特表 2025-501221 ランディングパッド細胞株の生成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-17

(54)【発明の名称】ランディングパッド細胞株の生成

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20250109BHJP

   C12N 15/90 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/64 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/65 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20250109BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04 ZNA

C12N15/90 104Z

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N5/10

C12N15/64 Z

C12N15/65 Z

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024539465

(86)(22)【出願日】2022-12-28

(85)【翻訳文提出日】2024-08-21

(86)【国際出願番号】 US2022082485

(87)【国際公開番号】W WO2023129974

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】63/294,605

(32)【優先日】2021-12-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391015708

【氏名又は名称】ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ－ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】マクベイ，ダンカン ロキエル

(72)【発明者】

【氏名】ガーグ，チャル

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チャオジエ

(72)【発明者】

【氏名】トレムル，ガブリエーレ

(72)【発明者】

【氏名】ケタン，アヌラグ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QQ43

4B063QR33

4B063QR48

4B063QR77

4B063QS33

4B063QS36

4B063QS38

4B063QX01

4B063QX02

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BA25

4B065CA24

4B065CA25

(57)【要約】

本開示は、標的化遺伝子組み込みのためのランディングパッド細胞を生成する方法であって、例えば相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内にランディングパッドプラスミドを組み込むことを含む方法を提供する。一態様において、２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）はポリヌクレオチド配列にフランキングし、２つの相同組換え部位は、ＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する。ランディングパッドプラスミドの２つの相同組換え部位は、親プラスミド上の対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込むことができる。開示される方法は、ホット細胞株における標的化組み込みのためのホットスポットを同定することにより、高発現細胞株の生成を可能にする。本開示はまた、本開示のランディングパッド細胞の生成のための細胞ならびに細胞および／または試薬を含むキットを提供する。標的化組み込みのための新規ホットスポットも提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ランディングパッド細胞株の造成に好適な親細胞を選択する方法であって、
（ｉ）目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現力価が高い細胞株をスクリーニングし選択すること、および
（ｉｉ）さらに（ｉ）の細胞をスクリーニングし、ＧＯＩをコードする核酸を含む親プラスミドのコピー数が低い細胞を選択することであって、コピー数が１または２である、選択すること
を含む方法。

【請求項2】

親プラスミドは、２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）を含むか、１つのＳＳＲＳを含むか、またはＳＳＲＳを含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ランディングパッド細胞を選択する方法であって、
（ｉ）親細胞株における親プラスミドまたはその一部の喪失についてスクリーニングし、そのような喪失（欠失）がある細胞を選択すること、および
（ｉｉ）ランディングパッドの存在について（ｉ）の細胞をさらにスクリーニングし、ランディングパッドが存在する細胞を選択すること
を含む方法。

【請求項4】

ランディングパッド細胞を選択する方法であって、
（ｉ）親細胞株における少なくとも１つの親プラスミドまたはその一部の喪失についてスクリーニングし、そのような喪失（欠失）がある細胞を選択すること、および
（ｉｉ）少なくとも１つのランディングパッドの存在について（ｉ）の細胞をさらにスクリーニングし、ランディングパッドが存在する細胞を選択すること
を含む方法。

【請求項5】

ランディングパッド細胞におけるランディングパッド配列を、
（ｉ）低複雑性または高複雑性の領域の存在または非存在、
（ｉｉ）レトロトランスポゾン配列の存在または非存在、
（ｉｉｉ）Ａｌｕリピートの存在または非存在、
（ｉｖ）長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）の存在または非存在、
（ｖ）ＣｐＧアイランドの存在または非存在、
（ｖｉ）シトシンメチル化のレベル、
（ｖｉｉ）ヒストンアセチル化のレベル、
（ｖｉｉｉ）活発な転写の存在または非存在、および、
（ｉｘ）それらのいずれかの組合せ
からなる群から選択される特徴についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項３または請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ランディングパッド細胞を生成する方法であって、
（ｉ）親細胞株における第１ ＧＯＩを含む少なくとも１つの親プラスミドまたはその一部を欠失させること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの欠失の後に、ランディングパッドを含むランディングパッドプラスミドまたはその一部を細胞に導入すること
を含む方法。

【請求項7】

ランディングパッドを含むランディングパッドプラスミドまたはその一部は、（ｉ）の欠失の部位において挿入される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ランディングパッドを含むランディングパッドプラスミドまたはその一部は、（ｉ）の欠失の部位ではない部位において挿入される、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

ランディングパッド細胞を生成する方法であって、
相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内にランディングパッドプラスミドを組み込むことを含み、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に位置し、
各ランディングパッドプラスミドが、
（１）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、
（３）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（２）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位と
を含み、
ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、方法。

【請求項10】

親プラスミドは、２つ以上のゲノム座位に位置する、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ランディングパッド細胞を同定するための方法であって、
（１）親細胞のゲノム配列に組み込まれた親プラスミドから第１ ＧＯＩの少なくとも一部を除去すること、
（２）代替的ゲノム座位においてランディングパッドプラスミドを組み込むこと、
（３）少なくとも１つの代替的ゲノム座位において組み込まれたランディングパッドプラスミドを少なくとも１コピー含む候補細胞のライブラリーをスクリーニングすることであって、候補細胞株が、以下の特性
（ａ）細胞力価が既定の閾値レベルを超えること、
（ｂ）ランディングパッドプラスミドまたはランディングパッドのコピー数が既定の値であること、
（ｃ）既定の閾値レベルを超えるＲＮＡ発現レベル、
（ｄ）複数のプラスミドコピーが、存在する場合、特定のプラスミド構成を有すること、
（ｅ）親プラスミドからの第１ ＧＯＩの少なくとも一部の欠失、および、
（ｆ）機能的ＳＳＲＳを含む少なくとも１つのランディングパッドの存在
のうちの１つまたは複数について評価される、スクリーニングすること
を含む方法。

【請求項12】

親細胞は、歴史的細胞株である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

候補細胞のライブラリーは、親細胞のゲノム内の複数の場所におけるランディングパッド配列のランダム組み込みによって生成されたライブラリーである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

ホットスポットに組み込まれたランディングパッド配列を含むホット細胞を選択する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

親細胞株は、ＣＨＯ細胞株である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

発現細胞を生成する方法であって、部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、請求項３～１５に記載のランディングパッド細胞のゲノム内に第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことを含み、結果として得られた発現プラスミドが、
（１）第２ ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳと
を含み、
ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、第２ ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、方法。

【請求項17】

発現細胞を生成する方法であって、
（ａ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内にランディングパッドプラスミドまたはその一部を組み込むことであって、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に位置し、
各ランディングパッドプラスミドまたはその一部が、
（１ａ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、
（２ａ）（１ａ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つのＳＳＲＳと、
（３ａ）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（２ａ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位と
を含み、
ランディングパッドプラスミドまたはその一部の相同組換え部位が、異なるゲノム座位においてランディングパッド内で親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡ中の異なるゲノム座位においてランディングパッドの内部の場所におけるランディングパッドプラスミドまたはその一部を組み込む、組み込むこと、ならびに、
（ｂ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、ランディングパッド細胞のゲノム内に第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことであって、発現プラスミドが、
（１ｂ）ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、
（２ｂ）（１ｂ）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳと
を含み、
ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、組み込むこと
を含む方法。

【請求項18】

ランディングパッド細胞を生成する方法であって、
（ａ）親細胞株における第１のホットスポット場所から親プラスミドの少なくとも一部を除去すること、および、
（ｂ）相同組換えまたはランダム組み込みを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内の第２のホットスポット場所にランディングパッドプラスミドを組み込むことであって、相同組換えまたはランダム組み込みのために標的化される配列が、ランディングパッドプラスミドに存在したものであり、
各ランディングパッドプラスミドが、
（１）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、
（３）親細胞株ゲノム内の対応する相同組換え部位と相同である、（２）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位と
を含む、組み込むこと
を含む方法。

【請求項19】

発現細胞を生成する方法であって、
（ａ）親細胞株における第１のホットスポット場所から親プラスミドまたはその一部を除去すること、
（ｂ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内の第２のホットスポット場所にランディングパッドプラスミドを組み込むことであって、相同組換えのために標的化される配列が、親細胞株に存在したものであり、
各ランディングパッドプラスミドが、
（１ｂ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、
（２ｂ）（１ｂ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、
（３ｂ）親細胞株中の対応する相同組換え部位と相同である、（２ｂ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位と
を含み、
ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親細胞株の対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、組み込むこと、ならびに、
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、ランディングパッド細胞のゲノム内にＧＯＩプラスミドを組み込むことであって、発現プラスミドが、
（１ｃ）第１ ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、
（２ｃ）（１ｃ）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳと
を含み、
ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、組み込むこと
を含む方法。

【請求項20】

ランディングパッド細胞は、記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－、または、
－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｍ］は、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを有するプラスミドを含む、
請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

発現細胞に組み込まれるプラスミドのトポロジーは、記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［＝ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応する、請求項１６、１７、または１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

相同組換えは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、またはＺＦＮシステムによって媒介される、請求項９または１７から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

部位特異的リコンビナーゼ組換え部位（ＳＳＲＳ）は、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位、またはセリン－インテグラーゼ部位である、請求項２または９から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ３、またはＢ３ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位は、λ（ラムダ）、ＨＫ０２２、またはＨＰ１ Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位は、γδ（ガンマデルタ）、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、またはＧｉｎセリン－リゾルバーゼ／インテグラーゼ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

セリン－インテグラーゼ部位は、ＰｈｉＣ３１、Ｂｘｂ１、またはＲ４セリン－インテグラーゼ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

ＳＳＲＳは、ＬｏｘＰ部位である、請求項２４に記載の方法。

【請求項31】

ＬｏｘＰ部位は、配列番号１に定める核酸配列（野生型ＬｏｘＰ）を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ＬｏｘＰ部位は、突然変異型ＬｏｘＰ部位を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

突然変異型ＬｏｘＰ部位は、配列番号２に定める核酸配列（突然変異型ＬｏｘＰ）を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

突然変異型ＬｏｘＰ部位は、配列番号３（Ｌｏｘ ５１１）、配列番号４（Ｌｏｘ ５１７１）、配列番号５（Ｌｏｘ ２２７２）、配列番号６（Ｌｏｘ Ｍ２）、配列番号７（Ｌｏｘ Ｍ３）、配列番号８（Ｌｏｘ Ｍ７）、配列番号９（Ｌｏｘ Ｍ１１）、配列番号１０（Ｌｏｘ ７１）、および配列番号１１（Ｌｏｘ ６６）からなる群から選択される核酸を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｆｌｐ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項36】

ＳＳＲＳは、短いフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

セリン－インテグラーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢ部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項38】

少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）および／またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である、請求項９、１０、または１７から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列は、薬物耐性遺伝子である、請求項９、１０、または１７から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

薬物耐性遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

抗生物質耐性遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

ピューロマイシン耐性遺伝子は、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列は、タンパク質を構成する、請求項９、１０、または１７から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

タンパク質は、蛍光タンパク質である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

蛍光タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＡｃＧＦＰ１、ＥＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＡｃＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＢａｎａｎａ、ＹＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

細胞は、ＨＥＫ２９３またはＮＳ０である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

ＧＯＩをコードする核酸は、少なくとも１つのポリペプチドをコードする、請求項１、２、６から８、１１から１７、または１９から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

少なくとも１つのポリペプチドは、抗体または融合タンパク質である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

発現プラスミドは、１コピー、２コピー、または３コピー以上のＧＯＩ、検出可能マーカー、またはそれらの組合せを含む、請求項１６、１７または１９から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

ＧＯＩ、検出可能マーカー、またはそれらの組合せの発現を決定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

ＧＯＩの発現は、定量的におよび／または定性的に決定される、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

ＧＯＩの発現は、細胞選別、ＦＡＣＳ、細胞表面染色、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス、ＵＶ吸光度、免疫組織化学、細胞サイズ、分泌タンパク質レベル、転写物レベル、またはそれらのいずれかの組合せによって決定される、請求項５２または請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミドは、１のコピー数で細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３から５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のコピー数で細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

（ｉ）５’相同組換え部位は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含むか、
（ｉｉ）５’相同組換え部位は、配列番号１１４のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１１５のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含むか、または、
（ｉｉｉ）５’相同組換え部位および３’相同組換え部位は、親プラスミドにフランキングするポリヌクレオチド配列を含む、
請求項９もしくは１０または１７から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

親プラスミドは、抗体などの第１ ＧＯＩをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－、または、
－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｍ］は、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを有するプラスミドを含むランディングパッド細胞。

【請求項60】

記述、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、または、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを持つプラスミドを含む発現細胞。

【請求項61】

請求項３から６０のいずれか一項に記載の方法によって生産された細胞株。

【請求項62】

請求項６１に記載の細胞または請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法に従って生成された細胞と、それらの使用に関する説明書とを含むキット。

【請求項63】

細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、単離細胞。

【請求項64】

目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞に導入することと、ＣＨＯ細胞のゲノムの特定座位において核酸が組み込まれたＣＨＯ細胞を得ることとを含む方法であって、座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、方法。

【請求項65】

目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含む細胞を用意することを含む方法であって、ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結された目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含み、核酸が、ＣＨＯ細胞のゲノムの特定座位において組み込まれ、座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、方法。

【請求項66】

（ｉ）配列番号２０の中のヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列を含むか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中のヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列を含む、請求項６３に記載の単離細胞または請求項６４もしくは６５に記載の方法。

【請求項67】

（ｉ）配列番号２０の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列からなるか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列からなる、請求項６３に記載の単離細胞または請求項６４もしくは６５に記載の方法。

【請求項68】

（ｉ）配列番号２０の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列に対して上流の（配列番号２０の５’末端の方の）部分配列であるか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列に対して上流の（配列番号１１６の５’末端の方の）部分配列である、請求項６３に記載の単離細胞または請求項６４もしくは６５に記載の方法。

【請求項69】

（ｉ）配列番号２０の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列に対して下流の（配列番号２０の３’末端の方の）部分配列であるか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列に対して下流の（配列番号１１６の３’末端の方の）部分配列である、請求項６３に記載の単離細胞または請求項６４もしくは６５に記載の方法。

【請求項70】

少なくとも２つのランディングパッドプラスミドまたは少なくとも２つの発現プラスミドを含む、請求項１から５８もしくは６４から６９のいずれか一項に記載の方法、請求項５９もしくは６０、６３もしくは６６から６９のいずれか一項に記載の細胞、請求項６１に記載の細胞株、または請求項６２に記載のキット。

【請求項71】

２つのランディングパッドプラスミドまたは２つの発現プラスミドは、ヘッド・トゥ・ヘッド、テール・トゥ・テール、テール・トゥ・ヘッド、およびヘッド・トゥ・テールからなる群から選択される構成にある、請求項７０に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項72】

各発現プラスミドは、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を少なくとも含む、請求項７０または７１に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項73】

すべてのＧＯＩは同じである、請求項７２に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項74】

すべてのＧＯＩは異なっている、請求項７２に記載の方法、細胞株、キット、または単離細胞。

【請求項75】

少なくとも１つのＧＯＩは残りと異なっている、請求項７２に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項76】

第１ ＧＯＩは抗体の重鎖（ＨＣ）を含み、第２ ＧＯＩは抗体の軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項７４または７５に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項77】

少なくとも１つの発現プラスミドは、バイシストロン性である、請求項７０から７６のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項78】

バイシストロン性発現プラスミドは、抗体のＨＣを含む第１ ＧＯＩと、抗体のＬＣを含む第２ ＧＯＩとをコードする、請求項７７に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項79】

少なくとも１つのランディングパッドプラスミドは、アドレス指定可能である、請求項７０から７８のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項80】

各ランディングパッドプラスミドは、２つのＬｏｘ部位を含む、請求項７０から７９のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項81】

Ｌｏｘ部位は、Ｌｏｘ ＰおよびＬｏｘ ５１１である、請求項８０に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項82】

各ランディングパッドプラスミドは、Ｌｏｘ部位およびＦｒｔ部位を含む、請求項７０から８１のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項83】

各ランディングパッドプラスミドは、１つまたは２つのａａｔ部位を含む、請求項７０から８１のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項84】

各ランディングパッドプラスミドは、アドレス指定可能である、請求項７０から８３のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項85】

各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドは、ランディングパッドに対してユニークである一対のアドレス指定可能ＳＳＲＳを含む、請求項８４に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項86】

少なくとも一対のアドレス指定可能ＳＳＲＳは、一対のＬｏｘ部位である、請求項８５に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項87】

少なくとも一対のＬｏｘ部位は、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐである、請求項８６に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項88】

少なくとも一対のＬｏｘ部位は、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ ｍ７である、請求項８６に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項89】

Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐの対のＬｏｘ部位を含む第１のアドレス指定可能ランディングパッドプラスミドと、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ ｍ７の対のＬｏｘ部位を含む第２のアドレス指定可能ランディングパッドプラスミドとを含む、請求項８４から８８のいずれか一項に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項90】

各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドは、非相互適合性ａｔｔ部位を含む、請求項８４に記載の方法、細胞、細胞株、またはキット。

【請求項91】

細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、座位が、配列番号２０もしくは配列番号１１６またはそれらのオルソロガス配列の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、細胞。

【請求項92】

細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、座位が、配列番号２１もしくは配列番号１１７またはそれらのオルソロガス配列の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、細胞。

【請求項93】

細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、座位が、配列番号２０もしくは配列番号１１６またはそれらのオルソロガス配列と重なるまたはそれを包含するポリヌクレオチド部分配列である、細胞。

【請求項94】

細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、座位が、配列番号２１もしくは配列番号１１７またはそれらのオルソロガス配列と重なるまたはそれを包含するポリヌクレオチド部分配列である、細胞。

【請求項95】

ＣＨＯ細胞である、請求項９１から９４のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項96】

オルソロガス配列は、配列番号２０、２１、１１６、１１７、またはそれらの部分配列との約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する、請求項９１から９５のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項97】

配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの実行を使用したペアワイズアラインメントによって決定される、請求項９８に記載の細胞。

【請求項98】

２つのランディングパッドプラスミドまたは２つの発現プラスミドを含む、請求項９１から９５のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項99】

３つ以上のランディングパッドプラスミドまたは３つ以上の発現プラスミドを含む、請求項９１から９８のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項100】

２つのランディングパッドプラスミドは、アドレス指定可能である、請求項９８または９９に記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子提出された配列表の参照
電子提出された配列表（名称：３３３８＿１９６ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２６．ｔｘｔ、サイズ：４５，０３９，４７３バイト、および作成日：２０２２年１２月２７日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

本開示は、標的化遺伝子組み込みに好適なランディングパッド細胞（ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ ｃｅｌｌ）の生成のための方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

歴史的に、発現プラスミドＤＮＡを通常は線状化した状態で細胞にトランスフェクトし、それを本質的にランダムな様式で細胞ゲノムに組み込ませることにより、細胞株が作製されてきた。このプラスミドは薬物耐性または栄養要求体相補性などの選択的利点をもたらすため、発現プラスミドを含む細胞のみが生存する。いくつかあるパラメータの中でも、高い力価、翻訳後修飾、発現安定性、細胞密度、およびバイオリアクターにおける生存能のような性能の許容可能なレベルを維持しながら、目的の生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）を発現する細胞株を作製するのにかかる時間を最小限に抑え、予測可能性を高めることが所望されている。

【0004】

この目標を達成する方途の１つは、細胞株の造成中に発現カセットまたは発現プラスミドを細胞株の同じ座位に挿入する標的化組み込み（ＴＩ）（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）（ＴＩ）という技術を使用することである。標的化される座位はランディングパッドとも呼ばれ、ランディングパッドを含む細胞株はランディングパッド細胞株とも呼ばれる。発現カセットまたは発現プラスミドは、組換え媒介カセット交換（ＲＭＣＥ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ）もしくは部位特異的組換え（ＳＳＲ：ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）と呼ばれることもあるＣｒｅ／Ｌｏｘ技術などを使用した部位指向性組換えによって、またはＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）、ＴＡＬＥＮ、もしくは他のそのような部位特異的ヌクレアーゼにより刺激される相同組換えを使用することによって、ランディングパッドに組み込まれ得る。

【0005】

ＴＩに対する大きな課題は、使用すべき細胞株および座位を同定することである。細胞株自体が良好に機能することができなければならず、ランディングパッドは、高い転写が起こり、生物製剤の転写がエピジェネティック修飾などによってサイレンシングされない座位（「ホットスポット」）にある必要がある。ＴＩランディングパッド宿主細胞株は、高発現のために染色体中に「ホットスポット」を有する必要があるが、この「ホットスポット」には、生物製剤の高タンパク質発現に必要な中間工程のすべてをサポートする「ホット細胞（ｈｏｔ ｃｅｌｌ）」の環境が必要であると理解されている。ランディングパッド細胞株の生成および同定を可能にすることは、宿主細胞ゲノムに固有の柔軟性によって引き起こされる変動性を１つの理由として非常に困難である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、信頼でき再現可能なタンパク質発現が可能なランディングパッド細胞を生成するための効率的な方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、ランディングパッド細胞株の造成に好適な親細胞を選択する方法であって、（ｉ）目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現力価が高い細胞株をスクリーニングし選択すること、および（ｉｉ）さらに（ｉ）の細胞をスクリーニングし、ＧＯＩをコードする核酸を含む親プラスミドのコピー数が低い細胞を選択することであって、コピー数が１または２である、選択することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、親プラスミドは、２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）を含むか、１つのＳＳＲＳを含むか、またはＳＳＲＳを含まない。

【0008】

本開示はまた、ランディングパッド細胞を選択する方法であって、（ｉ）親細胞株における親プラスミドまたはその一部の喪失についてスクリーニングし、そのような喪失（欠失）がある細胞を選択すること、および（ｉｉ）ランディングパッドの存在について（ｉ）の細胞をさらにスクリーニングし、ランディングパッドが存在する細胞を選択することを含む方法を提供する。

【0009】

また、ランディングパッド細胞を選択する方法であって、（ｉ）親細胞株における少なくとも１つの親プラスミドまたはその一部の喪失についてスクリーニングし、そのような喪失（欠失）がある細胞を選択すること、および（ｉｉ）少なくとも１つのランディングパッドの存在について（ｉ）の細胞をさらにスクリーニングし、ランディングパッドが存在する細胞を選択することを含む方法も提供される。いくつかの態様において、この方法は、ランディングパッド細胞におけるランディングパッド配列を、（ｉ）低複雑性または高複雑性の領域の存在または非存在、（ｉｉ）レトロトランスポゾン配列の存在または非存在、（ｉｉｉ）Ａｌｕリピートの存在または非存在、（ｉｖ）長鎖散在核要素（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＬＩＮＥ）の存在または非存在、（ｖ）ＣｐＧアイランドの存在または非存在、（ｖｉ）シトシンメチル化のレベル、（ｖｉｉ）ヒストンアセチル化のレベル、（ｖｉｉｉ）活発な転写の存在または非存在、および、（ｉｘ）それらのいずれかの組合せからなる群から選択される特徴についてスクリーニングすることをさらに含む。

【0010】

また、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、（ｉ）親細胞株における第１ ＧＯＩを含む少なくとも１つの親プラスミドまたはその一部を欠失させること、および（ｉｉ）少なくとも１つの欠失の後に、ランディングパッドを含むランディングパッドプラスミドまたはその一部を細胞に導入することを含む方法も提供される。いくつかの態様において、ランディングパッドを含むランディングパッドプラスミドまたはその一部は、（ｉ）の欠失の部位において挿入される。いくつかの態様において、ランディングパッドを含むランディングパッドプラスミドまたはその一部は、（ｉ）の欠失の部位ではない部位において挿入される。

【0011】

本開示はまた、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内にランディングパッドプラスミドを組み込むことを含み、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に位置し、各ランディングパッドプラスミドが、（１）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（２）（１）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、（３）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（２）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含み、ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、方法を提供する。いくつかの態様において、親プラスミドは、２つ以上のゲノム座位に位置する。

【0012】

本開示はまた、ランディングパッド細胞株を同定するための方法であって、（１）親細胞のゲノム配列に組み込まれた親プラスミドから第１ ＧＯＩの少なくとも一部を除去すること、（２）代替的ゲノム座位においてランディングパッドプラスミドを組み込むこと、（３）少なくとも１つの代替的ゲノム座位において組み込まれたランディングパッドプラスミドを少なくとも１コピー含む候補細胞のライブラリーをスクリーニングすることであって、候補細胞株が、以下の特性：（ａ）細胞力価が既定の閾値レベルを超えること、（ｂ）ランディングパッドプラスミドまたはランディングパッドのコピー数が既定の値であること、（ｃ）既定の閾値レベルを超えるＲＮＡ発現レベル、（ｄ）複数のプラスミドコピーが、存在する場合、特定のプラスミド構成を有すること、（ｅ）親プラスミドからの第１ ＧＯＩの少なくとも一部の欠失、および、（ｆ）機能的ＳＳＲＳを含む少なくとも１つのランディングパッドの存在のうちの１つまたは複数について評価される、スクリーニングすることを含む方法を提供する。いくつかの態様において、親細胞は、歴史的細胞株（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）である。いくつかの態様において、候補細胞のライブラリーは、親細胞のゲノム内の複数の場所におけるランディングパッド配列のランダム組み込みによって生成されたライブラリーである。いくつかの態様において、この方法は、ホットスポットに組み込まれたランディングパッド配列を含むホット細胞を選択する。いくつかの態様において、親細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。

【0013】

本開示はまた、部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用することにより、上記で開示した方法のいずれかに従ってランディングパッド細胞のゲノム内に第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことを含む発現細胞を生成する方法であって、結果として得られた発現プラスミドが、（１）第２ ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、（２）（１）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳとを含み、ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、第２ ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0014】

また、発現細胞を生成する方法であって、
（ａ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内にランディングパッドプラスミドまたはその一部を組み込むことであって、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に位置し、各ランディングパッドプラスミドまたはその一部が、（１ａ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（２ａ）（１ａ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つのＳＳＲＳと、（３ａ）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（２ａ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含み、ランディングパッドプラスミドまたはその一部の相同組換え部位が、異なるゲノム座位においてランディングパッド内で親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡ中の異なるゲノム座位においてランディングパッドの内部の場所におけるランディングパッドプラスミドまたはその一部を組み込む、組み込むこと、ならびに、
（ｂ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、ランディングパッド細胞のゲノム内に第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことであって、発現プラスミドが、（１ｂ）ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、（２ｂ）（１ｂ）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳとを含み、ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、組み込むこと
を含む方法も開示される。

【0015】

また、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、
（ａ）親細胞株における第１のホットスポット場所から親プラスミドの少なくとも一部を除去すること、および、
（ｂ）相同組換えまたはランダム組み込みを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内の第２のホットスポット場所にランディングパッドプラスミドを組み込むことであって、相同組換えまたはランダム組み込みのために標的化される配列が、ランディングパッドプラスミドに存在したものであり、各ランディングパッドプラスミドが、（１ｂ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（２ｂ）（１ｂ）ポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、（３ｂ）親細胞株ゲノム内の対応する相同組換え部位と相同である、ＳＳＲＳ（２ｂ）に対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含む、組み込むこと
を含む方法も提供される。

【0016】

また、発現細胞を生成する方法であって、
（ａ）親細胞株における第１のホットスポット場所から親プラスミドまたはその一部を除去すること、
（ｂ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内の第２のホットスポット場所にランディングパッドプラスミドを組み込むことであって、相同組換えのために標的化される配列が、親細胞株に存在したものであり、各ランディングパッドプラスミドが、（１ｂ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（２ｂ）（１ｂ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、（３ｂ）親細胞株中の対応する相同組換え部位と相同である、（２ｂ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含み、ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親細胞株の対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、組み込むこと、ならびに、
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、ランディングパッド細胞のゲノム内にＧＯＩプラスミドを組み込むことであって、発現プラスミドが、（１ｃ）第１ ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、（２ｃ）（１ｃ）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳとを含み、ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、組み込むこと
を含む方法も提供される。

【0017】

上記で開示した方法のいくつかの態様において、ランディングパッド細胞は、記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－、または、
－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－
［ここで、
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｍ］は、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを有するプラスミドを含む。

【0018】

上記で開示した方法のいくつかの態様において、発現細胞に組み込まれるプラスミドのトポロジーは、記述：
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２
、
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応する。

【0019】

上記で開示した方法のいくつかの態様において、相同組換えは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、またはＺＦＮシステムによって媒介される。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む。上記で開示した方法のいくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼ組換え部位（ＳＳＲＳ）は、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位、またはセリン－インテグラーゼ部位である。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ３、またはＢ３ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位は、λ（ラムダ）、ＨＫ０２２、またはＨＰ１ Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位を含む。いくつかの態様において、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位は、γδ（ガンマデルタ）、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、またはＧｉｎセリン－リゾルバーゼ／インテグラーゼ部位を含む。いくつかの態様において、セリン－インテグラーゼ部位は、ＰｈｉＣ３１、Ｂｘｂ１、またはＲ４セリン－インテグラーゼ部位を含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、ＬｏｘＰ部位である。いくつかの態様において、ＬｏｘＰ部位は、配列番号１に定める核酸配列（野生型ＬｏｘＰ）を含む。いくつかの態様において、ＬｏｘＰ部位は、突然変異型ＬｏｘＰ部位を含む。いくつかの態様において、突然変異型ＬｏｘＰ部位は、配列番号２に定める核酸配列（突然変異型ＬｏｘＰ）を含む。いくつかの態様において、突然変異型ＬｏｘＰ部位は、配列番号３（Ｌｏｘ ５１１）、配列番号４（Ｌｏｘ ５１７１）、配列番号５（Ｌｏｘ ２２７２）、配列番号６（Ｌｏｘ Ｍ２）、配列番号７（Ｌｏｘ Ｍ３）、配列番号８（Ｌｏｘ Ｍ７）、配列番号９（Ｌｏｘ Ｍ１１）、配列番号１０（Ｌｏｘ ７１）、および配列番号１１（Ｌｏｘ ６６）からなる群から選択される核酸を含む。いくつかの態様において、突然変異型ＬｏｘＰ部位は、本明細書において開示されるいずれかのＬｏｘＰ部位を含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｆｌｐ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、短いフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ：ｆｌｉｐｐａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔ）部位である。いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、本明細書において開示されるいずれかのＦＲＴ部位配列を含む。いくつかの態様において、セリン－インテグラーゼ部位は、ａｔｔ部位、例えば、ａｔｔＰまたはａｔｔＢ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、本願において開示されるいずれかのａｔｔ部位を含む。

【0020】

上記で開示した方法のいくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）および／またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列は、薬物耐性遺伝子である。いくつかの態様において、薬物耐性遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様において、抗生物質耐性遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子である。いくつかの態様において、ピューロマイシン耐性遺伝子は、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列は、タンパク質を構成する。いくつかの態様において、タンパク質は、蛍光タンパク質である。いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＡｃＧＦＰ１、ＥＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＡｃＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＢａｎａｎａ、ＹＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、またはそれらのいずれかの組合せを含む。

【0021】

上記で開示した方法のいくつかの態様において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ＨＥＫ２９３またはＮＳ０である。

【0022】

上記で開示した方法のいくつかの態様において、ＧＯＩをコードする核酸は、少なくとも１つのポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、抗体または融合タンパク質である。いくつかの態様において、発現プラスミドは、１コピー、２コピー、もしくは３コピー以上のＧＯＩ、検出可能マーカー、またはそれらの組合せを含む。

【0023】

いくつかの態様において、上記で開示した方法は、ＧＯＩ、検出可能マーカー、またはそれらの組合せの発現を決定することをさらに含む。いくつかの態様において、ＧＯＩの発現は、定量的におよび／または定性的に決定される。いくつかの態様において、ＧＯＩの発現は、細胞選別、ＦＡＣＳ、細胞表面染色、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス、ＵＶ吸光度、免疫組織化学、細胞サイズ、分泌タンパク質レベル、転写物レベル、またはそれらのいずれかの組合せによって決定される。

【0024】

本明細書において開示される方法のいくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミドは、１のコピー数で細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のコピー数で細胞のゲノムに組み込まれる。

【0025】

本明細書において開示される方法のいくつかの態様において、（ｉ）５’相同組換え部位は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含むか、（ｉｉ）５’相同組換え部位は、配列番号１１４のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１１５のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含むか、または、（ｉｉｉ）５’相同組換え部位および３’相同組換え部位は、親プラスミドにフランキングするポリヌクレオチド配列を含む。

【0026】

本明細書において開示される方法のいくつかの態様において、親プラスミドは、抗体などの第１ ＧＯＩをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。

【0027】

本開示は、記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２、
－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－、または、
－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｍ］は、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを有するプラスミドを含む、
ランディングパッド細胞を提供する。

【0028】

本開示は、記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２、
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ_２、または、
ＣＧ_１／－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_２
［ここで
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを持つプラスミドを含む発現細胞を提供する。

【0029】

本開示は、本明細書において開示される方法のいずれかによって生産された細胞株を提供する。また、本明細書において開示される細胞または本明細書において開示される方法のいずれかに従って生成された細胞と、それらの使用に関する説明書とを含むキットも提供される。

【0030】

本開示はまた、細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、当該座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、単離細胞を提供する。

【0031】

また、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞に導入することと、ＣＨＯ細胞のゲノムの特定座位において当該核酸が組み込まれたＣＨＯ細胞を得ることとを含む方法であって、当該座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、方法も提供される。また、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含む細胞を用意することを含む方法であって、当該ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結された目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含み、当該核酸が、ＣＨＯ細胞のゲノムの特定座位において組み込まれ、当該座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、方法も提供される。本明細書において開示される方法または単離細胞のいくつかの態様において、（ｉ）配列番号２０の中のヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列を含むか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中のヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列を含む。本明細書において開示される方法または単離細胞のいくつかの態様において、（ｉ）配列番号２０の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列からなるか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列からなる。本明細書において開示される方法または単離細胞のいくつかの態様において、（ｉ）配列番号２０の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列に対して上流の（配列番号２０の５’末端の方の）部分配列であるか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列に対して上流の（配列番号１１６の５’末端の方の）部分配列である。本明細書において開示される方法または単離細胞のいくつかの態様において、（ｉ）配列番号２０の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列に対して下流の（配列番号２０の３’末端の方の）部分配列であるか、または（ｉｉ）配列番号１１６の中からのヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列に対して下流の（配列番号１１６の３’末端の方の）部分配列である。

【0032】

いくつかの態様において、本明細書において開示される方法、細胞、細胞株、またはキットは、少なくとも２つのランディングパッドプラスミドまたは少なくとも２つの発現プラスミドを含むか、またはそれらの使用を含む。いくつかの態様において、２つのランディングパッドプラスミドまたは２つの発現プラスミドは、ヘッド・トゥ・ヘッド、テール・トゥ・テール、テール・トゥ・ヘッド、およびヘッド・トゥ・テールからなる群から選択される構成にある。いくつかの態様において、各発現プラスミドは、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を少なくとも含む。いくつかの態様において、すべてのＧＯＩが同じである。いくつかの態様において、すべてのＧＯＩが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのＧＯＩは残りと異なっている。いくつかの態様において、第１ ＧＯＩは抗体の重鎖（ＨＣ）を含み、第２ ＧＯＩは抗体の軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの発現プラスミドはバイシストロン性である。いくつかの態様において、バイシストロン性発現プラスミドは、抗体のＨＣを含む第１ ＧＯＩと、抗体のＬＣを含む第２ ＧＯＩとをコードする。いくつかの態様において、少なくとも１つのランディングパッドプラスミドは、アドレス指定可能である。いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、２つのＬｏｘ部位を含む。いくつかの態様において、Ｌｏｘ部位は、Ｌｏｘ ＰおよびＬｏｘ ５１１である。いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、Ｌｏｘ部位およびＦｒｔ部位を含む。いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、１つまたは２つのａａｔ部位を含む。いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、アドレス指定可能である。いくつかの態様において、各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドが、ランディングパッドに対してユニークである一対のアドレス指定可能ＳＳＲＳを含む。いくつかの態様において、少なくとも一対のアドレス指定可能ＳＳＲＳは、一対のＬｏｘ部位である。いくつかの態様において、少なくとも一対のＬｏｘ部位は、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐである。いくつかの態様において、少なくとも一対のＬｏｘ部位は、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ ｍ７である。いくつかの態様において、第１のアドレス指定可能ランディングパッドプラスミドは、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ部位のＬｏｘ Ｐの対を含み、第２のアドレス指定可能ランディングパッドプラスミドは、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ部位のＬｏｘ ｍ７の対を含む。いくつかの態様において、各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドが、非相互適合性（ｎｏｎ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ａｔｔ部位を含む。

【0033】

本開示はまた、細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、当該座位が、配列番号２０もしくは配列番号１１６またはそれらのオルソロガス配列の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、細胞を提供する。また、細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、当該座位が、配列番号２１もしくは配列番号１１７またはそれらのオルソロガス配列の中のヌクレオチド位置またはポリヌクレオチド部分配列である、細胞も提供される。また、細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、当該座位が、配列番号２０もしくは配列番号１１６またはそれらのオルソロガス配列と重なるか、あるいはそれを包含するポリヌクレオチド部分配列である、細胞も提供される。また、細胞のゲノムの特定座位において組み込まれた、目的遺伝子（ＧＯＩ）、選択マーカー、検出可能マーカー、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞であって、当該座位が、配列番号２１もしくは配列番号１１７またはそれらのオルソロガス配列と重なるか、あるいはそれを包含するポリヌクレオチド部分配列である、細胞も提供される。いくつかの態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの態様において、オルソロガス配列は、配列番号２０、２１、１１６、１１７、またはそれらの部分配列との約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの実行を使用したペアワイズアラインメントによって決定される。いくつかの態様において、細胞は、２つのランディングパッドプラスミドまたは２つの発現プラスミドを含む。いくつかの態様において、細胞は、３つ以上のランディングパッドプラスミドまたは３つ以上の発現プラスミドを含む。いくつかの態様において、２つのランディングパッドプラスミドは、アドレス指定可能である。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、細胞に発現プラスミドをトランスフェクトした結果、それが細胞のゲノム内のランダムな場所で組み込まれる、標準的な発現細胞株造成方策を描写する概略表現である。

【図2】図２は、ランディングパッド細胞造成に好適な２つの親細胞株を同定するために使用した方策を概括する。親細胞株１および２は、それぞれ、タンパク質１およびタンパク質２に対する指向性を持つ親プラスミド由来のモノクローナル抗体を発現する細胞株である。矢印およびＧＳはグルタミンシンテターゼ相補性を表す。ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖；コピー数＝細胞株における発現プラスミド数（各発現プラスミドがＬＣおよびＨＣの発現カセットを含有する。コピー数はＧＡＰＤＨを内部対照として使用したｑＰＣＲにより決定した）；ｓｐＰＣＲ＝スプリンケレットＰＣＲ（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔ ＰＣＲ）（プラスミドジャンクション配列の同定を可能にする技術）。ＬＣ ＲＮＡおよびＨＣ ＲＮＡのレベルは、タンパク質１に対する抗体について見出されたレベルに対して正規化した（すなわち、タンパク質１に対する抗体＝１．００）。

【図3】図３は、細胞株１および細胞株２の両方において見出された構成を示す親プラスミドの簡略化された描写である。両細胞株における親プラスミドがヘッド・トゥ・テール構成にある。細胞株１および細胞株２における構成は、サザンブロット分析、およびプラスミドとプラスミドの融合が検出されたプラスミド配列ジャンクションの決定によって確立された。矢印およびＧＳは、グルタミンシンテターゼ相補性を表す。

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、ＬｏｘＰなどの部位指向性組換え部位を含むランディングパッド細胞株を生成するための２つの方策を示す。両方策において、ランディングパッドプラスミドは、鋏によって表されるＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などの部位特異的ヌクレアーゼにより親細胞株のゲノムを制限することによって刺激される相同組換えによって細胞に導入される。図４Ａでは、親細胞株が、その性能、および発現プラスミド／カセットがそのゲノム内に見出される部位の数に基づいて同定されている。図４Ｂでは、図４Ａの親細胞株がランディングパッド細胞株として使用されている。図４Ａおよび４Ｂの両方において、細胞ゲノムの配列の知識が必要とされ、細胞ゲノムと相同である配列（相同性１、相同性２）が、発現カセットにフランキングするようにクローニングされる。ｍＣｈｅｒｒｙは、蛍光マーカーをコードするオープンリーディングフレームを表し、ＬｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって使用される配列であり、矢印およびＧＳは、グルタミンシンテターゼ相補性を表し、矢印およびＰｕｒｏは、ピューロマイシン耐性を表す。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、本開示の汎用性（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ＴＩ方策を概略的に提示する。本明細書において開示されるＴＩ技術は、第２のＤＮＡとの相同組換えを刺激するための、親細胞株における（図５Ａ）、またはランディングパッド細胞株における（図５Ｂ）、親プラスミド配列に対する指向性を持つ部位特異的エンドヌクレアーゼの使用を含む。親細胞株（図５Ａ）は、ランディングパッド細胞株（図５Ｂ）として機能することもできる。これらの方策は、ゲノム配列の知識および使用が必要とされる技術とは対照的である（例えば、図４Ａおよび４Ｂを参照されたい）。ゲノム配列の隣りにある縦線および波線の付いたボックスは、異なるプラスミドの間の相同性の領域を表す。各相同性領域の隣りにある黒塗りのボックスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって標的化される、図５Ａの親細胞株または図５Ｂのランディングパッド細胞株には存在するが、これらの細胞株中に組換えられるプラスミドには存在しない配列である。鋏は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを表し、ｍＣｈｅｒｒｙオープンリーディングフレームは、蛍光マーカーをコードし、ＬｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって使用される配列であり、矢印およびＧＳは、グルタミンシンテターゼ相補性を表し、矢印およびＰｕｒｏは、ピューロマイシン耐性を表す。図５Ｃは、本明細書において開示される方法に従って生成された発現細胞における発現プラスミド（Ｐ４）の配列編成を描写する。これらの略図は、親プラスミド（Ｐ１）、ランディングパッドプラスミド（Ｐ２）、および第２ ＧＯＩプラスミド（Ｐ３）から生じる配列の場所を示す。「細胞ゲノム」はフランキングゲノム配列を示す。図５Ｄは、単一のＳＳＲＳ部位を使用する汎用性ＴＩ方策を示す。ここでは、部位特異的エンドヌクレアーゼが、親細胞株における親プラスミド配列に対する指向性を持ち、相同組換えを刺激する。ゲノム配列の隣りにある縦線および波線の付いたボックスは、異なるプラスミドの間の相同性の領域を表す。各相同性領域の隣りにある黒塗りのボックスは、配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって標的化される、親細胞株には存在するが、これらの細胞株中に組換えられるプラスミドには存在しない配列である。ランディングパッド細胞株には単一のＳＳＲＳ部位が存在し、ここでは一例としてａｔｔＢを使用して示されている。単一のＳＳＲＳ部位を通して、ＧＯＩプラスミド（Ｐ３）が標的化座位に挿入される。鋏は、配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを表し、ｍＣｈｅｒｒｙオープンリーディングフレームは、例示的な蛍光マーカーをコードし、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位は、インテグラーゼによって使用される配列である。矢印はプロモーターを表し、ＧＳはグルタミンシンテターゼ相補性を表す。ＡｎはポリＡシグナル配列である。ｍＡｂは、特有のプロモーターおよびポリＡシグナルを含むモノクローナル抗体発現カセットである。図５Ｅは、ランディングパッドを作出する相同組換えのために細胞ゲノム配列を使用するＴＩ方策を示す。ここでは、部位特異的エンドヌクレアーゼが、細胞ゲノム配列に対する指向性を持ち、相同組換えを刺激する。ゲノム配列は、ランディングパッドプラスミドと親細胞との間の相同性の領域を表す。各相同性領域の隣りにある黒塗りのボックスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって標的化される、親細胞株には存在するが、これらの細胞株中に組換えられるプラスミドには存在しない配列である。ランディングパッド細胞株には単一のＳＳＲＳ部位が存在し、ここでは一例としてａｔｔＢを使用して示されている。単一のＳＳＲＳ組換えを通して、ＧＯＩプラスミド（Ｐ３）が標的化座位に挿入される。鋏は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを表し、ｍＣｈｅｒｒｙオープンリーディングフレームは、蛍光マーカーをコードする。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位は、インテグラーゼによって使用される配列である。矢印はプロモーターを表し、ＧＳはグルタミンシンテターゼ相補性を表す。ＡｎはポリＡシグナル配列である。ｍＡｂは、特有のプロモーターおよびポリＡを含むモノクローナル抗体発現カセットを表す。図５Ｆは、図５Ｅに記述される方法に従って、または新しいゲノム座位へのランダム組み込みを使用して生成された、発現細胞株における発現プラスミド（Ｐ５）の配列編成を描写する。これらの略図は、ランディングパッドプラスミド（Ｐ２）および第２ ＧＯＩプラスミド（Ｐ３）から生じる配列の場所を示す。「細胞ゲノム」はフランキングゲノム配列を示す。プラスミドＰ１は完全に除去されているか座位に存在しないかのいずれかであるため、この発現プラスミド構成にはＰ１部分がない。

