特表 2025-501144 ハロゲン化キサンテン含有局所抗グラム陽性菌眼科用組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-17

(54)【発明の名称】ハロゲン化キサンテン含有局所抗グラム陽性菌眼科用組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/352 20060101AFI20250109BHJP

   A61K 31/365 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20250109BHJP

   A61K 41/00 20200101ALN20250109BHJP

【ＦＩ】

A61K31/352

A61K31/365

A61P27/02

A61P31/04

A61K41/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538697

(86)(22)【出願日】2022-12-27

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 US2022054076

(87)【国際公開番号】W WO2023129542

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】63/294,252

(32)【優先日】2021-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510293969

【氏名又は名称】プロヴェクタス ファーマテック，インク．

(71)【出願人】

【識別番号】512018287

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ テネシー リサーチ ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ミチオ クロス

(72)【発明者】

【氏名】ドミニク ロドリゲス

(72)【発明者】

【氏名】エドワード ブイ． パーシング

(72)【発明者】

【氏名】ブルース ホロヴィッツ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン 三世、 レイシー

(72)【発明者】

【氏名】エリック エー． ワクター

(72)【発明者】

【氏名】エドワード ピー． ガムソン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA11

4C084MA05

4C084MA17

4C084MA58

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086CA01

4C086GA13

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA17

4C086MA58

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZB35

(57)【要約】

本発明は、グラム陽性菌に感染した哺乳動物の眼を治療するための局所眼科システムを考慮する。このシステムは、水性眼科用担体に溶解又は分散され、約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの抗菌性角膜炎治療に有効な濃度で存在するハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルを含む眼科用組成物を含む。眼科用組成物は、ｐＨ値が約６．５から約７．６、粘度が約１０から約３００ｃｐｓ、浸透圧が約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。眼科用組成物は、化学線に対して不透明な容器内に存在する。また、眼科用組成物を感染した眼に投与し、治療した眼を約３時間から約１２時間、実質的に化学線のない状態に維持することによって、眼のグラム陽性菌感染症に罹患している哺乳動物を治療する方法も考慮される。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物の眼のグラム陽性菌感染症の治療に必要な局所眼科システムであって、
前記システムは、水性点眼剤中に溶解又は分散されたハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルを含む眼科用組成物を含み、該組成物は約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの細菌性角膜炎治療に有効な濃度で存在し、
約６．５から約７．６のｐＨ値と、約１０から約３００ｃｐｓの粘度と、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、化学線に対して不透明な容器内に存在する局所眼科システム。

【請求項2】

前記組成物が更に、グリセリン又はプロピレングリコール又はグリセリン及びプロピレングリコールの両方を最大で前記組成物の合計２．５重量パーセント含む、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項3】

少なくとも一部の前記浸透圧が、１つ以上の水溶性のナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの塩化物、リン酸塩、及び硝酸塩の存在によって与えられる、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項4】

前記粘度が、前記組成物の前記ｐＨ値でイオン電荷のない１つ以上のポリマーによって少なくとも部分的に与えられる、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項5】

前記組成物の前記ｐＨ値でイオン電荷のない前記ポリマーが、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、デキストラン、デキストリン、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒプロメロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びポリ（ビニルアルコール）のうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項４に記載の局所眼科システム。

【請求項6】

前記粘度が、前記組成物の前記ｐＨ値でアニオン電荷を帯びる１つ以上のポリマーによって少なくとも部分的に与えられる、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項7】

前記組成物の前記ｐＨ値でアニオン電荷を帯びる前記ポリマーが、ａ）ヒアルロン酸、ｂ）各架橋剤が１分子当たり平均して少なくとも３つのアリル基を含む、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋された水溶性の部分的に中和された架橋アクリル酸、メタクリル酸及び共重合体、ｃ）水膨潤性であるが非水溶性の部分的に中和された、少なくとも８０重量パーセントのモノエチレン性不飽和カルボキシ官能性モノマーと約０．０５から約１．５重量パーセントの３,４－ジヒドロキシ－１,５－ヘキサジエン又は２,５－ジメチル－１,５－ヘキサジエンである架橋剤との共重合反応生成物、及びｄ）部分的に中和されたカルボキシメチルセルロースのうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項６に記載の局所眼科システム。

【請求項8】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式１及び／又は式２の一方又は両方の化学式を有し、

【化1】

式中、Ｒ_１が独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５が独立してＣｌ、Ｈ又はＩであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５から選択される少なくとも１つの置換基がＩであり；
Ｒ_６が独立してＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１１がＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１２がＨ又はＣ_１－Ｃ_７アシルであり；すべての（ａ）互変異性型、（ｂ）アトロプ異性体、（ｄ）式２に示すラクトン型の光学異性体、及び（ｅ）それらの薬学的に許容される塩、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項9】

前記式１及び式２の前記ハロゲン化フルオレセインのＲ_１がクロロ又はブロモ置換基のいずれかである一方、それらの式のＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のそれぞれが、以下の式Ｉ及び式ＩＩに存在するヨウド置換基であり、Ｘが酸素又は窒素であり、「ｎ」がゼロ又は１であり、Ｘが

【化2】

酸素である場合、ｎがゼロであり、Ｒ^７が存在せず芳香族エステルを形成するのに対して、Ｘが窒素である場合、ｎが１であり、Ｒ^７が存在して芳香族アミドを形成し、
Ｘが酸素である場合、Ｒ^７が、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ^＋、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、及び芳香環含有置換基からなる群から選択され、
前記芳香環含有置換基が、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む、５若しくは６員を含む単環、又は５，６若しくは６，６縮合芳香環系であり、
Ｘが窒素である場合、Ｒ^７及びＲ^８が同じか又は異なり、水素、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、芳香環含有置換基又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共にアミド窒素原子Ｒ^７及びＲ^８と共に含んでなる群から選択される、請求項８に記載の局所眼科システム。

【請求項10】

前記芳香族エステル又は芳香族アミドの前記芳香環含有置換基が非置換であり、次のものからなる群から選択され、

【化3】

である、請求項９に記載の局所眼科システム。

【請求項11】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式Ｉａ及び／又は式ＩＩｂの一方又は両方の化学式を有し、

【化4】

式中、Ｍ^＋が薬学的に許容されるカチオンである、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項12】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルがローズベンガルジナトリウムである、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項13】

角膜炎を示すグラム陽性菌に感染した眼を有する哺乳動物対象を治療する方法であって、水性眼科用担体に溶解又は分散されたハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルを含む眼科用組成物であって、前記組成物中に約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの細菌性角膜炎治療に有効な濃度で存在し、約６．５から約７．６のｐＨ値と、約１０から約３００ｃｐｓの粘度と、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する眼科用組成物を前記菌に感染した眼に投与することによって前記菌に感染した眼を治療するステップと、前記治療した眼を実質的に化学線のない状態に約３時間から約１２時間維持するステップとを含む方法。

【請求項14】

前記治療が前記実質的に化学線のない状態で実行される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記眼科用組成物が、前記投与の前に化学線に対して不透明な容器に保持される、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式１及び／又は式２の一方又は両方の化学式を有し、

【化5】

式中、Ｒ_１が独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５が独立してＣｌ、Ｈ又はＩであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５から選択される少なくとも１つの置換基がＩであり；
Ｒ_６が独立してＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１１がＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１２がＨ又はＣ_１－Ｃ_７アシルであり；すべての（ａ）互変異性型、（ｂ）アトロプ異性体、（ｄ）式２に示すラクトン型の光学異性体、及び（ｅ）それらの薬学的に許容される塩、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記式１及び式２の前記ハロゲン化フルオレセインのＲ_１がクロロ又はブロモ置換基のいずれかである一方、それらの式のＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のそれぞれが、以下の式Ｉ及び式ＩＩに存在するヨウド置換基であり、Ｘが酸素又は窒素であり、「ｎ」がゼロ又は１であり、Ｘが

【化6】

酸素である場合、ｎがゼロであり、Ｒ^７が存在せず芳香族エステルを形成するのに対して、Ｘが窒素である場合、ｎが１であり、Ｒ^７が存在して芳香族アミドを形成し、
Ｘが酸素である場合、Ｒ^７が、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ^＋、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、及び芳香環含有置換基からなる群から選択され、
前記芳香環含有置換基が、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む、５若しくは６員を含む単環、又は５，６若しくは６，６縮合芳香環系であり、
Ｘが窒素である場合、Ｒ^７及びＲ^８が同じか又は異なり、水素、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、芳香環含有置換基又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共にアミド窒素原子Ｒ^７及びＲ^８と共に含んでなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記芳香族エステル又は芳香族アミドの前記芳香環含有置換基が非置換であり、次のものからなる群から選択され、

【化7】

である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式Ｉａ及び／又は式ＩＩｂの一方又は両方の化学式を有し、

【化8】

式中、Ｍ^＋が薬学的に許容されるカチオンである、請求項１３に記載の方法。

【請求項20】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルがローズベンガルジナトリウムである、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、２０２１年１２月２８日に出願された米国出願第６３／２９４２５２号の優先権を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

角膜疾患は、世界的に単眼盲の主な原因であり、特に社会的に疎外された人々に影響を与えている。主に伝染性角膜炎によって引き起こされる角膜混濁は、世界的に失明の第４位の原因であり、世界で最も資源の少ない国々における回避可能な視力障害の１０％を占める。インドだけで、毎年約２００万人が角膜潰瘍を発症している。米国では、伝染性角膜炎はコンタクトレンズの装用に関連することが多いが、資源の乏しい国では、農作業中に受けた眼外傷が原因であることが多い。［Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．, Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２４（１１）：１６７８－１６８９（２０１７）．］

【0003】

角膜潰瘍、角膜炎は角膜にできる開放創であり、よく見られる人間の眼の疾患である。外傷、特に植物質による外傷のほか、化学傷害、コンタクトレンズ、感染症などによって引き起こされる可能性がある。内反、二重まつ毛、角膜ジストロフィー、乾性角結膜炎（ドライアイ）など、他の眼疾患も角膜潰瘍の原因となる可能性がある。

【0004】

多くの微生物が感染性角膜潰瘍の原因となる。その中には、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、クラミジアなどがある。

【0005】

細菌性角膜炎は、黄色ブドウ球菌、緑色連鎖球菌、大腸菌、腸球菌、緑膿菌、ノカルジア菌、淋菌を含む多くの細菌及びその他の細菌によって引き起こされる可能性がある。多剤耐性（ＭＤＲ）グラム陽性菌の出現の増加は、公衆衛生上の大きな脅威である［Ｂａｓｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．, Ａｎｎａｌ． Ｃｌｉｎｉｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． １２：１－１５（２０１３）；Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ６６：５７１－５９１（２０１３）；及びＷｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． ５９：Ｓ４－１６（２００９）］。特に、ブドウ球菌、腸球菌、及び連鎖球菌種のＭＤＲ株は、罹患率と死亡率に大きな影響を与える［Ｄｕｐｏｎｔ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ６６：２３７９－２３８５（２０１１）］．

【0006】

真菌性角膜炎は、深くて重度の角膜潰瘍を引き起こす。これは通常、アスペルギルス種、フザリウム種、カンジダ種、またクモノズカビ、ケカビ、及びその他の真菌によって引き起こされる。真菌性角膜炎の典型的な特徴は、発症が遅く、進行が緩徐であることであり、兆候は症状よりもはるかに多くなる。潰瘍の周りの小さな周辺病巣は真菌性角膜炎の一般的な特徴であり、眼の前房の炎症細胞を伴う疾患（前房蓄膿）が観察される。

【0007】

ウイルス性角膜炎は角膜潰瘍を引き起こす。これは、単純ヘルペス、帯状疱疹、及びアデノウイルスによって最も一般的に引き起こされる。コロナウイルスや他の多くのウイルスによっても引き起こされる可能性がある。

【0008】

ヘルペスウイルスは樹枝状潰瘍を引き起こし、これは個人の生涯にわたって再発する可能性がある。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）角膜炎は、米国では推定５０万人、世界では推定１５０万人に影響を与えている。これは、先進国の多くで片側性感染性角膜失明の最も一般的な原因である。［Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．, Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２４（１１）：１６７８－１６８９（２０１７）．］

【0009】

ウイルス性角膜炎は、慢性化したり再発したりする可能性がある点で、細菌性角膜炎や真菌性角膜炎とは異なる。痛みを伴い、視力を脅かす感染症であるだけでなく、ＨＳＶ角膜炎は、患者が活動性感染症を経験していない場合でも、生活の質に重大な影響を与えることが示されている。ウイルス性角膜炎のあまり一般的ではない形態には、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）角膜炎やサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）角膜炎がある。［Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．, Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２４（１１）：１６７８－１６８９（２０１７）．］

