特表 2025-501358 Ｔ細胞受容体、その製造方法、及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-17

(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体、その製造方法、及び使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/725 20060101AFI20250109BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250109BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250109BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250109BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250109BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20250109BHJP

【ＦＩ】

C07K14/725 ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61K38/17

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/17

A61P35/00

A61P37/04

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024540916

(86)(22)【出願日】2022-12-29

(85)【翻訳文提出日】2024-07-04

(86)【国際出願番号】 CN2022143567

(87)【国際公開番号】W WO2023131053

(87)【国際公開日】2023-07-13

(31)【優先権主張番号】202210005890.X

(32)【優先日】2022-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524255106

【氏名又は名称】蘇州系統医学研究所

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＺＨＯＵ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】李 貴登

(72)【発明者】

【氏名】程 洪成

(72)【発明者】

【氏名】邱 雅静

(72)【発明者】

【氏名】許 悦

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA02

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

Ｔ細胞受容体の構築及びその使用を提供する。Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖の細胞内定常領域部位の突然変異を利用して、ＴＣＲ抗原信号が活性化された後のＴ細胞受容体の分解を阻害し、細胞の表面のＴＣＲレベルを維持し、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法の効果を高める。該方法は、様々なＴＣＲ－Ｔ細胞療法に適している。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖を含む、単離されたＴ細胞受容体又はその断片であって、
前記ＴＣＲ β鎖は、ＴＣＲ β鎖可変領域とＴＣＲ β鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、
（１）野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される、ことを特徴とするＴ細胞受容体又はその断片。

【請求項2】

前記野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項3】

前記ＴＣＲ α鎖はＴＣＲ α鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ α鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（３）（１）又は（２）に記載の野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択され、
任意選択で 、前記ＴＣＲ α鎖は、ＴＣＲ α鎖可変領域をさらに含む、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項4】

ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖を含む、単離されたＴ細胞受容体又はその断片であって、
前記ＴＣＲ α鎖は、ＴＣＲ α鎖可変領域とＴＣＲ α鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ α鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、
（１）野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択される、ことを特徴とするＴ細胞受容体又はその断片。

【請求項5】

前記野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択される、ことを特徴とする請求項４に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項6】

前記ＴＣＲ β鎖はＴＣＲ β鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（３）（１）又は（２）に記載の野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択され、
任意選択で、前記ＴＣＲ β鎖はＴＣＲ β鎖可変領域をさらに含む、ことを特徴とする請求項４～５のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項7】

前記単離されたＴ細胞受容体は、ポリペプチド系抗原、脂質系抗原、又は多糖系抗原を認識する、ことを特徴とする前記請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項8】

前記単離されたＴ細胞受容体は、腫瘍抗原、微生物抗原、又は自己抗原を認識する、ことを特徴とする前記請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項9】

前記単離されたＴ細胞受容体は、ＢＣＭＡ、ＣＡ９、ＣＴＡＧ、ＣＣＬ－１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＧ－２、ＥＰＧ－４０、ＦＣＲＬ５、ＦＢＰ、ＯＧＤ２、ＧＰＣ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＬＲＲＣ８Ａ、ＣＭＶ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＲＴ－１、ＮＣＡＭ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＰＢＧ、ＴＡＧ７２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種の抗原、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種の抗原を認識する、ことを特徴とする請求項８に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項10】

前記ＴＣＲ β鎖可変領域は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ β鎖可変領域、又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ β鎖可変領域から選択される、ことを特徴とする前述請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項11】

前記ＴＣＲ α鎖可変領域は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ α鎖可変領域、又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ α鎖可変領域から選択される、ことを特徴とする前述請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項12】

以下の特徴のうちの１つ又は複数を含む、前述請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。
（１）前記ＴＣＲ α鎖細胞外定常領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種のＴＣＲ α鎖細胞外定常領域に由来する。
（２）前記ＴＣＲ α鎖細胞外定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。
（３）前記ＴＣＲ α鎖膜貫通領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種のＴＣＲ α鎖膜貫通領域に由来する。
（４）前記ＴＣＲ α鎖膜貫通領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。
（５）前記ＴＣＲ β鎖細胞外定常領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種のＴＣＲ β鎖細胞外定常領域に由来する。
（６）前記ＴＣＲ β鎖細胞外定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。
（７）前記ＴＣＲ β鎖膜貫通領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種のＴＣＲ β鎖膜貫通領域に由来する。
（８）前記ＴＣＲ β鎖膜貫通領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【請求項13】

前記ＴＣＲ α鎖定常領域及びＴＣＲ β鎖定常領域は、
（１）前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、
（２）前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、又は
（３）前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるものから選択される、ことを特徴とする前述請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項14】

シグナルペプチドをさらに含み、前記シグナルペプチドは、ＴＣＲ α鎖可変領域及び／又はＴＣＲ β鎖可変領域とシグナルペプチド－可変領域構造を形成する、前述請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項15】

前記シグナルペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド、ＣＤ８αシグナルペプチド又は免疫グロブリンシグナルペプチドである、ことを特徴とする請求項１４に記載の単離されたＴ細胞受容体。

【請求項16】

前述請求項のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞受容体又はその断片をコードする、単離された核酸又はその断片。

【請求項17】

請求項１６に記載の単離された核酸又はその断片を含む、核酸構築物。

【請求項18】

請求項１７に記載の核酸構築物を含む、ベクター。

【請求項19】

発現ベクター又はｃｒｉｓｐｅｒ遺伝子編集ベクター、好ましくはレトロウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。

【請求項20】

請求項１７に記載の核酸構築物、又は請求項１８～１９のいずれか１項に記載のベクターを含む、工学的細胞。

【請求項21】

Ｔ細胞、例えばヒトＴ細胞である、請求項２０に記載の工学的細胞。

【請求項22】

工学的細胞の生産方法であって、
請求項１７に記載の核酸構築物又は請求項１８～１９のいずれか１項に記載のベクターを用いて宿主細胞への形質転換又は形質導入を行うステップ（１）と、
適切な培地にて宿主細胞を培養するステップ（２）と、
培地又は細胞から工学的細胞を単離して精製するステップ（３）と、を含む、生産方法。

【請求項23】

（１）抗原刺激中のＴ細胞受容体の分解阻害、
（２）腫瘍に対する殺傷効果の提供、又は腫瘍の成長阻害、
（３）Ｔ細胞の増殖能維持、及び
（４）抗腫瘍免疫薬及び細胞の調製のうちの１つ又は複数の用途における、前記請求項のいずれか１項に記載の前記単離されたＴ細胞受容体又はその断片、核酸又はその断片、核酸構築物、ベクター又は工学的細胞の使用。

【請求項24】

Ｔ細胞受容体の改変方法であって、
野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンをアルギニン又はアラニンに突然変異するステップ（１）、及び／又は
野生型ＴＣＲα鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンをアラニンに突然変異するステップ（２）を含む、Ｔ細胞受容体の改変方法。

【請求項25】

（１）前記野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、請求項２に記載の野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される、及び／又は
（２）前記野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、請求項５に記載の野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択される、ことを特徴とする請求項２４に記載のＴ細胞受容体の改変方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、Ｔ細胞受容体の分野に関し、具体的には、改変されたＴ細胞受容体の構築及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍は、人間の健康と生命を深刻に脅かしており、人間の死の主な原因の１つであり、その発生率は年々増加している。従来のがん治療法は、外科的治療を主とし、放射線療法と化学療法を補助とする。従来の治療法と比較して、腫瘍免疫療法は、免疫系を標的とし、腫瘍に対する全身反応を刺激するものである。さらに、臨床データは、腫瘍免疫療法が特定の腫瘍タイプの患者の予後を大幅に改善できることを示している。抗原特異的Ｔ細胞の養子移入は腫瘍免疫療法の主要な方法の１つであり、血液腫瘍及び固形腫瘍の治療のために研究されている。これは、主に、様々な腫瘍抗原を認識できるＴ細胞表面のＴ細胞受容体に基づいており、それによって腫瘍細胞の殺傷と除去を実現する。

【0003】

現段階でさらに研究が進められているＴ細胞養子療法には、主にＣＡＲ－Ｔ細胞療法とＴＣＲ－Ｔ療法が含まれる。このうち、ＣＡＲ－Ｔは、特定の腫瘍抗原を認識する抗体の抗原結合部分がインビトロでＣＤ３－ζ鎖に結合してキメラタンパク質を形成し、遺伝子導入によってこのキメラタンパク質を患者のＴ細胞にトランスミッションし、患者のＴ細胞にキメラ抗原受容体を発現させるものである。患者のＴ細胞が「再コード化」されると、多数の腫瘍Ｔ細胞が生成され、それによって腫瘍殺傷作用が果たされる。ＴＣＲ－Ｔ療法では、Ｔ細胞は、標的細胞の表面にある主要組織適合性複合体（ＭＨＣ：Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ）によって提示される抗原を、その表面のＴＣＲで認識し、それによって標的細胞を直接攻撃して殺傷する。これは、天然のＴＣＲに基づいた、又はＴＣＲの弱い変改により開発されたＴ細胞治療技術である。腫瘍細胞の表面上の主要組織適合性複合体分子によって提示される腫瘍エピトープを認識する能力があるため、より幅広い適用可能性がある。

【0004】

ＴＣＲ－Ｔ細胞療法の標的は、Ｔ細胞の表面に発現する抗原ＴＣＲに依存し、ＴＣＲはＴ細胞の表面にある受容体であり、非共有結合を介してＣＤ３に結合してＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成し、ＭＨＣによって提示される抗原を認識して結合することによってＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞の分裂と分化を促進する。ＣＡＲとは異なり、ほとんどのＴＣＲはα鎖とβ鎖で構成されるヘテロ二量体であり、α鎖とβ鎖の両方に抗原結合領域、定常領域、及び膜貫通ドメインが含まれている。これらのα鎖とβ鎖は、各鎖の所定の領域内に位置する保存システイン残基間のジスルフィド結合によって共有結合している。ＣＡＲ－Ｔ療法と比較して、ＴＣＲ－Ｔは、ほとんどの細胞内抗原を標的とすることができ、表面抗原に限定されないものではなく、つまり、ＴＣＲ－Ｔは、ほとんどの腫瘍抗原を標的としており、特に腫瘍細胞の細胞内抗原を認識することができる。したがって、Ｔ細胞受容体による腫瘍の認識範囲は、抗体医薬品や抗体に依存して腫瘍を認識するＣＡＲ－Ｔの範囲よりも広い。さらに、ＣＡＲ－Ｔは固形腫瘍の治療において欠陥があり、ＴＣＲ－Ｔ技術はこの問題を解決すると期待されている。

