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特表2025-501303ハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群の新規アッセイ及び新規治療方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】ハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群の新規アッセイ及び新規治療方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20250109BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539898
(86)(22)【出願日】2022-12-29
(85)【翻訳文提出日】2024-08-26
(86)【国際出願番号】 IB2022062870
(87)【国際公開番号】W WO2023126868
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】63/294,418
(32)【優先日】2021-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524246377
【氏名又は名称】ザ プロジェリア リサーチ ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】ゴードン，レスリー ビー．
(72)【発明者】
【氏名】ハムレン，サラ
(72)【発明者】
【氏名】グッドソン，ロバート
(57)【要約】
本明細書には、プロジェリンを高感度で検出できるが、野生型ラミンＡを検出しない、新たに開発されたイムノアッセイが記載されている。また、新たに開発されたイムノアッセイの、プロジェリアの診断、予後、及び治療のための新規方法への適用についても記載される。
【選択図】図７
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被検体におけるハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ－Ｇｉｌｆｏｒｄ ｐｒｏｇｅｒｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＨＧＰＳ）の予後のための方法であって：被検体からの試料を提供すること；
定量的イムノアッセイにより試料中のプロジェリン濃度を定量することであり、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質を検出しないこと；及び
試料中のプロジェリン濃度をＨＧＰＳ陽性コントロールと比較することであり、ここで試料中のプロジェリン濃度がＨＧＰＳ陽性コントロールのプロジェリン濃度未満であることは、被検体の平均余命の延長を示すこと、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記試料は、血漿、血清、尿、及び唾液から選択される液体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
定量的イムノアッセイは：試料を、野生型ラミンＡとプロジェリンとの両方に結合する捕捉抗体と接触させて、捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を得ること；
捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を試料から分離すること；
捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を、検出可能な標識を含むプロジェリン特異的検出抗体と接触させ、それにより検出抗体と捕捉されたプロジェリンを結合させるが、捕捉されたラミンＡを結合させないこと；
捕捉されたラミンＡとの混合物から検出可能な標識を分離すること；及び
検出可能な標識を検出し、かつそれにより試料中のプロジェリンの量を定量すること、
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
コントロールは、より早い時点にて同一の被検体から得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
被検体はＨＧＰＳの治療を受けた後、前記方法を１回以上繰り返すことをさらに含み、ここで治療後のプロジェリン濃度の減少が平均余命の延長を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
治療後のプロジェリン濃度の減少は３５～６２％である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
プロジェリン濃度の減少が大きいほどより長い平均余命の延長を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
ハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の治療の有効性を決定するための方法であって：ＨＧＰＳの治療薬の投与前に採取される、被検体からの治療前試料を提供すること；
定量的イムノアッセイにより治療前試料中のプロジェリン濃度を決定することであり、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質を検出しないこと；
ＨＧＰＳの治療薬の投与中又は投与後に採取される被検体からの治療後試料を提供すること；
定量的イムノアッセイにより治療後試料中のプロジェリン濃度を決定すること；及び
治療前のプロジェリン濃度と治療後のプロジェリン濃度とを比較することであり、ここで治療後の試料のプロジェリン濃度の有意な減少は、治療が有効であることを示すこと、
を含む、前記方法。
【請求項11】
治療前試料及び治療後試料は、血漿、血清、尿、及び唾液から選択される液体試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
最初の治療後試料の後の時点で被検体から採取される１つ又は複数の追加の治療後試料を提供することをさらに含み、ここでプロジェリン濃度の継続的な減少又はさらなる減少は、治療の有効性の継続を示す、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
定量的イムノアッセイは：試料を、野生型ラミンＡとプロジェリンとの両方に結合する捕捉抗体と接触させて、捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を得ること；
捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を試料から分離すること；
捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を、検出可能な標識を含むプロジェリン特異的検出抗体と接触させ、それにより検出抗体と捕捉されたプロジェリンを結合させるが、捕捉されたラミンＡを結合させないこと；
捕捉されたラミンＡとの混合物から検出可能な標識を分離すること；
検出可能な標識を検出し、かつそれにより試料中のプロジェリンの量を定量すること、
を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
治療はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤はロナファルニブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
被検体におけるハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の治療のための方法であって：被検体からの試料を提供すること；
定量的イムノアッセイにより試料中のプロジェリン濃度を定量することであり、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質を検出しないこと；
試料中のプロジェリン濃度をＨＧＰＳ陽性コントロールと比較することであり、ここで試料中のプロジェリン濃度は、被検体がＨＧＰＳを有することを示すこと；及び
被検体がＨＧＰＳを有する場合、被検体にプロジェリン濃度を低下させるＨＧＰＳのための治療薬を投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項19】
定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ＨＧＰＳの治療は、被検体にファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤はロナファルニブである、請求項２１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２９４，４１８号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２９４，４１８号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本開示は、プロジェリンを高感度で検出できるが、野生型ラミンＡを検出しない、新たに開発されたイムノアッセイ、及びプロジェリアの診断、予後、及び治療のための新規方法に関する。
本開示は、プロジェリンを高感度で検出できるが、野生型ラミンＡを検出しない、新たに開発されたイムノアッセイ、及びプロジェリアの診断、予後、及び治療のための新規方法に関する。
【0003】
政府の支援の承認
本発明は、米国食品医薬品局から授与された助成金番号１Ｕ０１ＦＤ００６８８６－０１による政府支援の一部を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、米国食品医薬品局から授与された助成金番号１Ｕ０１ＦＤ００６８８６－０１による政府支援の一部を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
ハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ－Ｇｉｌｆｏｒｄ ｐｒｏｇｅｒｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＨＧＰＳ）は、超希少であり（有病率１８００万～２０００万人に１人）、一様に致死的である早老症である。性別、民族、地域に偏りはない。罹患率には、発育不全、全身性脂肪異栄養症、脱毛症、骨形成不全、及び進行性動脈硬化症などが挙げられ、平均１４．６歳で主に心不全により死亡する。
【0005】
ＨＧＰＳは、プロジェリンと呼ばれる核膜タンパク質ラミンＡの有毒なスプライスバリアントを産生するＬＭＮＡの変異によって引き起こされる散発性常染色体優性疾患である（Ｄｅ Ｓａｎｄｒｅ－Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら；Ｅｒｉｋｓｓｏｎら）。症例の９０％はｃ．１８２４Ｃ＞Ｔの点変異によって引き起こされる古典的ＨＧＰＳであり、残りの１０％はイントロン１１のスプライセオソーム認識配列内の一塩基変異によって引き起こされる非古典的ＨＧＰＳである（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１８；Ｇｏｒｄｏｎら、２０１４）。プロジェリンタンパク質はドミナントネガティブ様式で作用する；これはプロジェリンが存在し、かつ正常なラミンＡ量の相対的な低下がないことであり、これにより疾患が生じるのである（Ｓｃａｆｆｉｄｉら）。これを裏付けるように、ラミンＡを欠損したマウスは正常な表現型を示す（Ｆｏｎｇら）。プロジェリンの用量の影響は、ヘテロ接合型プロジェリン発現マウスとホモ接合型プロジェリン発現マウスにおける段階的な疾患の重症度及び寿命の短縮、並びにプロジェリン標的治療を受けたＨＧＰＳマウスにおける寿命の延長を示すマウス研究によって裏付けられる（Ｂｅｎｅｄｉｃｔｏら、Ｃａｂｒａｌら）。症例報告では、軽度と重度の早老症罹患患者の線維芽細胞培養で発現したプロジェリンの量がそれぞれ低い、及び高いことが報告されている（Ｂａｒら；Ｈｉｓａｍａら）。
【0006】
ラミンＡとは異なり、プロジェリンは亜鉛メタロプロテアーゼの切断部位を欠くため、持続的にファルネシル化されたままであり、核内ラミナの一部として長期的に取り込まれ、そこに蓄積して細胞障害を引き起こす。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、マウスモデル、及びヒトを対象とした研究では、ファルネシル化を阻害することにより、ＨＧＰＳの表現型が遅延及び／又は逆転することが証明されている。ＨＧＰＳの小児を対象とした臨床試験では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＦＴＩ）であるロナファルニブによる治療により、心血管、骨、聴覚、及び体重の改善がみられ（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１２）、平均で推定２．５年の生存期間延長に関連することが実証された。これらのエビデンスを総合して、ロナファルニブは初めてＦＤＡに承認されたＨＧＰＳの治療用薬物となった。
【0007】
現在のところ、ＨＧＰＳの検証済みバイオマーカーは存在しない。プロジェリンは病気の原因となるタンパク質であるため、最適なバイオマーカー候補である。プロジェリンタンパク質は、ヒトの剖検組織及び皮膚生検で免疫蛍光法又はＥＬＩＳＡ法を用いて検出されているが、これらの方法は臨床試験で使用するには感度又は定量性が不十分であり、また、一連の患者試料を得るためには組織検出は実行不可能である。イムノアッセイアプローチの限界が以前から認められていたため、近年、標的質量分析法を用いたイムノ検出の代替法が開発されてきた（Ｃａｍａｆｅｉｔａら）。しかし、その臨床的有用性もまた制限がある可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｂａｒ ＤＺ，ら，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．２０１７；５４：２１２－２１６
