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▶ アイ－エムエービー バイオファーマ カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-17
(54)【発明の名称】多重特異性構築物及びその方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250109BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20250109BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024541042
(86)(22)【出願日】2023-01-09
(85)【翻訳文提出日】2024-08-08
(86)【国際出願番号】 CN2023071334
(87)【国際公開番号】W WO2023131329
(87)【国際公開日】2023-07-13
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/070870
(32)【優先日】2022-01-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/117334
(32)【優先日】2022-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520035034
【氏名又は名称】アイ－エムエービー バイオファーマ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジアン， ウェンチン
(72)【発明者】
【氏名】リー， ジアン
(72)【発明者】
【氏名】チェン， シー
(72)【発明者】
【氏名】リウ， ヤン
(72)【発明者】
【氏名】グオ， ビンシー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB42
4C085BB43
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG04
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
クローディン６（ＣＬＤＮ６）及び４－１ＢＢを標的とする二重特異性抗体及び多重特異性抗体が提供される。これらの抗体は、ＣＬＤＮ６発現細胞の不在下において、４－１ＢＢに結合することができるが、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することはできない。しかし、ＣＬＤＮ６発現細胞の存在下では、これらの抗体は、ＣＬＤＮ６依存性４－１ＢＢシグナル伝達を誘発することができ、ＣＬＤＮ６発現腫瘍細胞に対する強力な免疫応答をもたらす。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）クローディン－６（「ＣＬＤＮ６」）に特異的に結合する第１の抗体部分と、（２）４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分と
を含む、多重特異性構築物。
【請求項2】
前記第１の抗体部分が、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択される、請求項０に記載の多重特異性構築物。
【請求項3】
前記第１の抗体部分が、（１）配列番号７に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、
（２）配列番号８に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３と
を含む、請求項０または０に記載の多重特異性構築物。
【請求項4】
前記第１の抗体部分が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（ａ）前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、
（ｂ）前記ＶＬは、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、
請求項０～０のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項5】
前記第１の抗体部分が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（１）前記ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７に対して少なくとも約８０％の配列同一性を含むそのバリアントを含み、及び／または
（２）前記ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を含むそのバリアントを含む、
請求項０～０のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項6】
前記第１の抗体部分が、（１）配列番号１８に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、
（２）配列番号１９に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３と
を含む、請求項０～２のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項7】
前記第１の抗体部分が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（１）前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、
（２）前記ＶＬは、
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、
請求項０～２及び６のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項8】
前記第１の抗体部分が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（１）前記ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／または
（２）前記ＶＬは、配列番号１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１９に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、
請求項１～２及び６～７のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項9】
前記第１の抗体部分とＣＬＤＮ６の結合が、前記第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、請求項０～８のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項10】
前記第２の抗体部分が、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する、請求項９に記載の多重特異性構築物。
【請求項11】
前記第２の抗体部分が、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択される、請求項０～１０のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項12】
前記第２の抗体部分が、ｓｄＡｂである、請求項１１に記載の多重特異性構築物。
【請求項13】
前記ｓｄＡｂが、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む、請求項１２に記載の多重特異性構築物。
【請求項14】
前記ｓｄＡｂが、（１）配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、
（２）配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及び
（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３
を含む、請求項１２に記載の多重特異性構築物。
【請求項15】
前記第２の抗体部分が、配列番号２７のアミノ酸配列または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項０～１４のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項16】
前記多重特異性構築物が、二重特異性抗体または二重特異性結合断片である、請求項０～１５のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項17】
（１）前記第１の抗体部分が、（ａ）配列番号７に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号８に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含み、
（２）前記第２の抗体部分が、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ ＣＤＲ３を含む、
請求項０～５及び９～１６のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項18】
請求項０～１７のいずれか１項に記載の多重特異性構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項19】
請求項０～１７のいずれか１項に記載の多重特異性構築物をコードする、核酸。
【請求項20】
請求項１９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項21】
請求項１９に記載の核酸、または請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項22】
疾患または状態を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の請求項０～１７のいずれか１項に記載の多重特異性構築物、または請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項23】
前記疾患または状態が、がんである、請求項２２記載の方法。
【請求項24】
疾患または状態を治療することを、それを必要とする対象において行うための医薬品の調製における、請求項０～１７のいずれか１項に記載の多重特異性構築物の使用。
【請求項25】
（１）腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、（２）４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、前記第１の抗体部分と前記腫瘍抗原との結合は、前記第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物。
【請求項26】
前記第２の抗体部分による前記４－１ＢＢの活性化が、前記第１の抗体部分と前記腫瘍抗原との結合後、少なくとも１０倍増強される、請求項０に記載の多重特異性構築物。
【請求項27】
前記第２の抗体部分が、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する、請求項０または０に記載の多重特異性構築物。
【請求項28】
前記第２の抗体部分が、ｓｄＡｂである、請求項０～０のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項29】
前記ｓｄＡｂが、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む、請求項０に記載の多重特異性構築物。
【請求項30】
前記ｓｄＡｂが、（１）配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、
（２）配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及び
（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３
を含む、請求項０に記載の多重特異性構築物。
【請求項31】
前記腫瘍抗原が、ＣＬＤＮ６である、請求項０～０のいずれか１項に記載の多重特異性構築物。
【請求項32】
２つの重鎖構成要素及び２つの軽鎖構成要素を含む多重特異性構築物であって、（ａ）各重鎖構成要素は、配列番号２８に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号２９に記載される配列を含むか、
（ｂ）各重鎖構成要素は、配列番号３０に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３１に記載される配列を含むか、
（ｃ）各重鎖構成要素は、配列番号３２に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３３に記載される配列を含むか、
（ｄ）各重鎖構成要素は、配列番号３４に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３５に記載される配列を含むか、
（ｅ）各重鎖構成要素は、配列番号３６に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３７に記載される配列を含むか、または
（ｆ）各重鎖構成要素は、配列番号３８に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３９に記載される配列を含む、前記多重特異性構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２２／０７０８７０号の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２２年１月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２２／０７０８７０号の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
本出願は、多重特異性分子、例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体、及び疾患または状態を治療することを含むその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
クローディンは、密着した細胞結合の重要な構成要素を形成するタンパク質のファミリーである。クローディン－６（ＣＬＤＮ６）は、タイトジャンクションの形成に関与する４回膜貫通型タンパク質である。成人のヒト正常組織では、ＣＬＤＮ６ ｍＲＮＡ及びタンパク質は存在しない。一方、精巣癌、卵巣癌、子宮癌及び肺腺癌などの様々なヒト固形癌では、ＣＬＤＮ６の転写レベルが高いことが頻繁に検出されている。ｍＲＮＡレベルと同様に、これらのヒトがんでは、ＣＬＤＮ６タンパク質が高く、均一であることが報告されている。
【0004】
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子スーパーファミリー９）は、ＴＮＦ－受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化後に発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは、様々な免疫細胞の活性を調節する重要な役割を果たしている。４－１ＢＢアゴニストは、免疫細胞増殖、生存、サイトカインの分泌及び細胞溶解活性ＣＤ８ Ｔ細胞を増強する。多くの他の研究でも、４－１ＢＢの活性化が免疫応答を増強し、マウスの腫瘍を除去することが示されている。したがって、４－１ＢＢは、がん免疫学における有望な標的分子であることが示唆された。
【0005】
本明細書で言及される刊行物、特許、特許出願及び特許出願公開の開示は全て、その全体が参照により本明細書に援用される。
【発明の概要】
【0006】
一態様において、本明細書で提供されるのは、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する。
【0007】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分による４－１ＢＢの活性化は、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合後、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の値分増強される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物は、腫瘍抗原に結合することなく、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、腫瘍抗原に結合しなければ、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない。
【0008】
いくつかの実施形態では、ａ）クローディン－６（「ＣＬＤＮ６」）に特異的に結合する第１の抗体部分と、ｂ）４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含む、多重特異性構築物が提供される。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む、全長抗体を含む。
【0009】
本明細書で提供されるのは、（１）クローディン－６（「ＣＬＤＮ６」）に特異的に結合する第１の抗体部分と、（２）４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含む、多重特異性構築物である。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、（１）配列番号７に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（２）配列番号８に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（ａ）ＶＨは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、（ｂ）ＶＬは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（１）ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７に対して少なくとも約８０％の配列同一性を含むそのバリアントを含み、及び／または（２）ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、（１）配列番号１８に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（２）配列番号１９に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（１）ＶＨは、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、（２）ＶＬは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、（１）ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／または（２）ＶＬは、配列番号１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１９に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体部分とＣＬＤＮ６の結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する。
【0011】
いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、（１）配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１；（２）配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２；及び（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、多重特異性構築物は、二重特異性抗体または二重特異性結合断片である。いくつかの実施形態では、（１）第１の抗体部分は、（ａ）配列番号７に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（ｂ）配列番号８に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含み、（２）第２の抗体部分は、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ ＣＤＲ３を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が提供される。
