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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】アンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20250109BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20250109BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20250109BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20250109BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20250109BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20250109BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20250109BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20250109BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20250109BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20250109BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 130Z
C12N15/113 ZNA
A61K31/712
A61K48/00
A61P19/02
A61P35/00
A61P3/10
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P25/14
A61P13/12
A61P11/00
A61P9/00
A61P9/10
A61P1/16
A61P31/12
A61P17/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539674
(86)(22)【出願日】2022-12-28
(85)【翻訳文提出日】2024-08-20
(86)【国際出願番号】 US2022082445
(87)【国際公開番号】W WO2023129939
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】63/294,835
(32)【優先日】2021-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506198263
【氏名又は名称】財團法人生物技術開發中心
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】ライリー， イング・シュアン
(72)【発明者】
【氏名】リュウ， チア・ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ワング， チ・タング
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ， ペイ・イー
(72)【発明者】
【氏名】ウー， チャング・フシアン
(72)【発明者】
【氏名】ラム， キング
(72)【発明者】
【氏名】サン， ウェイ・ティング
(72)【発明者】
【氏名】ヤング， カイ・チェン
(72)【発明者】
【氏名】フワング， ハング・ジャン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA02
4C084ZA16
4C084ZA45
4C084ZA59
4C084ZA75
4C084ZA81
4C084ZA89
4C084ZA96
4C084ZB26
4C084ZB33
4C084ZC35
4C084ZC52
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA02
4C086ZA16
4C086ZA36
4C086ZA45
4C086ZA59
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA89
4C086ZA96
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZC35
4C086ZC52
4C086ZC54
(57)【要約】
チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ＴＸＮＤＣ５）ｍＲＮＡの転写を低減可能な新規の１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）がここに開示される。ＴＸＮＤＣ５の上方制御に関連する疾患を処置するのに適した医薬品を製造するための、ここに開示されたような１本鎖ＡＳＯの使用も開示される。したがって、開示されるＡＳＯ分子を含む薬学的組成物及び開示された１本鎖ＡＳＯ分子を被検体に投与することを介してＴＸＮＤＣ５媒介性疾患に罹患している被検体を処置する方法が提供される。
【選択図】 図４
【選択図】 図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ＴＸＮＤＣ５）ｍＲＮＡの翻訳を阻害する１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、前記１本鎖ＡＳＯは、約１６～２１ヌクレオチド長であり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を有するデオキシリボヌクレオチド配列を備える、１本鎖ＡＳＯ。
【請求項2】
少なくとも１個のロックド核酸（ＬＮＡ）分子、２’－糖修飾、修飾ヌクレオチド間結合、修飾核酸塩基又はそれらの組合せを備える請求項１に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項3】
少なくとも１個の２’－フルオロ糖、２’－Ｏ－メチル糖又は２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項4】
６個のＬＮＡ分子を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項5】
１０個の２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項6】
少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項7】
少なくとも１個の５－メチルシトシンを備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項8】
チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ＴＸＮＤＣ５）の上方制御を通じて媒介される被検体における疾患を処置する方法であって、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写を抑制するように有効量の請求項１に記載の１本鎖ＡＳＯを前記被検体に投与するステップを備える方法。
【請求項9】
前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個のロックド核酸（ＬＮＡ）分子、２’－糖修飾、修飾ヌクレオチド間結合、修飾核酸塩基又はそれらの組合せを備える、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個の２’－フルオロ糖、２’－Ｏ－メチル糖又は２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記１本鎖ＡＳＯは、６個のＬＮＡ分子を備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記１本鎖ＡＳＯは、１０個の２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個の５－メチルシトシンを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
前記疾患は、老化、関節炎、癌、糖尿病、神経変性疾患、線維症、アテローム性動脈硬化症、白斑及びウイルス感染からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項16】
前記癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌及び子宮癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びプリオン病からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記線維症は、肺線維症、腎線維症、肝線維症及び心筋線維症からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記被検体はヒトである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は２０２１年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２９４８３５号の優先権及びその利益を主張し、その全体が参照によりここに取り込まれる。
本出願は２０２１年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２９４８３５号の優先権及びその利益を主張し、その全体が参照によりここに取り込まれる。
【0002】
本開示は、疾患の処置に関する。より具体的には、本開示は、チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ５：ＴＸＮＤＣ５）ｍＲＮＡの発現を阻害する１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用によって疾患を処置することに関する。
【背景技術】
【0003】
チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ＴＸＮＤＣ５）は、そのチオレドキシン活性を触媒し、それを小胞体におけるシャペロンとして作用可能とするタンパク質ジスルフィド異性化酵素である。ＴＸＮＤＣ５の上方制御された発現は、癌、糖尿病、関節炎、神経変性疾患、臓器線維症関連疾患（例えば、肺線維症、腎線維症、肝線維症及び心筋線維症）及び白斑を含む種々のタイプの疾患と関連していることが確認されている。
【0004】
転写後遺伝子サイレンシング技術、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、ＡＳＯ）の、様々な生物における特定の遺伝子の発現をノックアウトするツールとしての新たな使用により、現在では、機能的遺伝子を系統的にサイレンシングすることによって細胞シグナル伝達経路におけるタンパク質相互作用をマッピングし、それにより、無数の疾患に対する治療法を開発する新規の方法を提供することが可能となる。広範な研究及び実験の後、本研究の発明者らは、ＴＸＮＤＣ５のプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを標的とし、ＴＸＮＤＣ５のＲＮＡレベルを減少させ、同様にＴＸＮＤＣ５タンパク質レベルを低下させることができる短いオリゴヌクレオチド分子を同定した。アンチセンス分子は、種々の作用機序：ＲＮａｓｅＨを通じたｍＲＮＡの分解、リボソームサブユニット結合の立体障害、ｍＲＮＡの成熟の変化、５’－キャップ形成阻害、翻訳の停止を通じて標的配列に作用し得る。したがって、これらの同定された短い核酸分子は、ＴＸＮＤＣ５の過剰発現に関連する疾患を処置し、それにより、そのような処置を必要とする被検体において、それに関連する症状を軽減又は最小化するための医薬品の開発に有用である。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、疾患、特に、ＴＸＮＤＣ５の上方制御に関連する疾患の処置又はそれに対する予防のための１本鎖核酸に向けられる。