【0010】

アカントアメーバ角膜炎などの原虫感染症は、激しい痛みを特徴とし、プールで泳ぐコンタクトレンズ使用者に関連する。

【0011】

表在性潰瘍は上皮の一部の喪失を伴う。深部潰瘍は実質に広がったり、実質を貫通したりして、重度の瘢痕や角膜穿孔を引き起こす可能性がある。潰瘍が実質を貫通すると、デスメ膜瘤が生じる。このタイプの潰瘍は特に危険であり、適切なタイミングで治療しない場合に、急速に角膜穿孔を引き起こす可能性がある。

【0012】

潰瘍の場所は原因によって多少異なる。中心潰瘍は通常、外傷、ドライアイ、又は顔面神経麻痺や眼球突出による曝露によって引き起こされる。内反、重度のドライアイ、及び睫毛乱生（睫毛の内反）は、周辺角膜の潰瘍を引き起こす可能性がある。免疫介在性眼疾患は、角膜と強膜の境界に潰瘍を引き起こす可能性がある。これらには、関節リウマチ、酒さ、及び全身性強皮症が含まれ、これらはモーレン潰瘍と呼ばれる特殊なタイプの角膜潰瘍を引き起こす。モーレン潰瘍は、角膜輪部の内側の周囲にクレーターのような陥没があり、通常は縁が張り出している。

【0013】

最適な治療には適切な診断が不可欠である。潰瘍の原因が感染性か非感染性かを判断する必要がある。

【0014】

細菌性角膜潰瘍では通常、感染症を治療するために集中的な強化抗生物質療法が必要である。真菌性角膜潰瘍では、局所性抗真菌薬の集中的な塗布が必要である。ヘルペスウイルスによって引き起こされるウイルス性角膜潰瘍は、１日に少なくとも５回点眼する局所アシクロビル軟膏などの抗ウイルス薬に反応することがある。これと並行して、鎮痛剤などの支持療法が通常行われ、これには瞳孔を散大させて毛様体筋の痙攣を止めるアトロピンやホマトロピンなどの局所毛様体筋麻痺薬が含まれる。

【0015】

表在性潰瘍は１週間足らずで治癒することがある。深部潰瘍やデスメ膜瘤には、結膜グラフトや結膜フラップ、ソフトコンタクトレンズ、又は角膜移植が必要になることがある。通常、タンパク質摂取やビタミンＣなどの適切な栄養摂取が推奨される。角膜潰瘍がビタミンＡの欠乏が原因となって引き起こされる角膜軟化症の場合、経口又は筋肉内経路でビタミンＡを補給する。角膜潰瘍に通常禁忌である薬剤は、外用副腎皮質ホルモン剤［Ａｌｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ．１（１）：ＣＤ００６１３１（２０１４）］及び麻酔薬であり、これらは、いかなる種類の角膜潰瘍にも使用すべきではない。なぜなら、治癒を妨げ、真菌や他の細菌との重複感染を引き起こすことがあり、多くの場合、症状を悪化させることになるためである。

【0016】

よく言及される問題は、「赤目」、「結膜炎」、「角膜潰瘍／角膜炎」などであった。結膜炎は、結膜血管の拡張を引き起こし、炎症を引き起こすよく見られる疾患である。ウイルス性結膜炎と細菌性結膜炎はどちらも赤目を呈し、伝染性が高い。評価は、視力のチェックと懐中電灯又は細隙灯による検査を含む必要がある。角膜潰瘍又は感染の兆候を除外するために、フルオレセイン点眼薬を結膜嚢に点眼し、細隙灯又は眼底鏡のコバルトブルーの光で眼を観察する必要がある。

【0017】

ウイルス性結膜炎は、感染性結膜炎の最も一般的な原因である。この感染症は、子供よりも成人に多く見られる。ほとんどの症例はアデノウイルスが原因である。時には、単純ヘルペスウイルスや帯状疱疹ウイルスが原因となることもある。ウイルス性結膜炎には特別な治療法がないため、一般的に患者にはウイルス性結膜炎は自己限定的であるとアドバイスされる可能性がある。

【0018】

細菌性結膜炎は、結膜炎の原因としては頻度が低いが、子供に多く見られる。最も一般的な細菌は、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌である。抗生物質点眼薬を使用すると、臨床的及び微生物学的寛解率が向上する。多くの場合、広域スペクトルの局所抗生物質が推奨される。

【0019】

角膜の感染症（細菌性角膜炎）は急速に進行する可能性があるため、応急手当が必要な眼科的緊急症である。これは、労働年齢の成人における視力障害の最も一般的な原因の１つである。米国では、毎年約３０,０００件の細菌性角膜炎が報告されている［Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．, Ｏｃｕｌ Ｓｕｒｆ １５：６７０－６７９（２０１７）］。

【0020】

細菌感染は伝染性角膜炎の最も一般的な原因である。一般的な病原細菌には、Ｓ．アウレウス、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、Ｓ．ニューモニエ、及び緑膿菌などがある［Ｔｅｗｅｌｄｍｅｄｈｉｎ ｅｔ ａｌ．, ＢＭＣ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １７：２１２（２０１７）］。Ｐ．エルギノーザは、コンタクトレンズ装用者の細菌性角膜炎に関係する最も一般的な微生物である。

【0021】

細菌性潰瘍は通常、以下で考察するように市販の局所抗生物質点眼薬による治療に反応するが、北米ではメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などの抗生物質耐性感染症の割合が増加しており、懸念されている。米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は、毎年２００万人が薬剤耐性菌に感染していると推定している。米国におけるＭＲＳＡの眼分離株の約８０％は、最も一般的に処方される抗生物質クラスであるフルオロキノロンに耐性があると報告されている。［Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．, Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２４（１１）：１６７８－１６８９（２０１７）。］

【0022】

局所抗生物質が現在の治療の中心であり、選択肢にはフルオロキノロンの単独療法（シプロフロキサシン０．３％又はオフロキサシン０．３％を１～２滴、４８時間毎時、その後治癒するまで４時間毎）又は強化アミノグリコシド／セファロスポリンの併用療法（強化セファロチン５％とゲンタマイシン０．９％を１～２滴、４８時間毎時、その後治療反応に応じて頻度を減らす）が含まれる。これらの投薬計画は同様の効果があるが、フルオロキノロンは化学性結膜炎と眼の不快感のリスクを軽減する。オフロキサシンと比較して、シプロフロキサシンは白色角膜沈殿物のリスクを高める。また、菌を根絶するか損傷を修復するのに角膜移植が必要になることがある。明らかに効果的であるが、１時間ごとの点眼治療は多くの患者にとって従うのが難しい投薬計画である。

【0023】

クロラムフェニコールは、充血した眼に処方される最も一般的な第一選択の抗生物質である。点眼薬としても眼軟膏としても、いくつかの市販製品が入手可能である。例として、クロラムフェニコールを０．２５％及び０．５％含む点眼液と、クロラムフェニコールを１％含む眼軟膏が、^ＰｒＰＥＮＴＡＭＹＣＥＴＩＮ（登録商標）の商品名でＳａｎｄｏｚ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．から入手可能である。

【0024】

点眼液の用法及び用量の指示には、「患眼に３時間おきに点眼液を２滴、又は必要に応じてそれ以上の頻度で投与する」とだけ記載されている。眼軟膏の用法及び用量の指示には、「患眼に３時間おきに少量の軟膏を、又は必要に応じてそれ以上の頻度で投与する」と記載されている。ここでも、頻繁な反復投与が必要である。［処方情報、^ＰｒＰＥＮＴＡＭＹＣＥＴＩＮ（登録商標）、^ＰｒＰＥＮＴＡＭＹＣＥＴＩＮ／ＨＣ（登録商標）Ｓａｎｄｏｚ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．、改訂日：２０１８年６月１４日。］

【0025】

天然に存在する染料及び合成染料が、抗菌剤又は抗原虫剤として適用されてきた［Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０（２０２０）］。例えば、メチレンブルーとクロファジミンは、依然として重要な希少疾病用医薬品であると考えられている［Ｇｉｎｉｍｕｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２６：５１７－５２０（２０１０）；及びＡｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ７２：４５５－４６１（２０１７）］。

【0026】

ローズベンガル（ＲＢ）は、１９世紀に初めて羊毛の染料として合成され、後に日本において食用色素（食用赤色１０５号）として使用された明るいバラ色のキサンテン誘導体化合物である。［Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ． ２００９, ９５３９５２］。より具体的には、ＲＢはキサンテン化合物フルオレセインの誘導体である。フルオレセインと比較すると、ＲＢは２種類の追加のハロゲン：４つの塩化物置換基及び４つのヨウ化物置換基を有する。

【0027】

ＲＢを人間の眼表面損傷の視覚的診断（点眼による）に使用することは、１９１４年に初めて記述された［Ｆｅｅｎｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．, Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ９９：６０６－６１７（１９９２）］。ＲＢは後に、１００ｍｇの単回投与後のヒトの肝臓の機能的能力を評価するための静脈内投与の比較的迅速な診断補助薬として導入された［Ｗａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ Ｍｅｄ． ３２：１０１－１１０（２００３）］。１９７１年には、^１３１Ｉ ＲＢ（Ｒｏｂｅｎｇａｔｏｐｅ（登録商標）、ローズベンガルナトリウム^１３１Ｉ注射液（ＵＳＰ）が、肝機能を判断する際の診断補助薬として使用するために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された［Ｂａｒｏｙａｎ ｅｔ ａｌ．, Ｅｋｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ'ｎａｙａ Ｍｅｄｉｔｓｉｎａ（Ｒｉｇａ） ２０：７４－７８（１９８５）；及びＭｉｎｃｅｖ ｅｔ ａｌ．, Ｆｏｌｉａ Ｍｅｄｉｃａ（Ｐｌｏｖｄｉｖ） １６：３５－４１（１９７４）］。

【0028】

２００９年、Ｒｏｂｅｎｇａｔｏｐｅの製造業者であるＢｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ.は、肝臓画像診断のより新しい方法（コンピュータ断層撮影など）の出現により、ＲＢ診断薬を米国市場から正式に撤退させた。１９７４年、Ｂａｒｎｅｓ－Ｈｉｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.（Ｂａｒｎｅｓ－Ｈｉｎｄ）は、角膜損傷の染色、角膜炎、角結膜炎、乾性角膜炎の診断、及び眼内異物の検出を目的とした１％ＲＢ水溶液の医療機器製品を導入した［Ｇｉｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ｖｅｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １６：１９２－１９７（２０１３）］。１９８１年、Ｂａｒｎｅｓ－Ｈｉｎｄは同じ適応症に対して同じ濃度の眼科用ストリップを導入した。両診断薬は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に販売が認められたものの、溶液及びストリップ機器もそれぞれの主張も、導入が正式なＦＤＡの審査及び承認より前であったため承認されなかった。

【0029】

市販されている染料含有量が８０％から９５％のＲＢ（総汚染物質と物質関連の不純物を含む）である商用グレードのＲＢは、１８８０年代にＧｎｅｈｍにより開発された歴史的プロセスを用いて製造される。診断用途に使用されるＲＢは、いくらかの不純物を含む商用グレードのＲＢであると考えられている［Ｐａｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．, Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １：３４１－３５１（１９８５）］。米国薬局方（ＵＳＰ）は以前、ＲＢを分析標準としてリストしていた。ＲＢは２０１９年にＵＳＰから削除された。したがって、商用グレードのＲＢは、現代の診断設定及び治療設定との関連性を欠いている。したがって、ＲＢをヒトの疾患の治療に適用することを検証することは、重大な規制上の課題をもたらす。

【0030】

Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号及び第９,４２２,２６０号には、高度に精製されたローズベンガルの合成、及び異なるハロゲン置換基と異なる数のそれらのハロゲン置換基、並びにそれらのラクトン形態を含む同様に精製された類似化合物について説明及び特許請求されている。これらの化合物は、本明細書では「ハロゲン化キサンテン」と総称する。

