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▶ ザ トラスティース オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨークの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】最初の細胞を標的とする二重特異性分子
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20250109BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20250109BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20250109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250109BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250109BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/30
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N5/10
A61K39/395 Y
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 T
A61K47/68
A61K38/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539913
(86)(22)【出願日】2022-12-30
(85)【翻訳文提出日】2024-07-12
(86)【国際出願番号】 US2022082628
(87)【国際公開番号】W WO2023130073
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】63/295,681
(32)【優先日】2021-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501306715
【氏名又は名称】ザ トラスティース オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラザ、アズラ
(72)【発明者】
【氏名】アリ、アブドゥラ、エム．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA45
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084CA53
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA14
4C085AA26
4C085AA27
4C085BB11
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045EA51
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本明細書に記載の主題は、最初の細胞の表面上の異なる組織系統の２つの抗原マーカーを認識する二重特異性分子を使用して、がんの処置を必要とする対象のがんを処置する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二重特異性分子であって、少なくとも２つの抗原結合領域を含み、各抗原結合領域が、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する、前記二重特異性分子。
【請求項2】
第１の抗原が、上皮細胞系統マーカーである、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項3】
前記上皮細胞系統マーカーが、図２のマーカーのいずれか１つである、請求項２に記載の二重特異性分子。
【請求項4】
前記上皮細胞系統マーカーが、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項２に記載の二重特異性分子。
【請求項5】
ＥｐＣＡＭが、配列番号７または配列番号１２を含む、請求項４に記載の二重特異性分子。
【請求項6】
第２の抗原が、マクロファージ細胞系統マーカーである、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項7】
前記マクロファージ細胞系統マーカーが、図１のマーカーのいずれか１つである、請求項６に記載の二重特異性分子。
【請求項8】
前記マクロファージ細胞系統マーカーが、ＣＤ１６３である、請求項６に記載の二重特異性分子。
【請求項9】
ＣＤ１６３が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む、請求項８に記載の二重特異性分子。
【請求項10】
前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項１～９のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項11】
前記がんが、乳癌、脳癌、消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項12】
前記消化器癌が、胃癌または大腸癌である、請求項１１に記載の二重特異性分子。
【請求項13】
前記がんが、液体癌を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項14】
前記液体癌が、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項１３に記載の二重特異性分子。
【請求項15】
前記液体癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１３に記載の二重特異性分子。
【請求項16】
前記液体癌が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項１３に記載の二重特異性分子。
【請求項17】
前記液体癌が、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である、請求項１３に記載の二重特異性分子。
【請求項18】
第１の抗原結合領域が、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１～１７のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項19】
第２の抗原結合領域が、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１８に記載の二重特異性分子。
【請求項20】
第２の抗原結合領域が、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１８に記載の二重特異性分子。
【請求項21】
第１の抗原結合領域が、配列番号２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項１～１７のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項22】
第２の抗原結合領域が、配列番号３０の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２９の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項２１に記載の二重特異性分子。
【請求項23】
第２の抗原結合領域が、配列番号３２の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号３１の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項２１に記載の二重特異性分子。
【請求項24】
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、マクロファージ細胞系統マーカーである、請求項１３～１７に記載の二重特異性分子。
【請求項25】
前記第１の抗原が、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、またはＣＤ１２３であり、前記第２の抗原が、ＣＤ１６３である、請求項２４に記載の二重特異性分子。
【請求項26】
ＴＦＣが、転移性ＴＦＣである、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項27】
前記二重特異性分子が、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～２６のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項28】
前記二重特異性抗体が、薬物にコンジュゲートされている、請求項２７に記載の二重特異性分子。
【請求項29】
前記薬物が、毒素である、請求項２８に記載の二重特異性抗体。
【請求項30】
前記薬物が、化学療法剤である、請求項２８に記載の二重特異性抗体。
【請求項31】
前記二重特異性分子が、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む、請求項１～２６のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項32】
前記二重特異性分子が、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１～２６のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項33】
前記二重特異性分子が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがそれぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する、請求項１～２６のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項34】
前記第１のポリペプチドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９を含む、請求項３３に記載の二重特異性分子。
【請求項35】
前記第２のポリペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、または配列番号２１を含む、請求項３３に記載の二重特異性分子。
【請求項36】
前記二重特異性ＣＡＲが、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである、請求項３２に記載の二重特異性分子。
【請求項37】
前記二重特異性分子が、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、及び第３ポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがそれぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、前記第３のポリペプチドが、ＣＡＲに結合し、前記第３のポリペプチドが、前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドに作動可能に連結されている、請求項１～２６に記載の二重特異性分子。
【請求項38】
前記二重特異性分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）モジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）モジュールを含むスプリットＣＡＲ－Ｔシステムを含み、前記ＣＡＲモジュールが、第１の抗原結合領域及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含み、
前記ＣＣＲモジュールが、第２の抗原結合領域及び２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含み、
前記ＣＡＲモジュール及び前記ＣＣＲモジュールがそれぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する、請求項１～２６に記載の二重特異性分子。
【請求項39】
前記スプリットＣＡＲ－Ｔシステムが、表４のポリペプチド配列のうちの１つ以上を含む、請求項２８に記載の二重特異性分子。
【請求項40】
請求項１～３９のいずれかに記載の二重特異性分子を含む、医薬組成物。
【請求項41】
請求項１～３９のいずれかに記載の二重特異性分子をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項42】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項43】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
【請求項44】
請求項１～３９のいずれかに記載の二重特異性分子を含む、遺伝子改変型細胞。
【請求項45】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変型細胞。
【請求項46】
がんの処置または予防を必要とする対象の前記がんを処置または予防する方法であって、前記方法が、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を前記対象に投与することを含み、各抗原結合領域が、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する、前記方法。
【請求項47】
第１の抗原が、上皮細胞系統マーカーである、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記上皮細胞系統マーカーが、図２のマーカーのいずれか１つである、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記上皮細胞系統マーカーが、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
ＥｐＣＡＭが、配列番号７または配列番号１２を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
第２の抗原が、マクロファージ細胞系統マーカーである、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記マクロファージ細胞系統マーカーが、図１のマーカーのいずれか１つである、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記マクロファージ細胞系統マーカーが、ＣＤ１６３である、請求項５１に記載の方法。
【請求項54】
ＣＤ１６３が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項４６～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記がんが、乳癌、脳腫瘍、胃腸癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記消化器癌が、胃癌または大腸癌である、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記がんが、液体癌である、請求項４６～５４に記載の方法。
【請求項59】
前記液体癌が、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記液体癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項61】
前記液体癌が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項５８に記載の方法。
【請求項62】
前記液体癌が、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項63】
第１の抗原結合領域が、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項４６～６２のいずれかに記載の方法。
【請求項64】
第２の抗原結合領域が、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
第２の抗原結合領域が、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項66】
第１の抗原結合領域が、配列番号２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項４６～６２のいずれかに記載の方法。
【請求項67】
第２の抗原結合領域が、配列番号３０の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２９の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
第２の抗原結合領域が、配列番号３２の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号３１の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項69】
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、マクロファージ細胞系統マーカーである、請求項５８～６２に記載の方法。
【請求項70】
前記第１の抗原が、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、またはＣＤ１２３であり、前記第２の抗原が、ＣＤ１６３である、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
ＴＦＣが、転移性ＴＦＣである、請求項４６に記載の方法。
【請求項72】
前記二重特異性分子が、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４６～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
前記二重特異性抗体が、薬物にコンジュゲートされている、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記薬物が、毒素である、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記薬物が、化学療法剤である、請求項７３に記載の方法。
【請求項76】
前記二重特異性分子が、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む、請求項４６～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
前記二重特異性分子が、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４６～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項78】
前記二重特異性分子が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する、請求項４６～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項79】
第１のポリペプチドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項80】
第２のポリペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、または配列番号２１を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項81】
二重特異性ＣＡＲが、ｓｙｎＮｏｔｃｈＣＡＲである、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記二重特異性分子が、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがそれぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、前記第３のポリペプチドが、前記二重特異性ＣＡＲに結合し、前記第３のポリペプチドが、前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドに作動可能に連結されている、請求項８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項83】
前記二重特異性分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）モジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）モジュールを含むスプリットＣＡＲ－Ｔシステムを含み、前記ＣＡＲモジュールが、第１の抗原結合領域及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含み、
前記ＣＣＲモジュールが、第２の抗原結合領域及び２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含み、
前記ＣＡＲモジュール及び前記ＣＣＲモジュールがそれぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する、請求項４６～７１に記載の方法。
【請求項84】
前記スプリットＣＡＲ－Ｔシステムが、表４のポリペプチド配列の１つ以上を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項85】
少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する、改変型細胞。
【請求項86】
前記少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーが、図２のマーカーのいずれか１つである、請求項８５に記載の細胞。
【請求項87】
前記少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーが、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項８５に記載の細胞。
【請求項88】
ＥｐＣＡＭが、配列番号７または配列番号１２を含む、請求項８７に記載の細胞。
【請求項89】
前記少なくとも１つマクロファージ細胞系統マーカーが、図１のマーカーのいずれか１つである、請求項８５～８８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項90】
前記少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーが、ＣＤ１６３である、請求項８５に記載の細胞。
【請求項91】
ＣＤ１６３が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む、請求項９０に記載の細胞。
【請求項92】
がんを診断する方法であって、前記方法が、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む、前記方法。
【請求項93】
前記少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーが、図２のマーカーのいずれか１つである、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーが、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項９２に記載の方法。
【請求項95】
ＥｐＣＡＭが、配列番号７を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記少なくとも１つマクロファージ細胞系統マーカーが、図１のマーカーのいずれか１つである、請求項９２～９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項97】
前記少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーが、ＣＤ１６３である、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
ＣＤ１６３が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記検出することが、二重特異性分子が前記少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び前記少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項100】
前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項９２～９９のいずれかに記載の方法。
【請求項101】
前記がんが、乳癌、脳癌、消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である、請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記消化器癌が、胃癌または大腸癌である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
前記がんが、液体癌である、請求項９２～９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項104】
前記液体癌が、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
前記液体癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項106】
前記液体癌が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項107】
前記液体癌が、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である、請求項１０３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／２９５，６８１号の利益及び優先権を主張し、この内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0002】
本特許開示は、著作権保護の対象となる資料を含有する。著作権所有者は、米国特許出願に記載されている特許文書または特許開示を、米国特許商標庁の特許ファイルまたは記録に記載されているとおりに、如何なる者が複写することにも異議を唱えないが、他の点では、ありとあらゆる著作権を留保する。
【0003】
引用されている全ての特許、特許出願、及び出版物は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。全体におけるこれらの刊行物の開示は、本明細書に記載の発明の日付時点で、本明細書で当業者らに既知の技術水準をより詳細に記載するために、それにより参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
がんは、異常な細胞成長を特徴とする一群の状態を指す。がん細胞は、体の他の臓器に広がり、侵入する可能性がある。がんの最も一般的な症状は、しこり、異常な出血、長引く咳、及び原因不明の体重減少を含む。細胞塊を形成しない血液がんも存在する。１００種類以上のがんが、ヒトの体内で発生し得、それらのほとんどは、不治である。
【発明の概要】
【0005】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を提供し、各抗原結合領域は、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。
【0006】
いくつかの実施形態では、第１の抗原は、上皮細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７または配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳癌、消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、消化器癌は、胃癌または大腸癌である。
【0008】
いくつかの実施形態では、がんは、液体癌を含む。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【0009】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３０の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２９の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３２の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号３１の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、またはＣＤ１２３であり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、転移性ＴＦＣである。
【0012】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、薬物は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。
【0013】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、または配列番号２１を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。
【0015】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）モジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）モジュールを含むスプリットＣＡＲ－Ｔシステムを含み、ＣＡＲモジュールが、第１の抗原結合領域及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＣＲモジュールが、第２の抗原結合領域及び２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＡＲモジュール及びＣＣＲモジュールが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲ－Ｔシステムは、表４のポリペプチド配列の１つ以上を含む。
【0016】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態による二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。
【0017】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態による二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0018】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態によるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0019】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態によるポリヌクレオチドを含むウイルスを提供する。
【0020】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態による二重特異性分子を含む遺伝子改変型細胞を提供する。
【0021】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態によるポリヌクレオチドを含む遺伝子改変型細胞を提供する。
【0022】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、それを必要とする対象におけるがんを処置または予防する方法を提供し、方法は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を対象に投与することを含み、各抗原結合領域が、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。
【0023】
いくつかの実施形態では、第１の抗原は、上皮細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７または配列番号１２を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳腫瘍、胃腸、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、消化器癌は、胃癌または大腸癌である。
【0026】
いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【0027】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３０の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２９の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３２の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号３１の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、またはＣＤ１２３であり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、転移性ＴＦＣである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【0031】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、薬物は、化学療法剤である。
【0032】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、または配列番号２１を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、二重特異性ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。
【0034】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）モジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）モジュールを含むスプリットＣＡＲ－Ｔシステムを含み、ＣＡＲモジュールが、第１の抗原結合領域及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＣＲモジュールが、第２の抗原結合領域及び２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＡＲモジュール及びＣＣＲモジュールが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲ－Ｔシステムは、表４のポリペプチド配列の１つ以上を含む。
【0035】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する改変型細胞を提供する。
【0036】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７または配列番号１２を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【0038】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、がんを診断する方法を提供し、方法は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７を含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、検出は、二重特異性分子が、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳癌、消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、消化器癌は、胃癌または大腸癌である。いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【0043】
図の１つ以上が、カラーで提示される。ＰＣＴ特許出願の要件に準拠するため、本明細書で提示されている図の多くは、元々カラーで作成された画像を白黒表示したものである。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1-1】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-2】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-3】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-4】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-5】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-6】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-7】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-8】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-9】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図1-10】優勢または排他的なマクロファージを発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図2-1】優勢または排他的な上皮を発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図2-2】優勢または排他的な上皮を発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図2-3】優勢または排他的な上皮を発現する抗原を示す。最後の２つの列では、「＋」は、発現が存在することを示し、「－」は、発現が存在しないことを示し、空白は、発現が不明であることを示す。
【図3】Ｃｏ－ＬＯＣＫＲの一実施形態を示す。Ａは、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲの立体配座の変化を示す。Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を動員するＣｏ－ＬＯＣＫＲを示す。
【図4】大きな細胞が選択されるサイズによる細胞の分離を示す。
【図5】系統特異的抗原（ＬＳＡ）を発現していない細胞（Ａ）、各ＬＳＡのみを発現している細胞（Ｂ及びＣ）、または両方の抗原を一緒に発現している細胞（Ｄ）の概略図を示す。個々のＬＳＡ発現の発現がない細胞または発現している細胞は、標的に対して試験された様々なモダリティの特異性を示すための対照として使用される。
【図6A】ＣＤ１６３（Ａ）もしくはＥｐＣＡＭ（Ｂ）、またはＣＤ１６３とＥｐＣＡＭの両方（Ｃ）、の発現のフローサイトメトリー分析を示す。左のパネルは、アイソタイプ対照を示し、右のパネルは、ＥｐＣＡＭ（クローン９Ｃ４、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５マウスモノクローナルＩｇＧ２；カタログ番号３２４２１３ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＣＤ１６３（クローンＲＭ３／１、ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナルＩｇＧ２；カタログ番号３２６５０６ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を認識する抗体を用いる染色を示す。
【図6B】ＣＤ１６３（Ａ）もしくはＥｐＣＡＭ（Ｂ）、またはＣＤ１６３とＥｐＣＡＭの両方（Ｃ）、の発現のフローサイトメトリー分析を示す。左のパネルは、アイソタイプ対照を示し、右のパネルは、ＥｐＣＡＭ（クローン９Ｃ４、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５マウスモノクローナルＩｇＧ２；カタログ番号３２４２１３ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＣＤ１６３（クローンＲＭ３／１、ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナルＩｇＧ２；カタログ番号３２６５０６ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を認識する抗体を用いる染色を示す。
【図6C】ＣＤ１６３（Ａ）もしくはＥｐＣＡＭ（Ｂ）、またはＣＤ１６３とＥｐＣＡＭの両方（Ｃ）、の発現のフローサイトメトリー分析を示す。左のパネルは、アイソタイプ対照を示し、右のパネルは、ＥｐＣＡＭ（クローン９Ｃ４、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５マウスモノクローナルＩｇＧ２；カタログ番号３２４２１３ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＣＤ１６３（クローンＲＭ３／１、ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナルＩｇＧ２；カタログ番号３２６５０６ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を認識する抗体を用いる染色を示す。
【図7】抗原Ａ（パネルＡ）または抗原Ｂ（パネルＢ）のいずれかを発現する細胞への、ケージ及びキーそれぞれの結合の概略図を示す。キーがケージと共局在していない場合、ケージは、閉じた立体配座になっており、ラッチを隔離する（パネルＡ）が、ラッチは、キー及びケージが同じ細胞上の抗原Ａ及びＢと共に共局在している場合、ケージから放出される（パネルＣ）。
【図8】Ｃｏ－ＬＯＣＫＲ構成要素であるケージ及びキータンパク質（パネルＡ）、またはケージ及びキータンパク質のバリアント（パネルＢ）、の様々な構成要素の概略図を示す。ＡまたはＢタンパク質への抗原結合ドメインは、最適な組み合わせを特定するように、ケージとキーの両方の組み合わせで作成される。
【図9】Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質の発現及び精製を示す。Ａ）クマシーＧ２５０染色ゲル。Ｂ）抗ＨＩｓ６抗体を使用した免疫ブロット。１）ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓプレステインプロテインラダー。２）Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿ＥｐＣＡＭ－ＳｃＦＶ＿ケージ（約６４ｋＤａ）。３）Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿キー＿ＥｐＣＡＭ－ＳｃＦＶ（約３８ｋＤａ）。４）Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿キー＿Ｎ３＿ＥｐＣＡＭ－ＳｃＦＶ（約３７ｋＤａ）。５）ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓプレステインプロテインラダー。６）Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿ＣＤ１６３－ＳｃＦＶ＿ケージ（約６２ｋＤａ）。７）Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿キー＿ＣＤ１６３－ＳｃＦＶ（約３５．８ｋＤａ）。８）Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿ＣＤ１６３－ＳｃＦＶ＿ケージ＿Ｉ２８７Ａ（約６２ｋＤａ）。９．Ｈｉｓ６＿ＴＥＶ＿キー＿Ｎ３＿ＣＤ１６３－ＳｃＦＶ（約３５．５ｋＤａ）。
【図10】ＣＡＲモジュール及びＣＣＲモジュールを発現するスプリットＣＡＲ－Ｔ細胞の結合の概略図を示す。スプリットＣＡＲ－Ｔは、抗原ＡとＢの両方を発現する標的細胞に結合する場合、活性化及び共刺激されて、Ａ及びＢを発現する細胞の根絶を生じる。スプリットＣＡＲ－ＴがＡまたはＢのいずれかを発現する細胞と結合すると、準最適な活性化が生じる。
【図11】スプリットＣＡＲ－ＴシステムのＣＡＲモジュール及びＣＣＲモジュールの様々な構成要素の概略図を示す。ＡまたはＢタンパク質への抗原結合ドメインは、最適な組み合わせを特定するように、ＣＡＲとＣＣＲの両方の組み合わせで作成される。
【発明を実施するための形態】
【0045】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を提供し、各抗原結合領域は、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。
【0046】
いくつかの実施形態では、第１の抗原は、上皮細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７または配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳癌、消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、消化器癌は、胃癌または大腸癌である。
【0048】
いくつかの実施形態では、がんは、液体癌を含む。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【0049】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３０の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２９の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３２の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号３１の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、またはＣＤ１２３であり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、転移性ＴＦＣである。
【0052】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、薬物は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。
【0053】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、または配列番号２１を含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。
【0055】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）モジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）モジュールを含むスプリットＣＡＲ－Ｔシステムを含み、ＣＡＲモジュールが、第１の抗原結合領域及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＣＲモジュールが、第２の抗原結合領域及び２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＡＲモジュール及びＣＣＲモジュールが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲ－Ｔシステムは、表４のポリペプチド配列の１つ以上を含む。
【0056】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態による二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。
【0057】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態による二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0058】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態によるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0059】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態によるポリヌクレオチドを含むウイルスを提供する。
【0060】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態による二重特異性分子を含む遺伝子改変型細胞を提供する。
【0061】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の任意の実施形態によるポリヌクレオチドを含む遺伝子改変型細胞を提供する。
【0062】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、それを必要とする対象におけるがんを処置または予防する方法を提供し、方法は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を対象に投与することを含み、各抗原結合領域が、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。
【0063】
いくつかの実施形態では、第１の抗原は、上皮細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７または配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳腫瘍、胃腸、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、消化器癌は、胃癌または大腸癌である。
【0065】
いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【0066】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＬ領域が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み、ＶＨ領域が、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３０の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号２９の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３２の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び配列番号３１の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、またはＣＤ１２３であり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。
【0069】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、転移性ＴＦＣである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【0070】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、薬物は、化学療法剤である。
【0071】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、または配列番号２１を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、二重特異性ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。
【0073】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）モジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）モジュールを含むスプリットＣＡＲ－Ｔシステムを含み、ＣＡＲモジュールが、第１の抗原結合領域及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＣＲモジュールが、第２の抗原結合領域及び２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含み、ＣＡＲモジュール及びＣＣＲモジュールが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲ－Ｔシステムは、表４のポリペプチド配列の１つ以上を含む。
【0074】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する改変型細胞を提供する。
【0075】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７または配列番号１２を含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【0077】
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、がんを診断する方法を提供し、方法は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭは、配列番号７を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１を含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、検出は、二重特異性分子が、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳癌、消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、消化器癌は、胃癌または大腸癌である。いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【0082】
がん細胞の特異的標的化は、がん分野における主要課題を有しており１。化学療法及び放射線療法などのがん処置の最も一般的なアプローチは、無差別であり、がん細胞と正常細胞（非がん細胞または健康な細胞）の両方を標的として、患者に多くの痛みを伴う副作用を経験させる。抗体及びキメラ抗原療法（ＣＡＲ－Ｔ）を含む免疫療法アプローチなどの、がん細胞を殺傷する標的化アプローチは、１つ以上の事前に決定された抗原を発現する細胞を正確に排除する能力を有する。しかし、最大の課題は、標的とすることができるがん細胞に特有の抗原を特定することである１、２。この課題は、がん細胞にのみ存在し、正常細胞には存在しない単一の固有の抗原が存在しないことに起因する。がん細胞を区別するための方策は、２つ以上の抗原を標的とすることを含む１。
【0083】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の主題は、ほとんどが自然的に発生しないという発見に関する。臓器または組織にストレスを加えると、ストレスを受けた細胞は、勇敢な生存方策を展開し得る。いくつかの実施形態では、これらの細胞生存方策の１つは、血液由来のマクロファージとの融合を含む３～６。このハイブリッド組織細胞及びマクロファージは、最初の細胞（ＴＦＣ）と呼ばれ、がん性成長を引き起こす。従って、がんは、必ずしも１つの細胞で生じるわけではなく、２つの細胞で生じ得る。
【0084】
いくつかの実施形態では、このＴＦＣは、ゲノム再構成及び再改変を受け、以下を含む複数の結果が生じる。
【0085】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、免疫システムを回避する能力を有する－ＴＦＣは、マクロファージマーカーを発現するので、免疫システムを回避し得る４、５、７～１３。
【0086】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、ハイブリッドであり、これは、両方の起源組織の特性を保持している。ＴＦＣは、マクロファージの１つの部分であるので、体中を自由に移動し得、転移と大きく関連し得る４、５、７～１３。
【0087】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、視覚的に識別することができる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、巨大な倍数体細胞として現れる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、固形腫瘍の１００％において巨大な倍数体細胞として観察することができる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の場合に、巨大な倍数体細胞として観察することができる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の場合に、巨大な倍数体細胞として観察することができる７。
【0088】
固形腫瘍では、ＴＦＣは、それが由来する上皮組織の少なくとも１つのマーカーと、マクロファージの少なくとも１つのマーカーを発現し得る５、１４。いくつかの実施形態では、上皮組織マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。ＥｐＣＡＭは、体の表面及び空洞を覆う上皮細胞に存在する。ＥｐＣＡＭは、上皮細胞の膜に及び得、細胞接着に重要である。いくつかの実施形態では、マクロファージマーカーは、ハプトグロビン－ヘモグロビン複合体のスカベンジャー受容体であるＣＤ１６３である。
【0089】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、他の腫瘍細胞とは異なる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とは異なる７。
【0090】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、ＣＡＭＬ（がん関連マクロファージ様細胞）またはＰＡＣＣ（多異数体がん細胞）またはＰＧＣＣ（多倍体巨大がん細胞）などとも呼ばれる７。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、融合細胞または巨大細胞と呼ばれることがある。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３マーカーを発現するという点で特異である７。ＥｐＣＡＭの発現は、上皮系統の細胞に限定され、ＣＤ１６３の発現は、マクロファージ系統の細胞に限定される。いくつかの実施形態では、これらの抗原の両方を発現する正常細胞は存在しない。
【0092】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、患者のがん療法の一部として、ＴＦＣを除去するために２つの抗原を標的とすることに関する。いくつかの実施形態では、抗原は、上皮細胞系統マーカー及びマクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、抗原は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、２つの抗原は、本明細書に記載の２つの抗原を認識する二重特異性分子のいずれか（限定されないが、２つの抗原を認識する二重特異性抗体を含む）により標的とされる。
【0093】
いくつかの実施形態では、これらの抗原のいずれかのみを発現する細胞を標的とすることを回避するために、ブール論理演算子ＡＮＤシステムを使用することができる。いくつかの実施形態では、このシステムは、両方の抗原（ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３）が存在するので、ＴＦＣのみを標的とする。いくつかの実施形態では、この方策は、ＣＤ１６３（マクロファージ系統）またはＥｐＣＡＭ（上皮系統）のいずれかのみを発現する細胞を見逃す。
【0094】
ブール演算子は、数学的なセット及びデータベース論理の基礎を形成して、検索用語の結合により、検索結果を絞り込むか、または広げることができる。基本的なブール演算子は３つある：ＡＮＤ、ＯＲ、及びＮＯＴ。ＡＮＤ演算子を使用すると、全ての検索用語が結果のレコードに存在する必要があるので、検索結果が絞り込まれるであろう。２つの状態のみを有する論理ベースモデルは、ブールモデルと呼ばれる。いくつかの実施形態では、集積回路の設計及び機能に主に使用されるブール論理ゲートの原理が、１つ以上の入力を感知し、これらの入力を統合して所望の生物学的出力を生成するために本明細書で実装される。いくつかの実施形態では、論理ＡＮＤゲートは、指定された全ての入力が存在する場合に出力を生成する。本明細書に開示の主題のいくつかの実施形態では、論理ＡＮＤゲートが分子回路の設計で実装されている。いくつかの実施形態では、抗原（入力）ＥｐＣＡＭとＣＤ１６３の両方が同じ細胞上に存在する場合にのみ、細胞傷害性応答（出力）を可能にすることができる。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＴＦＣ上の２つの抗原を標的とする場合、下記のアプローチの１つ以上を利用することができる。いくつかの実施形態では、アプローチは、大きな生体分子（例えば、タンパク質）に基づいている。いくつかの実施形態では、アプローチは、養子細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）に基づいている。
【0096】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の主題は、がん細胞を選択的に標的とする方法に関し、方法は、少なくとも２つの抗原結合領域を標的とすることを含み、各抗原結合領域が、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、上皮細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、図２のマーカーの１つ以上と、図１のマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、例えば、骨髄性白血病または骨髄起源のがんでは、第１の抗原及び第２の抗原は、双方ともに、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の両方のマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳腫瘍、胃癌及び大腸癌を含む消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、限定されないが、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、転移性ＴＦＣである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントは、毒素にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む共ラッチング直交ケージ－キータンパク質（Ｃｏ－ＬＯＣＫＲ）であり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。
【0097】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、それぞれの抗原に結合した後に、第１及び第２のポリペプチドの立体配座の変化がある。いくつかの実施形態では、立体配座の変化は、第３のポリペプチドが周囲のタンパク質にさらされるようにする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞の表面上に発現する。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲの第１及び第２のポリペプチドは、ＤＡＲＰｉｎドメインを使用して、がんのＴＦＣ上のそれぞれの抗原（例えば、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３）に結合する。
【0098】
本発明の二重特異性分子
特定の態様では、本発明は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を提供し、各抗原結合領域は、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。
特定の態様では、本発明は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を提供し、各抗原結合領域は、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。
【0099】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体、その機能的同等物、その抗原結合フラグメント、その誘導体、または抗体様二重特異性分子である。そのような分子は、当該技術分野で既知であり、全長重鎖及び軽鎖、全長重鎖、全長軽鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含むが、これらに限定されず、これらのそれぞれは、標的抗原、単一ドメイン抗体、または標的抗原に特異的な１つ以上のペプチドである。様々な二重特異性分子フォーマットが、例えば、以下の図２に記載されるように、当該技術分野で既知である：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ２０（Ｊｕｌｙ（７））（２０１５）８３８－８４７の図２と、Ｓｕｕｒｓ Ｆ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１９ Ｓｅｐ；２０１：１０３－１１９の図１（それぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の二重特異性分子は、免疫グロブリン（Ｉｇ）様二重特異性抗体及び小さな二重特異性分子を含むが、これらに限定されず、これらのほとんどは、Ｆｃ領域（限定されないが、二重ナノボディ、ＤＡＲＰｉｎ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む）を有さない。アフィボディ、ペプチド、及びＣｏ－ＬＯＣＫＲなどの代替品も多数ある。実際には、当業者らが理解するように、がんのＴＦＣ上の特定の抗原に高い親和性で結合するほぼ全ての分子が、抗原結合領域として使用することができる。二重特異性分子が特定の抗原に高い親和性で結合するかどうかを判定する方法は、当業者らに既知であり、これらは、ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅなどの直接的及び間接的な固相アッセイを含むが、これらに限定されない。