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、本開示に係るランディングパッド細胞株の生成を概括する。図６Ａは、親細胞株におけるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコードするプラスミドを、ランディングパッドプラスミドのタンパク質（例えば、ＬｏｘＰ部位によってフランキングされたｍＣｈｅｒｒｙおよびピューロマイシン耐性遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを含む線状プラスミド）の一部に置き換えることによる、マーカー（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現するランディングパッド細胞株の生成を示す。図６Ａ中の構成要素の説明は、上記の図５Ａおよび５Ｂの説明に見出すことができる。図６Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術に必要なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の存在によって刺激されたｍＣｈｅｒｒｙランディングパッド細胞株の生成における頻度の増加を示す。単一のｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットが存在し、ｍＡｂが存在しないという、所望の表現型を有するクローンのパーセント（約２５％）。ＴＩのために使用されたランディングパッド細胞株は、その発現レベル（平均蛍光強度ＭＦＩ）、転写物レベル、および細胞を継代した際のこれら２つのパラメータの安定性によって同定された。

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂの細胞において提示された標的化組み込みの方法論の実際の適用を示す。図７Ａでは、ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼの使用により、タンパク質３に対する抗体（ｍＡｂ３）を発現するものに交換している。ｍＡｂ３のみを発現した細胞を、Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ（ＢＬ）およびＦＡＣＳ技術によって単細胞クローニングした。ＡＭＢＲ（登録商標）１５、ＡＭＢＲ（登録商標）２５０バイオリアクターシステムにおいて、かつ２４ディープウェルフェドバッチ（２４ＤＷ ＦＢ）により、細胞を増殖させ、タンパク質発現について評価した。図７Ｂは、ＧＳ相補性についての選択後の結果として得られた細胞集団を、タンパク質３の細胞表面発現（縦軸）、およびｍＣｈｅｒｒｙの発現（横軸）について、ＦＡＣＳによってスクリーニングしたことを示す。細胞の５．２４％はタンパク質３のみを発現し、９０．０６％は両タンパク質を発現し、４．１２％はｍＣｈｅｒｒｙのみを発現し、０．６８％はいずれのタンパク質も発現しなかった。タンパク質３に対するｍＡｂ（ｍＡｂ３）の細胞表面染色だけがある細胞が、所望の細胞である。スクリーニングしたクローンから得られた生産性は、ＦＡＣＳデータの隣りにある文章に概括されている。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、４つの異なる方策（方策Ａ、方策Ｂ、方策Ｃ、および方策Ｄ）を使用して実行され得る汎用性標的化組み込み（ＵＴＩ）技術を概括する。本明細書において開示される汎用性ＴＩ技術は、ランディングパッドプラスミドとの相同組換えを刺激するための、ランディングパッドプラスミドには存在しない、親細胞株における親プラスミド配列に対する指向性を持つ部位特異的エンドヌクレアーゼの使用を含む。この方策の利点は、フランキングゲノムＤＮＡ配列の知識が必要ないことである。図８Ａに描写されるようなこのＵＴＩ技術では、親細胞株における親発現プラスミドが、ランディングパッドによって置き換えられるか（方策Ａ）、または親発現プラスミドが欠失して、ランディングパッドが細胞ゲノム内の代替的座位に挿入される（方策Ｂ）。両方の場合において、組換えを刺激するために部位特異的エンドヌクレアーゼが使用される。ランディングパッド細胞株が作出されたら、これが、Ｃｒｅリコンビナーゼの使用によりランディングパッドが第２ ＧＯＩに置き換えられた発現細胞株を作製するために使用される。図８Ｂに描写されるようなこのＵＴＩ技術では、方策Ｃおよび方策Ｄにおいて発現細胞株を作出するために、単一のＳＳＲＳ部位が使用される。縦線および波線の付いたボックスは、異なるプラスミドの間の相同性の領域を表す。黒塗りのボックスは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって標的化される、親発現プラスミドには存在するが、これらの細胞株中に組換えられるプラスミドには存在しない配列を表す。鋏は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを表す。ｍＣｈｅｒｒｙオープンリーディングフレームは、蛍光マーカーをコードする。ＬｏｘＰおよびＬｏｘ５１１部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって使用される配列である。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位は、インテグラーゼによって使用される配列である。矢印およびＧＳは、ＧＳ相補性をコードする。矢印およびＰｕｒｏは、ピューロマイシン耐性をコードする。これら４つの代替的方策の描写は、例示的であり、図面に示される構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位）は、本明細書において開示される機能的均等物に置き換えられ得る。

【図9】図９は、図８Ａおよび８Ｂに示される方策を使用したランディングパッド細胞株の作製におけるデータの概要を示す。写真は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術に必要なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の存在によって刺激されたｍＣｈｅｒｒｙランディングパッド細胞株の生成における頻度の増加を示す。２５％のパーセントのクローンが、ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットが存在し、親細胞株からのｍＡｂが存在しないという、所望の表現型を有する。ＴＩのために使用されたランディングパッド細胞株は、それらのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子コピー数、発現レベル（平均蛍光強度ＭＦＩ）、転写物レベル、および細胞を継代した際のこれら２つのパラメータの安定性によって同定された。

【図10】図１０は、ｍＡｂの軽鎖２コピーおよび重鎖２コピーをコードする第２ ＧＯＩプラスミドならびにＣｒｅをコードするプラスミドを使用して発現細胞株を構築するために１２個のランディングパッド細胞株を使用した実験の結果を概括する。発現細胞株のパーセントは、選択後のバルク培養物中のｍＣｈｅｒｒｙ陰性［Ｒｅｄ（－）］細胞のパーセントである。

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、細胞株造成を経た５つのランディングパッド細胞株を使用した実験の結果を概括する。単細胞クローニング後、各ランディングパッド細胞株から３２個の発現細胞株をランダムに選定し、増殖させ、２４ディープウェルプレート（ＤＷＰ）での１４日間のフェドバッチアッセイにおいて試験した。これは、ランディングパッド細胞株の潜在力の総合的な特性解析を可能にする。データは図１１Ａに概括され、図１１Ｂに箱ひげ図で表されている。

【図12】図１２Ａは、ヘッド・トゥ・ヘッドのデュオランディングパッド（ｄｕｏ－ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ）構成を示す。各ランディングパッドが、指向性組換えのための２つの別個のＳＳＲＳ部位を含有する。組換えにより、各ランディングパッド座位に１つのＧＯＩ（ｍＡｂ）が挿入された。結果として得られたｍＡｂ発現プラスミドは、依然としてヘッド・トゥ・ヘッド構成にある。図１２Ｂは、デュオランディングパッド構成、およびデュオランディングパッドに対するＣｒｅリコンビナーゼの影響の描写である。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。両方のランディングパッドがＬｏｘＰおよびＬｏｘ５１１を使用する。ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成は、Ｃｒｅの存在下でインタクトな状態を保つ。他の２つの構成では、ランディングパッドの一方が恒久的に欠失し得る。２つ以上のランディングパッドを有することの目的は、例えば、二重特異性ｍＡｂを作製し、力価を上昇させることを可能にすることである。同じ調節性配列（例えば、同じプロモーター）の制御下にあるとき、複数のランディングパッドは、同じ活性を有する確率が高い。いくつかの態様において、複数のランディングパッドが、例えば、３つ、４つまたはそれよりも多くが、１：１の比率で、または１：２もしくは２：１などの代替的比率で存在し得る。

【図13】図１３は、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールのデュオランディングパッド構成における第２ ＧＯＩのＴＩの結果を示す。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。両方のランディングパッドがＬｏｘＰおよびＬｏｘ５１１を使用する。第２ ＧＯＩは黒塗りの長方形として示されている。両方の場合において、発現細胞株は２つの第２ ＧＯＩを有する。

【図14】図１４は、テール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールのデュオランディングパッド構成における第２ ＧＯＩのＴＩの結果を示す。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。両方のランディングパッドがＬｏｘＰおよびＬｏｘ５１１を使用する。第２ ＧＯＩは黒塗りの長方形として示されている。両方の場合において、２つの異なる発現細胞株が作出され、その１つは第２ ＧＯＩを１つ有し、２つ目は第２ ＧＯＩを２つ有する。

【図15】図１５は、ＦｒｔおよびＬｏｘ部位を含むデュオランディングパッド構成、ならびにデュオランディングパッドに対するＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼの影響の描写を示す。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。両方のランディングパッドがＬｏｘＰおよびＦｒｔを使用する。ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成は、Ｃｒｅ＋Ｆｌｐの存在下でインタクトな状態を保つ。他の２つの構成では、ランディングパッドの一方が恒久的に欠失し得る。これは、図１２Ｂにおいて観察されたものに相当する。

【図16】図１６は、すべてのランディングパッドにフランキングするように同じａａｔＰ部位を使用するデュオランディングパッド構成、ならびに第２ ＧＯＩプラスミドおよびＩｎｔが細胞にトランスフェクトされた後の結果の描写を示す。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。ＧＯＩは黒塗りの長方形として示されている。

【図17】図１７Ａおよび１７Ｂは、デュオランディングパッドが、所望の複合生物製剤を作製するようにアセンブリーする異なるサブユニットの発現の多様性を高めるために使用され得ることを概略的に提示する。実線および破線の矢印は、生物製剤を作製するために必要とされる異なる構成要素を表す。例示の目的で、複合生物製剤は、各矢印を少なくとも１つ必要とする。各ＧＯＩプラスミドは、異なる構成の複合生物製剤の各サブユニット、すなわち、複合生物製剤の矢印を含有し得る。第２ ＧＯＩは、異なる順序の複数の矢印または各矢印自体から構成され得る。第２ ＧＯＩプラスミドは、リコンビナーゼと併せてデュオランディングパッド細胞株にトランスフェクトされる。サブユニット発現のレベルを調整するために、異なる組合せの第２ ＧＯＩプラスミドがデュオランディングパッド細胞株にトランスフェクトされる。ＴＩが完了した後の実線矢印と破線矢印との遺伝子コピー比を１：２、１：１、および２：１にするような、第２ ＧＯＩの異なるトランスフェクションが示されている。例えば、図１７Ａの１：２比では、一方の第２ ＧＯＩが破線矢印を１コピー含み、他方の第２ ＧＯＩプラスミドが２つのうち１つの構成で実線および破線の矢印を含む。図１７Ａに示すように、これには、デュオランディングパッド細胞株の２回の独立したトランスフェクションが必要になる。これが起こり得る結果またはインプットの網羅的リストではないことは明らかである。また、サブセットのみが、すなわち１つの実線のみ、または破線矢印のみがランディングパッドに組み込まれる故に複合生物製剤が作製されない構成は示されていない。図１７Ｂは、ユニークなＳＳＲＳを持つアドレス指定可能ランディングパッドを使用する簡略図を示す。１つのランディングパッドはＬｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐから構成され、２つ目はＬｏｘ部位２２７２およびＭ３を含む。第２ ＧＯＩプラスミドは、対応するＬｏｘ部位を使用して、一方のランディングパッドまたは他方に対して特異的に標的化されることになる。

【図18】図１８は、アドレス指定可能ランディングパッドを含むデュオランディングパッドを有することの有用性を示す。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。第２ ＧＯＩプラスミドは、黒塗りの長方形または縦線付きの長方形として示されている。この例では、各ランディングパッドが、相互にしか組換わらないユニークな組合せのＬｏｘ部位によってフランキングされている。この例は説明のためのものであり、他のリコンビナーゼおよびそれらの標的部位を使用してもよい。アドレス指定可能ランディングパッドを有することで、デュオランディングパッドの４つの構成すべてが、図１２Ｂに示したようなテール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの構成におけるランディングパッドのうちの１つの喪失を起こさずに、規定の第２ ＧＯＩを有することが確実になる。

【図19】図１９は、各ランディングパッドに単一のａａｔＢ部位を含むデュオランディングパッドを有することで、ランディングパッドの欠失がなくなることを説明する図を示す。一方のランディングパッドは斜線付き矢印として示され、他方は網目パターン付き矢印として示されている。第２ ＧＯＩプラスミドは黒塗りの長方形として示されている。使用されるａｔｔＰ部位が相互適合性でなければ、デュオランディングパッドはアドレス指定可能になる。

【図20】図２０は、デュオランディングパッド細胞株を用いた標的化組み込みの概念実証（ＰＯＣ）を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを、図８ｂに概説したように、Ｃｒｅリコンビナーゼの使用により、第２ ＧＯＩ ｍＡｂ発現カセットに交換する。ＧＳ相補性選択後の結果として得られた細胞集団を、ｍＣｈｅｒｒｙの発現（横軸）およびｍＡｂの細胞表面発現（縦軸）について、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。ここでは、細胞の５．２４％がｍＡｂのみを発現し、９０．０６％が両タンパク質を発現し、４．１２％がｍＣｈｅｒｒｙのみを発現し、０．６８％はいずれのタンパク質も発現しない。

【図21】図２１は、ＧＯＩの標的化組み込みが、ランダム組み込みに対して生産性のより高い細胞をもたらすことを示す。第２ ＧＯＩプラスミド形態のｍＡｂ ＡおよびＢを、ランダム組み込みまたは標的化組み込みのいずれかにより、宿主細胞に組み込んだ。ランディングパッド細胞株は、ランダム組み込みに使用された細胞株の直系子孫である。単細胞クローニングに使用した細胞集団の力価を決定した。標的化組み込み集団は、ランダム組み込みの力価のおおよそ３倍から４倍高い力価を有し、ランダム組み込みの業界標準を凌駕し得るランディングパッド細胞株を生成するためのこの技術の価値を実証している。

【図22】図２２は、１ＬＣ＋１ＨＣまたは２ＬＣ＋２ＨＣを含む第２ ＧＯＩプラスミドを使用して発現細胞株を作製するためのデュオランディングパッド細胞株の使用の概要を示す。ｍＡｂ ＡおよびＢの１ＬＣ＋１ＨＣ、または２ＬＣ＋２ＨＣのいずれかを含む第２ ＧＯＩプラスミドをＴＩ細胞株造成において使用した。各群からの上位６クローンの生産性が示されている。両方の場合において、ＬＣおよびＨＣのコピー数を増加させることにより、平均力価が２５％～３７％改善し、力価中央値が３５％～３７％改善した。

【発明を実施するための形態】

【0035】

本開示は、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、目的遺伝子（例えば、抗体をコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレーム）を含む線状プラスミドなどの線状プラスミドを宿主細胞のゲノムに挿入することができ、その標的化挿入のために宿主細胞のゲノム配列に関する事前の知識を必要としない方法を提供する。線状プラスミドが好ましいことが多いが、環状プラスミドを使用してランディングパッド細胞を生成することもできる。

【0036】

「標的化挿入」および「標的化組み込み」という用語は交換可能に使用され、ゲノム上の特定場所に対する指向性を遺伝子または核酸配列の直接的な挿入または組み込みに持たせる、すなわち、連続するポリヌクレオチド鎖における２つのヌクレオチドの間の特定部位に対する指向性を遺伝子または核酸配列に持たせるために用いられる遺伝子標的化方法を指す。標的化挿入は、少数のヌクレオチドを導入するために行われることもあれば、例えば、複数の遺伝子、調節要素、および／または核酸配列を含む遺伝子カセット全体を導入するために行われることもある。「挿入」および「組み込み」ならびにそれらの文法的変形は、本明細書を通して交換可能に使用される。いくつかの態様において、標的化組み込みは、組換え、例えば、部位特異的組換え、相同組換え、またはそれらの組合せによって遂行され得る。

【0037】

これらの方法によれば、目的タンパク質の発現に関する有利な特性（例えば、組換え型タンパク質収量の高さ、タンパク質分解もしくはミスフォールディングの低さ、特定のグリコシル化パターン、または翻訳後修飾に関連する他の特性）を示すことが歴史的に知られている細胞株などの細胞株を親細胞株として使用することで、他の目的遺伝子を発現させるために使用され得るランディングパッド細胞株を生成することができる。親細胞株は、ホット細胞である（すなわち、高力価の組換え型タンパク質を生産する）、かつ１つまたは複数のホットスポット（目的タンパク質をコードする外来核酸の導入が問題を起こさず、高レベルの組換え型タンパク質発現をもたらすゲノム上のエリア）を有する細胞であるのが理想的である。本明細書において開示される親細胞選択プロセスの一環として、２つのホットスポットが同定された。

【0038】

親細胞株のゲノムに組み込まれた発現カセットを含む親細胞内のプラスミド（親プラスミド）は、親プラスミドに内在する２つの場所（例えば、組換え部位）の間でそれを（例えば、相同組換えによって）切除することにより（すなわち、親細胞ゲノムＤＮＡをカット／破壊することなく）部分的に除去され、切除された領域は、少なくとも１つのマーカー（例えば、選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカー）にフランキングする２つの新しい組換え部位を含む別のＤＮＡ配列（ランディングパッドプラスミド）に置き換えられる。この方法は、２つの新たに導入された組換え部位における組換えによって、異なる目的遺伝子（すなわち、親細胞に存在する目的遺伝子とは異なる目的遺伝子）を含む核酸配列（例えば、発現プラスミドまたは目的遺伝子プラスミド）を挿入するために使用され得るランディングパッド細胞をもたらす。本願では、この概略的プロセスに関連する異なる方策を開示する。

【0039】

これらの方法は本質的に汎用性であり、親プラスミドの配列の知識に基づいて、あらゆる特に有利な親細胞株をランディングパッド細胞株として使用することを可能にする。大抵は当技術分野において公知の商業的プラスミドである、親細胞株に存在するプラスミド（親プラスミド）の知識により、ランディングパッドプラスミドまたはその一部を親細胞のゲノムに導入するのに好適な組換え部位の選択が容易にできる。ひいては、ランディングパッドプラスミドにおける新たに導入された組換え部位を使用して、目的遺伝子を含む線状または環状プラスミドなどのプラスミドまたはその一部を親細胞のゲノムに組み込むことにより、発現細胞をもたらすことができる。例えば、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、および図８Ａを参照されたい。汎用性標的化組み込みの方策は、例えば、図８Ａ（方策Ａおよび方策Ｂ）および図８Ｂ（方策Ｃおよび方策Ｄ）にて描写されている。異なる構成における複数のランディングパッドを含むコンストラクトも提供され（例えば、図１２Ｂを参照されたい）、ユニークなＳＳＲＳの組合せを使用することにより、各パッドをユニークに同定することができる（例えば、図１８を参照されたい）。

【0040】

「ホット細胞株」である（すなわち、組換え型タンパク質の高い収量または別の有利な特性を有する）親細胞株を同定し、その後に親プラスミドが挿入された「ホットスポット」を同定することは、親細胞ゲノムの配列の知識を必要としない、ランディングパッド細胞を作製および使用するための方法、ならびに、これらの方法および／またはランディングパッド細胞を使用したモノクローナル抗体などの適切な代替的生物製剤の発現の改善をサポートする。

【0041】

したがって、本開示はまた、ランディングパッド細胞、ランディングパッドプラスミド、ならびに、例えばランディングパッド細胞株の生成および／または発現細胞株の生成のための試薬を含むキットを提供する。本開示は、単一のランディングパッドプラスミドを含有するランディングパッド細胞を提供することに加えて、複数のランディングパッドを含むランディングパッド細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示のランディングパッド細胞における複数のランディングパッドは、例えば、各ランディングパッドをユニークに同定する部位特異的組換え部位またはそれらの組合せを含有することにより、アドレス指定可能であり得る。

【0042】

Ｉ．用語
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語をまず定義する。本願において使用される場合、本明細書において別段明記されていない限り、以下の用語の各々は、以下に定める意味を有するものとする。さらなる定義は、本願の随所で定められる。

【0043】

「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段の記載がない限り、複数形の参照対象が含まれる。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数の」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。ある特定の態様において、「ａ」または「ａｎ」という用語は「単一」を意味する。他の態様において、「ａ」または「ａｎ」という用語は「２つ以上」または「複数」を含む。

【0044】

さらに、「および／または」は、本明細書において使用される場合、２つの特定された特徴または構成要素の各々の具体的な開示として解釈され、他方の有無を問わないものとする。よって、本明細書中の「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むよう意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、次の態様の各々を包含するよう意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

【0045】

「約」または「を本質的に含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、当業者によって決定される、特定の値または組成についての許容できる誤差範囲内にある値または組成を指し、この誤差範囲は、値または組成がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」または「を本質的に含む」は、当技術分野における慣例に従い、１または１を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」または「を本質的に含む」は、１０％までの範囲を意味し得る。さらに、生物学的システムまたはプロセスに関しては特に、これらの用語は、値の一桁まで、または５倍までを意味し得る。特定の値または組成が本願および特許請求の範囲において提供される場合、別段の定めがない限り、「約」または「を本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成についての許容できる誤差範囲以内にあると想定されるべきである。

【0046】

態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言を用いて本明細書に記述される場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を用いて記述される、さもなければ同様の態様も提供されるものと理解される。

【0047】

本明細書において使用される場合、１つまたは複数の対象値に適用される「おおよそ」という用語は、規定の参照値と同様の値を指す。ある特定の態様では、別段の定めがない限り、または文脈から別の解釈が明らかでない限り、「おおよそ」という用語は、規定の参照値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも少なく上下する（上回るまたは下回る）値の範囲を指す（ただし、そのような数が可能な値の１００％を超える場合はこの限りではない）。

【0048】

本明細書に記述される場合、いかなる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別段の記載がない限り、記載された範囲以内のあらゆる整数値を含み、適切な場合には、その分数（例えば整数の１／１０および１／１００）も含むと理解されるべきである。

【0049】

別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press、The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press、およびOxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。

【0050】

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）の認める形態にて表記される。本明細書において提供される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、本開示の諸態様は本明細書全体を参照することにより理解され得る。したがって、定義される用語は、本明細書の全体を参照することによってさらに詳細に定義される。

【0051】

本明細書において使用される略語は、本開示の随所で定義される。本開示の様々な態様については、以下の小節においてさらに詳細に記述する。

【0052】

ヌクレオチドは、一般的に認められている一文字コードによって言及される。別段の記載がない限り、核酸は、左から右に５’から３’の向きで書かれる。ヌクレオチドは、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている一般的に知られている一文字記号によって言及される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

【0053】

アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている三文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている一文字記号のいずれかによって言及される。別段の記載がない限り、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシの向きで書かれる。

【0054】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含む、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。よって、この用語には、三重鎖、二重鎖、および一重鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三重鎖、二重鎖、および一重鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。また、例えばアルキル化および／またはキャッピングによって修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに未修飾の形態のポリヌクレオチドも含まれる。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）（ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含み、スプライシングされているかスプライシングされていないかを問わない）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシドである、任意の他の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）およびポリモルホリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーが含まれるが、ただし、ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような塩基対合および塩基スタッキングを可能にする構成における核酸塩基を含有することを条件とする。

【0055】

「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は交換可能に使用され、連続する核酸配列を指す。配列は、一重鎖または二重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）のいずれであってもよい。

【0056】

本明細書において使用される場合、「部分配列」という用語は、配列（物理的配列またはその記号表現のいずれか）における連続するヌクレオチドのサブセットを指す。

【0057】

本明細書において開示される方法は、例えば、抗体などの生物製剤の生産のために使用され得る。

【0058】

本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、限定されるものではないが、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む、糖タンパク質免疫グロブリン、またはその抗原結合部分を含むものとする。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、すなわちＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、Ｃ_Ｌを含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、それらの間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が存在する。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、様々な免疫系細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。したがって、例えば、「抗ＰＤ－１抗体」という用語には、２本の重鎖および２本の軽鎖を有し、ＰＤ－１に特異的に結合する完全抗体、ならびに完全抗体の抗原結合部分が含まれる。抗原結合部分の非限定的な例は、本明細書における他の箇所で示される。本開示のいくつかの態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブまたはその抗原結合部分である。

【0059】

いくつかの態様において、抗体は二重特異性抗体である。「二重特異性抗体」は、「二重特異性分子」または「二重特異性結合分子」の特定の種類である。「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる抗原結合部位を介して少なくとも２つの抗原決定基（例えば、エピトープ）に結合することができる抗体を意味する。ある特定の態様において、二重特異性抗体は、２つの抗原決定基（例えば、エピトープ）に同時に結合することが可能である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、その結合アームのうちの１つ（一対の重鎖／軽鎖）において１つの抗原（またはエピトープ）に結合し、その第２の結合アーム（異なる一対の重鎖／軽鎖）において異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、２つの別個の抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）を有することができ、それが結合する各抗原に対して一価である。二重特異性抗体には、例えば、クアドローマ技術［Milstein & Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40］によって、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーション［Staerz et al. (1985) Nature 314(6012):628-31］によって、またはノブ・イントゥ・ホールもしくはＦｃ領域に突然変異を導入する同様の手法［Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14):6444-6448］によって生成されたものが含まれる。

【0060】

近年になって、三価または四価の二重特異性抗体など、多種多様な組換え型抗体フォーマットが造成されている。例としては、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの融合が挙げられる［異なるフォーマットについては、例えば、Coloma, M.J., et al, Nature Biotech 15 (1997), 159-163、ＷＯ２００１／０７７３４２、Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007), 1233-1234、Holliger. P. et. al, Nature Biotech. 23 (2005), 1 126-1 136、Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007), 3-14、Shen, J., et. al, J. Immunol. Methods 318 (2007), 65-74、Wu, C, et al., Nature Biotech. 25 (2007), 1290-1297を参照されたい］。二重特異性抗体には、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、ＷＯ２０１０／１４５７９３、およびＷＯ２０１１／１１７３３０において開示されている方法に従って生産された三価または四価の二重特異性抗体が含まれ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。当業者は、より高次の価数も使用され得ることを理解するであろう。

【0061】

近年になって、多種多様な組換え型二重特異性抗体フォーマットが、例えばＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの融合などによって造成されている［Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16を参照されたい］。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いにより置き換えられた二重特異性抗体は、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記述されている。

【0062】

誤対合した副産物の問題を避けるための「ノブ・イントゥ・ホール」として知られる手法は、突然変異をＣＨ３ドメイン内に導入して接触界面を修飾することにより、２つの異なる抗体重鎖を強制的に対合させることを目的とする。一方の鎖では、嵩高のアミノ酸が、短い側鎖を持つアミノ酸により置き換えられて、「ホール」が作出された。反対に、大きな側鎖を持つアミノ酸が他方のＣＨ３ドメインに導入されて、「ノブ」が作出された。これら２つの重鎖（および、両方の重鎖に対して適切でなければならない２つの同一の軽鎖）を共発現させることにより、ホモ二量体形成（「ホール・ホール」または「ノブ・ノブ」）に対して高収量のヘテロ二量体形成（「ノブ・ホール」）が観察された（Ridgway JB, Presta LG, Carter P、およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ヘテロ二量体のパーセンテージは、ファージディスプレイ手法を使用した２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面のリモデリングと、ヘテロ二量体を安定化するためのジスルフィド橋の導入とにより、さらに増加させることができた［Merchant A.M, et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681、Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35］。ノブ・イントゥ・ホール技術の新しい手法は、例えばＥＰ１８７０４５９Ａ１に記述されている。Xie, Z., et al, J Immunol Methods 286 (2005) 95-101は、Ｆｃ部に対するノブ・イントゥ・ホール技術と組み合わせたｓｃＦｖを使用する二重特異性抗体のフォーマットに言及している。Godar et al. (2018) “Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017)” Expert. Opin. Ther. Pat. 28(3):251-276、およびBrinkmann & Kontermann (2017) “The making of bispecific antibodies” mAbs 9:182-212を参照されたい。これらはいずれも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、Ridgway et al (1996) Protein Eng 9:617-21、Atwell et al (1997) J. Mol. Biol. 270:26-35、Merchant et al (1998) Nat. Biotechnol. 16:677-681、Moore et al (2011) MAbs 3:546-55、Von Kreudenstein et al (2013) MAbs 5:646-54、Gunasekaran et al (2010) J. Biol. Chem. 285:19637-47、Geuijen et al (2014) J. Clin. Oncology 32:suppl:560、Strop et al (2012) J. Mol. Biol. 420:204-19、Choi et al (2013) Mol. Cancer Ther. 12:2748-59、Choi et al (2015) Mol. Immunol. 65:377-83、Labrijn et al (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:5145-50、Davis et al (2010) Protein Eng. 23:195-202、Moretti et al (2013) BMC Proceedings 7(Suppl 6):O9、およびLeaver-Fey et al (2016) Structure 24:641-51を参照されたい。これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。軽鎖対合の方策は、例えば、Schaefer et al (2011) Proc Natl Acad Sci U S A. 108(27):11187-92、Lewis et al. (2014) Nat Biotechnol. 32(2):191-8、Mazor et al. (2015) MAbs. 7(2):377-89、Liu et al. (2015) J Biol Chem. 290(12):7535-62、Dillon et al. (2017) MAbs. 9(2):213-230、および米国特許第９，９１４，７８５号において開示されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0063】

免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むがこれらに限定されない、広く知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「抗体」という用語には、例として、自然において存在する抗体と自然において存在しない抗体の両方、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ヒト抗体または非ヒト抗体、完全に合成の抗体、ならびに単鎖抗体が含まれる。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低減するために組換え法によってヒト化され得る。明記されていない場合は、文脈上別段の記載がない限り、「抗体」という用語は、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合部分も含み、一価および二価のフラグメントまたは部分、ならびに単鎖抗体も含む。

【0064】

「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＰＤ－１などの抗原に特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ－１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＰＤ－１に特異的に結合する単離抗体は、異なる種からのＰＤ－１分子のような他の抗原との交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。

【0065】

「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、単一分子組成の抗体分子、すなわち、一次配列が本質的に同一であり、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を呈する抗体分子の、自然において存在しない調製物を指す。モノクローナル抗体は単離抗体の一例である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、組換え技法、トランスジェニック技法、または当業者に公知の他の技法によって生産することができる。

【0066】

「ヒト抗体」（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基［例えば、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の体細胞突然変異によって導入される突然変異］を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むことを意図してはいない。「ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」という用語は同義に使用される。

【0067】

「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体のＣＤＲ外のアミノ酸の一部、大部分、または全部が、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸に置き換えられた抗体を指す。ヒト化型の抗体の一態様では、ＣＤＲ外のアミノ酸の一部、大部分、または全部が、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸に置き換えられているが、１つまたは複数のＣＤＲの中のアミノ酸の一部、大部分、または全部は変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換、または修飾は、特定の抗原に結合する抗体の能力を消失させない限り許容可能である。「ヒト化抗体」は、元の抗体の抗原特異性と同様の抗原特異性を保持する。

【0068】

「キメラ抗体」とは、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体を指す。

【0069】

「抗抗原抗体」は、抗原に特異的に結合する抗体を指す。例えば、抗ＰＤ－１抗体はＰＤ－１抗原に特異的に結合し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する。

【0070】

抗体の「抗原結合部分」（「抗原結合フラグメント」とも呼ばれる）は、全抗体が結合する抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などの抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（パパイン切断からのフラグメント）、またはＶ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインからなる同様の一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ペプシン切断からのフラグメント）、またはヒンジ領域にてジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む同様の二価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の片腕のＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント［Ward et al., (1989) Nature 341:544-546］；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーにより接合されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖（Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成したもの）にすることができる合成リンカーにより、それらを接合させることができる［単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426、およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい］。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的な切断によって生産され得る。

【0071】

いくつかの態様において、生物製剤は、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、生物製剤は、酵素、受容体、受容体リガンド、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、構造タンパク質、調節性タンパク質、ワクチン、成長因子、ホルモン、またはサイトカインである。いくつかの態様において、生物製剤は、１つまたは複数の異種部分、例えば、生物製剤の血漿半減期を延長するための部分、膜もしくは脳血液関門を横断する輸送を円滑化するための部分、クリアランス速度を増大もしくは減少させるための部分、または生物製剤に、特定の細胞もしくは組織型に対する指向性を持たせるための部分（すなわち、標的化部位）を含むことができる。

【0072】

本明細書において開示される、「単離」されているポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、またはいずれかの組成物は、天然に見出されない形態にあるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物には、それらが天然に見出される形態ではなくなる程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離されているポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。

【0073】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、修飾されたアミノ酸を含み得る。これらの用語には、天然に、または介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの何らかの他の操作もしくは修飾により修飾された、アミノ酸ポリマーも包含される。この定義には、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）、および当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。

【0074】

２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の「パーセント配列同一性」という用語は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮に入れた、比較ウィンドウにおいて当該配列が共有する同一のマッチする位置の数を指す。マッチする位置とは、標的配列と参照配列との両方において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が現れる任意の位置である。ギャップはヌクレオチドでもアミノ酸でもないので、標的配列に現れるギャップはカウントされない。同様に、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるので、参照配列に現れるギャップはカウントされない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する際、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は均等とみなされ得る。

【0075】

配列同一性のパーセンテージは、両配列において同一のアミノ酸残基または核酸塩基が生じる位置の数を決定して、マッチする位置の数を求め、マッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出される。配列の比較および２配列間のパーセント配列同一性の決定は、オンライン使用とダウンロードとの両方で容易に利用可能なソフトウェアを使用して達成することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から、タンパク質およびヌクレオチドの両方の配列のアラインメントのために利用可能である。パーセント配列同一性を決定するための好適なプログラムの１つはｂｌ２ｓｅｑであり、これは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（blast.ncbi.nlm.nih.gov）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰのいずれかのアルゴリズムを使用して２配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、これらは、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、また、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からwww.ebi.ac.uk/Tools/psaにおいて入手可能である。

【0076】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインする単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列の中の異なる領域は、各々、特有のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は小数第１位に丸められることは注記すべき点である。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は８０．１に丸められ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は８０．２に丸められる。長さの値は常に整数になることも注記すべき点である。

【0077】

ある特定の態様において、第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の、第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対するパーセンテージ同一性「％ＩＤ」は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、式中、Ｙは、第１および第２の配列のアラインメントにおいて（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによりアラインされた場合に）同一のマッチとしてスコアリングされるアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長ければ、第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は、第１の配列に対する第２の配列のパーセント同一性よりも高くなる。

【0078】

当業者には理解されるであろうが、パーセント配列同一性の算出のための配列アラインメントの生成は、もっぱら一次配列データによって決められるバイナリの配列間比較に限定されない。また、例えば構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異の場所）、または系統学的データのような異質なソースからのデータと、配列データを統合することにより、配列アラインメントが生成され得ることも理解されるであろう。多重配列アラインメントを生成するために異質データを統合する好適なプログラムにはＴ－Ｃｏｆｆｅｅがあり、これはwww.tcoffee.orgにおいて入手可能であり、代替的には、ＥＢＩなどからも入手可能である。また、パーセント配列同一性を算出するために使用される最終的なアラインメントが自動または手動でキュレートされ得ることも理解されるであろう。

【0079】

「遺伝子」、「コーディング配列」、「エンコーディング核酸」、「オープンリーディングフレーム」、「ＯＲＦ」という用語、およびそれらの文法的変形は、本開示では交換可能に使用され、大抵は抗体のような生物製剤などのタンパク質である目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指す。コーディング配列には、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞における発現に指向性を持たせることが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に連結された開始シグナルおよび終結シグナルがさらに含まれ得る。コーディング配列はコドン最適化されていてもよい。

【0080】

本明細書において使用される場合、「目的遺伝子」という用語は、「ＧＯＩ」と略され、本明細書において開示される細胞によって発現される外因性タンパク質を指す。いくつかの態様において、ＧＯＩは、生物製剤、例えば抗体またはその一部である。いくつかの態様において、ＧＯＩは、例えば、１つもしくは複数のプロモーターおよび／または他の調節性配列に作動可能に連結された、１つまたは複数の組換え型タンパク質をコードする、１つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される細胞は、第１ ＧＯＩを含有することができ、これは、第２ ＧＯＩによって置き換えられ得る。いくつかの態様において、第１ ＧＯＩ（例えば、親プラスミド上に位置するＧＯＩ）および第２ ＧＯＩ（例えば、第２ ＧＯＩプラスミド上に位置するＧＯＩ）は、同じ分子クラスに属する。例えば、第１ ＧＯＩが抗体であった場合、親細胞株はその種類の組換え型タンパク質を効率的に発現したので、第２ ＧＯＩも抗体であり得る。いくつかの態様において、ＧＯＩは、治療用核酸などの核酸である。いくつかの態様において、ＧＯＩおよびＯＲＦという用語は、特にＧＯＩが単一のＯＲＦによってコードされる場合は、交換可能に使用され得る。いくつかの態様において、ＧＯＩは、２つ以上のＯＲＦによってコードされ得る。いくつかの態様において、ＧＯＩは、検出可能な分子、例えば、マーカーであり得る。

【0081】

本明細書において使用される「相補体」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン－クリック型（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン型の塩基対合を指す。「相補性」は、２つの核酸配列が互いに逆平行にアラインされたとき、各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的になるような、それらの間で共有される特性を指す。

【0082】

「ベクター」、「発現ベクター」、「プラスミド」という用語、およびそれらの文法的変形は、本開示では交換可能に使用され、宿主細胞のゲノム内の特定場所に挿入される、宿主細胞のゲノムにとって外因性のポリヌクレオチドを指す。概して、プラスミドは、組換え部位（例えば、相同組換え部位および／または部位特異的組換え部位）、マーカー（例えば、検出マーカーおよび／または選択マーカー）、１つもしくは複数の発現カセット、またはそれらのいずれかの組合せのような複数の要素を含む。いくつかの態様において、プラスミドは、線状プラスミドであり得る。他の態様において、プラスミドは、環状プラスミド、例えば、インタクトな環状プラスミドであり得る。

【0083】

「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコーディング配列を含む。「作動可能に連結された」とは、そのように記述された複数の構成要素が意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列に作動可能に連結されているというのは、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合である。

【0084】

本明細書において使用される「宿主細胞」は、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞（例えば、細菌または古細菌の細胞）、または単細胞物として培養された多細胞生物からの細胞（例えば、細胞株）を意味し、この真核細胞または原核細胞は、異種核酸を受けるものとして使用されることにより組換え型宿主細胞になることができるか、またはなったものである。したがって、宿主細胞という用語には、元の宿主細胞（すなわち、異種核酸を受ける前の宿主細胞）の子孫が異種核酸によって形質転換されたもの、すなわち、組換え型宿主細胞も含まれる。単細胞の子孫は、天然、偶発性、または故意の突然変異に起因して、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において、必ずしも元の親と完全に同一であるとは限らないと理解されている。

【0085】

「組換え型宿主細胞」または「遺伝子修飾型宿主細胞」は、発現ベクターなどの異種核酸が導入された宿主細胞である。例えば、真核宿主細胞は、真核宿主細胞への外因性核酸の導入によって、組換え型または遺伝子修飾型の真核宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）になる。

【0086】

本明細書において使用される場合、「ホット細胞」、「ホットクローン」、および「ホット細胞株」という用語はそれぞれ、有利な特性を有する、例えば、同じ組換え型タンパク質を発現する他の細胞、クローン、または細胞株と比較して組換え型タンパク質の収量が高い、細胞、クローン、または細胞株を指す。例えば、ホット細胞、ホットクローン、またはホット細胞株は、増量した組換え型タンパク質を発現することができるか、上昇したレベルの正しくフォールディングした組換え型タンパク質を発現することができるか、高分子量凝集体のレベルが低下した組換え型タンパク質を発現することができるか、フラグメント化のレベルが低下した組換え型タンパク質を発現することができるか、もしくはそれらのいずれかの組合せであるか、または望ましい何らかの他の特性がある。

【0087】

本明細書において使用される場合、「ホットスポット」という用語は、組換え発現のためのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドなどの外因性配列を挿入することができ、（ｉ）外因性配列の転写がサイレンシングされない（例えば、エピジェネティック修飾によって）、かつ（ｉｉ）外因性配列の転写が、外因性配列が他の場所（例えば、参照場所）において挿入されたときに観察される転写レベルと比較して高いレベルで起こる、ゲノム上の位置（座位）を指す。いくつかの態様において、ホットスポットは、機能的ＯＲＦを含有しない。よって、いくつかの態様において、ホットスポットは、活発に転写される１つまたは複数の遺伝子を含有しない。活発に転写される遺伝子を欠いているホットスポットは、外因性遺伝子（目的遺伝子）をコードするポリヌクレオチド配列を挿入するためのそれらの部分的または全体的な欠失が内因性タンパク質の生産を妨害しないため、特に有利である。いくつかの態様において、本開示のホットスポットは、１つの活発に転写される遺伝子に隣接して位置するか、または２つの活発に転写される遺伝子の間に位置し、すなわち、ホットスポットは、２つの活発に転写される遺伝子によってフランキングされていてもよい。いくつかの態様において、外因性遺伝子（目的遺伝子）をコードするポリヌクレオチド配列を本開示のホットスポットに挿入することは、ホットスポットに隣接またはフランキングする１つまたは複数の活発に転写される遺伝子の発現に影響を及ぼさない。いくつかの態様において、外因性遺伝子（目的遺伝子）をコードするポリヌクレオチド配列を本開示のホットスポットに挿入することは、ホットスポットに隣接またはフランキングする１つまたは複数の活発に転写される遺伝子の発現を、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、または約１０％未満低減させる。

【0088】

本明細書において使用される場合、本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列、例えば、本明細書において開示されるランディングパッド配列に適用される、「アドレス指定可能」という用語は、ユニークな部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）またはそれらの組合せの存在によってユニークに同定されるポリヌクレオチド配列を指す。例えば、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐ部位を有する第１のランディングパッドと、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ ｍ７部位を有する第２のランディングパッドとは、互いに対してアドレス指定可能である。よって、いくつかの態様において、ランディングパッドは、２つのＳＳＲＳの特定の組合せの存在に起因してアドレス指定可能であり得る。他の態様において、ランディングパッドは、単一のＳＳＲＳを介して、第２のランディングパッドに対してアドレス指定され得る。例えば、第１のランディングパッドは、第１の単一のａａｔＰ部位を有し得、第２のランディングパッドは、第２の単一のａａｔＰ部位を有し得、これらのａａｔＰ部位は、相互適合性ではない。本開示のいくつかの態様では、複数の連接したランディングパッドが存在することができ、各ランディングパッドは、所定のランディングパッドを特異的に同定する（アドレス指定する）ユニークなＳＳＲＳまたはそれらの組合せが存在することにより、ユニークにアドレス指定可能である。

【0089】

本明細書において使用される場合、「アドレス指定可能ＳＳＲＳ」という用語は、組換えのために特異的に標的化され得るユニークなＳＳＲＳまたはそれらの組合せを指す。本明細書において使用される場合、「アドレス指定可能ランディングパッドプラスミド」という用語は、組換えのために特異的に標的化され得るアドレス指定可能ＳＳＲＳまたはそれらの組合せを含むランディングパッドプラスミドを指す。

【0090】

本明細書において使用される場合、一対の部位特異的組換え部位に適用される「非相互適合性」という用語は、代替的ＳＳＲＳとの組換えに欠陥のある、すなわち、組換えできないか、または代替的ＳＳＲＳとの交差反応性が一部しか残っていない部位を指す。例えば、互いとの組換え能力が低減しているＬｏｘＰおよびＬｏｘ５１１などの２つのＬｏｘ部位は、非相互適合性とみなされる。同様に、互いとの組換え能力が低減している２つのａｔｔＰ－ａａｔＢ部位対は、非相互適合性とみなされる。

【0091】

本明細書において使用される場合、「ヘッド・トゥ・ヘッド」、「テール・トゥ・テール」、「テール・トゥ・ヘッド」、および「ヘッド・トゥ・テール」という用語は、本明細書において開示される遺伝子コンストラクトにおける２つのランディングパッド、ランディングパッドプラスミド、発現プラスミド、または目的遺伝子などの２つのポリヌクレオチド配列の相対的な向きを指す。「ヘッド」という用語は核酸配列の５’末端を指し、「テール」という用語は核酸配列の３’末端を指す。よって、３’－５’５’－３’構成は、（コンストラクトにとっての５’～３’末端を考慮すると）元の配列の両５’末端（ヘッド）が互いの隣りにあるため、ヘッド・トゥ・ヘッドである。したがって、５’－３’３’－５’構成はテール・トゥ・テールとなり、５’－３’５’－３’はテール・トゥ・ヘッドとなり、３’－５’３’－５’はヘッド・トゥ・テールとなる。