【0014】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、かかる核酸を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、かかる核酸またはかかるベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0015】
また、本明細書で提供されるのは、疾患または状態を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載される多重特異性構築物または本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法である。また、本明細書で提供されるのは、疾患または状態を治療することを、それを必要とする対象において行うための医薬品の調製における、本明細書に記載される多重特異性構築物の使用である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、がんである。
【0016】
いくつかの実施形態では、（１）腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、（２）４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物が提供される。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分による４－１ＢＢの活性化は、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合後、少なくとも１０倍増強される。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、（１）配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１；（２）配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２；及び（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＬＤＮ６である。
【0017】
また、本明細書で提供されるのは、２つの重鎖構成要素及び２つの軽鎖構成要素を含む多重特異性構築物であって、ここで、（ａ）各重鎖構成要素は、配列番号２８及び／または配列番号４４に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号２９に記載される配列を含むか、（ｂ）各重鎖構成要素は、配列番号３０に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３１に記載される配列を含むか、（ｃ）各重鎖構成要素は、配列番号３２に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３３に記載される配列を含むか、（ｄ）各重鎖構成要素は、配列番号３４に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３５に記載される配列を含むか、（ｅ）各重鎖構成要素は、配列番号３６に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３７に記載される配列を含むか、または（ｆ）各重鎖構成要素は、配列番号３８に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３９に記載される配列を含む、多重特異性構築物である。
【0018】
本出願は、本明細書に記載される多重特異性構築物及び／または本明細書に記載される医薬と、疾患または状態（例えば、がん）を治療するために多重特異性構築物（または医薬組成物）を使用するための添付文書または説明書とを含むキットを提供する。
【0019】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者には明らかになるであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）とＣＬＤＮ６との結合親和性を示す。
【図1B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）とＣＬＤＮ６との結合親和性を示す。
【0021】
【図2A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂとＣＬＤＮ６発現細胞との結合親和性を示す。
【図2B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂとＣＬＤＮ６発現細胞との結合親和性を示す。
【図2C】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂとＣＬＤＮ６発現細胞との結合親和性を示す。
【0022】
【図3A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと４－１ＢＢとの結合親和性を示す。
【図3B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと４－１ＢＢとの結合親和性を示す。
【図3C】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと４－１ＢＢとの結合親和性を示す。
【図3D】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと４－１ＢＢとの結合親和性を示す。
【0023】
【図4A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと可溶性４－１ＢＢ及び４－１ＢＢ発現細胞との結合を示す。
【図4B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと可溶性４－１ＢＢ及び４－１ＢＢ発現細胞との結合を示す。
【0024】
【図5A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂのＣＬＤＮ６依存性４－１ＢＢ活性化を示す。
【図5B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂのＣＬＤＮ６依存性４－１ＢＢ活性化を示す。
【図5C】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂのＣＬＤＮ６依存性４－１ＢＢ活性化を示す。
【図5D】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂのＣＬＤＮ６依存性４－１ＢＢ活性化を示す。
【0025】
【図6A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6C】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6D】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6E】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6F】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6G】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図6H】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるＰＢＭＣの活性化を示す。
【0026】
【図7A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂで処置した後のＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍担持ｈｕ４－１ＢＢマウスにおける腫瘍阻害を示す。
【図7B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂで処置した後のＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍担持ｈｕ４－１ＢＢマウスにおける腫瘍阻害を示す。
【0027】
【0028】
【図9A】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂで処置した後のＭＣ３８マウス結腸腺癌腫瘍担持ｈｕ４－１ＢＢマウスにおける腫瘍阻害を示す。
【図9B】本明細書で開示されるＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂで処置した後のＭＣ３８マウス結腸腺癌腫瘍担持ｈｕ４－１ＢＢマウスにおける腫瘍阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
定義
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体及びその抗原結合断片を含む様々な抗体構造を包含する。「抗体部分」という用語は、全長抗体またはその抗原結合断片を指す。
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体及びその抗原結合断片を含む様々な抗体構造を包含する。「抗体部分」という用語は、全長抗体またはその抗原結合断片を指す。
【0030】
全長抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称され得る。両鎖における可変領域は通常、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変のループを含有する（ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）。本明細書に開示される抗体及び抗原結合断片についてのＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの規則によって定義または同定され得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ １９９７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８５；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９；Ｋａｂａｔ １９８７；Ｋａｂａｔ １９９１）。重鎖または軽鎖の３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接する区間の間に介在し、ＣＤＲよりも高度に保存され、超可変ループを支持する足場を形成する。重鎖及び軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμ重鎖の存在によって特徴付けられるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭである。主要な抗体クラスのいくつかは、ｌｇＧ１（γ１重鎖）、ｌｇＧ２（γ２重鎖）、ｌｇＧ３（γ３重鎖）、ｌｇＧ４（γ４重鎖）、ｌｇＡ１（α１重鎖）、またはｌｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。
【0031】
本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ化単一ドメイン抗体）、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を含む、抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体または親抗体断片（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合するものと同じ抗原に結合することが可能である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、１つ以上の異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域にグラフトされた、特定のヒト抗体に由来する１つ以上のＣＤＲを含み得る。
【0032】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、一本のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む、抗体断片である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とする。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
【0033】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見られる非連続的抗原結合部位を意味することが意図されている。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（１９９７）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５－７７（２００３）；及びＨｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７－６７０（２００１）によって記載されており、定義には、互いに対して比較された場合にアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。しかしながら、抗体もしくはグラフト抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すいずれの定義の適用も、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であることが意図される。上に引用される参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を比較として以下の表１に記載する。例えば、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）；Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３８：Ｄ３０１－Ｄ３０７（２０１０）；及びＡｄｏｌｆ－Ｂｒｙｆｏｇｌｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４３：Ｄ４３２－Ｄ４３８（２０１５）を含む、ＣＤＲ予測アルゴリズム及びインターフェースが当該技術分野で知られている。本段落において引用される参考文献の内容は、本出願における使用及び本明細書における１つ以上の請求項における可能な包含のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
【表1】
【0034】
「Ｋａｂａｔに従う可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔに従うアミノ酸位置番号付け」という表現及びそれらの変形は、前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．における抗体の編成の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。このナンバリングシステムを使用する場合、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくは超可変領域（ＨＶＲ）の短縮、またはＦＲもしくはＨＶＲへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有することがある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従うと残基５２ａ）を含み得、また重鎖ＦＲ残基８２の後に複数の挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従うと残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。所与の抗体に対する残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによって番号付けされた配列との相同領域でのアラインメントによって決定され得る。
【0035】
本明細書中で別段の指示がない限り、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従うＥＵインデックスの番号付けに軽微な修正を加えたものである。簡潔に述べると、重鎖ＣＤＲ１の前の超可変ループに５残基をさらに追加した。「Ｋａｂａｔに従うＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【0036】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【0037】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）に由来する残基が、所望の抗体特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意選択により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
【0038】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製する技術のうちの任意のものを用いて作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーが含まれる当該技術分野において公知の様々な技術を使用して生成され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。ヒトモノクローナル抗体の作製には、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載されている方法も利用可能である。また、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答してかかる抗体を産生するよう改変されているが、その内因性遺伝子座は無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することによって、調製することができる（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生されるヒト抗体については、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）を参照されたい。
【0039】
本明細書で同定されるポリペプチド及び抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」または「相同性」は、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮して配列を整列させた後、比較されるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アライメントを評価するのに適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的上、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータープログラムＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７，２００４；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５（１）：１１３，２００４）を使用して生成される。
【0040】
「相同」とは、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。比較された２つの配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、分子は、その位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列により共有されるマッチング位置または相同位置の数を、比較した位置の数で割り、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個がマッチまたは相同である場合、２つの配列は、６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％相同である。一般に、比較は、２つの配列が最大相同性を与えるように整列されたときになされる。
【0041】