【0005】

現在、ＴＣＲ－Ｔによる腫瘍治療の効果を改善又は強化するために、様々なＴＣＲ－Ｔ最適化及び改良方法がある。これらの方法は、主に、Ｔ細胞が腫瘍抗原に結合する「プローブ」であるＴＣＲを改変することにより、腫瘍細胞に対するＴ細胞の認識プロセスを強化し、腫瘍細胞に対するＴリンパ球の親和性を向上させ、これにより、もともと腫瘍認識能力を持たなかったＴ細胞が効率よく腫瘍細胞を認識して殺傷することができるようにするものである。具体的には、次のものが含まれる。

【0006】

（１）外因性ＴＣＲの発現を増加させ、ＴＣＲ－Ｔの抗腫瘍効果を強化する。ａ．ＴＣＲ定常領域のマウス化：遺伝子工学的手法を使用してＴＣＲ定常領域をマウス化することで、内因性及び外因性のＴＣＲミスマッチを軽減又は防止し、外因性ＴＣＲの優先的なペアリングを促進し、それによってＴ細胞表面抗原の発現レベルを向上させ、ＴＣＲ－Ｔの抗腫瘍効果を高める。ｂ．ＴＣＲ定常領域システイン挿入法：システインをＴＣＲ α鎖とβ鎖の定常領域に導入することにより、外因性ＴＣＲの優先的なペアリングを促進し、外因性ＴＣＲの表面発現レベルを向上させ、内因性ＴＣＲ鎖とのミスマッチを減少させる。この方法により、腫瘍反応性Ｔ細胞の有効性と安全性を向上させることができる。ｃ．ＴＣＲ膜貫通領域への疎水性突然変異の挿入：ＴＣＲα鎖の膜貫通領域の疎水性を高めることでＴＣＲの安定性を向上させ、Ｔ細胞表面でのＴＣＲ発現を向上させ、それにより細胞親和性と抗腫瘍ＴＣＲ活性を向上させる。

【0007】

（２）外因性ＴＣＲの腫瘍抗原への親和性を向上させる。合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体法（ＳＴＡＲ：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）：抗体の抗原結合領域のＶＨとＶＬをそれぞれＴＣＲαβ定常領域に挿入することで、ＣＡＲの高い親和性とＴＣＲ複合体の高いシグナル伝達能を併せ持ち、ＴＣＲ－Ｔの抗腫瘍効果を高める。

【0008】

修飾ＴＣＲ－Ｔ細胞養子療法は、転移性黒色腫やその他の悪性腫瘍の治療で良好な結果を達成しているが、腫瘍の治療には依然として多くの限界がある。

【0009】

（１）Ｔ細胞の機能不全：ａ．腫瘍微小環境内での継続的な抗原刺激は、ＰＤ－１、Ｌａｇ－３、ＣＤ３９やＴＩＭ－３などの阻害性受容体の発現向上など、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の枯渇を引き起こす。ｂ．低酸素及び低ｐＨの腫瘍微小環境は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αなどの炎症誘発性サイトカインの分泌レベルの低下、Ｔ細胞の増殖及び自己複製能力の低下、代謝活動障害など、Ｔ細胞エフェクター機能の進行性の喪失を引き起こす。

【0010】

（２）Ｔ細胞表面のＴＣＲの発現レベルが低下する。腫瘍微小環境における抗原刺激により、ＣＤ８^＋Ｔ細胞表面での外因性ＴＣＲの発現が低下し、又は分解が促進され、腫瘍細胞を攻撃するのに十分なＴＣＲ－Ｔ細胞が存在しなくなる。

【0011】

（３）治療毒性は臨床治療中に存在する。現在、ＴＣＲ－Ｔが標的とする抗原には腫瘍組織が存在することはほとんどないため、治療中に腫瘍を標的とした腫瘍外毒性が発生する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

上記のＴＣＲ－Ｔ細胞療法のいくつかの技術上の欠点に対して、本願の目的は、分解を阻害することができるＴ細胞受容体を提供し、ＴＣＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を高めることである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

一態様では、本願は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の単離されたＴＣＲ α鎖又はその断片を提供し、前記ＴＣＲ α鎖は、ＴＣＲ α鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ α鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域であり、前記突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異したものである。

【0014】

別の態様では、本願は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の単離されたＴＣＲ β鎖又はその断片を提供し、前記ＴＣＲ β鎖は、ＴＣＲ β鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域であり、前記突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域のうちの少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異したものである。

【0015】

別の態様では、本願は、前述の何れかに記載のＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖を含む、単離されたＴ細胞受容体又はその断片を提供する。

【0016】

別の態様では、本願は、１種又は複数種のＴ細胞受容体、例えばＦ５－ＷＴ ＴＣＲ、Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ、Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ又はＦ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲ、例えば１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ又は１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲを提供する。

【0017】

別の態様では、本願は、前述の何れかの単離されたＴＣＲ α鎖又はその断片、ＴＣＲ β鎖若しくはその断片、又はＴ細胞受容体若しくはその断片をコードする、単離された核酸又はその断片を提供する。

【0018】

別の態様では、前述の何れかの単離された核酸又はその断片を含む、本願は、核酸構築物を提供する。

【0019】

別の態様では、本願は、前述の何れかの核酸構築物を含む、ベクターを提供する。

【0020】

別の態様では、本願は、前述の何れかの核酸構築物又はベクターを含む、工学的細胞を提供する。

【0021】

別の態様では、本願はまた、本願の前述の何れかのＴＣＲ核酸構築物がＴ細胞で産生するＴＣＲ複合体を提供する。

【0022】

別の態様では、本願は、ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ培養における機能検出を提供する。

【0023】

別の態様では、本願は、
（１）抗原刺激中のＴ細胞受容体の分解阻害、
（２）腫瘍に対する殺傷効果の提供、又は腫瘍の成長阻害、
（３）Ｔ細胞の増殖能維持、及び
（４）抗腫瘍免疫薬及び細胞の調製のうちの１つ又は複数の用途における、前述の何れかの単離されたＴＣＲ α鎖又はその断片、ＴＣＲβ鎖又はその断片、Ｔ細胞受容体又はその断片、核酸又はその断片、核酸構築物、ベクター又は工学的細胞の使用を提供する。

【0024】

別の態様では、本願による突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞療法は、単独で使用される、他の療法と併用されるか、又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、サイトカイン療法若しくは放射線療法と化学療法と併用される。

【0025】

別の態様では、本願は、
野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンをアルギニン又はアラニンに突然変異するステップ（１）、及び／又は
野生型ＴＣＲα鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンをアラニンに突然変異するステップ（２）を含む、Ｔ細胞受容体の改変方法を提供する。

【発明の効果】

【0026】

本願では、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖細胞内定常領域のユビキチン化修飾部位の突然変異を利用して、ＴＣＲ抗原シグナル活性化後のＴ細胞受容体の分解を阻害し、細胞表面のＴＣＲレベルを維持する。この方法は、様々なＴＣＲ－Ｔ細胞療法に適用できる。

【0027】

一方、抗原刺激後、ＷＴ ＴＣＲ細胞（野生型ＴＣＲ細胞）と比較して、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞は、細胞表面のＴＣＲ発現がより多く、インビトロ培養の過程で、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞への分化表現型を示し、インビトロ枯渇モデルにより、ＷＴ ＴＣＲと比較して、ＫＲ ＴＣＲとｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞の枯渇レベルがより低く、この表現型の変化は、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞内の健康なミトコンドリア状態のおかげであり、この結果、インビトロで培養された突然変異体ＴＣＲ－Ｔ細胞がより低いミトコンドリア膜電位とＲＯＳレベルを示した。一方、本願では、マウス移植腫瘍－Ｔ細胞養子モデルにより、ＷＴ ＴＣＲよりもＫＲ ＴＣＲ及びｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞に強い抗腫瘍効果があることや、ｄＭＵＴ ＴＣＲ突然変異体群ではマウスの脾臓及び血液中にはＴＣＲ－Ｔ細胞がより多く存在するのに対し、腫瘍組織には、ＫＲ ＴＣＲ及びｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞数の割合が顕著に増加していることを明らかにした。細胞表現型に関しては、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ群では、マウスの脾臓にはセントラルメモリーＴ細胞がより多く蓄積され、腫瘍組織にはｄＭＵＴ突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞がより低いＴ細胞枯渇表現型及び増殖能を示した。したがって、ＫＲ ＴＣＲ及びｄＭＵＴ ＴＣＲ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞を同量導入した療法では、より優れた腫瘍増殖阻害の潜在力を示している。

【0028】

理解されるように、本願は、ＴＣＲ細胞内定常領域のアミノ酸の突然変異によって、ＴＣＲの分解を阻害するだけでなく、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法の効果も高め、固形腫瘍に限定されず、血液腫瘍又はリンパ腫であってもよい腫瘍の成長を効果的に阻害することができる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】抗原刺激は細胞表面ＴＣＲの分解を促進する。（Ａ）Ｋ５６２－ＮＹＥＳＯ－１を接種した担癌マウスでは、１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞を導入してから１２日後、脾臓及び腫瘍中のＴＣＲ－Ｔ細胞表面ＴＣＲの発現を検出する。（Ｂ）インビトロ機能実験はすべてヒト初代Ｔ細胞上で行った。１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞をインビトロで培養し、それぞれＫ５６２－ＮＹＥＳＯ－１及びＫ５６２－ＭＡＲＴ－１細胞とそれぞれ１２時間共インキュベートし、ＴＣＲの分解を検出する。（Ｃ）活性化したＦ５－ＴＣＲ－Ｔ細胞をインビトロで培養し、ＣＤ３抗体刺激１２時間後、ＴＣＲの分解を検出する。（Ｄ）活性化した１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞をインビトロで培養し、ＣＤ３抗体刺激１２時間後、ＴＣＲの分解を検出する。