【0092】

ＩＩ．ランディングパッド細胞
本開示は、少なくとも１つの目的遺伝子（ＧＯＩ）の組換え発現のために使用され得るランディングパッド細胞を提供する。いくつかの態様において、これらの細胞株には、「ランディングパッド」、すなわち、親細胞のゲノムに挿入される１つまたは複数の特定のポリヌクレオチド配列であって、例えば組換えにより、少なくとも１つのＧＯＩをコードするヌクレオチド配列を含む別の１つまたは複数の特定のポリヌクレオチド配列に置き換えられ得る、ポリヌクレオチド配列が含まれる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド配列を例えば組換えにより置き換える代わりに、少なくとも１つのＧＯＩをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の特定のポリヌクレオチド配列を、ランディングパッドの中の場所において、例えば、ａａｔ部位を介して挿入することができる。

【0093】

本明細書において開示されるプロセスのうちの１つの概説としては、親細胞株（例えば、特定の生物製剤を効率的に発現することが知られている「歴史的」細胞株）が、親のＧＯＩまたは第１ ＧＯＩを含む外因性ポリヌクレオチド配列（すなわち、「親プラスミド」）を第２の外因性ポリヌクレオチド配列（すなわち、「ランディングパッドプラスミドまたはその一部」）に完全にまたは部分的に置き換えることによって修飾される。結果として得られた、親プラスミド全体ではなくランディングパッドプラスミドまたはその一部を組み込んだ細胞株は、「ランディングパッド細胞」となる。いくつかの態様において、本開示のランディングパッドプラスミドは、親プラスミドからのフランキング配列を含む。

【0094】

次に、ランディングパッド細胞におけるランディングパッドプラスミドが、組換えにより、異なるＧＯＩまたは第２ ＧＯＩを含む別のポリヌクレオチド（「ＧＯＩプラスミド」）に置き換えられ（例えば、部分的に）、それにより「発現細胞」がもたらされ得る。例えば、図５Ａおよび図５Ｂに描写したプロセスならびに表１を参照されたい。

【0095】

【表1】

【0096】

したがって、いくつかの態様において、本開示は、ゲノム配列に組み込まれた、少なくとも１つの発現プラスミド（Ｐ４）、例えば線状プラスミドを含む発現細胞であって、各発現プラスミドは、
（ｉ）目的遺伝子（第２ ＧＯＩ）をコードする核酸を含む、発現プラスミド（Ｐ４）に由来するポリヌクレオチド配列、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つのＳＳＲＳ（例えば、Ｌｏｘなどのリコンビナーゼシステムが使用される場合）、または単一のＳＳＲＳ（例えば、ａｔｔなどのインテグラーゼシステムが使用される場合）、
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）のＳＳＲＳに対して遠位に位置するポリヌクレオチド配列［ここで、（ｉｉｉ）の両方のフランキングポリヌクレオチド配列は、ランディングパッドプラスミド（Ｐ２）に由来する］、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチド配列に遠位にフランキングするポリヌクレオチド配列［ここで、（ｉｖ）の両方のフランキングポリヌクレオチド配列は、親プラスミド（Ｐ１）に由来する］を含む、発現細胞を提供する。

【0097】

「部位特異的組換え部位」という用語は、「ＳＳＲＳ」と略され、本明細書で使用される場合、部位特異的リコンビナーゼによって認識されて組換え事象のための基質として機能することができるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるコンストラクト（例えば、ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミド）は、ＧＯＩまたはマーカーをコードする核酸に対して上流に位置するものと下流に位置するものとの、２つのＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本明細書において開示されるコンストラクト（例えば、ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミド）は、ＧＯＩまたはマーカーをコードする核酸に対して上流または下流のいずれかに位置する単一のＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本明細書において開示されるコンストラクト（例えば、ランディングパッドプラスミドまたは発現プラスミド）は、３つ以上のＳＳＲＳを含むことができ、それらのすべてがＧＯＩまたはマーカーをコードする核酸に対して上流に位置するか、それらのすべてがＧＯＩまたはマーカーをコードする核酸に対して下流に位置するか、またはそれらのいくつかはＧＯＩまたはマーカーをコードする核酸に対して上流に位置し、それらのいくつかは下流に位置する。

【0098】

本願において開示される、２つのＳＳＲＳを含む式では、２つのＳＳＲＳ（ｌｏｘまたはＦｒｔなど）を必要とする組換えシステムの代わりに、単一のＳＳＲＳ（例えば、ａｔｔ）を必要とするシステムを使用して組換えが起こる場合には、式中の２つのＳＳＲＳのうちの１つは省略可能であり、存在しなくてもよいと理解されたい。上記式中のＳＳＲＳ部位のうちの１つが存在しない場合の単一のＳＳＲＳ部位は、［Ｍ］または［Ｐ３］構成要素に対して上流のＳＳＲＳまたは下流のＳＳＲＳのいずれであってもよい。いくつかの態様において、単一のＳＳＲＳは、ａｔｔ部位である。

【0099】

本明細書において使用される「部位特異的リコンビナーゼ」という用語には、「組換え部位」間の組換えを生じさせることが可能な酵素群が含まれ、２つの組換え部位は、単一の核酸分子の中か、または別個の核酸分子の上に位置する。「部位特異的リコンビナーゼ」の例は、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼは、インテグラーゼ、例えば、λ（ラムダ）インテグラーゼである。いくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼは、Ｂｘｂインテグラーゼ、例えば、Ｂｘｂ１インテグラーゼである。マイコバクテリオファージＢｘｂ１によってコードされるインテグラーゼであるＢｘｂ１は、セリン－リコンビナーゼファミリーのメンバーであり、ａｔｔＰおよびａｔｔＢ（それぞれ、ファージおよび細菌宿主のための結合部位）の間の鎖交換を触媒する。

【0100】

本開示は、ゲノム配列に組み込まれた、少なくとも１つのプラスミド、例えば、線状プラスミドもしくは環状プラスミドまたはそれらの組合せを含むランディングパッド細胞であって、各プラスミドは、
（ｉ）少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）（Ｌｏｘなどのリコンビナーゼシステムが使用される場合。ａｔｔなどのインテグラーゼシステムが使用される場合には単一のＳＳＲＳ）とを含む、ランディングパッドプラスミド（Ｐ２）に由来するポリヌクレオチド配列、ならびに、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングするポリヌクレオチド配列［ここで、（ｉｉ）の両方のフランキングポリヌクレオチド配列は、親プラスミド（Ｐ１）に由来する］を含む、ランディングパッド細胞を提供する。

【0101】

単一のＳＳＲＳが存在する場合には、式中の別の要素、例えば、［Ｐ２］または［Ｐ３］要素（すなわち、マーカーまたはＧＯＩをコードする要素）に「フランキング」しているものとしてのその場所の記述は、フランキングされた要素に対してすぐ上流または下流にあるＳＳＲＳの場所を指すと理解されたい。一例として、式ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２における［ＳＳＲＳ］は、ＧＯＩをコードすることになる［Ｐ３］にフランキングしていることになる。

【0102】

本開示は、そのゲノム配列に挿入された線状プラスミドなどのプラスミドを含む発現細胞であって、プラスミドのトポロジーは、式
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２
［式中
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入された線状プラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む第２ ＧＯＩプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）である］に対応する、発現細胞を提供する。

【0103】

本開示はまた、複数のプラスミド、例えば、ランディングプラスミドまたはその一部を含むランディングパッド細胞を想定する。よって、本開示はまた、ゲノム配列に組み込まれた、少なくとも１つのプラスミド、例えば、１つ、２つ、３つもしくはそれよりも多くの線状プラスミドまたは環状プラスミドを含むランディングパッド細胞であて、各プラスミドは、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含む、ランディングパッドプラスミド（Ｐ２）に由来するポリヌクレオチド配列、ならびに、（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）の両方のフランキングポリヌクレオチド配列は、親プラスミド（Ｐ１）に由来する、ランディングパッド細胞を提供する。

【0104】

したがって、本開示は、そのゲノム配列に挿入された線状プラスミドなどのプラスミドを含む発現細胞であって、プラスミドのトポロジーは、式
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２
［式中
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入された線状プラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１～１０の間の整数である］に対応する、発現細胞を提供する。

【0105】

場合によっては、［Ｐ３］は、単一のＧＯＩまたは複数のＧＯＩを含み得る。いくつかの態様において、５’［ＳＳＲＳ］または３’［ＳＳＲＳＡ］のいずれかは省略可能である。いくつかの態様において、発現細胞はプラスミドを含み、プラスミドは発現プラスミドである。

【0106】

いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが同一である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのプラスミドは異なっている。

【0107】

いくつかの態様において、ＣＧ_１は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、ＣＧ_２は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。

【0108】

いくつかの態様において、ＣＧ_１は、配列番号１１４のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、ＣＧ_２は、配列番号１１５のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。

【0109】

本開示は、ゲノム配列に組み込まれた、少なくとも１つのプラスミド、例えば、線状プラスミドを含むランディングパッド細胞であって、プラスミドは、
ａ．少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、
ｂ．（１）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つのＳＳＲＳと、
ｃ．親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（２）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位と
を含む、ランディングパッド細胞を提供する。

【0110】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞における線状プラスミドなどのプラスミドのトポロジーは、式
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２
［式中
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入された線状プラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｍ］は、少なくとも１つのマーカー、例えば、スクリーニング可能マーカー、選択可能マーカー、またはそれらの組合せを含む、ポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）である］に対応する。

【0111】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞における線状プラスミドなどのプラスミドのトポロジーは、式
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２
［式中ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入された線状プラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｍ］は、少なくとも１つのマーカー、例えば、スクリーニング可能マーカー、選択可能マーカー、またはそれらの組合せを含む、ポリヌクレオチド配列であり、
［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、
ｎは、１～１０の間の整数である］に対応する。
いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが同一である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのプラスミドは異なっている。

【0112】

本開示はまた、そのゲノム配列に挿入された線状プラスミドなどのプラスミドを含むランディングパッド細胞であって、プラスミドのトポロジーは、記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－／ＣＧ_２
［ここで、
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含む、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列である］に対応する、ランディングパッド細胞を提供する。

【0113】

本開示はまた、そのゲノム配列に挿入された線状プラスミドなどのプラスミドを含むランディングパッド細胞であって、ラスミドのトポロジーは、以下の記述
ＣＧ_１／－［Ｐ１^＊］－／ＣＧ_２
ＣＧ_３／－［Ｐ２］－／ＣＧ_４
［ここで、
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、第１のホットスポットにおける挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
ＣＧ_３およびＣＧ_４は、第２のホットスポットにおける挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１^＊］は、少なくとも部分的な欠失を含む親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含む、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列である］対応する、ランディングパッド細胞を提供する。

【0114】

本開示はまた、そのゲノム配列に挿入された線状プラスミドなどのプラスミドを含むランディングパッド細胞であって、プラスミドのトポロジーは、記述
ＣＧ_１／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ_２
［ここで、
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含む、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、ｎは、１～１０の間の整数である］に対応する、ランディングパッド細胞を提供する。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが同一である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのプラスミドは異なっている。

【0115】

本開示はまた、そのゲノム配列に挿入された線状プラスミドなどのプラスミドを含むランディングパッド細胞であって、プラスミドのトポロジーは、以下の記述
ＣＧ_１／－（［Ｐ１^＊］－／ＣＧ_２
ＣＧ_３／－（［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ_４
［ここで、
ＣＧ_１およびＣＧ_２は、第１のホットスポットにおける挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
ＣＧ_３およびＣＧ_４は、第２のホットスポットにおける挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、
［Ｐ１^＊］は、少なくとも部分的な欠失を含む親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含む、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、ｎは、１～１０の間の整数である］に対応する、ランディングパッド細胞を提供する。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが同一である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのプラスミドは異なっている。

【0116】

いくつかの態様において、ＣＧ_１は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、ＣＧ_２は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。

【0117】

いくつかの態様において、ＣＧ_３は、配列番号１１４のポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、ＣＧ_４は、配列番号１１５のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。

【0118】

いくつかの態様において、例えば、線状プラスミドが、親細胞株における元のホットスポットとは異なるホットスポットに挿入される場合、ＣＧ_１およびＣＧ_２ゲノム配列（挿入された線状プラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列）は、それぞれ、代替的なホットスポットにおいて挿入された線状プラスミドにフランキングするゲノム配列に対応するＣＧ_３およびＣＧ_４ゲノム配列によって置き換えられることになる。

【0119】

本開示はまた、線状プラスミドなどのプラスミドを含む、宿主細胞のゲノムへの標的化組み込みのためのランディングパッドプラスミドであって、プラスミドのトポロジーは、式
－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－
［式中
［Ｐ１］は、相同組換え部位を含む宿主に組み込まれた親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、
［Ｐ２］は、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含むポリヌクレオチド配列である］に対応する、ランディングパッドプラスミドを提供する。

【0120】

本開示はまた、線状プラスミドなどのプラスミドを含む、宿主細胞のゲノムへの標的化組み込みのためのランディングパッドプラスミドであって、プラスミドのトポロジーは、式
－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－
［式中
［Ｐ１］は、相同組換え部位を含む宿主に組み込まれた親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、［Ｐ２］は、少なくとも１つのマーカーと、少なくとも１つのマーカーにフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）とを含むポリヌクレオチド配列であり、ｎは、１～１０の間の整数である］に対応する、ランディングパッドプラスミドを提供する。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが同一である。いくつかの態様において、すべてのプラスミドが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのプラスミドは異なっている。

【0121】

本明細書において開示されるプラスミドの簡略化されたトポロジー（例えば、－［Ｐ１］－［Ｐ２］－［Ｐ１］－）は、「記述」または「式」という用語を交換可能に使用して記述され得ることを理解されたい。

【0122】

本開示はまた、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、
（ａ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内にランディングパッドプラスミドまたはその一部を組み込むことを含み、
ランディングパッドプラスミドが、
（１）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つのＳＳＲＳと、
（３）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（２）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位と
を含み、
ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0123】

本明細書において開示される標的化組み込みプロセスは、プラスミドにおける２つの組換え部位の間に位置するポリヌクレオチド部分配列を、別のプラスミドにおける２つの対応する組換え部位の間に位置する別のポリヌクレオチド部分配列に置換することを含む。よって、例えば、図４Ａ、５Ａ、８Ａ、および８Ｂにおいて例示されるような、親プラスミドにおけるランディングパッドプラスミドの標的化組み込みは、親プラスミドの部分配列を、ランディングパッドプラスミドからの対応する部分配列に置き換え、ゲノム配列における組換え部位の間の親プラスミド配列からの残余物を残す。この標的化組み込みでは、あるプラスミドを別のプラスミドに完全に置換する必要はない。

【0124】

同様に、第２ ＧＯＩプラスミドがランディングパッドプラスミドと組換えられる際には、ＳＳＲＳ（例えば、ＬｏｘＰ部位）間の部分配列が交換されることになるが、ランディングパッドプラスミドの残余物が組換え部位とゲノム配列との間に残ることになる。この場合、第２ ＧＯＩプラスミドに由来する配列は、ランディングパッドプラスミドから生じた配列によってフランキングされることになり、次いで、ランディングパッドプラスミドから生じた配列は、親プラスミドから生じた配列によってフランキングされることになる。

【0125】

これらの説明から分かるように、本願における、あるプラスミドを別のプラスミドに挿入することへの言及は、概して、一方のプラスミドを他方に完全に置き換えることを必要としない。むしろ、プラスミドは別のプラスミドによって完全にもしくは部分的に置き換えられるか、または切除されるプラスミドは完全にもしくは部分的に切除される。

【0126】

いくつかの態様において、本開示は、発現細胞を生成する方法であって、
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、標的化組み込み部位において本開示のランディングパッド細胞のゲノム内に線状プラスミドなどの第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことを含み、発現プラスミド（Ｐ４）が、
（１）ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳと
を含み、
ランディングパッドプラスミドの部位特異的リコンビナーゼ組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的リコンビナーゼ組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞ゲノムＤＮＡに挿入されたランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0127】

本開示はまた、発現細胞を生成する方法であって、
（ａ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親プラスミドを含む親細胞のゲノム内に線状プラスミドなどの第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことを含み、発現プラスミドが、
（１）ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳと
を含み、
親プラスミドの部位特異的リコンビナーゼ組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的リコンビナーゼ組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0128】

本開示はまた、発現細胞を生成する方法であって、
相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親プラスミドを含む親細胞のゲノム内に線状プラスミドなどの第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことを含み、結果として得られた発現プラスミドが、ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含み、
親プラスミドがＧＯＩプラスミドと組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0129】

本開示はまた、発現細胞を生成する方法であって、
相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親プラスミドを含む親細胞のゲノム内に線状プラスミドなどの第２ ＧＯＩプラスミドを組み込むことを含み、
親プラスミドがフランキングゲノム配列と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの中にＧＯＩプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0130】

本明細書において開示される方法は、２つの入れ子になったヌクレアーゼ媒介組換え事象、例えば、親細胞における親プラスミドとランディングパッドプラスミドとの間の相同組換え、およびランディングパッド細胞におけるランディングパッドプラスミドと第２ ＧＯＩプラスミドとの間の部位特異的リコンビナーゼ組換えに関するが、組換え事象の他の組合せ、例えば、Ｐ１とＰ２との間の第１の相同組換え事象、およびＰ２とＰ３との間の第２の相同組換えも、等しく適用可能となることを理解されたい。

【0131】

また、ランディングパッドプラスミドまたはＧＯＩプラスミドなどの本開示に関連するプラスミドの組み込みに関する教示は、複数のプラスミド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の挿入を包含することを意図しており、これらのプラスミドは、同じであっても異なっていてもよく、かつ、最終的なコンストラクトにおけるそれらの向き（例えば、最終的なコンストラクトにおけるプラスミドの各々が、元のコンストラクトおよび最終的なコンストラクトにおける他のプラスミドに対して５’－３’の向きにあるか３’－５’の向きにあるか）に関して異なっていてもよいことを理解されたい。

【0132】

いくつかの態様において、本開示はまた、発現細胞を生成する方法であって、
相同組換えを使用して、親細胞のゲノム内に線状プラスミドなどのＧＯＩプラスミドを組み込むことを含み、発現プラスミドが、ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含み、
ＧＯＩプラスミドが、ホットスポットに対応すると決定された場所において、相同組換えにより組み込まれる、方法を提供する。いくつかの態様において、親プラスミドの少なくとも一部が除去される。いくつかの態様において、親プラスミド全体が除去される。

【0133】

いくつかの態様において、本開示はまた、高力価をもたらすことが可能なランディングパッド細胞株を作製するために効率的な様式で出発細胞（親細胞株）を同定する方法を提供する。よって、本開示は、例えば、実施例１および実施例２において開示されるような、発現細胞を生成するための親細胞を選択する方法を提供する。

【0134】

いくつかの態様において、本明細書において開示される方法は、少なくとも１つの親プラスミドの少なくとも一部を除去することと、ランディングパッドを含む１つもしくは複数のランディングパッドプラスミドまたはその一部を細胞ゲノムに導入することとを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法は、少なくとも１つの親プラスミドの一部だけを除去することと、ランディングパッドを含む１つもしくは複数のランディングパッドプラスミドまたはその一部を細胞ゲノムに導入することとを含む。

【0135】

いくつかの態様において、本開示のランディング細胞株の造成に好適な親細胞株を選択する方法は、
（ｉ）目的遺伝子の発現力価が高い細胞株を選択すること、
（ｉｉ）目的遺伝子をコードするＯＲＦのコピー数が低い細胞をさらに選択すること
を含む。
いくつかの態様において、親細胞は、目的遺伝子をコードするＯＲＦを１または２コピー有する。いくつかの態様において、親細胞は、目的遺伝子をコードするＯＲＦを３コピー以上有する。

【0136】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株を選択する方法は、親プラスミドまたはその一部の喪失についてスクリーニングし、そのような喪失（欠失）がある細胞を選択することを含む。いくつかの態様において、親細胞株を選択する方法は、ランディングパッドの存在についてスクリーニングし、ランディングパッドが存在する細胞を選択することをさらに含む。いくつかの態様において、この方法は、ランディングパッドを、低複雑性または高複雑性の領域の存在または非存在、レトロトランスポゾン配列の存在または非存在、Ａｌｕリピートの存在または非存在、長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）の存在または非存在、アイランドの存在または非存在、シトシンメチル化のレベル、ヒストンアセチル化のレベル、ＯＲＦの存在または非存在、およびそれらのいずれかの組合せなどの特徴についてスクリーニングすることをさらに含む。

【0137】

いくつかの態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの態様において、ホットスポット場所は、配列番号１８またはそのフラグメントおよび配列番号１９またはそのフラグメントから選択される配列を含む。いくつかの態様において、ホットスポット場所は、配列番号１１４またはそのフラグメントおよび配列番号１１５またはそのフラグメントから選択される配列を含む。

【0138】

いくつかの態様において、ＧＯＩプラスミドは、相同組換えまたはランダム組み込みにより、配列番号１８のゲノム配列の中の場所において挿入され、組み込まれる。いくつかの態様において、ＧＯＩプラスミドは、相同組換えまたはランダム組み込みにより、配列番号１９のゲノム配列の中のゲノム配列の中の場所において挿入され、組み込まれる。いくつかの態様において、ＧＯＩプラスミドは、相同組換えまたはランダム組み込みにより、配列番号１１４のゲノム配列の中の場所において挿入され、組み込まれる。いくつかの態様において、ＧＯＩプラスミドは、相同組換えまたはランダム組み込みにより、配列番号１１５のゲノム配列の中の場所において挿入され、組み込まれる。

【0139】

いくつかの態様において、ＧＯＩプラスミドは、相同組換えにより、ゲノム配列の中の場所において組み込まれ、５’相同組換え部位は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含み、かつ／または３’相同組換え部位は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含む。

【0140】

いくつかの態様において、ＧＯＩプラスミドは、相同組換えにより、ゲノム配列の中の場所において組み込まれ、５’相同組換え部位は、配列番号１１４のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含み、かつ／または３’相同組換え部位は、配列番号１１５のポリヌクレオチド配列もしくはその部分配列を含む。

【0141】

いくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１８または配列番号１１４からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、または少なくとも約６００個の連続するヌクレオチドを含む。

【0142】

いくつかの態様において、３’相同組換え部位は、配列番号１９または配列番号１１５からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、または少なくとも約６００個の連続するヌクレオチドを含む。

【0143】

いくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１８または配列番号１１４からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、または少なくとも約６００個の連続するヌクレオチドを含み、３’相同組換え部位は、配列番号１９または配列番号１１５からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、または少なくとも約６００個の連続するヌクレオチドを含む。

【0144】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体である。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体の重鎖（ＨＣ）を含む。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体の軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体のＨＣおよびＬＣを含む。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体の抗原結合部分を含む。いくつかの態様において、発現プラスミドは、１コピー、２コピー、またはそれよりも多くのＧＯＩのコピーを含む。いくつかの態様において、発現プラスミドは、１つ、２つ、またはそれよりも多くの発現カセットを含む。いくつかの態様において、発現プラスミドはバイシストロン性である。いくつかの態様において、発現プラスミドはマルチシストロン性である。

【0145】

いくつかの態様において、発現プラスミドは、少なくとも１のコピー数で発現細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、発現プラスミドは、１のコピー数で発現細胞のゲノムに組み込まれる。他の態様において、発現プラスミドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０コピーのコピー数で発現細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、３０より多くのコピーが発現細胞のゲノムに存在する。

【0146】

他の態様において、発現プラスミドは、約１から約３、約３から約６、約６から約９、約９から約１２、約１２から約１５、約１５から約１８、約１８から約２１、約２１から約２４、約２４から約２７、約２７から約３０、約５から約１０、約１０から約１５、約１５から約２０、約２０から約２５、約２５から約３０、約１から約１０、約５から約１５、約１０から約２０、約１５から約２５、約２０から約３０、約１から約１５、約５から約２０、約１０から約２５、約１５から約３０、約１から約２０、約５から約２５、約１０から約３０コピーのコピー数で発現細胞のゲノムに組み込まれる。

【0147】

いくつかの態様において、本明細書において開示される方法は、発現プラスミド（Ｐ４；例えば、図５Ａを参照されたい）を生成するためのランディングパッド細胞株における第２ ＧＯＩプラスミド（Ｐ３；例えば、図５Ａを参照されたい）の標的化組み込みの後に宿主細胞によって生産されたＧＯＩの発現を決定することを含む。いくつかの態様において、発現レベルは定量的に決定される。他の態様において、発現は定性的に決定される。ＧＯＩの発現は、当技術分野において公知のいずれかの方法、例えば、細胞選別、ＦＡＣＳ、細胞表面染色、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス、ＵＶ吸光度、細胞サイズ、分泌タンパク質レベル、転写物レベル、免疫組織化学、またはそれらのいずれかの組合せを使用することによって決定され得る。

【0148】

本開示の文脈において、第２ ＧＯＩの組換え発現レベルは、本開示の方法に従って生成された発現細胞を使用した、単一の発現カセットからの発現、または複数の発現カセットからの発現に対応し得る。いくつかの態様において、ＧＯＩの発現は、同じ部位において挿入されたＧＯＩを含む複数のカセットに対応し得る。

【0149】

本開示は、本明細書において開示される方法に従って生産されたランディングパッド細胞および発現細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示の方法に従って生成された発現細胞を使用した際に得られる第２ ＧＯＩ（例えば、第２の抗体などの第２の生物製剤）の組換え型タンパク質発現レベルは、親細胞を同じ条件下で培養した際に観察される第１ ＧＯＩ（例えば、第１の抗体などの第１の生物製剤）の組換え型タンパク質発現レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１３５％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１４５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１５５％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１６５％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１８５％、少なくとも約１９０％、少なくとも約１９５％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％である。

【0150】

本開示は、本明細書において開示される方法に従って生産されたランディングパッド細胞および発現細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示の方法に従って生成された発現細胞を使用した際に得られる第２ ＧＯＩ（例えば、第２の抗体などの第２の生物製剤）の組換え型タンパク質発現レベルは、親細胞を同じ条件下で培養した際に観察される第１ ＧＯＩ（例えば、第１の抗体などの第１の生物製剤）の組換え型タンパク質発現レベルの約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、または１０００％超である。

【0151】

本開示は、本明細書において開示される方法に従って生産されたランディングパッド細胞および発現細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示の方法に従って生成された発現細胞を使用した際に得られる第２ ＧＯＩ（例えば、第２の抗体などの第２の生物製剤）の組換え型タンパク質発現レベルは、親細胞を同じ条件下で培養した際に観察される第１ ＧＯＩ（例えば、第１の抗体などの第１の生物製剤）の組換え型タンパク質発現レベルの約５０％から約５５％、約５５％から約６０％、約６５％から約７０％、約７０％から約７５％、約７５％から約８０％、約８０％から約８５％、約８５％から約９０％、約９０％から約１００％、約１００％から約１１０％、約１１０％から約１２０％、約１２０％から約１２５％、約１２５％から約１３０％、約１３０％から約１３５％、約１３５％から約１４０％、約１４０％から約１４５％、約１４５％から約１５０％、約１５０％から約１５５％、約１５５％から約１６０％、約１６０％から約１６５％、約１６５％から約１７０％、約１７０％から約１１７５％、約１７５％から約１８０％、約１８０％から約１８５％、約１８５％から約１９０％、約１９０％から約１９５％、約１９５％から約２００％、約２００％から約３００％、約３００％から約４００％、約４００％から約５００％、約５００％から約６００％、約６００％から約７００％、約７００％から約８００％、約８００％から約９００％、約９００％から約１０００％、または１０００％超である。

【0152】

本開示のいくつかの態様において、本明細書において開示される細胞は、細胞株、すなわち、単細胞から造成された故に均一な遺伝子構成を持つ細胞からなる細胞培養物として樹立することができ、これらの細胞は、ある特定の条件下では研究所内で無限に増殖し、発現細胞株の場合には、１つまたは複数の目的遺伝子が細胞のゲノムに安定に組み込まれている。

【0153】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、「Ｃｈｒ３ ＴＩコンティグ」または３番染色体標的化組み込み座位の中に位置し、これは、モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）（チャイニーズハムスター）の３番染色体からのポリヌクレオチドであって、（ｉ）ポリヌクレオチドの５’末端における配列番号２３（ｇｉ｜１４９７１５５５９８｜ｒｅｆ｜ＮＷ＿０２０８２２４９９．１ ２６Ｍｂａｓｅコンティグの５’末端５ｋｂ配列）と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、または少なくとも約９６．６％同一の配列、および（ｉｉ）ポリヌクレオチドの３’末端における配列番号２４（ｇｉ｜１４９７１５５５９８｜ｒｅｆ｜ＮＷ＿０２０８２２４９９．１ ２６Ｍｂａｓｅコンティグの３’末端５ｋｂ配列）と少なくとも９６．６％同一の配列を含む、ポリヌクレオチドとして定義され、このポリヌクレオチドの長さは、２５Ｍｂａｓｅ（メガベース）から２６．５Ｍｂａｓｅ（メガベース）の間である。

【0154】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、「Ｃｈｒ５ ＴＩコンティグ」または５番染色体標的化組み込み座位の中に位置し、これは、モンゴルキヌゲネズミ（チャイニーズハムスター）の５番染色体からのポリヌクレオチドであって、（ｉ）ポリヌクレオチドの５’末端における配列番号１１９（ＮＷ＿０２０８２２５７７．１ １８Ｍｂａｓｅコンティグの５’末端５ｋｂ配列）と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、または少なくとも約９６．６％同一の配列、および（ｉｉ）ポリヌクレオチドの３’末端における配列番号１２０（ＮＷ＿０２０８２２５７７．１ １８Ｍｂａｓｅコンティグの３’末端５ｋｂ配列）と少なくとも９６．６％同一の配列を含む、ポリヌクレオチドとして定義され、このポリヌクレオチドの長さは、１７Ｍｂａｓｅ（メガベース）から１９Ｍｂａｓｅ（メガベース）の間である。

【0155】

配列番号２２（Ｒｅｆｓｅｑ ＮＷ＿０２０８２２４９９．１；ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822499.1?report=genbankおよびncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822499.1?report=fastaにおいて入手可能）のホットスポットおよび配列番号１１８（Ｒｅｆｓｅｑ ＮＷ＿０２０８２２５７７．１；ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822577.1?report=genbankおよびncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822577.1?report=fastaにおいて入手可能）のホットスポットの中には、ＣＨＯ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットに記述されおり［Singh et al. Biotechnol J. 2018 Oct;13(10):e1800070、およびLin et al. PLoS Comput Biol 16(12):e1008498を参照されたい。これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる］、出願人により実験的に確認された、活発に転写される遺伝子が存在する。ＮＷ＿０２０８２２４９９．１の第１のホットスポットについては、ランディングパッドが存在する欠失の５’側にある最も近い遺伝子は、２６９ｋｂ上流にあるＰｒｋｇ１であり、ランディングパッドが存在する欠失の３’側にある最も近い遺伝子は、４３ｋｂ下流にあるＭｂｌ２である。Ｐｒｋｇ１とＭｂｌ２との間で、他の活発な転写物は、出願人によってもＣＨＯ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおいても同定されなかった。ＮＷ＿０２０８２２５７７．１の第２のホットスポットについては、ランディングパッドが存在する欠失の５’側にある最も近い遺伝子は、２０９ｋｂ上流にあるＡｃｋｒ１であり、ランディングパッドが存在する欠失の３’側にある最も近い遺伝子は、１７０ｋｂ下流にあるＣｒｐである。Ａｃｋｒ１とＣｒｐとの間で、他の活発な転写物は、出願人によってもＣＨＯ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおいても同定されなかった。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２または配列番号１１８の中の、活発に転写される１つまたは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼさない位置に位置する。いくつかの態様において、活発に転写される１つまたは複数の遺伝子は、配列番号２２のホットスポットまたは配列番号１１８のホットスポットの中に位置する。いくつかの態様において、活発に転写される１つまたは複数の遺伝子は、配列番号２２のホットスポットまたは配列番号１１８のホットスポットの５’末端の近くに位置する。いくつかの態様において、活発に転写される１つまたは複数の遺伝子は、配列番号２２のホットスポットまたは配列番号１１８のホットスポットの近くに位置する。本開示のいくつかの態様において、活発に転写される遺伝子が、本明細書において開示されるホットスポットの５’末端または３’末端から約２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、７５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３２５ｋｂ、３５０ｋｂ、３７５ｋｂ、４００ｋｂ、４２５ｋｂ、４５０ｋｂ、４７５ｋｂ、または５００ｋｂの距離に位置するとき、活発に転写される遺伝子は、本明細書において開示されるホットスポットの５’末端または３’末端に近いとみなされる。

【0156】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における特定場所に位置する。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における、配列番号２２のヌクレオチド位置１（５’開始位置）および２６，２９０，５００（３’末端位置）の中の特定場所に位置する。

【0157】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における特定場所に位置する。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における、配列番号１１８のヌクレオチド位置１（５’開始位置）および１８，２３１，０９２（３’末端位置）の中の特定場所に位置する。

【0158】

本明細書において使用される場合、「特定場所」という用語は、例えば、組み込みが起こることになる、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに、または配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における特定位置（例えば、単一の塩基）を指す。例えば、１００位における特定場所とは、ヌクレオチド１００と１０１との間の挿入によって組み込みが起こることを意味することになる。いくつかの態様において、「特定場所」という用語は、組み込みが起こる際に切除されることになる２つの位置の間のヌクレオチドの特定の範囲を指す。例えば、１００位と２００位との間の特定場所とは、ヌクレオチド１０１から１９９を含む元の配列が欠失し、組み込まれる配列によって置き換えられることを意味することになる。

【0159】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２（配列番号２１の例示的な標的化組み込み部位に対応する）、もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグ、または配列番号１１８（配列番号１１７の例示的な標的化組み込み部位に対応する）、もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における、位置の間に位置する。いくつかの態様において、囲まれた配列、すなわち、標的化組み込み部位に対応する配列は、発現プラスミド（例えば、本明細書において記載される親プラスミドまたはランディングパッドプラスミド）によって置き換えられる。いくつかの態様において、発現プラスミド（例えば、本明細書において記載される親プラスミドまたはランディングパッドプラスミド）は、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列に対応するマイナス鎖上で組み込まれる。よって、いくつかの態様において、囲まれた配列から上流（５’）および下流（３’）にある下線付きの配列は、それぞれ、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列に対応するマイナス鎖上で組み込まれる、組み込まれる発現プラスミドの３’および５’ジャンクションに対応する。

【0160】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列の１位から１，０００，０００位の間、１，０００，０００位から２，０００，０００位の間、２，０００，０００位から３，０００，０００位の間、３，０００，０００位から４，０００，０００位の間、４，０００，０００位から５，０００，０００位の間、５，０００，０００位から６，０００，０００位の間、６，０００，０００位から７，０００，０００位の間、７，０００，０００位から８，０００，０００位の間、８，０００，０００位から９，０００，０００位の間、９，０００，０００位から１０，０００，０００位の間、１０，０００，０００位から１１，０００，０００位の間、１１，０００，０００位から１２，０００，０００位の間、１２，０００，０００位から１３，０００，０００位の間、１３，０００，０００位から１４，０００，０００位の間、１４，０００，０００位から１５，０００，０００位の間、１５，０００，０００位から１６，０００，０００位の間、１６，０００，０００位から１７，０００，０００位の間、１７，０００，０００位から１８，０００，０００位の間、１８，０００，０００位から１９，０００，０００位の間、１９，０００，０００位から２０，０００，０００位の間、２０，０００，０００位から２１，０００，０００位の間、２１，０００，０００位から２２，０００，０００位の間、２２，０００，０００位から２３，０００，０００位の間、２３，０００，０００位から２４，０００，０００位の間、２４，０００，０００位から２５，０００，０００位の間、２５，０００，０００位から２６，０００，０００位の間、または２６，０００，０００位から２６，２９４，０５６位の間である。

【0161】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列の１位～１００，０００位、１００，０００位～２００，０００位、２００，０００位～３００，０００位、３００，０００位～４００，０００位、４００，０００位～５００，０００位、５００，０００位～６００，０００位、６００，０００位～７００，０００位、７００，０００位～８００，０００位、８００，０００位～９００，０００位、９００，０００位～１，０００，０００位、１，０００，０００位～１，１００，０００位、１，１００，０００位～１，２００，０００位、１，２００，０００位～１，３００，０００位、１，３００，０００位～１，４００，０００位、１，４００，０００位～１，５００，０００、１，５００，０００位～１，６００，０００位、１，６００，０００位～１，７００，０００位、１，７００，０００位～１，８００，０００位、１，８００，０００位～１，９００，０００位、１，９００，０００位～２，０００，０００位、２，０００，０００位～２，１００，０００位、２，１００，０００位～２，２００，０００位、２，２００，０００位～２，３００，０００位、２，３００，０００位～２，４００，０００位、２，４００，０００位～２，５００，０００、２，５００，０００位～２，６００，０００位、２，６００，０００位～２，７００，０００位、２，７００，０００位～２，８００，０００位、２，８００，０００位～２，９００，０００位、２，９００，０００位～３，０００，０００位、３，０００，０００位～３，１００，０００位、３，１００，０００位～３，２００，０００位、３，２００，０００位～３，３００，０００位、３，３００，０００位～３，４００，０００位、３，４００，０００位～３，５００，０００、３，５００，０００位～３，６００，０００位、３，６００，０００位～３，７００，０００位、３，７００，０００位～３，８００，０００位、３，８００，０００位～３，９００，０００位、３，９００，０００位～４，０００，０００位、４，０００，０００位～４，１００，０００位、４，１００，０００位～４，２００，０００位、４，２００，０００位～４，３００，０００位、４，３００，０００位～４，４００，０００位、４，４００，０００位～４，５００，０００、４，５００，０００位～４，６００，０００位、４，６００，０００位～４，７００，０００位、４，７００，０００位～４，８００，０００位、４，８００，０００位～４，９００，０００位、４，９００，０００位～５，０００，０００位、５，０００，０００位～５，１００，０００位、５，１００，０００位～５，２００，０００位、５，２００，０００位～５，３００，０００位、５，３００，０００位～５，４００，０００位、５，４００，０００位～５，５００，０００、５，５００，０００位～５，６００，０００位、５，６００，０００位～５，７００，０００位、５，７００，０００位～５，８００，０００位、５，８００，０００位～５，９００，０００位、５，９００，０００位～６，０００，０００位、６，０００，０００位～６，１００，０００位、６，１００，０００位～６，２００，０００位、６，２００，０００位～６，３００，０００位、６，３００，０００位～６，４００，０００位、６，４００，０００位～６，５００，０００、６，５００，０００位～６，６００，０００位、６，６００，０００位～６，７００，０００位、６，７００，０００位～６，８００，０００位、６，８００，０００位～６，９００，０００位、６，９００，０００位～７，０００，０００位、７，０００，０００位～７，１００，０００位、７，１００，０００位～７，２００，０００位、７，２００，０００位～７，３００，０００位、７，３００，０００位～７，４００，０００位、７，４００，０００位～７，５００，０００、７，５００，０００位～７，６００，０００位、７，６００，０００位～７，７００，０００位、７，７００，０００位～７，８００，０００位、７，８００，０００位～７，９００，０００位、７，９００，０００位～８，０００，０００位、８，０００，０００位～８，１００，０００位、８，１００，０００位～８，２００，０００位、８，２００，０００位～８，３００，０００位、８，３００，０００位～８，４００，０００位、８，４００，０００位～８，５００，０００、８，５００，０００位～８，６００，０００位、８，６００，０００位～８，７００，０００位、８，７００，０００位～８，８００，０００位、８，８００，０００位～８，９００，０００位、８，９００，０００位～９，０００，０００位、９，０００，０００位～９，１００，０００位、９，１００，０００位～９，２００，０００位、９，２００，０００位～９，３００，０００位、９，３００，０００位～９，４００，０００位、９，４００，０００位～９，５００，０００、９，５００，０００位～９，６００，０００位、９，６００，０００位～９，７００，０００位、９，７００，０００位～９，８００，０００位、９，８００，０００位～９，９００，０００位、９，９００，０００位～１０，０００，０００位、１０，０００，０００位～１０，１００，０００位、１０，１００，０００位～１０，２００，０００位、１０，２００，０００位～１０，３００，０００位、１０，３００，０００位～１０，４００，０００位、１０，４００，０００位～１０，５００，０００、１０，５００，０００位～１０，６００，０００位、１０，６００，０００位～１０，７００，０００位、１０，７００，０００位～１０，８００，０００位、１０，８００，０００位～１０，９００，０００位、１０，９００，０００位～１１，０００，０００位、１１，０００，０００位～１１，１００，０００位、１１，１００，０００位～１１，２００，０００位、１１，２００，０００位～１１，３００，０００位、１１，３００，０００位～１１，４００，０００位、１１，４００，０００位～１１，５００，０００、１１，５００，０００位～１１，６００，０００位、１１，６００，０００位～１１，７００，０００位、１１，７００，０００位～１１，８００，０００位、１１，８００，０００位～１１，９００，０００位、１１，９００，０００位～１２，０００，０００位、１２，０００，０００位～１２，１００，０００位、１２，１００，０００位～１２，２００，０００位、１２，２００，０００位～１２，３００，０００位、１２，３００，０００位～１２，４００，０００位、１２，４００，０００位～１２，５００，０００、１２，５００，０００位～１２，６００，０００位、１２，６００，０００位～１２，７００，０００位、１２，７００，０００位～１２，８００，０００位、１２，８００，０００位～１２，９００，０００位、１２，９００，０００位～１３，０００，０００位、１３，０００，０００位～１３，１００，０００位、１３，１００，０００位～１３，２００，０００位、１３，２００，０００位～１３，３００，０００位、１３，３００，０００位～１３，４００，０００位、１３，４００，０００位～１３，５００，０００、１３，５００，０００位～１３，６００，０００位、１３，６００，０００位～１３，７００，０００位、１３，７００，０００位～１３，８００，０００位、１３，８００，０００位～１３，９００，０００位、１３，９００，０００位～１４，０００，０００位、１４，０００，０００位～１４，１００，０００位、１４，１００，０００位～１４，２００，０００位、１４，２００，０００位～１４，３００，０００位、１４，３００，０００位～１４，４００，０００位、１４，４００，０００位～１４，５００，０００、１４，５００，０００位～１４，６００，０００位、１４，６００，０００位～１４，７００，０００位、１４，７００，０００位～１４，８００，０００位、１４，８００，０００位～１４，９００，０００位、１４，９００，０００位～１５，０００，０００位、１５，０００，０００位～１５，１００，０００位、１５，１００，０００位～１５，２００，０００位、１５，２００，０００位～１５，３００，０００位、１５，３００，０００位～１５，４００，０００位、１５，４００，０００位～１５，５００，０００、１５，５００，０００位～１５，６００，０００位、１５，６００，０００位～１５，７００，０００位、１５，７００，０００位～１５，８００，０００位、１５，８００，０００位～１５，９００，０００位、１５，９００，０００位～１６，０００，０００位、１６，０００，０００位～１６，１００，０００位、１６，１００，０００位～１６，２００，０００位、１６，２００，０００位～１６，３００，０００位、１６，３００，０００位～１６，４００，０００位、１６，４００，０００位～１６，５００，０００、１６，５００，０００位～１６，６００，０００位、１６，６００，０００位～１６，７００，０００位、１６，７００，０００位～１６，８００，０００位、１６，８００，０００位～１６，９００，０００位、１６，９００，０００位～１７，０００，０００位、１７，０００，０００位～１７，１００，０００位、１７，１００，０００位～１７，２００，０００位、１７，２００，０００位～１７，３００，０００位、１７，３００，０００位～１７，４００，０００位、１７，４００，０００位～１７，５００，０００、１７，５００，０００位～１７，６００，０００位、１７，６００，０００位～１７，７００，０００位、１７，７００，０００位～１７，８００，０００位、１７，８００，０００位～１７，９００，０００位、１７，９００，０００位～１８，０００，０００位、１８，０００，０００位～１８，１００，０００位、１８，１００，０００位～１８，２００，０００位、１８，２００，０００位～１８，３００，０００位、１８，３００，０００位～１８，４００，０００位、１８，４００，０００位～１８，５００，０００、１８，５００，０００位～１８，６００，０００位、１８，６００，０００位～１８，７００，０００位、１８，７００，０００位～１８，８００，０００位、１８，８００，０００位～１８，９００，０００位、１８，９００，０００位～１９，０００，０００位、１９，０００，０００位～１９，１００，０００位、１９，１００，０００位～１９，２００，０００位、１９，２００，０００位～１９，３００，０００位、１９，３００，０００位～１９，４００，０００位、１９，４００，０００位～１９，５００，０００、１９，５００，０００位～１９，６００，０００位、１９，６００，０００位～１９，７００，０００位、１９，７００，０００位～１９，８００，０００位、１９，８００，０００位～１９，９００，０００位、１９，９００，０００位～２０，０００，０００位、２０，０００，０００位～２０，１００，０００位、２０，１００，０００位～２０，２００，０００位、２０，２００，０００位～２０，３００，０００位、２０，３００，０００位～２０，４００，０００位、２０，４００，０００位～２０，５００，０００、２０，５００，０００位～２０，６００，０００位、２０，６００，０００位～２０，７００，０００位、２０，７００，０００位～２０，８００，０００位、２０，８００，０００位～２０，９００，０００位、２０，９００，０００位～２１，０００，０００位、２１，０００，０００位～２１，１００，０００位、２１，１００，０００位～２１，２００，０００位、２１，２００，０００位～２１，３００，０００位、２１，３００，０００位～２１，４００，０００位、２１，４００，０００位～２１，５００，０００、２１，５００，０００位～２１，６００，０００位、２１，６００，０００位～２１，７００，０００位、２１，７００，０００位～２１，８００，０００位、２１，８００，０００位～２１，９００，０００位、２１，９００，０００位～２２，０００，０００位、２２，０００，０００位～２２，１００，０００位、２２
，１００，０００位～２２，２００，０００位、２２，２００，０００位～２２，３００，０００位、２２，３００，０００位～２２，４００，０００位、２２，４００，０００位～２２，５００，０００、２２，５００，０００位～２２，６００，０００位、２２，６００，０００位～２２，７００，０００位、２２，７００，０００位～２２，８００，０００位、２２，８００，０００位～２２，９００，０００位、２２，９００，０００位～２３，０００，０００位、２３，０００，０００位～２３，１００，０００位、２３，１００，０００位～２３，２００，０００位、２３，２００，０００位～２３，３００，０００位、２３，３００，０００位～２３，４００，０００位、２３，４００，０００位～２３，５００，０００、２３，５００，０００位～２３，６００，０００位、２３，６００，０００位～２３，７００，０００位、２３，７００，０００位～２３，８００，０００位、２３，８００，０００位～２３，９００，０００位、２３，９００，０００位～２４，０００，０００位、２４，０００，０００位～２４，１００，０００位、２４，１００，０００位～２４，２００，０００位、２４，２００，０００位～２４，３００，０００位、２４，３００，０００位～２４，４００，０００位、２４，４００，０００位～２４，５００，０００、２４，５００，０００位～２４，６００，０００位、２４，６００，０００位～２４，７００，０００位、２４，７００，０００位～２４，８００，０００位、２４，８００，０００位～２４，９００，０００位、２４，９００，０００位～２５，０００，０００位、２５，０００，０００位～２５，１００，０００位、２５，１００，０００位～２５，２００，０００位、２５，２００，０００位～２５，３００，０００位、２５，３００，０００位～２５，４００，０００位、２５，４００，０００位～２５，５００，０００、２５，５００，０００位～２５，６００，０００位、２５，６００，０００位～２５，７００，０００位、２５，７００，０００位～２５，８００，０００位、２５，８００，０００位～２５，９００，０００位、２５，９００，０００位～２６，０００，０００位、２６，０００，０００位～２６，１００，０００位、２６，１００，０００位～２６，２００，０００位、２６，２００，０００位～２６，２９４，０５６位である。