【0100】
ＩｇＧ抗体の構造上の性質は、２つの抗原結合部位があるものであり、これらは、双方ともに、同じエピトープに特異的である。それ故、それらは、単一特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は、その臨床治療効果がモノクローナル抗体よりも優れている可能性があるので、腫瘍免疫療法に幅広く応用されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、二重特異性抗体、その機能的同等物、その抗原結合フラグメント、その誘導体、または抗体様二重特異性分子に関し、これは、がん細胞上の２つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、その機能的同等物、その抗原結合フラグメント、その誘導体、または抗体様二重特異性分子は、ＴＦＣの表面上の２つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、一方の抗原は、上皮細胞系統マーカーであり、他方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、その機能的同等物、その抗原結合フラグメント、その誘導体、または抗体様二重特異性分子は、２つの異なる抗原（一方は、図１から選択され、他方は、図２から選択される）に結合する。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、その機能的同等物、その抗原結合フラグメント、その誘導体、または抗体様二重特異性分子は、図１から選択される２つの異なる抗原に結合する。
【0101】
いくつかの実施形態では、本発明は、２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を提供し、第１の抗原結合領域は、ＥｐＣＡＭに結合し、第２の抗原結合領域は、ＣＤ１６３に結合する。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の二重特異性分子は、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域のいずれかを含む。
【0102】
様々な種類の二重特異性抗体を生成するための様々なプラットフォームが存在する。二重特異性抗体を生成するいくつかの技術は、重鎖及び軽鎖の異種組み換えに基づいている。２つの異なる抗体の抗原結合部位から誘導される二重特異性抗体を生成するための様々な方策は、例えば、以下に記載されるように、当該技術分野で知られている：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ２０（Ｊｕｌｙ（７））（２０１５）８３８－８４７（これらの内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる）。
【0103】
特定の態様では、上記の二重特異性分子、二重特異性分子をコードするポリヌクレオチド、二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、遺伝子改変型細胞、形質転換もしくは形質導入宿主細胞を含む医薬組成物も提供され、これは、二重特異性分子及び／または二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含む。
【0104】
ＣＡＲ－Ｔ療法
キメラ抗原受容体技術（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、患者自身のＴ細胞が体内のがん細胞を攻撃するようにプログラムされるタイプのがん処置である。この療法では、患者の血液から、Ｔ細胞を採取することができる。患者の腕の静脈の血液を、アフェレシス装置に通す。これは、Ｔ細胞を含む白血球を除去し、残りの血液を患者に戻す。次に、実験室環境で、患者のがん細胞上の特定のタンパク質に結合する特定の受容体の遺伝子を、採取されたＴ細胞に導入することができる。受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる。これらの多数の改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞は、実験室環境に成長させることができ、患者の血流に注入することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、追加処置なしで、持続的な寛解が得られる成功率が３０％～４０％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＡＲ－Ｔ療法と組み合わせて投与することができる。
キメラ抗原受容体技術（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、患者自身のＴ細胞が体内のがん細胞を攻撃するようにプログラムされるタイプのがん処置である。この療法では、患者の血液から、Ｔ細胞を採取することができる。患者の腕の静脈の血液を、アフェレシス装置に通す。これは、Ｔ細胞を含む白血球を除去し、残りの血液を患者に戻す。次に、実験室環境で、患者のがん細胞上の特定のタンパク質に結合する特定の受容体の遺伝子を、採取されたＴ細胞に導入することができる。受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる。これらの多数の改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞は、実験室環境に成長させることができ、患者の血流に注入することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、追加処置なしで、持続的な寛解が得られる成功率が３０％～４０％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＡＲ－Ｔ療法と組み合わせて投与することができる。
【0105】
特定の態様では、本発明の二重特異性分子は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性ＣＡＲであり、各抗原結合領域は、がんの最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ＴＦＣの表面上の２つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、一方の抗原は、上皮細胞系統マーカーであり、他方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原（一方は、図１から選択され、他方は、図２から選択される）に結合する。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、図１から選択される２つの異なる抗原に結合する。
【0106】
いくつかの実施形態では、本発明は、２つの抗原結合領域を含む二重特異性ＣＡＲを提供し、第１の抗原結合領域は、ＥｐＣＡＭに結合し、第２の抗原結合領域は、ＣＤ１６３に結合する。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域のいずれかを含む。
【0107】
特定の態様では、上記の二重特異性ＣＡＲ、二重特異性ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、二重特異性ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、二重特異性ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、ならびに二重特異性ＣＡＲ及び／または二重特異性ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変型細胞を含む医薬組成物も提供される。
【0108】
いくつかの実施形態では、１つの抗原のみを発現する細胞を標的とすることを回避するアプローチを使用することができる。そのようなアプローチは、当該技術分野で既知であり、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲ、ＳｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲ細胞、及び組み合わせ抗原認識システムを含むが、これらに限定されない。
【0109】
Ｃｏ－ＬＯＣＫＲ細胞標的化
Ｃｏ－ＬＯＣＫＲは、ＡＮＤ、ＯＲ、及びＮＯＴの論理演算を実行する共局在依存性タンパク質スイッチである１５。システムは、合成タンパク質で作られた設計されたナノスケールデバイスを含み、これは、細胞表面マーカーの特有な所定の組み合わせで、細胞のみに治療薬または抗体を標的とする。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質スイッチは、細胞表面上でＡＮＤ論理を実施する。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質は、混合細胞集団内で２入力及び３入力の論理演算を実行する。いくつかの実施形態では、ラッチング直交ケージ－キータンパク質（ＬＯＣＫＲ）スイッチは、別の「キー」タンパク質の結合により「エフェクター」タンパク質への結合を可能にする立体配座の変化が誘導されるまで、「ラッチ」ドメインを使用して、機能ペプチドを不活性立体配座に隔離する構造「ケージ」タンパク質で構成される。いくつかの実施形態では、ケージ、キー、及びエフェクターは、３方向の平衡で結合し、スイッチの感度は、相対的なケージ－ラッチ親和性及びケージ－キー親和性を調整することにより調整することができる。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲシステムの追加の実施形態は、以下に記載されており：Ｌａｊｏｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｇｉｃ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０ Ｓｅｐ ２５；３６９（６５１１）：１６３７－１６４３（これらは、全文が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、合成タンパク質は、分離されると、効果を持たない分子スイッチである。しかし、それらは、標的細胞の表面で結合すると、立体配座が変化して、分子ビーコンが活性化される。細胞表面上のこれらのビーコンは、事前に決定された生物活性（例えば、細胞の除去）を、特定の標的細胞に誘導し得る。いくつかの実施形態では、これらの分子ビーコンは、図３Ａ～Ｂに示すように、分子ビーコンに特異的に結合するＣＡＲ－Ｔ細胞を動員する。いくつかの実施形態では、分子ビーコンは、Ｂｉｍ－Ｂｃｌ２システムを含む。いくつかの実施形態では、Ｂｉｍは、隔離されたペプチドとしてＬＯＣＫＲシステムのラッチにコードされる。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ２は、ＬＯＣＫＲシステムのエフェクターとして使用される。
Ｃｏ－ＬＯＣＫＲは、ＡＮＤ、ＯＲ、及びＮＯＴの論理演算を実行する共局在依存性タンパク質スイッチである１５。システムは、合成タンパク質で作られた設計されたナノスケールデバイスを含み、これは、細胞表面マーカーの特有な所定の組み合わせで、細胞のみに治療薬または抗体を標的とする。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質スイッチは、細胞表面上でＡＮＤ論理を実施する。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質は、混合細胞集団内で２入力及び３入力の論理演算を実行する。いくつかの実施形態では、ラッチング直交ケージ－キータンパク質（ＬＯＣＫＲ）スイッチは、別の「キー」タンパク質の結合により「エフェクター」タンパク質への結合を可能にする立体配座の変化が誘導されるまで、「ラッチ」ドメインを使用して、機能ペプチドを不活性立体配座に隔離する構造「ケージ」タンパク質で構成される。いくつかの実施形態では、ケージ、キー、及びエフェクターは、３方向の平衡で結合し、スイッチの感度は、相対的なケージ－ラッチ親和性及びケージ－キー親和性を調整することにより調整することができる。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲシステムの追加の実施形態は、以下に記載されており：Ｌａｊｏｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｇｉｃ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０ Ｓｅｐ ２５；３６９（６５１１）：１６３７－１６４３（これらは、全文が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、合成タンパク質は、分離されると、効果を持たない分子スイッチである。しかし、それらは、標的細胞の表面で結合すると、立体配座が変化して、分子ビーコンが活性化される。細胞表面上のこれらのビーコンは、事前に決定された生物活性（例えば、細胞の除去）を、特定の標的細胞に誘導し得る。いくつかの実施形態では、これらの分子ビーコンは、図３Ａ～Ｂに示すように、分子ビーコンに特異的に結合するＣＡＲ－Ｔ細胞を動員する。いくつかの実施形態では、分子ビーコンは、Ｂｉｍ－Ｂｃｌ２システムを含む。いくつかの実施形態では、Ｂｉｍは、隔離されたペプチドとしてＬＯＣＫＲシステムのラッチにコードされる。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ２は、ＬＯＣＫＲシステムのエフェクターとして使用される。
【0110】
いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲシステムは、システムのエフェクター分子として使用されるＢｃｌ２に結合するＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔシステムは、以下のアミノ酸配列を含むＢｃｌ２ ＣＡＲ配列を含む：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＳＡＨＡＧＲＴＧＹＤＮＲＥＩＶＭＫＹＩＨＹＫＬＳＱＲＧＹＥＷＤＡＧＤＤＡＥＥＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＶＶＨＲＡＬＲＤＡＧＤＤＦＥＲＲＹＲＲＤＦＡＥＭＳＳＱＬＨＬＴＰＤＴＡＲＱＲＦＥＴＶＶＥＥＬＦＲＤＧＶＮＷＧＲＩＶＡＦＦＥＦＧＧＶＭＣＶＥＳＶＮＲＥＭＳＰＬＶＤＮＩＡＥＷＭＴＥＹＬＮＲＨＬＨＴＷＩＱＤＮＧＧＷＤＡＦＶＥＬＹＧＰＳＭＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＭＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＧＧＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号１）。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＳＡＨＡＧＲＴＧＹＤＮＲＥＩＶＭＫＹＩＨＹＫＬＳＱＲＧＹＥＷＤＡＧＤＤＡＥＥＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＶＶＨＲＡＬＲＤＡＧＤＤＦＥＲＲＹＲＲＤＦＡＥＭＳＳＱＬＨＬＴＰＤＴＡＲＱＲＦＥＴＶＶＥＥＬＦＲＤＧＶＮＷＧＲＩＶＡＦＦＥＦＧＧＶＭＣＶＥＳＶＮＲＥＭＳＰＬＶＤＮＩＡＥＷＭＴＥＹＬＮＲＨＬＨＴＷＩＱＤＮＧＧＷＤＡＦＶＥＬＹＧＰＳＭＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＭＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＧＧＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号１）。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＬＯＣＫＲシステムのＢｃｌ２エフェクターは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＢｃｌ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＬＯＣＫＲシステムのＢｃｌ２エフェクターは、配列番号１の配列を含むＢｃｌ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＬＯＣＫＲシステムのＢｃｌ２エフェクターは、配列番号１の配列からなるＢｃｌ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ ＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔシステムの一部である。
【0112】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、がんの第１の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、一方の抗原は、上皮細胞系統マーカーであり、他方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３を認識する二重特異性Ｃｏ－ＬＯＣＫＲシステムの生成に関する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドが結合する上皮細胞系統マーカーは、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドが結合するマクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、図１から選択される任意の抗原に結合し、第２のポリペプチドは、図２から選択される任意の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、図１から選択される任意の抗原に結合し、第２のポリペプチドは、図１から選択される他の任意の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドが、がんのＴＦＣに結合すると、分子ビーコンは、例えば、キラーＴ細胞を誘導してがんのＴＦＣを殺傷するように活性化される。
【0113】
いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性Ｃｏ－ＬＯＣＫＲを提供し、第１のポリペプチドが、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域を含み、第２のポリペプチドは、ＣＤ１６３に結合する抗原結合領域を含む。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の二重特異性Ｃｏ－ＬＯＣＫＲは、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域のいずれかを含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性Ｃｏ－ＬＯＣＫＲを提供し、第１のポリペプチドが、キーまたはケージドメインと、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域を含み、第２のポリペプチドが、キーまたはケージドメインと、ＣＤ１６３に結合する抗原結合領域を含み、第１のポリペプチドがキードメインを含む場合、第２のポリペプチドが、ケージドメインを含むか、または、第１のポリペプチドがケージドメインを含む場合、第２のポリペプチドが、キードメインを含む。二重特異性Ｃｏ－ＬＯＣＫＲをコードする配列は、さらに、シグナルペプチド、精製タグ、及び／またはプロテアーゼ部位を含み得る。二重特異性Ｃｏ－ＬＯＣＫＲをそれを必要とする対象に投与する前に、シグナルペプチド及び／または精製タグが、任意のポリペプチドから切断または除去されることを、当業者は理解している。例示的なキードメイン及びケージドメイン、ならびにシグナルペプチド、精製タグ、及びプロテアーゼ部位は、例２に記載されている。
【0115】
特定の態様では、本明細書に記載のＣｏ－ＬＯＣＫＲ、本明細書に記載のＣｏ－ＬＯＣＫＲをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＣｏ－ＬＯＣＫＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、ならびに本明細書に記載のＣｏ－ＬＯＣＫＲ及び／または本明細書に記載のＣｏ－ＬＯＣＫＲをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変型細胞を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
スプリットＣＡＲ－Ｔ
スプリットＣＡＲ－Ｔ
【0116】
スプリットキメラ抗原受容体Ｔ細胞（スプリットＣＡＲ－Ｔ）システムは、２つのモジュール（ＣＡＲを含むモジュール及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）を含むモジュール）を含む。Ｔ細胞を完全に活性化するために、ＣＡＲとＣＣＲの両方の結合が必要となる。２つの異なる標的抗原を発現する標的細胞（例えば、第１の細胞）に対して、バランスのとれたシグナル伝達及び最大のＴ細胞細胞傷害活性を達成するために、ＣＡＲ及びＣＣＲを同じＴ細胞で発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲモジュールは、第１の抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインと、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲモジュールは、１）膜標的化のためのシグナルペプチド（ＧＭ－ＣＳＦまたはＣＤ８アルファ由来）、２）ＳｃＦｖ配列（抗ＥｐＣＡＭまたは抗ＣＤ１６３抗体のいずれか由来）、３）ヒンジ領域（ＣＤ８由来）、４）膜貫通ドメイン（ＣＤ８由来）、及び、５）ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン、を含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲモジュールは、第２の抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインと、２つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲモジュールは、１）膜標的化のためのシグナルペプチド（ＧＭ－ＣＳＦ由来）、２）ＳｃＦｖ配列（抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗ＣＤ１６３抗体のいずれか由来）、３）ヒンジ領域（ＣＤ２８由来）、４）膜貫通ドメイン（ＣＤ２８由来）、及び、５）ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び６）４－１ＢＢ共刺激ドメイン、を含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性スプリットＣＡＲ－Ｔを提供し、第１のポリペプチドが、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域を含み、第２のポリペプチドは、ＣＤ１６３に結合する抗原結合領域を含む。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の二重特異性スプリットＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域のいずれかを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性スプリットＣＡＲ－Ｔを提供し、第１のポリペプチドは、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域、ならびにスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含み、第２のポリペプチドは、ＣＤ１６３に結合する抗原結合領域、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、及び第２の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性スプリットＣＡＲ－Ｔを提供し、第１のポリペプチドは、ＣＤ１６３に結合する抗原結合領域、ならびにスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含み、第２のポリペプチドは、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、及び第２の共刺激ドメインを含む。ポリペプチド配列は、さらに、シグナルペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、ＣＤ２８ヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、第２の共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインである。シグナルペプチドが翻訳後処理中に任意のポリペプチドから切断または除去されることを、当業者は理解している。例示的なスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激ドメイン、ならびにシグナルペプチドは、例３に記載されている。
【0120】
いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性スプリットＣＡＲ－Ｔを提供し、第１のポリペプチドが、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域、ならびにＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含み、第２のポリペプチドが、ＣＡ１６３に結合する抗原結合領域、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性スプリットＣＡＲ－Ｔを提供し、第１のポリペプチドが、ＣＤ１６３に結合する抗原結合領域、ならびにＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含み、第２のポリペプチドが、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合領域、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【0121】
特定の態様では、本明細書に記載のスプリットＣＡＲ－Ｔ、本明細書に記載のスプリットＣＡＲ－Ｔをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のスプリットＣＡＲ－Ｔをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、ならびに本明細書に記載のスプリットＣＡＲ－Ｔ及び／または本明細書に記載のスプリットＣＡＲ－Ｔをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変型細胞、を含む医薬組成物も提供される。
【0122】
ＳｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲ細胞１６、１７
合成ノッチ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）経路は、哺乳動物細胞において事前に決定された機能的応答を駆動し得る。個々のｓｙｎＮｏｔｃｈ経路は、共通のシグナル伝達中間体を共有せず、これにより、経路が機能的に直交する。ブール応答プログラムを含む複数の外部キューの統合を達成するために、従って、複数のｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体を同じ細胞内で使用することができる。ＳｙｎＮｏｔｃｈ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、プライム及びキル分子回路である。ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体は、関連抗原が全て、標的細胞上に存在する場合にのみ、ＣＡＲ－Ｔ細胞を準備し、活性化する。これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、がん細胞のみを標的とし、正常細胞を見逃すことが可能になる。追加のＣＡＲベースのアプローチは、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲ１９、２０、ＲｅｖＣＡＲ２１、２２、及びＡｖｉｄＣＡＲを含む２３。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ＳｙｎＮｏｔｃｈＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、タンパク質スイッチのＣｏ－ＬＯＣＫＲシステムを使用して、二重特異性分子で標的化される。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、ｓｙｎＣＡＲシステム、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲシステム、ＲｅｖＣＡＲシステム、またはＡｖｉｄＣＡＲシステムを使用して、二重特異性分子で標的化される。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、コンビナトリアル抗原認識システムを使用する二重特異性抗体により標的とされる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、毒素にコンジュゲートされた二重特異性抗体により標的とされる。
合成ノッチ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）経路は、哺乳動物細胞において事前に決定された機能的応答を駆動し得る。個々のｓｙｎＮｏｔｃｈ経路は、共通のシグナル伝達中間体を共有せず、これにより、経路が機能的に直交する。ブール応答プログラムを含む複数の外部キューの統合を達成するために、従って、複数のｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体を同じ細胞内で使用することができる。ＳｙｎＮｏｔｃｈ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、プライム及びキル分子回路である。ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体は、関連抗原が全て、標的細胞上に存在する場合にのみ、ＣＡＲ－Ｔ細胞を準備し、活性化する。これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、がん細胞のみを標的とし、正常細胞を見逃すことが可能になる。追加のＣＡＲベースのアプローチは、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲ１９、２０、ＲｅｖＣＡＲ２１、２２、及びＡｖｉｄＣＡＲを含む２３。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ＳｙｎＮｏｔｃｈＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、タンパク質スイッチのＣｏ－ＬＯＣＫＲシステムを使用して、二重特異性分子で標的化される。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、ｓｙｎＣＡＲシステム、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲシステム、ＲｅｖＣＡＲシステム、またはＡｖｉｄＣＡＲシステムを使用して、二重特異性分子で標的化される。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、コンビナトリアル抗原認識システムを使用する二重特異性抗体により標的とされる。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、毒素にコンジュゲートされた二重特異性抗体により標的とされる。
【0123】
組み合わせ抗原認識システム１８
組み合わせ抗原認識システムは、改変型Ｔ細胞による選択的な腫瘍根絶を促進し得る。それにより、真に腫瘍特異的標的抗原が存在しない場合でも、改変型Ｔ細胞が腫瘍に特異的になることが可能になる。
組み合わせ抗原認識システムは、改変型Ｔ細胞による選択的な腫瘍根絶を促進し得る。それにより、真に腫瘍特異的標的抗原が存在しない場合でも、改変型Ｔ細胞が腫瘍に特異的になることが可能になる。
【0124】
ＤＡＲＰｉｎｓ
