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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20250109BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20250109BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10
C12N15/54 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/00
C12P21/02 C
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539635
(86)(22)【出願日】2022-01-24
(85)【翻訳文提出日】2024-06-28
(86)【国際出願番号】 CN2022073561
(87)【国際公開番号】W WO2023123589
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】202111645514.9
(32)【優先日】2021-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516336828
【氏名又は名称】凱菜英医藥集團（天津）股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＹＭＣＨＥＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＴＩＡＮＪＩＮ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110003694
【氏名又は名称】弁理士法人有我国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホン，ハオ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ナー
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ，シュエチョン
(72)【発明者】
【氏名】リー，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，イーミン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，イエンチン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE01
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA10
4B064CA11
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA29
4B065CA60
(57)【要約】
トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用を提供する。該トランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、アミノ酸突然変異が起こった部位はＶ２４２Ｗ部位を含む。上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるトランスアミナーゼを基にして、部位特異的突然変異誘発方法によって突然変異を行うことで、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質構造及び機能を変えたものであり、次に、指向性スクリーニング方法によって、上記の突然変異部位を有するトランスアミナーゼが得られ、得たトランスアミナーゼは、高い触媒活性、特異的選択性、及び広い基質スペクトルを有しており、産業化が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスアミナーゼ突然変異体であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、前記アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｖ２４２Ｗ部位を含み、又は
前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、前記アミノ酸突然変異が起こった部位を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列と９０％以上の相同性を有し、トランスアミナーゼ触媒活性を有するアミノ酸配列である、ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
【請求項2】
前記アミノ酸突然変異が起こった部位は、以下の組み合わせの突然変異部位のいずれかを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。V242W+L59Q、V242W+F164C、V242W+F164Q、V242W+F164W、V242W+F164Y、V242W+L272G、V242W+L272I、V242W+L272K、V242W+L272M、V242W+L272P、V242W+L272V、V242W+L272Y、V242W+V328C、V242W+V328K V242W+V328L、V242W+V328M、V242W+V328Q、V242W+V328S、V242W+V328T、V242W+V328W、V242W+T330F、V242W+T330I、V242W+T330S、V242W+A436H、V242W+A436K、V242W+A436L、V242W+A436N、V242W+A436P、V242W+A436Q、V242W+A436S、V242W+A436Y、V242W+R442A、V242W+R442C、V242W+R442F、V242W+R442G、V242W+R442H、V242W+R442N、V242W+R442Q、V242W+R442S、V242W+R442T、V242W+F164Q+V328A、V242W+F164Q+V328C、V242W+F164Q+V328D、V242W+F164Q+V328E、V242W+F164Q+V328F、V242W+F164Q+V328G、V242W+F164Q+V328H、V242W+F164Q+V328I、V242W+F164Q+V328L、V242W+F164Q+V328M、V242W+F164Q+V328P、V242W+F164Q+V328Q、V242W+F164Q+V328R、V242W+F164Q+V328S、V242W+F164Q+V328W、V242W+F164Q+V328T、V242W+F164Q+V328Y、V242W+F164Q+R442T、V242W+F164Q+V328I+G2S、V242W+F164Q+V328I+T46M、V242W+F164Q+V328I+G48D、V242W+F164Q+V328I+C185Y、V242W+F164Q+V328I+S186N、V242W+F164Q+V328I+S194P、V242W+F164Q+V328I+T197M、V242W+F164Q+V328I+N202D、V242W+F164Q+V328I+Y205L、V242W+F164Q+V328I+T245A、V242W+F164Q+V328I+V252I、V242W+F164Q+V328I+S268N、V242W+F164Q+V328I+L353F、V242W+F164Q+V328I+N359D、V242W+F164Q+V328I+R409T、V242W+F164Q+V328I+E424K、V242W+F164Q+V328I+A436V、V242W+F164Q+V328I+R442T、V242W+F164Q+V328I+R442T+G48D、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P、V242W+F164Q+V328I+R442T+V252I、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+V252I、V242W+F164Q+V328I+R442T+V252I+G48D、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+G48D、又はV242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+V252I+G48D
【請求項3】
請求項１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードする、ことを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項4】
請求項３に記載のＤＮＡ分子を含有する、ことを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項5】
前記組換えプラスミドは、pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18、又はpUC-19である、ことを特徴とする請求項４に記載の組換えプラスミド。
【請求項6】