【非特許文献2】Ｂｅｎｅｄｉｃｔｏ Ｉら，Ｃｅｌｌｓ．２０２１；１０
【非特許文献3】Ｃａｂｒａｌ ＷＡら，Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．２０２１：ｅ１３４５７
【非特許文献4】Ｃａｍａｆｅｉｔａ Ｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｓｃｉ．２０２２，３，１１７３３
【非特許文献5】Ｄｅ Ｓａｎｄｒｅ－Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉ Ａら，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００６；４４：１９９－２３２
【非特許文献6】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２３：２９３－２９７
【非特許文献7】Ｆｏｎｇ ＬＧら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２００６；１１６：７４３－７５２
【非特許文献8】Ｇｏｒｄｏｎ ＬＢら，ＰＮＡＳ．２０１２；１０９：１６６６６－１６６７１
【非特許文献9】Ｇｏｒｄｏｎ ＬＢら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１３０：２７－３４
【非特許文献10】Ｇｏｒｄｏｎ ＬＢら，ＪＡＭＡ．２０１８；３１９：１６８７－１６９５
【非特許文献11】Ｈｉｓａｍａ ＦＭら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｐａｒｔ Ａ．２０１１；１５５Ａ：３００２－３００６
【非特許文献12】Ｓｃａｆｆｉｄｉ Ｐら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５；１１：４４０－４４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、治療有効性を評価するために、ＨＧＰＳの小児から縦断的に得ることができる生物学的材料から、高感度で特異的な様式でプロジェリンを検出する方法が引き続き必要とされている。現在進行中の研究（オンラインｇｒａｎｔｏｍｅ．ｃｏｍ／ｇｒａｎｔ／ＮＩＨ／Ｕ０１－ＦＤ００６８８６－０１を参照）では、プロジェリンをバイオマーカーとして検証することを目標としているが、プロジェリンの高感度検出が診断又は予後の目的に利用できること、あるいは、所定のＨＧＰＳ治療に対するプロジェリンにおける患者の変化をモニターするのに十分な感度があることは、これまで実証されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【0010】
概要
本明細書に記載されるのは、被検体におけるハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の予後のための方法であり、以下の工程：被検体からの試料を提供する工程；定量的イムノアッセイを用いて試料中のプロジェリン濃度を定量する工程であって、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質を検出しない、前記工程；及び試料中のプロジェリン濃度をＨＧＰＳ陽性コントロールと比較する工程であって、ここで試料中のプロジェリン濃度がＨＧＰＳ陽性コントロール中のプロジェリン濃度未満である場合、被検体における平均余命（ｌｉｆｅ ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ）の延長を示す、前記工程、を含む。
本明細書に記載されるのは、被検体におけるハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の予後のための方法であり、以下の工程：被検体からの試料を提供する工程；定量的イムノアッセイを用いて試料中のプロジェリン濃度を定量する工程であって、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質を検出しない、前記工程；及び試料中のプロジェリン濃度をＨＧＰＳ陽性コントロールと比較する工程であって、ここで試料中のプロジェリン濃度がＨＧＰＳ陽性コントロール中のプロジェリン濃度未満である場合、被検体における平均余命（ｌｉｆｅ ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ）の延長を示す、前記工程、を含む。
【0011】
記載された方法の特定の実施形態では、試料は血漿、血清、尿、及び唾液から選択される液体試料である。
【0012】
他の特定の実施形態では、記載の方法で使用するための定量的イムノアッセイは、以下の工程：野生型ラミンＡ及びプロジェリンの両方に結合する捕捉抗体と試料を接触させて、捕捉されたラミンＡ及び捕捉されたプロジェリンの混合物を得る工程；捕捉されたラミンＡ及び捕捉されたプロジェリンの混合物を試料から分離する工程；捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンの混合物を、検出可能な標識を含むプロジェリン特異的検出抗体と接触させることにより、検出抗体と捕捉されたプロジェリンを結合させるが、捕捉されたラミンＡは結合させない工程；捕捉されたラミンＡとの混合物から検出可能な標識を分離する工程；及び検出可能な標識を検出することにより、試料中のプロジェリンの量を定量する工程、を含む。
【0013】
記載の方法の特定の実施形態では、コントロールは同じ被検体の以前の時点のものである。
【0014】
いくつかの実施形態において、定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである。他の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量範囲は５９ｐｇ／ｍｌ～３０，０００ｐｇ／ｍｌである。
【0015】
特定の実施形態において、記載の方法は、被検体がＨＧＰＳの治療を受けた後に、その方法を１回以上繰り返すさらなる工程を含み、治療後のプロジェリン濃度の減少、さらなる減少、又は維持された減少は、平均余命の延長を示す。
【0016】
特定の実施形態では、プロジェリン濃度の減少は３５～６２％である。
【0017】
さらに他の実施形態では、プロジェリン濃度の減少が大きいほど平均余命の延長が大きくなる。
【0018】
また、本明細書には、ハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の治療有効性を決定するための方法が記載され、前記方法は以下の工程：ＨＧＰＳに対する治療薬の投与前に採取される、被検体からの治療前試料を提供する工程；定量的イムノアッセイにより治療前試料中のプロジェリン濃度を決定する工程であって、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質は検出しない、前記工程；ＨＧＰＳに対する治療薬の投与中又は投与後に採取される、被検体からの治療後試料を提供する工程；定量的イムノアッセイにより治療後試料中のプロジェリン濃度を決定する工程；及び治療前のプロジェリン濃度と治療後のプロジェリン濃度を比較する工程であって、ここで治療後試料中のプロジェリン濃度が有意に減少している場合、治療が有効であることを示す、前記工程、を含む。
【0019】
特定の実施形態において、治療前試料及び治療後試料は、血漿、血清、尿、及び唾液から選択される液体試料である。
【0020】
他の実施形態において、本方法は、最初の治療後試料の後の時点で被検体から採取される１つ又は複数の追加の治療後試料を提供することをさらに含み、ここで、プロジェリン濃度の継続的又はさらなる減少は、治療の有効性の継続を示す。
【0021】
特定の実施形態では、定量的イムノアッセイは、野生型ラミンＡ及びプロジェリンの両方に結合する捕捉抗体と試料を接触させて、捕捉されたラミンＡ及び捕捉されたプロジェリンの混合物を得る工程；捕捉されたラミンＡ及び捕捉されたプロジェリンの混合物を試料から分離する工程；捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンとの混合物を、検出可能な標識を含むプロジェリン特異的検出抗体と接触させ、それにより検出抗体と捕捉されたプロジェリンとを結合させるが、捕捉されたラミンＡは結合させない工程；捕捉されたラミンＡとの混合物から検出可能な標識を分離する工程；検出可能な標識を検出し、それにより試料中のプロジェリンの量を定量する工程、を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである。他の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量範囲は５９ｐｇ／ｍｌ～３０，０００ｐｇ／ｍｌである。
【0023】
記載された方法の特定の実施形態では、ＨＧＰＳの治療にはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤が含まれ、これは特定の実施形態ではロナファルニブである。
【0024】
さらに、本明細書に記載されるのは、被検体におけるハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の治療のための方法であって、前記方法は、被検体からの試料を提供する工程；定量的イムノアッセイを用いて試料中のプロジェリン濃度を定量する工程であって、ここで定量的イムノアッセイはプロジェリンを検出するが、野生型ラミンＡタンパク質は検出しない、前記工程；試料中のプロジェリン濃度をＨＧＰＳ陽性コントロールと比較する工程であって、ここで試料中のプロジェリン濃度は、被検体がＨＧＰＳを有すること（場合）を示す、前記工程；及び被検体がＨＧＰＳを有する場合に、プロジェリン濃度を低下させるＨＧＰＳのための治療を被検体に投与する工程、を含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである。他の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量範囲は５９ｐｇ／ｍｌ～３０，０００ｐｇ／ｍｌである。
【0026】
記載された方法の特定の実施形態では、ＨＧＰＳの治療にはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤が含まれ、これは特定の実施形態ではロナファルニブである。
【0027】
上記及びその他の目的、特徴、及び利点は、添付図を参照しながら進む以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】図１は、プロジェリン特異的ＳＭＣイムノアッセイの概略図である。１．ラミンＡ／Ｃ捕捉抗体は、重鎖非特異的領域で磁性微粒子（円形）に結合している；２．プロジェリン含有溶液をウェルに添加し、プロジェリンをラミンＡ／Ｃ抗体捕捉抗体の抗体結合部位に結合させる；３．蛍光標識したプロジェリン特異的検出抗体を添加し、プロジェリンに結合させる；４．溶出－ 磁性微粒子からのプロジェリン＋Ｆｌ（蛍光標識化）プロジェリン特異的抗体を化学的に分離する；及び５．蛍光標識（長方形）のレーザー検出を用いて単一分子を計数する。
【図3】図３は、非ＨＧＰＳ患者と未治療の臨床試験患者との血漿プロジェリン量を示す。各記号は、個々の患者の量と年齢の比較を表す。Ｙ軸は対数スケールである。Ａ．非ＨＧＰＳ患者（Ｎ＝６９）＝三角形。Ｂ．未治療のＨＧＰＳ患者（Ｎ＝７４）＝円形。これはＨＧＰＳ患者と同じ年齢範囲内にあるパネルＡに示されている非ＨＧＰＳ患者＝三角形と共に表示される。
【図4A】図４は臨床試験患者の血漿プロジェリン量を示す。現地治験施設来院回数及び治療時間と平均±ＳＥＭプロジェリンとの比較。ＢＣＨへの試験来院は、異なる試験について来院１回後の様々な時期に行われた。来院１回の患者はすべて治療に対してナイーブ（ｎａｉｖｅ）であった。Ａ．ロナファルニブ（Ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ）で治療された、ＰｒｏＬｏｎ１（Ｎ＝２５）。
【図4B】Ｂ．ベースラインから来院５回までトリプル療法（ｔｒｉｐｌｅ ｔｈｅｒａｐｙ）により治療されその後ロナファルニブ単剤療法に切り替えた３剤試験患者（Ｎ＝１３）（来院６、７；Ｎ＝１０）。
【図4C】Ｃ． ＰｒｏＬｏｎ２ ロナファルニブ単剤療法（Ｎ＝２６）。
【図4D】Ｄ．長期継続治療（Ｎ＝１３）。上下のボックスの端はそれぞれ７５分位と２５分位との四分位数（ＩＱＲ）範囲を表す。横線は中央値、ボックス内の×は平均値を表す。下ヒゲ及び上ヒゲは、Ｑ１－１．５×ＩＱＲ及びＱ３＋１．５×ＩＱＲを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ＮＳ，ｐ＞０．０５。各来院は関連した来院と比較される。
【図5】図５は、プロジェリン量が生存期間と関連していることを示す。時間依存的ジョイントモデリングを使用して、血漿プロジェリン値の低下と共に死亡リスクは徐々に減少した（ｐ＜０．０００１）。死亡リスクの変化（ｙ軸）と、０から６５，０００ｐｇ／ｍＬの観察されたプロジェリンの減少の範囲におけるすべての値（ｘ軸）。実線は死亡リスクの減少率（％）であり、破線は９５％信頼区間（ＣＩ）である。Ｎ＝７４人の被検体（単一試料により治療されていない９人、及び未治療ベースラインと複数の療法中（ｏｎ－ｔｈｅｒａｐｙ）の試料によって治療される６５人）。
【発明を実施するための形態】
【0029】