【図2】突然変異によるＴＣＲのダウンレギュレーション及び分解の阻害結果を示す図である。インビトロ機能実験はすべてヒト初代Ｔ細胞上で行った。（Ａ）分解が阻害されたＴＣＲ突然変異の模式図。（Ｂ）突然変異後の１Ｇ４－ＴＣＲのヒト初代Ｔ細胞での発現。（Ｃ）インビトロで活性化された各突然変異Ｆ５－ＴＣＲ－Ｔ細胞をＣＤ３抗体刺激１２時間後、各ＴＣＲの分解を検出する（「Ｒ」はＣＤ３抗体刺激なし、「Ｓ」はＣＤ３抗体刺激あり）。（Ｄ）インビトロで活性化された各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞をＣＤ３抗体刺激１２時間後、各ＴＣＲの分解を検出する（「Ｒ」はＣＤ３抗体刺激なし、「Ｓ」はＣＤ３抗体刺激あり）。（Ｅ）インビトロで活性化された各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞をＣＤ３抗体で様々な時間だけ刺激し、各ＴＣＲの発現を検出する。

【図3】突然変異による１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ機能への影響を示す図である。インビトロ機能実験はすべてヒト初代Ｔ細胞上で行った。（Ａ）インビトロで活性化されたＴＣＲ－Ｔ細胞について、ＣＤ４５ＲＯとＣＤ２７をメモリーＴ細胞分化指標とし、フローサイトメトリー検出を行った。（Ｂ）活性化した１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞について、メモリーＴ細胞分化指標ＣＤ６２Ｌを検出する。（Ｃ）インビトロで活性化された１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞について、メモリーＴ細胞分化指標ＴＣＦ－１を検出した。（Ｄ）インビトロ枯渇モデルを用いて、各突然変異体ＴＣＲ－Ｔ細胞枯渇分子ＬＡＧ－３の発現を検出する。（Ｅ）インビトロ枯渇モデルを用いて、ＴＣＲ－Ｔ細胞枯渇の重要な転写因子ＴＯＸの発現を検出する。（Ｆ）インビトロ枯渇モデルを用いて、突然変異体ＴＣＲ－Ｔサイトカインの産生を検出する。

【図4】各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞のミトコンドリア機能状態を比較した図である。インビトロ実験はすべてヒト初代Ｔ細胞上で行った。（Ａ）各ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ活性化１２日後、細胞内のミトコンドリア数を検出する。（Ｂ）突然変異後の１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞内のミトコンドリア膜電位の変化を検出する。（Ｃ）インビトロで活性化された１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞について、その細胞内ミトコンドリアのＲＯＳ産生レベルを検出する。（Ｄ）各ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ活性化１２日後、２－ＮＢＤＧ処理後、ＦＡＣＳフローサイトメトリー分析により、ＴＣＲ－Ｔ細胞のグルコースの取り込みを検出する。（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ Ｃ１６の取り込み実験により、各突然変異群のＴＣＲ－Ｔ細胞の細胞外脂肪酸の利用効率を検出する。

【図5】各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を比較した図である。（Ａ）１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞を接種したＫ５６２－ＮＹＥＳＯ－１ ＮＳＧ担癌マウスについて様々な時点での腫瘍サイズを統計した図である。Ｋ５６２－ＮＹＥＳＯ－１ ＮＳＧ担癌マウスにＴ細胞を導入した後、１２日目に各突然変異群の腫瘍組織の重量（Ｂ）を検出し、また、担癌マウスの血液（Ｃ）、脾臓（Ｄ）及び腫瘍組織（Ｅ）中に導入されたＴＣＲ－Ｔ細胞の割合を検出する。

【図6】マウスにおける１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞の機能に対する突然変異の影響を示す図である。（Ａ）ＮＳＧ担癌マウスの脾臓では、ＣＤ４５ＲＯとＣＤ２７をメモリーＴ細胞分化指標とし、各突然変異群に対してフローサイトメトリー検出を行った。（Ｂ）ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織内で、各突然変異群のメモリーＴ細胞分化指標ＣＤ６２Ｌの発現を検出する。（Ｃ）ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織内で、各突然変異群のメモリーＴ細胞分化指標ＣＣＲ７の発現を検出する。（Ｄ）ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織内で、各突然変異群の枯渇Ｔ細胞ＰＤ－１^＋ＴＩＭ－３^＋二重陽性細胞の割合を検出して統計した図。ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織内の各突然変異群のＴＣＲ－Ｔ細胞の免疫抑制分子ＰＤ－１（Ｅ）、ＴＩＭ－３（Ｆ）、ＬＡＧ－３（Ｇ）、及びＣＤ３９（Ｈ）の発現を検出する。（Ｉ）ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織内で、各突然変異群の転写因子ＴＯＸの発現を検出する。（Ｊ）ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織のＩＦＮ－γ^＋陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を検出する。（Ｋ）ＮＳＧ担癌マウスの腫瘍組織のＩＦＮ－γ^＋ＴＮＦ－α^＋二重陽性ＴＣＲ－Ｔ細胞の割合を検出する。

【発明を実施するための形態】

【0030】

一態様では、本願は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の単離されたＴＣＲ α鎖又はその断片を提供し、前記ＴＣＲ α鎖はＴＣＲ α鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ α鎖細胞内定常領域を含む。任意選択で、前記ＴＣＲ α鎖は、ＴＣＲ α鎖可変領域をさらに含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖定常領域及びそれに対応するＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、並びにＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、それぞれヒト、マウス又は他の哺乳動物種の野生型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常領域に由来する。

【0032】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域である。

【0033】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域であり、前記突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異したものであり、例えばヒト、マウス又は他の哺乳動物種の野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域に由来する。

【0034】

いくつかの実施形態では、前記突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異したものであり、前記野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列の１つ又は２つ（全部）のセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域である。

【0035】

いくつかの実施形態では、前記突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0036】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖はＴＣＲ α鎖可変領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖可変領域は、１種又は複数種の抗原を結合して認識することができ、この抗原には、ポリペプチド系抗原（例えば、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、及びＭＡＲＴ－１）、脂質系抗原（例えば、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、及びＬＰＥ）、及び多糖系抗原（例えば、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、及びＣＡ１２５）が含まれるが、これらに限定されない。

【0037】

いくつかの実施形態では、前記抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原、又は自己抗原、例えばＢＣＭＡ、ＣＡ９、ＣＴＡＧ、ＣＣＬ－１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＧ－２、ＥＰＧ－４０、ＦＣＲＬ５、ＦＢＰ、ＯＧＤ２、ＧＰＣ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＬＲＲＣ８Ａ、ＣＭＶ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＲＴ－１、ＮＣＡＭ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＰＢＧ、ＴＡＧ７２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種の抗原である。

【0038】

いくつかの実施形態では、前記抗原は、腫瘍抗原、例えばＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種である。前記抗原は、細胞表面抗原、又は細胞内抗原であってもよい。

【0039】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列を含み、又は当該アミノ酸配列からなり、腫瘍抗原ＭＡＲＴ－１を認識し、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列を含み、又は当該アミノ酸配列からなり、腫瘍抗原ＮＹＥＳＯ－１を認識する。

【0040】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。前記相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に含まれる。

【0041】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、腫瘍抗原ＭＡＲＴ－１を認識し、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、腫瘍抗原ＮＹＥＳＯ－１を認識する。

【0042】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖細胞外定常領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来するＴＣＲ α鎖細胞外定常領域である。

【0043】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖細胞外定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0044】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖膜貫通領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来するＴＣＲ α鎖膜貫通領域である。

【0045】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖膜貫通領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0046】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ 又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0047】

一態様では、本願は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の単離されたＴＣＲ β鎖又はその断片を提供し、前記ＴＣＲ β鎖は、ＴＣＲ β鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含む。任意選択で、前記ＴＣＲ β鎖は、ＴＣＲ β鎖可変領域をさらに含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖定常領域及びそれに対応するＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、それぞれ、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種の野生型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域に由来する。

【0049】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域である。

【0050】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域であり、前記突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域のうちの少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異したもの、例えばヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域である。

【0051】

いくつかの実施形態では、前記突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異したものであり、前記野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列の１つ、２つ又は３つ（全部）のリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の１つ又は２つ（全部）のリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域である。

【0052】

いくつかの実施形態では、前記突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0053】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖はＴＣＲ β鎖可変領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖可変領域は、１種又は複数種の抗原を結合して認識することができ、この抗原には、ポリペプチド系抗原（例えば、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、及びＭＡＲＴ－１）、脂質系抗原（例えば、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、及びＬＰＥ）、及び多糖系抗原（例えば、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４及びＣＡ１２５）が含まれるが、これらに限定されない。

【0054】

いくつかの実施形態では、前記抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原、又は自己抗原、例えばＢＣＭＡ、ＣＡ９、ＣＴＡＧ、ＣＣＬ－１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＧ－２、ＥＰＧ－４０、ＦＣＲＬ５、ＦＢＰ、ＯＧＤ２、ＧＰＣ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＬＲＲＣ８Ａ、ＣＭＶ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＲＴ－１、ＮＣＡＭ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＰＢＧ、ＴＡＧ７２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種の抗原である。

【0055】

いくつかの実施形態では、前記抗原は、腫瘍抗原、例えばＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種である。前記抗原は、細胞表面抗原、又は細胞内抗原であってもよい。

【0056】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなり、腫瘍抗原ＭＡＲＴ－１を認識し、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなり、腫瘍抗原ＮＹＥＳＯ－１を認識する。

【0057】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。前記相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７で示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５で示されるアミノ酸配列に含まれる。

【0058】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、腫瘍抗原ＭＡＲＴ－１を認識し、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、腫瘍抗原ＮＹＥＳＯ－１を認識する。

【0059】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖細胞外定常領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来するＴＣＲ β鎖細胞外定常領域である。

