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特表2025-501245ＩＬ－１０を発現するポリドナーＣＤ４＋Ｔ細胞およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】ＩＬ－１０を発現するポリドナーＣＤ４＋Ｔ細胞およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20250109BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20250109BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250109BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250109BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20250109BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20250109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250109BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250109BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20250109BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20250109BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20250109BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20250109BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20250109BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20250109BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20250109BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20250109BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20250109BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250109BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20250109BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20250109BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20250109BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250109BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20250109BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C07K14/54 ZNA
C12N15/24
C12N15/867 Z
A61K35/17
A61P37/06
A61K35/12
A61K35/28
A61P35/00
A61P35/02
A61P29/00
A61P37/02
A61P3/10
A61P27/02
A61P1/16
A61P17/00
A61P17/14
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P17/06
A61P25/00
A61P1/04
A61P21/04
A61P9/00
A61P7/06
A61P37/08
A61P11/06
A61P11/02
A61K35/545
A61P31/14
A61P31/12
A61P31/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539565
(86)(22)【出願日】2022-12-27
(85)【翻訳文提出日】2024-08-27
(86)【国際出願番号】 US2022082422
(87)【国際公開番号】W WO2023129922
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】63/295,389
(32)【優先日】2021-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523000846
【氏名又は名称】ティーアール１エックス，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100141195
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 恵美子
(72)【発明者】
【氏名】デ フリーズ，ジャン，エグバート
(72)【発明者】
【氏名】ロンカロロ，マリア，グラツィア
(72)【発明者】
【氏名】パリアード，ザビエル
(72)【発明者】
【氏名】デ フリーズ，デイビッド
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB57
4C087BB63
4C087BB65
4C087DA32
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA33
4C087ZA36
4C087ZA55
4C087ZA59
4C087ZA68
4C087ZA75
4C087ZA89
4C087ZA92
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB09
4C087ZB11
4C087ZB13
4C087ZB15
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZC35
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA02
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を遺伝子改変することによって生成されたポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を提供する。さらに、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を生成する方法、および免疫寛容のためにポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用する方法、ＧｖＨＤ、細胞および臓器移植、がん、自己免疫疾患および炎症疾患、および他の免疫障害を処置する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞（ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）の集団であって、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項2】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られた、請求項１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項3】
前記集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞が、集合的に６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれより多くの異なるＨＬＡハプロタイプを有する、請求項１または請求項２に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項4】
前記集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞が全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくともｌ／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０の一致を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項5】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して少なくとも１／８、２／８、３／８、４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８の一致を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項6】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２の一致を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項7】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２の一致を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項8】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２の一致を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項9】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも３／４または４／４の一致を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項10】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項11】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する、請求項１０に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項12】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する、請求項１０～１１のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項13】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項14】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項15】
前記集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して２／４、３／４、または４／４未満の一致を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項16】
前記集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞が全て、Ａ＊０２またはＡ＊２４対立遺伝子を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項17】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれも、不死化されていない、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項18】
前記外因性ポリヌクレオチドが、発現制御エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項19】
前記ＩＬ－１０がヒトＩＬ－１０である、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項20】
前記ＩＬ－１０がウイルスＩＬ－１０である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項21】
前記ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントが、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項22】
前記ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントが、配列番号２の配列を有する、請求項２１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項23】
前記ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントが、配列番号６の配列を有するタンパク質をコードする、請求項２０に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項24】
前記ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントが、配列番号７の配列を有する、請求項２３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項25】
前記発現制御エレメントが、コードされるＩＬ－１０の構成的発現を駆動する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項26】
前記外因性ポリヌクレオチドが、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドセグメントをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項27】
前記選択マーカーが、ΔＮＧＦＲである、請求項２６に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項28】
前記ΔＮＧＦＲが、配列番号３の配列を有する、請求項２７に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項29】
前記ポリヌクレオチドセグメントが、配列番号４の配列を含む、請求項２７に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項30】
前記選択マーカーが、ＥＧＦＲポリペプチドの切断型である、請求項２６に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項31】
前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号５の配列を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項32】
前記外因性ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれている、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項33】
前記外因性ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれていない、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項34】
前記外因性ポリヌクレオチドが、レンチウイルスベクター配列をさらに含む、請求項３２または３３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項35】
前記外因性ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれていない、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項36】
前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、ＩＬ－１０を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項37】
前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が、ＩＬ－１０を発現する、請求項３６に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項38】
前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％または９８％が、ＩＬ－１０を発現する、請求項３７に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項39】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬ培養培地あたり少なくとも１００ｐｇのＩＬ－１０を構成的に発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項40】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬあたり、少なくとも１００ｐｇ、２００ｐｇ、５００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、または５０ｎｇのＩＬ－１０を構成的に発現する、請求項３９に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項41】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による活性化後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬあたり少なくとも１ｎｇのＩＬ－１０を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項42】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による活性化後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬあたり少なくとも２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または５００ｎｇのＩＬ－１０を発現する、請求項４１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項43】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より少なくとも５倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項44】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より少なくとも１０倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する、請求項４３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項45】
前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、前記外因性ポリヌクレオチドからの選択マーカーを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項46】
前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が、前記外因性ポリヌクレオチドからの選択マーカーを発現する、請求項４５に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項47】
前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％または９８％が、前記外因性ポリヌクレオチドからの選択マーカーを発現する、請求項４６に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項48】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４９ｂを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項49】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＬＡＧ－３を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項50】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＧＦ－βを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項51】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮ－γを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項52】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＧｚＢを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項53】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がパーフォリンを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項54】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ１８を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項55】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項56】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２２６を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項57】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ－２２を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項58】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、宿主からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でアネルギー化されていない、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項59】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、組換えＩＬ－１０タンパク質の存在下でアネルギー化されておらず、前記組換えＩＬ－１０タンパク質が、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されない、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項60】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、宿主からのＤＣ１０細胞の存在下でアネルギー化されていない、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項61】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、凍結浮遊液中に存在する、請求項１～６０のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項62】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、液体浮遊液中に存在する、請求項１～６０のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項63】
前記液体浮遊液が事前に凍結されている、請求項６２に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団。
【請求項64】
（ｉｉ）薬学的に許容される担体に浮遊させた；（ｉ）先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞集団
を含む医薬組成物。
【請求項65】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得た初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールするステップ；および
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、プールしたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変し、
それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得るステップ
を含む方法。
【請求項66】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ；および
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を個別に改変するステップ、次に
（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、
それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得るステップ
を含む方法。
【請求項67】
ステップ（ｉ）の後かつステップ（ｉｉ）の前、ステップ（ｉｉ）の後、ステップ（ｉｉ）の後かつステップ（ｉｉｉ）の前、またはステップ（ｉｉｉ）の後に、前記初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下でインキュベートするステップ
をさらに含む、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＬ－２の存在下でさらにインキュベートされる、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記外因性ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターを使用して前記初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントが、配列番号２または７の配列を有する、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記外因性ポリヌクレオチドが、選択マーカーをコードするセグメントをさらに含む、請求項６５～７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
前記コードされる選択マーカーがΔＮＧＦＲである、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記コードされる選択マーカーが、配列番号３の配列を有する、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
ステップ（ｉｉ）の後に、前記選択マーカーを発現する前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団を生成するステップをさらに含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
前記濃縮集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、ＩＬ－１０を発現する、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記濃縮集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％、９５％、または９８％が、ＩＬ－１０を発現する、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記濃縮集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、選択マーカーを発現する、請求項７６～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記濃縮集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％、９５％、または９８％が、選択マーカーを発現する、請求項７０に記載の方法。
【請求項81】
遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップをさらに含む、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項82】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップが、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下、ＩＬ－２の存在下で実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を凍結する後のステップをさらに含む、請求項６５～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
ステップ（ｉ）において、前記初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる、請求項６５～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０の一致を有する、請求項８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して少なくとも１／８、２／８、３／８、４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８の一致を有する、請求項６５～８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項87】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２の一致を有する、請求項６５～８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２の一致を有する、請求項６５～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２の一致を有する、請求項６５～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも３／４または４／４の一致を有する、請求項６５～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する、請求項８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項92】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する、請求項８４または９１に記載の方法。
【請求項93】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する、請求項８４および９１～９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する、請求項８４および９１～９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する、請求項８４および９１～９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項96】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーが、前記ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して３／４、または４／４未満の一致を有する、請求項８４および９１～９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項97】
前記少なくとも２人のＴ細胞ドナーの各々が、Ａ＊０２またはＡ＊２４対立遺伝子を有する、請求項６５～９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項98】
ステップ（ｉ）において、前記初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞が、１つまたは複数の凍結保存物から得られる、請求項６５～９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項99】
ステップ（ｉ）において、前記初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーの凍結していない末梢血単核細胞から得られる、請求項６５～９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項100】
前記末梢血単核細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
患者を処置する方法であって、請求項１～６３のいずれか一項に記載のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞、または請求項６４に記載の医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項102】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の凍結浮遊液を融解する事前のステップをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、前記患者における病原性のＴ細胞応答を防止するかまたはその重症度を低減する、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、炎症を低減させるか、または免疫寛容を増強する、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項105】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、組織修復を増強する、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項106】
単核細胞を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１０１～１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項107】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物および前記単核細胞が同時に投与される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項108】
前記単核細胞が、前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに投与される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項109】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、ＨＳＣドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１０１～１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項110】
前記ＨＳＣドナーが、前記患者に対して部分的にＨＬＡ不一致である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項111】
前記ＨＳＣドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で前記患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０または１０／１０未満の一致を有する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項112】
前記ＨＳＣドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で前記患者に対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項113】
前記ＨＳＣドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で前記患者に対して２／２未満の一致を有する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項114】
前記ＨＳＣドナーが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で前記患者に対して３／４または４／４未満の一致を有する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項115】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、前記患者に対してＨＬＡ不一致であるかまたは部分的にＨＬＡ不一致である、請求項１０１～１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項116】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で前記患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０または１０／１０未満の一致を有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項117】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で前記患者に対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項118】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で前記患者に対して２／２未満の一致を有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項119】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で前記患者に対して２／４、３／４または４／４未満の一致を有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項120】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、前記ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致であるか、または部分的にＨＬＡ不一致である、請求項１０１～１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項121】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で前記ＨＳＣドナーに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０または１０／１０未満の一致を有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項122】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で前記ＨＳＣドナーに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項123】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で前記ＨＳＣドナーに対して２／２未満の一致を有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項124】
前記Ｔ細胞ドナーの１人または複数が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で前記ＨＳＣドナーに対して３／４または４／４未満の一致を有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項125】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、前記移植された造血幹細胞によるＧｖＨＤを防止するかまたはその重症度を低減させる、請求項１０１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項126】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、前記移植された造血細胞からのリンパ系細胞の病原性の応答を防止するかまたはその重症度を低減させる、請求項１０９～１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項127】
前記患者が、腫瘍性細胞を有する、請求項１０１～１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項128】
前記腫瘍性細胞が、ＣＤ１３、ＨＬＡ－クラスＩ、およびＣＤ５４を発現する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項129】
前記腫瘍性細胞が、ＣＤ１１２、ＣＤ５８、またはＣＤ１５５を発現する、請求項１２７～１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項130】