詳細な説明
用語
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別段の指示がない限り、複数形の参照語を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という言葉は、文脈で明確に別段の指示がない限り、「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子質量値は概算であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本開示の実施又は試験には、本明細書に記載したものと類似又は同等の方法及び材料を用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。「ｅ．ｇ．（例えば）」という略語は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために用いられる。したがって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義である。米国で確立された定義と一致して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」は「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」を意味し、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に含む）」又は「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」は、記載された組成物又は方法の活性成分又は工程が、明示的に引用された成分又は工程のみを含むことを示す。さらに、米国で確立された定義と一致して、所定の成分を「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」組成物は、他の実施形態において、その成分から「本質的になる」こともできる。同様に、所与の一連の工程を「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」方法は、他の実施形態において、明示的に示された一連の工程から「本質的になる」こともできる。
用語
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別段の指示がない限り、複数形の参照語を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という言葉は、文脈で明確に別段の指示がない限り、「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子質量値は概算であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本開示の実施又は試験には、本明細書に記載したものと類似又は同等の方法及び材料を用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。「ｅ．ｇ．（例えば）」という略語は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために用いられる。したがって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義である。米国で確立された定義と一致して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」は「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」を意味し、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に含む）」又は「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」は、記載された組成物又は方法の活性成分又は工程が、明示的に引用された成分又は工程のみを含むことを示す。さらに、米国で確立された定義と一致して、所定の成分を「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」組成物は、他の実施形態において、その成分から「本質的になる」こともできる。同様に、所与の一連の工程を「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」方法は、他の実施形態において、明示的に示された一連の工程から「本質的になる」こともできる。
【0030】
矛盾が生じた場合は、用語の説明を含む本明細書が優先される。すべての材料、方法、及び例は例示であり、限定を意図するものではない。
【0031】
ＨＧＰＳの予後の方法（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ）
臨床的に適切な生物学的マーカーの開発は、ＨＧＰＳの小児及び若年成人に対する効果的な治療法を特定し、実施するために不可欠である。しかし、これまでのところ、このようなバイオマーカーの同定は、臨床試験での有用性を高めるには感度又は定量性が十分でなかった免疫学的手法のために妨げられてきた。さらに、連続した患者試料を得るためのこのようなバイオマーカーの組織における検出は不可能であった。イムノアッセイアプローチには限界があるため、免疫検出に代替法が標的質量分析法を使用して開発されたが（Ｃａｍａｆｅｉｔａら）、その臨床的有用性にも限界があり得る。本明細書に記載の研究は、プロジェリンがＨＧＰＳの定量可能なバイオマーカーであることを立証し、プロジェリン濃度がこの普遍的に致死的な疾患に対する新しい治療法を直接評価するために使用できることを示している。さらに記載の研究はまた、血漿プロジェリンの患者の生存との定量的な関係も実証し、患者の生存を予後（予後判定）（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）するための定量的な方法を初めて可能にした。
臨床的に適切な生物学的マーカーの開発は、ＨＧＰＳの小児及び若年成人に対する効果的な治療法を特定し、実施するために不可欠である。しかし、これまでのところ、このようなバイオマーカーの同定は、臨床試験での有用性を高めるには感度又は定量性が十分でなかった免疫学的手法のために妨げられてきた。さらに、連続した患者試料を得るためのこのようなバイオマーカーの組織における検出は不可能であった。イムノアッセイアプローチには限界があるため、免疫検出に代替法が標的質量分析法を使用して開発されたが（Ｃａｍａｆｅｉｔａら）、その臨床的有用性にも限界があり得る。本明細書に記載の研究は、プロジェリンがＨＧＰＳの定量可能なバイオマーカーであることを立証し、プロジェリン濃度がこの普遍的に致死的な疾患に対する新しい治療法を直接評価するために使用できることを示している。さらに記載の研究はまた、血漿プロジェリンの患者の生存との定量的な関係も実証し、患者の生存を予後（予後判定）（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）するための定量的な方法を初めて可能にした。
【0032】
したがって、本明細書では、被検体から容易に得られる液体試料（例えば、血漿、尿、及び唾液）中のプロジェリンを選択的に定量する、新しく開発されたイムノアッセイについて記載する。この開発されたイムノアッセイにより、ＨＧＰＳの治療有効性を決定するため、及び患者の生存の相対的な期間を予後することができるための両方にも使用できる、被検体におけるＨＧＰＳの予後の方法の開発が可能になった。
【0033】
ＨＧＰＳ治療の有効性を決定するために、記載された方法は、ＨＧＰＳ治療を受ける前に被検体からの試料を提供すること；この治療前試料中のプロジェリン濃度を定量的イムノアッセイを用いて定量すること；被検体がＨＧＰＳ治療を受けた後に被検体から採取される試料を提供すること；この治療後試料中のプロジェリン濃度を定量的イムノアッセイを用いて定量すること；及び治療後試料中のプロジェリン濃度を治療前試料中のプロジェリン濃度と比較すること、を含む。この比較に基づき、治療後の試料のプロジェリン濃度が治療前の試料のプロジェリン濃度より有意に低ければ、治療の有効性を示す。
【0034】
特定の実施形態において、記載の方法は、治療薬の投与後の単一の時点で被検体から採取した試料中のプロジェリン濃度を定量するために使用される。他の実施形態では、記載の方法は、治療の初回投与後の、及び特定の実施形態では治療の継続投与中の、連続した時点で被検体から採取される長期的試料においてプロジェリンを定量するために使用することができる。プロジェリン濃度を複数の時点にわたって定量するこれらの方法では、最初に測定した時点の後のプロジェリンの濃度からさらにプロジェリン濃度が減少した場合、あるいは減少したプロジェリン濃度が長期にわたって維持される場合に、所与の治療が有効であるとみなされる。
【0035】
前述のように、記載の方法の実施形態は、ＨＧＰＳ患者の生存の相対的な長さを決定するために使用することができる。このような実施形態は、被検体からの試料を提供すること；定量的イムノアッセイで被検体中のプロジェリン濃度を定量すること；及び試料中のプロジェリン濃度を、ＨＧＰＳ陽性被検体を示すコントロールの濃度と比較すること、を含む。この比較に基づき、被検体のプロジェリン濃度がコントロールのプロジェリン濃度より低いことは、被検体の平均余命の延長を示す。
【0036】
記載の方法で使用する試料には、被検体から直接又は間接的に得ることができ、そこから細胞又は細胞外タンパク質を検出できるあらゆる試料が含まれる。このような試料には、全血、血漿、血清、涙、粘液、唾液、尿、喀痰、組織、細胞（線維芽細胞、末梢血単核球、又は筋肉細胞など）、臓器、及び／又は組織、細胞（線維芽細胞、末梢血単核球、又は筋肉細胞など）、又は臓器の抽出物が含まれるが、これらに限定されない。試料は、当業者によく知られた方法を使用して採取又は取得される。特定の実施形態では、記載の方法で使用するための試料には、血漿、血清、尿、又は唾液などの液体試料が含まれる。さらに他の特定の実施形態では、被検体から採取され、記載の方法で使用するために提供される試料は、血漿試料である。
【0037】
記載の方法において、試料を「提供すること」には、タンパク質を検出する免疫学的方法において使用するために、被検体から試料を収集し、かつ処理するための当該技術分野で知られている任意の方法が含まれる。特定の実施形態において、試料は、被検体から採取された直後に、記載のイムノアッセイに提供される。他の実施形態では、試料は、数日、数週間、数ヶ月、又は数年の短期及び長期の保存のために、凍結などによって保存される。タンパク質含有試料の収集及び保存の方法は、当該技術分野において標準的であり、よく知られている。同様に、特定の実施形態では、プロジェリンは、試料の大規模な前処理を追加することなく、記載の定量的イムノアッセイを用いて検出される。あるいは、試料は、本明細書に記載のイムノアッセイによるタンパク質の検出を可能にするために十分な処理が行われる。このようなタンパク質の抽出及び濃縮の手順は、すべての試料に必要というわけではないが、検出されるシグナルを増加させるために、記載の方法に試料を提供する前に必要に応じて行うことができる。
【0038】
本明細書に記載の予後の方法は、被検体から採取した試料（複数可）中のプロジェリンを選択的に検出するが、該タンパク質の野生型（非変異体）形態であるラミンＡは検出しない定量的イムノアッセイを使用することによりプロジェリンを定量する。定量的イムノアッセイは、比較源（例えば、病歴的なコントロール又は被検体からのより早い時点のもの）からの試料中のプロジェリン濃度の差を、ピコグラム／ｍｌの範囲で検出するのに十分な感度を有していなければならない。例えば、定量的イムノアッセイは、１０，０００ｐｇ／ｍｌ、５，０００ｐｇ／ｍｌ、４，０００ｐｇ／ｍｌ、３，０００ｐｇ／ｍｌ、２，０００ｐｇ／ｍｌ、１，０００ｐｇ／ｍｌ以下の差を検出できる必要がある。特定の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量下限は５９ｐｇ／ｍｌである。別の実施形態では、定量的イムノアッセイの定量上限は３０，０００ｐｇ／ｍｌである。
【0039】
イムノアッセイは当技術分野でよく知られており、タンパク質の野生型と変異型との間を特異的に区別するために適合することができ、記載のとおりピコグラムのスケールで標的タンパク質を定量するのに十分な感度を有する任意のイムノアッセイであれば、記載の方法での使用に適合することができることが理解されよう。記載の方法において使用され得るイムノアッセイの特に非限定的な例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学、共焦点顕微鏡を伴う又は伴わない免疫蛍光組織化学、及び酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び関連非酵素的技術、並びにフローサイトメトリー関連方法論が挙げられる（例えばＣｏｘら，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ”ｉｎ Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｒｋｏｓｓｉａｎら，編，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，２０１９年更新を参照）。特定の実施形態では、イムノアッセイは典型的な「サンドイッチアッセイ」又はその派生法であり、目的の抗原が抗体によって試料から最初に捕捉され、次に抗原を特異的に認識し、かつ検出可能な標識に結合される第２の抗体によって検出される。
【0040】