請求項４又は５に記載の組換えプラスミドを含有する、ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項7】
原核細胞又は真核細胞を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項8】
前記原核細胞は、ＢＬ２１－ＤＥ３細胞又は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ＤＥ３細胞であり、前記真核細胞は酵母細胞である、ことを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項9】
ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒するステップを含む、キラルアミンの生産方法であって、前記トランスアミナーゼは、請求項１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。
【請求項10】
前記ケトン系化合物は、【化1】
【請求項11】
前記ケトン系化合物は、【化2】
【請求項12】
前記アミノ供与体は、イソプロピルアミン又はアラニンである、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記アミノ供与体は、イソプロピルアミンである、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系において、酵素の使用量が１．５～６．６ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項15】
ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系において、酵素の使用量が１．７ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系の温度が、２０℃～４５℃である、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系の温度が、３０℃である、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術分野に関し、具体的には、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
キラルアミン系化合物は、キラル薬物の重要な中間体であり、医薬などの分野で広く使用されている。その工業化生産は、主に遷移金属触媒の不斉合成に依存しているが、このプロセスには触媒として高価な遷移金属錯体が必要であり、これらの遷移金属の資源は限られており、高価であるため、このアプローチは持続可能性を達成することが困難である。生体酵素触媒法は、基質のケトンが入手されやすく、反応条件が穏やかで、生成物選択性が高いため、多くの注目を集めている。
【0003】
アミノトランスフェラーゼ（aminotransferase）としても知られるトランスアミナーゼ （transaminase、TA、EC2.6.1.X）は、ケトン基とアミノ基の間のアミノ転移反応を可逆的に触媒できる。中でもトランスアミナーゼは、優れた立体選択性、再現性のある補因子、強力な反応性や環境に優しい性質を持ち、キラルアミンの生体触媒生産に使用され、医薬品中間体や農薬中間体の合成に広く使用されている。
【0004】
トランスアミナーゼ反応には、通常、トランスアミナーゼの活性中心にあるリジン残基のε－アミノ基に共有結合しているリン酸ピリドキサールが補酵素として必要であるが、反応に参加するアミノ供与体も必要であり、一般的に使用されるアミノ供与体には、イソプロピルアミン、フェニルエチルアミンなどが含まれる。
【0005】
キラルアミンの生産にトランスアミナーゼを使用する進歩は大きな注目を集めているが、酵素法は、スケールアップ生産の用途においては多くの問題を抱えている。例えば、既存のトランスアミナーゼは、選択性が低く、可逆反応の存在により変換率が低くなり、工業化生産に不利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、トランスアミナーゼの選択性を向上させる、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の目的を達成させるために、本発明の一態様によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供する。該トランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｖ２４２Ｗ部位を含み、又はトランスアミナーゼ突然変異体は、上記の突然変異部位を含み、突然変異部位を有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、又は前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、前記アミノ酸突然変異が起こった部位を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列と９０％以上の相同性を有し、トランスアミナーゼ触媒活性を有するアミノ酸配列である。
【0008】
さらに、アミノ酸突然変異が起こった部位は、V242W+L59Q、V242W+F164C、V242W+F164Q、V242W+F164W、V242W+F164Y、V242W+L272G、V242W+L272I、V242W+L272K、V242W+L272M、V242W+L272P、V242W+L272V、V242W+L272Y、V242W+V328C、V242W+V328I、V242W+V328L、V242W+V328M、V242W+V328Q、V242W+V328S、V242W+V328T、V242W+V328W、V242W+T330F、V242W+T330I、V242W+T330S、V242W+A436H、V242W+A436K、V242W+A436L、V242W+A436N、V242W+A436P、V242W+A436Q、V242W+A436S、V242W+A436Y、V242W+R442A、V242W+R442C、V242W+R442F、V242W+R442G、V242W+R442H、V242W+R442N、V242W+R442Q、V242W+R442S、V242W+R442T、V242W+F164Q+V328A、V242W+F164Q+V328C、V242W+F164Q+V328D、V242W+F164Q+V328E、V242W+F164Q+V328F、V242W+F164Q+V328G、V242W+F164Q+V328H、V242W+F164Q+V328I、V242W+F164Q+V328L、V242W+F164Q+V328M、V242W+F164Q+V328P、V242W+F164Q+V328Q、V242W+F164Q+V328R、V242W+F164Q+V328S、V242W+F164Q+V328W、V242W+F164Q+V328T、V242W+F164Q+V328Y、V242W+F164Q+R442T、V242W+F164Q+V328I+G2S、V242W+F164Q+V328I+T46M、V242W+F164Q+V328I+G48D、V242W+F164Q+V328I+C185Y、V242W+F164Q+V328I+S186N、V242W+F164Q+V328I+S194P、V242W+F164Q+V328I+T197M、V242W+F164Q+V328I+N202D、V242W+F164Q+V328I+Y205L、V242W+F164Q+V328I+T245A、V242W+F164Q+V328I+V252I、V242W+F164Q+V328I+S268N、V242W+F164Q+V328I+ L353F、V242W+F164Q+V328I+N359D、V242W+F164Q+V328I+ R409T、V242W+F164Q+V328I+E424K、V242W+F164Q+V328I+A436V、V242W+F164Q+V328I+R442T、V242W+F164Q+V328I+R442T+G48D、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P、V242W+F164Q+V328I+R442T+V252I、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+V252I、V242W+F164Q+V328I+R442T+V252I+G48D、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+G48D、又はV242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+V252I+G48Dの組み合わせの突然変異部位のいずれかを含み、又はトランスアミナーゼ突然変異体は、上記の突然変異部位を含み、突然変異部位を有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0009】
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記のトランスアミナーゼ突然変異体のいずれかをコードする。
【0010】
本発明の更なる態様によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記のＤＮＡ分子のいずれかを含有する。
【0011】