【0060】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖細胞外定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0061】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖膜貫通領域は、ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来するＴＣＲ β鎖膜貫通領域である。

【0062】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖膜貫通領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の突然変異を有するアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0063】

いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ 又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0064】

別の態様では、本願は、単離されたＴ細胞受容体又はその断片を提供し、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（３）（１）又は（２）に記載の野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択される。

【0066】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ β鎖を含み、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（３）（１）又は（２）に記載の野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される。

【0067】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域と前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は同時に野生型ではいけない。例えば、ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域が前述の何れかの野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域である場合、ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、前述の何れかの突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域であり、ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域が前述の何れかの突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域である場合、ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、前述の何れかの野生型又は突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域である。

【0068】

いくつかの実施形態では、本願は、単離されたＴ細胞受容体又はその断片を提供し、前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖を含み、前記ＴＣＲ β鎖は、ＴＣＲ β鎖可変領域とＴＣＲ β鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、
（１）野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される。

【0069】

さらに、前記野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、本願の前述の何れかの野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、例えば、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される。

【0070】

さらに、前記ＴＣＲ α鎖はＴＣＲ α鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ α鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、本願の前述の何れかの野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域又は突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、例えば、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（３）（１）又は（２）に記載の野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択され、
さらに、前記ＴＣＲ α鎖はＴＣＲ α鎖可変領域を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、本願は、ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖を含む、単離されたＴ細胞受容体又はその断片であって、前記Ｔ細胞受容体は、前記ＴＣＲ α鎖は、ＴＣＲ α鎖可変領域とＴＣＲ α鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ α鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ α鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ α鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、
（１）野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択される、ことを特徴とする単離されたＴ細胞受容体又はその断片を提供する。

【0072】

さらに、前記野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域は、本願の前述の何れかの野生型ＴＣＲα鎖細胞内定常領域、例えば、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域から選択される。

【0073】

さらに、前記ＴＣＲ β鎖はＴＣＲ β鎖定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖定常領域は、順に連結されたＴＣＲ β鎖細胞外定常領域、ＴＣＲ β鎖膜貫通領域、及びＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含み、前記ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域は、本願の前述のいずれかの野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域又は突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、例えば、
（１）ヒト、マウス又は他の哺乳動物種に由来する野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（３）（１）又は（２）に記載の野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに突然変異した突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域から選択される。

【0074】

さらに、前記ＴＣＲ β鎖は、ＴＣＲ β鎖可変領域を含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、前述の何れかのＴ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖可変領域及び／又はＴＣＲ β鎖可変領域を含む。前記ＴＣＲ α鎖可変領域及び／又はＴＣＲ β鎖可変領域は、１種又は複数種の抗原を結合して認識することができ、この抗原には、ポリペプチド系抗原（例えば、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、及びＭＡＲＴ－１）、脂質系抗原（例えば、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、及びＬＰＥ）、及び多糖系抗原（例えば、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、及びＣＡ１２５）が含まれるが、これらに限定されない。前記抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原、又は自己抗原、例えばＢＣＭＡ、ＣＡ９、ＣＴＡＧ、ＣＣＬ－１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＧ－２、ＥＰＧ－４０、ＦＣＲＬ５、ＦＢＰ、ＯＧＤ２、ＧＰＣ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＬＲＲＣ８Ａ、ＣＭＶ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＲＴ－１、ＮＣＡＭ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＰＢＧ、ＴＡＧ７２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種の抗原であってもよく、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１／Ａ３／Ａ４／Ａ６／Ａ１０／Ｃ２、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、ＭＡＲＴ－１、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲ２、ＬＭＰ１／２、ＢＲＬＦ－１、ＢＭＬＦ－１、ＨＰＶ－１６Ｅ６／Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、ＬＰＥ、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４、又はＣＡ１２５のうちの１種又は複数種である。前記抗原は、細胞表面抗原、又は細胞内抗原であってもよい。

【0079】

いくつかの実施形態では、前述の何れかのＴ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ β鎖可変領域、例えば、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ β鎖可変領域、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ β鎖可変領域、又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ β鎖可変領域を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、前述の何れかのＴ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖可変領域、例えば、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むＴＣＲ α鎖可変領域、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ α鎖可変領域、又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなるＴＣＲ α鎖可変領域を含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、前述の何れかのＴ細胞受容体のＴＣＲ α鎖可変領域及びＴＣＲ β鎖可変領域は、
（１）前記ＴＣＲ α鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、前記ＴＣＲ β鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むもの、
（２）前記ＴＣＲ α鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、前記ＴＣＲ β鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列に含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むもの、
（３）前記ＴＣＲ α鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、前記ＴＣＲ β鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むもの、
（４）前記ＴＣＲ α鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、前記ＴＣＲ β鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列のＣＤＲ３を含むもの、
（５）前記ＴＣＲ α鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、又は
（６）前記ＴＣＲ α鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列を含むか、又は当該アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるものから選択される。

【0082】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖細胞外定常領域及び／又はＴＣＲ β鎖細胞外定常領域を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖膜貫通領域及び／又はＴＣＲ β鎖膜貫通領域を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体は、前述の何れかのＴＣＲ α鎖定常領域及び／又はＴＣＲ β鎖定常領域を含む。例えば、前記ＴＣＲ α鎖定常領域及びＴＣＲ β鎖定常領域は、
（１）前記ＴＣＲ α鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、
（２）前記ＴＣＲ α鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるもの、又は
（３）前記ＴＣＲ α鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記ＴＣＲ β鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるものから選択される。

【0085】

別の態様では、本願は、Ｆ５－ＷＴ ＴＣＲ、Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ、Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ又はＦ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲを含む、１種又は複数種のＴ細胞受容体Ｆ５－ＴＣＲを提供する。前記Ｆ５－ＴＣＲ可変領域は、腫瘍抗原ＭＡＲＴ－１を認識し、前記Ｆ５－ＴＣＲ α鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列であり、前記Ｆ５－ＴＣＲ β鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列であり、
さらに、前記Ｆ５－ＷＴ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列であり、Ｆ５－ＷＴ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列であり、
さらに、前記Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列であり、Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列であり、
さらに、前記Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列であり、Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列であり、
さらに、前記Ｆ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列であり、Ｆ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列である。

【0086】

別の態様では、本願は、１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ又は１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲを含む、１種又は複数種のＴ細胞受容体１Ｇ４－ＴＣＲを提供する。前記１Ｇ４－ＴＣＲ可変領域は、腫瘍抗原ＮＹＥＳＯ－１を認識し、前記１Ｇ４－ＴＣＲ α鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列であり、又は、前記１Ｇ４－ＴＣＲ β鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列であり、
さらに、前記１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列であり、１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列であり、
さらに、前記１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列であり、１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列であり、
さらに、前記１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列であり、１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列である。

【0087】

さらに、前記１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲ α鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列であり、１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲ β鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列である。

【0088】

別の態様では、前述の何れかのＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖又はＴ細胞受容体は、さらにシグナルペプチドに結合され、前記シグナルペプチドは、ＴＣＲ α鎖可変領域及び／又はＴＣＲ β鎖可変領域とシグナルペプチド－可変領域構造を形成する。

【0089】

いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド、ＣＤ８αシグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチドから選択される。

【0090】

いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ α鎖シグナルペプチドアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ β鎖シグナルペプチドアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。

【0093】

本願の前述の何れかのＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖又はＴ細胞受容体を形成する上記の各部分は、互いに直接連結されてもよく、リンカー配列を介して連結されてもよい。リンカー配列は、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＳＡ、及びＧＧＳＧＧなどのモチーフが１～５個繰り返して隣接して連結された配列であり、その長さは３～２５アミノ酸残基である。

【0094】

別の態様では、本願は、前述の何れかの単離されたＴＣＲ α鎖若しくはその断片、ＴＣＲ β鎖若しくはその断片、又はＴ細胞受容体若しくはその断片をコードする、単離された核酸又はその断片を提供する。

【0095】

いくつかの実施形態では、野生型ＴＣＲ α鎖定常領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0096】

いくつかの実施形態では、野生型ＴＣＲ β鎖定常領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＳＡ ＴＣＲ α鎖定常領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＫＲ ＴＣＲ β鎖定常領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0099】

いくつかの実施形態では、Ｆ５－ＴＣＲ α鎖可変領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0100】

いくつかの実施形態では、Ｆ５－ＴＣＲ β鎖可変領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0101】

いくつかの実施形態では、１Ｇ４－ＴＣＲ α鎖可変領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0102】

いくつかの実施形態では、１Ｇ４－ＴＣＲ β鎖可変領域をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0103】

いくつかの実施形態では、Ｆ５－ＷＴ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0104】

いくつかの実施形態では、Ｆ５－ＳＡ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0105】

いくつかの実施形態では、Ｆ５－ＫＲ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0106】

いくつかの実施形態では、Ｆ５－ｄＭＵＴ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0107】

いくつかの実施形態では、１Ｇ４－ＷＴ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0108】

いくつかの実施形態では、１Ｇ４－ＳＡ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0109】

いくつかの実施形態では、１Ｇ４－ＫＲ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。

【0110】

いくつかの実施形態では、１Ｇ４－ｄＭＵＴ－ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる。別の態様では、本願は、前述の何れかの単離された核酸又はその断片を含む核酸構築物を提供する。

【0111】

いくつかの実施形態では、前記核酸構築物は、前記核酸に動作可能に連結された１つ又は複数の調節配列をさらに含む。例えば、宿主細胞において転写活性を示すプロモータ配列、宿主細胞において認識され転写を停止し、コード配列の３’末端に動作可能に連結された転写ターミネーター配列、宿主細胞の翻訳に重要なコード配列の５’末端に動作可能に連結されたプリアンブル配列などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0112】

別の態様では、本願は、前述の何れかの核酸構築物を含むベクターを提供する。

【0113】

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、発現ベクター又はｃｒｉｓｐｅｒ遺伝子編集ベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0114】

