特表 2025-501413 生物学的ブロックプラットフォームの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-17

(54)【発明の名称】生物学的ブロックプラットフォームの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20250109BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20250109BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07

C12M3/00 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024561737

(86)(22)【出願日】2023-01-04

(85)【翻訳文提出日】2024-08-29

(86)【国際出願番号】 US2023010096

(87)【国際公開番号】W WO2023133127

(87)【国際公開日】2023-07-13

(31)【優先権主張番号】63/296,276

(32)【優先日】2022-01-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524252105

【氏名又は名称】ロナウク， インク．

【氏名又は名称原語表記】ＲＯＮＡＷＫ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107364

【弁理士】

【氏名又は名称】斉藤 達也

(72)【発明者】

【氏名】メロット，アダム ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ホッジ，ジェイコブ ジー．

(72)【発明者】

【氏名】デッカー，ヘザー イー．

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029CC02

4B029GA08

4B029GB01

4B029GB02

4B029GB03

4B065AA93X

4B065BB32

4B065BC41

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】
【解決手段】エクスビボで組織細胞を成長させる方法が提供される。此れに於いて、方法は、（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、複数のＩＰＨＢの其々は、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークを包含する事、（ｉｉ）第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、（ｉｉｉ）第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種する事、（ｉｖ）第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、（ｖ）第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに（ｖｉ）第１の細胞型及び第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事を包含する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織のエクスビボの細胞の成長の方法であって：
（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、前記複数のＩＰＨＢの其々が、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される夫々の三次元（３Ｄ）マクロ構造と、前記夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークとを包含し、此処で、前記夫々の３Ｄマクロ構造が、其々、夫々の上面と、夫々の底面と、前記夫々の上面から前記夫々の底面まで延在する少なくとも１つの夫々の側面エッジ部に依って画定される夫々の厚さとを含み、此処で、前記夫々の３Ｄマクロ構造の構造が、其々、少なくとも１つの夫々の噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの夫々の噛み合わせメス構成要素を包含する事、
（ｉｉ）前記第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、
（ｉｉｉ）前記第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種し、此処で、前記第１の対象細胞型が前記第２の対象細胞型とは異なる事、
（ｉｖ）前記第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、前記第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて前記第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、
（ｖ）前記第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、前記第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて前記第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに
（ｖｉ）前記第１の細胞型及び前記第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事、
を含む、組織のエクスビボの細胞の成長の方法。

【請求項2】

前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワークが、第１の構造と、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワークとを有し、此処で、前記第１の構造が前記第２の構造とは異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方が、約１００～約８００ミクロンを含む平均直径、例えば次の何れか：少なくとも約１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、及び２５０ミクロン、並びに／又は次の何れか：多くとも約８００、７８０、７５０、７２０、７００、６８０、６５０、６２０、６００、５８０、５５０、５２０、５００、４８０、４５０、４２０、４００、３８０、３５０、３２０、３００、２８０、及び２５０ミクロンを有する、請求項１～２に記載の方法。

【請求項4】

前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方が、互いに独立して、前記夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０体積％、例えば次の何れか：前記夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０、５０、６０、及び７０体積％から、並びに／又は次の何れか：前記夫々の３Ｄマクロ構造の多くとも約９０、８５、８０、７５、及び７０体積％を含む、請求項１～３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料が、非分解性のハイドロゲル材料又は又は選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項１～４に記載の方法。

【請求項6】

前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が、非分解性のハイドロゲル材料又は選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項１～５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方が、１つ以上の合成ポリマー、例えば石油に由来する合成ポリマーを含む非分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項５～６に記載の方法。

【請求項8】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方が、１つ以上の分解性のポリマー、例えば生物に由来する１つ以上のバイオポリマーを含む選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項５～６に記載の方法。

【請求項9】

生物に由来する前記１つ以上のバイオポリマーがポリヌクレオチド、多糖、ポリペプチド、又は其れ等の何れかの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記１つ以上のバイオポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、アルギン酸、グリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、脂質、セルロース、アルギン酸、及び蛋白質を含み、此れ等が、バイオポリマー鎖を壊す為の、例えば蛋白質特異的酵素、イオン性溶媒、中性界面活性剤、弱酸、及び過酸化物の使用に依って穏やかに分解され得る、請求項８～９に記載の方法。

【請求項11】

前記１つ以上のバイオポリマーが、エステル、例えばヒドロキシブチレート、乳酸、グリコール酸、及びカプロラクトン、酸無水物、例えばアジピン酸及びセバシン酸、糖、例えばセルロース、アルギン酸、ペクチン、デキストリン、キトサン、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、及びヘパリン、蛋白質、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、例えばコラーゲン、ゼラチン、絹、及びフィブリン、ウレタン、ホスフェート、カーボネート、並びに塩化ビニルを含む分解性のモノマーを含む、請求項８～１０に記載の方法。

【請求項12】

前記選択可能に分解性のハイドロゲル材料が、更に、合成ポリマー、例えばポリエステル、ポリ酸無水物、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリホスフェート、又は其れ等の組み合わせを含む、請求項８～１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料から形成され、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が選択可能に分解性のハイドロゲル材料から形成される、請求項１～１２に記載の方法。

【請求項14】

更に、第３のＩＰＨＢを直接的に前記第２のＩＰＨＢに噛み合わせる事、及び前記第３のＩＰＨＢに第３の対象細胞型を播種する事を含み、此処で、前記第３の対象細胞型が前記第１の対象細胞型及び前記第２の対象細胞型とは異なる、請求項１～１３に記載の方法。

【請求項15】

更に、前記第３の対象細胞型に第３の培養培地を供給し、前記第３の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に於いて前記第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にするステップと、前記第１の細胞型及び前記第２の細胞型の間の第２の境界面を形成するステップとを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

更に、前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含む、請求項１～１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、前記第１のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、前記人工組織サンプルの表面に於いて前記第１の対象細胞型の前記細胞の少なくとも一部分を露出する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項１７に記載の方法は、更に、人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記第１のＩＰＨＢを凍結する事を含む。

【請求項19】

前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、（ｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）前記第２のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に在る前記第２の対象細胞型からの第２の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）前記第１の境界面を形成する第１の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記細胞を露出する、請求項１７～１８に記載の方法。

【請求項20】

請求項１９に記載の方法は、更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを凍結する事を含む。

【請求項21】

前記第３のＩＰＨＢの前記第３の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、加えて、（ｉｖ）前記第３のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に在る前記第３の対象細胞型からの第３の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｖ）前記第２の境界面を形成する第２の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、前記各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｖ）の前記細胞を露出する、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

請求項２１に記載の方法は、更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを凍結する事を含む。

【請求項23】

前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を前記収穫するステップが、其れ等を前記第１のＩＰＨＢから液体媒体に依って流し出す事を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項24】

前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を前記収穫するステップが、前記第１のＩＰＨＢの前記３Ｄマクロ構造を分解する、請求項１６に記載の方法。

【請求項25】

一緒に噛み合った前記複数のＩＰＨＢが、少なくとも２つのＩＰＢＨから様々であり得、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個のＩＰＢＨである、請求項１～２４に記載の方法。

【請求項26】

前記第１の対象細胞型が第１の対象治療薬、例えば第１の生物製剤を生産又は分泌する、請求項１～２５に記載の方法。

【請求項27】

前記第２の対象細胞型が第２の対象治療薬、例えば第２の生物製剤を生産又は分泌する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記第３の対象細胞型が第３の対象治療薬、例えば第３の生物製剤を生産又は分泌する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

更に、第１の無細胞基質を直接的に前記第１のＩＰＨＢに隣接して又は直接的に前記第１のＩＰＨＢ及び前記第２のＩＰＨＢの間に配置する事又は噛み合わせる事を含み、此処で、前記第１の無細胞基質は、第１の対象細胞型に関連する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の連続的なマトリックスに依って画定される無細胞３Ｄマクロ構造と、第１の対象細胞型に関連する前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとを含み、此処で、前記無細胞３Ｄマクロ構造は、上面と、底面と、前記上面から前記底面まで延在する少なくとも１つの側面エッジ部に依って画定される厚さとを含む、請求項１～２８に記載の方法。

【請求項30】

前記第１の無細胞基質が、更に、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

更に、前記第１の無細胞基質に第４の対象細胞型を播種する事を含み、此処で、前記第４の対象細胞型が前記第１の対象細胞型及び前記第２の対象細胞型とは異なる、請求項２９～３０に記載の方法。

【請求項32】

更に、前記第４の対象細胞型に第４の培養培地を供給し、前記第４の対象細胞型が、前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在する前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に於いて前記第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

更に、前記第１の対象細胞型及び前記第４の対象細胞型の間の第３の境界面を形成する事を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

更に、前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在する前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る前記第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含む、請求項２９～３３に記載の方法。

【請求項35】

前記収穫するステップが、前記第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、前記人工組織サンプルの表面に於いて前記第４の対象細胞型の前記第４の細胞の少なくとも一部分を露出する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

更に、人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記第１の無細胞基質を凍結する事を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記収穫するステップが、（ｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）前記第１の無細胞基質の前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る前記第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）前記第３の境界面を形成する第３の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った又は隣接した第１のＩＰＨＢ及び第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記細胞を露出する、請求項３５～３６に記載の方法。

【請求項38】

前記第４の対象細胞型が、例えば哺乳類又は植物等の生物からの自然状態の細胞を含む、請求項２９～３７に記載の方法。

【請求項39】

１つ以上のＩＰＨＢとの境界面を成す前記第１の無細胞基質を包含する複数の無細胞基質が、少なくとも１つの無細胞基質から様々であり得、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個の無細胞基質である、請求項２９～３８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０２２年１月４日出願の米国仮特許出願第６３／２９６，２７６号の優先権を主張し、此れは其の全体が参照に依って本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

本開示の発明の実施形態は一般的にはエクスビボの組織細胞の成長の方法に関し、此れ等に於いては、１つ以上のインターロッキング（interlocking）多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）及び／又は１つ以上の無細胞基質が、１つ以上の対象細胞型の成長の為に一緒に接合される。此れ等は、異なる対象細胞型の間のユニークな境界面の形成、及び／又は対象細胞型の１つ以上から生産若しくは分泌される１つ以上の生物製剤の収集を包含し得る。

【背景技術】

【0003】

細胞（例えば、ヒト、動物、植物、細菌、真菌）は、従来、ペトリ皿、非分割型のシャーレ、ウェルプレート、フラスコ、及び足場等のプラスチック基質上で培養殖される。然し乍ら、此れ等の細胞培養容器の其々は個別的且つ有限であるか、又は細胞増殖拡大の為の表面積が限定される。例えば、此れ等のインビトロ拡大培養システムは、単層として細胞を拡大培養する為の硬質な２Ｄプラスチック培養容器の使用を包含し、十分に多い細胞の数量を達成する為の複数のプロテアーゼ依存的な継代培養（継代）イベントを必要とする。証拠は、従来の２Ｄ培養システムが幹細胞拡大培養にとって理想的ではなく、複能性の損失を齎し、生存性を縮減し、老化を誘導し、再生因子の分泌を減少させ得るという事を示唆する。此れ等の種の容器は、其の上、対象細胞が自然に於いて成長する内部環境（例えば、異なる細胞型が生起する人体）に擬態しない。此れ等の細胞培養容器は細胞の容易な培養殖を可能にするが、細胞は、元々の細胞培養容器より成長すると、細胞に対して毒素を用いて解離させられ、追加の細胞培養容器に移動されなければならない。上で参照された通り、此のプロセスは継代培養として公知であり、継代としても公知である。細胞を増殖拡大するプロセスは、時間消費的であり、エラーの傾向があり、面倒であり、高額である。直接的に組織に由来する初代細胞が何度も継代培養されると、此れ等の初代細胞は最後には自然状態の特徴（表現型）及び機能を失う。或る点に於いて、初代細胞は分裂する事を止め、最早、最初に一次組織から抽出された時と同じ様には機能しないであろう。此の機能の停止は老化として公知であり、対象の初代細胞の当初のサンプルからの細胞の増殖拡大の寿命を限定し得る。

【0004】

其の上、結合組織、例えば骨、軟骨、皮膚、神経、肺、筋肉、及びその他の多くは、細胞が遊走、増殖、及び組織化して組織を形成する事を可能にする為の足場を作り出す為に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質を分泌及び組織化する細胞を含有する。ＥＣＭの組成及び構造の組織化の間の相互作用は良く立証されている。然し乍ら、治療目的で又は分析の為に斯かる異なる細胞型の間の境界面を発生させる為のアプローチは現在欠如している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

因って、当技術分野に於いては、異なる対象細胞型の間の境界面の成長等のもう１つの対象細胞を成長させる方法の為のフレキシブルなプラットフォームの必要性が残っている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の１つ以上の実施形態は、前述の問題の１つ以上に対処し得る。本発明の或る種の実施形態はエクスビボで組織細胞を成長させる方法を提供し、此れに於いて、方法は次を含み得る：（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、複数のＩＰＨＢの其々は、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される夫々の三次元（３Ｄ）マクロ構造と、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークとを包含し、此処で、夫々の３Ｄマクロ構造は、其々、夫々の上面と、夫々の底面と、夫々の上面から夫々の底面まで延在する少なくとも１つの夫々の側面エッジ部に依って画定される夫々の厚さとを含み、此処で、夫々の３Ｄマクロ構造の構造は、其々、少なくとも１つの夫々の噛み合わせ（interlocking）オス構成要素及び少なくとも１つの夫々の噛み合わせメス構成要素を包含する事、（ｉｉ）第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、（ｉｉｉ）第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種し、此処で、第１の対象細胞型は第２の対象細胞型とは異なる事、（ｉｖ）第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、（ｖ）第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに（ｖｉ）第１の細胞型及び第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事。本発明の或る種の実施形態に従うと、複数のＩＰＨＢは組織細胞成長の為に１つ以上の無細胞基質と接合され得る。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、本発明の或る種の実施形態に従う方法の視覚的な例解である。

【図2】図２は、本発明の或る種の実施形態に従って、２つの別個のＩＰＨＢを例解する。

【図3】図３は、本発明の或る種の実施形態に従って、３つの噛み合ったＩＰＨＢを例解する。

【図4】図４は、本発明の或る種の実施形態に従って、ＩＰＨＢの上面図及び側面図を図示し、連続的なポリマーマトリックス材料、並びにＩＰＨＢの表面に於いて露出する連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを例解する。

【図5】図５は、本発明の或る種の実施形態に従って、上面に在る噛み合わせオス構成要素と底面の中に突き出る噛み合わせメス構成要素とを包含するＩＰＨＢを例解する。

【図6】図６は、本発明の或る種の実施形態に従って、上面に在る噛み合わせオス構成要素と底面の中に突き出る噛み合わせメス構成要素とを包含する別のＩＰＨＢを例解する。

【図7】図７は、本発明の或る種の実施形態に従って、一緒に噛み合った時の第１のＩＰＨＢから第２のＩＰＨＢへの細胞遊走を例解する。

【図8A】乃至

【図8F】図８Ａ～８Ｆは、本発明の或る種の実施形態に従うマイクロチャンネル内の細胞成長パターンを例解する。

【図9】図９は、本発明の或る種の実施形態に従う複数のＩＰＨＢの命名法及び概念上の細胞遊走を例解する模式図である。

【図10】図１０は、図９のＩＰＨＢに様々な数及び配置の追加のＩＰＨＢを追加する為の追加のオプションを例解する模式図である。

【図11】図１１は、一連の噛み合った空のＩＰＨＢの浸潤アッセイ構成の模式図である。４つの播種されたＩＰＨＢが、一連の噛み合った空のＩＰＨＢに側鎖として噛み合わせられている。

【図12】図１２は、一連の噛み合った空のＩＰＨＢの二重浸潤アッセイ構成の模式図である。第１の細胞型を播種された４つのＩＰＨＢの第１のセットが、一連の噛み合った空のＩＰＨＢに側鎖として噛み合わせられ、治療薬剤を生産又は分泌し得る第２の細胞型を播種された４つのＩＰＨＢの第２のセットが、一連の噛み合った空のＩＰＨＢの反対側に於いて側鎖として噛み合わせられている。

【図13】図１３は、多重浸潤アッセイ構成を例解する。此れに於いては、８つのＩＰＨＢが一連の噛み合った空のＩＰＨＢに側鎖として取り付けられ、此れに於いて、側鎖として取り付けられた各ＩＦＰＢは異なる細胞型を播種され、此れ等の其々は異なる治療薬剤を生産又は分泌し得る。

【図14】図１４は、遊走アッセイ構成を例解する。此れに於いては、一連の播種されたＩＰＨＢが、其れ等に取り付けられた未播種の又は空のＩＰＨＢの８つの側鎖を有する。

【図15】図１５は、二重遊走アッセイ構成を例解する。此れに於いては、一連の播種されたＩＰＨＢがＩＰＨＢの第１のグループを包含し、第１の細胞型を播種され、ＩＰＨＢの第２のグループが第２の細胞型を播種され、此れに於いては、未播種の又は空のＩＰＨＢの８つの側鎖が其れ等に取り付けられている。

【図16】図１６は、多重遊走アッセイ構成を例解する。此れに於いては、各ＩＰＨＢが異なる細胞型を播種されている一連の播種されたＩＰＨＢ、及び未播種の又は空のＩＰＨＢの８つの側鎖が其れ等に取り付けられている。

【図17】図１７は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いては、各チャンバは、異なる細胞型を播種された４つの噛み合ったＩＰＨＢのグループを装填されている（例えば、各チャンバは其の固有の細胞型を其の中に有する）。

【図18】図１８は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いては、ＩＰＨＢは１方向傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。

【図19】図１９は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いては、ＩＰＨＢは２方向傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。

【図20】図２０は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いては、ＩＰＨＢは傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。

【図21】図２１は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いては、ＩＰＨＢは４方向傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。

【図22】図２２は、本発明の或る種の実施形態に従う無細胞マトリックスを例解する。

【図23】図２３は、其の中に３Ｄ印刷又は其の中に配設されたマイクロチャンネル及び／又はマイクロポッドのネットワークを有する直方体モールドを例解する。

【図24】図２４は、マイクロチャンネル及び／又はマイクロポッドのネットワーク上への対象細胞型の播種と、直方体モールドに装填する為の対象細胞型の細胞外マトリックスの成長とを例解する。

【図25】図２５は、中間体の無細胞基質を形成する為の脱細胞化組織及び其の後のハイドロゲル材料の分解又は溶解を例解する。

【図26】図２６は、凍結乾燥され、其の後に直方体モールドから取り除かれ、次に滅菌をされる中間体の無細胞基質を例解する。

【図27】図２７は、本発明の或る種の実施形態に従って形成される無細胞マトリックスを例解する。

【図28】乃至

【図31】図２８～３１は、本発明の或る種の実施形態に従う複数の接合された無細胞基質の異なる構成を例解する。

【図32A】図３２Ａは、ハイドロゲルシステムのマクロ構造を例解する。此れに於いて、（ｉ）左の画像は、約１ｃｍ^３の３Ｄハイドロゲルシステムの単一の写真画像である。（ｉｉ）中央の画像は、６ウェルプレート上の互いに接続された４つのハイドロゲルの写真画像である。及び（ｉｉｉ）右の画像は、接続された４つのハイドロゲルの写真画像であり、注釈は、当初に播種されたハイドロゲルからの細胞無しの追加で取り付けられたハイドロゲルの中への／方への細胞の遊走を図示する。

【図32B】図３２Ｂは、ハイドロゲルシステムのマイクロ構造を例解する。此れに於いて、（ｉ）左の画像は、ハイドロゲルの内部構造の断面の共焦点顕微鏡法画像であり、多孔性のアーキテクチャ内で遊走及び増殖する脂肪に由来する間葉系幹／間質細胞（ＡＳＣ）を図示する。此処で、（ａ）小さい白色の矢印はハイドロゲルのポリマー支柱を指示し、（ｂ）青色＝Ｈｏｅｃｈｓｔであり、（ｃ）緑色＝ファロイジンであり、（ｄ）赤色＝Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒである。（ｉｉ）中央の画像は、ハイドロゲルシステムのマイクロ構造内の個々の細孔を内張りするＡＳＣの蛍光画像である。此処で、（ａ）青色＝Ｈｏｅｃｈｓｔであり、（ｂ）緑色＝小麦胚芽アグルチニンであり、（ｃ）赤色＝Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒである。並びに（ｉｉｉ）右の画像は、当初に播種されたハイドロゲル（ハイドロゲル＃１）から新たに取り付けられたハイドロゲル（ハイドロゲル＃２）内に遊走するＡＳＣの共焦点顕微鏡法ｚスタック画像である。此れに於いて、大きい白色の矢印はＡＳＣ遊走の方向性を指示し、白色の点線は２つの取り付けられたハイドロゲルの接合部を指示する。