さらに、組換えプラスミドは、pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18、又はpUC-19である。
【0012】
本発明の別の態様によれば、宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、上記の組換えプラスミドのいずれかを含有する。
【0013】
さらに、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは原核細胞は、ＢＬ２１－ＤＥ３細胞又は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ＤＥ３細胞であり、真核細胞は、酵母細胞である。
【0014】
本発明の更なる態様によれば、キラルアミンの生産方法を提供する。該方法は、ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒するステップを含み、トランスアミナーゼは、上記のトランスアミナーゼ突然変異体のいずれかである。
【0015】
さらに、ケトン系化合物は、
（ｎ＝０、１、２又は３、Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ又はＳ、Ｒ＝Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３）であり、好ましくは、ケトン系化合物は、
である。
【化1】
【化2】
【0016】
さらに、アミノ供与体は、イソプロピルアミン又はアラニン、好ましくはイソプロピルアミンである。
【0017】
さらに、ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系において、酵素の使用量が、１．５～６．６ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１．７ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系の温度が、２０℃～４５℃、より好ましくは３０℃である。
【発明の効果】
【0018】
本発明の上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるトランスアミナーゼを基にして、部位特異的突然変異誘発方法によって突然変異を行うことで、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質構造及び機能を変えたものであり、次に、指向性スクリーニング方法によって、上記の突然変異部位を有するトランスアミナーゼが得られ、本発明で得られたトランスアミナーゼは、高い触媒活性、特異的選択性、及び広い基質スペクトルを有しており、産業化が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【0019】
なお、本願における実施例及び実施例の特徴は、矛盾することなく互いに組み合わされてもよい。以下、実施例を参照して本発明について詳細に説明する。
【0020】
トランスアミナーゼは、タンパク質を主成分とする生体触媒であり、それが触媒する反応は、以下の反応式で表されてもよい。
（ｎ＝０、１、２又は３、Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ又はＳ、Ｒ＝Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３）
従来のトランスアミナーゼは、選択性が悪く、変換率の低下を招く可逆性が存在するため、工業化生産に不利である。この技術的課題に鑑み、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるトランスアミナーゼを基に、定向進化方法によりトランスアミナーゼの選択性及び活性を向上させ、高い触媒活性及び特異的選択性を有するトランスアミナーゼを得るものである。
【化3】
従来のトランスアミナーゼは、選択性が悪く、変換率の低下を招く可逆性が存在するため、工業化生産に不利である。この技術的課題に鑑み、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるトランスアミナーゼを基に、定向進化方法によりトランスアミナーゼの選択性及び活性を向上させ、高い触媒活性及び特異的選択性を有するトランスアミナーゼを得るものである。
【0021】
まず、部位特異的突然変異誘発によってトランスアミナーゼに突然変異部位を導入し、その突然変異体について選択性を検出し、選択性が向上した突然変異体を選択する。ここで、突然変異体Ｖ２４２Ｗは、開始テンプレートに比べて約２倍高い選択性を持っているが、活性が劣っている。続いて、選択性と活性のより顕著な向上を有する突然変異体を得るために、Ｖ２４２Ｗをテンプレートとして突然変異を継続する。
【0022】
部位特異的突然変異誘発とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法により、ＤＮＡ断片（ゲノム又はプラスミド）の特定の部位に塩基の変更、又は断片の挿入や欠失を導入することを指す。部位特異的突然変異誘発は、ＤＮＡによって発現される標的タンパク質の特性と特性評価を迅速かつ効率的に改善することができ、遺伝子研究において非常に有用な手段である。
【0023】
全プラスミドＰＣＲを利用して単一又は複数の部位特異的突然変異を導入することには、単純さと効率という利点がある。原理は以下の通りである。突然変異部位を含む一対のプライマー（順方向及び逆方向）及びテンプレートプラスミドをアニーリングし、その後、ポリメラーゼを用いて「サイクル伸長」を行い、いわゆるサイクル伸長とは、ポリメラーゼがテンプレートに従ってプライマーを伸長し、１サイクル後、プライマー５'末端に戻り、加熱、アニーリング、伸長のサイクルを繰り返すことを指し、この反応は、ローリングサークル増幅とは異なり、複数のタンデムコピーを形成することはない。順方向プライマー及び逆方向プライマーの伸長産物がアニールされ、対になって、ニックが入ったオープンサーキュラープラスミドが形成される。Ｄｐｎ Ｉで伸長産物を消化する際には、元のテンプレートプラスミドが従来の大腸菌由来であり、ｄａｍメチル化により修飾されているため、Ｄｐｎ Ｉに感受性があり切断されるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されていないため、切断されていないので、その後の形質転換をうまく行うことができ、突然変異プラスミドのクローンが得られる。
【0024】
突然変異プラスミドを大腸菌宿主細胞に形質転換し、その後、超音波処理により細胞を破砕して粗酵素を取得し、反応検証を行った。トランスアミナーゼ誘導発現の最適条件：２０℃、０．０６ ｍＭ ＩＰＴＧ、１６ｈ。
【0025】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供する。該トランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｖ２４２Ｗ部位を含み、又は前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、前記アミノ酸突然変異が起こった部位を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示される配列と９０％、９５％又は９９％以上の相同性を有し、トランスアミナーゼ触媒活性を有するアミノ酸配列である。
【0026】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、当技術分野で一般に知られている意味を有し、異なる配列間の相同性を決定するための規則及び基準も当業者によく知られている。当業者は、本開示の教示に基づいてそのようなバリアント配列を得ることができる。
【0027】
好ましくは、アミノ酸突然変異が起こった部位は、以下の組み合わせ突然変異部位のいずれかを含む。V242W+L59Q、V242W+F164C、V242W+F164Q、V242W+F164W、V242W+F164Y、V242W+L272G、V242W+L272I、V242W+L272K、V242W+L272M、V242W+L272P、V242W+L272V、V242W+L272Y、V242W+V328C、V242W+V328I、V242W+V328L、V242W+V328M、V242W+V328Q、V242W+V328S、V242W+V328T、V242W+V328W、V242W+T330F、V242W+T330I、V242W+T330S、V242W+A436H、V242W+A436K、V242W+A436L、V242W+A436N、V242W+A436P、V242W+A436Q、V242W+A436S、V242W+A436Y、V242W+R442A、V242W+R442C、V242W+R442F、V242W+R442G、V242W+R442H、V242W+R442N、V242W+R442Q、V242W+R442S、V242W+R442T、V242W+F164Q+V328A、V242W+F164Q+V328C、V242W+F164Q+V328D、V242W+F164Q+V328E、V242W+F164Q+V328F、V242W+F164Q+V328G、V242W+F164Q+V328H、V242W+F164Q+V328I、V242W+F164Q+V328L、V242W+F164