いくつかの実施形態では、前記レトロウイルスベクターの構築は、複製開始部位、５’－ＬＴＲ、３’－ＬＴＲ、及び前述のいずれかの核酸配列又は核酸構築物を主に含む。

【0115】

通常、プロモータをＴ細胞受容体をコードする核酸配列に作動可能に連結し、核酸構築物を発現ベクターに組み込むことで、Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド配列の発現を達成する。本願のＴ細胞受容体をコードする核酸配列は、多くのタイプのベクターにクローニングされ得る。例えば、プラスミド、ファージ、動物ウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0116】

適切な発現ベクターは、生体において機能する１つ又は複数のプロモータ配列、複製開始点、適切な酵素切断部位、及び選択可能なマーカーを含む。

【0117】

適切なプロモータは、これらに連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベル発現を駆動することができる、即時型初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、伸長因子－１ａ（ＥＦ－１ａ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモータなどの構成的プロモータ配列を含むが、これらに限定されず、また、ポリヌクレオチド配列の発現が予想される場合に開き、発現が予想されない場合に閉じるための、メタロチオネインプロモータやテトラサイクリンプロモータなどの誘導性プロモータを含むが、これらに限定されない。

【0118】

選択可能なマーカーは、ウイルスベクターを介して感染した細胞集団中の選択的に発現する細胞の同定を容易にするために、マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子を含む。適切なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子、ｎｅｏ遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。適切なレポーター遺伝子としては、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0119】

別の態様では、本願は、前述の何れかの核酸構築物又はベクターを含む工学的細胞を提供する。

【0120】

いくつかの実施形態では、前記工学的細胞は、被験者から得られる初代細胞である。いくつかの実施形態では、被験者は、哺乳動物被験者、例えばヒトである。

【0121】

いくつかの実施形態では、工学的細胞は、Ｔ細胞、好ましくは、ヒトＴ細胞である。

【0122】

いくつかの実施形態では、工学的細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、γδＴ細胞、人ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、又はＣＤ４^＋ Ｔ／ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の混合細胞集団である。

【0123】

通常の組換えＤＮＡ技術により、本願のＴＣＲ核酸構築物又は前記核酸構築物を含むベクターを利用して、ＴＣＲ又は前記ＴＣＲを含む工学的細胞を発現又は生産することができる。通常、前記方法は、
本願のＴＣＲ核酸構築物又は前記核酸構築物を含むベクターを用いて適切な宿主細胞への形質転換又は形質導入を行うステップ（１）と、
適切な培地にて宿主細胞を培養するステップ（２）と、
培地又は細胞から本願の工学的細胞又はＴＣＲを単離して精製するステップ（３）と、を含む。

【0124】

様々な核酸配列又はベクターを工学的細胞に導入する方法は、現在、物理的方法、化学的方法、及び生物学的方法によって目的遺伝子を宿主細胞に導入できることが当分野でよく知られている。

【0125】

いくつかの実施形態では、本願は、宿主細胞への目的配列の導入にはレトロウイルスを使用する。レトロウイルス感染法は、ヒト又はマウス由来の初代細胞を感染させるために現在非常に広く使用されている方法である。本願のいくつかの実施形態では、様々な突然変異ＴＣＲ核酸配列をレトロウイルスベクターに構築した後、好ましいウイルスエンベロープタンパク質又はキャプシドタンパク質でパッケージングすることによってウイルス粒子を生成する。次いで、組換えウイルス粒子を宿主又はインビトロ培養細胞に送り、宿主細胞での目的遺伝子の発現を達成する。

【0126】

上記のウイルス粒子は、ＴＣＲ核酸配列、レトロウイルスベクター、及びパッケージングタンパク質の核酸配列を含む。

【0127】

別の態様では、本願はまた、本願の前述の何れかのＴＣＲ核酸構築物がＴ細胞で産生するＴＣＲ複合体を提供する。

【0128】

別の態様では、本願は、インビトロ培養におけるＴＣＲ－Ｔ細胞の機能検出を提供する。具体的には、ＴＣＲ－Ｔ細胞の記憶表現型の検出、インビトロ枯渇モデルにおけるＴＣＲ－Ｔ細胞の枯渇表現型の検出、及びＴＣＲ－Ｔ細胞のミトコンドリア表現型の検出が含まれる。上記のＴＣＲ－Ｔ細胞記憶表現型とミトコンドリア表現型の検出は、ヒト初代Ｔ細胞の活性化後に細胞フローサイトメトリーを使用して検出された。上記の突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞枯渇検出では、インビトロで構築された枯渇モデルが使用される。具体的には、ＣＤ３抗体を使用して、様々な突然変異を持つＴＣＲ－Ｔ細胞をインビトロで複数回刺激し、次に、フローサイトメトリーによって枯渇関連分子の発現を検出する。

【0129】

別の態様では、本願は、
（１）抗原刺激中のＴ細胞受容体の分解阻害、
（２）腫瘍に対する殺傷効果の提供、又は腫瘍の成長阻害、
（３）Ｔ細胞の増殖能維持、及び
（４）抗腫瘍免疫薬及び細胞の調製のうちの１つ又は複数の用途における、前述の何れかに記載の単離されたＴＣＲ α鎖又はその断片、ＴＣＲβ鎖又はその断片、Ｔ細胞受容体又はその断片、核酸又はその断片、核酸構築物、ベクター又は工学的細胞の使用を提供する。

【0130】

一方、本願による突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞療法は、単独で使用される、他の療法と併用されるか、又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、サイトカイン療法若しくは放射線療法と化学療法と併用され得る。上記の治療法は、単独使用や併用の場合、使用量と頻度が、疾患の特性や疾患の重症度などの様々な要因によって決定される。理論的には、本願によるＴＣＲ－Ｔ細胞療法は、低用量で複数回使用することができ、上記の用量範囲は１０^４～１０^９細胞／ｋｇである。本願によるＴＣＲ－Ｔ細胞の養子治療方法は、国際的に認められた養子技術に従って実施され、本明細書の一実施例では、５×１０^６個のＴＣＲ－Ｔ細胞を尾静脈注射することにより実施される。則として、Ｔ細胞療法と併用されるものは、腫瘍組織又は感染部位に直接注射できる。

【0131】

別の態様では、本願は、
前述の何れかの野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンをアルギニン又はアラニンに突然変異するステップ（１）、及び／又は
前述の何れかの野生型ＴＣＲα鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンをアラニンに突然変異するステップ（２）と、を含む、Ｔ細胞受容体の改変方法を提供する。

【0132】

本願の開示をより容易に理解するために、以下のいくつかの用語が定義される。

【0133】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴ細胞の表面に存在する分子であり、ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する。いくつかの実施態様では、前記ＴＣＲは完全又は全長ＴＣＲである。いくつかの実施態様では、本願は、全長ＴＣＲよりも小さいが、ＭＨＣ分子の特定の抗原ペプチド、すなわちＭＨＣ－ペプチド複合体との結合を保持するＴＣＲ断片を提供する。いくつかの実施態様では、ＴＣＲはα及びβ鎖からなるヘテロ二量体である。いくつかの実施態様では、ＴＣＲは１本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）であってもよい。

【0134】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、ＴＣＲα又はβ鎖のドメインであり、ＴＣＲと抗原－ＭＨＣ複合体との結合に関与する。天然ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の可変領域は、一般的に同様の構造を有し、各構造領域は、４つの保存フレーワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。このうち各可変領域のＣＤＲ３は、加工された抗原の認識を担う主要ＣＤＲである。単一のＴＣＲα鎖可変領域又はＴＣＲβ鎖可変領域は、ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合を与えるのに十分であり得る。

【0135】

いくつかの実施態様では、本願のＴＣＲα鎖は、ヒトＴＣＲα鎖、ヒト化ＴＣＲα鎖、キメラＴＣＲα鎖、又はマウス由来ＴＣＲα鎖であり得ることが理解されるべきである。本願のいくつかの実施態様では、ＴＣＲα鎖は、キメラＴＣＲα鎖であり、ヒト及びマウスに由来する配列など、複数の種に由来する配列を含む。例えば、ヒトＴＣＲ定常領域をマウス対応物と交換することで、ヒトＴ細胞の機能及び発現レベルを改善することができる（例えば、Ｄａｎｉｅｌ Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１０ Ｊｕｎ １；１８４（１１）：６２２３－３１．，参照。これは、参照として本明細書に組み込まれている）。したがって、ＴＣＲは、ヒト由来の可変領域及びマウス由来の定常領域を含むことができる。

【0136】

同様に、いくつかの実施態様では、本願のＴＣＲβ鎖も、ヒトＴＣＲβ鎖、ヒト化ＴＣＲβ鎖、キメラＴＣＲβ鎖、又はマウス由来ＴＣＲβ鎖であってもよい。キメラＴＣＲβ鎖は、ヒト及びマウスに由来する配列など、複数の種に由来する配列を含む。

【0137】

本願に記載のＴＣＲ α鎖定常領域及び／又はＴＣＲβ鎖定常領域は、順に連結された細胞外定常領域、膜貫通領域、及び細胞内定常領域を含み、細胞外定常領域は、ＴＣＲ α鎖とＴＣＲβ鎖ヒンジ領域を含んでもよく、ＴＣＲ α鎖ＴＣＲ β鎖ジスルフィド結合の形成に関与する。膜貫通領域も定常領域に属し、その作用はＴＣＲ α鎖、ＴＣＲβ鎖の細胞膜アンカー及びＣＤ３サブユニットとの相互作用に関与し、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成することを含む。細胞内定常領域の可能な作用は、ＴＣＲシグナル伝達後、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体のコンホメーション変化及びシグナル伝達に関与することを含む。

【0138】

「抗原」という用語は、細胞表面分子又は、細胞内でＭＨＣ分子又はＭＨＣ－ｌｉｋｅ分子によって提示され、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合され得る分子を意味し、ポリペプチド系抗原（例えば、ＮＹＥＳＯ－１、ＡＦＰ、及びＭＡＲＴ－１）、脂質系抗原（例えば、β－ＧｌｃＣｅｒ、ｅＬＰＡ、及びＬＰＥ）、又は多糖類抗原（例えば、ＣＡ１９９、ＣＡ７２－４及びＣＡ１２５）を含むが、これらに限定されない。前記抗原は、腫瘍抗原、例えば、腫瘍細胞関連抗原（ＴＡＡ：Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ：Ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）であってもよい。