「定常ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの他の部分である、抗原結合部位を含有する可変ドメインと比べて、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（総称して、ＣＨ）ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含有する。
【0042】
任意の哺乳動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。
【0043】
「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも称される）は、通常、約アミノ酸１１８～約アミノ酸２１５（ＥＵ番号付けシステム）に及ぶ。
【0044】
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６～Ｐｒｏ２３０に対応するＩｇＧの領域として定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ－Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列し得る。
【0045】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃ２」ドメインとも称される）は、通常、約アミノ酸２３１～約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと緊密に対合しないという点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖は、インタクト天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。炭水化物は、ドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５）。
【0046】
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ３」ドメインとも称される）は、Ｆｃ領域のＣ末端残基からＣＨ２ドメインまでのストレッチを含む（すなわち、抗体配列の約アミノ酸残基３４１からＣ末端、典型的に、ＩｇＧのアミノ酸残基４４６または４４７まで）。
【0047】
本明細書における「Ｆｃ領域」または「断片結晶性領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用され、天然配列のＦｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、アミノ酸残基の位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶものと定義される。Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（ＥＵ番号付けシステムに従って残基４４７）は、例えば、抗体の生成もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を遺伝子組み換え操作することによって除去され得る。したがって、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。本明細書に記載される抗体における使用に好適な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。
【0048】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体（これらの受容体のアレルバリアント及び選択的スプライシング形態を含む）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）参照。） ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に概説されている。今後同定されるものを含め、他のＦｃＲも本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。
【0049】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体または抗体部分が結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２つの抗体または抗体部分は、抗原に対して競合的な結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合し得る。
【0050】
本明細書で使用される場合、第１の抗体またはその断片が第２の抗体またはその断片の標的抗原結合を等モル濃度の第１の抗体またはその断片の存在下で少なくとも約５０％（少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のいずれか１つなど）阻害する場合、第１の抗体またはその断片は、標的抗原への第２の抗体またはその断片の結合について「競合する」。その逆もまた同様である。相互競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／４８７３１号に記載されている。
【0051】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、及び「～に対して特異的」という用語は、標的と抗体または抗体部分との間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指し、生体分子を含む分子の異種集団の存在下で標的の存在を決定するものである。例えば、標的（エピトープであり得る）を特異的に認識する抗体または抗体部分は、他の標的への結合よりも大きな親和性、アビディティで、より容易に、及び／またはより長い持続時間で、この標的に結合する抗体または抗体部分である。いくつかの実施形態では、無関係な標的に対する抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合、標的への抗体の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、≦１０－５Ｍ、≦１０－６Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、≦１０－１０Ｍ、≦１０－１１Ｍ、または≦１０－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種に由来するタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、必須ではない。抗体または抗原結合ドメイン結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）試験及びペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されない。
【0052】
「単離された」抗体（または構築物）は、その産生環境の構成成分から特定され、分離され、及び／または回収されたものである（例えば、天然または組み換え）。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その産生環境に由来する他の全ての成分との会合を含まない。
【0053】
本明細書に記載される構築物、抗体、またはその抗原結合断片をコードする「単離された」核酸分子は、それが産生された環境において通常付随する少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に付随する全ての成分との会合を含まない。本明細書に記載されるポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、それが自然界に見出される形態または状況とは異なる形態で存在する。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書に記載されるポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0054】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性に置かれているとき、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、その配列に作動可能に連結しており、あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接していること、分泌リーダーの場合、隣接しており、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションにより行われる。そのような部位が存在していない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣例に従って使用される。
【0055】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子に連結される別の核酸を増殖させることが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を誘導できる。そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。
【0056】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸によってトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【0057】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、区別なく使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫（継代の数に関わらず）が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一であるとは限らず、変異を含み得る。元の形質転換細胞でスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫は、本明細書に含まれる。
【0058】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本出願の目的上、有益なまたは望ましい臨床結果には、次のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する１つ以上の症状を軽減すること、疾患の程度を低減すること、疾患を安定化すること（例えば、疾患の悪化を防止または遅延させること）、疾患の広がり（例えば、転移）を防止もしくは遅延させること、疾患の再発を予防または遅延させること、疾患の進行を遅延または緩徐させること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解（部分的または全体的）を提供すること、疾患の治療に必要な１つ以上の他の医薬の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を向上もしくは改善させること、体重増加を増大させること、及び／または生存期間を延長させること。また、「治療」には、がんの病理学的結果（例えば、腫瘍体積など）の低減も包含される。本出願の方法は、これらの治療の態様のうちのいずれか１つ以上を企図する。
【0059】
がんの文脈において、「治療すること」という用語は、がん細胞の成長を阻害すること、がん細胞の複製を阻害すること、全体腫瘍組織量を減らすこと、及び疾患に関連する１つ以上の症状を改善することのいずれかまたは全てを含む。
【0060】
「阻害」または「阻害する」という用語は、任意の表現型特徴の減少もしくは消失、またはその特徴の発生、程度、もしくは可能性の減少もしくは消失を指す。「低減する」または「阻害する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／または量を減少させること、低下させること、または阻止することである。ある特定の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少をもたらす能力を意味する。別の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少をもたらす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少をもたらす能力を意味する。
【0061】
「アゴナイズすること」または「アゴナイズ」という用語は、任意の表現型特徴、またはその特徴の発生、程度もしくは可能性の増加または増強を指す。「増加する」または「増強する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／または量を減少させること、低下させること、または阻止することである。ある特定の実施形態では、「増加する」または「増強する」とは、例えば、少なくとも約１倍以上の活性、機能、及び／または量の全体的な増加をもたらす能力を意味する。別の実施形態では、「増加する」または「増強する」とは、例えば、参照と比較して少なくとも約５倍以上の活性、機能、及び／または量の全体的な増加をもたらす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「増加する」または「増強する」とは、例えば、参照と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）、または参照と比較して約１００倍を超える活性、機能、及び／または量の全体的な増加をもたらす能力を意味する。
【0062】
本明細書で使用される「参照」は、比較目的のために使用される任意の試料、標準、またはレベルを指す。参照は、健常試料及び／または非疾患試料から得ることができる。いくつかの例において、参照は、未治療の試料から得ることができる。いくつかの例において、参照は、個体の非疾患試料または未治療試料から得られる。いくつかの例において、参照は、個体または患者ではない１以上の健康な個体から得られる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「疾患の発生を遅延する」とは、疾患（がんなど）の発生を先延ばしにする、阻止する、減速させる、遅らせる、安定化させる、抑制する、及び／または延期させることを意味する。この遅延は、病歴及び／または治療される個体に応じて、様々な時間の長さになり得る。当業者に明らかであるように、十分なまたは著しい遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で予防を包含し得る。例えば、転移の発生などの末期がんを遅延させることができる。
【0064】
本明細書で使用される「予防すること」は、疾患の素因を有し得るが、まだ疾患と診断されていない個体における疾患の発症または再発に関して予防を提供することを含む。
【0065】
本明細書で使用される場合、機能または活性を「抑制する」とは、目的の条件もしくはパラメーター以外は同じである条件と比較した場合、あるいは、別の条件と比較した場合に、機能または活性が減少することである。例えば、腫瘍成長を抑制する抗体は、抗体がない場合の腫瘍の成長速度と比較して、腫瘍の成長速度を低減させる。
【0066】
本明細書で使用される場合、「基づく」には、本明細書に記載される個体の特徴を評価、決定、または測定すること（及び好ましくは治療を受けるのに好適な個体を選択すること）が含まれる。クローディン－１８異常の状態が本明細書に記載される治療の選択、評価、測定、または決定する方法の「基礎として使用される」場合、治療前及び／または治療中に決定されたＣＬＤＮ６異常、ならびに得られた状態（ＣＬＤＮ６の存在、不在、発現レベル、活性レベル及び／またはリン酸化レベルを含む）は、次のいずれかを評価する際に臨床医によって使用される：（ａ）個体が最初に治療（複数可）を受けるのに適する可能性が高いもしくは見込みがあること；（ｂ）個体が最初に治療（複数可）を受けるのに適しない可能性が高いもしくは見込みがあること；（ｃ）治療に対する応答性；（ｄ）個体が継続して治療（複数可）を受けるのに適する可能性が高いもしくは見込みがあること；（ｅ）個体が継続して治療（複数可）を受けるのに適しない可能性が高いもしくは見込みがあること；（ｆ）投与量の調節；または（ｇ）臨床上の利益の可能性を予測すること。
【0067】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において、限定するものではないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類、または霊長類を含む哺乳動物を指すために、区別なく使用される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【0068】
本明細書に記載される本出願の実施形態は、実施形態から「なること」及び／または「本質的になること」を含むことが理解される。
【0069】
本明細書における「約」という値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に対する変形を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【0070】
本明細書で使用される場合、ある値またはパラメーター「ではない」ことへの言及は、一般にある値またはパラメーター「以外」を意味し、かつ記載する。例えば、方法がＸタイプのがんを処置するために使用されないとは、方法がＸ以外のタイプのがんを処置するために使用されることを意味する。
【0071】
本明細書で使用される「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。
【0072】
本明細書及び添付される特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ｏｒ」及び「ｔｈｅ」は、別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。
【0073】
抗体結合親和性
本明細書に記載される多重特異性構築物の抗体部分の結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）試験及びペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される多重特異性構築物の抗体部分の結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）試験及びペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
いくつかの実施形態では、結合親和性は、解離定数ＫＤによって測定される。解離定数は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏによるＯｃｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ参照）、メソスケールディスカバーアッセイ（例えば、ＭＳＤ－ＳＥＴ参照）、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）、ストップトフロー分析、及び比色もしくは蛍光タンパク質融解分析；または細胞結合アッセイなどの生化学的または生物物理学的技術を含む、当該技術分野で公知の任意の分析技術によって決定することができる。
【0075】
いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫＤは、約１０－７Ｍ～約１０－１２Ｍ、約１０－７Ｍ～約１０－８Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－９Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１０Ｍ、約１０－１０Ｍ～約１０－１１Ｍ、約１０－１１Ｍ～約１０－１２Ｍ、約１０－７Ｍ～約１０－１２Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－１２Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１２Ｍ、約１０－１０Ｍ～約１０－１２Ｍ、約１０－７Ｍ～約１０－１１Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－１１Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１１Ｍ、約１０－７Ｍ～約１０－１０Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－１０Ｍ、または約１０－７Ｍ～約１０－９Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫＤは、約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍのいずれか１つよりも強い。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）は、ヒト抗原である。
