特表2025-501365 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ エンザイマスター（ニンポー）バイオエンジニアリングカンパニー・リミテッドの特許一覧

特表2025-501365ウブロゲパント中間体を合成するための生体触媒及びその合成方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2
3
4

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-17

(54)【発明の名称】ウブロゲパント中間体を合成するための生体触媒及びその合成方法

(51)【国際特許分類】

C12N 9/10 20060101AFI20250109BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20250109BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20250109BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20250109BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP

C12N 15/54 20060101ALI20250109BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20250109BHJP

C07C 269/06 20060101ALI20250109BHJP

C07C 271/22 20060101ALI20250109BHJP

C07B 61/00 20060101ALN20250109BHJP

【ＦＩ】

C12N9/10 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/54

C12N15/63 Z

C12N15/09 Z

C07C269/06

C07C271/22

C07B61/00 300

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024541005

(86)(22)【出願日】2023-02-17

(85)【翻訳文提出日】2024-07-05

(86)【国際出願番号】 CN2023076973

(87)【国際公開番号】W WO2023169184

(87)【国際公開日】2023-09-14

(31)【優先権主張番号】202210240991.5

(32)【優先日】2022-03-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521196257

【氏名又は名称】エンザイマスター（ニンポー）バイオエンジニアリングカンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チェンハイビン

(72)【発明者】

【氏名】フフ

(72)【発明者】

【氏名】チャイバウチン

(72)【発明者】

【氏名】シュジュンプェン

(72)【発明者】

【氏名】リュウシトン

(72)【発明者】

【氏名】ジンルゥピン

(72)【発明者】

【氏名】ウシンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チェイチンイェン

(72)【発明者】

【氏名】ジャンチェンショウ

(72)【発明者】

【氏名】ジュカイルゥン

【テーマコード（参考）】

4B065

4H006

4H039

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4H006AA02

4H006AC52

4H006BA80

4H006RA06

4H006RB34

4H039CA71

4H039CB30

(57)【要約】

本願は、立体選択性が高く、触媒活性が高く、安定性に優れる、ウブロゲパント中間体を合成するためのエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。本願はまた、アミノトランスフェラーゼポリペプチドを用いたウブロゲパント中間体（（５Ｓ,６Ｒ）－６－メチル－２－オキソ－５－フェニル－３－カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル）ピペリジンの不斉合成の反応プロセス及び生成物の精製プロセスを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミノ酸配列であり、適切な反応条件下で、化合物Ｓ１を化合物Ｉ１に変換することができる、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド。

【請求項2】

前記適切な反応条件には、化合物Ｓ１の担持量５ｇ／Ｌ、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドの担持量１０ｇ／Ｌ、１．０Ｍイソプロピルアミン、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、メタノール／水又はＤＭＳＯ／アセトニトリル／水混合溶媒、ｐＨ１０．５、４５℃が含まれる、請求項１に記載のアミノトランスフェラーゼポリペプチド。

【請求項3】

アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２で示される配列と比較して、Ｘ５２Ｙ、Ｘ５３Ｔ、Ｘ５３Ｋ、Ｘ５３Ｆ、Ｘ５３Ｅ、Ｘ５３Ｈ、Ｘ１１５Ｇ、Ｘ１１５Ｅ、Ｘ１２６Ｌ、Ｘ１４６Ｑ、Ｘ１８３Ａ、Ｘ１８３Ｓ、Ｘ１８３Ｔ、Ｘ１９０Ｌ、Ｘ１９０Ｉから選択される１つ又は複数の残基位置でのアミノ酸残基の違いを含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：２ポリペプチドよりも優れた触媒活性、安定性及び／又はｄｒ値でＳ１をＩＴ又はＬ１に変換する、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド。

【請求項4】

対応するＳＥＱＩＤＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド。

【請求項5】

化学結合又は物理吸着の方法によって固体材料に固定化されたポリペプチドであって、請求項１～４のいずれか１項に記載のアミノトランスフェラーゼポリペプチドから選択される、ポリペプチド。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７に対応する配列である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項６～７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項9】

プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。

【請求項10】

請求項８～９のいずれか１項に記載の発現ベクターを含み、前記宿主細胞は好ましくは大腸菌である、宿主細胞。

【請求項11】

請求項１０に記載の宿主細胞を培養するステップと、培養物からアミノトランスフェラーゼポリペプチドを取得するステップと、を含む、アミノトランスフェラーゼポリペプチドの調製方法。

【請求項12】

請求項１１に記載の培養物、培養物から取得されるアミノトランスフェラーゼポリペプチド含有宿主細胞又は培養液、又はこれらを用いた加工製品から選択され、前記製品は、形質転換体細胞から得られた抽出物、抽出物中のアミノトランスフェラーゼを単離又は精製することにより得られる単離生成物、又は、固定化形質転換体細胞及びその抽出物若しくは抽出物の単離生成物を固定化することにより得られる固定化製品である、アミノトランスフェラーゼ触媒。

【請求項13】

適切な反応条件下で、構造式XIの基質を請求項１～５のいずれか１項に記載のエンジニアリングポリペプチドと接触させるステップを含む、構造式Ｉ化合物の調製方法。

（ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５の基は、任意に置換された－Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、ハロゲン（例えば、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ）、－ＮＯ：２、－ＮＯ、－ＳＯ_２Ｒ’又は－ＳＯＲ’、－ＳＲ’、－ＮＲ’Ｒ’、－ＯＲ’、－ＣＯ_２Ｒ’又は－ＣＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＳＯ_２ＮＨ_２又は－ＳＯＮＨ_２、－ＣＮ、ＣＦ_３であってもよく、Ｒ^６は、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロゲン化炭化水素、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロキシ置換炭化水素であってもよく、Ｒ^７は、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロゲン化炭化水素、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロキシ置換炭化水素であってもよく、Ｒ^８は、ＣＢＺ保護基、ＢＯＣ保護基、Ｆｏｍｃ保護基、Ｂｎ保護基、メトキシ（エトキシ）カルボニル保護基であってもよく、Ｒ’は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ_１Ｃ_４ヒドロカルビルから選択される。）

【請求項14】

構造式Ｉの生成物が、構造式II－VIで示されるキラルアミン生成物のうちの１種又は複数種の混合物であり、
化合物Iエステル基の活性によって、適切な反応条件下、例えば適切な温度、ｐＨ及び溶媒の条件で、構造式Iで示されるアミン生成物の一部は自発的に環を形成し、構造式VIのラクタムを形成し、
構造式VIで示されるキラルアミン生成物が、以下の構造式VII－Xで示されるキラルアミン生成物のうちの１種又は複数種の化合物の混合物である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

適切な反応条件下で、構造式Ｓ１の基質を請求項１～５のいずれか１項に記載のエンジニアリングポリペプチドと接触させるステップを含む、構造式Ｉ１化合物の調製方法。

【請求項16】

。
適切な反応条件下で、構造式Ｓ１の基質を請求項１～５のいずれか１項に記載のエンジニアリングポリペプチドと接触させるステップを含む、構造式Ｌ１化合物の調製方法。

【請求項17】

生成物のｄｒ値（すなわち、［Ｔ１＋Ｔ２］／［Ｄ１＋Ｄ２］）が少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記反応溶媒には、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、酢酸イソプロピル、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）又はこれらの２種以上の溶媒の混合物が含まれる、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記反応条件は、１０℃～６５℃の温度を含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記反応条件は、ｐＨ７．０～ｐＨ１１．５を含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記基質は１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの担持量で存在する、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物工学の技術分野に関し、特にウブロゲパント（Ｕｂｒｏｇｅｐａｎｔ）中間体の合成触媒におけるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

片頭痛は一般的な一次性頭痛症状であり、主に片側の中程度から重度のズキズキする頭痛を特徴とし、吐き気、嘔吐、羞明、その他の症状を伴う場合がある。現在、世界人口の１０％以上が片頭痛に苦しんでおり、女性の数は男性の約２倍である。片頭痛の発症には複雑な遺伝的原因があるが、どの遺伝子が片頭痛の発症に関係しているのかはまだ不明であり、片頭痛の発症機序はまだ明確には解明されていない。従来、片頭痛の治療には、主に５ＨＴ１Ｂ／１Ｄ受容体に作用するスマトリプタン、ゾルミトリプタン、アルモトリプタンなどのトリプタン系薬物が使用されてきた。これらに固有の血管収縮作用があるため、心血管疾患を伴う片頭痛患者への使用には適していない。カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、３７個のアミノ酸を含む神経ペプチドであり、血管拡張作用があり、複数の部位に作用することができ、片頭痛の病態生理学に関連している三叉神経血管系の末梢及び中枢ニューロンの侵害受容及び感作に関与することができる。現在、ＣＧＲＰ受容体拮抗は片頭痛を軽減する効果的な方法であることが証明されている。ウブロゲパント（Ｕｂｒｏｇｅｐａｎｔ）は２０１９年にＦＤＡによって市販を承認され、片頭痛の治療薬としてＦＤＡによって承認された最初の経口カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体アンタゴニストである。ウブロゲパントは、ＣＧＲＰの受容体への結合をブロックすることで片頭痛の症状を緩和する。その作用機序は従来のトリプタン系薬物とはまったく異なり、多くの既存の片頭痛治療法の問題である血管を収縮させることなく、新しい方法で作用を発揮する。