前記患者が、がんを有し、任意選択で、前記がんが固形または血液の腫瘍（neoplasm）である、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項131】
前記患者が、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、男性乳がん、原発不明がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭下咽頭がん、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、骨髄肉腫および皮膚白血病を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、口腔中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん、皮膚がん－基底細胞および扁平上皮、皮膚がん－黒色腫、皮膚がん－メルケル細胞、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんを有する、請求項１０１～１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項132】
前記患者が、骨髄系のがんを有する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項133】
前記患者が、ＡＭＬまたはＣＭＬを有する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項134】
前記患者が、炎症疾患または自己免疫疾患を有する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項135】
前記炎症または自己免疫疾患が、１型糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、自己免疫性肝炎、白斑、円形脱毛症、リウマチ性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性狼瘡、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーヴス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、水疱疾患、強皮症、およびセリアック病からなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項136】
前記炎症疾患または自己免疫疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、１型糖尿病、狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、またはリウマチ性関節炎である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項137】
前記患者が、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性を伴う疾患または障害を有する、請求項１０１～１２９または１３４～１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項138】
前記患者が、２型糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、または炎症性腸疾患を有する、請求項１０１～１２９、または１３４～１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項139】
前記患者が、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１β産生の増加を伴う疾患または障害を有する、請求項１０１～１２９または１３４～１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項140】
前記患者が、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１８産生の増加を伴う疾患または障害を有する、請求項１０１～１２９または１３４～１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項141】
前記患者が、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞による成熟カスパーゼ－１産生の増加を伴う疾患または障害を有する、請求項１０１～１２９または１３４～１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項142】
前記患者が、アレルギー性またはアトピー性疾患を有する、請求項１０１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項143】
前記アレルギー性またはアトピー性疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、および鼻炎からなる群から選択される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
前記患者が、食物アレルギーを有する、請求項１０１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項145】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞集団または前記医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、前記患者に臓器移植を行うステップをさらに含む、請求項１０１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項146】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、前記臓器移植の宿主拒絶を防止するかまたはその重症度を低減させる、請求項１４５に記載の方法。
【請求項147】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞集団または前記医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、ｉＰＳ細胞由来細胞または組織を前記患者に移植するステップをさらに含む、請求項１０１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項148】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、前記細胞移植の宿主拒絶を防止するかまたはその重症度を低減させる、請求項１４７に記載の方法。
【請求項149】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、組換えＡＡＶを前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１０１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項150】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または前記医薬組成物が、前記組換えＡＡＶに対する免疫応答を低減させる、請求項１４９に記載の方法。
【請求項151】
前記ＣＤ４ＩＬ－１０／ＣＡＲ細胞、前記ＣＤ４ＩＬ－１０／ＣＡＲ細胞集団、または前記医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、免疫原性治療タンパク質を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項152】
前記ＣＤ４ＩＬ－１０／ＣＡＲ細胞、前記ＣＤ４ＩＬ－１０／ＣＡＲ細胞集団、または前記医薬組成物が、免疫原性治療タンパク質に対する免疫応答を低減させる、請求項１５１に記載の方法。
【請求項153】
前記免疫原性治療タンパク質が、治療抗体、第ＶＩＩＩ因子置換、サイトカイン、およびサイトカイン変異タンパク質から選択される、請求項１５１または１５２に記載の方法。
【請求項154】
前記患者が、ウイルスまたは細菌感染症に対して過剰な免疫応答を有する、請求項１０１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項155】
前記患者がコロナウイルス感染症を有する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項156】
前記患者が、臓器および／または組織損傷を有する、請求項１４９または１５５に記載の方法。
【請求項157】
前記患者から得た生物試料中の前記選択マーカーを検出し、それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の存在または非存在を検出するステップをさらに含む、請求項１０１～１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項158】
前記生物試料が、前記患者からの生検または血液である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項159】
悪性疾患を有する患者を処置する方法であって、アロ－ＨＳＣＴを前記患者に投与すること、および
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療有効量を投与すること
を含む方法。
【請求項160】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞中のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のドナーがいずれも、ＨＳＣＴのドナーではない、請求項１５９に記載の方法。
【請求項161】
血液がんを処置する方法であって、血液がん患者に、抗がん効果を誘導するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与することを含み、
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、方法。
【請求項162】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与前または投与後にアロＨＳＣＴを前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項163】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の前記量が、アロＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するためにさらに十分である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項164】
前記血液がんが、骨髄性白血病である、請求項１６１～１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項165】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ１３を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項166】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＨＬＡ－クラスＩを発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項167】
前記骨髄性白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１６１～１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項168】
前記アロ－ＨＳＣＴが、レシピエントに関して血縁または非血縁のドナーから得られる、請求項１６１～１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項169】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記レシピエントに対して非自己である、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項170】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記レシピエントに対して同種である、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項171】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主への投与前に宿主アロ抗原に対してアネルギー化されない、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項172】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＴｒ１様細胞である、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項173】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が多クローン性である、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項174】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が多クローン性であり、前記レシピエントに対して非自己である、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項175】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人のドナーから単離された後に遺伝子改変される、請求項１６１～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項176】
前記少なくとも２人のドナーがいずれもアロ－ＨＳＣＴドナーと同じではない、請求項１７０に記載の方法。
【請求項177】
前記アロ－ＨＳＣＴが、前記レシピエントに関して一致または不一致のドナーから得られる、請求項１６１～１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項178】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ５４を発現する細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項179】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＨＬＡ－クラスＩおよびＣＤ５４を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項180】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ１１２を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項181】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ５８を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項182】
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記宿主におけるがん細胞を標的とし、かつ殺滅する、請求項１６１～１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項183】
同種造血幹細胞移植（アロ－ＨＳＣＴ）によって血液がんを処置する方法であって、アロ－ＨＳＣＴを対象に投与すること；
前記アロ－ＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を前記対象に投与すること
を含み、
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記対象に対して非自己であり、アロ－ＨＳＣＴドナーに対して非自己であり；
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記対象に投与される前に対象のアロ抗原に対してアネルギー化されず；および
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、多クローン性であり、Ｔｒ１様である、
方法。
【請求項184】
前記アロ－ＨＳＣＴが、前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与後に投与される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項185】
前記アロ－ＨＳＣＴが、前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与前に投与される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項186】
同種造血幹細胞移植（アロ－ＨＳＣＴ）によって血液がんを処置する方法であって、アロ－ＨＳＣＴを対象に投与すること；
前記アロ－ＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を前記対象に投与すること
を含み、
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記対象におけるがん細胞を標的とし、かつ殺滅し、
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記対象に投与される前に対象のアロ抗原に対してアネルギー化されず、および
前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記対象に対して非自己であり、多クローン性であり、Ｔｒ１様である、
方法。
【請求項187】
前記アロ－ＨＳＣＴが、前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与後に投与される、請求項１８６に記載の方法。
【請求項188】
前記アロ－ＨＳＣＴが、前記ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与前に投与される、請求項１８６に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２９５，３８９号明細書の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２９５，３８９号明細書の利益を主張する。
【0002】
２．配列表
本出願は、ＸＭＬフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＸＭＬコピーは、２０２２年１２月２３日に作成され、名称は３７１０４－４９８３５Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌであり、サイズは、３０．７キロバイト（ＫＢ）である。
本出願は、ＸＭＬフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＸＭＬコピーは、２０２２年１２月２３日に作成され、名称は３７１０４－４９８３５Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌであり、サイズは、３０．７キロバイト（ＫＢ）である。
【背景技術】
【0003】
３．背景
制御性Ｔ細胞は、自己抗原および非病原性抗原に対する免疫寛容を維持し、免疫系の恒常性を維持する小さいが重要なＴ細胞サブセットに属する。制御性Ｔ細胞には２つの主要な集団、すなわちＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋ ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＦＯＸＰ３＋細胞）および１型制御性Ｔ（Ｔｒ１）細胞が存在する。ＦＯＸＰ３＋およびＴｒ１細胞はいずれも、様々な前臨床の臓器および膵島移植モデル、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、ならびに様々な自己免疫および炎症疾患において病原性のＴ細胞応答を下方調節する。
制御性Ｔ細胞は、自己抗原および非病原性抗原に対する免疫寛容を維持し、免疫系の恒常性を維持する小さいが重要なＴ細胞サブセットに属する。制御性Ｔ細胞には２つの主要な集団、すなわちＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋ ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＦＯＸＰ３＋細胞）および１型制御性Ｔ（Ｔｒ１）細胞が存在する。ＦＯＸＰ３＋およびＴｒ１細胞はいずれも、様々な前臨床の臓器および膵島移植モデル、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、ならびに様々な自己免疫および炎症疾患において病原性のＴ細胞応答を下方調節する。
【0004】
Ｔｒ１細胞は、臨床試験において有効であることが示されている。クローン化した抗原特異的な自己Ｔｒ１細胞を、進行中の中等度から重度クローン病を有する患者に投与すると、客観的な一過性の寛解をもたらした（Desreumaux et al., Gastroenterology. 2012;143(5):1207-1217.e2.）。加えて、Ｔｒ１細胞に関して濃縮したドナー由来アロ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、同種造血幹細胞移植（アロ－ＨＳＣＴ）後の白血病患者に養子移入すると、重度のＧｖＨＤを引き起こすことなく、免疫系の迅速な再構成ならびに微生物およびウイルス感染症に対する保護をもたらした。レスポンダーの患者では、治癒をもたらす長期間の寛解および寛容（＞７年）が達成された（Bacchetta et al., Front Immunol. 2014; 5:16）。
【0005】
これらの勇気づけられる結果にもかかわらず、アンメットメディカルニーズが高い患者に関する大規模治療のためのドナー由来または自己Ｔｒ１細胞の産生は、必ずしも実現可能ではなく、非常に面倒であり、純粋なＴｒ１細胞を大量に生成することは可能ではない。
【0006】
最近、Ｌｏｃａｆａｒｏと共同研究者は、単一ドナーからの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ヒトＩＬ－１０遺伝子を含有する双方向性レンチウイルスベクターを形質導入することによってこれらの問題の一部を回避した。得られた単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０集団は、天然に存在するＴｒ１細胞の主な機能を共有した。Ｔｒ１細胞と同様に、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０を産生し、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞および同種ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖を下方調節する。加えて、それらは、正常な骨髄系細胞（抗原提示細胞、ＡＰＣを含む）および骨髄性白血病細胞の両方に対して細胞傷害性である。ヒト化ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤモデルでは、これらの単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、移植片対白血病（ＧｖＬ）活性を保持しながら、ヒト化ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤモデルにおけるＧｖＨＤの低減において有効であることが示された。Locafaro et al. Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269および国際公開第２０１６／１４６，５４２号パンフレットを参照されたい。
【0007】
治療的使用のために高度精製された単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生することは可能であるが、依然として顕著な制約があり、その理由は、様々な個々のバッチ間での定性的および定量的な差のためであり、それらは、バフィーコートの品質の変動に加えて様々なドナー間の固有の差に関連する可能性が最も高い。
【発明の概要】
【0008】
４．概要
本開示は、ポリドナー（polydonor）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を使用する新規Ｔｒ１ベースの治療を提供する。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた後、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を指す。Ｔ細胞ドナーは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって処置される宿主ではなく、ＨＳＣまたは臓器移植ドナーでもない第三者のドナーである。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、アロ抗原特異的ではなく、すなわち、それらは、投与前に宿主からの細胞によってプライミングまたは刺激されていない。
本開示は、ポリドナー（polydonor）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を使用する新規Ｔｒ１ベースの治療を提供する。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた後、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を指す。Ｔ細胞ドナーは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって処置される宿主ではなく、ＨＳＣまたは臓器移植ドナーでもない第三者のドナーである。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、アロ抗原特異的ではなく、すなわち、それらは、投与前に宿主からの細胞によってプライミングまたは刺激されていない。
【0009】
本出願人は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞と同等のサイトカイン産生プロファイル、免疫抑制能および細胞傷害能を有することを実証した。加えて、ｉｎ ｖｉｖｏで、それらは、単独でＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されるｘｅｎｏ ＧｖＨＤの防止において、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞より有効である。全体としてこれらのポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における機能的特性は、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の特性と同等であるかまたはそれより良好であった。
【0010】
これらの結果に基づき、本出願人は、ポリドナー同種（allogeneic）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、ＧｖＨＤ、細胞および臓器移植、自己免疫疾患および炎症疾患における治療目的のために使用することができると主張する。
【0011】
さらに、第三者のＴ細胞を使用することおよびアロ特異性の要件を排除することによって、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、Ｔｒ１ベースの細胞治療を、様々な遺伝的背景を有する患者のより大きい集団に利用可能にする。
【0012】
したがって、第１の態様では、本開示は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞集団であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた（ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を提供する。
【0013】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られた。一部の実施形態では、集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞は集合的に、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれより多くの異なるＨＬＡハプロタイプを有する。
【0014】
一部の実施形態では、集団における全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０の一致を有する。一部の実施形態では、集団における全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して少なくとも１／８、２／８、３／８、４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも３／４または４／４の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、Ａ＊０２またはＡ＊２４対立遺伝子を有する。
【0015】
一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団における全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0016】
一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して一致を有しない。一部の実施形態では、集団における全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して一致を有しない。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して一致を有しない。一部の実施形態では、集団における全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して一致を有しない。一部の実施形態では、集団における全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して一致を有しない。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して一致を有しない。
【0017】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はいずれも不死化されていない。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１０コード（encoding）ポリヌクレオチドセグメントを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１０はヒトＩＬ－１０である。一部の実施形態では、ＩＬ－１０はウイルスＩＬ－１０である。一部の実施形態では、ＩＬ－１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸修飾を有するヒトＩＬ－１０の配列を有するヒトＩＬ－１０のバリアントである。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸修飾は、対応するアミノ酸位置でウイルスＩＬ－１０のアミノ酸（複数可）との置換である。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１０のバリアントは、配列番号８または９の配列を有する。
【0018】
一部の実施形態では、ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２の配列を有する。一部の実施形態では、発現制御エレメントは、コードされるＩＬ－１０の構成的発現を駆動する。一部の実施形態では、発現制御エレメントは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の発現を駆動する。一部の実施形態では、発現制御エレメントは、組織特異的またはＣＤ４＋Ｔ細胞特異的発現を駆動する。
【0019】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、ΔＮＧＦＲである。一部の実施形態では、ΔＮＧＦＲは、配列番号３の配列を有する。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を含む。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５の配列を有する。
【0020】
一部の実施形態では、選択マーカーは、切断型ＥＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、選択マーカーは、切断型ヒトＥＧＦＲポリペプチドである。
【0021】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれている。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれていない。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター配列をさらに含む。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれていない。
【0022】
一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％、９８％または９９％が、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、選択マーカーはΔＮＧＦＲである。一部の実施形態では、ＩＬ－１０の発現レベルは、選択マーカーの発現レベルと線形に相関する。場合によっては、ＩＬ－１０発現レベルを、選択マーカーの発現レベルによって決定することができる。
【0023】
一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬ培養培地あたり少なくとも１００ｐｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬあたり少なくとも２００ｐｇ、５００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、または５０ｎｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による活性化後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬあたり少なくとも１または２ｎｇのＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による活性化後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬあたり少なくとも２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または５００ｎｇのＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より少なくとも５倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より少なくとも１０倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。
【0024】
一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、外因性ポリヌクレオチドからの選択マーカーを発現する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が、外因性ポリヌクレオチドからの選択マーカーを発現する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％、９８％または９９％が、外因性ポリヌクレオチドからの選択マーカーを発現する。
【0025】
一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４９ｂを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＬＡＧ－３を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、グランザイムＢ（ＧｚＢ）を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、パーフォリンを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ１８を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２２６を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ－２２を発現する。
【0026】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、宿主からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でアネルギー化（anergized）されていない。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、組換えＩＬ－１０タンパク質の存在下でアネルギー化されておらず、組換えＩＬ－１０タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されない。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、宿主からのＤＣ１０細胞の存在下でアネルギー化されていない。
【0027】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、凍結浮遊液（suspension）中に存在する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、液体浮遊液中に存在する。一部の実施形態では、液体浮遊液は、事前に凍結されている。
【0028】
別の態様では、本開示は、
（ｉ）本明細書に記載されるＣＤ４＋Ｔ細胞集団；および
（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を浮遊させた薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物を提供する。
（ｉ）本明細書に記載されるＣＤ４＋Ｔ細胞集団；および
（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を浮遊させた薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物を提供する。
【0029】
なお別の態様では、本開示は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、
（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得た初代培養（primary）ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールするステップ；および
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、プールしたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ
を含む方法を提供する。
（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得た初代培養（primary）ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールするステップ；および
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、プールしたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ
を含む方法を提供する。
【0030】
一態様では、本開示は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、
（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ；および
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を個別に改変するステップ、次に
（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ
を含む方法を提供する。
（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ；および
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を個別に改変するステップ、次に
（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ
を含む方法を提供する。
【0031】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の後でステップ（ｉｉ）の前、ステップ（ｉｉ）の後、ステップ（ｉｉ）の後でステップ（ｉｉｉ）の前、またはステップ（ｉｉｉ）の後に、
初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズ（anti-CD3 antibody and CD28 antibody coated beads）の存在下でインキュベートするステップ
をさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で培養されている。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で培養されている。