Q+V328M、V242W+F164Q+V328P、V242W+F164Q+V328Q、V242W+F164Q+V328R、V242W+F164Q+V328S、V242W+F164Q+V328W、V242W+F164Q+V328T、V242W+F164Q+V328Y、V242W+F164Q+R442T、V242W+F164Q+V328I+G2S、V242W+F164Q+V328I+T46M、V242W+F164Q+V328I+G48D、V242W+F164Q+V328I+C185Y、V242W+F164Q+V328I+S186N、V242W+F164Q+V328I+S194P、V242W+F164Q+V328I+T197M、V242W+F164Q+V328I+N202D、V242W+F164Q+V328I+Y205L、V242W+F164Q+V328I+T245A、V242W+F164Q+V328I+V252I、V242W+F164Q+V328I+S268N、V242W+F164Q+V328I+L353F、V242W+F164Q+V328I+N359D、V242W+F164Q+V328I+R409T、V242W+F164Q+V328I+E424K、V242W+F164Q+V328I+A436V、V242W+F164Q+V328I+R442T、V242W+F164Q+V328I+R442T+G48D、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P、V242W+F164Q+V328I+R442T+V252I、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+V252E V242W+F164Q+V328I+R442T+V252I+G48D、V242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+G48D、又はV242W+F164Q+V328I+R442T+S194P+V252I+G48D
本発明の上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるトランスアミナーゼを基にして、部位特異的突然変異誘発方法によって突然変異を行うことで、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質構造及び機能を変えたものであり、次に、指向性スクリーニング方法によって、上記の突然変異部位を有するトランスアミナーゼが得られ、本発明で得られたトランスアミナーゼは、高い触媒活性、特異的選択性、及び広い基質スペクトルを有しており、産業化が期待できる。
本発明の上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるトランスアミナーゼを基にして、部位特異的突然変異誘発方法によって突然変異を行うことで、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質構造及び機能を変えたものであり、次に、指向性スクリーニング方法によって、上記の突然変異部位を有するトランスアミナーゼが得られ、本発明で得られたトランスアミナーゼは、高い触媒活性、特異的選択性、及び広い基質スペクトルを有しており、産業化が期待できる。
【0028】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、ＤＮＡ分子を提供する。上記ＤＮＡがコードするトランスアミナーゼ突然変異体は、選択性と活性を向上させており、アミノ酸の工業化生産において酵素添加量を削減でき、後処理の難度も軽減できる。
【0029】
本発明の上記のＤＮＡ分子は、「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは、特定のヌクレオチド配列を適切な宿主細胞において発現させることを指導できるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する、線状又は環状の核酸分子をいう。一般に、目的ヌクレオチドに有効に連結されたプロモーターが含まれ、これは任意にターミネータシグナル及び／又は他の調節要素に有効に連結されている。発現カセットはまた、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列を含んでもよい。コード領域は、通常、目的タンパク質をコードするが、アンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡのような目的機能性ＲＮＡも、センス方向又はアンチセンス方向にコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その少なくとも１つの成分が他の少なくとも１つの成分と異種であることを意味するキメラであってもよい。発現カセットは、天然に存在するものであってもよいが、異種発現のための効率的な組換え形成によって得られる。
【0030】
本発明の1つの代表的な実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記のＤＮＡ分子のいずれかを含有する。上記組換えプラスミドのＤＮＡ分子は、上記ＤＮＡ分子が正確かつスムーズにコピー、転写、又は発現できるように、組換えプラスミド内の適切な位置に配置される。
【0031】
本発明において上記ＤＮＡ分子を限定する時に「含有する」という限定語が使用されているが、ＤＮＡ配列の両端にその機能に関係のない他の配列を任意に付加できることを意味するものではない。当業者は、組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限酵素切断部位を追加するか、追加の開始コドン、終止コドンなどを追加する必要があることを知っている。したがって、クローズな表現で限定すれば、これらの状況を現実的にカバーすることはできない。
【0032】
本発明で使用される「プラスミド」という用語は、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状の任意のプラスミド、コスミド、ファージまたはアグロバクテリウムの二元核酸分子を含み、好ましくは、組換え発現プラスミドであり、原核生物発現プラスミドまたは真核生物発現プラスミドであり得るが、原核生物発現プラスミドが好ましい。いくつかの実施態様では、組換えプラスミドに使用されるベクターは、以下から選択される。pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18、又はpUC-19
本発明の1つの代表的な実施形態によれば、上記の組換えプラスミドのいずれかを含有する宿主細胞を提供する。本発明に適切な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含むが、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は、ＢＬ２１－ＤＥ３細胞又は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ＤＥ３細胞であり、真核細胞は、酵母である。
本発明の1つの代表的な実施形態によれば、上記の組換えプラスミドのいずれかを含有する宿主細胞を提供する。本発明に適切な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含むが、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は、ＢＬ２１－ＤＥ３細胞又は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ＤＥ３細胞であり、真核細胞は、酵母である。
【0033】
本発明の1つの代表的な実施形態によれば、キラルアミンの生産方法を提供する。該方法は、ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒するステップを含み、トランスアミナーゼは、本発明のトランスアミナーゼ突然変異体である。好ましくは、ケトン系化合物は、
（ｎ＝０、１、２又は３、Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ又はＳ、Ｒ＝Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３）である。
【化4】
【0034】
ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応を本発明のトランスアミナーゼで触媒する反応系において、ｐＨは、７～１１、好ましくは７．５である。ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系の温度が、２０～４５℃、より好ましくは３０℃であり、つまり、温度の値は、２０～４５℃におけるいずれかの値、例えば、２０、２１、２２、２５、２７、２８、２９、２０、３１、３２、３５、３７、３８、３９、４０、４２、４５などであってもよい。ケトン系化合物及びアミノ供与体のアミノ基転移反応をトランスアミナーゼで触媒する反応系において、酵素の使用量が、１．５～６．６ｍｇ／ｍＬ；好ましくは１．７ｍｇ／ｍＬであり、つまり、酵素量の値は、１．５～６．６ｍｇ／ｍＬにおけるいずれかの値、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．６、３．８、４．０、４．４、４．５、４．９、５．１、５．５、６．６などであってもよい。