【0076】
いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫｏｎは、約１０３Ｍ－１ｓ－１～約１０８Ｍ－１ｓ－１、約１０３Ｍ－１ｓ－１～約１０４Ｍ－１ｓ－１、約１０４Ｍ－１ｓ－１～約１０５Ｍ－１ｓ－１、約１０５Ｍ－１ｓ－１～約１０６Ｍ－１ｓ－１、約１０６Ｍ－１ｓ－１～約１０７Ｍ－１ｓ－１、または約１０７Ｍ－１ｓ－１～約１０８Ｍ－１ｓ－１である。いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫｏｎは、約１０３Ｍ－１ｓ－１～約１０５Ｍ－１ｓ－１、約１０４Ｍ－１ｓ－１～約１０６Ｍ－１ｓ－１、約１０５Ｍ－１ｓ－１～約１０７Ｍ－１ｓ－１、約１０６Ｍ－１ｓ－１～約１０８Ｍ－１ｓ－１、約１０４Ｍ－１ｓ－１～約１０７Ｍ－１ｓ－１、または約１０５Ｍ－１ｓ－１～約１０８Ｍ－１ｓ－１である。いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫｏｎは、約１０３Ｍ－１ｓ－１、１０４Ｍ－１ｓ－１、１０５Ｍ－１ｓ－１、１０６Ｍ－１ｓ－１、１０７Ｍ－１ｓ－１または１０８Ｍ－１ｓ－１のいずれか１つ以下である。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）は、ヒト抗原である。
【0077】
いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫｏｆｆは、約１ｓ－１～約１０－６ｓ－１、約１ｓ－１～約１０－２ｓ－１、約１０－２ｓ－１～約１０－３ｓ－１、約１０－３ｓ－１～約１０－４ｓ－１、約１０－４ｓ－１～約１０－５ｓ－１、約１０－５ｓ－１～約１０－６ｓ－１、約１ｓ－１～約１０－５ｓ－１、約１０－２ｓ－１～約１０－６ｓ－１、約１０－３ｓ－１～約１０－６ｓ－１、約１０－４ｓ－１～約１０－６ｓ－１、約１０－２ｓ－１～約１０－５ｓ－１、または約１０－３ｓ－１～約１０－５ｓ－１である。いくつかの実施形態では、抗体部分と標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）との間の結合のＫｏｆｆは、少なくとも約１ｓ－１、１０－２ｓ－１、１０－３ｓ－１、１０－４ｓ－１、１０－５ｓ－１または１０－６ｓ－１のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、ＣＬＤＮ６または４－１ＢＢ）は、ヒト抗原である。
【0078】
キメラまたはヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性構築物の抗体部分のうちの１つ以上は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性構築物の抗体部分のうちの１つ以上は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的に、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低減するように、非ヒト抗体がヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部分）は、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部分）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意選択により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来となる抗体）の対応する残基と置換される。
【0080】
ヒト化抗体及びヒト化抗体を作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説され、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７８，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングについて記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」について記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載）に記載されている。
【0081】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）参照）；特定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域サブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）参照）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【0082】
ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性構築物の抗体部分のうちの１つ以上は、ヒト抗体である（ヒトドメイン抗体、またはヒトＤＡｂとしても知られる）。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の種々の技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）、及びＣｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（４）：９１２－２１（２０１０）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（またはＤＡｂ）を産生することが可能なトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性構築物の抗体部分のうちの１つ以上は、ヒト抗体である（ヒトドメイン抗体、またはヒトＤＡｂとしても知られる）。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の種々の技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）、及びＣｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（４）：９１２－２１（２０１０）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（またはＤＡｂ）を産生することが可能なトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。
【0083】
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、抗原投与に応答して、インタクトヒト抗体またはヒト可変領域を含むインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、調製され得る。そのような動物は、典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座に置き換わるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに統合される、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－ＭＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載する米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術）について記載する米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成されるインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変され得る。
【0084】
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作ることもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株についても記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
【0085】
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載される。
【0086】
置換、挿入、及び欠失バリアント
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体バリアントが本明細書に記載される多重特異性構築物に含まれる。置換による変異導入の対象となる部位には、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表２の「好ましい置換」という見出しで示される。より実質的な変化は、表２において、「例示的な置換」という見出しで示され、アミノ酸側鎖クラスに関しては、以下にさらに記載される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その産物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体バリアントが本明細書に記載される多重特異性構築物に含まれる。置換による変異導入の対象となる部位には、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表２の「好ましい置換」という見出しで示される。より実質的な変化は、表２において、「例示的な置換」という見出しで示され、アミノ酸側鎖クラスに関しては、以下にさらに記載される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その産物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
【表2】
【0087】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいたグループに分類され得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の方向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0088】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
【0089】
置換型バリアントの一種は、親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）。一般に、さらなる研究のために選択される、結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比べて、ある特定の生物学的特性における変更（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有することになり、及び／または親抗体の実質的に保持されたある特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して、簡便に生成され得る。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させ、バリアント抗体をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【0090】
改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ中になされ得る。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）参照）、及び／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）になされ得、それにより得られたバリアントＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、二次ライブラリーから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異導入）のいずれかによって、成熟について選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入法またはモデリングを使用して、特異的に特定され得る。多くの場合、特に、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が対象にされる。
【0091】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗体の抗原結合能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内に生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）がＨＶＲ中になされ得る。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」またはＣＤＲの外にあってもよい。上に提供されるバリアントＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有し得る。
【0092】
変異導入の対象となり得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５によって記載されている。この方法では、標的残基のうちのある残基または群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）を特定し、これを中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置き換え、抗体と抗原の相互作用に影響があるかどうかを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置にさらなる置換が導入され得る。代替的にまたは追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造から、抗体と抗原との間の接触点を特定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として、標的にされるか、または排除され得る。バリアントは、スクリーニングにより、所望の特性を含有するかどうか決定され得る。
【0093】
アミノ酸配列の挿入には、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドを抗体のＮ末端またはＣ末端に融合することが含まれる。
【0094】
グリコシル化バリアント
いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性構築物の１つ以上の抗体部分は、構築物のグリコシル化の程度が増加または減少するように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または除去は、１つ以上のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成され得る。
いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性構築物の１つ以上の抗体部分は、構築物のグリコシル化の程度が増加または減少するように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または除去は、１つ以上のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成され得る。
【0095】
抗体部分がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に結合している炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的に、分岐した二分岐型オリゴ糖を含み、これは、一般に、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ－結合により結合している。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、ならびに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体部分中のオリゴ糖の修飾は、ある特定の特性が改善した抗体バリアントを作製するために行われ得る。
【0096】
いくつかの実施形態では、抗体部分は、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する。例えば、そのような抗体のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているようなＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定されるように、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖構造の合計（例えば、複合型、混合型及び高マンノース型構造）に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖内にあるフコースの平均量を算出することによって決定され得る。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の位置２９７付近（ＥＵナンバリングのＦｃ領域残基）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体の軽微な配列変化に起因して、位置２９７から上流または下流の約±３アミノ酸、すなわち、位置２９４～３００の間に位置する場合もある。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する公開物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質のフコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、及びアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８をノックアウトしたＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７）が挙げられる。
【0097】
いくつかの実施形態では、抗体部分は、二分されたオリゴ糖を有し、例えば、抗体のＦｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている。そのような抗体バリアントは、フコシル化の減少及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を含む抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善したＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ、Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載されている。
【0098】
Ｆｃ領域バリアント
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が抗体部分のＦｃ領域に導入され得、それにより、Ｆｃ領域バリアントが作製される。Ｆｃ領域バリアントは、アミノ酸修飾（例えば、置換）を１つ以上のアミノ酸位置に含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が抗体部分のＦｃ領域に導入され得、それにより、Ｆｃ領域バリアントが作製される。Ｆｃ領域バリアントは、アミノ酸修飾（例えば、置換）を１つ以上のアミノ酸位置に含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
【0099】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有し、抗体部分のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）は不必要または有害である用途に対して、望ましい候補となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣ活性及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁表２に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例としては、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が採用され得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）参照。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的にまたは追加的に、目的分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルで評価され得る。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それにより、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で公知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）参照）。