【図32C】図３２Ｃは、単一の細孔チャンネル内の３Ｄのｚスタック画像を図示する３つの画像を例解して、（中央の画像）ＡＳＣに依って形成された３Ｄネットワーク及び（右の画像）細胞から突き出る細胞突起を強調し、左の画像は染色されたハイドロゲル全体の低倍率画像である。此処で、全ての画像は其れ等のＡＸＲ共焦点イメージングシステムに依って株式会社ニコンに依って取得された。此れ等に於いて、青色＝Ｈｏｅｃｈｓｔであり、緑色＝ファロイジンであり、ピンク色＝Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒである。

【図33A】乃至

【図33B】図３３Ａ～３３Ｂは、３Ｄハイドロゲルシステム又は従来の２Ｄ培養に於ける継代１（Ｐ１）で播種されたＡＳＣの結果を例解する。此れに於いて、ＡＳＣは連続的に継代培養され、２Ｄ培養ではＰ２、Ｐ６、及びＰ１０に於いて評価され、３ＤハイドロゲルシステムのＡＳＣは継代相当時点に於ける其れ等の夫々の２Ｄカウンターパートと比較された。図３３Ａは、各夫々の時点（Ｐ２、Ｐ６、及びＰ１０）に於いて、ＣＤ７３（左）、ＣＤ９０（中央）、又はＣＤ１０５（右）の何れかについて染色された２Ｄ（最も左の列）及び３Ｄ（最も右の列）培養されたＡＳＣの代表的画像が図示されているという事を例解する。ＣＤマーカー染色は画像中で緑色で示されている。サンプルはＨｏｅｃｈｓｔ（青色）及びファロイジン（示されていない）に依って対比染色された。図３３Ｂは、行われたイメージングデータの定量及び陽性細胞の合計のパーセンテージを例解し、各マーカーについて箱ひげ図に依って示されている。此れに於いて、各個々の点は、２Ｄ（黒色の円）又は３Ｄ（青緑色の菱形）培養に於けるＡＳＣの単一画像の定量を指示する。２０×対物レンズを用いた。サンプルは四反復で分析された（ｎ＝４）。スケールバー＝１００μｍである。エラーバーは平均の標準誤差であり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。

【図34A】乃至

【図34N】図３４Ａ～３４Ｎは、従来の２Ｄ培養システムと比較して、経時的な３Ｄハイドロゲルに於ける老化の縮減された誘導を例解する。此れに於いては、ＡＳＣが継代１（Ｐ１）に於いて３Ｄハイドロゲルシステム又は従来の２Ｄ培養に播種され、ＡＳＣは２Ｄ培養では連続的に継代培養され、Ｐ２、Ｐ６、及びＰ１０で評価された。３ＤハイドロゲルシステムのＡＳＣは、継代相当時点に依って、其れ等の夫々の２Ｄカウンターパートと比較された。連続的な細胞の成長の為の充分な表面積を提供する為に、３つの追加のハイドロゲルが２週マークに於いて各個々のハイドロゲルに追加され、培養期間の残りは放置された。図３４Ａは、各夫々の時点（Ｐ２、Ｐ６、及びＰ１０）に於いて、β－ガラクトシダーゼ（緑色）について染色された２Ｄ（上側の行）及び３Ｄ（下側の行）培養されたＡＳＣの代表的画像が図示されているという事を例解する。サンプルはＨｏｅｃｈｓｔ（青色）及びファロイジン（示されていない）に依って対比染色された。図３４Ｂは、行われたイメージングデータの定量及び陽性細胞の合計のパーセンテージを例解し、各マーカーについて箱ひげ図に依って示されている。各個々の点は、２Ｄ（黒色の円）又は３Ｄ（青緑色の菱形）に於けるＡＳＣの単一画像の定量を指示する。２０×対物レンズを用いた。サンプルは四反復で分析された（ｎ＝４）。スケールバー＝１００μｍである。エラーバーは平均の標準誤差であり、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。

【図35A】乃至

【図35D】図３５Ａ～３５Ｄは、各夫々の時点からの２Ｄ及び３Ｄからの脂肪に由来する間葉系幹／間質細胞馴化培地（ＡＳＣ－ＣＭ）に於ける創傷治癒能力の保持を例解する。此れはケラチノサイトを処置する為に用いられ、其れから、此れ等は其れ等の遊走、代謝、及び増殖活性の変化について評価された。図３５Ａ及び３５Ｂはスクラッチアッセイに依って評価された遊走活性を例解する。此れに於いて、図３５Ａは、取得された全ウェル画像走査を例解し、創傷画像の代表的画像が提供される。此れに於いて、白色の実線は元々の創傷境界線を示し、黒色の実線は残りの創傷部位の輪郭である。図３５Ｂは、２２時間後の平均創傷面積が決定され、三反復で行われたという事を例解する。図３５Ｃは代謝活性を例解する。此れはＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅに依って定量され、相対的な蛍光単位の平均値として表示されている。図３５Ｄは増殖活性を例解する。此れはＰｉｃｏＧｒｅｅｎに依って定量され、平均細胞数が決定された。２ＤのＡＳＣ－ＣＭに依って処置されたケラチノサイトは黒色のバーで示されている。３ＤのＡＳＣ－ＣＭに依って処置されたケラチノサイトは青緑色のバーで示されている。スケールバー＝５００μｍである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。エラーバーは平均の標準誤差である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明は、此処で、以下添付の図面を参照してより詳しく記載される。此れ等に於いては、本発明の全てではなく幾つかの実施形態が示される。実際、本発明は多くの異なる形態で実施され得、本明細書で示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。寧ろ、此れ等の実施形態は、本開示が該当する法的要件を満たす様に提供される。本明細書及び添付の請求項に於いて用いられる単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」は、文脈が明瞭に別様に述べていない限り複数の指示対象を包含する。

【0009】

本開示の発明は、一般的に、エクスビボで組織細胞を成長させる方法に関する。此れ等に於いては、複数の生物学的ブロックが一緒に噛み合わせられるか又は別様に接合されて、１つ以上の異なる対象細胞型の連続的な成長の為の調整された環境を提供し得る。例えば、生物学的ブロックは、組織を形成する為に如何に挙動すべきかについて細胞に指図する為のキュー及び構造の構成要素を含有する基質を含む。各組織は、例えば異なる組成及び組織化構造を有して、如何に配列、組織化、及び機能すべきかを各種細胞に指図する。生物学的ブロック（例えば、ＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質）は、自然状態の組織の同じ（又は同様の）物理的、化学的、及び構造的構成要素を保有するユニークな足場を作り出す為の源の材料としての組織構成要素を用いて製造され得る。例として、組織構成要素は、ＥＣＭ構成要素、例えばグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、プロテオグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、各種コラーゲン（例えば、線維性（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ）、Ｆａｃｉｔ（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ）、短鎖（ＶＩＩＩ、Ｘ）、基底膜（ＩＶ）、及びその他（ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩＩ）、エラスチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、フィブロネクチン及び糖蛋白質、ラミニン－１１１（ラミニン－１）、ラミニン－２１１（ラミニン－２）、ラミニン－１２１（ラミニン－３）、ラミニン－２２１（ラミニン－４）、ラミニン－３３２／ラミニン－３Ａ３２（ラミニン－５／ラミニン－５Ａ）、ラミニン－３Ｂ３２（ラミニン－５Ｂ）、ラミニン－３１１／ラミニン－３Ａ１１（ラミニン－６／ラミニン－６Ａ）、ラミニン－３２１／ラミニン－３Ａ２１（ラミニン－７／ラミニン－７Ａ）、ラミニン－４１１（ラミニン－８）、ラミニン－４２１（ラミニン－９）、ラミニン－５１１（ラミニン－１０）、ラミニン－５２１（ラミニン－１１）、ラミニン－２１３（ラミニン－１２）、ラミニン－４２３（ラミニン－１４）、ラミニン－５２２、ラミニン－５２３（ラミニン－１５）、ペプチド、脂質及びリン脂質、炭水化物、ホスフェート、飽和脂肪、不飽和脂肪、トランス脂肪、コレステロール、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体／装置、リソソーム、エンドソーム、ベシクル、ペルオキシソーム、核小体、核、及びリボソーム）、並びに細胞骨格構成要素（例えばアクチン）を含み得る。生物学的ブロックは、組織を融合及び形成する目的で其れ等が一緒に接続され得る様にして作られ得る。種々のカスタム化された生物学的ブロックを相互接続して、更にカスタム化された構成を提供して、エンドユーザの用途に基づいてカスタムの基質から組織（例えば微小組織）を生産する目的で複数の異なる対象細胞型の間の相互作用（interplay）又は相互作用（interaction）を可能にする能力、例えば特定の組織ＥＣＭを利用するユニークな構成の形成。其の上、生物学的ブロックは、Ｘ－Ｙ平面、Ｘ－Ｚ平面、又はＹ－Ｚ平面に於いて無数の異なる構成で一緒に接続又は接合され得る。更に其の上、生物学的ブロック間の細胞の相互作用は、生物学的なバイオブロックが何れの構成に依って一緒に連結されて細胞の成長及び増殖拡大の為の３Ｄ足場を提供するかに依存して変化する。例えば、生物学的ブロックが如何にして一緒に接合されるかに基づいて、単一の組織が形成され得るか、又は２つの異なる組織が境界面を成し得る組織構築物を作り出し得る。

【0010】

本発明の或る種の実施形態は、エクスビボで組織細胞を成長させる方法を提供し、此れに於いて、方法は次を含み得る：（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、複数のＩＰＨＢの其々は、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される夫々の三次元（３Ｄ）マクロ構造と、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークとを包含し、此処で、夫々の３Ｄマクロ構造は、其々、夫々の上面と、夫々の底面と、夫々の上面から夫々の底面まで延在する少なくとも１つの夫々の側面エッジ部に依って画定される夫々の厚さとを含み、此処で、夫々の３Ｄマクロ構造の構造が、其々、少なくとも１つの夫々の噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの夫々の噛み合わせメス構成要素を包含する事、（ｉｉ）第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、（ｉｉｉ）第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種し、此処で、第１の対象細胞型は第２の対象細胞型とは異なる事、（ｉｖ）第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、（ｖ）第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに（ｖｉ）第１の細胞型及び第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事。本発明の或る種の実施形態に従うと、複数のＩＰＨＢは組織細胞成長の為の１つ以上の無細胞基質と接合され得る。

【0011】

此の点については、本発明の或る種の実施形態に従う方法は、対象細胞が継代培養の必要無しに基質（例えば３Ｄ足場）上で連続的に増殖拡大し得るプラットフォームを利用して、カスタム可能な細胞培養殖方法を可能にする。本発明の或る種の実施形態に従うと、対象細胞を培養殖する方法は、１つ以上の生物学的ブロック、例えば１つ以上のＩＰＨＢ及び／又は１つ以上の無細胞基質を利用し、此れ等が互いと噛み合わせられて又は別様に接合されて、種々の細胞及び／又は組織の連続的な３Ｄ成長を提供し得る。此の点については、生物学的ブロック、例えば１つ以上のＩＰＨＢ及び／又は１つ以上の無細胞基質は、モジュール式である基質を提供し、例えば、パズルピースの取り付けに同様の様式で一緒に接続又は連結する。１つの生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質上で成長した細胞は、第２の生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質が元々の生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質に連結又は接続される時に、第２の生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質上で遊走及び増殖拡大し得る。追加の生物学的ブロック、斯かる１つ以上のＩＰＨＢ及び／又は１つ以上の無細胞基質（例えば足場基質）は、元々のＩＰＨＢに連結又は接続された元々の１つ以上のＩＰＨＢに接続又は連結され得る。有益には、因って、追加の生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質が一緒に連結又は接続される限り、細胞は増殖拡大を続け得る。従って、相互接続された生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質のシステムは、相互接続された生物学的ブロック、斯かるＩＰＨＢ及び／又は無細胞基質の全体の中に連続的な様式で延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの集合的な３Ｄネットワークを画定し得る（例えば、各生物学的ブロックはマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの其の固有の３Ｄネットワークを有し、此れ等は他の何れかと同じであり得るか又は異なり得る）。

【0012】

或る種の実施形態に従うと、細胞培養殖の方法は何れかの継代培養ステップを欠く。継代培養を避ける斯かる方法は、細胞が継代培養を必要とする容器で成長する時よりも２倍以上長く細胞の特徴を保全する。モジュール式のＩＰＨＢ（例えば基質）は二次元（２Ｄ）又は３Ｄであり得るが、３Ｄ構成がより望ましい場合がある。上記の、及び下記でより詳細に論じられる通り、ＩＰＨＢはボイド空間、チャンネルを含有し得るか、又は気体若しくは液体基質に対して透過性であり得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢの連続的なポリマー材料は、殆ど又は専ら、合成ポリマー、生物由来のポリマー、及び／又は組織由来の構成要素、斯かる細胞外マトリックスを含むか又は其れからなるハイドロゲル材料とされ得る。ハイドロゲル材料の使用に依って、ＩＰＨＢは、例えば人体内の実質的に何れかの環境の環境に擬態する特徴を有する様に個々に調整されて、細胞がより自然状態で成長し、継代培養を必要とする細胞培養容器で成長する時よりも長い期間に亘って細胞の特徴を維持する事を可能にし得る。其の上、異なるＩＰＨＢが一緒に組み合わせられて（例えば噛み合わせられて）、異なる型の細胞が混合する事を可能にして、組織を形成又は多重細胞オルガノイドを生産し得る。ＩＰＨＢは、本発明の或る種の実施形態に従うと、其の場で固定されて分析の為に細胞を保全し得るか、又は基質が分解されて分析の為に細胞を放出し得る。

【0013】

本発明の或る種の実施形態に従うと、細胞を培養殖する方法は、止める事無しに且つ継代培養無しに、エンドユーザが実質的に何れかの細胞型を連続的に培養する事を可能にし得る。此れは、有益には、従来のプラットフォームに依っては実現しない実験の連続性及び細胞生産の連続性を可能にする。其の上、細胞を培養殖する方法は、ヒトとの相互作用を最小化する。継代培養の必要性が排除されるので、此れはヒューマンエラー、コンタミネーションのリスク、及び其の他の非一貫性を縮減する。更に其の上、本発明の或る種の実施形態に従って生物学的ブロックを利用する方法は、現在の細胞培養トレイ及びプレートと適合性であり得る。此れは、此れ等の方法が、細胞培地を分注及び吸引する為にインキュベータ及びリキッドハンドラーの間で標準的な細胞培養トレイ及びプレートを移動させ得る自動システムに用いられ得るという事を意味する。より少ないマニュアル工程及び継代培養に依って、本明細書に於いて開示される方法は、培地及びプラスチック製品を包含する消耗品の消費をも劇的に縮減し得る。本発明の或る種の実施形態に従って生物学的ブロックを利用する方法は、ＩＰＨＢに組み込まれたマイクロチャンネルアーキテクチャに基づいて、ＩＰＨＢ（例えばハイドロゲル基質）の中の一様な栄養素及び気体交換をも可能にする。ＩＰＨＢを利用する此れ等の方法は、例えば、特定の細胞型の成長を容易にする為のカスタム化、例えば、連続的なポリマーネットワークを形成するハイドロゲル材料、並びに／或いはＩＰＨＢの連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの構造を可能にする。其の上、本発明の或る種の実施形態に従う方法は、組み合わせた複数の異なる細胞型の培養を可能にし、治療又は診断目的の原材料として収穫され得る細胞外マトリックスを細胞が分泌及び形成する事を可能にし、収集の為にマイクロチャンネルの内腔空間への細胞からの生体産物の分泌を促進する。

【0014】

本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢは、其れ等のマイクロチャンネルの中の液体培地及び／又は気体の灌流を可能にし、特定の組織構造を形成する目的で、細胞がマイクロアーキテクチャのデザインに従って組織化する事を可能にする。有益には、本発明の或る種の実施形態に従う細胞培養殖の方法は、スフェロイドがマイクロチャンネル内で解け、円柱及び他のより高次の構造を形成する事を可能にする事に依って、スフェロイド壊死の問題を克服する。此の点については、本方法は、細胞の増殖、遊走、生存性、及び機能を促進する自然状態の微小環境の形成を容易にする。其の上、ＩＰＨＢに基づくシステムを利用する方法のフレキシブルな且つロバストな性質は、細胞培養のカスタムの成長を可能にし得る。

【0015】

本発明の或る種の実施形態に従うと、細胞培養殖の方法は、生物製剤生物製剤、例えばエクソソーム、細胞外ベシクル、成長因子、モノクローナル抗体、ペプチド、蛋白質、ウイルス粒子、オリゴヌクレオチド、及びオルガネラの生産に適用され得る。此の点については、対象の生物製剤を生産又は分泌する細胞が、本明細書に於いて開示される通り培養殖され得、生産又は分泌された生物製剤は、更なる処理、使用、及び／又は分析の為に単離され得る。細胞培養殖の方法が適用され得る追加の用途は、例えば、組織形成、オルガノイド形成、濾過、再生医療、自家移植片生成、肉の生産、細胞培養、植物培養、蛋白質生産、生理学的モデリング、感染疾患、創傷治癒、細胞リプログラミング、疾患モデリング、癌研究、バイオリアクター工程、細胞の大量生産、及び微小環境形成を包含する。

【0016】

上記の通り、本開示の発明は一般的に細胞を培養殖する方法に関する。本発明の或る種の実施形態に従う方法は次のステップを含み得る：（ｉ）第１のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を含む当初の足場を提供し、此処で、第１のＩＰＨＢは、連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される三次元（３Ｄ）マクロ構造と、連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとを含み、此処で、３Ｄマクロ構造は、上面と、底面と、上面から底面まで延在する少なくとも１つの側面エッジ部に依って画定される厚さとを含み、此処で、３Ｄマクロ構造の構造は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を包含するステップ、（ｉｉ）第１のＩＰＨＢに１つ以上の対象細胞を播種するステップ、（ｉｉｉ）１つ以上の対象細胞に第１の培養培地を供給し、１つ以上の対象細胞がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に於いて増殖拡大する事を可能にするステップ、（ｉｖ）第２のＩＰＨＢを第１のＩＰＨＢに噛み合わせる事に依って当初の足場を拡張し、此処で、第１のＩＰＨＢの少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素又は少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素は、第２のＩＰＨＢの対応する噛み合わせオス構成要素又は対応する噛み合わせメス構成要素に接合されるステップ、並びに（ｖ）１つ以上の対象細胞が第１のＩＰＨＢから第２のＩＰＨＢ内に増殖拡大する事を可能にし、第２のＩＰＨＢ内に在る１つ以上の対象細胞に第１の培養培地又は第２の培養培地を供給するステップ。