【0003】

文献「Practical Asymmetric Synthesis of a Calcitonin Gene-Related Peptide(CGRP) Receptor Antagonist Ubrogepant」（Org. Process Res. Dev. 2017, 21, 1851-1858）には、ＮｏｂｕｙｏｓｈｉＹａｓｕｄａらはウブロゲパントの合成方法を開示した（図１参照）。ウブロゲパントには２つのコア構造断片が含まれており、その１つは３つのキラル中心を含むラクタム（構造式Ｌ２に示す）、もう１つの断片はスピロ酸（構造式Ａ１に示す）であり、ラクタム合成が最も難しい。鍵となる中間体Ｌ２を合成するために、ＮｏｂｕｙｏｓｈｉＹａｓｕｄａらは、まず構造式Ｓ１で示される化合物（４－フェニル－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソヘキサン酸イソプロピル）を合成し、Ｓ１（理論的には４つの異なる異性体：ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＤ１、及びＳＤ２を含む）を基質として、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）系でアミノトランスフェラーゼの動的速度論的触媒反応を実行し、２つのキラル中心が固定化されたラクタムＬ１を得た。このアミノトランスフェラーゼによって触媒される反応は、基質のエピマー化を利用して、高キラル純度のＬ１を一度に調製することができる。アミノトランスフェラーゼがＳ１基質の異性体ＳＴ１及びＳＴ２に対してのみ活性で、ＳＤ１又はＳＤ２に対して活性がない場合、ＳＴ１及びＳＴ２は、アミノトランスフェラーゼによってそれぞれＩＴ１及びＩＴ２（ＩＴ１およびＩＴ２の構造上のエステル結合は自然に破断され、その後環を形成してＬ１を形成することができる）に変換することができる。このため、生成物にはＩＤ１又はＩＤ２は存在しない。また、適切な反応条件下では、ＳＴ１及びＳＴ２が消費されると、アミノトランスフェラーゼ反応に参加できなかった異性体ＳＤ１及びＳＤ２がその場（ｉｎｓｉｔｕ）で自発的にＳＴ１及びＳＴ２に変換され、結果として生成されるＳＴ１及びＳＴ２がアミノトランスフェラーゼによってＩＴ１及びＩＴ２に変換される。この反応の鍵は、基質Ｓ１の異性体ＳＴ１及びＳＴ２に対して極めて高い選択性を持つアミノトランスフェラーゼを開発する必要があることである。つまり、ＳＴ１及びＳＴ２に対してのみ活性で、ＳＤ１及びＳＤ２に対しては活性がなく、目的のカルボニルをアミノに変換すると、Ｒ－配置のアミノのみが生成される。これにより、極めて高いキラル純度を有するラクタムＬ１が得られる。ＮｏｂｕｙｏｓｈｉＹａｓｕｄａらによって開示されたアミノトランスフェラーゼ反応では、生成物中のＩＤ１とＩＤ２の濃度の合計に対するＩＴ１とＩＴ２の濃度の合計の比（つまり、ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃｒａｔｉｏ、略してｄｒ）は、最大で６１：１であり、ＮｏｂｕｙｏｓｈｉＹａｓｕｄａらは、アミノトランスフェラーゼ反応によって中間体Ｌ１を得た後、アルキル化反応を実施し、結晶化を利用してジアステレオマー変換を誘導し、Ｌ２を調製した。

【0004】

【0005】

【0006】

本発明は、Ｌ１及びその類似体を合成するアミノトランスフェラーゼの動的速度論的触媒反応に適した、より優れた性能を有するエンジニアリングアミノトランスフェラーゼを開示する。本発明によって提供されるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼは、反応に使用される溶媒に対するより良好な耐性、より良好な活性、及びより良好な熱安定性を有する。また、本発明は、反応溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とアセトニトリル（ＡＣＮ）の混合溶媒を使用して、アミノトランスフェラーゼ反応系及び後処理系を最適化し、ＤＭＳＯ溶媒単独が使用される場合の基質Ｓ１の溶解性が低いという欠陥を大幅に改善し、また、基質の溶解度がより高い単一溶媒であるアセトニトリルの濃度が高すぎることによる酵素活性への影響を回避し、後処理で溶媒の一部をリサイクルできるため、経済的で環境に優しい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、キラルアミン系化合物、特にウブロゲパント中間体Ｌ１の不斉合成が可能である、立体選択性が高く、触媒活性が高く、安定性に優れるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。また、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドの遺伝子、該遺伝子を含有する組換え発現ベクター、工学菌株、その効率的な調製方法、及びエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを用いたＬ１の不斉合成反応プロセス、並びに生成物精製プロセスを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１態様は、改良されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。このようなエンジニアリングポリペプチドは、人工的な指向性進化プロセスによる改変によって、特定の数のアミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失などの突然変異が発生したものである。図２に示す反応で活性なアミノトランスフェラーゼを得るため

スフェラーゼ酵素ライブラリーをスクリーニングし、最終的に、図２に示す反応で活性であるＳＥＱＩＤＮＯ：２に示す配列を有するアミノトランスフェラーゼを決定した。ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来の野生型アミノトランスフェラーゼから開発された。しかしながら、ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、基質Ｓ１に対する活性及び立体選択性が低く、溶媒耐性が低い。本発明者らによる検出の結果、ＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いて図２に示す反応を行った場合、基質Ｓ１の担持量が５ｇ／Ｌ、アミノトランスフェラーゼの担持量が１０ｇ／Ｌの条件で、２４時間反応の場合、反応収率は３５％であった。また、メタノールやＤＭＳＯなどの高濃度溶媒はＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して阻害効果を及ぼす。例えば、２０％メタノールの条件下でのＳＥＱＩＤＮＯ：２の活性が１００％と定義される場合、３５％メタノール及び５０％メタノールの条件下でのＳＥＱＩＤＮＯ：２の相対活性は、それぞれ５９％及び４３％であり、２０％ＤＭＳＯ、３５％ＤＭＳＯ、及び５０％ＤＭＳＯの条件下でのアミノトランスフェラーゼの相対活性は、それぞれ７４％、２３％、及び８％であった。メタノールを溶媒とした反応系では、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で触媒される生成物のｄｒ値は１．７であり、ＤＭＳＯ系ではｄｒ値は０．３であった。このアミノトランスフェラーゼがＬ１の工業生産を達成するには、その活性と選択性を向上させるようにこのアミノトランスフェラーゼを工学的に改変する必要がある。

【0009】

本発明は、計算生物学技術を使用して、アミノトランスフェラーゼＳＥＱＩＤＮＯ：２の突然変異体のモデル構築及び仮想スクリーニングを行う。まず、１１２個の安定突然変異体を取得し、次に活性仮想スクリーニング技術を使用して、１１２個の安定突然変異体から、図２に示す反応を触媒する活性を向上させるのに潜在的に寄与する突然変異体４０個を選択した。次に、本発明者らは、仮想スクリーニングにより予測されたこれら４０個の突然変異体の遺伝子構築と組換え発現を実験室で実施し、適切な反応条件を設定することで図２に示す反応を触媒するその性能を実験的に検証し、最終的に、Ｓ１からＬ１への生成の触媒活性及び／又は選択性が向上した１５個の突然変異体を確認した。その中でＳＥＱＩＤＮＯ：２４の性能がより良好であった。ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４は突然変異Ｗ１８３Ａを含む。実験的に検証されたこれらの１５個の突然変異体に基づいて、本発明者らは、組み合わせ突然変異ライブラリーの仮想スクリーニングの新たなラウンドを実施し、組み合わせに適した７つの有益な突然変異体を同定した。次に、本発明者らは、これらの７つの有益な突然変異を含む組み合わせ突然変異ライブラリーを構築し、実験的方法を使用してこのライブラリーをスクリーニングし、最終的に最適な突然変異体ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０を得た。ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０に含まれるアミノ酸突然変異は、Ｔ５２Ｙ、Ｑ５３Ｔ、Ｗ１８３Ａ、Ｎ１９０Ｉである。

【0010】

本発明で提供されるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、図２に示す反応に対して活性であり、Ｘ５２、Ｘ５３、Ｘ１１５、Ｘ１２６、Ｘ１４６、Ｘ１８３、Ｘ１９０に対応するアミノ酸残基位置でＳＥＱＩＤＮＯ：２配列と比較した１つ又は複数の残基の違いを有するアミノ酸配列を含む。

【0011】

さらに、ＳＥＱＩＤＮＯ：２配列と比較して、本発明で提供されるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｔ５２Ｙ、Ｑ５３ＴＫＦＥＨ、Ｎ１１５ＧＥ、Ｒ１２６Ｌ、Ｉ１４６Ｑ、Ｗ１８３ＡＳＴ、Ｎ１９０ＬＩの特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を含み、また、これらの違いに基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入又は欠失を含む。

【0012】

より具体的には、いくつかの実施形態では、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に基づいて改良されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、対応するＳＥＱＩＤＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、改良されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８の参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0014】

２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列間の同一性は、この分野で一般的に使用されるアルゴリズムによって得られ、ＮＣＢＩＢｌａｓｔｐ及びＢｌａｓｔｎソフトウェアを使用して、デフォルトのパラメータに従って計算するか、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３－４６８０，１９９４）を採用してもよい。例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用すると、ＳＥＱＩＤＮＯ：２とＳＥＱＩＤＮＯ：１３０のアミノ酸配列同一性は９８．７％である。

【0015】

別の態様では、本発明は、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを発現させるための１つ又は複数の制御配列を有する発現ベクターの部分であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７で示される配列に対応するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0016】

当業者に知られるように、ヌクレオチドコドンの縮重のため、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７に限定されるものでｈなあい。本発明のエンジニアリングアミノトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８で示されるアミノ酸配列をコードする他の任意の核酸配列であってもよい。

【0017】

別の態様では、本開示は、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド又はエンジニアリングアミノトランスフェラーゼを発現することができる発現ベクター、及び宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌などの細菌宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、本明細書に記載のエンジニアリングアミノトランスフェラーゼを発現および単離するために使用することができ、あるいは、基質を生成物に変換するための反応に直接使用することもできる。

【0018】

いくつかの実施形態では、全細胞、粗抽出物、単離ポリペプチド、又は精製ポリペプチドの形態のエンジニアリングアミノトランスフェラーゼを、単独で、又は固定化形態（例えば、樹脂上に固定化）で使用することができる。

【0019】

本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、構造式XIで示されるケトン基質から構造式Iで示されるアミン生成物への変換を触媒することができる。

【0020】

（ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５の基は、任意に置換された－Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、ハロゲン（例えば、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ）、－ＮＯ：２、－ＮＯ、－ＳＯ_２Ｒ’又は－ＳＯＲ’、－ＳＲ’、－ＮＲ’Ｒ’、－ＯＲ’、－ＣＯ_２Ｒ’又は－ＣＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＳＯ_２ＮＨ_２又は－ＳＯＮＨ_２、－ＣＮ、ＣＦ_３であってもよく、Ｒ^６は、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロゲン化炭化水素、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロキシ置換炭化水素であってもよく、Ｒ^７は、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロゲン化炭化水素、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロキシ置換炭化水素であってもよく、Ｒ^８は、ＣＢＺ保護基、ＢＯＣ保護基、Ｆｏｍｃ保護基、Ｂｎ保護基、メトキシ（エトキシ）カルボニル保護基であってもよい。Ｒ’は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_４ヒドロカルビルから選択される。）