【0100】
エフェクター機能が低減した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上に置換を含む抗体が含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（ここで、アミノ酸番号付けは、ＥＵインデックスに従う）。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）を参照されたい。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を含むＦｃ変異体（ここで、アミノ酸番号付けは、ＥＵインデックスに従う）が含まれ、残基２６５及び２９７をアラニンに置換したいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体も含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）（ここで、アミノ酸番号付けは、ＥＵインデックスに従う）。
【0101】
ＦｃＲへの結合が改善または低減された特定の抗体バリアントについても記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）参照）。
【0102】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１Ｆｃ断片である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異及び／またはＬ２３５Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及び／またはＬ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。
【0103】
いくつかの実施形態では、抗体部分は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４（残基はＥＵナンバリング）における置換を含むＦｃ領域を含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に変更（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす改変がＦｃ領域になされる。
【0105】
いくつかの実施形態では、抗体部分バリアントは、半減期を改変し、及び／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を変更するアミノ酸置換を１つ以上含むバリアントＦｃ領域を含む。半減期が長く、母胎ＩｇＧの胎児への輸送を担う胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））については、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．））に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改変する置換を１つ以上含むＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を含むものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【0106】
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【0107】
システイン操作された抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書の多重特異性構築物の１つ以上の抗体部分の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された、システイン操作された抗体部分、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製するのが望ましい場合がある。具体的な実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置されるので、本明細書でさらに記載されるように、これを使用して、抗体を薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作製することができる。いくつかの実施形態では、次の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換され得る：重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体部分は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書の多重特異性構築物の１つ以上の抗体部分の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された、システイン操作された抗体部分、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製するのが望ましい場合がある。具体的な実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置されるので、本明細書でさらに記載されるように、これを使用して、抗体を薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作製することができる。いくつかの実施形態では、次の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換され得る：重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体部分は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製することができる。
【0108】
抗ＣＬＤＮ６抗体部分
本出願に記載される多重特異性構築物の抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、クローディン－６（「ＣＬＤＮ６」）に特異的に結合する任意の抗体部分を含む。
本出願に記載される多重特異性構築物の抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、クローディン－６（「ＣＬＤＮ６」）に特異的に結合する任意の抗体部分を含む。
【0109】
クローディン６（ＣＬＤＮ６）
クローディンは、上皮及び内皮に発現し、タイトジャンクションの透過性を決定する傍細胞障壁及び孔を形成する、タイトジャンクション膜タンパク質のファミリーである。クローディンは、がんの発生、進行、及び転移における重要な制御因子として認識されており、組織依存的な発現パターンの違いにより、様々ながんにおいて明確に異なる役割を果たしている（Ｔａｂａｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．“Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｌａｕｄｉｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．” Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３６，１１７６－１１９０）。クローディン－６（ＣＬＤＮ６）は、クローディンファミリーのメンバーであり、上皮または内皮細胞シートにおける細胞間接着に重要な役割を果たすタイトジャンクション分子として機能する。ＣＬＤＮ６は、４回膜貫通型タンパク質をコードし、サイズは２２０アミノ酸であり、分子量は２３，２９２Ｄａである。ＣＬＤＮ６は、核受容体スーパーファミリーの分子を標的とし、その遺伝子発現を管理することにより、核受容体活性の制御に関与する細胞接着シグナル伝達の起源であることが同定されている（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）．“Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１６，２４６００－２４６０９）。ＣＬＤＮ６は、２０種類のヒトがんで有意に上方制御されていると思われる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９：７２６６５６）。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６は、ヒトＣＬＤＮ６（「ｈＣＬＤＮ６」）である。いくつかの実施形態では、ｈＣＬＤＮ６は、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列またはそのバリアント（例えば、翻訳後修飾バリアント及び／またはコンフォメーションバリアント）を含む。
クローディンは、上皮及び内皮に発現し、タイトジャンクションの透過性を決定する傍細胞障壁及び孔を形成する、タイトジャンクション膜タンパク質のファミリーである。クローディンは、がんの発生、進行、及び転移における重要な制御因子として認識されており、組織依存的な発現パターンの違いにより、様々ながんにおいて明確に異なる役割を果たしている（Ｔａｂａｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．“Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｌａｕｄｉｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．” Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３６，１１７６－１１９０）。クローディン－６（ＣＬＤＮ６）は、クローディンファミリーのメンバーであり、上皮または内皮細胞シートにおける細胞間接着に重要な役割を果たすタイトジャンクション分子として機能する。ＣＬＤＮ６は、４回膜貫通型タンパク質をコードし、サイズは２２０アミノ酸であり、分子量は２３，２９２Ｄａである。ＣＬＤＮ６は、核受容体スーパーファミリーの分子を標的とし、その遺伝子発現を管理することにより、核受容体活性の制御に関与する細胞接着シグナル伝達の起源であることが同定されている（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）．“Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１６，２４６００－２４６０９）。ＣＬＤＮ６は、２０種類のヒトがんで有意に上方制御されていると思われる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９：７２６６５６）。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６は、ヒトＣＬＤＮ６（「ｈＣＬＤＮ６」）である。いくつかの実施形態では、ｈＣＬＤＮ６は、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列またはそのバリアント（例えば、翻訳後修飾バリアント及び／またはコンフォメーションバリアント）を含む。
【0110】
例示的な抗ＣＬＤＮ６抗体部分
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ＣＬＤＮ６への結合について、ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ａ）ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ｂ）ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む抗体部分と、競合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ＣＬＤＮ６への結合について、ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ａ）ＶＨは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ｂ）ＶＬは、ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む抗体部分と、競合する。
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ＣＬＤＮ６への結合について、ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ａ）ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ｂ）ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む抗体部分と、競合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ＣＬＤＮ６への結合について、ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ａ）ＶＨは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ｂ）ＶＬは、ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む抗体部分と、競合する。
【0111】
本出願に記載される抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する任意の抗体部分を含む。いくつかの実施形態では、本出願の抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ａ）配列番号７に記載される配列、または配列番号７に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、ｂ）配列番号８に記載される配列、または配列番号８に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号７に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、配列番号８に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0112】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、ａ）配列番号１８に記載される配列、または配列番号１８に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、ｂ）配列番号１９に記載される配列、または配列番号１９に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号１８に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、配列番号１９に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0113】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ａ）ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、またはＨＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、またはＨＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、及びｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含み、ｂ）ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、またはＬＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、またはＬＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、及びｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ａ）ＶＨは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、またはＨＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、またはＨＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、及びｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含み、ｂ）ＶＬは、ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、またはＬＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、またはＬＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、及びｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／またはＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号７に記載される配列を含むＶＨと、配列番号８に記載される配列を含むＶＬとを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0116】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／またはＶＬは、配列番号１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１９に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号１８に記載される配列を含むＶＨと、配列番号１９に記載される配列を含むＶＬとを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0117】
本出願の抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、当該技術分野で公知の任意の好適なフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択され得る。
【0118】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む、全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、全長抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにその組み合わせ及びハイブリッドに由来するＦｃ断片からなる群から選択されるＦｃ断片を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにその組み合わせ及びハイブリッドに由来するＦｃ断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。