初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズ（anti-CD3 antibody and CD28 antibody coated beads）の存在下でインキュベートするステップ
をさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で培養されている。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で培養されている。
【0032】
一部の実施形態では、方法は、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をさらにＩＬ－２の存在下でインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを使用して初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、キメラウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメント（IL-10-encoding polynucleotide segment）は、配列番号２の配列を有する。
【0033】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードするセグメントをさらに含む。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーはΔＮＧＦＲである。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、配列番号３の配列を有する。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、切断型ＥＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、切断型ヒトＥＧＦＲポリペプチドである。
【0034】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉｉ）の後に、
選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団を生成するステップをさらに含む。
選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団を生成するステップをさらに含む。
【0035】
一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％、９５％、または９８％が、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、選択マーカーを発現する。一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％、９５％、または９８％が、選択マーカーを発現する。
【0036】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップは、ＩＬ－２の存在下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下で実施される。
【0037】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を凍結する後のステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくともｌ／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して少なくとも１／８、２／８、３／８、４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも３／４または４／４の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーの各々は、Ａ＊０２またはＡ＊２４対立遺伝子を有する。
【0038】
一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0039】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１つまたは複数の凍結保存物（stock）から得られる。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーの凍結していない末梢血単核細胞から得られる。
【0040】
一部の実施形態では、方法は、末梢血単核細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、末梢血単核細胞は、バフィーコートまたはアフェレーシスから得られる。
【0041】
別の態様では、本開示は、患者を処置する方法であって、
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または本開示の医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与するステップ
を含む方法を提供する。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または本開示の医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与するステップ
を含む方法を提供する。
【0042】
一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の凍結浮遊液を融解する事前のステップをさらに含む。
【0043】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、患者における病原性のＴ細胞応答を防止するかまたはその重症度を低減する。
【0044】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、炎症応答または自己免疫応答を防止するかまたはその重症度を低減する。
【0045】
一部の実施形態では、方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）ドナーからの単核細胞を患者に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物およびＨＳＣドナーからの単核細胞は、同時に投与される。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーからの単核細胞は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに投与される。一部の実施形態では、単核細胞は、ＰＢＭＣ中に存在する。一部の実施形態では、単核細胞は、骨髄中に存在する。一部の実施形態では、単核細胞は、臍帯血中に存在する。一部の実施形態では、単核細胞は、ＰＢＭＣ、骨髄、または臍帯血から単離されている。
【0046】
一部の実施形態では、方法は、
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者にＨＳＣドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップ、
をさらに含む。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者にＨＳＣドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップ、
をさらに含む。
【0047】
一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で患者に対して４／８、５／８，６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で患者に対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0048】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、患者に対してＨＬＡ不一致または部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で患者に対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で患者に対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して２／４、３／４または４／４未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致であるか、または部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座でＨＳＣドナーに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座でＨＳＣドナーに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座でＨＳＣドナーに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座でＨＳＣドナーに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0049】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、移植された造血幹細胞によるＧｖＨＤを防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0050】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、移植された造血幹細胞集団に存在するリンパ系細胞の病原性の応答を防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0051】
一部の実施形態では、患者はがんを有する。一部の実施形態では、患者は、腫瘍性（neoplastic）細胞を有する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞は、ＣＤ１３、ＨＬＡ－クラスＩおよびＣＤ５４を発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞は、ＣＤ１１２、ＣＤ５８、またはＣＤ１５５を発現する。
【0052】
一部の実施形態では、患者はがんを有する。一部の実施形態では、がんは固形または血液の腫瘍（neoplasm）である。一部の実施形態では、患者は、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、男性乳がん、原発不明がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭下咽頭がん、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、骨髄肉腫および皮膚白血病を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、口腔中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん、皮膚がん－基底細胞および扁平細胞、皮膚がん－黒色腫、皮膚がん－メルケル細胞、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんを有する。
【0053】
一部の実施形態では、がんは、骨髄系のがんである。一部の実施形態では、がんは、ＡＭＬまたはＣＭＬである。
【0054】
一部の実施形態では、患者は、炎症疾患または自己免疫疾患を有する。一部の実施形態では、炎症疾患または自己免疫疾患は、１型糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、自己免疫性肝炎、白斑、円形脱毛症、リウマチ性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーヴス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、水疱疾患、強皮症、クローン病、およびセリアック病からなる群から選択される。
【0055】
一部の実施形態では、炎症疾患または自己免疫疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、１型糖尿病、狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、またはリウマチ性関節炎である。
【0056】
一部の実施形態では、患者は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性を伴う疾患または障害を有する。一部の実施形態では、患者は、２型糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、または炎症性腸疾患を有する。
【0057】
一部の実施形態では、患者は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１β産生の増加を伴う疾患または障害を有する。
【0058】
一部の実施形態では、患者は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１８産生の増加を伴う疾患または障害を有する。
【0059】
一部の実施形態では、患者は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞による成熟カスパーゼ－１産生の増加を伴う疾患または障害を有する。
【0060】
一部の実施形態では、患者は、アレルギー性またはアトピー性疾患を有する。一部の実施形態では、アレルギー性またはアトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、および鼻炎からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、食物アレルギーを有する。
【0061】
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者に細胞および臓器移植を行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、細胞および臓器移植の宿主拒絶を防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0062】
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者にｉＰＳ細胞由来細胞または組織を移植するステップをさらに含む。
【0063】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、移植片の宿主拒絶を防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0064】
一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、麻疹ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ポックスウイルス、またはピコルナウイルスを患者に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、麻疹ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ポックスウイルス、またはピコルナウイルスに対する免疫応答を低減させる。
【0065】
一部の実施形態では、患者は、ウイルスまたは細菌感染症に対して過剰な免疫応答を有する。一部の実施形態では、患者は、コロナウイルス感染症を有する。一部の実施形態では、患者は、臓器および／または組織の損傷を有する。
【0066】
一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者に免疫原性治療タンパク質を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団または医薬組成物は、免疫原性治療タンパク質に対する免疫応答を低減させる。一部の実施形態では、免疫原性治療タンパク質は、治療抗体、第ＶＩＩＩ因子置換、サイトカイン、およびサイトカイン変異タンパク質から選択される。
【0067】
一部の実施形態では、方法は、患者から得た生物試料中の選択マーカーを検出し、それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の存在または非存在を検出するステップをさらに含む。一部の実施形態では、生物試料は、患者からの生検または血液である。
【0068】
一態様では、本開示は、悪性疾患を有する患者を処置する方法であって、アロ（allo）－ＨＳＣＴを患者に投与すること、およびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、アロ－ＨＳＣＴは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与前に投与される。一部の実施形態では、アロ－ＨＳＣＴは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与後に投与される。
【0069】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞中のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のドナーのいずれも、ＨＳＣＴのドナーではない。
【0070】
別の態様では、本開示は、血液がんを処置する方法であって、血液がん患者に、抗がん効果を誘導するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与することを含み、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られており、その後構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、方法を提供する。
【0071】
一部の実施形態では、血液がんを処置する方法は、抗がん効果を誘導するために十分である、投与されたポリドナーＣＤ４＋Ｔ細胞が、個々のドナーから得られており、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって最初に個別に遺伝子改変されており、その後プールされるステップを含む。
【0072】
一部の実施形態では、血液がんを処置する方法は、抗がん効果を誘導するために十分である、投与されたポリドナーＣＤ４＋Ｔ細胞が、最初にプールされた個々のドナーから得られており、その後プールが、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されるステップを含む。
【0073】
一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与前または投与後に患者にアロ－ＨＳＣＴを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の量は、アロＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するためにさらに十分である。
【0074】
一部の実施形態では、血液がんは、骨髄性白血病である。
【0075】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ１３を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＨＬＡ－クラスＩを発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する。一部の実施形態では、骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【0076】
一部の実施形態では、アロ－ＨＳＣＴは、レシピエントに関して血縁または非血縁のドナーから得られる。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、レシピエントに対して非自己（non-autologous）である。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、レシピエントに対して同種（allogeneic）である。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、宿主に投与する前に宿主アロ抗原に対してアネルギー化されない。
【0077】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、Ｔｒ１様細胞である。
【0078】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、多クローン性である。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、多クローン性であり、レシピエントに対して非自己である。
【0079】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、少なくとも２人のドナーから単離された後に遺伝子改変される。一部の実施形態では、少なくとも２人のドナーのいずれも、アロ－ＨＳＣＴドナーと同じドナーではない。一部の実施形態では、アロＨＳＣＴは、レシピエントに関して一致または不一致のドナーから得られる。
【0080】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ５４を発現する細胞を標的とし、かつ殺滅する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＨＬＡ－クラスＩおよびＣＤ５４を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ１１２を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ５８を発現するがん細胞を標的とし、かつ殺滅する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、宿主におけるがん細胞を標的とし、かつ殺滅する。
【0081】
本開示の一態様は、同種造血幹細胞移植（アロ－ＨＳＣＴ）によって血液がんを処置する方法であって、
アロ－ＨＳＣＴを対象（宿主）に投与すること；
アロ－ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を宿主に投与すること
を含み、
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主に対して非自己であり、アロ－ＨＳＣＴドナーに対して非自己であり；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主に投与される前に宿主アロ抗原に対してアネルギー化されず；および
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、多クローン性であり、Ｔｒ１様である、
方法を提供する。
アロ－ＨＳＣＴを対象（宿主）に投与すること；
アロ－ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を宿主に投与すること
を含み、
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的または誘導型プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主に対して非自己であり、アロ－ＨＳＣＴドナーに対して非自己であり；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主に投与される前に宿主アロ抗原に対してアネルギー化されず；および
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、多クローン性であり、Ｔｒ１様である、
方法を提供する。
【0082】
一部の実施形態では、アロ－ＨＳＣＴは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与前に投与される。一部の実施形態では、アロ－ＨＳＣＴは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与後に投与される。
【0083】
本開示の別の態様は、同種造血幹細胞移植（アロ－ＨＳＣＴ）によって血液がんを処置する方法であって、
アロ－ＨＳＣＴを対象（宿主）に投与すること；
アロ－ＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を宿主に投与すること；
を含み、
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が宿主におけるがん細胞を標的とし、かつ殺滅し；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主への投与前に宿主アロ抗原に対してアネルギー化されず；および
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が全て、宿主に対して非自己であり、多クローン性であり、Ｔｒ１様である、
方法を提供する。
アロ－ＨＳＣＴを対象（宿主）に投与すること；
アロ－ＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）または移植片対腫瘍（ＧｖＴ）有効性を抑制することなく、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制または防止するために十分な量のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を宿主に投与すること；
を含み、
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が宿主におけるがん細胞を標的とし、かつ殺滅し；
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主への投与前に宿主アロ抗原に対してアネルギー化されず；および
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が全て、宿主に対して非自己であり、多クローン性であり、Ｔｒ１様である、
方法を提供する。
【0084】
本開示の別の態様は、ＩＬ－１０がウイルスＩＬ－１０である、単一ドナーまたは複数のドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を提供する。ウイルスＩＬ－１０は、配列番号６、１９、２０、または２１の配列を有する。一部の実施形態では、ウイルスＩＬ－１０は、配列番号７の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、ＩＬ－１０は、ヒトＩＬ－１０からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸がウイルスＩＬ－１０からの対応するアミノ酸配列によって交換されているヒトＩＬ－１０である。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、構成的プロモーターの制御下で外因性のウイルスＩＬ－１０を形質導入される。一部の実施形態では、発現制御エレメントは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞においてウイルスＩＬ－１０の発現を駆動する。一部の実施形態では、ウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれている。一部の実施形態では、ウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれていない。一部の実施形態では、ウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７の配列を有する。
【0085】
本開示の別の態様は、単一ドナーまたは複数のドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞であって、ＩＬ－１０が、マウス（配列番号１０）、ラット（配列番号１１）、アカゲザル（Macaca mulatta）（ＭＡＣＭＵ）（配列番号１２）、ゴリラ（配列番号１３）、カニクイザル（ＣＹＮＯ）（配列番号１４）、アヌビスヒヒ（配列番号１５）、ボノボ（配列番号１６）、チンパンジー（配列番号１７）、またはＥＢＶＢ９（配列番号１８）のＩＬ－１０であるＣＤ４ＩＬ－１０細胞を提供する。一部の実施形態では、ＩＬ－１０は、マウス（配列番号１０）、ラット（配列番号１１）、アカゲザル（Macaca mulatta）（ＭＡＣＭＵ）（配列番号１２）、ゴリラ（配列番号１３）、カニクイザル（ＣＹＮＯ）（配列番号１４）、アヌビスヒヒ（配列番号１５）、ボノボ（配列番号１６）、チンパンジー（配列番号１７）、またはＥＢＶＢ９（配列番号１８）のＩＬ－１０と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有するタンパク質である。
【0086】
本開示の別の態様は、ＩＬ－１０がヒトＩＬ－１０のバリアントである、単一ドナーまたは複数のドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を提供する。ヒトＩＬ－１０のバリアントは、配列番号１９または配列番号２０の配列を有する。一部の実施形態では、ＩＬ－１０は、ヒトＩＬ－１０の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が、別の種のＩＬ－１０（例えば、マウス（配列番号１０）、ラット（配列番号１１）、アカゲザル（Macaca mulatta）（ＭＡＣＭＵ）（配列番号１２）、ゴリラ（配列番号１３）、カニクイザル（ＣＹＮＯ）（配列番号１４）、アヌビスヒヒ（配列番号１５）、ボノボ（配列番号１６）、チンパンジー（配列番号１７）、またはＥＢＶＢ９（配列番号１８）のＩＬ－１０）からの対応するアミノ酸配列によって交換されているヒトＩＬ－１０である。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、構成的プロモーターの制御下で外因性のＩＬ－１０バリアントを形質導入されている。一部の実施形態では、発現制御エレメントは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＬ－１０バリアントの発現を駆動する。一部の実施形態では、ＩＬ－１０バリアントをコードする外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれている。一部の実施形態では、ＩＬ－１０バリアントをコードする外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれていない。
【0087】
なお別の態様では、本開示は、ウイルスＩＬ－１０ ＣＤ４ＩＬ－１０を作製する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）単一のＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ；および
（ｉｉ）ウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を改変し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ
を含む方法を提供する。
（ｉ）単一のＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ；および
（ｉｉ）ウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を改変し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ
を含む方法を提供する。
【0088】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の後またはステップ（ｉｉ）の後に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下で初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートするステップをさらに含む。
【0089】
一部の実施形態では、方法は、さらにＩＬ－２の存在下で初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ベクターを使用してウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチド。
【0090】
一部の実施形態では、ウイルスＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードするセグメントを含む。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、ΔＮＧＦＲである。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、配列番号３の配列を有する。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、切断型ＥＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、切断型ヒトＥＧＦＲポリペプチドである。
【0091】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉｉ）の後に、選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団を生成するステップをさらに含む。
【0092】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップは、ＩＬ－２の存在下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下で実施される。
【0093】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、凍結保存物から得られる。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、単一Ｔ細胞ドナーの凍結していない末梢血単核細胞から得られる。
【0094】
一部の実施形態では、方法は、末梢血単核細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、末梢血単核細胞は、バフィーコートまたはアフェレーシスから得られる。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】図１は、ヒトＩＬ－１０およびΔＮＧＦＲコード配列を複数のドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞に送達して、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生するための双方向性レンチウイルスベクターの構造の非限定的な例証である。
【図2】図２は、ヒトＩＬ－１０およびΔＮＧＦＲコード配列を、複数のドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞に送達してポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生するためのレンチウイルスベクターを生成するための双方向性レンチウイルスベクターの完全な環状構造を例証する。
【図4-A】図４Ａは、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ（ヒトＩＬ－１０およびヒトＮＧＦ受容体の切断型をコードする双方向性レンチウイルスベクター）を形質導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞のパーセンテージ（平均値±ＳＤ、ｎ＝１０、左の灰色の棒グラフ）およびベクターコピー数（ＶＣＮ、平均値±ＳＤ、ｎ＝１０、右の灰色の棒グラフ）を示す。図４Ｂは、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲを形質導入し、抗ＣＤ２７１マイクロビーズを使用して精製した２人の代表的なドナー（ドナーＢおよびドナーＣ）からのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４およびΔＮＧＦＲの発現のＦＡＣＳ解析を示す。
【図5】図５は、２回目（ＴＦ２）および３回目（ＴＧ３）の再刺激後の単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを示す。ＴＦ２（左のパネル）およびＴＦ３（右のパネル）のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、非刺激のままとしたか（矢印によって示す）、または固定ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）によって４８時間刺激した。培養上清を収集し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。全ての試料を、三連で試験した。試験したｎ＝８ドナーの平均値±ＳＤを表す。
【図6】図６Ａは、ＦＡＣＳによって解析した、第２ラウンドの刺激（ＴＦ２）後にグランザイムＢ（ＧｚＢ）を発現するＣＤ４ＩＬ－１０細胞のパーセンテージを示す。ｎ＝７人の異なる単一ドナーの箱ひげ図を示す。図６Ｂは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）をＫ５６２およびＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と１：１の比で３日間共培養（co-culture）した場合の％死細胞を示す。箱ひげ図は、ｎ＝４のドナーからのデータを表し、ドットは、単一ドナーからのデータを表す。
【図7-A】図７Ａおよび７Ｂは、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができることを示す。同種ＰＢＭＣ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の非存在下または存在下で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０３個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞に関してゲート設定後、フローサイトメトリーによってｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図７Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦからの結果を示し、図７Ｂは、ドナーＨ、ドナーＩおよびドナーＬからの結果を示す。増殖および抑制のパーセンテージを示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を、以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下でのレスポンダーの増殖／レスポンダー単独の増殖］×１００）。
【図8-A】図８Ａおよび８Ｂは、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、同種ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができることを示す。同種ＰＢＭＣ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の非存在下または存在下で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０３個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞に関してゲート設定後、フローサイトメトリーによってｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図８Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦからの結果を示し、および図８Ｂは、ドナーＨ、ドナーＩおよびドナーＬからの結果を示す。増殖および抑制のパーセンテージを示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を、以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下でのレスポンダーの増殖／レスポンダー単独の増殖］×１００）。
【図9】図９は、８人の個々のドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって産生された平均レベル（±ＳＤ）と比較した、３回目の再刺激（ＴＦ３）後のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを示す。３人のドナーからのＴＦ３ ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１：１の比でプールし、固定ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）によって４８時間刺激した。培養上清を収集し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２２レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ドットは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果であり；灰色のバーは、ｎ＝８の単一ドナーの平均値±ＳＤを表す。
【図10】図１０Ａは、プールを生成するために使用したｎ＝３の単一ドナーのＣＤ４ＩＬ－１０細胞によるグランザイムＢ発現の平均％レベル（±ＳＤ）と比較した、グランザイムＢ（ＧｚＢ）を発現するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のパーセンテージを示す。細胞を、３ラウンドの刺激（ＴＦ３）後にＦＡＣＳによって解析した。図１０Ｂは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）をＫ５６２およびＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と１：１の比で３日間共培養した場合の％死細胞を示す。残存白血病細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３－）を、各標的細胞に関してＦＡＣＳによって計数した。ドットは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０の結果であり、灰色のバーは、プールを生成するために使用したｎ＝３の単一ドナーの平均値±ＳＤを表す。