【0021】

構造式Iで示されるアミン生成物は、構造式II－Vで示されるキラルアミン生成物のうちの１種又は複数種の混合物である。

【0022】

【0023】

化合物I構造中のエステル基の活性によって、適切な反応条件下で、酵素触媒により生成される構造式Iで示されるアミン生成物は、自発的に環を形成し、構造式VIで示されるラクタムを形成することができる。

【0024】

【0025】

構造式VIで示されるキラルアミン生成物は、以下の構造式VII－Xで示されるキラルアミン生成物のうちの１種又は複数種の化合物の混合物である。

【0026】

【0027】

本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドによる触媒で生成され得る構造式I－Xで示されるキラルアミン生成物に対応する基質の構造式XIは、以下の通りである。

【0028】

【0029】

好ましくは、本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、基質Ｓ１に対して顕著な触媒活性があり、Ｓ１の構造式は、以下で示される。

【0030】

【0031】

Ｓ１は、以下の４つの異なる異性体ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＤ１又はＳＤ２を含んでもよい。

【0032】

【0033】

本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｓ１をＩ１に変換してもよい。

【0034】

【0035】

Ｉ１は、以下の４つの異なる異性体ＩＴ１、ＩＴ２、ＩＤ１又はＩＤ２を含んでもよい。

【0036】

【0037】

構造式ＩＴで示される化合物は、ＩＴ１及び／又はＩＴ２を表す。

【0038】

【0039】

Ｉ１構造上のエステル結合は、自発的に破断して環を形成し、Ｔ１、Ｔ２、Ｄ１、及びＤ２で示される対応する化合物を形成してもよい。

【0040】

【0041】

本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドが基質Ｓ１を触媒して生成した生成物では、ＩＴ１とＩＴ２及びＴ１とＴ２は過剰な生成物である。Ｔ１及びＴ２は、Ｌ１で示される構造式で表される。

【0042】

【0043】

本発明において、「ジアステレオマー比」（すなわち、ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃｒａｔｉｏ、略してｄｒ）は、ジアステレオマー化合物Ｄ１及び化合物Ｄ２の濃度の合計に対する生成物中のジアステレオマー化合物Ｔ１及び化合物Ｔ２の濃度の合計の比であり、ｄｒ＝［Ｔ１＋Ｔ２］／［Ｄ１＋Ｄ２］によって計算される。

【0044】

いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、化合物Ｓ１を化合物Ｔ１、Ｔ２、Ｄ１、Ｄ２のうちの１種又は複数種のアミン生成物に変換することができる。

【0045】

いくつかの実施形態では、生成物のｄｒ値（すなわち、［Ｔ１＋Ｔ２］／［Ｄ１＋Ｄ２］）は、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上である。

【0046】

該方法に使用されるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドの具体的な実施形態は、発明の詳細にさらに説明される。以上の方法に使用され得る改良されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。本明細書に開示されるエンジニアリングポリペプチドを使用して式Ｉ、式ＶＩ、式ＩＩ又は式Ｌ１の化合物を調製する方法のいずれも、アミノドナー、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質担持量、ポリペプチド担持量、補因子担持量、圧力、及び反応時間の範囲を含むがこれらに限定されない一連の適切な反応条件下で実施され得る。例えば、いくつかの実施形態では、式Ｔ１及びＴ２の化合物の調製が実施されてもよく、ここで、適切な反応条件としては、（ａ）約１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの基質Ｓ１の担持量、（ｂ）約１ｇ／Ｌｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌのエンジニアリングポリペプチド、（ｃ）約０．１Ｍ～４．０Ｍのイソプロピルアミンの担持量、（ｄ）約７．０～１１．５のｐＨ、（ｅ）約１０℃～６５℃の温度、及び（ｆ）０％～７０％の溶媒が含まれる。ここで説明する有機溶媒には、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、酢酸イソプロピル、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、又はそれらの２つ以上の混合物などが含まれるが、これらに限定されない。

【0047】

詳細
定義
本開示に関して、特に明示的に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。

【0048】

「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化など）を問わず、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを意味する。この定義には、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸、及びＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の混合物が含まれる。

【0049】

「エンジニアリングアミノトランスフェラーゼ」、「エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド」、「改良アミノトランスフェラーゼポリペプチド」及び「エンジニアリングポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。

【0050】

「菌体」または「湿潤菌体」は、実施例２に示す調製プロセスによって得られる湿潤菌体を含む、ポリペプチドまたはエンジニアリングポリペプチドを発現する宿主細胞を指す

【0051】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書では互換的に使用される。

【0052】

本明細書で使用される場合、「補因子」とは、触媒反応において酵素と連携して作用する非タンパク質化合物を指す。本明細書で使用される場合、「補因子」とは、ビタミンＢ６ファミリーの化合物であるピリドキサール－５’－リン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、又はＰＬＰ）、ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ（ｐｙｒｉｄｏｘｏｌ、ＰＮ）、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ（ＰＬ）、ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ（ＰＭ）、ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＮＰ）、及びｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＭＰ）を含むことを意図しており、補酵素と呼ばれる場合もある。「ＰＬＰ」、「ピリドキサール－５’－リン酸」、「ピリドキサール－５’－リン酸」、「ＰＹＰ」、及び「Ｐ５Ｐ」は、本明細書では互換的に使用され、酵素触媒反応において補因子として機能する化合物を指す。

【0053】

「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸部分（例えば、遺伝子）を指す。

【0054】

「天然に存在する」又は「野生型」とは、自然界に見られる形態を指す。例えば、天然に存在する又は野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、生物体内に存在し、自然界の供給源から単離可能であり、人間の操作によって意図的に修飾されていない配列である。

【0055】

「組換え」又は「エンジニアリング」又は「非天然に存在する」は、例えば細胞、核酸又はポリペプチドを指すために使用される場合、自然界には起こらない方法で変更されるか、又は同じであるが、合成材料から、及び／又は組換え技術を使用した操作によって生成又は取得される材料、又はこのような材料の天然又は固有の形態に対応する材料を指す。

【0056】

「配列同一性」及び「相同性」は、ポリヌクレオチド間又はポリペプチド間の比較を指すために本明細書では互換的に使用され（「配列同一性」及び「相同性」は、通常パーセンテージとして表される）、最もよく整列した２つの配列を比較ウィンドウで比較することによって決定され。ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部は、参照配列と比較して、２つの配列の最もよい整列のために付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同じ核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する２つの配列内の位置の数を決定して一致する位置の数を得て、この一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割ったものに１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより得られる。あるいは、このパーセンテージは、同じ核酸塩基若しくはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数、又は核酸塩基若しくはアミノ酸残基がギャップと整列する位置の数を決定して一致する位置の数を得て、この一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割ったものに１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより得られてもよい。当業者であれば、２つの配列をアライメントするために使用できる確立されたアルゴリズムが多数存在することを認識する。比較のための配列の最もよいアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ、及びＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎお及びＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（ＧＣＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査による（一般的には、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＩｎｃ．及びＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の合弁事業，（１９９５年付録）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）。配列同一性のパーセンテージ及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９７７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３８９－３４０２にそれぞれ記載のＢＬＡＳＴ、及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するために使用されるソフトウェアは、米国の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＷｅｂサイトから公開されて利用可能される。このアルゴリズムは、まずクエリ配列内の長さＷの短いワードを識別することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を識別することを含み、前記短いワードは、データベース配列内の同じ長さのワードと比較したときに、何らかの正のしきい値スコアＴに一致するか、又は満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌら、前記の通り）。これらの最初の近傍ワードヒット（ｗｏｒｄｈｉｔ）は、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。その後、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加できない点まで、各配列に沿って両方向に拡張される。このヌクレオチド配列の場合、累積スコアはパラメータＭ（マッチする残基ペアの報酬スコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチする残基のペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを使用して累積スコアが計算される。累積アライメントスコアが、達成された最大値から量Ｘだけ低下する、１つ以上の負のスコア残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが０以下になるか、いずれかの配列末端に達する場合、各方向のワードヒット文字列の拡張が終了する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルト値として使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：１０９１５を参照））をデフォルト値として使用する。配列アラインメント及び配列同一性％の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴ又はＧＡＰプログラムを使用して行うことができる。「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用される限定配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば全長遺伝子又はポリペプチド配列の断片であってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド又はアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、あるいは核酸又はポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部）を含む可能性があり、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含む可能性があるため、２つ（それ以上）のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列の比較は、通常、配列類似性の局所領域を同定及び比較するために、「比較ウィンドウ」内で２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を比較することにより行われる。いくつかの実施形態では、「参照配列」は野生型配列に限定されることを意図しておらず、エンジニアリング配列又は改変された配列を含み得る。「比較ウィンドウ」とは、配列を少なくとも２０個の隣接するヌクレオチド又はアミノ酸残基の参照配列と比較することができる、少なくとも約２０個の隣接するヌクレオチド位置又はアミノ酸残基の概念的な断片を指し、ここで比較ウィンドウ内の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウは、２０個の隣接する残基よりも長くすることができ、任意に３０、４０、５０、１００、又はそれ以上のウィンドウを含む。指定されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列に使用される番号の場合、「に対応する」、「を参照する」、又は「に対する」とは、指定されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合に、指定された参照配列残基の番号を指す。換言すれば、所与の配列の残基番号又は残基位置は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなく、参照配列に基づいて割り当てられる。例えば、エンジニアリングポリペプチドのアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列間の残基のマッチを最適化することにより、参照配列とアライメントしてもよい。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の残基の番号は、それがアライメントされた参照配列と比較して定式化される。「アミノ酸の違い」又は「残基の違い」は、参照配列の対応する位置のアミノ酸残基に対する、ポリペプチド配列のある位置のアミノ酸残基の違いを指す。アミノ酸の違いの位置は、本明細書では一般に「Ｘｎ」と呼ばれ、ここで、ｎは残基の違いの基礎となる参照配列内の対応する位置を指す。例えば、「ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較したＸ１８３位置での残基の違い」は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の１８３位置に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の違いを指す。したがって、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の参照ポリペプチドが１８３位置にトリプトファンを有する場合、「ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較したＸ１８３位置での残基の違い」は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の１８３位置に対応するポリペプチド位置でのトリプトファ以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基の違いは「ＸｎＹ」で示され、ここで、「Ｘｎ」は上記の対応する位置を指し、「Ｙ」はエンジニアリングポリペプチドに現れるアミノ酸の１文字符号（すなわち、参照ポリペプチドの残基とは異なる残基）である。いくつかの例（例えば、表２）では、本開示は、従来の符号「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸の違いも提供し、ここで、Ａは、参照配列中の残基の１文字符号であり、「ｎ」は、参照配列内の残基位置の番号であり、Ｂは、エンジニアリングポリペプチドの配列内の残基置換の１文字符号である。いくつかの例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比較して残基違いが存在する特定の位置のリストによって表される、参照配列に対する１つ又は複数のアミノ酸残基の違いを含んでもよい。「欠失」とは、参照ポリペプチドから１つ又は複数のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの修飾を指す。欠失には、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼの図１に示す反応に対する活性を保持しながら、１つ以上、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０つ以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、又は２０個以上のアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大１０％、又は参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大２０％の除去が含まれる場合がある。欠失には、ポリペプチドの内部部分及び／又は末端部分が含まれる場合がある。様々な実施形態では、欠失は、連続したセグメントを含んでもよいし、不連続であってもよい。「挿入」とは、参照ポリペプチドから１つ又は複数のアミノ酸を付加することによるポリペプチドの修飾を指す。いくつかの実施形態では、本開示のエンジニアリングポリペプチドは、天然に存在するアミノトランスフェラーゼポリペプチドへの１つ又は複数のアミノ酸挿入、及び他のエンジニアリングポリペプチドへの１つ又は複数のアミノ酸挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部、又はカルボキシ末端又はアミノ末端に行うことができる。本明細書で使用される場合、挿入には、当技術分野で知られている融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであってもよく、又は天然に存在するポリペプチド内の１つ又は複数のアミノ酸によって隔離されていてもよい。本明細書で使用される「断片」とは、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するが、保持されているアミノ酸配列が配列内の対応する位置と同じであるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸以上の長さ、及び全長エンジニアリングポリペプチドの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、及び９９％であってもよい。

