化レベル（ピーク細胞質強度で判断）はＨＣＣ８２７細胞で２１．７倍高く、これは、標的受容体を高レベルで発現している細胞において、有意に高い濃度の抗体が細胞質に入ることを示唆している。重要なことに、顕著に異なる強度に加えて、内在化プロファイル（経時的な膜及び細胞質のシグナル）もＨＣＣ８２７細胞とＨ１９７５細胞間で著しく異なっていた。高発現ＨＣＣ８２７細胞では、ＲＡＡ２２／Ｂ０９－ＡＦ６４７膜シグナルの減少は、ＲＡＡ２２－Ｂ０９細胞質シグナルの逆数増加に対応し、総ＲＡＡ２２／Ｂ０９シグナルは経時的に維持され、両方の受容体との強力なデュアルアーム抗体相互作用とそれに続く内在化を示す。Ｈ１９７５細胞では、総強度及び膜強度の同時低下があり、結合前の抗体の一部が細胞表面から解離し、細胞内に内在化できなかった可能性があることが示されている。ＨＣＣ８２７細胞におけるＲＡＡ２２／ＩｇＧ及びＢ０９／ＩｇＧの内在化について、解離を示す同様のプロファイルが観察されたが、シングルアームの会合では有効な結合が得られず、解離する傾向があった（図９Ａ及び９Ｂ）。このデータは、ＲＡＡ２２／Ｂ０９がＨ１９７５細胞内に内在化される場合、受容体相互作用の混合モード（シングルアーム及びデュアルアーム会合）が存在することを示唆している。総合すると、これらのデータは、標的細胞受容体の発現レベルがＲＡＡ２２／Ｂ０９の内在化の程度及び効率を決定する重要な要因であることが示唆される。

【0283】

実施例５．放射性医薬品の一般的な材料及び方法
ルテチウム１７７は、０．０５Ｎ塩酸溶液中のルテチウム三塩化物としてＩＴＭＭｅｄｉｃａｌＩｓｏｔｏｐｅｓから入手でき；インジウム１１１は、０．０５Ｎ塩酸溶液中のインジウム三塩化物としてＢＷＸＴから入手でき；アクチニウム２２５は、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからアクチニウム２２５三硝酸塩として、又はＣａｎａｄｉａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからアクチニウム２２５三塩化物として入手できる。

【0284】

分析ＨＰＬＣ－ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ（サンプルは１０℃に冷却）、Ｗａｔｅｒ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｍａｎａｇｅｒ（カラム温度３０℃）、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（２５４ｎｍ及び２１４ｎｍでモニタリング）、エレクトロスプレーイオン化機能を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＴＱＤ、及びＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１×５０（１．７μｍ）カラムで構成される、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して実施できる。分取ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ １５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ検出器（２５４ｎｍ及び２１４ｎｍでモニタリング）、及びＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐフェニル又はＣ１８ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラムで構成されるＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して実施できる。

【0285】

ＨＰＬＣ溶出法１：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８ ２．１×５０ｍｍ（１．７μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速＝０．３ｍＬ／分；初期＝９０％Ａ、３～３．５分＝０％Ａ、４分＝９０％Ａ、５分＝９０％Ａ。

【0286】

ＨＰＬＣ溶出法２：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速：１０ｍＬ／分、初期＝８０％Ａ、１３分＝０％Ａ。

【0287】

ＨＰＬＣ溶出法３：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８ ２．１×５０ｍｍ（１．７μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速＝０．３ｍＬ／分；初期＝９０％Ａ、８分＝０％Ａ、１０分＝０％Ａ、１１分＝９０％Ａ、１２分＝９０％Ａ。

【0288】

ＨＰＬＣ溶出法４：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速：１０ｍＬ／分、初期＝８０％Ａ、３分＝８０％Ａ、１３分＝２０％Ａ、１８分＝０％Ａ。

【0289】

ＨＰＬＣ溶出法５：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速：１０ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、３分＝９０％Ａ、１３分＝０％Ａ、２０分＝０％Ａ。

【0290】

ＨＰＬＣ溶出法６：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速：１０ｍＬ／分、初期＝７５％Ａ、１３分＝０％Ａ、１５分＝０％Ａ。