【0162】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、上記で示した配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列の１位～１００，０００位から２６，２００，０００位～２６，２９４，０５６位の範囲のいずれかの、１位～１，０００位、１，０００位～２，０００位、２，０００位～３，０００位、３，０００位～４，０００位、４，０００位～５，０００位、５，０００位～６，０００位、６，０００位～７，０００位、７，０００位～８，０００位、８，０００位～９，０００位、９，０００位～１０，０００位、１０，０００位～１１，０００位、１１，０００位～１２，０００位、１２，０００位～１３，０００位、１３，０００位～１４，０００位、１４，０００位～１５，０００位、１５，０００位～１６，０００位、１６，０００位～１７，０００位、１７，０００位～１８，０００位、１８，０００位～１９，０００位、１９，０００位～２０，０００位、２０，０００位～２１，０００位、２１，０００位～２２，０００位、２２，０００位～２３，０００位、２３，０００位～２４，０００位、２４，０００位～２５，０００位、２５，０００位～２６，０００位、２６，０００位～２７，０００位、２７，０００位～２８，０００位、２８，０００位～２９，０００位、２９，０００位～３０，０００位、３０，０００位～３１，０００位、３１，０００位～３２，０００位、３２，０００位～３３，０００位、３３，０００位～３４，０００位、３４，０００位～３５，０００位、３５，０００位～３６，０００位、３６，０００位～３７，０００位、３７，０００位～３８，０００位、３８，０００位～３９，０００位、３９，０００位～４０，０００位、４０，０００位～４１，０００位、４１，０００位～４２，０００位、４２，０００位～４３，０００位、４３，０００位～４４，０００位、４４，０００位～４５，０００位、４５，０００位～４６，０００位、４６，０００位～４７，０００位、４７，０００位～４８，０００位、４８，０００位～４９，０００位、４９，０００位～５０，０００位、５０，０００位～５１，０００位、５１，０００位～５２，０００位、５２，０００位～５３，０００位、５３，０００位～５４，０００位、５４，０００位～５５，０００位、５５，０００位～５６，０００位、５６，０００位～５７，０００位、５７，０００位～５８，０００位、５８，０００位～５９，０００位、５９，０００位～６０，０００位、６０，０００位～６１，０００位、６１，０００位～６２，０００位、６２，０００位～６３，０００位、６３，０００位～６４，０００位、６４，０００位～６５，０００位、６５，０００位～６６，０００位、６６，０００位～６７，０００位、６７，０００位～６８，０００位、６８，０００位～６９，０００位、６９，０００位～７０，０００位、７０，０００位～７１，０００位、７１，０００位～７２，０００位、７２，０００位～７３，０００位、７３，０００位～７４，０００位、７４，０００位～７５，０００位、７５，０００位～７６，０００位、７６，０００位～７７，０００位、７７，０００位～７８，０００位、７８，０００位～７９，０００位、７９，０００位～８０，０００位、８０，０００位～８１，０００位、８１，０００位～８２，０００位、８２，０００位～８３，０００位、８３，０００位～８４，０００位、８４，０００位～８５，０００位、８５，０００位～８６，０００位、８６，０００位～８７，０００位、８７，０００位～８８，０００位、８８，０００位～８９，０００位、８９，０００位～９０，０００位、９０，０００位～９１，０００位、９１，０００位～９２，０００位、９２，０００位～９３，０００位、９３，０００位～９４，０００位、９４，０００位～９５，０００位、９５，０００位～９６，０００位、９６，０００位～９７，０００位、９７，０００位～９８，０００位、９８，０００位～９９，０００位、または９９，０００位～１００，０００位である。

【0163】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、上記で示した配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列の部分範囲１位～１，０００位から９９，０００位～１００，０００位のいずれかの、１位～１０位、１０位～２０位、２０位～３０位、３０位～４０位、４０位～５０位、５０位～６０位、６０位～７０位、７０位～８０位、８０位～９０位、９０位～１００位、１００位～１１０位、１１０位～１２０位、１２０位～１３０位、１３０位～１４０位、１４０位～１５０位、１５０位～１６０位、１６０位～１７０位、１７０位～１８０位、１８０位～１９０位、１９０位～２００位、２００位～２１０位、２１０位～２２０位、２２０位～２３０位、２３０位～２４０位、２４０位～２５０位、２５０位～２６０位、２６０位～２７０位、２７０位～２８０位、２８０位～２９０位、２９０位～３００位、３００位～３１０位、３１０位～３２０位、３２０位～３３０位、３３０位～３４０位、３４０位～３５０位、３５０位～３６０位、３６０位～３７０位、３７０位～３８０位、３８０位～３９０位、３９０位～４００位、４００位～４１０位、４１０位～４２０位、４２０位～４３０位、４３０位～４４０位、４４０位～４５０位、４５０位～４６０位、４６０位～４７０位、４７０位～４８０位、４８０位～４９０位、４９０位～５００位、５００位～５１０位、５１０位～５２０位、５２０位～５３０位、５３０位～５４０位、５４０位～５５０位、５５０位～５６０位、５６０位～５７０位、５７０位～５８０位、５８０位～５９０位、５９０位～６００位、６００位～６１０位、６１０位～６２０位、６２０位～６３０位、６３０位～６４０位、６４０位～６５０位、６５０位～６６０位、６６０位～６７０位、６７０位～６８０位、６８０位～６９０位、６９０位～７００位、７００位～７１０位、７１０位～７２０位、７２０位～７３０位、７３０位～７４０位、７４０位～７５０位、７５０位～７６０位、７６０位～７７０位、７７０位～７８０位、７８０位～７９０位、７９０位～８００位、８００位～８１０位、８１０位～８２０位、８２０位～８３０位、８３０位～８４０位、８４０位～８５０位、８５０位～８６０位、８６０位～８７０位、８７０位～８８０位、８８０位～８９０位、８９０位～９００位、９００位～９１０位、９１０位～９２０位、９２０位～９３０位、９３０位～９４０位、９４０位～９５０位、９５０位～９６０位、９６０位～９７０位、９７０位～９８０位、９８０位～９９０位、９９０位～１０００位、１位～１００位、１００位～２００位、２００位～３００位、３００位～４００位、４００位～５００位、５００位～６００位、６００位～７００位、７００位～８００位、８００位～９００位、または９００位～１０００位である。

【0164】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７に定める配列から上流または下流の、約１位から約１０位、約１０位から約２０位、約２０位から約３０位、約３０位から約４０位、約４０位から約５０位、約５０位から約６０位、約６０位から約７０位、約７０位から約８０位、約８０位から約９０位、約９０位から約１００位、約１００位から約１１０位、約１１０位から約１２０位、約１２０位から約１３０位、約１３０位から約１４０位、約１４０位から約１５０位、約１５０位から約１６０位、約１６０位から約１７０位、約１７０位から約１８０位、約１８０位から約１９０位、約１９０位から約２００位、約２００位から約２１０位、約２１０位から約２２０位、約２２０位から約２３０位、約２３０位から約２４０位、約２４０位から約２５０位、約２５０位から約２６０位、約２６０位から約２７０位、約２７０位から約２８０位、約２８０位から約２９０位、約２９０位から約３００位、約３００位から約３１０位、約３１０位から約３２０位、約３２０位から約３３０位、約３３０位から約３４０位、約３４０位から約３５０位、約３５０位から約３６０位、約３６０位から約３７０位、約３７０位から約３８０位、約３８０位から約３９０位、約３９０位から約４００位、約４００位から約４１０位、約４１０位から約４２０位、約４２０位から約４３０位、約４３０位から約４４０位、約４４０位から約４５０位、約４５０位から約４６０位、約４６０位から約４７０位、約４７０位から約４８０位、約４８０位から約４９０位、約４９０位から約５００位、約５００位から約５１０位、約５１０位から約５２０位、約５２０位から約５３０位、約５３０位から約５４０位、約５４０位から約５５０位、約５５０位から約５６０位、約５６０位から約５７０位、約５７０位から約５８０位、約５８０位から約５９０位、約５９０位から約６００位、約６００位から約６１０位、約６１０位から約６２０位、約６２０位から約６３０位、約６３０位から約６４０位、約６４０位から約６５０位、約６５０位から約６６０位、約６６０位から約６７０位、約６７０位から約６８０位、約６８０位から約６９０位、約６９０位から約７００位、約７００位から約７１０位、約７１０位から約７２０位、約７２０位から約７３０位、約７３０位から約７４０位、約７４０位から約７５０位、約７５０位から約７６０位、約７６０位から約７７０位、約７７０位から約７８０位、約７８０位から約７９０位、約７９０位から約８００位、約８００位から約８１０位、約８１０位から約８２０位、約８２０位から約８３０位、約８３０位から約８４０位、約８４０位から約８５０位、約８５０位から約８６０位、約８６０位から約８７０位、約８７０位から約８８０位、約８８０位から約８９０位、約８９０位から約９００位、約９００位から約９１０位、約９１０位から約９２０位、約９２０位から約９３０位、約９３０位から約９４０位、約９４０位から約９５０位、約９５０位から約９６０位、約９６０位から約９７０位、約９７０位から約９８０位、約９８０位から約９９０位、約９９０位から約１０００位、約１，０００位から約２，０００位、約２，０００位から約３，０００位、約３，０００位から約４，０００位、約４，０００位から約５，０００位、約５，０００位から約６，０００位、約６，０００位から約７，０００位、約７，０００位から約８，０００位、約８，０００位から約９，０００位、約９，０００位から約１０，０００位、約１０，０００位から約１１，０００位、約１１，０００位から約１２，０００位、約１２，０００位から約１３，０００位、約１３，０００位から約１４，０００位、約１４，０００位から約１５，０００位、約１５，０００位から約１６，０００位、約１６，０００位から約１７，０００位、約１７，０００位から約１８，０００位、約１８，０００位から約１９，０００位、約１９，０００位から約２０，０００位、約２０，０００位から約２１，０００位、約２１，０００位から約２２，０００位、約２２，０００位から約２３，０００位、約２３，０００位から約２４，０００位、約２４，０００位から約２５，０００位、約２５，０００位から約２６，０００位、約２６，０００位から約２７，０００位、約２７，０００位から約２８，０００位、約２８，０００位から約２９，０００位、約２９，０００位から約３０，０００位、約３０，０００位から約３１，０００位、約３１，０００位から約３２，０００位、約３２，０００位から約３３，０００位、約３３，０００位から約３４，０００位、約３４，０００位から約３５，０００位、約３５，０００位から約３６，０００位、約３６，０００位から約３７，０００位、約３７，０００位から約３８，０００位、約３８，０００位から約３９，０００位、約３９，０００位から約４０，０００位、約４０，０００位から約４１，０００位、約４１，０００位から約４２，０００位、約４２，０００位から約４３，０００位、約４３，０００位から約４４，０００位、約４４，０００位から約４５，０００位、約４５，０００位から約４６，０００位、約４６，０００位から約４７，０００位、約４７，０００位から約４８，０００位、約４８，０００位から約４９，０００位、約４９，０００位から約５０，０００位、約５０，０００位から約５１，０００位、約５１，０００位から約５２，０００位、約５２，０００位から約５３，０００位、約５３，０００位から約５４，０００位、約５４，０００位から約５５，０００位、約５５，０００位から約５６，０００位、約５６，０００位から約５７，０００位、約５７，０００位から約５８，０００位、約５８，０００位から約５９，０００位、約５９，０００位から約６０，０００位、約６０，０００位から約６１，０００位、約６１，０００位から約６２，０００位、約６２，０００位から約６３，０００位、約６３，０００位から約６４，０００位、約６４，０００位から約６５，０００位、約６５，０００位から約６６，０００位、約６６，０００位から約６７，０００位、約６７，０００位から約６８，０００位、約６８，０００位から約６９，０００位、約６９，０００位から約７０，０００位、約７０，０００位から約７１，０００位、約７１，０００位から約７２，０００位、約７２，０００位から約７３，０００位、約７３，０００位から約７４，０００位、約７４，０００位から約７５，０００位、約７５，０００位から約７６，０００位、約７６，０００位から約７７，０００位、約７７，０００位から約７８，０００位、約７８，０００位から約７９，０００位、約７９，０００位から約８０，０００位、約８０，０００位から約８１，０００位、約８１，０００位から約８２，０００位、約８２，０００位から約８３，０００位、約８３，０００位から約８４，０００位、約８４，０００位から約８５，０００位、約８５，０００位から約８６，０００位、約８６，０００位から約８７，０００位、約８７，０００位から約８８，０００位、約８８，０００位から約８９，０００位、約８９，０００位から約９０，０００位、約９０，０００位から約９１，０００位、約９１，０００位から約９２，０００位、約９２，０００位から約９３，０００位、約９３，０００位から約９４，０００位、約９４，０００位から約９５，０００位、約９５，０００位から約９６，０００位、約９６，０００位から約９７，０００位、約９７，０００位から約９８，０００位、約９８，０００位から約９９，０００位、約９９，０００位から約１００，０００位、約１００，０００位から約２００，０００位、約２００，０００位から約３００，０００位、約３００，０００位から約４００，０００位、約４００，０００位から約５００，０００位、約５００，０００位から約６００，０００位、約６００，０００位から約７００，０００位、約７００，０００位から約８００，０００位、約８００，０００位から約９００，０００位、約９００，０００位から約１，０００，０００位、約１，０００，０００位から約１，１００，０００位、約１，１００，０００位から約１，２００，０００位、約１，２００，０００位から約１，３００，０００位、約１，３００，０００位から約１，４００，０００位、約１，４００，０００位から約１，５００，０００位、約１，５００，０００位から約１，６００，０００位、約１，６００，０００位から約１，７００，０００位、約１，７００，０００位から約１，８００，０００位、約１，８００，０００位から約１，９００，０００位、約１，９００，０００位から約２，０００，０００位、約２，０００，０００位から約２，１００，０００位、約２，１００，０００位から約２，２００，０００位、約２，２００，０００位から約２，３００，０００位、約２，３００，０００位から約２，４００，０００位、約２，４００，０００位から約２，５００，０００位、約２，５００，０００位から約２，６００，０００位、約２，６００，０００位から約２，７００，０００位、約２，７００，０００位から約２，８００，０００位、約２，８００，０００位から約２，９００，０００位、約２，９００，０００位から約３，０００，０００位、約３，０００，０００位から約３，１００，０００位、約３，１００，０００位から約３，２００，０００位、約３，２００，０００位から約３，３００，０００位、約３，３００，０００位から約３，４００，０００位、約３，４００，０００位から約３，５００，０００位、約３，５００，０００位から約３，６００，０００位、約３，６００，０００位から約３，７００，０００位、約３，７００，０００位から約３，８００，０００位、約３，８００，０００位から約３，９００，０００位、約３，９００，０００位から約４，０００，０００位、約４，０００，０００位から約４，１００，０００位、約４，１００，０００位から約４，２００，０００位、約４，２００，０００位から約４，３００，０００位、約４，３００，０００位から約４，４００，０００位、約４，４００，０００位から約４，５００，０００位、約４，５００，０００位から約４，６００，０００位、約４，６００，０００位から約４，７００，０００位、約４，７００，０００位から約４，８００，０００位、約４，８００，０００位から約４，９００，０００位、約４，９００，０００位から約５，０００，０００位、約５，０００，０００位から約５，１００，０００位、約５，１００，０００位から約５，２００，０００位、約５，２００，０００位から約５，３００，０００位、約５，３００，０００位から約５，４００，０００位、約５，４００，０００位から約５，５００，０００位、約５，５００，０００位から約５，６００，０００位、約５，６００，０００位から約５，７００，０００位、約５，７００，０００位から約５，８００，０００位、約５，８００，０００位から約５，９００，０００位、約５，９００，０００位から約６，０００，０００位、約６，０００，０００位から約６，１００，０００位、約６，１００，０００位から約６，２００，０００位、約６，２００，０００位から約６，３００，０００位、約６，３００，０００位から約６，４００，０００位、約６，４００，０００位から約６，５００，０００位、約６，５００，０００位から約６，６００，０００位、約６，６００，０００位から約６，７００，０００位、約６，７００，０００位から約６，８００，０００位、約６，８００，０００位から約６，９００，０００位、約６，９００，０００位から約７，０００，０００位、約７，０００，０００位から約７，１００，０００位、約７，１００，０００位から約７，２００，０００位、約７，２００，０００位から約７，３００，０００位、約７，３００，０００位から約７，４００，０００位、約７，４００，０００位から約７，５００，０００位、約７，５００，０００位から約７，６００，０００位、約７，６００，０００位から約７，７００，０００位、約７，７００，０００位から約７，８００，０００位、約７，８００，０００位から約７，９００，０００位、約７
，９００，０００位から約８，０００，０００位、約８，０００，０００位から約８，１００，０００位、約８，１００，０００位から約８，２００，０００位、約８，２００，０００位から約８，３００，０００位、約８，３００，０００位から約８，４００，０００位、約８，４００，０００位から約８，５００，０００位、約８，５００，０００位から約８，６００，０００位、約８，６００，０００位から約８，７００，０００位、約８，７００，０００位から約８，８００，０００位、約８，８００，０００位から約８，９００，０００位、約８，９００，０００位から約９，０００，０００位、約９，０００，０００位から約９，１００，０００位、約９，１００，０００位から約９，２００，０００位、約９，２００，０００位から約９，３００，０００位、約９，３００，０００位から約９，４００，０００位、約９，４００，０００位から約９，５００，０００位、約９，５００，０００位から約９，６００，０００位、約９，６００，０００位から約９，７００，０００位、約９，７００，０００位から約９，８００，０００位、約９，８００，０００位から約９，９００，０００位、約９，９００，０００位から約１０，０００，０００位、約１０，０００，０００位から約１０，１００，０００位、約１０，１００，０００位から約１０，２００，０００位、約１０，２００，０００位から約１０，３００，０００位、約１０，３００，０００位から約１０，４００，０００位、約１０，４００，０００位から約１０，５００，０００位、約１０，５００，０００位から約１０，６００，０００位、約１０，６００，０００位から約１０，７００，０００位、約１０，７００，０００位から約１０，８００，０００位、約１０，８００，０００位から約１０，９００，０００位、約１０，９００，０００位から約１１，０００，０００位、約１１，０００，０００位から約１１，１００，０００位、約１１，１００，０００位から約１１，２００，０００位、約１１，２００，０００位から約１１，３００，０００位、約１１，３００，０００位から約１１，４００，０００位、約１１，４００，０００位から約１１，５００，０００位、約１１，５００，０００位から約１１，６００，０００位、約１１，６００，０００位から約１１，７００，０００位、約１１，７００，０００位から約１１，８００，０００位、約１１，８００，０００位から約１１，９００，０００位、約１１，９００，０００位から約１２，０００，０００位、約１２，０００，０００位から約１２，１００，０００位、約１２，１００，０００位から約１２，２００，０００位、約１２，２００，０００位から約１２，３００，０００位、約１２，３００，０００位から約１２，４００，０００位、約１２，４００，０００位から約１２，５００，０００位、約１２，５００，０００位から約１２，６００，０００位、約１２，６００，０００位から約１２，７００，０００位、約１２，７００，０００位から約１２，８００，０００位、約１２，８００，０００位から約１２，９００，０００位、約１２，９００，０００位から約１３，０００，０００位、約１３，０００，０００位から約１３，１００，０００位、約１３，１００，０００位から約１３，２００，０００位、約１３，２００，０００位から約１３，３００，０００位、約１３，３００，０００位から約１３，４００，０００位、約１３，４００，０００位から約１３，５００，０００位、約１３，５００，０００位から約１３，６００，０００位、約１３，６００，０００位から約１３，７００，０００位、約１３，７００，０００位から約１３，８００，０００位、約１３，８００，０００位から約１３，９００，０００位、約１３，９００，０００位から約１４，０００，０００位、約１４，０００，０００位から約１４，１００，０００位、約１４，１００，０００位から約１４，２００，０００位、約１４，２００，０００位から約１４，３００，０００位、約１４，３００，０００位から約１４，４００，０００位、約１４，４００，０００位から約１４，５００，０００位、約１４，５００，０００位から約１４，６００，０００位、約１４，６００，０００位から約１４，７００，０００位、約１４，７００，０００位から約１４，８００，０００位、約１４，８００，０００位から約１４，９００，０００位、約１４，９００，０００位から約１５，０００，０００位、約１５，０００，０００位から約１５，１００，０００位、約１５，１００，０００位から約１５，２００，０００位、約１５，２００，０００位から約１５，３００，０００位、約１５，３００，０００位から約１５，４００，０００位、約１５，４００，０００位から約１５，５００，０００位、約１５，５００，０００位から約１５，６００，０００位、約１５，６００，０００位から約１５，７００，０００位、約１５，７００，０００位から約１５，８００，０００位、約１５，８００，０００位から約１５，９００，０００位、約１５，９００，０００位から約１６，０００，０００位、約１６，０００，０００位から約１６，１００，０００位、約１６，１００，０００位から約１６，２００，０００位、約１６，２００，０００位から約１６，３００，０００位、約１６，３００，０００位から約１６，４００，０００位、約１６，４００，０００位から約１６，５００，０００位、約１６，５００，０００位から約１６，６００，０００位、約１６，６００，０００位から約１６，７００，０００位、約１６，７００，０００位から約１６，８００，０００位、約１６，８００，０００位から約１６，９００，０００位、約１６，９００，０００位から約１７，０００，０００位、約１７，０００，０００位から約１７，１００，０００位、約１７，１００，０００位から約１７，２００，０００位、約１７，２００，０００位から約１７，３００，０００位、約１７，３００，０００位から約１７，４００，０００位、約１７，４００，０００位から約１７，５００，０００位、約１７，５００，０００位から約１７，６００，０００位、約１７，６００，０００位から約１７，７００，０００位、約１７，７００，０００位から約１７，８００，０００位、約１７，８００，０００位から約１７，９００，０００位、約１７，９００，０００位から約１８，０００，０００位、約１８，０００，０００位から約１８，１００，０００位、約１８，１００，０００位から約１８，２００，０００位、約１８，２００，０００位から約１８，３００，０００位、約１８，３００，０００位から約１８，４００，０００位、約１８，４００，０００位から約１８，５００，０００位、約１８，５００，０００位から約１８，６００，０００位、約１８，６００，０００位から約１８，７００，０００位、約１８，７００，０００位から約１８，８００，０００位、約１８，８００，０００位から約１８，９００，０００位、約１８，９００，０００位から約１９，０００，０００位、約１９，０００，０００位から約１９，１００，０００位、約１９，１００，０００位から約１９，２００，０００位、約１９，２００，０００位から約１９，３００，０００位、約１９，３００，０００位から約１９，４００，０００位、約１９，４００，０００位から約１９，５００，０００位、約１９，５００，０００位から約１９，６００，０００位、約１９，６００，０００位から約１９，７００，０００位、約１９，７００，０００位から約１９，８００，０００位、約１９，８００，０００位から約１９，９００，０００位、約１９，９００，０００位から約２０，０００，０００位、約２０，０００，０００位から約２０，１００，０００位、約２０，１００，０００位から約２０，２００，０００位、約２０，２００，０００位から約２０，３００，０００位、約２０，３００，０００位から約２０，４００，０００位、約２０，４００，０００位から約２０，５００，０００位、約２０，５００，０００位から約２０，６００，０００位、約２０，６００，０００位から約２０，７００，０００位、約２０，７００，０００位から約２０，８００，０００位、約２０，８００，０００位から約２０，９００，０００位、約２０，９００，０００位から約２１，０００，０００位、約２１，０００，０００位から約２１，１００，０００位、約２１，１００，０００位から約２１，２００，０００位、約２１，２００，０００位から約２１，３００，０００位、約２１，３００，０００位から約２１，４００，０００位、約２１，４００，０００位から約２１，５００，０００位、約２１，５００，０００位から約２１，６００，０００位、約２１，６００，０００位から約２１，７００，０００位、約２１，７００，０００位から約２１，８００，０００位、約２１，８００，０００位から約２１，９００，０００位、約２１，９００，０００位から約２２，０００，０００位、約２２，０００，０００位から約２２，１００，０００位、約２２，１００，０００位から約２２，２００，０００位、約２２，２００，０００位から約２２，３００，０００位、約２２，３００，０００位から約２２，４００，０００位、約２２，４００，０００位から約２２，５００，０００位、約２２，５００，０００位から約２２，６００，０００位、約２２，６００，０００位から約２２，７００，０００位、約２２，７００，０００位から約２２，８００，０００位、約２２，８００，０００位から約２２，９００，０００位、約２２，９００，０００位から約２３，０００，０００位、約２３，０００，０００位から約２３，１００，０００位、約２３，１００，０００位から約２３，２００，０００位、約２３，２００，０００位から約２３，３００，０００位、約２３，３００，０００位から約２３，４００，０００位、約２３，４００，０００位から約２３，５００，０００位、約２３，５００，０００位から約２３，６００，０００位、約２３，６００，０００位から約２３，７００，０００位、約２３，７００，０００位から約２３，８００，０００位、約２３，８００，０００位から約２３，９００，０００位、約２３，９００，０００位から約２４，０００，０００位、約２４，０００，０００位から約２４，１００，０００位、約２４，１００，０００位から約２４，２００，０００位、約２４，２００，０００位から約２４，３００，０００位、約２４，３００，０００位から約２４，４００，０００位、約２４，４００，０００位から約２４，５００，０００位、約２４，５００，０００位から約２４，６００，０００位、約２４，６００，０００位から約２４，７００，０００位、約２４，７００，０００位から約２４，８００，０００位、約２４，８００，０００位から約２４，９００，０００位、約２４，９００，０００位から約２５，０００，０００位、約２５，０００，０００位から約２５，１００，０００位、約２５，１００，０００位から約２５，２００，０００位、約２５，２００，０００位から約２５，３００，０００位、約２５，３００，０００位から約２５，４００，０００位、約２５，４００，０００位から約２５，５００，０００位、約２５，５００，０００位から約２５，６００，０００位、約２５，６００，０００位から約２５，７００，０００位、約２５，７００，０００位から約２５，８００，０００位、約２５，８００，０００位から約２５，９００，０００位、約２５，９００，０００位から約２６，０００，０００位に位置する。

【0165】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７に定める配列から、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１５０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１７０個、少なくとも約１８０個、少なくとも約１９０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２１０個、少なくとも約２２０個、少なくとも約２３０個、少なくとも約２４０個、少なくとも約２５０個、少なくとも約２６０個、少なくとも約２７０個、少なくとも約２８０個、少なくとも約２９０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３１０個、少なくとも約３２０個、少なくとも約３３０個、少なくとも約３４０個、少なくとも約３５０個、少なくとも約３６０個、少なくとも約３７０個、約３８０個、少なくとも約３９０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４１０個、少なくとも約４２０個、少なくとも約４３０個、少なくとも約４４０個、少なくとも約４５０個、少なくとも約４６０個、少なくとも約４７０個、少なくとも約４８０個、少なくとも約４９０個、少なくとも約５００個、少なくとも約５１０個、少なくとも約５２０個、少なくとも約５３０個、少なくとも約５４０個、少なくとも約５５０個、少なくとも約５６０個、少なくとも約５７０個、少なくとも約５８０個、少なくとも約５９０個、少なくとも約６００個、少なくとも約６１０個、少なくとも約６２０個、少なくとも約６３０個、少なくとも約６４０個、少なくとも約６５０個、少なくとも約６６０個、少なくとも約６７０個、少なくとも約６８０個、少なくとも約６９０個、少なくとも約７００個、少なくとも約７１０個、少なくとも約７２０個、少なくとも約７３０個、少なくとも約７４０個、少なくとも約７５０個、少なくとも約７６０個、少なくとも約７７０個、少なくとも約７８０個、少なくとも約７９０個、少なくとも約８００個、少なくとも約８１０個、少なくとも約８２０個、少なくとも約８３０個、少なくとも約８４０個、少なくとも約８５０個、少なくとも約８６０個、少なくとも約８７０個、少なくとも約８８０個、少なくとも約８９０個、少なくとも約９００個、少なくとも約９１０個、少なくとも約９２０個、少なくとも約９３０個、少なくとも約９４０個、少なくとも約９５０個、少なくとも約９６０個、少なくとも約９７０個、少なくとも約９８０個、少なくとも約９９０個、少なくとも約１，０００個、少なくとも約２，０００個、少なくとも約３，０００個、少なくとも約４，０００個、少なくとも約５，０００個、少なくとも約６，０００個、少なくとも約７，０００個、少なくとも約８，０００個、少なくとも約９，０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約１１，０００個、少なくとも約１２，０００個、少なくとも約１３，０００個、少なくとも約１４，０００個、少なくとも約１５，０００個、少なくとも約１６，０００個、少なくとも約１７，０００個、少なくとも約１８，０００個、少なくとも約１９，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約２１，０００個、少なくとも約２２，０００個、少なくとも約２３，０００個、少なくとも約２４，０００個、少なくとも約２５，０００個、少なくとも約２６，０００個、少なくとも約２７，０００個、少なくとも約２８，０００個、少なくとも約２９，０００個、少なくとも約３０，０００個、少なくとも約３１，０００個、少なくとも約３２，０００個、少なくとも約３３，０００個、少なくとも約３４，０００個、少なくとも約３５，０００個、少なくとも約３６，０００個、少なくとも約３７，０００個、少なくとも約３８，０００個、少なくとも約３９，０００個、少なくとも約４０，０００個、少なくとも約４１，０００個、少なくとも約４２，０００個、少なくとも約４３，０００個、少なくとも約４４，０００個、少なくとも約４５，０００個、少なくとも約４６，０００個、少なくとも約４７，０００個、少なくとも約４８，０００個、少なくとも約４９，０００個、少なくとも約５０，０００個、少なくとも約５１，０００個、少なくとも約５２，０００個、少なくとも約５３，０００個、少なくとも約５４，０００個、少なくとも約５５，０００個、少なくとも約５６，０００個、少なくとも約５７，０００個、少なくとも約５８，０００個、少なくとも約５９，０００個、少なくとも約６０，０００個、少なくとも約６１，０００個、少なくとも約６２，０００個、少なくとも約６３，０００個、少なくとも約６４，０００個、少なくとも約６５，０００個、少なくとも約６６，０００個、少なくとも約６７，０００個、少なくとも約６８，０００個、少なくとも約６９，０００個、少なくとも約７０，０００個、少なくとも約７１，０００個、少なくとも約７２，０００個、少なくとも約７３，０００個、少なくとも約７４，０００個、少なくとも約７５，０００個、少なくとも約７６，０００個、少なくとも約７７，０００個、少なくとも約７８，０００個、少なくとも約７９，０００個、少なくとも約８０，０００個、少なくとも約８１，０００個、少なくとも約８２，０００個、少なくとも約８３，０００個、少なくとも約８４，０００個、少なくとも約８５，０００個、少なくとも約８６，０００個、少なくとも約８７，０００個、少なくとも約８８，０００個、少なくとも約８９，０００個、少なくとも約９０，０００個、少なくとも約９１，０００個、少なくとも約９２，０００個、少なくとも約９３，０００個、少なくとも約９４，０００個、少なくとも約９５，０００個、少なくとも約９６，０００個、少なくとも約９７，０００個、少なくとも約９８，０００個、少なくとも約９９，０００個、少なくとも約１００，０００個、少なくとも約２００，０００個、少なくとも約３００，０００個、少なくとも約４００，０００個、少なくとも約５００，０００個、少なくとも約６００，０００個、少なくとも約７００，０００個、少なくとも約８００，０００個、少なくとも約９００，０００個、少なくとも約１，０００，０００個、少なくとも約１，１００，０００個、少なくとも約１，２００，０００個、少なくとも約１，３００，０００個、少なくとも約１，４００，０００個、少なくとも約１，５００，０００個、少なくとも約１，６００，０００個、少なくとも約１，７００，０００個、少なくとも約１，８００，０００個、少なくとも約１，９００，０００個、少なくとも約２，０００，０００個、少なくとも約２，１００，０００個、少なくとも約２，２００，０００個、少なくとも約２，３００，０００個、少なくとも約２，４００，０００個、少なくとも約２，５００，０００個、少なくとも約２，６００，０００個、少なくとも約２，７００，０００個、少なくとも約２，８００，０００個、少なくとも約２，９００，０００個、少なくとも約３，０００，０００個、少なくとも約３，１００，０００個、少なくとも約３，２００，０００個、少なくとも約３，３００，０００個、少なくとも約３，４００，０００個、少なくとも約３，５００，０００個、少なくとも約３，６００，０００個、少なくとも約３，７００，０００個、少なくとも約３，８００，０００個、少なくとも約３，９００，０００個、少なくとも約４，０００，０００個、少なくとも約４，１００，０００個、少なくとも約４，２００，０００個、少なくとも約４，３００，０００個、少なくとも約４，４００，０００個、少なくとも約４，５００，０００個、少なくとも約４，６００，０００個、少なくとも約４，７００，０００個、少なくとも約４，８００，０００個、少なくとも約４，９００，０００個、少なくとも約５，０００，０００個、少なくとも約５，１００，０００個、少なくとも約５，２００，０００個、少なくとも約５，３００，０００個、少なくとも約５，４００，０００個、少なくとも約５，５００，０００個、少なくとも約５，６００，０００個、少なくとも約５，７００，０００個、少なくとも約５，８００，０００個、少なくとも約５，９００，０００個、少なくとも約６，０００，０００個、少なくとも約６，１００，０００個、少なくとも約６，２００，０００個、少なくとも約６，３００，０００個、少なくとも約６，４００，０００個、少なくとも約６，５００，０００個、少なくとも約６，６００，０００個、少なくとも約６，７００，０００個、少なくとも約６，８００，０００個、少なくとも約６，９００，０００個、少なくとも約７，０００，０００個、少なくとも約７，１００，０００個、少なくとも約７，２００，０００個、少なくとも約７，３００，０００個、少なくとも約７，４００，０００個、少なくとも約７，５００，０００個、少なくとも約７，６００，０００個、少なくとも約７，７００，０００個、少なくとも約７，８００，０００個、少なくとも約７，９００，０００個、少なくとも約８，０００，０００個、少なくとも約８，１００，０００個、少なくとも約８，２００，０００個、少なくとも約８，３００，０００個、少なくとも約８，４００，０００個、少なくとも約８，５００，０００個、少なくとも約８，６００，０００個、少なくとも約８，７００，０００個、少なくとも約８，８００，０００個、少なくとも約８，９００，０００個、少なくとも約９，０００，０００個、少なくとも約９，１００，０００個、少なくとも約９，２００，０００個、少なくとも約９，３００，０００個、少なくとも約９，４００，０００個、少なくとも約９，５００，０００個、少なくとも約９，６００，０００個、少なくとも約９，７００，０００個、少なくとも約９，８００，０００個、少なくとも約９，９００，０００個、少なくとも約１０，０００，０００個、少なくとも約１０，１００，０００個、少なくとも約１０，２００，０００個、少なくとも約１０，３００，０００個、少なくとも約１０，４００，０００個、少なくとも約１０，５００，０００個、少なくとも約１０，６００，０００個、少なくとも約１０，７００，０００個、少なくとも約１０，８００，０００個、少なくとも約１０，９００，０００個、少なくとも約１１，０００，０００個、少なくとも約１１，１００，０００個、少なくとも約１１，２００，０００個、少なくとも約１１，３００，０００個、少なくとも約１１，４００，０００個、少なくとも約１１，５００，０００個、少なくとも約１１，６００，０００個、少なくとも約１１，７００，０００個、少なくとも約１１，８００，０００個、少なくとも約１１，９００，０００個、少なくとも約１２，０００，０００個、少なくとも約１２，１００，０００個、少なくとも約１２，２００，０００個、少なくとも約１２，３００，０００個、少なくとも約１２，４００，０００個、少なくとも約１２，５００，０００個、少なくとも約１２，６００，０００個、少なくとも約１２，７００，０００個、少なくとも約１２，８００，０００個、少なくとも約１２，９００，０００個、少なくとも約１３，０００，０００個、少なくとも約１３，１００，０００個、少なくとも約１３，２００，０００個、少なくとも約１３，３００，０００個、少なくとも約１３，４００，０００個、少なくとも約１３，５００，０００個、少なくとも約１３，６００，０００個、少なくとも約１３，７００，０００個、少なくとも約１３，８００，０００個、少なくとも約１３，９００，０００個、少なくとも約１４，０００，０００個、少なくとも約１４，１００，０００個、少なくとも約１４，２００，０００個、少なくとも約１４，３００，０００個、少なくとも約１４，４００，０００個、少なくとも約１４，５００，０００個、少なくとも約１４，６００，０００個、少なくとも約１４，７００，０００個、少なくとも約１４，８００，０００個、少なくとも約１４，９００，０００個、少なくとも約１５，０００，０００個、少なくとも約１５，１００，０００個、少なくとも約１５，２００，０００個、少
なくとも約１５，３００，０００個、少なくとも約１５，４００，０００個、少なくとも約１５，５００，０００個、少なくとも約１５，６００，０００個、少なくとも約１５，７００，０００個、少なくとも約１５，８００，０００個、少なくとも約１５，９００，０００個、少なくとも約１６，０００，０００個、少なくとも約１６，１００，０００個、少なくとも約１６，２００，０００個、少なくとも約１６，３００，０００個、少なくとも約１６，４００，０００個、少なくとも約１６，５００，０００個、少なくとも約１６，６００，０００個、少なくとも約１６，７００，０００個、少なくとも約１６，８００，０００個、少なくとも約１６，９００，０００個、少なくとも約１７，０００，０００個、少なくとも約１７，１００，０００個、少なくとも約１７，２００，０００個、少なくとも約１７，３００，０００個、少なくとも約１７，４００，０００個、少なくとも約１７，５００，０００個、少なくとも約１７，６００，０００個、少なくとも約１７，７００，０００個、少なくとも約１７，８００，０００個、少なくとも約１７，９００，０００個、少なくとも約１８，０００，０００個、少なくとも約１８，１００，０００個、少なくとも約１８，２００，０００個、少なくとも約１８，３００，０００個、少なくとも約１８，４００，０００個、少なくとも約１８，５００，０００個、少なくとも約１８，６００，０００個、少なくとも約１８，７００，０００個、少なくとも約１８，８００，０００個、少なくとも約１８，９００，０００個、少なくとも約１９，０００，０００個、少なくとも約１９，１００，０００個、少なくとも約１９，２００，０００個、少なくとも約１９，３００，０００個、少なくとも約１９，４００，０００個、少なくとも約１９，５００，０００個、少なくとも約１９，６００，０００個、少なくとも約１９，７００，０００個、少なくとも約１９，８００，０００個、少なくとも約１９，９００，０００個、少なくとも約２０，０００，０００個、少なくとも約２０，１００，０００個、少なくとも約２０，２００，０００個、少なくとも約２０，３００，０００個、少なくとも約２０，４００，０００個、少なくとも約２０，５００，０００個、少なくとも約２０，６００，０００個、少なくとも約２０，７００，０００個、少なくとも約２０，８００，０００個、少なくとも約２０，９００，０００個、少なくとも約２１，０００，０００個、少なくとも約２１，１００，０００個、少なくとも約２１，２００，０００個、少なくとも約２１，３００，０００個、少なくとも約２１，４００，０００個、少なくとも約２１，５００，０００個、少なくとも約２１，６００，０００個、少なくとも約２１，７００，０００個、少なくとも約２１，８００，０００個、少なくとも約２１，９００，０００個、少なくとも約２２，０００，０００個、少なくとも約２２，１００，０００個、少なくとも約２２，２００，０００個、少なくとも約２２，３００，０００個、少なくとも約２２，４００，０００個、少なくとも約２２，５００，０００個、少なくとも約２２，６００，０００個、少なくとも約２２，７００，０００個、少なくとも約２２，８００，０００個、少なくとも約２２，９００，０００個、少なくとも約２３，０００，０００個、少なくとも約２３，１００，０００個、少なくとも約２３，２００，０００個、少なくとも約２３，３００，０００個、少なくとも約２３，４００，０００個、少なくとも約２３，５００，０００個、少なくとも約２３，６００，０００個、少なくとも約２３，７００，０００個、少なくとも約２３，８００，０００個、少なくとも約２３，９００，０００個、少なくとも約２４，０００，０００個、少なくとも約２４，１００，０００個、少なくとも約２４，２００，０００個、少なくとも約２４，３００，０００個、少なくとも約２４，４００，０００個、少なくとも約２４，５００，０００個、少なくとも約２４，６００，０００個、少なくとも約２４，７００，０００個、少なくとも約２４，８００，０００個、少なくとも約２４，９００，０００個、少なくとも約２５，０００，０００個、少なくとも約２５，１００，０００個、少なくとも約２５，２００，０００個、少なくとも約２５，３００，０００個、少なくとも約２５，４００，０００個、少なくとも約２５，５００，０００個、少なくとも約２５，６００，０００個、少なくとも約２５，７００，０００個、少なくとも約２５，８００，０００個、少なくとも約２５，９００，０００個、少なくとも２６，０００，０００個の核酸塩基、下流または上流に位置する。