【0017】

図１は、例えば、細胞を培養殖する１つの例示的な方法２００を例解し、第１のＩＰＨＢ １（例えば一次的な又は播種ブロック）をコンパティビライザーに依ってコーティングする任意選択のステップ２１０を包含する。此れは、第１のＩＰＨＢ内のポリマーマトリックス材料（例えば、連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを画定する壁）に対する対象細胞の接着を促進し得るか又は容易にし得る。図１に示される通り、コンパティビライザーに依るコーティングステップは、単純に、コンパティビライザーを包含する流動性の又は液体の組成物を第１のＩＰＨＢの上面に適用する事と、組成物が、連続的なポリマーマトリックス材料の中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク内に及び中を拡散する事及び／又は流れる事を可能にする事とに依って、行われ得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、細胞接着、細胞遊走、細胞増殖、又は他の細胞の挙動及び機能を容易にする為にマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークのテクスチャを変化させる目的で、気体、又は液体組成物及び気体の組み合わせが第１のＩＰＨＢの中を搬送され得る。此の点については、第１のＩＰＨＢは、コンパティビライザーを有する組成物中に浸漬又はソーキングされて、コンパティビライザーに依るマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの望ましいコーティングを保証し得る。図１は、第１のＩＰＨＢに１つ以上の対象細胞（例えば、培養の為の第１の細胞型）を播種する工程２２０をも例解する。細胞の性質は一般的には重大ではない。何故なら、ＩＰＨＢはアグノスティックであり、何れかの細胞株を許容するであろうからである。ステップ２３０は、第１のＩＰＨＢ内に存在する今播種された対象細胞に供給する事を含み得る。此の点については、１つ以上の培養培地が、播種された細胞の成長の為の所望のプロトコールに従って用いられ得る。再び、供給工程が、培養培地をＩＰＨＢの上面に適用する事と、培養培地がＩＰＨＢの中を拡散する事及び／又は流れる事を可能にする事とに依って、実施され得る。加えて又は代替的には、ＩＰＨＢは培養培地中にソーキング又は浸漬され得る。図１に示される通り、任意選択のステップ２４０は、第２のＩＰＨＢ及び第３のＩＰＨＢを第１のＩＰＨＢに噛み合わせる事に依って、第１のＩＰＨＢに関連する当初の足場を拡張する事を含み得る。ステップ２５０は、培養された細胞をＩＰＨＢ内から収穫する事を含む。連続的なポリマーマトリックス材料を形成するハイドロゲル材料の性質に依存して、収穫する事は、ハイドロゲル材料を分解して細胞を露出する事を含み得る。又は、細胞はＩＰＨＢの中を通過する液体形態の回収試薬に依って流し出され得る。

【0018】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る１つ以上の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含み得る。第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る１つ以上の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップは、流体媒体に依って第１のＩＰＨＢから其れ等を流し出す事を含み得る。用いられるＩＰＨＢに依存して、エンドユーザは、例えば、トリプシン及びアキュターゼ（Accutase）に基づく製品を利用して、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークから細胞を取り除き得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、酵素試薬が、連続的なポリマーマトリックス材料を形成するハイドロゲル材料の結合を物理的に切断してＩＰＨＢを分解し、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク内に在る細胞を穏やかに放出する。加えて又は代替的には、第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る１つ以上の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップは、第１のＩＰＨＢの３Ｄマクロ構造を分解する事を含み得る。本明細書に於いて記載される通り、分解性の材料は、天然に存在するバイオポリマー、例えばコラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、及び核酸を包含し得る。此れ等の種の材料、又は此れ等の材料の組み合わせは、対応する酵素、例えばコラゲナーゼ（例えば、コラーゲン及びゼラチンに効く）、ヒアルロナーゼ、及びＤｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅに依って分解され得る。

【0019】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、任意選択的に、連続的なポリマーマトリックス材料と連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとの間の境界面を、例えば本明細書に於いて記載及び開示されるコンパティビライザーに依ってコーティングするステップを含み得る。コンパティビライザーは、例えば、ＩＰＨＢに対する対象の初代細胞の接着を促進する様に選択され得る。此の点については、コーティングステップはＩＰＨＢの播種に先行して起こるであろう。

【0020】

本発明の或る種の実施形態に従うと、インターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）は互いと噛み合わせられて種々の細胞及び／又は組織の連続的な３Ｄ成長を提供し得る。ハイドロゲルは不溶性のポリマーマトリックスであり、此れ等は、最高で９６質量％の水分、例えば最高で４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び９５質量％の水分を持つ様に工作され得る）。種々の異なるポリマーが個々に又は組み合わせて用いられて、ユニークなハイドロゲルを作り出し得る。光、温度シフト、又は化学反応に依るポリマーの架橋に依って、ハイドロゲルは、異なる機械特性、拡散勾配、浸透圧、化学的配合、並びに構造、例えば様々な形状及びサイズの細孔及びファイバーを示す様に調整され得る。ハイドロゲルは分解性又は非分解性でもあり得る。ハイドロゲルは其れ等の能力が多用途的であり、異なる用途、例えば、患者の視力を矯正する為の光学部品を提供する為のソフトコンタクトレンズに用いられる。ハイドロゲルは創傷治癒用途に於いてドレッシングとして用いられており、バイオインクとしてライフサイエンス用途にも用いられて、マイクロ流体実験の為のユニークな構造的な足場を作り出しているか、又は細胞が培養されるべき基質を提供している。

【0021】

本発明の或る種の実施形態に従うＩＰＨＢは、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を介して、一緒に接合され得るか又は一緒に噛み合わせられ得る。例えば、第１のＩＰＨＢの少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、第２のＩＰＨＢの対応する少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素内に受けられる様に構成される。其れ等の３Ｄマクロ構造を介するＩＰＨＢの接合に加えて、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバ（例えばボイド空間）のネットワークのマイクロ構造。大部分のハイドロゲルは固体の材料である。然し乍ら、ボイド空間及びマイクロチャンネルをハイドロゲルに導入する事に依って、液体、気体、及び細胞の遊走が、連続的な基質を形成する為に一緒にハイドロゲルを拡張する目的で導かれ得る。本発明の或る種の実施形態に従う此の特徴は、特に有益であり得る。何故なら、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバ（例えばボイド空間）のネットワークのマイクロ構造は、第２の培地が用いられてＩＰＨＢ（例えばハイドロゲル）を一緒に噛み合わせ、細胞及び／又は組織の成長の為のより大きい又は拡張された材料を作り出す事を可能にするからである。

【0022】

ハイドロゲルは、何れかの合成ポリマー、生体ポリマー、組織構成要素（ヒト、動物、植物、若しくは其れ等の組み合わせに由来する）、又は其れ等の組み合わせを、水の存在下に於いて、フリーラジカルに依って媒介される反応（例えば、光反応、化学反応）又は温度変化の結果としての反応を用いて架橋する事に依って形成され得る。

【0023】

本発明の或る種の実施形態に従うＩＰＨＢ（例えばハイドロゲル）は、種々の用途、例えば、細胞培養、生物製剤、エクソソーム、細胞外ベシクル、成長因子、モノクローナル抗体、ペプチド、蛋白質、ウイルス粒子、オリゴヌクレオチド、オルガネラの生産又は成長、オルガノイド形成、植物成長、薬物送達、組織形成、エクスビボモデリング、電気伝導、創傷治癒、細胞リプログラミング、濾過、光学部品、マイクロ流体力学、マイクロチャンネルのカスタムネットワーク、カスタムの足場アーキテクチャ構築、カスタムの細胞外マトリックス由来の足場、溶解性のハイドロゲル、カスタム組織形成にとって好適であり得、患者細胞、カスタム構成、モジュール式、及び微小環境操作を許容する。

【0024】

本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢは、細胞が、２Ｄプラスチック細胞培養容器に於ける培養と比較してより自然状態の生理様の環境に於いて成長する事を可能にする。例えば、ＩＰＨＢは、カスタム可能且つモジュール式ではないプラスチック細胞培養容器及び他のテクノロジーとは異なり、特定の細胞が生起及び成長する元々の組織環境に擬態する様に調整又は構成され得る。加えて、本発明の或る種の実施形態は、似ている又は似ていない複数のＩＰＨＢ（例えばハイドロゲル）基質の組み合わせが、細胞生産及び／又はバイオロジクス生産の為の拡張された連続的なハイドロゲル基質を形成する為に接合される事を可能にする。例えば、他の細胞培養容器又はテクノロジーとは異なり、似ている又は似ていないハイドロゲル（例えばＩＰＨＢ）が一緒に接合されて、細胞が成長する為のユニークな且つカスタムの微小環境を作り出し得る。其の上、ＩＰＨＢは、ＩＰＨＢのマイクロチャンネルのネットワーク内に於いて壊死性コアを発生する事無しにスフェロイド及びオルガノイドの形成を可能にし得る。例えば、本発明の或る種の実施形態に従うＩＰＨＢは、スフェロイド及びオルガノイドが解け、管、円柱、及び他の洗練された構造を形成する事を可能にし、此処で、栄養素及び気体がＩＰＨＢ（例えばハイドロゲル）内の細胞迄一様に拡散し得る。有益には、例えば、細胞を大量生産すると主張する他のテクノロジーとは異なり、ＩＰＨＢは、健康な細胞の成長の為の一様な栄養素及び気体の交換を可能にし得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢは幅広い種々の異なる細胞型に適する様に改変され得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢは、細胞が細胞外マトリックスを分泌し、細胞の成長、遊走、生存性、及び機能を促進する自然の微小環境を作り出す事を可能にする。尚、更に、ＩＰＨＢは、有益には、細胞を継代培養する必要性を排除する。其の上、ＩＰＨＢの使用は用いる事が容易である。何故なら、其れ等は予め形成されたフォーマットで提供され得、用いる為に温度、ｐＨ、又は化学物質暴露の洗練された変化を要求しないからである。ＩＰＨＢは、例えば、ユーザが次の１つ以上を達成する事を可能にし得る：カスタムの細胞培養を成長させる、複数の細胞型を平行して又は順に成長させる、細胞培養を組み合わせて複雑な組織を作り出す、細胞の生産を一度も止める事無しに細胞を大量生産する、同じ基質を用いて、ベンチトップから治験迄ずっと、及び産業生産の為に細胞を生産する、並びに現行のテクノロジーよりも少ない培地及び少数の消耗品を用いる、細胞の生産に於いて人間のタッチポイントを縮減又は排除する事に依ってヒューマンエラー及びコンタミネーションのリスクを縮減する。本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢは、上で参照された用途の何れかの為のモジュール式プラットフォームを提供する。

【0025】

本発明に従う或る種の実施形態は、連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定された三次元（３Ｄ）マクロ構造と、連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとを含むインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を提供する。３Ｄマクロ構造は、上面と、底面と、上面から底面まで延在する少なくとも１つの側面エッジ部に依って画定される厚さとを含み得る。此れに於いて、３Ｄマクロ構造は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を包含する。本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢの少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、第２のＩＰＨＢの対応する少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素内に受けられる様に構成される。

【0026】

図２は、例えば、本発明の或る種の実施形態に従って、２つの別個のＩＰＨＢ １を例解する。此れ等のＩＰＨＢの其々は、上面１２、底面１４、及び少なくとも１つの側面エッジ部１６を包含する。図２に示される具体的なＩＰＨＢ １は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素５０及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素６０を包含する。図３は、本発明の或る種の実施形態に従って、３つの噛み合ったＩＰＨＢ １を例解する。図３に示されるＩＰＨＢ １は、其々、第１の噛み合わせオス構成要素５１、第２の噛み合わせオス構成要素５２、第１の噛み合わせメス構成要素６１、第２の噛み合わせメス構成要素６２を包含する。

【0027】

図４は、本発明の或る種の実施形態に従って、ＩＰＨＢ １の上面図及び側面図を図示し、連続的なポリマーマトリックス材料１０、並びにＩＰＨＢの表面に於いて露出する連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０を例解する。図４に依って例解される通り、播種されたＩＰＨＢは、細胞３３がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０中に於いて三次元の様式で成長及び遊走する事を可能にし得る。

【0028】

本発明の或る種の実施形態に従うと、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、少なくとも１つの側面エッジ部から外向きに延在する第１の噛み合わせオス構成要素を包含する。例えば、少なくとも１つの側面エッジ部は第１の側面エッジ部及び第２の側面エッジ部を包含し得、此れに於いて、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、第１の側面エッジ部から外向きに延在する第１の噛み合わせオス構成要素と、第２の側面エッジ部から外向きに延在する第２の噛み合わせオス構成要素とを包含する。側面エッジ部から外向きに延在する噛み合わせオス構成要素は、例えば、他のＩＰＨＢの対応する噛み合わせメス構成要素と噛み合うか又は接合する様に構成されて、拡張する連続的な３Ｄ足場形成システムを形成し、噛み合った又は接合したＩＰＨＢはｘ－ｙ平面に於いて外向きに拡張する。本発明の或る種の実施形態に従うと、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、上面から外向きに延在する第３の噛み合わせオス構成要素をも包含し得る。此の点については、上面から外向きに延在する噛み合わせオス構成要素は、例えば、他のＩＰＨＢの底面に在る対応する噛み合わせメス構成要素と噛み合うか又は接合する様に構成されて、拡張する連続的な３Ｄ足場形成システムを形成し、噛み合った又は接合したＩＰＨＢはｘ－ｙ平面に対して垂直のｚ方向に拡張する。本発明の或る種の実施形態に従うと、例えば、複数のＩＰＨＢが、ｘ－ｙ平面に於いて一緒に噛み合わせられ又は接合され、且つｚ方向に於いて其れ等同士で積み重ねられ得る。上記の通り、少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素は、３Ｄマクロ構造の内側部分の方へ少なくとも１つの側面エッジ部から内向きに延在する第１の噛み合わせメス構成要素を包含し得る。例えば、少なくとも１つの側面エッジ部が第３の側面エッジ部及び第４の側面エッジ部を包含し得、此れに於いて、少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素が、３Ｄマクロ構造の内側部分の方へ第３の側面エッジ部から内向きに延在する第１の噛み合わせメス構成要素と、３Ｄマクロ構造の内側部分の方へ第４の側面エッジ部から内向きに延在する第２の噛み合わせメス構成要素とを包含する。斯かる例示的実施形態に於いて、第１の側面エッジ部及び第３の側面エッジ部は、対向する側面エッジ部の第１のペアを画定し得、第２の側面エッジ部及び第４の側面エッジ部は、対向する側面エッジ部の第２のペアを画定し得る。本発明の或る種の実施形態に従い、且つ上記の通り、少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素は、３Ｄマクロ構造の内側部分の方へ底面から内向きに延在する第３の噛み合わせメス構成要素を包含し得る。此の点については、複数のＩＰＨＢが、ｘ－ｙ平面に於いて噛み合わせられ又は一緒に接合され、且つｚ方向に於いて其れ等同士で積み重ねられ得る。

【0029】

本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢの噛み合わせ特徴は、成長又は種々の細胞及び／又は組織の為の連続的な３Ｄ足場のカスタムの形成を可能にし、此れに於いて、連続的な３Ｄ足場に於いて播種及び／又は成長しようとする具体的な細胞の数は限定されない。異なるＩＰＨＢの相対的な配置及び噛み合わせに於ける斯かるフレキシビリティは、複数の細胞型のカスタムの成長を可能にし、此れ等は異なる型の細胞間の複雑な境界面を形成し得る。例えば、連続的な３Ｄ足場（例えば、複数の噛み合ったＩＰＨＢ中に延在する連続的なネットワークのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバ）を画定する複数の噛み合ったＩＰＨＢは、同時に成長しようとする１～２０個の異なる細胞及び／又は組織型、例えば同時に成長しようとする次の何れか：少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０個の異なる細胞及び／若しくは組織型、並びに／又は同時に成長しようとする次の何れか：多くとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、及び１０個の異なる細胞及び／若しくは組織型を包含し得る。

【0030】

図５は、例えば、本発明の或る種の実施形態に従って、上面１２に在る噛み合わせオス構成要素５３とＩＰＨＢの底面１４の中に突き出る噛み合わせメス構成要素６３とを包含するＩＰＨＢ １を例解する。此の点については、上面１２に在る噛み合わせオス構成要素５３及びＩＰＨＢの底面１４の中に突き出る噛み合わせメス構成要素６３は、本明細書に記載される通り、別個のＩＰＨＢと係合し噛み合う様に構成され得る。

【0031】

本発明の或る種の実施形態に従うと、３Ｄマクロ構造は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を例外として、立方体、四角柱、又は三角柱を画定し得る。本発明の或る種の実施形態に従う３Ｄマクロ構造は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を例外として、３～１２つの側面エッジ部、例えば少なくとも約３、４、５、６、７、及び８つの側面エッジ部、並びに／又は次の何れか：多くとも約１２、１１、１０、９、及び８つの側面エッジ部を有する多角柱を画定する。本発明の或る種の実施形態に従うと、各側面は、噛み合わせオス構成要素及び／又は噛み合わせメス構成要素の何れかを包含し得る。代替的には、側面エッジ部の幾つかは噛み合わせオス構成要素及び噛み合わせメス構成要素を欠き得る。

【0032】

本発明の或る種の実施形態に従うと、少なくとも１つの側面エッジ部は、第１の側面エッジ部と、第２の側面エッジ部と、第１の側面エッジ部及び第２の側面エッジ部の間に且つ其れ等に隣接して在る弓形の側面エッジ部とを包含する。例えば、第１の側面エッジ部は、第１の側面エッジ部から外向きに延在する少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素を包含し得、第２の側面エッジ部は、３Ｄマクロ構造の内側部分の方へ第２の側面エッジ部から内向きに延在する少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を包含し得る。此の点については、各ＩＰＨＢはパイ様の形状を画定し得、此れが、一緒に組み立てられるか又は噛み合わせられる時に円（例えば、各ＩＰＨＢは厚さを有する為円柱）を形成する。ＩＰＨＢの斯かる構成は、円形の培養ウェルでの使用にとって望ましい場合がある。加えて又は代替的には、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、上面から外向きに延在する第２の噛み合わせオス構成要素を包含し、及び／又は、少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素は、３Ｄマクロ構造の内側部分の方へ底面から内向きに延在する第２の噛み合わせメス構成要素を包含する。此の点については、複数のＩＰＨＢがｚ方向に互いに積み重ねられて、より厚い円柱又は半円柱を形成し得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、３Ｄマクロ構造は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を例外として、半円柱、例えば円柱の１／８～円柱の１／２、例えば円柱の１／８、１／４、１／３、又は１／２を画定し得る。

【0033】

図６は、本発明の或る種の実施形態に従って、例えば、上面１１２に在る噛み合わせオス構成要素１５３とＩＰＨＢの底面１１４の中に突き出る噛み合わせメス構成要素１６３とを包含する半円柱形状のＩＰＨＢ １００を例解する。図６に依って例解される半円柱形状のＩＰＨＢ １００は、第２の側面エッジ部１１８から延在する第１の噛み合わせオス構成要素１５０と、第２の側面エッジ部１１６の中に突き出る第１の噛み合わせメス構成要素１６０とを包含する。図６に示されるＩＰＨＢ １００の第１の側面エッジ部１１６及び第２の側面エッジ部１１８は、ＩＰＨＢの一端に於いて弓形の側面エッジ部１１９に依って接続される。此の点については、本明細書に記載される通り、上面１１２に在る噛み合わせオス構成要素１５３、及びＩＰＨＢの底面１１４の中に突き出る噛み合わせメス構成要素１６３は、別個のＩＰＨＢと係合し噛み合う様に構成され得る。

【0034】

本発明の或る種の実施形態に従うと、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素は、其れが其処から延在する表面（例えば、側面エッジ部、上面、又は底面）の巨視的な表面積の約５％～約５０％を占め得るか又はオーバーラップし得る。例えば、次の何れか：約１０、１５、２０、及び２５％、並びに／又は次の何れか：多くとも約５０、４５、４０、３５、３０、及び２５％に於いてである。加えて又は代替的には、少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素は、其れが其処に進入した表面（例えば、側面エッジ部、上面、又は底面）の巨視的な表面積の約５％～約５０％を占め得るか又はオーバーラップし得る。例えば、次の何れか：約１０、１５、２０、及び２５％、並びに／又は次の何れか：多くとも約５０、４５、４０、３５、３０、及び２５％に於いてである。

【0035】

本発明の或る種の実施形態に従うと、底面は上面に対して相対的に粗いテクスチャを有し得る。例えば、上面は、テクスチャ構造を有し得る底面に対して相対的に比較的平滑であり得る。底面のテクスチャ構造は、例えば、ＩＰＨＢからの培養培地又は洗浄媒体の排出を促す為の構造的なスペーサーを提供する事に依って、ＩＰＨＢの全体の培養培地又は洗浄媒体の流れを促し得る。底面のテクスチャ表面は、例えば、短いスペーサーとして機能する複数の軽度の隆起部、例えば個々の瘤又は畝を包含し得る。然し乍ら、複数の軽度の隆起部は、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素と比較してサイズが有意に小さくてもよい。例えば、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素のサイズの多くとも約１／１０である。此の点については、軽度の隆起部は、一般的には、本発明の或る種の実施形態に従う何れかの噛み合わせ機能性を提供しなくてもよい。