【0291】

ＨＰＬＣ溶出法７：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速：１０ｍＬ／分、初期＝８０％Ａ、１２分＝０％Ａ、１５分＝０％Ａ。

【0292】

ＨＰＬＣ溶出法８：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ １９×１００ｍｍ（５μｍ）カラム；移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）；流速：１０ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１２分＝０％Ａ、１５分＝０％Ａ。

【0293】

分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、Ｗａｔｅｒｓ １５２５バイナリＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ２４８９ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ検出器（２８０ｎｍでモニタリング）、Ｂｉｏｓｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔラジオディテクター（ＦＣ－３３００）、及びＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ、７．８×３００ｍｍカラムで構成される、Ｗａｔｅｒｓシステムを使用して実施できる。アイソクラティックＳＥＣ法は、移動相が０．１Ｍリン酸、０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウム、ｐＨ＝７で、流量は、例えば、ｍＬ／分であり得る。

【0294】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（陽イオン）は、ＭＡＬＤＩ Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ分光計を使用して実施できる。

【0295】

ラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオＴＬＣ）は、Ｂｉｏｓｃａｎ ＡＲ－２０００イメージングスキャナーによって実施することができ、クエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）を使用して、ｉＴＬＣ－ＳＧガラスマイクロファイバークロマトグラフィーペーパー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＧＩ０００１）プレート上で実行できる。

【0296】

実施例６．４－｛［１１－オキソ－１１－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）ウンデシル］カルバモイル｝－２－［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル］ブタン酸（化合物Ｂ）の合成
二官能性キレート、４－｛［１１－オキソ－１１－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）ウンデシル］カルバモイル｝－２－［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル］ブタン酸（化合物Ｂ）は、図１１に提供されるスキームに従って合成することができる。５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－５－オキソ－４－（４，７，１０－トリス（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）ペンタン酸（ＤＯＴＡ－ＧＡ－（ｔＢｕ）_４、５０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（２．０ｍＬ）溶液に、ＤＳＣ（５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を加え、続いてピリジン（０．２０ｍＬ、２．４８ｍｍｏｌ）を加える。反応物を室温で１時間撹拌する。反応混合物に１１－アミノウンデカン酸（７０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、続いて室温でＰＢＳ溶液（１．０ｍＬ）を加える。反応物を室温で７２時間攪拌した。反応混合物をシリンジフィルターで濾過し、方法６を使用して分取ＨＰＬＣで直接精製して、中間体２－Ａが得られる。

【0297】

中間体２－Ａ（４０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（９０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（１．０ｍＬ）溶液に、室温でピリジン（０．０５ｍＬ、５０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を加える。溶液を室温で２４時間攪拌した。反応物は方法７を使用して分取ＨＰＬＣで直接精製され、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｖ１０ Ｒａｐｉｄ Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒを使用して濃縮した後、ワックスとして中間体２－Ｂが得られる。

【0298】

中間体２－ＢをＤＣＭ／ＴＦＡ（１．０ｍＬ／２．０ｍＬ）に溶解し、室温で２４時間撹拌する。反応物を空気流で濃縮し、方法８を使用して分取ＨＰＬＣで直接精製し、濃縮後に透明ワックスとして化合物Ｂが得られる。アリコートをＨＰＬＣ－ＭＳ溶出法３によって分析する。

【0299】

^１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ７．９９－７．８８（ｍ，１Ｈ），７．８２（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｂｒｏａｄ ｓ，４Ｈ），３．４３（ｂｒｏａｄ ｓ，１２Ｈ），３．０８（ｂｒｏａｄ ｓ，４Ｈ），３．００（ｍ，３Ｈ），２．９３（ｂｒｏａｄ ｓ，３Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｂｒｏａｄ ｓ，２Ｈ），１．８８（ｂｒｏａｄ ｓ，２Ｈ），１．６６（ｐ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．３６（ｍ，４Ｈ），１．３２－１．２０（ｍ，９Ｈ）．

【0300】

実施例７．４－｛［２－（２－｛２－［３－オキソ－３－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）プロポキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］カルバモイル｝－２－［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル］ブタン酸（化合物Ｃ）の合成
二官能性キレート、４－｛［２－（２－｛２－［３－オキソ－３－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）プロポキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］カルバモイル｝－２－［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル］ブタン酸（化合物Ｃ）は、図１２に提供されるスキームに従って合成される。