【0166】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７に定める配列から、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３１０個、約３２０個、約３３０個、約３４０個、約３５０個、約３６０個、約３７０個、約３８０個、約３９０個、約４００個、約４１０個、約４２０個、約４３０個、約４４０個、約４５０個、約４６０個、約４７０個、約４８０個、約４９０個、約５００個、約５１０個、約５２０個、約５３０個、約５４０個、約５５０個、約５６０個、約５７０個、約５８０個、約５９０個、約６００個、約６１０個、約６２０個、約６３０個、約６４０個、約６５０個、約６６０個、約６７０個、約６８０個、約６９０個、約７００個、約７１０個、約７２０個、約７３０個、約７４０個、約７５０個、約７６０個、約７７０個、約７８０個、約７９０個、約８００個、約８１０個、約８２０個、約８３０個、約８４０個、約８５０個、約８６０個、約８７０個、約８８０個、約８９０個、約９００個、約９１０個、約９２０個、約９３０個、約９４０個、約９５０個、約９６０個、約９７０個、約９８０個、約９９０個、約１，０００個、約２，０００個、約３，０００個、約４，０００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１１，０００個、約１２，０００個、約１３，０００個、約１４，０００個、約１５，０００個、約１６，０００個、約１７，０００個、約１８，０００個、約１９，０００個、約２０，０００個、約２１，０００個、約２２，０００個、約２３，０００個、約２４，０００個、約２５，０００個、約２６，０００個、約２７，０００個、約２８，０００個、約２９，０００個、約３０，０００個、約３１，０００個、約３２，０００個、約３３，０００個、約３４，０００個、約３５，０００個、約３６，０００個、約３７，０００個、約３８，０００個、約３９，０００個、約４０，０００個、約４１，０００個、約４２，０００個、約４３，０００個、約４４，０００個、約４５，０００個、約４６，０００個、約４７，０００個、約４８，０００個、約４９，０００個、約５０，０００個、約５１，０００個、約５２，０００個、約５３，０００個、約５４，０００個、約５５，０００個、約５６，０００個、約５７，０００個、約５８，０００個、約５９，０００個、約６０，０００個、約６１，０００個、約６２，０００個、約６３，０００個、約６４，０００個、約６５，０００個、約６６，０００個、約６７，０００個、約６８，０００個、約６９，０００個、約７０，０００個、約７１，０００個、約７２，０００個、約７３，０００個、約７４，０００個、約７５，０００個、約７６，０００個、約７７，０００個、約７８，０００個、約７９，０００個、約８０，０００個、約８１，０００個、約８２，０００個、約８３，０００個、約８４，０００個、約８５，０００個、約８６，０００個、約８７，０００個、約８８，０００個、約８９，０００個、約９０，０００個、約９１，０００個、約９２，０００個、約９３，０００個、約９４，０００個、約９５，０００個、約９６，０００個、約９７，０００個、約９８，０００個、約９９，０００個、約１００，０００個、約２００，０００個、約３００，０００個、約４００，０００個、約５００，０００個、約６００，０００個、約７００，０００個、約８００，０００個、約９００，０００個、約１，０００，０００個、約１，１００，０００個、約１，２００，０００個、約１，３００，０００個、約１，４００，０００個、約１，５００，０００個、約１，６００，０００個、約１，７００，０００個、約１，８００，０００個、約１，９００，０００個、約２，０００，０００個、約２，１００，０００個、約２，２００，０００個、約２，３００，０００個、約２，４００，０００個、約２，５００，０００個、約２，６００，０００個、約２，７００，０００個、約２，８００，０００個、約２，９００，０００個、約３，０００，０００個、約３，１００，０００個、約３，２００，０００個、約３，３００，０００個、約３，４００，０００個、約３，５００，０００個、約３，６００，０００個、約３，７００，０００個、約３，８００，０００個、約３，９００，０００個、約４，０００，０００個、約４，１００，０００個、約４，２００，０００個、約４，３００，０００個、約４，４００，０００個、約４，５００，０００個、約４，６００，０００個、約４，７００，０００個、約４，８００，０００個、約４，９００，０００個、約５，０００，０００個、約５，１００，０００個、約５，２００，０００個、約５，３００，０００個、約５，４００，０００個、約５，５００，０００個、約５，６００，０００個、約５，７００，０００個、約５，８００，０００個、約５，９００，０００個、約６，０００，０００個、約６，１００，０００個、約６，２００，０００個、約６，３００，０００個、約６，４００，０００個、約６，５００，０００個、約６，６００，０００個、約６，７００，０００個、約６，８００，０００個、約６，９００，０００個、約７，０００，０００個、約７，１００，０００個、約７，２００，０００個、約７，３００，０００個、約７，４００，０００個、約７，５００，０００個、約７，６００，０００個、約７，７００，０００個、約７，８００，０００個、約７，９００，０００個、約８，０００，０００個、約８，１００，０００個、約８，２００，０００個、約８，３００，０００個、約８，４００，０００個、約８，５００，０００個、約８，６００，０００個、約８，７００，０００個、約８，８００，０００個、約８，９００，０００個、約９，０００，０００個、約９，１００，０００個、約９，２００，０００個、約９，３００，０００個、約９，４００，０００個、約９，５００，０００個、約９，６００，０００個、約９，７００，０００個、約９，８００，０００個、約９，９００，０００個、約１０，０００，０００個、約１０，１００，０００個、約１０，２００，０００個、約１０，３００，０００個、約１０，４００，０００個、約１０，５００，０００個、約１０，６００，０００個、約１０，７００，０００個、約１０，８００，０００個、約１０，９００，０００個、約１１，０００，０００個、約１１，１００，０００個、約１１，２００，０００個、約１１，３００，０００個、約１１，４００，０００個、約１１，５００，０００個、約１１，６００，０００個、約１１，７００，０００個、約１１，８００，０００個、約１１，９００，０００個、約１２，０００，０００個、約１２，１００，０００個、約１２，２００，０００個、約１２，３００，０００個、約１２，４００，０００個、約１２，５００，０００個、約１２，６００，０００個、約１２，７００，０００個、約１２，８００，０００個、約１２，９００，０００個、約１３，０００，０００個、約１３，１００，０００個、約１３，２００，０００個、約１３，３００，０００個、約１３，４００，０００個、約１３，５００，０００個、約１３，６００，０００個、約１３，７００，０００個、約１３，８００，０００個、約１３，９００，０００個、約１４，０００，０００個、約１４，１００，０００個、約１４，２００，０００個、約１４，３００，０００個、約１４，４００，０００個、約１４，５００，０００個、約１４，６００，０００個、約１４，７００，０００個、約１４，８００，０００個、約１４，９００，０００個、約１５，０００，０００個、約１５，１００，０００個、約１５，２００，０００個、約１５，３００，０００個、約１５，４００，０００個、約１５，５００，０００個、約１５，６００，０００個、約１５，７００，０００個、約１５，８００，０００個、約１５，９００，０００個、約１６，０００，０００個、約１６，１００，０００個、約１６，２００，０００個、約１６，３００，０００個、約１６，４００，０００個、約１６，５００，０００個、約１６，６００，０００個、約１６，７００，０００個、約１６，８００，０００個、約１６，９００，０００個、約１７，０００，０００個、約１７，１００，０００個、約１７，２００，０００個、約１７，３００，０００個、約１７，４００，０００個、約１７，５００，０００個、約１７，６００，０００個、約１７，７００，０００個、約１７，８００，０００個、約１７，９００，０００個、約１８，０００，０００個、約１８，１００，０００個、約１８，２００，０００個、約１８，３００，０００個、約１８，４００，０００個、約１８，５００，０００個、約１８，６００，０００個、約１８，７００，０００個、約１８，８００，０００個、約１８，９００，０００個、約１９，０００，０００個、約１９，１００，０００個、約１９，２００，０００個、約１９，３００，０００個、約１９，４００，０００個、約１９，５００，０００個、約１９，６００，０００個、約１９，７００，０００個、約１９，８００，０００個、約１９，９００，０００個、約２０，０００，０００個、約２０，１００，０００個、約２０，２００，０００個、約２０，３００，０００個、約２０，４００，０００個、約２０，５００，０００個、約２０，６００，０００個、約２０，７００，０００個、約２０，８００，０００個、約２０，９００，０００個、約２１，０００，０００個、約２１，１００，０００個、約２１，２００，０００個、約２１，３００，０００個、約２１，４００，０００個、約２１，５００，０００個、約２１，６００，０００個、約２１，７００，０００個、約２１，８００，０００個、約２１，９００，０００個、約２２，０００，０００個、約２２，１００，０００個、約２２，２００，０００個、約２２，３００，０００個、約２２，４００，０００個、約２２，５００，０００個、約２２，６００，０００個、約２２，７００，０００個、約２２，８００，０００個、約２２，９００，０００個、約２３，０００，０００個、約２３，１００，０００個、約２３，２００，０００個、約２３，３００，０００個、約２３，４００，０００個、約２３，５００，０００個、約２３，６００，０００個、約２３，７００，０００個、約２３，８００，０００個、約２３，９００，０００個、約２４，０００，０００個、約２４，１００，０００個、約２４，２００，０００個、約２４，３００，０００個、約２４，４００，０００個、約２４，５００，０００個、約２４，６００，０００個、約２４，７００，０００個、約２４，８００，０００個、約２４，９００，０００個、約２５，０００，０００個、約２５，１００，０００個、約２５，２００，０００個、約２５，３００，０００個、約２５，４００，０００個、約２５，５００，０００個、約２５，６００，０００個、約２５，７００，０００個、約２５，８００，０００個、約２５，９００，０００個、２６，０００，０００個の核酸塩基、下流または上流に位置する。

【0167】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における高複雑性配列内に位置する。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における高複雑性配列を含む。

【0168】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における高複雑性配列内に位置する。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における高複雑性配列を含む。

【0169】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における低複雑性配列内に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるレトロトランスポゾン配列の中に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるＡｌｕリピート（ＣＨＯ Ａｌｕ均等物）などの中に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）の中に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位／座位は、ＣＨＯ Ａｌｕ均等物配列を含有しない。

【0170】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における低複雑性配列内に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるレトロトランスポゾン配列の中に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるＡｌｕリピート（ＣＨＯ Ａｌｕ均等物）などの中に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）の中に位置しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位／座位は、ＣＨＯ Ａｌｕ均等物配列を含有しない。

【0171】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における複数の低複雑性配列で構成されない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるレトロトランスポゾン配列を含まない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるＡｌｕリピートを含まない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）を含まない。

【0172】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における複数の低複雑性配列で構成されない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるレトロトランスポゾン配列を含まない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるＡｌｕリピートを含まない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）を含まない。

【0173】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における低複雑性配列によってフランキングされていない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるレトロトランスポゾン配列によってフランキングされていない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるＡｌｕリピートによってフランキングされていない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）によってフランキングされていない。

【0174】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における低複雑性配列によってフランキングされていない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるレトロトランスポゾン配列によってフランキングされていない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるＡｌｕリピートによってフランキングされていない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）によってフランキングされていない。

【0175】

本明細書において使用される場合、「低複雑性配列」という用語は、反復要素、反復単位、またはリピートとしても知られる反復配列の存在を特徴とする核酸配列を指す。反対に、「高複雑性配列」という用語は、複数の反復配列が存在しないことを特徴とする核酸配列を指す。反復配列の主な種類は、タンデムリピート、およびレトロトランスポゾンなどの転位性要素を含む散在リピートである。

【0176】

レトロトランスポゾン（クラスＩ転位性要素、またはＲＮＡ中間体を介するトランスポゾンとも呼ばれる）は、ＲＮＡ転位中間体を使用する逆転写のプロセスを介してＲＮＡをＤＮＡに逆変換することによってゲノム上の異なる場所へと自己をコピーおよびペーストする遺伝子構成要素（トランスポゾン）の一種である。レトロトランスポゾンには、長末端リピート（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）および非長末端リピート（非ＬＴＲ）という２つの主な種類がある。レトロトランスポゾンは、配列および転位の方法に基づいて分類される。非ＬＴＲは主としてＬＩＮＥ（長鎖散在核要素）およびＳＩＮＥ（短鎖散在核要素）の２種類に分けられる。Ａｌｕｓは、霊長類において最もよく見られるＳＩＮＥである。

【0177】

Ａｌｕファミリーは、ヒトゲノムを含む霊長類ゲノム内の反復要素のファミリーである。Ａｌｕ要素は、アルスロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｕｓ）（Ａｌｕ）制限エンドヌクレアーゼの作用によって最初に特徴付けられたＤＮＡの短いストレッチである。Ａｌｕ要素は、ヒトゲノム全体に分散した１００万を超えるコピーを含む最も豊富な転位性要素である。近代のＡｌｕ要素は約３００塩基対長であり、したがって反復ＤＮＡ要素のクラスの中で短鎖散在核要素（ＳＩＮＥ）に分類される。典型的な構造は、５’－パートＡ－Ａ_５ＴＡＣＡ_６－パートＢ－ポリＡテール－３’（配列番号２５）であり、ここで、パートＡおよびパートＢ（「左腕」および「右腕」としても知られる）は、同様のヌクレオチド配列である。Ａｌｕでは、コンセンサスＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣ（配列番号２６）を持つ５’Ａボックス、およびコンセンサスＧＷＴＣＧＡＧＡＣ（ＩＵＰＡＣ核酸表記）を持つ３’Ｂボックスという２つの主なプロモーター「ボックス」が見出される。

【0178】

本開示の文脈では、本明細書において開示されるモンゴルキヌゲネズミ配列に適用されるＡｌｕ要素への言及は、ＣＨＯ Ａｌｕ均等物、すなわち、Haynes et al.(1981)Molecular and Cellular Biology 1(7):573-583に記述されているようなモンゴルキヌゲネズミのゲノムに存在するＡｌｕ様要素を指す。Ｈａｙｎｅｓらは、ヒトＡｌｕ配列およびマウスＢｌ散在性反復配列と高度に相同である、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）のゲノム内の主要な散在性デオキシリボ核酸リピートのコンセンサス配列を記述した。ＣＨＯコンセンサス配列はヒトＡｌｕ配列との著しい相同性を示すため、これをＣＨＯ Ａｌｕ均等物配列という。ＣＨＯ Ａｌｕ均等物ファミリーメンバーの周囲にある保存された構造が認識され得る。これは、ヒトＡｌｕおよびマウスＢｉ配列の周囲にあるものと同様であり、次のように表される：ダイレクトリピートＣＨＯ－Ａｌｕ－Ａリッチ配列－ダイレクトリピート。ＣＨＯ Ａｌｕ均等物配列のコンセンサス配列は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＨａｙｎｅｓらの図１において開示されている。

【0179】

長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ）（長鎖散在ヌクレオチド要素または長鎖散在要素としても知られる）は、多くの真核生物のゲノムに広く存在する非ＬＴＲ（長末端リピート）レトロトランスポゾンの一群である。それらはヒトゲノムの約２１．１％を構成する。ＬＩＮＥはトランスポゾンのファミリーを構成し、各ＬＩＮＥは約７，０００塩基対長である。ヒトにおいて豊富な唯一のＬＩＮＥはＬＩＮＥ１である。ヒトゲノムは、推定１００，０００個の切断型ＬＩＮＥ－１要素および４，０００個の完全長ＬＩＮＥ－１要素を含有する。ランダム突然変異の蓄積に起因して、多くのＬＩＮＥの配列は、もはや転写も翻訳もされない程度まで変性している。

【0180】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるＣｐＧアイランドを含まない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるＣｐＧアイランドの中に存在しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列におけるＣｐＧアイランドによってフランキングされていない。

【0181】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるＣｐＧアイランドを含まない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるＣｐＧアイランドの中に存在しない。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列におけるＣｐＧアイランドによってフランキングされていない。

【0182】

ＣｐＧアイランド（またはＣＧアイランド）は、高頻度のＣｐＧ部位を含む領域である。ＣｐＧアイランドの客観的定義は限られているが、通常の公式定義は、少なくとも２００ｂｐであり、ＧＣパーセンテージが５０％より大きく、ＣｐＧ実測値対期待値比が６０％より大きい領域である。「ＣｐＧ実測値対期待値比」は、実測値を（ＣｐＧの数）とし、期待値を（Ｃの数×Ｇの数）／配列の長さ、または［（Ｃの数＋Ｇの数）／２］^２／配列の長さとして算出することで導出され得る。

【0183】

哺乳動物ゲノムにおいて、ＣｐＧアイランドは、典型的には３００～３，０００塩基対長であり、哺乳動物遺伝子のプロモーターのおおよそ４０％の中または付近において見出されている。６０％を超えるヒト遺伝子およびほとんどすべてのハウスキーピング遺伝子において、それらのプロモーターがＣｐＧアイランドに埋め込まれている。

【0184】

ヒトの２１番染色体および２２番染色体の完全な配列に関する広範な調査に基づくと、５００ｂｐより大きいＤＮＡ領域は、５５％より大きいＧＣ含有量および６５％のＣｐＧ実測値対期待値比を有するならば、遺伝子の５’領域に関連する「真の」ＣｐＧアイランドである可能性が高くなる。

【0185】

ＣｐＧアイランドは、統計的に期待されるもの（約４～６％）の少なくとも６０％のＣｐＧジヌクレオチド含有量を特徴とするが、ゲノムの残りは大幅に低いＣｐＧ頻度（約１％）を有し、これはＣＧ抑制と呼ばれる現象である。遺伝子のコーディング領域内のＣｐＧ部位とは異なり、ほとんどの場合、プロモーターのＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位は、遺伝子が発現される場合はメチル化されていない。組織間、または正常サンプルとがんサンプルとの間のメチル化の差異のほとんどは、アイランド自体の中ではなく、ＣｐＧアイランドから短い距離をおいて（「ＣｐＧアイランドショア」において）起こる。

【0186】

ヒストンアセチル化およびシトシン脱メチル化は転写を向上させるので、標的化組み込み部位は、例えば、平均を超えるレベルのアセチル化されたヒストンおよび／または平均を超えるレベルのメチル化されていないシトシンを含む座位の中に位置する。

【0187】

したがって、いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、平均を超えるレベルのメチル化されていないシトシンを特徴とする、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における部分配列の中に位置するか、それを含むか、またはそれによってフランキングされている。本明細書において使用される場合、平均を超えるレベルのメチル化されていないシトシンは、特定のポリヌクレオチド長にわたる、例えばキロベース当たりの、メチル化されていないシトシンの数を基準として考慮される。よって、メチル化されていないシトシンのパーセンテージを、例えば、配列番号２２または配列番号１１８に定める配列に関して算出して、メチル化されていないシトシンの平均レベルを得ることができる。その後、配列番号２２または配列番号１１８における部分配列を、当該部分配列（例えば、１０ｎｔ、１００ｎｔ、１０００ｎｔ、１００００ｎｔ、それ以上）の中のメチル化されていないシトシンのパーセンテージが、配列番号２２または配列番号１１８に定める配列全体について算出されたメチル化されていないシトシンの平均数を上回るか下回るかに従って、スコアリングすることができる。

【0188】

同様に、いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、平均を超えるレベルのアセチル化を有するヒストンに関連することを特徴とする、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における部分配列の中に位置するか、それを含むか、またはそれによってフランキングされている。本明細書において使用される場合、平均を超えるレベルのヒストンアセチル化は、特定のポリヌクレオチド長にわたる、例えばキロベース当たりの、アセチル化されたヒストンの数を基準として考慮される。よって、アセチル化されたヒストンのパーセンテージを、例えば、配列番号２２または配列番号１１８に定める配列に関して算出して、アセチル化されたヒストンの平均レベルを得ることができる。その後、配列番号２２または配列番号１１８における部分配列を、当該部分配列（例えば、１０ｎｔ、１００ｎｔ、１０００ｎｔ、１００００ｎｔ、それ以上）の中のアセチル化されたヒストンのパーセンテージが、配列番号２２または配列番号１１８に定める配列全体について算出されたアセチル化されたヒストンの平均数を上回るか下回るかに従って、スコアリングすることができる。

【0189】

メチル化のマーカーおよび転写またはオープンクロマチンの境界を同定する方法は、例えば、Sharmin et al. (2016) BMC Cancer 16:88、Wang et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:511-29、Papin et al. (2020) J. Mol. Biol. doi:10.1016/j.jmb.2020.09.018、Li et al. (2013) BMC Genomics 14:553、Butcher & Beck (2015) Methods 72:21-8、Chen et al. (2020) Epigenetics 22:1-22、Keller et al. (2016) Mol. Biol. Evol. 33:1019-28、Symmons et al. (2014) Genome Res. 24:390-400、またはMifsud et al. (2015) Nat. Genet. 47:598-606、Collings & Anderson (2017) Epigenetics and Chromatin 10 doi.org/10.1186/s13072-017-0125-5において提供されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0190】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、複製の早期開始が起こる領域であることを特徴とする、配列番号２２またはＣｈｒ３ ＴＩコンティグに定める配列における部分配列の中に位置するか、それを含むか、またはそれによってフランキングされている。

【0191】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、複製の早期開始が起こる領域であることを特徴とする、配列番号１１８またはＣｈｒ５ ＴＩコンティグに定める配列における部分配列の中に位置するか、それを含むか、またはそれによってフランキングされている。

【0192】

複製の早期開始は、オープンクロマチンおよび転写のエリアに関連している。複製起点ならびにクロマチン状態および転写とのそれらの関連を同定する方法は、例えば、Smith & Aladjem (2014) J. Mol. Biol. 426:3330-41、Dellino et al. (2013) Genome Res. 23:1-11、Boos & Ferreira (2019) Genes 10:199、Boulos et al. (2015) FEBS Lett. 489:2944-57、またはGomez & Brockdorff (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6923-6928において提供されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの方法に基づくと、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈ５ ＴＩコンティグに定める配列の中の複製起点は、早期、中期、および後期の複製開始領域として分類および順位付けされ得る。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、上位１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以内の複製開始領域であることを特徴とする、配列番号２２もしくはＣｈｒ３ ＴＩコンティグまたは配列番号１１８もしくはＣｈ５ ＴＩコンティグに定める配列における部分配列の中に位置するか、それを含むか、またはそれによってフランキングされている。

【0193】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２０の２０，００２位～２０，０１９位に位置する、配列番号２１に定める配列、またはその一部を含む。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２０の中の配列番号２１の配列のうちの部分配列の中に位置するか、またはそれを含む。

【0194】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１７に定める配列、またはその一部を含む。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１６の中の配列番号１１７の配列のうちの部分配列の中に位置するか、またはそれを含む。

【0195】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７から上流に位置する。

【0196】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７から下流に位置する。

【0197】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７から、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、または約３０００ｎｔ上流に位置する。

【0198】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２１または配列番号１１７から、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、または約３０００ｎｔ下流に位置する。

【0199】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２０に定める配列、またはそのフラグメント、例えば、配列番号２１とオルソロガスな配列の中に位置する。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２０に定める配列、またはそのフラグメント、例えば、配列番号２１とパラロガスな配列の中に位置する。

【0200】

いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１６に定める配列、またはそのフラグメント、例えば、配列番号１１７とオルソロガスな配列の中に位置する。いくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１６に定める配列、またはそのフラグメント、例えば、配列番号１１７とパラロガスな配列の中に位置する。

【0201】

本開示のいくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号２０の中に位置する。配列番号２０は、配列番号２１の組み込み部位の各部位上の２０Ｋｂを含む、配列番号２２（モンゴルキヌゲネズミ、チャイニーズハムスターの３番染色体からの２６Ｍｂａｓｅ配列）の部分配列である。

【0202】

本開示のいくつかの態様において、標的化組み込み部位は、配列番号１１６の中に位置する。配列番号１１６は、配列番号１１７の組み込み部位の各部位上の２０Ｋｂを含む、配列番号１１８（モンゴルキヌゲネズミ、チャイニーズハムスターの染色体Ｃｈｒ５からの１８Ｍｂａｓｅ配列）の部分配列である。

【0203】

いくつかの態様において、本開示は、細胞のゲノムの特定座位の中に組み込まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列（外因性核酸）を含む単離細胞であって、当該座位は、配列番号２０、配列番号１１６またはそれらの部分配列との少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有する、単離細胞を提供する。

【0204】

本明細書において開示される配列はモンゴルキヌゲネズミに由来するが、本開示には、他の種、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、またはイヌからのオルソロガス配列も包含されると理解されたい。よって、配列番号１４～２４および１１０～１２０に定める配列のいずれかへの言及には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの実行を使用したペアワイズアラインメントによって決定した場合に、それらの親または参照配列（すなわち、配列番号１４～２４および１１０～１２０に定めるいずれかの配列またはそのフラグメントもしくは部分配列）との少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有するバリアント配列も包含される。本明細書において使用される場合、「オルソロガス」という用語は、種分化事象によって分離されたために同様の核酸配列を有する複数のポリヌクレオチドを指し、すなわち、それらは、先祖関係のために異なる生物において相同な配列を表し、したがって異なる生物において同様の機能を果たす。よって、本明細書において開示される配列（または部分配列）とオルソロガスな配列（または部分配列）は、本明細書において開示されるモンゴルキヌゲネズミからの既知の配列と機能的に等価である、すなわち、標的化組み込みのための特定座位として同様に使用可能であるとみなされる。

【0205】

いくつかの態様において、本開示は、細胞のゲノムの特定座位の中に組み込まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列（外因性核酸）を含む単離細胞であって、当該座位は、配列番号２０と、配列番号１１６またはそれらの部分配列との少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0206】

いくつかの態様において、部分配列は、約１８、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、または約２０００ヌクレオチド長であり、この部分配列は、配列番号２１または配列番号１１７に定める配列を含む。

【0207】

いくつかの態様において、部分配列は、配列番号２１または配列番号１１７に定める配列に対して上流の約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、または約２０００個のヌクレオチドを含む。

【0208】

いくつかの態様において、部分配列は、配列番号２１または配列番号１１７に定める配列に対して下流の約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、または約２０００個のヌクレオチドを含む。

【0209】

いくつかの態様において、本開示は、細胞のゲノムの特定座位の中に組み込まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列（外因性核酸）を含む単離細胞であって、当該座位（例えば、本開示の標的化組み込み部位）は、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはヌクレオチド配列である、単離細胞を提供する。本開示はまた、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列（外因性核酸）をＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞に導入することと、ＣＨＯ細胞のゲノムの特定座位に外因性核酸が組み込まれたＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を得ることとを含む方法であって、当該座位が、配列番号２０または配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはヌクレオチド配列である、方法を提供する。また、（ａ）目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列（外因性核酸）を含む細胞を用意することを含む方法であって、当該ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結された目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含み、座位が、配列番号２０および配列番号１１６の中のヌクレオチド位置またはヌクレオチド配列である、方法も提供される。いくつかの態様において、座位は、配列番号２０または配列番号１６と部分的に重なる。

【0210】

いくつかの態様において、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列は、配列番号２０または配列番号１１６のいずれかの位置における特定部位に組み込まれる。

【0211】

いくつかの態様において、特定部位は、１～１０００番、１００１～２０００番、２００１～３０００番、３００１～４０００番、４００１～５０００番、５００１～６０００番、６００１～７０００番、７００１～８０００番、８００１～９０００番、９００１～１００００番、１０００１～１１０００番、１１００１～１２０００番、１２００１～１３０００番、１３００１～１４０００番、１４００１～１５０００番、１５００１～１６０００番、１６００１～１７０００番、１７００１～１８０００番、１８００１～１９０００番、１９０００１～２００００番、２０００１～２１０００番、２１００１～２２０００番、２２００１～２３０００番、２３００１～２４０００番、２４００１～２５０００番、２５００１～２６０００番、２６００１～２７０００番、２７００１～２８０００番、２８００１～２９０００番、２９００１～３００００番、３０００１～３１０００番、３１００１～３２０００番、３２００１～３３０００番、３３００１～３４０００番、３４００１～３５０００番、３５００１～３６０００番、３６００１～３７０００番、３７００１～３８０００番、３８００１～３９０００番、３９００１～４００００番、または４０００１～４００２０番の位置に及ぶヌクレオチドからなる群から選択される配列番号２０の中の位置にある。

【0212】

いくつかの態様において、特定部位は、１～１０００番、１００１～２０００番、２００１～３０００番、３００１～４０００番、４００１～５０００番、５００１～６０００番、６００１～７０００番、７００１～８０００番、８００１～９０００番、９００１～１００００番、１０００１～１１０００番、１１００１～１２０００番、１２００１～１３０００番、１３００１～１４０００番、１４００１～１５０００番、１５００１～１６０００番、１６００１～１７０００番、１７００１～１８０００番、１８００１～１９０００番、１９０００１～２００００番、２０００１～２１０００番、２１００１～２２０００番、２２００１～２３０００番、２３００１～２４０００番、２４００１～２５０００番、２５００１～２６０００番、２６００１～２７０００番、２７００１～２８０００番、２８００１～２９０００番、２９００１～３００００番、３０００１～３１０００番、３１００１～３２０００番、３２００１～３３０００番、３３００１～３４０００番、３４００１～３５０００番、３５００１～３６０００番、３６００１～３７０００番、３７００１～３８０００番、３８００１～３９０００番、３９００１～４００００番、４０００１～４１０００番、４１０００１～４２０００番、４２００１～４３０００番、４３００１～４４０００番、４４００１～４５０００番、４５００１～４６０００番、４６００１～４７０００番、４７００１～４８０００番、４９００１～５００００番、５０００１～５１０００番、５１００１～５２０００番、５２００１～５３０００番、５３００１～５４０００番、５４００１～５５０００番、５５００１～５６０００番、５６００１～５７００． ５７００１～５８０００番、５８００１～５９０００番、５９００１～６００００番、６０００１～６１０００番、６１００１～６２０００番、６２００１～６３０００番、６３００１～６４０００番、６４００１～６５０００番、６５００１～６６０００番、６６００１～６７０００番、６７００１～６８０００番、６８００１～６９０００番、６９００１～７００００番、７０００１～７１０００番、７１００１～７２０００番、７２００１～７３００番、７３００１～７４０００番、７４００１～７５０００番、７５００１～７６０００番、７６００１～７７０００番、７７００１～７８０００番、７８００１～７９０００番、７９００１～８００００番、８０００１～８１０００番、８１００１～８２０００番、８２００１～８３０００番、８３００１～８４０００番、８４００１～８５０００番、８５００１～８６０００番、８６００１～８７０００番、８７００１～８８０００番、８８００１～８９０００番、８９００１～９００００番、９０００１～９１０００番、９１００１～９２０００番、９２００１～９３０００番、９３００１～９４０００番、９４００１～９５０００番、９５００１～９６０００番、９６００１～９７０００番、９７００１～９８０００番、９８００１～９９０００番、９９００１～１０００００番、１００００１～１０１０００番、１０１００１～１０２０００番、１０２００１～１０３０００番、１０３００１～１０４０００番、１０４００１～１０５０００番、１０５００１～１０６０００番、１０６００１～１０７０００番、１０７００１～１０８０００番、１０８００１～１０９０００番、１０９００１～１１００００番、１１０００１～１１１０００番、１１１００１～１１２０００番、１１２００１～１１３０００番、１１３００１～１１４０００番、１１４００１～１１５０００番、１１５００１～１１６０００番、１１６００１～１１７０００番、１１７００１～１１８０００番、１１８００１～１１９０００番、１１９００１～１２００００番、１２０００１～１２１０００番、１２１００１～１２２０００番、１２２００１～１２３０００番、１２３００１～１２４０００番、１２４００１～１２５０００番、１２５００１～１２６０００番、１２６００１～１２７０００番、１２７００１～１２８０００番、１２８００１～１２９０００番、１２９００１～１３００００番、１３０００１～１３１０００番、１３１００１～１３２０００番、１３２００１～１３３０００番、１３３００１～１３４０００番、１３４００１～１３５０００番、１３５００１～１３６０００番、１３６００１～１３７０００番、１３７００１～１３８０００番、１３８００１～１３９０００番、１３９００１～１４００００番、１４０００１～１４１０００番、１４１００１～１４２０００番、１４２００１～１４３０００番、１４３００１～１４４０００番、１４４００１～１４５０００番、１４５００１～１４６０００番、１４６００１～１４７０００番、１４７００１～１４８０００番、１４８００１～１４９０００番、１４９００１～１５００００番、１５０００１～１５１０００番、１５１００１～１５２０００番、１５２００１～１５３０００番、１５３００１～１５４０００番、１５４００１～１５５０００番、１５５００１～１５６０００番、１５６００１～１５７０００番、１５７００１～１５８０００番、１５８００１～１５９０００番、１５９００１～１６００００番、１６０００１～１６１０００番、１６１００１～１６２０００番、１６２００１～１６３０００番、１６３００１～１６４０００番、１６４００１～１６５０００番、１６５００１～１６６０００番、１６６００１～１６７０００番、１６７００１～１６８０００番、１６８００１～１６９０００番、１６９００１～１７００００番、１７０００１～１７１０００番、１７１００１～１７２０００番、１７２００１～１７３０００番、１７３００１～１７４０００番、１７４００１～１７５０００番、１７５００１～１７６０００番、１７６００１～１７７０００番、１７７００１～１７８０００番、１７８００１～１７９０００番、１７９００１～１８００００番、１８０００１～１８１０００番、１８１００１～１８２０００番、１８２００１～１８３０００番、１８３００１～１８４０００番、または１８４００１～１８５０００番の位置に及ぶヌクレオチドからなる群から選択される配列番号１１６の中の位置にある。

【0213】

いくつかの態様において、特定部位は、１９０００～２１０００番、１８０００～２２０００番、１７０００～２３０００番、１６０００～２４０００番、１５０００～２５０００番、１４０００～２６０００番、１３０００～２７０００番、１２０００～２８０００番、１１０００～２９０００番、１００００～３００００番、９０００～３１０００番、８０００～３２０００番、７０００～３３０００番、６０００～３４０００番、５０００～３５０００番、４０００～３６０００番、３０００～３７０００番、２０００～３８０００番、１０００～３９０００番、または１～４００２０番の位置に及ぶヌクレオチドからなる群から選択される配列番号２０の中の位置にある。

【0214】

いくつかの態様において、特定部位は、１９０００～１９１００番、１９１００～１９２００番、１９２００～１９３００番、１９３００～１９４００番、１９４００～１９５００番、１９５００～１９６００番、１９６００～１９７００番、１９７００～１９８００番、１９８００～１９９００番、１９９００～２００００番、２００００～２０１００番、２０１００～２０２００番、２０２００～２０３００番、２０３００～２０４００番、２０４００～２０５００番、２０５００～２０６００番、２０６００～２０７００番、２０７００～２０８００番、２０８００～２０９００番、または２０９００～２１０００番の位置に及ぶヌクレオチドからなる群から選択される配列番号２０の中の位置にある。

【0215】

いくつかの態様において、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列は、配列番号２０のいずれかの位置における特定部位に組み込まれ、特定部位は、２００００～２００２０番、１９９９０～２００３０番、１９９８０～２００４０番、１９９７０～２００５０番、１９９６０～２００６０番、１９９５０～２００７０番、１９９４０～２００８０番、１９９３０～２００９０番、１９９２０～２０１００番、１９９１０～２０１１０番、１９９００～２０１２０番、１９８９０～２０１２０番、１９８８０～２０１３０番、１９８７０～２０１４０番、１９８６０～２０１５０番、１９８５０～２０１６０番、１９８４０～２０１７０番、１９８３０～２０１８０番、１９８２０～２０１９０番、１９８１０～２０２００番、１９８００～２０２１０番、１９７９０～２０２２０番、１９７８０～２０２３０番、１９７７０～２０２３０番、１９７６０～２０２４０番、１９７５０～２０２５０番、１９７４０～２０２６０番、１９７３０～２０２７０番、１９７２０～２０２８０番、１９７１０～２０２９０番、１９７００～２０３００番、１９６９０～２０３１０番、１９６８０～２０３２０番、１９６７０～２０３３０番、１９６６０～２０３４０番、１９６５０～２０３５０番、１９６４０～２０３６０番、１９６３０～２０３７０番、１９６２０～２０３８０番、１９６１０～２０３９０番、１９６００～２０４００番、１９５９０～２０４１０番、１９５８０～２０４２０番、１９５７０～２０４３０番、１９５６０～２０４４０番、１９５５０～２０４５０番、１９５４０～２０４６０番、１９５３０～２０４７０番、１９５２０～２０４８０番、１９５１０～２０４９０番、または１９５００～２０５００番の位置に及ぶヌクレオチドからなる配列番号２０の中の位置にある。

【0216】

いくつかの態様において、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列は、配列番号２０（ホットスポット１を含むゲノム配列）の中もしくは配列番号１１６（ホットスポット２を含むゲノム配列）の中のいずれかの位置における、または配列番号２０もしくは配列番号１１６と部分的に重なる、特定部位（ホットスポット）に組み込まれる。

【0217】

いくつかの態様において、配列番号２０の中の位置における特定部位は、２０，００２～２０，０１９番の位置に及ぶ（配列番号２１に定める１８量体配列に対応する）ヌクレオチド位置または部分配列からなる群から選択される。

【0218】

いくつかの態様において、特定部位は、ヌクレオチド位置１９９００、１９９０１、１９９０２、１９９０３、１９９０４、１９９０５、１９９０６、１９９０７、１９９０８、１９９０９、１９９１０、１９９１１、１９９１２、１９９１３、１９９１４、１９９１５、１９９１６、１９９１７、１９９１８、１９９１９、１９９２０、１９９２１、１９９２２、１９９２３、１９９２４、１９９２５、１９９２６、１９９２７、１９９２８、１９９２９、１９９２０、１９９２１、１９９２２、１９９２３、１９９２４、１９９２５、１９９２６、１９９２７、１９９２８、１９９２９、１９９３０、１９９３１、１９９３２、１９９３３、１９９３４、１９９３５、１９９３６、１９９３７、１９９３８、１９９３９、１９９４９、１９９４１、１９９４２、１９９４３、１９９４４、１９９４５、１９９４６、１９９４７、１９９４８、１９９４９、１９９５０、１９９５１、１９９５２、１９９５３、１９９５４、１９９５５、１９９５６、１９９５６、１９９５８、１９９５９、１９９６０、１９９６１、１９９６２、１９９６３、１９９６４、１９９６５、１９９６６、１９９６７、１９９６８、１９９６９、１９９７０、１９９７１、１９９７１、１９９７２、１９９７３、１９９７４、１９９７５、１９９７６、１９９７７、１９９７８、１９９７９、１９９８０、１９９８１、１９９８２、１９９８３、１９９８４、１９９８５、１９９８６、１９９８７、１９９８８、１９９８９、１９９９０、１９９９１、１９９９２、１９９９３、１９９９４、１９９９５、１９９９６、１９９９７、１９９９８、１９９９９、２００００、２０００１、２０００２、２０００３、２０００４、２０００５、２０００６、２０００７、２０００８、２０００９、２００１０、２００１１、２００１２、２００１３、２００１４、２００１５、２００１６、２００１７、２００１８、２００１９、２００２０、２００２１、２００２２、２００２３、２００２４、２００２５、２００２６、２００２７、２００２８、２００２９、２００３０、２００３１、２００３２、２００３３、２００３４、２００３５、２００３６、２００３７、２００３８、２００３９、２００４０、２００４１、２００４２、２００４３、２００４４、２００４５、２００４６、２００４７、２００４８、２００４９、２００５０、２００５１、２００５２、２００５３、２００５４、２００５５、２００５６、２００５７、２００５８、２００５９、２００６０、２００６１、２００６２、２００６３、２００６４、２００６５、２００６６、２００６７、２００６８、２００６９、２００７０、２００７１、２００７２、２００７３、２００７４、２００７５、２００７６、２００７７、２００７８、２００７９、２００８０、２００８１、２００８２、２００８３、２００８４、２００８５、２００８６、２００８７、２００８８、２００８９、２００９０、２００９１、２００９２、２００９３、２００９４、２００９５、２００９６、２００９７、２００９８、２００９９、または２０１００からなる群から選択される配列番号２０の中の位置にある。

【0219】

本開示はまた、親プラスミドの周囲にあるゲノム配列に関するいかなる予備知識もなしにランディングパッド細胞株および発現細胞株の生成ならびに親細胞株のゲノム内の追加のホットスポットの同定を可能にした方法を提供する。この汎用性ＴＩ技術は、ランディングパッドプラスミド中に存在しない親細胞株における親プラスミド配列に対する指向性を持つ部位特異的エンドヌクレアーゼを使用する。この方策の利点は、フランキングゲノムＤＮＡ配列の知識が必要ないことである。例えば、図４Ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを表す鋏の隣りにある黒塗りのボックスによって示される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって標的化されるゲノム配列を知ることの必要性を示す。これに対し、図８Ａおよび８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって標的化される配列が親プラスミドに内在することを示す。縦線および波線の付いたボックスは、異なるプラスミドの間の相同性の領域を表す。

【0220】

これらの新しい方策によれば、例えば、図２および関連する開示において示されるように、高い発現力価（例えば、抗体３～４ｇ／Ｌ）および低いコピー数（例えば、２）を持つ親細胞株が最初に選択されることになる。そのような細胞株、すなわち「ホット細胞株」が同定されたら、ホット細胞株は、２つの異なる方策に従って使用され得る。両方の方策において、ランディングパッドプラスミドは、ｂ１ｍＣｈｅｒｒｙのような蛍光マーカーなどのマーカーをコードし、親細胞株に存在する親プラスミドとは異なるピューロマイシン耐性などの選択マーカーを発現し、マーカーをコードするポリヌクレオチド配列は、異種の部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）によってフランキングされている。図１２Ａ、１２Ｂ、１３および１４に示されている例示的なＳＳＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的である２つのＬｏｘ部位（ＬｏｘＰおよびＬｏｘ５１１）である。しかし、以下に開示するように、代替的ＳＳＲＳ、例えば、Ｌｏｘ、Ｆｒｔ、ａｔｔ、またはそれらの組合せを使用して、これらの方策を実施してもよい。例えば、ＬｏｘおよびＦｒｔの組合せが図１５に描写されており、ａｔｔ部位（結合部位）の使用が図１９などに示されている。

【0221】

部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）およびランディングパッドプラスミドの存在下で、親細胞株における第１ ＧＯＩ（例えば、ｍＡｂ発現カセット）は、Ｌｏｘ部位によってフランキングされたｍＣｈｅｒｒｙとして示されるランディングパッドに置き換えられるか（方策Ａ）、または欠失して、ランディングパッドプラスミドがホット細胞株のゲノム内の代替的座位に組み込まれる（方策Ｂ）。よって、方策Ａでは、ランディングパッドプラスミドが、親細胞株において使用されるものと同じホットスポットである高発現をサポートするホットスポットに挿入されることになる。方策Ｂでは、親細胞株における第１ ＧＯＩ（例えば、ｍＡｂ発現カセット）が除去され、ランディングパッドプラスミドが親細胞株のゲノム内の代替的な場所において挿入されることになる。親細胞株はホット細胞であるため、追加のホットスポットの同定は、高力価などの好ましい性状を持つ発現細胞株を生成することができるランディングパッド細胞株をもたらす。図８Ａを参照されたい。

【0222】

本開示は、ランディングパッド細胞株を同定するための方法であって、
（１）親細胞（例えば、ホット細胞）のゲノム配列に組み込まれたプラスミドから第１ ＧＯＩを除去することで、第１ ＧＯＩを含まない親細胞集団を生成することと、
（２）少なくとも１つのマーカー（例えば、Ｃｈｅｒｒｙ）を含むランディングパッドプラスミドを、代替的ゲノム座位において（１）の親細胞集団に組み込むことで、候補細胞のライブラリーを生成することと、
（３）少なくとも１つの代替的なゲノム座位において組み込まれたランディングパッドプラスミドを少なくとも１コピー含む候補細胞のライブラリーをスクリーニングすることであって、候補細胞株が、（ａ）細胞力価が既定の閾値レベルを超えること、（ｂ）プラスミドコピー数が既定の値であること、（ｃ）既定の閾値レベルを超えるようなＲＮＡ発現レベル、または、（ｄ）複数のプラスミドコピーが、存在する場合、特定のプラスミド構成を有することなどの所望の性状を満たす場合に選択される、スクリーニングすることと
を含む方法を提供する。

【0223】

いくつかの態様において、新しく同定されたホットスポットにランディングパッドプラスミドを含有する細胞のみが選択される。いくつかの態様において、新しく同定されたホットスポットに２つ以上のランディングパッドプラスミドを含有する細胞が選択される。いくつかの態様において、親細胞は、歴史的細胞株、例えば、抗体またはその抗原結合部分などのＧＯＩの発現における高力価を特徴とする細胞株である。いくつかの態様において、候補細胞のライブラリーは、抗体またはその抗原結合部分のような目的タンパク質をコードする発現カセットの欠失／切除／除去などによって修飾された親細胞のゲノム内の複数の場所におけるランディングパッド配列のランダム組み込みによって生成されたライブラリーである。いくつかの態様において、この方法は、新しいホットスポットに組み込まれた少なくとも１つのランディングパッドプラスミドを含むホット細胞を選択する。いくつかの態様において、親細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。

