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▶ ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】自動化操作に適した発酵ブロスからの菌体収集方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/02 20060101AFI20250109BHJP
C12N 1/14 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/16 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C12N1/02 ZNA
C12N1/14 A
C12N1/16 G
C12N1/20 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539490
(86)(22)【出願日】2022-12-29
(85)【翻訳文提出日】2024-07-22
(86)【国際出願番号】 CN2022143490
(87)【国際公開番号】W WO2023125831
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】202111660921.7
(32)【優先日】2021-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518330176
【氏名又は名称】ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】至 岩
(72)【発明者】
【氏名】陳 暁悦
(72)【発明者】
【氏名】周 偉昌
(72)【発明者】
【氏名】陳 智勝
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AA77X
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA30
4B065BD50
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、細菌または真菌の発酵培養ブロスから菌体を回収する方法を開示し、当該方法は、以下のステップを含む：ａ）細菌または真菌の発酵培養で得られる発酵培養ブロスと、カルボキシル化キトサンとを混合し、混合物を得る；任意的に、ｂ）混合物にアルギン酸ナトリウム溶液を加え、均一に混合する；及びｃ）沈殿し、菌体沈殿物または発酵培養ブロスの上清を得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のステップを含むことを特徴とする細菌または真菌の発酵培養ブロスから菌体を回収する方法：ａ）細菌または真菌の発酵培養で得られる発酵培養ブロスと、カルボキシル化キトサンとを混合し、混合物を得る；
ｂ）混合物にアルギン酸ナトリウム溶液を加え、均一に混合する；
及びｃ）沈殿し、菌体沈殿物または発酵培養ブロスの上清を得る。
【請求項2】
ステップｂ）が省略されることを特徴とする請求項１に記載される方法。
【請求項3】
さらにステップｃ）の後に、菌体を回収する、あるいは、発酵培養ブロスの上清を回収するステップｄ）を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項4】
前記の細菌は、バチルス、大腸菌、乳酸桿菌、ラクトコッカスから選ばれ、好ましくは大腸菌或枯草菌である；前記の真菌は、以下から選ばれる：酵母、好ましくはパン酵母、飼料酵母、醸造酵母、ピキア酵母である；カンジダ；カビ、より好ましくはリゾプス、アスペルギルス、最も好ましくは醸造酵母とピキア酵母であることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項5】
添加されるカルボキシル化キトサンの量は、発酵培養ブロスの１％－３２％重量、好ましくは１－１６％重量、より好ましくは４％－８％重量、最も好ましくは８％重量であることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項5】
ステップｂ）に混合されるアルギン酸ナトリウムの量は、発酵培養ブロスの０％－１６％重量、好ましくは０％－８％重量、より好ましくは０％又は８％重量であることを特徴とする請求項１に記載される方法。
【請求項6】
発酵培養ブロスに添加されるカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムは、それぞれに発酵培養ブロスの８％重量であり、好ましくは、発酵培養ブロスは、大腸菌とピキア酵母発酵培養ブロスであることを特徴とする請求項１に記載される方法。
【請求項7】
発酵培養ブロスに添加されるカルボキシル化キトサンは、発酵培養ブロスの８％重量であり、好ましくは、発酵培養ブロスは、大腸菌とピキア酵母発酵培養ブロスであることを特徴とする請求項２に記載される方法。
【請求項8】
前記のカルボキシル化キトサンは、アミノ基（－ＮＨ２）、又はヒドロキシル基（－ＯＨ）、又はアミノ基（－ＮＨ２）とヒドロキシル基（－ＯＨ）がカルボキシル化基に修飾されたキトサンであり、ただし、前記のカルボキシル化基は、１－３個のカルボキシル基に置換されたＣ１－Ｃ６直鎖または分岐鎖の炭化水素基、好ましくは３個のカルボキシル基を含み、より好ましくは２個のカルボキシル基を含み、最も好ましくは１個のカルボキシル基を含む；前記の直鎖または分岐鎖の炭化水素基は、好ましくは、１－６個の炭素原子を有するであることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項9】
大腸菌の株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、及び、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓｔｂｌ２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓｔｂｌ３、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ－Ｆａｓｔ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）などを含む他の大腸菌Ｋ株とＢ株の誘導菌株、あるいは酵母の株は、醸造酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含むことを特徴とする請求項４に記載される方法。
【請求項10】
前記のステップｄ）の回収は、培地を注ぎ出すか、自動ロボットアームを使用して培地を注ぎ出して菌体又は培地上清を得、磁気ビーズでＤＮＡ／ＲＮＡ又はタンパク質を吸着し、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はタンパク質を洗浄し、好ましくは、注ぎ出すこと、より好ましくは、培地上清を手動的に注ぎ出すまたは自動ロボットアームで培地上清を注ぎ出すことを特徴とする請求項３に記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生化学工学後処理の技術分野に属し、特に自動化操作に適した細菌および真菌の発酵ブロスから菌体を収集する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２０２１年の世界で最も売れた医薬品トップ３０のうち、２４品目はバイオ医薬品である。バイオ医薬品の研究開発のスピードと成功は、タンパク質の構造、インビトロおよびインビボの活性研究に対応するタンパク質サンプルを、迅速に得ることができるかどうかと密接に関係する。現在、哺乳動物細胞における一過性の発現プロセスは、研究用のタンパク質を得る主な方法である。このプロセスに必要なプラスミドＤＮＡの量は、一般的に、ミリグラムからグラムレベルであり、かつ初期段階の候補分子ライブラリーのサイズに応じて、生産する必要があるタンパク質サンプルの数は、一般に、数十から数千の範囲にあり、それに対応して、必要なプラスミドＤＮＡの量も数万から数千のオーダーになる。バイオ医薬品の研究開発が加速する過程には、タンパク質の生産に必要なプラスミドＤＮＡを、いかに迅速に大量に入手する問題の解決は、急務となる。