【0006】
したがって、本発明の一態様はＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ発現を低減させる単離された１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に向けられ、当該ＡＳＯ分子は約１６～２１ヌクレオチド長であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：（配列番号）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を有するデオキシリボヌクレオチド配列を備える。
【0007】
本開示の好適な実施形態によると、上記ＡＳＯ分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有するデオキシリボヌクレオチド配列を備える。
【0008】
本開示の実施形態によると、上記ＡＳＯ分子は、少なくとも１個のロックド核酸（ＬＮＡ）分子、２’－糖修飾、修飾ヌクレオチド間結合又はそれらの組合せを備える。本開示のいくつかの実施形態では、ＡＳＯ分子は、６個のＬＮＡ分子を備える。本開示の他の実施形態では、ＡＳＯ分子は、１０個の２’－糖修飾を備える。
【0009】
他の態様では、本開示は、ＴＸＮＤＣ５の上方制御を通じて媒介される疾患に罹患している被検体を処置する方法に向けられる。方法は、ＴＸＮＤＣ５遺伝子の転写を抑制するように治療上有効量の本発明のＡＳＯ分子を被検体に投与するステップを備える。
【0010】
本開示の実施形態によると、本発明のＡＳＯ分子は、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ発現を低減させる１本鎖オリゴヌクレオチドである。上記ＡＳＯ分子は、約１６～２１ヌクレオチド長であり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を有するデオキシリボヌクレオチド配列を有する。
【0011】
本開示の実施形態によると、ＡＳＯ分子は、少なくとも１個のＬＮＡ分子、２’－糖修飾、修飾ヌクレオチド間結合又はそれらの組合せを備える。いくつかの実施形態では、ＡＳＯ分子は、６個のＬＮＡ分子を備える。他の実施形態では、ＡＳＯ分子は、１０個の２’－糖修飾を備える。
【0012】
本開示の実施形態によると、ＴＸＮＤＣ５の過剰発現に関連する疾患は、老化、関節炎（例えば、関節リウマチ）、癌、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、神経変性疾患、線維症、白斑及びウイルス感染からなる群から選択される。好適な一実施例では、被検体は、肺線維症、腎線維症、肝線維症又は心筋線維症などの臓器線維症に罹患している。
【0013】
他の態様では、本開示は、ＴＸＮＤＣ５の過剰発現に関連する疾患を処置、予防又は改善するための薬学的組成物に向けられる。薬学的組成物は、本発明のＡＳＯ分子及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【0014】
本発明の１以上の実施形態の詳細を、以下の付随する説明において説明する。発明の他の特徴及び有利な効果が、詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【0015】
本発明のこれら及び他の特徴、態様及び有利な効果は、以下の説明、添付の特許請求の範囲及び添付の図面を参照してより深く理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】図１Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１１２８２３５である。
【図1B】図１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１１２８２５５である。
【図1C】図１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１２８２５２である。
【図1D】図１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１２８２６６である。
【図1E】図１Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１２８２６５である。
【図1F】図１Ｆは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１２８２３８である。
【図1G】図１Ｇは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１２８２７９である。
【図1H】図１Ｈは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェスタンブロット分析を介したＴＧＦ－β誘導の有り又は無しでのＴＸＮＤＣ５及び線維症関連タンパク質の発現パターンにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡの効果を示し、本ＡＳＯはＤＣＢ１１１１１２８２８０である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る唯一の形態を示すものではない。その説明は、本発明の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。
【0018】
１．定義
便宜上、本開示の文脈において採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りのない限り、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。
便宜上、本開示の文脈において採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りのない限り、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。
【0019】
用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのようなＤＮＡ又はＲＮＡの変異体又は類似体を包含する２個以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子として定義される。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、ここでは互換可能に用いられる。用語「オリゴヌクレオチド」は、２０個のヌクレオチドなどの２５個未満のヌクレオチドからなる核酸として定義される。
【0020】
ここで用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ配列に相補的であり、ＲＮＡレベルを低減させ、それによりタンパク質レベルを低減させ得る１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡをいう。本開示の好適な実施形態によると、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０３０８１０．４）の３３７～３５６位、６７０～６８９位、６７５～６９４位、８６２～８８１位、８７９～８９８位、１００３～１０２２位、１００７～１０２６位、１２７８～１２９７位、２８６４～２８８３位、２８６５～２８８４位、２８６８～２８８７位及び２８７３～２８９２位での核酸塩基に相補的なＡＳＯが生成され、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの下方制御をもたらす。
【0021】
ここで用いられるように、核酸の「配列」は、核酸を構成するヌクレオチドの順序をいう。本出願の全体を通じて、核酸は、５’末端及び３’末端を有するものとして指定される。特に断りのない限り、１本鎖核酸の左側末端は５’末端であり、１本鎖核酸の右側末端は３’末端である。
【0022】
ここで用いられる用語「ロックド核酸（ＬＮＡ）」は、核酸のいくつかのヌクレオチドがロックド核酸モノマー（すなわち、２環式ヌクレオチド又はその類似体）である核酸をいう。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’－酸素及び４’－炭素を接続する追加的な架橋で修飾される。この架橋は３’－エンド（ノース）コンフォメーションにおいてリボースを「ロック」しており、それはＡ型二本鎖において見られることが多い。これらのＬＮＡモノマーは、特に、国際公開第２００１／２５２４８号、国際公開第２００３／００６４７５号及び国際公開第２００３／０９５４６７号に記載されており、それぞれの引用刊行物の開示は、参照によりここに取り込まれる。
【0023】
用語「相補的」は、塩基対合規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は、「Ｔ－Ｃ－Ａ」の配列に相補的である。ハイブリダイゼーションが２個の１本鎖ポリヌクレオチドの間の逆平行構成において生じる場合、ポリヌクレオチドを相互に「相補的」として記載する。
【0024】
ここで同定される任意のヌクレオチド配列に対する「パーセント（％）配列同一性」は、配列をアライメントさせ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、特定のヌクレオチド配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義され、保存的置換を配列同一性の部分として考慮しない。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当分野の技術範囲内にある種々の態様において達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。ここでの目的のために、２個のヌクレオチド配列の間の配列比較をＮａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータープログラムＢｌａｓｔｎ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ）によって実施した。所与のヌクレオチド配列Ａの所与のヌクレオチド配列Ｂに対するパーセント配列同一性（代替的に、所与のヌクレオチド配列Ｂに対して特定の％ヌクレオチド配列同一性を有する所与のヌクレオチド配列Ａと表現され得る）は、以下の式：
Ｘ／Ｙ×１００％
によって計算される。ただし、Ｘは配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによってそのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一の一致としてスコアリングされたヌクレオチド残基の数であり、ＹはＡ又はＢのいずれか短い方のヌクレオチド残基の総数である。
Ｘ／Ｙ×１００％