【0301】

５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－５－オキソ－４－（４，７，１０－トリス（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）ペンタン酸（ＤＯＴＡ－ＧＡ（ｔＢｕ）_４、１００ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（８．０ｍＬ）溶液に、ＤＳＣ（７３ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．８０ｍＬ、９．８９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を周囲温度で９０分間撹拌する。この溶液を１００ｍＬ丸底フラスコ内のアミノＰＥＧ３酸の半溶液（ＤＭＦ１．２ｍＬ中、６３ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）に加える。周囲温度で４時間後、反応物を空気流下で濃縮乾固することによってワークアップする。粗物質をＨＰＬＣ溶出法２（粗物質を６ｍＬの２０％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏに溶解）で精製する。生成物を含有する画分をプールし、真空下で濃縮し、次いでＡＣＮ（３×２ｍＬ）と共蒸発させる。

【0302】

中間体１－Ａ（８２ｍｇ、６０μｍｏｌ）を含むバイアルに、ＡＣＮ（２ｍＬ）、ＮＥｔ_３（５０μＬ、３６０μｍｏｌ、６当量）、ＨＢＴＵ（２３ｍｇ、６０μｍｏｌ、１当量）及びＴＦＰ溶液（５０ｍｇ、３００μｍｏｌ、５当量、２５０μＬのＡＣＮに溶解）を加える。得られた透明な溶液を環境温度で３時間撹拌した。反応物は、溶液を空気流下で濃縮乾固することによってワークアップされ、次いで、ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（１：１、合計３ｍＬ）で希釈され、溶出法４を使用して分取ＨＰＬＣで精製される。生成物を含有する画分をプールし、真空下で濃縮し、次いでＡＣＮ（３×２ｍＬ）と共蒸発させる。中間体１－Ｂは、透明な残留物として得られる。

【0303】

中間体１－Ｂ（６７ｍｇ、６４μｍｏｌ）を含有するバイアルにＤＣＭ（２ｍＬ）及びＴＦＡ（２ｍＬ）を加える。得られた溶液を環境温度で１６時間撹拌した。さらにＴＦＡ（２ｍＬ）を加え、反応物を室温で６時間撹拌する。反応物を空気流下で濃縮乾固し、粗生成物を最終的にＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（１０％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ １ｍＬ）に溶解する。次いで、粗反応物溶液を、溶出法５を使用した分取ＨＰＬＣで精製する。生成物を含有する画分をプールし、凍結し、凍結乾燥する。化合物Ｃは、白色固体として得られる。アリコートをＨＰＬＣ－ＭＳ溶出法３によって分析する。

【0304】

^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６，６００ＭＨｚ）δ ７．９７－７．９１（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．５８－３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５３－３．４８（ｍ，８Ｈ），３．４４－３．３８（ｍ，１０Ｈ），３．２３－３．０８（ｍ，１１Ｈ），３．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．９３（ｂｒｏａｄ ｓ，４Ｈ），２．３０（ｂｒｏａｄ ｓ，２Ｈ），１．８７（ｂｒｏａｄ ｓ，２Ｈ）．

【0305】

実施例８．ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体を含む放射性免疫抱合体の合成のための抱合及び放射性標識
８．１．免疫抱合体化合物Ｄの合成