【0003】
細菌を例にとると、大腸菌は、現代のバイオテクノロジーにおいて重要な遺伝子工学用宿主細菌であり、明確な遺伝的背景、速い増殖速度、簡単な遺伝子操作、および生産プロセスの容易なスケールアップという利点を持ち、実験室または工業規模でのプラスミドＤＮＡ、組換えタンパク質、酵素、その他の生物学的製品の生産に広く使用される。大腸菌を宿主細胞として用いてプラスミドＤＮＡを生産する場合、培地から大腸菌細胞を回収し、そして大腸菌細胞から所要のプラスミドＤＮＡを抽出する。発酵ブロスから大腸菌細胞を回収する一般的な方法はとしては、高速遠心分離と膜濾過法がある。高速遠心分離は、通常、研究室のマイクログラムからミリグラムレベルでのプラスミドＤＮＡの調製に使用され、バッチで処理されるサンプルの数は限られ、かつ多くの人工作業が必要となるため、スループットと規模を拡大することが困難になる；膜濾過法は、一回で大量の試料を処理できるため、同一試料を大量に処理する場合に適するが、膜の目詰まりや破損、汚染などのリスクがあり、消耗品のコストも高くなり、多サンプルかつハイスループットな処理を実現することが困難である。さらに、遠心分離法と膜濾過法は、どちらも多くの人工作業に依存し、バッチで処理されるサンプルの数が増加すると、それに応じて、設備や人員の投資も倍増する必要がある。したがって、ハイスループットかつ自動化された処理に適した大腸菌菌体の収集方法を確立することが急務である。
【0004】
化学凝集は、培地から細菌細胞を分離するために使用でき、遠心分離や膜濾過に代わる低コストの代替手段である。公開された中国特許（ＣＮ１０９４３９５８４Ａ）は、キトサンとアルギン酸ナトリウムが凝集によって大腸菌発酵ブロスを濃縮し、菌体濃縮効果を達成できることを示す。しかし、この方法は、大腸菌細胞の回収についてのみ研究され、菌体の完全性、生成物、そしてより重要なことにその後のプラスミド回収に対する沈降効果の影響は研究されなかった。
【0005】
キトサンは、直鎖アミノ多糖であり、熱アルカリ溶液中でキチンを脱アセチル化して調製され、その化学名は、β－（１，４）－２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－グルカンであり、分子式は（Ｃ６Ｈ１１ＮＯ４）ｎ、構造式は以下の通りである：
。
【化1】
【0006】
キトサンは、水や有機溶媒には溶けなく、希酸溶液には溶ける。キトサンは、水に不溶性であるため、その使用プロセスが複雑になるため、菌体の凝集収集への応用は広く実現されていない。
【0007】
したがって、当分野では、操作が簡単で、その後のプラスミド生産の収量に影響を与えず、かつ遠心分離機や膜濾過に依存せず、自動化できる菌体の収集方法を開発する必要があり、これは、プラスミドＤＮＡのハイスループット自動調製と、後期バイオ医薬品の研究開発に必要なタンパク質の迅速な生産にとって非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、本発明の目的は、発酵および培養された細菌および真菌細胞の菌体を、それらのプラスミドＤＮＡおよびＲＮＡの完全性を維持しながら回収するため、ならびにタンパク質および核酸生成物を抽出するための改良された高効率の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
したがって、本発明は、細菌または真菌の発酵培養ブロスから菌体を回収する方法を提供し、当該方法は、以下のステップを含む：
ａ）細菌または真菌の発酵培養で得られる発酵培養ブロスと、カルボキシル化キトサンとを混合し、混合物を得る；
ｂ）混合物にアルギン酸ナトリウム溶液を加え、均一に混合する；及び
ｃ）沈殿し、菌体沈殿物を得る。
ａ）細菌または真菌の発酵培養で得られる発酵培養ブロスと、カルボキシル化キトサンとを混合し、混合物を得る；
ｂ）混合物にアルギン酸ナトリウム溶液を加え、均一に混合する；及び
ｃ）沈殿し、菌体沈殿物を得る。
【0010】
本発明の別の態様では、上記方法のステップｂ）が省略され、したがって、この態様では、細菌または真菌の発酵培養ブロスから菌体沈殿物または発酵培養ブロスの上清を収集する方法を提供し、当該方法は、以下のステップを含む：
ａ）細菌または真菌の発酵培養で得られる発酵培養ブロスと、カルボキシル化キトサンとを混合し、混合物を得る；及びｃ）沈殿し、菌体沈殿物または発酵培養ブロスの上清を得る。
この態様の好ましい実施形態では、ステップｃ）の後に菌体を回収するステップｄ）も含む。
ａ）細菌または真菌の発酵培養で得られる発酵培養ブロスと、カルボキシル化キトサンとを混合し、混合物を得る；及びｃ）沈殿し、菌体沈殿物または発酵培養ブロスの上清を得る。
この態様の好ましい実施形態では、ステップｃ）の後に菌体を回収するステップｄ）も含む。
【0011】
具体的な実施形態では、細菌は、バチルス、大腸菌、乳酸桿菌、ラクトコッカスから選ばれ、好ましくは大腸菌或枯草菌である；前記の真菌は、以下から選ばれる：酵母、好ましくはパン酵母、飼料酵母、醸造酵母、ピキア酵母である；カンジダ；カビ、より好ましくはリゾプス、アスペルギルス、最も好ましくは醸造酵母とピキア酵母である。
【0012】
一つの好ましい実施形態では、前記の細菌は、大腸菌、及び／又は前記の真菌はピキア酵母である。
【0013】
具体的な実施形態では、ステップａ）に混合されるカルボキシル化キトサンの量は、発酵培養ブロスの１％－３２％重量、好ましくは１－１６％重量、より好ましくは４％－８％重量、最も好ましくは８％重量である。
【0014】
具体的な実施形態では、ステップｂ）に添加されるアルギン酸ナトリウムの量は、発酵培養ブロスの１％－１６％重量、好ましくは１％－８％重量、より好ましくは４％－８％重量、最も好ましくは８％重量である。
【0015】
別の具体的な実施形態では、発酵培養ブロスに添加されるカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの量は、それぞれ、発酵培養ブロスの８％重量であり、あるいは、発酵培養ブロスに添加されるカルボキシル化キトサンの量は、発酵培地の８％重量であり、且つアルギン酸ナトリウムを添加しない。一つのより好ましい実施形態では、発酵培養ブロスは、好ましくは、大腸菌発酵培養ブロスとピキア酵母発酵培養ブロスから選ばれる。
【0016】
もう一つの好ましい実施形態では、添加されるカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムとの質量の比は、１：４－４：１、好ましくは１：２－２：１、より好ましくは１：１である。
【0017】
具体的な実施形態では、カルボキシル化キトサンは、アミノ基（－ＮＨ２）、又はヒドロキシル基（－ＯＨ）、又はアミノ基（－ＮＨ２）とヒドロキシル基（－ＯＨ）がカルボキシル化基に修飾されたキトサンであり、ただし、前記のカルボキシル化基は、１－３個のカルボキシル基に置換されたＣ１－Ｃ６直鎖または分岐鎖の炭化水素基、好ましくは３個のカルボキシル基を含み、より好ましくは２個のカルボキシル基を含み、最も好ましくは１個のカルボキシル基を含む；前記の直鎖または分岐鎖の炭化水素基は、好ましくは、１－６個の炭素原子を有する。