【図11-A】図１１Ａおよび１１Ｂは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができることを示している。同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の非存在下または存在下で、同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（１×１０４個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞およびＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞に関してゲート設定後、フローサイトメトリーによってｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図１１Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦからプールしたＣＤ４＋細胞を含有するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞からの結果を示す。図１１Ｂは、ドナーＨ、ドナーＩ、およびドナーＬからプールしたＣＤ４＋細胞を含有するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞からの結果を示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を、以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下でのレスポンダーの増殖／レスポンダー単独の増殖］×１００）。
【図13】図１３は、ＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）、ポリドナー（３人のドナー；ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個／マウス）、またはＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）をポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人のドナー；ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）（５×１０６個／マウス）と組み合わせて注射後の各々の日におけるＧｖＨＤを示さないＮＳＧマウスの％を示す。
【図14】図１４は、ＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）、ポリドナー（３人のドナー；（ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ））、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個／マウス）、またはＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）をポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人のドナー；（ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ））（５×１０６個／マウス）と組み合わせて注射したＮＳＧマウスにおけるＣＤ４ＩＬ－１０細胞の脾臓（左のパネル）、および骨髄（右のパネル）への遊走を示す。試験したｎ＝８の動物の箱ひげ図を示す。
【図15】図１５は、放射線照射後３日目に注射したＣＤ４＋Ｔ細胞およびポリドナー（ＢＣ－Ｈ／Ｉ／Ｌ）または単一ドナー（ＢＣ－Ｈ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によるＧｖＨＤの誘導を試験するためのプロトコールを例証する。
【図17-A】図１７Ａ～１７Ｃは、循環中の白血病細胞の低減および長期間の白血病無病（leukemia free）生存に基づいて試験した移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を示す。白血病を以前に記載されたように（Locafaro G. et al Molecular Therapy 2017）測定した。ＮＳＧマウスに致死量下の放射線を照射して、０日目に骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）（２．５×１０６個）を静脈内注射した。図１７Ａは、実験の例証である。図１７Ｂは、ＰＢＭＣ（２．５×１０６個）、または単一ドナー（ドナーＢＣ－ＩおよびドナーＢＣ－Ｈから）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を３日目に注射した動物の白血病無病生存率を示す。図１７Ｃは、ＰＢＭＣ（２．５×１０６個）またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ドナーＢＣ－ＩおよびドナーＢＣ－Ｈから）（２．５×１０６個）を３日目に注射した動物における白血病無病生存率を示す。
【図18-A】図１８Ａ～１８Ｃは、致死量下の放射線を照射し、ＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を０日目に静脈内注射したＮＳＧマウスにおいて測定した長期間の白血病無病生存率を示す。図１８Ａは、実験の例証である。図１８Ｂは、単核細胞（ＰＢＭＣ）（２．５×１０６）単独または単核細胞（ＰＢＭＣ）（２．５×１０６個）＋単一ドナー（ドナーＢＣ－ＨおよびドナーＢＣ－Ｉからの）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を３日目に注射した動物からのデータを示す。図１８Ｃは、単核細胞（ＰＢＭＣ）（２．５×１０６個）単独、または単核細胞（ＰＢＭＣ）（２．５×１０６）＋ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｉ／Ｈ）（２．５×１０６個）を３日目に注射した動物からのデータを示す。
【図19-A】図１９Ａ～１９Ｇは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によるＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化の阻害を示す。図１９Ａは、ＬＰＳ活性化単球によるＩＬ－１βの産生に及ぼす単一ドナー（＃１）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の効果を示す。図１９Ｂは、ＬＰＳ活性化単球によるＩＬ－１βの産生に及ぼす別の単一ドナー（＃２）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の効果を示す。図１９Ｃは、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化剤ニゲリシン（ＮＩＧ）によって増強されたＬＰＳ誘導ＩＬ－１β産生の阻害に及ぼす単一ドナー（＃１）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の効果を示す。図１９Ｄは、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化剤ニゲリシン（ＮＩＧ）によって増強されたＬＰＳ誘導ＩＬ－１β産生の阻害に及ぼす単一ドナー（＃２）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の効果を示す。図１９Ｅは、抗ＩＬ－１０受容体（抗ＩＬ－１０Ｒ）ｍＡｂの存在下または非存在下における単球によるＬＰＳ誘導ＩＬ－１β産生に及ぼす、単一ドナー（ＢＣ－Ｅ）および２人の異なるドナー（ＢＣ－Ｃ／Ｅ）からプールした細胞からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の効果を示す棒グラフである。図１９Ｆは、抗ＩＬ－１０Ｒ ｍＡｂの存在下または非存在下における単球によるＩＬ－１β産生に及ぼすポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｔ／Ｕ／Ｖ）上清の効果を示す。図１９Ｇは、抗ＩＬ－１０Ｒ ｍＡｂの存在下または非存在下でニゲリシンと組み合わせたＬＰＳによって誘導されたＩＬ－１８産生に及ぼすポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｔ／Ｕ／Ｖ）上清の効果を示す。
【図20】図２０は、移植片対骨髄性白血病およびｘｅｎｏ－ＧｖＨＤ効果を試験するための実験プロトコールを例証する。ＮＳＧマウスに、０日目にＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を静脈内注射した。３日目に、マウスを５群に分け、各群を（ｉ）対照としての細胞なし、（ｉｉ）同種単核細胞（ＰＢＭＣ）；（ｉｉｉ）同種ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅを１：１：１でプールしたもの）；（ｉｖ）同種ＰＢＭＣおよび単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｅ）；または（ｖ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）によって、図２０に表記の濃度で処置した。
【図21】図２１は、単一ドナー（ＢＣ－Ｖ、ＢＣ－Ｔ、ＢＣ－Ｖ、およびＢＣ－Ｅ）およびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＰＯＯＬ：ＢＣ－Ｅ、ＢＣ－ＶおよびＢＣ－Ｔを１：１：１でプールしたもの）のサイトカイン分泌プロファイルを描写する棒グラフである。
【図22】図２２は、同種ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に及ぼす単一ドナー（ＢＣ－ＶおよびＢＣ－Ｅ）およびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅのプール）の抑制効果を示す。同種ＰＢＭＣ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の非存在下または存在下で、同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（１×１０４個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、ＣＤ４＋ ΔＮＧＦＲ－（上）、またはＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－（下）Ｔ細胞に関してゲート設定後、フローサイトメトリーによってｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図２２は、単一ドナーＢＣ－ＶおよびＢＣ－Ｅ、ならびにドナーＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅからプールした細胞の結果を示す。増殖および抑制のパーセンテージを示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を、以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下でのレスポンダーの増殖／レスポンダー単独の増殖］×１００）。
【図23】図２３は、単一（ＢＣ－ＥおよびＢＣ－Ｖ）またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）と、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄腫瘍細胞またはＫ５６２細胞との共培養における生存細胞の％を示す。結果は、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄腫瘍細胞に対する単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の選択的細胞傷害効果を示すが、クラスＩ ＭＨＣ発現を欠如するＫ５６２細胞に対しては細胞傷害効果を示さない。
【図24】図２４は、０日目にＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を静脈内注射したＮＳＧマウスにおいて測定した白血病無病生存率を示す。３日目に、マウスを５群に分け、各群を（ｉ）対照としての細胞なし、（ｉｉ）同種単核細胞（ＰＢＭＣ）；（ｉｉｉ）同種ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／ＥＴ）；（ｉｖ）同種ＰＢＭＣおよび単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｅ）；または（ｖ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）によって処置した。グラフは、各群における動物の白血病無病生存率を示す。
【図25】図２５は、ＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）の注射後、続いて（ｉ）対照としての細胞なし；（ｉｉ）同種単核細胞（ＰＢＭＣ）；（ｉｉｉ）同種ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）；（ｉｖ）同種ＰＢＭＣおよび単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｅ）、または（ｖ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与を３日目に行った、各々の日におけるＧｖＨＤを示さないＮＳＧマウスの％を示す。
【図26】図２６は、２．５Ｅ＋０６のＰＢＭＣ（ドナーＣ、Ｅ、ＦおよびＨに対して同種）を投与したＮＳＧマウスが全て、急性の致死性ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤのために２２日目に死亡したことを示している。ＰＢＭＣと組み合わせた単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ロットＣ）またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ロットＣＥＦＨ）の投与はそれぞれ、マウスの７５％（３／４マウス）および８０％（４／５マウス）において致死性ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤの発症を防止した。これに対し、２．５Ｅ＋０６ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の導入は、ＧｖＨＤのいかなる徴候も誘導しなかった。まとめると、これらの結果は、４人の異なるドナーからのポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞より強力に、またはわずかに強力に病原性のヒトＴ細胞応答を抑制することを示している。ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞；ＧｖＨＤ：移植片対宿主病。
【図27-A】図２７Ａは、ヒト（配列番号１）、ハツカネズミ（Mus musculus）、「ＭＯＵＳＥ」（配列番号１０）；ドブネズミ（Rattus norvegicus）、「ＲＡＴ」（配列番号１１）；アカゲザル（Macaca mulatta）、「ＭＡＣＭＵ」（配列番号１２）；ニシゴリラ（Gorilla gorilla）、「ＧＯＲＩＬＬＡ」（配列番号１３）；カニクイザル（Macaca fascicularis）、「ＣＹＮＯ」（配列番号１４）；アヌビスヒヒ（Papio Anubis）、「ＯＬＩＶＥ ＢＡＢＯＯＮ」（配列番号１５）；ボノボ（Pan paniscus）、「ＢＯＮＯＢＯ」（配列番号１６）；チンパンジー（Pan troglodytes）、「ＣＨＩＭＰ」（配列番号１７）；またはＥＢＶＢ９（配列番号１８）を含む様々な種のＩＬ－１０タンパク質配列のアライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【0096】
図面は、単なる例証目的で本発明の様々な実施形態を描写する。当業者は、本明細書に例証した構造および方法の代替の実施形態が、本明細書に記載される本発明の原理から逸脱することなく使用され得ることを、以下の考察から容易に認識するであろう。
【0097】
６．詳細な説明
６．１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に割り当てられる意味を有する。
６．１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に割り当てられる意味を有する。
【0098】
「移植片対白血病効果」または「ＧｖＬ」は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または骨髄移植（ＢＭＴ）後に出現する効果を指す。同種移植片中のＴリンパ球は、悪性の残存宿主白血病細胞を排除する。
【0099】
「移植片対腫瘍効果」または「ＧｖＴ」は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または骨髄移植（ＢＭＴ）後に出現する効果を指す。同種移植片中のＴリンパ球は、悪性の残存宿主がん細胞、例えば骨髄腫ならびにリンパ性白血病および骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、およびおそらく乳がんの細胞を排除する。用語ＧｖＴは、ＧｖＬの一般形である。
【0100】
用語「処置」、「処置する」、および同様のものは、本明細書において医学の技術分野で理解されるその最も広い意味で使用される。特に、用語は一般的に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味する。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の処置をその範囲に含み、（ａ）疾患もしくは状態に対して素因を有し得るが、まだそれを有すると診断されていない対象に疾患もしくは状態が起こるのを防止すること；（ｂ）疾患もしくは状態を阻害すること（例えば、その発症を停止させること）；または（ｃ）疾患もしくは状態を軽減すること（例えば、疾患または状態の退縮を引き起こすこと、１つまたは複数の症状の改善を提供すること）を含む。任意の状態の改善は、当技術分野で公知の標準的な方法および技術に従って容易に評価することができる。疾患の方法によって処置される対象集団は、望ましくない状態または疾患に罹っている対象、ならびに状態または疾患の発症のリスクがある対象を含む。
【0101】
「ＨＬＡ一致」とは、本明細書で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１）座において、個体を互いに免疫学的に適合性にする、一致するＨＬＡ対立遺伝子を有する個体のペアを指す。ＨＬＡ適合性は、当技術分野で利用可能な方法のいずれか、例えば参照により本明細書に組み込まれる、Tiervy, Haematologica 2016 Volume 101(6):680-687に記載される方法を使用して決定することができる。
【0102】
所定の座に関して、個体のペアは、１人の個体の２つの対立遺伝子の各々が他の個体の２つの対立遺伝子と一致する場合、２／２の一致を有する。個体のペアは、１人の個体の２つの対立遺伝子の１つのみが他の個体の２つの対立遺伝子の１つと一致する場合、１／２の一致を有する。個体のペアは、１人の個体の１０個の対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座の各々の２つ）の全てが、他の個体の１０個全ての対立遺伝子と一致する場合、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で１０／１０の一致を有する。
【0103】
好ましい実施形態では、対立遺伝子レベルタイピングを、ＨＬＡ適合度の決定のために使用する。対立遺伝子レベルタイピングは、第１、第２、第３、および第４区域における全ての桁、例えばＡ＊０２：０１：０１：０１を使用することによって定義される、ＨＬＡ遺伝子の一意的ヌクレオチド配列に対応する。機能的には、それぞれコード配列におけるサイレント置換および非コード配列における置換によって異なる対立遺伝子を特徴付ける第３および第４区域は、置換がＨＬＡ対立遺伝子の発現を防止する場合（例えば、無効対立遺伝子Ｂ＊１５：０１：０１：０２Ｎ）を除き無関係である。無効対立遺伝子の欠失は、アロ反応性Ｔ細胞によって認識される可能性が非常に高い不一致をもたらし、有害な臨床上の影響を有する。非コード配列における置換は、発現レベルに影響を及ぼし得る（例えば、Ａ２４ｌｏｗ対立遺伝子Ａ＊２４：０２：０１：０２Ｌ）。そのような多様性もまた、抗ＨＬＡアロ認識に影響を及ぼし得る。
【0104】
用語「ＨＬＡ不一致」は、本明細書で使用される場合、個体を互いに免疫学的に不適合にする、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１）座に不一致のＨＬＡ対立遺伝子を有する個体のペアを指す。
【0105】
用語「部分的ＨＬＡ不一致」は、本明細書で使用される場合、個体を互いに許容可能な程度に免疫学的に不適合にする、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１）座に不一致のＨＬＡ対立遺伝子を有する個体のペアを指す。一部の研究は、許容される不一致を同定している。一部のＨＬＡクラスＩ不適合は、より許容されると考えられる。
【0106】
「ＨＬＡハプロタイプ」は、母親から受け継がれた１つおよび父親から受け継がれた１つの染色体による一連のＨＬＡ座対立遺伝子を指す。ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１）座の遺伝子型を使用して、ＨＬＡハプロタイプを決定することができる。
【0107】
用語「治療有効量」は、疾患の症状を処置するため、およびこのように改善するために有効である量である。
【0108】
用語「予防有効量」は、疾患、状態、またはその症状の完全または部分的な防止に関して効果を有する量である。用語「改善する」は、予防、重症度もしくは進行を弱めること、寛解、またはその治癒を含む、疾患状態、例えば神経変性疾患状態の処置における任意の治療的有益な結果を指す。
【0109】
６．２．他の解釈上の慣例
本明細書で列挙した範囲は、列挙した終点を含む範囲内の値の全ての短縮形であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
本明細書で列挙した範囲は、列挙した終点を含む範囲内の値の全ての短縮形であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【0110】
６．３．ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞
第１の態様では、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞集団を提供する（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞）。集団は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得たＣＤ４＋Ｔ細胞（ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）を含む。
第１の態様では、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞集団を提供する（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞）。集団は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得たＣＤ４＋Ｔ細胞（ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）を含む。
【0111】
６．３．１．ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴ細胞ドナー
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０集団中で使用されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、当技術分野で利用可能な方法を使用して、ドナーからの末梢血、臍帯血、または他の血液試料から単離することができる。典型的な実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血、好ましくはヒトドナーから単離される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ロイコフェレーシスによって末梢血から単離される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、第三者の血液バンクから得られる。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、全血の遠心分離からのバフィーコートから得られる。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０集団中で使用されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、当技術分野で利用可能な方法を使用して、ドナーからの末梢血、臍帯血、または他の血液試料から単離することができる。典型的な実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血、好ましくはヒトドナーから単離される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ロイコフェレーシスによって末梢血から単離される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、第三者の血液バンクから得られる。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、全血の遠心分離からのバフィーコートから得られる。
【0112】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、血液の事前凍結保存物、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の事前凍結保存物から単離される。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、事前に凍結されていない末梢血またはＰＢＭＣから単離される。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、複数のドナーから得た血液またはＰＢＭＣから個別に単離され、その後プールされる。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、複数のドナーから最初にプールされている血液またはＰＢＭＣから単離される。
【0113】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３、４、５、６、７、８、９、または１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる。
【0114】
一部の実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーは、遺伝子型に関係なく選択される。一部の実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーは、遺伝子型に基づいて選択される。
【0115】
ある特定の実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーは、そのＨＬＡハプロタイプに基づいて選択される。
【0116】
一部の実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーの一部または全ては、一致するＨＬＡハプロタイプを有する。一部の実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーの一部または全ては、不一致のＨＬＡハプロタイプを有する。
【0117】
一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して少なくとも１／８、２／８、３／８、４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも３／４または４／４の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、Ａ＊０２またはＡ＊２４対立遺伝子を有する。
【0118】
一部の実施形態では、集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中の全てのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ ＤＱＢ１座で互いに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0119】
一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0120】
好ましい実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーはいずれも、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって処置される宿主ではない。好ましい実施形態では、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーはいずれも、本明細書に記載される処置の方法においてＣＤ４ＩＬ－１０細胞と共に使用される幹細胞（例えば、ＨＳＣ）、組織または臓器のドナーではない。
【0121】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、処置される患者（宿主）に対してＨＬＡ不一致であるか、または部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０、または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で患者に対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で患者に対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して２／４、３／４、または４／４未満の一致を有する。
【0122】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致であるか、または部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座でＨＳＣドナーに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０、または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座でＨＳＣドナーに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座でＨＳＣドナーに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座でＨＳＣドナーに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0123】
好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はいずれも不死化されない。
【0124】
６．３．２．ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチド
本開示のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞である。外因性ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントを含む。
本開示のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞である。外因性ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントを含む。
【0125】
ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントは、ヒト、ボノボ、またはアカゲザルのＩＬ－１０をコードし得る。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１の配列を有するヒトＩＬ－１０をコードする。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有するヒトＩＬ－１０のバリアントをコードする。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有する。
【0126】
一部の実施形態では、ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントは、ハツカネズミ（Mus musculus）、「ＭＯＵＳＥ」（配列番号１０）；ドブネズミ（Rattus norvegicus）、「ＲＡＴ」（配列番号１１）；アカゲザル（Macaca mulatta）、「ＭＡＣＭＵ」（配列番号１２）；ニシゴリラ（Gorilla gorilla）、「ＧＯＲＩＬＬＡ」（配列番号１３）；カニクイザル（Macaca fascicularis）、「ＣＹＮＯ」（配列番号１４）；アヌビスヒヒ（Papio Anubis）、「ＯＬＩＶＥ ＢＡＢＯＯＮ」（配列番号１５）；ボノボ（Pan paniscus）、「ＢＯＮＯＢＯ」（配列番号１６）；チンパンジー（Pan troglodytes）、「ＣＨＩＭＰ」（配列番号１７）；およびＥＢＶＢ９（配列番号１８）のＩＬ－１０をコードする。一部の実施形態では、ＩＬ－１０コードポリヌクレオチドセグメントは、ハツカネズミ（Mus musculus）、「ＭＯＵＳＥ」（配列番号１０）；ドブネズミ（Rattus norvegicus）、「ＲＡＴ」（配列番号１１）；アカゲザル（Macaca mulatta）、「ＭＡＣＭＵ」（配列番号１２）；ニシゴリラ（Gorilla gorilla）、「ＧＯＲＩＬＬＡ」（配列番号１３）；カニクイザル（Macaca fascicularis）、「ＣＹＮＯ」（配列番号１４）；アヌビスヒヒ（Papio Anubis）、「ＯＬＩＶＥ ＢＡＢＯＯＮ」（配列番号１５）；ボノボ（Pan paniscus）、「ＢＯＮＯＢＯ」（配列番号１６）；チンパンジー（Pan troglodytes）、「ＣＨＩＭＰ」（配列番号１７）；およびＥＢＶＢ９（配列番号１８）のＩＬ－１０と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有するタンパク質をコードする。
【0127】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドはウイルスＩＬ－１０をコードする。様々な実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ、ＧＭＣＭＶ、ＲｈＣＭＶ、ＢａＣＭＶ、ＭＯＣＭＶ、ＳＭＣＭＶ、ＥＢＶ、ボノボ－ＨＶ、ＢａＬＣＶ、ＯｖＨＶ－２、ＥＨＶ－２、ＣｙＨＶ－３、ＡｎｇＨＶ－１、ＯＲＦＶ、ＢＰＳＶ、ＰＣＰＶ、ＬＳＤＶ、ＳＰＶ、ＧＰＶ、またはＣＮＰＶからのＩＬ－１０をコードする。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＥＢＶまたはＯＲＦＶからのウイルスＩＬ－１０をコードする。
【0128】
一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、ヒトＩＬ－１０（例えば、配列番号１）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのアミノ酸修飾を有するヒトＩＬ－１０のバリアントをコードする。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換は、対応するアミノ酸位置（複数可）でウイルスＩＬ－１０のアミノ酸（複数可）による置換（複数可）である。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、ヒトＩＬ－１０（例えば、配列番号１）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのアミノ酸の挿入、欠失、または改変を有するヒトＩＬ－１０のバリアントをコードする。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１０のバリアントは、配列番号８または９の配列を有する。
【0129】
一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、ヒトＩＬ－１０（例えば、配列番号１）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有するヒトＩＬ－１０のバリアントをコードする。一部の実施形態では、改変は、対応する位置での、ハツカネズミ（Mus musculus）、「ＭＯＵＳＥ」（配列番号１０）；ドブネズミ（Rattus norvegicus）、「ＲＡＴ」（配列番号１１）；アカゲザル（Macaca mulatta）、「ＭＡＣＭＵ」（配列番号１２）；ニシゴリラ（Gorilla gorilla）、「ＧＯＲＩＬＬＡ」（配列番号１３）；カニクイザル（Macaca fascicularis）、「ＣＹＮＯ」（配列番号１４）；アヌビスヒヒ（Papio Anubis）、「ＯＬＩＶＥ ＢＡＢＯＯＮ」（配列番号１５）；ボノボ（Pan paniscus）、「ＢＯＮＯＢＯ」（配列番号１６）；チンパンジー（Pan troglodytes）、「ＣＨＩＭＰ」（配列番号１７）；およびＥＢＶＢ９（配列番号１８）のアミノ酸による置換、挿入、および／または欠失である。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１０のバリアントは、配列番号１９または配列番号２０の配列を有する。
【0130】
一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、ヒトＩＬ－１０と比較して免疫刺激活性が低減されたヒトＩＬ－１０のバリアントをコードする。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１０のバリアントは、Ｉ１０５Ａ置換を含む。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１０のバリアントは、A Single Amino Acid Determines the Immunostimulatory Activity of Interleukin 10, J Exp Med, 191, 2, 2000, p.213-223に記載される方法を使用して作製される。
【0131】
外因性ポリヌクレオチドは、形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞においてコードされるＩＬ－１０の発現を方向付ける発現制御エレメントをさらに含む。
【0132】
一部の実施形態では、発現制御エレメントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＬ－１０の発現を方向付けることが可能なプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＬ－１０の構成的発現を駆動する。一部の実施形態では、プロモーターは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＬ－１０の発現を駆動する。
【0133】
一部の実施形態では、治療上適切である場合、誘導型プロモーターを使用して、ＩＬ－１０の発現を誘導する。一部の実施形態では、ＩＬ－１０プロモーターを使用する。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターを使用する。一部の実施形態では、系列特異的プロモーターを使用する。一部の実施形態では、遍在性に発現されるプロモーターを使用する。
【0134】
一部の実施形態では、天然のヒトプロモーターを使用する。一部の実施形態では、ヒト伸長因子（ＥＦ）１αプロモーターを使用する。一部の実施形態では、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）を使用する。一部の実施形態では、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＩ－Ｃ）を使用する。
【0135】
一部の実施形態では、合成プロモーターを使用する。ある特定の実施形態では。最小ＣＭＶコアプロモーターを使用する。特定の実施形態では、誘導型または構成的双方向性プロモーターを使用する。特異的実施形態では、Amendola et al., Nature Biotechnology, 23(1):108-116(2005)に開示される合成の双方向性プロモーターを使用する。このプロモーターは、２つのｍＲＮＡの協調された転写を遍在的または組織特異的に媒介することができる。ある特定の実施形態では、双方向性プロモーターは、ＩＬ－１０および選択マーカーの発現を誘導する。
【0136】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、形質導入が成功したＣＤ４＋Ｔ細胞の選択を許容する選択マーカーをコードするセグメントをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーはΔＮＧＦＲである。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、配列番号３の配列を有するポリペプチドである。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有するポリペプチドである。特定の実施形態では、ΔＮＧＦＲ選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を有する。一部の実施形態では、ΔＮＧＦＲ選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有する。