【0224】

本開示は、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、相同組換えを使用して（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して）、標的化組み込み部位において親細胞（例えば、ＣＨＯホット細胞）のゲノム内にランディングパッドプラスミドを組み込むことを含み、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に位置し、すなわち、相同組換えのために標的化される配列が、ゲノム配列ではなく、ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、方法を提供する。

【0225】

いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドは、（ｉ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、（ｉｉｉ）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（ｉｉ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含む。

【0226】

本開示はまた、発現細胞を生成する方法であって、部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して（例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムを使用して）、上記で開示したランディングパッド細胞（例えば、ＣＨＯホット細胞）のゲノム内にＧＯＩプラスミド（例えば、抗体またはその抗原結合部分をコードするプラスミド）を組み込むことを含み、ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ＧＯＩを組み込む、方法を提供する。いくつかの態様において、結果として得られた発現プラスミドは、（ｉ）少なくとも１つのＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳとを含む。

【0227】

また、発現細胞を生成する方法であって、（ａ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞（例えば、親ホット細胞）のゲノム内にランディングパッドプラスミドを組み込むことであって、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に位置し、ランディングパッドプラスミド中の相同組換え部位が、異なるゲノム座位においてランディングパッド内で親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡ中の異なるゲノム座位においてランディングパッドの内部の場所におけるランディングパッドプラスミドを組み込む、組み込むこと、ならびに、（ｂ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、ランディングパッド細胞のゲノム内にＧＯＩプラスミドを組み込むことであって、ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、組み込むことを含む方法も提供される。この方法のいくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドは、（ｉ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つのＳＳＲＳと、（ｉｉｉ）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（ｉｉ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含む。この方法のいくつかの態様において、結果として得られた発現プラスミドは、（ｉ）少なくとも１つのＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳとを含む。

【0228】

また、ランディングパッド細胞を生成する方法であって、（ａ）親細胞株における第１のホットスポット場所から親プラスミドまたはその一部を除去すること、および、（ｂ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内の第２のホットスポット場所にランディングパッドプラスミドを組み込むことを含み、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミド中に存在し、ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、方法も提供される。この方法のいくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドは、（ｉ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、（ｉｉｉ）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（ｉｉ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含む。工程（ａ）は、第１ ＧＯＩ（例えば、親細胞株における発現レベルが高かった抗体）を含まない親細胞株（例えば、ホット細胞株）に由来する細胞集団を生成することになる。工程（ｂ）では、工程（ａ）の細胞集団のゲノムへのランディングパッドプラスミドの挿入により、複数の場所において組み込まれたランドセルパッド（ｌａｎｄ ｃｅｌｌ ｐａｄ）を含有する細胞集団が生成されることになり、次にこれらをスクリーニングすることで、新しいホット細胞およびそれらの対応するホットスポットを同定することができる。

【0229】

また、発現細胞を生成する方法であって、（ａ）親細胞株における第１のホットスポット場所から親プラスミドを除去すること、（ｂ）相同組換えを使用して、標的化組み込み部位において親細胞のゲノム内の第２のホットスポット場所にランディングパッドプラスミドを組み込むことであって、相同組換えのために標的化される配列が、親プラスミドに存在したものであり、各ランディングパッドプラスミドが、例えば、（ｉ）少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸および／または検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチド配列にフランキングする２つの部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）と、（ｉｉｉ）親プラスミド中の対応する相同組換え部位と相同である、（ｉｉ）のＳＳＲＳに対して５’および３’末端側に位置する２つの相同組換え部位とを含み、ランディングパッドプラスミドの相同組換え部位が、親プラスミドの対応する相同組換え部位と組換わり、それにより、親細胞ゲノムＤＮＡに挿入された親プラスミドの内部の場所においてランディングパッドプラスミドを組み込む、組み込むこと、ならびに、（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ組換えを使用して、ランディングパッド細胞のゲノム内にＧＯＩプラスミドを組み込むことであって、発現プラスミドが、例えば、（ｉ）ＧＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（１）のポリヌクレオチドにフランキングする２つのＳＳＲＳとを含み、ランディングパッドプラスミドの部位特異的組換え部位が、ＧＯＩプラスミドの対応する部位特異的組換え部位と組換わり、それにより、ランディングパッド細胞のランディングパッドプラスミドの内部の場所においてＧＯＩプラスミドを組み込む、組み込むことを含む方法も提供される。

【0230】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞は、記述
ＣＧ／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ、または、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ
［ここで、ＣＧは、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、［Ｍ］は、少なくとも１つのマーカーを含むポリヌクレオチド配列であり、［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、ｎは、１～１０の間の整数である］に対応するトポロジーを有するプラスミドを含む。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。

【0231】

本開示における式のいずれにおいても、［Ｐ１］、［Ｐ２］、および［ＳＳＲＳ］という標識は、コンストラクトのトポロジーを表すための構成要素の起源または種類の記述子にすぎないことに留意されたい。［Ｐ１］および［Ｐ２］の各構成要素の核酸配列は異なっており、すなわち、第１の［Ｐ１］の核酸配列は、第２の［Ｐ１］の核酸配列とは異なるが、それらは、共通の起源、すなわち、親プラスミドを共有する。同様に、第１の［Ｐ２］の核酸配列は、第２の［Ｐ２］の核酸配列とは異なるが、それらは、共通の起源、すなわち、ランディングパッドプラスミドを共有する。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞におけるＣＧ配列は、親細胞株におけるＣＧ配列とは異なっており、すなわち、プラスミドは、親細胞株における元のホットスポットとは異なるホットスポット内に位置する。

【0232】

［ＳＳＲＳ］構成要素は、例えばＣｒｅ／Ｌｏｘ部位であり、それらの各々が異なる配列を有し得る。しかし、いくつかの態様では、本開示の随所で提示される［ＳＳＲＳ］対を含む式のいずれにおいても、示されている［ＳＳＲＳ］の一方は省略可能である。組み込みがセリン－インテグラーゼなどを使用して遂行される際には、単一の［ＳＳＲＳ］が必要とされる。よって、そうした特定の態様では、単一のａｔｔ部位、例えばａｔｔＰ部位が、［ＳＳＲＳ］対の代わりに存在してもよい。

【0233】

いくつかの態様において、発現細胞に組み込まれるプラスミドのトポロジーは、記述
ＣＧ／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］－／ＣＧ、または、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ
［ここで、ＣＧは、挿入されたプラスミドにフランキングする親細胞ゲノム配列であり、［Ｐ１］は、親プラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、［Ｐ２］は、ランディングパッドプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、［Ｐ３］は、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドに由来するポリヌクレオチド配列であり、［ＳＳＲＳ］は、部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）であり、ｎは、１～１０の間の整数である］に対応する。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、ｎは７である。いくつかの態様において、ｎは８である。いくつかの態様において、ｎは９である。いくつかの態様において、ｎは１０である。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞におけるＣＧ配列は、親細胞株におけるＣＧ配列とは異なっており、すなわち、プラスミドは、親細胞株における元のホットスポットとは異なるホットスポット内に位置する。

【0234】

いくつかの態様において、相同組換えは、以下に詳細に記述する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、またはＺＦＮシステムによって媒介される。いくつかの態様において、相同組換えシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む。使用される相同組換えに応じて、以下に詳細に開示するような追加の構成要素が必要とされ得る。

【0235】

いくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼ組換え部位（ＳＳＲＳ）は、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位、セリン－インテグラーゼ部位、またはそれらの組合せである。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ３、またはＢ３ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位は、λ（ラムダ）、ＨＫ０２２、またはＨＰ１ Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位を含む。いくつかの態様において、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位は、γδ（ガンマデルタ）、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、またはＧｉｎセリン－リゾルバーゼ／インテグラーゼ部位を含む。いくつかの態様において、セリン－インテグラーゼ部位は、ＰｈｉＣ３１、Ｂｘｂ１、またはＲ４セリン－インテグラーゼ部位を含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、ＬｏｘＰ部位である。いくつかの態様において、ＬｏｘＰ部位は、配列番号１に定める核酸配列（野生型ＬｏｘＰ）を含む。いくつかの態様において、ＬｏｘＰ部位は、突然変異型ＬｏｘＰ部位を含む。いくつかの態様において、突然変異型ＬｏｘＰ部位は、配列番号２に定める核酸配列（突然変異型ＬｏｘＰ）を含む。いくつかの態様において、突然変異型ＬｏｘＰ部位は、例えば、配列番号３（Ｌｏｘ ５１１）、配列番号４（Ｌｏｘ ５１７１）、配列番号５（Ｌｏｘ ２２７２）、配列番号６（Ｌｏｘ Ｍ２）、配列番号７（Ｌｏｘ Ｍ３）、配列番号８（Ｌｏｘ Ｍ７）、配列番号９（Ｌｏｘ Ｍ１１）、配列番号１０（Ｌｏｘ ７１）、および配列番号１１（Ｌｏｘ ６６）からなる群から選択される核酸を含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位は、Ｆｌｐ Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、短いフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位である。いくつかの態様において、セリン－インテグラーゼ部位は、ａｔｔ部位、例えば、ａｔｔＰまたはａｔｔＢ部位を含む。

【0236】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるプラスミドにおける一対のＳＳＲＳの各ＳＳＲＳは、異なるクラスに属し得る。例えば、第１のＳＳＲＳは、例えばＴｙｒ－リコンビナーゼ部位であってもよく、第２のＳＳＲＳは、例えばＳｅｒ－インテグラーゼ部位であってもよい。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、野生型ＬｏｘＰ、突然変異型ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ ５１１部位、Ｌｏｘ ５１７１部位、Ｌｏｘ ２２７２部位、Ｌｏｘ Ｍ２部位、Ｌｏｘ Ｍ３部位、Ｌｏｘ Ｍ７部位、Ｌｏｘ Ｍ１１部位、Ｌｏｘ ７１部位、Ｌｏｘ ６６部位、またはそれらのいずれかの組合せから選択される２つの部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、Ｌｏｘ Ｐ部位およびＬｏｘ ５１１部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、Ｌｏｘ Ｐ部位およびＦｒｔ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、２つのａａｔ部位、例えば、２つのａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、２つのａａｔ部位、例えば、２つのａｔｔＲ部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、Ｌｏｘ ２２７２部位およびＬｏｘ Ｍ３部位を含む。いくつかの態様において、ＳＳＲＳ対は、Ｌｏｘ ｍ３部位およびＬｏｘ ｍ７部位を含む。

【0237】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるプラスミドは、少なくとも１つの単一選択マーカーを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるプラスミドは、単一選択マーカーを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるプラスミドは、２つ以上の単一選択マーカー、例えば、２つの選択マーカーを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）である。いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）マーカーおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）マーカーを含む。安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を生成するのに好適な選択マーカーはいくつかある。作用様式が異なるため、各選択マーカーには、高い生産性を得るための異なる宿主細胞における特有の最適な選択ストリンジェンシーがある。その全体が参照により本明細書に組み入れられるYeo et al. (2017) Biotechnol J 12(12)を参照されたい。

【0238】

いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、薬物耐性遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様において、抗生物質耐性遺伝子は、アクチノマイシンＤ耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイドロマイシン耐性遺伝子、マイトマイシンＣ耐性遺伝子、ミコフェノール酸耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。いくつかの態様において、抗生物質耐性遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子である。いくつかの態様において、ピューロマイシン耐性遺伝子は、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼである。

【0239】

いくつかの態様において、少なくとも１つの検出可能マーカーは、蛍光タンパク質などのタンパク質を含む。いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＡｃＧＦＰ１、ＥＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＡｃＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＢａｎａｎａ、ＹＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。

【0240】

いくつかの態様において、親細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＮＳ０細胞、またはそれらの派生物もしくは均等物からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ Ｋ１細胞である。

【0241】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、少なくとも１つのポリペプチド、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする。いくつかの態様において、抗体は、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメインを含有するタンパク質３（ＴＩＭ３）、ｔａｕのＮ末端フラグメント（ｅＴａｕ）などのＴａｕタンパク質、またはＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ニボルマブである。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体の重鎖（ＨＣ）である。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体の軽鎖（ＬＣ）である。いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体の（例えば、バイシストロン性コンストラクトにおける）ＨＣおよびＬＣを含む。いくつかの態様において、ＧＯＩは、二重特異性抗体またはその一部、例えば、二重特異性抗体のＨＣもしくはＬＣまたはそれらのいずれかの組合せである。いくつかの態様において、発現プラスミドは、１コピー、２コピー、または３コピー以上のＧＯＩを含む。

【0242】

いくつかの態様において、本明細書において開示される方法は、本明細書において開示されるＧＯＩまたはマーカーの発現を決定することを含む。いくつかの態様において、ＧＯＩまたはマーカーの発現は、定量的におよび／または定性的に決定される。いくつかの態様において、ＧＯＩまたはマーカーの発現は、例えば、細胞選別、ＦＡＣＳ、細胞表面染色、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス、ＵＶ吸光度、免疫組織化学、細胞サイズ、分泌タンパク質レベル、転写物レベル、またはそれらのいずれかの組合せによって決定される。

【0243】

いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミド（第２ ＧＯＩプラスミド）または発現プラスミド（Ｐ４）は、１のコピー数で細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミド（第２ ＧＯＩプラスミド）または発現プラスミド（Ｐ４）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のコピー数で細胞のゲノムに組み込まれる。

【0244】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるプラスミドの５’相同組換え部位は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列またはその部分配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列またはその部分配列を含む。

【0245】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるプラスミドの５’相同組換え部位は、配列番号１１４のポリヌクレオチド配列またはその部分配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１１５のポリヌクレオチド配列またはその部分配列を含む。

【0246】

いくつかの態様において、本開示の単離細胞または単離細胞集団は、細胞のゲノムの特定座位の中に組み込まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含み、当該座位は、配列番号２０および配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法は、少なくとも１つの目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞などの細胞または別の好適な細胞株に導入することと、ＣＨＯ細胞などの細胞のゲノムの特定座位に外因性核酸が組み込まれたＣＨＯ細胞などの細胞を得ることとを含み、当該座位は、配列番号２０および配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法は、（ａ）目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチド配列を含む細胞を用意することを含み、当該ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結された目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を含み、座位は、配列番号２０および配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列を含む。いくつかの態様において、配列番号２０から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列を含む。いくつかの態様において、配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列を含む。いくつかの態様において、配列番号２０から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列からなる。いくつかの態様において、配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列からなる。いくつかの態様において、配列番号２０から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列に対して上流の（配列番号２０の５’末端の方の）部分配列である。いくつかの態様において、配列番号２０から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号２１に定める配列に対して下流の（配列番号２０の３’末端の方の）部分配列である。いくつかの態様において、配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列に対して上流の（配列番号１１６の５’末端の方の）部分配列である。いくつかの態様において、配列番号１１６から選択されるヌクレオチド部分配列は、配列番号１１７に定める配列に対して下流の（配列番号１１６の３’末端の方の）部分配列である。

【0247】

本開示は、単一のランディングパッドプラスミドを含有するランディングパッド細胞株を提供する。しかし、２つ以上のランディングパッドプラスミドを含むランディングパッド細胞株は、二重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのマルチサブユニット生物製剤の発現をさらに洗練する機会を提供する。したがって、本明細書において開示される細胞スクリーニング方法は、同じ座位に２つのランディングパッドプラスミドを含むランディングパッド細胞株、すなわち、デュオランディングパッド細胞を同定するために使用され得る。これにより、両方のランディングパッドプラスミドが同じゲノム座位に存在するので、それら両方からの等しい発現が確実になる。

【0248】

本開示のデュオランディングパッドは、ヘッド・トゥ・ヘッド、テール・トゥ・テール、テール・トゥ・ヘッド、およびヘッド・トゥ・テールという４つの異なる向きで組み込むことができる。ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成は、互いと機能的に区別できないため、Ｃｒｅ／ＬｏｘまたはＦｌｐ／Ｆｒｔなどの単一部位指向性リコンビナーゼが使用される際は、これらが概して使用される。Ｃｒｅ／Ｌｏｘの存在下でランディングパッドのうちの１つの欠失をもたらし得るテール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの構成とは異なり、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成は、単純に反転を起こし、同じ始めの構成をもたらす。

【0249】

４つのデュオランディングパッド構成（ヘッド・トゥ・ヘッド、テール・トゥ・テール、テール・トゥ・ヘッド、およびヘッド・トゥ・テール）の各々を用いて第２ ＧＯＩプラスミドが使用される際には、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成は各々、プラスミドジャンクションにフランキングする２つの組換え部位の間の配列が反転し得る２つの細胞株を生成し得るが、さもなければ２つの細胞株は同じである。ヘッド・トゥ・テールまたはテール・トゥ・ヘッドの構成が第２ ＧＯＩプラスミドと共に使用される際には、２つの第２ ＧＯＩプラスミドを含む細胞株が生産される。しかし、十分な量のＣｒｅ活性が存在する場合には、第２ ＧＯＩプラスミドのうちの１つを除去して、単一の第２ ＧＯＩプラスミドを含む第２ ＧＯＩプラスミド細胞株をもたらすことができる。

【0250】

ランディングパッドが、Ｌｏｘ ５１１などのＬｏｘ部位の代わりにＦｌｐのためのＦｒｔ認識部位を使用し、Ｃｒｅ／ＬｏｘおよびＦｌｐの両方が使用される場合、同じ結果が得られ、テール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの向きでは欠失が起こり、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの向きでは反転が起こる。しかし、テール・トゥ・テールおよびヘッド・トゥ・ヘッドの構成では、インテグラーゼと共にａｔｔＰ／ａｔｔＢを使用してデュオランディングパッド内に第２ ＧＯＩプラスミドを組換えても反転は生じないが、テール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの構成では、ランディングパッドのうちの１つの欠失が依然として起こり得る。ランディングパッドの各々が単一のａｔｔＰ部位を有するならば、４つのデュオランディングパッド構成のいずれにおいても、単一のａｔｔＢ部位を含む第２ ＧＯＩプラスミドの単一の組み込みが起こり、欠失が起こらない結果となる。

【0251】

本明細書において使用される場合、「シングルランディングパッド（ｓｉｎｇｌｅ ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ）」という用語は、単一のランディングパッドプラスミドまたは第２ ＧＯＩプラスミドを含むランディングパッドを指す。本明細書において使用される場合、「デュオランディングパッド」という用語は、２つのランディングパッドプラスミドまたは第２ ＧＯＩプラスミドを含むランディングパッドを指す。

【0252】

デュオランディングパッドの使用は、異なるＧＯＩを含む生物製剤、例えば、重鎖および軽鎖を含む抗体を生産するための代替的方法を提示する。一態様において、本開示は、第２ ＧＯＩプラスミドが、抗体の重鎖および軽鎖などをコードする複数の発現カセットを含む、方法および組成物を提供する。別の態様において、各発現カセットは、異なる第２ ＧＯＩプラスミド中にあってもよく、両方の第２ ＧＯＩプラスミドは、デュオランディングパッド内に位置することになる。

【0253】

デュオランディングパッド細胞株の使用には、シングルランディングパッド（すなわち、単一の第２ ＧＯＩプラスミドを含むランディングパッド）を含むランディングパッド細胞株に優る利点がある。シングルランディングパッド細胞株の場合、この細胞株は単一の第２ ＧＯＩしか受け入れないため、多成分生物製剤を作製するために必要なすべての発現カセットが、単一の第２ ＧＯＩプラスミド中に配置されなければならない。これはデュオランディングパッド細胞株には当てはまらない。デュオランディングパッド細胞株は、上昇した発現多様性レベルにおいて設計する機会をもたらし、優れた特性を持つ発現細胞株を作出する機会を提供する。多様性は、第２ ＧＯＩプラスミドの異なる構成を使用して、複数のやり方で生成され得る。１つの例では、第２ ＧＯＩプラスミドが、ユニークな構成において、複合生物製剤を作製するのに必要なすべての発現カセットを含有する。第２の例では、第２ ＧＯＩプラスミドが、発現細胞株を作製するために同じ細胞内に存在する必要のある発現カセットのサブセットを含有してもよい。第３の例は、複合生物製剤を作製するために必要とされるユニークな構成における発現カセットのすべてを有する１つまたは複数の第２ ＧＯＩプラスミドを、ユニークな構成におけるすべての発現カセットのサブセットを含有する第２ ＧＯＩプラスミドのセットと併せた、前出の２例の組合せである。

【0254】

ここで開示された、デュオランディングパッドを生成するための方法と同じものが、より高次の組合せのランディングパッドプラスミドを含む細胞株を生成するために使用され得ると理解される。例えば、本明細書において開示される、２つのランディングパッドプラスミドをホットスポットに含むランディングパッド細胞株を同定するための方法は、３つ、４つ、またはそれよりも多くのランディングパッドプラスミドを有するランディングパッド細胞株を選択するために使用され得る。３つ以上のランディングパッドプラスミドを含有するホットスポットを有するランディングパッド細胞株および発現細胞は、例えば、３つ以上の異なるサブユニットを含む生物製剤を生産するために使用され得る。

【0255】

いくつかの態様において、デュオランディングパッド構成は、同じリコンビナーゼまたはＩｎｔ認識配列を有する両方のランディングパッドプラスミドを含み得るが、各ランディングパッドプラスミドにユニークな組換え「アドレス」を持たせること、すなわち、各ランディングパッドプラスミドがアドレス指定可能になることが可能である。ＣｒｅおよびＦｌｐなどのリコンビナーゼの場合、４つのユニークな認識配列が使用され得る。したがって、各ランディングパッドプラスミドは、認識部位のユニークな対を有することになる。いくつかの態様において、４つの不適合性Ｌｏｘ部位が使用され得る。Langer, S.J., Ghafoori, A.P., Byrd, M. and Leinwand, L. (2002) A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res., 30, 3067-3077、Missirlis, P.I., Smailus, D.E. and Holt, R.A. (2006) A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics, 7, 73.、およびSiegel, R.W., Jain, R. and Bradbury, A. (2001) Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. FEBS Lett., 505, 467-473を参照されたい。

【0256】

追加の方策の例としては、２つのＬｏｘ部位を２つの不適合性Ｆｒｔ部位に置き換えること、およびＣｒｅをＦｒｔと共に使用すること［Lauth, M., Spreafico, F., Dethleffsen, K. and Meyer, M. (2002) Stable and efficient cassette exchange under non-selectable conditions by combined use of two site-specific recombinases. Nucleic Acids Res., 30, e115を参照されたい］、インテグラーゼを２つから４つの不適合性ａａｔ部位と共に使用すること［Jusiak, B., Jagtap, K., Gaidukov, L., Duportet, X., Bandara, K., Chu, J., Zhang, L., Weiss, R. and Lu, T.K. (2019) Comparison of Integrases Identifies Bxb1-GA Mutant as the Most Efficient Site-Specific Integrase System in Mammalian Cells. ACS Synth Biol, 8, 16-24を参照されたい］、２つ以上のインテグラーゼ、例えばＢｘＢ１およびｐｈｉＣ３のものを使用すること［Smith, M.C., Brown, W.R., McEwan, A.R. and Rowley, P.A. (2010) Site-specific recombination by phiC31 integrase and other large serine recombinases. Biochem. Soc. Trans., 38, 388-394を参照されたい］、ならびにそれらの組合せが挙げられる。各ランディングパッドにおける単一のａｔｔ部位の使用は、各ランディングパッドへの第２ ＧＯＩプラスミドの挿入のために十分である。この場合、線状プラスミドは染色体を実質的に制限することになるので、第２ ＧＯＩプラスミドは環状である必要がある。また、各々がユニークなアドレスを含むように、ランディングパッドが複数のａｔｔ部位を含み得ることも明らかである。

【0257】

ユニークなアドレスを持つランディングパッドを用いるデュオランディングパッド構成は、それらがアドレス指定可能でない場合と比較して、発現細胞株のさらに定義された多様性、および、シングルランディングパッドを含むランディングパッド細胞株に対してより高い多様性を生成するために使用することもできる。

【0258】

アドレス指定可能ランディングパッドの追加の用途は、各々が特有の独立した機能を持つ２つの独立した生物製剤を発現させる選択肢である。生物製剤のうちの１つが、発現細胞株による第２の生物製剤の発現を助ける可能性もあれば、または、第１の生物製剤が、第２の生物製剤の特定の翻訳後修飾を引き起こす可能性もあれば、もしくは発現細胞株の何らかの他の構成要素を修飾する可能性もある。

【0259】

いくつかの態様において、本明細書において開示される方法、細胞、細胞株、またはキットは、タンデム状態の少なくとも２つのランディングパッドプラスミドまたは少なくとも２つの発現プラスミドを含む。言い換えると、いくつかの態様において、式
ＣＧ／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｍ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［Ｍ］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ１］－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－［Ｐ１］）－／ＣＧ、
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ３］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、もしくは
ＣＧ／－（［Ｐ２］－［Ｐ３］－［ＳＳＲＳ］－［Ｐ２］）ｎ－／ＣＧ、
または本明細書において開示されるｎの値を含む任意の他の式におけるｎの値は、２以上であり得る。いくつかの特定の態様において、ｎは２である。よって、いくつかの態様において、タンデムに配置された少なくとも２つのランディングパッドプラスミドまたは少なくとも２つの発現プラスミドが、本明細書において開示されるコンストラクトに存在する。いくつかの態様において、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のような整数である。いくつかの態様において、ｎは１０より高く、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である。

【0260】

いくつかの態様において、２つのランディングパッドプラスミドまたは２つの発現プラスミドは、ヘッド・トゥ・ヘッド、テール・トゥ・テール、テール・トゥ・ヘッド、およびヘッド・トゥ・テールからなる群から選択される構成にある。いくつかの態様において、各発現プラスミドは、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸を少なくとも含む。いくつかの態様において、すべてのＧＯＩが同じである。いくつかの態様において、すべてのＧＯＩが異なっている。いくつかの態様において、少なくとも１つのＧＯＩは残りと異なっている。いくつかの態様において、第１ ＧＯＩは抗体のＨＣであり、第２ ＧＯＩは抗体のＬＣである。いくつかの態様において、少なくとも１つの発現プラスミドは、バイシストロン性またはポリシストロン性である。いくつかの態様において、バイシストロン性発現プラスミドは、抗体のＨＣを含む第１ ＧＯＩと、抗体のＬＣを含む第２ ＧＯＩとをコードする。

【0261】

いくつかの態様において、デュオランディングパッド内の各ランディングパッドプラスミドが、アドレス指定可能である。いくつかの態様において、各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドが一対のＳＳＲＳを含み、これらはユニークまたは不適合性であり得る。いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドは、２つのＬｏｘ部位を含む。いくつかの態様において、Ｌｏｘ部位は、Ｌｏｘ ＰおよびＬｏｘ ５１１である。いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、Ｌｏｘ部位およびＦｒｔ部位を含む。いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、１つまたは２つのａａｔ部位、例えば、２つのａａｔＰ部位を含む。

【0262】

いくつかの態様において、各ランディングパッドプラスミドが、アドレス指定可能である。いくつかの態様において、各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドが、ランディングパッドに対してユニークである一対のアドレス指定可能ＳＳＲＳを含む。いくつかの態様において、少なくとも一対のアドレス指定可能ＳＳＲＳは、一対のＬｏｘ部位である。いくつかの態様において、少なくとも一対のＬｏｘ部位は、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐである。いくつかの態様において、少なくとも一対のＬｏｘ部位は、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ ｍ７である。

【0263】

いくつかの態様において、本開示の方法、細胞株、細胞またはキットは、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐの対のＬｏｘ部位を含む第１のアドレス指定可能ランディングパッドプラスミドと、Ｌｏｘ ｍ３およびＬｏｘ ｍ７の対のＬｏｘ部位を含む第２のアドレス指定可能ランディングパッドプラスミドとを含む。いくつかの態様において、各アドレス指定可能ランディングパッドプラスミドが、非相互適合性ａｔｔＰ部位を含む。

【0264】

いくつかの態様において、ＬｏｘＰ部位は、配列番号１～１１および２８～８２ならびにそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｆｒｔ部位は、配列番号１２および８３～９１ならびにそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。いくつかの態様において、本明細書において開示されるアドレス指定可能パッドは、配列番号１～１３および２８～１０９、ならびにそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、ＳＳＲＳまたはそれらの組合せを含み得る。

【0265】

いくつかの態様において、ａｔｔ部位は、配列番号９２～１０９およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号９２のａｔｔＢ部位および配列番号９３のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号９４のａｔｔＢ部位および配列番号９５のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号９６のａｔｔＢ部位および配列番号９７のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号９８のａｔｔＢ部位および配列番号９９のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号１００のａｔｔＢ部位および配列番号１０１のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号１０２のａｔｔＢ部位および配列番号１０３のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号１０４のａｔｔＢ部位および配列番号１０５のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号１０６のａｔｔＢ部位および配列番号１０７のａｔｔＰ部位を含む。いくつかの態様において、一対のａｔｔ部位は、配列番号１０８のａｔｔＢ部位および配列番号１０９のａｔｔＰ部位を含む。

【0266】

ヌクレアーゼ
本明細書において使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ切断の触媒活性を有する酵素を指す。

【0267】

いくつかの態様において、ヌクレアーゼ剤は、本明細書において開示される線状プラスミドなどの２つのプラスミド、例えば、親プラスミドとランディングパッドプラスミドとの間の相同組換えを促進し得る。いくつかの態様において、親細胞株のゲノムに組み込まれたプラスミド（親プラスミド、Ｐ１）およびランディングパッドプラスミド（Ｐ２）は、相同性の領域を含有し、親細胞株に組み込まれた親プラスミドにおいては、各相同性領域の隣りに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによって標的化される配列が存在するが、親細胞株中に組換えられるランディングパッドプラスミドにおいては存在しない。

【0268】

ヌクレアーゼ媒介相同組換えのための認識部位のサイズは様々であり得、例えば、少なくとも約４、少なくとも約６、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも約３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約４５、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５１、少なくとも約５２、少なくとも約５３、少なくとも約５４、少なくとも約５５、少なくとも約５６、少なくとも約５７、少なくとも約５８、少なくとも約５９、少なくとも約６０、少なくとも約６１、少なくとも約６２、少なくとも約６３、少なくとも約６４、少なくとも約６５、少なくとも約６６、少なくとも約６７、少なくとも約６８、少なくとも約６９、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約９１０、少なくとも約９２０、少なくとも約９３０、少なくとも約９４０、少なくとも約９５０、少なくとも約９６０、少なくとも約９７０、少なくとも約９８０、少なくとも約９９０、少なくとも約１０００、少なくとも約１０１０、少なくとも約１０２０、少なくとも約１０３０、少なくとも約１０４０、少なくとも約１０５０、少なくとも約１０６０、少なくとも約１０７０、少なくとも約１０８０、少なくとも約１０９０、少なくとも約１１００、少なくとも約１１１０、少なくとも約１１２０、少なくとも約１１３０、少なくとも約１１４０、少なくとも約１１５０、少なくとも約１１６０、少なくとも約１１７０、少なくとも約１１８０、少なくとも約１１９０、少なくとも約１２００、少なくとも約２０１０、少なくとも約２０２０、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである認識部位を含む。

【0269】

ヌクレアーゼ媒介相同組換えのための認識部位のサイズは様々であり得、例えば、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５８０、約５９０、約６００、約６１０、約６２０、約６３０、約６４０、約６５０、約６６０、約６７０、約６８０、約６９０、約７００、約７１０、約７２０、約７３０、約７４０、約７５０、約７６０、約７７０、約７８０、約７９０、約８００、約８１０、約８２０、約８３０、約８４０、約８５０、約８６０、約８７０、約８８０、約８９０、約９００、約９１０、約９２０、約９３０、約９４０、約９５０、約９６０、約９７０、約９８０、約９９０、約１０００、約１０１０、約１０２０、約１０３０、約１０４０、約１０５０、約１０６０、約１０７０、約１０８０、約１０９０、約１１００、約１１１０、約１１２０、約１１３０、約１１４０、約１１５０、約１１６０、約１１７０、約１１８０、約１１９０、約１２００、約２０１０、約２０２０、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである認識部位を含む。

【0270】

ヌクレアーゼ媒介相同組換えのための認識部位のサイズは様々であり得、例えば、約４から約１０、約１０から約２０、約２０から約３０、約３０から約４０、約４０から約５０、約５０から約６０、約６０から約７０、約７０から約８０、約８０から約９０、約９０から約１００、約１００から約１２５、約１２５から約１５０、約１５０から約１７５、約１７５から約２００、約２００から約２２５、約２２５から約２５０、約２５０から約２７５、約２７５から約３００、約３００から約３２５、約３２５から約３５０、約３５０から約３７５、約３７５から約４００、約４００から約４２５、約４２５から約４５０、約４５０から約４７５、約４７５から約５００、約５００から約５２５、約５２５から約５５０、約５５０から約５７５、約５７５から約６００、約６００から約６２５、約６２５から約６５０、約６５０から約６７５、約６７５から約７００、約７００から約７２５、約７２５から約７５０、約７５０から約７７５、約７７５から約８００、約８００から約８２５、約８２５から約８５０、約８５０から約８７５、約８７５から約９００、約９００から約９２５、約９２５から約９５０、約９５０から約９７５、約９７５から約１０００、約１０００から約１１００、約１１００から約１２００、約１２００から約１３００、約１３００から約１４００、約１４００から約１５００、約１５００から約１６００、約１６００から約１７００、約１７００から約１８００、約１８００から約１９００、約１９００から約２０００、もしくは約２０００から約２１００、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである認識部位を含む。

【0271】

一態様において、ヌクレアーゼ剤の各モノマーは、少なくとも９ヌクレオチドの認識部位を認識する。他の態様において、認識部位は、約９～約１２ヌクレオチドの長さ、約１２～約１５ヌクレオチドの長さ、約１５～約１８ヌクレオチドの長さ、または約１８～約２１ヌクレオチドの長さ、およびそのような部分範囲のいずれかの組合せ（例えば、９～１８ヌクレオチド）である。認識部位は回分構造であり得、すなわち、一方の鎖における配列の読み取りが、相補鎖における反対方向での読み取りと同じであり得る。所定のヌクレアーゼ剤は、認識部位に結合してその結合部位を切断することができるか、または代替的に、ヌクレアーゼ剤は、認識部位とは異なる配列に結合することができると認識されている。さらに、認識部位という用語には、ヌクレアーゼ剤結合部位とニック／切断部位との両方が含まれ、ニック／切断部位がヌクレアーゼ剤結合部位の中にあるか外にあるかにかかわらない。別のバリエーションでは、ヌクレアーゼ剤による切断が、互いのすぐ反対のヌクレオチド位置で起こって平滑末端の切り口をもたらし得るか、または他の場合には、切れ目がずれて一重鎖オーバーハングをもたらし得、オーバーハングは「粘着末端」とも呼ばれ、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかであり得る。

【0272】

いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドにおいて欠如している親プラスミドにおける配列の一方は配列番号１４であり、他方は配列番号１５である。

【0273】

いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドにおいて欠如している親プラスミドにおける配列の一方は配列番号１４である。

【0274】

いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドにおいて欠如している親プラスミドにおける配列の一方は配列番号１５である。

【0275】

本明細書において開示される方法および組成物では、所望の認識部位へとニックまたは二重鎖切断を誘導するいずれのヌクレアーゼ剤を使用してもよい。ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位においてニックまたは二重鎖切断を誘導する限り、自然において存在する、または天然のヌクレアーゼ剤を用いることができる。代替的には、修飾またはエンジニアリングされたヌクレアーゼ剤を用いることができる。「エンジニアリングされたヌクレアーゼ剤」には、所望の認識部位を特異的に認識して、そこにニックまたは二重鎖切断を誘導するように、天然型からエンジニアリングされた（修飾または導出された）ヌクレアーゼが含まれる。よって、エンジニアリングされたヌクレアーゼ剤は、天然の自然において存在するヌクレアーゼ剤から導出されてもよく、または人工的に作出もしくは合成されてもよい。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質切断剤における１つのアミノ酸または核酸切断剤における１つのヌクレオチドだけであり得る。いくつかの態様において、エンジニアリングされたヌクレアーゼは、認識部位においてニックまたは二重鎖切断を誘導し、この認識部位は、天然の（エンジニアリングされていないまたは修飾されていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではない。認識部位または他のＤＮＡにおいてニックまたは二重鎖切断を生じさせることは、本明細書では、認識部位または他のＤＮＡを「カットすること」または「切断すること」と称され得る。

【0276】

相同組換えシステム
本開示のいくつかの態様において、相同組換えは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、メガヌクレアーゼ、または制限エンドヌクレアーゼによって媒介される。

【0277】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
いくつかの態様において、本明細書において開示される様々な方法および組成物における相同組換えのために用いられるヌクレアーゼ剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み得る。「デフォルト」の相同組換えシステムとしての図面におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの描写は例示にすぎず、図面において図式化されたプロセスは、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、メガヌクレアーゼ、または制限エンドヌクレアーゼなどの代替的な相同組換えシステムを使用して行われ得ることに留意されたい。そのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いることができ、これは、場合によっては、それを発現させる所望の細胞型に合わせてコドン最適化されている。そのようなシステムは、２つの別個の分子を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いることもできる。例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「足場」）分子とを含む。

【0278】

ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一重鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）デュプレックスの半分を形成するヌクレオチドのストレッチとの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスの残り半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。よって、ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡが対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｃｒＲＮＡはさらに、一重鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズする配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。よって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（対応する対として）がハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。細胞内での修飾のために使用される場合、所定のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の厳密な配列および／または長さは、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的になるように設計され得る。

【0279】

３つの要素（Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）をコードする自然において存在する遺伝子は、典型的には、オペロンとして編成される。自然において存在するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、Ｃａｓ９システムおよび生物によって異なるが、２１～４６個のヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）によってフランキングされた、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含有することが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それとハイブリダイズし、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に結合する。

【0280】

代替的には、このシステムはさらに、コドン最適化されたＣａｓ９と共に機能する融合したｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡコンストラクト（すなわち、単一の転写物）を用いる。この単一のＲＮＡは、しばしば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡの中で、ｃｒＲＮＡ部分は、所定の認識部位のための「標的配列」として同定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、しばしば、「足場」と称される。簡潔に述べると、標的配列を含有する短いＤＮＡフラグメントが、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（いくつかの態様では約２０ヌクレオチド）、一形態のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（足場）、ならびに細胞内で活性のある好適なプロモーターおよび真核細胞における適切なプロセシングのための必要な要素を含む。こうしたシステムの多くは、アニーリングされて二重鎖ＤＮＡを形成した後にｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングされる特別仕様の相補的オリゴヌクレオチドに依存する。

【0281】

ｇＲＮＡ発現カセットおよびＣａｓ９発現カセットは、次に細胞に導入される。例えば、Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb. 15; 339(6121):823-6、Jinek M et al. Science 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21、Hwang W Y et al. Nat Biotechnol 2013 March; 31(3):227-9、Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 March; 31(3):233-9、およびCong L et al. Science 2013 Feb. 15; 339(6121):819-23を参照されたい。これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。また、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、およびＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１を参照されたい。これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。

【0282】

いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡとの複合体の形態で提供され得る。他の態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ［例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）］でもＤＮＡであってもよい。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で提供され得る。他の態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子の形態で提供され得る。

【0283】

一態様において、本明細書において開示されるランディングパッド細胞を生成するための方法は、細胞に、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現コンストラクト、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に連結されたゲノム標的配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現コンストラクトを導入することをさらに含み、ゲノム標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフによってフランキングされている。ゲノム標的配列は、３’末端において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列によってフランキングされていてもよい。

【0284】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の酸配列を含む。一態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質である。一態様において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。一態様において、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一態様において、ＩＩ型Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９は、ヒトコドン最適化Ｃａｓである。

【0285】

ある特定の態様において、Ｃａｓタンパク質は、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両鎖をカットすることなく標的部位において一重鎖切断（すなわち、「ニック」）を作出することができる「ニッカーゼ」である。Ｃａｓ９は、例えば、対向するＤＮＡ鎖の切断に関与するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインという２つのヌクレアーゼドメインを含む。これらドメインのいずれかにおける突然変異は、ニッカーゼを作出し得る。ニッカーゼを作出する突然変異の例は、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１およびＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１に見出すことができ、これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。

【0286】

ある特定の態様において、ｄｓＤＮＡの各鎖上の標的部位に特異的な２つの別個のＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）は、別の核酸におけるオーバーハング配列、または同じ核酸上の別個の領域と相補的なオーバーハング配列を作出し得る。ｄｓＤＮＡの両鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと核酸を接触させることによって作出されるオーバーハング末端は、５’または３’のいずれかのオーバーハング末端であり得る。例えば、オーバーハング配列が作出されるように、第１のニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第１の鎖において一重鎖切断を作出してもよく、第２のニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第２の鎖において一重鎖切断を作出してもよい。一重鎖切断を作出する各ニッカーゼの標的部位は、作出されるオーバーハング末端配列が、異なる核酸分子上のオーバーハング末端配列と相補的になるように選択され得る。２つの異なる核酸分子の相補的オーバーハング末端は、本明細書において開示される方法によってアニーリングされ得る。いくつかの態様において、第１の鎖上のニッカーゼの標的部位は、第２の鎖上のニッカーゼの標的部位とは異なっている。

【0287】

いくつかの態様において、第１の核酸は、Ｃａｓタンパク質中のヌクレアーゼ活性部位の少なくとも１つのアミノ酸残基を破壊する突然変異を含み、この突然変異型Ｃａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ領域の１つの鎖だけに切断を生成し、この突然変異は、標的ＤＮＡ領域における非相同組換えを減少させる。一態様において、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。一態様において、核局在化シグナルは、ＳＶ４０核局在化シグナルである。

【0288】

ＴＡＬＥＮ
いくつかの態様において、本明細書において開示される様々な方法および組成物における相同組換えのために用いられるヌクレアーゼ剤は、ＴＡＬＥＮシステムを含み得る。よって、一態様において、ヌクレアーゼ剤は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムにおける特定の標的配列において二重鎖切断を作るために使用され得る配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然のまたはエンジニアリングされた転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターまたはその機能的部分を、例えばＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合させることによって作出される。

【0289】

ユニークなモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、いかなるＤＮＡ認識特異性も有し得るタンパク質の設計を可能にする。よって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するようにエンジニアリングすることができ、したがって、所望の標的配列において二重鎖切断を作るために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107、Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432、Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761、Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704、およびMiller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148を参照されたい。これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。

【0290】

好適なＴＡＬヌクレアーゼおよび好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法の例は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４Ａ１号、同第２０１１／０１４５９４０Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９Ａ１号、同第２００５／００２６１５７Ａ１号、同第２００５／００６４４７４Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７Ａ１号、および同第２００６／００６３２３１Ａ１号において開示されている（各々、ここに参照することにより組み入れられる）。

【0291】

様々な態様において、例えば目的のゲノム座位内の標的核酸配列の中または付近でカットするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼがエンジニアリングされ、この標的核酸配列は、標的化ベクターによって修飾されることになる配列またはその付近にある。本明細書において提供される様々な方法および組成物で使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書において記述される標的化ベクターによって修飾されることになる標的核酸配列またはその付近に結合するように特別に設計されたものが含まれる。

【0292】

一態様において、ＴＡＬＥＮの各モノマーは１２～２５個のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは１ｂｐのサブサイトに結合する。一態様において、ヌクレアーゼ剤は、非依存性ヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一態様において、非依存性ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインとを含み、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結されており、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐから約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量化し、標的配列において二重鎖切断を作る。

【0293】

一態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインとを含み、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結されており、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、５ｂｐまたは６ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量化し、二重鎖切断を作る。

【0294】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
いくつかの態様において、本明細書において開示される様々な方法および組成物における相同組換えのために用いられるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含み得る。一態様において、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐのサブサイトに結合する。他の態様において、ＺＦＮは、非依存性ヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一態様において、非依存性エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含み、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結されており、第１および第２のＺＦＮは、約６ｂｐから約４０ｂｐの切断部位または約５ｂｐから約６ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量化し、二重鎖切断を作る。例えば、ＵＳ２００６０２４６５６７、ＵＳ２００８０１８２３３２、ＵＳ２００２００８１６１４、ＵＳ２００３００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３０１２３４８４、ＵＳ２０１００２９１０４８、およびＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２を参照されたい。これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。

【0295】

メガヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本明細書において開示される様々な方法および組成物における相同組換えのために用いられるヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼシステムを含み得る。メガヌクレアーゼは、保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、これらのファミリーは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ－ＹＩＧ」、「Ｈ－Ｎ－Ｈ」、および「Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス」のファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびホスホジエステル結合の加水分解に関与する。