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、遺伝子改変型抗体模倣タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは、高い特異性及び高い親和性で標的タンパク質に結合する。それらは、多様な細胞機能に関与している結合タンパク質のクラスであるアンキリンリピートタンパク質から誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＤＡＲＰｉｎは、２つ以上のリピートポリペプチドモチーフから構成され、Ｎ末端キャップ及びＣ末端キャップで保護された疎水性コアを有する。
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、遺伝子改変型抗体模倣タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは、高い特異性及び高い親和性で標的タンパク質に結合する。それらは、多様な細胞機能に関与している結合タンパク質のクラスであるアンキリンリピートタンパク質から誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＤＡＲＰｉｎは、２つ以上のリピートポリペプチドモチーフから構成され、Ｎ末端キャップ及びＣ末端キャップで保護された疎水性コアを有する。
【0125】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性分子は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＤＡＲＰｉｎ分子であり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、がんの第１の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、一方の抗原は、上皮細胞系統マーカーであり、他方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３を認識する二重特異性ＤＡＲＰｉｎ分子を生成することに関する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドが結合する上皮細胞系統マーカーは、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドが結合するマクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、図１から選択される任意の抗原に結合し、第２のポリペプチドは、図２から選択される任意の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、図１から選択される任意の抗原に結合し、第２のポリペプチドは、図１から選択される他の任意の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性ＤＡＲＰｉｎ分子は、キラーＴ細胞を誘導してがんのＴＦＣを殺傷する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ抗原認識ドメインは、二重特異性ＤＡＲＰｉｎ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ＬＯＣＫＲシステムの抗原結合ドメインは、ＤＡＲＰｉｎを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞上のＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３に特異的に結合する１つ以上のＤＡＲＰｉｎが、１つ以上のＤＡＰＲｉｎライブラリをスクリーニングすることにより特定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＡＰＲｉｎライブラリが市販されている。
【0126】
一本鎖可変フラグメント
単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、１つ以上の免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。２つの鎖は、１０～約２５個のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドで連結することができる。リンカーは、柔軟性を目的にグリシンを豊富に含み、溶解性を目的にセリンまたはトレオニンを豊富に含み得る。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆も連結することができる。このタンパク質は、元の１つ以上の免疫グロブリンの特異性を保持する。ｓｃＦＶは、本明細書に記載のいずれかの二重特異性分子の抗原結合ドメインとして表現することができる。ｓｃＦｖは、ＣＡＲの抗原結合ドメインとして表現することができる。いくつかの実施形態では、多価ｓｃＦｖは、２つ以上のｓｃＦｖフラグメントを連結することにより設計することができる。いくつかの実施形態では、多価ｓｃＦｖは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ抗体構築物）として既知の二重特異性タンデムｓｃＦｖに設計することができる。
単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、１つ以上の免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。２つの鎖は、１０～約２５個のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドで連結することができる。リンカーは、柔軟性を目的にグリシンを豊富に含み、溶解性を目的にセリンまたはトレオニンを豊富に含み得る。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆も連結することができる。このタンパク質は、元の１つ以上の免疫グロブリンの特異性を保持する。ｓｃＦＶは、本明細書に記載のいずれかの二重特異性分子の抗原結合ドメインとして表現することができる。ｓｃＦｖは、ＣＡＲの抗原結合ドメインとして表現することができる。いくつかの実施形態では、多価ｓｃＦｖは、２つ以上のｓｃＦｖフラグメントを連結することにより設計することができる。いくつかの実施形態では、多価ｓｃＦｖは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ抗体構築物）として既知の二重特異性タンデムｓｃＦｖに設計することができる。
【0127】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性分子は、少なくとも２つのｓｃＦｖを含み、各ｓｃＦｖの抗原結合部位は、それぞれ、がんの第１の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、一方の抗原は、上皮細胞系統マーカーであり、他方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３を認識する少なくとも２つのｓｃＦｖを含む二重特異性分子を生成することに関する。いくつかの実施形態では、第１のｓｃＦＶが結合する上皮細胞系統マーカーは、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、第２のｓｃＦＶにより結合されるマクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、第１のｓｃＦＶは、図１から選択される任意の抗原に結合し、第２のｓｃＦＶは、図２から選択される任意の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、第１のｓｃＦＶは、図１から選択される任意の抗原に結合し、第２のｓｃＦＶは、図１から選択される他の任意の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖフラグメントは、キラーＴ細胞を誘導してがんのＴＦＣを殺傷する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ抗原認識ドメインは、二重特異性ｓｃＦｖフラグメントを含む。ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体分子の実施形態及び配列は、米国特許第７，６３２，９２５Ｂ２号に開示され、この内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる。ＣＤ１６３に特異的に結合する抗体分子の実施形態及び配列は、米国特許出願公開番号：ＵＳ２０１７／０１１９７９０Ａ１、ＵＳ９，７２４，４２６、及びＵＳ１１，０３４，７７０に開示されており、それぞれの内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0128】
薬物コンジュゲート二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、薬物コンジュゲート二重特異性抗体の生成に関する。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、毒素は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、エムタンシンである。いくつかの実施形態では、薬物は、メトトレキサート、チオグアニン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（ＡＲＡ－Ｃ）、シスプラチン、アクチノマイシンＤ、アントラサイクリン、またはビンカアルカロイドである。いくつかの実施形態では、薬物は、微小管破壊剤である。いくつかの実施形態では、微小管破壊剤は、アウリスタチンである。いくつかの実施形態では、微小管破壊剤は、メイタンシノイドを含む。いくつかの実施形態では、薬物は、ＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、カリケアマイシンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、デュオカルマイシンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ドキソルビシンである。いくつかの実施形態では、毒素は、標的がん細胞を殺傷する。いくつかの実施形態では、薬物は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して二重特異性抗体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬物は、二重特異性抗体に共有結合的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬物は、リンカーを介して抗体にコンジュゲートされる。抗体薬物コンジュゲートのさらなる実施形態は、以下に開示される：Ｋｈｏｎｇｏｒｚｕｌ，Ｐ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０２０，１８（１）：３－１９（全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、薬物コンジュゲート二重特異性抗体の生成に関する。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、毒素は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、エムタンシンである。いくつかの実施形態では、薬物は、メトトレキサート、チオグアニン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（ＡＲＡ－Ｃ）、シスプラチン、アクチノマイシンＤ、アントラサイクリン、またはビンカアルカロイドである。いくつかの実施形態では、薬物は、微小管破壊剤である。いくつかの実施形態では、微小管破壊剤は、アウリスタチンである。いくつかの実施形態では、微小管破壊剤は、メイタンシノイドを含む。いくつかの実施形態では、薬物は、ＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、カリケアマイシンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、デュオカルマイシンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ドキソルビシンである。いくつかの実施形態では、毒素は、標的がん細胞を殺傷する。いくつかの実施形態では、薬物は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して二重特異性抗体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬物は、二重特異性抗体に共有結合的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬物は、リンカーを介して抗体にコンジュゲートされる。抗体薬物コンジュゲートのさらなる実施形態は、以下に開示される：Ｋｈｏｎｇｏｒｚｕｌ，Ｐ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０２０，１８（１）：３－１９（全体が本明細書に組み込まれる）。
【0129】
いくつかの実施形態では、薬物コンジュゲート抗体療法の目的は、特定の担体を使用して、毒性の高い薬物を、その標的細胞に送達することである。いくつかの実施形態では、胃酸及び抗体のタンパク質分解酵素による分解を避けるために、静脈内から血流への、そのような療法の投与が行われる。いくつかの実施形態では、標的細胞が認識されると、薬物コンジュゲート抗体及びその抗原は、受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞内に内在化される。いくつかの実施形態では、内部化すると、遊離細胞毒性薬が細胞質に放出され、薬物が細胞機序を妨害し、アポトーシスを誘導し、及び／または最終的に細胞死を誘導する。
【0130】
特定の態様では、本発明の二重特異性分子は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む薬物コンジュゲート二重特異性抗体であり、各抗原結合領域は癌の最初の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＴＦＣの表面上の２つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、一方の抗原は、上皮細胞系統マーカーであり、他方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原（一方は、図１から選択され、他方は、図２から選択される）に結合する。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、図１から選択される２つの異なる抗原に結合する。
【0131】
いくつかの実施形態では、本発明は、２つの抗原結合領域を含む薬物コンジュゲート二重特異性抗体を提供し、第１の抗原結合領域は、ＥｐＣＡＭに結合し、第２の抗原結合領域は、ＣＤ１６３に結合する。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の薬物コンジュゲート二重特異性抗体は、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域のいずれかを含む。
【0132】
特定の態様では、上記の薬物コンジュゲート二重特異性抗体、薬物コンジュゲート二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、薬物コンジュゲート二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、薬物コンジュゲート二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、ならびに二重特異性抗体及び／または薬物コンジュゲート二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変型細胞を含む医薬組成物も提供される。
【0133】
改変型ハイブリッド細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞または細胞集団の改変に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３のいずれかのみ、またはＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３マーカーの両方を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、少なくとも２つのマーカーマクロファージ細胞系統を発現する細胞または細胞集団の改変に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのマーカーは、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせ及びＣＤ１６３のいずれかである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、両方の抗原を発現する改変型細胞を特異的に標的として、いずれかの抗原のみを発現する細胞を見逃すことを実証することに関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、二重特異性分子の特異性及び毒性を実証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイ研究を実施することに関する。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、マクロファージ細胞系統の少なくとも２つのマーカーを発現するように設計される。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、２つの異なる抗原（一方は、図１から選択され、他方は、図２から選択される）を発現する改変型細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、図１から選択される２つの異なる抗原を発現する改変型細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３マーカーの両方を発現する改変型細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、限定された系統特異的発現を示し、図１及び図２の抗原の組み合わせが使用される場合、潜在的に標的とすることができるいくつかの他の抗原の同定に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のがん処置アプローチは、全てのがんにおいて普遍的にＴＦＣを標的として、除去する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞または細胞集団の改変に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３のいずれかのみ、またはＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３マーカーの両方を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、少なくとも２つのマーカーマクロファージ細胞系統を発現する細胞または細胞集団の改変に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのマーカーは、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせ及びＣＤ１６３のいずれかである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、両方の抗原を発現する改変型細胞を特異的に標的として、いずれかの抗原のみを発現する細胞を見逃すことを実証することに関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、二重特異性分子の特異性及び毒性を実証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイ研究を実施することに関する。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、マクロファージ細胞系統の少なくとも２つのマーカーを発現するように設計される。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、２つの異なる抗原（一方は、図１から選択され、他方は、図２から選択される）を発現する改変型細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、図１から選択される２つの異なる抗原を発現する改変型細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、アッセイで使用される標的細胞は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３マーカーの両方を発現する改変型細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、限定された系統特異的発現を示し、図１及び図２の抗原の組み合わせが使用される場合、潜在的に標的とすることができるいくつかの他の抗原の同定に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のがん処置アプローチは、全てのがんにおいて普遍的にＴＦＣを標的として、除去する。
【0134】
抗原結合領域またはドメイン
抗体は、少なくとも２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭを除き、インタクト抗体は、通常、２つの同一の軽鎖（Ｌ）と２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。通常、各軽鎖は、ジスルフィド結合で重鎖に連結される。それぞれの重鎖及び軽鎖は、鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を、その後に、多数の定常領域を有する。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に、定常領域を有する。ほとんどの脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てることができる。抗体の可変ドメインは、抗体に結合特異性を付与し、特定の領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる固有の可変性を示す。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。抗体のインタクトな重鎖及び軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲによって結合された４つのＦＲをそれぞれ含む。各鎖のＣＤＲは、他の鎖のＣＤＲと共にＦＲ領域により密接に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に関与する。特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する場合、修飾されるべきヒト抗体中に存在するＦＲに非ヒト抗体由来のＣＤＲを移植することにより、可変領域をヒト化することができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体の６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体に対して変更された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を有し、これらは、元の抗体由来の１つ以上のＣＤＲから誘導された１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。
抗体は、少なくとも２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭを除き、インタクト抗体は、通常、２つの同一の軽鎖（Ｌ）と２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。通常、各軽鎖は、ジスルフィド結合で重鎖に連結される。それぞれの重鎖及び軽鎖は、鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を、その後に、多数の定常領域を有する。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に、定常領域を有する。ほとんどの脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てることができる。抗体の可変ドメインは、抗体に結合特異性を付与し、特定の領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる固有の可変性を示す。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。抗体のインタクトな重鎖及び軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲによって結合された４つのＦＲをそれぞれ含む。各鎖のＣＤＲは、他の鎖のＣＤＲと共にＦＲ領域により密接に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に関与する。特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する場合、修飾されるべきヒト抗体中に存在するＦＲに非ヒト抗体由来のＣＤＲを移植することにより、可変領域をヒト化することができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体の６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体に対して変更された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を有し、これらは、元の抗体由来の１つ以上のＣＤＲから誘導された１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【0135】
所望の標的（例えば、限定されないが、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３）に結合する抗体に由来する所望の標的に結合する抗原結合領域またはドメインに関して、これらの抗体の可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖の例示的なアミノ酸配列が以下に示される。それ故、当業者らは、該ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲを有する二重特異性分子、ならびに、これらの抗体により認識されるエピトープに結合可能な抗体及びその誘導体（ヒト化誘導体を含む）を構築することができる。
【0136】
親和性は、２つの作用物質の可逆的な結合の平衡定数を指し、ＫＤとして表される。いくつかの実施形態では、二重特異性分子及び／またはその抗原結合領域もしくはドメインは、ナノモル範囲（１０－７～１０－９Ｍ）以下の結合親和性（ＣＤ１６３またはＥｐＣＡＭに対するＫＤ（平衡解離定数）で測定）を示す。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、１０ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＤ１６３ポリペプチドに特異的に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、１０ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＥｐＣＡＭポリペプチドに特異的に結合する。
【0137】
ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン
ＥｐＣＡＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１６４２２）に対応するアミノ酸配列が、以下に提示される：
ＭＡＰＰＱＶＬＡＦＧＬＬＬＡＡＡＴＡＴＦＡＡＡＱＥＥＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮＣＦＶＮＮＮＲＱＣＱＣＴＳＶＧＡＱＮＴＶＩＣＳＫＬＡＡＫＣＬＶＭＫＡＥＭＮＧＳＫＬＧＲＲＡＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤＥＳＧＬＦＫＡＫＱＣＮＧＴＳＭＣＷＣＶＮＴＡＧＶＲＲＴＤＫＤＴＥＩＴＣＳＥＲＶＲＴＹＷＩＩＩＥＬＫＨＫＡＲＥＫＰＹＤＳＫＳＬＲＴＡＬＱＫＥＩＴＴＲＹＱＬＤＰＫＦＩＴＳＩＬＹＥＮＮＶＩＴＩＤＬＶＱＮＳＳＱＫＴＱＮＤＶＤＩＡＤＶＡＹＹＦＥＫＤＶＫＧＥＳＬＦＨＳＫＫＭＤＬＴＶＮＧＥＱＬＤＬＤＰＧＱＴＬＩＹＹＶＤＥＫＡＰＥＦＳＭＱＧＬＫＡＧＶＩＡＶＩＶＶＶＶＩＡＶＶＡＧＩＶＶＬＶＩＳＲＫＫＲＭＡＫＹＥＫＡＥＩＫＥＭＧＥＭＨＲＥＬＮＡ（配列番号２）。
ＥｐＣＡＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１６４２２）に対応するアミノ酸配列が、以下に提示される：
ＭＡＰＰＱＶＬＡＦＧＬＬＬＡＡＡＴＡＴＦＡＡＡＱＥＥＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮＣＦＶＮＮＮＲＱＣＱＣＴＳＶＧＡＱＮＴＶＩＣＳＫＬＡＡＫＣＬＶＭＫＡＥＭＮＧＳＫＬＧＲＲＡＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤＥＳＧＬＦＫＡＫＱＣＮＧＴＳＭＣＷＣＶＮＴＡＧＶＲＲＴＤＫＤＴＥＩＴＣＳＥＲＶＲＴＹＷＩＩＩＥＬＫＨＫＡＲＥＫＰＹＤＳＫＳＬＲＴＡＬＱＫＥＩＴＴＲＹＱＬＤＰＫＦＩＴＳＩＬＹＥＮＮＶＩＴＩＤＬＶＱＮＳＳＱＫＴＱＮＤＶＤＩＡＤＶＡＹＹＦＥＫＤＶＫＧＥＳＬＦＨＳＫＫＭＤＬＴＶＮＧＥＱＬＤＬＤＰＧＱＴＬＩＹＹＶＤＥＫＡＰＥＦＳＭＱＧＬＫＡＧＶＩＡＶＩＶＶＶＶＩＡＶＶＡＧＩＶＶＬＶＩＳＲＫＫＲＭＡＫＹＥＫＡＥＩＫＥＭＧＥＭＨＲＥＬＮＡ（配列番号２）。
【0138】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子の抗原結合領域の１つは、ＥｐＣＡＭに結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性分子の抗原結合領域の１つは、配列番号２のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＩｇＧベースの構造、例えば、ＥｐＣＡＭ特異的抗体の重鎖及び軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド配列に関する。ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体分子の実施形態及び配列は、当該技術分野で既知であり、これは、米国特許第７，６３２，９２５Ｂ２号（この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものも含む。
【0139】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、ＥｐＣＡＭ特異的ＤＡＲＰｉｎである配列番号３を含む：
ＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＶＡＮＧＡＤＶＮＡＹＦＧＴＴＰＬＨＬＡＡＡＨＧＲＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＱＤＶＷＧＩＴＰＬＨＬＡＡＹＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＨＤＴＲＧＷＴＰＬＨＬＡＡＩＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＶＡＤＶＮＡＱＤＲＳＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＫＬＮ（配列番号３）。
ＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＶＡＮＧＡＤＶＮＡＹＦＧＴＴＰＬＨＬＡＡＡＨＧＲＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＱＤＶＷＧＩＴＰＬＨＬＡＡＹＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＨＤＴＲＧＷＴＰＬＨＬＡＡＩＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＶＡＤＶＮＡＱＤＲＳＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＫＬＮ（配列番号３）。
【0140】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＥｐＣＡＭへのＤＡＲＰｉｎのさらなる詳細は、以下に見出すことができる：Ｓｔｅｆａｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，ＤＡＲＰｉｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ＥｐＣＡＭ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１１，４１３（４）：８２６－８４３（全体が本明細書に組み込まれる）。