【0035】
本発明の一実施形態では、本発明のトランスアミナーゼ突然変異体の基質は以下の通りである。
【0036】
基質１：
Ｔｅｔｒ ａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ－３－ｏｎｅ
テトラヒドロフラン－３－オン
基質２：
２－メチルチオラン－３－オン
２－Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｌａｎ－３－ｏｎｅ
基質３：
２－Ｃｈｌｏｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ
２－クロロシクロペンタノン
基質４：
Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ
シクロペンタノン
基質５：
３－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｂｕｔａｎ－ｌ－ｏｎｅ
３－メチルシクロブタン－１－オン
本発明の1つの代表的な実施形態によれば、基質１、基質２、基質３、基質４、基質５の反応を検証する方法は以下の通りである。
【化5】
テトラヒドロフラン－３－オン
基質２：
【化6】
２－Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｌａｎ－３－ｏｎｅ
基質３：
【化7】
２－クロロシクロペンタノン
基質４：
【化8】
シクロペンタノン
基質５：
【化9】
３－メチルシクロブタン－１－オン
本発明の1つの代表的な実施形態によれば、基質１、基質２、基質３、基質４、基質５の反応を検証する方法は以下の通りである。
【0037】
５ｍＬ遠心分離管に基質１０ｍｇ、酵素１ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇをそれぞれ加え、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５を全体積０．５ｍＬまで補充し、４５℃、２００ｒｐｍで１６ｈ反応させた。
【0038】
反応終了後、基質１、２、及び３の選択性の検出
反応系０．０６ｍＬに０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５を０．０４ｍＬ加え、希釈系０．１ｍＬにアセトニトリル、水、及び重炭酸ナトリウムの等体積溶液０．３ｍＬを加え、均一に混合し、０．１ｍＬを採取し、５ｍｇ／ｍＬ Ｎα－（２,４－ジニトロ－５－フルオロフェニル）－Ｌ－アラニンアミド試薬０．９ｍＬを加え、５０℃の金属浴にて３ｈ放置し、誘導系を取り出して１２０００ｒｐｍで５ ｍｉｎ遠心分離し、０．５ｍＬを採取し、アセトニトリルと水の等体積溶液０．５ｍＬを加え、均一に混合し、ｅ．ｅ．検出に供した。本願では、活性（基質変換率で表される）検出方法は以下の通りである。酵素で基質反応を触媒した後の反応系から１００μＬを採取し、メタノール９００μＬを加え、振とうさせて遠心分離し、上清を採取してサンプルを得る。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により検出された、生成物が占める相対ピーク面積は、酵素活性を表す。
反応系０．０６ｍＬに０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５を０．０４ｍＬ加え、希釈系０．１ｍＬにアセトニトリル、水、及び重炭酸ナトリウムの等体積溶液０．３ｍＬを加え、均一に混合し、０．１ｍＬを採取し、５ｍｇ／ｍＬ Ｎα－（２,４－ジニトロ－５－フルオロフェニル）－Ｌ－アラニンアミド試薬０．９ｍＬを加え、５０℃の金属浴にて３ｈ放置し、誘導系を取り出して１２０００ｒｐｍで５ ｍｉｎ遠心分離し、０．５ｍＬを採取し、アセトニトリルと水の等体積溶液０．５ｍＬを加え、均一に混合し、ｅ．ｅ．検出に供した。本願では、活性（基質変換率で表される）検出方法は以下の通りである。酵素で基質反応を触媒した後の反応系から１００μＬを採取し、メタノール９００μＬを加え、振とうさせて遠心分離し、上清を採取してサンプルを得る。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により検出された、生成物が占める相対ピーク面積は、酵素活性を表す。
【0039】
本発明の１つの代表的な実施形態では、アミノ供与体は、イソプロピルアミン又はアラニン、好ましくはイソプロピルアミンである。
【0040】
以下、実施例を参照して本発明の有益な効果についてさらに説明する。
【0041】
実施例１
C60Y（Template、例えば、SEQ ID NO: 1，Arthrobacter citreus由来、MGLTVQKINWEQVKEWDRKYLMRTFSTQNEYQPVPIESTEGDYLITPGGTRLLDFFNQLYCVNLGQKNQKVNAAIKEALDRYGFVWDTYATDYKAKAAKIIIEDILGDEDWPGKVRFVSTGSEAVETALNIARLYTNRPLVVTREHDYHGWTGGAATVTRLRSFRSGLVGENSESFSAQIPGSSCSSAVLMAPSSNTFQDSNGNYLKDENGELLSVKYTRRMIENYGPEQVAAVITEVSQGVGSTMPPYEYVPQIRKMTKELGVLWISDEVLTGFGRTGKWFGYQHYGVQPDIITMGKGLSSSSLPAGAVVVSKEIAAFMDKHRWESVSTYAGHPVAMAAVCANLEVMMEENLVEQAKNSGEYIRSKLELLQEKHKSIGNFDGYGLLWIVDIVNAKTKTPYVKLDRNFRHGMNPNQIPTQIIMEKALEKGVLIGGAMPNTMRIGASLNVSRGDIDKAMDALDYALDYLESGEWQQSLEHHHHHH；対応するヌクレオチド配列はSEQ ID NO：2である。Arthrobactercitreus由来、atgggcctgaccgtacagaagatcaactgggaacaagtaaaggagtgggaccgcaagtacctgatgcgcactttttccactcagaacgaataccagccggtaccgattgaatctacggaaggtgattatctgatcaccccgggtggcacccgtctgctggacttcttcaaccaactgtattgcgttaacctgggccagaaaaaccagaaagtcaacgccgcgattaaagaggcactggaccgctacggcttcgtatgggacacttatgctaccgactacaaggcgaaagccgcgaaaatcattatcgaggatattctgggtgacgaggattggcctggtaaagttcgttttgttagcactggctccgaagccgtggaaaccgcgctgaatatcgcgcgtctgtataccaatcgtccgctggttgtgacccgtgaacacgactatcacggttggaccggcggcgctgcaaccgtcactcgtctgcgtagcttccgttctggtctggtgggtgaaaactccgaaagcttctctgctcagatcccgggttcttcttgtagctctgcagtcctgatggccccgtcttccaacaccttccaggactctaacggcaactacctgaaagacgaaaacggtgaactgctgtccgttaaatacacccgtcgcatgattgaaaactacggcccggagcaggtagccgcagtgattacggaagttagccagggtgttggttctacgatgccgccatacgaatatgttccacagatccgtaaaatgactaaagagctgggcgttctgtggatctccgacgaggtcctgaccggttttggtcgtaccggtaaatggttcggttaccagcattatggcgttcaaccagatatcattactatgggcaagggcctgtcttcttcctctctgccggcgggcgcagtagttgtgtccaaagaaatcgctgcgtttatggacaaacaccgctgggaatctgtttccacctacgcgggtcacccggtggcgatggcagctgtgtgcgctaacctggaagtgatgatggaagaaaacctggtggaacaagctaaaaatagcggcgaatacatccgtagcaaactggaactgctgcaggaaaagcataaaagcatcggcaacttcgacggttacggtctgctgtggattgttgatatcgtgaatgcgaaaactaaaaccccgtatgtcaaactggatcgcaacttccgccacggcatgaacccgaaccagatcccgacgcagattatcatggaaaaagctctggaaaaaggcgttctgatcggtggtgcaatgcctaacactatgcgtatcggcgcatctctgaacgtatctcgtggtgatatcgataaagctatggatgctctggattacgcgctggattacctggagtccggtgaatggcagcagagcctcgagcaccaccaccaccaccactga）に対して部位特異的突然変異誘発を行い、Ｌ５９、Ｙ６０、Ｙ１４８、Ｈ１４９、Ｆ１６４、Ｅ２３７、Ｖ２４２、Ｖ２７１、Ｌ２７２、及びＶ３２８で突然変異を行い、合計１０個の突然変異部位では、７２個の突然変異体を得た。