記載の方法で使用するイムノアッセイは、ラミンＡとプロジェリンとを特異的に認識する抗体を用いる。このような抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。記載の方法において使用するための抗体の特定の例には、インタクト（無傷）な免疫グロブリン、及びＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）などの当該技術分野において十分に知られているバリアント及びその一部が含まれる。
【0041】
特異的な構造又は分子配列以上に、記載の方法で使用するための抗体は、ラミンＡとプロジェリンとに特異的に結合できる必要があり（捕捉抗体）、又はプロジェリンには特異的に結合するがラミンＡには結合しない必要がある（検出抗体）。「特異的に結合する」及び「特異的結合」という用語は、特異的結合剤と標的分子種とが混在する他の分子種に結合するよりも優先して標的分子種に結合する抗体の能力を指す。特異的結合剤は、標的分子種に特異的に結合できる場合その標的分子種を特異的に認識することをいう。
【0042】
ラミンＡ及びプロジェリンのアミノ酸配列は当技術分野で知られている（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿７３３８２１．１（ラミンＡ）及びＡＡＲ２９４６６．１（プロジェリン）にてオンラインで入手可能）。ラミンＡは６６４個のアミノ酸のポリペプチドで、その切断型バリアントであるプロジェリンは６１４個のアミノ酸である。したがって、プロジェリンを特異的に認識するがラミンＡを認識しない記載の方法で使用する抗体又はその断片は、プロジェリンには存在するがラミンＡには存在しないＣ末端アミノ酸を認識するように設計されている。このような抗体の特定の非限定的な例は、ラミンＡの欠失領域をわたるプロジェリンのアミノ酸６０４と６１１との間のエピトープを認識する。記載の方法で使用する抗体は市販されている。
【0043】
記載の方法で使用するための検出抗体は、プロジェリンを特異的に認識するがラミンＡを認識又は結合しない抗体に直接的又は間接的にコンジュゲートすることができる任意の検出可能な化合物又は組成物を含む検出可能な標識にコンジュゲートされる。記載の方法で使用するための検出可能な標識の具体的な非限定的な例としては、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤又は蛍光剤、ハプテン、酵素が挙げられる。このような標識を検出する方法も同様に標準的である。
【0044】
特定の実施形態において、記載の定量的イムノアッセイは、以下の工程を含むサンドイッチ型イムノアッセイである：（ａ）野生型ラミンＡとプロジェリンの両方に結合する捕捉抗体と試料を接触させ、捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンの混合物を得る工程；（ｂ）捕捉されたラミンＡと捕捉されたプロジェリンの混合物を試料から分離する工程；（ｃ）捕捉されたラミンＡ及び捕捉されたプロジェリンの混合物を、検出可能な標識を含むプロジェリン特異的検出抗体と接触させて、それにより捕捉されたプロジェリンは検出抗体と結合するが捕捉されたラミンＡは結合しない工程；（ｄ）検出可能な標識を捕捉されたラミンＡとの混合物から分離する工程；および（ｅ）検出可能な標識を検出して、それにより、試料中のプロジェリンの量を定量する工程。
【0045】
上記の方法の工程（ｂ）のように、複合体混合物から所与の標的タンパク質を分離するための様々な方法が当技術分野で知られている。特定の実施形態では、捕捉抗体は、磁性粒子、ポリスチレンビーズ（アフィニティタグでコーティングすることもできる）、培養皿のウェルなどのような、しかしこれらに限定されない個体基質に付着させる。このような基質を使用することにより、標的タンパク質（この例ではラミンＡまたはプロジェリン）は、捕捉抗体によって特異的に認識され結合される場合に基質に結合する。次いで、捕捉された抗体－タンパク質－基質は標準的な方法で、かつ基質の性質に従って、残りの試料成分から分離することができる。例えば、捕捉抗体が磁性粒子にコーティングされている特定の実施形態では、捕捉された抗体－タンパク質－基質複合体を磁場によって固定することができ、一方、タンパク質の抗体への非特異的結合を防ぐように十分にストリンジェントな条件下で試料の残りを洗い流すことができる。別の例示的な実施形態では、捕捉抗体は９６ウェル培養プレートなどの培養プレートの底に貼り付けられ、それによって捕捉された抗体－タンパク質複合体がプレート上に残り、これにより試料の残りを洗い流すことが可能にする。
【0046】
同様に、捕捉された抗体－タンパク質複合体に検出抗体が結合し（上記の工程（ｃ））、かつ非特異的な検出抗体の結合を制限する条件下で過剰の検出抗体が洗い流された後に、結合した検出可能な標識を分離する様々な方法（工程（ｄ））が、記載の方法の範囲内で可能である。特定の実施形態では、検出抗体－プロジェリン－捕捉抗体複合体から分離される部分は、検出抗体－プロジェリンサブ複合体である（図１に描かれている分離工程４と同様）。他の実施形態では、除かれるのは標識を伴う抗体のみであり、一方で、さらに他の実施形態では、結合した複合体から分離されるのは標識のみである。特定の実施形態では、ポリペプチド複合体の１つ又は複数の部分を切断する酵素的手段によって、標識は分離される（抗体－プロジェリン、抗体の一部として、又は抗体から離れたものとしてであるかを問わず）。他の実施形態では、複合体から標識を放出する非酵素的手段によって分離される（抗体の一部として、又は抗体－プロジェリン複合体としてであるかを問わず）。
【0047】
ＨＧＰＳに対する治療の有効性を決定することにおいて、治療薬の投与前と治療薬の投与後の被検体のプロジェリン濃度を決定する。特定の実施形態では、有効性は治療薬の投与後の単一の時点で決定される。他の特定の実施形態では、有効性は治療薬の投与後又は投与中の複数の時点で決定される。例えば、試料は、治療薬の投与後又は治療の継続中に、数週間、数ヶ月、さらには数年にわたり、被検体から採取することができる。特定の実施形態では、試料は、治療薬の投与後又は投与中に、２、４、６、８、１０、１２か月ごと及びその間の増分ごとに被検体から採取される。別の実施形態では、治療期間中又は治療終了後、半年又は１年ごとに試料を採取する。
【0048】
ＨＧＰＳに対する治療の有効性は、治療薬の投与後又は投与中にＨＧＰＳの濃度が有意に減少したことを検出する記載の方法によって示される。有意な減少とは、統計的に有意な減少である場合もあるが、本方法では統計的に有意な減少である必要はない。治療の有効性を示すプロジェリン濃度の有意な減少には、検出された投与前のプロジェリン濃度から最大１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、あるいはそれ以上の減少が含まれる。特定の実施形態では、プロジェリン濃度の減少は、投与前のプロジェリン濃度より少なくとも３５％～６５％低いことであると決定される。
【0049】
治療の初回投与後、複数の時点で被検体から試料を採取し、プロジェリン濃度を決定するこれらの実施形態では、治療の有効性は、記載のとおりプロジェリン濃度のさらなる減少、又は治療薬の投与後、最初の時点で採取した試料から決定される減少したプロジェリン濃度の維持のいずれかによって決定することができる。このような実施形態では、検出されるプロジェリン濃度のさらなる減少は、最初の減少よりも少ない可能性があることが理解されよう。このようなさらなる減少は、１％～１０％程度に少ない可能性があるが、上述のとおりそれを超過する場合もあり得る。
【0050】
ＨＧＰＳに対する治療の有効性を決定する方法は、被検体におけるプロジェリンの発現又は蓄積を変化させると予想される任意の治療の有効性をモニターするために用いることができる。ＨＧＰＳの潜在的な治療法は、プロジェリン量を変化させることを目的とし、様々な作用機序を用いて開発されている、又は現在開発中であり（Ｍａｃｉｃｉｏｒらによるレビュー）、遺伝子編集（Ｋｏｂｌａｎら）、ＲＮＡベース療法（Ｅｒｄｏｓら、及びＰｕｔｔａｒａｊｕら）、ラミンＡとの相互作用、オートファジーの速度、及びプロジェリンタンパク質の翻訳後プロセシングを標的とする小分子を含む。特定の実施形態において、本方法は、ＨＧＰＳを有する被検体にロナファルニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を投与した場合の有効性をモニターする。
【0051】
開示の方法の特定の実施形態は、ＨＧＰＳを有する被検体における相対的な平均余命の予後を対象とする。前述のとおり、被検体からの試料中のプロジェリン濃度が低いことは平均余命の延長に相関する。記載の予後の方法は、被検体の試料中のプロジェリン濃度をＨＧＰＳ陽性コントロールと比較するものである。当該技術分野で一般的に理解されているように、コントロールとは参照標準である。したがって、ＨＧＰＳ陽性コントロールは、被検体の既知又は以前に決定されたプロジェリン濃度であり得、あるいは過去の平均値から求めることができる。特定の例では、ＨＧＰＳ陽性コントロールは、人生のより早い時点、又はＨＧＰＳ治療を受ける前の時点における、（本方法の試料が提供される）同じ被検体からの試料の決定されたプロジェリン濃度である。他の例では、ＨＧＰＳ陽性コントロールは、１人以上の既知の他の（被検体でない）ＨＧＰＳ陽性個体から決定されたプロジェリン濃度である。特定の実施形態において、ＨＧＰＳ陽性コントロールは、ＨＧＰＳ患者の過去のベースラインとして記録されるような、ＨＧＰＳ陽性被検体からの試料において決定されるプロジェリンの平均濃度である。
【0052】
臨床現場においてプロジェリンを正確に決定することは、ＨＧＰＳの効果的な診断、予後、及び治療にとって重要な側面である（例えばＢｅｎｅｄｉｃｔｏら；Ｃａｂｒａｌらを参照）。記載のイムノアッセイを用いることで、ＨＧＰＳ陽性コントロールと比較して、被検体のプロジェリン濃度がより減少していることが、相対的な平均余命の延長を定量的に示していることを初めて示すことができる。上述の治療有効性の決定方法と同様に、相対的減少は統計的に有意である必要はないが、上述のように、コントロールからの減少は最大１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、あるいはそれ以上とすることができる。特定の実施形態では、プロジェリン濃度の減少は、コントロールより少なくとも３５％～６５％低いことと決定される。予測寿命が延長する。
【0053】
ＨＧＰＳ治療の有効性を決定するための方法と同様に、特定の実施形態において、本明細書に記載の予後の方法は、被検体（患者）が診断される後の単一の時点にて採用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者の経過及びプロジェリン濃度の経時的変化をモニターするために用いることができる。このようなモニタリングでは複数の時点を使用することができ、例えば、診断及び治療開始後数か月、数年、又はそれ以上（およびその間の任意の時点）が、患者からの試料中のプロジェリンの濃度を測定するのに適した時点となり得る。
【0054】
ＨＧＰＳの治療のための方法
本開示では、プロジェリンはＨＧＰＳのバイオマーカーとして立証される。ＨＧＰＳと診断された患者はプロジェリン濃度の有意な上昇を有することだけでなく、ＨＧＰＳの特定の治療を受けた患者ではプロジェリン濃度が有意に減少すること、プロジェリン濃度の減少は平均余命の延長と相関することが示された。したがって、本明細書には、ＨＧＰＳを有する被検体の治療の方法が記載される。このような方法では、ＨＧＰＳを有することが疑われ得る被検体、又はＨＧＰＳを有することが疑われ得ない被検体から試料が提供される。試料中のプロジェリン濃度は上記のとおり決定され、ＨＧＰＳ陽性コントロールと比較され、ＨＧＰＳ陽性コントロールは、ＨＧＰＳを有することが知られている１人以上の個体からのプロジェリン濃度であり得る。試料中のプロジェリン濃度が、被検体がＨＧＰＳであることを示す場合（例えば、プロジェリン濃度がＨＧＰＳ陽性コントロールのプロジェリン濃度と類似、同等、又はそれを超過するため）、被検体に、プロジェリン濃度を低下させるＨＧＰＳのための治療が提供される。
本開示では、プロジェリンはＨＧＰＳのバイオマーカーとして立証される。ＨＧＰＳと診断された患者はプロジェリン濃度の有意な上昇を有することだけでなく、ＨＧＰＳの特定の治療を受けた患者ではプロジェリン濃度が有意に減少すること、プロジェリン濃度の減少は平均余命の延長と相関することが示された。したがって、本明細書には、ＨＧＰＳを有する被検体の治療の方法が記載される。このような方法では、ＨＧＰＳを有することが疑われ得る被検体、又はＨＧＰＳを有することが疑われ得ない被検体から試料が提供される。試料中のプロジェリン濃度は上記のとおり決定され、ＨＧＰＳ陽性コントロールと比較され、ＨＧＰＳ陽性コントロールは、ＨＧＰＳを有することが知られている１人以上の個体からのプロジェリン濃度であり得る。試料中のプロジェリン濃度が、被検体がＨＧＰＳであることを示す場合（例えば、プロジェリン濃度がＨＧＰＳ陽性コントロールのプロジェリン濃度と類似、同等、又はそれを超過するため）、被検体に、プロジェリン濃度を低下させるＨＧＰＳのための治療が提供される。
【0055】
前述のとおり、広範囲の様々な作用機序を用いてプロジェリン量を変化させるためのＨＧＰＳに対する複数の治療が開発中である。記載されている治療はいずれも、立証されれば本方法で使用可能である。現在までに承認されている唯一の治療は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤のロナファルニブの使用である。