【0141】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、ＤＡＲＰｉｎによりＥｐＣＡＭに標的化される共ＬＯＣＫＲケージである配列番号４を含む：
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＶＡＮＧＡＤＶＮＡＹＦＧＴＴＰＬＨＬＡＡＡＨＧＲＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＱＤＶＷＧＩＴＰＬＨＬＡＡＹＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＨＤＴＲＧＷＴＰＬＨＬＡＡＩＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＶＡＤＶＮＡＱＤＲＳＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＫＬＮＳＧＳＧＳＧＫＰＧＱＡＳＧＳＥＬＡＲＫＬＬＥＡＳＴＫＬＱＲＬＮＩＲＬＡＥＡＬＬＥＡＩＡＲＬＱＥＬＮＬＥＬＶＹＬＡＶＥＬＴＤＰＫＲＩＲＤＥＩＫＥＶＫＤＫＳＫＥＩＩＲＲＡＥＫＥＩＤＤＡＡＫＥＳＥＫＩＬＥＥＡＲＥＡＩＳＧＳＧＳＥＬＡＫＬＬＬＫＡＩＡＥＴＱＤＬＮＬＲＡＡＫＡＦＬＥＡＡＡＫＬＱＥＬＮＩＲＡＶＥＬＬＶＫＬＴＤＰＡＴＩＲＥＡＬＥＨＡＫＲＲＳＫＥＩＩＤＥＡＥＲＡＩＲＡＡＫＲＥＳＥＲＩＩＥＥＡＲＲＬＩＥＫＧＳＧＳＧＳＥＬＡＲＥＬＬＲＡＨＡＱＬＱＲＬＮＬＥＬＬＲＥＬＬＲＡＬＡＱＬＱＥＬＮＬＤＬＬＲＬＡＳＥＬＴＤＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩＲ（配列番号４）。
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＶＡＮＧＡＤＶＮＡＹＦＧＴＴＰＬＨＬＡＡＡＨＧＲＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＱＤＶＷＧＩＴＰＬＨＬＡＡＹＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＨＤＴＲＧＷＴＰＬＨＬＡＡＩＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＶＡＤＶＮＡＱＤＲＳＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＫＬＮＳＧＳＧＳＧＫＰＧＱＡＳＧＳＥＬＡＲＫＬＬＥＡＳＴＫＬＱＲＬＮＩＲＬＡＥＡＬＬＥＡＩＡＲＬＱＥＬＮＬＥＬＶＹＬＡＶＥＬＴＤＰＫＲＩＲＤＥＩＫＥＶＫＤＫＳＫＥＩＩＲＲＡＥＫＥＩＤＤＡＡＫＥＳＥＫＩＬＥＥＡＲＥＡＩＳＧＳＧＳＥＬＡＫＬＬＬＫＡＩＡＥＴＱＤＬＮＬＲＡＡＫＡＦＬＥＡＡＡＫＬＱＥＬＮＩＲＡＶＥＬＬＶＫＬＴＤＰＡＴＩＲＥＡＬＥＨＡＫＲＲＳＫＥＩＩＤＥＡＥＲＡＩＲＡＡＫＲＥＳＥＲＩＩＥＥＡＲＲＬＩＥＫＧＳＧＳＧＳＥＬＡＲＥＬＬＲＡＨＡＱＬＱＲＬＮＬＥＬＬＲＥＬＬＲＡＬＡＱＬＱＥＬＮＬＤＬＬＲＬＡＳＥＬＴＤＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩＲ（配列番号４）。
【0142】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0143】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、ＤＡＲＰｉｎによりＥｐＣＡＭに標的化される共ＬＯＣＫＲのキーである配列番号５を含む：
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳＤＥＡＲＫＡＩＡＲＶＫＲＥＳＫＲＩＶＥＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩＲＧＧＧＳＧＳＧＳＧＳＧＫＰＧＱＡＳＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＶＡＮＧＡＤＶＮＡＹＦＧＴＴＰＬＨＬＡＡＡＨＧＲＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＱＤＶＷＧＩＴＰＬＨＬＡＡＹＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＨＤＴＲＧＷＴＰＬＨＬＡＡＩＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＶＡＤＶＮＡＱＤＲＳＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＫＬＮ（配列番号５）。
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳＤＥＡＲＫＡＩＡＲＶＫＲＥＳＫＲＩＶＥＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩＲＧＧＧＳＧＳＧＳＧＳＧＫＰＧＱＡＳＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＶＡＮＧＡＤＶＮＡＹＦＧＴＴＰＬＨＬＡＡＡＨＧＲＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＱＤＶＷＧＩＴＰＬＨＬＡＡＹＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＨＤＴＲＧＷＴＰＬＨＬＡＡＩＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＶＡＤＶＮＡＱＤＲＳＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＫＬＮ（配列番号５）。
【0144】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号２７のＶＨ鎖を含む：
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸３１～３５（ＣＤＲＨ１）、５０～６６（ＣＤＲＨ２）、及び９８～１１７（ＣＤＲＨ３）を含む。配列番号２７をコードする核酸は、米国特許第７，６３２，９２５号（本明細書に参照により組み込まれる）の配列番号１４３である。ＣＤＲＨ１は、ｎｔ９１～ｎｔ１０５を含み、ＣＤＲＨ２は、ｎｔ１４８～ｎｔ１９８を含み、ＣＤＲＨ３は、ｎｔ２９２～ｎｔ３５１を含む。
【化1】
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸３１～３５（ＣＤＲＨ１）、５０～６６（ＣＤＲＨ２）、及び９８～１１７（ＣＤＲＨ３）を含む。配列番号２７をコードする核酸は、米国特許第７，６３２，９２５号（本明細書に参照により組み込まれる）の配列番号１４３である。ＣＤＲＨ１は、ｎｔ９１～ｎｔ１０５を含み、ＣＤＲＨ２は、ｎｔ１４８～ｎｔ１９８を含み、ＣＤＲＨ３は、ｎｔ２９２～ｎｔ３５１を含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号２７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、以下から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域を含む：
ＳＹＧＭＨ（配列番号３３）
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）
ＫＤＭＧＷＧＳＧＷＲＰＹＹＹＹＧＭＤＶＷ（配列番号３５）。
ＳＹＧＭＨ（配列番号３３）
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）
ＫＤＭＧＷＧＳＧＷＲＰＹＹＹＹＧＭＤＶＷ（配列番号３５）。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号２８のＶＬ鎖を含む：
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５６（ＣＤＲ２）、及び８９～９８（ＣＤＲ３）を含む。配列番号２８をコードする核酸は、米国特許第７，６３２，９２５号（本明細書に参照により組み込まれる）の配列番号１４７である。ＣＤＲＬ１は、ｎｔ７０～ｎｔ１０２を含み、ＣＤＲＬ２は、ｎｔ１４８～ｎｔ１６８を含み、ＣＤＲＬ３は、ｎｔ２６５～ｎｔ２９４を含む。
【化2】
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５６（ＣＤＲ２）、及び８９～９８（ＣＤＲ３）を含む。配列番号２８をコードする核酸は、米国特許第７，６３２，９２５号（本明細書に参照により組み込まれる）の配列番号１４７である。ＣＤＲＬ１は、ｎｔ７０～ｎｔ１０２を含み、ＣＤＲＬ２は、ｎｔ１４８～ｎｔ１６８を含み、ＣＤＲＬ３は、ｎｔ２６５～ｎｔ２９４を含む。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、配列番号２８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、以下から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域を含む：
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号３６）
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３７）
ＱＱＳＤＳＬＰＩＴＦ（配列番号３８）。
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号３６）
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３７）
ＱＱＳＤＳＬＰＩＴＦ（配列番号３８）。
【0151】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、所望の標的（例えば、限定されないが、ＥｐＣＡＭ）に結合する抗体のＶＬ鎖及び／またはＶＨ領域の１つ以上を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、所望の標的（例えば、限定されないが、ＥｐＣＡＭ）に結合する抗体のＶＬ鎖及び／またはＶＨ鎖ＣＤＲの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体のＶＬ鎖及び／またはＶＨ鎖の３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下のいずれかを有する抗体のアミノ酸配列を含む：ＥｐＣＡＭに結合する抗体の配列の少なくとも５個の連続アミノ酸、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の少なくとも８個の連続アミノ酸、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の少なくとも約１０個の連続アミノ酸、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の少なくとも約１５個の連続アミノ酸、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の少なくとも約２０個の連続アミノ酸、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の少なくとも約２５個の連続アミノ酸、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の少なくとも約３０個の連続アミノ酸。別の実施形態では、５個（またはそれ以上）の連続アミノ酸は、抗体のＣＤＲ由来のものである。
【0152】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２７）と、少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0153】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２７）と、少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0154】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２７）と、少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0155】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0156】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２７）と１００％同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２８）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0158】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0159】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0160】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0161】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２８）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２７）と１００％同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0162】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及びアミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２８）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２８）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも８５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２７）と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0163】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３３）と少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、アミノ酸配列（配列番号３４）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号３５）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列と、アミノ酸配列（配列番号３６）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号３７）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号３８）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３６）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号３７）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号３８）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３６）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号３７）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号３８）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３６）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号３７）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号３８）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３６）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号３７）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号３８）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３６）と１００％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号３７）と１００％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号３８）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３３）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号３４）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号３５）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３３）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号３４）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号３５）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３３）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号３４）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号３５）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３３）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号３４）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号３５）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３３）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号３４）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号３５）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。
【0164】
いくつかの実施形態では、配列番号３６として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号３８として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子は、配列番号３６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、配列番号３３として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号３５として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子は、配列番号３３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、配列番号３６として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３８として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；配列番号３３として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号３５として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子は、配列番号３６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；配列番号３３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、フレームワーク内のアミノ酸を変更することができる、ＥｐＣＡＭに結合特異性を付与するＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸の変化は、保存的アミノ酸置換の導入を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み；ＶＬ領域が、配列番号３６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号２８と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＨ領域が、配列番号３３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号３４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号３５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含み；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号２７と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。
【0168】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性分子は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み；ＶＬ領域が、配列番号３６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号３８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号２８と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＬ領域のＶ遺伝子の使用が、カッパ軽鎖であり；ＶＨ領域が、配列番号３３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号３４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号３５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含み；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号２７と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＨ領域のＶ遺伝子の使用が、ＩＧＨＶ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域のＶ遺伝子使用は、カッパ５．１軽鎖である。
【0169】
ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン
ＣＤ１６３（Ｕｎｉｐｏｒｔ ＩＤ：Ｑ８６ＶＢ７）配列に対応するアミノ酸配列が以下に提示される：
ＭＳＫＬＲＭＶＬＬＥＤＳＧＳＡＤＦＲＲＨＦＶＮＬＳＰＦＴＩＴＶＶＬＬＬＳＡＣＦＶＴＳＳＬＧＧＴＤＫＥＬＲＬＶＤＧＥＮＫＣＳＧＲＶＥＶＫＶＱＥＥＷＧＴＶＣＮＮＧＷＳＭＥＡＶＳＶＩＣＮＱＬＧＣＰＴＡＩＫＡＰＧＷＡＮＳＳＡＧＳＧＲＩＷＭＤＨＶＳＣＲＧＮＥＳＡＬＷＤＣＫＨＤＧＷＧＫＨＳＮＣＴＨＱＱＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＮＬＥＭＲＬＴＲＧＧＮＭＣＳＧＲＩＥＩＫＦＱＧＲＷＧＴＶＣＤＤＮＦＮＩＤＨＡＳＶＩＣＲＱＬＥＣＧＳＡＶＳＦＳＧＳＳＮＦＧＥＧＳＧＰＩＷＦＤＤＬＩＣＮＧＮＥＳＡＬＷＮＣＫＨＱＧＷＧＫＨＮＣＤＨＡＥＤＡＧＶＩＣＳＫＧＡＤＬＳＬＲＬＶＤＧＶＴＥＣＳＧＲＬＥＶＲＦＱＧＥＷＧＴＩＣＤＤＧＷＤＳＹＤＡＡＶＡＣＫＱＬＧＣＰＴＡＶＴＡＩＧＲＶＮＡＳＫＧＦＧＨＩＷＬＤＳＶＳＣＱＧＨＥＰＡＩＷＱＣＫＨＨＥＷＧＫＨＹＣＮＨＮＥＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＤＬＥＬＲＬＲＧＧＧＳＲＣＡＧＴＶＥＶＥＩＱＲＬＬＧＫＶＣＤＲＧＷＧＬＫＥＡＤＶＶＣＲＱＬＧＣＧＳＡＬＫＴＳＹＱＶＹＳＫＩＱＡＴＮＴＷＬＦＬＳＳＣＮＧＮＥＴＳＬＷＤＣＫＮＷＱＷＧＧＬＴＣＤＨＹＥＥＡＫＩＴＣＳＡＨＲＥＰＲＬＶＧＧＤＩＰＣＳＧＲＶＥＶＫＨＧＤＴＷＧＳＩＣＤＳＤＦＳＬＥＡＡＳＶＬＣＲＥＬＱＣＧＴＶＶＳＩＬＧＧＡＨＦＧＥＧＮＧＱＩＷＡＥＥＦＱＣＥＧＨＥＳＨＬＳＬＣＰＶＡＰＲＰＥＧＴＣＳＨＳＲＤＶＧＶＶＣＳＲＹＴＥＩＲＬＶＮＧＫＴＰＣＥＧＲＶＥＬＫＴＬＧＡＷＧＳＬＣＮＳＨＷＤＩＥＤＡＨＶＬＣＱＱＬＫＣＧＶＡＬＳＴＰＧＧＡＲＦＧＫＧＮＧＱＩＷＲＨＭＦＨＣＴＧＴＥＱＨＭＧＤＣＰＶＴＡＬＧＡＳＬＣＰＳＥＱＶＡＳＶＩＣＳＧＮＱＳＱＴＬＳＳＣＮＳＳＳＬＧＰＴＲＰＴＩＰＥＥＳＡＶＡＣＩＥＳＧＱＬＲＬＶＮＧＧＧＲＣＡＧＲＶＥＩＹＨＥＧＳＷＧＴＩＣＤＤＳＷＤＬＳＤＡＨＶＶＣＲＱＬＧＣＧＥＡＩＮＡＴＧＳＡＨＦＧＥＧＴＧＰＩＷＬＤＥＭＫＣＮＧＫＥＳＲＩＷＱＣＨＳＨＧＷＧＱＱＮＣＲＨＫＥＤＡＧＶＩＣＳＥＦＭＳＬＲＬＴＳＥＡＳＲＥＡＣＡＧＲＬＥＶＦＹＮＧＡＷＧＴＶＧＫＳＳＭＳＥＴＴＶＧＶＶＣＲＱＬＧＣＡＤＫＧＫＩＮＰＡＳＬＤＫＡＭＳＩＰＭＷＶＤＮＶＱＣＰＫＧＰＤＴＬＷＱＣＰＳＳＰＷＥＫＲＬＡＳＰＳＥＥＴＷＩＴＣＤＮＫＩＲＬＱＥＧＰＴＳＣＳＧＲＶＥＩＷＨＧＧＳＷＧＴＶＣＤＤＳＷＤＬＤＤＡＱＶＶＣＱＱＬＧＣＧＰＡＬＫＡＦＫＥＡＥＦＧＱＧＴＧＰＩＷＬＮＥＶＫＣＫＧＮＥＳＳＬＷＤＣＰＡＲＲＷＧＨＳＥＣＧＨＫＥＤＡＡＶＮＣＴＤＩＳＶＱＫＴＰＱＫＡＴＴＧＲＳＳＲＱＳＳＦＩＡＶＧＩＬＧＶＶＬＬＡＩＦＶＡＬＦＦＬＴＫＫＲＲＱＲＱＲＬＡＶＳＳＲＧＥＮＬＶＨＱＩＱＹＲＥＭＮＳＣＬＮＡＤＤＬＤＬＭＮＳＳＥＮＳＨＥＳＡＤＦＳＡＡＥＬＩＳＶＳＫＦＬＰＩＳＧＭＥＫＥＡＩＬＳＨＴＥＫＥＮＧＮＬ（配列番号６）。
ＣＤ１６３（Ｕｎｉｐｏｒｔ ＩＤ：Ｑ８６ＶＢ７）配列に対応するアミノ酸配列が以下に提示される：
ＭＳＫＬＲＭＶＬＬＥＤＳＧＳＡＤＦＲＲＨＦＶＮＬＳＰＦＴＩＴＶＶＬＬＬＳＡＣＦＶＴＳＳＬＧＧＴＤＫＥＬＲＬＶＤＧＥＮＫＣＳＧＲＶＥＶＫＶＱＥＥＷＧＴＶＣＮＮＧＷＳＭＥＡＶＳＶＩＣＮＱＬＧＣＰＴＡＩＫＡＰＧＷＡＮＳＳＡＧＳＧＲＩＷＭＤＨＶＳＣＲＧＮＥＳＡＬＷＤＣＫＨＤＧＷＧＫＨＳＮＣＴＨＱＱＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＮＬＥＭＲＬＴＲＧＧＮＭＣＳＧＲＩＥＩＫＦＱＧＲＷＧＴＶＣＤＤＮＦＮＩＤＨＡＳＶＩＣＲＱＬＥＣＧＳＡＶＳＦＳＧＳＳＮＦＧＥＧＳＧＰＩＷＦＤＤＬＩＣＮＧＮＥＳＡＬＷＮＣＫＨＱＧＷＧＫＨＮＣＤＨＡＥＤＡＧＶＩＣＳＫＧＡＤＬＳＬＲＬＶＤＧＶＴＥＣＳＧＲＬＥＶＲＦＱＧＥＷＧＴＩＣＤＤＧＷＤＳＹＤＡＡＶＡＣＫＱＬＧＣＰＴＡＶＴＡＩＧＲＶＮＡＳＫＧＦＧＨＩＷＬＤＳＶＳＣＱＧＨＥＰＡＩＷＱＣＫＨＨＥＷＧＫＨＹＣＮＨＮＥＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＤＬＥＬＲＬＲＧＧＧＳＲＣＡＧＴＶＥＶＥＩＱＲＬＬＧＫＶＣＤＲＧＷＧＬＫＥＡＤＶＶＣＲＱＬＧＣＧＳＡＬＫＴＳＹＱＶＹＳＫＩＱＡＴＮＴＷＬＦＬＳＳＣＮＧＮＥＴＳＬＷＤＣＫＮＷＱＷＧＧＬＴＣＤＨＹＥＥＡＫＩＴＣＳＡＨＲＥＰＲＬＶＧＧＤＩＰＣＳＧＲＶＥＶＫＨＧＤＴＷＧＳＩＣＤＳＤＦＳＬＥＡＡＳＶＬＣＲＥＬＱＣＧＴＶＶＳＩＬＧＧＡＨＦＧＥＧＮＧＱＩＷＡＥＥＦＱＣＥＧＨＥＳＨＬＳＬＣＰＶＡＰＲＰＥＧＴＣＳＨＳＲＤＶＧＶＶＣＳＲＹＴＥＩＲＬＶＮＧＫＴＰＣＥＧＲＶＥＬＫＴＬＧＡＷＧＳＬＣＮＳＨＷＤＩＥＤＡＨＶＬＣＱＱＬＫＣＧＶＡＬＳＴＰＧＧＡＲＦＧＫＧＮＧＱＩＷＲＨＭＦＨＣＴＧＴＥＱＨＭＧＤＣＰＶＴＡＬＧＡＳＬＣＰＳＥＱＶＡＳＶＩＣＳＧＮＱＳＱＴＬＳＳＣＮＳＳＳＬＧＰＴＲＰＴＩＰＥＥＳＡＶＡＣＩＥＳＧＱＬＲＬＶＮＧＧＧＲＣＡＧＲＶＥＩＹＨＥＧＳＷＧＴＩＣＤＤＳＷＤＬＳＤＡＨＶＶＣＲＱＬＧＣＧＥＡＩＮＡＴＧＳＡＨＦＧＥＧＴＧＰＩＷＬＤＥＭＫＣＮＧＫＥＳＲＩＷＱＣＨＳＨＧＷＧＱＱＮＣＲＨＫＥＤＡＧＶＩＣＳＥＦＭＳＬＲＬＴＳＥＡＳＲＥＡＣＡＧＲＬＥＶＦＹＮＧＡＷＧＴＶＧＫＳＳＭＳＥＴＴＶＧＶＶＣＲＱＬＧＣＡＤＫＧＫＩＮＰＡＳＬＤＫＡＭＳＩＰＭＷＶＤＮＶＱＣＰＫＧＰＤＴＬＷＱＣＰＳＳＰＷＥＫＲＬＡＳＰＳＥＥＴＷＩＴＣＤＮＫＩＲＬＱＥＧＰＴＳＣＳＧＲＶＥＩＷＨＧＧＳＷＧＴＶＣＤＤＳＷＤＬＤＤＡＱＶＶＣＱＱＬＧＣＧＰＡＬＫＡＦＫＥＡＥＦＧＱＧＴＧＰＩＷＬＮＥＶＫＣＫＧＮＥＳＳＬＷＤＣＰＡＲＲＷＧＨＳＥＣＧＨＫＥＤＡＡＶＮＣＴＤＩＳＶＱＫＴＰＱＫＡＴＴＧＲＳＳＲＱＳＳＦＩＡＶＧＩＬＧＶＶＬＬＡＩＦＶＡＬＦＦＬＴＫＫＲＲＱＲＱＲＬＡＶＳＳＲＧＥＮＬＶＨＱＩＱＹＲＥＭＮＳＣＬＮＡＤＤＬＤＬＭＮＳＳＥＮＳＨＥＳＡＤＦＳＡＡＥＬＩＳＶＳＫＦＬＰＩＳＧＭＥＫＥＡＩＬＳＨＴＥＫＥＮＧＮＬ（配列番号６）。
【0170】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子の抗原結合領域の１つは、ＣＤ１６３に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性分子の抗原結合領域の１つは、配列番号６のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＩｇＧベースの構造、例えば、ＣＤ１６３特異的抗体の重鎖及び軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド配列に関する。米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１１９７９０Ａ１号（この内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる）に開示されているものを含む、ＣＤ１６３に特異的に結合する抗体分子の実施形態及び配列は、当該技術分野で既知である。
【0171】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、所望の標的（例えば、限定されないが、ＣＤ１６３）に結合する抗体のＶＬ鎖及び／またはＶＨ領域の１つ以上を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、所望の標的（例えば、限定されないが、ＣＤ１６３）に結合する抗体のＶＬ鎖及び／またはＶＨ鎖ＣＤＲの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体のＶＬ鎖及び／またはＶＨ鎖の３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下のいずれかを有する抗体のアミノ酸配列を含む：ＣＤ１６３に結合する抗体の配列の少なくとも５個の連続アミノ酸、ＣＤ１６３に結合する抗体の少なくとも８個の連続アミノ酸、ＣＤ１６３に結合する抗体の少なくとも約１０個の連続アミノ酸、ＣＤ１６３に結合する抗体の少なくとも約１５個の連続アミノ酸、ＣＤ１６３に結合する抗体の少なくとも約２０個の連続アミノ酸、ＣＤ１６３に結合する抗体の少なくとも約２５個の連続アミノ酸、ＣＤ１６３に結合する抗体の少なくとも約３０個の連続アミノ酸。別の実施形態では、５個（またはそれ以上）の連続アミノ酸は、抗体のＣＤＲ由来のものである。
【0172】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号２９のＶＨ鎖を含む：
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２６～３３（ＣＤＲ１）、５４～５６（ＣＤＲ２）、及び９６～１０７（ＣＤＲ３）を含む。
【化3】
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２６～３３（ＣＤＲ１）、５４～５６（ＣＤＲ２）、及び９６～１０７（ＣＤＲ３）を含む。
【0173】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号２９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0174】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、以下から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域を含む：
ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号３９）
ＹＳＧ（配列番号４０）
ＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号４１）。
ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号３９）
ＹＳＧ（配列番号４０）
ＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号４１）。