によって計算される。ただし、Ｘは配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによってそのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一の一致としてスコアリングされたヌクレオチド残基の数であり、ＹはＡ又はＢのいずれか短い方のヌクレオチド残基の総数である。
【0025】
ここで用いられるように、用語「処置する」若しくは「処置している」又は「処置」は、防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的処置をいう。ここで用いられるように、用語「処置している」は、特定の疾患、障害及び／又は状態の１以上の症状又は特徴の発症を部分的又は完全に軽減し、改善し、救済し、遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し及び／又はその発生率を低減させる目的で、本開示のＡＳＯを、医学的状態、状態の症状、状態に続発する疾患若しくは障害又は状態に対する素因を有する被検体に適用又は投与することをいう。処置は、疾患、障害及び／若しくは状態の徴候を示さない被検体並びに／又は疾患、障害及び／若しくは状態に関連する病態の発症のリスクを減少させる目的で、疾患、障害及び／若しくは状態の初期徴候のみを示す被検体に施され得る。処置は、用語がここで定義されるように、１以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合、一般に「有効」である。代替的に、処置は、疾患の進行が低減又は停止される場合、「有効」である。すなわち、「処置」は、単に疾患の症状の改善又はマーカーの減少だけでなく、処置無しで予想されることになる症状の進行又は悪化の中断又は減速も含む。有益又は所望の臨床的結果は、検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、１以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延又は減速、疾患の状態の改善又は緩和及び（部分的であるか全体的であるかに関わらず）寛解を含むが、これらに限定されない。
【0026】
ここで用いられるように、用語「有効量」は、所望の応答をもたらすのに十分な成分の量をいう。ここで用いられるように、用語「治療上有効量」は、上記で定義されるように、治療上の所望の「有効な処置」をもたらす薬剤（例えば、本ＡＳＯ）の量をいう。具体的な治療上有効量は、処置されている特定の状態、患者の身体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、処置されている哺乳類又は動物の種類、処置の継続期間、（それがある場合には）併用治療の性質及び採用される具体的処方などの因子により変化することになる。治療上有効量は、治療上有益な効果が化合物又は組成物の任意の毒性又は有害な効果を上回る量でもある。
【0027】
ここで用いられるように、用語「被検体」又は「患者」は、健常被検体と比較してＴＸＮＤＣ５の調節不全な発現、特に、ＴＸＮＤＣ５の上方制御を有し、本発明の方法を受けるヒト又は非ヒト動物をいう。用語「被検体」又は「患者」は、一方の性別が具体的に示されていない限り、雄及び雌の双方の性別をいうことを意図している。非ヒト動物の例は、すべての脊椎動物、例えば、霊長類、イヌ、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、ネコ、ヒツジ、ウマ又はブタなどの哺乳類並びに鳥類、両生類などの非哺乳類を含む。
【0028】
ここで特に断りがない限り、本開示において採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者によって理解及び使用される意味を有するものとする。文脈によってそれ以外が要求されない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。
【0029】
発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、特定の実施例で説明される数値は可能な限り正確に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで用いられるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、又は明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及びパーセントのすべては、すべての事例において用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で記載される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効桁数を考慮してかつ通常の四捨五入技術を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【0030】
２．本アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子の使用による、上方制御されたＴＸＮＤＣ５に関連する疾患を処置するための新規の解決策に向けられる。したがって、最も広い態様では、本発明はＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡなどの標的遺伝子の少なくとも一部分に相補的な１本鎖デオキシリボ核酸に関し、宿主細胞にトランスフェクションされた場合、上記１本鎖デオキシリボ核酸は標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を抑制可能である。
本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子の使用による、上方制御されたＴＸＮＤＣ５に関連する疾患を処置するための新規の解決策に向けられる。したがって、最も広い態様では、本発明はＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡなどの標的遺伝子の少なくとも一部分に相補的な１本鎖デオキシリボ核酸に関し、宿主細胞にトランスフェクションされた場合、上記１本鎖デオキシリボ核酸は標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を抑制可能である。
【0031】
本発明の１本鎖デオキシリボ核酸又はＡＳＯ分子は、約１６～２１ヌクレオチド長であり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を有するデオキシリボヌクレオチド配列を備える。本開示の好適な実施形態によると、上記ＡＳＯ分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有するデオキシリボヌクレオチド配列を備える。特定の好適な実施形態では、上記ＡＳＯ分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４と１００％同一なデオキシリボヌクレオチド配列を備える。本開示のＡＳＯは、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド長などの１６～２１ヌクレオチド長であり得る。いくつかの好適な実施例では、本開示のＡＳＯは、２０ヌクレオチド長を有する。他の好適な実施例では、本開示のＡＳＯは、１６ヌクレオチド長を有する。
【0032】
３．修飾ＡＳＯ
代替的に又は追加的に、本ＡＳＯは、ヌクレオチド間結合、糖部分又は核酸塩基への置換又は変更を導入するなどして、その骨格核酸塩基での修飾（例えば、置換）又はその糖環での修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、本ＡＳＯの核酸は、１個以上のＬＮＡ分子と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。他の実施形態では、本ＡＳＯの核酸は、１個以上の２’－糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル置換）と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。修飾ＡＳＯは、例えば、増強された細胞取込み、増強された核酸標的に対する親和性、ヌクレアーゼ存在下での増加された安定性又は増加された阻害活性などの望ましい特性のために、天然型よりも好ましいことが多い。
代替的に又は追加的に、本ＡＳＯは、ヌクレオチド間結合、糖部分又は核酸塩基への置換又は変更を導入するなどして、その骨格核酸塩基での修飾（例えば、置換）又はその糖環での修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、本ＡＳＯの核酸は、１個以上のＬＮＡ分子と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。他の実施形態では、本ＡＳＯの核酸は、１個以上の２’－糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル置換）と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。修飾ＡＳＯは、例えば、増強された細胞取込み、増強された核酸標的に対する親和性、ヌクレアーゼ存在下での増加された安定性又は増加された阻害活性などの望ましい特性のために、天然型よりも好ましいことが多い。
【0033】
（ｉ）修飾ヌクレオチド間結合
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に生じるヌクレオチド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオチド間結合及びリン原子を有しないヌクレオチド間結合を含む。代表的なリン含有ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート及びホスホロチオエートを含むが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有結合体の調製の方法は公知である。
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に生じるヌクレオチド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオチド間結合及びリン原子を有しないヌクレオチド間結合を含む。代表的なリン含有ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート及びホスホロチオエートを含むが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有結合体の調製の方法は公知である。
【0034】
特定の実施形態では、本ＡＳＯは、１個以上のホスホロチオエート結合などの１個以上の修飾ヌクレオチド間結合を備える。
【0035】
（ｉｉ）修飾糖部分
本ＡＳＯは、任意選択的に、糖類が修飾された１個以上のヌクレオシドを含み得る。特定の実施形態では、本ＡＳＯは、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を備える。化学的に修飾されたリボフラノース環の例は、限定されることなく、置換基（例えば、５’－又は２’－置換基）の付加、ロックド核酸（ＬＮＡ）を形成する非ジェミナル環原子の架橋、Ｒ、Ｒａ及びＲｂが独立してＣ１－１２アルキル、保護基又はそれらの組合せであるリボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）２での置換を含む。