【0137】
一部の実施形態では、選択マーカーの発現は、外因性ポリヌクレオチドからのＩＬ－１０の発現と相関する。一部の実施形態では、選択マーカーの発現は、外因性ポリヌクレオチドからのＩＬ－１０の発現と線形に相関する。したがって、一部の実施形態では、選択マーカーの発現を測定して、外因性ポリヌクレオチドからのＩＬ－１０の発現を推定する。
【0138】
一部の実施形態では、選択マーカーは、ＥＧＦＲポリペプチドの切断型である。一部の実施形態では、選択マーカーは、ヒトＥＧＦＲポリペプチド、任意選択でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al. "A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells", Blood, v. 118, n. 5(2011)に開示されるｈｕＥＧＦＲの切断型である。
【0139】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、抗生物質耐性遺伝子をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、アンピシリン耐性遺伝子をコードする配列を含む。
【0140】
典型的な実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ベクターを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞に送達される。一部の実施形態では、ベクターはプラスミドベクターである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【0141】
ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞に送達され、外因性ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター配列を含む。ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる、Matrai et al., Molecular Therapy 18(3):477-490(2010)（「Matrai」）に開示されるレンチウイルスベクターを使用する。
【0142】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれることが可能である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれることが可能ではない。一部の実施形態では、組み込み能欠損型レンチウイルスベクターを使用する。例えば、一部の実施形態では、組み込み能欠損型またはMatraiに開示される他のレンチウイルスベクターを使用する。一部の実施形態では、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスを使用する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Matrai et al., Hepatology 53:1696-1707(2011)に記載される、インテグラーゼに不活化変異（Ｄ６４Ｖ）を含有するインテグラーゼ欠損型レンチウイルスを使用することができる。
【0143】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれている。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、核ゲノムに組み込まれていない。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞の細胞質に存在する。
【0144】
特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５の配列を有する。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有する。
【0145】
６．３．３．ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の遺伝子発現
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を構成的に発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、活性化されるとＩＬ－１０を発現する。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を構成的に発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、活性化されるとＩＬ－１０を発現する。
【0146】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬ培養培地あたり少なくとも１００ｐｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬ培養培地あたり少なくとも２００ｐｇ、５００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、または５０ｎｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。
【0147】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の組合せ、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズの組合せによる活性化後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬ培養培地あたり少なくとも１ｎｇまたは２ｎｇのＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体、またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体コーティングビーズによる活性化後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍＬ培養培地あたり少なくとも５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または５００ｎｇのＩＬ－１０を発現する。
【0148】
様々な実施形態では、ＩＬ－１０産生量は、タンパク質の検出および測定のための様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ、分光手順、比色定量、アミノ酸分析、放射線標識、エドマン分解、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロッティング等を使用して活性化の１２時間、２４時間、または４８時間後に決定される。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０産生量は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による活性化の４８時間後にＥＬＩＳＡによって決定される。
【0149】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より少なくとも５倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、または５０倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。
【0150】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、選択マーカーをさらに発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞において典型的に発現されるタンパク質を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞に特徴的なマーカータンパク質を発現する。
【0151】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４９ｂを発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＬＡＧ－３を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βを発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＦＮγを発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、グランザイムＢ（ＧｚＢ）を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、骨髄系抗原提示細胞または骨髄系腫瘍細胞によって活性化されると、グランザイムＢ（ＧｚＢ）を放出する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、パーフォリンを発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、骨髄系抗原提示細胞または骨髄系腫瘍細胞によって活性化されると、パーフォリンを放出する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ１８を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ２を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ２２６を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－２２を発現する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を発現する。
【0152】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞の少なくとも１つの表現型機能を示す。様々な実施形態では、機能は、ＩＬ－１０の分泌、ＴＧＦ－βの分泌、ならびにグランザイムＢ（ＧｚＢ）およびパーフォリンの放出を通しての骨髄系の抗原提示細胞の特異的殺滅である。
【0153】
６．３．４．プロセスの産物
典型的な実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドによって改変することによって得られる。
典型的な実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドによって改変することによって得られる。
【0154】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターによってＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ－１０のコード配列を含有するレンチウイルスを形質導入される。
【0155】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールすること；および（ｉｉ）プールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって改変すること、によって生成される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得ること；（ｉｉ）各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって個別に改変すること、および次に（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールすること、によって生成される。
【0156】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することが可能なタンパク質の存在下で培養されている。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下で培養されている。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ－２、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズおよびＩＬ－２の存在下で培養されている。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で培養されている。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で培養されている。
【0157】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、凍結保存物中に存在する。
【0158】
６．４．医薬組成物
別の態様では、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に開示されるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
別の態様では、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に開示されるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【0159】
医薬組成物は、ヒト医学または獣医学にとって適切な任意の投与経路によって投与するために製剤化することができる。典型的な実施形態では、組成物は、静脈内（ＩＶ）投与のために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内（ＩＶ）注入のために製剤化される。ＩＶ投与のために製剤化される実施形態では、医薬組成物は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口投与で許容される水溶液の形態である。
【0160】
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体または希釈剤は、食塩水、乳酸加リンゲル液、または他の生理的に適合性の溶液である。様々な実施形態では、医薬組成物溶液は、２～２０％、好ましくは５％ヒト血清アルブミンを含む。
【0161】
一部の実施形態では、全身投与、特に静脈内投与によって医薬組成物を投与するために適合される医薬組成物の単位投与剤形が提供される。
【0162】
一部の実施形態では、単位投与剤形は、１０４～１０１１個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０４～１０１０個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０４～１０９個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０５～１０１０個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０５～１０９個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０５～１０８個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、または１０５～１０７個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞を含有する。
【0163】
典型的な実施形態では、単位投与剤形の医薬組成物は液体形態で存在する。
【0164】
６．５．ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法
別の態様では、本開示は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法を提供する。
【0165】
一部の実施形態では、方法は、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールするステップ；および（ｉｉ）プールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって改変するステップを含む。他の実施形態では、方法は、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るステップ；（ｉｉ）各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって個別に改変するステップ；および次に（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールして、それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得るステップを含む。当技術分野で公知の様々な方法を使用して、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することができる。
【0166】
一部の実施形態では、方法は、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞または遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下でインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞または遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズおよびＩＬ－２の存在下でインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞または遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を、フィーダー細胞混合物の存在下でインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞または遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のナノ調製物の存在下でインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、インキュベーションは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で行われる。一部の実施形態では、インキュベーションは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で行われる。
【0167】
一部の実施形態では、インキュベーションステップは、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入する前に実施される。一部の実施形態では、インキュベーションステップは、（ｉ）少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールした後であるが；（ｉｉ）プールしたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって改変する前に実施される。一部の実施形態では、インキュベーションステップは、（ｉ）初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞を少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーから得た後であるが；（ｉｉ）各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって個別に改変する前に実施される。
【0168】
一部の実施形態では、インキュベーションステップは、ステップ（ｉｉ）の後に実施される。言い換えれば、一部の実施形態では、インキュベーションステップは、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、プールしたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変するステップの後に実施される。一部の実施形態では、インキュベーションステップは、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を個別に改変した後であるが、（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールして、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る前に実施される。一部の実施形態では、インキュベーションステップは、（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールして、それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得た後に実施される。
【0169】
一部の実施形態では、インキュベーションステップは、１回より多く実施される。一部の実施形態では、インキュベーションステップは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子改変の前および後の両方で実施される。
【0170】
一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを使用して初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは配列番号２の配列を有する。一部の実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％配列同一性を有する。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、形質導入が成功したＣＤ４＋Ｔ細胞の選択を許容するマーカーをコードするセグメントをさらに含む。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーはΔＮＧＦＲである。ある特定の実施形態では、コードされる選択マーカーは配列番号３の配列を有する。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を含む。一部の実施形態では、コードされる選択マーカーは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドの切断型である。
【0171】
一部の実施形態では、方法は、選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それによって遺伝子改変ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の濃縮集団を生成するステップをさらに含む。
【0172】
一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも７０％が、選択マーカーを発現する。一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％が、選択マーカーを発現する。一部の実施形態では、濃縮集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９６、９７、９８、または９９％が、選択マーカーを発現する。
【0173】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、インキュベーションは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズの存在下で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、さらにＩＬ－２の存在下で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、フィーダー細胞の存在下で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のナノ調製物の存在下で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で実施される。
【0174】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を凍結するステップをさらに含む。
【0175】
一部の実施形態では、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、そのＨＬＡハプロタイプに基づいて選択されるドナーに由来する。一部の実施形態では、方法は、その遺伝情報を解析することによってＴ細胞ドナーを選択するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、潜在的Ｔ細胞ドナーの遺伝情報またはＨＬＡハプロタイプを解析するステップを含む。
【0176】
一部の実施形態では、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞またはその改変によって処置される宿主と少なくとも部分的なＨＬＡ一致を有するドナーに由来する。一部の実施形態では、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、幹細胞（ＨＳＣ）、組織、または臓器ドナーと少なくとも部分的ＨＬＡ一致を有するドナーに由来する。一部の実施形態では、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、宿主と生物学的血縁がない第三者ドナーから得られる。一部の実施形態では、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、幹細胞、組織、または臓器ドナーと生物学的血縁がない第三者ドナーから得られる。
【0177】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して少なくとも１／８、２／８、３／８、４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して少なくとも３／４または４／４の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーの各々は、Ａ＊０２またはＡ＊２４対立遺伝子を有する。
【0178】
一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、または９／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で互いに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｂ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｃ座で互いに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、少なくとも２人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で互いに対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0179】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１つまたは複数の凍結保存物から得られる。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも２人の異なるＴ細胞ドナーの凍結していない末梢血単核細胞から得られる。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、初代培養ＣＤ４＋Ｔ細胞は、液体浮遊液から得られる。一部の実施形態では、液体浮遊液は、事前に凍結した保存物から得られる。
【0180】
一部の実施形態では、ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、患者の抗原提示細胞（単球、樹状細胞、またはＤＣ－１０細胞）と接触させて、アロ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を生成し、これを次に高レベルのＩＬ－１０を産生するように改変する（アロ－ＣＤ４ＩＬ－１０細胞）。
【0181】
一部の実施形態では、方法は、宿主からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をアネルギー化するステップを含まない。一部の実施形態では、方法は、組換えＩＬ－１０タンパク質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をアネルギー化するステップを含まず、組換えＩＬ－１０タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されない。一部の実施形態では、方法は、宿主からのＤＣ１０細胞の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をアネルギー化するステップを含まない。
【0182】
６．６．ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用する方法
なお別の態様では、本開示は、患者を処置する方法であって、本明細書に提供されるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。
なお別の態様では、本開示は、患者を処置する方法であって、本明細書に提供されるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【0183】
一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の凍結浮遊液を融解する事前のステップをさらに含む。
【0184】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞、または医薬組成物は、患者における病原性のＴ細胞応答を防止するかまたはその重症度を低減させる。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、炎症を低減させる。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、組織修復を増強する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、自己および非病原性抗原に対する免疫寛容を増強し、免疫系の恒常性を維持する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、臓器移植、ＧｖＨＤ、ならびに様々な自己免疫および炎症疾患に関連する病原性のＴ細胞応答を下方調節する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、自己免疫疾患を処置する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性を低減させる、またはＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性に関連する症状を低減させる。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、腫瘍細胞の死を誘導する、または腫瘍成長を低減させる。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、無病生存期間（例えば、微小残存病変の非存在）を増加させる。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、創傷治癒または組織修復を誘導する。
【0185】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、患者における病原性のＴ細胞応答の重症度を防止または低減させるために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、炎症を低減させるために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、組織修復を増強するために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、自己および病原性抗原に対する免疫寛容を増強するためならびに免疫系の恒常性を維持するために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、臓器移植、ＧｖＨＤおよび様々な自己免疫または炎症疾患に関連する病原性のＴ細胞応答を下方調節するために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、自己免疫疾患を処置するために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性を低減させるために、またはＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性に関連する症状を低減させるために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、腫瘍細胞の死を誘導するために、または腫瘍の成長を低減させるために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、無病生存期間（例えば、微小残存病変（minimal residual disease）の非存在）を増加させるために有効な量で投与される。
【0186】
一部の実施形態では、処置方法は、投与後の患者においてポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞をモニターすることをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者から得た生物試料中の選択マーカーを検出し、それによってポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の存在または非存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、患者におけるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在の変化を追跡するために複数の時点で検出される。一部の実施形態では、生物試料は、患者からの生検または血液試料である。
【0187】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、治療有効量で投与される。量は、体重および他の臨床要因に基づいて決定され得る。一部の実施形態では、細胞１０３～１０９個／ｋｇが投与される。一部の実施形態では、細胞１０３～１０８個／ｋｇが投与される。一部の実施形態では、細胞１０３～１０７個／ｋｇが投与される。一部の実施形態では、細胞１０３～１０６個／ｋｇが投与される。一部の実施形態では、細胞１０３～１０５個／ｋｇが投与される。一部の実施形態では、細胞１０３～１０４個／ｋｇが投与される。
【0188】
様々な実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、治療上有効なスケジュールで投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、１回投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、毎日、３日毎、７日毎、１４日毎、２１日毎、または毎月投与される。
【0189】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、異なる投与経路に従って、例えば全身、皮下、または腹腔内に投与され得る。一部の実施形態では、細胞は、２～２０％、好ましくは５％ヒト血清アルブミンを含有し得る食塩水または生理的溶液中で投与される。
【0190】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０を投与することは、疾患、状態、またはその症状を完全または部分的に防止するという点で、予防的である。
【0191】
６．６．１．ＧｖＨＤを低減または防止する方法
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含む医薬組成物を使用して、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＨＳＣＴ）の前、ＨＳＣＴと同時、またはＨＳＣＴの後に患者を処置する。
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含む医薬組成物を使用して、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＨＳＣＴ）の前、ＨＳＣＴと同時、またはＨＳＣＴの後に患者を処置する。
【0192】
様々な実施形態では、ＨＳＣＴは、一致した血縁のＨＳＣＴである。様々な実施形態では、ＨＳＣＴは、ハプロタイプ一致ＨＳＣＴ、不一致の血縁ＨＳＣＴ、または不一致の非血縁ＨＳＣＴである。
【0193】
一部の実施形態では、患者は、アロＨＳＣＴによる処置を必要とする血液悪性疾患を有する。一部の実施形態では、血液悪性疾患は、異常な骨髄系細胞によって媒介される。
【0194】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞およびＨＳＣによって処置される患者の遺伝情報、および／またはＨＳＣドナーの遺伝情報に基づいて選択される。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞およびＨＳＣによって処置される患者のＨＬＡハプロタイプ、および／またはＨＳＣドナーのＨＬＡハプロタイプに基づいて選択される。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与する前に、Ｔ細胞ドナーの遺伝情報またはＨＬＡハプロタイプを解析するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、宿主の遺伝情報またはＨＬＡハプロタイプを解析するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＨＳＣドナーの遺伝情報またはＨＬＡハプロタイプを解析するステップをさらに含む。
【0195】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナー、宿主、およびＨＳＣドナーは、生物学的に無関係である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナー、宿主およびＨＳＣドナーは、異なるＨＬＡハプロタイプを有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナー、宿主、およびＨＳＣドナーは、ＨＬＡハプロタイプに少なくとも部分的不一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーは、閾値より上のＨＬＡ一致を有するＨＬＡハプロタイプを有する場合に選択される。
【0196】
一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０、または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で患者に対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で患者に対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、ＨＳＣドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して３／４または４／４未満の一致を有する。
【0197】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、患者に対してＨＬＡ不一致または部分的にＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０、または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で患者に対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座で患者に対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座で患者に対して２／４、３／４、または４／４未満の一致を有する。
【0198】
一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致であるか、または部分的ＨＬＡ不一致である。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座でＨＳＣドナーに対して５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０、または１０／１０未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１座で、ＨＳＣドナーに対して４／８、５／８、６／８、７／８、または８／８未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ座でＨＳＣドナーに対して２／２未満の一致を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞ドナーの１人または複数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１座でＨＳＣドナーに対して３／４または４／４未満の一致を有する。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、移植された造血幹細胞によるＧｖＨＤを防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0199】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、移植された造血細胞による病原性のＴ細胞応答を防止するかまたはその重症度を低減させる。特定の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＧｖＨＤを防止するかまたは低減させる。