【0057】

「単離されたポリペプチド」又は「精製されたポリペプチド」とは、タンパク質、脂質、及びポリヌクレオチドなど、それに天然に結合している他の物質から実質的に単離されたポリペプチドを指す。この用語には、天然に存在する環境又は発現系（例えば、宿主細胞又はインビトロ合成）から除去又は精製されたポリペプチドが含まれる。エンジニアリングポリペプチドは、細胞内、細胞培養培地中に存在し得るか、又は溶解物や単離された調製物などの様々な形態で調製され得る。したがって、いくつかの実施形態では、エンジニアリングポリペプチドは、単離されたポリペプチドであってもよい。

【0058】

「キラル中心」とは、４つの異なる基を接続する炭素原子を指す。

【0059】

「立体選択性」（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）とは、化学反応又は酵素反応において、１つの立体異性体が別の又は複数の異性体よりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は、１つの立体異性体が他の立体異性体よりも形成される部分的な場合もあれば、１つの立体異性体のみが形成される完全な場合もある。立体選択性は、立体異性体がジアステレオマー（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ）である場合、ジアステレオ選択性（Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）と呼ばれ、他方の（組）のジアステレオマーに対する１種（組）のジアステレオマーの比は、通常、「ジアステレオマー比」（（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓｒａｔｉｏ、略してｄｒ）として報告される。この比は、当技術分野では、通常、式｛メジャージアステレオマー濃度｝／｛マイナージアステレオマー濃度｝から算出される「ジアステレオマー比」（（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓｒａｔｉｏ、略してｄｒ）として選択的に報告される。

【0060】

「立体異性体」、「立体異性形態」及び類似の表現は、本明細書では互換的に使用され、分子が空間内での原子の配向のみが異なるすべての異性体を指す。これには、エナンチオマー、及び複数のキラル中心を持ち、互いに鏡像ではない化合物の異性体（すなわち、「ジアステレオマー」）が含まれる。

【0061】

「改良された酵素特性」とは、エンジニアリングポリペプチドが参照配列と比較して示す任意の改良された酵素特性を指し、前記参照配列の進化はアミノトランスフェラーゼＳＥＱＩＤＮＯ：２２から始まる。改良が望ましい酵素特性には、酵素活性（基質の変換パーセンテージとして表すことができる）、熱安定性、溶液安定性（例えば、アルコール系化合物に対する安定性）、ｐＨ活性特性、補因子の要件、阻害剤に対する耐性（例えば、底質又は生成物の阻害）、立体特異性及び立体選択性が含まれるが、これらに限定されない。

【0062】

「反応収率」とは、指定された反応条件下および指定された反応時間内で、初期投入基質に対する反応系内で生成された生成物のモルパーセンテージを指す。したがって、アミノトランスフェラーゼまたはエンジニアリングポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、「反応収率」として表すことができる。反応は、一般に、サンプルを採取して反応系内の生成物のモル濃度と出発基質のモル濃度を測定することによって｛生成物のモル濃度｝／｛出発基質のモル濃度｝で計算される。

【0063】

「熱安定性」とは、エンジニアリングポリペプチドが一定期間（例えば、０．５時間以上）高温（例えば、６５℃以上）に暴露した後でも出発テンプレートと同様の活性を維持することを指す。

【0064】

「溶媒安定性」または「溶媒耐性」とは、エンジニアリングポリペプチドが、様々な濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）暴露した後でも出発テンプレートと同様の活性を維持することを指す。

【0065】

「適切な反応条件」とは、本開示に関するエンジニアリングポリペプチドが基質を所望の生成化合物に変換できる生体触媒反応溶液中の条件（例えば、酵素担持量、基質担持量、アミノドナー担持量、補因子担持量、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」が本開示に提供され、実施例によって検証される。化合物は、その化学構造及び／又は化学名によって示されてもよい。化学構造が化学名と矛盾する場合、化学構造によって化合物が決まる。

【0066】

指向性進化プロセス及び開発されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼ
本発明で開示されるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、革新的な指向性進化プロセスを通じて改変され、特定の数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失などの突然変異を受けたものである。本発明者らが検出したところ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対応するアミノトランスフェラーゼはＳ１に対して活性であるが、活性が低く、キラル選択性が低く、溶媒耐性も高くない。図２に示す反応に適した優れた性能を有するエンジニアリングアミノトランスフェラーゼを開発するために、本発明は、表１に示すように３つの研究開発段階を設計し、実行した。各段階での研究開発の焦点は異なり、異なるスクリーニング反応条件が的を絞って採用される。各段階で得られた最適なエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを表２に示す。

【0067】

【0068】

段階Ｉの主な目的は、開発されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼ酵素ライブラリーをスクリーニングして、基質Ｓ１からの生成物Ｌ１の生成に対して触媒活性があり、直接工業的に応用できる、又は指向性進化の出発酵素として使用できるアミノトランスフェラーゼ触媒を見つけることである。本発明者らによるスクリーニングの結果、ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来の野生型アミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ：ＸＰ＿７４８８２１．１）から開発された最も適切な進化出発酵素である。表２には、野生型酵素と比較したＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基の違い、及び野生型酵素と比較したＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列同一性が示されている。アミノ酸配列の同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３－４６８０，１９９４）を使用して計算した。ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、産業上の応用に適合するために、活性、安定性、選択性及び他の特性をさらに向上するために、指向性進化技術を通じて改変される必要がある。

【0069】

【0070】

段階ＩＩの主な目的は、酵素活性、安定性及び選択性に重大な影響を与えるアミノ酸突然変異を発見し、その後の指向性進化ライブラリー設計のためのデータサポートを提供することである。本発明は、バイオインフォマティクス及び計算生物学技術を使用して、アミノトランスフェラーゼＳＥＱＩＤＮＯ：２の突然変異体の仮想スクリーニングを行い、この仮想スクリーニング法の一般的なプロセスは次のとおりである。

【0071】

仮想スクリーニングのプロセスは次のとおりである。

【0072】

ステップ１：相同性モデリング：ＳＥＱＩＤＮＯ：２について、ＰＤＢＩＤ４ＵＵＧをテンプレートとして使用し、Ｙａｓａｒａソフトウェアを通じて相同性モデリングを行い、モデリングパラメーターを表３に示す。

【0073】

【0074】

ステップ２：Ａｕｔｏｄｏｃｋドッキング：ＹａｓａｒａソフトウェアのＡｕｔｏｄｏｃｋメソッドを通じて、４つのキラル基質ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＤ１、及びＳＤ２をターゲット酵素とドッキングし、図３に示す酵素基質複合体を得た。そして、基板５オングストローム以内のアミノ酸を候補突然変異部位（Ｔ５２、Ｑ５３、Ｔ６０、Ｌ１１３、Ｎ１１５、Ｒ１２６、Ｌ１４１、Ｌ１４３、Ｉ１４６、Ｌ１４８、Ｗ１８３、Ｎ１９０、Ｇ２１５、Ｓ２７３、Ｔ２７４、Ａ２７５５）として選択した。

【0075】

ステップ３：Ｒｏｓｅｔｔａ安定性仮想スクリーニング：ＲｏｓｅｔｔａソフトウェアのＣａｒｔｅｓｉａｎ＿ｄｄｇアルゴリズムを使用して、前のステップで得られた候補部位に対して単一点飽和突然変異安定性仮想スクリーニングを実行した。仮想スクリーニングの数は１６＊１９＝３０４個の単一部位突然変異である。スクリーニングの結果、安定性に有益な１１２個の単一部位突然変異が見つかった。この結果を表４に示す。

【0076】

【0077】

突然変異体の安定性の計算結果の評価基準は次のとおりである。ΔΔＧ≦－１ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合は安定突然変異体、ΔΔＧ≧１ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合は非安定突然変異体、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ＜ΔΔＧ＜１ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合は無効な突然変異体である。この基準は、他の計算方法で得られた安定性結果の評価にも適用される。

【0078】

ステップ４：活性仮想スクリーニング：反応エネルギー障壁は、反応物質分子が活性化された分子になるために必要な最小エネルギーである。エネルギー障壁の大きさは、反応の難しさを反映する。したがって、本発明は、経験的原子価結合理論に基づくプロセスを採用して反応エネルギー障壁のバッチ計算を実現し、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と突然変異体との間で計算された反応エネルギー障壁の差を比較することにより、活性が向上した突然変異体を得た。このスクリーニングステップにより、標的基質Ｔ１又はＴ２の活性を向上させる合計４０個の突然変異が得られた。この結果を表５に示す。

【0079】

【0080】

最終的な実験的スクリーニングの結果は、４０個の仮想スクリーニング突然変異のうち１５個が、Ｔ１又はＴ２を生成するｄｒ値を向上させる上で、同様又は顕著に向上した活性を示すことを示した。その中で、より優れた突然変異酵素はＳＥＱＩＤＮＯ：２４であり、その突然変異はＷ１８３Ａである。具体的なスクリーニング例については、実施例５を参照する。また、１５個の有利な突然変異とそれらに対応する活性及び選択性を表６に示す。