【0119】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、野生型Ｆｃと比較して低減したＦｃγＲ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、またはＬ２３５Ｅからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、及び／またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａからなる群から選択される１つ以上の置換を含むＩｇＧ１断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ａを含むＩｇＧ１断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、及び／またはＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含むＩｇＧ４断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ａを含むＩｇＧ４断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号４２に記載されるアミノ配列を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む、全長抗体を含み、ここで、重鎖は、配列番号９もしくは配列番号４２のアミノ酸配列、もしくは配列番号９もしくは配列番号４２に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／または軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列もしくは配列番号１１に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号９及び／または配列番号４２をそれぞれ含む２本の重鎖と、配列番号１１をそれぞれ含む２本の軽鎖とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0121】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む、全長抗体を含み、ここで、重鎖は、配列番号１０もしくは配列番号４３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０もしくは配列番号４３に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／または軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列もしくは配列番号１１に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％ ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれか１つを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号１０及び／または配列番号４３をそれぞれ含む２本の重鎖と、配列番号１１をそれぞれ含む２本の軽鎖とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0122】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む、全長抗体を含み、ここで、重鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列、もしくは配列番号２０に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかを含む）の配列同一性を含むそのバリアントを含み；及び／または軽鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかを含む）の配列同一性を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号２０をそれぞれ含む２本の重鎖と、配列番号２２をそれぞれ含む２本の軽鎖とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0123】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む、全長抗体を含み、ここで、重鎖は、配列番号２１のアミノ酸配列、もしくは配列番号２１に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み；及び／または軽鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号２１をそれぞれ含む２本の重鎖と、配列番号２２をそれぞれ含む２本の軽鎖とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0124】
抗４－１ＢＢ抗体部分
本出願に記載される多重特異性構築物の抗４－１ＢＢ抗体部分は、４－１ＢＢに特異的に結合する任意の抗体部分を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢ（「ｈ４－１ＢＢ」）である。ｈ４－１ＢＢは、４つの細胞外システインリッチドメイン（「ＣＲＤ」、すなわち、ＣＲＤ１、ＣＤＲ２、ＣＲＤ３、及びＣＲＤ４）に続いて短い膜貫通ドメイン及びＣ末端細胞質領域を含むＩ型膜貫通受容体である。ｈ４－１ＢＢのＣＲＤ２及びＣＲＤ３は、リガンド４－１ＢＢＬと相互作用する（Ｂｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２９３（２６）：９９５８－９９６９。他のＴＮＦＲと対照的に、ｈ４－１ＢＢは、ジスルフィド連結二量体として存在し、二量体化は、ｈ４－１ＢＢのＣＲＤ４内にある対合していないシステイン（Ｃｙｓ１２１）を介して生じると考えられる。いくつかの実施形態では、ｈ４－１ＢＢは、配列番号４１に記載される配列またはそのバリアント（例えば、翻訳後修飾バリアント及び／またはコンフォメーションバリアント）を含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／ＣＲＤ４領域に結合する。
本出願に記載される多重特異性構築物の抗４－１ＢＢ抗体部分は、４－１ＢＢに特異的に結合する任意の抗体部分を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢ（「ｈ４－１ＢＢ」）である。ｈ４－１ＢＢは、４つの細胞外システインリッチドメイン（「ＣＲＤ」、すなわち、ＣＲＤ１、ＣＤＲ２、ＣＲＤ３、及びＣＲＤ４）に続いて短い膜貫通ドメイン及びＣ末端細胞質領域を含むＩ型膜貫通受容体である。ｈ４－１ＢＢのＣＲＤ２及びＣＲＤ３は、リガンド４－１ＢＢＬと相互作用する（Ｂｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２９３（２６）：９９５８－９９６９。他のＴＮＦＲと対照的に、ｈ４－１ＢＢは、ジスルフィド連結二量体として存在し、二量体化は、ｈ４－１ＢＢのＣＲＤ４内にある対合していないシステイン（Ｃｙｓ１２１）を介して生じると考えられる。いくつかの実施形態では、ｈ４－１ＢＢは、配列番号４１に記載される配列またはそのバリアント（例えば、翻訳後修飾バリアント及び／またはコンフォメーションバリアント）を含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／ＣＲＤ４領域に結合する。
【0125】
抗４－１ＢＢ抗体部分は、当該技術分野で公知の任意の好適なフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、４－１ＢＢに結合する単一ドメイン抗体を含む。
【0126】
例示的な抗４－１ＢＢ抗体部分
いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２７に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを有する単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、そのような抗４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に対する親和性は、配列番号２７を含む抗４－１ＢＢ抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２７に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを有する単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、そのような抗４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に対する親和性は、配列番号２７を含む抗４－１ＢＢ抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0127】
いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及びｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、そのような抗４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に対する親和性は、配列番号２７を含む抗４－１ＢＢ抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0130】
多重特異性構築物
一態様において、本明細書で提供されるのは、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する。
一態様において、本明細書で提供されるのは、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する。
【0131】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分による４－１ＢＢの活性化は、第１の抗体部分と腫瘍抗原との結合後、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の値分増強される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物は、腫瘍抗原に結合することなく、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、腫瘍抗原に結合しなければ、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない。
【0132】
本出願の多重特異性構築物のいくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。
【0134】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に記載される配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのようなｓｄＡｂの４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に対する親和性は、配列番号２７を含むｓｄＡｂの親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0135】
第１の抗体部分が特異的に結合する腫瘍抗原は、当該技術分野で公知の任意の好適な腫瘍抗原であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＬＤＮ６である。
【0136】
いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＬＤＮ６と４－１ＢＢの両方に結合する多重特異性構築物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む二重特異性抗体である。抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分は、本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。
【0137】
本出願の多重特異性構築物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、（１）配列番号７に記載される配列、または配列番号７に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（２）配列番号８に記載される配列、または配列番号８に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号７に記載されるＶＨのＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及びＣＤＲ－３と、配列番号８に記載されるＶＬのＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及びＣＤＲ－３とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0138】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、またはＨＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、またはＨＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含み、ＶＬは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、またはＬＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、またはＬＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0139】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、含み、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／またはＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号７に記載されるＶＨと、配列番号８に記載されるＶＬとを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、（１）配列番号１８に記載される配列、または配列番号１８に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（２）配列番号１９に記載される配列、または配列番号１９に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号１８に記載されるＶＨのＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及びＣＤＲ－３と、配列番号１９に記載されるＶＬのＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及びＣＤＲ－３とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨは、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、またはＨＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、またはＨＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含み、ＶＬは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、またはＬＣ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、またはＬＣ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0142】
本出願の多重特異性構築物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、含み、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含み、及び／またはＶＬは、配列番号１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１９に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９９％超のいずれかを含む）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗ＣＬＤＮ６抗体部分のＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に対する親和性は、配列番号１８に記載されるＶＨと、配列番号１９に記載されるＶＬとを含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0143】
本出願の多重特異性構築物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、含み、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、及び／またはＶＬは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含むｓｄＡｂを含む。
【0144】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、抗４－１ＢＢ抗体部分は、４－１ＢＢのＣＲＤ３／４領域に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、そのような抗４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に対する親和性は、配列番号２７を含む抗４－１ＢＢ抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0146】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ１中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；配列番号２５のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ２中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアント；及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ３、またはｓｄＡｂ－ＣＤＲ３中に最大約３つ（約１、２、３つのいずれかなど）のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性構築物は、抗ＣＬＤＮ６抗体部分及び抗４－１ＢＢ抗体部分を含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）であり、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような抗４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に対する親和性は、配列番号２７を含む抗４－１ＢＢ抗体部分の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に結合する抗体（例えば、単一ドメイン抗体）を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供され、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、（１）配列番号７に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（２）配列番号８に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含み、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に結合する抗体（例えば、単一ドメイン抗体）を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供され、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、（１）配列番号１８に記載される配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３と、（２）配列番号１９に記載される配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３とを含み、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む単一単量体可変抗体ドメイン内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むｓｄＡｂ－ＣＤＲ１、ｓｄＡｂ－ＣＤＲ２、及びｓｄＡｂ－ＣＤＲ３を含む。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に結合する抗体（例えば、単一ドメイン抗体）を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供され、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、含み、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列、もしくは配列番号７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含み、及び／またはＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列、もしくは配列番号８に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含み、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）のＣＬＤＮ６及び４－１ＢＢに対する親和性は、配列番号７に記載されるＶＨ及び配列番号８に記載されるＶＬを含む全長抗体を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、配列番号２７に記載される配列を含む単一ドメイン抗体を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含む多重特異性構築物の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0151】