本ＡＳＯは、任意選択的に、糖類が修飾された１個以上のヌクレオシドを含み得る。特定の実施形態では、本ＡＳＯは、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を備える。化学的に修飾されたリボフラノース環の例は、限定されることなく、置換基（例えば、５’－又は２’－置換基）の付加、ロックド核酸（ＬＮＡ）を形成する非ジェミナル環原子の架橋、Ｒ、Ｒａ及びＲｂが独立してＣ１－１２アルキル、保護基又はそれらの組合せであるリボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）２での置換を含む。
【0036】
化学的に修飾された糖の例は、２’－Ｆ－５’－メチル置換ヌクレオシド又は２’－位での更なる置換を有するリボシル環酸素原子のＳでの置換を含む。
【0037】
代替的な実施例によると、化学的に修飾された糖は、ＬＮＡ分子の５’－置換を含む。ＬＮＡの例は、限定されることなく、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間の架橋を備えるヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ここでは、本ＡＳＯは、１個以上のＬＮＡヌクレオシドを含み、架橋は式：４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－Ｃ（ＣＨ３）２－Ｏ－２’、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’及び４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－ＮＲ－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｃ（ＣＨ３）－２’及び４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’のうちの１個を備え、Ｒは独立してＨ、Ｃ１－１２アルキル又は保護基である。前述のＬＮＡの各々は、例えばα－Ｌ－リボフラノース及びβ－Ｄ－リボフラノースを含む種々の立体化学的糖構成を含む。
【0038】
特定の実施形態では、ヌクレオシドは、リボシル環を糖サロゲートで置換することによって修飾される。そのような修飾は、限定されることなく、リボシル環の、以下の式
のうち１個を有するものなどのモルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環又はテトラヒドロピラニル環などの（ＤＮＡ類似体ということもある）サロゲート環系による置換を含む。
【化1】
【0039】
他の多数のビシクロ及びトリシクロ糖サロゲート環系もまた、本ＡＳＯへの組込みのためにヌクレオシドを修飾するのに用いられ得ることが当技術分野で公知である。
【0040】
したがって、本ＡＳＯは、完全にＤＮＡ分子で構成されることもあれば、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドと組み合わせたＤＮＡ分子で構成されることもある。いくつかの実施形態では、本ＡＳＯは、２’－Ｏ－、４’－ＣメチレンビシクロヌクレオシドモノマーなどのＬＮＡ分子と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。核酸中にＬＮＡモノマーを有することの１つの有利な効果は、核酸の安定性が改善されることであり、したがって、本発明のＡＳＯは、プロテアーゼ（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ）に対するＡＳＯの耐性を増加させ、それにより生物学的サンプルにおいてその循環半減期を増加させるなどして、もたらされる分子の安定性を増加させるように、標準的なＤＮＡオリゴヌクレオチドへのＬＮＡモノマーの組込みを含み得る。一般に、本発明の１本鎖ＡＳＯは、鎖中のヌクレオチドの総数に基づいて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％のＬＮＡモノマーを含み得る。特定の実施形態では、本発明のＡＳＯは、鎖中のヌクレオチドの総数に基づいて、少なくとも約２５％、３０％、４０％、５０％又は６０％のＬＮＡモノマー、好ましくは約４０％のＬＮＡモノマー、より好ましくは約６０％のＬＮＡモノマーを含むことになる。本発明の一実施形態では、本発明のＡＳＯは、完全にＤＮＡ分子で構成され、１本の鎖は配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を備える。本発明の他の実施形態では、本発明のＡＳＯは、ＬＮＡ分子と組み合わせたＤＮＡ分子で構成され、１本鎖ＡＳＯは少なくとも約３０％のＬＮＡ分子と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。本発明の一実施形態では、１本鎖ＡＳＯは少なくとも１個のＬＮＡモノマーを備える。他の実施形態では、１本鎖ＡＳＯは６個のＬＮＡモノマーを備える。
【0041】
代替的に、本発明の１本鎖ＡＳＯは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾糖などの少なくとも１個の２’－糖修飾と組み合わせたＤＮＡ分子で構成されてもよい。一般に、本発明の１本鎖ＡＳＯの個々の鎖は、鎖中のヌクレオチドの総数に基づいて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％の２’－糖修飾を含み得る。特定の実施形態では、本発明の１本鎖ＡＳＯは、鎖中のヌクレオチドの総数に基づいて、少なくとも約２５％、３０％、４０％、５０％又は６０％の２’－糖修飾、好ましくは約４０％の２’－糖修飾、より好ましくは約５０％の２’－糖修飾を含むことになる。本発明の一実施形態では、本発明の１本鎖ＡＳＯは、完全にＤＮＡ分子で構成され、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を備える。本発明の他の実施形態では、本発明の１本鎖ＡＳＯは１個以上の２’－糖修飾と組み合わせたＤＮＡ分子で構成され、デオキシリボ核酸の鎖は少なくとも２０％の２’－糖修飾と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。本発明の一実施形態では、１本鎖ＡＳＯは、１個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾糖のみを備える。他の実施形態では、１本鎖ＡＳＯは、１０個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾糖を備える。
【0042】
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基
化学的に修飾されたヌクレオシドも、標的核酸へのその結合親和性を高めるように本ＡＳＯに含まれ得る。核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、機能的に交換可能であるが、天然に生じる又は合成の修飾されていない核酸塩基とは構造的に区別可能である。天然核酸塩基及び修飾核酸塩基の双方は、水素結合に関与可能である。そのような核酸塩基修飾は、アンチセンス化合物へのヌクレアーゼ安定性、結合親和性又は他の何らかの有益な生物学的特性に影響を与え得る。修飾核酸塩基は、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）などの合成及び天然の核酸塩基を含む。５－メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの結合親和性を増加させるのに特に有用である。
化学的に修飾されたヌクレオシドも、標的核酸へのその結合親和性を高めるように本ＡＳＯに含まれ得る。核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、機能的に交換可能であるが、天然に生じる又は合成の修飾されていない核酸塩基とは構造的に区別可能である。天然核酸塩基及び修飾核酸塩基の双方は、水素結合に関与可能である。そのような核酸塩基修飾は、アンチセンス化合物へのヌクレアーゼ安定性、結合親和性又は他の何らかの有益な生物学的特性に影響を与え得る。修飾核酸塩基は、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）などの合成及び天然の核酸塩基を含む。５－メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの結合親和性を増加させるのに特に有用である。
【0043】
したがって、本１本鎖ＡＳＯは、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体；アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体；２－チオウラシル；２－チオチミン；２－チオシトシン；５－ハロウラシル；５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体；６－アゾウラシル、６－アゾシトシン及び６－アゾチミン；５－ウラシル；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換されたアデニン及びグアニン；５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換されたウラシル及びシトシン；７－メチルグアニン；７－メチルアデニン；２－Ｆ－アデニン；２－アミノアデニン；８－アザグアニン；８－アザアデニン；７－デアザグアニン；７－デアザアデニン；３－デアザグアニン並びに３－デアザアデニンなどの少なくとも１個の修飾核酸塩基と組み合わせたＤＮＡ分子で構成され得る。一般に、本発明の１本鎖ＡＳＯは、鎖中のヌクレオチドの総数に基づいて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％の修飾核酸塩基を含み得る。特定の実施形態では、本発明の１本鎖ＡＳＯは、鎖中のヌクレオチドの総数に基づいて、少なくとも約２５％、３０％、４０％、５０％又は６０％の修飾核酸塩基、好ましくは約４０％の修飾核酸塩基、より好ましくは約５０％の修飾核酸塩基を含む。本発明の一実施形態では、本発明の１本鎖ＡＳＯは、完全にＤＮＡ分子で構成され、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を備える。本発明の他の実施形態では、本発明の１本鎖ＡＳＯは、５－メチルシトシン（例えば、少なくとも２０％の５－メチルシトシン）と組み合わせたＤＮＡ分子で構成される。本発明のいくつかの実施形態では、１本鎖ＡＳＯは、１個の５－メチルシトシンのみを備える。他の実施形態では、１本鎖ＡＳＯは、１０個の５－メチルシトシンを備える。
【0044】
４．本ＡＳＯを生成する方法
現在、遺伝子サイレンシング研究のために、上記の化学修飾の有無に関わらず、長いｄｓＤＮＡの化学合成又はＤＮａｓｅＩＩＩファミリー酵素による消化を含むＡＳＯを生成する種々の方法が存在する。これらの方法は、その後リポフェクション、エレクトロポレーション又は他の技術により細胞に直接導入される核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製を伴う。
現在、遺伝子サイレンシング研究のために、上記の化学修飾の有無に関わらず、長いｄｓＤＮＡの化学合成又はＤＮａｓｅＩＩＩファミリー酵素による消化を含むＡＳＯを生成する種々の方法が存在する。これらの方法は、その後リポフェクション、エレクトロポレーション又は他の技術により細胞に直接導入される核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製を伴う。