【0056】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＦＴＩ）は、ファルネシル基をピロリン酸ファルネシルから所与の標的タンパク質に転移するファルネシルトランスフェラーゼの能力を阻害する化合物類である。ＦＴＩは、プロジェリンへのファルネシルの付加を阻害するために使用することができ、それによってプロジェリン又はプレラミンＡと、核膜の内膜（ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）との異常な結合を防ぐことができる。ＦＴＩは一般的に３つのグループに分けることができる：（１）ＣＡＡＸモチーフを持つ、あるいはそれを模倣したテトラペプチド（Ｂｒｏｗｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：８３１３－８３１６、１９９２；Ｒｅｉｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７３２－７３６，１９９１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５５７５－１５５７８，１９９１）；（２）ファルネシルピロホスフェート（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＦＰＰ）のアナログ（Ｇｉｂｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：７６１７－７６２０，１９９３）；及び（３）テトラペプチド又はＦＰＰのいずれにも似ていない構造を有する阻害剤（Ｌｉｕら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４５：４５４－４５７，１９９２；Ｍｉｕｒａら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１８：８８－９０，１９９３；Ｏｍｕｒａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４６：２２２－２２８，１９９３；Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｐｙｌら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４５：１８０２－１８０５，１９９２）。後者のカテゴリーの阻害剤は、一般的に最初の２つのカテゴリーに比べて活性が低い。例として、ＦＴＩのロナファルニブ（Ｚｏｋｉｎｖｙ（登録商標））は非ペプチド模倣型ＦＴＩであり、ＦＴＩ－２７７はペプチド模倣型ＦＴＩである。本明細書に記載の方法で使用するＦＴＩの別の非限定的な例としては、Ｒ１１５７７７（チピファルニブ、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（登録商標））が挙げられる。ＦＴＩの開発及び化学的性質は十分に文書化されており、当業者に知られている。現在までのところ、ロナファルニブはＨＧＰＳの治療における使用が承認された唯一のＦＴＩであるが、本明細書で提供される方法においては、すべてのカテゴリーのＦＴＩを使用することができると考えられ；かつ特定のＦＴＩを選択することは、通常の当業者の技量の範囲内である。いくつかの実施形態では、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩと比較して、ファルネシルトランスフェラーゼに対してより選択的である阻害剤化合物を選択することが有益である。他の実施形態では、ＦＴａｓｅ及びＧＧＴａｓｅ Ｉの両方を阻害するという点で二重選択的である阻害剤化合物を選択することが有益であり得る。ＦＴＩの選択性基準を決定するための考慮事項には、二重特異性ＦＴＩに対してＦＴａｓｅ特異的ＦＴＩにより毒性が低くなる可能性が含まれる（これらに限定されない）が、有効性と毒性との両方は特定の化合物及び特定の患者によって異なる可能性がある。当業者であれば認識できるように、他の考慮事項、例えば薬理学的及び医学的な考慮事項が適用されることもある。
【0057】
特定の例では、ロナファルニブなどのＦＴＩは、１１５ｍｇ／ｍ２～１５０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙの容量範囲で投与され、例えば約１１５ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、１３０ｍｇ／ｍ２、１３５ｍｇ／ｍ２、１４０ｍｇ／ｍ２、１４５ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２などで投与される。当業者であれば、ＦＴＩに典型的な他の投与量の範囲が本開示に包含されることを理解できよう。
【0058】
本明細書に記載の方法で使用するための治療（治療薬）（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、一般的に、薬学的に許容される担体及び／又は薬学的賦形剤に含まれる。「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されるか、又は動物、より特にヒトに使用するために米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、療法でともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。
【0059】
医薬賦形剤の例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。特定の治療には、必要に応じて、少量の湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有され得る。本明細書に記載の方法で使用するための治療は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口製剤には、医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含めることができる。
【0060】
他の医薬組成物の実施形態は、当業者に知られ得るとおり、従来の薬学的に許容される対イオンを用いて調製される。
【0061】
治療用調製剤は、治療上有効な量の少なくとも１つの有効成分、好ましくは精製された形態の有効成分を、患者に適切に投与できるよう、適切な量の担体と共に含有するであろう。この配合は投与様式に適したものでなければならない。
【0062】
本開示の併用療法は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤化することができる。一般に、静脈内投与用組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、該組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。
【0063】
様々な実施形態における成分は、例えば、錠剤、丸薬、粉末、液体溶液、又は懸濁液などの固体、半固体、及び液体の剤形、又は、懸濁液、又は活性剤の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器に入った乾燥凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、別々に、又は混合して単位剤形で供給される。指示された薬剤の１つ以上が輸液によって投与される場合、滅菌された医薬品グレードの水又は生理食塩水を含む輸液ボトルを用いて調剤することができる。
【0064】
任意の特定の被検体に対する具体的な投与量のレベル及び投与回数は様々であり得、特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用時間、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、治療を受ける受給者の状態の重症度など、様々な要因に依存するであろう。
【0065】
本開示の治療用化合物及び組成物は、治療期間を通じてほぼ同じ用量で、漸増用量レジメンで、又は負荷用量レジメン（例えば、負荷用量が維持用量の約２～５倍）で投与され得る。いくつかの実施形態において、用量は、治療される被検体の状態、疾患又は状態の重症度、療法に対する明らかな応答、及び／又は当業者によって判断される他の因子に基づいて、治療の過程で変更される。いくつかの実施形態では、薬物による長期治療が企図されている。
【0066】
いくつかの実施形態では、治療有効量の治療用化合物又は組成物を含む医薬調製剤の持続的局所放出が有益であり得る。徐放性製剤は当業者に知られている。一例として、ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）プロパン－セバシン酸又はレシチンの懸濁液などのポリマーを用いて、持続的局所放出を行うことができる。
【0067】
以下の実施例は、特定の特徴及び／又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載の特定の特徴又は実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0068】
実施例１：方法
１分子カウント（Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ：ＳＭＣ（商標））プロジェリンイムノアッセイ
血漿プロジェリン検出のためのＳＭＣ超高感度イムノアッセイを立ち上げた。全体として、このアッセイは、磁性微粒子上にコートされた抗ラミンＡ捕捉抗体と、蛍光タグにコンジュゲートした抗プロジェリン特異的検出抗体とによるサンドイッチイムノアッセイ形式を採用し、９６ウェルプレートで実施した（図１）。プロジェリン結合検出抗体を溶出し、共焦点レーザーを用いて１分子として読み取った。
１分子カウント（Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ：ＳＭＣ（商標））プロジェリンイムノアッセイ
血漿プロジェリン検出のためのＳＭＣ超高感度イムノアッセイを立ち上げた。全体として、このアッセイは、磁性微粒子上にコートされた抗ラミンＡ捕捉抗体と、蛍光タグにコンジュゲートした抗プロジェリン特異的検出抗体とによるサンドイッチイムノアッセイ形式を採用し、９６ウェルプレートで実施した（図１）。プロジェリン結合検出抗体を溶出し、共焦点レーザーを用いて１分子として読み取った。
【0069】
プロジェリン測定用のＳＭＣアッセイは、捕捉抗体と検出試薬とでコートした磁性微粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＭＰ）がプロジェリンアッセイに特異的であったこと以外は、以前の記載のとおりであった（Ｔｏｄｄら）。簡潔には、プロジェリン捕捉抗体（マウスＭａｂ抗ラミンＡ＋Ｃ、クローン：１３１Ｃ３ Ａｂｃａｍ、アミノ酸残基３１９～５６６間のエピトープ、ラミンＡ、Ｃ及びプロジェリンに共通）を２５μｇ抗体／ｍｇ ＭＰでＭＰ上にコートした。試料はＭＰ－捕捉抗体に暴露され、分析対象物に特異的に結合した後、未結合の物質を除去するためにプレートを１回洗浄した。次に、蛍光標識されたプロジェリン特異的検出抗体（マウスＭａｂ、クローン：１３Ａ４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、ラミンＡの欠失領域をわたるプロジェリンのアミノ酸６０４～６１１間のエピトープ）をアッセイ緩衝液中で２，０００ ｎｇ／ｍＬに予め希釈し、次いで０．２μｍフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で濾過し、ウェルに加えた。その後プレートを４回洗浄し、未結合の検出抗体を除去した。その後、プレートに結合した非特異的検出抗体の溶出を防ぐために、すべてのＭＰを最初の９６ウェルアッセイプレートから新しいプレートに移した。その後、プロジェリン結合検出抗体を独占所有権のあるグリシン緩衝液を用いたｐＨシフトにより溶出し、新しいプレートに移し、Ｅｒｅｎｎａ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＳｇｘＬｉｎｋ（商標））を用いてＳＭＣにより検出した。ＳｇｘＬｉｎｋから得られた生のシグナルデータ及び補間データはエクセルに転送され、そこで複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）ウェルについて精度を計算した。生シグナル及び補間値の許容仕様は、精度及び回収の偏り≦２０％であった。
【0070】
ＥＭＤ標準希釈液（トリス緩衝液とキャリアタンパク質との独占使用権のある混合物（ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）を含む合成血清ベースの溶液）中で希釈した組み換えプロジェリン（Ａｂｃａｍ ９３９１８）の１２ポイントの標準曲線を、各プレートで３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）に行った。標準曲線は、未知試料中のプロジェリン濃度を測定するために使用した。予想されるプロジェリンが標準曲線のダイナミックレンジに収まるように、試料は標準希釈液で希釈した。報告されたプロジェリン及びＳＤはすべて希釈補正される。すべての試料は、３連と指定がない限り、２連で試験した。
【0071】
バックグラウンドに２標準偏差を加えた値以下のシグナルは不検出（ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ：ＮＤ）と報告した。定量下限（ＬＬｏＱ）は、上から下へ、標準曲線上の最も低い点として予め定義され、これは期待値の２０％以内に回収され、かつ変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＶ）の割合（％）が２０％以下であった。
【0072】