【0031】

ローズベンガル（ＲＢ）染料（４,５,６,７－テトラクロロ－２',４',５',７'－テトラヨードフルオレセイン）は、黒色腫やその他の固形癌の治療のために臨床的に研究されている［Ｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：３４３－３４９（２０１５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．, Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ７：３７８９３－３７９０５（２０１６）；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３８：３１４３（２０２０）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ． １５６：３１５－３２２（２０１１）；及びＱｉｎ ｅｔ ａｌ．, Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ． ８：ｅ２５８４（２０１７）］。ＲＢの光力学的抗菌特性は散発的に報告されている［Ｐｅｒｅｚ－Ｌａｇｕｎａ ｅｔ ａｌ．, Ｐｈｏｔｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｐｈｏｔｏｄｙｎ． Ｔｈｅｒ． ２１：２１１－２１６（２０１８）；Ｕｅｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．, Ｌａｓｅｒ Ｔｈｅｒ． ２５：２９９－３０８（２０１６）；Ａｎｊｕ ｅｔ ａｌ．, Ｐｈｏｔｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｐｈｏｔｏｄｙｎ． Ｔｈｅｒ． ２４：３００－３１０（２０１８）；Ｇａｖａｒａ ｅｔ ａｌ．, Ｆｒｏｎｔ． Ｍｅｄ． ８：４９４（２０２１）；Ｊｏａｎｎａ ｅｔ ａｌ．, Ｆｒｏｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：１９４９（２０１８）；Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．, Ａｒｃｈ． Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ． １２２：１０５０２４（２０２１）；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．, Ｐｈｏｔｏｄｉａｇ． Ｐｈｏｔｏｄｙｎ． Ｔｈｅｒ． ６：１７０－１８８（２００９）；Ｇｈｏｒｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．, Ｌａｓｅｒ Ｔｈｅｒ． ２７：２９３－３０２（２０１８）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ． ７３：Ｃ５４０－５４５（２００８）；Ｍａｎｏｉ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｂ． １６２：２５８－２６５（２０１６）；Ｎａｋｏｎｉｅｃｚｎａ ｅｔ ａｌ．, Ｆｒｏｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：１９４９（２０１８）；Ｓａｂｂｈｉ ｅｔ ａｌ．, Ａｐｐｌ． Ｗａｔｅｒ Ｓｃｉ． ８：５６（２０１８）；Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．, Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ８：２１１（２０１９）： 及びＷｏｒｚｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．, Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ： Ｔｏｔｏｗａ, ＮＪ, ＵＳＡ, ２８５－２９１．（２０１１）］。

【0032】

例えば、Ｄｅｅｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８,９７４,３６３号は、１０～１００μＭ（すなわち、１０μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ）のＲＢの局所製剤を５００～６００ｎｍの波長帯の緑色光照射と組み合わせて、グラム陽性及びグラム陰性の抗生物質耐性菌に使用することを教示しているが、光源、その強度又は照射時間についての詳細は記載されていない。

【0033】

Ｎａｒａｎｊｏ ｅｔ ａｌ．, Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０８：３８７－３９６（２０１９）は、標準治療に反応しない進行性伝染性角膜炎の患者１８人の眼にローズベンガル光線力学抗菌療法（ＲＢ－ＰＤＡＴ）を使用したことを報告した。０．１又は０．２％のローズベンガル（ＲＢ）を含む組成物を脱上皮化角膜に３０分間塗布し、その後ＬＥＤ光源からの５．４ジュール／ｃｍ^２の緑色光を１５分間照射した。最も頻繁に検出された微生物は、アカントアメーバ（アメーバ）（１０／１７；５９％）で、次いでフザリウム種（真菌；４／１７；２４％）、緑膿菌（グラム陰性菌；２／１７；１２％）及びカーブラリア種（真菌；１／１７；６％）であった。１人の患者は微生物学的診断が確定しなかった。ＲＢ－ＰＤＡＴの成功（治療的角膜移植の回避）は症例の７２％で達成されたと報告され、臨床的解決（再上皮化及び浸潤の解消による痛みと炎症の軽減）までの平均時間はＲＢ－ＰＤＡＴ後４６．９±２６．４日であった。

【0034】

Ａｍｅｓｃｕａ ｅｔ ａｌ．, Ｃｏｒｎｅａ ３６（９）：１１４１－１１４４（２０１７）は、３７５ｎｍ又は５１８ｎｍで１５分間照射して光活性化した約０．１％のローズベンガル（ＲＢ）が、多剤耐性フザリウムケラトプラスティクムの真菌増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制できたことを教示している。複数の連続した抗真菌薬治療の後、上記の濃度のＲＢをフザリウムケラトプラスティクムに感染したヒト患者の角膜上皮剥離部に３０分間滴下し、その後５１８ｎｍの光を使用した照射によって０．９Ｊ／ｃｍ^２の総エネルギーを供給する研究が行われた。照射後３６時間で痛みが解消し、その後２週間あまりで角膜浸潤は縮小した。治療の４日後に、浸潤は全方向に約１ｍｍ小さくなった。

【0035】

照射処理後１３日目に浸潤はほぼ治まり、２回目のローズベンガルＲＢ照射処理（１．８Ｊ／ｃｍ^２）が実施された。局所コルチコステロイド治療の後、最初のＲＢ治療から２４６日目までに、患者は治療した眼の眼表面が健康かつ穏やかで、角膜が透明であることを示した。治療した患者の眼の追跡研究が、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．, Ｃｏｒｎｅａ ３７（１０）：ｅ４６－ｅ４８（２０１８）に報告されている。

【0036】

Ｈａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．, Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １６６：１９４－２０２（２０１６）は、暗闇、周囲の室内光下で３０分間、及び５．４Ｊ／ｃｍ^２を得るためにＬＥＤ緑色光照射下で３４分間、高純度水に溶解した０．１％及び０．０３％のＲＢを使用して、寒天培地における患者から分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を報告した。その後、サンプルは遮光ボックス内のインキュベータにおいて７２時間培養された。両方のＭＲＳＡ株の完全な増殖阻害が、（１）周囲光及び緑色ＬＥＤ照射下での両方のローズベンガル濃度について、及び（２）暗闇での０．１％ローズベンガルについて実証された。暗状態での０．０３％ローズベンガルは、株２の完全な阻害を示したが、株１の阻害は不完全であった。

【0037】

Ａｒｂｏｌｅｄａ ｅｔ ａｌ．, Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １５８（１）：６４－７０（２０１４）は、とりわけ、照射（５１８ｎｍ；５．４Ｊ／ｃｍ^２）及び暗状態でＲＢを使用し、その後３日間のインキュベーションを行った真菌性角膜炎患者の分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖阻害について報告した。フザリウムソラニ、アスペルギルスフミガーツス、カンジダアルビカンスの分離株が調査された。この研究のデータを以下の表にまとめる。

【0038】

【表1】

【0039】

以下に開示されるように、本発明は、必要に応じて穏やかでより容易に使用できる治療を提供する。更に、この治療は、治療対象が眼を閉じて眠っているときのように、物質（化学線）と相互作用するときに、識別可能又は測定可能な変化をもたらす光が実質的にない場合の使用を想定している。

【発明の概要】

【0040】

一態様では、本発明は、水性眼科用担体に溶解又は分散され、組成物中に約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬ（又は約０．００００２から約０．００５重量％）の細菌性角膜炎の治療に有効な濃度で存在する、ローズベンガルなどのハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルの局所眼科用組成物を含む、化学線不透明容器の眼科システムを意図している。好ましい実施では、組成物は、通常の涙のｐＨ値である約６．５から約７．６、好ましくは約７．０から約７．４のｐＨ値を有する。意図される組成物は、好ましくは増粘剤及び電解質を更に含む。より好ましくは、ヒアルロン酸も存在する。

【0041】

本発明の別の態様では、必要としている哺乳動物対象が、片眼につき１滴又は２滴などの、角膜炎治療に有効な量の上記組成物を、実質的に化学線がない状態で、対象の微生物感染した眼の角膜表面に投与することによって、上記局所眼科用組成物で治療され、その後、そのように治療された対象は、約３から約１２時間、化学線のない状態で維持される。治療は、通常、哺乳動物対象が就寝する直前に行われる。この治療レジメンは、通常、微生物感染が克服されるまで複数回繰り返される。

【0042】

本明細書で使用される「化学線」という語句は、局所眼科用組成物の１つ以上の成分の光化学反応を引き起こし得る光を意味する。この定義によれば、化学線は、組成物のレシピエント分子によって吸収される波長を有し、吸収するレシピエントハロゲン化フルオレセイン分子に又はそれにより誘発される検出可能な化学反応を引き起こすのに十分な吸収波長の光子束がある。例示的な化学反応には、分解及び光感作が含まれる。

【0043】

「化学線が実質的に存在しない」という用語は、本明細書において、感染した眼に塗布した後、組成物が約２分未満の間、周囲光にさらされることを意味するのに用いられる。したがって、塗布後、瞼を閉じ、処置した眼に遮光パッチを置き、周囲光を遮断したりする。同様に、吸収される波長の光子束が不十分であるため、吸収するレシピエントハロゲン化フルオレセイン分子に又はそれにより誘発される検出可能な化学反応が引き起こされる。

【0044】

微生物感染源は、細菌、ウイルス、真菌又はアメーバである可能性がある。好ましくは、感染源は細菌であり、感染細菌は好ましくはグラム陽性菌である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明は、一態様において、水性眼科用担体に溶解又は分散され、局所眼科用組成物中に約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬ（又は約０．００００２から約０．００５重量％）の角膜炎治療に有効な濃度で存在する、ローズベンガルなどのハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルの局所眼科用組成物を含む、化学線に対して不透明な容器の眼科システムを検討する。好ましくは、ハロゲン化フルオレセイン（キサンテン）の濃度は約０．５μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬである。好ましい実施では、組成物は、通常の涙のｐＨ値である約６．５から約７．６、より好ましくは約７．０から約７．４のｐＨ値を有する。検討される組成物は、好ましくは更に増粘剤及び電解質を含む。

【0046】

なお、検討される組成物は、先に考察したＮａｒａｎｊｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｓｃｕａ ｅｔ ａｌ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．、Ｈａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．、及びＡｒｂｏｌｅｄａ ｅｔ ａｌ．の論文で使用されているローズベンガルの濃度と比較して、約１０分の１から約１,０００分の１の濃度のハロゲン化キサンテンを含む。

【0047】

より好ましくは、交互β－（１→４）及びβ－（１→３）グリコシド結合を介して結合した、Ｄ－グルクロン酸及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからなる二糖類のポリマーであるヒアルロン酸も存在する。ヒアルロン酸は、組成物にいくらかの増粘、緩衝及び張性を与え、塗布された組成物の水分が眼の表面との接触状態を維持するのを助ける。

【0048】

本発明の別の態様では、必要としている哺乳動物対象が、片眼につき１滴又は２滴などの、角膜炎治療に有効な量の上記組成物を、更に供給される化学線がない状態で、対象の微生物感染した眼の表面に投与することによって、上記局所眼科用組成物で治療され、その後、そのように治療された対象は、約３から約１２時間、化学線のない状態で維持される。治療は、通常、哺乳動物対象が就寝する直前に行われる。投与後に治療された対象が化学線の存在下にある又はあると予想される場合、投与後に治療された眼を覆うために化学線を通さない眼帯を使用することもできる。この治療レジメンは、通常、微生物感染が克服されるまで複数回繰り返される。

【0049】

局所眼科用医薬組成物

【0050】

水性眼科用担体
検討される組成物は、主として（重量比で）他の成分が溶解又は分散されている水性眼科用担体である。組成物の主成分は、滅菌水、例えばＵＳＰ注射用滅菌水である。

【0051】

検討される組成物は、粘度が約１０から約３００ｃｐｓ、好ましくは約３０から約１２０ｃｐｓ、より好ましくは約５０から約８０ｃｐｓとなるような十分なレベルで存在する、少なくとも１つのビルダー又は増粘剤を有する。典型的な増粘剤はポリマーであるが、グリセリンやプロピレングリコールなどの溶剤も組成物に増粘作用を与えることができる。

【0052】

グリセリン及びプロピレングリコールは、単独又は組み合わせて組成物の０から約２．５重量パーセントを占めることができる。より好ましくは、一方又は両方が一緒になって約０．４から約２重量パーセントで存在する。グリセリン及びプロピレングリコールのそれぞれは水と混ざる。

【0053】

検討される局所眼科用組成物は、薬剤組成物の浸透圧（Ｏｓｍ）が約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの組成物を提供するのに十分な１つ以上の溶解した溶質を含み、好ましくは約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧が提供され、これはほぼヒトの涙が示す浸透圧の範囲である。