【0045】
本発明のＡＳＯ分子を、当技術分野で周知のプロトコルを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ調製及び／又は化学合成によって取得した。例えば、本発明の１本鎖核酸は、有機化学の当業者に公知である核酸化学の重合技術を用いて生成され得る。一般に、ホスホロアミダイトアプローチの標準的なオリゴマー化サイクルが用いられることもあるが、Ｈ－ホスホネート化学作用又はホスホトリエステル化学作用などの他の化学作用が用いられることもある。本ＡＳＯ分子は、被検体に直接、又はリポソームなどの送達ビヒクルを介して送達され得る。さらに、本ＡＳＯは、薬学的に許容可能な製剤を与えるために、適切な担体及び／又は希釈剤とともに処方され得る。核酸分子を送達する方法は、本技術分野において公知であり、リポソーム中の封入、イオントフォレシス又は生分解性ポリマー、ヒドロゲル若しくはシクロデキストリンなどの他の小胞への取込みを含むが、これらに限定されない。
【0046】
本発明で用いられるすべてのＡＳＯ分子を表１に列挙する。本発明の修飾ＡＳＯ（すなわち、ＡＳＯ－ＬＮＡ又はＡＳＯ－ＭＯＥ）を、表１に列挙されたように対応するＡＳＯを少なくとも１個のＬＮＡ分子又は２’－ＭＯＥ修飾糖で修飾することによって取得した。表２は本発明の修飾ＡＳＯ分子を列挙する。
表１．本ＡＳＯのデオキシリボヌクレオチド配列
表２．ＡＳＯ－ＬＮＡ又はＡＳＯ－ＭＯＥのデオキシリボヌクレオチド配列
表１．本ＡＳＯのデオキシリボヌクレオチド配列
【表1】
表２．ＡＳＯ－ＬＮＡ又はＡＳＯ－ＭＯＥのデオキシリボヌクレオチド配列
【表2】
【0047】
したがって、本発明のさらなる態様は、老化、関節炎（例えば、関節リウマチ）、癌、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、神経変性疾患、肺線維症、腎線維症、心筋線維症、肝線維症、アテローム性動脈硬化症、白斑及びウイルス感染などのＴＸＮＤＣ５の上方制御に関連する疾患の処置のための医薬品の製造のための、本発明の１本鎖デオキシリボ核酸の使用に関する。本発明の１本鎖ＡＳＯによって処置され得る癌の例は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌及び子宮癌を含むが、これらに限定されない。本発明の１本鎖ＡＳＯによって処置され得る神経変性疾患の例は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びプリオン病を含むが、これらに限定されない。好適な一実施例では、本発明の１本鎖ＡＳＯは、肺線維症、腎線維症、肝線維症又は心筋線維症の処置のための医薬品の製造のためのものである。
【0048】
したがって、ＴＸＮＤＣ５の上方制御を通じて媒介される疾患の処置又はそれに対する予防のための薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、有効成分として少なくとも１個の本発明の１本鎖デオキシリボ核酸及び薬学的に許容可能な担体を含む。任意選択的に、薬学的組成物は、いくつかの例を挙げると、糖尿病の処置のための抗糖尿病薬、癌の処置のための化学療法剤、関節炎の処置のための非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、線維性肺疾患のためのニンテダニブ又はピルフェニドンなどの抗線維症治療薬などの上記疾患の処置を促進するのに適した他の薬剤をさらに含み得る。
【0049】
本発明の核酸は、水、ＰＢＳ、生理食塩水、油又は脂肪酸などの適切な分散媒体に懸濁され得る。結果として調製された薬学的組成物は、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔に又は膣内に投与され得る。ここで用いられるように、用語「非経口的」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下、肝内、病巣内及び頭蓋内注入又は点滴技術を含む。好適には、組成物は、筋肉内、腹腔内又は静脈内に投与され、最も好適には、組成物は、筋肉内に投与される。一実施例では、本発明の組成物は、被検体の一本の肢（すなわち、腕又は脚）における部位から筋肉内に注入される。注入に適した身体部分は、以下の、放出される核酸の選択、性別、年齢、体重を含む被検体の個人的状態並びに／又は現在及び以前の病状などに基づいて選択される。熟練した医師であれば、過度な実験無しに、注入に適した身体部分を決定し得る。本発明の組成物の滅菌注入可能な形態は、水性又は油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、当技術分野で周知の技術により処方され得る。滅菌注入可能な調製物はまた、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注入可能な溶液又は懸濁液であり得る。採用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル液、リン酸緩衝液及び等張塩化ナトリウム溶液（すなわち、生理食塩水）がある。さらに、滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として慣例的に採用される。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含む、任意の凡庸（ｂｌａｎｄ）な固定油が採用され得る。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油などの天然の薬学的に許容可能な油と同様に、特にそのポリオキシエチル化されたものにおける注入剤の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液はまた、乳濁液及び懸濁液を含む薬学的に許容可能な剤形の処方に一般的に用いられるカルボキシメチルセルロース又は同様の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤又は分散体を含み得る。Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓなどの他の一般的に用いられる界面活性剤及び薬学的に許容可能な固体、液体若しくは他の剤形の製造において一般的に用いられる他の乳化剤又は生物学的利用能増強物質も、処方の目的で用いられ得る。必要とされる用法は、投与経路の選択、処方の性質、被検体の疾患の性質、被検体の体重、体表面積、年齢及び性別、他の投与される薬剤並びに主治医の判断に依存する。適切な用法は、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４及び１．５ｍｇの核酸／Ｋｇ体重などの０．１５ｍｇ～１．５ｍｇの核酸／Ｋｇ体重であり、好ましくは０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１及び１．２ｍｇの核酸／Ｋｇ体重などの０．３ｍｇ～１．２ｍｇの核酸／Ｋｇ体重であり、より好ましくは０．５、０．６、０．７、０．８、０．９及び１．０ｍｇの核酸／Ｋｇ体重などの０．５ｍｇ～１．０ｍｇの核酸／Ｋｇ体重である。種々の投与経路の異なる効率の観点から、必要とされる用法の変動が予想される。当業者は、関連因子を容易に評価し、この情報に基づいて意図する目的のために用いる用法を決定し得る。
【0050】
本発明はまた、ＴＸＮＤＣ５の上方制御を示す被検体を処置する方法を特徴とし、上記方法は、本発明の１本鎖デオキシリボ核酸又は本発明の組成物をそれを必要とする被検体に投与するステップを備え、追加的な医薬品（例えば、癌の処置のための化学療法剤）を被検体に投与するステップをさらに備える。ここでの被検体は、ヒト及び非ヒト動物をいう。好適な実施例では、被検体はヒトである。一実施例では、被検体は、肺線維症と診断されている。他の実施例では、被検体は、癌と診断されている。さらに他の実施例では、被検体は、関節リウマチと診断されている。被検体は、本発明の方法及び／又は組成物を受ける前に、医療処置を受けていてもよい。癌の場合、医療処置は、腫瘍を有する患者に一般的に適用される外科手術、化学療法又は放射線療法をいい、したがって、遺伝子治療の抗腫瘍効果を増補するために、癌と予め診断された被検体は、本発明の方法及び／又は組成物を受ける前に、それと同時又はその後に、他の抗腫瘍療法も受け得る。一実施例では、被検体は肺線維症を有し、本発明の方法及び／又は組成物を受ける前にピルフェニドン又はニンテダニブで処置されている。
【0051】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明し、本発明の実施の際に当業者を補助するように提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとして決してみなされるべきではない。
【実施例】
【0052】
材料及び方法
細胞培養
初代成体ヒト肺線維芽細胞（ＨＰＦ－ａ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社、米国、カリフォルニア州）を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％の線維芽細胞増殖補助物（ＦＧＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補足した線維芽細胞培地で培養し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を含む加湿環境中で３７℃で維持した。
細胞培養
初代成体ヒト肺線維芽細胞（ＨＰＦ－ａ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社、米国、カリフォルニア州）を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％の線維芽細胞増殖補助物（ＦＧＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補足した線維芽細胞培地で培養し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を含む加湿環境中で３７℃で維持した。
【0053】
本ＡＳＯの生成
ヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡを、本ＡＳＯの調製のための標的配列として用いた。具体的には、本開示のＡＳＯを、それぞれ３３７～３５６位、６７０～６８９位、６７５～６９４位、８６２～８８１位、８７９～８９８位、１００３～１０２２位、１００７～１０２６位、１２７８～１２９７位、２８６４～２８８３位、２８６５～２８８４位、２８６８～２８８７位及び２８７３～２８９２位での標的配列を用いて調製した。
ヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡを、本ＡＳＯの調製のための標的配列として用いた。具体的には、本開示のＡＳＯを、それぞれ３３７～３５６位、６７０～６８９位、６７５～６９４位、８６２～８８１位、８７９～８９８位、１００３～１０２２位、１００７～１０２６位、１２７８～１２９７位、２８６４～２８８３位、２８６５～２８８４位、２８６８～２８８７位及び２８７３～２８９２位での標的配列を用いて調製した。
【0054】