【0036】

本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢの上面は、約０．２５ｃｍ^２～約２５ｃｍ^２の巨視的な表面積、例えば次の何れか：少なくとも約０．２５、０．５、．７５、１、１．５、２、５、８、１０、及び１２ｃｍ^２、並びに／又は次の何れか：約２５、２２、２０、１８、１５、及び１２ｃｍ^２を含み得る。加えて又は代替的には、底面は、約０．２５ｃｍ^２～約２５ｃｍ^２の巨視的な表面積、例えば次の何れか：少なくとも約０．２５、０．５、．７５、１、１．５、２、５、８、１０、及び１２ｃｍ^２、並びに／又は次の何れか：約２５、２２、２０、１８、１５、及び１２ｃｍ^２を含み得る。加えて又は代替的には、３Ｄマクロ構造の厚さは、約０．５ｃｍ～約３ｃｍ、例えば次の何れか：少なくとも約０．５、０．７５、１、１．２５、及び１．５ｃｍ、並びに／又は次の何れか：多くとも約３、２．５、２、及び１．５ｃｍであり得る。

【0037】

上記の通り、少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素の其々は、第２のＩＰＨＢの対応する少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素を受ける様に構成され得る。此の点については、複数のＩＰＨＢが、ｘ－ｙ平面及びｚ方向単独に沿って所望の通り３Ｄ足場を拡張する様に、個々に順の追加で一緒に接合され得るか又は噛み合わせられ得る。例えば、複数の相互に接続されたＩＰＨＢに於ける細胞の成長は、ＩＰＨＢの第１の層の上部に追加のＩＰＨＢの層を積み重ねる事に依ってｚ方向に続けられ得る。

【0038】

本発明の或る種の実施形態に従うと、連続的なポリマーマトリックス材料は非分解性であり得る。此の点については、ＩＰＨＢに依って生産された細胞及び／又は組織は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの内側のネットワークから、更なる分析、精製、又は発生の為に流し出される事を必要とし得る。加えて又は代替的には、連続的なポリマーマトリックス材料は選択可能に分解性であり得る。例えば、ハイドロゲル製剤は、例えば酵素感受性の配列の挿入又は自然状態のマトリックスに由来する化合物の利用に依って、生分解性にさせられ得る。例えば、連続的なポリマーマトリックス材料は、生物に由来する１つ以上のバイオポリマー等の１つ以上の分解性のポリマーを含む選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含み得る。生物に由来する１つ以上のバイオポリマーは、例えばポリヌクレオチド、多糖、ポリペプチド、又は其れ等の何れかの組み合わせを含み得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、１つ以上のバイオポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、アルギン酸、グリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、脂質、セルロース、アルギン酸、及び蛋白質を含み得る。此れ等は、バイオポリマー鎖を壊す為の、例えば蛋白質特異的な酵素、イオン性溶媒、中性界面活性剤、弱酸、及び過酸化物の使用に依って穏やかに分解され得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、１つ以上のバイオポリマーは、エステル、例えばヒドロキシブチレート、乳酸、グリコール酸、及びカプロラクトン、酸無水物、例えばアジピン酸及びセバシン酸、糖、例えばセルロース、アルギン酸、ペクチン、デキストリン、キトサン、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、及びヘパリン、蛋白質、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、例えばコラーゲン、ゼラチン、絹、及びフィブリン、ウレタン、ホスフェート、カーボネート、並びに塩化ビニルを含む分解性のモノマーを含み得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、選択可能に分解性のハイドロゲル材料は、更に、合成ポリマー、例えばポリエステル、ポリ酸無水物、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリホスフェート、又は其れ等の組み合わせを含み得る。本発明の或る種の実施形態に従う連続的なポリマーマトリックス材料は、３Ｄの架橋されたポリマーネットワーク、架橋されていないポリマーネットワーク、又は其れ等の組み合わせを含み得る。

【0039】

本発明の或る種の実施形態に従うと、連続的なポリマーマトリックス材料は、膨潤性ハイドロゲル材料を含み得る。膨潤性ハイドロゲル材料は、少なくとも、アクリレート又はメタクリレート官能基を包含する第１のモノマーと、少なくとも２つのフリーラジカル重合可能な官能基を包含する第２のモノマー又はオリゴマーとのラジカルに依って媒介される反応産物を含み得る。例えば、少なくとも２つのフリーラジカル重合可能な官能基は、互いに独立して、アクリレート又はメタクリレート基、アリル基、アルキニル、ビニルニトリル、ビニルエーテル、ビニルエステル、ビニルアミド、スチレン基、マレイン酸基、フマル酸基、又はノルボルネン基を含み得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のモノマー又は第２のモノマーの少なくとも１つは、モノマーの主鎖に組み込まれた及び／又はモノマーに側鎖若しくは側鎖の構成要素としてグラフトされた、以下を含み得る：ポリエチレングリコール官能性（例えば、－Ｏ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎＨ（此処で、ｎは１～１００の値を有する）、ポリプロピレングリコール官能性（例えば、－Ｏ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｎＨ（此処で、ｎは１～１００の値を有する）、及び／又はグリセロール官能性。あくまで例として、第１のモノマー又は第２のモノマーの少なくとも１つは、２－ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレート（ＭＰＥＧＡ）、Ｎ－メチルアセトアミド（ＮＭＡ）、又はポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を含む。本発明の或る種の実施形態に従うと、ハイドロゲル材料に利用され得る非分解性のモノマーの非限定的な例は、ポリオレフィン（例えば、エチレン、プロピレン）、スチレン、ナイロン（例えば、アミド）、及び／又はアクリルを包含し得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、ハイドロゲル材料に利用され得る分解性モノマーの限定しない例は、エステル（例えば、ヒドロキシブチレート、乳酸、グリコール酸、カプロラクトン）、酸無水物（例えば、アジピン酸、セバシン酸）、糖（例えば、セルロース、アルギン酸、ペクチン、デキストリン、キトサン、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン）、蛋白質、ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド（例えば、コラーゲン、ゼラチン、絹、フィブリン）、ウレタン、ホスフェート、カーボネート、並びに塩化ビニルを包含し得る。加えて又は代替的には、架橋剤を含む第３のモノマーが連続的なポリマーマトリックス材料に組み込まれ得る。加えて又は代替的には、膨潤性ハイドロゲル材料は、１つ以上の天然ポリマー、例えば植物に由来するポリマー（例えばセルロースポリマー）及び動物に由来するポリマーを含み得る。

【0040】

本発明の或る種の実施形態に従うと、連続的なポリマーマトリックス材料は、対象の自然組織の約２０％以内の、例えば約１５％、１０％、８％、５％、３％、又は１％以内の１つ以上の物理特性を包含する事に依って対象の自然組織に擬態し得る。此処で、対象の１つ以上の物理特性は柔軟性及び張力を包含する。例えば、１つ以上の物理特性は、弾性及び／又は圧縮モジュラス、１Ｈｚの貯蔵モジュラス、１Ｈｚのモジュラス損失、並びに／或いは蛋白質／化学物質コーティング（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型、ラミニンＩ、ＩＩ、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン等）を含み得る。あくまで例として、自然状態の脂肪組織は、５０～１００ｋＰａの１Ｈｚの貯蔵モジュラス、１０～２０ｋＰａの１Ｈｚのモジュラス損失、並びに３ｋＰａの弾性及び／又は圧縮モジュラスを有する。此の点については、例えば、ＩＰＨＢは、約１１０ｋＰａの１Ｈｚの貯蔵モジュラス、約２２ｋＰａの１Ｈｚのモジュラス損失、並びに約３ｋＰａの弾性及び／又は圧縮モジュラスを有し得る。例えばＩＰＨＢは、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＤＭＡ； ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＲＳＡ３）をセットアップして分析し、機械的および物理的特性を評価することができる。力が集中する点を防ぐため、円形のヒドロゲルサンプルを分離するために５ｍｍの生検パンチを用いてもよい。ＤＭＡは、０．００５－ｍｍ／ｓｅｃの圧縮率と１－Ｈｚの周波数掃引による動的円筒圧縮分析によって実施される。例えば、具体的な化学的構成成分及び／又は架橋度は、対象の自然組織に関連する物に擬態又は反映する様に、齎される連続的なポリマーマトリックス材料の１つ以上の物理及び／又は機械特性を調整する様に変調させられ得る。加えて又は代替的には、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク並びに／或いはＩＰＨＢの外側の表面トポグラフィー／テクスチャが操作され得る。此れ等の表面の大部分は平滑であり得、溝、瘤、山、ディボット、及び他の表面の凹凸が導入されて、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの液体又は気体の流れを変調させ得る。斯かる表面の凹凸は、例えば、乱流を導入して、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中の液体又は気体の流れを遅くする事を助け得る。あくまで例として、表面の凹凸は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの平均直径と比較してサイズが有意に小さくてもよい。例えば、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの平均直径のサイズの多くとも約１／４～約１／１０である。

【0041】

本発明の或る種の実施形態に従うと、連続的なポリマーマトリックス材料は、３Ｄ印刷又はデジタル光合成印刷等の付加製造技術に依って形成される。此の点については、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークは、例えば、対象の自然組織の形態を反映する様にマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの形状及び寸法を変える事に依って、対象の自然組織の形態に擬態する構造である。例えば、対象の自然組織の形態は当業者に依って容易く確かめられ得、此の形態は３Ｄ印刷又はデジタル光合成印刷工程に依って再現されて、対象の自然組織の形態に擬態するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを有するＩＰＨＢを形成し得る。

【0042】

本発明の或る種の実施形態に従うと、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの平均直径は、約１００～約８００ミクロン、例えば次の何れか：少なくとも約１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、及び２５０ミクロン、並びに／又は次の何れか：多くとも約８００、７８０、７５０、７２０、７００、６８０、６５０、６２０、６００、５８０、５５０、５２０、５００、４８０、４５０、４２０、４００、３８０、３５０、３２０、３００、２８０、及び２５０ミクロンを含み得る。加えて又は代替的には、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークは、３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０体積％、例えば次の何れか：３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０、５０、６０、及び７０体積％から、並びに／又は次の何れか：３Ｄマクロ構造の多くとも約９０、８５、８０、７５、及び７０体積％を含み得る。

【0043】

本発明の或る種の実施形態に従うと、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークと連続的なポリマーマトリックス材料との間の境界面は、対象の初代細胞の接着を促進する為に選択されるコンパティビライザーのコーティングを含み得る。此のコーティングは、ＩＰＨＢの形成の後に適用され得る。例として、コンパティビライザーを含むコーティングは生物学的コーティングを含み得る。例えば、コラーゲンＩ（例えば、ヒト間葉系幹細胞［脂肪、骨髄、臍帯から］、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒトケラチノサイト、ヒト筋細胞、ヒト骨芽細胞、ヒト骨細胞、ヒト軟骨細胞、ウシ筋細胞、ブタ肝細胞、ブタ軟骨細胞、ブタ骨細胞、ウマ筋肉由来幹細胞）、ラミニンＩ（例えば、ヒト人工多能性幹細胞、マウス後根神経節）、ヒアルロナン（例えば、ブタ肝細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞）、ゼラチン（例えば、ヒト間葉系幹細胞［脂肪、骨髄、臍帯から］、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒトケラチノサイト、ヒト筋細胞、ヒト骨芽細胞、ヒト骨細胞、ヒト軟骨細胞、ヒトＴ細胞（ＣＤ８＋）、ヒトＴ細胞（ＣＤ４＋）、ヒトマクロファージ、ウシ筋細胞、ブタ肝細胞、ブタ軟骨細胞、ブタ骨細胞、ウマ筋肉由来幹細胞）、フィブリン（例えば、ヒトケラチノサイト）、フィブロネクチン（例えば、ヒト間葉系幹細胞［脂肪、骨髄、臍帯から］、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒトケラチノサイト、ヒト骨芽細胞、ヒト骨細胞、ヒト軟骨細胞）、又は其れ等の何れかの組み合わせを包含する。

【0044】

別の態様に於いて、本発明は、本明細書に於いて記載及び開示される物等の複数のＩＰＨＢを含む足場形成システムを提供する。本発明の或る種の実施形態に従うと、例えば、複数のＩＰＨＢは、第１の噛み合わせオス構成要素を包含する第１のＩＰＨＢと第２の噛み合わせメス構成要素を包含する第２のＩＰＨＢとを包含し、此れに於いて、第２の噛み合わせメス構成要素は第１の噛み合わせオス構成要素を受ける様に構成される。本発明の或る種の実施形態に従うと、例えば、第１の噛み合わせオス構成要素は第２の噛み合わせメス構成要素に挿入され得、此れに於いて、第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢは其々膨潤した状態で提供され、其れに依って、第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢの噛み合わせを改善する。此の点については、膨潤した状態は、水又は培養培地等の液体の吸収性を原因として提供され得る。第１及び第２のＩＰＨＢは噛み合った状態で膨潤する為、嵌合した噛み合わせオス及び噛み合わせメス構成要素の間の摩擦力が増大して、ＩＰＨＢを分離する為に要求される力を増大させる。

【0045】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢは第１のマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを有し、第２のＩＰＨＢは第２のマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを有する。此れに於いては、第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢが噛み合わせられ、集合的な連続的なマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを画定する時に、第１のマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの第１の部分が、第２のマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの第１の部分と少なくとも部分的にオーバーラップする。此の点については、上記の通り、ＩＰＨＢの表面に於けるマイクロポーラスチャンネルの密度は十分に大きい。其の結果、夫々のＩＰＨＢの表面に於けるマイクロポーラスチャンネルの少なくとも部分の部分的なオーバーラップは、噛み合わせられ得る各ＩＰＨＢ中に延在する連続した集合的な連続的なマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの形成を可能にする。上記の通り、複数のＩＰＨＢは、其のｘ－ｙ平面に沿って及び／又はｚ方向に沿って一緒に噛み合わせられ得る。

【0046】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢは第１の初代細胞を播種され得、第２のＩＰＨＢは第２の初代細胞を播種され、此処で、第１の初代細胞は第２の初代細胞とは異なる。上記の通り、ＩＰＨＢの其々は、異なる及び／若しくはユニークな初代細胞又は複数の初代細胞の組み合わせに依って播種され得る。代替的には、対象の所与の細胞の大量生産の為に、各ＩＰＨＢは同じ初代細胞を播種され得る。

【0047】

あくまで例として、ＩＰＨＢの１つ以上は播種され、次の何れかの細胞の成長を可能にし得る：（１）ヒト幹細胞、例えばヒトホウォートンゼリー細胞（ＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト皮膚由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト血球由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞、ヒトＣＤ８ ＋Ｔ細胞、（２）初代哺乳類細胞、例えばＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞）、ヒト成人皮膚線維芽細胞（初代細胞）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（初代細胞）、ヒト成人ケラチノサイト（初代細胞）、マウス後根神経節（初代神経細胞）、ウシ筋細胞（初代細胞株）、初代ブタ肝細胞、ブタ軟骨細胞、ブタ骨細胞、ウマ筋肉由来幹細胞（初代ＭＳＣ）、初代スネイル細胞、ヒトマクロファージ、（３）不死化哺乳類細胞株、例えばＵＢ－ＯＣ２細胞（マウス蝸牛上皮）、ヒト筋芽細胞腫（筋肉腫）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＳＨＳＹ５Ｙ（神経細胞腫）、ＰＡＮＣ－１（ヒト膵臓癌）、ＨｅＬａ（子宮頚癌）、Ａ５４９（肺癌）、Ａ６７３（筋肉腫）、並びに（４）初代植物細胞、例えばローズマリー、タバコ、及びトマト。

【0048】

図７は、本発明の或る種の実施形態に従って、一緒に噛み合った時の第１のＩＰＨＢ １から第２のＩＰＨＢ ２への細胞３３の遊走を例解する。図７に例解される通り、第１のＩＰＨＢ １は細胞３３を播種され、其れから、空の（例えば、細胞を欠く）第２のＩＰＨＢ ２に接合され得る。一度一緒に接合されると、細胞３３は、平衡に到達する迄、第１のＩＰＨＢ １から第２のＩＰＨＢ ２内に遊走する。両方のＩＰＨＢに於いて平衡に到達した後に、細胞３３は増殖し続けるであろう。

【0049】

上記の通り、本発明の或る種の実施形態に従って細胞を培養殖する方法は１つ以上のＩＰＨＢを利用する。例として、例えば、細胞を培養殖する方法は、第１のＩＰＨＢを含む当初の足場を提供する事と、第１のＩＰＨＢに１つ以上の対象細胞（例えば第１の細胞型）を播種する事とを含み得る。一度播種されると、１つ以上の細胞は１つ以上の培養培地に依って適当な栄養を提供され得る。此れ等は、第１のＩＰＨＢに形成されたマイクロポーラスネットワークに依って、播種された細胞に到達し得る。此の点については、古い又は消耗した培養培地は、ＩＰＨＢ及び／又はＩＰＨＢが収容され得るウェルから流し出され及び／又は吸出され得る。古い又は消耗した培養培地の取り除き後に、新しい培養培地がＩＰＨＢに適用され得る。例えば、第１の培養培地が播種後の成長の初期に於いては望まれ得るが、一度細胞成長が良好に確立され、ＩＰＨＢの中での細胞の増殖拡大が良好に確立されると、改変された（異なる）培養培地が好ましい場合がある。此の点については、方法は、１つ以上の対象細胞に供給して、１つ以上の対象細胞がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に増殖拡大する事を容易にするか又は可能にする事を含み得る。細胞が第１のＩＰＨＢ中に成長及び増殖拡大すると、当初の足場は第２のＩＰＨＢを第１のＩＰＨＢに噛み合わせる事に依って拡張され得る。此の点については、第１のＩＰＨＢはマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワークを有し、第２のＩＰＨＢはマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワークを有し、此れ等は、第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢの間の境界面に於いて少なくとも部分的にオーバーラップする。此の点については、１つ以上の対象細胞は第１のＩＰＨＢから第２のＩＰＨＢ内に増殖拡大する事を可能にし、此処で、培養培地が提供されて、第２のＩＰＨＢ中に於ける細胞株の成長及び増殖拡大を容易にし得る。

【0050】

本発明の或る種の実施形態に従うと、ネットワークのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバに播種された１つ以上の対象細胞は、ネットワーク内で種々のパターンで増殖拡大し得る。図８Ａに例解される通り、例えば、１つ以上の対象細胞３３（例えばＩＰＨＢに播種された）は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０の中で成長及び増殖拡大し、屈曲パターンを画定する。此処で、１つ以上の対象細胞が第１のＩＰＨＢの内側部分から１つ以上の外面、例えば上面、底面、及び／又は少なくとも１つの側面エッジ部の方へ増殖拡大すると、１つ以上の対象細胞が、個々のマイクロポーラスチャンネルの少なくとも一部分を横切って３Ｄ構成で前後に屈曲する。図８Ｂに例解される通り、例えば、１つ以上の対象細胞３３（例えばＩＰＨＢに播種された）は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０の中で成長及び増殖拡大し、１つ以上の対象細胞が第１のＩＰＨＢの内側部分から１つ以上の外面、例えば上面、底面、及び／又は少なくとも１つの側面エッジ部の方へ増殖拡大すると、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの壁に接着した螺旋パターンを画定する。図８Ｃに例解される通り、例えば、１つ以上の対象細胞３３（例えばＩＰＨＢに播種された）は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０の中で成長及び増殖拡大し、１つ以上の対象細胞が第１のＩＰＨＢの内側部分から１つ以上の外面、例えば上面、底面、及び／又は少なくとも１つの側面エッジ部の方へ増殖拡大すると、節点及び分枝の間の開放された領域を画定する節点及び分枝のネットワークを画定する。図８Ｄに例解される通り、例えば、１つ以上の対象細胞３３（例えばＩＰＨＢに播種された）は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０の中で成長及び増殖拡大し、１つ以上の対象細胞が第１のＩＰＨＢの内側部分から１つ以上の外面、例えば上面、底面、及び／又は少なくとも１つの側面エッジ部の方へ増殖拡大すると、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークの壁に接着した連続的な細胞シートを画定する。図８Ｅに例解される通り、例えば、１つ以上の対象細胞３３（例えばＩＰＨＢに播種された）は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０の中で成長及び増殖拡大し、スフェロイドを画定する。図８Ｆに例解される通り、例えば、１つ以上の対象細胞３３（例えばＩＰＨＢに播種された）は、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク３０の中で成長及び増殖拡大し、１つ以上の対象細胞が第１のＩＰＨＢの内側部分から１つ以上の外面、例えば上面、底面、及び／又は少なくとも１つの側面エッジ部の方へ増殖拡大すると、スフェロイド構造とスフェロイド構造から生じる螺旋構造とを有する彗星様構造を画定する。