【化31】

１３３ｍＬの滅菌溶液容器に、ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴモノクローナル二重特異性抗体ＲＡＡ２２／Ｂ０９ ＤｕｅｔＭａｂのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（５８．８ｍＬ；５．１ｍｇ／ｍＬ；３００ｍｇ）を入れ、続いて５．８８ｍＬの炭酸緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ９．５）、及び化合物Ｃの０．００１Ｍ ＨＣｌ溶液２．８３ｍＬ（７．７当量；３．００ｍＬ中１７．３ｍｇ；この溶液は使用直前に調製）を入れた。得られた混合物のｐＨは、ｐＨストリップによって約９．５～１０であると測定された。反応は、室温で２時間反応させた。酢酸アンモニウム（２８．１ｇ）を反応混合物に加え、得られた溶液を５ｍＬ Ｃｙｔｉｖａ ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ（ＨＩＣ）カートリッジにロードした（ＨＩＣカートリッジは最初に酢酸ナトリウム緩衝生理食塩水とＴｗｅｅｎ（ＳＡＢＳＴ；５０ｍＬ）で前処理し、次に酢酸アンモニウム溶液（５０ｍＬ；０．４２ｇ／ｍＬ）で前処理した）。ＨＩＣカートリッジを酢酸アンモニウム溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、生成物をＳＡＢＳＴ（約１０ｍＬ）で溶出した。生成物溶液をＳＡＢＳＴで約１５ｍＬに希釈し、ＳＡＢＳＴ（２５０ｍＬ）で前処理したＣｙｔｉｖａ １５ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カートリッジにロードした。生成物画分をＳＡＢＳＴ（約１６ｍＬ）で溶出して、無色透明の液体を得、サイズ排除クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を使用した分析により、化合物Ｄ（１５．９ｍＬ、１４．８ｍｇ／ｍＬ、２３４．９ｍｇ、７８％）の形成が示された。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法を使用して、キレート対抗体比（ＣＡＲ）５．３を決定し、ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体と免疫抱合体化合物Ｄの質量対電荷比の差から計算した。

【0306】

８．２ 放射性免疫抱合体化合物Ｅの放射性合成

【化32】

１．５ｍＬエッペンドルフチューブに化合物ＤのＳＡＢＳＴ溶液（０．１００ｍＬ；２．００ｍｇ／ｍＬ；０．２００ｍｇ）を入れ、続いて［^１７７Ｌｕ］ＬｕＣｌ_３の０．０４Ｍ ＨＣｌ溶液（２．２ｍＣｉ）を入れた。室温で２０分後、反応混合物のｉＴＬＣ分析（シリカゲル（ＳＧ）プレート、移動相として０．０２Ｍクエン酸緩衝液（５％ＭｅＯＨ））により、放射化学変換（ＲＣＣ）が９７％超であることが示された。精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０樹脂（ＳＡＢＳＴで水和）を充填した１ｍＬカラムを使用して実施した。生成画分を、ＳＡＢＳＴを使用して溶出し、結合した。Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム及びジエチレントリアミン五酢酸カルシウム三ナトリウム塩水和物（ＤＴＰＡ）のＳＡＢＳＴ溶液を加え、得られた配合物（約１０ｍＭＬ－アスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＰＡ）を合成終了時（ＥＯＳ）にｉＴＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析したところ、化合物Ｅ（３６４μＬ、０．４３１ｍｇ／ｍＬ、１０．１ｍＣｉ／ｍｇの比活性、放射化学的純度＞９５％、化学的純度＞９９％）の形成が示された。

【0307】

８．３ 放射性免疫抱合体化合物Ｆの放射性合成

【化33】

１．５ｍＬエッペンドルフチューブに化合物ＤのＳＡＢＳＴ溶液（０．１９３ｍＬ、２．０７ｍｇ／ｍＬ、０．４００ｍｇ）を入れ、続いて［^２２５Ａｃ］Ａｃ（ＮＯ_３）_３の０．００１Ｍ ＨＣｌ溶液（２４μＣｉ）を入れた。３５℃で１２０分後、ＤＴＰＡ（０．１Ｍ ＳＡＢＳＴ溶液２μＬ）を加えて反応をクエンチした。反応混合物のｉＴＬＣ分析（ＳＧプレート、移動相として０．０２Ｍクエン酸緩衝液（５％ＭｅＯＨ））では、ＲＣＣが９９％であることが示された。精製は、Ｇ５０樹脂（ＳＡＢＳＴで水和）を充填した１ｍＬカラムを使用して実施した。生成画分を、ＳＡＢＳＴを使用して溶出し、結合した。Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム及びＤＴＰＡのＳＡＢＳＴ溶液を加え、得られた配合物（約１０ｍＭＬ－アスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＰＡ）をＥＯＳで、ｉＴＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析したところ、化合物Ｆ（４４８μＬ、０．６８０ｍｇ／ｍＬ、０．０５３ｍＣｉ／ｍｇ比活性、放射化学的純度＞９９％、化学的純度＞９９％）の形成が示された。