C60Y（Template、例えば、SEQ ID NO: 1，Arthrobacter citreus由来、MGLTVQKINWEQVKEWDRKYLMRTFSTQNEYQPVPIESTEGDYLITPGGTRLLDFFNQLYCVNLGQKNQKVNAAIKEALDRYGFVWDTYATDYKAKAAKIIIEDILGDEDWPGKVRFVSTGSEAVETALNIARLYTNRPLVVTREHDYHGWTGGAATVTRLRSFRSGLVGENSESFSAQIPGSSCSSAVLMAPSSNTFQDSNGNYLKDENGELLSVKYTRRMIENYGPEQVAAVITEVSQGVGSTMPPYEYVPQIRKMTKELGVLWISDEVLTGFGRTGKWFGYQHYGVQPDIITMGKGLSSSSLPAGAVVVSKEIAAFMDKHRWESVSTYAGHPVAMAAVCANLEVMMEENLVEQAKNSGEYIRSKLELLQEKHKSIGNFDGYGLLWIVDIVNAKTKTPYVKLDRNFRHGMNPNQIPTQIIMEKALEKGVLIGGAMPNTMRIGASLNVSRGDIDKAMDALDYALDYLESGEWQQSLEHHHHHH；対応するヌクレオチド配列はSEQ ID NO：2である。Arthrobactercitreus由来、atgggcctgaccgtacagaagatcaactgggaacaagtaaaggagtgggaccgcaagtacctgatgcgcactttttccactcagaacgaataccagccggtaccgattgaatctacggaaggtgattatctgatcaccccgggtggcacccgtctgctggacttcttcaaccaactgtattgcgttaacctgggccagaaaaaccagaaagtcaacgccgcgattaaagaggcactggaccgctacggcttcgtatgggacacttatgctaccgactacaaggcgaaagccgcgaaaatcattatcgaggatattctgggtgacgaggattggcctggtaaagttcgttttgttagcactggctccgaagccgtggaaaccgcgctgaatatcgcgcgtctgtataccaatcgtccgctggttgtgacccgtgaacacgactatcacggttggaccggcggcgctgcaaccgtcactcgtctgcgtagcttccgttctggtctggtgggtgaaaactccgaaagcttctctgctcagatcccgggttcttcttgtagctctgcagtcctgatggccccgtcttccaacaccttccaggactctaacggcaactacctgaaagacgaaaacggtgaactgctgtccgttaaatacacccgtcgcatgattgaaaactacggcccggagcaggtagccgcagtgattacggaagttagccagggtgttggttctacgatgccgccatacgaatatgttccacagatccgtaaaatgactaaagagctgggcgttctgtggatctccgacgaggtcctgaccggttttggtcgtaccggtaaatggttcggttaccagcattatggcgttcaaccagatatcattactatgggcaagggcctgtcttcttcctctctgccggcgggcgcagtagttgtgtccaaagaaatcgctgcgtttatggacaaacaccgctgggaatctgtttccacctacgcgggtcacccggtggcgatggcagctgtgtgcgctaacctggaagtgatgatggaagaaaacctggtggaacaagctaaaaatagcggcgaatacatccgtagcaaactggaactgctgcaggaaaagcataaaagcatcggcaacttcgacggttacggtctgctgtggattgttgatatcgtgaatgcgaaaactaaaaccccgtatgtcaaactggatcgcaacttccgccacggcatgaacccgaaccagatcccgacgcagattatcatggaaaaagctctggaaaaaggcgttctgatcggtggtgcaatgcctaacactatgcgtatcggcgcatctctgaacgtatctcgtggtgatatcgataaagctatggatgctctggattacgcgctggattacctggagtccggtgaatggcagcagagcctcgagcaccaccaccaccaccactga）に対して部位特異的突然変異誘発を行い、Ｌ５９、Ｙ６０、Ｙ１４８、Ｈ１４９、Ｆ１６４、Ｅ２３７、Ｖ２４２、Ｖ２７１、Ｌ２７２、及びＶ３２８で突然変異を行い、合計１０個の突然変異部位では、７２個の突然変異体を得た。
【0042】
基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。ここで、突然変異体Ｌ５９Ｑ、Ｌ５９Ｗ、Ｈ１４９Ｄ、Ｈ１４９Ｉ、Ｈ１４９Ｒ、Ｆ１６４Ｗ、Ｖ２４２Ｗ、Ｖ２４２Ｈ、Ｖ２４２Ｑ、Ｖ３２８Ｉでは、向上が明らかであり、その中でも、Ｖ２４２Ｗでは、ｅ．ｅ．は最も高く、Ｔｅｍｐｌａｔｅよりも約２倍向上したが、活性（基質変換率）がある程度低下した。結果を表１に示す。
【0043】
【表1】
【0044】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0045】
実施例２
Ｖ２４２Ｗをテンプレートとして、Ｌ５９、Ｆ１６４、Ｌ２７２、Ｖ３２８、Ｔ３３０、Ａ４３６、及びＲ４４２の６つの部位について突然変異を持続し、合計４０個の突然変異体を得た。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。表２に示す結果から、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｌ２７２Ｋ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｖ３２８Ｍ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｖ３２８Ｉ、及びＶ２４２Ｗ＋Ｒ４４２Ｔなどは、ｅ．ｅ．がＶ２４２Ｗよりも大きく向上し、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑの活性（変換率）及び選択性がテンプレートＶ２４２Ｗよりも大きく向上したことから、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑを後のテンプレートとした。
Ｖ２４２Ｗをテンプレートとして、Ｌ５９、Ｆ１６４、Ｌ２７２、Ｖ３２８、Ｔ３３０、Ａ４３６、及びＲ４４２の６つの部位について突然変異を持続し、合計４０個の突然変異体を得た。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。表２に示す結果から、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｌ２７２Ｋ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｖ３２８Ｍ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｖ３２８Ｉ、及びＶ２４２Ｗ＋Ｒ４４２Ｔなどは、ｅ．ｅ．がＶ２４２Ｗよりも大きく向上し、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑの活性（変換率）及び選択性がテンプレートＶ２４２Ｗよりも大きく向上したことから、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑを後のテンプレートとした。
【0046】
【表2】
【0047】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0048】
実施例３
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑをテンプレートとして、Ｖ３２８の１７種類のアミノ酸部位及びＲ４４２Ｔの合計１８個の単一点突然変異部位を構築した。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。表３に示す結果から、活性（変換率で表される）が明らかに向上したものとしてスクリーニングされた２つの突然変異体は、それぞれ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ、及びＶ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｒ４４２Ｔであった。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉを次のステップのテンプレートとした。
