特表 2025-501407 融合タンパク質及びその製造方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-17

(54)【発明の名称】融合タンパク質及びその製造方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20250109BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20250109BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20250109BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20250109BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N5/07

C12P21/02 C

A61K39/395 N

A61P37/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024560807

(86)(22)【出願日】2022-12-16

(85)【翻訳文提出日】2024-09-02

(86)【国際出願番号】 CN2022139667

(87)【国際公開番号】W WO2023125079

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】202111673917.4

(32)【優先日】2021-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524250341

【氏名又は名称】チュー、タオチョン

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チュー、タオチョン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB35

4C085CC05

4C085DD33

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG04

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、融合タンパク質及びその製造方法と使用を開示し、更にそれをコードする遺伝子、融合タンパク質の製造方法、当該融合タンパク質を活性成分とする抗アレルギー薬及び当該融合タンパク質の使用を開示する。本発明で提供される融合タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸残基を有するタンパク質である。本発明の融合タンパク質は、アレルギー反応の細胞内シグナル伝達系の阻害系を活性化して、細胞のアレルギー反応を効果的に阻害し、アレルギー疾患の治療において重要な役割を果たす。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列が配列番号３に示されることを特徴とする、融合タンパク質。

【請求項2】

融合タンパク質をコードする遺伝子であって、前記遺伝子のヌクレオチド配列は、
１）配列番号４、
２）請求項１に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
から選択されることを特徴とする、融合タンパク質をコードする遺伝子。

【請求項3】

前記遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号４に示されることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子。

【請求項4】

請求項２又は３に記載の遺伝子を含むことを特徴とする、組換え発現ベクター。

【請求項5】

前記組換え発現ベクターの骨格プラスミドは、ｐＳｅｃＴａｇであることを特徴とする、請求項４に記載の組換え発現ベクター。

【請求項6】

請求項４又は５に記載の組換え発現ベクターを含み、好ましくは宿主が哺乳動物細胞であることを特徴とする、形質転換体。

【請求項7】

前記哺乳動物の細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の形質転換体。

【請求項8】

請求項１に記載の融合タンパク質の製造方法であって、請求項６又は７に記載の形質転換体を培養して、前記融合タンパク質を発現させ、好ましくは、前記融合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより分離・精製し、より好ましくは、前記アフィニティークロマトグラフィーは、マウス抗ヒトＩｇＥアフィニティークロマトグラフィーであることを特徴とする、製造方法。

【請求項9】

活性成分が請求項１に記載の融合タンパク質を含むことを特徴とする、医薬。

【請求項10】

抗アレルギー剤の製造における、請求項１に記載の融合タンパク質の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は出願日が２０２１年１２月３１日である中国特許出願２０２１１１６７３９１７４の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。

【0002】

本発明は、遺伝子工学及び免疫学の分野に属する。具体的には、融合タンパク質、それをコードする遺伝子、融合タンパク質の製造方法、当該融合タンパク質を活性成分とする抗アレルギー薬及び当該融合タンパク質の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

アレルギー疾患は急性疾患及び慢性疾患を引き起こす６番目に多い原因であり、明らかな遺伝的傾向を有する。一般的なアレルギー疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性関節炎、蕁麻疹、アナフィラキシーショックなどを含む。中国人の約１０～１５％及びアメリカ人の約２０％がアレルギー疾患に苦しんでいる。

【0004】

現在、アレルギー疾患の治療に使用される医薬のほとんどは、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血除去薬、トリプトファンナトリウム、気管支拡張薬など、臨床症状を制御するためのものである。最近、米国ＦＤＡは抗ＩｇＥモノクローナル抗体の臨床試験を承認した。しかし、これらの薬には異なる程度の副作用を有するため、国内外の多くの医薬品研究開発機関及び製薬会社が新しいタイプの抗アレルギー薬の開発に取り組んでいる。