【0054】

その浸透圧の少なくとも一部は、水溶性のナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの塩化物、リン酸塩、及び硝酸塩の存在によって与えられる可能性がある。塩化ナトリウムの形態などのナトリウムは、その固有の生理学的適合性のため電解質として好ましい実施形態である。そのような電解質は、組成物中に約０．１から約２パーセントの濃度で、より好ましくは約０．５から約１．５パーセントの濃度で、より好ましくは約０．８から約１．２パーセントの濃度で、最も好ましくは約０．９パーセントの濃度で存在するのが好ましい。０．９Ｎ塩化ナトリウム水溶液の浸透圧は３０８ｍＯｓｍｏｌ／リットルである。

【0055】

治療を必要とする対象が角膜の腫れを呈している場合、約２パーセントから約５パーセントの塩化ナトリウムを含む高張組成物を使用して、感染症を治療しながら角膜の腫れを軽減することができる。２％及び５％の塩化ナトリウムを含む眼治療組成物の浸透圧は、それぞれ６８４ｍＯｓｍ及び１７１１ｍＯｓｍと計算された。［Ｙｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．, Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ５７：２４１２－２４１９（２０１６）］。これらの例示的な製品は、商標Ｍｕｒｏ１２８（登録商標）の下でＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ（ニュージャージー州ブリッジウォーター）によって販売されている。

【0056】

ＰＥＧ４００やＰＥＧ１０００などの低分子量ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、組成物に潤滑性を与え、ドライアイの症状をいくらか緩和することができる。これらのポリマーはまた、イオン電荷がないため、比較的少量の浸透圧を加える。検討される組成物中に存在する他の溶質に応じて、低分子量ＰＥＧが存在しないか、約１から約１０ｍｇ／ｍＬで存在する可能性がある。

【0057】

デキストランは、微生物由来の複雑な分岐した非イオン帯電ポリ－α－ｄ－グルコシドで、主にＣ－１→Ｃ－６のグリコシド結合を有し、α－１，３結合から分岐している。デキストラン鎖は長さがさまざまである（約３から約２０００キロダルトン）。一般的に使用されている２つのデキストランは、分子量がそれぞれ約４０，０００及び７０，０００ｋＤａであることから、デキストラン４０及びデキストラン７０と呼ばれている。

【0058】

デキストリンは、α－１，４又はα－１，６結合でつながれた水溶性の直鎖ポリグルコースである。デキストリンは、デンプンとグリコーゲンの加水分解によって生成される混合物であり、イオン電荷がない。特徴的な分岐により、デキストランは、α－１，４又はα－１，６結合でつながれた直鎖グルコースポリマーであるデキストリンと区別される。

【0059】

ＰＥＧと同様に、荷電されていないため、検討される組成物中に存在するデキストラン及びデキストリンは、組成物の浸透圧を大きく変化させる傾向はない。デキストランは、眼にいくらかの潤滑性を与える可能性があり、存在しない又は約０．５から約２ｍｇ／ｍＬで存在する可能性がある。

【0060】

ポビドンとして市販されていることが多いポリ（ビニルピロリドン）は、デキストランと同様に、眼科用薬剤における静脈内使用の血液増量剤として使用されている別の非イオン帯電ポリマーであり、存在する場合、検討される組成物の浸透圧をそれほど変化させない。ポビドンは、存在する場合、約１から約２ｍｇ／ｍＬで、より好ましくは約７から約１５ｍｇ／ｍＬで存在する。

【0061】

更に有用な非イオン性ポリマーは、ヒプロメロースとして市販されているヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。米国特許第５,６７９,７１３号は、ドライアイ治療活性剤であるコリン作動性化合物を、ヒプロメロース、メチルセルロース、ポリ（ビニルアルコール）、又はヒアルロン酸とともに医薬組成物に使用し得ることを教示している。上記の特許の結果のない例では、０．５から１重量パーセントのメチルセルロース及び１．４重量パーセントのポリ（ビニルアルコール）を使用した。

【0062】

別の水溶性非イオン性ポリマー増粘剤はヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。この物質は、存在する重量パーセントあたりの増粘量が異なるいくつかの分子量で入手可能である。Ｎａｔｒｏｓｏｌ（登録商標）２５０という名前で販売されるＨＥＣの１つの供給元は、ケンタッキー州コビントンのＡｓｈｌａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社である。

【0063】

Ｒｅｆｒｅｓｈ（登録商標）Ｔｅａｒｓ（登録商標）及びＲｅｆｒｅｓｈ（登録商標）Ｒｅｌｉｅｖａ（商標）という商標名で販売されている市販のドライアイ治療薬はいずれも、活性成分としてアニオン性カルボキシメチルセルロースナトリウムを０．５％含み、Ｒｅｆｒｅｓｈ（登録商標）Ｒｅｌｉｅｖａ（商標）には、活性成分としてグリセリンも０．９パーセント含まれている。活性成分は、精製水に溶解した複数の不活性成分とともに存在する。これらの製品は、ＡｂｂＶｉｅ社の子会社であるＡｌｌｅｒｇａｎ, Ｉｎｃ．（イリノイ州ノースシカゴ）によって販売されている。

【0064】

ヒアルロン酸（ＨＡ）は、結合組織、上皮組織、神経組織全体に広く分布するアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。これは、交互β－（１→４）及びβ－（１→３）グリコシド結合を介して結合された、Ｄ－グルクロン酸及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからなる繰り返し単位のポリマーである。これは、硫酸化されておらず、分子量が数百万ダルトンになる可能性があるため、グリコサミノグリカンの中では特異である。ＨＡはアニオン性であり、通常、１分子あたり数個のカルボキシル基を含むため、検討される組成物の浸透圧に比較的大きな影響を与える可能性がある。

【0065】

別のアニオン性増粘ポリマーは、部分的に中和された水分散性カルボキシメチルセルロースである。この材料は、多くの供給元から水中の所定の重量パーセント当たりの粘度が異なる、異なる分子量のものが入手可能である。

【0066】

「部分的に中和された」という語句は、カルボキシル官能基が塩基と反応してアニオン荷電カルボキシレート基を形成し、ポリマーに水溶性又は分散性を与えるのに役立つカルボキシル基含有ポリマーに関連して使用される。

【0067】

部分的に中和された架橋アクリル酸、メタクリル酸、及び米国特許第３,０７４,８５２号、第３,３３０,７２９号及び第４,２２６,８４８号の１つ以上の、商標ＣＡＲＢＯＬＯＬ（登録商標）９３４Ｐ ＮＦ又は９７４Ｐ ＮＦのもとにオハイオ州ウィクリフのＬｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐ．社によって販売される材料によって例示される水溶性架橋アクリレートポリマーなどのコポリマーなどの、追加のアニオン性増粘剤も使用することができる。これらの材料は、アリルスクロースやアリルペンタエリスリトールなどのポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸ホモポリマーで、各架橋剤が１分子あたり平均して少なくとも３つのアリル基を含んでいる。両ポリマーは水溶性であると報告されており、０．５重量パーセントで存在する場合にｐＨ値７．５で粘度をもたらす。９３４Ｐ ＮＦはベンゼンで重合され、９７４Ｐ ＮＦは溶媒として酢酸エチルで重合される。

【0068】

もう１つの有用なクラスの増粘剤は、水膨潤性だが非水溶性の架橋アクリルポリマーで、これは米国特許第３,２０２,５７７号及び第４,６１５,６９７号に記載されており、文献ではポリカルボフィル及び生体接着剤と呼ばれることがよくある。これらのポリマーは、少なくとも８０重量パーセントのモノエチレン性不飽和カルボキシ官能性モノマーと、約０．０５から約１．５重量パーセントの３，４－ジヒドロキシ－１，５－ヘキサジエン又は２，５－ジメチル－１，５－ヘキサジエンである架橋剤との共重合反応生成物と定義することができる。このポリマーのカルボキシル基も、組成物のｐ値で少なくとも部分的に中和されている。

【0069】

これらの生体接着性ポリマーには、先に考察したポリアルケニルポリエーテル架橋剤が含まれていない。モノマーの１００重量パーセントを構成するために存在し得る残りのモノマーについては、以下で考察する。

【0070】

上記の２つの成分に加えて、生体接着性ポリマーには、次のような重合されたモノエチレン性不飽和繰り返し単位も含まれる可能性がある。ヘキシルアクリレート、ブチルメタクリレート及びメチルクロトネートなどの上記酸の１種以上のＣ_１－Ｃ_６アルキルエステル；ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、及びテトラエチレングリコールモノアクリレートなどの、２～３個の炭素原子を含む１分子あたり平均１から約４個のオキシアルキレン基を含む上記酸のヒドロキシアルキレン官能性エステル；メタクリルアミド、アクリルアミド、及びＮ－メチルアクリルアミド、Ｎ－ブチルメタクリルアミド及びＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドなどのＣ_１－Ｃ_６モノ及びジアルキル誘導体；スチレン；並びに上記カルボキシル官能基含有モノマー及び架橋剤と共重合可能であることが当技術分野で知られている同様のもの。生体接着性ポリマーは、最も好ましくはモノエチレン性不飽和カルボキシ官能性モノマー及び架橋剤のみから調製される。

【0071】

本明細書で有用な生体接着剤は、過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなどの開始剤を使用する従来のフリーラジカル重合技術によって調製することができ、水性溶媒中で重合することもでき、蒸気作用によって凝集されない。有用な生体接着剤の例示的な調製は、すぐ上で引用した２つの特許に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0072】

前述のように、生体接着剤は水性溶媒中で重合される可能性がある。好ましい実施では、水性溶媒は硫酸マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩の飽和溶液である。

【0073】

アルカリ土類金属塩は少なくとも２つの機能を果たす。第１に、重合した生体接着剤が水性溶媒の表面に浮かび、そこから容易に除去できるように、重合媒体の密度を増大させる。第２に、特に硫酸マグネシウムの使用により、重合及び回収が容易になるように水性溶媒中の生体接着剤の膨潤を低減する。生体接着剤は、通常、ポリマーを数回水で洗い流した後、約０．５から約１パーセントのアルカリ土類金属イオンを含む。

【0074】

米国特許第５,２２１,７２２号は、いわゆる強化ポリカルボフィルの調製を教示している。このポリマーは、アセトン及びアルキル基に１から６個の炭素原子を含むアルキルアセテートから選択される溶媒中で、適切な開始剤及び３，４－ジヒドロキシ－１，５－ヘキサジエンなどのジビニルグリコール架橋剤の存在下で調製される。この方法で調製されたポリカルボフィルは、生体接着の特性を有するとともに、粉砕しなくても粒子サイズが小さく、水中で１重量％の粘液を測定した場合の粘度が２０,０００ｃＰｓを上回ると言われている。

【0075】

ポリマーのゲル化を防ぎ、重合中に個別の粒子形成を促進するために、カルボキシル基の少なくとも一部を、水酸化物、酸化物、又は炭酸塩などの形態のＩＡ族金属化合物で中和することが教示されている。これらの例としては、ナトリウム、カリウムなどがあり、また、アンモニア及びモルホリン、モノ、ジ、トリエタノールアミン、モノプロパノールアミン、及び部分的ポリマー塩が反応媒体に溶解しにくいその他のアミンを含む特定のアミンとの反応も含まれる。好ましくは、モノマー上のカルボキシル基の０．１重量％超が中和されるか、又は上に挙げた物質の塩に形成される。より好ましくは、カルボキシル基の１重量％超かつ最大１０重量％、特に５％未満が、重合前に中和又は同等の塩に変換される。

【0076】

上記の合成により、粒子がメッシュＮｏ．６３５（ＡＳＴＭ－Ｅ１１）を通過することになる平均粒子サイズが１０μ未満のポリマーが得られたと報告されている。１つの商業的供給業者は、上記のＬｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで、Ｎｏｖｅｏｎ（登録商標）ＡＡ－１という名前で、医療用のポリマー、ポリカルボフィル、ＵＳＰを販売している。

【0077】

上記のポリマーの具体的な量は、増粘剤及び／又は生体接着剤としてのポリマーの効果ほど重要ではない。したがって、使用されるポリマーの量は、増粘及び生体接着能力が異なるため、通常、ポリマー間で異なる。一般的に言えば、増粘効果及び／又は生体接着効果のある量が使用される。