【0175】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号３０のＶＬ鎖を含む：
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２５～３３（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）、及び９０～９７（ＣＤＲ３）を含む。
【化4】
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２５～３３（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）、及び９０～９７（ＣＤＲ３）を含む。
【0176】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号３０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0177】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、以下から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域を含む：
ＡＳＱＳＶＳＳＤＶ（配列番号４２）
ＹＡＳ（配列番号４３）
ＱＤＹＴＳＰＲＴ（配列番号４４）。
ＡＳＱＳＶＳＳＤＶ（配列番号４２）
ＹＡＳ（配列番号４３）
ＱＤＹＴＳＰＲＴ（配列番号４４）。
【0178】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0179】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0180】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0181】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0182】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２９）と１００％同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３０）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0184】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0185】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0186】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0187】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３０）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号２９）と１００％同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0188】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及びアミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３０）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３０）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも８５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号２９）と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0189】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３９）と少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、アミノ酸配列（配列番号４０）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４１）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列と、アミノ酸配列（配列番号４２）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号４４）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４２）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号４４）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４２）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号４４）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４２）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号４４）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４２）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号４４）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４２）と１００％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４３）と１００％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号４４）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３９）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４０）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４１）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３９）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４０）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４１）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３９）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４０）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４１）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３９）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４０）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４１）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３９）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４０）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４１）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。
【0190】
いくつかの実施形態では、配列番号４２として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４３として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号４４として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、配列番号４２として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0191】
いくつかの実施形態では、配列番号３９として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号４１として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、配列番号３９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４１として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0192】
いくつかの実施形態では、配列番号４２として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４３として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；配列番号４４として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；配列番号３９として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号４１として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、配列番号４２として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；配列番号４４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；配列番号３９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４１として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0193】
いくつかの実施形態では、フレームワーク内のアミノ酸を変更することができる、ＣＤ１６３に結合特異性を付与するＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸の変化は、保存的アミノ酸置換の導入を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み；ＶＬ領域が、配列番号４２として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号３０と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＨ領域が、配列番号３９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号４１として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含み；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号２９と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２９と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２９と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２９と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。
【0194】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み；ＶＬ領域が、配列番号４２として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４３として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号４４として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号３０と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＬ領域のＶ遺伝子の使用が、カッパ軽鎖であり；ＶＨ領域が、配列番号３９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号４１として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含み；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号２９と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＨ領域のＶ遺伝子の使用が、ＩＧＨＶ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２９と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２９と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２９と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域のＶ遺伝子使用は、カッパ８軽鎖である。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域のＶ遺伝子使用は、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９＊０１である。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域のＶ遺伝子使用は、ＩＧＨＶ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域のＶ遺伝子使用は、ＩＧＨＶ４－ｂ＊０１である。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号３１のＶＨ鎖を含む：
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸３１～３５（ＣＤＲ１）、５０～６５（ＣＤＲ２）、及び９９～１２２（ＣＤＲ３）を含む。
【化5】
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸３１～３５（ＣＤＲ１）、５０～６５（ＣＤＲ２）、及び９９～１２２（ＣＤＲ３）を含む。
【0196】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号３１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0197】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、以下から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域を含む：
ＳＹＡＭＨ（配列番号４５）
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号４６）
ＥＮＶＲＰＹＹＤＦＷＳＧＹＹＳＥＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号４７）。
ＳＹＡＭＨ（配列番号４５）
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号４６）
ＥＮＶＲＰＹＹＤＦＷＳＧＹＹＳＥＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号４７）。
【0198】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号３２のＶＬ鎖を含む：
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５５（ＣＤＲ２）、及び８９～９８（ＣＤＲ３）を含む。
【化6】
ＣＤＲは、太字及び下線で示され、アミノ酸２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５５（ＣＤＲ２）、及び８９～９８（ＣＤＲ３）を含む。
【0199】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、配列番号３２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0200】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、以下から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域を含む：
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号４８）
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４９）
ＱＱＳＹＳＴＰＲＧＴ（配列番号５０）。
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号４８）
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４９）
ＱＱＳＹＳＴＰＲＧＴ（配列番号５０）。
【0201】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0202】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0203】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0204】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0205】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３１）と１００％同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３２）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0206】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0207】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0208】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0209】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。
【0210】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３２）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、さらに、アミノ酸配列（配列番号３１）と１００％同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0211】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及びアミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３２）と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３２）と１００％同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも８５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号３１）と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0212】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（配列番号４５）と少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、アミノ酸配列（配列番号４６）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４７）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列と、アミノ酸配列（配列番号４８）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４９）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号５０）と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４８）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４９）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号５０）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４８）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４９）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号５０）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４８）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４９）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号５０）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４８）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４９）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号５０）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４８）と１００％の同一性を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列（配列番号４９）と１００％の同一性を有するＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列（配列番号５０）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４５）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４６）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４７）と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４５）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４６）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４７）と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４５）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４６）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４７）と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４５）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４６）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４７）と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、アミノ酸配列（配列番号４５）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列（配列番号４６）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列（配列番号４７）と少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖配列を含む。
【0213】
いくつかの実施形態では、配列番号４８として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４９として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号５０として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、配列番号４８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号５０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、配列番号４５として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４６として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号４７として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、配列番号４５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0215】
いくつかの実施形態では、配列番号４８として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４９として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；配列番号５０として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；配列番号４５として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４６として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び、配列番号４７として記載されているアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、配列番号４８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；配列番号５０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；配列番号４５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号４６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも１つを含む。
【0216】
いくつかの実施形態では、フレームワーク内のアミノ酸を変更することができる、ＣＤ１６３に結合特異性を付与するＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む二重特異性分子が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸の変化は、保存的アミノ酸置換の導入を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み；ＶＬ領域が、配列番号４８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号３２と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＨ領域が、配列番号４５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号４７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含み；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。
【0217】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する二重特異性分子は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含み；ＶＬ領域が、配列番号４８として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号４９として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、配列番号５０として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＬ領域のＶ遺伝子の使用が、カッパ軽鎖であり；ＶＨ領域が、配列番号４５として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４６として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号４７として記載されているアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含み；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し；ＶＨ領域のＶ遺伝子の使用が、ＩＧＨＶ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも９０％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも９５％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の外側のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の外側のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも９９％の同一性の全体的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域のＶ遺伝子使用は、ＶＫ１．Ｏ１２である。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域のＶ遺伝子使用は、ＩＧＨＶ３遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域のＶ遺伝子使用は、ＩＧＨＶ３．３０－３である。
【0218】
処置方法
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、がんに罹患している対象における、がんを処置または予防する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を対象に投与することを含み、各抗原結合領域が、がんの第１の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の二重特異性分子のいずれか１つを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、がんに罹患している対象における、がんを処置または予防する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む二重特異性分子を対象に投与することを含み、各抗原結合領域が、がんの第１の細胞（ＴＦＣ）上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の二重特異性分子のいずれか１つを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【0219】
いくつかの実施形態では、第１の抗原は、上皮細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、上皮マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つであり、上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、マクロファージマーカーは、図１のマーカーのいずれかである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統マーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、両方の抗原は、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、その機能的同等物、その抗原結合フラグメント、その誘導体、または抗体様二重特異性分子は、図１から選択される２つの異なる抗原に結合する。