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑをテンプレートとして、Ｖ３２８の１７種類のアミノ酸部位及びＲ４４２Ｔの合計１８個の単一点突然変異部位を構築した。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。表３に示す結果から、活性（変換率で表される）が明らかに向上したものとしてスクリーニングされた２つの突然変異体は、それぞれ、Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ、及びＶ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｒ４４２Ｔであった。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉを次のステップのテンプレートとした。
【0049】
【表3】
【0050】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0051】
実施例４
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉをテンプレートとして、Ｇ２Ｓ、Ｔ４６Ｍ、Ｇ４８Ｄ、Ｃ１８５Ｙ、Ｓ１８６Ｎ、Ｓ１９４Ｐ、Ｔ１９７Ｍ、Ｎ２０２Ｄ、Ｙ２０５Ｌ、Ｔ２４５Ａ、Ｖ２５２Ｉ、Ｓ２６８Ｎ、Ｌ３５３Ｆ、Ｎ３５９Ｄ、Ｒ４０９Ｔ、Ｅ４２４Ｋ、Ａ４３６Ｖ、及びＲ４４２の１８個の単一点突然変異部位を構築した。基質１について反応検証を行い、反応条件は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔは、活性が大きく向上したため、次のステップのテンプレートとした、表４は、対応するｅ．ｅ．及び活性の結果を示す。
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉをテンプレートとして、Ｇ２Ｓ、Ｔ４６Ｍ、Ｇ４８Ｄ、Ｃ１８５Ｙ、Ｓ１８６Ｎ、Ｓ１９４Ｐ、Ｔ１９７Ｍ、Ｎ２０２Ｄ、Ｙ２０５Ｌ、Ｔ２４５Ａ、Ｖ２５２Ｉ、Ｓ２６８Ｎ、Ｌ３５３Ｆ、Ｎ３５９Ｄ、Ｒ４０９Ｔ、Ｅ４２４Ｋ、Ａ４３６Ｖ、及びＲ４４２の１８個の単一点突然変異部位を構築した。基質１について反応検証を行い、反応条件は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔは、活性が大きく向上したため、次のステップのテンプレートとした、表４は、対応するｅ．ｅ．及び活性の結果を示す。
【0052】
【表4】
【0053】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0054】
実施例５
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔをテンプレートとして、単一点突然変異を行い、プライマーとしてＧ４８Ｄ、Ｓ１９４Ｐ、及びＶ２５２Ｔとした。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐ、及びＶ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｖ２５２Ｉは、活性が最も高く、タンパク質電気泳動の結果によれば、上清中で突然変異体のタンパク質発現が明らかになった。
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔをテンプレートとして、単一点突然変異を行い、プライマーとしてＧ４８Ｄ、Ｓ１９４Ｐ、及びＶ２５２Ｔとした。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐ、及びＶ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｖ２５２Ｉは、活性が最も高く、タンパク質電気泳動の結果によれば、上清中で突然変異体のタンパク質発現が明らかになった。
【0055】
【表5】
【0056】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0057】
＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が１０～２５％の間であることを示し、＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が２５％～４０％の間であることを示し、＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が４０％～５５％の間であることを示し、＃＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が５５％～７０％の間であることを示し、＃＃＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が７０％～８５％の間であることを示し、＃＃＃＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が８５％～９０％の間であることを示す。
【0058】
実施例６
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐをテンプレートとして単一点突然変異を行い、突然変異部位をＶ２５２Ｉ及びＧ４８Ｄとした。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｖ２５２Ｉをテンプレートとし、突然変異部位をＧ４８Ｄとした。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。表６に示す結果から、突然変異体Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｇ４８Ｄは、活性が向上し、上清中でタンパク質の発現が明らかになった。
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐをテンプレートとして単一点突然変異を行い、突然変異部位をＶ２５２Ｉ及びＧ４８Ｄとした。Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｖ２５２Ｉをテンプレートとし、突然変異部位をＧ４８Ｄとした。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、１６ｈとした。表６に示す結果から、突然変異体Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｇ４８Ｄは、活性が向上し、上清中でタンパク質の発現が明らかになった。
【0059】
【表6】
【0060】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0061】
＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が１０～２５％の間であることを示し、＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が２５％～４０％の間であることを示し、＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が４０％～５５％の間であることを示し、＃＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が５５％～７０％の間であることを示し、＃＃＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が７０％～８５％の間であることを示し、＃＃＃＃＃＃はＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの百分率が８５％～９０％の間であることを示す。
【0062】
実施例７
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐ＋Ｖ２５２Ｉをテンプレートとして、単一点突然変異を行い、突然変異部位をＧ４８Ｄとした。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表７に示す結果から、突然変異体Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｇ４８Ｄは、活性が最も高かった。
Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐ＋Ｖ２５２Ｉをテンプレートとして、単一点突然変異を行い、突然変異部位をＧ４８Ｄとした。基質１について反応検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．２５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．５ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表７に示す結果から、突然変異体Ｖ２４２Ｗ＋Ｆ１６４Ｑ＋Ｖ３２８Ｉ＋Ｒ４４２Ｔ＋Ｓ１９４Ｐ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｇ４８Ｄは、活性が最も高かった。
【0063】
【表7】
【0064】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0065】
実施例８