【0296】

ＨＥａｓｅは、その認識部位が長いことと、そのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型を許容することで知られている。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、および機能は公知であり、例えば、Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248、Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9、Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26、Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95、およびMoure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764を参照されたい。

【0297】

いくつかの例では、自然において存在するバリアントおよび／またはエンジニアリングされた派生的メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、および／または認識部位特異性を修飾し、活性についてスクリーニングするための方法は公知であり、例えば、Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62、Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905、Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008、Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9、Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41、Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800、Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178、Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149、Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29、Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154、ＷＯ２００５１０５９８９、ＷＯ２００３０７８６１９、ＷＯ２００６０９７８５４、ＷＯ２００６０９７８５３、ＷＯ２００６０９７７８４、およびＷＯ２００４０３１３４６を参照されたい。

【0298】

本明細書では、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｅｃＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、またはそれらのいずれかの活性バリアントもしくはフラグメントを含むがこれらに限定されない、いかなるメガヌクレアーゼを使用してもよい。

【0299】

一態様において、メガヌクレアーゼは、１２～４０塩基対の二重鎖ＤＮＡ配列を認識する。一態様において、メガヌクレアーゼは、本明細書において記述される異種プラスミドのうちの１つにおける１つの完全にマッチする標的配列を認識する。一態様において、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一態様において、ホーミングヌクレアーゼは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一態様において、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、およびＩ－Ｄｍｏｌから選択される。

【0300】

制限エンドヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本明細書において開示される様々な方法および組成物における相同組換えのために用いられるヌクレアーゼ剤は、制限エンドヌクレアーゼを含み得、これには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型のエンドヌクレアーゼが含まれる。Ｉ型およびＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、典型的には、切断部位（認識部位）から何百もの塩基対、離れている場合があるヌクレアーゼ結合部位から不定の位置において切断する。ＩＩ型システムでは、制限活性は、いかなるメチラーゼ活性とも無関係であり、切断は典型的には、結合部位の中または付近の特定部位において起こる。ほとんどのＩＩ型酵素は回分配列をカットするが、ＩＩａ型酵素は、非回文構造の認識部位を認識し、認識部位の外を切断し、ＩＩｂ型酵素は、配列を２回カットし、その部位は両方とも認識部位の外にあり、ＩＩ型酵素は、非対称な認識部位を認識し、片側において、かつ認識部位から約１～２０ヌクレオチドの規定距離で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化されたＤＮＡを標的化する。制限酵素は、例えばＲＥＢＡＳＥデータベース［ウェブページはrebase.neb.com；Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20］、Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12、およびBelfort et al., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, D.C.)において、さらに記述および分類されている。

【0301】

ヌクレアーゼ剤は、当技術分野において公知のいずれの手段によって細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入されてもよい。代替的には、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される場合、ヌクレアーゼ剤は、細胞の中で一過性に、条件付きで、または構成的に発現され得る。よって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結されていてもよい。そのような目的のプロモーターは、本明細書における他の箇所にさらに詳細に記載される。代替的には、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするまたは構成するｍＲＮＡとして細胞に導入される。

【0302】

ヌクレアーゼ剤の活性バリアントおよびフラグメント（すなわち、エンジニアリングされたヌクレアーゼ剤）も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤との少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多くの配列同一性を含むことができ、活性バリアントは、所望の認識部位においてカットする能力を保持し、したがってニックまたは二重鎖切断の誘導活性を保持する。例えば、本明細書において記述されるヌクレアーゼ剤のいずれかを、天然のエンドヌクレアーゼ配列から修飾し、天然のヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位を認識してそこでニックまたは二重鎖切断を誘導するように設計することができる。よって、いくつかの態様において、エンジニアリングされたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤の認識部位とは異なる認識部位においてニックまたは二重鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二重鎖切断の誘導活性についてのアッセイは公知であり、概して、認識部位を含有するＤＮＡ基質に対するエンドヌクレアーゼの総合的な活性および特異性を測定する。

【0303】

ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入によって細胞にヌクレアーゼ剤が提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする自然において存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞における使用頻度がより高いコドンを置換するように修飾され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、自然において存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、非ラットげっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の目的の宿主細胞を含む、所定の目的の原核細胞または真核細胞における使用頻度がより高いコドンを置換するように修飾され得る。

【0304】

相同組換え配列
本開示の方法および組成物の決定的な利点は、ランディングパッドプラスミドまたはその一部が挿入されることになるゲノムコンテキストに関する情報を必要とせずにランディングパッド細胞を生成する可能性である。これが可能であるのは、本明細書において開示される方法が、親プラスミドによって占有される場所におけるランディングパッドプラスミドまたはその一部の標的化組み込みに依存するからである。親プラスミドに関する配列情報は、一般に利用可能であるか、または当技術分野において公知である（例えば、市販のプラスミド）。よって、そのような情報に依存して、相同組換えを介した親プラスミドの内部部分配列とランディングパッドプラスミド配列またはその一部との交換をガイドする相同組換え配列を生成することが可能である。

【0305】

本開示のいくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む。

【0306】

本開示のいくつかの態様において、３’相同組換え部位は、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む。

【0307】

本開示のいくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む。

【0308】

いくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１６からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも５５０、または少なくとも約５５３個の連続するヌクレオチドを含む。

【0309】

いくつかの態様において、３’相同組換え部位は、配列番号１７からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０１０、少なくとも約１０２０、少なくとも約１０３０、少なくとも約１０４０、少なくとも約１０５０、少なくとも約１０６０、少なくとも約１０７０、少なくとも約１０８０、少なくとも約１０９０、少なくとも約１１００、少なくとも約１１１０、少なくとも約１１２０、少なくとも約１１３０、少なくとも約１１４０、少なくとも約１１５０、少なくとも約１１６０、少なくとも約１１７０、少なくとも約１１８０、少なくとも約１１９０、少なくとも約１２００、少なくとも約１２１０、少なくとも約１２２０、または少なくとも約１２２１個の連続するヌクレオチドを含む。

【0310】

いくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１６からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも５５０、または少なくとも約５５３個の連続するヌクレオチドを含み、３’相同組換え部位は、配列番号１７からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約５７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０１０、少なくとも約１０２０、少なくとも約１０３０、少なくとも約１０４０、少なくとも約１０５０、少なくとも約１０６０、少なくとも約１０７０、少なくとも約１０８０、少なくとも約１０９０、少なくとも約１１００、少なくとも約１１１０、少なくとも約１１２０、少なくとも約１１３０、少なくとも約１１４０、少なくとも約１１５０、少なくとも約１１６０、少なくとも約１１７０、少なくとも約１１８０、少なくとも約１１９０、少なくとも約１２００、少なくとも約１２１０、少なくとも約１２２０、または少なくとも約１２２１個の連続するヌクレオチドを含む。

【0311】

本開示のいくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１８または配列番号１１４のポリヌクレオチド配列を含む。本開示のいくつかの態様において、３’相同組換え部位は、配列番号１９または配列番号１１５のポリヌクレオチド配列を含む。本開示のいくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１８または配列番号１１４のポリヌクレオチド配列を含み、３’相同組換え部位は、配列番号１９または配列番号１１５のポリヌクレオチド配列を含む。

【0312】

いくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１８または配列番号１１４からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、または少なくとも約５０８個の連続するヌクレオチドを含む。

【0313】

いくつかの態様において、３’相同組換え部位は、配列番号１９または配列番号１１５からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、または少なくとも約２９８個の連続するヌクレオチドを含む。

【0314】

いくつかの態様において、５’相同組換え部位は、配列番号１８または配列番号１１４からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、または少なくとも約５０８個の連続するヌクレオチドを含み、３’相同組換え部位は、配列番号１９または配列番号１１５からの、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、または少なくとも約２９８個の連続するヌクレオチドを含む。

【0315】

いくつかの態様において、相同組換え配列（すなわち、図５Ａのランディングパッドプラスミドまたは第２ ＧＯＩプラスミドなどの遊離プラスミドを、図Ａの親プラスミドまたは組み込まれたランディングパッドプラスミドなどの組み込まれたプラスミドに対して標的化する、ＤＮＡ標的化セグメント）は、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、相同組換え配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔ、約１２ｎｔから約５０ｎｔ、約１２ｎｔから約４０ｎｔ、約１２ｎｔから約３０ｎｔ、約１２ｎｔから約２５ｎｔ、約１２ｎｔから約２０ｎｔ、または約１２ｎｔから約１９ｎｔの長さを有し得る。例えば、相同組換え配列は、約１９ｎｔから約２０ｎｔ、約１９ｎｔから約２５ｎｔ、約１９ｎｔから約３０ｎｔ、約１９ｎｔから約３５ｎｔ、約１９ｎｔから約４０ｎｔ、約１９ｎｔから約４５ｎｔ、約１９ｎｔから約５０ｎｔ、約１９ｎｔから約６０ｎｔ、約１９ｎｔから約７０ｎｔ、約１９ｎｔから約８０ｎｔ、約１９ｎｔから約９０ｎｔ、約１９ｎｔから約１００ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約５０ｎｔ、約２０ｎｔから約６０ｎｔ、約２０ｎｔから約７０ｎｔ、約２０ｎｔから約８０ｎｔ、約２０ｎｔから約９０ｎｔ、または約２０ｎｔから約１００ｎｔ、約１００ｎｔから約１２５ｎｔ、約１２５ｎｔから約１５０ｎｔ、約１５０ｎｔから約１７５ｎｔ、約１７５ｎｔから約２００ｎｔ、約２００ｎｔから約２２５ｎｔ、約２２５ｎｔから約２５０ｎｔ、約２５０ｎｔから約３００ｎｔ、約３００ｎｔから約３５０ｎｔ、約３５０ｎｔから約４００ｎｔ、約４００ｎｔから約４５０ｎｔ、約４５０ｎｔから約５００ｎｔ、約５００ｎｔから約６００ｎｔ、約６００ｎｔから約７００ｎｔ、約７００ｎｔから約８００ｎｔ、約８００ｎｔから約９００ｎｔ、約９００ｎｔから約１０００ｎｔ、約１０００ｎｔから約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔから約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔから約１３００ｎｔ、約１３００ｎｔから約１４００ｎｔ、または約１４００ｎｔから約１５００ｎｔの長さを有し得る。

【0316】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列と相補的である遊離プラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２１ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約４５ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約５５ｎｔ、少なくとも約６０ｎｔ、少なくとも約６５ｎｔ、少なくとも約７０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少なくとも約８０ｎｔ、少なくとも約８５ｎｔ、少なくとも約９０ｎｔ、少なくとも約９５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約３００ｎｔ、少なくとも約４００ｎｔ、少なくとも約５００ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約７００ｎｔ、少なくとも約８００ｎｔ、少なくとも約９００ｎｔ、少なくとも約１０００ｎｔ、少なくとも約１１００ｎｔ、少なくとも約１２００ｎｔ、少なくとも約１３００ｎｔ、少なくとも約１４００ｎｔ、または少なくとも約１５００ｎｔの長さを有し得る。

【0317】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列と相補的である遊離プラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約１００ｎｔ、約１２ｎｔから約９０ｎｔ、約１２ｎｔから約８０ｎｔ、約１２ｎｔから約７０ｎｔ、約１２ｎｔから約６０ｎｔ、約１２ｎｔから約５０ｎｔ、約１２ｎｔから約４５ｎｔ、約１２ｎｔから約４０ｎｔ、約１２ｎｔから約３５ｎｔ、約１２ｎｔから約３０ｎｔ、約１２ｎｔから約２５ｎｔ、約１２ｎｔから約２０ｎｔ、約１２ｎｔから約１９ｎｔ、約１９ｎｔから約２０ｎｔ、約１９ｎｔから約２５ｎｔ、約１９ｎｔから約３０ｎｔ、約１９ｎｔから約３５ｎｔ、約１９ｎｔから約４０ｎｔ、約１９ｎｔから約４５ｎｔ、約１９ｎｔから約５０ｎｔ、約１９ｎｔから約６０ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約５０ｎｔ、約２０ｎｔから約６０ｎｔ、または約１２ｎｔから約２０ｎｔの長さを有し得る。

【0318】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列と相補的である遊離プラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約１００ｎｔ、約１２ｎｔから約９０ｎｔ、約１２ｎｔから約８０ｎｔ、約１２ｎｔから約７０ｎｔ、約１２ｎｔから約６０ｎｔ、約１２ｎｔから約５０ｎｔ、約１２ｎｔから約４５ｎｔ、約１２ｎｔから約４０ｎｔ、約１２ｎｔから約３５ｎｔ、約１２ｎｔから約３０ｎｔ、約１２ｎｔから約２５ｎｔ、約１２ｎｔから約２０ｎｔ、約１２ｎｔから約１９ｎｔ、約１９ｎｔから約２０ｎｔ、約１９ｎｔから約２５ｎｔ、約１９ｎｔから約３０ｎｔ、約１９ｎｔから約３５ｎｔ、約１９ｎｔから約４０ｎｔ、約１９ｎｔから約４５ｎｔ、約１９ｎｔから約５０ｎｔ、約１９ｎｔから約６０ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約５０ｎｔ、約２０ｎｔから約６０ｎｔ、または約１２ｎｔから約２０ｎｔの長さを有し得る。

【0319】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列と相補的である遊離プラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、または５５００ヌクレオチドの長さを有し得る。

【0320】

遊離プラスミド中の相同組換え配列のヌクレオチド配列と、組み込まれたプラスミド中の対応する相同組換え配列のヌクレオチド配列との間のパーセント相補性は、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％相補的（すなわち、完全に相補的）であり得る。

【0321】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列と隣接するゲノム配列との間の距離は、少なくとも１ｎｔ、少なくとも２ｎｔ、少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも６ｎｔ、少なくとも７ｎｔ、少なくとも８ｎｔ、少なくとも９ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１１ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２１ｎｔ、少なくとも２２ｎｔ、少なくとも２３ｎｔ、少なくとも２４ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも２６ｎｔ、少なくとも２７ｎｔ、少なくとも２８ｎｔ、少なくとも２９ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも３１ｎｔ、少なくとも３２ｎｔ、少なくとも３３ｎｔ、少なくとも３４ｎｔ、少なくとも３５ｎｔ、少なくとも３６ｎｔ、少なくとも３７ｎｔ、少なくとも３８ｎｔ、少なくとも３９ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、少なくとも４１ｎｔ、少なくとも４２ｎｔ、少なくとも４３ｎｔ、少なくとも４４ｎｔ、少なくとも４５ｎｔ、少なくとも４６ｎｔ、少なくとも４７ｎｔ、少なくとも４８ｎｔ、少なくとも４９ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも５１ｎｔ、少なくとも５２ｎｔ、少なくとも５３ｎｔ、少なくとも５４ｎｔ、少なくとも５５ｎｔ、少なくとも５６ｎｔ、少なくとも５７ｎｔ、少なくとも５８ｎｔ、少なくとも５９ｎｔ、少なくとも６０ｎｔ、少なくとも６１ｎｔ、少なくとも６２ｎｔ、少なくとも６３ｎｔ、少なくとも６４ｎｔ、少なくとも６５ｎｔ、少なくとも６６ｎｔ、少なくとも６７ｎｔ、少なくとも６８ｎｔ、少なくとも６９ｎｔ、少なくとも７０ｎｔ、少なくとも７１ｎｔ、少なくとも７２ｎｔ、少なくとも７３ｎｔ、少なくとも７４ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、少なくとも７６、少なくとも７７ｎｔ、少なくとも７８ｎｔ、少なくとも７９ｎｔ、少なくとも８０ｎｔ、少なくとも８１ｎｔ、少なくとも８２ｎｔ、少なくとも８３ｎｔ、少なくとも８４ｎｔ、少なくとも８５ｎｔ、少なくとも８６ｎｔ、少なくとも８７ｎｔ、少なくとも８８ｎｔ、少なくとも８９ｎｔ、少なくとも９０ｎｔ、少なくとも９１、少なくとも９２ｎｔ、少なくとも９３ｎｔ、少なくとも９４ｎｔ、少なくとも９５ｎｔ、少なくとも９６、少なくとも９７ｎｔ、少なくとも９８ｎｔ、少なくとも９９ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも３５０ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも４５０ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも５５０ｎｔ、少なくとも６００ｎｔ、少なくとも６５０ｎｔ、少なくとも７００ｎｔ、少なくとも７５０ｎｔ、少なくとも８００ｎｔ、少なくとも８５０ｎｔ、少なくとも９００ｎｔ、少なくとも９５０ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも１１００ｎｔ、少なくとも１２００ｎｔ、少なくとも１３００ｎｔ、少なくとも１４００ｎｔ、少なくとも１５００ｎｔ、少なくとも１６００ｎｔ、少なくとも１７００ｎｔ、少なくとも１８００ｎｔ、少なくとも１９００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも２１００ｎｔ、少なくとも２２００ｎｔ、少なくとも２３００ｎｔ、少なくとも２４００ｎｔ、少なくとも２５００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも３５００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも４５００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、または少なくとも５０００ｎｔである。

【0322】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列と隣接するゲノム配列との間の距離は、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、３５ｎｔ、３６ｎｔ、３７ｎｔ、３８ｎｔ、３９ｎｔ、４０ｎｔ、４１ｎｔ、４２ｎｔ、４３ｎｔ、４４ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、５５ｎｔ、５６ｎｔ、５７ｎｔ、５８ｎｔ、５９ｎｔ、６０ｎｔ、６１ｎｔ、６２ｎｔ、６３ｎｔ、６４ｎｔ、６５ｎｔ、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９１、９２ｎｔ、９３ｎｔ、９４ｎｔ、９５ｎｔ、９６、９７ｎｔ、９８ｎｔ、９９ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、４５０ｎｔ、５００ｎｔ、５５ｎｔ、６００ｎｔ、６５０ｎｔ、７００ｎｔ、７５０ｎｔ、８００ｎｔ、８５０ｎｔ、９００ｎｔ、９６０ｎｔ、１０００ｎｔ、１１００ｎｔ、１２００ｎｔ、１３００ｎｔ、１４００ｎｔ、１５００ｎｔ、１６００ｎｔ、１７００ｎｔ、１８００ｎｔ、１９００ｎｔ、２０００ｎｔ、２１００ｎｔ、２２００ｎｔ、約２３００ｎｔ、約２４００ｎｔ、２５００ｎｔ、３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、５０００ｎｔ、または５０００ｎｔである。

【0323】

いくつかの態様において、組み込まれたプラスミド中の相同組換え配列と隣接するゲノム配列との間の距離は、約１０ｎｔから約２０ｎｔ、約１０ｎｔから約２０ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約３０ｎｔから約４０ｎｔ、約４０ｎｔから約５０ｎｔ、約５０ｎｔから約６０ｎｔ、約６０ｎｔから約７０ｎｔ、約７０ｎｔから約８０ｎｔ、約８０ｎｔから約９０ｎｔ、約９０ｎｔから約１００ｎｔ、約１００ｎｔから約２００ｎｔ、約２００ｎｔから約３００ｎｔ、約３００ｎｔから約４００ｎｔ、約４００ｎｔから約５００ｎｔ、約５００ｎｔから約６００ｎｔ、約６００ｎｔから約７００ｎｔ、約７００ｎｔから約８００ｎｔ、約８００ｎｔから約９００ｎｔ、約９００ｎｔから約１０００ｎｔ、約１０００ｎｔから約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔから約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔから約１３００ｎｔ、約１３００ｎｔから約１４００ｎｔ、約１４００ｎｔから約１５００ｎｔ、約１５００ｎｔから約１６００ｎｔ、約１６００ｎｔから約１７００ｎｔ、約１７００ｎｔから約１８００ｎｔ、約１８００ｎｔから約１９００ｎｔ、約１９００ｎｔから約２０００ｎｔ、約２０００ｎｔから約２１００ｎｔ、約２１００ｎｔから約２２００ｎｔ、約２２００ｎｔから約２３００ｎｔ、約２３００ｎｔから約２４００ｎｔ、約２４００ｎｔから２５００ｎｔ、約２５００ｎｔから約３０００ｎｔ、約３０００ｎｔから約３５００ｎｔ、約３５００ｎｔから約４０００ｎｔ、約４０００ｎｔから約４５００ｎｔ、約４５００ｎｔから約５０００ｎｔ、または約５０００ｎｔから約５０００ｎｔである。

【0324】

部位特異的組換えシステム
本開示のいくつかの態様において、例えば、ランディングパッドプラスミドと第２ ＧＯＩプラスミドとの間の組換え事象において、組換えプロセスは、部位特異的組換えシステムの使用によって起こる。

【0325】

部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリペプチドを細胞に導入すること、または部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含め、いかなる手段によって細胞に導入されてもよい。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、挿入核酸の中または別個のポリヌクレオチドの中に位置し得る。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、誘導性プロモーター、細胞に対して内因性のプロモーター、細胞に対して異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または発生段階特異的プロモーターを含め、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。

【0326】

いくつかの態様において、部位特異的組換え部位は、挿入核酸の中に含まれた選択マーカーおよび／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドにフランキングする。そのような場合には、例えば、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ媒介相同組換えを介した、親細胞における標的化座位でのランディングパッドプラスミド核酸の組み込みの後、部位特異的組換え部位（例えば、ＬｏｘＰ部位）の間の配列が除去され得るか、または、部位特異的組換えを介して、第２ ＧＯＩプラスミド中の部位特異的組換え部位の間に位置するＧＯＩの対応する配列と交換され得る。

【0327】

保存的部位特異的組換えとしても知られる部位特異的組換えは、少なくともある程度の配列相同性を有するセグメント間でＤＮＡ鎖交換が起こる一種の遺伝子組換えである。部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）は、短いＤＮＡ配列（部位）を認識してそれに結合し、そこでＤＮＡ骨格を切断し、関与する２本のＤＮＡ螺旋を交換し、ＤＮＡ鎖を再結合させることにより、ＤＮＡセグメントの再編成を行う。いくつかのシステムでは、リコンビナーゼ酵素および組換え部位だけの部位特異的組換えシステムが、これらの反応のすべてを行うのに十分であるが、他のシステムでは、いくつかのアクセサリータンパク質および／またはアクセサリー部位も必要である。既定のゲノム座位への転写ユニットの標的化導入のための高度な手法である、これらのリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）の中でも、複数のゲノム修飾方策は、ＳＳＲの能力に依存する。

【0328】

部位特異的組換えシステムは、複雑な真核生物ゲノムに対しても、高度に特異的であり、高速かつ効率的である。

【0329】

組換え部位は、典型的には、３０～２００ヌクレオチドの間の長さであり、リコンビナーゼが結合する部分的反転リピート対称性を有する２つのモチーフからなり、これらは、組換えが起こる中央のクロスオーバー配列にフランキングする。その間で組換えが起こる部位の対は、通常は同一であるが、例外もある（例えば、λインテグラーゼのａｔｔＰおよびａｔｔＢ）。

【0330】

いくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼ組換えは、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ媒介システム、Ｔｙｒ－インテグラーゼ媒介システム、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ媒介システム、またはセリン－インテグラーゼ媒介システムによって媒介される。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ媒介システムは、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ３、またはＢ３ Ｔｙｒ－リコンビナーゼを含む。いくつかの態様において、Ｔｙｒ－インテグラーゼ媒介システムは、λ（ラムダ）、ＨＫ０２２、またはＨＰ１ Ｔｙｒ－インテグラーゼを含む。いくつかの態様において、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ媒介システムは、γδ（ガンマデルタ）、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、またはＧｉｎセリン－リゾルバーゼ／インテグラーゼを含む。いくつかの態様において、セリン－インテグラーゼ媒介システムは、ＰｈｉＣ３１、Ｂｘｂ１、またはＲ４セリン－インテグラーゼを含む。

【0331】

いくつかの特定の態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ媒介システムは、Ｃｒｅ Ｔｙｒ－リコンビナーゼを含む。Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えは、細胞のＤＮＡ中の特定部位において欠失、挿入、転座および反転を行うために使用される部位特異的リコンビナーゼ技術である。これにより、ＤＮＡ修飾が、特定の細胞型に標的化されること、または特定の外的刺激によって引き起こされることが可能になる。このシステムは、Ｌｏｘ配列と呼ばれる一対の短い標的配列を組換える単一の酵素であるＣｒｅリコンビナーゼからなる。このシステムは、いかなる追加の補足的なタンパク質または配列を挿入することなく実行され得る。Ｃｒｅ酵素と、ＬｏｘＰ配列と呼ばれる元のＬｏｘ部位とは、バクテリオファージＰ１に由来する。

【0332】

ＬｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１）は、３４ｂｐからなるバクテリオファージＰ１上の部位である。この部位には、２セットの対称な１３ｂｐ配列の間の、中央の２塩基を除いては可変である、非対称な８ｂｐ配列が含まれる。厳密な配列を以下に示す。「Ｎ」は、可変の塩基を示し、小文字は、野生型から突然変異している塩基を示す。１３ｂｐの配列は回文構造であるが、８ｂｐのスペーサーはそうでないため、ｌｏｘＰ配列にはある特定の向きが与えられる。通常、ｌｏｘＰ部位は、遺伝子操作のために対で機能する。２つのｌｏｘＰ部位が同じ向きであれば、フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）配列（２つのｌｏｘＰ部位によってフランキングされた配列）が切除される。しかし、２つのｌｏｘＰ部位が反対の向きであれば、フロックス配列が反転する。フロックスドナー配列が存在する場合には、ドナー配列が元の配列と入れ替えられ得る。リコンビナーゼ媒介カセット交換と呼ばれるこの技法は、ランディングパッドプラスミド中の２つのＬｏｘＰ部位の間に位置するポリヌクレオチド配列を、第２ ＧＯＩプラスミド中の２つのＬｏｘＰ部位の間に位置するポリヌクレオチド配列と入れ替えるために、本開示の方法において使用され得る。したがって、いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、ＬｏｘＰ部位である。

【0333】

いくつかの態様において、ＬｏｘＰは、配列番号１の核酸配列、すなわち、野生型ＬｏｘＰ部位を含む。他の態様において、ＬｏｘＰ部位は、配列番号２に対応する突然変異型ＬｏｘＰ部位であり、Ｎは、いずれのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）であってもよい。

【0334】

いくつかの態様において、突然変異型ＬｏｘＰ部位は、配列番号３（ｌｏｘ ５１１）、配列番号４（ｌｏｘ ５１７１）、配列番号５（ｌｏｘ ２２７２）、配列番号６（Ｍ２）、配列番号７（Ｍ３）、配列番号８（Ｍ７）、配列番号９（Ｍ１１）、配列番号１０（ｌｏｘ ７１）、配列番号１１（ｌｏｘ ６６）、および配列番号２８～８２からなる群から選択される核酸を含む。

【0335】

いくつかの態様において、本開示に従って使用される２つのＬｏｘＰ部位は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２８～８２、またはそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される２つのＬｏｘＰ部位であり得る。いくつかの態様において、一対のＬｏｘＰ部位におけるＬｏｘＰ部位は同一である。いくつかの態様において、一対のＬｏｘＰ部位におけるＬｏｘＰ部位は異なっている。

【0336】

いくつかの態様において、両方のＬｏｘＰ部位が野生型ＬｏｘＰ部位である。Araki, K (1997). “Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells”. Nucleic Acids Research. 25 (4):868-872を参照されたい。これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0337】

他の態様において、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ媒介システムは、Ｆｌｐ Ｔｙｒ－リコンビナーゼを含む。Ｆｌｐ－ＦＲＴ組換えは、部位指向性組換え技術であり、インビボで制御された条件下で生物のＤＮＡを操作するために使用されることが増えている。これはＣｒｅ－ｌｏｘ組換えに類似しているが、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するリコンビナーゼであるフリッパーゼ（Ｆｌｐ）によるフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位の間の配列の組換えを要する。

【0338】

チロシンリコンビナーゼとセリンリコンビナーゼとの両方で基本的な化学反応は同じであるが、それらの間にはいくつかの相違点がある。ＣｒｅまたはＦＬＰなどのチロシンリコンビナーゼは、６～８ｂｐずれた点で一度に１本のＤＮＡ鎖を切断し、その鎖の３’末端をチロシン求核剤のヒドロキシル基に連結させる。その後、一対の鎖のみが交換されているホリデイジャンクションに類似した交差鎖中間体を介して鎖交換が進行する。セリンリコンビナーゼの機序および制御は、これよりもはるかに理解されていない。この酵素群は、１９９０年代中盤になって初めて発見され、依然として比較的小さい。今や古典的なメンバーであるガンマ－デルタおよびＴｎ３リゾルバーゼだけでなく、φＣ３１－、Ｂｘｂ１－、およびＲ４インテグラーゼのような新しく追加されたものも、２ｂｐずれた点で４本のＤＮＡ鎖すべてを同時にカットする。切断の間、切断部位における５’リン酸と、保存されたセリン残基（リゾルバーゼにおけるＳ１０）のヒドロキシル基との間のホスホセリン結合によってホスホジエステル結合が置き換えられるエステル交換反応を介して、タンパク質－ＤＮＡ結合が形成される。Ｔｙｒクラスのメンバーとは違って、この組換え経路は、２つの異なる基質部位（ａｔｔＰおよびａｔｔＢ）を部位ハイブリッド（ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）に変換する。これは、補助的な「組換え指向性因子」（ＲＤＦ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）によってしか克服できない、この特定の組換え経路の非可逆的性質を説明する。

【0339】

いくつかの態様において、ＳＳＲＳは、フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位である。この３４ｂｐの極小ＦＲＴ部位配列は、配列番号１２に定める配列を有し、そのために、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）が、８ｂｐスペーサーにフランキングする配列番号１３の１３ｂｐアームの両方に結合する［すなわち、逆向きの部位特異的組換え（クロスオーバーの領域）］。ＦＲＴ媒介切断は、トップ鎖上の非対称な８ｂｐコア領域（５’－ｔｃｔａｇａａａ－３’）から少し前、かつボトム鎖上のこの配列の後に起こる。いくつかのバリアントＦＲＴ部位が存在するが、組換えは通常、２つの同一のＦＲＴの間でしか起こり得ず、非同一の（「異種特異的な」）ＦＲＴの間では概して起こらない。いくつかの態様において、本明細書において開示されるＦＲＴ部位は、配列番号１２、１３、および８３～９１から選択される。いくつかの態様において、本明細書において開示される一対のＦＲＴ部位は、配列番号１２、１３、および８３～９１から選択される。いくつかの態様において、一対のＦＲＴ部位におけるＦＲＴ部位は同一である。いくつかの態様において、一対のＦＲＴ部位におけるＦＲＴ部位は異なっている。

【0340】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるａｔｔ部位は、配列番号９２～１０９から選択される。いくつかの態様において、ａｔｔ部位は、ａｔｔＢ部位である。いくつかの態様において、ａｔｔ部位は、ａｔｔＰ部位である。

【0341】

いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、単一のＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つ以上のＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、同じ部位特異的リコンビナーゼシステムに対応する２つのＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのＴｙｒ－リコンビナーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのＴｙｒ－インテグラーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのセリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つまたは１つのセリン－インテグラーゼ部位を含むことができる。

【0342】

いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、異なる部位特異的リコンビナーゼシステムに対応する２つのＳＳＲＳを含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのＴｙｒ－リコンビナーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのＴｙｒ－インテグラーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つのセリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、２つまたは１つのセリン－インテグラーゼ部位を含むことができる。

【0343】

いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位およびＴｙｒ－インテグラーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位およびセリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、Ｔｙｒ－リコンビナーゼ部位およびセリン－インテグラーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位およびセリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、Ｔｙｒ－インテグラーゼ部位およびセリン－インテグラーゼ部位を含むことができる。いくつかの態様において、本開示のプラスミド、例えばＧＯＩプラスミドまたはランディングパッドプラスミドは、セリン－リゾルバーゼ／インベルターゼ部位およびセリン－インテグラーゼ部位を含むことができる。

【0344】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【0345】

マーカー
いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミド中の部位特異的組換え部位は、マーカー（例えば、選択マーカーもしくは選択可能マーカーおよび／または検出可能マーカーもしくはスクリーニング可能なマーカー、例えばレポーター遺伝子）をコードするポリヌクレオチドにフランキングする。そのような場合には、第２ ＧＯＩプラスミドからの挿入核酸（両方のＳＳＲＳの間に位置するエリア）の組み込みの後に、ランディングパッドプラスミド上の部位特異的組換え部位の間の配列が除去される。

【0346】

マーカーシステムは、選択可能マーカーおよびスクリーニング可能マーカーという２つの広いカテゴリで存在する。選択可能マーカーは、典型的には、形質転換生物（通常は単細胞）に抗生物質の存在下で生きる能力を与える、抗生物質耐性のための遺伝子である。スクリーニング可能マーカーは、レポーター遺伝子とも呼ばれ、典型的には、細胞または形質転換生物における色の変化または他の視認できる変化を引き起こす。これにより、調査者が、形質転換された細胞について細胞の大群を素早くスクリーニングできるようになる。

【0347】

いくつかの態様において、選択マーカーは、選択カセットに含まれる。一態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）および／またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。

【0348】

いくつかの態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、薬物耐性遺伝子である。いくつかの態様において、薬物耐性遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼなどのピューロマイシン耐性遺伝子である。本開示の方法および組成物では、当技術分野において公知のいずれの選択マーカーを使用してもよい。そのような選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、またはそれらのいずれかの組合せを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、選択マーカーは、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、ＺＥＯＣＩＮ（商標）（フレオマイシンＤ１）、またはＧ４１８（ジェネテシン）に対する耐性遺伝子であり得る。

【0349】

いくつかの態様において、ランディングパッドプラスミドは、タンパク質をコードする検出可能マーカー（例えば、レポーター遺伝子）を含むことができる。いくつかの態様において、検出可能マーカーをコードする核酸配列は、選択カセットに含まれる。いくつかの態様において、検出可能マーカーをコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0350】

いくつかの態様において、タンパク質は、レポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質である。特定の態様において、蛍光タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＡｃＧＦＰ１、改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＧＦＰｕｖ、ＡｃＧＦＰ、改良型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、改良型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、改良型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＢａｎａｎａ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、またはそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。いくつかの態様において、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼである。

【0351】

そのようなレポーター遺伝子は、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子もしくは細胞に対して内因性のプロモーター、レポーター遺伝子もしくは細胞に対して異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または発生段階特異的プロモーターであり得る。

【0352】

細胞
原理上、本明細書において開示される方法は、いかなる真核細胞のゲノムへの標的化遺伝子組み込みにも使用することができる。「真核細胞」は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、両生類細胞、例えば、カエルの卵母細胞、魚類細胞、真菌細胞および酵母細胞を含む。

【0353】

本明細書において使用される場合、「哺乳動物細胞」という用語は、ヒト、またはブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ウシ、げっ歯類、有蹄類、ブタ（ｐｉｇ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、子ヒツジ、ヤギ、畜牛、シカ、ラバ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物から得られるあらゆる細胞を含むことを意図している。

【0354】

いくつかの態様において、細胞は、ハイブリドーマ細胞、モノクローナル抗体産生細胞、ウイルス産生細胞、トランスフェクト細胞、がん細胞、および／または組換え型ペプチド産生細胞である。

【0355】

具体的な哺乳動物細胞としては、例えば、Ｃｏｓ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１）、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ（ラージＴ細胞抗原を発現するヒト胎児腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３、ＢＨＫ（例えば、ＢＨＫ－２１）、Ｌ９２９マウス線維芽細胞、ＡＨＴ－１０７ハイブリドーマ細胞、マウス骨髄腫細胞、サル線維芽細胞、Ｘ６３骨髄腫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＳＯハイブリドーマ細胞、Ｕ－９３７細胞、ＭＫ２．７細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、５Ｌ８ハイブリドーマ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｅｌ４細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ－１細胞、Ｓｐ２／０細胞、または本明細書において開示されるもしくは当業者に公知の任意の他の細胞型が挙げられる。

【0356】

追加の哺乳動物細胞型は、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）ならびに樹立細胞株およびそれらの系統［例えば、２９３胎児腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞およびＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞、ＨｅＬａ ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ １８０細胞、ＬＳ １７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ．ｓｕｂ．２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－１細胞、ＬＬＣ－ＰＫ．ｓｕｂ．１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ．１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ ２５６細胞、ＭＨ．ｓｕｂ．１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、またはそれらの派生物］、いずれかの組織または器官［心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細）、リンパ系組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃、骨髄、および血液）、脾臓を含むがこれらに限定されない］からの線維芽細胞、ならびに線維芽細胞および線維芽細胞様細胞株［例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３細胞、ＨＥＬ ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ＭｉＣｌ．ｓｕｂ．１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ．ｓｕｂ．１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、系統２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ系統（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔａｃ）細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、ならびにＪｅｎｓｅｎ細胞、またはそれらの派生物］を含み得るが、これらに限定されない。

【0357】

様々ながん細胞株が当業者によく知られている。本発明の方法によって培養され得るがん細胞株の代表例は、次のがん細胞株を含むが、これらに限定されない：ヒト骨髄腫（例えば、ＫＭＭ－１、ＫＭＳ－１１、ＫＭＳ－１２－ＰＥ、ＫＭＳ－１２－ＢＭ、ＫＭＳ－１８、ＫＭＳ－２０、ＫＭＳ－２１－ＰＥ、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）；ヒト乳がん［例えば、ＫＰＬ－１、ＫＰＬ４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、ＫＰＬ－３Ｃ、Ｔ４７Ｄ、ＳｋＢｒ３、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ４３５５、Ｈｓ ６０６（ＣＲＬ－７３６８）、Ｈｓ ６０５．Ｔ（ＣＲＬ－７３６５）Ｈｓ ７４２．Ｔ（ＣＲＬ－７４８２）、ＢＴ４７４、ＨＢＬ－１００、ＨＣＣ２０２、ＨＣＣ１４１９、ＨＣＣ１９５４、ＭＣＦ７、ＭＤＡ－３６１、ＭＤＡ４３６、ＭＤＡ４５３、ＳＫ－ＢＲ－３、ＺＲ－７５－３０、ＵＡＣＣ－７３２、ＵＡＣＣ－８１２、ＵＡＣＣ－８９３、ＵＡＣＣ－３１３３、ＭＸ－１およびＥＦＭ－１９２Ａ］；乳管癌（乳癌）［例えば、ＨＳ ５７ＨＴ（ＨＴＢ－１２６）、ＨＣＣ１００８（ＣＲＬ－２３２０）、ＨＣＣ１９５４（ＣＲＬ－２３３８）；ＨＣＣ３８（ＣＲＬ－２３１４）、ＨＣＣ１１４３（ＣＲＬ－２３２１）、ＨＣＣ１１８７（ＣＲＬ－２３２２）、ＨＣＣ１２９５（ＣＲＬ－２３２４）、ＨＣＣ１５９９（ＣＲＬ－２３３１）、ＨＣＣ１９３７（ＣＲＬ－２３３６）、ＨＣＣ２１５７（ＣＲＬ－２３４０）、ＨＣＣ２２１８（ＣＲＬ－２３４３）、Ｈｓ５７４．Ｔ（ＣＲＬ－７３４５）、Ｈｓ ７４２．Ｔ（ＣＲＬ－７４８２）］；皮膚がん［例えば、ＣＯＬＯ ８２９（ＣＲＬ－１９７４）、ＴＥ ３５４．Ｔ（ＣＲＬ－７７６２）、Ｈｓ ９２５．Ｔ（ＣＲＬ－７６７７）］；ヒト前立腺がん（例えば、ＭＤＡ ＰＣａ ２ａおよびＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ）；骨がん［例えば、Ｈｓ ９１９．Ｔ（ＣＲＬ－７６７２）、Ｈｓ ８２１．Ｔ（ＣＲＬ－７５５４）、Ｈｓ ８２０．Ｔ（ＣＲＬ－７５５２）、Ｈｓ ７０４．Ｔ（ＣＲＬ－７４４４）、Ｈｓ ７０７（Ａ）．Ｔ（ＣＲＬ－７４４８）、Ｈｓ ７３５．Ｔ（ＣＲＬ－７４７１）、Ｈｓ ８６０．Ｔ（ＣＲＬ－７５９５）、Ｈｓ ８８８．Ｔ．（ＣＲＬ－７６２２）；Ｈｓ ８８９．Ｔ（ＣＲＬ－７６２６）；Ｈｓ ８９０．Ｔ（ＣＲＬ－７６２８）、Ｈｓ ７０９．Ｔ（ＣＲＬ－７４５３）］；ヒトリンパ腫（例えば、Ｋ５６２）；ヒト子宮頸部癌（例えば、ＨｅＬＡ）；肺癌細胞株［例えば、Ｈ１２５、Ｈ５２２、Ｈ１２９９、ＮＣＩ－Ｈ２１２６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２５６）、ＮＣＩ－Ｈ１６７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８８６）、ＮＣＩ－２１７１（ＣＲＬ－５９２９）；ＮＣＩ－Ｈ２１９５（ＣＲＬ０５９３１）］；肺腺癌［例えば、ＮＣＩ－Ｈ１３９５（ＣＲＬ－５８５６）、ＮＣＩ－Ｈ１４３７（ＣＲＬ－５８７２）、ＮＣＩ－Ｈ２００９（ＣＲＬ－５９１１）、ＮＣＩ－Ｈ２１２２（ＣＲＬ－５９８５）、ＮＣＩ－Ｈ２０８７（ＣＲＬ－５９２２）］；転移性肺がん（例えば、骨）［例えば、ＮＣＩ－Ｈ２０９（ＨＴＢ－１７２）］；結腸癌細胞株［例えば、ＬＮ２３５、ＤＬＤ２、Ｃｏｌｏｎ Ａ、ＬＩＭ２５３７、ＬＩＭ１２１５、ＬＩＭ１８６３、ＬＩＭ１８９９、ＬＩＭ２４０５ ＬＩＭ２４１２、ＳＫ－ＣＯ１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３８）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２９）、ＳＷ１２２２（ＡＴＣＣ ＨＢ－１１０２８）、およびＳＷ４８０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２８）］；卵巣がん［例えば、ＯＶＣＡＲ－３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１６１）およびＳＫＯＶ－３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）］；中皮腫［例えば、ＮＣＩ－ｈ２０５２（ＣＲＬ－５９１５）］；神経内分泌癌［例えば、ＨＣＩ－Ｈ１７７０（例えば、ＣＲＬ－５８９３）］；胃がん（例えば、ＬＩＭ１８３９）；神経膠腫（例えば、Ｔ９８、Ｕ２５１、ＬＮ２３５）；頭頸部扁平細胞癌細胞株（例えば、ＳＣＣ４、ＳＣＣ９およびＳＣＣ２５）；髄芽腫（例えば、Ｄａｏｙ、Ｄ２８３ ＭｅｄおよびＤ３４１ Ｍｅｄ）；非セミノーマ精巣（例えば、ＴＥＲＡ１）；前立腺がん（例えば、１７８－２ＢＭＡ、Ｄｕ１４５、ＬＮＣａＰ、およびＰＣ－３）。他のがん細胞株は当技術分野において公知である。

【0358】

いくつかの態様において、細胞は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００６／００７３５９１号の表２において開示されているハイブリドーマである。

【0359】

いくつかの態様において、真核細胞は、哺乳動物細胞、線維芽細胞、多能性細胞、非ヒト多能性細胞、げっ歯類多分化能細胞、マウスもしくはラットの胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト多能性細胞、ヒト成体幹細胞、発生学的に制限されたヒト前駆細胞、またはヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなる群から選択される。

【0360】

発現に有用な酵母には、例として、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）［例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）］、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）［例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・イノシトベラ（Ｐｉｃｈｉａ ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａ）］が含まれる。

【0361】

細胞は、Ｃａ^２＋リン酸または脂質ベースのシステムなどだがこれらに限定されない、当技術分野において公知の標準的方法を使用してトランスフェクトすることができる。

【0362】

目的遺伝子
いくつかの態様において、目的遺伝子（ＧＯＩ）は、例えば、１つもしくは複数のプロモーターおよび／または他の調節性配列に作動可能に連結された、１つまたは複数の組換え型タンパク質をコードする、１つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む。いくつかの態様において、第１ ＧＯＩ（親プラスミド上に位置する目的遺伝子）および第２ ＧＯＩ（第２ ＧＯＩプラスミド上に位置する目的遺伝子）は、同じ分子クラスに属する。例えば、第１ ＧＯＩが抗体であった場合、親細胞株はその種類の組換え型タンパク質を効率的に発現したので、第２ ＧＯＩも抗体であり得る。

【0363】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、生物製剤、例えば、抗体またはその抗原結合部分をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む。