【0220】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、薬物にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、薬物は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、スプリットＣＡＲ－Ｔである。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲに結合し、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、二重特異性ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。
【0221】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性分子のいずれか１つを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供し、第１の抗原結合領域が、ＥｐＣＡＭに結合し、第２の抗原結合領域が、ＣＤ１６３に結合する。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の処置方法は、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域の、本明細書に記載の二重特異性分子のいずれかを使用することを含む。
【0222】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、脳腫瘍、胃癌及び大腸癌を含む消化器癌、膵癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、胸腺癌、卵巣癌、前立腺癌、または子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、液体癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄性腫瘍である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、ＴＦＣは、転移性ＴＦＣである。
【0223】
骨髄性白血病
いくつかの実施形態では、がんは、骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、骨髄性白血病ＴＦＣは、第１抗原及び第２抗原を発現する。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、双方ともに、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１抗原及び第２抗原は、図１のマーカーのいずれか１つのペアである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の二重特異性分子は、２つの抗原（これらの両方は、マクロファージ細胞系統マーカーである）に結合する。
いくつかの実施形態では、がんは、骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、骨髄性白血病ＴＦＣは、第１抗原及び第２抗原を発現する。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、双方ともに、マクロファージ細胞系統マーカーである。いくつかの実施形態では、第１抗原及び第２抗原は、図１のマーカーのいずれか１つのペアである。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の二重特異性分子は、２つの抗原（これらの両方は、マクロファージ細胞系統マーカーである）に結合する。
【0224】
骨髄性腫瘍
いくつかの実施形態では、がんは、骨髄性腫瘍である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、ＭＤＳ／ＭＰＮ症候群の重複である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、急性または慢性骨髄性白血病である。
いくつかの実施形態では、がんは、骨髄性腫瘍である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、ＭＤＳ／ＭＰＮ症候群の重複である。いくつかの実施形態では、骨髄性腫瘍は、急性または慢性骨髄性白血病である。
【0225】
がん処置
現在、利用可能ながん処置の選択肢が多数ある。手術は、がんまたは腫瘍塊を除去するために行われる。化学療法は、がん細胞を殺傷するために患者に有毒薬物を投与することを含む。放射線療法では、Ｘ線または陽子などの高出力のエネルギービームを利用してがん細胞を殺傷する。健常個体から、がん患者に骨髄を移植して、患者自身の罹患骨髄を置き換えることができる。骨髄は、血液幹細胞から血液細胞を生成し、骨髄移植は、液体癌の処置または治癒の目的で実施される。骨髄移植は、がん患者を処置するための高用量の化学療法の使用も可能にする。免疫療法は、がんと闘うために体自身の免疫システムを利用する。免疫療法は、患者の免疫システムが、がん細胞を認識して攻撃するのを助け得る。ホルモン療法は、体内のホルモンによりサポートされ得る乳癌または前立腺癌の処置に使用することができる。それらの体への影響をブロックすると、がんの成長が停止し得る。冷凍アブレーションは、患者の皮膚を通してがん腫瘍に直接挿入された細い針（冷凍プローブ）を使用して温度を低下させることにより、がん細胞を殺傷する。高周波アブレーションは、電気エネルギーを使用して、がん細胞を加熱し、それにより、がん細胞を殺傷する。高周波エネルギーが、針を通して誘導され、周囲の組織が加熱される。これらの各処置は、本明細書に記載の方法と組み合わせて投与することができる。
現在、利用可能ながん処置の選択肢が多数ある。手術は、がんまたは腫瘍塊を除去するために行われる。化学療法は、がん細胞を殺傷するために患者に有毒薬物を投与することを含む。放射線療法では、Ｘ線または陽子などの高出力のエネルギービームを利用してがん細胞を殺傷する。健常個体から、がん患者に骨髄を移植して、患者自身の罹患骨髄を置き換えることができる。骨髄は、血液幹細胞から血液細胞を生成し、骨髄移植は、液体癌の処置または治癒の目的で実施される。骨髄移植は、がん患者を処置するための高用量の化学療法の使用も可能にする。免疫療法は、がんと闘うために体自身の免疫システムを利用する。免疫療法は、患者の免疫システムが、がん細胞を認識して攻撃するのを助け得る。ホルモン療法は、体内のホルモンによりサポートされ得る乳癌または前立腺癌の処置に使用することができる。それらの体への影響をブロックすると、がんの成長が停止し得る。冷凍アブレーションは、患者の皮膚を通してがん腫瘍に直接挿入された細い針（冷凍プローブ）を使用して温度を低下させることにより、がん細胞を殺傷する。高周波アブレーションは、電気エネルギーを使用して、がん細胞を加熱し、それにより、がん細胞を殺傷する。高周波エネルギーが、針を通して誘導され、周囲の組織が加熱される。これらの各処置は、本明細書に記載の方法と組み合わせて投与することができる。
【0226】
診断方法
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、がんを診断する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態では、第１のマーカーは、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２のマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのマクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか２つである。いくつかの実施形態では、検出は、二重特異性分子が、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む。いくつかの実施形態では、検出は、二重特異性分子が少なくとも２つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む。いくつかの実施形態では、検出は、フローサイトメトリーアッセイを含む。いくつかの実施形態では、検出は、免疫染色アッセイを含む。いくつかの実施形態では、各抗原に結合する抗体は、それぞれ、異なる蛍光色素とコンジュゲートされ、蛍光色素は、フローサイトメトリーまたは免疫染色のいずれかを使用して検出される。いくつかの実施形態では、免疫染色は、免疫蛍光染色である。いくつかの実施形態では、検出は、アッセイの前に、図４に示されるように、細胞をサイズで分離するステップを含む。いくつかの実施形態では、サイズ分離中に大きな細胞が選択され、アッセイされる。
特定の態様では、本明細書に記載の主題は、がんを診断する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、図２のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、図１のマーカーのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、マクロファージ細胞系統の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態では、第１のマーカーは、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、またはそれらの任意の組み合わせであり、第２のマーカーは、ＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのマクロファージ細胞系統マーカーは、図１のマーカーのいずれか２つである。いくつかの実施形態では、検出は、二重特異性分子が、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む。いくつかの実施形態では、検出は、二重特異性分子が少なくとも２つのマクロファージ細胞系統マーカーに結合するアッセイを含む。いくつかの実施形態では、検出は、フローサイトメトリーアッセイを含む。いくつかの実施形態では、検出は、免疫染色アッセイを含む。いくつかの実施形態では、各抗原に結合する抗体は、それぞれ、異なる蛍光色素とコンジュゲートされ、蛍光色素は、フローサイトメトリーまたは免疫染色のいずれかを使用して検出される。いくつかの実施形態では、免疫染色は、免疫蛍光染色である。いくつかの実施形態では、検出は、アッセイの前に、図４に示されるように、細胞をサイズで分離するステップを含む。いくつかの実施形態では、サイズ分離中に大きな細胞が選択され、アッセイされる。
【0227】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物は、毒素である。いくつかの実施形態では、薬物は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦＶ、及びＤＮＬ－Ｆａｂ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドを含むＣｏ－ＬＯＣＫＲに結合し、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれ、がんのＴＦＣ上の異なる抗原に結合し、第３のポリペプチドが、二重特異性ＣＡＲに結合し、第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに作動可能に連結されている。
【0228】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性分子のいずれか１つを使用して、少なくとも１つの上皮細胞系統マーカー及び少なくとも１つのマクロファージ細胞系統マーカーを発現する細胞を検出することを含む方法を提供し、第１の抗原結合領域が、ＥｐＣＡＭに結合し、第２の抗原結合領域が、ＣＤ１６３に結合する。ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域は、本明細書に記載されており、これは、「ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域またはドメイン」という名称のセクションを含むが、これに限定されない。本発明の診断方法は、ＣＤ１６３に特異的な抗原結合領域のいずれかと組み合わせて、ＥｐＣＡＭに特異的な抗原結合領域の、本明細書に記載の二重特異性分子のいずれかを使用することを含む。
【0229】
医薬組成物
特定の態様では、上記の二重特異性分子を含む医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の二重特異性分子の有効量と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
特定の態様では、上記の二重特異性分子を含む医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題は、本明細書に記載の二重特異性分子の有効量と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0230】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本発明による治療上有効な製剤を意味する。本明細書で使用される「治療有効量」または「有効量」または「治療的に有効な」は、所定の状態及び投与計画に対して治療効果をもたらす量を指す。治療有効量は、当該技術分野で周知のように、患者特性、例えば、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など、に基づいて、当業者が決定することができる。
【0231】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、固体組成物として投与することができる。いくつかの実施形態では、固体組成物は、限定されないが、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量のポリエチレングリコールを含む賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、水性懸濁液及び／またはエリキシル剤として投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、様々な甘味料または香味料、着色料または染料と、乳化剤及び／または懸濁剤と、希釈剤（例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン）と、ならびにそれらの組み合わせで、組み合わされ得る。
【0232】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口、例えば、静脈内、動脈内、腹膜内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下に投与することができるか、または注入手法で投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、他の物質、例えば、血液と等張にするのに十分な塩またはグルコース、を含有し得る滅菌水溶液の形態で投与することができる。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者らに既知の標準的な製薬手法により容易に達成される。
【0233】
いくつかの実施形態では、非経口投与に適した医薬組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、殺菌剤、及び溶質（意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする）を含有し得る水性及び非水性の滅菌注射液と、懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。医薬組成物は、単位用量または複数用量の容器で提供することができる。医薬組成物は、密封アンプルまたはバイアルであり得る。医薬組成物は、使用直前に、注射用水などの滅菌液体担体を添加することのみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。
【0234】
ポリヌクレオチド
特定の態様では、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部をコードするポリヌクレオチドも提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部をコードするポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を含む当該技術分野で利用可能な方法に従って、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部を発現する細胞から単離される。本明細書に記載の１つ以上の二重特異性分子またはその一部をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上の発現ベクターにサブクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、二重特異性分子またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、当該技術分野で既知の手順を使用して、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部を組み換え生成するために使用することができる。
特定の態様では、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部をコードするポリヌクレオチドも提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部をコードするポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を含む当該技術分野で利用可能な方法に従って、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部を発現する細胞から単離される。本明細書に記載の１つ以上の二重特異性分子またはその一部をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上の発現ベクターにサブクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、二重特異性分子またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、当該技術分野で既知の手順を使用して、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部を組み換え生成するために使用することができる。
【0235】
ベクター
特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の二重特異性分子またはその一部をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部は、当該技術分野で既知の任意の好適なベクター及び方法を使用して組み換え生成される。好適な発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．４、ｐｃＤＮＡ３．３ Ｔｏｐｏ、ｐＯｐｔｉＶｅｃ、ｐＳＧ５Ｌ、ｐＤＥＳＴ２７、ｐＣＩ、ｐＩＲＥＳ、ｐＢＡｐｏ、ｐＳＦ－ＣＭＶ、及びｐＥＦ４／Ｖ５ＨｉｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の二重特異性分子またはその一部をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子またはその一部は、当該技術分野で既知の任意の好適なベクター及び方法を使用して組み換え生成される。好適な発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．４、ｐｃＤＮＡ３．３ Ｔｏｐｏ、ｐＯｐｔｉＶｅｃ、ｐＳＧ５Ｌ、ｐＤＥＳＴ２７、ｐＣＩ、ｐＩＲＥＳ、ｐＢＡｐｏ、ｐＳＦ－ＣＭＶ、及びｐＥＦ４／Ｖ５ＨｉｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【0236】
ウイルス
特定の態様では、二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスも提供される。好適なウイルスベースのタンパク質発現システムは、当該技術分野で既知であり、レンチウイルス発現システム及びアデノウイルス発現システムを含むが、これらに限定されない。好適なレンチウイルスベクターは、ｐＨＩＶ－ｄＴｏｍａｔｏ、ｐＡＷｐ１１、ＬＲＧ２．１、ＬＴ３、ＬｅｎｔｉＶ、ｐＣＣＬ、ｐＣＳ、及びｐＨＩＶ－ｅＧＦＰなどが含まれるが、これらに限定されない。好適なアデノウイルスベクターとしては、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴ、ｐＡｄｅｎｏＸ、ｐＩＣＰＩＳ、ｐＡＡＶ、及びｐＡｄ／ＰＬ－ＤＥＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベースの発現システムを使用したタンパク質発現の方法は、当該技術分野で周知である。
特定の態様では、二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスも提供される。好適なウイルスベースのタンパク質発現システムは、当該技術分野で既知であり、レンチウイルス発現システム及びアデノウイルス発現システムを含むが、これらに限定されない。好適なレンチウイルスベクターは、ｐＨＩＶ－ｄＴｏｍａｔｏ、ｐＡＷｐ１１、ＬＲＧ２．１、ＬＴ３、ＬｅｎｔｉＶ、ｐＣＣＬ、ｐＣＳ、及びｐＨＩＶ－ｅＧＦＰなどが含まれるが、これらに限定されない。好適なアデノウイルスベクターとしては、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴ、ｐＡｄｅｎｏＸ、ｐＩＣＰＩＳ、ｐＡＡＶ、及びｐＡｄ／ＰＬ－ＤＥＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベースの発現システムを使用したタンパク質発現の方法は、当該技術分野で周知である。
【0237】
細胞
特定の態様では、二重特異性分子及び／または二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変型細胞、形質転換または形質導入宿主細胞も提供される。当該技術分野で既知の好適な細胞としては、Ｔ細胞、ＨＬ－６０細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＤＨ５ａが挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って、二重特異性分子及び／または二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドで、遺伝子改変、形質転換、または形質導入することができる。
参考文献：
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８ Ｓｈａｂｏ，Ｉ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｘ．Ｆ．＆ Ｓｖａｎｖｉｋ，Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ１６３ ｉｎ ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅａｒｌｙ ｌｏｃａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２５，１８２６－１８３１，ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２４５０６（２００９）．
９ Ａｌｊａｂｅｒｙ，Ｆ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｇｉｍｍ，Ｏ．，Ｊａｈｎｓｏｎ，Ｓ．＆ Ｓｈａｂｏ，Ｉ．Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３６，１５９ ｅ１１９－１５９ ｅ１２６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｕｒｏｌｏｎｃ．２０１７．１１．０２０（２０１８）．
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１９ Ｌｅｅ，Ｓ．＆ Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｗ．Ｔｈｅ Ｍｏｓｔ Ｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ １１，４２１－４２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０２０．１０．００８（２０２０）．
２０ Ｃｈｏ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．＆ Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｗ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ Ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ １７３，１４２６－１４３８ ｅ１４１１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０３．０３８（２０１８）．
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２３ Ｓａｌｚｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＡｖｉｄＣＡＲｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣＡＲ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，４１６６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１７９７０－３（２０２０）．
特定の態様では、二重特異性分子及び／または二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変型細胞、形質転換または形質導入宿主細胞も提供される。当該技術分野で既知の好適な細胞としては、Ｔ細胞、ＨＬ－６０細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＤＨ５ａが挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って、二重特異性分子及び／または二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドで、遺伝子改変、形質転換、または形質導入することができる。
参考文献：
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２２ Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９，１７８５６０８，ｄｏｉ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０２０．１７８５６０８（２０２０）．
２３ Ｓａｌｚｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＡｖｉｄＣＡＲｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣＡＲ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，４１６６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１７９７０－３（２０２０）．
【0238】
実施例１．系統特異的抗原の発現のための細胞株モデルの生成。
本明細書で腫瘍マクロファージハイブリッド（ＴＭＨ）標的細胞とも呼ばれる「最初の細胞」上の２つの系統特異的抗原（ＬＳＡ）の発現を繰り返す細胞株モデルを生成した（図５Ａ～Ｄ）。
本明細書で腫瘍マクロファージハイブリッド（ＴＭＨ）標的細胞とも呼ばれる「最初の細胞」上の２つの系統特異的抗原（ＬＳＡ）の発現を繰り返す細胞株モデルを生成した（図５Ａ～Ｄ）。
【0239】
ＬＳＡ選択：ＴＭＨ細胞は、２つの異なる系統由来の細胞の融合により形成される。融合により、クロマチン、トランスクリプトーム、及びプロテオームを含む生体分子の再編成がもたらされ、これにより、両方の系統の特定の抗原の発現を保持するハイブリッド細胞が生じる（１～３）。理論的には、いずれかの系統由来のＬＳＡが、ハイブリッド細胞に存在するはずである。図１及び図２は、上皮またはマクロファージ系統のＣＤ抗原のリストを示す。ＴＭＨにおける、いくつかのＬＳＡの発現が報告されている（４、５）。ＴＭＨ上のこれらの抗原の発現に基づいて選択されたＬＳＡは、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３であった（１、２、４、６～１９）。ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３のタンパク質配列と、それらのアイソフォームは、以下の表１に見出され得る。
【0240】
細胞株：ＨＬ－６０（ＣＣＬ－２４０；ＡＴＣＣ）細胞株は、ＬＳＡを発現させるために使用される。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１Ｘのペニシリン及びストレプトマイシンが補充されたＩＭＤＭ培地中、加湿チャンバー内で３７℃、５％のＣＯ２で、ＨＬ－６０細胞を培養した。
【0241】
プラスミドＤＮＡ：レンチウイルスバックボーン（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＤＥＳＴ）及びＣ末端のＶ５タグを有するプラスミドをコードするＥｐＣＡＭ（ＨｓＣＤ００９５４３３５；ＤＮＡＳＵリポジトリ）及びＣＤ１６３（ＨｓＣＤ００８６１０６６；ＤＮＡＳＵリポジトリ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ａ）細胞で増幅し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。ＨＬ－６０細胞で発現したＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３の配列が表２に示される。
【0242】
レンチウイルス：２９３個の細胞でヘルパープラスミド（ＶＳＶＧコートタンパク質をコードする）と共トランスフェクトすることにより、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３発現プラスミドのレンチウイルス粒子を得た。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１Ｘのペニシリン及びストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地中、加湿チャンバー内で、３７℃、５％のＣＯ２で、２３９個の細胞を培養した。ＰＥＧを使用して、細胞上清からのレンチウイルス粒子を精製し、ＩＭＤＭ培地に再懸濁した。
【0243】
ウイルスの導入及び選択：レンチウイルス粒子を使用して、ＨＬ－６０細胞を導入した。濃縮レンチウイルス粒子を、フィブロネクチン処理細胞培養物及びＨＬ－６０細胞と共インキュベートした。４８時間の共培養後、抗生物質ブラストサイジンを使用して、ＥｐＣＡＭもしくはＣＤ１６３またはその両方を発現する細胞を選択した。
【0244】
表現型解析：フローサイトメトリーを使用して、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３の発現を測定した（図６Ａ～Ｃ）。蛍光色素古樹ゲートモノクローナル抗体（ヒトＥｐＣＡＭ（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５にコンジュゲートされたクローン９Ｃ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２４２１３）またはＣＤ１６３（ＰＥにコンジュゲートされたクローンＲＭ３／１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２６５０６）を認識する）の１：１００希釈液で、細胞を染色し、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター及びＤｉｖａソフトウェアでデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）またはＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ ＮｏｖｏＳ ｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。
【0245】
【表1-1】
【0246】
【表1-2】
【0247】
【表1-3】
【0248】
【表1-4】
【0249】
【表2】
【0250】
実施例２．Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質の生成