【0005】

アレルギー反応のメカニズムは、抗原（アレルゲン、アレルギーの原因物質）が体内に侵入すると、マスト細胞及び好塩基球に付着したＩｇＥ分子（細胞親和性抗体）に結合し、細胞の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ、略してＩＴＡＭ）の活性化を引き起こし、細胞の生理活性物質の放出を促し、平滑筋の収縮、血管透過性の増加、漿液分泌の増加などの臨床病理学的変化を引き起こす。この病理学的プロセスにおいて、生体のマスト細胞及び好塩基球上の親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）がアレルギー疾患において重要な役割を果たしている。同時に、二量体ＩｇＧがマスト細胞及び好塩基球の細胞膜表面に発現しているＦｃγＲＩＩＢ阻害受容体に結合すると、重合が生じ、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ、略してＩＴＩＭ）のリン酸化を誘発し、Ｆｃ＿２５ＲＩの活性化シグナルを阻害する。研究によると、ＦｃγＲＩＩ受容体がＦｃεＲＩ受容体と架橋結合すると、マスト細胞又は好塩基球に阻害シグナルを誘導し、細胞内活性化経路をブロックすることで、活性メディエーターの放出を阻害し、更にアレルギー反応を阻害することができる（Ｚｈａｏ Ｗ， Ｋｅｐｌｅｙ ＣＬ， Ｍｏｒｅｌ ＰＡ， ｅｔ ａｌ．， ＦｃγＲＩＩａ， Ｎｏｔ ＦｃγＲＩＩｂ， Ｉｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｓｋｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００６， １７７（１）：６９４－７０１）ことを表した。従って、当該反応メカニズムを利用して、アレルギー反応における阻害シグナルを活性化する融合タンパク質を研究することは、アレルギーを治療する新しい方法となるはずである。

【0006】

最新の研究では、ヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子発現の多型により、少数のヒト皮下肥満細胞はＦｃγＲＩＩＢを発現せず、ＦｃγＲＩＩＡを発現することが示されている。ＦｃγＲＩＩＡ受容体の細胞内末端には、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）が含まれている。ＦｃγＲＩＩＡからＦｃεＲＩへの直接架橋（融合タンパク質ＦＰ４を得る）は、アレルギー細胞でリン酸化反応を引き起こし、それによって細胞内活性化経路を活性化し、アレルギー細胞の脱顆粒反応を引き起こし、アレルギー疾患を引き起こす可能性がある。しかし、融合タンパク質ＦＰ４は、ＦｃγＲＩＩＡの発現によって引き起こされるアレルギー反応を克服することができない。

【発明の概要】

【0007】

融合タンパク質ＦＰ４がＦｃγＲＩＩＡ受容体に結合して、アレルギー反応細胞の脱顆粒を引き起こす先行技術における欠陥を克服するために、本発明は、融合タンパク質及びその製造方法と使用を提供し、前記融合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のみに結合し、その親和性は、融合タンパク質ＦＰ４（アミノ酸配列は、配列番号１に示され、それをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２に示される）より有意に優れており、ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩに対する親和性は変化しない。

【0008】

本発明で提供される融合タンパク質は、名称がＭＥＧであり、配列番号３に示されるアミノ酸残基を有するタンパク質であるか、又は配列番号３のアミノ酸残基配列が、１つ又は複数のアミノ酸残基により置換、欠失しており、配列番号３のアミノ酸残基配列と同じ又はより優れた活性を有する配列番号３に由来するタンパク質である。

【0009】

配列番号３のアミノ酸残基配列は、５５２個のアミノ酸残基から構成されたタンパク質である。ＭＥＧの構造は、図１に示され、領域Ａ（Ｆｃ－ε）（アミノ末端から１～３２０位のアミノ酸残基）と領域Ｂ（Ｆｃ－γ）（アミノ末端から３２１～５５２位のアミノ酸残基）の２つの部分から構成される。ここで、領域Ａは、ヒトＩｇＥ免疫グロブリンに由来し、ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩに結合する部位を有し、領域ＢはヒトＩｇＧ免疫グロブリンに由来し、ＩｇＧ受容体ＦｃγＲＩＩに結合する部位を有する。

【0010】

本発明の技術的解決策は下記に示される通りである。

【0011】

本発明により提供される第１の技術的解決策は、アミノ酸配列が配列番号３に示される、融合タンパク質である。

【0012】

本発明により提供される第２の技術的解決策は、ヌクレオチド配列が、
（１）配列番号４、
（２）技術的解決策の１つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
から選択される、融合タンパク質をコードする遺伝子である。

【0013】

いくつかの好ましい実施形態において、前記遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号４に示される。