【0018】
別の具体的な実施形態では、大腸菌の株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０， Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９， Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１， Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α， Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、および他の大腸菌Ｋ株とＢ株の誘導菌株を含む。好ましい実施形態では、酵母の株は、醸造酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。
【0019】
別の具体的な実施形態では、ステップｄ）の回収は、培地を注ぎ出すか、自動ロボットアームを使用して培地を注ぎ出して菌体を得、物理的または化学的方法を使用して菌体を破壊し、菌体内のＤＮＡまたはＲＮＡを放出し、磁気ビーズでＤＮＡまたはＲＮＡを吸着し、洗浄液でＤＮＡまたはＲＮＡを洗浄し、精製する；好ましくは、注ぎ出すこと、より好ましくは、培地を手動的に注ぎ出すまたは自動ロボットアームで培地を注ぎ出す。
【0020】
この態様の具体的な実施形態では、菌体を得た後、タンパク質を菌体から抽出することもできる。
【0021】
さらに別の好ましい実施形態では、ステップｄ）で回収された培地の上清は、培地を注ぎ出すか、または培地を自動ロボットアームによって注ぎ出すこと得られ、その後、上清中のＤＮＡ、タンパク質、または小分子代謝産物を精製する。
【0022】
さらに別の態様では、大腸菌発酵培地は、ＬＢブロス培地から選ばれ、酵母発酵培地は、ＹＰＤ培地から選ばれる。
【0023】
したがって、本発明の細菌および真菌の発酵培養の菌体を回収する方法の利点は次のとおり：
１．水溶性カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの使用が、発酵ブロス中の菌体を効果的に沈降させ、操作が簡単で、コストが低く、遠心分離や膜濾過が不要である。
２．発酵ブロスを、カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムで処理した後、発酵上清を注ぎ出して除去し、沈降した菌体を得る。当該プロセスは、ロボットアームを使用して自動化できる。
（３）沈降によって得られた菌体は、比較的分散し、凝集してフロックを形成することがないため、菌体の溶解とその後の細胞内プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の抽出に役立つ。
（４）発酵ブロスをカルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムで処理した後、発酵上清を注ぎ出すことによって直接分離することもでき、当該上清を、その後の生化学的分離プロセスに使用して、目的の生成物を得ることができる（タンパク質、アルコール、酸、エステル、ケトンなどの生物学的代謝産物を含むが、これらに限定されない）。
１．水溶性カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの使用が、発酵ブロス中の菌体を効果的に沈降させ、操作が簡単で、コストが低く、遠心分離や膜濾過が不要である。
２．発酵ブロスを、カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムで処理した後、発酵上清を注ぎ出して除去し、沈降した菌体を得る。当該プロセスは、ロボットアームを使用して自動化できる。
（３）沈降によって得られた菌体は、比較的分散し、凝集してフロックを形成することがないため、菌体の溶解とその後の細胞内プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の抽出に役立つ。
（４）発酵ブロスをカルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムで処理した後、発酵上清を注ぎ出すことによって直接分離することもでき、当該上清を、その後の生化学的分離プロセスに使用して、目的の生成物を得ることができる（タンパク質、アルコール、酸、エステル、ケトンなどの生物学的代謝産物を含むが、これらに限定されない）。
【0024】
様々な実施形態の追加の特徴および利点は、以下の明細書で部分的に説明され、かつ部分的には、これらは明細書によって明らかになるか、または様々な実施形態の実践によって知ることができる。様々な実施形態の目的および他の利点は、明細書および添付の請求の範囲で特に指摘された要素および組み合わせによって実現および達成される。
【0025】
特に明記しない限り、本発明で使用される試薬、細胞、および機器は、一般に市販されており、公的に入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
ここで、以下の実施例に記載される本発明のいくつかの実施形態を詳細に参照する。しかしながら、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図したものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、添付の請求の範囲によって定義される本発明に含まれるすべての置換、修正、および均等物を網羅するものとする。
【0028】
本明細書の具体的な実施例に使用されるカルボキシル化キトサンは、アミノ基（－ＮＨ２）、又はヒドロキシル基（－ＯＨ）、又はアミノ基（－ＮＨ２）とヒドロキシル基（－ＯＨ）がカルボキシル化基に修飾されたキトサンであり、ただし、前記のカルボキシル化基は、１－３個のカルボキシル基に置換されたＣ１－Ｃ６直鎖または分岐鎖の炭化水素基、好ましくは３個のカルボキシル基を含み、より好ましくは２個のカルボキシル基を含み、最も好ましくは１個のカルボキシル基を含む；前記の直鎖または分岐鎖の炭化水素基は、好ましくは、１－６個の炭素原子を有する。カルボキシル化キトサンは、水溶性に優れる。現在市販されるカルボキシル化キトサンの種類は、例えば、アラジン試薬社製のカルボキシル化キトサンがあり、「カルボキシル化キトサンの合成と水溶液からのカドミウム（ＩＩ）、鉛（ＩＩ）、銅（ＩＩ）の吸着特性」（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｄｍｉｕｍ （ＩＩ）， ｌｅａｄ （ＩＩ） ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ （ＩＩ） ｆｒｏｍ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ）（Ｋ． Ｌ． Ｌｖ， Ｙ． Ｌ． Ｄｕ， Ｃ． Ｍ． Ｗａｎｇ；． Ｗａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １ Ｊｕｌｙ ２００９； ６０ （２）：４６７－４７４． ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１６６／ｗｓｔ．２００９．３６９）等の文献に記載の方法に従って調製することができる。
【0029】