【0051】

上記の通り、本発明の或る種の実施形態に従う方法は、ユニークにもインビボの成長及び増殖拡大に似通う３Ｄ細胞成長及び増殖拡大の形成を可能にする。此の点については、図９は、本発明の或る種の実施形態に従って、複数のＩＰＨＢの命名法及び概念上の細胞遊走を例解する模式図である。図９に示される通り、当初に播種されたＩＰＨＢ ３００は一次的な又は播種ブロック（Ｉ）として参照され得る。細胞表現型依存的であり１～２週間を要し得る所望のコンフルエンシーに、一度播種ブロック３００が到達すると、其れは、例えば２つの二次的な（ＩＩ）ＩＰＨＢ ３０２ａ、３０２ｂを直接的に播種ブロック３００に噛み合わせる事に依って拡張され得る。二次的、三次的等の数は、細胞及び／又は組織成長の為の最終的なゴールに依存し得る。図９は、二次的な（ＩＩ）３０２ａ、３０２ｂのＩＰＨＢの両方に直接的に取り付けられた単一の三次的な（ＩＩＩ）ＩＰＨＢ ３０４ａを例解する。図１０は、様々な数及び配置の追加のＩＰＨＢを図９のＩＰＨＢに追加する為の追加のオプションを例解する模式図である。図１０は３つの例示的な追加を例解し、四次的な（ＩＶ）ＩＰＨＢ ３０８を有する１つの例を包含する種々の構成を包含する。図９～１０に於いて例解される通り、複数のＩＰＨＢを利用する方法は、成長プロトコールをカスタム化する為の無数の異なる連続的な成長足場を提供する。

【0052】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、第１のＩＰＨＢへの複数の二次的なブロックの順の追加を含む連鎖的培養殖方法を含む。複数の二次的なブロックは、第２のＩＰＨＢと、第２のＩＰＨＢに直接的に相互接続された第３のＩＰＨＢとを包含し得、其の結果、第２のＩＰＨＢは直接的に第１のＩＰＨＢ及び第３のＩＰＨＢの間に在り、此処で、複数の二次的なＩＰＨＢは当初に細胞を欠く。此の点については、第１のＩＰＨＢに在る対象細胞は第１のＩＰＨＢから第２のＩＰＨＢへの細胞の増殖拡大後に収穫され、第２のＩＰＨＢに在る対象細胞は第２のＩＰＨＢから第３のＩＰＨＢへの細胞の増殖拡大後に収穫される。斯かる方法は、因って、特に再播種又は継代培養の必要無しに、対象細胞の連続的な成長及び収穫を可能にする。本発明の或る種の実施形態に従うと、二次的なブロック（即ち二次的なＩＰＨＢ）の数は、少なくとも２個から、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個のブロックであり得る。

【0053】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は多重細胞培養殖方法を含み、此れに於いては、第１のＩＰＨＢに播種される１つ以上の対象細胞は第１の細胞型を含み、第２のＩＰＨＢは第２の細胞型を播種される。此の点については、第１の細胞型は第２の細胞型とは異なる。此の点については、第１の細胞型の細胞（例えば骨細胞）及び第２の細胞型の細胞（例えば軟骨細胞）は互いの方へ増殖拡大し、第１の細胞型及び第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事が可能とされる。本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、ＩＰＨＢの其々を分解して各細胞型及び第１の境界面を露出するステップを含み得る。此の点については、各細胞型及び第１の境界面は更なる分析及び／又は使用の為に単離され得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、第３のＩＰＨＢを直接的に第２のＩＰＨＢと一緒に噛み合わせ、此処で、第２のＩＰＨＢは直接的に第１のＩＰＨＢ及び第３のＩＰＨＢの間に在る事、並びに第１の細胞型及び第２の細胞型とは異なる第３の細胞型を第３のＩＰＨＢに播種する事を含み得る。方法は、第２の細胞型の細胞及び第３の細胞型の細胞が互いの方へ増殖拡大し、第２の細胞型及び第３の細胞型の間の第２の境界面を形成する事を可能にする事及び／又は其の様に成長させる事をも含み得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、ＩＰＨＢの其々を分解して各細胞型、第１の境界面、及び第２の境界面を露出するステップを含み得る。

【0054】

上記の通り、１つ以上の対象細胞は対象の治療薬剤、例えば生物製剤を生産又は分泌し得る。例えば、治療薬剤はエクソソーム、細胞外ベシクル、成長因子、モノクローナル抗体、ペプチド、蛋白質、ウイルス粒子、オリゴヌクレオチド、オルガネラ、又は其れ等の組み合わせを含み得る。此の点については、複数のＩＰＨＢの種々の構成が噛み合わせられて集合的な足場ネットワークを提供し得る。此れに於いては、複数の細胞株、例えば治療薬剤を生産又は分泌し得る細胞株が、異なるＩＰＨＢに播種される。

【0055】

上記の通り、本発明の或る種の実施形態に従う方法は、複数のＩＰＨＢを無数の異なる構成で噛み合わせて、幅広い種々の異なる細胞株の為に成長プロトコールをカスタム化する為の幅広い種々の連続的な成長足場を提供する事を包含し得る。図１１～２１は、本発明の或る種の実施形態に従うあくまで少数の限定しない例示的な構成を例解する。図１１は、例えば、噛み合った空のＩＰＨＢ ４１０（例えば、一連の当初には播種された細胞を欠くＩＰＨＢ）の浸潤アッセイ構成の模式図であり、４つの播種されたＩＰＨＢ ４２０が、一連の噛み合った空のＩＰＨＢに側鎖として噛み合わせられている。ＩＰＨＢの全ては、ＩＰＨＢ及び／又は細胞培養培地を収容する為のトレイに収容される。此の点については、播種されたＩＰＨＢ ４２０の播種された細胞は、一連の相互接続された空のＩＰＨＢ内に成長及び増殖拡大する。図１２は、一連の噛み合った空のＩＰＨＢ ４１０の二重浸潤アッセイ構成についての模式図であり、第１の細胞型を播種された４つのＩＰＨＢ ４２０の第１のセットが、一連の噛み合った空のＩＰＨＢに側鎖として噛み合わせられ、治療薬剤を生産又は分泌し得る第２の細胞型を播種された４つのＩＰＨＢ ４３０の第２のセットが、一連の噛み合った空のＩＰＨＢの反対側に於いて側鎖として噛み合わせられている。此の点については、一連の当初に噛み合った空のＩＰＨＢ ４１０（例えば、播種された細胞を欠く）は、ＩＰＨＢ ４２０及びＩＰＨＢ ４３０からの細胞株から同時に浸透され得る。此の具体的な構成では、第１及び第２の細胞型は、当初に空のＩＰＨＢ ４１０に於いて互いと境界面及び／又は相互作用の領域を複数形成し得る。図１３は、例えば、多重浸潤アッセイ構成を例解する。此れに於いては、８つのＩＰＨＢ ４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５が、一連の噛み合った空のＩＰＨＢ ４１０に側鎖として取り付けられ、此れに於いて、側鎖として取り付けられた各ＩＦＰＢは異なる細胞型を播種され、此れ等の其々は異なる治療薬剤を生産又は分泌し得る。此の点については、複数の細胞株の成長及び増殖拡大は、一連の噛み合った当初に空のＩＰＨＢ ４１０内に同時に成長及び増殖拡大し得る。此の点については、異なる細胞型又は細胞株間の複数の異なる境界面も、一連の噛み合った当初に空のＩＰＨＢ中に形成され得る。

【0056】

図１４は遊走アッセイ構成を例解する。此れに於いては、一連の播種されたＩＰＨＢ ４２０が、其れ等に取り付けられた未播種の又は当初に空のＩＰＨＢ ４１０の８つの側鎖を有する。斯かる構成は、例えば、例えば上記の多連鎖的培養方法を提供し得る。詰まり、ＩＰＨＢ ４２０に播種された対象細胞は、当初に空のＩＰＨＢ ４１０の其々の中で外向きに成長及び増殖拡大する。此れに於いては、細胞成長に依って進入されたより初期のＩＰＨＢ（播種されたＩＰＨＢ ４２０に最も近いＩＰＨＢ）が収穫され得乍ら、細胞株の成長は其の後のＩＰＨＢ（例えば、播種されたＩＰＨＢ ４２０から更に遠くのＩＰＨＢ）に於いて同時に成長する。斯かるアプローチは、例えば、対象細胞の連続した３Ｄ成長を停止する事無しに細胞が収穫され得る対象細胞の大量生産を提供し得る。

【0057】

図１５は二重遊走アッセイ構成を例解する。此れに於いては、一連の播種されたＩＰＨＢがＩＰＨＢの第１のグループを包含し、第１の細胞型４２０を播種され、ＩＰＨＢの第２のグループが第２の細胞型４３０を播種され、此れに於いては、未播種の又は当初に空のＩＰＨＢ ４１０の８つの側鎖が其れ等に取り付けられている。此の点については、斯かる構成は、対象の複数の異なる細胞型の大量生産を提供し得る。此れに於いては、各細胞型が、複数の異なる対象細胞の連続した３Ｄ成長を停止する事無しに収穫され得る。図１６は多重遊走アッセイ構成を例解する。此れに於いては、各ＩＰＨＢが異なる細胞型を播種されている一連の播種されたＩＰＨＢ ４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、及び未播種の又は当初に空のＩＰＨＢ ４１０の８つの側鎖が、其れ等に取り付けられている。図１６に示される通り、異なる細胞型の其々は対象の治療薬剤を生産又は分泌し得る。

【0058】

図１７は、複数のＩＰＨＢ ４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いては、各チャンバは、異なる細胞型を播種された４つの噛み合ったＩＰＨＢのグループを装填されている（例えば、各チャンバは其の中に其の固有の細胞型を有する）。斯かる構成は、同じ期間に亘って同じトレイ上で単離の為の対象の治療薬を生産又は分泌し得る複数の細胞株の生産を可能にする。図１８は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いて、ＩＰＨＢは１方向傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。図１９は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いて、ＩＰＨＢは２方向傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。図２０は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いて、ＩＰＨＢは傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。図２１は、複数のＩＰＨＢ及びスペーサーを装填された８チャンバオムニトレイを例解する。此れに於いて、ＩＰＨＢは４方向傍分泌シグナル伝達アッセイとして構成されている。

【0059】

上述の例示的な構成は、単に、本発明の或る種の実施形態に従う少数の可能な方法を例解している。詰まり、上述の例示的な構成及び図は単に例解しているのであり、限定していない。其の上、複数のＩＰＨＢの使用を例解している上述の例示的な構成にもかかわらず、本発明の或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢの１つ以上は、無細胞基質、例えば本明細書に於いて記載及び開示される物に依って置換され得る。

【0060】

本発明の或る種の実施形態はエクスビボで組織細胞を成長させる方法を提供し、此れに於いて、方法は次を含み得る：（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、複数のＩＰＨＢの其々は、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される夫々の三次元（３Ｄ）マクロ構造と、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークとを包含し、此処で、夫々の３Ｄマクロ構造は、其々、夫々の上面と、夫々の底面と、夫々の上面から夫々の底面まで延在する少なくとも１つの夫々の側面エッジ部に依って画定される夫々の厚さとを含み、此処で、夫々の３Ｄマクロ構造の構造は、其々、少なくとも１つの夫々の噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの夫々の噛み合わせメス構成要素を包含する事、（ｉｉ）第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、（ｉｉｉ）第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種し、此処で、第１の対象細胞型は第２の対象細胞型とは異なる事、（ｉｖ）第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、（ｖ）第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに（ｖｉ）第１の細胞型及び第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事。本発明の或る種の実施形態に従うと、複数のＩＰＨＢは組織細胞成長の為に１つ以上の無細胞基質と接合され得る。或る種の実施形態に従うと、ＩＰＨＢの１つ以上（例えば全て）は、１つ以上の無細胞基質、例えば本明細書に於いて記載及び開示される物に依って置き換えられ得る。

【0061】

本発明の或る種の実施形態に従うと、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワークは、第１の構造と、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワークとを有し、此処で、第１の構造は第２の構造とは異なる。例として、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方は、互いに独立して、約１００～約８００ミクロンを含む平均直径、例えば次の何れか：少なくとも約１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、及び２５０ミクロン、並びに／又は次の何れか：多くとも約８００、７８０、７５０、７２０、７００、６８０、６５０、６２０、６００、５８０、５５０、５２０、５００、４８０、４５０、４２０、４００、３８０、３５０、３２０、３００、２８０、及び２５０ミクロンを有し得る。加えて又は代替的には、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方は、互いに独立して、夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０体積％、例えば、次の何れか：夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０、５０、６０、及び７０体積％から、並びに／又は次の何れか：夫々の３Ｄマクロ構造の多くとも約９０、８５、８０、７５、及び７０体積％を含み得る。

【0062】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料は、例えば上に記載された非分解性のハイドロゲル材料又は又は選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む。加えて又は代替的には、第２のＩＰＨＢの第２の連続的なポリマーマトリックス材料は、例えば上に記載された非分解性のハイドロゲル材料又は選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む。本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料、第２のＩＰＨＢの第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方は、１つ以上の合成ポリマー、例えば石油に由来する合成ポリマーを含む非分解性のハイドロゲル材料を含む。

【0063】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料、第２のＩＰＨＢの第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方は、１つ以上の分解性のポリマー、例えば（上に記載された通りの）生物に由来する１つ以上のバイオポリマーを含む選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む。例えば、生物に由来する１つ以上のバイオポリマーは、ポリヌクレオチド、多糖、ポリペプチド、又は其れ等の何れかの組み合わせを含む。本発明の或る種の実施形態に従うと、１つ以上のバイオポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、アルギン酸、グリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、脂質、セルロース、アルギン酸、及び蛋白質を含み、此れ等が、バイオポリマー鎖を壊す為の、例えば蛋白質特異的酵素、イオン性溶媒、中性界面活性剤、弱酸、及び過酸化物の使用に依って穏やかに分解され得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、１つ以上のバイオポリマーは、エステル、例えばヒドロキシブチレート、乳酸、グリコール酸、及びカプロラクトン、酸無水物、例えばアジピン酸及びセバシン酸、糖、例えばセルロース、アルギン酸、ペクチン、デキストリン、キトサン、ヒアルロナン、コンドイチン硫酸（Chondoitin sulfate）、及びヘパリン、蛋白質、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、例えばコラーゲン、ゼラチン、絹、及びフィブリン、ウレタン、ホスフェート、カーボネート、並びに塩化ビニルを含む分解性のモノマーを含む。本発明の或る種の実施形態に従うと、選択可能に分解性のハイドロゲル材料は、更に、合成ポリマー、例えばポリエステル、ポリ酸無水物、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリホスフェート、又は其れ等の組み合わせを含む。

【0064】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料は非分解性のハイドロゲル材料から形成され、第２のＩＰＨＢの第２の連続的なポリマーマトリックス材料は選択可能に分解性のハイドロゲル材料から形成される。例えば、複数の生物学的ブロックの構成は、複数の異なる分解性の及び／又は非分解性の生物学的ブロックを包含し得る。エンドユーザは、例えば、他の生物学的ブロックの組織構造とは境界面を成さずに、成長した組織の切片の回収の為に生物学的ブロックの構成の一部分だけを分解する事が望ましいと見出し得る。

【0065】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、第３の生物学的ブロック（例えば第３のＩＰＨＢ）を直接的に第２のＩＰＨＢに噛み合わせる事と、第３のＩＰＨＢに第３の対象細胞型を播種する事とを含み得、此処で、第３の対象細胞型は第１の対象細胞型及び第２の対象細胞型とは異なる。此の点については、噛み合った又は別様に接合された生物学的ブロックの構成は、複数の異なる対象細胞型を同時に成長させ、複数の異なる対象細胞型からのカスタムの境界面を形成し得る。方法は、例えば、更に、第３の対象細胞型に第３の培養培地を供給し、第３の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に於いて第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にするステップと、第１の細胞型及び第２の細胞型の間の第２の境界面を形成するステップとを含み得る。

【0066】

本発明の或る種の実施形態に従うと、複数の異なるＩＰＨＢ（例えば、其々は、異なるハイドロゲル材料から形成され得る及び／又は異なる細胞形態に基づく異なるマイクロアーキテクチャを有し得る）は、所望の場合には単独培養で接続され得る。例えば、細胞型１が溶解性のＩＰＨＢに播種され、其れから非分解性の／溶解性のＩＰＨＢが溶解性のＩＰＨＢに接続され、其れから部分的に溶解性のＩＰＨＢが元々の溶解性のＩＰＨＢに接続される場合には、細胞型１が全ての３つのＩＰＨＢ型中に増殖拡大し得る。此の点については、連鎖的培養がＩＰＨＢの各型について３つの異なる方向で続けられ得る。エンドユーザが欲する時には、エンドユーザは元々細胞型１を播種された溶解性のＩＰＨＢを取り除き、酵素試薬を適用して、元々細胞型１を播種されたＩＰＨＢを溶解し、分析の為に細胞を穏やかに放出し得る。

【0067】

同様に、エンドユーザは溶解性のＩＰＨＢに元々接続されていた非分解性の／溶解性のＩＰＨＢの１つを取り、細胞型１が非分解性の／溶解性のＩＰＨＢ（及び其の後の接続された非分解性の／溶解性のＩＰＨＢ）内に増殖拡大した後に、エンドユーザは非分解性の／溶解性のＩＰＨＢを取り除き、其れを固定し、パラフィン包埋又は急速凍結し、非分解性の／溶解性のＩＰＨＢを染色等の更なる分析の為に切片化し得る。同様に、エンドユーザは溶解性のＩＰＨＢに元々接続されていた部分的に溶解性のＩＰＨＢを１つ取り、細胞型１が部分的に溶解性のＩＰＨＢ（及び其の後の接続された部分的に溶解性のＩＰＨＢ）内に増殖拡大した後に、エンドユーザは部分的に溶解性のＩＰＨＢを取り除き、トリプシン又はアキュターゼ（Accutase）を用いて、部分的に溶解性のＩＰＨＢ内から細胞又は他の生物製剤を取り出し得る。此の点については、相互接続されたＩＰＨＢ（例えば、２つ以上の異なる型のＩＰＨＢ）は異なるハイドロゲル製剤を有するが、其れ等は巨視的なレベルでは構造的に同じであり、一緒に接続され得る。其の結果、エンドユーザは本質的には１つの細胞型について複数の実験を同時に行い得る。

【0068】

加えて、エンドユーザは、複数の細胞型が異なるアウトカム及び適用の為に各ＩＰＨＢ型に導入され得る所望の通り複雑な実験をデザインし得る。各ＩＰＨＢ型は、本明細書に於いて記載及び開示されるアッセイの其々に用いられ得る。

【0069】

例えば、二重浸潤アッセイは、３つの異なるハイドロゲル材料（例えば、溶解性の／分解性の、非溶解性の／分解性の、及び部分的に溶解性の）から形成されたＩＰＨＢに依って行われ得る。アッセイはＩＰＨＢ型にかかわらず同じ工程であるが、ユーザは、何れのＩＰＨＢ型が用いられたかに基づいて異なる収穫手順を用いる事に依って、異なる結果を得る事ができる。例えば、アッセイが溶解性の／分解性のＩＰＨＢＳで行われる場合には、アッセイの終わりに、エンドユーザは、元々アッセイの始めには空のままにされていた溶解性の／分解性のＩＰＨＢを取り除き、溶解性の／分解性のＩＰＨＢを穏やかに溶解して、対象細胞が元々は空の溶解性の／分解性のＩＰＨＢ内に浸潤したかどうかを見るであろう。同様に、非溶解性の／分解性のＩＰＨＢが用いられる場合には、エンドユーザは、元々は空であった非溶解性の／分解性のＩＰＨＢを取り除き、非溶解性の／分解性のＩＰＨＢを固定し、其れ等をパラフィン包埋し又は其れ等を凍結し、非溶解性の／分解性のＩＰＨＢを切片化し、其れから、核染色及びバックグラウンド染色を用いて、ＩＰＨＢの３Ｄ体積中の何処を細胞が遊走したかを物理的に見る事ができる。同様に、エンドユーザは、細胞が増殖拡大した他の非溶解性の／分解性のＩＰＨＢを取って、何れのマイクロチャンネル経路を細胞が最も利用して非溶解性の／分解性のＩＰＨＢの中を遊走したかを分析し得る。二重浸潤アッセイのケースでは、溶解性の／分解性のＩＰＨＢを用いる事は、細胞が空の溶解性の／分解性のＩＰＨＢ内に遊走したかどうか、及び何れ程多くの細胞が中に遊走したかについて、エンドユーザが経時的に「はい／いいえ」の回答を得る事を可能にする。一方で、非溶解性の／分解性のＩＰＨＢが用いられる場合には、エンドユーザは定量可能な及び定性的な情報を獲得する。何故なら、エンドユーザは、経時的に其れ等が空間的に非溶解性の／分解性のＩＰＨＢの何処を動くかを調べるオプションを有し、其の結果、観察され得る挙動の構成要素があるからである。