【0014】

本発明により提供される第３の技術的解決策は、第２の技術的解決策に記載の遺伝子を含む、組換え発現ベクターである。

【0015】

いくつかの好ましい実施形態において、前記組換え発現ベクターの骨格プラスミドはｐＳｅｃＴａｇである。

【0016】

本発明により提供される第４の技術的解決策は、第３の技術的解決策に記載の組換え発現ベクターを含む、形質転換体であり、好ましくは前記形質転換体の宿主は哺乳動物細胞である。

【0017】

好ましい実施形態として、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0018】

本発明により提供される第５の技術的解決策は、第１の技術的解決策に記載の融合タンパク質の製造方法であり、前記方法は、第４の技術的解決策に記載の形質転換体を培養して、前記融合タンパク質を発現させることであり、好ましくは、前記タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより分離・精製し、より好ましくは、前記アフィニティークロマトグラフィーは、マウス抗ヒトＩｇＥアフィニティークロマトグラフィーである。

【0019】

本発明により提供される第６の技術的解決策は、活性成分が第１の技術的解決策に記載の融合タンパク質を含む、医薬である。

【0020】

本発明により提供される第７の技術的解決策は、抗アレルギー剤の製造における第１の技術的解決策に記載の融合タンパク質の使用である。

【0021】

本発明の積極的な進歩効果は：
本発明の融合タンパク質ＭＥＧは、その組成分の９９．９％がヒト（ｈｕｍａｎ）免疫グロブリン由来であるため、当該タンパク質は外来蛋白質の免疫原性を有することなく医薬として体内に入る。体内及び体外の実験結果により、融合タンパク質ＭＥＧがマスト細胞又は好塩基球の表面のＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩを効果的に架橋して、アレルギー反応を阻害できることが証明された。本発明の融合タンパク質ＭＥＧは、主にアレルギー反応の細胞内シグナル伝達系の阻害系を活性化して、細胞のアレルギー反応を効果的に阻害し、アレルギー疾患の治療において重要な役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】融合タンパク質ＭＥＧの構造概略図である。

【図2】上清及び精製ＭＥＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥ比較図である。

【図3】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃεＲＩ受容体の結合能力を同定した結果図である。

【図4】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃγＲＩＩＢ受容体の結合能力を同定した結果図である。

【図5】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃγＲＩＩＡ（即ちＦｃｇＲＩＩＡ）受容体（Ａ）とＦｃγＲＩＩＢ（即ちＦｃｇＲＩＩＢ）受容体（Ｂ）との結合分析図である。

【図6】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃγＲ（即ちＦｃｇＲ）との親和性の全面的な分析であり、ここで、ＦｃγＲＩ（即ちＦｃｇＲＩ）、ＦｃγＲＩＩＡのＨサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＡＨ）及びＲサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＢ（即ちＦｃｇＲＩＩＢ）、ＦｃγＲＩＩＩＡのＦサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＩＡＦ）及びＶサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＩＡＶ）の親和性は、それぞれ図６のＡ－Ｆに示される通りである。

【図7】融合タンパク質ＭＥＧが体内でアレルゲン誘発性脱顆粒反応を阻害することを示している。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、実施例の形態によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。本発明で使用される試薬及び原料は市販品として入手できる。

【0024】

実施例１ ＭＥＧ分子の発現及び精製
融合タンパク質ＦＰ４の発現は、ＣＮ１３１７３０４Ｃに示される通りであり、具体的には下記のステップを含む。

【0025】

通常の方法に従って、ヒト末梢血からＢリンパ球を分離・精製し、ゲノムＤＮＡを抽出し、特異的プライマーを使用してＦｃε及びＦｃγ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、Ｆｃε ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物は１１５５ｂｐであり、Ｆｃγ ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物は９２８ｂｐであった。ＰＣＲ産物をそれぞれｐＣＲ４－ＴＯＰＯ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、ＣＡ）にクローニングしてＦＰＥＦｃ－ε及びＦＰＧＦｃ－γを得、ヌクレオチド配列分析を実行し、１００％正しいヌクレオチド配列を得た後、Ｆｃε及びＦｃγ遺伝子をそれぞれＳｆｉＩ－ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ）を使用して酵素切断し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩ－ＮｏｔＩを使用してｐＳｅｃＴａｇ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、ＣＡ）発現ベクターを酵素切断し、その後連結してプラスミドｐＳｅｃＴａｇＭＥＧを得、プラスミドｐＳｅｃＴａｇＭＥＧに対してヌクレオチド配列分析を実行し、挿入された外来遺伝子配列が配列番号２に示される通りであった。次に、当該プラスミドを通常のエレクトロポレーションを使用してマウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞にトランスフェクトし、ＺＥＯＣＩＮによって薬剤耐性のスクリーニングを実行し、ＥＬＩＳＡにより同定し（通常の方法により製造されたマウス抗ヒトＩｇＥ抗体を使用してＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、検体上清を加え、更にヤギ抗ヒトＩｇＥ酵素標識抗体を加えた）、ＦＰ４（そのアミノ酸配列は、配列番号１で表される）高発現のクローンを得た。