本明細書に記載される細菌および真菌の発酵細胞培養は、発酵培地を媒介として使用し、適切な条件下で細菌および真菌細胞を培養し、所要の目的産物を増幅および生産する当分野の技術を含む。本明細書の発酵培養は、実験室レベルであってもよく、工業生産レベルであっても良い。
【0030】
本明細書で使用される「細菌」という用語は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を含むが、これらに限定されなく、特に発酵培養に一般的に使用される細菌、例えばバチルス、大腸菌、乳酸桿菌、ラクトコッカスなどであり、好ましくは、大腸菌、枯草菌である。本明細書で使用される「真菌」という用語には、真核性の胞子形成微生物を含むが、これらに限定されなく、酵母、好ましくはパン酵母、飼料酵母、醸造酵母、ピキア酵母など；カンジダ；カビ、例えばリゾプス、アスペルギルスなどである。好ましくは、醸造酵母とピキア酵母である。
【実施例1】
【0031】
実施例１ 大腸菌細胞の抽出と解析
【0032】
１、試薬
ＬＢブロス培地（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａ５０７００２）：１０ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物；キトサン溶液：１．５ｇのキトサン（アラジン試薬、Ｃ１０５７９９）を１００ｍＬの１％酢酸溶液（ＦＩＳＨＥＲ、Ａ３５－５００）に溶解して、１．５％キトサン酢酸溶液を調製した。
カルボキシル化キトサン溶液：カルボキシル化キトサン（アラジン試薬、Ｃ１０５８００）１．５ｇを超純水１００ｍＬに溶解し、１．５％カルボキシル化キトサン水溶液を調製した。
アルギン酸ナトリウム溶液：アルギン酸ナトリウム（アラジン試薬、Ｓ１００１２７）１．０ｇを超純水１００ｍＬに溶解し、１％アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。
細菌再懸濁液：５０ｍＭグルコース（滬試、１００１０５１８）、２５ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（滬試、３０１８８３３６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（滬試、１０００９７１７）。
溶解溶液：０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（滬試、１００１９７１８）、１％（ｍ／Ｖ）ＳＤＳ（滬試、３０１６６４２８）。
中和溶液（１００ｍＬ）：６０ｍＬ ５Ｍ酢酸カリウム（滬試、３０１５４５１８）、１１．５ｍＬ氷酢酸（ＦＩＳＨＥＲ、Ａ３５－５００）、２８．５ｍＬ蒸留水。
ＲＮａｓｅ Ａ：１０ｍｇ／ｍＬ（Ｙｉｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１０４０５ＥＳ０３）。
ｐＵＣ１９プラスミド：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＤ００６１
大腸菌Ｔｏｐ１０菌株：ＴＩＡＮＧＥＮ ＣＢ１０４
ＬＢブロス培地（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａ５０７００２）：１０ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物；キトサン溶液：１．５ｇのキトサン（アラジン試薬、Ｃ１０５７９９）を１００ｍＬの１％酢酸溶液（ＦＩＳＨＥＲ、Ａ３５－５００）に溶解して、１．５％キトサン酢酸溶液を調製した。
カルボキシル化キトサン溶液：カルボキシル化キトサン（アラジン試薬、Ｃ１０５８００）１．５ｇを超純水１００ｍＬに溶解し、１．５％カルボキシル化キトサン水溶液を調製した。
アルギン酸ナトリウム溶液：アルギン酸ナトリウム（アラジン試薬、Ｓ１００１２７）１．０ｇを超純水１００ｍＬに溶解し、１％アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。
細菌再懸濁液：５０ｍＭグルコース（滬試、１００１０５１８）、２５ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（滬試、３０１８８３３６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（滬試、１０００９７１７）。
溶解溶液：０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（滬試、１００１９７１８）、１％（ｍ／Ｖ）ＳＤＳ（滬試、３０１６６４２８）。
中和溶液（１００ｍＬ）：６０ｍＬ ５Ｍ酢酸カリウム（滬試、３０１５４５１８）、１１．５ｍＬ氷酢酸（ＦＩＳＨＥＲ、Ａ３５－５００）、２８．５ｍＬ蒸留水。
ＲＮａｓｅ Ａ：１０ｍｇ／ｍＬ（Ｙｉｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１０４０５ＥＳ０３）。
ｐＵＣ１９プラスミド：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＤ００６１
大腸菌Ｔｏｐ１０菌株：ＴＩＡＮＧＥＮ ＣＢ１０４
【0033】
ｐＵＣ１９プラスミドの配列は以下のとおり：
１．ｐＵＣ１９ ＤＮＡ配列
＞ｐＵＣ１９（配列番号１）
GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT
１．ｐＵＣ１９ ＤＮＡ配列
＞ｐＵＣ１９（配列番号１）
GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT
【0034】
２．方法：
２．１少量大腸菌発酵ブロスのカルボキシル化キトサン沈降処理
ｐＵＣ１９プラスミドを含むＴｏｐ１０大腸菌株を、ＬＢ培地で一晩培養して、大腸菌発酵ブロスを取得し、サンプルを採取して、ＯＤ６００を測定した。当該発酵ブロス１ｍＬを６回採取し、カルボキシル化キトサンの沈降実験に用いられた。さまざまな量のカルボキシル化キトサン溶液を、１ｍＬの発酵ブロスに加え、ボルテックスして混合した；次に、対応する量のアルギン酸ナトリウム溶液を加え、ボルテックスして混合し、３０分間放置した。ブランク対照として、さらに１ｍｌの発酵ブロスを採取した。対照群とカルボキシル化キトサン処理群のＯＤ６００を検出した。カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの添加量を表１に示した。沈降前後のＯＤ６００に基づいて、沈降率を計算した；沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００。
２．１少量大腸菌発酵ブロスのカルボキシル化キトサン沈降処理
ｐＵＣ１９プラスミドを含むＴｏｐ１０大腸菌株を、ＬＢ培地で一晩培養して、大腸菌発酵ブロスを取得し、サンプルを採取して、ＯＤ６００を測定した。当該発酵ブロス１ｍＬを６回採取し、カルボキシル化キトサンの沈降実験に用いられた。さまざまな量のカルボキシル化キトサン溶液を、１ｍＬの発酵ブロスに加え、ボルテックスして混合した；次に、対応する量のアルギン酸ナトリウム溶液を加え、ボルテックスして混合し、３０分間放置した。ブランク対照として、さらに１ｍｌの発酵ブロスを採取した。対照群とカルボキシル化キトサン処理群のＯＤ６００を検出した。カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの添加量を表１に示した。沈降前後のＯＤ６００に基づいて、沈降率を計算した；沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００。
【0035】