本開示のＡＳＯのすべてを、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃから取得し、又はＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１０Ｐｌｕｓ合成機を用いることによって合成した。ＡＳＯを、逆相ＨＰＬＣ又はＩＥＸＨＰＬＣによって精製した。ＡＳＯの純度をＵＰＬＣによって分析した。ＡＳＯの特性評価は、ＭＯＬＤＩ－ＴＯＦ又はＬＣ－ＨＲＭＳによって分析された。
【0055】
さらに、ＡＳＯをロックド核酸（ＬＮＡ）分子（以下、「ＡＳＯ－ＬＮＡ」）又は２’－Ｏ－メトキシエチル糖（以下、「ＡＳＯ－ＭＯＥ」）修飾を含む修飾ＡＳＯの調製のために独立して用いた。各修飾ＡＳＯを、装置マニュアル中に記載された手順に従うＭＯＳＳ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ装置プラットフォームにおいて１ｎｍｏｌのスケールで合成した。
【0056】
ＨＰＦ－ａ細胞を本ＡＳＯでトランスフェクションするステップ
ＨＰＦ－ａ細胞を、１×１０５個／ウェルの密度で６ウェルプレート中で維持及び培養し、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ社、米国）を活用して上記の本ＡＳＯでトランスフェクションした。具体的には、本ＡＳＯ含んだプラスミド及びＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２を、無血清のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）中で混合し、１ｍＬの培地あたり０．４～６０ｎＭのＡＳＯ及び３．３μＬのＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２の最終濃度でＨＰＦ－ａ細胞培養培地に添加し、さらに２４時間インキュベーションした。細胞中のヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ ＡＳＯのトランスフェクションを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析によるＲＮＡレベル又は免疫ブロットアッセイによるタンパク質レベルのいずれかの、ヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ遺伝子発現の検出によって確認した。
ＨＰＦ－ａ細胞を、１×１０５個／ウェルの密度で６ウェルプレート中で維持及び培養し、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ社、米国）を活用して上記の本ＡＳＯでトランスフェクションした。具体的には、本ＡＳＯ含んだプラスミド及びＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２を、無血清のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）中で混合し、１ｍＬの培地あたり０．４～６０ｎＭのＡＳＯ及び３．３μＬのＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２の最終濃度でＨＰＦ－ａ細胞培養培地に添加し、さらに２４時間インキュベーションした。細胞中のヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ ＡＳＯのトランスフェクションを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析によるＲＮＡレベル又は免疫ブロットアッセイによるタンパク質レベルのいずれかの、ヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ遺伝子発現の検出によって確認した。
【0057】
定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
上記の本ＡＳＯでトランスフェクションした細胞のトータルＲＮＡを、製造業者の指示（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキットを用いて単離した。１００ｎｇの量のＤＮａｓｅ処置トータルＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイプローブセット（ｈＴＸＮＤＣ５：Ｈｓ０１０４６７１０＿ｍ１（ＦＡＭ）；ｈＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１（ＶＩＣ））を含む４×ＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ１－ｓｔｅｐ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を有する２０μＬの反応物におけるファーストストランドＤＮＡ合成のための鋳型として使用し、ファーストストランドＤＮＡ合成を、以下の、５０℃で５分間、９５℃で２０秒間、９５℃で１５秒間に続けて６０℃で１分間のサイクルを４０回繰り返すプログラムを実行するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００Ｆａｓｔ装置において行った。各個々の転写産物の発現レベルを、コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、コントロールサンプルの平均発現値に対して表した。
上記の本ＡＳＯでトランスフェクションした細胞のトータルＲＮＡを、製造業者の指示（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキットを用いて単離した。１００ｎｇの量のＤＮａｓｅ処置トータルＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイプローブセット（ｈＴＸＮＤＣ５：Ｈｓ０１０４６７１０＿ｍ１（ＦＡＭ）；ｈＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１（ＶＩＣ））を含む４×ＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ１－ｓｔｅｐ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を有する２０μＬの反応物におけるファーストストランドＤＮＡ合成のための鋳型として使用し、ファーストストランドＤＮＡ合成を、以下の、５０℃で５分間、９５℃で２０秒間、９５℃で１５秒間に続けて６０℃で１分間のサイクルを４０回繰り返すプログラムを実行するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００Ｆａｓｔ装置において行った。各個々の転写産物の発現レベルを、コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、コントロールサンプルの平均発現値に対して表した。
【0058】
免疫ブロットアッセイ
ＨＰＦ－ａ細胞の２４時間のトランスフェクション後、細胞を無血清培地に交換し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社、米国）で４８時間処置した。ＨＰＦ－ａ細胞を２×サンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）を用いてホモジナイズし、続けて９５℃で１０分間煮沸した。タンパク質サンプルを１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて分画し、ＰＶＤＦ膜に移行させ、そしてブロッキング緩衝液（Ｖｉｓｕａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ社、台湾、ＢＰ０１－１Ｌ）によってブロッキングした。膜を、ＣＯＬ１Ａ１（１：５００、ＯｒｉＧｅｎｅ社、米国、ＴＡ３０９０９６、ヒト種用）、フィブロネクチン（１：２０００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国、６１００７７）、ＴＸＮＤＣ５（１：１５０００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社、米国、１９８３４－１－ＡＰ）、αＳＭＡ（１：１０００、Ａｂｃａｍ社、英国、ａｂ５６９４）、β－アクチン（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ドイツ、ＭＡＢ１５０１）に対する１次抗体とともに４℃で一晩インキュベーションした。ブロットを、ＨＲＰ標識抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ２次抗体（１：５０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、７０７６、７０７４）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ又はＦｅｍｔｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、３４０８０、３４０９４）を用いて現像した。タンパク質バンドの検出を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）を用いて行った。タンパク質バンド強度定量化分析を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアバージョン５．２．１を用いて行った。
ＨＰＦ－ａ細胞の２４時間のトランスフェクション後、細胞を無血清培地に交換し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社、米国）で４８時間処置した。ＨＰＦ－ａ細胞を２×サンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）を用いてホモジナイズし、続けて９５℃で１０分間煮沸した。タンパク質サンプルを１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて分画し、ＰＶＤＦ膜に移行させ、そしてブロッキング緩衝液（Ｖｉｓｕａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ社、台湾、ＢＰ０１－１Ｌ）によってブロッキングした。膜を、ＣＯＬ１Ａ１（１：５００、ＯｒｉＧｅｎｅ社、米国、ＴＡ３０９０９６、ヒト種用）、フィブロネクチン（１：２０００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国、６１００７７）、ＴＸＮＤＣ５（１：１５０００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社、米国、１９８３４－１－ＡＰ）、αＳＭＡ（１：１０００、Ａｂｃａｍ社、英国、ａｂ５６９４）、β－アクチン（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ドイツ、ＭＡＢ１５０１）に対する１次抗体とともに４℃で一晩インキュベーションした。ブロットを、ＨＲＰ標識抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ２次抗体（１：５０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、７０７６、７０７４）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ又はＦｅｍｔｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、３４０８０、３４０９４）を用いて現像した。タンパク質バンドの検出を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）を用いて行った。タンパク質バンド強度定量化分析を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアバージョン５．２．１を用いて行った。