【0081】

【0082】

突然変異ライブラリーを構築する方法は、当分野で一般的な部位特異的突然変異ＰＣＲ又は多部位突然変異ＰＣＲを用いることができる（「ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＮｏｖｅｌＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅｓＵｓｉｎｇＰＣＲ」，Ｃｈａｐｔｅｒ３２，ｉｎＰＣＲＰｒｉｍｅｒ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈａｎｄＤｖｅｋｓｌｅｒ）．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ，２００３．参照）。

【0083】

段階ＩＩＩの主な目的は、活性、選択性、及び溶媒耐性（安定性）が大幅に向上された酵素を得ることである。前の２つの段階で、本発明者らは、メタノール又はＤＭＳＯ単独が基質Ｓ１の共溶媒として使用される場合、それぞれに独自の長所と短所があることを発見した。メタノールを共溶媒として使用すると、共溶媒の基質の溶解度は高くなるが、基質が加水分解しやすく、ＤＭＳＯを共溶媒として使用すると、基質Ｓ１の系中の溶解度が低くなり、基質のその場でのラセミ化に影響する（つまり、ＳＴ１、ＳＴ２のＳＤ１、ＳＤ２への変換）。反応に単一溶媒を使用することによって引き起こされる欠点を解決するために、本発明者らは、単一溶媒の代わりに反応溶媒としてＤＭＳＯ／ＡＣＮの混合溶媒を独創的に使用した。ＡＣＮにおける基質Ｓ１の溶解度はＤＭＳＯでの溶解度よりもはるかに高く、基質はＤＭＳＯ系とＡＣＮ系の両方で容易に加水分解されないため、混合溶媒を使用する利点は、反応系における基質Ｓ１の溶解度を向上させ、の基質のその場のラセミ化を促進し、アルコール系溶媒の使用による基質の加水分解を大幅に軽減し、高濃度の単一アセトニトリル溶媒による酵素活性の阻害をある程度回避することができる。性能が向上した酵素を得るために、ライブラリーを設計する際には、段階ＩＩでスクリーニングされた１５個の有利な突然変異を組み合わせて、１７２８個のタンパク質配列を含む組み合わせ突然変異ライブラリーを得て、また、組み合わせ突然変異のＲｏｓｅｔｔａ安定性仮想スクリーニングと活性仮想スクリーニングを行い、活性が向上した突然変異の組み合わせの最初の２０％を用いて、優勢なアミノ酸の出現確率を求め、最終的に部位ごとに最適なアミノ酸の組み合わせ突然変異を得て、その結果を表７に示す。

【0084】

【0085】

最後に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に基づいて、各部位で得られた最適な突然変異を組み合わせて実験的スクリーニングライブラリーにし、表１の段階ＩＩＩのスクリーニング反応条件を用いてスクリーニングした。具体的なスクリーニングの例については実施例７を参照する。最後に、キラル選択性及び活性が大幅に向上したアミノトランスフェラーゼ突然変異体ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０を得た。ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：Ｔ５２Ｙ、Ｑ５３Ｔ、Ｗ１８３Ａ、Ｎ１９０Ｉの４つのアミノ酸突然変異を含む。表８は、突然変異の各組み合わせに対応するエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較した活性の向上、及びそれによる触媒によって生成された生成物のｄｒ値を示す。

【0086】

【0087】

【0088】

文献「ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｓｙｍｍｅｔｒｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａＣａｌｃｉｔｏｎｉｎＧｅｎｅ－ＲｅｌａｔｅｄＰｅｐｔｉｄｅ（ＣＧＲＰ）ＲｅｃｅｐｔｏｒＡｎｔａｇｏｎｉｓｔＵｂｒｏｇｅｐａｎｔ」では、基質濃度５０ｇ／ＬにおけるアミノトランスフェラーゼＡＴＡ－４１２とＡＴＡ－４２６の生成物のｄｒ値が６１であることが開示されている。本発明によって開発されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、より優れた活性、選択性、安定性（熱安定性を含む）、溶媒耐性、基質耐性などを有する。また、本発明は、反応に使用する溶媒を最適化し、ＡＣＮ水溶液中の基質Ｓ１の溶解度をＤＭＳＯ水溶液中の溶解度よりもはるかに高く、単一の高濃度ＡＣＮ溶媒による酵素活性への損傷を避け、基質Ｓ１の水相系での溶解性を向上させるために、本発明では、反応溶媒としてＡＣＮとＤＭＳＯの混合溶媒を革新的に使用した。また、混合溶媒系における基質Ｓ１のエステル加水分解が非常に効果的に制御されることも証明されており、したがって、本発明で開示されるエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、工業生産シナリオにより適している。

【0089】

エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドの調製に有用なポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のアミノトランスフェラーゼ活性を有するエンジニアリングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御する１つ又は複数の異種調節配列に作動可能に連結されて、ポリペプチドを発現できる組換えポリヌクレオチドを生成することができる。エンジニアリングアミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを発現させることができる。当業者には明らかなように、タンパク質配列の入手可能性及び様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、標的タンパク質配列をコードできるすべてのポリヌクレオチドの説明が提供される。同じアミノ酸が代替コドン又は同義コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、非常に多数の核酸の生成が可能となり、そのすべての核酸が本明細書に開示される改良アミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を決定した後、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えないことにより、１つ又は複数のコドンのみの配列を修飾することによって、任意の数の異なる核酸を生成することができる。この点に関して、本開示は、可能なコドンの選択に基づいて組み合わせを選択することによって調製され得るポリヌクレオチドのあらゆる可能な改変を具体的に想定し、本明細の任意のポリペプチドについて、表６、及び表８に提供される例示的なエンジニアリングポリペプチドのアミノ酸配列、及び引用により本明細書に組み込まれる配列表のＳＥＱＩＤＮＯ：ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８の配列として開示される任意のポリペプチドを含み、これらの改変は、すべて、特に開示されているものとみなされる。

【0090】

様々な実施形態では、コドンは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択されることが好ましい。例えば、細菌で遺伝子を発現させるために細菌で好ましいコドンが使用され、酵母で遺伝子を発現させるために酵母で好ましいコドンが使用され、哺乳動物細胞で遺伝子を発現させるために哺乳動物で好ましいコドンが使用される。

【0091】

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードし、ここで、前記ポリペプチドは、アミノトランスフェラーゼ活性や、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドと比較して向上した活性、化合物Ｓ１を生成物Ｔ２やＴ２に変換する能力など、本明細書に記載の改良された特性の１つ又は複数を有する。

【0092】

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して、上記同一性パーセンテージを有し、１つ又は複数のアミノ酸残基の違いを有するアミノ酸配列を含むエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、Ｘ５２、Ｘ５３、Ｘ１１５、Ｘ１２６、Ｘ１４６、Ｘ１８３、Ｘ１９０から選択される位置での残基違いの組み合わせを有する、アミノトランスフェラーゼ活性を有するエンジニアリングポリペプチドを提供する。

【0093】

いくつかの実施形態では、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７から選択される配列を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドのレベルでエンジニアリングアミノトランスフェラーゼをコードする参照ポリヌクレオチドと約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。

【0095】

いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７の配列から選択される。

【0096】

エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するための様々な方法で操作することができ、前記方法は、コドン最適化によるさらなる配列改変により発現を改良すること、追加の制御配列の有無にかかわらず、適切な発現エレメントへの挿入、およびポリペプチドの発現および生産に適した宿主細胞への形質転換を含む。発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドに対する操作が望ましい場合又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチド及び核酸配列を修飾する技術は当技術分野でよく知られている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、及びＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．編，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２０１０年更新には指導が提供される。

【0097】

別の態様では、本開示は、また、導入される宿主の種類に応じて、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、及び１つ又は複数の発現調節領域、例えば、プロモーターターミネーターや複製起点などを含む、組換え発現ベクターに関する。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列又はその配列を含む核酸構築物を適切な発現ベクターに挿入することによって発現され得る。発現ベクターを産生する際に、コード配列は、コード配列が発現のために適切な制御配列に作動可能に連結されるようにベクター内に配置される。組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡステップにおいて都合よく使用でき、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、通常、ベクターとそのベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、直鎖状プラスミド又は閉環状プラスミドであってもよい。発現ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体などの、その複製が染色体複製とは独立である染色体外実体として存在するベクターであってもよい。ベクターには、自己複製を確実にするためのあらゆる手段が含まれていてもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときにゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体とともに複製するものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、又は宿主細胞ゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用することができる。本開示の実施形態に有用な多くの発現ベクターが市販されている。例示的な発現ベクターは、改良されたアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプラスミドｐＡＣＹＣ－Ｄｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に作動可能に連結することによって調製することができる。

【0098】

別の態様では、本開示は、本開示の改良されたアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞中のアミノトランスフェラーゼの発現のための１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結される。本開示の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、大腸菌、アルスロバクター種ＫＮＫ１６８、ストレプトマイセス種、及びサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ））などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞の動物細胞；及び植物細胞を含むが、これらに限定されるものではない。例示的な宿主細胞は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。上記の宿主細胞は、野生型であってもよいし、宿主細胞のゲノムに含まれる野生型アミノトランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトするなどのゲノム編集を受けたエンジニアリング細胞であってもよい。上記の宿主細胞に適した培地及び成長条件は、当技術分野でよく知られている。

【0099】

アミノトランスフェラーゼを発現させるためのポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている様々な方法によって細胞に導入することができる。技術としては、エレクトロポレーション、生体粒子衝撃法、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、及びプロトプラスト融合などが含まれる。ポリヌクレオチドを細胞に導入する様々な方法は、当業者には明らかである。

【0100】

エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドの産生方法
エンジニアリングポリペプチドの配列が既知である場合、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、既知の合成方法に従って標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、最大約１００塩基の断片を個別に合成し、次いで（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法又はポリメラーゼ媒介法によって）ライゲーションして、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，ＴｅｔＬｅｔｔ２２：１８５９－６９に記載の古典的なホスホルアミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓら，１９８４，ＥＭＢＯＪ．３：８０１－０５に記載の方法、例えば、自動合成法において典型的に実施されるものである。ホスホロアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローン化される。また、本質的にあらゆる核酸は、さまざまな商業的供給源のいずれかから入手することができる。