【0026】

ＭＥＧ（ＭＥＧ構造は図１に示される）の構造はＦＰ４と異なり、その違いは下記に示される通りである。

【0027】

（１）ヒト免疫グロブリンＩｇＥ Ｆｃε及びＩｇＧ Ｆｃγの配列に基づいてＭＥＧ遺伝子を合成し、ＳＯＥ ＰＣＲ及び酵素切断の方法を使用して、ＭＥＧ遺伝子をｐＢＧ真核発現ベクターにクローニングし、配列決定によって正しいことが確認された後、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、５０％のＣＤ ＣＨＯ＋５０％のＤｙｎａｍｉｓ培地で発現させた。

【0028】

（２）ＧＥ Ｍａｂ－ｓｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー及び陽イオン交換による２段階の精製により高純度のタンパク質を得、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（結果は図２に示される）及びＨＰＬＣ検出により純度は９０％以上であり、タンパク質試料は限外濾過によって緩衝液を取り替え、濾過後に定量した。

【0029】

（３）ＭＥＧはＦＰ４と比較して、Ｆｃ－γのアミノ酸残基にアミノ酸突然変異を起こし、ＰからＤに突然変異した。

【0030】

【化1】

【0031】

ここで、下線はＢ領域Ｆｃ－γを表す。

【0032】

ＦＰ４遺伝子をコードするヌクレオチド配列：
ｔｔｃａｃｃｃｃｇｃｃｃａｃｃｇｔｇａａｇａｔｃｔｔａｃａｇｔｃｇｔｃｃｔｇｃｇａｃｇｇｃｇｇｃｇｇｇｃａｃｔｔｃｃｃｃｃｃｇａｃｃａｔｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｔｇｃｃｔｃｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａｃａｃｃｃｃａｇｇｇａｃｔａｔｃａａｃａｔｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｇｃａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｇｔｇｇａｃｔｔｇｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｔａｃｃａｃｇｃａｇｇａｇｇｇｔｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃａｃａｃａａａｇｃｇａｇｃｔｃａｃｃｃｔｃａｇｃｃａｇａａｇｃａｃｔｇｇｃｔｇｔｃａｇａｃｃｇｃａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃｃａｇｇｔｃａｃｃｔａｔｃａａｇｇｔｃａｃａｃｃｔｔｔｇａｇｇａｃａｇｃａｃｃａａｇａａｇｔｇｔｇｃａｇａｔｔｃｃａａｃｃｃｇａｇａｇｇｇｇｔｇａｇｃｇｃｃｔａｃｃｔａａｇｃｃｇｇｃｃｃａｇｃｃｃｇｔｔｃｇａｃｃｔｇｔｔｃａｔｃｃｇｃａａｇｔｃｇｃｃｃａｃｇａｔｃａｃｃｔｇｔｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｃａｃｃｃａｇｃａａｇｇｇｇａｃｃｇｔｇａａｃｃｔｇａｃｃｔｇｇｔｃｃｃｇｇｇｃｃａｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｇｔｇａａｃｃａｃｔｃｃａｃｃａｇａａａｇｇａｇｇａｇａａｇｃａｇｃｇｃａａｔｇｇｃａｃｇｔｔａａｃｃｇｔｃａｃｇｔｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｇｔｇｇｇｃａｃｃｃｇａｇａｃｔｇｇａｔｃｇａｇｇｇｇｇａｇａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｃａｇｇｇｔｇａｃｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｔｃａｔｇｃｇｇｔｃｃａｃｇａｃｃａａｇａｃｃａｇｃｇｇｃｃｃｇｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｇｇａａｇｔｃｔａｔｇｃｇｔｔｔｇｃｇａｃｇｃｃｇｇａｇｔｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｃｃｇｇｇａｃａａｇｃｇｃａｃｃｃｔｃｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｔｃｃａｇａａｃｔｔｃａｔｇｃｃｔｇａｇｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｃａｇｔｇｇｃｔｇｃａｃａａｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｃｃｃｇｇａｃｇｃｃｃｇｇｃａｃａｇｃａｃｇａｃｇｃａｇｃｃｃｃｇｃａａｇａｃｃａａｇｇｇｃｔｃｃｇｇｃｔｔｃｔｔｃｇｔｃｔｔｃａｇｃｃｇｔｃｔａｇａｇｇｔｇａｃｃａｇｇｇｃｃｇａａｔｇｇｇａｇｃａｇａａａｇａｔｇａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃａｔｇａｇｇｃａｇｃｔａｇｃｃｃｃｔｃａｃａｇａｃｃｇｔｃｃａｇｃｇａｇｃｇｇｔｇｔｃｔｇｔａａａｔｃｃｃｇｇｔａａａｇｇａｔｃｃｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａｔｇａ

【0033】

【化2】

【0034】

ここで、下線はＢ領域Ｆｃ－γを表す。

【0035】

ＭＥＧのヌクレオチド配列：
ｔｔｃａｃｃｃｃｇｃｃｃａｃｃｇｔｇａａｇａｔｃｔｔａｃａｇｔｃｇｔｃｃｔｇｃｇａｃｇｇｃｇｇｃｇｇｇｃａｃｔｔｃｃｃｃｃｃｇａｃｃａｔｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｔｇｃｃｔｃｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａｃａｃｃｃｃａｇｇｇａｃｔａｔｃａａｃａｔｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｇｃａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｇｔｇｇａｃｔｔｇｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｔａｃｃａｃｇｃａｇｇａｇｇｇｔｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃａｃａｃａａａｇｃｇａｇｃｔｃａｃｃｃｔｃａｇｃｃａｇａａｇｃａｃｔｇｇｃｔｇｔｃａｇａｃｃｇｃａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃｃａｇｇｔｃａｃｃｔａｔｃａａｇｇｔｃａｃａｃｃｔｔｔｇａｇｇａｃａｇｃａｃｃａａｇａａｇｔｇｔｇｃａｇａｔｔｃｃａａｃｃｃｇａｇａｇｇｇｇｔｇａｇｃｇｃｃｔａｃｃｔａａｇｃｃｇｇｃｃｃａｇｃｃｃｇｔｔｃｇａｃｃｔｇｔｔｃａｔｃｃｇｃａａｇｔｃｇｃｃｃａｃｇａｔｃａｃｃｔｇｔｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｃａｃｃｃａｇｃａａｇｇｇｇａｃｃｇｔｇａａｃｃｔｇａｃｃｔｇｇｔｃｃｃｇｇｇｃｃａｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｇｔｇａａｃｃａｃｔｃｃａｃｃａｇａａａｇｇａｇｇａｇａａｇｃａｇｃｇｃａａｔｇｇｃａｃｇｔｔａａｃｃｇｔｃａｃｇｔｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｇｔｇｇｇｃａｃｃｃｇａｇａｃｔｇｇａｔｃｇａｇｇｇｇｇａｇａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｃａｇｇｇｔｇａｃｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｔｃａｔｇｃｇｇｔｃｃａｃｇａｃｃａａｇａｃｃａｇｃｇｇｃｃｃｇｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｇｇａａｇｔｃｔａｔｇｃｇｔｔｔｇｃｇａｃｇｃｃｇｇａｇｔｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｃｃｇｇｇａｃａａｇｃｇｃａｃｃｃｔｃｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｔｃｃａｇａａｃｔｔｃａｔｇｃｃｔｇａｇｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｃａｇｔｇｇｃｔｇｃａｃａａｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｃｃｃｇｇａｃｇｃｃｃｇｇｃａｃａｇｃａｃｇａｃｇｃａｇｃｃｃｃｇｃａａｇａｃｃａａｇｇｇｃｔｃｃｇｇｃｔｔｃｔｔｃｇｔｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｃｔｇｇａｇｇｔｇａｃｃａｇｇｇｃｃｇａａｔｇｇｇａｇｃａｇａａａｇａｔｇａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃａｔｇａｇｇｃａｇｃｔａｇｃｃｃｃｔｃａｃａｇａｃｃｇｔｃｃａｇｃｇａｇｃｇｇｔｇｔｃｔｇｔａａａｔｃｃｃｇｇｔａａａｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｇａｃｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａｔｇａ（配列番号４）