酵素量を１ｍｇにした条件下で、基質１の様々な基質濃度について検証を行った。反応条件：リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、様々な濃度の６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩、全体積 ２ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表８に示す結果から、ｅ．ｅ．は基質濃度の上昇に応じて上昇したが、基質変換率は基質濃度の上昇に応じて低下し、好ましくは基質濃度は３０ｍｇ／ｍＬであった。
酵素量を１ｍｇにした条件下で、基質１の様々な基質濃度について検証を行った。反応条件：リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、様々な濃度の６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩、全体積 ２ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表８に示す結果から、ｅ．ｅ．は基質濃度の上昇に応じて上昇したが、基質変換率は基質濃度の上昇に応じて低下し、好ましくは基質濃度は３０ｍｇ／ｍＬであった。
【0066】
【表8】
【0067】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0068】
実施例９
基質１の濃度を３０ｍｇ／ｍＬにした条件下で、様々な酵素の使用量について検証を行った。反応系は、リン酸ピリドキサール０．５ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩９０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５、全体積１．５ｍＬとし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表９に示す結果から、ｅ．ｅ．は、酵素量の低下に応じて僅かに向上したが、突然変異体の活性には大きな変化が認められず、好ましくは１．７ｍｇ／ｍＬ酵素量である。
基質１の濃度を３０ｍｇ／ｍＬにした条件下で、様々な酵素の使用量について検証を行った。反応系は、リン酸ピリドキサール０．５ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩９０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５、全体積１．５ｍＬとし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表９に示す結果から、ｅ．ｅ．は、酵素量の低下に応じて僅かに向上したが、突然変異体の活性には大きな変化が認められず、好ましくは１．７ｍｇ／ｍＬ酵素量である。
【0069】
【表9】
【0070】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊代表 ８０－９０％、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0071】
実施例１０
基質１について反応温度を最適化させた。反応系は、基質６０ｍｇ、酵素３ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．６ｍｇ、６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩１２０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積１．８ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表１０に示す結果から、ｅ．ｅ．は、温度の低下に応じた明らかな変化が認められなかったが、２０℃では活性は明らかに低下し、３０℃で反応させるのが好ましい。
基質１について反応温度を最適化させた。反応系は、基質６０ｍｇ、酵素３ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．６ｍｇ、６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩１２０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積１．８ｍＬまで補充）とし、反応条件は、４５℃、２００ｒｐｍ、４０ｈとした。表１０に示す結果から、ｅ．ｅ．は、温度の低下に応じた明らかな変化が認められなかったが、２０℃では活性は明らかに低下し、３０℃で反応させるのが好ましい。
【0072】
【表10】
【0073】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊代表 ８０－９０％、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0074】
実施例１１
基質１の反応をスケールアップし、反応系は、基質１ｇ、酵素０．０５ｇ、リン酸ピリドキサール１０ｍｇ、６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２ｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積３０ｍＬまで補充）とし、反応条件は、３０℃、２００ｒｐｍ、６０ｈとした。２５０ｍＬ三角フラスコにて反応を行った。表１１に示す結果から、突然変異体は、ｅ．ｅ．及び活性が母本のｅ．ｅ．及び活性よりも有意に向上した。
基質１の反応をスケールアップし、反応系は、基質１ｇ、酵素０．０５ｇ、リン酸ピリドキサール１０ｍｇ、６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２ｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積３０ｍＬまで補充）とし、反応条件は、３０℃、２００ｒｐｍ、６０ｈとした。２５０ｍＬ三角フラスコにて反応を行った。表１１に示す結果から、突然変異体は、ｅ．ｅ．及び活性が母本のｅ．ｅ．及び活性よりも有意に向上した。
【0075】
【表11】
【0076】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0077】
反応終了後の系を以下の具体的なステップで処理した。不純物を除去し、系を５０ｍＬ遠心分離管に移した。系の体積の半分の酢酸エチルを加えて振とうさせ、２つの５０ｍＬ遠心分離管に分包し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨てて、下層の系に系の体積の半分の酢酸エチルを加えて振とうさせ、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。これを１回繰り返した。下層の系に系の体積の半分の酢酸エチルを加えて振とうさせ、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。これを１回繰り返した。下層の系を２５０ｍＬ丸底フラスコに移し、重量を量った。基質を除去するために、水酸化ナトリウム乾燥粉末を残りの系の重量の半分に相当する量で丸底フラスコ中の系に加えて、このプロセスに亘って系を４０℃未満に維持した。０．５倍の系（系の体積の半分）のメチル第３級ブチルエーテルを加え、２つの５０ｍＬ遠心分離管に移し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。上清に０．５倍の系（上清の体積の半分）のメチル第３級ブチルエーテルを加えて振とうさせ、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。これを１回繰り返した。上清を丸底フラスコに移し、回転蒸発させた。生成物の収率は５３％であった。
【0078】
実施例１２
最適かされた反応条件で、基質２、基質３、基質４、基質５について検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．３ｍＬまで補充）とし、反応条件は、３０℃、２００ｒｐｍ、６０ｈとした。表１２に示す結果から、いずれの基質でも、突然変異体活性は向上した。
最適かされた反応条件で、基質２、基質３、基質４、基質５について検証を行い、反応系は、基質１０ｍｇ、リン酸ピリドキサール０．１ｍｇ、６ Ｍイソプロピルアミン塩酸塩２０ｍｇ、酵素０．５ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５（全体積０．３ｍＬまで補充）とし、反応条件は、３０℃、２００ｒｐｍ、６０ｈとした。表１２に示す結果から、いずれの基質でも、突然変異体活性は向上した。
【0079】
【表12】
【0080】
注：＊は活性１～３０％を示し、＊＊は３０～６０％を示し、＊＊＊は６０～７０％を示し、＊＊＊＊は７０～８０％を示し、＊＊＊＊＊は、８０～９０％を示し、＊＊＊＊＊＊は９０～９５％を示し、＊＊＊＊＊＊＊は９５％超を示す。
【0081】
また、トランスアミナーゼの立体構造をコンピューターシミュレーション解析ソフトを用いて解析したところ、突然変異部位の多くが活性中心付近に位置しており、この突然変異により基質と酵素の結合が強化される可能性があることが判明した。したがって、選択性と触媒効率が向上した。
【0082】
上記は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとって本発明は様々な変更及び変化が可能である。本発明の精神及び原則において行われる補正、均等置換、改良などであれば、本発明の保護範囲内に含まれるものとする。
【配列表】
【国際調査報告】