【0308】

実施例９．［^１７７Ｌｕ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体のインビトロ結合
４つの異なる細胞株：ＨＣＣ８２７細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈ４４１細胞、及びＨ１９７５細胞を用いて、［^１７７Ｌｕ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体（すなわち、化合物Ｅ）の受容体結合親和性を評価する試験を実施した。この試験は、以下に説明する手順に従った。

【0309】

このアッセイの目的は、ＨＴ２９、Ｈ４４１、ＨＴ２９、ＨＣＣ８２７、及びＨ１９７５を含むＥＧＦＲ及び／又はｃＭＥＴ発現細胞株において、放射性免疫抱合体が天然抗体の結合特性を維持することを確認することであった。実験の１日前に、細胞（１．５～２×１０^５）を５００μＬの補充培地中、４８ウェルマイクロプレートに播種した。アッセイの開始時に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、４μＭの冷式抗体の存在下及び不存在下で、漸増濃度の化合物Ｅ（０．０５ｎＭ～１００ｎＭ）で処理した［それぞれ総結合（ＴＢ）及び非特異的結合（ＮＳＢ）］。プレートを穏やかに振盪しながら、４℃で約３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で溶解した。溶解物をガンマ計数チューブに移し、Ｗｉｚａｒｄ １４７０ガンマカウンターで化合物Ｅ標準とともに分析し、各溶解物につき放射能量を１分あたりのカウント数（ＣＰＭ）で測定した。各ウェルの残りの溶解物（２５μＬ）は、標準的なタンパク質定量アッセイを使用してタンパク質含有量を分析するために使用した。

【0310】

総結合、特異的結合、非特異的結合の値（ｆｍｏｌ／ｍｇ）を、図１４Ａ～１４Ｂに示すように、抱合体濃度に対してプロットした。Ｋｄ及びＢｍａｘは、特異的結合データを単一部位双曲線モデル（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン９）に曲線フィッティングすることによって導かれた。結合データにより、Ｋｄの望ましい値が明らかになった。最も高いＢｍａｘ（ｆｍｏｌ／ｍｇ）は、ＨＣＣ８２７（２８６１±２０７）及びＨＴ２９（２３５１±２３７）で観察され、次いでＨ４４１（１１９５±１５３）及びＨ１９７５（４９８±４２）であった。

【0311】

ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体、すなわち化合物Ｅは、ＨＣＣ８２７細胞で約９．９ｎＭ、ＨＴ２９細胞で約５．７ｎＭ、Ｈ４４１細胞で約１５．５ｎＭ、Ｈ１９７５細胞で約６．０ｎＭという高い結合親和性を示すことが観察された。

【0312】

実施例１０．［^１７７Ｌｕ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体の内在化評価
この内在化アッセイは、放射性標識リンカー抗体誘導体の細胞保持の程度を決定するために設計された。このアッセイは、抗体に結合したときに内在化するＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ受容体の固有の能力、及び放射性標識化合物を追跡する能力に依存している。ここでは、一定量の放射性免疫抱合体を４つの異なる細胞株とともに一定時間インキュベートし、内在化された放射能の量を総細胞関連活性の割合として計算することによって残留率を決定する。

【0313】

下記のプロトコルに従って、［^１７７Ｌｕ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体、すなわち化合物Ｅの、ＨＣＣ８２７細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈ４４１細胞、及びＨ１９７５細胞の４つの異なる細胞株での内在化を評価する試験が実行された。