【0070】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含み得る。本発明の或る種の実施形態に従う第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料は、非分解性のハイドロゲル材料を含み得、収穫するステップは、第１のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、人工組織サンプルの表面に於いて第１の対象細胞型の細胞の少なくとも一部分を露出する。本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、人工組織サンプルを形成する前に又は後に第１のＩＰＨＢを凍結する事を含み得る。人工組織サンプルは、例えば、保存され、其の後に、自然状態の組織サンプルに類似の様式で下流の試験に用いられ得る。

【0071】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第２のＩＰＨＢの第２の連続的なポリマーマトリックス材料は非分解性のハイドロゲル材料を含み、収穫するステップは、（ｉ）第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）第２のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に在る第２の対象細胞型からの第２の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）第１の境界面を形成する第１の境界面細胞の少なくとも一部分を、噛み合った第１のＩＰＨＢ並びに第２のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の細胞を露出する。方法は、例えば、更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に、噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを凍結する事を含み得る。例えば、多重細胞含有人工組織サンプルは形成され、其の後に、保存及び後程の利用の為に凍結され得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、第３のＩＰＨＢの第３の連続的なポリマーマトリックス材料は非分解性のハイドロゲル材料を含み、収穫するステップは、加えて、（ｉｖ）第３のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に在る第３の対象細胞型からの第３の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｖ）第２の境界面を形成する第２の境界面細胞の少なくとも一部分を、噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、並びに第３のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｖ）の細胞を露出する。同様に、方法は、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に、噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを凍結する事を含み得る。例えば、多重細胞含有人工組織サンプルが形成され、其の後に、保存及び後程の利用の為に凍結され得る。

【0072】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップは、例えば上に記載された液体媒体に依って第１のＩＰＨＢから其れ等を流し出す事を含む。加えて又は代替的には、第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップは、例えば上に記載された第１のＩＰＨＢの３Ｄマクロ構造を分解する。

【0073】

本発明の或る種の実施形態に従うと、一緒に噛み合った複数のＩＰＨＢは、少なくとも２つのＩＰＢＨから様々であり得、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個のＩＰＢＨである。

【0074】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第１の対象細胞型は、第１の対象治療薬、例えば第１の生物製剤を生産又は分泌する。加えて又は代替的には、第２の対象細胞型は、第２の対象治療薬、例えば第２の生物製剤を生産又は分泌する。加えて又は代替的には、第３の対象細胞型は、第３の対象治療薬、例えば第３の生物製剤を生産又は分泌する。此の点については、例えば、１つ以上の治療薬剤、例えば本明細書に記載される治療薬剤が、本発明の或る種の実施形態に従って生産され得る。

【0075】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、第１の無細胞基質を直接的に第１のＩＰＨＢに隣接して又は直接的に第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢの間に配置する事又は噛み合わせる事を含み得、此処で、第１の無細胞基質は、第１の対象細胞型に関連する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の連続的なマトリックスに依って画定される無細胞３Ｄマクロ構造と、第１の対象細胞型に関連するＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとを含み、此処で、無細胞３Ｄマクロ構造は、上面と、底面と、上面から底面まで延在する少なくとも１つの側面エッジ部に依って画定される厚さとを含む。図２２は、例えば、本発明の或る種の実施形態に従う無細胞マトリックス７５０を例解する。図２２では、ＥＣＭ材料の連続的なマトリックスは、マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークを例解する為に透明にされている。

【0076】

図２２には例解されていないが、第１の無細胞基質は、更に、本明細書に於いて記載及び開示されるＩＰＨＢに類似の様式で、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を含み得る。

【0077】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、更に、第１の無細胞基質に第４の対象細胞型を播種するステップを含み得、此れに於いて、第４の対象細胞型は第１の対象細胞型とは異なる。或る種の実施形態に従うと、第４の対象細胞型は第２の対象細胞型及び第３の対象細胞型とは異なり得る。本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、第４の対象細胞型に第４の培養培地を供給する事と、第４の対象細胞型がＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に於いて第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事とを含み得る。此の点については、方法は、第１の対象細胞型及び第４の対象細胞型の間の第３の境界面を形成する事を含み得る。

【0078】

本発明の或る種の実施形態に従うと、方法は、ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る第４の対象細胞型から第４の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含み得る。例えば、収穫するステップは、第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、人工組織サンプルの表面に於いて第４の対象細胞型の第４の細胞の少なくとも一部分を露出し得る。方法は、上記の様式で人工組織サンプルを形成する前に又は後に、第１の無細胞基質を凍結する事も含み得る。

【0079】

本発明の或る種の実施形態に従うと、収穫するステップは、（ｉ）第１のＩＰＨＢのマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）第１の無細胞基質のＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）第３の境界面を形成する第３の境界面細胞の少なくとも一部分を、噛み合った又は隣接する第１のＩＰＨＢ並びに第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の細胞を露出し得る。

【0080】

本発明の或る種の実施形態に従うと、第４の対象細胞型は、哺乳類又は植物等の生物からの自然状態の細胞を含む。加えて又は代替的には、１つ以上のＩＰＨＢとの境界面を成す第１の無細胞基質を包含する複数の無細胞基質は、少なくとも１つの無細胞基質から様々であり得、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個の無細胞基質である。

【0081】

図２３～２６は無細胞基質を作る為の一般的方法を例解する。図２３は、其の中に３Ｄ印刷又は其の中に配設されたマイクロストランド及び／又はマイクロポッドのネットワーク７０５を有する直方体モールド７００を例解する。マイクロストランド及び／又はマイクロポッドのネットワーク７０５は、分解性の又は溶解性のハイドロゲル材料、例えば本明細書に於いて記載及び開示される物から形成され得る。図２４は、マイクロチャンネル及び／又はマイクロポッドのネットワーク上への対象細胞型７１０の播種、並びに直方体モールドに装填する為の対象細胞型の細胞外マトリックス７１２の成長を例解する。此れは少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び／又は少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を包含し得る（示されていない）。直方体モールドが細胞外マトリックス材料を装填された後に、図２５に例解される通り、脱細胞化組織７１５、及び中間体の無細胞基質７２０を形成する為のハイドロゲル材料（例えば、マイクロストランド及び／又はマイクロポッドのネットワーク）の其の後の分解又は溶解が生ずる。図２６は、凍結乾燥され、其の後に直方体モールドから取り除かれ、次に滅菌をされる中間体の無細胞基質を例解する。図２７は、本発明の或る種の実施形態に従って形成される齎される無細胞マトリックスを例解する。図２８～３１は、本発明の或る種の実施形態に従う複数の接合された無細胞基質の異なる構成７６０を例解する。図２８～３１に依って例解される通り、無細胞基質は、多数の異なる３Ｄ幾何形状で一緒に噛み合わせられ得るか又は別様に接合され得る。

【0082】

本発明の或る種の実施形態に従うと、無細胞基質を生産する方法は、液体が必要に応じて適用及び吸引されるユニークな閉鎖系のシステムを利用し得る。反転形状のハイドロゲルモールド（例えば、マイクロストランド及び／又はマイクロポッドのネットワーク）が、最初に立方センチメートルモールド内に置かれる。反転形状のハイドロゲルは、例えば、ＩＰＨＢの何れかの反転形状の構造であり得る。此れは対象の特定の組織形態に基づいて構成され得る。換言すると、ＩＰＨＢは、マイクロチャンネルのネットワークが其の中に延在するハイドロゲル材料の連続的なマトリックスを形成し得るが、無細胞基質は反対であろう（即ち、ハイドロゲル材料は、ＩＰＨＢのマイクロチャンネルに対応するマイクロストランドのネットワークを形成する為に用いられる）。反転形状のハイドロゲルモールド（例えば、マイクロストランド及び／又はマイクロポッドのネットワーク）の形成後に、滅菌生理食塩水が、其々約５分間持続して２回適用され得る。其の後、１ｍＬ当たり１００万個の細胞を含有する細胞培地が各モールド（即ち、マイクロストランド及び／又はマイクロポッドのネットワーク）に適用される。培地は、例えば４８時間毎に交換される。最小で７日後に、細胞培地は取り除かれ、モールドは滅菌生理食塩水に依って洗浄される。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びパーム脂肪酸Ｎａ（ＳＰ）が、穏やかな撹拌をし乍ら最高で７２時間、各モールドに適用される。ＳＤＳ及びＳＰは吸引され、ＥＣＭは滅菌脱イオン水（ＤＩ）に依って最高で７２時間透析される。其れから、ＥＣＭは－１７０℃～３７℃の間を６日間に亘って２４時間インクリメントで循環させる。ＳＤＳ及びＳＰが、穏やかな撹拌をし乍ら最高で７２時間、各モールドに適用される。ＳＤＳ及びＳＰが吸引され、ＥＣＭは滅菌ＤＩ水に依って最高で７２時間透析される。其れから、反転形状のモールドは光分解に依って溶解される。ＥＣＭは、ＵＶ光下に於いて６０分間持続して３回、滅菌生理食塩水及び１０％抗生物質に依って洗浄される。ＥＣＭは滅菌生理食塩水に依って洗浄される。其れから、ＥＣＭは保存の為にパッケージング及び凍結乾燥される。

【実施例】

【0083】

本開示を次の例に依って更に例解する。此れ等は決して限定していると解釈されるべきではない。詰まり、次の実施例に於いて記載される特定の特徴は単に例解的であり、限定はしていない。

【0084】

此の例では、脂肪に由来するＭＳＣ（ＡＳＣ）等のＭＳＣ集団の拡大培養のアウトカムを改善する３Ｄハイドロゲルシステムを実証する。カスタム可能な３Ｄハイドロゲルシステムをバイオプリンティングし、製剤して、生体不活性な基質にした。此れは自然状態の脂肪組織の力学に緻密に擬態した。最終的には、ＭＳＣ拡大培養及び生物製剤収集の為の調整のバイオリアクターの様に働く。ユニークな「パズルピース」マクロ構造デザインを有する３Ｄハイドロゲルシステムを構築した（例えば、複数ＩＰＨＢ）。此れは追加のハイドロゲル（例えば、１つのＩＰＨＢ）の容易な追加を可能にする。加えて、ユニークな多孔性のマイクロアーキテクチャデザインは、質量輸送を可能にし、細胞の遊走及び増殖を促進し、マイクロチャンネル内のハイドロゲル間の細胞遊走に依って、細胞を継代培養する必要性を排除する。生体不活性な基質の当初の利用は、生物活性な基質を導入する事無しに、ＡＳＣの老化及び幹細胞様の表現型特性に対する３Ｄシステムの機械及び寸法特性の潜在的役割の検討及び観察を可能にした。より柔軟な３Ｄハイドロゲル基質は、従来の２Ｄ培養方法に対して相対的に、ＡＳＣにとってより自然な機械的な環境を提供し、老化していない幹細胞様のＡＳＣ集団の保持を齎すであろうと思われた。其の上、ユニークなアーキテクチャデザインは、取り付けられたハイドロゲル（例えば、取り付けられたＩＰＨＢ）間の細胞遊走に依ってＡＳＣの連続的な拡大培養を可能にし、其れ故に、ネガティブな２Ｄ継代培養手順に対する細胞の暴露及び其の後の後遺症状を排除するであろう。

【0085】

材料及び方法
細胞培養
ロンザ（Lonza）（バーゼル、スイス）から得られたヒトＡＳＣ（ロット番号１８ＴＬ２１２６３９、２３歳女性、黒人）、ヒトケラチノサイト（ＫＣ；ロット番号１８ＴＬ３１８５５９、６２歳男性、白人）を此の研究に利用した。ＭＳＣ－ＧＭ間葉系幹細胞成長培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）をロンザ（Lonza）（＃ＰＴ－３００１）から得て、ＡＳＣに用いた。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦプラス培地キット（ステムセルテクノロジーズ（Stem Cell Technologies）、ブリティッシュコロンビア、カナダ；カタログ番号０５４４５）を無血清培地として用いた。ＤｅｒｍａＬｉｆｅ Ｋケラチノサイト培地コンプリートキットをライフラインセルテクノロジーズ（Lifeline Cell Technologies）（メリーランド、米国；＃ＬＬ－０００７）から得て、ＫＣに用いた。

【0086】

３Ｄ印刷されたハイドロゲル細胞培養システム
生体不活性な３Ｄハイドロゲルシステム（例えば、ＩＰＨＢ）は凡そ１×１×１ｃｍであり、ユニークなマイクロアーキテクチャデザインを含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づくシステムである。自然状態の脂肪軟部組織の力学に似通う様に作製され、３ヶ月間に亘って機械特性の有意な変化を実証しなかった。３Ｄハイドロゲルを培養の為にガラス６ウェル培養プレート上に置いた。フィブロネクチンは、其れ等の自然のフィブロネクチン分泌を原因として、ＡＳＣの為の普通に選択されるコーティング基質である。細胞はＰＥＧに基づくポリマーに効率的には接着しない／取り付かないので、２Ｄ培養プラスチック／ガラス及び３Ｄハイドロゲルの両方を５μｇ／ｃｍ^２の濃度のフィブロネクチンでコーティングして、当初の細胞取り付けを増強した。２Ｄ及び３Ｄシステムの間の内在的な表面積対体積の違いを原因として、フィブロネクチンの濃度を表面積に対して標準化した。３Ｄハイドロゲルの凡その表面積をバイオプリンティングに用いられた３Ｄモデルから計算した。

【0087】

ＡＳＣ及びＫＣの拡大培養
ＡＳＣ及びＫＣをＴ－１５０フラスコに播種し、継代培養（継代）前に約８０％コンフルエンス迄培養した。細胞の継代培養は、培養培地を取り除く事、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、マサチューセッツ、米国；カルシウム不含、マグネシウム不含）に依って３回洗浄する事、及び０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ロンザ（Lonza）；カタログ番号ＣＣ－３２３２）と３７℃で５分間インキュベーションする事に依って行った。トリプシンを血清に依って中和し、細胞を５００×ｇで５分間遠心し、其れからペレット化し、新たな２Ｄ組織培養プラスチック容器への再播種の為に再懸濁した。継代１（Ｐ１）のＡＳＣを、２Ｄ培養プラスチック上に、又はバイオプリンティングされた３Ｄハイドロゲル（例えば、ＩＰＨＢ）システム上／内に、ハイドロゲルの表面への濃縮された細胞溶液の滴下に依って再播種した。此のプロセスを残りの細胞溶液で５回繰り返して、効率的な細胞播種を保証した。此の繰り返し播種プロセスは、細胞がハイドロゲルシステム内のマイクロポーラス構造中に分配する事を可能にした。追加のハイドロゲルの取り付け及び増大した表面積が此の研究では継代培養の必要性を排除したという事から、継代相当時点を利用して２Ｄ培養との同様の比較を可能にした。其れ故に、継代イベントはＡＳＣの２Ｄ培養では典型的には４～５日毎に行われたが、３Ｄ培養では行われなかった。Ｐ２のＡＳＣの４～５日の２Ｄ培養後に、細胞を継代培養し、２ＤではＰ３であると見做し、３ＤのＡＳＣはＰ３継代相当と見做した。細胞数を標準化する為に、培養の拡大培養は、既知の２Ｄ及び３Ｄ表面積、当初の細胞播種密度、並びに２．２５日の平均の集団倍加時間（２Ｄに於いて実験的に決定された。データは示さない）に基づいてＡＳＣについて決定した。ＡＳＣをアッセイの為には５０００個の細胞／ｃｍ^２の標準化された濃度で播種した。培地追加はＡＳＣ拡大培養では１５０μｌ／ｃｍ^２に標準化して、２Ｄ及び３Ｄ培養の間の表面積対体積比の希釈上の違いを考慮した。

【0088】

ＡＳＣ表現型キャラクタリゼーション
ＭＳＣ幹細胞様表現型を、３つの主要なＭＳＣ表面マーカー（ＣＤ７３／９０／１０５）の免疫標識キャラクタリゼーションに依って、Ｐ１／２／６／１０のＡＳＣについて評価した。ＡＳＣをＴ－１５０フラスコに於いて連続的に継代培養するか、又は３Ｄハイドロゲルシステム内で拡大培養する事を可能にした。各夫々の継代時点に於いて、細胞を２Ｄでは約５０００個の細胞／ｃｍ^２の標準化された密度で９６ウェルガラス培養プレート（セルビス（Cellvis）、カリフォルニア、米国；カタログ番号Ｐ９６－１．５Ｈ－Ｎ）に２日間播種し、固定し、其れから、表面ＣＤマーカーの免疫標識に依ってＡＳＣ表現型について評価した。３Ｄ培養システムのＡＳＣでは、細胞をインサイチュで固定及び染色した。此の研究では、ＣＤ７３／９０／１０５の染色陽性及びＣＤ３４／４５の染色陰性を用いて幹細胞様のＭＳＣ表現型を示した。４％パラホルムアルデヒドに依る固定後に、細胞をＨＢＳＳに依って３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＨＢＳＳ中の１％ロバ血清）中に１時間置いた。ブロッキング後に、ＣＤ７３（アブカム（Abcam）、マサチューセッツ、米国；カタログ番号１３３５８２；１：１００）、ＣＤ９０（アブカム（Abcam）；カタログ番号１８１４６９；１：１００）、ＣＤ１０５（アブカム（Abcam）；カタログ番号２３１７７４；１：１００）、ＣＤ３４（アブカム（Abcam）；カタログ番号８１２８９；１：２００）、又はＣＤ４５（アブカム（Abcam）；カタログ番号４０７６３；１：２００）の一次抗体を追加し、細胞を４℃で一晩インキュベーションした。次の日に、細胞を３回洗浄し、二次抗体を１時間適用し、次に３回の追加の洗浄をした。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（インビトロジェン（Invitrogen）、マサチューセッツ、米国；カタログ番号Ｈ３５７０；１：１０００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ファロイジン（インビトロジェン（Invitrogen）；カタログ番号Ａ２２２８７；１：１０００）に依って対比染色した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；ＥＸ－３８０／３０、ＥＭ－４５０／５０）、フルオレセインイソチオシアネート（ＥＸ－４７０／４０、ＥＭ－５２５／５０）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＥＸ－５６０／４０、ＥＭ－６３０／７５）、及びＣｙ５（ＥＸ－６３０／４０、ＥＭ－７００／７５）（エコー（Echo）、カリフォルニア、米国）のフィルター、並びに２０×対物レンズ（オリンパス株式会社、東京、日本；ＵＰｌａｎＳＡｐｏ、０．７５ＮＡ）を用いて、免疫蛍光をＲｅｖｏｌｖｅ顕微鏡に依って評価した。ＡＳＣ幹細胞様の表現型定量を四反復で実施し（ｎ＝４）、画像を、生物学的反復当たり（２Ｄ＝ウェル当たり、３Ｄ＝ハイドロゲル当たり）、合計で１０個のランダムな視野から取って、各サンプルについて最高で４０個の合計の測定値を達成した。合計の核を計数し、合計の陽性細胞を評価した。ファロイジン対比染色を用いて、染色陽性の特定を助けた。Ｐ１でキャラクタリゼーションされたＡＳＣを比較の為のベースラインとして用いた。

【0089】

ＡＳＣ老化のキャラクタリゼーション
上のＡＳＣ表現型解析方法と同様に、ＡＳＣ老化の評価を行った。其れ等を９６ウェルガラス培養プレートに播種する各夫々のアッセイ時点迄、ＡＳＣをＴ－１５０培養フラスコで連続的に継代培養した。９６ウェルプレート上のＡＳＣが、血清に基づく培地で２日間順化する事を可能にし、固定し、其れから、老化活性について、β－ガラクトシダーゼ活性の免疫蛍光標識に依って、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｇｒｅｅｎ検出キット（インビトロジェン（Invitrogen）；カタログ番号Ｃ１０８５０）に依って、製造者の説明書に従って評価した。３ＤシステムのＡＳＣをＰ２／６／１０継代相当時点に於いて同時に評価した。上の方法と同様に、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ及びファロイジンに依って対比染色した。老化キャラクタリゼーションは四反復で実施し（ｎ＝４）、画像を生物学的反復当たり合計で１０個のランダムな視野から取って、サンプル当たり最高で４０個の合計の測定値を達成した。合計の核を計数し、合計の老化した陽性及び陰性細胞を決定した。