【0364】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、次のタンパク質のうちの１つの全体または一部と同一または実質的に同様のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、ＩＬ－２、アンジオポエチン－２［Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60］、ＮＦカッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、オーストラリア特許第５８８８１９号）、マスト細胞成長因子、幹細胞成長因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、巨核球増殖分化因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノゲン様２タンパク質［ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ－００６８２；Rueegg and Pytela (1995), Gene 160: 257-62］成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン［α－インターフェロン、γ－インターフェロン、およびコンセンサスインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号および同第４，８９７４７１号）を含む］、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １～５）、ニューロトロフィン－３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン－β、白血病抑制因子、およびオンコスタチン－Ｍ。例えば、Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, all volumes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, Mass., 1998)、Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993)、およびThe Cytokine Handbook, Vols. 1 and 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, Calif., 2003)を参照されたい。これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0365】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、上述のタンパク質のいずれかの受容体、かかる受容体もしくは上述のタンパク質のいずれかに対するアンタゴニスト、および／またはかかる受容体もしくはアンタゴニストと実質的に同様なタンパク質のアミノ酸配列の全体または一部を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。これらの受容体およびアンタゴニストには、両形態の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ、ｐ５５およびｐ７５と称される、米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）受容体（Ｉ型およびＩＩ型；欧州特許第０４６０８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、および米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ－１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３号、同第６，０９６，７２８号、および同第５，０７５，２２２号）、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体（欧州特許第０３６７５６６号および米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１７受容体、ＩＬ－１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン－Ｍおよび白血病抑制因子の受容体、ＮＦカッパＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７および米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテジェリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬの受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４を含む）、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が含まれる。

【0366】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）もしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に同様のタンパク質のアミノ酸配列の全体または一部を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。そのような抗原の例としては、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドなど）が挙げられる。ＣＤ抗原のうちのいくつかは、４１ＢＢおよびＯＸ４０も含むＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。これらのリガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドに当てはまるように、ＴＮＦファミリーのメンバーであることが多い。

【0367】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、酵素活性のあるタンパク質またはそのリガンドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、また、本明細書において開示される方法を使用して生産することができる。例としては、次のタンパク質もしくはそれらのリガンドまたはこれらのうちの１つと実質的に同様のタンパク質のうちの１つの全体または一部を含むタンパク質が挙げられる：ＴＮＦ－アルファ変換酵素を含むＡＤＡＭ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）ドメインファミリーメンバー、様々なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ、グロビン、ＩＬ－２アンタゴニスト、アルファ－１アンチトリプシン、上述の酵素のいずれかのリガンド、ならびに多数の他の酵素およびそれらのリガンド。

【0368】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む。抗体の例は、タンパク質のいずれか１つまたは組合せを認識するものを含むが、これらに限定されず、タンパク質は、上述のタンパク質および／または以下の抗原を含むが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ－βおよびそれらの類似体（米国特許第５，２７２，０６４号および同第５，１４９，７９２号参照）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号参照）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテジェリンリガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子［ＢｌｙＳ、別名ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ－１、およびｚＴＮＦ４；Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25参照］、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺がんとの関連で発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＲＡＳ（例えば、Ｋ－ＲＡＳ）、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ－７２、ＳＫ－１抗原、結腸がんおよび／または膵臓がんを有する患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳がん、結腸がん、扁平細胞がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、および／もしくは腎臓がんの細胞上ならびに／または黒色腫、神経膠腫、もしくは神経芽細胞腫の細胞上で発現されるがん関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ－４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ－α、接着分子ＶＡＰ－１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞内接着分子－３（ＩＣＡＭ－３）、ロイコインテグリンアドヘシン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｄｈｅｓｉｎ）、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ－γ－１受容体、ＨＬＡ－ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ－セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ならびにスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。本発明の方法を使用して生産され得る既知の抗体の具体例は、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリゾマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｏｍａｂ）、ザルツムマブ、およびザノリムマブを含むが、これらに限定されない。

【0369】

いくつかの態様において、ＧＯＩは、例えば、上述のタンパク質のいずれかを含む組換え型融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例えば、ロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分などの多量体化ドメインを加えた上述のタンパク質のうちの１つ、または実質的に同様のタンパク質を含む、組換え型融合タンパク質は、本発明の方法を使用して生産することができる。例えば、ＷＯ９４／１０３０８、Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293、Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05、Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83、Hakansson et al. (1999), Structure 7:255-64を参照されたい。そのような組換え型融合タンパク質に具体的に含まれるのは、受容体の一部が、エタネルセプト（ｐ７５ ＴＮＦＲ：Ｆｃ）、アバタセプト、またはベラタセプト（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）などの抗体のＦｃ部分に融合しているタンパク質である。いくつかの態様において、ＧＯＩは、ＧＦＰまたはルシフェラーゼのような上記で開示したスクリーニング可能マーカーなどのマーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0370】

ランディングパッド細胞株を生成するのに好適な候補親細胞を同定する方法
本開示はまた、本明細書において開示される方法に従ってランディングパッド細胞を生成するのに好適な候補親細胞を効率的に同定する方法を提供する。本明細書において開示される方法は、抗体などの目的の生物製剤の発現に好適な細胞の選択および造成を大幅に簡略化する。例えば、典型的な選択プロセスは、各細胞株について上位の生産クローン（例えば、５～１０クローン）を同定し、サザンブロットおよび／または遺伝子コピー数の決定を介して各クローンを特性解析し、次いで上位候補を親細胞株として選択する、最大１０種またはそれよりも多くの異なる細胞株生成ワークフローを必要とし得る。

【0371】

いくつかの態様において、本方法は、プラスミドを含む細胞株のライブラリーをスクリーニングすることを含み、このプラスミドは、ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現カセットを含有する（親プラスミド）。いくつかの態様において、親プラスミドは、ゲノム上の異なる場所において親細胞のゲノム内に組み込まれ得る。

【0372】

いくつかの態様において、細胞株ライブラリーは、細胞株の歴史的セット、すなわち、親プラスミドを組み込むことによって以前に修飾されている細胞、例えば、抗体などの生物製剤を発現するように造成されている細胞株である。他の態様において、細胞株ライブラリーは、例えば、親細胞のゲノム内の複数の場所における親プラスミドのランダム組み込みによって生成される。

【0373】

次に、候補細胞、すなわち、ライブラリー内の細胞を、特定の判断基準の存在についてスクリーニングすることができ、その目標は、（ｉ）「ホット細胞」である細胞株、すなわち、同じＧＯＩを発現する他の細胞と比較して組換え型タンパク質の収量が高いなどの有利な特性を有する細胞株、および（ｉｉ）「ホットスポット」、すなわち、親プラスミドが高レベルで転写されるゲノム上の位置（座位）において、親プラスミドが挿入されている細胞株、または何らかの他の望ましい特徴の選択である。

【0374】

いくつかの態様において、ライブラリー内の細胞をランディングパッド細胞の造成に好適な親細胞として選択するために考慮される特定の判断基準は、以下を含む：
（ａ）細胞力価：候補細胞によって発現された組換え型目的タンパク質の量（大抵はグラム／Ｌ単位）、
（ｂ）親プラスミドコピー数：例えば、ＧＡＰＤＨを内部対照として使用するｑＰＣＲを使用して測定される、候補細胞に組み込まれた親プラスミドのコピー数、
（ｃ）ＲＮＡ発現レベル：例えば、サザンブロットを使用して決定される、候補細胞によって発現されたＲＮＡの量、
（ｄ）プラスミド構成：例えば、プラスミドジャンクション配列の同定を可能にする技法であるｓｐＰＣＲ（スプリンケレットＰＣＲ）を使用して測定された、候補細胞のゲノム内の親プラスミドの向き、
（ｅ）発現産物（例えば、ＧＯＩによってコードされる組換え型タンパク質）の特定の特性：例えば、特定のグリコシル化パターン、免疫原性、親和性、結合特異性、凝集、熱安定性など、または、
（ｆ）それらのいずれかの組合せ。

【0375】

いくつかの態様において、候補細胞は、細胞力価が閾値レベルを超える場合、ランディングパッド細胞株の生成のために選択される。細胞力価は、発現される目的遺伝子に依存する量であり、したがって、ある特定の目的遺伝子について高いとみなされ得る量が、別のものについては低いとみなされる場合があり、その逆も同様である。例えば、いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌ、約１９ｇ／Ｌ、または約２０ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、約１ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌから約３ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌから約６ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌから約７ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌから約８ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌから約９ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌから約１１ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌから約１２ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌから約１３ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌから約１４ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌから約１６ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌから約１７ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌから約１８ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌから約１９ｇ／Ｌ、または約１９ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌである。

【0376】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察される力価より、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％高い。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察される力価より、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％高い。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察される力価より、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、約３０％から約４０％、約４０％から約５０％、約５０％から約６０％、約６０％から約７０％、約７０％から約８０％、約８０％から約９０％、約９０％から約１００％、約１００％から約１１０％、約１１０％から約１２０％、約１２０％から約１３０％、約１３０％から約１４０％、約１４０％から約１５０％、約１５０％から約１６０％、約１６０％から約１７０％、約１７０％から約１８０％、約１８０％から約１９０％、または約１９０％から約２００％高い。

【0377】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察される力価より、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、または少なくとも約２０倍高い。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察される力価より、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、または約２０倍高い。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するための細胞力価閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察される力価より、約２倍から約３倍、約３倍から約４倍、約４倍から約５倍、約５倍から約６倍、約６倍から約７倍、約７倍から約８倍、約８倍から約９倍、約９倍から約１０倍、約１０倍から約１１倍、約１１倍から約１２倍、約１２倍から約１３倍、約１３倍から約１４倍、約１４倍から約１５倍、約１５倍から約１６倍、約１６倍から約１７倍、約１７倍から約１８倍、約１８倍から約１９倍、または約１９倍から約２０倍高い。

【0378】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するためのコピー数閾値は、親プラスミドの１コピーのみの存在である。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するためのコピー数閾値は、親プラスミドの２コピーの存在である。

【0379】

いくつかの態様において、特に、候補細胞のゲノム内の場所において組み込まれた親プラスミドが２コピー以上存在する場合には、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するためのプラスミド構成は、ヘッド・トゥ・テール構成であり、すなわち、親プラスミドの両コピーが同じ向きにある。

【0380】

いくつかの態様において、候補細胞は、親プラスミドのＲＮＡ発現レベルが閾値レベルを超える場合、ランディングパッド細胞株の生成のために選択される。いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するためのＲＮＡ発現レベル閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察されるＲＮＡ発現レベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％高い。

【0381】

いくつかの態様において、ランディングパッド細胞株の生成のための候補細胞を選択するためのＲＮＡ発現レベル閾値は、同じ目的遺伝子を発現する参照細胞株において観察されるＲＮＡ発現レベルより、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、または少なくとも約２０倍高い。

【0382】

好適な細胞株の同定により、親プラスミドの中の潜在的な相同組換え場所の同定が可能になり、次に、これを使用して、親株からランディングパッド細胞株を導出することができた。よって、この方法論は、ランダム組み込み細胞株造成プログラムから標的化組み込み方策への移行を可能にする。

【0383】

キット
本開示はまた、本明細書において開示される方法のいずれかを実施するためのキットおよび製品、例えば、本明細書において開示される方法に従って生成される発現細胞を作製するために使用される、細胞（例えば、ランディングパッド細胞または親細胞）、ランディングパッドプラスミド、第２ ＧＯＩプラスミドを作製するためのプラスミド、またはそれらのいずれかの組合せを含み、使用説明書を含んでいてもよいキットおよび製品を提供する。いくつかの態様において、キットは、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、部位特異的リコンビナーゼを発現するプラスミド、リコンビナーゼタンパク質自体、リコンビナーゼをコードする転写物を作製するためのプラスミド、またはそれらのいずれかの組合せを含む。

【実施例】

【0384】

［実施例１］

【0385】

ランディングパッド細胞株を生成するための親細胞株の同定
ある方策を使用して、新しい細胞株を構築する必要なく、ランディングパッド細胞株として使用される１つまたは複数の好適な親細胞株を同定した。これは、従来のランダム組み込みを用いて生成された細胞株の歴史的セットを、発現カセットがゲノム内の１つの座位だけに組み込まれる所望の生産性および性能について分析することによって達成された。この分析は、生物学的に重要な目的タンパク質を使用して、「ホット細胞」およびそれらのそれぞれの「ホットスポット」（ゲノム上の位置）を効率的に同定した。

【0386】

いくつかの細胞株造成プロジェクトに関する、サザンブロットデータ、およびｑＰＣＲによって決定された発現プラスミドコピー数データをスクリーニングして、１～２の低コピー数の発現プラスミドを含有する単一の組み込み部位を含む親細胞株を同定した。

【0387】

２つの好適な細胞株の同定の例は、２つの好適な細胞株を見出すために使用した方策を概括する図２に示されている。親細胞株である細胞株１および細胞株２は、それぞれ、特定の標的に対する指向性を持つｍＡｂを発現する細胞株である。ＬＣ＝軽鎖、ＨＣ＝重鎖。コピー数＝細胞株における発現プラスミドの数。各発現プラスミドは、ＬＣおよびＨＣの発現カセットを含んでいた。コピー数は、ＧＡＰＤＨを内部対照として使用するｑＰＣＲによって決定した。ｓｐＰＣＲ＝スプリンケレットＰＣＲ。この技術は、プラスミドジャンクション配列の同定を可能にした。ＬＣ ＲＮＡおよびＨＣ ＲＮＡのレベルは、細胞株１について見出されたものに対して正規化した。したがって、細胞株２における転写物レベルは、細胞株１のものよりも２０％高かった。

【0388】

各細胞株において観察されたモノクローナル抗体発現プラスミドの構成は、図２および図３に示されている。図３は、細胞株１および細胞株２の両方において見出された構成を示す親プラスミドの簡略化された描写である。両細胞株における親プラスミドがヘッド・トゥ・テール構成にあった。細胞株１および細胞株２における構成は、サザンブロット分析、およびプラスミドとプラスミドの融合が検出されたプラスミド配列ジャンクションの決定によって確立された。図３における矢印およびＧＳは、グルタミンシンテターゼ相補性を表す。

【0389】

好適な細胞株の同定により、親プラスミドの中の潜在的な相同組換え場所の同定が可能になり、次に、これを使用して、親株からランディングパッド細胞株を導出することができた。よって、この方法論は、ランダム組み込み細胞株造成プログラムから標的化組み込み方策への移行を可能にする。

【0390】

親細胞株１の５’および３’プラスミド配列ジャンクションが同定された。５’ジャンクションに対応するＣＨＯゲノム配列を、配列番号１８に定める配列に示し、３’ジャンクションに対応するＣＨＯゲノム配列を、配列番号１９に定める配列に示す。
［実施例２］

【0391】

候補親細胞株からのランディングパッド細胞株の生成
上述のように細胞株が同定されたら、親細胞株における発現カセットをランディングパッドプラスミドなどの代替的プラスミドに置き換えること（図４Ａ）、またはそれをランディングパッド細胞株として直接使用すること（図４Ｂ）のいずれかが望まれる。この手法を使用した場合、親細胞株の均等物において元のプラスミドにフランキングする配列を使用することによって相同組換え反応が起こり、そのため、細胞（ゲノム）のフランキング配列の知識が必要になる。図４Ｂの親細胞株は、低コピー数の発現プラスミドからの高発現をサポートするものとして確立されている。
［実施例３］

【0392】

汎用性ランディングパッド細胞
当技術分野において公知のような相同組換えによって発現プラスミドまたはランディングパッドプラスミドを細胞ゲノムに直接挿入するには、相同組換えのために使用される細胞配列を同定する必要がある。この方策は、有害効果をもたらす可能性がある部位特異的ヌクレアーゼによって制限された同じ配列を持つ姉妹染色体が存在することが多いため、潜在的に良好な親細胞株を見逃すリスクがある。

【0393】

細胞（ゲノム）のフランキング配列に関する知識と無関係である、ランディングパッド細胞を作製するための、かつ、親細胞株における親プラスミドをランディングパッドそのものとして使用するための、代替的方法を開発した。この方策は、（１）好適な部位特異的エンドヌクレアーゼの設計を可能にするための十分なフランキング細胞配列の同定を必要とせず、（２）ランディングパッド上への相同組換えのための領域の生成およびクローニングを必要とせず、（３）有害な姉妹染色分体の制限の可能性の回避を必要としないことにより、現在の工業的方策に優る複数の利点を提供する。この方法は、（４）すべての発現細胞株に適用可能であることから本質的に汎用性であり、（５）代替的なゲノム依存性方策よりも高速かつ安価である。上記で開示した親細胞選択方法を、本明細書において提供される汎用性ランディングパッド細胞を生成する方法と組み合わせることで、ランディングパッド、およびそれらの関連する「ホットクローン」、またはランディングパッド細胞として使用するための「ホット細胞株」の生成および検証のための、特に効率的な方策がもたらされる。この方策を使用する場合、フランキングする染色体領域の同定を必要とせずに、同じプラスミドベクターセットアップが使用される。

【0394】

例示的な概略的方法を図５Ａに提示する。本発明者らは、モノクローナル抗体を発現していた親細胞株を使用し、親細胞株における発現カセットにフランキングするプラスミド配列を相同組換えの部位として使用した。部位特異的エンドヌクレアーゼは、親細胞株におけるプラスミド配列を標的化し、それにより、姉妹染色体中の部位を回避した。部位指向性エンドヌクレアーゼによって標的化された配列は、第２のプラスミド（ランディングパッドプラスミド）には存在しなかった。標的化された配列がランディングパッドプラスミド中にあった場合、それらは除去される。図５Ａに示すように、第２のプラスミド（Ｐ２）は、Ｌｏｘ部位を有し、蛍光マーカー（ｂ１ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードし、親細胞株に存在した元の発現プラスミドとは異なる選択マーカー（ピューロマイシン耐性）を発現した。

【0395】

部位特異的エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）および第２のプラスミドの存在下で、ランディングパッド細胞株を生成した（図６Ａ）。ランディングパッド細胞株に存在するＬｏｘ部位を使用して、Ｃｒｅ指向性組換え（図７Ａ）によってｍＣｈｅｒｒｙ／ピューロマイシンコーディング配列を置き換えるために、Ｌｏｘ部位によってフランキングされた生物製剤のための発現カセットを含む第３のプラスミド（Ｐ３）を使用した。

【0396】

したがって、図５Ａに表されたすべての工程は、実施例１において試験された２つの親細胞株のうちの１つから選択された、抗体（第１目的遺伝子）を発現していた親細胞株から出発し、２．５ｇ／Ｌ超でｍＡｂ３抗体をコードする遺伝子（第２目的遺伝子）を発現することが可能な発現細胞株を作製することによって遂行した（図７Ａおよび７Ｂ）。第２の親細胞株は、ランディングパッド細胞株を作出するために使用した。

【0397】

提示した実験データにおいて、図５Ａに提示したプロセス全体を遂行した。しかし、ｍＣｈｅｒｒｙ／ピューロマイシン中間体ランディングパッド細胞株を生成するために必要な工程は、図５Ｂに示すように完全に省いてもよい。この場合、親細胞株のｍＡｂ発現プラスミドがランディングパッドとして機能する。よって、ランディングパッドとして機能するｍＡｂ発現プラスミドが、この場合は、部位特異的エンドヌクレアーゼによって刺激された相同組換えによって直接、異なるｍＡｂ発現プラスミドに置き換えられる。この方法は、図５Ａにおいて開示されるものより少ない時間を要し、標的化組み込みについての親細胞株の好適性の直接評価を可能にする。

【0398】

推定上の発明における部位特異的組換えを使用する２つの代替的フォーマットの概略が図８Ａに示されている。両方のバージョンにおいて、ランディングパッドプラスミドは、蛍光マーカー（ｂ１ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードし、親細胞株に存在する親プラスミドとは異なる選択マーカー（ピューロマイシン耐性）を発現し、例えば、異種の部位特異的組換え部位（ＳＳＲＳ）によってフランキングされている。部位特異的組換え部位は、図８Ａでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的であるＬｏｘ ＰおよびＬｏｘ ５１１として示されている。部位特異的エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）およびランディングパッドプラスミドの存在下で、親細胞株におけるｍＡｂ発現カセットは、Ｌｏｘ部位によってフランキングされたｍＣｈｅｒｒｙとして示されるランディングパッドに置き換えられるか、または欠失して、ランディングパッドが代替的座位に組み込まれる（それぞれ、図８Ａおよび８Ｂ）。図８Ａのフォーマットでは、ランディングパッドは、高発現をサポートするホットスポットにある。図８Ｂのフォーマットでは、代替的なホットスポットが同定され得る。親細胞株はホット細胞であるため、追加のホットスポットの同定は、高力価などの好ましい性状を持つ発現細胞株を生成することができるランディングパッド細胞株をもたらす。

【0399】

図８Ａおよび８Ｂに示されるランディングパッド細胞株を同定するためのスクリーニング方策を確立した（図９）。ランディングパッドプラスミドをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ部位特異的エンドヌクレアーゼと併せて親細胞株にトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用は、組換えを促進することによってランディングパッド細胞株の生成を刺激し得る。図９参照。それぞれ左および右の写真におけるｓｇＲＮＡあり（＋）およびなし（－）を比較されたい。ｓｇＲＮＡの存在は、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の数を増加させ、組換えの刺激を示した。ＦＡＣＳを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性（Ｒｅｄ＋）ピューロマイシン耐性細胞を単細胞クローニングした。親細胞株のｍＡｂをもはや発現しない細胞を増殖させ、ＰＣＲベースの定量的遺伝子コピー数アッセイにより、ランディングパッドならびにあらゆる残存する軽鎖および重鎖遺伝子の存在についてスクリーニングした。ｍＡｂ配列を含まず、ランディングパッドを１～２コピーのみ含むものをさらに評価した。ピューロマイシン耐性細胞のおおよそ２５％がランディングパッド細胞株である。これらの細胞を継代して、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）および転写物レベルが一定のままであることを確実にした。スクリーニングした２８クローンのうち１４クローンは、ジャンクション特異的ＰＣＲおよびｄｄＰＣＲによる遺伝子コピー数の評価によって決定すると、図８Ａに描写したようにｍＡｂ配列を置き換えるシングルランディングパッドを有していた。ランディングパッド細胞株の残りは、図８Ｂに描写したように代替的座位にあった。

【0400】

図８Ａおよび図８Ｂの方策Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに表されたすべての工程は、首尾よく遂行された。ｍＡｂを作製するための２本の軽鎖および２本の重鎖の発現カセットから構成された第２ ＧＯＩプラスミドを使用して、１２個のランディングパッド細胞株の性能を評価した。評価した第１のパラメータは、Ｃｒｅ組換え後の発現細胞のパーセントであった。これは、選択後だが単細胞クローニングの工程の前のバルク集団に存在するＲｅｄ（－）細胞のパーセントを測定することによって行った。Ｒｅｄ（－）発現細胞のパーセントは、試験した１２個のランディングパッド細胞株について１１～３９の範囲であり、平均は２４であった（図１０）。Ｃｒｅの非存在下では、ほぼすべてのランディングパッド細胞株でＲｅｄ（＋）が９９％を超えている。これは、ランディングパッド細胞株およびそれらのＬｏｘ部位がＣｒｅ指向性組換えのために機能的であることを実証する。

【0401】

図８Ａの代表的な発現細胞株を、Ｒｅｄ（－）細胞に対するＦＡＣＳ選別により、１２個のランディングパッド細胞株のうちの５つから生成した。ランディングパッド細胞株１つ当たり３２個の発現細胞株をランダムにピッキングし、増殖させ、２４ディープウェルプレート（ＤＷＰ）フェドバッチアッセイを使用してそれらの生産性を決定した。その結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。すべてのランディングパッド細胞株が力価中央値１．６９ｇ／Ｌ超で複数の発現細胞株を生成し、複数のクローンは各々３ｇ／Ｌ超の力価を有し、少数は４ｇ／Ｌ超の力価を有していた。これは、ランディングパッド細胞株のすべてが製造目的に好適な発現細胞株を生成できることを実証する。

【0402】

これらの高発現細胞株は、わずか３２個のランダムに選定されたクローンからの単細胞クローニングの後に中間スクリーニングを用いずに同定された。それにより何週間もの時間が短縮され、スクリーニングする必要のあるクローンの数が大幅に低減し、これらはいずれも高い価値を持つ。さらに、試験した５つのランディングパッド細胞株は、互いと統計的に区別不能である。これらのデータは、親プラスミド座位がホットスポットであること、そして、この１つの座位から、比較的わずかなスクリーニングを用いて複数のランディングパッド細胞株が生成されたので、図８Ａおよび８Ｂに概説した汎用性ＴＩ方策が有効であることを実証する。

【0403】

図８Ａおよび８Ｂに示されるような発現細胞株を生産する技術は、ランディングパッドの少なくとも一部を置き換える。当技術分野では、置き換えが必要とされないランディングパッド技術が公知であり、それには、［Thyagarajan, B., Olivares, E.C., Hollis, R.P., Ginsburg, D.S. and Calos, M.P. (2001) Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage phiC31 integrase. Mol. Cell. Biol., 21, 3926-3934、Gaidukov, L., Wroblewska, L., Teague, B., Nelson, T., Zhang, X., Liu, Y., Jagtap, K., Mamo, S., Tseng, W.A., Lowe, A. et al. (2018) A multi-landing pad DNA integration platform for mammalian cell engineering. Nucleic Acids Res., 46, 4072-4086、Sauer, B. and Henderson, N. (1990) Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase. New Biol, 2, 441-449、Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Genomic targeting with a positive-selection lox integration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 7905-7909］が含まれる。これらの代替的なランディングパッドおよび関連技術は、図８Ａにおいて開示されるＣｒｅ／Ｌｏｘランディングパッド設計の代わりに使用され得る。
［実施例４］

【0404】

デュオランディングパッド細胞
上文では、シングルランディングパッドを含有するランディングパッド細胞株について記述している。しかし、２つ以上のランディングパッドを含むランディングパッド細胞株は、二重特異性モノクローナル抗体などのマルチサブユニット生物製剤の発現をさらに洗練する機会を提供する。したがって、本発明者らは、同じ座位にある２つのランディングパッド、デュオランディングパッドを含むランディングパッド細胞株についてスクリーニングした。これにより、両方のランディングパッドが同じ座位に存在するので、それら両方からの等しい発現が確実になるであろう。デュオランディングパッドは、ヘッド・トゥ・ヘッド、テール・トゥ・テール、テール・トゥ・ヘッド、およびヘッド・トゥ・テール（図１２Ｂ）という４つの異なる向きで組み込むことができる。ＣｒｅまたはＦｌｐなどの単一部位指向性リコンビナーゼが使用される際は、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成が好ましく、互いに機能的に区別できない。Ｃｒｅの存在下でランディングパッドのうちの１つの欠失をもたらし得るテール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの構成とは異なり、他の２つの構成は、単純に反転を起こし、同じ始めの構成をもたらす（図１２Ｂ）。本発明者らは、そのようなデュオランディングパッド細胞株をヘッド・トゥ・ヘッド構成で生成した。これは、図８Ｂに示したような親細胞株のｍＡｂが存在したところ以外の代替座位である。

【0405】

図１２Ｂの４つのデュオランディングパッド構成の各々を用いて第２ ＧＯＩプラスミドが使用される際には、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの構成は各々、プラスミドジャンクションにフランキングする２つの組換え部位の間の配列が反転し得る２つの細胞株を生成し得るが、さもなければ２つの細胞株は同じである（図１３）。ヘッド・トゥ・テールまたはテール・トゥ・ヘッドの構成が第２ ＧＯＩプラスミドと共に使用される際には、２つの第２ ＧＯＩを含む細胞株が生産される。しかし、十分な量のＣｒｅ活性が存在する場合には、第２ ＧＯＩのうちの１つを除去して、単一の第２ ＧＯＩを含む第２ ＧＯＩプラスミド細胞株をもたらすことができる（図１４）。

【0406】

ランディングパッドが、例えば図１２ＢのＬｏｘ ５１１の代わりにＦｌｐのためのＦｒｔ認識部位を使用し、ＣｒｅおよびＦｌｐの両方が使用される場合、同じ結果が得られ（図１２Ａを図１５と比較されたい）、テール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの向きでは欠失が起こり、一方、ヘッド・トゥ・ヘッドおよびテール・トゥ・テールの向きでは反転が起こる（図１５）。しかし、テール・トゥ・テールおよびヘッド・トゥ・ヘッドの構成では、インテグラーゼと共にａｔｔＰ／ａｔｔＢを使用してデュオランディングパッド内に第２ ＧＯＩを組換えても反転は生じないが、テール・トゥ・ヘッドおよびヘッド・トゥ・テールの構成では、ランディングパッドのうちの１つの欠失が依然として起こり得る（図１６）。ランディングパッドの各々が例えばａｔｔＰ部位を１つだけ有するならば、図１６の４つのデュオランディングパッド構成のいずれにおいても、単一のａｔｔＢ部位を含む環状の第２ ＧＯＩプラスミドの単一の組み込みが起こり、欠失が起こらない結果となる。

【0407】

デュオランディングパッドは、複数の異なるＧＯＩプラスミドと同時に使用することができる。生物製剤を作製するために必要な複数の異なる発現カセットを含むシングルランディングパッドを含むランディングパッド細胞株の使用が開示されている。デュオランディングパッド細胞株の使用には、シングルランディングパッドを含むランディングパッド細胞株に優る利点がある。シングルランディングパッド細胞株の場合、この細胞株は単一の第２ ＧＯＩしか受け入れないため、多成分生物製剤を作製するために必要なすべての発現カセットが、単一の第２ ＧＯＩプラスミド中に配置されなければならない。これはデュオランディングパッド細胞株には当てはまらない。デュオランディングパッド細胞株は、上昇した発現多様性レベルにおいて設計する機会をもたらし、優れた特性を持つ発現細胞株を作出する機会を提供する。

【0408】

多様性は、第２ ＧＯＩプラスミドの異なる構成を使用して、複数のやり方で生成され得る。１つの例では、第２ ＧＯＩプラスミドが、ユニークな構成において、複合生物製剤を作製するのに必要なすべての発現カセットを含有する。第２の例では、第２ ＧＯＩプラスミドが、発現細胞株を作製するために同じ細胞内に存在する必要のある発現カセットのサブセットを含有してもよい。第３の例は、複合生物製剤を作製するために必要とされるユニークな構成における発現カセットのすべてを有する１つまたは複数の第２ ＧＯＩプラスミドを、ユニークな構成におけるすべての発現カセットのサブセットを含有する第２ ＧＯＩプラスミドのセットと併せた、前出の２例の組合せである。

【0409】

例示のみを目的として、実現され得る多様性の簡略化された表現を図１７Ａに示す。各ランディングパッドは、Ｌｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐの対から構成されている。ここでは、複合生物製剤を作製するために必要な発現カセットが２つのセットに分割されており、その一方は実線の矢印によって表され、他方は破線の矢印によって表されている。両セットが単一の第２ ＧＯＩプラスミド中に見出される場合、それらは、実線－破線および破線－実線の配置におけるタンデムの矢印によって示されるように、異なる構成であり得る。また、単一の矢印として示されているのは、発現プラスミドの２つのセットのうちの１つのみを含有する第２ ＧＯＩプラスミドである。各ランディングパッドにおける単一の実線および破線の矢印は示されていない。発現カセットの２つのセットを異なる組合せで含む７つの異なる発現細胞株が示されている。発現細胞株における２つのセットの比率は左側に示されている。容易に分かるように、複雑性は、シングルランディングパッドを有するものと比較すると大きく増加する。このような多様な発現細胞株セットを容易にスクリーニングして、優れた特性のうちの１つを見出すことは可能である［Altamura, R., Doshi, J. and Benenson, Y. (2022) Rational design and construction of multi-copy biomanufacturing islands in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 50, 561-578］。

【0410】

図１２Ａ～１７Ａは、両方のランディングパッドが同じリコンビナーゼまたはＩｎｔ認識配列を有するデュオランディングパッド構成を示すが、各ランディングパッドにユニークな組換え「アドレス」を持たせることが可能である。ＣｒｅおよびＦｌｐなどのリコンビナーゼの場合、４つのユニークな認識配列が使用されることになる。各ランディングパッドは、認識部位のユニークな対を有することになる。４つの不適合性Ｌｏｘ部位を使用する例が図１８に示されている［Langer, S.J., Ghafoori, A.P., Byrd, M. and Leinwand, L. (2002) A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res., 30, 3067-3077、Missirlis, P.I., Smailus, D.E. and Holt, R.A. (2006) A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics, 7, 73、Siegel, R.W., Jain, R. and Bradbury, A. (2001) Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. FEBS Lett., 505, 467-473］。追加の方策の例としては、図１８における２つのＬｏｘ部位を２つの不適合性Ｆｒｔ部位に置き換えること、およびＣｒｅをＦｒｔと共に使用すること［Lauth, M., Spreafico, F., Dethleffsen, K. and Meyer, M. (2002) Stable and efficient cassette exchange under non-selectable conditions by combined use of two site-specific recombinases. Nucleic Acids Res., 30, e115］、インテグラーゼを２つから４つの不適合性ａａｔ部位と共に使用すること［Jusiak, B., Jagtap, K., Gaidukov, L., Duportet, X., Bandara, K., Chu, J., Zhang, L., Weiss, R. and Lu, T.K. (2019) Comparison of Integrases Identifies Bxb1-GA Mutant as the Most Efficient Site-Specific Integrase System in Mammalian Cells. ACS Synth Biol, 8, 16-24.］、２つ以上のインテグラーゼ、例えばＢｘＢ１［Jusiak, B., Jagtap, K., Gaidukov, L., Duportet, X., Bandara, K., Chu, J., Zhang, L., Weiss, R. and Lu, T.K. (2019) Comparison of Integrases Identifies Bxb1-GA Mutant as the Most Efficient Site-Specific Integrase System in Mammalian Cells. ACS Synth Biol, 8, 16-24.］およびｐｈｉＣ３１のものを使用すること［Smith, M.C., Brown, W.R., McEwan, A.R. and Rowley, P.A. (2010) Site-specific recombination by phiC31 integrase and other large serine recombinases. Biochem. Soc. Trans., 38, 388-394］、ならびにそれらの組合せが挙げられる。各ランディングパッドにおける単一のａｔｔ部位の使用は、各ランディングパッドへの第２ ＧＯＩプラスミドの挿入のために十分である（図１９）。この場合、線状プラスミドは染色体を実質的に制限することになるので、第２ ＧＯＩプラスミドは環状である必要がある。また、各々がユニークなアドレスを含むように、ランディングパッドが複数のａｔｔ部位を含み得ることも明らかである。これらの例は範囲を限定することを意図してはいない。

【0411】

ユニークなアドレスを持つランディングパッドを用いるデュオランディングパッド構成は、それらがアドレス指定可能でない場合と比較して（図１７Ａおよび１７Ｂを参照されたい）、発現細胞株のさらに定義された多様性、およびシングルランディングパッドを含むランディングパッド細胞株に対してより高い多様性を生成するために使用することもできる。図１７Ｂには、ユニークなアドレスを持つランディングパッドを使用する簡略図が示されている。１つのランディングパッドはＬｏｘ ５１１およびＬｏｘ Ｐから構成され、２つ目はＬｏｘ部位２２７２およびＭ３を含む。矢印の説明は、上記の図１７Ａのものと同じである。この例では、特定の第２ ＧＯＩが所望されることは分かっているが、複合生物製剤を発現するために必要なものの残りは十分に定義されていないため、４つの異なる第２ ＧＯが隣接するランディングパッド内に配置された結果、４つの異なる発現細胞株が生じている。このような多様な発現細胞株セットを容易にスクリーニングして、優れた特性のうちの１つを見出すことは可能である［Altamura, R., Doshi, J. and Benenson, Y. (2022) Rational design and construction of multi-copy biomanufacturing islands in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 50, 561-578］。

【0412】

アドレス指定可能ランディングパッドの追加の用途は、各々が特有の独立した機能を持つ２つの独立した生物製剤を発現させる選択肢である。生物製剤のうちの１つが、発現細胞株による第２の生物製剤の発現を助ける可能性もあれば、または、第１の生物製剤が、第２の生物製剤の特定の翻訳後修飾を引き起こす可能性もあれば、もしくは発現細胞株の何らかの他の構成要素を修飾する可能性もある。これらは単に例であり、本質的に限定的であることを意図してはいない。図１７Ａのように２つのランディングパッドがユニークなアドレスを有しない場合にこれらの同じ使用が該当し、より高レベルの多様性が得られるだけであることは明らかである。

【0413】

親細胞株の親プラスミドのものとは代替的な座位におけるヘッド・トゥ・ヘッド構成の使用を実践するため、デュオランディングパッド細胞株の有用性を低減させた。この第２ ＧＯＩプラスミドは、軽鎖および重鎖遺伝子の単一コピー、ならびに図８Ａおよび８Ｂに示したようなＧＳ選択カセットを含有する。Ｃｒｅ組換え後の発現細胞のパーセントを決定した。これは、ｍＡｂ発現がＩｇＧ細胞表面染色によって検出されたＲｅｄ（－）ｍＡｂ（＋）細胞の数を測定することによって行った。その結果を（図２０）に示す。選択からの回復後、両ランディングパッドの６．２４％が第２ ＧＯＩによって置き換えられた。本質的にすべてのＲｅｄ（－）細胞がｍＡｂ（＋）であるため、例えばＦＡＣＳによるＲｅｄ（－）細胞における単細胞クローニングは、発現細胞株のみの単離を可能にする。

【0414】

これにより、選択段階中の増殖およびＣ５０生産性スクリーニング、ならびに細胞株造成におけるクローン造成中の静的スクリーニング（図１）をなくすことができる。また、クローン造成段階（図１）においてスクリーニングする必要のある発現細胞株の数も低減する。図１は、ランダム組み込みを使用した歴史的細胞株の造成を描写する。これは、細胞株に線状発現プラスミドをトランスフェクトした結果、それが細胞のゲノム内のランダムな場所で組み込まれる、標準的な細胞株造成方策であった。トランスフェクション後、細胞を細分してプレートに入れ、薬物（ピューロマイシン）または栄養要求体相補性［グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）］などの選択に供した。発現プラスミドを含む細胞のみが生存し、これらをマスターウェル造成中に増殖させた。高発現クローンが見出され得ることを確実にするために、生産性上位のマスターウェルからの細胞数千個をクローン造成のために単細胞クローニングした。クローンを増殖させ、上位候補クローンが同定されるまで複数回のスクリーニングに供した。上位６クローンが同定され（上位６つのＲＣＢ）、これらを製造目的での好適性についてさらに評価し（ＲＣＢクローン選択）、その最後に最上位クローンが同定された。

【0415】

２つのｍＡｂに対する発現細胞株を作製することにより、ランダム組み込みと比べた標的化組み込みの価値を評価した。デュオランディングパッド細胞株およびＣＨＯ宿主細胞株に、それぞれＣｒｅリコンビナーゼありまたはなしで、それぞれの第２ ＧＯＩプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を選択にかけ、ｃ５０チューブに播種するのに十分な細胞が利用可能になるまで増殖させ、それらの生産性を試験した。その結果を図２１に提示する。標的化組み込みは、ランダムに組み込まれた細胞の力価の３倍を超える力価を生成した。これらは総集団であるため、このことは、標的化組み込みが、平均して、ランダム組み込みと比較して著しく高く発現する細胞株を作製することを実証する。

【0416】

デュオランディングパッド細胞株は、適切なレベルで生物製剤を生産することができる。１ＬＣおよび１ＨＣまたは２ＬＣおよび２ＨＣのいずれかの発現カセットを有する２つの異なる第２ ＧＯＩプラスミド構成をデュオランディングパッド細胞株で使用して、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂを作製した。各々からの上位６クローンを製造バイオリアクターのスケールダウンモデルにおいて各ｍＡｂについて評価した（図２２）。１ＬＣおよび１ＨＣ構成では、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂの力価はそれぞれ３．１～５．７ｇ／Ｌおよび３．５～４．８ｇ／Ｌの範囲であった。２ＬＣおよび２ＨＣの第２ ＧＯＩプラスミドを使用した場合、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂの両方の力価が上昇し、それぞれ３．８～６．６ｇ／Ｌおよび４．３～６．７ｇ／Ｌの範囲の力価が生じた。これは、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂについてそれぞれ２５％および３８％の平均力価上昇に相当し、ＧＯＩプラスミド構成の変化が力価を上昇させ得ることを実証している。このデータは、デュオランディングパッドが高力価発現細胞株を再現可能に生成することも実証する。１２個の発現細胞株のサザンブロットおよびロングリードＤＮＡシーケンシングによる遺伝子特性解析は、それらがすべてランディングパッド内へのＣｒｅ指向性組換えから生じたことを実証した（データは示さない）。

【0417】

これらのデータは、図５Ｂおよび８に概説したようなＴＩランディングパッド細胞株を作製するための汎用性方策が明らかな有用性を有し、ランダム組み込み技術と比較して、より高く発現する発現細胞株を含む集団を生成し、適切な生産性を有する発現細胞株を作製するのにかかる時間を削減することを立証する。これはまた、デュオランディングパッド設計、およびホットスポットとしてのデュオランディングパッドが存在する座位の機能性を立証する。
［実施例５］

【0418】

ランディングパッドホットスポット
前述の開示に加えて、本発明者らは、同定された「ホットスポット」の座位も提供する。これらの「ホットスポット」座位はユニークであり、１つまたは複数のランディングパッドが挿入され得る場所を提供する。これらの座位は、互いと無関係に使用することも、組合せで使用することもできる。本開示は、２つのランディングパッドホットスポット（ホットスポット１およびホットスポット２）を提供する。

【0419】

ホットスポット１は、モンゴルキヌゲネズミのｇｉ｜１４９７１５５５９８｜ｒｅｆ｜ＮＷ＿０２０８２２４９９．１（配列番号２２）の中に位置する。いくつかの態様において、ホットスポット１は、配列番号２０の中に位置する。相同組換えに好適な５’配列を配列番号１６および１８に示す。相同組換えに好適な３’配列を配列番号１７および１９に示す。いくつかの態様において、ホットスポット１における組み込み部位は、配列番号２１に定める配列を含むかまたはそれからなる。

【0420】

ホットスポット２は、モンゴルキヌゲネズミのｒｅｆ｜ＮＷ＿０２０８２２５７７．１（配列番号１１８）の中に位置する。いくつかの態様において、ホットスポット２は、配列番号１１６の中に位置する。相同組換えに好適な５’配列を配列番号１１２および１１４に示す。相同組換えに好適な３’配列を配列番号１１３および１１５に示す。いくつかの態様において、ホットスポット２における組み込み部位は、配列番号１１７に定める配列を含むかまたはそれからなる。ホットスポット２は、その配列にオープンリーディングフレームが含まれないため、特に有利である。

【0421】

発明の概要および要約のセクションではなく、発明を実施するための形態のセクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されるよう意図されていることを理解されたい。発明の概要および要約のセクションは、本発明者が想定する本発明の例示的な実施形態の１つまたは複数を定め得るが、すべてを定めるとは限らず、そのため、本発明および添付の特許請求の範囲を何らかのかたちで限定することを意図したものではない。

【0422】

特定の機能およびそれらの関係の実施態様を例示する機能的構成要素を用いて本発明を上記で説明した。これら機能的構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書では任意に定義されている。特定の機能およびその関係が適切に果たされる限り、代替の境界が定義され得る。

【0423】

特定の実施形態についての前述の説明は、本発明の概略的性質を十分に明らかにして、他者が、過度の実験を行うことなく、本発明の概略的概念から逸脱することなく、当業者が備えている技能の範囲内の知識を適用することにより、そのような特定の実施形態を様々な用途のために容易に改変および／または応用することができるようにするものである。したがって、そのような応用および改変は、本明細書において提示される教示および指針に基づいて、開示される実施形態の均等物の意味および範囲に入るよう意図されている。本明細書における表現または専門用語は、当業者が当該教示および指針を踏まえて本明細書の専門用語または表現を解釈するように、限定ではなく説明を目的としたものであることを理解されたい。

【0424】

本発明の広さおよび範囲は、上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の請求項およびそれらの均等物のみに従って定義されるべきである。

【0425】

本願の随所で引用され得る、引用されたすべての参照物（参考文献、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、２０２２年１１月１５日付けで公的に利用可能なバージョンにおいて、その中で引用されている参照物と共に、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により、ここに明示的に組み入れられる。データベース受託番号および対象データベースエントリーに含まれる他の情報（例えば、特定のＧｅｎｂａｎｋ受託番号に対応するデータベースエントリー内の配列に関連しない内容）によって同定されるタンパク質および核酸配列は、参照により組み入れられ、２０２２年１１月１５日付けで公的に利用可能な対応するデータベースリリースに対応する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

2025501221000001.xml

【国際調査報告】