【0200】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、病原性のＴ細胞または炎症によって誘導される組織損傷を防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0201】
６．６．２．がんを処置する方法
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、がんを処置するために使用される。好ましい実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、抗腫瘍効果を直接媒介し、特定の実施形態では、抗白血病効果を直接媒介する。
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、がんを処置するために使用される。好ましい実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、抗腫瘍効果を直接媒介し、特定の実施形態では、抗白血病効果を直接媒介する。
【0202】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、がんを処置するために同種単核細胞またはＰＢＭＣと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＰＢＭＣの投与前または投与後に投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞および同種単核細胞またはＰＢＭＣは、同時に投与される。
【0203】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞および同種単核細胞またはＰＢＭＣは、１：３、１：２、１：１、２：１または３：１の比で投与される。
【0204】
一部の実施形態では、腫瘍性細胞はＣＤ１３を発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はＨＬＡ－クラスＩを発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はＣＤ５４を発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞は、ＣＤ１３、ＨＬＡ－クラスＩおよびＣＤ５４を発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はＣＤ１１２を発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はＣＤ５８を発現する。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はＣＤ１５５を発現する。一部の実施形態では、腫瘍は、ＣＤ１１２、ＣＤ５８、またはＣＤ１５５を発現する。様々な実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍または血液腫瘍である。
【0205】
一部の実施形態では、患者は、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、男性乳がん、原発不明がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭下咽頭がん、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、骨髄肉腫および皮膚白血病を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、口腔中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん、皮膚がん－基底細胞および扁平上皮、皮膚がん－黒色腫、皮膚がん－メルケル細胞、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんを有する。
【0206】
一部の実施形態では、がんは骨髄腫瘍である。特定の実施形態では、がんは、ＡＭＬまたはＣＭＬである。一部の実施形態では、がんは骨髄腫瘍である。
【0207】
一部の実施形態では、方法は、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼす血液がんを処置するために使用される。様々な実施形態では、血液がんは、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫）、リンパ球性白血病、骨髄腫である。様々な実施形態では、血液がんは、急性または慢性骨髄性（骨髄性）白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ）、または骨髄異形成症候群である。
【0208】
一部の実施形態では、がんは、難治性であるか、または治療介入に対して抵抗性である。
【0209】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、治療介入と組み合わせて使用される。組合せは、同時であってもよく、または異なる時間で行われてもよい。好ましくは、治療介入は、化学療法、放射線療法、アロ－ＨＳＣＴ免疫抑制、輸血、骨髄移植、成長因子、生物製剤からなる群から選択される。
【0210】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、腫瘍浸潤性および腫瘍成長促進性骨髄系列細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球）の細胞死を誘導する。
【0211】
６．６．３．炎症疾患または自己免疫疾患を処置する方法
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、炎症疾患または自己免疫疾患を処置するために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性を伴う疾患または障害を処置するために投与される。
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、炎症疾患または自己免疫疾患を処置するために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性を伴う疾患または障害を処置するために投与される。
【0212】
ＮＯＤ様受容体ファミリー（ＮＬＲ）タンパク質ＮＬＲＰ３は、病原体、環境、または内因性起源からの危険なシグナルを感知する細胞内シグナル伝達分子である。活性化後、ＮＬＰＲ３は、カスパーゼ－１と相互作用して、インフラマソームと呼ばれる複合体を形成する。これは、カスパーゼ－１の活性化をもたらし、これは炎症促進性サイトカインであるＩＬ－１βおよびＩＬ－１８をその活性型へと切断し、パイロトーシスとして公知の炎症細胞死のタイプを媒介する。
【0213】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、マックルウェルズ症候群（ＭＷＳ）、家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）および新生児発症型多系統炎症疾患（ＮＯＭＩＤ）から選択される炎症疾患を処置するために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、非アルコール性脂肪性肝炎、変形性関節症、珪肺症、石綿肺症、痛風、および肺線維症から選択される慢性疾患を処置するために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症および全身性エリテマトーデス、または炎症性眼疾患、例えば糖尿病性網膜症、急性緑内障、および加齢関連黄斑変性症を処置するために投与される。
【0214】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＮＬＲＰ３に関連する疾患を処置するために投与される。疾患は、ＣＡＰＳ、ＮＡＳＨ、アルツハイマー病、パーキンソン病、心血管疾患、変形性関節症、痛風、偽痛風、腎石灰化症、ＩＩ型糖尿病、シェーグレン症候群、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、ＡＭＤ、感染症、脳性マラリア、石綿肺症、接触性過敏症、日焼け、珪肺症、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、腎石灰化症、ＡＬＳ、骨髄異形成症候群、およびぶどう膜炎からなる群から選択され得る。
【0215】
一部の実施形態では、疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、加齢関連認知障害、前頭側頭型認知症、外傷性脳損傷、脳内出血、敗血症関連脳症、脳虚血、くも膜下出血、てんかん、アクリルアミド中毒、オピオイド誘発性神経炎症、慢性偏頭痛、周術期神経認知障害、卒中後認知障害、心停止後認知障害、社会的孤立誘発性認知障害、不安、および外傷後ストレス障害から選択される脳障害である。
【0216】
一部の実施形態では、疾患は、喘息、ＩＲ肺損傷、ＡＲＤＳ／ＣＯＰＤ、粒子状物質誘発肺損傷、放射線肺炎、肺高血圧症、サルコイドーシス、嚢胞性線維症、およびアレルギー性鼻炎から選択される肺障害である。
【0217】
一部の実施形態では、疾患は、アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧症、心筋梗塞、心房細動、代謝機能障害によって誘発される心損傷、および内皮機能障害から選択される心障害である。
【0218】
一部の実施形態では、疾患は、消化器疾患、例えば大腸炎である。一部の実施形態では、疾患は、急性肝不全、免疫の概日リズム調節、ＮＡＳＨ、糖尿病性認知機能障害、ＩＲ肝損傷、特異体質性薬物性肝損傷および肝線維症から選択される肝障害である。一部の実施形態では、疾患は、糖尿病性脳症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、インスリン抵抗性、島移植拒絶、慢性結晶腎症、腎線維症、Ｉ／Ｒ腎損傷、肥満関連腎疾患、および腎高血圧症から選択される膵障害または腎障害である。一部の実施形態では、疾患は、乾癬および網膜血管新生から選択される皮膚または眼障害である。一部の実施形態では、疾患は、生殖障害、例えば早産である。一部の実施形態では、疾患は、原発性月経困難症、自然免疫、自然免疫から獲得免疫、全身性エリテマトーデス－ループス腎炎、および多発性硬化症から選択される免疫障害である。一部の実施形態では、疾患は、マックルウェルズ症候群、リウマチ性関節炎、鎌状赤血球症、およびＶＣＰ関連疾患から選択される遺伝性障害である。一部の実施形態では、疾患は、多発性硬化症関連神経障害性疼痛、慢性前立腺炎／慢性骨盤痛、がん誘発性骨痛、および痛覚過敏から選択される疼痛障害である。一部の実施形態では、疾患は、がん、例えば頭部および頸部がんのヒト扁平上皮がんである。一部の実施形態では、疾患は、感染障害、例えば細菌、ウイルス、または寄生虫感染症である。
【0219】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＮＬＲＰ３関連疾患の現在利用可能な処置、例えばＩＬ－１を標的とする生物剤と組み合わせて使用される。生物剤は、組換えＩＬ－１受容体拮抗剤アナキンラ、中和性ＩＬ－１β抗体カナキヌマブおよび可溶性デコイＩＬ－１受容体リロナセプトを含む。
【0220】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、心血管疾患、ＳＬＥ、ＭＳ、ＣＤ、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、変形性関節症、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎａｓｈ）、パーキンソン病、ＡＬＳ、肺線維症、珪肺症、石綿肺症、糖尿病性網膜症、および加齢関連黄斑変性から選択される疾患を処置するために投与される。
【0221】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、炎症を処置するために投与される。炎症は、これらに限定されないが、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、２型糖尿病、神経変性疾患、または炎症性腸疾患に関係し得る。
【0222】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１β産生の増加を伴う疾患または障害を処置するために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１８産生の増加を伴う疾患または障害を処置するために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞による成熟カスパーゼ－１産生の増加を伴う疾患または障害を処置するために投与される。
【0223】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１β産生を低減させるために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞によるＩＬ－１８産生を低減させるために投与される。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化された単球、マクロファージ、または樹状細胞による成熟カスパーゼ－１産生を低減させるために投与される。
【0224】
６．６．４．他の障害を処置する方法
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、自己免疫疾患を処置するために投与される。
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、自己免疫疾患を処置するために投与される。
【0225】
一部の実施形態では、自己免疫疾患は、１型糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、自己免疫性肝炎、白斑、円形脱毛症、リウマチ性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーヴス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、水疱疾患、強皮症、およびセリアック病からなる群から選択される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、１型糖尿病、狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、またはリウマチ性関節炎である。一部の実施形態では、患者はアレルギー性またはアトピー性疾患を有する。アレルギー性またはアトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、および鼻炎からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、患者は食物アレルギーを有する。
【0226】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＨＳＣＴ以外の細胞および臓器移植に対する病原性のＴ細胞応答を防止するまたはその重症度を低減させるために投与される。一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者に臓器移植を行うステップを含む。ある特定の実施形態では、臓器は、腎臓、心臓、または膵島細胞である。好ましい実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物は、臓器移植の宿主拒絶を防止するかまたはその重症度を低減させる。
【0227】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、遺伝子治療、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の投与に関連する免疫応答を防止または低減させるために投与される。これらの実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、患者に組換えＡＡＶを投与するステップをさらに含む。
【0228】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ｉＰＳ細胞由来組織または細胞の移植に関連する免疫応答を防止または低減させるために投与される。ｉＰＳ由来組織および細胞としては、これらに限定されないが、心筋細胞、肝細胞、上皮細胞、軟骨、骨および筋細胞、ニューロンが挙げられる。
【0229】
一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ウイルス感染症に対する患者の過剰活性免疫応答を低減させるために投与される。一部の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ｃｏＶ－２である。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、細菌感染症に対する過剰活性免疫応答、例えば毒素性ショックおよびサイトカインストームを低減させるために投与される。
【0230】
一部の実施形態では、方法は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団、または医薬組成物の投与前または投与後のいずれかに、免疫治療剤タンパク質を患者に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団、または医薬組成物は、免疫原性治療タンパク質に対する免疫応答を低減させる。一部の実施形態では、免疫治療タンパク質は、治療抗体、第ＶＩＩＩ因子置換、サイトカイン、およびサイトカイン変異タンパク質から選択される。
【実施例】
【0231】
６．７．実施例
以下の実施例を、限定ではない例証として提供する。
以下の実施例を、限定ではない例証として提供する。
【0232】
６．７．１．実験上の知見の要約
本開示は、ヒトＩＬ－１０遺伝子およびヒトＮＧＦＲの切断型の非シグナル伝達型を含有する双方向性レンチウイルスベクターが形質導入されている高度精製同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生および使用のための方法を提供する。形質導入が成功したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＮＧＦＲ特異的モノクローナル抗体を利用して精製すると、＞９５％純粋なＩＬ－１０産生性でＮＧＦＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞と呼ぶ）をもたらした。３人の異なる同種ＨＬＡ不一致ドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、１：１：１の比でプールした。
本開示は、ヒトＩＬ－１０遺伝子およびヒトＮＧＦＲの切断型の非シグナル伝達型を含有する双方向性レンチウイルスベクターが形質導入されている高度精製同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生および使用のための方法を提供する。形質導入が成功したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＮＧＦＲ特異的モノクローナル抗体を利用して精製すると、＞９５％純粋なＩＬ－１０産生性でＮＧＦＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞と呼ぶ）をもたらした。３人の異なる同種ＨＬＡ不一致ドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、１：１：１の比でプールした。
【0233】
これらのプールした集団は、本明細書においてポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞とも呼ばれ、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞および天然由来の１型制御性Ｔ（Ｔｒ１）細胞のプロファイルと同等のサイトカイン産生プロファイルを有した。それらは、高レベルのＩＬ－１０およびＩＬ－２２、多様なレベルのＩＦＮ－γおよびＩＬ－５、ならびに低レベルのＩＬ－４を産生する。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、多クローン性（複数の抗原特異性を有する）であり、同種ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を抑制した。加えて、それらは、骨髄性白血病細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に殺滅した。加えて、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト単球による炎症促進性ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８産生を阻害した。
【0234】
ヒト化マウス移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデルにおけるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入は、これらの細胞が、脾臓および骨髄へと効率的にホーミングすることを示した。ヒト化マウスＧｖＨＤモデルにおけるポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞またはＰＢＭＣによって誘導される重度のｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを阻害した。重要なことに、たとえ高濃度であっても、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、単独でＧｖＨＤを誘導しなかった。加えて、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＡＬＬ－ＣＭ細胞を静脈内注射したＮＳＧマウスにおけるがん細胞に対して細胞傷害効果を有した。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、ＡＬＬ－ＣＭ細胞の投与の３日後（この時点で既にこれらの細胞の大量の増大が進行中である）に注射すると、腫瘍成長の阻害をもたらした。これらの結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで直接の治療的抗骨髄性白血病効果を有することを示している。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞をＰＢＭＣと共に投与すると、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種ＰＢＭＣによって誘導されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤをさらに下方調節した。
【0235】
これらの結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、ＧｖＨＤの処置および／または防止のために使用することができ；ＨＳＣＴのＧｖＬまたはＧｖＴ治療効果を保持しながらＧｖＨＤを低減させるために白血病および他の悪性疾患の処置のための同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の補助として使用することができ；ならびに細胞および臓器拒絶、ならびに自己免疫および炎症疾患を処置するために使用することができることを実証する。
【0236】
［実施例１］
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の生成
ベクターの産生
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１４６５４２号パンフレットに記載されるように、ヒトＩＬ－１０およびＮＧＦＲの切断型（ΔＮＧＦＲ）の両方のコード配列を含有するレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ）を形質導入することによって産生した（図１および２）。ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲを製造するために使用したヒトＩＬ－１０およびΔＮＧＦＲ（ｐＬＶＩＬ－１０）をコードするプラスミドの配列を、配列番号５に提供する。簡単に説明すると、ｐＬＶＩＬ－１０を、ｐＨ１５Ｃ（ＡＴＣＣ６８１９２）の５４９ｂｐ断片からのヒトＩＬ－１０のコード配列をプラスミド＃１０７４．１０７１．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ｄＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡにライゲーションすることによって生成した。双方向性プロモーター（ヒトＰＧＫプロモータープラス反対方向のＣＭＶプロモーターの最小コアエレメント）の存在は、２つのトランスジーンの共発現を可能にする。プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン）のコード配列をさらに含有する。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の生成
ベクターの産生
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１４６５４２号パンフレットに記載されるように、ヒトＩＬ－１０およびＮＧＦＲの切断型（ΔＮＧＦＲ）の両方のコード配列を含有するレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ）を形質導入することによって産生した（図１および２）。ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲを製造するために使用したヒトＩＬ－１０およびΔＮＧＦＲ（ｐＬＶＩＬ－１０）をコードするプラスミドの配列を、配列番号５に提供する。簡単に説明すると、ｐＬＶＩＬ－１０を、ｐＨ１５Ｃ（ＡＴＣＣ６８１９２）の５４９ｂｐ断片からのヒトＩＬ－１０のコード配列をプラスミド＃１０７４．１０７１．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ｄＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡにライゲーションすることによって生成した。双方向性プロモーター（ヒトＰＧＫプロモータープラス反対方向のＣＭＶプロモーターの最小コアエレメント）の存在は、２つのトランスジーンの共発現を可能にする。プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン）のコード配列をさらに含有する。
【0237】
レンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞へのＣａ３ＰＯ４一過性４プラスミド共トランスフェクションによって産生し、超遠心分離によって濃縮した。１μＭ酪酸ナトリウムを、ベクター収集のために培養物に添加した。力価を、２９３Ｔ細胞において限界希釈によって推定し、ベクター粒子をＨＩＶ－１ Ｇａｇ ｐ２４抗原免疫捕捉（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって測定した。ベクターの感染力を、力価と粒子の間の比として計算した。濃縮ベクターに関して、力価は、５×１０８～６×１０９形質導入単位／ｍＬ、および感染力は５×ｌ０４～５×１０５形質導入単位／ｎｇの範囲であった。
【0238】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生
図３は、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の生産プロセスの概略図である。健康なドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、およびｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）によって最大４８時間活性化した後、ヒトＩＬ－１０およびヒトＮＧＦ受容体の切断型をコードする双方向性レンチウイルスベクター（ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ）を感染多重度（ＭＯＩ）２０で形質導入した。
図３は、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の生産プロセスの概略図である。健康なドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、およびｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）によって最大４８時間活性化した後、ヒトＩＬ－１０およびヒトＮＧＦ受容体の切断型をコードする双方向性レンチウイルスベクター（ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ）を感染多重度（ＭＯＩ）２０で形質導入した。
【0239】
９～１１日後、形質導入した細胞を、ΔＮＧＦＲの発現に関してＦＡＣＳによって解析し、ベクターコピー数（ＶＣＮ）を、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量した。
【0240】
１０人の異なるドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞の平均形質導入効率は、４５±１７％であり、ＶＣＮは、２．７±０．６％であった。図４Ａは、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ（ヒトＩＬ－１０およびヒトＮＧＦ受容体の切断型をコードする双方向性レンチウイルスベクター）を形質導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞のパーセンテージ（平均値±ＳＤ、ｎ＝１０、左の棒グラフ）およびベクターコピー数（ＶＣＮ、平均値±ＳＤ、ｎ＝１０、右の棒グラフ）を示す。ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞の頻度およびベクターコピー数を、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞においてデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量した。
【0241】
ΔＮＧＦＲ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２７１ ｍＡｂ－コーティングマイクロビーズを使用して精製し、＞９５％純粋なＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を得た。精製後、細胞を、ＣＤ４およびΔＮＧＦＲのマーカーによって染色し、ＦＡＣＳによって解析した。データは、精製ステップから得られた純度が９８％を超えたことを示した。図４Ｂは、試験した１０人のドナー中２人の代表的なドナー（ドナーＢおよびドナーＣ）からのＦＡＣＳデータを示す。これらの２人のドナーのＣＤ４ＩＬ－１０細胞の純度はそれぞれ、９８．３％および９９．２％であった。精製ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、１４日間隔で３回再刺激し、そのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ機能を、２回目（ＴＦ２）および／または３回目の再刺激（ＴＦ３）機能後に試験した。
【0242】
休止期ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＩＬ－１０を構成的に産生した。活性化すると、産生されるＩＬ－１０レベルは強く増強された。
【0243】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、天然由来のＴｒ１細胞のプロファイルと同等のサイトカイン産生プロファイルを有する
【0244】
単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを、２回目（ＴＦ２）および３回目（ＴＦ３）の再刺激後に解析し、結果を図５に提供する。具体的には、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２００μｌ中に２×１０５個）を、以前に記載されたように（Andolfi et al. Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790およびLocafaro et al. Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269）再刺激した。１４日目、第２ラウンド（ＴＦ２）および第３ラウンド（ＴＦ３）の再刺激後、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、非刺激のままとしたか、または固定ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）によって４８時間活性化した。培養上清を収集し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２２のレベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。全ての試料を三連で試験した。試験したｎ＝８のドナーの平均値±ＳＤを示す。図５に提供する結果は、固定抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂによって刺激されたＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、Ｔｒ１細胞のサイトカイン産生プロファイルを示すことを示している。
【0245】
異なるドナー間の変動が観察されたが、２回目（ＴＦ２）（図５、左のパネル）または３回目（ＴＦ３）（図５、右のパネル）の再刺激後の全体的なサイトカイン産生プロファイルは同等であり、Ｔｒ１細胞のプロファイルを反映した（Roncarolo et al.,Immunity,2018）。Ｔｒ１細胞と同様に、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０およびＩＬ－２２、多様なレベルのＩＬ－５およびＩＦＮ－γ、比較的低レベルのＩＬ－４、および検出不能レベルのＩＬ－２（示していない）を産生した。
【0246】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのグランザイムを発現し、骨髄性白血病細胞を選択的に殺滅する
【0247】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、第２ラウンド（ＴＦ２）の再刺激後にグランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現に関してさらに解析した。図６Ａのデータは、７人の異なるドナーに由来する全てのＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％より多くが高レベルのグランザイムＢを発現したことを示す。
【0248】
第２ラウンド（ＴＦ２）の再刺激からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、ヒト骨髄性白血病細胞株（ＡＬＬ－ＣＭ）および赤白血病細胞株（Ｋ５６２）に対するその細胞傷害効果に関してさらに解析した。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）を、Ｋ５６２およびＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と１：１の比で３日間共培養した。残存白血病細胞株（ＣＤ４５ｌｏｗ、ＣＤ３－）を、各標的細胞に関してＦＡＣＳによって計数した。
【0249】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、図６Ｂに示すように骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）を選択的に殺滅した。殺滅されたＡＬＬ－ＣＭ細胞の％は、６２％～１００％の間で変動したが、赤白血病細胞株Ｋ５６２（非特異的細胞傷害性およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性に対して高度に感受性である）の殺滅は、０～２７％の間で変動した（試験した４人の異なるドナー）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞がグランザイムＢを発現し、骨髄性白血病細胞を有効に殺滅することを確認する。予想されたように、個々のドナーに由来するＣＤ４ＩＬ－１０細胞の殺滅能の何らかの変動が観察された。
【0250】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖性応答を抑制する
【0251】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞をまた、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に及ぼすその効果に関しても解析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の存在下または非存在下で同種成熟樹状（ｍＤＣ）細胞（５×１０３個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞またはＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞に関してゲート設定後、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図７Ａおよび７Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に及ぼす、６人の異なるプールしていないドナー（図７ＡではドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦ、図７ＢではドナーＨ、ドナーＩ、およびドナーＬ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果を、増殖および抑制のパーセンテージで示す。図８Ａおよび８Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に及ぼす、６人の異なる単一ドナー（図８ＡではドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦ、図８ＢではドナーＨ、ドナーＩ、およびドナーＬ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果を示す。
【0252】
結果は、６人の異なる単一ドナーからのプールされていない個別に試験したＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、同種ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖応答を下方調節したことを実証した。ＣＤ４＋Ｔ細胞に及ぼす抑制効果は、５１％～９６％の間で変動したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞に及ぼす抑制効果は、６２％～７３％の間で変動した。
【0253】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生および特徴付け
【0254】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、複数のドナーからのＣＤ４＋細胞を使用して、上記および図３に記載するように生成した。各ドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、２回目（ＴＦ２）および３回目（ＴＦ３）の再刺激によって刺激した。３回目の刺激後、３人のドナーからのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、１：１：１の比でプールし、固定ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）によって４８時間刺激した。
【0255】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、個々のドナーのＣＤ４Ｉｌ－１０細胞およびＴｒ１細胞のプロファイルと同等であるサイトカイン産生プロファイルを有する
【0256】
培養上清を収集し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２２のレベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。図９に提供される結果は、３人の異なる同種ドナーからプールした（１：１：１でプールした）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生（黒色のドット）が、個々のドナー（ｎ＝８）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞のそれと同等であったことを示す（灰色の棒グラフ）。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０およびＩＬ－２２、多様なレベルのＩＬ－５、ＩＦＮ－γ、および低レベルのＩＬ－４、および検出不能レベルのＩＬ－２（示していない）を産生した。これらのデータは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞をプールすることが実現可能であること、およびこれらのポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、単一ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞およびＴｒ１細胞のサイトカイン産生シグネチャーを維持することを示している。重要なことに、プールした同種細胞集団は、＞９５％の生存細胞を含有し、それらが互いを殺滅しなかったことを示している。
【0257】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのグランザイムＢを発現し、骨髄性白血病細胞株を殺滅する