【0078】

ハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）
検討される局所眼科用組成物のハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）化合物は、以下の式１の化合物である可能性があり、式中、Ｒ_１は独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は独立してＣｌ、Ｈ又はＩであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５から選択される少なくとも１つの置換基がＩであり；Ｒ_６は独立してＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１１はＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１２はＨ又はＣ_１－Ｃ_７アシルであり；並びにすべての（ａ）互変異性型、（ｂ）アトロプ異性体、（ｃ）式２（下記）に示す閉環ラクトン型、（ｄ）式２に示すラクトン型の光学異性体、及び（ｅ）それらの薬学的に許容される塩。

【0079】

【化1】

【0080】

検討されるハロゲン化キサンテンは、フルオレセインがキサンテンの誘導体であるため、より正確にはハロゲン化フルオレセインと呼ばれると考えられる。好ましい実施では、上記式１及び２のハロゲン化フルオレセインの各Ｒ_１は、クロロ又はブロモ置換基のいずれかであり、一方、それらの式のＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のそれぞれは、以下の式Ｉ及びＩＩに存在するようなヨウド置換基である。以下の式において、Ｘは酸素又は窒素であり、「ｎ」はゼロ又は１であり、Ｘが

【0081】

【化2】

【0082】

酸素の場合、ｎはゼロでＲ^７は存在しないのに対して、Ｘが窒素の場合、ｎは１でＲ^７は存在する。Ｘが酸素である場合、Ｒ^７は、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ^＋、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、及び後に本明細書で定義される芳香環含有置換基からなる群から選択される。Ｘが窒素の場合、Ｒ^７及びＲ^８は同じか又は異なり、水素、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、芳香環含有置換基又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子Ｒ^７及びＲ^８と共に、及び芳香環含有置換基からなる群から選択される。芳香環含有置換基は、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む、５若しくは６員を含む単環、又は５、６若しくは６、６縮合芳香環系である。

【0083】

説明を簡単にするために、芳香族エステル又は芳香族アミドは、まとめて芳香族誘導体と呼ぶ。したがって、それらの誘導体は、好ましくは一置換の、独立して窒素、酸素又は硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む単一の５若しくは６員芳香環、又は５、６若しくは６、６縮合芳香環系を有するアルコール又はアミンから形成される。

【0084】

例示的な芳香環置換基の構造式を以下に示す。

【0085】

【化3】

【0086】

ローズベンガル（ＲＢ）は、本明細書で使用するための好ましい化合物であり、そのジナトリウム塩であるローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）は、最も好ましいＲＢ化合物である。これらの化合物は、本明細書ではＲＢ化合物の群として例示的に使用される。

【0087】

ローズベンガルの化学名は、４,５,６,７－テトラクロロ－２',４',５',７'－テトラヨード－フルオレセインである。好ましい形態であるローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）は、次の構造式Ｉａを有する。

【0088】

【化4】

【0089】

ローズベンガル（上記式Ｉａ）やテトラブロモテトラヨード類似体（上記式ＩＩｂ）などの高度に精製されたハロゲン化フルオレセイン分子の調製については、米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号及び第９，４２２，２６０号で考察されている。光化学的誘発治療へのＲＢＤの使用については、米国特許第５,９９８,５９７号、第６,３３１,２８６号、第６,４９３,５７０号、第７，３９０，６６８号及び第８,９７４,３６３号に開示されている。好ましくは、上記構造式におけるカチオンＭ^＋はナトリウム（Ｎａ^＋）又はカリウム（Ｋ^＋）である。

【0090】

それらの種々の文法的な形態における「生理学的に許容される塩」及び「薬学的に許容される塩」という用語は、当技術分野で既知の方法で調製され得る、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム及びプロタミン亜鉛塩を含む、製薬業界で一般的に使用されるアルカリ金属、アルカリ土類金属、及びアンモニウム塩などの非毒性カチオンを指す。そのような塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、又はアンモニウム水酸化物を使用して、検討されるハロゲン化フルオレセインの酸形態を中和するか、又はイオン交換樹脂の水酸化物形態と混合することによって有効に調製される。そのようにして形成されたカチオンハロゲン化フルオレセイン塩は、最終的に製剤化された局所眼科用組成物に溶解することが好ましい。

【0091】

検討されるカチオンは、組成物に溶解するキサンテン（フルオレセイン又はフルオレセイン酸塩）塩を提供する。好ましくは、塩は、一塩基性塩又は二塩基性塩の形態のナトリウム、カリウム、カルシウム及びアンモニウムである。医薬化合物と生理学的に許容される塩を形成する、一般的に使用される生理学的に（又は薬学的に）許容される酸及び塩基のリストについては、Ｂｅｒｇｅ， Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ. １９７７ ６８（１）：１－１９を参照のこと。

【0092】

ハロゲン化フルオレセインは、角膜炎治療有効濃度で組成物中に存在する。通常、角膜炎治療有効濃度は、局所眼科用組成物中、ＤＲＢとして測定して約５０μｇ／ｍＬから約３,０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬから約２,０００μｇ／ｍＬ、更に好ましくは約５００μｇ／ｍＬから約１,５００μｇ／ｍＬである。

【0093】

したがって、ＤＲＢ以外のハロゲン化フルオレセインを使用する場合、使用量はＤＲＢの分子量、つまり１０１７．６ｇ／モルに基づく。例えば、４つのクロロ置換基を４つのブロモ置換基に置き換えると、分子量は１１９５．２ｇ／モルになる。分子量の差は約１７．４５パーセントである。したがって、使用するテトラブロモテトラヨードフルオレセインの等量は、ＤＲＢの所定量と比較して約１７．４５パーセント大きくなる。

【0094】

ローズベンガルなどの検討されるハロゲン化フルオレセイン化合物は二塩基性であり、ｐＫ_ａ値は２.５２と１.８１である。いくつかの考えられるハロゲン化フルオレセインのｐＫ_ａ値の決定は、Ｂａｔｓｉｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ Ｐａｒｔ Ａ ７９（５）：８８９－８９７（２０１１年９月）に見られる。

【0095】

ハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）医薬組成物のｐＨ値は、当業者に知られている任意の適切な手段によって制御又は調整することができる。酸又は塩基などの添加によって組成物を緩衝化したり、ｐＨ値を調整したりすることができる。ハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）、又はその生理学的に許容される塩は弱酸であるため、ハロゲン化キサンテン（フルオレセイン）濃度及び／又は電解質濃度によっては、組成物のｐＨ値に緩衝剤及び／又はｐＨ値調整剤の使用を必要としないことがある。しかし、組成物は緩衝化されず、投与されると涙液などの生物学的環境に順応することが特に好ましい。

【0096】

Ａｂｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ９９（２）：３０１（１９８１）は、４４人の健常者から得た下盲嚢内の涙液のｐＨ値を測定したところ、ｐＨ値は約６．５から約７．７で、平均値は約７．０であったと報告した。したがって、検討される組成物は、好ましくは約６．５から約７．６、好ましくは約７．０から約７．４のｐＨ値を有する。

【0097】

また、医薬組成物には防腐剤が含まれないことも好ましい。防腐剤の多くは、医薬組成物又はその製剤に有害な干渉を及ぼす可能性がある、又はハロゲン化キサンテン組成物の有効成分と錯体を形成したり別の相互作用をしたり、その有効成分の送達を妨害したりすることがある。防腐剤が使用される限り、イミド尿素は、医薬組成物中又は投与時にハロゲン化キサンテンと相互作用しないため、好ましい防腐剤である。

【0098】

検討される治療方法は、それを必要とする哺乳動物対象を治療するのに利用される。「治療を必要とする哺乳動物」とは、細菌、ウイルス、真菌又はアメーバ感染などの眼感染症を呈する哺乳動物である。そのような感染症は、通常、細菌感染症である傾向があり、感染細菌は典型的にはグラム陽性菌である。

【0099】

治療するグラム陽性菌の例としては、薬剤感受性及び薬剤耐性のＳ.アウレウス、Ｓ.エピダーミス、Ｅ.フェカーリス及びＥ.フェシウムのうちの１つ以上、並びに枯草菌、セレウス菌、及び唾液連鎖球菌のうちの１つ以上が挙げられる。グラム陽性菌は、感染した眼が治療される（細胞と接触する）とき、眼の哺乳動物細胞内又は細胞上に存在する。

【0100】

一部のグラム陽性菌株が、本明細書において「耐性」若しくは「薬剤耐性」又は耐性の他の文法上の変形と呼ばれる。ここで言う「耐性」とは、その種類の細菌に対して既知の濃度及び細菌細胞密度で殺菌性があると通常みなされる１つ以上の抗菌医薬品による治療に対する細菌の耐性である。したがって、黄色ブドウ球菌（Ｓ.アウレウス）、表皮ブドウ球菌（Ｓ.エピダーミス）、エンテロコッカスフェカーリス（Ｅ.フェカーリス）、及びエンテロコッカスフェシウム（Ｅ.フェシウム）などの細菌の「薬剤感受性」及び「薬剤耐性」株の両方が存在する。いくつかの一般的な細菌株が耐性となった薬剤の例として、バンコマイシン、メチシリン及びゲンタマイシンが挙げられる。

【0101】

同様の方法が、好ましくはバークホルデリア、サルモネラ、及びプロテウスのうちの１つ以上であるグラム陰性菌を治療するのにも検討される。ここで、上記ＲＢ化合物は、水性医薬組成物中に、約１０μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約２０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの濃度で溶解又は分散して存在する。

【0102】

本明細書中で使用される「投与」という語は、組成物を感染した眼の外面に塗布する治療計画の開始を意味するのに使用される。したがって、投与は、通常、本明細書に記載の眼科用組成物の投与量を、眼の表面上、又は下眼瞼を引き下げることによって形成されるポケット又は袋内に置き、次いで眼瞼を閉じて、眼科用組成物を治療する眼球の外面上に行き渡らせることを伴う。

【0103】

治療方法
検討される治療方法は、必要とする対象の角膜表面を、抗グラム陽性菌量のハロゲン化フルオレセイン化合物を含む組成物と接触させることを含む。そのような化合物の例としてローズベンガルを使用して、抗グラム陽性殺菌有効量のＲＢを、必要とする哺乳動物対象に投与し、先に考察したように、粘度の高い水性液体、ゲル、又は他の形式を使用して製剤化することができる。

【0104】

治療された眼は、その後、約３時間から約１２時間の間、実質的に化学線のない状態に維持される。したがって、例えば、塗布後、眼瞼を閉じ、治療した眼の上に遮光パッチを置き、周囲光を遮断したりする。おそらく最も容易には、レシピエントが夜就寝する直前に眼を治療する。

【0105】

一実施形態では、グラム陽性菌細胞は、対象哺乳動物の表面又は内部に存在する（例えば、感染している）。例示的に、対象哺乳動物は、化膿連鎖球菌などの皮膚グラム陽性菌感染症に罹患している可能性があり、特に開放創の局所治療の場合には、現在の感染症の治療薬として、またその後のグラム陽性菌感染症の予防薬として用いられる可能性がある。

【0106】

治療対象となる哺乳動物は、ヒトなどの霊長類、チンパンジーやゴリラなどの類人猿、カニクイザルやマカクなどのサル、ラット、マウス若しくはうさぎなどの実験動物、犬、猫、馬などのコンパニオンアニマル、又は雌牛若しくは去勢雄牛、羊、子羊、豚、山羊、ラマなどの食用動物などである可能性がある。

【0107】

それぞれの検討される組成物投与は、一般的には、治療される細菌性疾患（感染症）が検出できないなど、所望の程度まで減少するまで繰り返される。したがって、必要とする哺乳動物対象への投与は、治療医の指示に従って、１日、毎日、毎週、毎月又は数ヶ月から数年にわたって複数回行われる可能性がある。

【0108】

治療に携わる医療関係者の指示に従って、感染症、例えば角膜潰瘍を取り囲む部位の角膜上皮を、検討中の組成物の投与前にデブライドして、脱上皮エリアを得てローズベンガルの吸収を高めることができる。

【0109】

結果

【0110】

医薬品グレードのローズベンガル（ＲＢ）
テネシー州ノックスビルのＰｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.（Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓ）は、商用グレードのＲＢを使用して、製剤原料として純粋な形のＲＢを調製するための製造プロセスを探していた。しかしながら、染料製造プロセス中に商用グレードの反応が発生すること、及びヨウ化物置換基の１つ以上が失われた他の副産物が原因で、ＲＢの精製にはいくつかの課題が見つかった。