高値、中値、低値のアッセイ間で同様のプロジェリン定量を保証するため、同じ内因性血漿のアッセイ間品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ：ＱＣ）セットを各プレートで２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にアッセイした。内因性血漿プロジェリンは、古典的なｐＧ６０８Ｇ，ｃ．１８２４ Ｃ＞Ｔ変異を有するヒトＬＭＮＡ遺伝子を発現するＨＧＰＳのホモ接合トランスジェニックマウスモデルから得られる（Ｍｕｒｔａｄａら）。このマウス血漿には高レベルのプロゲリンが含まれており、貴重なヒトＨＧＰＳ血漿貯蔵を使用せずにＱＣ生成を可能にした。アリコートを正常ヒト血漿で希釈し、－８０℃で保存した。ＱＣプレートの許容性パラメータは、アッセイ開発中の最初の２４回のＱＣ実行の平均±２０％として固定した。高ＱＣと中ＱＣの平均プロジェリンはそれぞれ１８８，２０６±１０，５８０ｐｇ／ｍＬ（％ＣＶ＝５．６）と１９，５１３±１，２３５ｐｇ／ｍＬ（％ＣＶ＝６．３）であった。低ＱＣは常にＬＬｏＱ未満であった。臨床試験試料用の１：２５希釈のプロトコルを反映させるため、ＱＣは濾過され、アッセイが実施される同日に２５倍に希釈した。臨床試験試料プレート（Ｎ＝３９）における高ＱＣおよび中ＱＣのアッセイプロジェリンの平均は、それぞれ７，３０３±６０９ｐｇ／ｍＬ（％ＣＶ＝３．８）、７５５±９０ｐｇ／ｍＬ（％ＣＶ＝５．７）であった。したがって、高ＱＣと中ＱＣは常に分析測定範囲内に収まった。
【0073】
有効な実行では、標準曲線から算出される定量下限が５９ｐｇ／ｍＬ以下であり、コントロールが確率された高および中のＱＣの２０％以内であることが必要とされた。
【0074】
最終的なアッセイ条件が確立されると、プロジェリン量がアッセイの定量限界内に収まることを確認するため、補間濃度が定量上限超過（ｕｐｐｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ：ＵＬｏＱ）の試料、又は％ＣＶが２０％超過の試料は、適切な希釈を用いて再試験した。さらに、標準曲線のＬＬｏＱ（５９９ｐｇ／ｍＬ）を満たさないプレート、又はＱＣ（高および中。低い管理はＬＬｏＱ未満をともなう）が平均及びＳＤの２０％から外れたプレートはいずれも、繰り返し行った。
【0075】
希釈直線性
希釈の直線性は、一連の希釈における希釈補正プロジェリン値を先行の希釈のプロジェリン値で割ることによって計算し、百分率で表した：
ＤＬ（希釈直線性）＝［実測値］Ｂ／［実測値］Ａ ＊１００。式中、Ｂはより高い希釈の希釈補正値であり、Ａは先行の希釈系列の希釈補正値である。
希釈の直線性は、一連の希釈における希釈補正プロジェリン値を先行の希釈のプロジェリン値で割ることによって計算し、百分率で表した：
ＤＬ（希釈直線性）＝［実測値］Ｂ／［実測値］Ａ ＊１００。式中、Ｂはより高い希釈の希釈補正値であり、Ａは先行の希釈系列の希釈補正値である。
【0076】
凍結融解検体の安定性
－８０°Ｃで凍結した血漿試料を室温（ＲＴ）で１５分間解凍し、十分に混合した後、この研究用に３つの追加のアリコートを作成するために分注した。その後、追加の凍結融解試験に供するためにすべてのアリコートを－８０℃で再凍結した。試験の当日、割り当てられたアリコートを、最大４回の凍結融解サイクルとして１５分間室温まで解凍及び－８０℃で再凍結を行った。最終的に解凍した試料を希釈し、３連で評価した。すべての試料は同じ日に試験した。凍結融解試料の安定性は、凍結融解サイクル２及び５での差の割合（％）が±２０％（業界標準）であれば合格とした。
－８０°Ｃで凍結した血漿試料を室温（ＲＴ）で１５分間解凍し、十分に混合した後、この研究用に３つの追加のアリコートを作成するために分注した。その後、追加の凍結融解試験に供するためにすべてのアリコートを－８０℃で再凍結した。試験の当日、割り当てられたアリコートを、最大４回の凍結融解サイクルとして１５分間室温まで解凍及び－８０℃で再凍結を行った。最終的に解凍した試料を希釈し、３連で評価した。すべての試料は同じ日に試験した。凍結融解試料の安定性は、凍結融解サイクル２及び５での差の割合（％）が±２０％（業界標準）であれば合格とした。
【0077】
凍結融解サイクル３、４、５における各試料のサイクル２との差の割合（％差）は、以下の式を用いて算出した：
【数1】
【0078】
天然プロジェリンと組み換えプロジェリンの検出
健康な非ＨＧＰＳ血漿試料（市販品）を標準希釈液中で５０倍に希釈し、次いで１０体積％の標準希釈の１，０００ｐｇ／ｍＬを生成する組み換えプロジェリン、または１，０００ｐｇ／ｍＬのプロジェリンを送達するように設計されたＨＧＰｌ１１０のいずれかをスパイク（添加）した。実際のプロジェリンのスパイクの計算値は、緩衝液スパイク試料ＨＧＰｌ１１０のコントロール値から決定し、１，０１９ｐｇ／ｍＬであった。
健康な非ＨＧＰＳ血漿試料（市販品）を標準希釈液中で５０倍に希釈し、次いで１０体積％の標準希釈の１，０００ｐｇ／ｍＬを生成する組み換えプロジェリン、または１，０００ｐｇ／ｍＬのプロジェリンを送達するように設計されたＨＧＰｌ１１０のいずれかをスパイク（添加）した。実際のプロジェリンのスパイクの計算値は、緩衝液スパイク試料ＨＧＰｌ１１０のコントロール値から決定し、１，０１９ｐｇ／ｍＬであった。
【0079】
スパイク回収率（％）＝（スパイクした試料のプロジェリン（ｐｇ／ｍＬ）－内因性プロジェリン（ｐｇ／ｍＬ）／期待されるプロジェリンのスパイク（ｐｇ／ｍＬ）。
【0080】
ロナファルニブ干渉アッセイ
ロナファルニブ原薬（ＡＰＩ）（バッチ番号ＭＫ－６３３６－０００Ｒ０２５）は、ＰＲＦ細胞・組織バンクから入手した。ＨＧＰＳ血漿に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＤＭＳＯ ７．９２μｇ／ｍＬに溶解したロナファルニブのいずれかを２μＬ添加した。干渉率（％）＝［（スパイクした試料の平均濃度－コントロールの平均濃度）／コントロールの平均濃度］×１００。
ロナファルニブ原薬（ＡＰＩ）（バッチ番号ＭＫ－６３３６－０００Ｒ０２５）は、ＰＲＦ細胞・組織バンクから入手した。ＨＧＰＳ血漿に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＤＭＳＯ ７．９２μｇ／ｍＬに溶解したロナファルニブのいずれかを２μＬ添加した。干渉率（％）＝［（スパイクした試料の平均濃度－コントロールの平均濃度）／コントロールの平均濃度］×１００。
【0081】
ヒト臨床データ及び試料
ヒト臨床データは、Ｔｈｅ ＰＲＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｅｒｉａ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ、及びＭｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｐｒｏｇｅｒｉａｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇからオンラインで入手可能）から入手した。ＨＧＰＳ血漿及び血清は、ＰＲＦ細胞・組織バンク（Ｔｈｅ ＰＲＦ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）（ｐｒｏｇｅｒｉａｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇからオンラインで入手可能）から入手した。臨床試験試料は、インフォームド・コンセント又はＢＣＨ臨床試験委員会の承認を得て、ボストン小児病院（ＢＣＨ）から該バンクに提供された。試験試料は、トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）試料として治療投与直前の朝に空腹状態で採取したが、ただし、トラフ時に、及びその後のトラフ後の指定された時間に採取したｐＫ試料を除く。非試験試料は、採取時間の規制はなかった。いくつかの非ＨＧＰＳ健常ヒト血漿試料はＰｒｏＭｅｄＤｘから入手した。ＨＧＰＳ及び非ＨＧＰＳ血漿試料のＩＤには、ＨＧＰｌ及びＮＰｌの接頭辞をそれぞれ付けた。
ヒト臨床データは、Ｔｈｅ ＰＲＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｅｒｉａ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ、及びＭｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｐｒｏｇｅｒｉａｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇからオンラインで入手可能）から入手した。ＨＧＰＳ血漿及び血清は、ＰＲＦ細胞・組織バンク（Ｔｈｅ ＰＲＦ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）（ｐｒｏｇｅｒｉａｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇからオンラインで入手可能）から入手した。臨床試験試料は、インフォームド・コンセント又はＢＣＨ臨床試験委員会の承認を得て、ボストン小児病院（ＢＣＨ）から該バンクに提供された。試験試料は、トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）試料として治療投与直前の朝に空腹状態で採取したが、ただし、トラフ時に、及びその後のトラフ後の指定された時間に採取したｐＫ試料を除く。非試験試料は、採取時間の規制はなかった。いくつかの非ＨＧＰＳ健常ヒト血漿試料はＰｒｏＭｅｄＤｘから入手した。ＨＧＰＳ及び非ＨＧＰＳ血漿試料のＩＤには、ＨＧＰｌ及びＮＰｌの接頭辞をそれぞれ付けた。
【0082】
ＨＧＰＳ患者は、ＬＭＮＡ遺伝子にプロジェリンを産生する変異があることが遺伝学的に確認されていた。古典的ＨＧＰＳ（ｃ．１８２４Ｃ＞Ｔ）患者からの試料は主分析に提供され、非古典的ＨＧＰＳの比較はサブグループ比較に用いた。
【0083】
血漿の単離のため、血液をヘパリンナトリウム（ヘパリン又はＣＰＴ（商標）バキュテイナのいずれか）に採取し、４℃で１５００ｘｇで１５分間遠心分離するか、又はＫ２ＥＤＴＡに採取し、室温（ＲＴ）で１３００ｇで１０分間遠心分離した（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。血清を単離するために、血液を室温で６０分間（±１０分間）凝固させ、その後、室温で１１００ｘｇで１０分間遠心分離した。すべての試料をアリコートし、－８０°Ｃで保管し、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅに分析用のドライアイスで送った。
【0084】
分析のため、試料は５分未満で完全に解凍し、軽く混合し、標準希釈液で希釈した後、フィルタープレートウェル（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ ＭＳＢＶＮ１２１０）に移した。分析に必要な患者血漿体積は、２００μｌ又は１００μｌ（非ＨＧＰＳ １：１及び１：２）及び８μｌ（ＨＧＰＳ１：２５）であり２連作成した。試料を入れたフィルタープレートを１０分間遠心分離し、試料をフィルターに通した。その後、濾液を記載の方法で評価した。
【0085】
研究の薬剤の投与量及び投与
臨床試験研究試料は、ＰｒｏＬｏｎ１（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１４；Ｇｏｒｄｏｎら、２０１２）、トリプル療法（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１６）、ＰｒｏＬｏｎ２（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１８）の頭文字をとった３つのカテゴリーに分けられ、ボストン小児病院においてオープンラベル単施設試験として順次実施した（既報の研究の詳細を参照）。すべての臨床試験において、患者にロナファルニブ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ又はＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ，Ｉｎｃ．又はＥｉｇｅｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）をカプセル又は液体懸濁液で１２±２時間ごとに経口投与した。ロナファルニブの投与量は１５０ｍｇ／ｍ２であったが、ただしＰｒｏＬｏｎ１の最初の４ヵ月間は１１５ｍｇ／ｍ２であったことを除く。
臨床試験研究試料は、ＰｒｏＬｏｎ１（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１４；Ｇｏｒｄｏｎら、２０１２）、トリプル療法（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１６）、ＰｒｏＬｏｎ２（Ｇｏｒｄｏｎら、２０１８）の頭文字をとった３つのカテゴリーに分けられ、ボストン小児病院においてオープンラベル単施設試験として順次実施した（既報の研究の詳細を参照）。すべての臨床試験において、患者にロナファルニブ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ又はＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ，Ｉｎｃ．又はＥｉｇｅｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）をカプセル又は液体懸濁液で１２±２時間ごとに経口投与した。ロナファルニブの投与量は１５０ｍｇ／ｍ２であったが、ただしＰｒｏＬｏｎ１の最初の４ヵ月間は１１５ｍｇ／ｍ２であったことを除く。
【0086】
トリプル療法試験では、経口プラバスタチン（プラバコール、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）とゾレドロン酸（ゾメタ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｉｎｃ）をロナファルニブと共に投与した。