【0090】

ＡＳＣ馴化培地の単離
ＡＳＣ拡大培養の為の培地追加を標準化して、２Ｄ及び３Ｄ培養の間の表面積対体積比の希釈上の違いを考慮した。培地は２日毎に交換した。ＡＳＣ馴化培地（ＡＳＣ－ＣＭ）収集の為には、ＭＳＣ－ＧＭを取り除き、細胞をＨＢＳＳに依って３回洗浄し、其れから、収集前に無血清ＭＳＣ培地で４８時間培養した（２Ｄ及び３Ｄ培養両方で）。其れから、収集されたＡＳＣ－ＣＭを１５００×ｇで１０分間遠心して、細胞デブリを排除し、０．２２μｍフィルターでステリフリップ濾過し、使用迄－８０℃で保存した。

【0091】

ＡＳＣ－ＣＭ処置後のＫＣ活性
ＡＳＣ－ＣＭを上のプロトコールに従って各夫々の時点に於いて収集した。其れから、ＡＳＣ－ＣＭをＫＣ上に最高で２４時間置いて、代謝、増殖、又は遊走活性を調節する其の能力を評価して、ＡＳＣ－ＣＭの創傷治癒性能を評価した。此れ等の研究の為には、ＡＳＣ－ＣＭをＫＣ成長培地と１：１比で追加した。実験アッセイを製造者の説明書に従って行った。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ蛍光を５６０／５９０ｎｍで得（ｎ＝４）、２４時間のＡＳＣ－ＣＭ処置後の代謝活性の評価に用いた。細胞数の可能性としての違いをコントロールし、細胞当たりの凡その代謝活性を得る為に、ＨｏｅｃｈｓｔをＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅサンプルに追加し、値をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ／Ｈｏｅｃｈｓｔシグナルの平均の相対的蛍光単位値として表示した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光を４８５／５３５ｎｍで得て（ｎ＝４）、２４時間のＡＳＣ－ＣＭ培養後のＫＣ増殖のサロゲート測定として細胞数の評価に用いた。９６ウェルプレート当たりの合計の細胞数を、７．７ｐｇ／細胞の平均ＤＮＡ含量に基づいて計算した。ＫＣスクラッチアッセイを行って、ＫＣ遊走のサロゲート測定として創傷サイズの変化を評価した（ｎ＝３）。遊走画像はＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロＸＬＳイメージングシステム（モレキュラーデバイス（Molecular Devices）、カリフォルニア、米国）を用いて撮影した。創傷全体を各創傷三反復についてイメージングし、創傷三反復当たり３つの異なる創傷領域を用いて創傷面積を計算した。３つの創傷面積値を各群について三反復当たり且つ時点当たり平均化し、パーセンテージの回復創傷面積として表示した（ｎ＝３）。

【0092】

統計分析
全てのデータは平均の標準誤差の平均として報告する。老化及びＣＤマーカーの免疫標識に依るＡＳＣ集団のキャラクタリゼーション分析は、二元配置分散分析に依って評価した。ＫＣ代謝、増殖、及び遊走活性は二元配置分散分析に依って評価した。データはシャピロ－ウィルク及びコルモゴロフ－スミルノフ検定に依って正規性を検定し、ＱＱプロットでプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ－Ｐｒｉｓｍ ９．０．２ソフトウェア（グラフパッド（GraphPad）、カリフォルニア、米国）を分析に用い、ｐ値＜０．０５を有意と見做した。

【0093】

結果
ユニークな３Ｄハイドロゲル（ＩＰＨＢ）デザインは継代培養を排除する
約１ｃｍ^３の３Ｄ印刷されたハイドロゲルシステムはユニークな「パズルピース」マクロ構造を含有し、此れは追加のハイドロゲルの連続的な追加を可能にし（図３２Ａ）、一次的な播種されたハイドロゲルから新たに取り付けられたハイドロゲル内への細胞の遊走を促進する（図３２Ａ及びＢ）。ＡＳＣを単一のハイドロゲルシステム内／上で２週間培養し、ハイドロゲル中に遊走する事を可能にした。其の後に、追加のハイドロゲルを５日間追加し、細胞が新たに取り付けられたハイドロゲルに遊走する事を可能にした。其れから、細胞を染色し、２つのハイドロゲルの間の遊走及び増殖について評価した（図３２Ｂ）。ＡＳＣは内部構造内の表層の表面を越えて多孔性のチャンネルを内張りする事が見られており、ハイドロゲル細孔内でネットワークを形成する事が見られ得る（図３２Ｂ及びＣ）。細胞は、取り付けられたハイドロゲルの表面上及びマイクロチャンネル内の両方を遊走する事ができており、遊走を助ける為に細胞から突き出る多数の細胞突起及び接着斑がある事が見られ得る（図３２Ｃ）。３ＤのＡＳＣの相互作用及びハイドロゲルマイクロアーキテクチャ内の３Ｄネットワークの形成が容易く同定された。顕著には、ＡＳＣは、ハイドロゲルの表面を内張りし、細孔チャンネルの１つの中に遊走する事が見られ得た。最終的には、３つの次元に於いて細孔内の他の細胞集団と相互作用する。

【0094】

経時的な３Ｄハイドロゲルに於ける幹細胞様のＭＳＣ表面マーカーの保持
経時的な幹細胞様のＡＳＣ集団の評価を、ＣＤマーカーＣＤ７３／９０／１０５の免疫標識定量に依って行った（図３３Ａ）。幹細胞様のＣＤマーカーの存在率は２Ｄ及び３Ｄシステム両方で経時的に低下した。然し乍ら、２Ｄ培養は、３Ｄシステムに対して相対的に、有意に増強された此れ等のマーカーの損失率を有した（図３３Ｂ）。同様に、２Ｄ及び３Ｄシステム両方で経時的に染色陽性細胞の強度の明らかな減少があった。３Ｄシステムに於ける培養は、ＣＤ１０５の当初のＰ２比較を例外として、全ての３つの陽性幹細胞様マーカーについて全ての継代時点で有意な保持を齎した。Ｐ６及びＰ１０に於ける３ＤのＡＳＣをＰ２に於ける２ＤのＡＳＣに対して比較する時には、２Ｄ培養に於ける幹細胞様表現型の有意な損失が明瞭に見られ得る（図３３Ｂ）。３Ｄでは５又は９継代相当（即ち、夫々Ｐ６又はＰ１０について３Ｄシステムでは３又は６週）、２Ｄでは僅か１継代イベント（Ｐ１に於いて播種された）の過程に於いて、ＡＳＣは複数のＣＤマーカーについて類似の発現パターンを有した。Ｐ２に於ける２ＤのＣＤ１０５に対して相対的に、Ｐ１０に於けるＣＤ１０５の３Ｄ発現の間の有意な違いのみがあった（図３３Ｂ）。両方のシステムは、ＣＤ３４及びＣＤ４５マーカーの染色陽性細胞の低集団（＜５％）を維持した。

【0095】

経時的な３Ｄハイドロゲルに於ける老化の誘導遅延
経時的な老化したＡＳＣ集団の存在率を、細胞老化の一般的に利用されるサロゲート測定のβ－ガラクトシダーゼ活性の蛍光標識に依って評価した（図３４Ａ）。β－ガラクトシダーゼ活性のベースライン発現はＰ２に於いては２Ｄ及び３ＤのＡＳＣの両方で約５％であった。２Ｄに於ける複数の継代イベントの過程に於いて、老化は２Ｄでは有意に増大し、夫々Ｐ６及びＰ１０に於いて１１．７及び２２．５％の老化した細胞であった（図３４Ｂ）。反対に、３Ｄシステムでは、此の研究の経過（６週）では、ＡＳＣ集団に於ける経時的な老化の存在率の有意な変化はなかった（図３４Ｂ）。同様に、３Ｄシステムに対して、２Ｄシステムの細胞形態の顕著な違いがあった。より具体的には、２ＤのＡＳＣはより平坦化されている様に見え、より不均一な形態的分布と、培養中の経時的な細胞サイズの明らかな増大とを有するが、３ＤのＡＳＣはより均一な形態を維持し、細胞のサイズ又は形態の観察可能な変化はなかった。

【0096】

ＡＳＣ馴化培地の創傷治癒能力の保持
二次細胞集団を調節するＡＳＣ－ＣＭの機能的な能力の評価を利用して、ＡＳＣ集団表現型とＫＣの創傷治癒活性を促進する能力との間の動的な相互関係性を実証した（図３５Ｄ）。ＫＣを、各夫々の時点からの２Ｄ又は３ＤのＡＳＣ－ＣＭの何れかに依って最高で２４時間処置した。２Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭに依って処置されたＫＣは、Ｐ２に対して相対的に、Ｐ６及びＰ１０のＡＳＣ－ＣＭに依って処置された時に、回復創傷面積の有意な落ち込みを示した。Ｐ２に対して相対的に、Ｐ１０からの３ＤのＡＳＣ－ＣＭで観察されるＫＣ遊走活性の軽度の減少も認められた（図３５Ａ及びＢ）。総体的に、３ＤのＡＳＣ－ＣＭは、其れ等の２ＤのＡＳＣ－ＣＭカウンターパートに対して相対的に、ＫＣ遊走を増強し其れ等の夫々の創傷を閉じる有意に高い能力を維持した。ＫＣの代謝活性は、２Ｄ拡大培養された細胞からのＡＳＣ－ＣＭに依って処置された時には減少傾向を実証し、Ｐ１０ではＰ２のＡＳＣ－ＣＭに対して相対的に有意な減少が認められた（図３５Ｃ）。経時的な３Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭでは有意な違いは観察されなかった。同様に、２Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭに依って処置されたＫＣの増殖活性は減少傾向を実証し、Ｐ１０及びＰ２のＡＳＣ－ＣＭの間では有意な違いがあったが、ＫＣが３Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭに依って処置された時には有意な変化は認められなかった（図３５Ｄ）。其の上、Ｐ６及びＰ１０からの３ＤのＡＳＣ－ＣＭに依って処置されたＫＣの増殖活性は、其れ等の２ＤのＡＳＣ－ＣＭカウンターパートよりも有意に高かった。

【0097】

考察
ＭＳＣの内在的な再生特性は、再生医療及び組織工学の技術分野を前進させる事から大いなる関心を集めている。然し乍ら、ＭＳＣは典型的には、第１にドナー組織源から取り除かれ、体外で、ヒト組織の自然状態でない人工的な環境に於いて培養されなければならない。今迄の所、市販のインビトロ拡大培養システムは本質的に殆ど専ら２Ｄである。硬質な２Ｄシステムは細胞にとって非生理的であり、急速に、ＭＳＣの複能性幹細胞様の特徴の損失を、其の後の生存性の損失及び老化の誘導と共に齎す。此れ等の変化は、再生性能が有意に縮減されたＭＳＣ集団に至らせる。此れは標準化された細胞培養条件の欠如に依って複雑化し、再生治療の成長及び開発に於ける有意なボトルネックを作り出す。其れ故に、３Ｄであり且つ其れ等の機械、アーキテクチャ、及び基質組成特性がより組織擬態的であり、最終的には継代培養の連続的な必要性等の従来の２Ｄ培養の限定の多くを回避し得るＭＳＣ拡大培養の為の培養システムを開発する重大な必要性がある。

【0098】

３Ｄシステムの最近の前進は、より幹細胞様であるＭＳＣ集団の生産の方への進歩を実証している。然し乍ら、３Ｄシステム、例えばスフェロイド、オルガノイド、マイクロスフェア、及び多くの足場システムは、典型的には、其れ等の細胞／組織源の自然状態の力学（例えば、ＡＳＣでは脂肪の力学）を緻密には擬態せず、多くの場合に、臨床上の使用の為の大量の細胞数を達成する為の大きいバイオリアクターシステム及び連続的な継代培養を要求する。然し乍ら、組織工学に依るハイドロゲルシステムは、細胞培養システムの為の調整可能な組織擬態的なシステムを生産する事に向けて有利である様に見える。より具体的には、ハイドロゲルのより柔軟な基質に対するメカノトランスダクション応答は、幹細胞様の特徴の保持を助けると考えられる。残念乍ら、大部分の現在のハイドロゲルシステムは、細胞が長期拡大培養の為に幹細胞様表現型を維持する事を可能とする様にではなく、特定の組織系列の方への幹細胞のコントロールされた分化を促進する様に製造されている。最終的には、理想的なＭＳＣハイドロゲル拡大培養システムは、老化から保護し乍ら、再生幹細胞様表現型の保持をも改善し、最小限の継代培養又はユーザ介入に依って長期拡大培養を可能にするであろう。

【0099】

ＭＳＣに基づく治療は有望さを実証し、１０００超の治験が今迄の所米国ＦＤＡのリストに入っているが、其れ等は先に考えられた程速やかには前進していない。此れは、少なくとも部分的には、老化したＭＳＣ集団が組織再生に対して有し得る有害なインパクトを原因とすると見做される。老化は典型的にはＤＮＡ及び／又は酸化ダメージを原因とする細胞周期の停止の進行性の形態であり、此れはＤＮＡ修復モダリティが損なわれたＭＳＣを齎す。此れ等は最早増殖せず、複能性の損失を示す。其の上、老化したＭＳＣは、血管新生を損なう事、酸化ストレスを増大させる事、及び因子の分泌に依って炎症を悪化させる事に依って、組織再生及び創傷治癒にネガティブなインパクトを及ぼす因子を分泌する事が示されており、老化に関連する分泌表現型として公知である。此の表現型の組成は不均一であり得、老化誘導のメカニズム及び環境刺激に依存的である。因って、此れは、蓋然的には、細胞に基づく及び無細胞系の治療の両方で治験に於いて見られる患者のアウトカムの不均一性に寄与する。其れ故に、患者の為に意図される健康な同種又は自家ＭＳＣ集団の老化の誘導を限定／防止するインビトロ培養の拡大培養システムを開発する事は、ＭＳＣに基づく臨床治療の効力及び一貫性を改善するであろう。

【0100】

此の現在の実施例では、従来の２Ｄ培養システムに於けるＡＳＣの培養は、先に文献で確立された通り老化の有意な増大を齎した。反対に、本発明の或る種の実施形態に従う３Ｄハイドロゲルシステムは、６週間の研究の過程（即ち１０継代相当）に於いてＡＳＣ集団の老化の有意な変化を齎さなかった。其の上、細胞の形態及びサイズの変化は表現型の変化の指標となり得る。２ＤのＡＳＣで見られる細胞サイズの明らかな増大は、老化の誘導と関連し得、其れ故に、β－ガラクトシダーゼイメージングデータ及び先行文献を更に支持する。総体的に、此れ等のデータは、３Ｄの培養及び基質の力学が老化からの保護的な役割を維持するという先の仮説を支持する。然し乍ら、本発明の或る種の実施形態に従う３Ｄハイドロゲルシステム（ＩＰＨＢ）では、継代培養の必要性は排除され、分泌副産物は、多孔性のマイクロアーキテクチャを欠如するより従来の注型成形／モールド成形ハイドロゲルに対して、より容易く利用可能である。

【0101】

同様に、ＭＳＣの幹細胞様の表現型は、其れ等の再生ポテンシャルにとって重大であり、細胞の培養環境に依存して急速に変化し得る。分化し其れ等の幹細胞様の特徴を失うＭＳＣ集団は、細胞表現型のばらつき及びセクレトーム組成の変調を齎し、最終的には細胞系及び無細胞系両方の再生ＭＳＣ治療の一貫性を減少させる。其れ故に、ＡＳＣ等のＭＳＣ集団は、多くの場合に、再生ポテンシャルの損失を回避する為の試み上、少数の継代イベント以内でのみ用いられる。然し乍ら、此の実施例に見る通り、２Ｄ培養の追加の１継代イベント以内でさえも、ＡＳＣは幹細胞様マーカーの其れ等の発現を有意に変調させる。其の上、３Ｄ培養に於いて６又は１０継代相当（即ちＰ６又はＰ１０）に亘って６週間超拡大培養されたＡＳＣは、ベースラインＰ２のＡＳＣに対して相対的に数個のマーカーの類似の発現レベルと、其れ等の夫々の２Ｄカウンターパートに対して相対的に高い発現とを維持し、ＭＳＣ集団に対する２Ｄ培養システムの有害な効果と３Ｄ培養の可能性としての保護効果とを更に強調した。より長い期間に渡るＭＳＣ集団内の幹細胞様特性の保持を改善する能力は、細胞治療、再生組織工学、免疫治療、及び分泌される生物製剤の生産を包含する多数の用途にとって望ましい。

【0102】

先に言及された通り、最近のＭＳＣ治療は、可能性としての再生治療としての生物製剤を検討する事に拡張している。ＭＳＣ集団は本質的に高度に適応性であり、其れ等の周囲の環境刺激を感知し、然るべく因子を分泌する事が公知である。其れ故に、分泌される生物活性化合物は、自己分泌、パラ分泌、又は内分泌的な様式で種々の組織修復プロセスを調和及び橋渡しする様に働く。此の研究では、３Ｄシステムに対して２Ｄで培養されたＡＳＣからの馴化培地を経時的に収集し、二次細胞集団ＫＣの治療として、創傷治癒活性を促進する事に向けてＡＳＣセクレトームの表現型を機能評価する為の手段として利用した。ＡＳＣ表現型は２Ｄ培養では経時的に劣化するが３Ｄシステムでは持続するという仮説の下で作業する本発明者等は、２Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭの再生性能では徐々に低下を見せるが、３Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭでは最小限の変化を見る事を予想した。此の仮説は、ＡＳＣ－ＣＭに依って処置されたＫＣの代謝、増殖、及び遊走データに依って支持された。２Ｄ培養からのＡＳＣ－ＣＭは、ＫＣ活性を増加させる能力の着実な低下を実証し、実施例の過程に於いて其の３Ｄカウンターパートに依って一貫して上回られた。

【0103】

此の実施例の限定は、生物活性な基質の何れかの寄与を排除する為に意図的に生体不活性であるハイドロゲルシステムの製剤を包含する。其れ故に、其れは分解性ではなかった。結果として、此の製剤からの細胞の充分な除去は実現可能ではなかった。因って、免疫蛍光標識をフローサイトメトリー又はＲＮＡ分析の代替として利用して、ＭＳＣ集団の老化及び表現型を実証した。然し乍ら、其れ等を再懸濁する必要無しにＭＳＣ等の接着性の集団のインサイチュ可視化を行う能力は、サイトメトリーと比べて免疫標識の利点である。其の上、２Ｄ及び３Ｄ培養の間の相対的な比較は、ＡＳＣ－ＣＭの機能データとペアになって、免疫標識データを補強する支持的な且つ全体観的な視点を提供する事を助ける。但し、セクレトームのより包括的な分析が、定性的及び定量的変化の両方を評価する為には必要とされる。

【0104】

結論
此の実施例では、より緻密に其れ等の自然状態の組織の力学に似通うシステムに依ってＭＳＣを培養する事の利益を実証する為に、３Ｄハイドロゲルシステムの首尾良い使用を例解している。３Ｄシステムはユニークなアーキテクチャデザインを含有し、此れは、取り付けられたハイドロゲル内及び間の細胞の移動をも可能にし乍ら、有効な質量及び流体輸送を妨害せず、事実上、細胞を継代培養する必要性を排除する連続的な３Ｄ培養システムを提供する。連続性は、２つのパズルピースを一緒に取り付けるように、先に播種されたハイドロゲルへの追加のハイドロゲルの追加に依って達成される。多孔性のマイクロアーキテクチャは、細胞がｘ、ｙ、及びｚ平面に於いて相互作用し、取り付け点に於ける表面遊走に加えてハイドロゲル内及び間を遊走する為の「トンネル」システムを作り出す。