【0139】

「単離された」という用語は、本明細書に記載のα鎖、β鎖、Ｔ細胞受容体や核酸のように、天然状態から移動されたか、又は他の方式で人為的に操作された材料を意味する。単離された材料は、その天然状態において通常付随する成分をほぼ又は実質的に有していなくてもよく、又は、その天然状態において通常付随する成分とともに操作されて人工的な状態にあることができる。単離された材料は、天然、化学的に合成された、又は組み換えられた形態であってもよい。単離された材料はまた、代替的に、富化された、部分的に精製された、又は精製された形態であってもよい。

【0140】

本発明の「野生型」とは、天然に存在するアミノ酸配列若しくはコード核酸配列、又は天然に存在するアミノ酸配列若しくはコード核酸配列と比較して少なくとも９０％～１００％の同一性を有する、又は天然に存在するアミノ酸配列若しくはコード核酸配列と比較して１～１０個又は１～５個以下のアミノ酸突然変異（特に保存的アミノ酸置換）を有するが、その領域と同一又は類似の活性及び／又は機能を依然として有することを意味することが理解されるべきである。

【0141】

「野生型」とは、本願の対応する突然変異又は突然変異の組み合わせのテンプレートとして導入され、例えば、「ヒト、マウス又は他の哺乳動物種属に由来する野生型」とは、天然ヒト、天然マウス若しくはラット、又は他の哺乳動物種属の当該領域のアミノ酸配列又はコード核酸配列を有するか、又は当該アミノ酸配列若しくはコード核酸配列からなることをいう。ヒト、マウス又は他の哺乳動物種属に「由来する」領域は、天然のヒト、天然のマウス若しくはラット、又は他の哺乳動物種属の当該領域のアミノ酸配列又はコード核酸配列と実質的に同一であり、例えば、天然に存在するアミノ酸配列若しくはコード核酸配列と比較して少なくとも９０％～１００％の同一性を有するか、又は天然に存在するアミノ酸配列若しくはコード核酸配列と比較して１～１０個又は１～５個以下のアミノ酸突然変異（特に保存的アミノ酸置換）を有するが、かつ、その領域と同一又は類似の活性及び／又は機能を依然として有する領域も包含する。

【0142】

「突然変異」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸又は核酸の置換、欠失、又は付加を意味すると解することができる。例えば、アミノ酸の保存的置換であってもよく、保存的アミノ酸置換は、当技術分野で知られており、特定の物理的及び／又は化学的性質を有するアミノ酸の１つが、同じ化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、前記保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）を、非極性側鎖を有するアミノ酸が別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）を、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）を、極性側鎖を有するアミノ酸が別の極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を置換するなどであってもよく、前記保存的置換は、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関連する残基の両親媒性の類似性に基づいて行われてもよい。

【0143】

本願のＴＣＲ α鎖細胞内定常領域及び／又はＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の「突然変異」に関連する場合、それはアミノ酸の置換であることが好ましい。例えば、突然変異ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域とは、野生型ＴＣＲ α鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのセリンがアラニンに置換されたものを意味する。突然変異ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域とは、野生型ＴＣＲ β鎖細胞内定常領域の少なくとも１つのリジンがアルギニン又はアラニンに置換されたものを意味する。

【0144】

配列間の同一性の計算は以下のように行う。

【0145】

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセンテージを決定するために、前記配列は、最適なアライメントのためにアライメントにかけられる（例えば、第１及び第２アミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入したり、比較のために非相同配列を棄却したりすることができる）。１つの好ましい実施態様では、比較のために、アライメント対象となる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置又は核酸位置のアミノ酸残基又は核酸を比較する。第１配列中の位置が、第２配列中の対応する位置にある同じアミノ酸残基又は核酸によって占められている場合、前記分子はこの位置で同じである。

【0146】

２つの配列間の配列比較及び同一性パーセンテージの計算は、数学的アルゴリズムを用いて実行されてもよい。好ましい実施態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａ及びＷｕｎｓｃｈ（（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３）アルゴリズムにより、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスと、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さウェイト１、２、３、４、５又は６とを使用して決定される。さらに別の好ましい実施態様では、２つの核酸配列間の同一性パーセンテージは、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能な）ＧＣＧパッケージ内のＧＡＰプログラムにより、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスと、ギャップウェイト４０、５０、６０、７０又は８０及び長さウェイト１、２、３、４、５又は６とを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット（及び特に明記されていない限り使用されるべきパラメータのセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアマトリックスを採用する。

【0147】

２つのアミノ酸配列又は核酸配列間の同一性パーセンテージは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（（１９８９） ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１－１７）を使用して、ＰＡＭ１２０加重剰余テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。

【0148】

追加的に又は代替的に、本明細書に記載の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー配列又は関連配列を同定するために、共通のデータベースに対する検索を実行するための「クエリ配列」として使用されてもよい。

【0149】

当技術分野で知られているように、本明細書で交換して使用することができる「ヌクレオチド」又は「核酸」とは、任意の長さの核酸鎖を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。核酸は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、修飾された核酸又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡやＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込まれ得る任意の基質であってもよい。

【0150】

本明細書に記載の核酸配列は、本明細書に記載のヌクレオチド配列に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅法により得ることができるか、又は、熟練者がＰＣＲ増幅のためにｃＤＮＡライブラリーを作製することにより得ることができる。

【0151】

本願において、「野生型」と「ＷＴ」とは交換して使用することができる。「ＳＡ」とは、α鎖細胞内定常領域のアミノ酸配列の少なくとも１つのセリンがアラニンに突然変異したものをいう。「ＫＲ」とは、β鎖細胞内定常領域のアミノ酸配列の少なくとも１つのリジンがアルギニンに突然変異したものをいう。「ｄＭＵＴ」とは、α鎖細胞内定常領域の「ＳＡ」突然変異とβ鎖細胞内定常領域のアミノ酸配列の「ＫＲ」突然変異が同時に存在することを意味することが理解されるべきである。

【0152】

本明細書においてＦ５－ＴＣＲとは、腫瘍抗原ＭＡＲＴ－１を認識することができるＴＣＲのクラスを意味し、それに含まれるＦ５－ＷＴ ＴＣＲ、Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ、Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ、及びＦ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲは、α鎖細胞内定常領域又はβ鎖細胞内定常領域における突然変異に基づいて異なるように分割された同じＴＣＲ α鎖可変領域及びＴＣＲ β鎖可変領域を有することが理解されるべきである。

【0153】

同様に、本願における１Ｇ４－ＴＣＲとは、腫瘍抗原ＮＹＥＳＯ－１を認識することができるＴＣＲを意味し、それに含まれる１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ、又は１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲは、同じＴＣＲ α鎖可変領域及びＴＣＲ β鎖可変領域を有し、α鎖細胞内定常領域又はβ鎖細胞内定常領域における突然変異の違いに応じて区別される。

【0154】

「ベクター」は、宿主細胞に１つ又は複数の関心のある遺伝子又は配列を送達することができ、好ましくは宿主細胞において前記遺伝子又は配列を発現させることができるものを意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクターが含まれるが、これらに限定されない。

【0155】

「宿主細胞」という用語は、外因性核酸が導入された細胞を指し、これらの細胞の子も含む。
遺伝子クローニング操作において、設計された適切な酵素切断部位は、発現されたアミノ酸配列の両端に１つ又は複数の無関係な残基を導入し、かつ目的配列の活性に影響を与えないことが理解されるべきである。例えば、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩなどの酵素切断部位が含まれるが、これらに限定されない。

【0156】

融合タンパク質を構築するため、又は宿主細胞膜上に自動的に局在化する組換えタンパク質を得るため、又は組換えタンパク質の発現を促進するためには、アミノ酸断片を組換えタンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端、又は、シグナルペプチド、リーダーペプチド、２Ａペプチド、末端伸長などを含むがこれらに限定されないタンパク質内の適切な領域に追加できることが理解されるべきである。

【0157】

構築された組換えタンパク質を精製するために、構築されたタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端は１つ又は複数のタンパク質タグを含むことが理解されるべきである。このタンパク質タグには、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｐｏｌｙ－Ｈｉｓなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0158】

上記の実施例（実施形態）はすべて例示的なものであり、特許請求の範囲に含まれる可能性のあるすべての実施形態を含めるために使用されるものではないことが理解されるべきである。本開示の範囲を逸脱することなく、上記実施例に基づいて様々な変形及び変更が加えられてもよい。同様に、上記実施例の様々な技術的特徴は、明示的に説明されていない可能性のある本願の別の実施例を形成するために任意に組み合わされてもよい。したがって、上記した実施例は本願のいくつかの実施形態を表現しただけであり、本願の特許の保護範囲を制限するものではない。
本願の配列表及び注

【0159】

【表1】

実施例１．ＴＣＲ発現ベクターの構築

【0160】

Ｆ５－ＴＣＲ、及び１Ｇ４－ＴＣＲをそれぞれ構築した。Ｆ５－ＴＣＲは、Ｆ５－ＷＴ ＴＣＲ、Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ、Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ、及びＦ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲを含み、１Ｇ４－ＴＣＲは、１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ、及び１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲを含む。

【0161】

前に述べたように、各Ｆ５－ＴＣＲ又は１Ｇ４－ＴＣＲは、それぞれＴＣＲα鎖とＴＣＲ β鎖を含み、ＴＣＲα鎖は、それぞれヒト成長ホルモンシグナルペプチド、ＴＣＲα鎖可変領域、ＴＣＲα鎖細胞外定常領域、ＴＣＲα鎖膜貫通領域、ＴＣＲα鎖細胞内領域が順に連結されたものであり、ＴＣＲβ鎖は、それぞれヒト成長ホルモンシグナルペプチド、ＴＣＲβ鎖可変領域、ＴＣＲβ鎖細胞外定常領域、ＴＣＲβ鎖膜貫通領域、ＴＣＲβ鎖細胞内領域が順に連結されたものである。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖は、Ｆ２Ａペプチドを介して直列に連結されている。以上の各ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のアミノ酸又はヌクレオチド配列は、本願の前述の実施形態に記載されたとおりである。