２つの異なる系統由来のＬＳＡの発現を特徴とするＴＭＨの正確な標的化を行い、親系統の細胞（単一のＬＳＡを発現）を見逃すために、表面抗原（ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３）の正確な組み合わせでＴＭＨを標的とするために、ＡＮＤブール論理演算を実行する共局在依存性タンパク質ベースのロジックゲート設計を使用した（２０）。ＡＮＤ論理を計算するために共局在されると起動されるｄｅ ｎｏｖｏタンパク質スイッチについて記載されており、これは、ラッチング直交ケージ－キータンパク質（Ｃｏ－ＬＯＣＫＲ）を含む。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲは、ケージ及びキーが共局在すると、立体配座の変化を介して活性化するケージ及びキータンパク質で構成される（図７Ａ～Ｃ）（２０）。ケージモジュールは、不活性な立体配座で機能ペプチド（Ｂｉｍ）を隔離するが、立体配座の変化時にエフェクター（Ｂｃｌ２）に結合し得る「ラッチ」で構成される。エフェクターは、タンパク質薬物コンジュゲート（細胞傷害性化合物にコンジュゲートされたＢｃｌ２）またはＢｃｌ２ＣＡＲを発現するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）であり得る（２０）。ケージ及びキーは、双方ともに、モジュール式であり、標的抗原（ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３）を発現する細胞に、ケージ及びキーを動員するために、抗原結合ドメインに結合することができる。抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）もしくはＤａｒｐｉｎ、または標的に対して親和性を有する任意の分子、であり得る。
２つの異なる系統由来のＬＳＡの発現を特徴とするＴＭＨの正確な標的化を行い、親系統の細胞（単一のＬＳＡを発現）を見逃すために、表面抗原（ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３）の正確な組み合わせでＴＭＨを標的とするために、ＡＮＤブール論理演算を実行する共局在依存性タンパク質ベースのロジックゲート設計を使用した（２０）。ＡＮＤ論理を計算するために共局在されると起動されるｄｅ ｎｏｖｏタンパク質スイッチについて記載されており、これは、ラッチング直交ケージ－キータンパク質（Ｃｏ－ＬＯＣＫＲ）を含む。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲは、ケージ及びキーが共局在すると、立体配座の変化を介して活性化するケージ及びキータンパク質で構成される（図７Ａ～Ｃ）（２０）。ケージモジュールは、不活性な立体配座で機能ペプチド（Ｂｉｍ）を隔離するが、立体配座の変化時にエフェクター（Ｂｃｌ２）に結合し得る「ラッチ」で構成される。エフェクターは、タンパク質薬物コンジュゲート（細胞傷害性化合物にコンジュゲートされたＢｃｌ２）またはＢｃｌ２ＣＡＲを発現するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）であり得る（２０）。ケージ及びキーは、双方ともに、モジュール式であり、標的抗原（ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１６３）を発現する細胞に、ケージ及びキーを動員するために、抗原結合ドメインに結合することができる。抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）もしくはＤａｒｐｉｎ、または標的に対して親和性を有する任意の分子、であり得る。
【0251】
設計：ＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３を標的とするケージ及びキーの概略設計が、図８Ａ～Ｂに示される。典型的なケージ及びキー標的タンパク質は、マウス免疫グロブリンカッパ（ｍＩｇｋ）からのシグナルペプチド、タンパク質精製用の６ｘのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）、タグを除去するためのタバコエッチングウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位、キーまたはケージドメイン、及び抗原結合ドメインを含有する。キー及びケージの「野生型」配列またはバリアントの両方を使用して、ＥｐＣＡＭとＣＤ１６３の両方に対して、ケージ及びキータンパク質を設計して、合計８つのタンパク質が得られた（表３）。ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインでは、本発明者らは、抗ＥｐＣＡＭ ＳｃＦｖを選択した：抗ＥｐＣＡＭ ＳｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）配列は、特許ＵＳ７，６３２，９２５Ｂ２に記載されており、この内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインでは、本発明者らは、抗ＣＤ１６３ ＳｃＦｖを選択した：抗ＣＤ１６３ ＳｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）配列は、特許ＵＳ９，７２４，４２６Ｂ２に記載されており、この内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインでは、抗ＣＤ１６３ ＳｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）配列は、特許ＵＳ１１，０３４，７７０Ｂ２に記載されており、この内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれ、使用することもできる。ケージ配列及びキー配列は、以下に記載されている：Ｌａｊｏｉｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０；３６９（６５１１）：１６３７－４３（この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0252】
ケージ及びキータンパク質の合成及びクローニング：表２のタンパク質配列をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をフラグメントとして合成し、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にクローニングした。得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ａ）細胞で増幅し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。
【0253】
Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質の発現及び精製
ＭＩＲＵＳ ＢＩＯ（商標）ＴＲＡＮＳＩＴ（商標）－２９３トランスフェクション試薬（ＭＩＲ ２７００ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）の製造者のプロトコールに従って、２９３細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間前に、１０ｃｍの組織培養処理済みディッシュに、２９３細胞をプレーティングし、トランスフェクション当日に、８０％のコンフルエンスを達成した。各Ｃｏ－ＬＯＣＫＲプラスミドのＭａｘｉ ＤＮＡを、ＴＲＡＮＳＩＴ（商標）－２９３試薬及び無血清培地と混合し、室温で２５分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を２９３細胞に滴加した。細胞を７２～９６時間インキュベーターに戻した。最後に、細胞培養上清を収集し、遠心分離して、孤立した細胞を分離し、精製中にセリンプロテアーゼ活性を阻害するために、最終濃度１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を補充した。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質を精製するために、上清１ｍｌ当たりＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１０μＬを、ＰＢＳＴで洗浄した。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質を含有する培養上清を、４℃で一晩回転させた。翌日、サンプルを４℃で５分間、５００ｇで遠心分離し、上清を吸引した。樹脂をＰＢＳＴに再懸濁させ、４℃で１０分間回転させて、以前と同様に、遠心分離した。この洗浄プロセスを合計３回繰り返した。樹脂１００μＬ当たり、溶出バッファー３００μＬ、ＰＢＳ中のイミダゾール１５０ｍＭを樹脂ベッドに添加し、サンプルを４℃で少なくとも１時間回転させた。サンプルを、４℃、５００ｇで５分間遠心分離し、ピペッティングで穏やかに再懸濁し、その後、ＭＩＣＲＯ ＢＩＯ－ＳＰＩＮ（商標）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に移した。カラムを微小遠心管に入れ、４℃、１０，０００ｇで１分間遠心分離した。ＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂からの溶出液を、ＰＢＳ中で最終容量６ｍＬに希釈し、３０ｋＤａのＭＷＣＯタンパク質濃縮器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加した。サンプルを、３，０００ｇで１５分間遠心分離した。濃縮器の下部チャンバーからのフロースルーを廃棄し、濃縮サンプルを５ｍＬのＰＢＳで希釈し、その後、上記条件下で遠心分離した。Ｈｉｓ精製実験構成物を含有する濃縮サンプルを収集し、後続の実験にすぐに使用するか、使用するまで－２０℃で凍結した。
ＭＩＲＵＳ ＢＩＯ（商標）ＴＲＡＮＳＩＴ（商標）－２９３トランスフェクション試薬（ＭＩＲ ２７００ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）の製造者のプロトコールに従って、２９３細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間前に、１０ｃｍの組織培養処理済みディッシュに、２９３細胞をプレーティングし、トランスフェクション当日に、８０％のコンフルエンスを達成した。各Ｃｏ－ＬＯＣＫＲプラスミドのＭａｘｉ ＤＮＡを、ＴＲＡＮＳＩＴ（商標）－２９３試薬及び無血清培地と混合し、室温で２５分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を２９３細胞に滴加した。細胞を７２～９６時間インキュベーターに戻した。最後に、細胞培養上清を収集し、遠心分離して、孤立した細胞を分離し、精製中にセリンプロテアーゼ活性を阻害するために、最終濃度１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を補充した。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質を精製するために、上清１ｍｌ当たりＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１０μＬを、ＰＢＳＴで洗浄した。Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質を含有する培養上清を、４℃で一晩回転させた。翌日、サンプルを４℃で５分間、５００ｇで遠心分離し、上清を吸引した。樹脂をＰＢＳＴに再懸濁させ、４℃で１０分間回転させて、以前と同様に、遠心分離した。この洗浄プロセスを合計３回繰り返した。樹脂１００μＬ当たり、溶出バッファー３００μＬ、ＰＢＳ中のイミダゾール１５０ｍＭを樹脂ベッドに添加し、サンプルを４℃で少なくとも１時間回転させた。サンプルを、４℃、５００ｇで５分間遠心分離し、ピペッティングで穏やかに再懸濁し、その後、ＭＩＣＲＯ ＢＩＯ－ＳＰＩＮ（商標）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に移した。カラムを微小遠心管に入れ、４℃、１０，０００ｇで１分間遠心分離した。ＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂からの溶出液を、ＰＢＳ中で最終容量６ｍＬに希釈し、３０ｋＤａのＭＷＣＯタンパク質濃縮器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加した。サンプルを、３，０００ｇで１５分間遠心分離した。濃縮器の下部チャンバーからのフロースルーを廃棄し、濃縮サンプルを５ｍＬのＰＢＳで希釈し、その後、上記条件下で遠心分離した。Ｈｉｓ精製実験構成物を含有する濃縮サンプルを収集し、後続の実験にすぐに使用するか、使用するまで－２０℃で凍結した。
【0254】
染色及び免疫ブロット分析：Ｃｏ－ＬＯＣＫＲタンパク質溶出液を、β－メルカプトエタノールを含有する２Ｘ－Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合した。混合物を９５℃で１０分間加熱し、サンプル２５μＬを、Ｎｏｖｅｘ ４－２０％トリスグリシンミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で分離した。発現及び純度を確認するために、ゲルをクマシーＧ－２５０染色で染色した（図９Ａ）。ゲルを脱イオン水で５分間洗浄し、クマシーＧ－２５０で２０分間染色した後、１０分間脱色した。ＬｉＣＯＲイメージングシステムを使用して、ゲルを撮影した。免疫ブロット分析では、ゲルからのタンパク質を、ナイロン膜に転写し、ＰＢＳＴで調製された５％のミルクを使用してブロックし、ＰＢＳＴで調製された０．５％のミルク中の抗Ｈｉｓ６一次抗体と共に一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、膜をＰＢＳＴで合計４回洗浄する。ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）から入手した抗マウス８００ＣＷ二次抗体で室温で３０分間、膜をプローブした。二次抗体を廃棄し、上記のように、膜を４回洗浄した。ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＸＦイメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ）で、膜を分析した（図９Ｂ）。
【0255】
【表3-1】
【0256】
【表3-2】
【0257】
【表3-3】
【0258】
実施例３－スプリットＣＡＲ－Ｔの生成
スプリットキメラ抗原受容体Ｔ細胞（スプリットＣＡＲ－Ｔ）システムでは、２つのモジュール（一方はＣＡＲを有し、他方はキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）を有する）は、同じＴ細胞で発現し、２つの異なる標的抗原を発現する標的細胞での、シグナル伝達のバランスとＴ細胞の細胞傷害活性の最大化を達成した（図１０）（２１）。ＣＡＲモジュールは、１つの抗原を標的とする抗原結合ドメインと、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む。ＣＣＲモジュールは、別の抗原を標的とする抗原結合ドメインと、２つ以上の共刺激ドメインを含有する。
スプリットキメラ抗原受容体Ｔ細胞（スプリットＣＡＲ－Ｔ）システムでは、２つのモジュール（一方はＣＡＲを有し、他方はキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）を有する）は、同じＴ細胞で発現し、２つの異なる標的抗原を発現する標的細胞での、シグナル伝達のバランスとＴ細胞の細胞傷害活性の最大化を達成した（図１０）（２１）。ＣＡＲモジュールは、１つの抗原を標的とする抗原結合ドメインと、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む。ＣＣＲモジュールは、別の抗原を標的とする抗原結合ドメインと、２つ以上の共刺激ドメインを含有する。
【0259】
設計：ＣＡＲ及びＣＣＲモジュールを標的とするＥｐＣＡＭ及びＣＤ１６３の概略設計が図１１に示される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲモジュールは、１）膜標的化のためのシグナルペプチド（ＧＭ－ＣＳＦまたはＣＤ８アルファ由来）、２）ＳｃＦｖ配列（抗ＥｐＣＡＭまたは抗ＣＤ１６３抗体のいずれか由来）、３）ヒンジ領域（ＣＤ８由来）、４）膜貫通ドメイン（ＣＤ８由来）、及び、５）ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン、を含むように設計された。いくつかの実施形態では、ＣＣＲモジュールは、１）膜標的化のためのシグナルペプチド（ＧＭ－ＣＳＦ由来）、２）ＳｃＦｖ配列（抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗ＣＤ１６３抗体のいずれか由来）、３）ヒンジ領域（ＣＤ２８由来）、４）膜貫通ドメイン（ＣＤ２８由来）、及び、５）ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び６）４－１ＢＢ共刺激ドメイン、を含むように設計された。ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインでは、本発明者らは、抗ＥｐＣＡＭ ＳｃＦｖを選択した：抗ＥｐＣＡＭ ＳｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）配列は、特許ＵＳ７，６３２，９２５Ｂ２に記載されており、この内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインでは、本発明者らは、抗ＣＤ１６３ ＳｃＦｖを選択した：抗ＣＤ１６３ ＳｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）配列は、特許ＵＳ９，７２４，４２６Ｂ２及びＵＳ１１，０３４，７７０Ｂ２に記載されており、これらのそれぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々なスプリットＣＡＲモジュールの配列は、表４に記載されている。
【0260】
スプリットＣＡＲモジュールの合成及びクローニング：表４のタンパク質配列をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を、フラグメントとして合成し、ｐＨＩＶ－ｄＴｏｍａｔｏまたはｐＨＩＶ－ｅＧＦＰレンチウイルスベクターバックボーン内にクローニングした。得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ａ）細胞で増幅し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。
【0261】
【表4-1】
【0262】
【表4-2】
【0263】
実施例１～３の参考文献：
１． Ｇａｓｔ ＣＥ，Ｓｉｌｋ ＡＤ，Ｚａｒｏｕｒ Ｌ，Ｒｉｅｇｌｅｒ Ｌ，Ｂｕｒｋｈａｒｔ ＪＧ，Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ ＫＴ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０１８；４（９）：ｅａａｔ７８２８．
２． Ｐｏｗｅｌｌ ＡＥ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＥＣ，Ｄａｖｉｅｓ ＰＳ，Ｓｉｌｋ ＡＤ，Ｐｅｌｚ Ｃ，Ｉｍｐｅｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ａ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｎｔｅｘｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；７１（４）：１４９７－５０５．
３． Ｓｕｔｔｏｎ ＴＬ，Ｗａｌｋｅｒ ＢＳ，Ｗｏｎｇ ＭＨ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｊｏｉｎ ｔｈｅ Ｆｒａｙ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１９；８（４）：５９５－６０７．
４． Ａｄａｍｓ ＤＬ，Ｍａｒｔｉｎ ＳＳ，Ａｌｐａｕｇｈ ＲＫ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｍ，Ｔｓａｉ Ｓ，Ｂｅｒｇａｎ ＲＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４；１１１（９）：３５１４－９．
５． Ｔａｎｇ ＣＭ，Ｚｈｕ Ｐ，Ｌｉ Ｓ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＯＶ，Ａｍｓｔｕｔｚ ＰＴ，Ａｄａｍｓ ＤＬ．Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｐｓｉｅｓ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｂｅｙｏｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２０１８；９３（１２）：１２４６－５０．
６． Ａｄａｍｓ ＤＬ，Ａｄａｍｓ ＤＫ，Ａｌｐａｕｇｈ ＲＫ，Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ ＳＳ，Ｃｈｕｍｓｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｂｅｎｉｇｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．２０１６；２５（７）：１０３７－４２．
７． Ａｇｕｉｒｒｅ ＬＡ，Ｍｏｎｔａｌｂａｎ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｋ，Ａｖｅｎｄａｎｏ－Ｏｒｔｉｚ Ｊ，Ｍａｒｉｎ Ｅ，Ｌｏｚａｎｏ Ｒ，Ｔｏｌｅｄａｎｏ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｕｓｅ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ－ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０２０；９（１）：１７７３２０４．
８． Ａｌｊａｂｅｒｙ Ｆ，Ｏｌｓｓｏｎ Ｈ，Ｇｉｍｍ Ｏ，Ｊａｈｎｓｏｎ Ｓ，Ｓｈａｂｏ Ｉ．Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６（４）：１５９ ｅ１９－ ｅ２６．
９． Ａｕｇｕｓｔｙｎ Ａ，Ａｄａｍｓ ＤＬ，Ｈｅ Ｊ，Ｑｉａｏ Ｙ，Ｖｅｒｍａ Ｖ，Ｌｉａｏ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｇｉａｎｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｃｈｅｍｏｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ．Ｃｌｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ．２０２１；２２（３）：ｅ４５１－ｅ６５．
１０． Ｃｌａｗｓｏｎ ＧＡ，Ｍａｔｔｅｒｓ ＧＬ，Ｘｉｎ Ｐ，Ｉｍａｍｕｒａ－Ｋａｗａｓａｗａ Ｙ，Ｄｕ Ｚ，Ｔｈｉｂｏｕｔｏｔ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（８）：ｅ０１３４３２０．
１１． Ｃｌａｗｓｏｎ ＧＡ，Ｍａｔｔｅｒｓ ＧＬ，Ｘｉｎ Ｐ，ＭｃＧｏｖｅｒｎ Ｃ，Ｗａｆｕｌａ Ｅ，ｄｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｅａｌｔｈ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ”ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（９）：ｅ０１８４４５１．
１２． Ｐａｗｅｌｅｋ ＪＭ．Ｔｕｍｏｕｒ－ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２００５；６（１２）：９８８－９３．
１３． Ｐａｗｅｌｅｋ ＪＭ．Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ： ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｓ ａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１４；３３（３）：１３３－９．
１４． Ｓｈａｂｏ Ｉ，Ｏｌｓｓｏｎ Ｈ，Ｓｕｎ ＸＦ，Ｓｖａｎｖｉｋ Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ１６３ ｉｎ ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅａｒｌｙ ｌｏｃａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００９；１２５（８）：１８２６－３１．
１５． Ｓｈａｂｏ Ｉ，Ｓｔａｌ Ｏ，Ｏｌｓｓｏｎ Ｈ，Ｄｏｒｅ Ｓ，Ｓｖａｎｖｉｋ Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１６３，ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｅａｒｌｙ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００８；１２３（４）：７８０－６．
１６． Ｓｈａｂｏ Ｉ，Ｓｖａｎｖｉｋ Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１１；７１４：１４１－５０．
１７． Ｓｈａｂｏ Ｉ，Ｓｖａｎｖｉｋ Ｊ，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ Ａ，Ｌｅｃｈｅｒｔｉｅｒ Ｔ，Ｔｒａｂｕｌｏ Ｓ，Ｈｕｌｉｔ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ，ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０２０；１１（３）：１２１－３５．
１８． Ｓｉｅｌｅｒ Ｍ，Ｗｅｉｌｅｒ Ｊ，Ｄｉｔｔｍａｒ Ｔ．Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｏａｄｓ ｔｏ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｓ．２０２１；１０（６）．
１９． Ｗａｌｋｅｒ ＢＳ，Ｓｕｔｔｏｎ ＴＬ，Ｚａｒｏｕｒ Ｌ，Ｈｕｎｔｅｒ ＪＧ，Ｗｏｏｄ ＳＧ，Ｔｓｉｋｉｔｉｓ ＶＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．２０２１；２８（１３）：８５６７－７８．
２０． Ｌａｊｏｉｅ ＭＪ，Ｂｏｙｋｅｎ ＳＥ，Ｓａｌｔｅｒ ＡＩ，Ｂｒｕｆｆｅｙ Ｊ，Ｒａｊａｎ Ａ，Ｌａｎｇａｎ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｇｉｃ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０；３６９（６５１１）：１６３７－４３．
２１． Ｋｌｏｓｓ ＣＣ，Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ Ｍ，Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ Ｍ，Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｍ，Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（１）：７１－５．
１． Ｇａｓｔ ＣＥ，Ｓｉｌｋ ＡＤ，Ｚａｒｏｕｒ Ｌ，Ｒｉｅｇｌｅｒ Ｌ，Ｂｕｒｋｈａｒｔ ＪＧ，Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ ＫＴ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０１８；４（９）：ｅａａｔ７８２８．
２． Ｐｏｗｅｌｌ ＡＥ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＥＣ，Ｄａｖｉｅｓ ＰＳ，Ｓｉｌｋ ＡＤ，Ｐｅｌｚ Ｃ，Ｉｍｐｅｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ａ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｎｔｅｘｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；７１（４）：１４９７－５０５．
３． Ｓｕｔｔｏｎ ＴＬ，Ｗａｌｋｅｒ ＢＳ，Ｗｏｎｇ ＭＨ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｊｏｉｎ ｔｈｅ Ｆｒａｙ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１９；８（４）：５９５－６０７．
４． Ａｄａｍｓ ＤＬ，Ｍａｒｔｉｎ ＳＳ，Ａｌｐａｕｇｈ ＲＫ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｍ，Ｔｓａｉ Ｓ，Ｂｅｒｇａｎ ＲＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４；１１１（９）：３５１４－９．
５． Ｔａｎｇ ＣＭ，Ｚｈｕ Ｐ，Ｌｉ Ｓ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＯＶ，Ａｍｓｔｕｔｚ ＰＴ，Ａｄａｍｓ ＤＬ．Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｐｓｉｅｓ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｂｅｙｏｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２０１８；９３（１２）：１２４６－５０．
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１１． Ｃｌａｗｓｏｎ ＧＡ，Ｍａｔｔｅｒｓ ＧＬ，Ｘｉｎ Ｐ，ＭｃＧｏｖｅｒｎ Ｃ，Ｗａｆｕｌａ Ｅ，ｄｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｅａｌｔｈ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ”ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（９）：ｅ０１８４４５１．
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１７． Ｓｈａｂｏ Ｉ，Ｓｖａｎｖｉｋ Ｊ，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ Ａ，Ｌｅｃｈｅｒｔｉｅｒ Ｔ，Ｔｒａｂｕｌｏ Ｓ，Ｈｕｌｉｔ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ，ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０２０；１１（３）：１２１－３５．
１８． Ｓｉｅｌｅｒ Ｍ，Ｗｅｉｌｅｒ Ｊ，Ｄｉｔｔｍａｒ Ｔ．Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｏａｄｓ ｔｏ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｓ．２０２１；１０（６）．
１９． Ｗａｌｋｅｒ ＢＳ，Ｓｕｔｔｏｎ ＴＬ，Ｚａｒｏｕｒ Ｌ，Ｈｕｎｔｅｒ ＪＧ，Ｗｏｏｄ ＳＧ，Ｔｓｉｋｉｔｉｓ ＶＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．２０２１；２８（１３）：８５６７－７８．
２０． Ｌａｊｏｉｅ ＭＪ，Ｂｏｙｋｅｎ ＳＥ，Ｓａｌｔｅｒ ＡＩ，Ｂｒｕｆｆｅｙ Ｊ，Ｒａｊａｎ Ａ，Ｌａｎｇａｎ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｇｉｃ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０；３６９（６５１１）：１６３７－４３．
２１． Ｋｌｏｓｓ ＣＣ，Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ Ｍ，Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ Ｍ，Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｍ，Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（１）：７１－５．
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図1-7】
【図1-8】
【図1-9】
【図1-10】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】