【0101】

いくつかの実施形態では、本開示は、また、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを調製又は作製するための方法を提供し、この方法は、エンジニアリングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した培養条件下で培養することを含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドを調製する方法は、ポリペプチドを単離することをさらに含む。エンジニアリングポリペプチドは、適切な細胞で発現され、タンパク質精製用の周知の技術のいずれか１つ又は複数を使用して、宿主細胞及び／又は培地から単離（又は回収）され得る。タンパク質精製のための前記技術には、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、熱処理、超遠心分離、およびクロマトグラフィーが含まれる。

【0103】

エンジニアリングアミノトランスフェラーゼの利用方法及びそれを用いた化合物の調製
別の態様では、本明細書に記載の改良されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、アミノドナーの存在下、プロキラル受容体ケトン化合物をキラルアミン化合物に変換できる。本開示はまた、本明細書で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを用いて、幅広い化合物Ｉ又はその構造類似体を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、構造式Ｉの化合物を調製する方法に用いられ得る。

【0104】

（ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５の基は、任意に置換された－Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、ハロゲン（例えば、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ）、－ＮＯ：２、－ＮＯ、－ＳＯ_２Ｒ’又は－ＳＯＲ’、－ＳＲ’、－ＮＲ’Ｒ’、－ＯＲ’、－ＣＯ_２Ｒ’又は－ＣＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＳＯ_２ＮＨ_２又は－ＳＯＮＨ_２、－ＣＮ、ＣＦ_３であってもよく、Ｒ^６は、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロゲン化炭化水素、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロキシ置換炭化水素であってもよく、Ｒ^７は、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロカルビル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロゲン化炭化水素、Ｃ_１～Ｃ_６ヒドロキシ置換炭化水素であってもよく、Ｒ^８は、ＣＢＺ保護基、ＢＯＣ保護基、Ｆｏｍｃ保護基、Ｂｎ保護基、メトキシ（エトキシ）カルボニル保護基であってもよい。Ｒ’は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_４ヒドロカルビルから選択される。）
構造式Iで示されるアミン生成物は、構造式II－VIで示されるキラルアミン異性体のうちの１種又は複数種の混合物である。

【0105】

【0106】

化合物I構造中のエステル基の活性によって、適切な反応条件下、例えば適切な温度、ｐＨ及び溶媒条件で、構造式Iで示されるアミン生成物の一部は自発的に環を形成し、構造式VIのラクタムを形成してもよい。

【0107】

【0108】

構造式VIで示されるアミン生成物は、以下の構造式VII－Xで示されるキラルアミン異性体のうちの１種又は複数種の化合物の混合物である。

【0109】

【0110】

アミノトランスフェラーゼによって構造式I－Xで示されるキラルアミン生成物の生成を触媒し得る基質構造式XIは以下の通りである。

【0111】

【0112】

好ましくは、本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、基質Ｓ１に対して顕著な触媒の活性があり、Ｓ１の構造式は以下に示される。

【0113】

【0114】

Ｓ１は、ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＤ１又はＳＤ２の４つの異なる異性体を含んでもよい。

【0115】

【0116】

本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｓ１をＩ１に変換することができる。

【0117】

【0118】

Ｉ１は、ＩＴ１、ＩＴ２、ＩＤ１又はＩＤ２の４つの異なる異性体を含んでもよい。

【0119】

【0120】

構造式ＩＴで示される化合物は、ＩＴ１及び／又はＩＴ２を表す。

【0121】

【0122】

Ｉ１の構造上のエステル結合は、自発的に破断して環を形成し、Ｔ１、Ｔ２、Ｄ１、及びＤ２で示される対応する化合物を形成してもよい。

【0123】

【0124】

本発明で開示されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドによって基質Ｓ１を触媒して生成する生成物のうち、ＩＴ１とＩＴ２及びＴ１とＴ２は過剰な生成物である。Ｔ１及びＴ２のＬ１で示される構造式は以下に示される。

【0125】

【0126】

本明細書に記載の改良的エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、アミノドナーの存在下で、Ｓ１をＴ１、Ｔ２、Ｄ１、Ｄ２のうちの１種又は複数種に変換することができる。いくつかの実施形態では、生成物のｄｒ値（すなわち、［Ｔ１＋Ｔ２］／［Ｄ１＋Ｄ２］）は、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はこれ以上である。

【0127】

いくつかの実施形態では、以上の方法に使用され得る改良されたエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８から選択されるアミノ酸配列を含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８配列から選択される参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列も含む。

【0128】

本明細書に記載され、実施例で検証されるように、本開示は、本明細書の方法で使用できる適切な反応条件を想定しており、これには、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質担持量、ポリペプチド担持量及び反応時間の範囲が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載のアミノトランスフェラーゼポリペプチドを使用して基質化合物を生成化合物に生体触媒的に変換する方法を実施するための追加の適切な反応条件は、通常の実験によって容易に最適化することができる。前記通常の実験には、濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験反応条件下でエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを基質化合物と接触させること、及び例えば、本明細書に提供される実施例に記載の方法を使用して生成化合物を検出することが含まれるが、これらに限定されない。

【0129】

上記の通り、本開示の方法に使用されるアミノトランスフェラーゼ活性を有するエンジニアリングポリペプチドは、通常、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８から選択される配列のうちの参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0130】

反応混合物中の基質化合物は、例えば、所望の生成化合物の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、及び基質から生成物への変換パーセンテージなどを考慮して変化し得る。前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件には、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ又はそれ以上の基質Ｓ１の担持量が含まれる。本明細書で提供される基質担持量の値は化合物Ａ１の分子量に基づいているが、等モル量の化合物の様々な水和物及び塩が方法で使用され得ることも想定される。

【0131】

本明細書に記載の方法において、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、ケトン基質およびアミノドナーからのキラルアミン生成物の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、反応条件におけるアミノドナーには、アラニン、イソプロピルアミン（２－アミノプロパンとしても知られる）、フェニルアラニン、グルタミン、ロイシン、または３－アミノ酪酸から選択される任意の適切なアミノ酸、またはメチルベンジルアミンから選択される任意の適切なキラルもしくはアキラルアミンが含まれる。前記アミノドナーは、実施形態では塩（例えば、塩酸アラニン、酢酸アラニン、塩酸イソプロピルアミン、酢酸イソプロピルアミンなど）の形態で使用することもできる。いくつかの実施形態では、アミノドナーはイソプロピルアミンである。いくつかの実施形態では、適切な反応条件には、アミノドナー、特にイソプロピルアミンが、基質Ｓ１のモル担持量の少なくとも約１倍の担持量で存在することが含まれる。いくつかの実施形態では、イソプロピルアミンは、０．１Ｍ～約４．０Ｍの担持量で存在する。

【0132】

反応の実施形態では、反応条件には適切なｐＨが含まれてもよい。上で述べたように、所望のｐＨ又は所望のｐＨ範囲は、酸又は塩基、適切な緩衝剤、又は緩衝剤と酸又は塩基の添加との組み合わせを使用することによって維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応プロセス前及び／又は反応プロセス中に制御することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件には、約７～約１１．５の溶液ｐＨが含まれる。いくつかの実施形態では、反応条件には、約７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５の溶液ｐＨが含まれる。

【0133】

本明細書における方法の実施形態では、例えば、高温での反応速度の増加、十分に長い反応時間にわたる酵素活性を考慮して、反応条件に適切な温度を使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件には、約１０℃～約６５℃、約２５℃～約５０℃、約２５℃～約４０℃、又は約２５℃～約３０℃の温度が含まれる。いくつかの実施形態では、適切な反応温度には、約２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、又は６０℃の温度が含まれる。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応全体を通じて特定の温度に維持され得る。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応中の温度プロファイルに調整することができる。

【0134】

エンジニアリングアミノトランスフェラーゼを使用する方法は、通常、水又は溶媒中で行われる。適切な溶媒には、水性緩衝液、有機溶媒、及び／又は共溶媒系が含まれ、共溶媒系には、通常、水性溶媒及び有機溶媒が含まれる。水性溶液（水又は水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝されていても、緩衝されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、エンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチドを使用する方法は、通常、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ））、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸ブチル、１－オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン液体（例えば、１－エチル４－メチルイミダゾールテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾールテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾールヘキサフルオロホスフェートなど）を含む水性共溶媒系で行われる。水性共溶媒系中の有機溶媒成分は、水性成分と混和して単一液相を提供することも、水性成分と部分的に混和性又は非混和性として二液相を提供することもできる。加水分解反応中に発生する二酸化炭素は泡の形成を引き起こす可能性があるため、消泡剤を適宜添加することができる。例示的な水性共溶媒系には、水及び１つ又は複数の有機溶媒が含まれる。通常、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、アミノトランスフェラーゼを完全には不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、候補溶媒系中の目的の規定の基質を用いて本明細書に記載されるような酵素活性アッセイを使用して、特定のエンジニアリングアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定することによって容易に同定することができる。方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件には、水性共溶媒が含まれ、前記水性共溶媒は、約１％～約１００％（ｖ／ｖ）、約１％～約６０％（ｖ／ｖ）、約２％～約６０％（ｖ／ｖ）、約５％～約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％～約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％～約５０％（ｖ／ｖ）又は約１０％～約４０％（ｖ／ｖ）の濃度のＤＭＳＯとＡＣＮとの混合溶媒を含む。方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件には、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％の濃度のＤＭＳＯとＡＣＮとの混合溶媒を含む。

【0135】

適切な反応条件には、基質化合物の対応する生成化合物への生体触媒変換を提供する反応パラメータの組み合わせが含まれ得る。したがって、本方法のいくつかの実施形態では、反応パラメータの組み合わせには、（ａ）約１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ基質Ｓ１の担持量、（ｂ）約１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌのエンジニアリングポリペプチド、（ｃ）約０．１Ｍ～４．０Ｍのイソプロピルアミンの担持量、（ｄ）約７．０～１１．５のｐＨ、（ｅ）約１０℃～６５℃の温度、及び（ｆ）１％～７０％のＤＭＳＯとＡＣＮとの混合溶媒が含まれる。