【0087】
試料の盲検化及び採用基準（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）
アッセイの開発が確立されると、すべての試料をＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの技術スタッフによって盲検化された様式で評価した。繰り返し試料には異なるランダムなＩＤ番号を割り当てた。ＨＧ又はｎｏｎＨＧの接頭辞のないＩＤの割り当ては、分析のために提出され、ＨＧ及びｎｏｎＨＧの識別子に変換した。
アッセイの開発が確立されると、すべての試料をＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの技術スタッフによって盲検化された様式で評価した。繰り返し試料には異なるランダムなＩＤ番号を割り当てた。ＨＧ又はｎｏｎＨＧの接頭辞のないＩＤの割り当ては、分析のために提出され、ＨＧ及びｎｏｎＨＧの識別子に変換した。
【0088】
縦断的分析への採用には、試料セットにはベースラインと試験終了時の療法中の血漿試料を必要とした。ロナファルニブの投与量を比較するため、ＰｒｏＬｏｎ１の採用には、ベースラインの治療前、４ヵ月（投与量１１５ｍｇ／ｍ２）、及び試験終了時の試料（投与量１５０ｍｇ／ｍ２）を必要とした。ｐＫ分析に含めるため、試料セットには少なくとも１つのトラフ血漿試料及び１つのトラフ後血漿試料を必要とした。
【0089】
統計分析
データ要約は主に記述的なものであり、試料セット間の比較には、対応のあるスチューデントのＴ検定、２標本のＴ検定、及びピアソン相関を用いた。記述統計には、標本数、平均値、及び標準偏差が含まれる。統計的有意水準は両側ｐ＜０．０５とした。多重比較の調整は行わなかった。
データ要約は主に記述的なものであり、試料セット間の比較には、対応のあるスチューデントのＴ検定、２標本のＴ検定、及びピアソン相関を用いた。記述統計には、標本数、平均値、及び標準偏差が含まれる。統計的有意水準は両側ｐ＜０．０５とした。多重比較の調整は行わなかった。
【0090】
血漿プロジェリン濃度と生存との間の関係を評価するため、ベースライン時の年齢と性別との両方に対して調整した２つの分析を行った。１つ目は、時間依存の勾配パラメタリゼーションを持つジョイントモデルを実装し、これによりプロジェリンの変化を調整しながら、プロジェリンの現在値が生存に及ぼす影響を評価した。２つ目は、プロジェリンを時間依存の共変量として扱い、時間依存Ｃｏｘモデルを実装した。ベースライン直後に患者はプロジェリン量に影響を及ぼすと予想される治療を開始したため、ベースラインのプロジェリンのみによる生存アウトカムの評価は偏りのため実施しなかった。
【0091】
プロジェリンの減少及びロナファルニブ療法の期間と関連した平均余命の伸びを定量化するために、条件付き制限平均生存時間（ｃＲＭＳＴ）に基づく一連のランドマーク時点を利用した動的モデル（Ｄａｆｎｉ、２０１１）を提案するＹａｎｇら（２０２１）の方法論を利用した。この分析では、ベースライン時の性別及び年齢についても調整した。
【0092】
記述統計にはエクセルを使用した。時間依存的ＣｏｘモデルにはＳＡＳバージョン９．４を使用し、ジョイントモデリング及びｃＲＭＳＴ動的モデルにはそれぞれＲバージョン４．０．２のＪＭパッケージとｄｙｎｐｒｅｄパッケージとを用いた。
【0093】
実施例２：ＨＧＰＳ特異的血漿プロジェリンアッセイ
本実施例では、血漿試料中のプロジェリンを特異的かつ高感度に検出するためのイムノアッセイの開発と立証について説明する。
本実施例では、血漿試料中のプロジェリンを特異的かつ高感度に検出するためのイムノアッセイの開発と立証について説明する。
【0094】
血漿プロジェリン検出のための定量アッセイの開発及び立証
標準曲線及び報告範囲：ＳＭＣプロジェリンイムノアッセイ標準曲線を作成し、かつ信頼できる報告範囲を決定するために、組み換えプロジェリンを３０ｎｇ／ｍＬになるように緩衝液にスパイクし、２倍の段階で連続希釈し、３０，０００～２９ｐｇ／ｍＬの標準曲線を作成した（図２、パネルＡ及びＢ）。シグナルはＳＧＸＬｉｎｋソフトウェアで補間した。ダイナミック検出範囲は５９ｐｇ／ｍＬ（ＬＬｏＱ）～３０，０００ｐｇ／ｍＬ（ＵＬｏＱ）であった。（測定される濃度）／（期待される濃度）の平均値は１００％（範囲９５％～１０６）であり、５９ｐｇ／ｍＬ～３０，０００ｐｇ／ｍＬまで直線応答（Ｒ２＝０．９９８７）を観察した。その結果、すべての試料はこの範囲に収まるように標準希釈液で希釈した。具体的には、非ＨＧＰＳ試料は１：１又は１：２で評価し、ＨＧＰＳ試料は１：２５で希釈する際にＵＬｏＱ未満であった。
標準曲線及び報告範囲：ＳＭＣプロジェリンイムノアッセイ標準曲線を作成し、かつ信頼できる報告範囲を決定するために、組み換えプロジェリンを３０ｎｇ／ｍＬになるように緩衝液にスパイクし、２倍の段階で連続希釈し、３０，０００～２９ｐｇ／ｍＬの標準曲線を作成した（図２、パネルＡ及びＢ）。シグナルはＳＧＸＬｉｎｋソフトウェアで補間した。ダイナミック検出範囲は５９ｐｇ／ｍＬ（ＬＬｏＱ）～３０，０００ｐｇ／ｍＬ（ＵＬｏＱ）であった。（測定される濃度）／（期待される濃度）の平均値は１００％（範囲９５％～１０６）であり、５９ｐｇ／ｍＬ～３０，０００ｐｇ／ｍＬまで直線応答（Ｒ２＝０．９９８７）を観察した。その結果、すべての試料はこの範囲に収まるように標準希釈液で希釈した。具体的には、非ＨＧＰＳ試料は１：１又は１：２で評価し、ＨＧＰＳ試料は１：２５で希釈する際にＵＬｏＱ未満であった。
【0095】
希釈直線性：ＨＧＰＳの様々な試料希釈により血漿プロジェリンを一貫して測定するアッセイの能力を評価するため、ヒトＨＧＰＳ血漿試料（Ｎ＝３）をアッセイ緩衝液中で５倍、２５倍、及び１２５倍希釈にて３連で定量した（表１）。すべての患者試料は、試験したすべての希釈液で定量可能であり、最終のプロジェリンは１５，８３５ｐｇ／ｍＬ～５０，６１０ｐｇ／ｍＬの範囲であった。希釈の平均直線性は９８．２％であった（範囲９２～１１０）。非ＨＧＰＳ血漿（Ｎ＝４）は、ＬＬｏＱ超過を維持するために、無溶媒（ｎｅａｔ）に対して１：２の直線性について評価した。
【0096】
【表1】
【0097】
アッセイ内及びアッセイ間の変動：ＳＭＣプロジェリンイムノアッセイの精度を、複数日に複数回反復して、実行内（アッセイ内（ｉｎｔｒａ－ａｓｓａｙ））及び日々（アッセイ間（ｉｎｔｅｒ－ａｓｓａｙ））の血漿試料を確実に定量化するために決定した。アッセイ内変動（表２）は平均７％（範囲１～１６）のＣＶを示し、アッセイ間変動（表３）は平均１２％（範囲７～１８）のＣＶを示した。さらに、各臨床試験試料プレート（Ｎ＝３９）に対して２連で実行した高ＱＣおよび中ＱＣから、優れたアッセイ内精度が実証された。希釈補正した平均高ＱＣ値は１８２，５９３±１５，２２９ｐｇ／ｍＬのプロジェリンでＣＶは３．８％であり、中ＱＣ値は１８，８８０±２，２６０ｐｇ／ｍＬのプロジェリンでＣＶは５．８％であった。
【0098】
【表2】
【表3】
【0099】
ＨＧＰＳ特異的血漿プロジェリンアッセイの評価：ラミンＡの交差反応性及び試料の凍結融解の完全性
プロジェリンアッセイはラミンＡと交差反応しない：アッセイにおけるプロジェリンとラミンＡの検出の間の潜在的な交差反応性を評価するために、ヒト組み換えラミンＡを含むものとヒト組み換えプロジェリンを含むものの２つの１２ポイントの試料曲線を、各曲線に０ｐｇ／ｍＬの緩衝液のみのアンカーポイントをもつ、１０，０００ｐｇ／ｍＬから開始して９．８ｐｇ／ｍＬまで２倍連続希釈するＳＭＣプロジェリンイムノアッセイにて３連で実行した。このアッセイでは、ラミンＡに対する交差反応は検出されなかった。プロジェリンの回収範囲は、試験された様々な濃度で期待値の９７～１１１％であり、Ｒ２＝０．９９９１であった。したがって、プロジェリンの定量を競合又は干渉するラミンＡの存在によってシグナルが生成されることはなかった。
プロジェリンアッセイはラミンＡと交差反応しない：アッセイにおけるプロジェリンとラミンＡの検出の間の潜在的な交差反応性を評価するために、ヒト組み換えラミンＡを含むものとヒト組み換えプロジェリンを含むものの２つの１２ポイントの試料曲線を、各曲線に０ｐｇ／ｍＬの緩衝液のみのアンカーポイントをもつ、１０，０００ｐｇ／ｍＬから開始して９．８ｐｇ／ｍＬまで２倍連続希釈するＳＭＣプロジェリンイムノアッセイにて３連で実行した。このアッセイでは、ラミンＡに対する交差反応は検出されなかった。プロジェリンの回収範囲は、試験された様々な濃度で期待値の９７～１１１％であり、Ｒ２＝０．９９９１であった。したがって、プロジェリンの定量を競合又は干渉するラミンＡの存在によってシグナルが生成されることはなかった。
【0100】
天然プロジェリンと組み換えプロジェリンのスパイクの回収及び検出：天然プロジェリンと比較して組み換えプロジェリンを測定するアッセイの能力を評価するために、いずれかを、スパイクを受ける前に標準希釈液で５０倍に希釈される３つの異なる健康な非ＨＧＰＳドナー血漿試料にスパイクした。天然プロジェリンおよび組み換えプロジェリンの両方は、期待される範囲内で同様のプロジェリン回収率を示し、平均回収率はそれぞれ９６±６％と１２０±１５％であった（表４）。
【0101】
【表4】
【0102】
凍結融解の安定性：本研究で示される試料は、分析前に凍結されている。オフサイトアッセイを実施するため、凍結前試料のみが臨床試験で定期的に評価されると予想される。４回の凍結融解サイクルによる凍結融解分析では、プロジェリン間に差はみられなかった（すべてｐ＜０．０５）。
【0103】
古典的遺伝子型と非古典的遺伝子型
ＨＧＰＳの古典型と非古典型はともにプロジェリン産生型であり；古典型は内部スプライス部位の最適化によるものであり、非古典型は正準スプライス部位の非最適化によるものである。古典的遺伝子型（Ｇ６０８Ｇ、ｃ．１８２４Ｃ＞Ｔ；Ｎ＝７４）の小児のデータを、非古典的ＨＧＰＳ患者試料（ＬＭＮＡ ｃ．１８２２Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｇ６０８Ｓｘ２、ｃ．１９６８＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．１９６８＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．１９６８＋５Ｇ＞Ｃ）（Ｎ＝５；平均±ＳＤ＝２８，４０２±１１，６０１ｐｇ／ｍＬ）と比較した。ベースラインの療法離脱時（ｏｆｆ－ｔｈｅｒａｐｙ）のプロジェリンを古典的患者試料と比較すると（Ｎ＝７４、平均±ＳＤ＝３３，２４９±１２，２９９ｐｇ／ｍＬ）、すべての非古典的患者のプロジェリン量は古典的患者の量の範囲内に収まり、全体的な差は検出されなかった（ｐ＝０．３９）。同様に、療法によるベースラインから研究終了時までのプロジェリンの減少（４０．３～５７．５％）は、古典的な患者の範囲内であり、研究終了時の値は古典的な患者と差がなかった（ｐ＝０．８５）。
ＨＧＰＳの古典型と非古典型はともにプロジェリン産生型であり；古典型は内部スプライス部位の最適化によるものであり、非古典型は正準スプライス部位の非最適化によるものである。古典的遺伝子型（Ｇ６０８Ｇ、ｃ．１８２４Ｃ＞Ｔ；Ｎ＝７４）の小児のデータを、非古典的ＨＧＰＳ患者試料（ＬＭＮＡ ｃ．１８２２Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｇ６０８Ｓｘ２、ｃ．１９６８＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．１９６８＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．１９６８＋５Ｇ＞Ｃ）（Ｎ＝５；平均±ＳＤ＝２８，４０２±１１，６０１ｐｇ／ｍＬ）と比較した。ベースラインの療法離脱時（ｏｆｆ－ｔｈｅｒａｐｙ）のプロジェリンを古典的患者試料と比較すると（Ｎ＝７４、平均±ＳＤ＝３３，２４９±１２，２９９ｐｇ／ｍＬ）、すべての非古典的患者のプロジェリン量は古典的患者の量の範囲内に収まり、全体的な差は検出されなかった（ｐ＝０．３９）。同様に、療法によるベースラインから研究終了時までのプロジェリンの減少（４０．３～５７．５％）は、古典的な患者の範囲内であり、研究終了時の値は古典的な患者と差がなかった（ｐ＝０．８５）。
【0104】
プロジェリン定量におけるヘパリンナトリウム単離した血漿、Ｋ２ＥＤＴＡ単離した血漿、及び血清の間の類似性
このアッセイが様々な血液採取チューブの種類にわたってプロジェリン検出に適しているかどうかを評価するために、同じ患者の同じ採血（Ｎ＝３患者）からヘパリンナトリウム（血漿）、Ｋ２ＥＤＴＡ（血漿）を含み、かつ抗凝固剤を含まない（血清）チューブに採取した血液の比較分析を３連で実施した。ヘパリンナトリウム血漿とＥＤＴＡ血漿ではｐ＝０．９８であり、ヘパリンナトリウム血漿と血清ではｐ＝１．００であり、ＥＤＴＡと血清ではｐ＝０．９７であった。
このアッセイが様々な血液採取チューブの種類にわたってプロジェリン検出に適しているかどうかを評価するために、同じ患者の同じ採血（Ｎ＝３患者）からヘパリンナトリウム（血漿）、Ｋ２ＥＤＴＡ（血漿）を含み、かつ抗凝固剤を含まない（血清）チューブに採取した血液の比較分析を３連で実施した。ヘパリンナトリウム血漿とＥＤＴＡ血漿ではｐ＝０．９８であり、ヘパリンナトリウム血漿と血清ではｐ＝１．００であり、ＥＤＴＡと血清ではｐ＝０．９７であった。
【0105】
未治療患者における血漿プロジェリン検出
非ＨＧＰＳ血漿：非ＨＧＰＳ血漿（Ｎ＝６９；３９Ｍ（男性）、３０Ｆ（女性））を評価した（図３、パネルＡ）。この試料セットは、ＬＭＮＡ±ＺＭＰＳＴＥ２４変異分析を用いてＨＧＰＳ又は非ＨＧＰＳのプロジェロイドラミノパチー（ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｙ：ＰＬ）について評価した３３人のドナー、変異について評価されたものの３２人の健康な親族、及び市販で購入した健康なコントロールからの４個の血漿試料からなる。ＨＧＰＳ又はＰＬについて評価されたドナーの中には、プロジェリン産生変異を持つものはいなかった。全体の平均プロジェリンは３５１±２５１ｐｇ／ｍＬ（範囲＝ＮＤ－１５３４）であった。ドナーの平均年齢は２３．３±１８．７歳（範囲０．２～７１．３）であった。ドナーの年齢とプロジェリンとの間に相関はなかった（ｒ＝０．３、ｐ＝０．８１）。