２．２少量サンプルのカルボキシル化キトサン沈降処理がプラスミドＤＮＡ抽出に及ぼす影響
方法２．１によって調製された対照群のサンプルと実験群１、２、および３のサンプルの大腸菌菌体に対して、異なる処理方法を適用した。具体的なプロセスは以下の通りである：（１）対照群：菌液を３５００ｇで１分間遠心分離し、発酵上清を除去して菌体を得た；（２）実験群：沈降した発酵ブロスの上清をピペットで吸い取り、遠心管の底に沈殿した菌体を得た。２５０μＬの菌体再懸濁液と１μＬのＲＮａｓｅ Ａで菌体を再懸濁し、２５０μＬの溶解溶液を加え、穏やかに転倒して均一に混合して菌体を溶解し、３５０μＬの中和溶液を加え、穏やかに転倒して均一に混合した。１２，０００ｇで遠心分離した後、上清を回収し、適量の磁気ビーズを加え、均一に混合し、磁気ビーズが上清中のＤＮＡを吸着した。次に、磁石を使用して磁気ビーズを吸着し、上清を除去した。次に、７０％エタノールを加えて磁性ビーズを２回洗浄し、エタノールを乾燥させ、５０μＬの超純水で磁性ビーズを溶出してプラスミドＤＮＡを取得し、分光光度計を使用して、プラスミドＤＮＡ濃度を検出し、プラスミドＤＮＡ収量を計算した。
方法２．１によって調製された対照群のサンプルと実験群１、２、および３のサンプルの大腸菌菌体に対して、異なる処理方法を適用した。具体的なプロセスは以下の通りである：（１）対照群：菌液を３５００ｇで１分間遠心分離し、発酵上清を除去して菌体を得た；（２）実験群：沈降した発酵ブロスの上清をピペットで吸い取り、遠心管の底に沈殿した菌体を得た。２５０μＬの菌体再懸濁液と１μＬのＲＮａｓｅ Ａで菌体を再懸濁し、２５０μＬの溶解溶液を加え、穏やかに転倒して均一に混合して菌体を溶解し、３５０μＬの中和溶液を加え、穏やかに転倒して均一に混合した。１２，０００ｇで遠心分離した後、上清を回収し、適量の磁気ビーズを加え、均一に混合し、磁気ビーズが上清中のＤＮＡを吸着した。次に、磁石を使用して磁気ビーズを吸着し、上清を除去した。次に、７０％エタノールを加えて磁性ビーズを２回洗浄し、エタノールを乾燥させ、５０μＬの超純水で磁性ビーズを溶出してプラスミドＤＮＡを取得し、分光光度計を使用して、プラスミドＤＮＡ濃度を検出し、プラスミドＤＮＡ収量を計算した。
【0036】
２．３大量大腸菌発酵ブロスにおけるカルボキシル化キトサンとキトサンの沈降効果の比較
【0037】
１５０ｍＬのＬＢ培地を、２つの２５０ｍＬ三角振盪フラスコに加え、ｐＵＣ１９プラスミドを含むＴｏｐ１０大腸菌株を一晩培養し、大腸菌発酵ブロスを取得し、サンプルを採取して、ＯＤ６００を測定した。カルボキシル化キトサン沈降群に、実験室規模のテストで最適な凝集剤の使用量として、８％カルボキシル化キトサンと８％アルギン酸ナトリウムを添加した；公開特許（ＣＮ１０９４３９５８４Ａ）に記載される凝集剤の好ましい添加量として、４％キトサンと２％アルギン酸ナトリウムをキトサン沈降群に添加した。２群の実験の添加プロセスと操作は、次のとおり：
カルボキシル化キトサン群：１２ｍｌ（添加量８％）のカルボキシル化キトサン溶液を振盪フラスコに加え、手動で３０秒間水平に振り、次に、同体積のアルギン酸ナトリウム溶液（添加量８％）を加え、手動で３０秒間水平に振った。低温で４時間放置し、大腸菌菌体を完全に沈降させ、その後、上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
キトサン群：６ｍｌ（添加量４％）のキトサン溶液を、振盪フラスコに加え、シェーカー上で１２０～１５０ｒｐｍで、２～３分間速く均一に混合し、次に、３ｍｌ（添加量２％）のアルギン酸ナトリウム溶液を加え、シェーカー上で５０～６０ｒｐｍで２～５分間ゆっくりと均一に混合した。低温で４時間放置し、大腸菌菌体を完全に沈降させ、その後、上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
手動注ぎ出しにより、振盪フラスコから上清をゆっくり注ぎ出し、メスシリンダーを用いて残った菌液の体積を測定し、培養上清の除去率を算出した。沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００；培養上清の除去率＝（培養体積－沈降後の菌液の体積）／培養体積。
カルボキシル化キトサン群：１２ｍｌ（添加量８％）のカルボキシル化キトサン溶液を振盪フラスコに加え、手動で３０秒間水平に振り、次に、同体積のアルギン酸ナトリウム溶液（添加量８％）を加え、手動で３０秒間水平に振った。低温で４時間放置し、大腸菌菌体を完全に沈降させ、その後、上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
キトサン群：６ｍｌ（添加量４％）のキトサン溶液を、振盪フラスコに加え、シェーカー上で１２０～１５０ｒｐｍで、２～３分間速く均一に混合し、次に、３ｍｌ（添加量２％）のアルギン酸ナトリウム溶液を加え、シェーカー上で５０～６０ｒｐｍで２～５分間ゆっくりと均一に混合した。低温で４時間放置し、大腸菌菌体を完全に沈降させ、その後、上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
手動注ぎ出しにより、振盪フラスコから上清をゆっくり注ぎ出し、メスシリンダーを用いて残った菌液の体積を測定し、培養上清の除去率を算出した。沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００；培養上清の除去率＝（培養体積－沈降後の菌液の体積）／培養体積。
【0038】
２．４大量サンプルのカルボキシル化キトサンとキトサン沈降処理がプラスミドＤＮＡ抽出に及ぼす影響
プラスミドＤＮＡ抽出試験には、カルボキシル化キトサンとキトサン沈殿後に得られた濃縮菌液を使用し、対照群として、一晩培養した大腸菌液１５０ｍＬを３５００ｇで１０分間遠心分離して回収した菌体を使用した。キトサン処理後に残った菌液の体積が多いため、きれいに注ぎきれない培地を電動ピペットを使用して慎重に除去し、最終的な濃縮菌液の体積を、カルボキシル化キトサン処理群と同じにした（約１０ｍｌ）。対照群を遠心分離して得た菌体に、１０ｍｌの菌体再懸濁液を加え、凝集せずに菌体を完全に再懸濁した。次に、対照群と実験群の菌液に、１０μＬのＲＮａｓｅ Ａを加え、１０秒間水平に振盪し、次に、１０ｍＬの溶解溶液を加え、３０秒間水平に振盪し、菌体を溶解し、次に１２μＬの中和溶液を加え、３０秒間水平に振盪した。振盪フラスコ中の中和溶液を５０ｍｌ遠心管に移し、３５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収し、適量の磁気ビーズを加え、均一に混合し、磁気ビーズが上清中のＤＮＡを吸着した。次に、磁石を使用して磁気ビーズを吸着し、上清を除去した。その後、７０％エタノールを加え、磁性ビーズを２回洗浄し、エタノールを十分に蒸発させた後、１０００μＬの超純水で、磁性ビーズを溶出させ、プラスミドＤＮＡを得た。分光光度計を使用して、プラスミドＤＮＡ濃度を検出し、プラスミドＤＮＡ収量を計算した。アガロースゲル電気泳動を使用して、プラスミドのバンドとスーパーコイル状態を観察した。アガロースゲル電気泳動の実験手順については、「分子クローニング実験ガイド第４版」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ． Ｇｒｅｅｎ， Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０１２）を参照する。