【0111】

商用グレードのＲＢは、ＦＤＡやその他の世界的な医薬品規制機関によって、臨床開発と登録をサポートするのに十分な量の医薬品グレードの材料を効率的に生産することができないと結論が下された。ＲＢを合成及び製造するための新しい多段階アプローチがＰｒｏｖｅｃｔｕｓによって確立された［Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号及び第９,４２２,２６０号］。その研究の重要な要素は、重要な歴史的不純物の形成につながる条件を排除する能力であった。

【0112】

それらの合成及び精製方法は適正製造基準（ＧＭＰ）に適用され、医薬品グレードのＲＢが製造されている。このＲＢ、ＰＶ－１０（登録商標）は、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓから入手可能な０.９％生理食塩水中のローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）の滅菌１０％溶液であり、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインに従って製造され、注射用医薬品として適用されるように設計されている。医薬品グレードのＲＢＤは、ＰＨ－１０（登録商標）と呼ばれる異なる処方の局所用薬剤［米国特許第９,４２２,２６０号；Ｉｎｎａｍａｒａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２１：７５６（２０２１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ． ３１：２３２－２４１（２０２１）；Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ． １２：１２９３－１３０７（２０１９）］にも存在する。どちらの製剤も、構造式が先に示されているローズベンガルジナトリウム（ＲＢＤ）を有効成分として使用する。ローズベンガルの多くの可溶性塩は、ジナトリウム塩に加えて使用できるため、本明細書では「ＲＢ」はローズベンガルの薬学的に許容される塩の名称として使用するが、「ＲＢＤ」という名称はローズベンガルジナトリウムを具体的に指す。

【0113】

微生物
微生物感染源は、細菌、ウイルス、真菌又はアメーバである可能性がある。通常、感染源は細菌であり、感染細菌は好ましくはグラム陽性菌である。

【0114】

光線力学的アプローチによるＲＢの抗菌活性は、いくつかの研究グループによって研究されてきた［Ｋｕｒｏｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：３２２（２０２２）及びその中の引用文献を参照］。ＲＢの光線力学的療法の応用は、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、毛嚢炎、せつ及び癰を含む皮膚感染症に限定されない。しかしながら、ＲＢの活性スペクトル、殺菌率、及びバイオフィルム破壊活性は散発的に報告されている。

【0115】

マイコバクテリウム種を含むグラム陽性、グラム陰性好気性菌を含む一連の微生物に対する医薬グレードのＲＢの殺菌活性は、異なる光源（蛍光、ＬＥＤ、及び太陽光）下及び暗状態で、上記のＫｕｒｏｓｕ ｅｔ ａｌ．によって再調査されている。興味深いことに、化学線による照射はより即効性を示したが、ＲＢは暗所でも抗菌活性を示した。

【0116】

本発明は、暗闇でのその抗菌活性を本発明で利用する。したがって、細菌性眼感染症のヒトなど、治療を必要とする哺乳動物対象には、就寝して眼を閉じる前のゼロから約５分以内に、抗菌有効量の検討中の医薬組成物が塗布される。

【0117】

上記のＫｕｒｏｓｕ ｅｔ ａｌ．の論文の暗条件から、アルミホイルで覆われた９６ウェルプレートを使用して、暗室で２４時間（ｈ）液体希釈法及び寒天希釈法で得られた最小発育阻止濃度（ＭＩＣ、μｇ／ｍＬ）を以下の表（テーブル１Ａ、テーブル１Ｂ）にまとめる。テーブル１Ａ，テーブル１Ｂで使用されているＲＢは、Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ．（米国テネシー州ノックスビル）から提供されたＰＶ－１０（登録商標）の希釈形態である［Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号及び第９,４２２,２６０号］。

【0118】

【表2A】

【0119】

【表2B】

【0120】

ＲＢの殺菌活性は、テーブル１Ａ、テーブル１Ｂの異なるＳＣＣｍｅｃ型（エントリ５～１１）の７つのメチシリン耐性Ｓ.アウレウス（ＭＲＳＡ）のパネルに対して検査された［Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．, Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． １１：Ａｒｔｉｃｌｅ ５４４７（２０２１）］。テーブル１Ａ、テーブル１ＢでテストされたすべてのＭＲＳＡ株が、蛍光灯又はＬＥＤライトの下で０.７８～３.１μｇ／ｍＬの濃度でＲＢによって殺された。ＲＢは更に、４つのバンコマイシン耐性Ｓ.アウレウス株（エントリ１２～１６）に対して検査され、すべてのバンコマイシン耐性株が、どちらの照明条件下でも１.０μｇ／ｍＬ未満の濃度で殺された。

【0121】

表皮ブドウ球菌は嫌気性菌であるが、好気性条件下でもよく成長する。好気性条件下でＲＢによって効果的に殺された（エントリ１６）。薬剤感受性及び薬剤耐性のエンテロコッカスフェカーリス（バンコマイシン耐性株を含む）は、ＲＢによって殺された（エントリ１７～２１）。唾液連鎖球菌はＲＢに対して感受性があった（エントリ２３）が、肺炎連鎖球菌はＲＢに対して耐性を示した（エントリ２４）。その耐性の根拠は現在のところ不明である。

【0122】

そして、暗条件下では、ＲＢは２５.０～１００μｇ／ｍＬの濃度で、エントリ１～２３（テーブル１Ａ，テーブル１Ｂ）にリストされているすべてのグラム陽性菌に対して抗菌活性を示した。暗条件下では、ＲＢは高濃度で抗菌活性を示すことが知られている。テーブル１Ａ，テーブル１Ｂで分析したすべてのグラム陰性菌は暗条件下でＲＢに対して感受性がなかった。これらのデータは、ＲＢが三重項酸素の励起メカニズムを介して細胞毒性活性酸素種を生成する以外に、細菌の増殖を阻害する１つ以上の未知のメカニズムを有するという考えを裏付ける。

【0123】

５種のマイコバクテリウム属菌に対するＲＢの抗菌活性を検査した（エントリ２５～２９）。興味深いことに、暗条件下では、これらのマイコバクテリウムは、照明条件下で観察されたものと同様のＭＩＣで殺された。ＲＢは、サッカロマイセスセレヴィシエの増殖を、暗条件下では細菌よりも高い濃度で阻害した（エントリ３０）。

【0124】

寒天希釈法で測定したＲＢのＭＩＣ値は、液体希釈法で測定した値と異なった（テーブル１）。寒天希釈法で測定したＭＩＣ値の選択例を、分析した微生物に番号を付け直すことによって示した表（テーブル２）にまとめた。

【0125】

【表3】

【0126】

Ｂ.サブチリス、Ｂ.セレウス、及びＳ.アウレウスなどのグラム陽性菌の増殖は、約２５から約１２５μｇ／ｍＬの濃度（テーブル２のエントリ１～４）で阻害され、これは液体希釈法で測定したＭＩＣ値よりも高い。Ｍ．スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７^ＴＭ）を、薬剤を含む寒天プレート（又はウェル）上で液体中よりも低い濃度で殺した（エントリ２９、テーブル１；エントリ５、テーブル２）［Ｌｅｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ ７３：７８０－７８９（２０２０）］。

【0127】

暗条件下では、寒天希釈法で測定したＲＢのＭＩＣは、液体希釈法で測定した値と良好な一致を示した。選択した細菌に対するＲＢの最小殺菌濃度（ＭＢＣ）も上記のテーブル２にまとめられている。

【0128】

処理及び殺菌の対象となるグラム陽性菌の例としては、薬剤感受性及び薬剤耐性のＳ.アウレウス、Ｓ.エピダーミス、Ｅ.フェカーリス及びＥ.フェシウムのうちの１つ以上、同様に枯草菌、セレウス菌、及び唾液連鎖球菌のうちの１つ以上が挙げられる。

【0129】

医薬品グレードＲＢ（ＨＰ－ＲＢｆ）の抗バイオフィルム活性
前のセクションで観察されたＲＢの抗菌特性は、グラム陽性菌におけるＲＢの抗バイオフィルム効果の評価を促した。上でまとめたデータは、ＲＢが顕著な薬剤親和性又はグラム陽性菌に対する浸透性を有することを示している。

【0130】

抗菌及び抗真菌光線力学療法が、バイオフィルム条件下で光増感剤を使用して研究されてきたが、ＲＢを使用して検査された細菌バイオフィルムの数は限られている［Ｐｅｒｅｚ－Ｌａｇｕｎａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈｏｔｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｐｈｏｔｏｄｙｎ． Ｔｈｅｒ． ２１：２１１－２１６（２０１８）］。

【0131】

ここで、薬剤感受性Ｓ.アウレウス６５０８（商標）、薬剤耐性Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５のバイオフィルムに対するＲＢの有効性を蛍光灯及び暗条件下で検討した。リネゾリドはグラム陽性菌のバイオフィルムを根絶するのに効果的な薬剤ではないが、バイオフィルム形成の予防に有益な効果があるため［Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２：３９４－３９９（２０１３）］、対照として使用した。

【0132】

Ｋｕｒｏｓｕ ｅｔ ａｌ．, Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：３２２（２０２２）により報告されたバイオフィルムアッセイにおいて、リネゾリドを陽性対照として６００μｇ／ｍＬ（浮遊細胞の場合は１００×ＭＩＣ超）の非常に高い濃度で適用した。それらの著者は、試験したすべての株がポリスチレンウェルプレート上で強力なバイオフィルムを形成することを確認したと報告した。蛍光灯下では、ＲＢは３０.０μｇ／ｍＬ（３８×ＭＩＣ）の濃度でＳ.アウレウス６５０８（商標）のバイオフィルムを７対数減少で根絶する可能性があり、これはリネゾリド（６００μｇ／ｍＬ）で観察されたのと同じレベルの有効性を示した（上記のＫｕｒｏｓｕ ｅｔ ａｌ．、図３）。

【0133】

ＲＢは、光下及び暗状態の両方で用量依存的にバイオフィルム根絶活性を示した。より高い濃度が必要であるが、ＲＢは暗条件下でバイオフィルム根絶活性を示した。５０.０μｇ／ｍＬ（暗下で２×ＭＩＣ）の濃度では、ＲＢは生菌の数を大幅に減らした。５００μｇ／ｍＬ（２０×ＭＩＣ）の濃度では、約１１０から約１５０ＣＦＵ／ｍＬしか観察されなかった。１,０００μｇ／ｍＬの濃度では生菌は現れなかった（Ｎ．Ｄ．）。同様の傾向は、薬剤耐性Ｓ.アウレウス７１０８０（ＶＲＳ８）及びＥ.フェシウムＮＲ－３２０６５のバイオフィルムで、はるかに低いＲＢ濃度で観察された。

【0134】

ＲＢの抗菌メカニズム
ＲＢの抗菌光線力学療法については、いくつかの論文で報告されている。ＲＢが細菌細胞壁を透過し、細胞膜に結合して活性酸素種を生成することは、照明条件下での殺菌メカニズムである可能性が高い［Ｎｓｕｂｕｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ａｄｖ． ３：１３７５（２０２１）；及びＬａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ６６：１５－２５（１９９７）］。比較的高い濃度が必要であるが、ＲＢは暗状態でマイコバクテリウム種を含むグラム陽性菌の大部分を殺す。また、（上記）グラム陽性菌のバイオフィルムを効果的に根絶する。暗状態でのＲＢの抗菌活性は、まだ完全に解明されているとは言えない［Ｎａｋｏｎｅｃｈｎｙ ｅｔ ａｌ．, Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２９：３１９６（２０１９）；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｅｎｚｙｍｅ． Ｉｎｈｉｂｉｔ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３５：１４１４－１４２１（２０２０）］。

【0135】

ＲＢは、照明状態では１２.５～２５.０ｍｇ／ｍＬで、暗状態では２５.０～５０.０ｍｇ／ｍＬでマイコバクテリア種を殺す（表１）。両状態において、ＲＢは５つのマイコバクテリア種をグラム陽性菌よりも遅い速度で殺す。ＲＢはマイコバクテリア細胞壁の透過性が低いと見られる。ＲＢは暗状態でもグラム陽性菌に対して迅速な殺菌効果を発揮するため、グラム陽性菌のＲＢ耐性変異体の生成は極めて困難な課題である。

【0136】

我々は、ＭＩＣ値が２００ｍｇ／ｍＬのＭ.スメグマチスのＲＢ耐性変異体の生成に成功した［Ｌｅｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ７３：７８０－７８９（２０２０）］。ＲＢ耐性株は、ほとんどの結核治療薬［アミカシン、カプレオマイシン、リファンピシン、アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド（ＡＰＰＢ）、及びエチオナミド］に感受性を示した（下記テーブル３）。