非ＨＧＰＳ血漿：非ＨＧＰＳ血漿（Ｎ＝６９；３９Ｍ（男性）、３０Ｆ（女性））を評価した（図３、パネルＡ）。この試料セットは、ＬＭＮＡ±ＺＭＰＳＴＥ２４変異分析を用いてＨＧＰＳ又は非ＨＧＰＳのプロジェロイドラミノパチー（ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｙ：ＰＬ）について評価した３３人のドナー、変異について評価されたものの３２人の健康な親族、及び市販で購入した健康なコントロールからの４個の血漿試料からなる。ＨＧＰＳ又はＰＬについて評価されたドナーの中には、プロジェリン産生変異を持つものはいなかった。全体の平均プロジェリンは３５１±２５１ｐｇ／ｍＬ（範囲＝ＮＤ－１５３４）であった。ドナーの平均年齢は２３．３±１８．７歳（範囲０．２～７１．３）であった。ドナーの年齢とプロジェリンとの間に相関はなかった（ｒ＝０．３、ｐ＝０．８１）。
【0106】
ＨＧＰＳの薬物ナイーブ（ｎａｉｖｅ（治療未経験））患者における血漿プロジェリン：治験薬投与開始前のベースラインでＨＧＰＳ患児の血漿プロジェリンのプロファイルを評価した（図３、パネルＢ）。平均プロジェリンは全体で３３，２４９±１２，２９９ｐｇ／ｍＬ（Ｎ＝７４）であり、女性は３３，２３７±１１，７９７（Ｎ＝３７）であり、男性は３３，２８５±１３，０３５（Ｎ＝３７）であった。プロジェリンと性別との間に関連はみられなかった。ＨＧＰＳの平均プロジェリンは非ＨＧＰＳの９５倍増加した（ｐ＜０．０００１）。個々の試験では、治療ナイーブのプロジェリンのベースライン平均値は、ＰｒｏＬｏｎ１（Ｎ＝２６）では２７，５７２±７，５４２ｐｇ／ｍＬであり、トリプル療法（Ｎ＝１３）では３１，４６４±１６，９５８ｐｇ／ｍＬであり、ＰｒｏＬｏｎ２（Ｎ＝３５）では３８，１５４±１１，５４６ｐｇ／ｍＬであった。ＰｒｏＬｏｎ１又はＰｒｏＬｏｎ２とトリプル療法を比較した場合、プロジェリンに有意差はなかったが（それぞれｐ＝０．４４及び０．１２）、ベースライン値はＰｒｏＬｏｎ２の方がＰｒｏＬｏｎ１より高かった（ｐ＜０．０００１）。年齢と性別を一致させたコントロールからなるサブグループ比較でも、ＨＧＰＳ（プロジェリン＝３４，５１２±１４，４３２ｐｇ／ｍＬ、Ｎ＝２５）と非ＨＧＰＳコントロール量（プロジェリン＝３７７±２２６ｐｇ／ｍＬ、Ｎ＝１３、ｐ＜０．０００１）の間に非常に有意な差があることが示された。
【0107】
血漿プロジェリンと年齢：ほとんどの患者は、ＢＣＨ試験施設で臨床試験薬の投与直前に単一のベースライン試料を提供したが、一部の患者は、ＢＣＨ試験の提供前に国立衛生研究所（ＮＩＨ）臨床センターで実施された自然史研究（ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ）の一環として血液試料も提供した（Ｍｅｒｉｄｅｔｈら）；したがって薬物療法の影響を受けずプロジェリンの長期評価が可能となった。これらの試料をその後、ＰＲＦの細胞・組織バンク（ＰＲＦ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）に提出した。ＮＩＨ研究の血液試料は臨床試験試料と同様に処理された。平均採血間隔は１．６±０．５年（範囲０．９～２．３）であった。初回及び追跡時の血漿プロジェリン（Ｎ＝１３）の平均は、それぞれ２９，２２１±７，７７２ｐｇ／ｍＬと３３，２７２±１１，９５９ｐｇ／ｍＬであり、時間の経過に伴うプロジェリンの有意差は認められなかった（ｐ＝０．１４）。
【0108】
実施例３：ＨＧＰＳ治療の有効性を決定するための血漿プロジェリンアッセイ
この実施例では、開発されたプロジェリンイムノアッセイを、ＦＴＩロナファルニブなどのＨＧＰＳの治療有効性の決定に用いる可能性を検討する。
この実施例では、開発されたプロジェリンイムノアッセイを、ＦＴＩロナファルニブなどのＨＧＰＳの治療有効性の決定に用いる可能性を検討する。
【0109】
外因性ロナファルニブはプロジェリンアッセイを干渉しない：血漿プロジェリンの変化が血漿プロジェリン量に対するロナファルニブ療法の影響を真に反映しているかどうかを評価するため、ロナファルニブ自体がプロジェリンアッセイの測定値を干渉するかどうかを評価した。臨床試験中にロナファルニブで治療されたＨＧＰＳの小児における薬物動態試験から決定されたＣｍａｘは２．６４μｇ／ｍＬであったため（Ｇｏｒｄｏｎ、２０１２）、血漿試料にはＣｍａｘの３倍である７．９２μｇ／ｍＬのロナファルニブをスパイクした。平均プロジェリンは、コントロールの条件と比較して、ＤＭＳＯ中のロナファルニブでスパイクしても影響を受けなかった（ｐ＝０．１９８；表５）。
【0110】
【表5】
【0111】
ロナファルニブ療法によるプロジェリンの変化：ＰｒｏＬｏｎ１は、ＨＧＰＳを有する小児にロナファルニブを投与した最初の臨床試験であり、トリプル療法及びＰｒｏＬｏｎ２とはいくつかの相違点があった。患者は４ヵ月ごとに試験施設を訪れ、合計２．２±０．１年間（７回来院）採血を受けた。これに対し、トリプル療法では６ヵ月ごとに合計３．５±０．２年間（５回来院）であり、ＰｒｏＬｏｎ２ではベースライン＋試験終了時の２．４±０．６年間に採血を受けた（２回来院）。さらに、ＰｒｏＬｏｎ１の患者は１１５ｍｇ／ｍ２で４ヵ月間治療を開始し、その後１５０ｍｇ／ｍ２に増量した。トリプル試験及びＰｒｏＬｏｎ２の両方は、患者を１５０ｍｇ／ｍ２で開始した。試料数は個々の研究及び来院によって異なる；研究来院間の比較には、一致した血漿セットのみが含まれる。プロジェリンの変化を、別個の、しかし連続した試験内と試験間で比較した（図４、パネルＡ～Ｄ）。全体として、療法中の血漿プロジェリンの平均は、ベースラインの未治療時から３８％減少し、３２，７２６±１２，６５９から２０，２１１±１０，１９０ｐｇ／ｍＬとなった（ｐ＜０．０００１）。
【0112】
ロナファルニブ療法によるＰｒｏＬｏｎ１プロジェリンの変化：平均プロジェリンは、１１５ｍｇ／ｍ２のロナファルニブを用いた投与期間中の４ヵ月目に、ベースラインから４８％減少した（Ｎ＝２５、ｐ＜０．０００１、図４、パネルＡ）。ロナファルニブの用量が１５０ｍｇ／ｍ２であった残りの５人の患者の各来院について、ベースラインからの平均減少率は５０～６２％であった（Ｎ＝２２～２５人、すべてｐ＜０．０００１）。重要なことは、１１５ｍｇ／ｍ２の投与から１５０ｍｇ／ｍ２の投与に移行した後４ヵ月の８ヵ月目の試験来院で、プロジェリンが有意に近いレベルまでさらに減少したことであり（Ｎ＝２５、ｐ＝０．０６）、その後の４回の試験来院では、ロナファルニブを１１５ｍｇ／ｍ２投与を超えて１５０ｍｇ／ｍ２投与する間にプロジェリンが有意に減少した（Ｎ＝２２～２５人、すべてｐ＜０．０５）。８ヵ月目の１５０ｍｇ／ｍ２の来院での平均プロジェリンと、それ以降の同投与量の来院での平均プロジェリンとの間に有意差は認められなかった（Ｎ＝２２～２５人、すべてｐ≧０．０５）。この用量応答により、１１５ｍｇ／ｍ２よりも１５０ｍｇ／ｍ２投与の方が漸増的ではあるが有意な利益を検出するアッセイの能力が実証される。
【0113】
ロナファルニブ＋プラバスタチン＋ゾレドロン酸療法（トリプル療法）によるプロジェリンの変化：６ヵ月後の最初の療法中（ｏｎ－ｔｈｅｒａｐｙ）の試験来院では、平均プロジェリンはベースラインから４１％減少した（Ｎ＝１３、ｐ＝０．００１８；図４、パネルＢ）。その後、平均プロジェリンはベースラインから３５～４７％有意な減少を維持した（Ｎ＝１２～１３人、３～５回来院、ｐ＝０．００１５～０．００５８）。
【0114】
正式なトリプル療法期間が終了した後、プラバスタチンとゾレドロン酸とは中止され、１０人の患者がさらに４．１±０．５年間のロナファルニブ単剤療法の延長を完了した（範囲３．４１～４．６５；図４、パネルＢ）。これら１０人の患者では、連続したトリプル療法と治療中（ｏｎ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のロナファニブ単独療法の延長試験来院の間に、平均プロジェリンに有意差はみられなかった（ｐ＝０．９９）。
【0115】
ロナファルニブ療法によるＰｒｏＬｏｎ２プロジェリンの変化：平均プロジェリンは投与期間中、ベースラインから３６．７％減少した（Ｎ＝２６、ｐ＜０．０００１；図４、パネルＣ）。
【0116】
プロジェリンに対するロナファルニブの長期療法の効果：１３人の被検体のサブグループは、ＰｒｏＬｏｎ１、トリプル療法試験、及びトリプル試験のロナファルニブ単剤療法延長試験の一部として、治療を中断することなくロナファルニブによる治療を継続した（図４、パネルＤ）。これは、平均９．８±０．５年（範囲９．０～１０．３年）のロナファルニブ継続治療を構成する。平均プロジェリンは、１１５ｍｇ／ｍ２を使用する投与期間中、４ヵ月目にベースラインから４８％減少した（ｐ＜０．０００１）。その後のすべての時点において、１５０ｍｇ／ｍ２投与中にベースラインからの平均減少は５６～７４％の範囲であった（ｐ＜０．０００１）。１５０ｍｇ／ｍ２の最初の時点（０．６６年の時点＃３）と比較すると、時点５、８、及び９は有意に低く（ｐ＜０．０５）、他のすべての時点（４、６、７、１０～１３）は時点＃３と同様であった（ｐ≧０．０５）。
【0117】
薬物動態研究によるプロジェリンの日内変動：ロナファルニブ投与量１１５ｍｇ／ｍ２及び１５０ｍｇ／ｍ２のＰｒｏＬｏｎ１（Ｇｏｒｄｏｎ、２０１２）及びトリプル療法（Ｇｏｒｄｏｎ、２０１６）期間中、ｐＫ研究のためにトラフ時及び投与後１、２、４、６、８時間に血漿を採取した。これらの各試料セット内で、プロジェリンは、１５０ｍｇ／ｍ２のＰｒｏＬｏｎ１及びトリプル療法で投与後の量とトラフ量との間に有意な変化を示さず、プロジェリンは日内変動を実施しないことを示している（すべてｐ≧０．０５）。ＰｒｏＬｏｎ１の１１５ｍｇ／ｍ２のロナファルニブ投与量の場合、平均プロジェリントラフは投与後１時間と同程度であったが（ｐ＝０．２６４７）、投与後２、４、８時間よりも有意に低く、平均で約３，０００ｐｇ／ｍＬの差があった（すべてｐ＜０．０５）。
【0118】
実施例４：プロジェリン量は生存と強い関連がある
この実施例では、血漿プロジェリンが生存の予測バイオマーカーとして機能するのに適しているかどうかを評価する。第１に、プロジェリン測定値の変化に対する死亡リスクの変化を、これら２つの測定値を関連付けるジョイントモデルから直接推定した。療法の実施の有無、療法の期間、又は追跡期間にかかわらず、血漿試料のある全患者を含めた（Ｎ＝７４、２０２２年４月１日現在、死亡２６人、生存４７人）。プロジェリン量は死亡リスクと有意に関連していた（ｐ＜０．０００１；図５）。例えば、血漿プロジェリンが１，０００ｐｇ／ｍＬ減少すると死亡リスクが６．３％減少し（９５％ＣＩは４．７～７．８％）、一方、血漿プロジェリンが１０，０００ｐｇ／ｍＬ減少すると死亡リスクが４７．６％減少する（９５％ＣＩ：３８．４～５５．４％）。プロジェリンは、療法の期間、療法の期間の２乗、性別、及びベースライン時の年齢の関数としてモデル化した。ジョイントモデルでは療法の期間について調整した。縦断的共変量（プロジェリン）の潜在的な測定誤差を考慮しない標準的な時間依存Ｃｏｘモデリングを用いた追加分析、並びに療法中（ｏｎ－ｔｈｅｒａｐｙ）の血漿試料が少なくとも１つある患者のみを用いたサブグループ分析で、同様の結果が得られた（図６、表６）。
この実施例では、血漿プロジェリンが生存の予測バイオマーカーとして機能するのに適しているかどうかを評価する。第１に、プロジェリン測定値の変化に対する死亡リスクの変化を、これら２つの測定値を関連付けるジョイントモデルから直接推定した。療法の実施の有無、療法の期間、又は追跡期間にかかわらず、血漿試料のある全患者を含めた（Ｎ＝７４、２０２２年４月１日現在、死亡２６人、生存４７人）。プロジェリン量は死亡リスクと有意に関連していた（ｐ＜０．０００１；図５）。例えば、血漿プロジェリンが１，０００ｐｇ／ｍＬ減少すると死亡リスクが６．３％減少し（９５％ＣＩは４．７～７．８％）、一方、血漿プロジェリンが１０，０００ｐｇ／ｍＬ減少すると死亡リスクが４７．６％減少する（９５％ＣＩ：３８．４～５５．４％）。プロジェリンは、療法の期間、療法の期間の２乗、性別、及びベースライン時の年齢の関数としてモデル化した。ジョイントモデルでは療法の期間について調整した。縦断的共変量（プロジェリン）の潜在的な測定誤差を考慮しない標準的な時間依存Ｃｏｘモデリングを用いた追加分析、並びに療法中（ｏｎ－ｔｈｅｒａｐｙ）の血漿試料が少なくとも１つある患者のみを用いたサブグループ分析で、同様の結果が得られた（図６、表６）。
【0119】
【表6】
【0120】
次に、ロナファルニブ治療期間と血漿プロジェリンの変化の程度による平均余命の変化との間の関係を評価した（図７、表７）。この分析には、療法前のベースライン及び治療中の少なくとも１回のプロジェリン測定を受けた患者の試料が含まれた（Ｎ＝６５人の患者）。血漿プロジェリンの減少の程度と、プロジェリン量が低い状態で過ごす時間の両方によって平均余命は徐々に改善した。図４には、治療が１０年間にわたる療法中のプロジェリン減少の代表的な３つの広範囲な例（１，０００、１０，０００、１５，０００ｐｇ／ｍＬ）がグラフ化されている。３つの例すべてで患者の寿命が延長した。
【0121】
【表7】
【0122】
【0123】
開示された本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、図示された実施形態は本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって本発明者らは、これらの請求項の範囲及び精神に含まれるすべてのものを発明として主張する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】