プラスミドＤＮＡ抽出試験には、カルボキシル化キトサンとキトサン沈殿後に得られた濃縮菌液を使用し、対照群として、一晩培養した大腸菌液１５０ｍＬを３５００ｇで１０分間遠心分離して回収した菌体を使用した。キトサン処理後に残った菌液の体積が多いため、きれいに注ぎきれない培地を電動ピペットを使用して慎重に除去し、最終的な濃縮菌液の体積を、カルボキシル化キトサン処理群と同じにした（約１０ｍｌ）。対照群を遠心分離して得た菌体に、１０ｍｌの菌体再懸濁液を加え、凝集せずに菌体を完全に再懸濁した。次に、対照群と実験群の菌液に、１０μＬのＲＮａｓｅ Ａを加え、１０秒間水平に振盪し、次に、１０ｍＬの溶解溶液を加え、３０秒間水平に振盪し、菌体を溶解し、次に１２μＬの中和溶液を加え、３０秒間水平に振盪した。振盪フラスコ中の中和溶液を５０ｍｌ遠心管に移し、３５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収し、適量の磁気ビーズを加え、均一に混合し、磁気ビーズが上清中のＤＮＡを吸着した。次に、磁石を使用して磁気ビーズを吸着し、上清を除去した。その後、７０％エタノールを加え、磁性ビーズを２回洗浄し、エタノールを十分に蒸発させた後、１０００μＬの超純水で、磁性ビーズを溶出させ、プラスミドＤＮＡを得た。分光光度計を使用して、プラスミドＤＮＡ濃度を検出し、プラスミドＤＮＡ収量を計算した。アガロースゲル電気泳動を使用して、プラスミドのバンドとスーパーコイル状態を観察した。アガロースゲル電気泳動の実験手順については、「分子クローニング実験ガイド第４版」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ． Ｇｒｅｅｎ， Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０１２）を参照する。
【0039】
２．５大量サンプルのカルボキシル化キトサン単独処理が菌体沈降とプラスミドＤＮＡ抽出に及ぼす影響
１５０ｍＬのＬＢ培地を、２つの２５０ｍＬ三角振盪フラスコに加え、ｐＵＣ１９プラスミドを含むＴｏｐ１０大腸菌株を一晩培養し、大腸菌発酵ブロスを取得し、サンプルを採取して、ＯＤ６００を測定した。実験群に、実験室規模のテストで最適な凝集剤の使用量として、８％カルボキシル化キトサンを添加した；同体積の超純水を対照群に加えた。２群の実験の添加プロセスと操作は、次のとおり：
実験群：振盪フラスコに、１２ｍｌ（添加量８％）のカルボキシル化キトサン溶液を加え、手動で３０秒間水平に振盪し、低温で静置し、大腸菌菌体を完全に沈降させ、４時間および６時間の時点で、それぞれ上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
対照群：振盪フラスコに１２ｍｌの超純水を加え、手動で３０秒間水平振盪し、低温で静置し、４時間および６時間の時点で、それぞれ上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
手動注ぎ出しにより、振盪フラスコから上清をゆっくり注ぎ出し、メスシリンダーを用いて残った菌液の体積を測定し、培養上清の除去率を算出した。沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００；培養上清の除去率＝（培養体積－沈降後の菌液の体積）／培養体積
１５０ｍＬのＬＢ培地を、２つの２５０ｍＬ三角振盪フラスコに加え、ｐＵＣ１９プラスミドを含むＴｏｐ１０大腸菌株を一晩培養し、大腸菌発酵ブロスを取得し、サンプルを採取して、ＯＤ６００を測定した。実験群に、実験室規模のテストで最適な凝集剤の使用量として、８％カルボキシル化キトサンを添加した；同体積の超純水を対照群に加えた。２群の実験の添加プロセスと操作は、次のとおり：
実験群：振盪フラスコに、１２ｍｌ（添加量８％）のカルボキシル化キトサン溶液を加え、手動で３０秒間水平に振盪し、低温で静置し、大腸菌菌体を完全に沈降させ、４時間および６時間の時点で、それぞれ上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
対照群：振盪フラスコに１２ｍｌの超純水を加え、手動で３０秒間水平振盪し、低温で静置し、４時間および６時間の時点で、それぞれ上清を採取し、ＯＤ６００を測定し、沈降率を計算した。
手動注ぎ出しにより、振盪フラスコから上清をゆっくり注ぎ出し、メスシリンダーを用いて残った菌液の体積を測定し、培養上清の除去率を算出した。沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００；培養上清の除去率＝（培養体積－沈降後の菌液の体積）／培養体積
【0040】
３．実験結果と解析
３．１少量の大腸菌発酵ブロスに対するカルボキシル化キトサンの沈降効果
方法２．１で説明したように、大腸菌菌液の一晩培養物１ｍＬの菌体沈降効果に対する、異なる添加量のカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの使用の影響を、表１に示した。ある範囲内では、カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの添加量が増加するにつれて、菌体沈降率は上昇傾向を示した。カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの添加量が、それぞれ８％と８％の場合、最良の菌体沈降効果は、９３．５％に達した。２種類の凝集剤の添加量をさらに増やしても、沈降効果はそれ以上向上せず、低下傾向にあった。したがって、その後の研究では、８％のカルボキシル化キトサン添加および８％のアルギン酸ナトリウム添加を沈降条件として使用した。
３．１少量の大腸菌発酵ブロスに対するカルボキシル化キトサンの沈降効果
方法２．１で説明したように、大腸菌菌液の一晩培養物１ｍＬの菌体沈降効果に対する、異なる添加量のカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの使用の影響を、表１に示した。ある範囲内では、カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの添加量が増加するにつれて、菌体沈降率は上昇傾向を示した。カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムの添加量が、それぞれ８％と８％の場合、最良の菌体沈降効果は、９３．５％に達した。２種類の凝集剤の添加量をさらに増やしても、沈降効果はそれ以上向上せず、低下傾向にあった。したがって、その後の研究では、８％のカルボキシル化キトサン添加および８％のアルギン酸ナトリウム添加を沈降条件として使用した。
【表1】
【0041】
３．２カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムで菌体を沈降することが少量プラスミドサンプルの抽出に対する影響
プラスミドミニプレップテスト用に、上記で得られたカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウム実験群１、２、および３から得られた沈降された菌体を選択し、遠心分離によって収集された菌体を対照として使用し（方法２．２のように）、結果を表２に示した。対照群のプラスミド収量は、９．４μｇで、実験群３では８％カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムを使用して細胞を沈殿させることが、１４．５μｇの最高のプラスミド収量を得、対照群の１．５倍である；さらに、菌体の沈降率の増加に伴い、プラスミド収量は直線的な向上傾向を示した。対照群と実験群で小規模に抽出されたプラスミドＤＮＡのＡ２６０／Ａ２８０は、どちらも１．８～２．０であり、ＲＮＡやタンパク質の汚染はなく、さらなる研究に使用できる。少量の条件下での菌体の沈降によって収集されたプラスミド収量は、菌体の遠心分離よって得られたプラスミド収量よりも著しく高く、カルボキシル化キトサンまたはアルギン酸ナトリウムは、プラスミド収量に一定の促進効果を与える可能性がある。