【0258】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、第３ラウンド（ＴＦ３）の再刺激後に、グランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現に関してさらに解析した。図１０Ａのデータは、ほとんどのポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＧｚＢを発現することを示している。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％より多くが、単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＧｚＢ発現と同等であるグランザイムＢを発現した（図１０Ａ）。
【0259】
第３ラウンド（ＴＦ３）の再刺激からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ細胞株）またはＫ５６２に及ぼすその細胞傷害効果に関してさらに解析した。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）を、Ｋ５６２およびＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と、１：１の比で３日間共培養した。残存白血病細胞株（ＣＤ４５ｌｏｗ、ＣＤ３－）を、各標的細胞に関してＦＡＣＳにより計数した。図１０Ｂに提供した結果は、非特異的細胞傷害性に対して高度に感受性であるＫ５６２細胞に対する何らかのレベルの細胞傷害性を示す。それにもかかわらず、単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（白色の棒グラフ）のレベルと同等である、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）に対するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（黒色のドット）の選択的殺滅レベルが得られた。
【0260】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖応答を抑制する
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞をまた、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に及ぼすその効果に関して解析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の存在下または非存在下、同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０３個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞またはＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞に関してゲート設定後、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図１１Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦ（Ｃ－Ｅ－Ｆ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。図１１Ｂは、試験前に凍結、保存、および融解されているドナーＨ、ドナーＩ、およびドナーＬ（Ｈ－Ｉ－Ｌ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞をまた、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に及ぼすその効果に関して解析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（５×１０４個／ウェル）によって標識し、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０４個／ウェル）の存在下または非存在下、同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０３個／ウェル）および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂによって１：１のレスポンダー：サプレッサー比で刺激した。３日間培養後、増殖性のレスポンダー細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞またはＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞に関してゲート設定後、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の希釈により決定した。図１１Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ、およびドナーＦ（Ｃ－Ｅ－Ｆ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。図１１Ｂは、試験前に凍結、保存、および融解されているドナーＨ、ドナーＩ、およびドナーＬ（Ｈ－Ｉ－Ｌ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。
【0261】
図１１Ａは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人の異なるドナーから）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答をそれぞれ、９７％および７４％抑制することを示す。試験前に細胞が凍結、保存および融解されていた後に試験したポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の第２の異なるバッチについて同等の結果が得られた（図１１Ｂ）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の抑制はそれぞれ、６８％および７５％であった。これらのデータは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、機能を失うことなく凍結、保存および融解することができることを示している。
【0262】
集合的に、ポリドナーＣＤ４ＩＬ１０細胞について得られたデータは、これらの細胞調製物を、いかなる問題もなくプールすることができることを示している。それらは、＞９５％の生存細胞を含有し、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の全ての関連する機能（サイトカイン産生、細胞傷害能、および同種Ｔ細胞応答の抑制）を維持する。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のより大きいプールの使用は、異なる個々のドナーを起源とするＣＤ４ＩＬ－１０細胞ロット間で観察される自然の変動を低減させるはずであり、ヒト治療のための大量の既製のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を提供するはずである。
【0263】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞産物は、良好に定義された、ロット間の変動が少ない、効力、および放出基準の決定を可能にするより均質な産物に関して有意な利点を有する。加えて、これは、連続的な大規模細胞産生プロセスの開発を可能にする。
【0264】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の他の産生方法
【0265】
レンチウイルス形質導入の前に、少なくとも３～５人の異なるドナーからのバフィーコートをプールする。ＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ４抗体を使用する正の選択によってバフィーコートから単離する。プールしたＣＤ４＋細胞の純度をＦＡＣＳによってチェックする。あるいは、凍結したヒトＣＤ４＋細胞を、少なくとも３～５人の健常ドナーから得る。凍結したヒトＣＤ４＋細胞を、使用前に融解する。バフィーコートまたは凍結保存物からのＣＤ４＋細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体の組合せ、またはＣＤ３およびＣＤ２８抗体コーティングビーズによって、ＩＬ－２の存在下で２４～４８時間活性化する。一部の例では、バフィーコートまたは凍結保存物からのＣＤ４＋細胞を、可溶性抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、およびｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）によって４８時間活性化し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生するために、上記のようにヒトＩＬ－１０をコードする双方向性レンチウイルスベクターを形質導入する。
【0266】
一部の例では、Ｔ細胞ドナー（またはドナーから単離されたＣＤ４＋細胞）のＨＬＡハプロタイプを最初に決定し、所望のＨＬＡハプロタイプを有するＣＤ４＋細胞を選択的にプールして使用する。
【0267】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、上記の活性化ＣＤ４＋細胞に、上記のヒトＩＬ－１０およびΔＮＧＦＲコード配列を含有するレンチウイルスベクターを形質導入することによって生成する。
【0268】
形質導入の５～９日後である７～１１日目に、細胞を採取し、形質導入が成功したＴ細胞を、抗ＮＧＦＲ抗体を利用して精製する。このプロセスは一般的に、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％純粋な集団をもたらす。
【0269】
精製されたポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を計数し、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体の混合物、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体コーティングビーズによって、任意選択でフィーダー細胞の存在下、ＩＬ－２の存在下でさらに８～１０日間再刺激する。一部の例では、精製されたポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、フィーダー細胞の存在下で再刺激する。
【0270】
５週間の総培養期間の後、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を採取し、計数し、自然発生の、またはＣＤ３およびＣＤ２８抗体、もしくはＣＤ３およびＣＤ２８抗体コーティングビーズによる活性化後の、ＩＬ－１０の産生能に関して試験する。加えて、ＧｒｚＢおよびパーフォリンのレベルを測定する。それらが、ヒトＴ細胞（ＰＢＭＣ）ならびに精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を抑制する能力もまた試験する。
【0271】
加えて、ＩＬ－２２の産生を、構成的に、ならびにＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－４およびＩＬ－５などの他のサイトカインの産生に関して以前に記載されたように、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体の組合せを使用して２００マイクロリットルの容量中で、２００，０００個のＣＤ４ＩＬ－１０細胞の活性化後に測定する。ＩＬ－２２産生レベルを、国際公開第２０１６／１４６５４２号パンフレットにおいて他のサイトカインについて記載されるように、ＩＬ－２２特異的ＥＬＩＳＡにおいて測定する。プールしたＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、凍結後、保存する。
【0272】
［実施例２］
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用するＧｖＨＤの処置または防止
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を、ヒト化ｘｅｎｏ ＧｖＨＤ疾患モデル、ＮＳＧマウスモデルにおいて、図１２に例証されるようにヒトＰＢＭＣによって誘導されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤに及ぼすその効果に関して試験した。ＮＳＧマウスに、致死量下の放射線を照射し、（ｉ）ヒトＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）、（ｉｉ）ポリドナー（３人のドナー；ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個／マウス）、または（ｉｉｉ）ヒトＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）とポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）（５×１０６個／マウス）の組合せを静脈内注射した。Ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを、以前に記載されるように（Bondanza et al. Blood 2006）、生存、体重減少（＞２０％体重減少）、皮膚病変、毛並みの状態、活動度、および体を丸めることに基づいて評価した。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用するＧｖＨＤの処置または防止
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を、ヒト化ｘｅｎｏ ＧｖＨＤ疾患モデル、ＮＳＧマウスモデルにおいて、図１２に例証されるようにヒトＰＢＭＣによって誘導されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤに及ぼすその効果に関して試験した。ＮＳＧマウスに、致死量下の放射線を照射し、（ｉ）ヒトＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）、（ｉｉ）ポリドナー（３人のドナー；ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個／マウス）、または（ｉｉｉ）ヒトＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）とポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）（５×１０６個／マウス）の組合せを静脈内注射した。Ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを、以前に記載されるように（Bondanza et al. Blood 2006）、生存、体重減少（＞２０％体重減少）、皮膚病変、毛並みの状態、活動度、および体を丸めることに基づいて評価した。
【0273】
図１３は、注射後、各々の日においてｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを示さないＮＳＧマウスの％を示す。５×１０６個のヒトＰＢＭＣを、放射線照射したＮＳＧマウスに投与すると、予想外にも異常な劇症ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤをもたらした。全てのマウスが、１０日目に死亡し、これは非常に致死性のｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを反映する。５×１０６個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を共投与すると、この劇症ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを遅らせたが、マウスが、１４日目に屠殺基準である既定の人道的２０％体重減少に達したために屠殺した（図１３）。それにもかかわらず、これらの結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０が、非常に重度のｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを遅らせることができることを示している。重要なことに、ＰＢＭＣと同じ用量（５×１０６個）を単独で投与したポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤのいかなる徴候も誘導しなかった。
【0274】
ヒトＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在をまた、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）、ポリドナー（３人のドナー；ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個／マウス）、またはヒトＰＢＭＣ（５×１０６個／マウス）とポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人のドナー；ＢＣ－Ｃ／Ｅ／Ｆ）（５×１０６個／マウス）の組合せを、注射後１４日目に注射したＮＳＧマウスの脾臓（図１４、左のパネル）および骨髄（図１４、右のパネル）においても試験した。図１４で提供される結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が脾臓および骨髄に遊走したことを示す。これらの細胞の低いパーセンテージが、細胞注入の１４日後に存在することが見出された。これらの結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ヒトＰＢＭＣによって誘導される劇症ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを遅らせたが、それ自身はいかなるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤも誘導しないことを示している。
【0275】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、精製ＣＤ４＋細胞による重度ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを阻害する
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、図１５に例証されるように、ＧｖＨＤ疾患を２．５×１０６個の精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の投与によって誘導するヒト化ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤモデルにおいて試験した。ＮＳＧマウスに、０日目に致死量下の放射線を照射し、３日目にヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６個／マウス）を単独で、またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人の異なるドナー；ＢＣ－Ｈ／Ｉ／Ｌ）（２．５×１０６個／マウス）との組合せ、またはプールからの単一ドナー（ＢＣ－Ｈ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個／マウス）との組合せを静脈内に注射した。Ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを、以前に記載されるように（Bondanza et al. Blood 2006）、生存、体重減少（＞２０％体重減少）、皮膚病変、毛並みの状態、活動度、および体を丸めることに基づいて評価した。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、図１５に例証されるように、ＧｖＨＤ疾患を２．５×１０６個の精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の投与によって誘導するヒト化ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤモデルにおいて試験した。ＮＳＧマウスに、０日目に致死量下の放射線を照射し、３日目にヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６個／マウス）を単独で、またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人の異なるドナー；ＢＣ－Ｈ／Ｉ／Ｌ）（２．５×１０６個／マウス）との組合せ、またはプールからの単一ドナー（ＢＣ－Ｈ）からのＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個／マウス）との組合せを静脈内に注射した。Ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを、以前に記載されるように（Bondanza et al. Blood 2006）、生存、体重減少（＞２０％体重減少）、皮膚病変、毛並みの状態、活動度、および体を丸めることに基づいて評価した。
【0276】
図１６は、注射後の各々の日にＧｖＨＤを示さないＮＳＧマウスの％を示す。結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０（ＢＣ－Ｈ／Ｉ／Ｌ）細胞が、ヒト同種ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを阻害することができることを示している。この実験では、ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤは非常に重度であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞を投与した対照群の全てのマウスが、２０日目で死亡した。これに対し、２．５×１０６個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０の共投与は、ＧｖＨＤを７５％阻害した。単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞もまた、保護的であったが、効果はより弱かった。
【0277】
他の実験
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療効果を、４つの異なる群のマウスにおいて試験する：（ｉ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞に対して非血縁のドナーからのヒトＰＢＭＣを投与したマウス（ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤ陽性対照）；（ｉｉ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与したマウス（陰性対照）；（ｉｉｉ）ＰＢＭＣとポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の１：１の比の組合せを投与したマウス；および（ｉｖ）ＰＢＭＣとポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の２：１の比または異なる比の組合せを投与したマウス。ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組合せを投与した動物では、一部の動物に、ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を同時に投与し、一部の動物に、ＰＢＭＣを投与した数日（例えば、５日）後にポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与し、および一部の動物には、ＰＢＭＣを投与する数日（例えば、５日）前にポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与する。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療効果を、４つの異なる群のマウスにおいて試験する：（ｉ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞に対して非血縁のドナーからのヒトＰＢＭＣを投与したマウス（ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤ陽性対照）；（ｉｉ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与したマウス（陰性対照）；（ｉｉｉ）ＰＢＭＣとポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の１：１の比の組合せを投与したマウス；および（ｉｖ）ＰＢＭＣとポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の２：１の比または異なる比の組合せを投与したマウス。ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組合せを投与した動物では、一部の動物に、ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を同時に投与し、一部の動物に、ＰＢＭＣを投与した数日（例えば、５日）後にポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与し、および一部の動物には、ＰＢＭＣを投与する数日（例えば、５日）前にポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与する。
【0278】
マウスを、ＰＢＭＣおよび／またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与後、１、２、３、４週目、および必要であれば５週目に体重を測定することにより、ＧｖＨＤの発症に関してモニターする。体重減少に加えて、マウスを、皮膚病変、毛並みの状態および活動度に関して検査する。処置群のマウスを、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が長期間の生存に及ぼす効果を決定するために追加の期間モニターする。
【0279】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の量および局在をまた、投与後の末梢血および組織中でもモニターする。具体的には、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在を、末梢血および炎症部位：脾臓および骨髄でモニターする。リンパ節および腸管を含むポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の他の部位での存在をモニターする。処置群（複数可）のマウスを、さらに３週間モニターして長期の生存を決定する。
【0280】
結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤの低減および防止において有効であることを実証する。
【0281】
［実施例３］
ＧｖＨＤの阻害およびがんの処置
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を、ヒトＰＢＭＣおよびＡＭＬ腫瘍細胞を移植したＮＳＧマウスモデルにおいて、ヒトＰＢＭＣによって誘導されたｘｅｎｏ－ＧｖＨＤに及ぼすその効果および抗腫瘍効果に関して試験する。ＡＭＬ細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）を、国際公開第２０１６／１４６５４２号パンフレットに以前に記載されるようにｉ．ｖ．投与する。ＰＢＭＣまたはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞、またはその組合せを、３日後に投与する。
ＧｖＨＤの阻害およびがんの処置
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を、ヒトＰＢＭＣおよびＡＭＬ腫瘍細胞を移植したＮＳＧマウスモデルにおいて、ヒトＰＢＭＣによって誘導されたｘｅｎｏ－ＧｖＨＤに及ぼすその効果および抗腫瘍効果に関して試験する。ＡＭＬ細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）を、国際公開第２０１６／１４６５４２号パンフレットに以前に記載されるようにｉ．ｖ．投与する。ＰＢＭＣまたはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞、またはその組合せを、３日後に投与する。
【0282】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、実施例１に記載されるように得る。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療効果を、各々に放射線を照射し、０日目に５×１０６個のＡＬＬ－ＣＭ細胞を投与したマウス（ＡＭＬマウス）の４つの異なる群において試験する：（ｉ）追加の処置を行わないＡＭＬマウス；（ｉｉ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞と非血縁のドナーからの５×１０６個のヒトＰＢＭＣを投与したＡＭＬマウス－ＰＢＭＣは重度のｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを引き起こす；（ｉｉｉ）２．５×１０６個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与したＡＭＬマウス；ならびに（ｉｖ）ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の１：１または２：１の比、または異なる比の組合せを投与したＡＭＬマウス。マウスの１つの追加の群には、ＡＬＬ－ＣＭＬ細胞を投与しないが、放射線照射の３日後に５×１０６個のヒトＰＢＭＣを投与する。
【0283】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がヒトＰＢＭＣによって誘導されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤに及ぼす効果を、体重減少、皮膚病変、毛並みの状態、活動度、死亡率、および長期生存に基づいて試験する。ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の抗腫瘍または移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を、循環中の腫瘍細胞の低減および長期腫瘍無病生存に基づいて試験する。
【0284】
一部のマウスを、長期生存および完全な腫瘍退縮をモニターするために最大７週間モニターする。
【0285】
結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤの阻害およびがんの処置の両方において有効であることを実証する。
【0286】
［実施例４］
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用するがんの処置
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を、ＮＳＧマウスにおけるＴ細胞治療のＡＬＬ－ＣＭ白血病モデルにおいて試験した。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用するがんの処置
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を、ＮＳＧマウスにおけるＴ細胞治療のＡＬＬ－ＣＭ白血病モデルにおいて試験した。
【0287】
ＮＳＧマウスに、致死量下の放射線を照射して、０日目に骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）（２．５×１０６個）を静脈内注射した。第１の群の動物では、追加の細胞を投与しなかった。第２の群の動物では、ＰＢＭＣ（２．５×１０６個）を３日目に注射した。第３の群の動物では、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を、３日目に注射した。第４の群の動物では、単一ドナー（ドナーＢＣ－Ｉ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を３日目に注射した。第５の群の動物では、単一ドナー（ドナーＢＣ－Ｈ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を、３日目に注射した。移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を、動物において循環中の白血病細胞の低減および長期白血病無病生存に基づいて試験した。白血病を、以前に記載されるように（Locafaro G. et al Molecular Therapy 2017）測定した。図１７Ａを参照されたい。
【0288】
図１７Ｂおよび図１７Ｃに提供されるように、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄性白血病細胞単独を注射したマウスは全て、１７日目に広範な白血病の進行を示した。２．５×１０６個のＰＢＭＣの投与は、白血病の進行の強い阻害をもたらした。興味深いことに、白血病進行阻害の同等のレベルが、単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０（図１７Ｂ）またはポリドナーＣＤ４ＩＬ１０（図１７Ｃ）細胞の両方によって得られた。これらのデータは、単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ１０が、強い直接的な抗白血病効果を有することを示している。
【0289】
単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０およびポリドナーＣＤ４ＩＬ１０の移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄性白血病細胞を注射したマウスにおいてＰＢＭＣと組み合わせてさらに試験した（図１８Ａ）。２．５×１０６個のＰＢＭＣの投与は、白血病進行の強い阻害をもたらした。２．５×１０６個のＰＢＭＣを（２．５×１０６個の）単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０細胞と組み合わせて投与すると、白血病進行のより強い阻害をもたらした（図１８Ｂ）。２．５×１０６個のＰＢＭＣを２．５×１０６個のポリドナーＣＤ４ＩＬ１０細胞と組み合わせて投与すると、単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０（２．５×１０６個）細胞と同等の相乗的白血病阻害効果を有した（図１８Ｃ）。これらのデータは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ１０細胞が、ＰＢＭＣの保護的ＧＶＬ効果を妨害せず、ＰＢＭＣと相乗的に作用して、強いＧｖＬ効果を媒介することを示している。
【0290】
[実施例５]
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用する慢性炎症および自己免疫疾患の処置
ＮＬＰＲ３インフラマソームの活性化は、多くの慢性炎症疾患および自己免疫疾患に関係している。ＮＬＰＲ３インフラマソームは、単球／マクロファージによる炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８のカスパーゼ－１媒介産生をもたらす「危険シグナル」によって活性化され得る。一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施して、ＮＬＰＲ３インフラマソームおよびヒト単球によるＩＬ－１β／ＩＬ－１８産生に及ぼすポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果を調べる。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用する慢性炎症および自己免疫疾患の処置
ＮＬＰＲ３インフラマソームの活性化は、多くの慢性炎症疾患および自己免疫疾患に関係している。ＮＬＰＲ３インフラマソームは、単球／マクロファージによる炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８のカスパーゼ－１媒介産生をもたらす「危険シグナル」によって活性化され得る。一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施して、ＮＬＰＲ３インフラマソームおよびヒト単球によるＩＬ－１β／ＩＬ－１８産生に及ぼすポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果を調べる。
【0291】
最初に、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上での標準的な密度勾配遠心分離により末梢血から単離する。単球を、単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、製造元の使用説明書に従って負の選択によりヒトＰＢＭＣから単離する。正の選択または接着は、細胞の望ましくない活性化をもたらし得ることから、負の選択が好ましい。単離された単球を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて３％毒素フリーのヒトＡＢ血清を含有する培養培地中、２×１０５または１×１０５個のポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０個／２００μｌ／ウェルの存在下、細胞５×１０４個／２００μｌで播種する。
【0292】
表１は、各セットが６ウェルの細胞を含む９セットの単球に適用した処置条件を要約する。
【0293】
【表1】
【0294】
表１に概要した処置後、上清を、各群に関して６個のウェルから収集し、ＩＬ－１β／ＩＬ－１８産生を、成熟ＩＬ－１βまたはＩＬ－１８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して特異的なＥＬＩＳＡによって測定する。選択した群の６個のウェルから収集した細胞を、ウェスタンブロットによって解析し、活性化カスパーゼ１のレベルを決定する。
【0295】
実験データは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、活性化された単球によるＩＬ－１βおよびＩＬ－１８産生を下方調節することを示す。それらはさらに、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、活性化された単球による成熟カスパーゼ－１産生を下方調節することを示している。加えて、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０およびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０によって産生されたＩＬ－１０は、インフラマソームを下方調節する。
【0296】
類似の実験を、単球ではなくてヒトマクロファージまたは樹状細胞について実施する。実験結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、活性化されたマクロファージおよび樹状細胞からのＩＬ－１β、ＩＬ－１８、および成熟カスパーゼ－１産生をさらに下方調節することを実証する。
【0297】
これらのデータは、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用して、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性化を伴う疾患または障害を処置することができることを示唆している。特に、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用して、慢性炎症疾患および自己免疫疾患を処置することができる。ＮＬＰＲ３インフラマソームは、外因性または内因性の「危険シグナル」、例えば病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、シリカ、アスベスト、損傷を受けたミトコンドリア、壊死した細胞、およびストレスを受けた細胞からの危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）様産物、ならびに尿酸結晶によって活性化され得る。
【0298】
[実施例６]
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清は、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化、ならびにヒト単球によるＩＬ－１βおよびＩＬ－１８産生を阻害する
ＣＤ１４＋単球を、汎単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢＭＣから単離し、９６ウェル平底マイクロタイターウェルに２×１０５個／２００μＬ／ウェルで播種し、ＬＰＳの存在下で培養した。細胞を、表１に要約するように、Ｚ－ＹＶＡＤｆｍｋ（２０マイクロモル）、ＭＭＣ９５０（１０マイクロモル）、ＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍＬ）または様々な濃度の単一ドナーもしくはプールしたドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の存在下でさらに培養した。
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清は、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化、ならびにヒト単球によるＩＬ－１βおよびＩＬ－１８産生を阻害する
ＣＤ１４＋単球を、汎単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢＭＣから単離し、９６ウェル平底マイクロタイターウェルに２×１０５個／２００μＬ／ウェルで播種し、ＬＰＳの存在下で培養した。細胞を、表１に要約するように、Ｚ－ＹＶＡＤｆｍｋ（２０マイクロモル）、ＭＭＣ９５０（１０マイクロモル）、ＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍＬ）または様々な濃度の単一ドナーもしくはプールしたドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清の存在下でさらに培養した。