【0105】

本発明の此れ等の及び他の改変及び変形は、添付の請求項に於いてより特定して示される本発明の主旨及び範囲から逸脱する事無しに、当業者に依って実施され得る。加えて、種々の実施形態の態様が全体的に又は部分的に交換され得るという事は理解されるべきである。更に其の上、当業者は、上述の記載はあくまで例としてであり、斯かる添付の請求項に更に記載される通りの本発明を限定する事は意図されないという事を理解するであろう。因って、添付の請求項の主旨及び範囲は、本明細書に含有される変形物の例示的な記載に限定されるべきではない。

【符号の説明】

【0106】

１ 第１のＩＰＨＢ
２ 第２のＩＰＨＢ
１０ 連続的なポリマーマトリックス材料
１２ 上面
１４ 底面
１６ 側面エッジ部
３０ マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク
３３ 細胞
５０ 噛み合わせオス構成要素
５１ 第１の噛み合わせオス構成要素
５２ 第２の噛み合わせオス構成要素
５３ 上面に在る噛み合わせオス構成要素
６０ 噛み合わせメス構成要素
６１ 第１の噛み合わせメス構成要素
６２ 第２の噛み合わせメス構成要素
６３ 底面の中に突き出る噛み合わせメス構成要素
１００ 半円柱形状のＩＰＨＢ
１１２ 上面
１１４ 底面
１１６ 第１の側面エッジ部
１１８ 第２の側面エッジ部
１１９ 弓形の側面エッジ部
１５０ 第２の側面エッジ部から延在する第１の噛み合わせオス構成要素
１５３ 上面に在る噛み合わせオス構成要素
１６０ 第２の側面エッジ部の中に突き出る第１の噛み合わせメス構成要素
１６３ 底面の中に突き出る噛み合わせメス構成要素
２１０ ステップ
２３０ ステップ
２４０ ステップ
２５０ ステップ
３００ 当初に播種されたＩＰＨＢ
３０２ 二次的なＩＰＨＢ
３０４ 三次的なＩＰＨＢ
３０８ 四次的なＩＰＨＢ
４１０ 噛み合った空のＩＰＨＢ
４２０ 播種されたＩＰＨＢ
４２５ 播種されたＩＰＨＢ
４３０ 播種されたＩＰＨＢ
４３５ 播種されたＩＰＨＢ
４４０ 播種されたＩＰＨＢ
４４５ 播種されたＩＰＨＢ
４５０ 播種されたＩＰＨＢ
４５５ 播種されたＩＰＨＢ
７００ 直方体モールド
７１０ 対象細胞型
７１２ 細胞外マトリックス
７１５ 脱細胞化組織
７２０ 中間体の無細胞基質
７５０ 無細胞マトリックス
７６０ 複数の接合された無細胞基質の異なる構成

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図35D】

【手続補正書】

【提出日】2024-08-29

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織のエクスビボの細胞の成長の方法であって：
（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、前記複数のＩＰＨＢの其々が、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される夫々の三次元（３Ｄ）マクロ構造と、前記夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークとを包含し、此処で、前記夫々の３Ｄマクロ構造が、其々、夫々の上面と、夫々の底面と、前記夫々の上面から前記夫々の底面まで延在する少なくとも１つの夫々の側面エッジ部に依って画定される夫々の厚さとを含み、此処で、前記夫々の３Ｄマクロ構造の構造が、其々、少なくとも１つの夫々の噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの夫々の噛み合わせメス構成要素を包含する事、
（ｉｉ）前記第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、
（ｉｉｉ）前記第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種し、此処で、前記第１の対象細胞型が前記第２の対象細胞型とは異なる事、
（ｉｖ）前記第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、前記第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて前記第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、
（ｖ）前記第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、前記第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて前記第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに
（ｖｉ）前記第１の細胞型及び前記第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事、
を含む、組織のエクスビボの細胞の成長の方法。

【請求項2】

前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワークが、第１の構造と、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワークとを有し、此処で、前記第１の構造が前記第２の構造とは異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方が、（ｉ）約１００～約８００ミクロンを含む平均直径、例えば次の何れか：少なくとも約１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、及び２５０ミクロン、並びに／又は次の何れか：多くとも約８００、７８０、７５０、７２０、７００、６８０、６５０、６２０、６００、５８０、５５０、５２０、５００、４８０、４５０、４２０、４００、３８０、３５０、３２０、３００、２８０、及び２５０ミクロンを有し、（ｉｉ）互いに独立して、前記夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０体積％、例えば次の何れか：前記夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０、５０、６０、及び７０体積％から、並びに／又は次の何れか：前記夫々の３Ｄマクロ構造の多くとも約９０、８５、８０、７５、及び７０体積％を含み、又は、（ｉｉｉ）上記（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料、及び／又は、前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が、非分解性のハイドロゲル材料、又は、選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方が、１つ以上の合成ポリマー、例えば石油に由来する合成ポリマーを含む非分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方が、１つ以上の分解性のポリマー、例えば生物に由来する１つ以上のバイオポリマーを含む選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記１つ以上のバイオポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、アルギン酸、グリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、脂質、セルロース、アルギン酸、及び蛋白質を含み、此れ等が、バイオポリマー鎖を壊す為の、例えば蛋白質特異的酵素、イオン性溶媒、中性界面活性剤、弱酸、及び過酸化物の使用に依って穏やかに分解され得る、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

更に、第３のＩＰＨＢを直接的に前記第２のＩＰＨＢに噛み合わせる事、及び前記第３のＩＰＨＢに第３の対象細胞型を播種する事を含み、此処で、前記第３の対象細胞型が前記第１の対象細胞型及び前記第２の対象細胞型とは異なり、更に、前記第３の対象細胞型に第３の培養培地を供給し、前記第３の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に於いて前記第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にするステップと、前記第１の細胞型及び前記第２の細胞型の間の第２の境界面を形成するステップとを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

更に、前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、前記第１のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、前記人工組織サンプルの表面に於いて前記第１の対象細胞型の前記細胞の少なくとも一部分を露出する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

更に、人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記第１のＩＰＨＢを凍結する事を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、（ｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）前記第２のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に在る前記第２の対象細胞型からの第２の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）前記第１の境界面を形成する第１の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記細胞を露出する、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを凍結する事を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第３のＩＰＨＢの前記第３の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、加えて、（ｉｖ）前記第３のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に在る前記第３の対象細胞型からの第３の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｖ）前記第２の境界面を形成する第２の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、前記各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｖ）の前記細胞を露出する、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを凍結する事を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項16】

前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を前記収穫するステップが、（ｉ）其れ等を前記第１のＩＰＨＢから液体媒体に依って流し出す事を含み、又は、（ｉｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記３Ｄマクロ構造を分解する事を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項17】

（ｉ）前記第１の対象細胞型が第１の対象治療薬、例えば第１の生物製剤を生産又は分泌し、（ｉｉ）前記第２の対象細胞型が第２の対象治療薬、例えば第２の生物製剤を生産又は分泌し、（ｉｉｉ）前記第３の対象細胞型が第３の対象治療薬、例えば第３の生物製剤を生産又は分泌し、あるいは、（ｉv）上記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の任意の組み合わせである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

更に、第１の無細胞基質を直接的に前記第１のＩＰＨＢに隣接して又は直接的に前記第１のＩＰＨＢ及び前記第２のＩＰＨＢの間に配置する事又は噛み合わせる事を含み、此処で、前記第１の無細胞基質は、第１の対象細胞型に関連する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の連続的なマトリックスに依って画定される無細胞３Ｄマクロ構造と、第１の対象細胞型に関連する前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとを含み、此処で、前記無細胞３Ｄマクロ構造は、上面と、底面と、前記上面から前記底面まで延在する少なくとも１つの側面エッジ部に依って画定される厚さとを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第１の無細胞基質が、更に、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を含み、更に、前記第１の無細胞基質に第４の対象細胞型を播種する事を含み、此処で、前記第４の対象細胞型が前記第１の対象細胞型及び前記第２の対象細胞型とは異なる、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

更に、前記第４の対象細胞型に第４の培養培地を供給し、前記第４の対象細胞型が、前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在する前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に於いて前記第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事を含み、更に、前記第１の対象細胞型及び前記第４の対象細胞型の間の第３の境界面を形成する事を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

更に、前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在する前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る前記第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含み、前記収穫するステップが、前記第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、前記人工組織サンプルの表面に於いて前記第４の対象細胞型の前記第４の細胞の少なくとも一部分を露出する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記収穫するステップが、（ｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）前記第１の無細胞基質の前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る前記第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）前記第３の境界面を形成する第３の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った又は隣接した第１のＩＰＨＢ及び第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記細胞を露出する、請求項２１に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0105】

本発明の此れ等の及び他の改変及び変形は、添付の請求項に於いてより特定して示される本発明の主旨及び範囲から逸脱する事無しに、当業者に依って実施され得る。加えて、種々の実施形態の態様が全体的に又は部分的に交換され得るという事は理解されるべきである。更に其の上、当業者は、上述の記載はあくまで例としてであり、斯かる添付の請求項に更に記載される通りの本発明を限定する事は意図されないという事を理解するであろう。因って、添付の請求項の主旨及び範囲は、本明細書に含有される変形物の例示的な記載に限定されるべきではない。
〔付記１〕
組織のエクスビボの細胞の成長の方法であって：
（ｉ）第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを包含する複数のインターロッキング多孔性ハイドロゲルブロック（ＩＰＨＢ）を一緒に噛み合わせ、此処で、前記複数のＩＰＨＢの其々が、夫々の連続的なポリマーマトリックス材料に依って画定される夫々の三次元（３Ｄ）マクロ構造と、前記夫々の連続的なポリマーマトリックス材料中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの夫々のネットワークとを包含し、此処で、前記夫々の３Ｄマクロ構造が、其々、夫々の上面と、夫々の底面と、前記夫々の上面から前記夫々の底面まで延在する少なくとも１つの夫々の側面エッジ部に依って画定される夫々の厚さとを含み、此処で、前記夫々の３Ｄマクロ構造の構造が、其々、少なくとも１つの夫々の噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの夫々の噛み合わせメス構成要素を包含する事、
（ｉｉ）前記第１のＩＰＨＢに第１の対象細胞型を播種する事、
（ｉｉｉ）前記第２のＩＰＨＢに第２の対象細胞型を播種し、此処で、前記第１の対象細胞型が前記第２の対象細胞型とは異なる事、
（ｉｖ）前記第１の対象細胞型に第１の培養培地を供給し、前記第１の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に於いて前記第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、
（ｖ）前記第２の対象細胞型に第２の培養培地を供給し、前記第２の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に於いて前記第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事、並びに
（ｖｉ）前記第１の細胞型及び前記第２の細胞型の間の第１の境界面を形成する事、
を含む、組織のエクスビボの細胞の成長の方法。
〔付記２〕
前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワークが、第１の構造と、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワークとを有し、此処で、前記第１の構造が前記第２の構造とは異なる、付記１に記載の方法。
〔付記３〕
前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方が、約１００～約８００ミクロンを含む平均直径、例えば次の何れか：少なくとも約１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、及び２５０ミクロン、並びに／又は次の何れか：多くとも約８００、７８０、７５０、７２０、７００、６８０、６５０、６２０、６００、５８０、５５０、５２０、５００、４８０、４５０、４２０、４００、３８０、３５０、３２０、３００、２８０、及び２５０ミクロンを有する、付記１～２に記載の方法。
〔付記４〕
前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク、前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク、或いは其の両方が、互いに独立して、前記夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０体積％、例えば次の何れか：前記夫々の３Ｄマクロ構造の少なくとも約４０、５０、６０、及び７０体積％から、並びに／又は次の何れか：前記夫々の３Ｄマクロ構造の多くとも約９０、８５、８０、７５、及び７０体積％を含む、付記１～３に記載の方法。
〔付記５〕
前記第１のＩＰＨＢの第１の連続的なポリマーマトリックス材料が、非分解性のハイドロゲル材料又は又は選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、付記１～４に記載の方法。
〔付記６〕
前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が、非分解性のハイドロゲル材料又は選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、付記１～５に記載の方法。
〔付記７〕
前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方が、１つ以上の合成ポリマー、例えば石油に由来する合成ポリマーを含む非分解性のハイドロゲル材料を含む、付記５～６に記載の方法。
〔付記８〕
前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料、又は其の両方が、１つ以上の分解性のポリマー、例えば生物に由来する１つ以上のバイオポリマーを含む選択可能に分解性のハイドロゲル材料を含む、付記５～６に記載の方法。
〔付記９〕
生物に由来する前記１つ以上のバイオポリマーがポリヌクレオチド、多糖、ポリペプチド、又は其れ等の何れかの組み合わせを含む、付記８に記載の方法。
〔付記１０〕
前記１つ以上のバイオポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、アルギン酸、グリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、脂質、セルロース、アルギン酸、及び蛋白質を含み、此れ等が、バイオポリマー鎖を壊す為の、例えば蛋白質特異的酵素、イオン性溶媒、中性界面活性剤、弱酸、及び過酸化物の使用に依って穏やかに分解され得る、付記８～９に記載の方法。
〔付記１１〕
前記１つ以上のバイオポリマーが、エステル、例えばヒドロキシブチレート、乳酸、グリコール酸、及びカプロラクトン、酸無水物、例えばアジピン酸及びセバシン酸、糖、例えばセルロース、アルギン酸、ペクチン、デキストリン、キトサン、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、及びヘパリン、蛋白質、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、例えばコラーゲン、ゼラチン、絹、及びフィブリン、ウレタン、ホスフェート、カーボネート、並びに塩化ビニルを含む分解性のモノマーを含む、付記８～１０に記載の方法。
〔付記１２〕
前記選択可能に分解性のハイドロゲル材料が、更に、合成ポリマー、例えばポリエステル、ポリ酸無水物、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリホスフェート、又は其れ等の組み合わせを含む、付記８～１１に記載の方法。
〔付記１３〕
前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料から形成され、前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が選択可能に分解性のハイドロゲル材料から形成される、付記１～１２に記載の方法。
〔付記１４〕
更に、第３のＩＰＨＢを直接的に前記第２のＩＰＨＢに噛み合わせる事、及び前記第３のＩＰＨＢに第３の対象細胞型を播種する事を含み、此処で、前記第３の対象細胞型が前記第１の対象細胞型及び前記第２の対象細胞型とは異なる、付記１～１３に記載の方法。
〔付記１５〕
更に、前記第３の対象細胞型に第３の培養培地を供給し、前記第３の対象細胞型がマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に於いて前記第２のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にするステップと、前記第１の細胞型及び前記第２の細胞型の間の第２の境界面を形成するステップとを含む、付記１４に記載の方法。
〔付記１６〕
更に、前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含む、付記１～１５に記載の方法。
〔付記１７〕
前記第１のＩＰＨＢの前記第１の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、前記第１のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、前記人工組織サンプルの表面に於いて前記第１の対象細胞型の前記細胞の少なくとも一部分を露出する、付記１６に記載の方法。
〔付記１８〕
付記１７に記載の方法は、更に、人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記第１のＩＰＨＢを凍結する事を含む。
〔付記１９〕
前記第２のＩＰＨＢの前記第２の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、（ｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）前記第２のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第２のネットワーク中に在る前記第２の対象細胞型からの第２の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）前記第１の境界面を形成する第１の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記細胞を露出する、付記１７～１８に記載の方法。
〔付記２０〕
付記１９に記載の方法は、更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記噛み合った第１のＩＰＨＢ及び第２のＩＰＨＢを凍結する事を含む。
〔付記２１〕
前記第３のＩＰＨＢの前記第３の連続的なポリマーマトリックス材料が非分解性のハイドロゲル材料を含み、前記収穫するステップが、加えて、（ｉｖ）前記第３のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第３のネットワーク中に在る前記第３の対象細胞型からの第３の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｖ）前記第２の境界面を形成する第２の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、前記各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｖ）の前記細胞を露出する、付記１９に記載の方法。
〔付記２２〕
付記２１に記載の方法は、更に、各多重細胞含有人工組織サンプルを形成する前に又は後に、前記噛み合った第１のＩＰＨＢ、第２のＩＰＨＢ、及び第３のＩＰＨＢを凍結する事を含む。
〔付記２３〕
前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を前記収穫するステップが、其れ等を前記第１のＩＰＨＢから液体媒体に依って流し出す事を含む、付記１６に記載の方法。
〔付記２４〕
前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分を前記収穫するステップが、前記第１のＩＰＨＢの前記３Ｄマクロ構造を分解する、付記１６に記載の方法。
〔付記２５〕
一緒に噛み合った前記複数のＩＰＨＢが、少なくとも２つのＩＰＢＨから様々であり得、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個のＩＰＢＨである、付記１～２４に記載の方法。
〔付記２６〕
前記第１の対象細胞型が第１の対象治療薬、例えば第１の生物製剤を生産又は分泌する、付記１～２５に記載の方法。
〔付記２７〕
前記第２の対象細胞型が第２の対象治療薬、例えば第２の生物製剤を生産又は分泌する、付記２６に記載の方法。
〔付記２８〕
前記第３の対象細胞型が第３の対象治療薬、例えば第３の生物製剤を生産又は分泌する、付記２７に記載の方法。
〔付記２９〕
更に、第１の無細胞基質を直接的に前記第１のＩＰＨＢに隣接して又は直接的に前記第１のＩＰＨＢ及び前記第２のＩＰＨＢの間に配置する事又は噛み合わせる事を含み、此処で、前記第１の無細胞基質は、第１の対象細胞型に関連する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の連続的なマトリックスに依って画定される無細胞３Ｄマクロ構造と、第１の対象細胞型に関連する前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワークとを含み、此処で、前記無細胞３Ｄマクロ構造は、上面と、底面と、前記上面から前記底面まで延在する少なくとも１つの側面エッジ部に依って画定される厚さとを含む、付記１～２８に記載の方法。
〔付記３０〕
前記第１の無細胞基質が、更に、少なくとも１つの噛み合わせオス構成要素及び少なくとも１つの噛み合わせメス構成要素を含む、付記２９に記載の方法。
〔付記３１〕
更に、前記第１の無細胞基質に第４の対象細胞型を播種する事を含み、此処で、前記第４の対象細胞型が前記第１の対象細胞型及び前記第２の対象細胞型とは異なる、付記２９～３０に記載の方法。
〔付記３２〕
更に、前記第４の対象細胞型に第４の培養培地を供給し、前記第４の対象細胞型が、前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在する前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に於いて前記第１のＩＰＨＢの方へ増殖拡大する事を可能にする事を含む、付記３１に記載の方法。
〔付記３３〕
更に、前記第１の対象細胞型及び前記第４の対象細胞型の間の第３の境界面を形成する事を含む、付記３２に記載の方法。
〔付記３４〕
更に、前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在する前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る前記第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分を収穫するステップを含む、付記２９～３３に記載の方法。
〔付記３５〕
前記収穫するステップが、前記第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依って人工組織サンプルを形成する事を含み、前記人工組織サンプルの表面に於いて前記第４の対象細胞型の前記第４の細胞の少なくとも一部分を露出する、付記３４に記載の方法。
〔付記３６〕
更に、人工組織サンプルを形成する前に又は後に前記第１の無細胞基質を凍結する事を含む、付記３５に記載の方法。
〔付記３７〕
前記収穫するステップが、（ｉ）前記第１のＩＰＨＢの前記マイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバの第１のネットワーク中に在る前記第１の対象細胞型からの第１の細胞の少なくとも一部分、（ｉｉ）前記第１の無細胞基質の前記ＥＣＭ材料の連続的なマトリックス中に延在するマイクロポーラスチャンネル及び／又はチャンバのネットワーク中に在る前記第４の対象細胞型からの第４の細胞の少なくとも一部分、並びに（ｉｉｉ）前記第３の境界面を形成する第３の境界面細胞の少なくとも一部分を、前記噛み合った又は隣接した第１のＩＰＨＢ及び第１の無細胞基質を複数の切片に切断する事に依る多重細胞含有人工組織サンプルを形成する事に依って収穫する事を含み、各多重細胞含有人工組織サンプルの表面に於いて（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記細胞を露出する、付記３５～３６に記載の方法。
〔付記３８〕
前記第４の対象細胞型が、例えば哺乳類又は植物等の生物からの自然状態の細胞を含む、付記２９～３７に記載の方法。
〔付記３９〕
１つ以上のＩＰＨＢとの境界面を成す前記第１の無細胞基質を包含する複数の無細胞基質が、少なくとも１つの無細胞基質から様々であり得、例えば次の何れか：少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００個の無細胞基質である、付記２９～３８に記載の方法。

【国際調査報告】