【0036】

実施例２ それぞれＦｃεＲＩ及びＦｃγＲＩＩ受容体へのＭＥＧの結合試験
ＦｃεＲＩ受容体との結合試験：１×１０^６ ＣＨＯ ３Ｄ１０細胞（ＦｃεＲＩ受容体を発現）とそれぞれ５μｇのｈＩｇＥ、５μｇのＦＰ４及び５μｇの実施例２の精製ＭＥＧタンパク質とを４℃で１時間反応させ、洗浄した後５μＬの抗ヒトＩｇＥ Ｆｃ－ＦＩＴＣ標識抗体（ＣＡＬＴＡＧ、ＣＡ）を加え、フローサイトメトリーで細胞を検出した。結果では、ｈＩｇＥ（図３のＡ）及びＦＰ４（図３のＢ）と比較して、ＭＥＧタンパク質はＦｃεＲＩ受容体と結合できることを示した。

【0037】

ＦｃγＲＩＩ受容体との結合試験：１×１０^６ ＨＭＣ－１細胞（ＦｃγＲＩＩＢ受容体を発現）とそれぞれ５μｇのｈＩｇＧ、５μｇのＦＰ４及び５μｇの実施例２の精製ＭＥＧタンパク質とを４℃で１時間反応させ、洗浄した後５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ標識抗体（ＣＡＬＴＡＧ、ＣＡ）を加え、フローサイトメトリーで細胞を検出した。結果では、ｈＩｇＧ（図４のＡ）及びＦＰ４（図４のＢ）と比較して、ＭＥＧタンパク質はＦｃγＲＩＩＢ受容体と結合できることを示した。

【0038】

実施例３ ＥＬＩＳＡによるＭＥＧと異なるタイプのＦｃγＲ受容体との結合特性の分析
１００μＬの適切な濃度（２μｇ／ｍＬ）のＭＥＧを酵素結合プレートに加えて一晩コーティングし、上清を捨て、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで２時間ブロックし、ＰＢＳＴ（０．０５％のトウェイン２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、次に、それぞれ適切な濃度のｂｉｏｔｉｎタグ付きＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡＨ、ＦｃｇＲＩＩＡＲ、ＦｃｇＲＩＩＩＡＦ、ＦｃｇＲＩＩＩＡＶ又はＦｃγＲＩＩＢなどの細胞外ドメインタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を加え、室温で１時間培養した後上清を捨て、ＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、室温で１時間培養してｂｉｏｔｉｎタンパク質を検出し、上清を捨て、ＰＢＳＴで４回洗浄し、発色性溶液を加えて５～４０分間発色させ、６５０ｎｍにおける吸光度Ａ６５０を測定した。

【0039】

１回目の結果では、ＭＥＧタンパク質はＦｃγＲＩＩＡＨ（即ち図５ＡではＦｃｇＲＩＩＡとして示す）には結合せず、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃｇＲＩＩＢ）受容体のみに結合し、ＦｃγＲＩＩＢに対するＭＥＧの親和性はＦＰ４よりも大幅に優れていることが示された（図５のＢに示す）。

【0040】

２回目は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩの各サブタイプについて更に分析を実行し、その結果、ＭＥＧタンパク質は、ＦｃγＲＩ（即ちＦｃｇＲＩ）（図６のＡ）、ＦｃγＲＩＩＡのＨサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＡＨ）（図６のＢ）及びＲサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＡＲ）（図６のＣ）、ＦｃγＲＩＩＩＡのＦサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＩＡＦ）（図６のＥ）及びＶサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＩＡＶ）（図６のＦ）に結合せず、ＦｃγＲＩＩＢ（即ちＦｃｇＲＩＩＢ）受容体のみに結合し、ＭＥＧとＦｃγＲＩＩＢの親和性は、ＦＰ４（図６のＤ）よりも有意に優れていた。