【0162】

以上のアミノ酸配列及びＴＣＲα鎖細胞内定常領域では、セリンがアラニンに突然変異し、ＴＣＲβ鎖定常領域では、リジンがアルギニンに突然変異したアミノ酸配列は、すべてコドン最適化後に塩基配列に変換され、会社が合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。

【0163】

前記Ｆ５－ＷＴ ＴＣＲ、Ｆ５－ＳＡ ＴＣＲ、Ｆ５－ＫＲ ＴＣＲ、及びＦ５－ｄＭＵＴ ＴＣＲ、並びに１Ｇ４－ＷＴ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＳＡ ＴＣＲ、１Ｇ４－ＫＲ ＴＣＲ、及び１Ｇ４－ｄＭＵＴ ＴＣＲの全長ヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４６に記載の通りである。

【0164】

本願におけるすべてのＴＣＲの塩基配列は、最終的に酵素切断、Ｔ４リガーゼによる連結によってｐＭＳＧＶ－ＬＮＧＦＲ－Ｐ２Ａベクターにクローニングされた。
実施例２．レトロウイルスのパッケージング及び調製方法

【0165】

実施例１で構築されたＴＣＲ発現ベクター（ｐＭＳＧＶ－ＴＣＲ）を、エンベローププラスミドｐＨＩＴ６０／ＲＤ１１４とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスミッションし、レトロウイルスをパッケージングした。具体的には、パッケージング系の割合は、ＭＳＧＶ－ＴＣＲ：ｐＨＩＴ６０：ＲＤ１１４＝２：２：１．３である。ＯＰＴＩ－ＤＭＥＭ培地にて均一に混合し、ＴｒａｎｓＩＴ２９３－Ｍｉｒｕｓトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ ＃ＭＩＲ ２７００）１５．９μｌを加え、ピペッティングにより均一に混合した後、室温で２５分間静置し、ＨＥＫ２９３Ｔ 細胞培養皿に上記混合リポソーム液を加え、３７℃のインキュベータに容れて４８ｈ培養した。その後、ウイルス液を採取し、０．２２μｍろ過膜でろ過し、－８０℃の冷蔵庫に保管した。
実施例３．ヒト初代突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞の調製及び培養方法

【0166】

ヒト初代Ｔ細胞の培養：ヒト初代Ｔ細胞は、商業化会社（ＡＬＬＣＥＬＬＳ）から購入した。初代Ｔ細胞を培養するための完全培地は、５％のヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－５１２）、二重抗体（Ｇｉｂｃｏ ＃１５１４０－１２２）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＃ＳＨ３０８０９．０１）及び１ｘＧｌｕｔＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ ＃３５０５０－０６１）を含み、また、培地に１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＃２００－０２）も加えた。上記の完全培地１ｍｌを用いてヒト初代Ｔ細胞を再懸濁させ、１μｇ／ｍｌ ｈＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１７３４７）と１μｇ／ｍｌ ｈＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１０２１２１）で被覆された２４ウェルプレート（Ｎｅｓｔ ＃７０２００１）に加え、３７℃のインキュベータに入れて４８時間培養した後、ウイルス感染実験を行った。

【0167】

レトロウイルスによるヒト初代Ｔ細胞の感染：２４ウェルプレートに再懸濁させたヒト初代Ｔ細胞７５０μｌをＥＰチューブ（Ａｘｙｇｅｎ ＃ＭＣＴ－１０５Ｃ）に吸引し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、対応するウイルス液５００μｌ（すなわち、突然変異ＴＣＲレトロウイルス）を用いてＴ細胞を再懸濁させ、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＃ＳＣ－１３４２２０）０．７５μｌを加え、均一にピペッティングし、対応する２４ウェルプレートに加えた。そのときの感染系は７５０μｌであった。３０℃、２５００ｒｐｍで９０分間遠心分離した後、２４ウェルプレートから上清５００μｌをＥＰチューブに吸引し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、Ｔ細胞完全培地７５０μｌ（１．２５倍のｒｈＩＬ－２）を２４ウェルプレートに加え、３７℃のインキュベータに入れて２４時間培養した。翌日、２回目のウイルス感染操作を行い、具体的なステップは前述の操作と同じあった。感染完了後のヒト初代Ｔ細胞には１～２日ごとに新鮮なＲＰＭＩ－１６４０完全培地を補充した。
実施例４．細胞フローサイトメトリー分析方法

【0168】

細胞フローサイトメトリー分析技術は、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出するものである。細胞表面分子の検出：２×１０^５個の細胞を９６ウェルＵ底プレートに吸引し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液（２％血清１×ＰＢＳを含む）で調製したフローサイトメトリー抗体を加え、氷上で光を避けて２５分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメータで検出した。

【0169】

サイトカインの染色：２×１０^５個の細胞を９６ウェルＵ底プレートに吸引し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液（２％血清を含む１×ＰＢＳ）で調製したフローサイトメトリー抗体を加え、氷上で光を避けて２５分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、パラホルムアルデヒド固定液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０８０１）で細胞を２０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、透過化緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃００－８３３３－５６）で調製したサイトカインフローサイトメトリー抗体を加え、氷上で光を避けて２５分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメータで検出した。

【0170】

転写因子の染色：２×１０^５個の細胞を９６ウェルＵ底プレートに吸引し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液（２％血清を含む１×ＰＢＳ）で調製したフローサイトメトリー抗体を加え、氷上で光を避けて２５分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＯＸＰ３転写因子固定液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃００－５５２３－００）で細胞を２０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、透過化緩衝液で調製したサイトカインフローサイトメトリー抗体を加え、氷上で光を避けて２５分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメータで検出した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータ分析を行った。
実施例５．抗原刺激によるＴＣＲの分解

【0171】

インビボ腫瘍抗原刺激によるＴＣＲ発現のダウンレギュレーションに関する実験：Ｋ５６２－ＮＹＥＳＯ－１を接種した担癌マウスについて、１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞を導入してから１２日目に、脾臓及び腫瘍中のＴＣＲ－Ｔ細胞表面のＴＣＲ発現を検出した。図１（Ａ）に示すように、腫瘍組織では、腫瘍抗原刺激はＴＣＲ発現のダウンレギュレーションを引き起こした。インビトロ標的細胞抗原刺激によるＴＣＲのダウンレギュレーション及び分解に関する実験：１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞とＫ５６２－ＮＹＥＳＯ－１標的細胞又はＫ５６２－ＭＡＲＴ－１非標的細胞を１：１比で２４ウェルプレートに混合し、３７℃のインキュベータで１２時間共インキュベートし（なお、具体的な時間は実験によって決定される。）、細胞を吸引してフローＦＡＣＳ検出を行った。ＴＣＲのダウンレギュレーションの検出は、染色Ｔ細胞表面のＴＣＲによって測定され、一方、ＴＣＲ分解レベルの分析は、細胞の固定及び透過化後の染色細胞内のＴＣＲによって検出された。その結果、図１（Ｂ）に示すように、標的細胞抗原刺激は、ＴＣＲのダウンレギュレーション及び分解を促進した。ｈＣＤ３抗体刺激によるＴＣＲのダウンレギュレーション及び分解に関する実験：活性化後の１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞とＦ５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を再懸濁させた後、ｈＣＤ３抗体で被覆された２４ウェルプレートに加え、３７℃のインキュベータで１２時間共インキュベートし（なお、具体的な時間は実験によって決定される。）、細胞を吸引してフローＦＡＣＳ検出を行った。ＴＣＲのダウンレギュレーションの検出は、染色Ｔ細胞表面のＴＣＲによって測定され、ＴＣＲ分解レベルの分析は、細胞の固定及び透過化後の染色細胞内のＴＣＲによって検出された。図１（Ｃ、及びＤ）に示すように、インビトロＣＤ３抗体刺激は、ヒト化Ｔ細胞におけるＴＣＲのダウンレギュレーション及び分解を促進した。各突然変異ＴＣＲの発現比較実験：活性化後の各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞を再懸濁させた後、ＦＡＣＳ染色により異なるＴＣＲの発現を検出した。図２（Ｂ）に示すように、各突然変異ＴＣＲは、野生型ＴＣＲと比較して、その発現に明らかな差がなかった。ｈＣＤ３抗体刺激による各突然変異ＴＣＲのダウンレギュレーション及び分解の比較実験：活性化後の１Ｇ４－ＴＣＲ－Ｔ細胞とＦ５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を再懸濁させた後、ｈＣＤ３抗体で被覆された２４ウェルプレートに加え、３７℃のインキュベータで実験に必要な時間だけ共インキュベートした。ＴＣＲのダウンレギュレーションの検出は、染色Ｔ細胞表面のＴＣＲによって測定され、ＴＣＲ分解レベルの分析は、細胞の固定及び透過化後の染色細胞内のＴＣＲによって検出された。その結果、図２（Ｃ、及びＤ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲと比較して、突然変異群では、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲは、より多くのＴ細胞膜滞留を示し、抗体刺激によるダウンレギュレーション及び分解に顕著に抵抗することができ、これは、ｄＭＵＴ ＴＣＲ群では、特に明らかである。図（Ｅ）に示すように、ｈＣＤ３抗体刺激による様々な時点での表面のＴＣＲ発現を検出する実験により、他の群と比較して、ｄＭＵＴ ＴＣＲは、最も強い分解抵抗力を持つことが示された。
実施例６．Ｔ細胞のインビトロ機能検出及び枯渇モデルの構築

【0172】

Ｔ細胞のインビトロ機能検出：インビトロで活性化されたヒト初代Ｔ細胞に各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲレトロウイルスを感染させた後、ＲＰＭＩ－１６４０完全培地でＴ細胞を１２日間培養し、２×１０^５個の細胞を９６ウェルプレートに吸引してフローＦＡＣＳ検出を行った。検出指標は、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＦ１、ＣＤ２７、及びＣＤ４５ＲＯなどのＴ細胞記憶分子の発現である。その結果、図３（Ａ～Ｃ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲ群と比較して、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞では、ＣＤ２７^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋（セントラルメモリーＴ細胞）の割合が有意に増加し、突然変異群は、メモリーＴ細胞に分化する傾向が強く、また、Ｔ細胞記憶分子であるＣＤ６２ＬとＴＣＦ１の発現が上昇し、特にｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞が最も顕著であった。