【0136】

本明細書に記載の酵素反応を実施する際、エンジニアリングポリペプチドは、部分的に精製された、又は精製された酵素、熱処理された酵素液、酵素をコードする遺伝子で形質転換された完全な細胞、及び／又はそのような細胞の細胞抽出物であってもよく、及び／又は溶解物の形態で反応混合物に添加されてもよい。エンジニアリングポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された完全な細胞、又はその細胞抽出物、その溶解物、及び単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）又は半固体（例えば、湿潤菌体などの粗製ペースト）など、さまざまな形態で使用されてもよい。細胞抽出物又は細胞溶解物は、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理などの処理）によって部分的に精製され、その後、凍結乾燥前に脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）を行うことができる。あらゆる酵素製品は、例えばグルタルアルデヒドなどの既知の架橋剤を使用して固相材料（例えば樹脂）に架橋又は固定化することによって安定化することができる。

【0137】

本明細書に記載の酵素反応のいくつかの実施形態では、反応は、本明細書に記載の適切な反応条件下で行われ、エンジニアリングポリペプチドは固体支持体に固定化される。酵素反応を行うためのエンジニアリングポリペプチドを固定化するために使用できる固体支持体には、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシ官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むミクロスフェアまたは樹脂が含まれるが、これらに限定されない。例示的な固体支持体としては、キトサンビーズ、ＥｕｐｅｒｇｉｔＣ、及びＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が含まれるが、これらに限定されず、これには、ＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９、及びＥＸＥ１２０の異なるタイプが含まれる。

【0138】

いくつかの実施形態では、エンジニアリングポリペプチドが分泌ポリペプチドとして発現され得る場合、この分泌ポリペプチドを含む培地が本明細書の方法において使用され得る。
いくつかの実施形態では、固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、エマルジョン、懸濁液など、さまざまな形態で反応に適用されてもよい。反応物は、当業者に周知の方法及び器具を使用して容易に凍結乾燥又は噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を－８０℃で少量凍結し、あらかじめ冷却した凍結乾燥チャンバーに加え、その後真空にする。

【0139】

いくつかの実施形態では、反応物を添加する順序又は方法には複数の選択肢がある。反応物は同時に溶媒に加えることができる（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）。あるいは、一部の反応物質を最初に添加し、他の反応物質をフローストリーム又は間隔をあけてバッチで添加することもできる。
本開示の様々な特徴及び実施形態は、以下の代表的な実施例において例示されるが、これらは例示を目的とするものであり、限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0140】

【図1】ウブロゲパントの合成ルートである。

【図2】本発明のアミノトランスフェラーゼ触媒反応である。

【図3】仮想スクリーニングの基本プロセスである。

【図4】基質ＳＴ１付近のアミノ酸部位の分布である。

【発明を実施するための形態】

【0141】

実施例１：段階Ｉにおけるアミノトランスフェラーゼのスクリーニング
細胞溶解液（１ｇ／Ｌｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．５ｇ／ＬＰＭＢＳ、０．５ｇ／Ｌヌクレアーゼ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、ｐＨ１０．５）を、さまざまなアミノトランスフェラーゼを含む湿潤菌体を含むウェルプレートにウェルあたり２００μＬ加え、１ｈ振盪して細胞を破砕し、細胞溶解液を得た。溶解液を遠心分離し、上清を新しいディープウェルプレートに移して、反応に使用できる酵素液を得た。９６ウェルディープウェルプレートに、ＤＭＳＯに溶解した２０ｇ／Ｌ基質母液４０μＬと反応混合物（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）５０μＬを加え、反応系の各成分の最終濃度として、［５ｇ／Ｌ基質、５５％酵素液（ｖ／ｖ）、２０％ＤＭＳＯ、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、１Ｍイソプロピルアミン、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．５とし、ウェルプレートを４５℃の恒温シェーカーに２４ｈ置いた。反応終了後、ウェルプレートを取り出し、７０℃の水浴シェーカー上に入れて１ｈ加熱した後、純粋なアセトニトリルを１：１で加えて不活化し、サンプルを２．５ｇ／Ｌに希釈し、注入して検出した。ＨＰＬＣ検出の結果、ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、最適な活性及び選択性を示し、２４時間では反応収率は２９％、ｄｒ値は０．３であった。

【0142】

実施例２：アミノトランスフェラーゼポリペプチドの発現
アミノトランスフェラーゼポリペプチド発現プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む単一微生物コロニーを、ＬＢ培地（クロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬを含む）５０ｍＬを含む２５０ｍＬ三角フラスコに接種し、３０℃のシェーカー上に置いて振盪しながら一晩培養した。培養液のＯＤ_６００が２に達したら、ＴＢ培地２５０ｍＬを入れた１０００ｍＬ三角フラスコに５％（ｖ／ｖ）の接種量を加え、３０℃のシェーカーに置いて振盪培養した。培地液のＯＤ_６００が０．６に達したら、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、アミノトランスフェラーゼの発現を誘導した。２０ｈ培養した後、培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、遠心分離後、上清を捨て、細胞を回収して湿潤菌体を得た。湿潤菌体は酵素液の調製に直接使用することも、使用するまで－２０℃で冷凍保存することもできる。

【0143】

実施例３：ＥＱＩＤＮＯ：２の溶媒耐性の試験
実施例２で調製したＳＥＱＩＤＮＯ：２の湿潤菌体０．５ｇを秤量し、細胞溶解液（１ｇ／Ｌｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．５ｇ／ＬＰＭＢＳ、０．５ｇ／Ｌヌクレアーゼ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、ｐＨ１０．５）５ｍＬを加え、１ｈ振盪して細胞を破砕し、細胞溶解液を得て、細胞溶解液を遠心分離し、上清を採取して酵素液を得た。反応器を開け、事前に４５℃に昇温し、ＤＭＳＯ、メタノール、ＩＰＡにそれぞれ溶解したＳ１、反応混合物（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）、四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２酵素液を反応フラスコに加え、反応系の最終濃度として、５ｇ／Ｌ基質、２０％酵素液（ｖ／ｖ）、２０％溶媒（ｖ／ｖ）、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、１Ｍイソプロピルアミン、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．５とし、次いで、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４ｈ反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、１ｈ加熱し続けた。その後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて酵素を不活性化させ、サンプルを採取してＨＰＬＣ検出に供した。検出の結果、メタノール、ＤＭＳＯ、イソプロパノール系では、２４ｈ反応後の収率は以下の通りである。

【0144】

実施例４：突然変異酵素ライブラリーの発現及びスクリーニング用酵素液の調製
寒天プレートから突然変異酵素ライブラリーのコロニーを選び、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地を入れた９６ウェルプレートに接種し、シェーカーに置いて３０℃で一晩培養した。培養液のＯＤ_６００が２～３に達したら、９６ウェルプレートから２０μＬを採取し、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地を容れた９６ウェルディープウェルプレート（ウェルあたり４００μＬＴＢ培地）に接種し、シェーカーに置いて、３０℃で培養した。培養液のＯＤ_６００が０．６～０．８に達したら、誘導剤として最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、シェーカーに置いて、３０℃で一晩発現させた（１８～２０ｈ）。発現終了後、菌液を含むディープウェルプレートを遠心分離、菌液上清を除去し、湿潤菌体を得た。湿潤菌体を－２０℃の冷蔵庫で少なくとも２４時間保存した後、湿潤菌体を含むウェルプレートにウェルあたり２００μＬの細胞溶解液（１ｇ／Ｌｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．５ｇ／ＬＰＭＢＳ、０．５ｇ／Ｌヌクレアーゼを含み、０．０５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、ｐＨ１０．５）を加え、１ｈ振盪して細胞を破砕し、溶解液を得た。溶解液を遠心分離し、上清を新しいディープウェルプレートに移し、スクリーニング反応に利用可能な酵素液を得た。

【0145】

実施例５：段階IIにおける酵素のハイスループットスクリーニング
メタノールに溶解した基質母液７０μＬ、四ホウ酸ナトリウム緩衝液４０μＬ（ｐＨ１０．５）、イソプロピルアミン混合液（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）５０μＬをディープウェルプレートに順に加え、実施例４で調製した酵素液６０μＬを順に加え、反応系の各成分の最終濃度として、５ｇ／Ｌ基質、酵素液３０％（ｖ／ｖ）、３５％メタノール、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、１Ｍイソプロピルアミン、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．５とし、ウェルプレートを４５℃の恒温シェーカーに入れて２４ｈ反応させた。反応終了後、ウェルプレートを取り出し、７０℃の水浴シェーカーに入れて１ｈ加熱した後、アセトニトリルを１：１で加えて不活性化させ、サンプルを２．５ｇ／Ｌに希釈し、注入して検出した。

【0146】

実施例６：ＤＭＳＯ：ＡＣＮ混合溶媒反応
実施例２で調製したＳＥＱＩＤＮＯ：２４湿潤菌体０．５ｇを秤量し、細胞溶解液（１ｇ／Ｌｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．５ｇ／ＬＰＭＢＳ、０．５ｇ／Ｌヌクレアーゼ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、ｐＨ１０．５）５ｍＬを加え、１ｈ振盪して細胞を破砕し、細胞溶解液を得て、細胞溶解液を遠心分離し、上清を採取し、酵素液を得た。反応器を開け、事前に４５℃に昇温し、メタノール、ＤＭＳＯ、８０％ＤＭＳＯ：２０％ＡＣＮ、７０％ＤＭＳＯ：３０％ＡＣＮ、６０％ＤＭＳＯ：４０％ＡＣＮ、５０％ＤＭＳＯ：５０％ＡＣＮにそれぞれ溶解したＳ１、反応混合液（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４酵素液を反応フラスコにそれぞれ加え、反応系の最終濃度として、５０ｇ／Ｌ基質、２５％（ｖ／ｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２４酵素液、５０％（ｖ／ｖ）溶媒、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、１Ｍイソプロピルアミン、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．５とし、次いで、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４時間反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、１ｈ加熱し続けた。その後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて酵素を不活性化させ、サンプルを採取してＨＰＬＣ検出に供した。検出の結果、さまざまな溶媒系では、２４ｈ反応後の収率は以下の表の通りである。

【0147】

実施例７：段階IIIにおける酵素のハイスループットスクリーニング
７０％ＤＭＳＯ：３０％ＡＣＮ混合溶媒に溶解した基質母液７０μＬ、四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）４０μＬ、イソプロピルアミン混合液４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）５０μＬ、実施例４で調製した酵素液６０μＬをディープウェルプレートに順に加え、反応系の各成分の最終濃度として、３０ｇ／Ｌ基質、酵素液３０％（ｖ／ｖ）、３５％ＤＭＳＯ：１５％ＡＣＮ、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、１Ｍイソプロピルアミン、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．５とし、ウェルプレートを５５℃恒温シェーカーに入れて２４ｈ反応させた。反応終了後、ウェルプレートを取り出し、７０℃の水浴シェーカーに入れて１ｈ加熱した後、アセトニトリルを１：１で加えて不活性化させ、サンプルを５ｇ／Ｌに希釈し、注入して検出した。