【0059】
ブレオマイシン誘導性肺線維症動物モデル
８～９週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを購入後１週間検疫した。マウスを、各ケージに５匹で一定の温度及び湿度での個別的換気ケージシステム中で飼育した。部屋を１２時間の明／１２時間の暗サイクル（０７：００の点灯、１９：００の消灯）として、室温を５５±１０％の湿度で２２±２℃とした。動物には、げっ歯類のペレット餌及び水を自由に摂取させた。動物実験をＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓにおける倫理規則に従って行った。
８～９週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを購入後１週間検疫した。マウスを、各ケージに５匹で一定の温度及び湿度での個別的換気ケージシステム中で飼育した。部屋を１２時間の明／１２時間の暗サイクル（０７：００の点灯、１９：００の消灯）として、室温を５５±１０％の湿度で２２±２℃とした。動物には、げっ歯類のペレット餌及び水を自由に摂取させた。動物実験をＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓにおける倫理規則に従って行った。
【0060】
肺線維症を誘導するために、マウスに（滅菌生理食塩水に溶解した）ブレオマイシンを３Ｕ／Ｋｇ体重の用量で気管内注入した。偽薬群のマウスには、同じ容積の滅菌生理食塩水のみを注入した。ブレオマイシン誘導の７日後、マウスを無作為に５個の群に分割し、ビヒクル溶液、ニンテダニブ、配列番号７３（すなわち、ＤＣＢ１１１１１２８２３５）、配列番号１４（すなわち、ＤＣＢ１１１１１２８２７９）又は配列番号８２（すなわち、ＤＣＢ１１１１１２８２８１）の本修飾ＡＳＯを同じ試験日に投与した。各群を６匹のマウスから構成した。ニンテダニブを、最終容積の１０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含むＰＢＳに、６ｍｇ／ｍＬの最終濃度に溶解し、６０ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ）で強制経口投与（ＰＯ）によって１日に１回（ＱＤ）で１４日間投与した。本修飾ＡＳＯ（すなわち、ＤＣＢ１１１１１２８２３５、ＤＣＢ１１１１１２８２７９又はＤＣＢ１１１１１２８２８１）の各々を、ＴｒｕｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州）に溶解し、０．２ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ）で気管内点滴によって１週間に２回（ＢＩＷ）で２週間投与した。ビヒクル群中のマウスには、同一容積のＴｒｕｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬のみを注入し、これらをコントロール群とした。試験を疾患誘導後２１日目に終了し、肺機能を特定し、肺組織を採取し、分析まで適切に保存した。
【0061】
肺機能試験
肺機能を、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔシステム（Ｓｃｉｒｅｑ社、カナダ、ケベック州、モントリオール）を用いて評価した。マウスを気管切開し、１５０回／分の呼吸数、１０ｍｌ／ｋｇの換気容積及び２～３ｃｍのＨ２Ｏの呼気終末陽圧で換気した。深部膨張摂動を、吸気容量を推定するのに用いた。圧力－容積ループを、一定の増加圧力に続いて定期的な減少圧力によって生成した。空気抵抗、コンプライアンス及びエラスタンスを含む他の肺機能パラメータを、ＳｎａｐＳｈｏｔ－１５０を用いて測定した。なお、コンプライアンスは肺の伸縮する能力を反映する因子であり、空気抵抗は肺の気道を通る気体の単位流量を生成するのに必要な肺内圧力の変化を反映し、口と肺の肺胞の間の圧力差を空気流量で除したものである因子であり、エラスタンスは肺を膨らませるのに必要な圧力を反映する因子である。
肺機能を、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔシステム（Ｓｃｉｒｅｑ社、カナダ、ケベック州、モントリオール）を用いて評価した。マウスを気管切開し、１５０回／分の呼吸数、１０ｍｌ／ｋｇの換気容積及び２～３ｃｍのＨ２Ｏの呼気終末陽圧で換気した。深部膨張摂動を、吸気容量を推定するのに用いた。圧力－容積ループを、一定の増加圧力に続いて定期的な減少圧力によって生成した。空気抵抗、コンプライアンス及びエラスタンスを含む他の肺機能パラメータを、ＳｎａｐＳｈｏｔ－１５０を用いて測定した。なお、コンプライアンスは肺の伸縮する能力を反映する因子であり、空気抵抗は肺の気道を通る気体の単位流量を生成するのに必要な肺内圧力の変化を反映し、口と肺の肺胞の間の圧力差を空気流量で除したものである因子であり、エラスタンスは肺を膨らませるのに必要な圧力を反映する因子である。
【0062】
病理学的評価
マウスの左肺を緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。切片（５μｍ）をヘマトキシリン・エオシン染色又はピクロシリウスレッド（Ａｂｃａｍ社、英国、ケンブリッジ州）で染色した。ピクロシリウスレッド染色による線維化領域の測定を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。
マウスの左肺を緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。切片（５μｍ）をヘマトキシリン・エオシン染色又はピクロシリウスレッド（Ａｂｃａｍ社、英国、ケンブリッジ州）で染色した。ピクロシリウスレッド染色による線維化領域の測定を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。
【0063】
実施例１ 本ＡＳＯによるＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写の阻害
ＨＰＦ－ａ細胞を、指定されたＡＳＯで処置し、そして、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの発現を「材料及び方法」の章に記載された手順に従ってｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果を表３にまとめ、３０ｎＭで５０％を超える指定されたＡＳＯのＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ発現阻害活性を以下のように格付けする：＋＋＋は５０％未満のＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡレベルであり、＋＋は７０％～５０％のＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡレベルである。
表３．本ＡＳＯを介したヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
ＨＰＦ－ａ細胞を、指定されたＡＳＯで処置し、そして、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの発現を「材料及び方法」の章に記載された手順に従ってｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果を表３にまとめ、３０ｎＭで５０％を超える指定されたＡＳＯのＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ発現阻害活性を以下のように格付けする：＋＋＋は５０％未満のＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡレベルであり、＋＋は７０％～５０％のＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡレベルである。
表３．本ＡＳＯを介したヒトＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
【表3】
【0064】
表３にまとめたデータによると、処置後、「材料及び方法」に記載された手順に従って調製されたすべてのＡＳＯのうち、表３に列挙されたように、それらのうちの２６個は５０％を超えるＴＸＮＤＣ５発現を抑制することにおいて有効であり、それらのうちの４１個は７０％～５０％であるＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡレベルでＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写を中程度に抑制した。残りのＡＳＯ（すなわち、表３に列挙された６９個のＡＳＯ以外のＡＳＯ）は、処置後、７０％より大きく維持されたＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡレベルでＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写を軽度にしか抑制できなかった（データ不図示）。
【0065】
実施例２ 本修飾ＡＳＯによるＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ及びＴＧＦ－β誘導性線維症関連タンパク質の阻害
本実施例では、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖（すなわち、ＡＳＯ－ＭＯＥ）又はＬＮＡ分子（すなわち、ＡＳＯ－ＬＮＡ）を有するＡＳＯは、表１のＡＳＯに「材料及び方法」の章に記載された手順に従って由来し、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写発現レベル及び形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）誘導性線維症関連タンパク質に対するそれらのそれぞれの効果を調べた。結果を表４及び図１にまとめる。
本実施例では、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖（すなわち、ＡＳＯ－ＭＯＥ）又はＬＮＡ分子（すなわち、ＡＳＯ－ＬＮＡ）を有するＡＳＯは、表１のＡＳＯに「材料及び方法」の章に記載された手順に従って由来し、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写発現レベル及び形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）誘導性線維症関連タンパク質に対するそれらのそれぞれの効果を調べた。結果を表４及び図１にまとめる。
【0066】
表４のデータが示すように、すべてのＡＳＯ－ＭＯＥは６０ｎＭ以下のＩＣ５０でＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写を順調に抑制可能であり、ＤＣＢ１１１１１１２２３８（配列番号７５）、ＤＣＢ１１１１１１２２４０（配列番号７６）及びＤＣＢ１１１１１１２２７７（配列番号７９）は１０ｎＭ未満のＩＣ５０で最も強い阻害効果を示した。ＡＳＯ－ＬＮＡに関しては、ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの転写を抑制することにおいて、ＡＳＯ－ＬＮＡのＩＣ５０がＡＳＯ－ＭＯＥのものよりも小さかったように（配列番号３（すなわちＤＣＢ１１１１１２８００３）及び配列番号４（すなわちＤＣＢ１１１１１２８００４）について、それぞれ＋＋＋対＋＋）、一般に、対応するＡＳＯ－ＭＯＥよりも強力であった。