【0137】

【表4】

【0138】

しかし、イソニアジド（ＩＮＨ）に交差耐性を示した。ＩＮＨはカタラーゼペルオキシダーゼファミリーに属する酵素ＫａｔＧによる酸化的活性化を必要とするプロドラッグである。ＫａｔＧはＩＮＨを酸化して求電子種であるイソニコチノイルラジカル分子を形成し、これがマイコバクテリアのミコール酸の生合成に関与する酵素であるＮＡＤＨ依存性エノイル－ＡＣＰ（アシル担体タンパク質）還元酵素と反応する（下記スキーム１）［Ｖｉｌｃｈｅｚｅ ｅｔ ａｌ．, Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｐｅｃｔｒ． ２：ＭＧＭ２－００１４－２０１３（２０１４）；及びＭｏｒｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．, Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４７：３７９９－３８０５（２００３）］。

【0139】

【化5】

【0140】

ＲＢ耐性Ｍ.スメグマチス株は中程度のＩＮＨ耐性を獲得したが、エチオナミド（ＥＴＨ）に対する耐性は示さなかった。ＩＮＨ耐性の主なメカニズムはｋａｔＧの変異であり、ＥＴＨはモノオキシゲナーゼＥｔｈＡによって活性化される［Ｌａｂｏｒｄｅ ｅｔ ａｌ．, Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １４：８８４８－８８５８（２０１６）］。これらの観察は、ＲＢの抗菌メカニズムが１つ以上のＩＮＨ代謝酵素を共有して殺菌種を形成することを示唆している可能性がある。

【0141】

潜在的な作用機序を解明するために、次世代ＤＮＡ配列決定技術を用いてＲＢ耐性Ｍ.スメグマチスＡＴＣＣ６０７株の全ゲノム配列解析を行った［Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．, Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｓｏｕｒ． Ａｎｎｏｕｎｃ． ８：ｅ００５５１（２０１９）］。同定された挿入変異の１つは、それぞれ抗シグマＥ因子遺伝子（ｒｓｅＡ：ＴＧ：１０４ｖｓ．Ｔ：０で証明）とアクアポリンファミリータンパク質遺伝子（ＧＣＡＣＣＣＴ：７１ｖｓ．Ｇ：０で証明）で発生した。

【0142】

その結果、これらの挿入変異は対応するタンパク質の読み枠の変化を引き起こし、親株と比較して短縮されたタンパク質を生成した。ＲｓｅＡがヒト型結核菌の特異的な抗シグマＥ因子として機能すること、及びシグマＥ因子（ＳｉｇＥ）がマイコバクテリア生物がさまざまなストレス応答に耐えることを可能にすることが報告されている［Ｂｏｌｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ９：１７６４３（２０１９）；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：２９２２－２９２９（１９９７）］。したがって、ＲＢ耐性変異体における非機能的ＲｓｅＡの発現はＳｉｇＥの活性に影響を及ぼし、ＲＢに対する細菌耐性を高めることがある。一方、アクアポリンファミリータンパク質はさまざまな生物に存在し、細胞膜を通過する水と非荷電溶質の双方向フラックスにおいて重要な役割を果たす。

【0143】

連鎖球菌アクアポリンホモログのヌル変異により細胞内のＨ_２Ｏ_２保持が増加することが報告されており、これは、アクアポリンが連鎖球菌種におけるＨ_２Ｏ_２の輸送を媒介することを示している［Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２９４：４５８３－４５９５（２０１９）］。したがって、ＲＢがアクアポリンの機能を阻害し、細菌細胞内へのＨ_２Ｏ_２の蓄積をもたらし得ると仮定する。興味深いことに、フレームシフト変異を引き起こす１つのヌクレオチド欠失が、ＲＢ耐性株のモリブドプテリン依存性酸化還元酵素（Ｔ：７４ｖｓ．ＴＣ：０で証明）で観察された。

【0144】

酸化還元酵素系は、分子酸素の還元によってスーパーオキシドを、又は無機硝酸塩の還元によってＮＯを形成する可能性がある。ＲＢは、ラジカルアニオン（ＲＢ'－）又はＲＢ三重項状態を生成することになる酸化還元酵素の酸化還元において単一電子受容体として機能し、酸素との電子移動反応を起こすことがある。そのため、暗条件下でのＲＢの励起による活性酸素種又は活性窒素種の生成に、モリブドプテリン依存性酸化還元酵素が関与することを提案する（下記スキーム２）。スキーム２の酸化還元酵素は、モリブドプテリン依存性酸化還元酵素キサンチン脱水素酵素ファミリータンパク質である。スキーム２の「・ＯＨ＋ＯＨ^－」は、活性酸素種（ＲＯＳ）又は活性窒素種である。

【0145】

【化6】

【0146】

ｋａｔＧ遺伝子はＲＢ耐性株では無傷であった。そのため、ＩＮＨとの交差耐性を与えるメカニズムを推測することは依然として困難である。しかし、ＫａｔＧの発現レベルに影響を与え、ＩＮＨ活性化を抑制し得るＲＢ耐性株のいくつかの転写制御因子の変異を観察した。これは、Ｈ_２Ｏ_２のフェントン反応を通じてヒドロキシラジカル（活性酸素種）を生成する。マイコバクテリア種を含むグラム陽性菌に対する殺菌活性を示すために比較的高濃度のＲＢが必要であることは、ＲＢとカタラーゼの親和性が中程度であることを意味することがある。同様に、哺乳動物細胞におけるＲＢの細胞毒性機構が、以下のスキーム３に示すように説明されることがある。

【0147】

【化7】

【0148】

ＲＢは５０年以上にわたって眼疾患や肝臓疾患の診断に使用されてきた。結膜疾患や眼瞼疾患などの特定の医療問題を診断する際の染色剤として有用であることが多い（上記参照）。これらの用途では、０.１～２.０％のＲＢ（すなわち、１,０００～２０,０００μｇ／ｍＬ）が使用されてきた。

【0149】

２.０％未満の濃度のＲＢは、自然光及び人工光下で安全であると考えられる［Ｗｈｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ａｍ． Ｊ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １４９：４０５－４１５（２０１０）］。健康な細胞株であるＶｅｒｏ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞を選択し、蛍光灯下でのＲＢのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を調べた。

【0150】

ベロ細胞に対する抗菌剤と抗癌剤の細胞毒性に関する大規模なデータセットを生成しており、これにより新しい分子の毒性レベルを比較することができる［Ｓｉｒｉｃｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６０：２８６９－２８７８（２０１７）；及びＳｉｒｉｃｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ６８：２７１－２７８（２０１５）］。暗闇下での２４時間の試験で、ＲＢはベロ細胞に対して３００μＭ（２９２μｇ／ｍＬ）のＩＣ_５０値を示した。

【0151】

ＲＢの治療濃度は約０．１μＭから約１０μＭである可能性が高い。したがって、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験は、照明条件下では宿主細胞の細胞毒性を引き起こすことなく、皮膚感染症をＲＢで治療できることを示唆している。

【0152】

結論
Ｐｒｏｖｅｃｔｕｓは、ｃＧＭＰとＩＣＨの両方の要件を満たす医薬品グレードＲＢの製造及び精製プロセスを確立した。我々は、照明及び暗状態における例示的なＲＢ化合物である医薬品グレードＲＢ配合製品（ＰＶ－１０（登録商標））の抗菌活性と細胞毒性を評価した。ここでまとめた生理食塩水で希釈したＰＶ－１０（登録商標）によるＲＢの包括的なＭＩＣデータは、ＲＢが、肺炎連鎖球菌種を除くほとんどのグラム陽性菌（ＭＩＣ０.３９～３．１μｇ／ｍＬ）を殺すのに非常に効果的であることを示す。

【0153】

Ｓ.ニューモニエは、抗グラム陰性菌薬であるコリスチン（ポリミキシンＥ）に感受性のある非常に数少ないグラム陽性菌の１つである。我々は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方におけるＲＢの殺菌効果とコリスチン耐性の関係を研究した。Ｓ.ニューモニエのＲＢに対する耐性メカニズムは、他の箇所で報告されることになる。

【0154】

我々は、ＲＢが薬剤耐性株を含むグラム陽性菌のバイオフィルムを根絶する優れた薬剤であることを確認した。蛍光及び暗条件下では、ＲＢは濃度依存的にＳ.アウレウス及びＥ.フェシウムの薬剤耐性株の生細胞数を大幅に減少させた。これらの研究は、ＲＢがあらゆる増殖期に薬剤耐性菌を殺す潜在的な抗菌剤を有することを示している。

【0155】

材料及び方法

【0156】

抗生物質
すべての抗生物質は、商業的供給源から購入され［アミカシン二硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１７７４－１Ｇ）、硫酸カプレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４１４２－１Ｇ）、シプロフロキサシン塩酸塩一水和物（ＴＣＩ、Ｃ２２２７）、エチオナミド（ＴＣＩ、Ｅ０６９５）、イソニアジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ３３７７－５Ｇ）、リネゾリド（Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ、２９７２３）、メロペネム三水和物（Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ、ＡＫ１６１９８７）、リファンピシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ３５０１－１Ｇ）］、特に記載のない限り、更に精製することなく使用した。ＡＰＰＢ（アミノウリジルフェノキシピペリジニルベンジルブタンアミド）を、報告された手順に従って合成した。［（ａ）Ｍｉｔａｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１８、３：１７２６－１７３９;及び（ｂ）Ｍｉｔａｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１９、６：２３０５－２３２１.］

【0157】

生理食塩水中での医薬品グレードローズベンガルの製剤化（ＰＶ－１０（登録商標））
ローズベンガルジナトリウム塩をＰｒｏｖｅｃｔｕｓの特許手順に従って合成した。詳細な手順は、米国特許第８,５３０,６７５号、第９,２７３,０２２号及び第９,４２２,２６０号に記載されたとおりである。

【0158】

細菌の取得
このプログラムで使用した薬剤感受性細菌及び酵母は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス）から購入した。薬剤耐性株は、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から取得した。

【0159】

対数期細菌培養
すべての液体細菌培養は、エアフィルタ付きの三角フラスコを用いて行った。細菌株の単一コロニーをＡＴＣＣが推奨する条件に従って増殖させた。細菌の種培養及び大規模培養は、ＡＴＣＣが推奨する培地を使用して得た。Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７）は、０.５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ ミドルブルック ７Ｈ１０ニュートリエント寒天培地（０.４％グリセロール）で培養した［４６］。培養フラスコは、Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７）の場合は３～４日間、Ｍ.ツベルクローシスＨ３７Ｒｖの場合は１０～１２日間、振とう培養器で３７℃、振とう速度２００ｒｐｍでインキュベートし、中間対数期（光学密度－０.５）まで培養した。光学密度は、９６ウェルマイクロプレートリーダを使用して６００ｎｍでモニタされた。

【0160】

ＭＩＣアッセイ
すべての試験は、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）が定めたガイドラインに従う［「検査基準範囲の決定：ＣＬＳＩガイドラインによりタスクが管理可能」、Ｌａｂ． Ｍｅｄ． ４０：７５－７６（２００９）］。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、液体希釈マイクロプレートアラマーブルーアッセイ又はＯＤ測定によって決定した。すべての化合物は、ＤＭＳＯ又は生理食塩水（１ｍｇ／１００μＬ濃度）に保存した。この濃度は、すべてのＭＩＣ研究に貯蔵液として使用された。貯蔵液からの各化合物は、滅菌９６ウェルプレートの第１のウェルに入れられ、培養液（総量１０μＬ）で連続希釈を行った。対数期の細菌懸濁液（１９０μＬ）を各ウェル（総量２００μＬ）に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。各ウェルに２０μＬのレザズリン（０.０２％）を加え、４時間インキュベートした（臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬＳ）法（ピンク＝増殖、青＝目に見える増殖なし））。比色分析を行う前に、すべての実験でＯＤ測定を行った。また、各ウェルの吸光度をＵＶ－Ｖｉｓを介して５７０ｎｍ及び６００ｎｍで測定した。

【0161】

最小殺菌濃度（ＭＢＣ）アッセイ
（寒天プレート上で増殖した）特定の細菌の単一コロニーを培養液に接種した。細菌培養物を一晩中（約１８時間）増殖させた後、増殖支援培養液で１×１０^５から１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬの間の濃度に希釈する。ＭＩＣ値に基づいて、薬剤（ＭＩＣ、２×～２０×ＭＩＣ）を含む寒天プレートを調製した。一連の薬剤含有寒天プレートに、等量の特定の細菌を接種した。寒天プレートを適切な温度と時間でインキュベートした。ＣＦＵ／ｍＬをカウントした。ＭＢＣ値は、細菌の９９.９％超の減少によって決定した。