プラスミドミニプレップテスト用に、上記で得られたカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウム実験群１、２、および３から得られた沈降された菌体を選択し、遠心分離によって収集された菌体を対照として使用し（方法２．２のように）、結果を表２に示した。対照群のプラスミド収量は、９．４μｇで、実験群３では８％カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムを使用して細胞を沈殿させることが、１４．５μｇの最高のプラスミド収量を得、対照群の１．５倍である；さらに、菌体の沈降率の増加に伴い、プラスミド収量は直線的な向上傾向を示した。対照群と実験群で小規模に抽出されたプラスミドＤＮＡのＡ２６０／Ａ２８０は、どちらも１．８～２．０であり、ＲＮＡやタンパク質の汚染はなく、さらなる研究に使用できる。少量の条件下での菌体の沈降によって収集されたプラスミド収量は、菌体の遠心分離よって得られたプラスミド収量よりも著しく高く、カルボキシル化キトサンまたはアルギン酸ナトリウムは、プラスミド収量に一定の促進効果を与える可能性がある。
【表2】
【0042】
３．３大量の大腸菌発酵ブロスに対するカルボキシル化キトサンとキトサンの沈降効果
本研究の方法２．１の小規模抽出によって得られた適切なカルボキシル化キトサン沈降菌体の最適条件：８％添加量のカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウム及び公開された特許出願（ＣＮ１０９４３９５８４Ａ）で報告されるキトサンおよびアルギン酸ナトリウムによる菌体沈降の最適条件：４％添加量のキトサンと２％添加量のアルギン酸ナトリウムを採用し、一晩培養した１５０ｍＬの大腸菌菌体の沈降実験を行い、結果を表３に示した。表３からわかるように、元の発酵ブロスのＯＤ６００が近いの場合、キトサンによる菌体の沈降率は、カルボキシル化キトサンによる菌体の沈降率よりわずかに高く、それぞれ９８．４％と９２．７％であった。しかし、培養上清を直接に注ぎ出して除去した場合、カルボキシル化キトサン群の培地除去率は、キトサン群よりもはるかに高く、それぞれ９３％、６２％であった。直接注ぎ出すことにより培養上清を除去した後、カルボキシル化キトサン処理群に残った菌液体積は、わずか１０．５ｍｌであった。沈降後の培地除去率が高いため、カルボキシル化キトサンの沈降後のサンプルを自動ロボットアームを使用してバッチで自動的に処理でき、菌体沈降後の下流の自動操作全体のシステム統合に寄与する。
本研究の方法２．１の小規模抽出によって得られた適切なカルボキシル化キトサン沈降菌体の最適条件：８％添加量のカルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウム及び公開された特許出願（ＣＮ１０９４３９５８４Ａ）で報告されるキトサンおよびアルギン酸ナトリウムによる菌体沈降の最適条件：４％添加量のキトサンと２％添加量のアルギン酸ナトリウムを採用し、一晩培養した１５０ｍＬの大腸菌菌体の沈降実験を行い、結果を表３に示した。表３からわかるように、元の発酵ブロスのＯＤ６００が近いの場合、キトサンによる菌体の沈降率は、カルボキシル化キトサンによる菌体の沈降率よりわずかに高く、それぞれ９８．４％と９２．７％であった。しかし、培養上清を直接に注ぎ出して除去した場合、カルボキシル化キトサン群の培地除去率は、キトサン群よりもはるかに高く、それぞれ９３％、６２％であった。直接注ぎ出すことにより培養上清を除去した後、カルボキシル化キトサン処理群に残った菌液体積は、わずか１０．５ｍｌであった。沈降後の培地除去率が高いため、カルボキシル化キトサンの沈降後のサンプルを自動ロボットアームを使用してバッチで自動的に処理でき、菌体沈降後の下流の自動操作全体のシステム統合に寄与する。
【表3】
【0043】
３．４大量サンプルのカルボキシル化キトサンとキトサン沈降処理がプラスミドＤＮＡ抽出に及ぼす影響
３．３で得られた沈降された大腸菌菌液からアルカリ溶解法により調製したプラスミドＤＮＡの収量を調べた。遠心分離により収集した菌体を用いて、対照としてプラスミドＤＮＡを調製した。キトサン群の沈降処理後の菌液体積が多かったので、ピペットを使用して手作業で残った培地を除去し、最終的な菌液体積を約１０ｍＬまで減らした。次に、１０μＬのＲＮａｓｅ Ａを菌液に加え、水平に振って均一に混合した後、アルカリ溶解溶液を加えて菌体を溶解した。次いで、２．４に記載の方法に従って、プラスミドＤＮＡを抽出し、抽出により得られたプラスミドＤＮＡの収量を表４に示した。
３．３で得られた沈降された大腸菌菌液からアルカリ溶解法により調製したプラスミドＤＮＡの収量を調べた。遠心分離により収集した菌体を用いて、対照としてプラスミドＤＮＡを調製した。キトサン群の沈降処理後の菌液体積が多かったので、ピペットを使用して手作業で残った培地を除去し、最終的な菌液体積を約１０ｍＬまで減らした。次に、１０μＬのＲＮａｓｅ Ａを菌液に加え、水平に振って均一に混合した後、アルカリ溶解溶液を加えて菌体を溶解した。次いで、２．４に記載の方法に従って、プラスミドＤＮＡを抽出し、抽出により得られたプラスミドＤＮＡの収量を表４に示した。
【表4】
【0044】
表４の抽出結果から、カルボキシル化キトサン沈降によって収集された菌体のプラスミド抽出によって得られたプラスミド収量と、遠心分離によって収集されたものとが、それぞれ３３０．５μｇと３２４．５μｇで、あまり違いがないことがわかる。キトサンでの沈降が菌体のプラスミド抽出効率を大幅に低下させ、プラスミド収量はわずか３７．２μｇで、これは、カルボキシル化キトサン処理群の約１１％である。沈降した菌体の溶解処理中に、キトサンとアルギン酸ナトリウムが、大腸菌に大きな綿状の細菌塊を形成させ、均一に分散させることが困難であり、さらにアルカリ溶解中に不十分な溶解を引き起こすことが目視観察により判明した。カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムで沈降されて得た大腸菌は、繊細な外観をして、手動で振盪した後、素早く分散して均一に分散することができ、後のアルカリ溶解に影響を与えることがない（結果は表示されない）。したがって、キトサンとアルギン酸ナトリウムでの菌体沈降が、発酵ブロス内の菌体を除去し、発酵上清を収集する場合に適するが、カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムでの菌体沈降が、発酵上清を収集するために使用できるだけでなく、その後の菌体の処理にも使用でき、たとえば、菌体内の生物産物（プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞内タンパク質など）を抽出する。
【0045】
プラスミドＤＮＡのＡ２６０／Ａ２８０試験結果（表２）とアガロースゲル電気泳動で示されるプラスミドスーパーコイル比の結果（図１）によれば、カルボキシル化キトサン法を使用した菌体の収集は、抽出されたプラスミドＤＮＡの品質に影響を与えないこともわかる。
【0046】
３．５大量サンプルのカルボキシル化キトサン単独処理が細菌沈降とプラスミドＤＮＡ抽出に及ぼす影響
カルボキシル化キトサンを単独で使用した場合の大腸菌菌体の沈降およびプラスミドＤＮＡ抽出収量に対する影響を調査した。カルボキシル化キトサンを含まないサンプルを、沈降効率の対照およびプラスミド収量の対照として使用した。結果は、表５に示した。