【0173】

Ｔ細胞のインビトロ枯渇モデルの構築：インビトロで活性化されたヒト初代Ｔ細胞を各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲレトロウイルスで感染させてから４８時間後、Ｔ細胞を取り出し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、完全培地でＴＣＲ－Ｔ細胞を再懸濁させ、２μｇ／ｍｌ ｈＣＤ３抗体があらかじめ被覆された２４ウェルプレート（１ウェル当たり１０^６個の細胞）に入れ、さらにＴＣＲ－Ｔ細胞を４８時間刺激し、その後、上記のステップを２回繰り返した。培養終了後、ＴＣＲ－Ｔ細胞を採取してフローサイトメトリー検出を行った。このインビトロ枯渇モデルの構築は、当分野で知られている関連文書（Ｓａｎｔｏｓｈａ Ａ． Ｖａｒｄｈａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０２０ Ｓｅｐ；２１（９）：１０２２－１０３３．）を参考にしており、検出指標は、枯渇関連分子のＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３、ＴＯＸなどやサイトカインＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γである。その結果、図３（Ｄ～Ｆ）に示すように、枯渇関連分子のＬＡＧ－３及びＴＯＸの発現は、ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞とｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞において明らかに減少し、また、より多くのｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞はサイトカインＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γを産生し、以上より、ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞とｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞はＴ細胞枯渇の発生により抵抗できることを示唆した。
実施例７．Ｔ細胞のミトコンドリア機能検出及び代謝分析

【0174】

ミトコンドリア指標の検出：インビトロで活性化されたヒト初代Ｔ細胞を各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲレトロウイルスに感染させた後、Ｔ細胞をＲＰＭＩ－１６４０完全培地で１２日間培養し、２×１０^５個の細胞をＥＰチューブに吸収し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｍ７５１４）を加えて染色し、最終濃度を５０ｎＭとし、３７℃で光を避けて１時間染色した後、フローＦＡＣＳ検出を行った。その結果、図４（Ａ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲ細胞と比較して、各突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞では、ミトコンドリアの数に明らかな変化はなかった。ミトコンドリア膜電位の検出方法としては、２×１０^５個の細胞をＥＰチューブに吸引し、ＴＭＲＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｔ６６９）を加えて染色し、最終濃度を２００ｎＭとし、３７℃で光を避けて１時間染色した後、フローＦＡＣＳ検出を行った。その結果、図４（Ｂ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲ細胞と比較して、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞、特にｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞では、べミトコンドリア膜電位が有意に低下した。ミトコンドリア活性酸素の検出方法としては、２×１０^５個の細胞をＥＰチューブに吸引し、ＭｉｔｏＳＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｍ３６００８）を加えて染色し、最終濃度を５μＭとし、３７℃で光を避けて１時間染色した後、フローＦＡＣＳ検出を行った。図４（Ｃ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲ細胞と比較して、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及び突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞では、ミトコンドリアＲＯＳの産生は有意に減少した。上記実施例の結果を総括すると、各ＴＣＲ突然変異は、Ｔ細胞内のミトコンドリアの数に影響しないが、突然変異ＴＣＲ細胞、特にｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞では、ミトコンドリアはより健全な状態を示し、これは、ｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ培養中に記憶性表現型を示し、Ｔ細胞の枯渇に抵抗することと関連している。

【0175】

代謝関連指標の検出：突然変異１Ｇ４－ＴＣＲレトロウイルスに感染したヒト初代Ｔ細胞を、３７℃のインキュベータにおいてＲＰＭＩ－１６４０完全培地中で１２日間インビトロ培養し、２×１０^５個の細胞をＥＰチューブに吸入し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、その後、無グルコース・無血清培地を用いてＴ細胞を再懸濁させ、２４ウェルプレートに入れ、最終濃度５０μＭの２－ＮＢＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｎ１３１９５）あるいは１μＭのＢｏｄｉｐｙ ＦＬ Ｃ１６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｄ３８２１）で細胞を処理し、３７℃で光を避けて３０分間染色した後、フローＦＡＣＳ検出を行った。フローサイトメータで検出する前に、実験の要件に応じて他の標識分子で標識してもよい。図４（Ｄ、及びＥ）の結果により、ＷＴ ＴＣＲ細胞と比較して、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞では、グルコースの摂取量は明らかに低下し、細胞外脂肪酸の摂取には明らかな変化がなかった。
実施例８．突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍機能の検出

【0176】

突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍実験は、４～８週齢の免疫不全ＮＳＧマウスで行った。突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞が野生型ＴＣＲ－Ｔ細胞より優れた抗腫瘍効果を有することを確認するために、まず、８×１０^５個のＫ５６２－ＮＹＥＳＯ－１細胞をＮＳＧマウスの右後肢の腋窩に皮下接種し、標的細胞がマウスの皮下で約８～１２日間成長した後、ノギスを使用して腫瘍体積を測定した。具体的には、腫瘍体積が８０ｍｍ^３～１２０ｍｍ^３の場合、各突然変異１Ｇ４－ＴＣＲを感染させた５×１０^６個のヒト初代Ｔ細胞をＮＳＧマウスの尾静脈に注射した。次に、腫瘍体積を２日ごとに測定し、約１４日後（具体的な操作時間は、実験の現象によって決定される。）、ＮＳＧマウスの血液、脾臓及び腫瘍組織を採取した。まず、腫瘍組織の重量を量り、次に赤血球溶解溶（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０３０１）を使用して、マウスの血液及び脾臓中の赤血球を溶解した。マウスの腫瘍組織を粉砕し、次にＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｃｙｔｉｖａ ＃１７０８９１１０）に供し、マウスの血液、脾臓及び腫瘍組織から、尾静脈を通じて導入したヒト初代Ｔ細胞を収集し、フローサイトメトリー染色によって分析した。

【0177】

具体的な結果を図５及び６に示す。まず、図５（Ａ）では、腫瘍成長体積を統計したところ、ＷＴ ＴＣＲ群と比較して、ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞を導入した実験群では、腫瘍成長速度が大幅に遅くなることが判明した。腫瘍組織の重量を量った結果、図５（Ｂ）に示すように、ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞を導入した実験群では、腫瘍重量が大幅に減少した。また、この実施例では、担癌ＮＳＧマウスの脾臓、血液及び腫瘍組織中の導入ＣＤ８^＋ＴＣＲ－Ｔ細胞の割合を計算した。その結果、図５（Ｃ～Ｅ）に示すように、マウスの脾臓及び血液において、ｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞の割合は、ＷＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、有意に増加した。一方、マウスの腫瘍組織において、ＷＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞とｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞の割合が有意に増加した。これは、ＮＳＧマウス養子免疫モデルにおいて、ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞とｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞がより強い抗腫瘍持続性を有することを示した。さらに細胞表現型を分析したところ、図６（Ａ）に示すように、野生型ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、脾臓中のＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ２７^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋（セントラルメモリーＴ細胞）の割合が有意に増加していることが明らかになった。また、腫瘍組織中のＴＣＲ－Ｔ細胞の分析を通じて、図６（Ｂ、及びＣ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、ｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞はより高いＴ細胞記憶分子ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７を発現していることが判明した。図６（Ｄ）は、腫瘍組織において、ＳＡ ＴＣＲ、ＫＲ ＴＣＲ、及びｄＭＵＴ ＴＣＲ群におけるＰＤ－１^＋ＴＩＭ－３^＋二重陽性細胞の割合が、ＷＴ ＴＣＲ群よりも有意に低下したことを示す。さらに、阻害分子ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ３９の蛍光強度を検出することにより、図６（Ｅ～Ｈ）に示すように、ＷＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、突然変異群のＴＣＲ－Ｔ細胞では、阻害分子の発現が大幅に低下していることが判明した。また、図６（Ｉ）に示すように、枯渇に重要な転写因子ＴＯＸの発現がｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞では大幅に減少していることがわかった。以上より、上記は、インビボ抗腫瘍モデルにおいて、突然変異群のＴＣＲ－Ｔ細胞がＴ細胞枯渇の発生に抵抗できることを示していた。また、腫瘍組織におけるＴＣＲ－Ｔ細胞によるサイトカインの産生を検出した結果、図６（Ｊ、及びＫ）に示すように、養子ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞群及びｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞群において、ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ８^＋細胞の割合が明らかに上昇した。このことから、ＫＲ ＴＣＲ細胞とｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞はより強い抗腫瘍効果を有し、ＣＤ８^＋ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞とＣＤ８^＋ｄＭＵＴ ＴＣＲ－ＴにおけるＴＮＦ－α^＋ＩＦＮ－γ^＋二重陽性細胞の割合が高いことが示された。ＫＲ ＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＷＴ ＴＣＲ細胞よりも多くのサイトカインを産生するが、ｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞よりはサイトカインの産生が少ないことを示した。これは、ｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔ細胞が腫瘍組織においてより強力なエフェクター機能を持っていることを示していた。

【0178】

Ｔ細胞養子免疫療法では、患者の限られたＴ細胞を集めてＴＣＲ－Ｔ細胞を大量に増殖させることも、養子治療後に腫瘍患者がＴ細胞機能の持続性低下とＴ細胞枯渇の発生に直面することも、現在のＴＣＲ－Ｔ細胞療法が直面する課題である。本願による突然変異ＴＣＲ－Ｔ細胞の改変方法、特にｄＭＵＴ ＴＣＲ－Ｔの改変により、ＴＣＲ－Ｔ細胞がインビトロで増殖されて腫瘍モデルに再注入した後、より持続的な抗腫瘍効果を示すことを可能にし、Ｔ細胞の枯渇の発生にも抵抗することができる。これは、ｄＭＵＴ ＴＣＲ突然変異によって改変されたＴＣＲ－Ｔ細胞が臨床生産及び治療において持続的かつ効率的な抗腫瘍機能を達成すると期待されることを示唆していた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】