【0148】

実施例８：酵素の熱安定性の試験
酵素母液の調製：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０菌体１．５ｇを秤量し、細胞溶解液（１ｇ／Ｌｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．５ｇ／ＬＰＭＢＳ、０．５ｇ／Ｌヌクレアーゼ、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、ｐＨ１０．５）３０ｍＬに溶解し、室温で１時間振盪し、遠心分離し、上清を採取して使用に備えた。

【0149】

酵素液の熱処理：調製した酵素液上清３ｍＬを採取し、４５℃、５５℃、６５℃の水浴でそれぞれ２ｈ、２４ｈ熱処理した。

【0150】

熱処理酵素液活性の検出：事前に反応器を開けておき、４５℃に昇温し、７０％ＤＭＳＯ：３０％ＡＣＮの混合溶媒に溶解した基質、反応混合液［４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整］、各条件で熱処理されたＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液を反応フラスコに順に加え、反応系の最終濃度として、５０ｇ／Ｌ基質、３５％ＤＭＳＯ：１５％ＡＣＮ、１Ｍイソプロピルアミン、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．５、２５％（ｖ／ｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液とし、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４時間反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、反応フラスコを１時間加熱した後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて不活性化させた。ＨＰＬＣ検出を行い、さまざまな熱処理条件での酵素活性を以下の表に示す。

【0151】

実施例９：酵素のｐＨ耐性の試験
事前に反応器を開けておき、５５℃に昇温し、７０％ＤＭＳＯ：３０％ＡＣＮの混合溶媒に溶解した基質、反応混合液（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液を反応フラスコに順に加え、反応の最終濃度として、５０ｇ／Ｌ基質、３５％ＤＭＳＯ：１５％ＡＣＮ、１Ｍイソプロピルアミン（ｐＨ９．５、１０．５、１１、１１．５）、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５、１０．５、１１、１１．５）、２５％（ｖ／ｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液とし、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４時間反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、反応フラスコを１時間加熱した後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて不活性化させた。サンプルを採取し、ＨＰＬＣ検出を行い、ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１１、ｐＨ１１．５条件、２４時間での収率を以下の表に示す。

【0152】

実施例１０：反応温度の最適化
事前に反応器を開けておき、３０℃、４５℃、５５℃、６５℃にそれぞれ昇温し、７０％ＤＭＳＯ：３０％ＡＣＮの混合溶媒に溶解した基質、反応混合液（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液を反応フラスコに順に加え、反応の最終濃度として、５０ｇ／Ｌ基質、３５％ＤＭＳＯ：１５％ＡＣＮの混合溶媒、１Ｍイソプロピルアミン（ｐＨ１０．５）、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、２５％（ｖ／ｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液とし、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４時間反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、反応フラスコを１時間加熱した後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて不活性化させた。サンプルを採取し、ＨＰＬＣ検出を行い、４５℃、５５℃、６５℃条件下、２４時間での収率の結果を以下の表に示す。

【0153】

実施例１１：エンジニアリングアミノトランスフェラーゼの溶媒耐性の試験
事前に反応器を開けておき、５５℃に昇温し、メタノール、ＤＭＳＯ、イソプロパノール、ＡＣＮにそれぞれ溶解した基質、反応混合液（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液を反応フラスコに順に加え、反応の最終濃度として、５０ｇ／Ｌ基質、２０％、３５％、５０％、６０％のメタノール、ＤＭＳＯ、イソプロパノール、ＡＣＮ、１Ｍイソプロピルアミン（ｐＨ１０．５）、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、２５％（ｖ／ｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０酵素液とし、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４時間反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、反応フラスコを１時間加熱した後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて不活性化させた。サンプルを採取し、ＨＰＬＣ検出を行い、さまざまな溶媒濃度の条件での２４時間の収率の結果を以下の表に示す。

【0154】

実施例１２：全有機相反応
事前に反応器を開けておき、５５℃に昇温し、メタノール、ＤＭＳＯ、イソプロパノール、ＡＣＮ、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエンにそれぞれ溶解した基質Ｓ１、イソプロピルアミン混合液（含０．２５ｍＬ純水及び３．５ｇ／ＬＰＬＰ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０全細胞を反応フラスコに順に加え、反応の最終濃度として、５０ｇ／Ｌ基質、８６％メタノール、ＤＭＳＯ、イソプロパノール、ＡＣＮ、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、１Ｍイソプロピルアミン、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、５０ｇ／ＬＳＥＱＩＤＮＯ：１３０全細胞とし、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら２４時間反応させ、反応終了後、反応器を７０℃に昇温し、反応フラスコを１時間加熱した後、純粋なアセトニトリル５ｍＬを加えて不活性化させた。サンプルを採取し、ＨＰＬＣ検出を行い、さまざまな溶媒濃度条件での２４時間の収率の結果を以下の表に示す。

【0155】

実施例１３：発酵及び後処理
目的のエンジニアリングアミノトランスフェラーゼポリペプチド発現プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（５．０ｇ／ＬＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔＬＰ００２１、１０ｇ／ＬＴｒｙｐｔｏｎｅＬＰ００４２、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）を含むＬＢブロス５０ｍＬに接種し、３０℃のシェーカーにて２５０ｒｐｍで１６ｈ振盪培養した。培養液のＯＤ_６００が３．５～４．５になったら、培養液をシェーカーから取り出し、すぐに発酵槽に接種した。０．４Ｌの成長培地を含む１．０Ｌ発酵槽を１２１℃の高圧蒸気滅菌器で３０ｍｉｎ滅菌した。発酵槽に上記振盪フラスコ内の培養液を接種した。ジャケットにより発酵槽の温度を３７℃に保ち、２００～８００ｒｐｍの速度で撹拌し、発酵槽内に０．４～０．８Ｌ／ｍｉｎで空気を供給し、溶存酸素濃度を３０％以上に保った。２５～２８％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムを添加することによって培養液のｐＨを７．０に維持した。５００ｇ／Ｌの食用グルコースデキストロース一水和物、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、及び５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物を含む供給溶液を流加することによって菌の成長を維持した。培養液のＯＤ_６００が２５±５に達したら、培養液の温度を下げ、３０℃に保ち、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように加えてアミノトランスフェラーゼの発現を誘導し、約１６ｈ発酵させた後、槽から取り出した。ＴｈｅｒｍｏＭｕｌｔｉｆｕｇｅＸ３Ｒ遠心分離機を使用し、４℃、８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して、湿潤菌体を収集した。収集した湿潤菌体を、次の下流の回収プロセスで直接使用するか、使用するまで冷凍して－２０℃で保存した。湿潤菌体６ｇを、２５０μＭピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍＬに４℃で再懸濁させた。８００ｂａｒのホモジナイザーを使用して均質化及び粉砕を２回行い、細胞からアミノトランスフェラーゼを放出した。ＴｈｅｒｍｏＭｕｌｔｉｆｕｇｅＸ３Ｒ遠心分離機を使用し、４℃、８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して、得られた破砕液を清澄化した。清澄化した上清を浅い容器に分注し、－２０℃で凍結し、凍結乾燥機を使用して酵素粉末に凍結乾燥した。アミノトランスフェラーゼ酵素粉末を－２０℃で冷凍して保存した。

【0156】

実施例１４：アミノトランスフェラーゼ触媒反応
水浴鍋を起動させて５５℃に昇温し、２つの５００ｍＬ反応フラスコを鉄スタンドに固定し、水浴鍋に入れて予熱し、２つの５００ｍＬ反応フラスコにＳ１２０ｇ、ＤＭＳＯ７０ｍＬ、及びＡＣＮ３０ｍＬを順に加え、Ｓ１を完全に溶解させるために撹拌した。次に、反応混合液５０ｍＬ（４Ｍイソプロピルアミン、２ｇ／ＬＰＬＰ含有、四ホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解、濃塩酸でｐＨを１０．５（４０℃）に調整）、実施例１３で調製したＳＥＱＩＤＮＯ：２４及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３０の酵素粉末をそれぞれ加え、反応の最終系を、１００ｇ／ＬＳ１、３５％ＤＭＳＯ：１５％ＡＣＮ、１Ｍイソプロピルアミン（ｐＨ１０．５）、０．５ｇ／ＬＰＬＰ、０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、２０ｇ／ＬＳＥＱＩＤＮＯ：２４又はＳＥＱＩＤＮＯ：１３０（それぞれ反応１及び反応２と番号付け）とし、反応プロセス中、リアルタイムｐＨ調整器を使用して６Ｍイソプロピルアミン水溶液で反応系のｐＨを調整し、反応系のｐＨをｐＨ１０．３～ｐＨ１０．５に維持した。２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈのそれぞれで２００μＬのサンプルを採取し、７０℃で１ｈ加熱した。次いで、純粋なアセトニトリル２００μＬを加えて不活化させ、ＨＰＬＣ検出を行った。反応の収率を以下の表に示す。

【0157】

実施例１５：反応後処理
実施例１４の反応液を４０℃、－０．０９５ＭＰａのウォーターポンプ条件下でロータリーエバポレーションしてイソプロピルアミン及びアセトニトリルを除去し、２Ｍ水酸化ナトリウムを加えて反応系をｐＨ１０に調整した。次いで、反応液を酢酸エチル１００ｍＬで抽出し、上澄み液を分離し、下層の水相を酢酸エチル５０ｍＬで再度抽出し、酢酸エチル層を合わせて、飽和食塩水５０ｍＬで２回洗浄し、分液した。次に、４０℃、－０．０９５ＭＰａのウォーターポンプ条件下でロータリーエバポレーションして酢酸エチルを除去し、凝縮装置を使用して酢酸エチルを回収した。次いで、粗生成物を、酢酸エチル／ｎ－ヘプタン（１：２（ｖ／ｖ））の混合溶媒を使用して結晶化させた。最終反応１では、１３．１ｇの純粋な生成物が得られ、生成物は、総収率７７．４％、ｄｒ値７９、純度９８．５％であった。反応２では、１４．３ｇの純粋な生成物が得られ、生成物は、総収率８４．５％、ｄｒ値１００超、純度９９％超であった。

【図1】