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に結合する抗体（例えば、単一ドメイン抗体）を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含む多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供され、ここで、抗ＣＬＤＮ６抗体部分は、含み、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含み、及び／またはＶＬは、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含み、抗４－１ＢＢ抗体部分は、ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのような多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）のＣＬＤＮ６及び４－１ＢＢに対する親和性は、配列番号１８に記載されるＶＨ及び配列番号１９に記載されるＶＬを含む全長抗体を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、配列番号２７に記載される配列を含む単一ドメイン抗体を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含む多重特異性構築物の親和性と同等（例えば、同じ）である。
【0152】
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、抗ＣＬＤＮ６抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ６抗体）の重鎖の一方または両方のＮ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、抗ＣＬＤＮ抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ６抗体）の重鎖の一方または両方のＣ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、抗ＣＬＤＮ６抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ６抗体）の軽鎖の一方または両方のＮ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、抗４－１ＢＢ抗体部分は、抗ＣＬＤＮ６抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ６抗体）の軽鎖の一方または両方のＣ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。
【0153】
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６（例えば、ヒトＣＬＤＮ６）に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に結合する単一ドメイン抗体を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、抗ＣＬＤＮ抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ抗体）の重鎖の一方または両方のＮ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢに結合する単一ドメイン抗体を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、抗ＣＬＤＮ抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ抗体）の重鎖の一方または両方のＣ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢに結合する単一ドメイン抗体を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、抗ＣＬＤＮ６抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ６抗体）の軽鎖の一方または両方のＮ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する抗体（例えば、全長抗体）を含む抗ＣＬＤＮ６抗体部分と、４－１ＢＢに結合する単一ドメイン抗体を含む抗４－１ＢＢ抗体部分とを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、抗ＣＬＤＮ６抗体（例えば、全長抗ＣＬＤＮ６抗体）の軽鎖の一方または両方のＣ末端に融合される、多重特異性構築物（例えば、二重特異性抗体）が提供される。
【0154】
いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体部分は、リンカーを介して抗ＣＬＤＮ６抗体部分に融合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、約４～約５０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＳＧＧＳ）ｎからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、０～８である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。
【0155】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、重鎖構成要素及び軽鎖構成要素を含む多重特異性構築物であり、ここで、重鎖構成要素は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８、４４、もしくは４５のアミノ酸配列、もしくは配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８、４４もしくは４５に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含み、及び／または軽鎖は、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９のアミノ酸配列、もしくは配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の配列同一性）を有するそのバリアントを含む。
【0156】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、重鎖構成要素及び軽鎖構成要素を含む多重特異性構築物であり、ここで、重鎖構成要素は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８、４４、もしくは４５のアミノ酸配列を含み、及び／または軽鎖は、配列番号配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９のアミノ酸配列を含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、２つの重鎖構成要素及び２つの軽鎖構成要素を含む多重特異性構築物が提供され、ここで、（ａ）各重鎖構成要素は、配列番号２８及び／または４４に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号２９に記載される配列を含むか、（ｂ）各重鎖構成要素は、配列番号３０及び／または配列番号４５に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３１に記載される配列を含むか、（ｃ）各重鎖構成要素は、配列番号３２に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３３に記載される配列を含むか、（ｄ）各重鎖構成要素は、配列番号３４に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３５に記載される配列を含むか、（ｅ）各重鎖構成要素は、配列番号３６に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３７に記載される配列を含むか、または（ｆ）各重鎖構成要素は、配列番号３８に記載される配列を含み、各軽鎖構成要素は、配列番号３９に記載される配列を含む。
【0158】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する第１の抗体部分と、４－１ＢＢに特異的に結合する第２の抗体部分とを含み、ここで、第１の抗体部分とＣＬＤＮ６との結合は、第２の抗体部分が４－１ＢＢを活性化することを誘発する、多重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分による４－１ＢＢの活性化は、第１の抗体部分とＣＬＤＮ６との結合後、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍増強される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物は、ＣＬＤＮ６に結合しなければ、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＣＬＤＮ６に結合することなく、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する。
【0159】
４－１ＢＢシグナル伝達活性化は、ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）及びウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）などのアゴニスト抗体について期待される機序である。しかしながら、本開示の抗体のいくつかの抗４－１ＢＢの部分は、そのような活性を必須としていない。実際に、いくつかの実施形態では、本抗体の抗４－１ＢＢ部分は、ＣＬＤＮ６結合がない場合には、４－１ＢＢを独立して活性化することができないことが好ましい。実験例が示すように、興味深いことに、抗ＣＬＤＮ６部分が細胞上のＣＬＤＮ６タンパク質に結合した場合に、かかるＣＬＤＮ６結合は、４－１ＢＢシグナル伝達の活性化を誘発することができる。
【0160】
一般に用量制限的なオンターゲット肝毒性を伴う既知の抗４－１ＢＢアゴニスト抗体と比較して、本開示の抗体は、はるかに安全であることが企図される。健常な状態ではＣＬＤＮ６を発現していない肝臓などの組織において、本開示の抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができないため、細胞傷害性免疫応答を誘発することは予想されない。対照的に、ＣＬＤＮ６を発現する及び／またはアクセス可能である腫瘍組織では、本抗体は、腫瘍細胞に対する強力な免疫応答を開始することができる。したがって、オンターゲット毒性／固有毒性を被る現在臨床開発中の抗４－１ＢＢ抗体とは異なり、本開示の抗体は、がん治療において、強力であると同時に安全であり得る。
【0161】
核酸
本明細書に記載される多重特異性構築物または様々な抗体部分をコードする核酸分子もまた企図される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物または様々な抗体部分の１つ以上のポリペプチドをコードする核酸（または核酸のセット）が提供される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）またはそのポリペプチド部分をコードする核酸（または核酸のセット）が提供される。
本明細書に記載される多重特異性構築物または様々な抗体部分をコードする核酸分子もまた企図される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物または様々な抗体部分の１つ以上のポリペプチドをコードする核酸（または核酸のセット）が提供される。いくつかの実施形態では、多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）またはそのポリペプチド部分をコードする核酸（または核酸のセット）が提供される。
【0162】
また、本明細書では、本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）、多重特異性構築物のポリペプチド構成要素をコードする核酸（複数可）、または多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）のポリペプチド構成要素をコードする核酸を含むベクターを含む、単離された宿主細胞も企図される。
【0163】
本出願は、これらの核酸配列のバリアントも含む。例えば、バリアントは、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）または様々な抗体部分をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【0164】
本出願は、本出願の核酸が挿入されたベクターも提供する。
【0165】
核酸は、多数の種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、該核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ派生物、動物ウイルス、及びコスミドが挙げられるがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特に重要なベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
【0166】
さらに、該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号参照）。
【0167】
治療方法
個体の疾患または状態を治療する方法も本明細書において提供される。方法は、本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）を個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、臨床患者、臨床試験志願者、実験動物などである。
個体の疾患または状態を治療する方法も本明細書において提供される。方法は、本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）を個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、臨床患者、臨床試験志願者、実験動物などである。
【0168】
方法のいくつかの実施形態では、疾患または状態は、増殖性障害である。いくつかの実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍、黒色腫、腎臓癌、卵巣癌、大腸癌、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
【0169】
組成物、キット及び製品
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）、多重特異性構築物のいずれかもしくはその一部をコードする核酸、多重特異性構築物のうちの１つをコードする核酸を含むベクター、または核酸もしくはベクターを含む宿主細胞のいずれか１つを含む、組成物（製剤など）である。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）、多重特異性構築物のいずれかもしくはその一部をコードする核酸、多重特異性構築物のうちの１つをコードする核酸を含むベクター、または核酸もしくはベクターを含む宿主細胞のいずれか１つを含む、組成物（製剤など）である。
【0170】
本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）の好適な製剤は、所望の純度を有する多重特異性構築物を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって得ることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。
【0171】
本明細書に記載される多重特異性構築物（例えば、抗ＣＬＤＮ６／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体）のいずれか１つを含むキットも提供される。キットは、本明細書に記載される治療の方法のいずれかに有用であり得る。
【0172】
本出願のキットは、好適な包装がなされている。好適な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、軟包装（例えば、密封マイラーバッグまたはプラスチック袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、任意選択により、緩衝剤及び説明情報などの追加の構成要素を備えてもよい。
【0173】
したがって、本出願は、製品も提供する。製品は、容器と、容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書とを含み得る。好適な容器には、バイアル（密封バイアルなど）、ボトル、ジャー、軟包装などが含まれる。一般に、容器は、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。
【0174】
当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨内でいくつかの実施形態が可能であることを認識するであろう。本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より詳細に記載される。以下の実施例は、本発明をさらに例示説明するが、当然のことながら、その範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【0175】
以下の実施例は、当業者らに本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することが意図されず、また、以下の実験が、実施された全ての実験または唯一の実験であることを表すことも意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関しては、正確さを確保するように努めたが、多少の実験誤差及び偏差を考慮されたい。以下の実施例は、本出願の純粋な例示であることが意図されており、したがって、本出願をいかなる形でも限定するものとみなされるものではない。以下の実施例及び詳細な説明は、例示として提供されるものであり、限定するためのものではない。
【0176】
実施例１：ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体の作製
以下の表３に示される例示的なＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体を設計し、作製した。
以下の表３に示される例示的なＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体を設計し、作製した。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【0177】
実施例２．ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂの抗原結合活性
２．１ ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂとＣＬＤＮ６との結合親和性
ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（実施例１で調製）のヒトＣＬＤＮ６に対する結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、ＣＬＤＮ６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、それぞれ２．３６×１０－９Ｍ及び１．６１×１０－９ＭのＫＤで結合した。
２．１ ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂとＣＬＤＮ６との結合親和性
ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（実施例１で調製）のヒトＣＬＤＮ６に対する結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、ＣＬＤＮ６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、それぞれ２．３６×１０－９Ｍ及び１．６１×１０－９ＭのＫＤで結合した。
【0178】
ヒトＣＬＤＮ６を安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＬＤＮ６）を調製して、ＣＬＤＮ６に対するＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴの結合能力を評価した。親ＣＬＤＮ６－１抗体を対照として使用した。簡潔に述べると、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＬＤＮ６細胞を異なる濃度のＢｓＡｂとＦＡＣＳ緩衝液中４℃で３０分間インキュベートした。次いで、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ヒトＩｇＧ抗体を洗浄後に加え、細胞を４℃でさらに３０分間インキュベートした。ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって評価した。図２Ａに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは両方ともＣＬＤＮ６発現細胞に濃度依存的に結合した。
【0179】
ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０は、内因性ＣＬＤＮ６の発現があるヒト卵巣癌細胞株である。図２Ｂ及び図２Ｃに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは両方ともＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０に結合することが可能であった。全体として、抗ＣＬＤＮ６－１抗体部分を含むＢｓＡｂのヒトＣＬＤＮ６に対する結合親和性は、親ＣＬＤＮ６－１抗体のヒトＣＬＤＮ６に対する結合親和性と同等である。結合シグナルは、ＯＶＣＡＲ３細胞及びＯＶ９０細胞の表面上のＣＬＤＮ６発現レベルとよく相関した。
【0180】
２．２ ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂと４－１ＢＢとの結合親和性
ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴのヒト４－１ＢＢに対する結合親和性をＳＰＲによって測定した。図３Ａ～図３Ｄに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、それぞれ１．６４×１０－８Ｍ及び１．５７×１０－８ＭのＫＤでヒト４－１ＢＢ単量体に結合した。ＩｇＧ１ Ｆｃ断片と結合した親抗４－１ＢＢ ｓｄＡｂ抗体（４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃ）の４－１ＢＢに対する親和性を並行して測定したところ、４．３９３×１０－９ＭのＫＤを有することがわかった。これにより、ＢｓＡｂの４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢに対する親和性は、４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃの４－１ＢＢに対する親和性と同等であることが示唆された。
ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴのヒト４－１ＢＢに対する結合親和性をＳＰＲによって測定した。図３Ａ～図３Ｄに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、それぞれ１．６４×１０－８Ｍ及び１．５７×１０－８ＭのＫＤでヒト４－１ＢＢ単量体に結合した。ＩｇＧ１ Ｆｃ断片と結合した親抗４－１ＢＢ ｓｄＡｂ抗体（４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃ）の４－１ＢＢに対する親和性を並行して測定したところ、４．３９３×１０－９ＭのＫＤを有することがわかった。これにより、ＢｓＡｂの４－１ＢＢ抗体部分の４－１ＢＢに対する親和性は、４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃの４－１ＢＢに対する親和性と同等であることが示唆された。
【0181】
ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴと可溶性組み換えヒト４－１ＢＢとの結合をＥＬＩＳＡにより分析した。図４Ａに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは両方とも、それぞれ０．１２９ｎＭ及び０．０７８ｎＭのＥＣ５０で、濃度依存的に組み換えヒト４－１ＢＢに結合した。かかるＥＣ５０は、４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－ＦｃのＥＣ５０と同等であった。加えて、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴと４－１ＢＢ発現ＨＥＫ２９３細胞との結合をＦＡＣＳによって評価した。図４Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは両方とも、それぞれ０．４０６ｎＭ及び０．３４７ｎＭのＥＣ５０で、４－１ＢＢに結合することが可能であった。かかるＥＣ５０は、４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－ＦｃのＥＣ５０と同等であった。
【0182】
実施例３．ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＢｓＡｂの機能活性
３．１ 細胞株に基づくＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂの機能特性評価
ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体が４－１ＢＢシグナルを活性化する能力を試験するために、４－１ＢＢ及びＮＦκＢルシフェラーゼレポーターを安定して発現するＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株をエフェクター細胞として使用し、ＣＬＤＮ６発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１ ＣＬＤＮ６、ＯＶＣＡＲ３またはＯＶ９０）を標的細胞として使用した。ＣＬＤＮ６を発現しないＲＫＯ結腸癌細胞を陰性対照として使用した。
３．１ 細胞株に基づくＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂの機能特性評価
ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ二重特異性抗体が４－１ＢＢシグナルを活性化する能力を試験するために、４－１ＢＢ及びＮＦκＢルシフェラーゼレポーターを安定して発現するＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株をエフェクター細胞として使用し、ＣＬＤＮ６発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１ ＣＬＤＮ６、ＯＶＣＡＲ３またはＯＶ９０）を標的細胞として使用した。ＣＬＤＮ６を発現しないＲＫＯ結腸癌細胞を陰性対照として使用した。
【0183】
簡潔に述べると、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞（ウェルあたり５．０×１０４細胞の密度）を白色９６ウェルプレートで５．０×１０４個の標的細胞と混合した。抗体を連続希釈し、プレートに加えた。３７℃で６時間インキュベーションした後、発光量を測定した。図５Ａ～図５Ｄに示されるように、ウレルマブは、ＣＬＤＮ６発現に無関係に４－１ＢＢ活性化を誘発したが、本出願の４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃは、４－１ＢＢに結合することができるにもかかわらず、同じ実験設定下でアゴニスト活性を持たなかった。同様に、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴも、全てのＣＬＤＮ６発現標的細胞の存在下で、ＣＬＤＮ６の発現レベルに関係なく、ＮＦκＢ活性を誘導した。対照的に、ＣＬＤＮ６を発現しないＲＫＯ細胞を標的細胞として使用した場合、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、図５Ｄに示されるように、ウレルマブと比較して４－１ＢＢ活性化が有意に低かった。
【0184】
３．２ ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の免疫応答促進活性
予め活性化させたヒトＰＢＭＣをＣＬＤＮ６発現細胞またはＲＫＯ細胞と１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。異なる濃度の抗体を混合培養物に加えた。４８時間後、培養培地中のＩＬ－２またはＩＦＮγのレベルを、ホモジニアスＨＴＲＦアッセイを使用して測定した。
予め活性化させたヒトＰＢＭＣをＣＬＤＮ６発現細胞またはＲＫＯ細胞と１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。異なる濃度の抗体を混合培養物に加えた。４８時間後、培養培地中のＩＬ－２またはＩＦＮγのレベルを、ホモジニアスＨＴＲＦアッセイを使用して測定した。
【0185】
図６Ａ～図６Ｆに示されるように、ＰＢＭＣをＣＬＤＮ６発現標的細胞と共培養した場合、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、ＩＬ－２及びＩＦＮγ産生を刺激した。しかしながら、図６Ｇ及び図６Ｈに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、ＣＬＤＮ６を発現しないＲＫＯの存在下では、ＰＢＭＣからのＩＬ－２またはＩＦＮγの産生を刺激しなかった。これにより、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴの活性が腫瘍抗原の存在に依存することが示唆された。対照的に、４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃは、このアッセイで不活性であった。
【0186】
実施例４．ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＢｓＡｂによる腫瘍成長阻害
４．１ ＣＴ２６同系マウス大腸癌モデル
ＣＴ２６は、進行性結腸癌のＢＡＬＢ／ｃマウスから樹立されたＮ－ニトロソ－Ｎ－メチルウレタン－（ＮＮＭＵ）誘導未分化結腸癌細胞株である。ＣＬＤＮ６を内因性に発現するＣＴ２６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃヒト化４－１ＢＢマウスに皮下移植した。腫瘍が平均１００ｍｍ３まで成長したら、（ａ）ヒトＩｇＧ、（ｂ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）、（ｃ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（２ｍｇ／ｋｇ）、または（ｄ）親ＣＬＤＮ６－１抗体と４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃの組み合わせ（１．８ｍｇ／ｋｇ及び０．７ｍｇ／ｋｇ）でマウスを腹腔内処置した。処置は、週２回、合計６回投与された。腫瘍成長は、体積測定によってモニタリングした。図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡは両方とも抗腫瘍活性を示したが、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、７５％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）でさらに強い活性を示した。
４．１ ＣＴ２６同系マウス大腸癌モデル
ＣＴ２６は、進行性結腸癌のＢＡＬＢ／ｃマウスから樹立されたＮ－ニトロソ－Ｎ－メチルウレタン－（ＮＮＭＵ）誘導未分化結腸癌細胞株である。ＣＬＤＮ６を内因性に発現するＣＴ２６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃヒト化４－１ＢＢマウスに皮下移植した。腫瘍が平均１００ｍｍ３まで成長したら、（ａ）ヒトＩｇＧ、（ｂ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）、（ｃ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（２ｍｇ／ｋｇ）、または（ｄ）親ＣＬＤＮ６－１抗体と４－１ＢＢ ｓｄＡｂ－Ｆｃの組み合わせ（１．８ｍｇ／ｋｇ及び０．７ｍｇ／ｋｇ）でマウスを腹腔内処置した。処置は、週２回、合計６回投与された。腫瘍成長は、体積測定によってモニタリングした。図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡは両方とも抗腫瘍活性を示したが、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴは、７５％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）でさらに強い活性を示した。
【0187】
４．２ ＭＣ３８同系マウス大腸腺癌モデル
結腸腺癌マウスからＭＣ３８腫瘍形成性上皮細胞株を単離した。ヒトＣＬＤＮ６を発現するように操作したＭＣ３８細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ヒト化４－１ＢＢマウスに皮下移植した。腫瘍が平均１００ｍｍ３まで成長したら、（ａ）ビヒクル（対照）、（ｂ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、（ｃ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、または（ｄ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（４．５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを腹腔内処置した。処置は、週１回、合計３回投与された。図９Ａを参照されたい。腫瘍成長は、体積測定によってモニタリングした。図９Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡは、有意な抗腫瘍活性を示したが、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴでの処置は、同用量でより大きな腫瘍成長阻害を達成し、高用量では完全な腫瘍退縮に至った。
結腸腺癌マウスからＭＣ３８腫瘍形成性上皮細胞株を単離した。ヒトＣＬＤＮ６を発現するように操作したＭＣ３８細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ヒト化４－１ＢＢマウスに皮下移植した。腫瘍が平均１００ｍｍ３まで成長したら、（ａ）ビヒクル（対照）、（ｂ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、（ｃ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、または（ｄ）ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ（４．５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを腹腔内処置した。処置は、週１回、合計３回投与された。図９Ａを参照されたい。腫瘍成長は、体積測定によってモニタリングした。図９Ｂに示されるように、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡは、有意な抗腫瘍活性を示したが、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴでの処置は、同用量でより大きな腫瘍成長阻害を達成し、高用量では完全な腫瘍退縮に至った。
【0188】
実施例５．ＣＬＤＮ６×４－１ＢＢ ＢｓＡｂの肝毒性評価
ｔ４－１ＢＢアゴニスト抗体療法の主な懸念事項は、ウレルマブの臨床開発で観察されたように、用量制限性の肝毒性である。最も一般的な有害事象は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の上昇、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇及び疲労であった。そのため、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡの肝毒性をさらに評価した。
ｔ４－１ＢＢアゴニスト抗体療法の主な懸念事項は、ウレルマブの臨床開発で観察されたように、用量制限性の肝毒性である。最も一般的な有害事象は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の上昇、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇及び疲労であった。そのため、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴ及びＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡの肝毒性をさらに評価した。
【0189】
簡潔に述べると、ＡＬＴ及びＡＳＴ測定のために、ＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＷＴまたはＣＬＤＮ６－１×４－１ＢＢ ＮＡを異なる用量で週２回治療した後、ｈｕ４－１ＢＢマウスから血液サンプルを採取した。図８に示されるように、ＡＬＴ及びＡＳＴの有意な上昇は観察されなかった。これにより、他の４－１ＢＢアゴニスト抗体によって一般に誘発される肝毒性のリスクがほとんどないことが示唆された。
【0190】
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等である任意の組成物または方法は、本開示の範囲内である。本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の方法及び組成物に様々な変更及び変形を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、添付する特許請求の範囲及びその同等物の範囲内にある限り、本開示の変更及び変形を包含することが意図される。
【0191】
本明細書で言及される全ての公開物及び特許出願は、それぞれ個々の公開物または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
【0192】
本発明は、本発明の実施に好ましい態様を含むことが本発明人に認められるか、または提案される特定の実施形態の観点から記載されてきた。本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態に多数の変更及び変化を行うことができることは、当業者には明らかであろう。例えば、コドン冗長性により、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎となるＤＮＡ配列に変更を加えることができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、生物学的作用の種類または量に影響を与えることなく、タンパク質構造に変更を加えることができる。そのような変更は全て、添付する特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【表4-7】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【配列表】
【国際調査報告】