表４．本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡによるＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ発現阻害活性のＩＣ５０は、＋＋＋を１０ｎＭ以下のＩＣ５０、＋＋を１０ｎＭ～２０ｎＭのＩＣ５０レベル、＋を２０ｎＭ～６０ｎＭのＩＣ５０レベルとして格付けされる
表４．本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はＡＳＯ－ＬＮＡによるＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
【表4】
ＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡ発現阻害活性のＩＣ５０は、＋＋＋を１０ｎＭ以下のＩＣ５０、＋＋を１０ｎＭ～２０ｎＭのＩＣ５０レベル、＋を２０ｎＭ～６０ｎＭのＩＣ５０レベルとして格付けされる
【0067】
ＴＧＦ－βは、線維症関連タンパク質の発現を誘導することが知られており、したがって、ＡＳＯ－ＭＯＥの存在下又は非存在下での、ＴＸＮＤＣ５並びにフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン及びα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）を含む線維症関連タンパク質の発現を、免疫ブロット分析によってそれぞれ測定した。結果を図１に示す。
【0068】
ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）がフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン及びα－ＳＭＡを含む線維症関連タンパク質の発現を増強することになり、この増強されたタンパク質発現がＤＣＢ１１１１１１２８２３５（図１Ａ）、ＤＣＢ１１１１１１２８２５５（図１Ｂ）、ＤＣＢ１１１１１２８２５２（図１Ｃ）、ＤＣＢ１１１１１２８２６６（図１Ｄ）、ＤＣＢ１１１１１２８２６５（図１Ｅ）、ＤＣＢ１１１１１２８２３８（図１Ｆ）、ＤＣＢ１１１１１２８２７９（図１Ｇ）、ＤＣＢ１１１１１２８２８０（図１Ｈ）、及びＤＣＢ１１１１１２８２８１（図１Ｉ）を含む本ＡＳＯ－ＭＯＥによって用量依存的に有意に抑制されたことは図１Ａ～図１Ｉのデータから明らかである。
【0069】
実施例３ 本ＡＳＯ－ＭＯＥは、肺線維症の進行を減少させた
本ＡＳＯのｉｎ ｖｉｖｏの機能を特定するために、「材料及び方法」の章に記載された手順に従って、ブレオマイシン（ＢＬＭ、３Ｕ／Ｋｇ体重）の気管内点滴によって肺線維症を誘導した。そして、線維症マウスを無作為に５個の群（６匹／群）に分割し、ビヒクル群中の動物にはＰＢＳ（気管内、２週間）を注入し、ＡＳＯ群中の動物には本ＡＳＯ－ＭＯＥ（配列番号７３又は１４）又はスクランブルＡＳＯ（配列番号８２）（すべて気管内投与経路による、０．２ｍｇ／Ｋｇ）を７、１０、１４及び１７日目に注入し、一方で、ニンテダニブ群中の動物にはニンテダニブの用量（６０ｍｇ／Ｋｇ、１４日間）を毎日注入した。また、偽薬群中の健常動物（すなわち、非線維症マウス）は処置を受けなかった。コンプライアンス（肺の伸縮する能力を反映する因子）、空気抵抗（肺の気道を通る気体の単位流量を生成するのに必要な肺内圧力の変化を反映し、口と肺の肺胞の間の圧力差を空気流量で除したものである因子）及びエラスタンス（肺を膨らませるのに必要な圧力を反映する因子）を含む指定された日における種々の因子を特定するために、肺機能をＦｌｅｘｉＶｅｎｔシステムを用いて評価し、動物を２１日目に屠殺して線維化領域の特定のための肺サンプルを採取した。結果を図２、図３及び図４に示す。
本ＡＳＯのｉｎ ｖｉｖｏの機能を特定するために、「材料及び方法」の章に記載された手順に従って、ブレオマイシン（ＢＬＭ、３Ｕ／Ｋｇ体重）の気管内点滴によって肺線維症を誘導した。そして、線維症マウスを無作為に５個の群（６匹／群）に分割し、ビヒクル群中の動物にはＰＢＳ（気管内、２週間）を注入し、ＡＳＯ群中の動物には本ＡＳＯ－ＭＯＥ（配列番号７３又は１４）又はスクランブルＡＳＯ（配列番号８２）（すべて気管内投与経路による、０．２ｍｇ／Ｋｇ）を７、１０、１４及び１７日目に注入し、一方で、ニンテダニブ群中の動物にはニンテダニブの用量（６０ｍｇ／Ｋｇ、１４日間）を毎日注入した。また、偽薬群中の健常動物（すなわち、非線維症マウス）は処置を受けなかった。コンプライアンス（肺の伸縮する能力を反映する因子）、空気抵抗（肺の気道を通る気体の単位流量を生成するのに必要な肺内圧力の変化を反映し、口と肺の肺胞の間の圧力差を空気流量で除したものである因子）及びエラスタンス（肺を膨らませるのに必要な圧力を反映する因子）を含む指定された日における種々の因子を特定するために、肺機能をＦｌｅｘｉＶｅｎｔシステムを用いて評価し、動物を２１日目に屠殺して線維化領域の特定のための肺サンプルを採取した。結果を図２、図３及び図４に示す。
【0070】
本ＡＳＯ－ＭＯＥ又はニンテダニブで処置有り又は無しでのコンプライアンス、抵抗及びエラスタンスの変化を示す棒グラフである図２を参照する。データは、動物を本開示のＡＳＯ－ＭＯＥで処置した場合、コンプライアンスがビヒクルコントロールのものと比較してはるかに高く（図２Ａ）、抵抗及びエラスタンスが独立してビヒクルコントロールのものと比較してはるかに小さかったことを明らかに示す（図２Ｂ及び２Ｃ）。さらに、圧力－容積ループにおけるＡＳＯ－ＭＯＥ（配列番号７３又は１４）の効果は、ニンテダニブ（６０ｍｇ／Ｋｇ）のものよりも有効であった（図３）。これらのデータは、本ＡＳＯ－ＭＯＥ（配列番号７３又は１４）で処置した線維症マウスがビヒクルコントロール群及びスクランブルＡＳＯ群（ＤＣＢ１１１１１２８２８１、すなわち配列番号８２）のものと比較して（コンプライアンス、抵抗、エラスタンス及び圧力－容積ループを含む）肺機能の改善を示すことを示した。
【0071】
肺組織中のＢＬＭ誘導性線維化領域を低減させることにおける本ＡＳＯ－ＭＯＥの効果に関して、配列番号７３（ＤＣＢ１１１１１２８２３５）の本ＡＳＯ－ＭＯＥがＢＬＭ誘導性線維化領域を低減可能であり、その効果はニンテダニブのものよりも強力であることが分かった（図４）。
【0072】
まとめると、本発明における知見は、老化、関節炎、癌、糖尿病、神経変性疾患、肺線維症、白斑及びウイルス感染などのＴＸＮＤＣ５の調節不全からもたらされる疾患及び／又は障害が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＴＸＮＤＣ５ ｍＲＮＡの発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、そのような処置を必要とする被検体（例えば、ヒト患者）に導入することによって処置され得るという提案を支持する。
【0073】
実施形態の上記説明は例示としてのみ与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述したが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ＴＸＮＤＣ５）ｍＲＮＡの翻訳を阻害する１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、前記１本鎖ＡＳＯは、約１６～２１ヌクレオチド長であり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれか一つであるデオキシリボヌクレオチド配列を備え、前記配列番号１４の前記１本鎖ＡＳＯは６個のロックド核酸(ＬＮＡ)分子を備える、１本鎖ＡＳＯ。
【請求項2】
前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３の前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個のＬＮＡ分子又は２’－糖修飾を備える請求項１に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項3】
少なくとも１個の２’－フルオロ糖、２’－Ｏ－メチル糖又は２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項4】
前記配列番号１３の前記１本鎖ＡＳＯが、６個のＬＮＡ分子を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項5】
前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の前記１本鎖ＡＳＯが、１０個の２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える請求項２に記載の１本鎖ＡＳＯ。
【請求項6】
チオレドキシンドメイン含有タンパク質５（ＴＸＮＤＣ５）の上方制御を通じて媒介される被検体における疾患を処置する医薬品の製造のための１本鎖ＡＳＯの使用であって、前記１本鎖ＡＳＯは、約１６～２１ヌクレオチド長であり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のいずれか一つであるデオキシリボヌクレオチド配列を備え、前記配列番号１４の前記１本鎖ＡＳＯは６個のロックド核酸(ＬＮＡ)分子を備える使用。
【請求項7】
前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３の前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個のＬＮＡ分子又は２’－糖修飾を備える、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記１本鎖ＡＳＯは、少なくとも１個の２’－フルオロ糖、２’－Ｏ－メチル糖又は２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える、請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記配列番号１３の前記１本鎖ＡＳＯは、６個のＬＮＡ分子を備える、請求項７に記載の使用。
【請求項10】
前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の前記１本鎖ＡＳＯは、１０個の２’－Ｏ－メトキシエチル糖を備える、請求項８に記載の使用。
【請求項11】
前記疾患は、老化、関節炎、癌、糖尿病、神経変性疾患、線維症、アテローム性動脈硬化症、白斑及びウイルス感染からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項12】
前記癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌及び子宮癌からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びプリオン病からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項14】
前記線維症は、肺線維症、腎線維症、肝線維症及び心筋線維症からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【国際調査報告】