カルボキシル化キトサンを単独で使用した場合の大腸菌菌体の沈降およびプラスミドＤＮＡ抽出収量に対する影響を調査した。カルボキシル化キトサンを含まないサンプルを、沈降効率の対照およびプラスミド収量の対照として使用した。結果は、表５に示した。
【表5】
【0047】
表５からわかるように、４時間の沈降後に実験群の菌体沈降率は、８０．５％に達し、これは、４時間の沈降後のカルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの菌体沈降率９２．７％よりも低かった（表３）。ただし、６時間の沈降後に８％のカルボキシル化キトサンを単独で使用すると、カルボキシル化キトサンとアルギン酸ナトリウムを組み合わせて４時間の沈降を行った場合と同じ菌体沈降効果（９５．２％）を達成できる。カルボキシル化キトサンを単独で使用した場合の沈降時間は、２種類の凝集剤を使用した場合よりも２時間長くなるが、試薬の添加プロセスが簡素化され、自動運転中のアルギン酸ナトリウムの高粘度によって引き起こされる不精確な液体の添加やパイプラインの閉塞のリスクも回避され、より大きな応用価値をもたらす。
【0048】
また、処理しようとする大腸菌の菌液体積やバッチサイズを大きくする必要がある場合、遠心分離法も膜ろ過法も、バッチ処理サンプル数が限られ、手作業が多く、自動化が困難であり、かつ遠心分離機や膜ろ過装置も相応に増加する必要があるので、コストが増加するなどの問題が生じる。本発明の沈降法は、１～２種類の凝集剤を添加するだけでよく、低温条件下での重力沈降により菌体と発酵培地の分離が可能であり、方法が簡単であり、低コストであり、自動化スケールアップバッチ処理が容易に実現でき、遠心分離法や膜ろ過法に比べて優れる。
【0049】
４．結果のまとめ：
上述したように、本発明者は、予想外にも、水溶性カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの使用、またはカルボキシル化キトサン単独の使用により、遠心分離または膜濾過を回避し、操作が容易で、大腸菌発酵ブロス中での菌体の沈降を効果的に達成できることを発見した。大腸菌発酵ブロスを凝集剤で処理した後、注ぎ出すことにより発酵上清を除去し、沈降した菌体を得ることができる。当該プロセスは、ロボットアームを使用して自動化できる。本発明の沈降方法で沈降させ得られた菌体は、比較的分散し、凝集してフロックを形成することがないため、菌体の溶解とその後の細胞内プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の抽出に役立つ。
上述したように、本発明者は、予想外にも、水溶性カルボキシル化キトサンおよびアルギン酸ナトリウムの使用、またはカルボキシル化キトサン単独の使用により、遠心分離または膜濾過を回避し、操作が容易で、大腸菌発酵ブロス中での菌体の沈降を効果的に達成できることを発見した。大腸菌発酵ブロスを凝集剤で処理した後、注ぎ出すことにより発酵上清を除去し、沈降した菌体を得ることができる。当該プロセスは、ロボットアームを使用して自動化できる。本発明の沈降方法で沈降させ得られた菌体は、比較的分散し、凝集してフロックを形成することがないため、菌体の溶解とその後の細胞内プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の抽出に役立つ。
【0050】
本明細書に記載の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載のさまざまな実施形態にさまざまな修正および変更を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、様々な実施形態は、本教示の範囲内の様々な実施形態の他の修正および変形を網羅することを意図する。
【実施例2】
【0051】
実施例２ ピキア酵母菌体の沈降
【0052】
１、試薬
ＹＰＤ培地：１％酵母抽出物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＰ００２１Ｂ）、２％ペプトン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＰ００４２Ｂ）、２％デキストラン（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｒｅａｇｅｎｔ、６３００５５１８）。
カルボキシル化キトサン溶液：カルボキシル化キトサン（アラジン試薬、Ｃ１０５８００）１．５ｇを超純水１００ｍＬに溶解し、１．５％カルボキシル化キトサン水溶液を調製した。
ＹＰＤ培地：１％酵母抽出物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＰ００２１Ｂ）、２％ペプトン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＰ００４２Ｂ）、２％デキストラン（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｒｅａｇｅｎｔ、６３００５５１８）。
カルボキシル化キトサン溶液：カルボキシル化キトサン（アラジン試薬、Ｃ１０５８００）１．５ｇを超純水１００ｍＬに溶解し、１．５％カルボキシル化キトサン水溶液を調製した。
【0053】
２．方法
ピキアパストリスＧＳ１１５株を、４ｍｌのＹＰＤ培地で培養して、ピキアパストリスＧＳ１１５発酵ブロスを得、サンプルを採取してＯＤ６００を測定した。さまざまな添加量のカルボキシル化キトサン溶液を、発酵ブロスに加え、ボルテックスして混合し、４℃で放置した。カルボキシル化キトサンを添加しない発酵ブロスをブランク対照とした。対照群とカルボキシル化キトサン処理群のＯＤ６００を、１時間ごとに検出した。沈降前後のＯＤ６００に基づいて、沈降率を計算した；沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００。
ピキアパストリスＧＳ１１５株を、４ｍｌのＹＰＤ培地で培養して、ピキアパストリスＧＳ１１５発酵ブロスを得、サンプルを採取してＯＤ６００を測定した。さまざまな添加量のカルボキシル化キトサン溶液を、発酵ブロスに加え、ボルテックスして混合し、４℃で放置した。カルボキシル化キトサンを添加しない発酵ブロスをブランク対照とした。対照群とカルボキシル化キトサン処理群のＯＤ６００を、１時間ごとに検出した。沈降前後のＯＤ６００に基づいて、沈降率を計算した；沈降率＝（元のサンプルのＯＤ６００－沈降後のサンプルのＯＤ６００）／元のサンプルのＯＤ６００。
【0054】
３．結果
方法のセクションで説明したように、異なる添加量のカルボキシル化キトサンを使用した場合の、４ｍＬのピキアパストリス液の菌体沈降効果に対する影響を、表６に示した。
方法のセクションで説明したように、異なる添加量のカルボキシル化キトサンを使用した場合の、４ｍＬのピキアパストリス液の菌体沈降効果に対する影響を、表６に示した。
【表6】
【0055】
ある範囲内では、カルボキシル化キトサンの添加量が増加するにつれて、菌体沈降率は上昇傾向を示した。カルボキシル化キトサンの添加量が８％である場合、最良の細菌沈降効果は、９４．２％に達した。カルボキシル化キトサンの添加量をさらに増やしても、沈降効果はさらに改善されなかった。
【0056】
当該実施例は、カルボキシル化キトサンが、ピキアパストリスの細胞沈降に良好な効果を持ち、ピキアパストリスの菌体収集または沈降後の培養上清の収集に使用でき、その後のタンパク質精製やその他の用途に用いられる。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】