【0314】

このアッセイは、放射性免疫抱合体化合物Ｅの細胞保持の程度を決定するために設計された。簡潔には、上記の細胞株を３つの２４ウェルプレートに完全培地中３×１０^５細胞／ウェルの濃度で播種した（０時間、２時間、２４時間の培養時間）。翌日、培地をデカントし、細胞を滅菌ＰＢＳで１回洗浄し、化合物Ｅ（１０ｎＭ）で、３７℃で２～３時間処理した。インキュベーション後、全てのプレートを直ちに氷上に置き、培地を予めラベル付けした（結合していない）ガンマ計数チューブに捨てた。細胞を滅菌ＰＢＳで１回洗浄し、穏やかに振盪させ、（結合していないラベル付きの）ガンマチューブにデカントした。強酸洗浄緩衝液（ｐＨ２．５、５００μＬ）を０時間の時点で４℃で５分間にわたって加え、次いで、緩衝液を予めラベル付けした（膜結合）ガンマ計数チューブに収集した。次いで、細胞を、３００μＬの１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で、室温で３０分間穏やかに振盪させながら溶解した。２５０μＬの細胞溶解物をガンマ計数チューブに移し、１０分間計数した。弱酸洗浄緩衝液（ｐＨ４．６、５００μＬ）を２時間及び２４時間プレートに加え、４℃で１５分間放置した。次いで、緩衝液を予めラベル付けした（膜結合）ガンマ計数チューブに収集した。温培地１ｍＬをプレートに加え、さらに３７℃でそれぞれ２時間及び２４時間インキュベートした。規定の培養時間後、プレートを氷上に置き、以下の方法で処理した。培地をデカントし、予めラベル付けした（排出）ガンマチューブに収集した。次いで、プレートを１ｍＬの冷ＰＢＳで１回洗浄し、排出チューブに加えた。強酸洗浄緩衝液を全てのウェルに加え、プレートを氷上で５分間インキュベートした。次いで、酸洗浄画分を、予めラベル付けした（リサイクル）ガンマチューブに収集した。細胞を、３００ｕＬの１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で、室温で３０分間溶解した。２５０μＬの細胞溶解物を、予めラベル付けした（保持）ガンマ計数チューブに移し、１０分間計数した。２５μＬの細胞溶解物画分を、タンパク質定量（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ）のために９６ウェルプレートに移した。

【0315】

この内在化試験の結果を図１５に示す。残留率は、ＣＰＭ（溶解）又はＣＰＭ（排出＋リサイクル＋溶解）として決定された。培養後２４時間で最低の排出率が観察されたのはＨＣＣ８２７であり、続いてＨＴ２９、Ｈ４４１及びＨ１９７５であった（それぞれ約２５％、３０％、３５％、４５％）。この場合、ＥＧＦＲ＋ｃＭＥＴ受容体の発現レベルと細胞保持の間に相関性があるようである。

【0316】

実施例１１．様々な動物モデルにおける［^１７７Ｌｕ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体のインビボ生体内分布
以下のプロトコルに従って、［^１７７Ｌｕ］－ＤＯＴＡ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体（すなわち、化合物Ｅ）のインビボ生体内分布を評価するために、５つの異なる細胞株異種移植マウスモデルを使用した。

【0317】

腫瘍接種：細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥離した。採取した細胞は、ＰＢＳとマトリゲル（ＢＤ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ ＯＮ）の１：１混合物に以下の濃度で再懸濁した：
ＨＣＣ８２７：５０×１０^６細胞／ｍＬ
ＨＴ２９：２０×１０^６細胞／ｍＬ
Ｈ１９７５：５０×１０^６細胞／ｍＬ
Ｈ２９２：３０×１０^６細胞／ｍＬ
Ｈ４４１：５０×１０^６細胞／ｍＬ

【0318】

５～７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃＮＣＩ無胸腺ＮＣｒ－ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に、１００μＬの混合物を皮下注射した。放射性物質の注射は、接種後３週間で同じサイズに達したＨＣＣ８２７異種移植片を除き、接種後約７～１０日で腫瘍の体積が１５０～２００ｍｍ３に達したときに開始した。

【0319】

生体内分布試験：皮下腫瘍（上記）を有する３匹のマウスの５つの群に、およそ０．７４ＭＢｑの^１７７Ｌｕ（抗体約２μｇ）を含有する化合物Ｅ２００μＬを側尾静脈から静脈内注射した。注射後指定された時点（４時間、２４時間、４８時間、９６時間、及び１６８時間）で、各時点につき１群をイソフルランで麻酔し、心臓穿刺により失血させ、次いで解剖により血液及び異なる器官を採取するために安楽死させた。腫瘍及び器官は、残留血液をＰＢＳですすぎ、水分を拭き取って、予め重量を測定したガンマ計数チューブに収集した。組織サンプルに含有される１分あたりの放射線計数はガンマカウンターを使用して測定され、次いで、較正標準を使用して、減衰補正された放射能のμＣｉに変換された。活性測定値及びサンプル重量を使用して、組織重量１グラムあたりの注入量の割合（％ＩＤ／ｇ）を計算した。