【0041】

実施例４ ＭＥＧタンパク質体内におけるアレルゲン誘発性の脱顆粒反応の阻害
トランスジェニックマウス（マウスＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩα鎖ノックアウト、ヒトＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩα鎖移植）に特異的ヒト抗ＮＰ－ＩｇＥ（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ）を皮下注射し、４時間後１００μｇのアレルゲンＮＰ及び１％のエバンスブルー（ＥＶＡＮＳ）色素をｉ．ｖ．注射してから、感作部位で脱顆粒アレルギー反応が発生し、局所皮膚の血管透過性の増加により、青色色素が血管から漏出して組織空間に入り、皮下粘膜が青色反応を示した。対応する皮膚部位を感作させながら同量のＭＥＧタンパク質を加えると、脱顆粒アレルギー反応が完全に阻害され、局所的な皮膚にいかなる反応もなかったが、同量のヒトＩｇＧ対照では阻害反応がなかった（図７を参照）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2025501407000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-11-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0008】

本発明で提供される融合タンパク質は、名称がＭＥＧであり、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、又は配列番号３のアミノ酸残基配列が、１つ又は複数のアミノ酸残基により置換、欠失しており、配列番号３のアミノ酸残基配列と同じ又はより優れた活性を有する配列番号３に由来するタンパク質である。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0022】

【図1】融合タンパク質ＭＥＧの構造概略図である。

【図2】上清及び精製ＭＥＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥ比較図である。

【図3-1】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃεＲＩ受容体の結合能力を同定した結果図である。

【図3-2】 同上

【図4-1】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃγＲＩＩＢ受容体の結合能力を同定した結果図である。

【図4-2】 同上

【図5】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃγＲＩＩＡ（即ちＦｃｇＲＩＩＡ）受容体（Ａ）とＦｃγＲＩＩＢ（即ちＦｃｇＲＩＩＢ）受容体（Ｂ）との結合分析図である。

【図6-1】融合タンパク質ＭＥＧとＦｃγＲ（即ちＦｃｇＲ）との親和性の全面的な分析であり、ここで、ＦｃγＲＩ（即ちＦｃｇＲＩ）、ＦｃγＲＩＩＡのＨサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＡＨ）及びＲサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＢ（即ちＦｃｇＲＩＩＢ）、ＦｃγＲＩＩＩＡのＦサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＩＡＦ）及びＶサブタイプ（即ちＦｃｇＲＩＩＩＡＶ）の親和性は、それぞれ図６のＡ－Ｆに示される通りである。

【図6-2】 同上

【図6-3】 同上

【図7】融合タンパク質ＭＥＧが体内でアレルゲン誘発性脱顆粒反応を阻害することを示している。

【手続補正3】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列が配列番号３に示されることを特徴とする、融合タンパク質。

【請求項2】

融合タンパク質をコードする遺伝子であって、前記遺伝子のヌクレオチド配列は、
１）配列番号４、
２）請求項１に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
から選択されることを特徴とする、融合タンパク質をコードする遺伝子。

【請求項3】

前記遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号４に示されることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子。

【請求項4】

請求項２又は３に記載の遺伝子を含むことを特徴とする、組換え発現ベクター。

【請求項5】

前記組換え発現ベクターの骨格プラスミドは、ｐＳｅｃＴａｇであることを特徴とする、請求項４に記載の組換え発現ベクター。

【請求項6】

請求項４に記載の組換え発現ベクターを含み、好ましくは宿主が哺乳動物細胞であることを特徴とする、形質転換体。

【請求項7】

前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の形質転換体。

【請求項8】

請求項１に記載の融合タンパク質の製造方法であって、請求項６又は７に記載の形質転換体を培養して、前記融合タンパク質を発現させ、好ましくは、前記融合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより分離・精製し、より好ましくは、前記アフィニティークロマトグラフィーは、マウス抗ヒトＩｇＥアフィニティークロマトグラフィーであることを特徴とする、製造方法。

【請求項9】

活性成分が請求項１に記載の融合タンパク質を含むことを特徴とする、医薬。

【請求項10】

アレルギー疾患の治療における使用のための、請求項１に記載の融合タンパク質。

【手続補正4】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【国際調査報告】