【0299】
上清を、以前に記載されたように（Andolfi et al. 2012,Mol. Therapy Vol. 20,1778-1790,Locafaro et al. Mol Ther 2017,25,2254）、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体の組合せによって７２時間活性化した単一ドナーまたはプールしたドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞から得た。一部の例では（図１９Ｃおよび１９Ｄ）、単球を、ＬＰＳ活性化の最後の３０分間に添加したＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化剤であるニゲリシン（「ＮＩＧ」）と組み合わせてＬＰＳと共にインキュベートした。
【0300】
ＮＬＰＲ３インフラマソームを、ＬＰＳによって活性化すると、成熟カスパーゼ１ならびにＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の生物活性型の産生をもたらした。ＬＰＳ活性化の非存在下で播種した単球は、インキュベーション期間の間検出可能レベルのＩＬ－１０を産生しなかった（示していない）。
【0301】
単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の上清（１７６９ｐｇ ＩＬ－１０／ｍＬを含有する）を添加すると、ドナー＃１および＃２からのＬＰＳ活性化単球によるＩＬ－１β産生をそれぞれ、５０％、２５％および１２．５％の濃度で用量依存的に阻害した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。ＧＦＰを形質導入したＣＤ４＋細胞の上清を対照として使用した。ＩＬ－１β産生の完全な阻害が、５０％および２５％の濃度で観察されるが、ＧＦＰを形質導入した対照ＣＤ４＋細胞の上清は、濃度５０％で無効であった。
【0302】
様々な濃度のＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞上清（５０％、２５％、または１２．５％）、Ｚ－ＹＶＡＤｆｍｋ、またはＭＣＣ９５０を、ＬＰＳおよびニゲリシン（「ＮＩＧ」）によって活性化した単球についてさらに試験した。単一ドナー（ＢＣ－Ｅ）またはプールしたドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞からの上清はそれぞれ、５２９５または３５３２ｐｇ ＩＬ－１０／ｍＬを含有した。単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の上清はまた、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化剤ニゲリシンによって増強されたＬＰＳ誘導ＩＬ－１β産生の阻害においても非常に有効であった（図１９Ｃおよび図１９Ｄ）。
【0303】
データは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞からの上清が、５０％の濃度で、不可逆的カスパーゼ１阻害剤Ｚ－ＹＶＡＤｆｍｋ（Guo et al. 2015, Nature Med 21, 677）、選択的ＮＬＰＲ３インフラマソーム阻害剤ＭＣＣ９５０（Coll et al. 2019,Nature Chem. Biol 15,556）、および組換えＩＬ－１０と同程度に有効であったことを実証し、ＩＬ－１０含有上清が、ＮＬＰＲ３インフラマソーム活性化および成熟カスパーゼ１産生を阻害し、炎症促進性サイトカインＩＬ－１βの産生の強い阻害をもたらすことを示している（図１９Ａ～１９Ｄ）。
【0304】
同等の結果が、単一ドナー（ＢＣ－Ｅ）および２人の異なるドナー（ＢＣ－Ｃ／Ｅ）からプールしたＣＤ４ＩＬ－１０細胞の上清による第２のシリーズの実験において得られた。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、記載されるように（Andolfi et al. 2012）ＣＤ３およびＣＤ２８抗体の組合せによって活性化した。３日後、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞からの上清を収集した。これらの上清はそれぞれ、５２９５および３５３２ｐｇ ＩＬ－１０／ｍＬを含有し、ドナー＃３からの単球によるＬＰＳ誘導ＩＬ－１β産生を用量依存的に阻害した（図１９Ｅ）。上清は５０％濃度で、Ｚ－ＹＶＡＤｆｍｋおよびＭＣＣ９５０と同程度に有効であった。プールしたＣＤ４ＩＬ－１０細胞の上清の阻害効果は、抗ＩＬ－１０受容体抗体によって完全に中和された。同様に、２５８９ｐｇ ＩＬ－１０／ｍＬを含有する３人の異なるドナーからプールした上清は、ドナー＃４からの単球によるＩＬ－１β産生を用量依存的に阻害した（図１９Ｆ）。上清の阻害効果は、ＩＬ－１０受容体抗体によって完全に中和され、ＮＬＰＲ３活性化がＩＬ－１０によって媒介されることを実証している。結果は、炎症促進性サイトカインであるＩＬ－１βの産生が、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞によって産生されるＩＬ－１０によって強く阻害されることを示している。予想されるように、抗ＩＬ－１０受容体抗体は、Ｚ－ＶＡＤｆｍｋおよびＭＣＣ９５０によって媒介されるＩＬ－１β産生の阻害効果を有しなかった（図１９Ｅ）。
【0305】
ＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞を、ＬＰＳおよびニゲリシンによって活性化されたドナー＃４からの単球についてさらに試験した。２５８３または２５８９ｐｇ ＩＬ－１０／ｍＬをそれぞれ含有する、様々な濃度の単一ドナー（ＢＣ－Ｖ）またはポリドナー（３人のドナー；ＢＣ－Ｔ／Ｕ／Ｖ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞上清、ＺＹＶＡＤｆｍｋ、またはＭＣＣ９５０を試験した。図１９Ｇに提供するデータは、３人の異なるドナー（ＢＣ Ｔ－Ｕ－Ｖ）のプールした上清が、ＬＰＳとニゲリシンとの組合せによって誘導されるＩＬ－１８産生を下方調節することを示す。
【0306】
集合的に、これらのデータは、単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって産生されたＩＬ－１０が、ＮＬＰＲ３インフラマソームを強く下方調節し、炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の強い阻害をもたらすことを示している。
【0307】
[実施例７]
単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ｘｅｎｏ ＧｖＨＤおよびｉｎ ｖｉｖｏでの骨髄腫瘍の成長を阻害する
単一ドナー（ＢＣ－Ｔ、ＢＣ－Ｖ、およびＢＣ－Ｅ）またはポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の機能的特性および品質を、Andolfi et al. Mol Ther 2012,20,177およびLocafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254に記載されるように試験した。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０、多様なレベルのＩＦＮ－γ、非常に低レベルのＩＬ－４および検出不能なＩＬ－２（後者は示していない）を産生し、Ｔｒ１細胞の特徴的なサイトカイン産生プロファイルを反映する（図２１）。
単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ｘｅｎｏ ＧｖＨＤおよびｉｎ ｖｉｖｏでの骨髄腫瘍の成長を阻害する
単一ドナー（ＢＣ－Ｔ、ＢＣ－Ｖ、およびＢＣ－Ｅ）またはポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の機能的特性および品質を、Andolfi et al. Mol Ther 2012,20,177およびLocafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254に記載されるように試験した。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０、多様なレベルのＩＦＮ－γ、非常に低レベルのＩＬ－４および検出不能なＩＬ－２（後者は示していない）を産生し、Ｔｒ１細胞の特徴的なサイトカイン産生プロファイルを反映する（図２１）。
【0308】
さらに、単一ドナー（ＢＣ－Ｔ、ＢＣ－Ｖ、およびＢＣ－Ｅ）またはポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に及ぼす抑制能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同種ＰＢＭＣについて測定した。ＰＢＭＣを、ｅＦＬｕｏｒ６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって標識した。標識したＰＢＭＣ（１×１０５個）を、固定ＣＤ３（１０ｍｇ／ｍＬ）および可溶性ＣＤ２８抗体（１ｍｇ／ｍＬ）によって活性化した。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、９６ウェル丸底プレートに最終容量０．２ｍＬで１：１の比で添加した。４日間共培養後、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識レスポンダー細胞の増殖に及ぼすその抑制効果を、記載されるように（Locafaro et al. Mol Ther 2017,25,2254）、フローサイトメトリーを使用してｅＦｌｕｏｒ６７０の希釈により決定した。図２２は、フローサイトメトリーの結果を提供する。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を８０％より大きく強く阻害した（図２２）。
【0309】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）および赤白血病細胞株（Ｋ５６２）に対するその細胞傷害効果に関してさらに解析した。単一ドナー（ＢＣ－ＥおよびＢＣ－Ｖ）、またはポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、ＡＬＬ－ＣＭまたはＫ５６２細胞と１：１の比で共培養した。３日後、細胞を採取し、生き残ったＣＤ４５ｌｏｗ、ＣＤ３－標的細胞を計数し、記載のように（Locafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254）、ＦＡＣＳによって解析した。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞はまた、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄腫瘍細胞に対して強い直接の細胞傷害効果を媒介したが、それらは、その細胞傷害活性にとって必要なクラスＩ ＭＨＣ発現を欠如する感受性のＫ５６２細胞を殺滅することはできなかった（図２３）。単一ドナー（ＢＣ－ＥおよびＢＣ－Ｖ）またはポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、これらの２つの標的細胞株（ＡＬＬ－ＣＭおよびＫ５６２）に対して同等の細胞傷害活性を有した。
【0310】
単一ドナー（ＢＣ－Ｅ）およびポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の細胞傷害作用をまた、ヒト化ｘｅｎｏ ＧｖＨＤ疾患モデル、すなわちＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を静脈内注射したＮＳＧマウスを使用してｉｎ ｖｉｖｏでも試験した。同種ドナーからのヒトＰＢＭＣによって誘導されたＧｖＨＤに及ぼすその効果ならびに治療状況での急性骨髄性白血病細胞株ＡＬＬ ＣＭの成長に及ぼすその効果を、図２０に例証するように試験した。
【0311】
８～１０週齢の雌性ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ、（ＮＳＧ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ－Ｒｉｖｅｒ Ｉｔａｌｉａ（Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から得た。実験プロトコールは、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅの動物試験に関する内部委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））の承認を受けた。０日目に、マウスに、線形加速器からの全身照射を行った。ＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を０日目に注射した。０日目に、異なる群のマウスに、細胞なし、同種ＰＢＭＣ（２．５×１０６個）、単一ドナー（ＢＣ－Ｅ、２．５×１０６個）、または３人の異なるドナーから１：１：１の比でプールしたポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ、２．５×１０６個）と同種ＰＢＭＣ（２．５×１０６）またはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６）の組合せを３日目に注射した。全ての細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地２５０μｌの容量でｉ．ｖ．投与した。マウスを週に３～４回モニターした。
【0312】
ＮＳＧマウスを、マウス５匹の５つのコホートに分け、各群を、０日目に（ｉ）対照としての細胞なし；（ｉｉ）同種単核細胞（ＰＢＭＣ）；（ｉｉｉ）同種ＰＢＭＣおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）；（ｉｖ）同種ＰＢＭＣおよび単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｅ）；、または（ｖ）ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）細胞を３日目に投与することによって処置した。骨髄性白血病の進行を、以前に記載されたように（Locafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254）測定した。
【0313】
ＡＬＬ－ＣＭ細胞をＮＳＧマウスに投与すると、これらの細胞の急速な増大をもたらし、全てのマウスが死亡したか、または２０日目に屠殺しなければならなかった。ＰＢＭＣの注射は、予想されたように白血病の進行を防止した。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ１０細胞の両方を、同種ＰＢＭＣと組み合わせて投与しても、ＰＢＭＣの抗骨髄性白血病効果を妨害しなかった。
【0314】
ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）細胞を、ＡＬＬ－ＣＭ細胞の投与の３日後（この時点で既にこれらの細胞の大量の増大が進行中である）に注射すると、腫瘍成長の阻害をもたらした。これらの結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで直接の治療的抗骨髄性白血病効果を有することを示している（図２４）。
【0315】
しかし、その有益な抗骨髄性白血病効果にもかかわらず、ＰＢＭＣは、非常に重度のｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを誘導し、全てのマウスが２４日までに死亡した（図２５）。試験において、単一ドナー（ＢＣ－Ｅ）およびポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、ＮＳＧマウスに投与後のＰＢＭＣによって誘導されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤのその阻害能に関して試験した。０日目に、ＮＳＧマウスにＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を注射した。マウスを５群に分け、各群を、（ｉ）対照としての細胞なし；（ｉｉ）同種単核細胞（ＰＢＭＣ）；（ｉｉｉ）同種ＰＢＭＣおよびポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞；（ｉｖ）同種ＰＢＭＣおよび単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＢＣ－Ｅ）、またはポリドナー（ＢＣ－Ｖ／Ｔ／Ｅ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を３日目に注射することによって処置した。動物において、ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを、生存および体重減少によって測定した。加えて、体を丸める、毛並みの状態および皮膚の完全性を、記載されるように（Bondanza et al,Blood, 2006, 107, 1828）モニターした。体重減少が２０％より多くに達した場合、マウスを倫理的理由から屠殺した。図２５は、ＡＬＬ－ＣＭ細胞（２．５×１０６個）を１日目に注射し、単一ドナーまたはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下または非存在下でＰＢＭＣによる処置を行った後、各々の日におけるＧｖＨＤを示さないＮＳＤマウスの％を示す。
【0316】
結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを誘導せず、同種ＰＢＭＣによって誘導されるｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを下方調節したことを示す。集合的に、これらの結果は、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、重度のｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを下方調節し、治療状況で直接の抗骨髄性白血病効果を有し、ＰＢＭＣの保護的な抗骨髄性白血病効果を妨害しないことを示している。
【0317】
[実施例８]
４人の異なるドナーに由来するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入
４人の異なるドナーに由来するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入を、移入がＰＢＭＣ誘導ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを阻害する能力に関して試験した。
４人の異なるドナーに由来するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入
４人の異なるドナーに由来するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入を、移入がＰＢＭＣ誘導ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを阻害する能力に関して試験した。
【0318】
これらの実験では、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ドナーＣ；ロットＣ）および４人の異なるドナーに由来するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ドナーＣ、Ｅ、Ｆ、およびＨ；ロットＣＥＦＨ）を、同種ＰＢＭＣによって誘導されるヒト化マウスＧｖＨＤモデルにおいて試験した。このモデルでは、ＮＳＧマウスに、０日目に致死量下の放射線を照射し、３日目に（ｉ）２．５Ｅ＋０６同種ＰＢＭＣ、（ｉｉ）２．５Ｅ＋０６同種ＰＢＭＣと２．５Ｅ＋０６単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ロットＣ）の組合せ、（ｉｉｉ）２．５Ｅ＋０６同種ＰＢＭＣと２．５Ｅ＋０６細胞ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ロットＣＥＦＨ）の組合せ、または（ｉｖ）２．５Ｅ＋０６細胞ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ロットＣＥＦＨ）単独を注射（ゆっくりのボーラスｉ．ｖ．）した。ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを、体重減少、毛並みの外観、皮膚の外観、体を丸める、および活動度の複合スコアを使用して決定した（Bondanza A,et al. Blood 2006;107:1828-36を参照されたい）。図２６に示すように、ポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与したマウスのみが試験終了時にｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを全く（１００％）示さなかった。
【0319】
要約すると、このデータは、４人の異なるドナーに由来するポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入が、ＰＢＭＣ誘導ｘｅｎｏ－ＧｖＨＤを阻害するが、ｘｅｎｏ ＧｖＨＤを誘導しないことを実証した。
【0320】
[実施例９]
ＩＬ－１０のバリアントの生成
ヒトＩＬ－１０のバリアントを、他の種のＩＬ－１０配列に関してアミノ酸修飾（複数可）（例えば、置換、挿入、欠失）を導入することによって生成する。修飾部位を、図２７Ａに提供される配列アライメントによって決定する。種の間で異なるアミノ酸を有するアミノ酸位置をアライメントから同定し、アミノ酸の置換、挿入、または欠失を導入することによって改変する。
ＩＬ－１０のバリアントの生成
ヒトＩＬ－１０のバリアントを、他の種のＩＬ－１０配列に関してアミノ酸修飾（複数可）（例えば、置換、挿入、欠失）を導入することによって生成する。修飾部位を、図２７Ａに提供される配列アライメントによって決定する。種の間で異なるアミノ酸を有するアミノ酸位置をアライメントから同定し、アミノ酸の置換、挿入、または欠失を導入することによって改変する。
【0321】
ヒトＩＬ－１０のバリアントの２つの例を図２７Ｂに提供する。可能性があるｈｕＩＬ－１０ハイブリッド＃１（配列番号１９）は、ヒトＩＬ－１０の３つのアミノ酸（Ｄ、ＩおよびＡ）を、対応する位置のウイルスＩＬ－１０（ＥＢＶＢ９）の３つの異なるアミノ酸（Ｅ、Ａ、およびＤ）に置換することによって生成される。可能性があるｈｕＩＬ－１０ハイブリッド＃２（配列番号２０）は、ヒトＩＬ－１０の１つのアミノ酸（Ｉ１０５）を、対応する位置でウイルスＩＬ－１０（ＥＢＶＢ９）の別のアミノ酸（Ａ１０５）に置換することによって生成される。図２７Ｃは、ヒトＩＬ－１０（配列番号１）とＩＬ１０ ＥＢＶＢ９（配列番号１８）とのアライメントを示し、「＊」は、ＩＬ－１０ハイブリッド＃１において置換されている１つまたは複数のアミノ酸位置を示し、「＃」は、ＩＬ－１０ハイブリッド＃２に関する好ましいＩ１０５からＡ１０５へのアミノ酸置換を示す。
【0322】
ヒトＩＬ－１０のバリアントを、上記の節で記載されるように発現ベクターにクローニングし、バリアントタンパク質の発現および機能に関して試験する。ヒトＩＬ－１０の選択されたバリアントを使用して、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を生成する。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の有効性を、本明細書に提供されるように試験する。
【0323】
実験方法および材料
細胞の調製および細胞株。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上での遠心分離によって調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製し、得られた純度は＞９５％であった。成熟樹状細胞（ＤＣ）を、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造元の使用説明書に従って使用して正の選択を行った末梢血ＣＤ１４＋単球から生成し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）中、３７℃で１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ、ＵＳＡ）および１００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）の存在下で５日間培養し、１ｍｇ／ｍＬリポ多糖類（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってさらに２日間成熟させた。
細胞の調製および細胞株。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上での遠心分離によって調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製し、得られた純度は＞９５％であった。成熟樹状細胞（ＤＣ）を、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造元の使用説明書に従って使用して正の選択を行った末梢血ＣＤ１４＋単球から生成し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）中、３７℃で１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ、ＵＳＡ）および１００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）の存在下で５日間培養し、１ｍｇ／ｍＬリポ多糖類（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってさらに２日間成熟させた。
【0324】
プラスミドの構築。ヒトＩＬ－１０のコード配列を、ｐＨ１５Ｃ（ＡＴＣＣ番号６８１９２）から切り出し、５４９ｂｐ断片を、ｐＢｌｕＫＳＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトにクローニングしてｐＢｌｕＫＳＭ－ｈＩＬ－１０を得た。５５５ｂｐの断片を、ｐＢｌｕＫＳＭ－ｈＩＬ－１０からｈＩＬ－１０を切り出すことによって得て、１０７４．１０７１．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ｄＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡ（本明細書においてＬＶ－ΔＮＧＦＲと命名する）とのライゲーションによりｐＬＶＩＬ－１０を得た。双方向性プロモーター（ヒトＰＧＫプロモータープラス反対方向のＣＭＶプロモーターの最小コアエレメント）の存在は、２つのトランスジーンの共発現を可能にする（Locafaro et al. Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269）。ｐＬＶＩＬ－１０の配列をパイロシーケンシング（Ｐｒｉｍｍ）によって確認した。
【0325】
ベクターの産生および力価測定。ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプ第３世代双方向性レンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞へのＣａ３ＰＯ４一過性４プラスミド共トランスフェクションによって産生し、記載されるように（Locafaro et al. Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269）超遠心分離によって濃縮した。力価を、限界希釈によって推定し、ベクター粒子をＨＩＶ－１ Ｇａｇ ｐ２４抗原免疫捕捉（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって測定し、ベクターの感染力を、力価と粒子の間の比として計算した。力価は、５×１０８～６×１０９形質導入単位／ｍＬであり、感染力は、５×１０４～１０５形質導入単位／ｎｇ ｐ２４であった。
【0326】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞株の生成。ポリクローナルＣＤ４形質導入細胞を、以前に記載されたように（Andolfi et al. Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790, Locafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254）得た。簡単に説明すると、ＣＤ４精製Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ、３０ｎｇ／ｍＬ、ＯＫＴ３、Ｊａｎｓｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ、ＢＤ）およびｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｉｔａｌｙ）によって４８時間活性化した。Ｔ細胞に、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ（ＣＤ４ＩＬ－１０）を感染多重度（ＭＯＩ）２０で形質導入した。１１日目、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞を、ＣＤ２７１＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してビーズ選別し、５％ヒト血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ－Ｌｏｎｚａ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、および５０Ｕ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｉｔａｌｙ）を有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地中で増大させた。７および１０日目に、培地を、５０Ｕ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２を補充した新鮮な培地に交換した。１４日目に、細胞を収集して洗浄し、以前に記載されたように（Locafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254）同種フィーダー混合物によって再刺激した。１４日後、細胞を収集して凍結した。融解したＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、再刺激し、２回目および３回目の再刺激後、増大をｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的に特徴付け、ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために使用した。
【0327】
ベクターコピー数解析。細胞を、非組み込みベクター形体を除外するために形質導入後１１日間培養した。ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、５１１０６）によって製造元の使用説明書に従って単離した。ベクターの組み込みを、ＱＸ２００ドロップレットデジタルＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって製造元の使用説明書に従って定量した。
【0328】
サイトカインの決定。サイトカイン産生を測定するために、２回目および３回目の再刺激後、単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を非刺激のままとしたか、または培地２００μＬの最終容積中で固定抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）ｍＡｂによって刺激した（９６ウェル丸底プレート、２×１０５個／ウェル）。上清を、４８時間培養後に採取し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－２２のレベルを、ＥＬＩＳＡによって製造元の使用説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って決定した。
【0329】
フローサイトメトリー解析。ＣＤ４による表面染色後のグランザイムＢ（クローンＭＨＧＢ０４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の発現に関して、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、固定し、透過処理し、およびＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを使用して製造元の使用説明書に従って染色した（カタログ番号５５４７１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）。染色した細胞を、１％ＦＢＳを補充したＰＢＳによって２回洗浄し、ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェアを利用して解析するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａによって解析した。
【0330】
殺滅アッセイ。２回目および３回目の再刺激後、単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の細胞傷害性を、共培養実験において解析した(Locafaro et al. Mol Ther 2017, 25, 2254)。簡単に説明すると、非骨髄性白血病および骨髄性白血病細胞株、Ｋ５６２およびＡＬＬ－ＣＭをそれぞれ、標的細胞として使用して、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞と共に１：１の比（１０５個の標的細胞および１０５個のＣＤ４ＩＬ－１０細胞）で３日間播種した。
共培養の終了時、細胞を採取し、Ｋ５６２およびＡＬＬ－ＣＭ細胞を、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－発現に基づいて解析し、ＦＡＣＳにより計数した。
共培養の終了時、細胞を採取し、Ｋ５６２およびＡＬＬ－ＣＭ細胞を、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－発現に基づいて解析し、ＦＡＣＳにより計数した。
【0331】
抑制アッセイ。単一ドナーおよびポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の抑制能を測定するために、同種ＰＢＭＣを、細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって製造元の使用説明書に従って標識した。標識細胞を、ＣＤ１４＋細胞からの同種成熟樹状細胞（ＤＣ）によって、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で活性化した。末梢血ＣＤ１４単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造元の使用説明書に従って正の選択を行った。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１００ｎｇ／ｍＬ組換えヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ）の存在下で５日間培養した。成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を生成するために、５日目に細胞を、１ｍｇ／ｍＬリポ多糖類（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ）によってさらに２日間刺激した。７日目に、ＤＣを収集し、表現型を解析し、Ｔ細胞を刺激するために使用した。ＤＣの純度および成熟状態を、フローサイトメトリーによってチェックし、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＨＬＡ－ＤＲの発現を決定した。
【0332】
標識した細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終容積２００μＬで播種し、以下のように３日間インキュベートした：（ｉ）標識ＰＢＭＣ単独５×１０４個／ウェル；（ｉｉ）標識ＰＢＭＣ ５×１０４個／ウェル＋成熟ＤＣ ５×１０３個／ウェル＋抗ＣＤ３ ｍＡｂ（５０ｎｇ／ｍＬ）；（ｉｉｉ）標識ＰＢＭＣ ５×１０４個／ウェル＋単一ドナーまたはポリドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞 ５×１０４個／ウェル＋成熟ＤＣ ５×１０３個／ウェル＋抗ＣＤ３ ｍＡｂ（５０ｎｇ／ｍＬ）。
【0333】
３日間培養後、細胞を、採取し、免疫蛍光染色のために９６ウェルＶ底プレートに移した。細胞を、生きているＣＤ４＋ ｅＦｌｕｏｒ６７０＋およびＣＤ８＋ ｅＦｌｕｏｒ６７０＋細胞に関してゲート設定したＦＡＣＳによって解析した。阻害のパーセンテージを、以前に記載されたように（Locafaro et al. Mol Ther 2017,25,2254）ｅＦｌｕｏｒ６７０標識の希釈を測定することによって計算した。
【0334】
移植片対宿主病のモデル：全ての実験において、６／８週齢の雌性ＮＳＧマウスを使用した。０日目にマウスに、マウスの体重に従って線形加速器から１７５～２００ｃＧｙの１回線量を全身に照射した。一部の実験では、マウスに３５０ｃＧｙの１回線量を照射した。マウスに、ＰＢＭＣ細胞（５×１０６個または２．５×１０６個）、またはＣＤ４ＩＬ－１０細胞（単一ドナーまたは３人のドナーのプールであるポリドナーの５×１０６個または２．５×１０６個）、またはＰＢＭＣ（５×１０６個または２．５×１０６個）とＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個または２．５×１０６個）の組合せを静脈内注射した。生存、体重減少、活動度、毛並み、皮膚、および体を丸めることを、以前に記載されたように（Bondanza et al. Blood. 2006;107(5):1828-1836）週に少なくとも３回モニターした。マウスの体重減少が２０％であった場合、マウスを倫理上の理由から安楽死させた。
【0335】
あるいは、０日目に、マウスに上記のように全身照射した。３日目に、マウスに、ＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６個）、単一ドナーおよびポリドナー（３人のドナーからのプール）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）、またはＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６個）を、単一ドナーおよびポリドナー（３人のドナーからのプール）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）と組み合わせて注射した。ＧｖＨＤの誘導を、上記のようにモニターした。
【0336】
７．参照による組み入れ
本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれることが個々に示されているのと同程度に、全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれることが個々に示されているのと同程度に、全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0337】
８．均等物
様々な特定の実施形態を説明し、記載してきたが、上記の明細書は限定的ではない。様々な変化を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることが認識される。多くの変形形態が、本明細書を再検討することにより当業者に明らかとなるであろう。
様々な特定の実施形態を説明し、記載してきたが、上記の明細書は限定的ではない。様々な変化を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることが認識される。多くの変形形態が、本明細書を再検討することにより当業者に明らかとなるであろう。
【0338】
９．配列
配列番号１（ヒトＩＬ－１０アミノ酸配列－タンパク質配列：Ｒｅｆ Ｐ２２３０１）
配列番号１（ヒトＩＬ－１０アミノ酸配列－タンパク質配列：Ｒｅｆ Ｐ２２３０１）
【0339】
【化1】
【0340】
配列番号２（ヒトＩＬ－１０の例示的な核酸配列）
【0341】
【化2】
【0342】
【化3】
【0343】
【化4】
【0344】
【化5-1】
【0345】
【化5-2】
【0346】
【化5-3】
【0347】
【化5-4】
【0348】
【化6】
ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）：Ｒｅｆ：ＮＣ＿００７６０５．１
【0349】
【化7】
【0350】
【化8】
【0351】
【化9】
【0352】
【化10】
【0353】
【化11】
【0354】
【化12】
【0355】
【化13】
【0356】
【化14】
【0357】
【化15】
【0358】
【化16】
【0359】
【化17】
【0360】
【化18】
【0361】
【化19】
【0362】
【化20】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-A】
【図4-B】
【図5】
【図6】
【図7-A】
【図7-B】
【図8-A】
【図8-B】
【図9】
【図10】
【図11-A】
【図11-B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-A】
【図17-B】
【図17-C】
【図18-A】
【図18-B】
【図18-C】
【図19-A】
【図19-B】
【図19-C】
【図19-D】
【図19-E】
【図19-F】
【図19-G】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27-A】
【図27-B】
【図27-C】
【配列表】
【国際調査報告】