【0162】

哺乳動物細胞株及び培養
ベロ細胞（ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ－８１）はＡＴＣＣから購入した。ＨＥＫ細胞（ＳＣＣＥ０２０）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。細胞株はサプライヤーが推奨するように培地で培養し維持した。

【0163】

ベロ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、３０－００２－ＣＩ）、１％ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＨ３０２３８.０１）及び１％ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＨ３０２３９.０１）が補充されたＥａｇｌｅのＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）、１０－００９－ＣＶ）で培養し、湿度１００％、ＣＯ_２５％の３７℃インキュベータでインキュベートした。培養物は、増殖速度に応じて約５日かかる１００％コンフルエンスに達するまで、２日ごとに新鮮な培地でリフレッシュした。

【0164】

ヒト表皮角化細胞、新生児（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）、カタログ番号ＳＣＣＥ０２０）をＥｐｉＧＲＯ（商標）ヒト表皮角化細胞完全培養培地キット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）、ＳＣＭＫ００１）で培養し、湿度１００％、ＣＯ２５％の３７℃インキュベータでインキュベートした。培養物が１００％のコンフルエンスに達するまで、２日後及び週３回新鮮な培地でリフレッシュする。

【0165】

ベロ細胞を用いた細胞毒性分析
すべての試験は、若干の変更を含む臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）が定めたガイドラインに従う。ＰＶ－１０の細胞毒性分析は、２４ウェルプレートで実施した。各ウェル（１ｍＬ培地／ウェル）に、１μＬの薬剤濃度を加えた。光下での室温（ｒ．ｔ．）での１、２、３及び４時間のインキュベーション後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで（３回）洗浄した。培地（１ｍＬ／ウェル）を加えた後、１０μＬの３－（４,５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２,５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃（５％ＣＯ_２）でもう３時間インキュベートした。培地を除去し、ＤＭＳＯ（１ｍＬ／ウェル）を添加した。生存率はＭＴＴの紫色ホルマザン産物への細胞変換に基づいて評価した。着色したホルマザン産物の吸光度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴ分光光度計によって５７０ｎｍで測定した［Ｍｉｔａｃｈｉｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６３：１０８５５－１０８７８（２０２０）］。

【0166】

ベロ細胞［５×１０^４細胞／ウェル（１９６μＬの培養培地中）を９６ウェルプレートに入れ、細胞培養物を４日間インキュベートして単層（１００％コンフルエンス）を形成した。各ウェル中にＲＢ（０～３００ｍＭ）を添加した。

【0167】

画像は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞イメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ミシガン州アナーバー）を使用して１時間ごとに取得された。細胞増殖は、計算される細胞で覆われる視野の面積の測定値であるメトリック位相物体コンフルエンス（ＰＯＣ）を使用して定量化された。

【0168】

Ｍ.スメグマチス株の全ゲノム配列
ＲＢ耐性Ｍ.スメグマチス（ＡＴＣＣ６０７（商標））株は、以前に報告された手順に従って調製された［Ｋａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．（２０１０）］。細菌のＲＢ耐性に寄与し得る一塩基変異多型（ＳＮＰ）を同定するために、以前に報告された手順に従って、ＲＢ耐性変異体とその親対照株Ｍ.スメグマチス６０７（商標）の静置培養物からゲノムＤＮＡを精製した［Ｌｅｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ７３：７８０－７８９（２０２０）］。

【0169】

精製されたゲノムＤＮＡはミネソタ大学ゲノムセンター（ＵＭＧＣ）に送られ、品質管理分析、ライブラリ調製、及び高度なＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）ＤＮＡ－ｓｅｑテクノロジを用いたＤＮＡ塩基配列決定が行われた。変異体及び対照からの配列読み取りは、ＦａｓｔＱＣを使用して品質が評価された。低品質のテール及びアダプタがＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用して除去された［Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０６９：１２５－１３８ （２０２０)]。Ｍ.スメグマチス株ＦＤＡＡＲＧＯＳ＿６７９の全ゲノム配列を参照として使用し、ＳＮＰ又は欠失や挿入などの他の変異は、バイオインフォマティクスツールＳｎｉｐｐｙ［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ／ｔｓｅｅｍａｎｎ／ｓｎｉｐｐｙ］を使用して呼び出された。

【0170】

本明細書で引用した特許、特許出願及び論文は、それぞれ参照によって組み込まれる。冠詞「ａ」及び「ａｎ」（「１つの」）は、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すのに本明細書において使用される。

【0171】

前述の説明及び実施例は、例示を目的としたものであり、限定と捉えられるべきではない。本発明の趣旨及び範囲内で、更に他の変形も可能であり、当業者であれば容易に思いつくであろう。

【手続補正書】

【提出日】2024-07-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物の眼のグラム陽性菌感染症の治療に必要な局所眼科システムであって、
前記システムは、水性点眼剤中に溶解又は分散されたハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルを含む眼科用組成物を含み、該組成物は約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの細菌性角膜炎治療に有効な濃度で存在し、
約６．５から約７．６のｐＨ値と、約１０から約３００ｃｐｓの粘度と、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、化学線に対して不透明な容器内に存在する局所眼科システム。

【請求項2】

前記組成物が更に、グリセリン又はプロピレングリコール又はグリセリン及びプロピレングリコールの両方を最大で前記組成物の合計２．５重量パーセント含む、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項3】

少なくとも一部の前記浸透圧が、１つ以上の水溶性のナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの塩化物、リン酸塩、及び硝酸塩の存在によって与えられる、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項4】

前記粘度が、前記組成物の前記ｐＨ値でイオン電荷のない１つ以上のポリマーによって少なくとも部分的に与えられる、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項5】

前記組成物の前記ｐＨ値でイオン電荷のない前記ポリマーが、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、デキストラン、デキストリン、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒプロメロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びポリ（ビニルアルコール）のうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項４に記載の局所眼科システム。

【請求項6】

前記粘度が、前記組成物の前記ｐＨ値でアニオン電荷を帯びる１つ以上のポリマーによって少なくとも部分的に与えられる、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項7】

前記組成物の前記ｐＨ値でアニオン電荷を帯びる前記ポリマーが、ａ）ヒアルロン酸、ｂ）各架橋剤が１分子当たり平均して少なくとも３つのアリル基を含む、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋された水溶性の部分的に中和された架橋アクリル酸、メタクリル酸及び共重合体、ｃ）水膨潤性であるが非水溶性の部分的に中和された、少なくとも８０重量パーセントのモノエチレン性不飽和カルボキシ官能性モノマーと約０．０５から約１．５重量パーセントの３,４－ジヒドロキシ－１,５－ヘキサジエン又は２,５－ジメチル－１,５－ヘキサジエンである架橋剤との共重合反応生成物、及びｄ）部分的に中和されたカルボキシメチルセルロースのうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項６に記載の局所眼科システム。

【請求項8】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式１及び／又は式２の一方又は両方の化学式を有し、

【化1】

式中、Ｒ_１が独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５が独立してＣｌ、Ｈ又はＩであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５から選択される少なくとも１つの置換基がＩであり；
Ｒ_６が独立してＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１１がＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１２がＨ又はＣ_１－Ｃ_７アシルであり；すべての（ａ）互変異性型、（ｂ）アトロプ異性体、（ｄ）式２に示すラクトン型の光学異性体、及び（ｅ）それらの薬学的に許容される塩、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項9】

前記式１及び式２の前記ハロゲン化フルオレセインのＲ_１がクロロ又はブロモ置換基のいずれかである一方、それらの式のＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のそれぞれが、以下の式Ｉ及び式ＩＩに存在するヨウド置換基であり、Ｘが酸素又は窒素であり、「ｎ」がゼロ又は１であり、Ｘが

【化2】

酸素である場合、ｎがゼロであり、Ｒ^７が存在せず芳香族エステルを形成するのに対して、Ｘが窒素である場合、ｎが１であり、Ｒ^７が存在して芳香族アミドを形成し、
Ｘが酸素である場合、Ｒ^７が、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ^＋、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、及び芳香環含有置換基からなる群から選択され、
前記芳香環含有置換基が、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む、５若しくは６員を含む単環、又は５，６若しくは６，６縮合芳香環系であり、
Ｘが窒素である場合、Ｒ^７及びＲ^８が同じか又は異なり、水素、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、芳香環含有置換基又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共にアミド窒素原子Ｒ^７及びＲ^８と共に含んでなる群から選択される、請求項８に記載の局所眼科システム。

【請求項10】

前記芳香族エステル又は芳香族アミドの前記芳香環含有置換基が非置換であり、次のものからなる群から選択され、

【化3】

である、請求項９に記載の局所眼科システム。

【請求項11】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式Ｉａ及び／又は式ＩＩｂの一方又は両方の化学式を有し、

【化4】

式中、Ｍ^＋が薬学的に許容されるカチオンである、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項12】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルがローズベンガルジナトリウムである、請求項１に記載の局所眼科システム。

【請求項13】

哺乳動物の眼のグラム陽性菌感染症の治療に使用する眼科用組成物であって、水性眼科利用担体に溶解又は分散されたハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルを含み、前記組成物中に約０．２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの細菌性角膜炎治療に有効な濃度で存在し、約６．５から約７．６のｐＨ値と、約１０から約３００ｃｐｓの粘度と、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、前記グラム陽性菌に感染した眼に投与する眼科用組成物。

【請求項14】

前記投与が前記実質的に化学線のない状態で実行される、請求項１３に記載の眼科用組成物。

【請求項15】

前記眼科用組成物が、前記投与の前に化学線に対して不透明な容器に保持される、請求項１３に記載の眼科用組成物。

【請求項16】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式１及び／又は式２の一方又は両方の化学式を有し、

【化5】

式中、Ｒ_１が独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５が独立してＣｌ、Ｈ又はＩであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５から選択される少なくとも１つの置換基がＩであり；
Ｒ_６が独立してＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１１がＨ又はＣ_１－Ｃ_４アルキルであり；Ｒ_１２がＨ又はＣ_１－Ｃ_７アシルであり；すべての（ａ）互変異性型、（ｂ）アトロプ異性体、（ｄ）式２に示すラクトン型の光学異性体、及び（ｅ）それらの薬学的に許容される塩、請求項１３に記載の眼科用組成物。

【請求項17】

前記式１及び式２の前記ハロゲン化フルオレセインのＲ_１がクロロ又はブロモ置換基のいずれかである一方、それらの式のＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のそれぞれが、以下の式Ｉ及び式ＩＩに存在するヨウド置換基であり、Ｘが酸素又は窒素であり、「ｎ」がゼロ又は１であり、Ｘが

【化6】

酸素である場合、ｎがゼロであり、Ｒ^７が存在せず芳香族エステルを形成するのに対して、Ｘが窒素である場合、ｎが１であり、Ｒ^７が存在して芳香族アミドを形成し、
Ｘが酸素である場合、Ｒ^７が、水素（Ｈ）、薬学的に許容されるカチオンであるＭ^＋、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、及び芳香環含有置換基からなる群から選択され、
前記芳香環含有置換基が、独立して窒素、酸素若しくは硫黄である０、１又は２個のヘテロ環原子を含む、５若しくは６員を含む単環、又は５，６若しくは６，６縮合芳香環系であり、
Ｘが窒素である場合、Ｒ^７及びＲ^８が同じか又は異なり、水素、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、芳香環含有置換基又は５若しくは６員環を形成するアミド窒素原子と共にアミド窒素原子Ｒ^７及びＲ^８と共に含んでなる群から選択される、請求項１６に記載の眼科用組成物。

【請求項18】

前記芳香族エステル又は芳香族アミドの前記芳香環含有置換基が非置換であり、次のものからなる群から選択され、

【化7】

である、請求項１７に記載の眼科用組成物。

【請求項19】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルが、次の式Ｉａ及び／又は式ＩＩｂの一方又は両方の化学式を有し、

【化8】

式中、Ｍ^＋が薬学的に許容されるカチオンである、請求項１３に記載の眼科用組成物。

【請求項20】

前記ハロゲン化フルオレセイン又はその薬学的に許容される塩若しくはエステルがローズベンガルジナトリウムである、請求項１３に記載の眼科用組成物。

【国際調査報告】