【0320】

結果は組織１グラムあたりの注入量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表され、図１６Ａ～１６Ｅに示される。化合物Ｅの生体内分布試験では、ＩｇＧの典型的な生体内分布プロファイルが示され、正常な臓器における取り込みレベルは許容されるレベルであることが示された。最も高い腫瘍取り込み率（％ＩＤ／ｇ）は、Ｈ２９２＞Ｈ４４１＞ＨＴ２９及びＨ１９７５異種移植片で観察された［それぞれ約７５％（９６時間、１６８時間）、約３５％（４８時間、９６時間）、約２９％（４８時間、９６時間）、及び約２０％（４８時間、９６時間）］。ＨＣＣ８２７異種移植モデルでは、腫瘍の取り込み（％ＩＤ／ｇ）は４８時間でピークに達し、化合物Ｅは約２５％であり、注射後９６時間及び１６８時間で約１７％に低下した。ＨＣＣ８２７異種移植モデルは、腫瘍成長速度が遅いため、治療試験に進めなかった。

【0321】

実施例１２．様々な動物モデルにおける［^２２５Ａｃ］－化合物Ｃ－抗ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抱合体のインビボ有効性
アクチニウム－２２５で標識された放射性免疫抱合体である化合物Ｆの異なる用量の有効性を、冷式抗体クローン及び／又はビヒクル対照と比較して評価する試験が設計された。

【0322】

有効性試験は、化合物Ｆ（^２２５Ａｃ放射標識ＥＧＦＲ－ｃＭＥＴ抗体）の４つの漸増用量で行い、冷抗体及び／又はビヒクル対照と比較した。治療効果試験は、Ｈ４４１、ＨＴ２９及びＨ１９７５腫瘍異種移植片を使用して実行した。各研究では、担癌動物６～７群（ｎ＝５）に、側尾静脈から２００μＬの化合物を静脈内注射した。化合物Ｆは、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５、０．８２％ＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ－８０緩衝液中に配合され、５０～４００ナノキュリー（ｎＣｉ）の活性で投与された。対照として、研究で試験された化合物Ｆの最高放射能量に対応するタンパク質質量当量で、放射性標識されていない非抱合抗体が投与された。腫瘍の測定は、ノギスを使用して２次元で少なくとも６０日間にわたり、週に２～３回行った。腫瘍の長さは最長寸法として定義され、幅は腫瘍の長さに対して垂直に測定された。同時に動物の体重も測定した。全体的な身体状態及び一般行動を毎日評価した。腫瘍体積（ｍｍ）は、キャリパー測定から楕円体として計算された。腫瘍成長は、Ｘ日目に測定された腫瘍体積を投与日に測定された腫瘍体積で割った相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）として表した。全てのモデルにおいて、２００ｎＣｉ及び４００ｎＣｉは全てのマウスで長期的な腫瘍退縮を生じた（図１７Ａ～１７Ｃ）。最も良い反応はＨ４４１モデルで観察され、５０ｎＣｉ及び１００ｎＣｉの両方の用量で複数のマウスにおいて腫瘍の抑制及び退縮を示した。Ｈ１９７５モデルでは、５０ｎＣｉにより全てのマウスで腫瘍成長が有意に遅延し、１００ｎＣｉ投与群では腫瘍成長の遅延、腫瘍の抑制及び退縮を含む、混合的反応が見られた。ＨＴ２９モデルでは、１００ｎＣｉで腫瘍抑制を示したマウス１匹を除き、５０ｎＣｉ又は１００ｎＣｉの用量では有効性は観察されなかった。

【0323】

参考文献
本開示及び本開示に関係する最新技術をより詳細に説明及び開示するために、多数の刊行物が上記で引用されている。これらの参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれている。

【0324】

【表4】

【0325】

【表5】

【0326】

【表6】

【0327】

【表7】

【0328】

【表8】

【0329】

【表9】

【0330】

【表10】

【0331】

標準的な分子生物学手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

【0332】

その他の実施形態
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されてきたが、さらなる修正が可能であり、本願は、概して本発明の原理に従う任意の変更、使用又は適用を包含することが意図され、本発明が属する技術の既知の又は慣習的な実践の範囲内となり、前述した本質的な特徴に適合し得る、本開示からのそのような逸脱を含むことが理解されるであろう。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【配列表】

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【国際調査報告】