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特表2025-501499Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（またはｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させるための、および１種または複数のプロテアーゼの産生のための培養培地
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-22
(54)【発明の名称】Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（またはｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させるための、および１種または複数のプロテアーゼの産生のための培養培地
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20250115BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20250115BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/20 E
C12N9/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535682
(86)(22)【出願日】2023-01-02
(85)【翻訳文提出日】2024-06-14
(86)【国際出願番号】 EP2023050027
(87)【国際公開番号】W WO2023131588
(87)【国際公開日】2023-07-13
(31)【優先権主張番号】22150333.7
(32)【優先日】2022-01-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】102022121862.7
(32)【優先日】2022-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521327699
【氏名又は名称】ノルドマルク ファーマ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100112737
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 考晴
(74)【代理人】
【識別番号】100136168
【弁理士】
【氏名又は名称】川上 美紀
(74)【代理人】
【識別番号】100196117
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 利恵
(72)【発明者】
【氏名】ジャン ヘイランド
(72)【発明者】
【氏名】マウゴジャータ スタヴォルツィンスカ－ゲッデ
(72)【発明者】
【氏名】トーマス シュラーダー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA23X
4B065AC14
4B065BB02
4B065BB03
4B065BB12
4B065BB29
4B065CA31
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、酵母抽出物、グリシン、アルギニン、グルタミン、セリン、トレオニン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、セレン、および水を含む液体培養培地に関する。本発明は、酵母抽出物、トレオニン、セリン、および水を少なくとも含む、フェドバッチ過程における飼料としての使用のための液体飼料組成物にさらに関する。本発明は、液体培養培地および液体飼料組成物を含むパーツのキット、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させかつ培養上清から１種または複数のプロテアーゼを獲得するための組成物の使用、ならびに増殖に関する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２．５～１００ｇ／Ｌの酵母抽出物と、１．０～３０ｇ／Ｌのグリシンと、
１．０～３５ｇ／Ｌのアルギニンと、
０．２０～０．８０ｇ／Ｌのグルタミンと、
０．２０～１．０ｇ／Ｌのセリンと、
０．３～３．０ｇ／Ｌのトレオニンと、
０．４～１２ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）と、
０．３４～３．４ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）と、
０．０００９５～０．０１５２ｍｍｏｌ／Ｌのセレンと、
水と、
を含む、液体培養培地。
【請求項2】
２．５～１００ｇ／Ｌの酵母抽出物と、１．０～３０ｇ／Ｌのグリシンと、
１．０～３５ｇ／Ｌのアルギニンと、
０．２０～０．８０ｇ／Ｌのグルタミンと、
０．２０～１．０ｇ／Ｌのセリンと、
０．３～３．０ｇ／Ｌのトレオニンと、
１００～３０００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物と、
５０～５００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物と、
０．２５～４．００ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物と、
水と、
を含む、請求項１に記載の液体培養培地。
【請求項3】
１０～３０ｇ／Ｌの酵母抽出物と、５～８ｇ／Ｌのグリシンと、
５～８ｇ／Ｌのアルギニンと、
０．２５～０．４０ｇ／Ｌのグルタミンと、
０．３７～０．５０ｇ／Ｌのセリンと、
０．５０～１．５０ｇ／Ｌのトレオニンと、
３００～１７００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物と、
１００～３００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物と、
０．７０～１．６０ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物と、
水と、
を含む、請求項２に記載の液体培養培地。
【請求項4】
１７～２５ｇ／Ｌの酵母抽出物と、５～７ｇ／Ｌのグリシンと、
６～７ｇ／Ｌのアルギニンと、
０．３０～０．３５ｇ／Ｌのグルタミンと、
０．３７～０．４７ｇ／Ｌのセリンと、
０．８～１．２ｇ／Ｌのトレオニンと、
７００～１３００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物と、
１５０～３００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物と、
１．００～１．４０ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物と、
水と、
を含む、請求項３に記載の液体培養培地。
【請求項5】
動物または植物に由来するいかなる構成要素も含んでいない、請求項１から４のいずれか一項に記載の液体培養培地。
【請求項6】
６．５～８．２の範囲内のｐＨ値を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の液体培養培地。
【請求項7】
請求項１から６のいずれか一項に記載の滅菌された液体培養培地。
【請求項8】
Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の接種源を付加的に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の液体培養培地。
【請求項9】
少なくとも２０ｇ／Ｌの酵母抽出物と、少なくとも３ｇ／Ｌのトレオニンと、
少なくとも１．５ｇ／Ｌのセリンと、
水と、
を含む、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の増殖のためのフェドバッチ過程における飼料としての使用のための、液体飼料組成物。
【請求項10】
６．５～８．２の範囲内のｐＨ値を有する、請求項９に記載の液体飼料組成物。
【請求項11】
請求項９または１０のいずれかに記載の滅菌された液体飼料組成物。
【請求項12】
請求項１から８のいずれか一項に記載の液体培養培地および請求項９から１１のいずれか一項に記載の液体飼料組成物を含む、パーツのキット。
【請求項13】
Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させ、培養上清から少なくとも１種のプロテアーゼを獲得するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の液体培養培地および／または請求項９から１１のいずれか一項に記載の液体飼料組成物の使用。
【請求項14】
請求項１から８のいずれか一項に記載の液体培養培地においてＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させ、培養上清から少なくとも１種のプロテアーゼを獲得する工程を含む、方法。
【請求項15】
増殖は、請求項９から１１のいずれか一項に記載の液体飼料組成物の使用によるフェドバッチ操作において実施される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
序論
本発明は、酵母抽出物、グリシン、アルギニン、グルタミン、セリン、トレオニン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、（例えば、亜セレン酸ナトリウムの形態での）セレン、および水を含む液体培養培地に関する。本発明は、酵母抽出物、トレオニン、セリン、および水を少なくとも含む、フェドバッチ過程における飼料としての使用のための液体飼料組成物にさらに関する。本発明は、液体培養培地および液体飼料組成物を含むパーツのキット、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させ、１種または複数のプロテアーゼを獲得するための液体培養培地および液体飼料組成物の使用、ならびに増殖に関する方法に関する。
本発明は、酵母抽出物、グリシン、アルギニン、グルタミン、セリン、トレオニン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、（例えば、亜セレン酸ナトリウムの形態での）セレン、および水を含む液体培養培地に関する。本発明は、酵母抽出物、トレオニン、セリン、および水を少なくとも含む、フェドバッチ過程における飼料としての使用のための液体飼料組成物にさらに関する。本発明は、液体培養培地および液体飼料組成物を含むパーツのキット、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を増殖させ、１種または複数のプロテアーゼを獲得するための液体培養培地および液体飼料組成物の使用、ならびに増殖に関する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
先行技術の考察
コラーゲンは、哺乳類生物の主要な構造的構成成分であり、動物体の皮膚および他の部分の総タンパク質含有量の大部分を占める。ヒトにおいて、コラーゲンは、創傷治癒過程および自然老化の過程に特に重要である。隆起（ｂｕｍｐ）、手術、感染、および事故等の様々な皮膚外傷は、コラーゲンに富みかつプロテオグリカン含有量の増加を有する線維性組織の不規則な蓄積によってしばしば特徴付けられる。損傷を受けているまたは破壊されている正常組織の置き換えに加えて、新しい組織の過度でかつ外観を損なう沈着が、治癒過程の間に形成されることがある。
コラーゲンは、哺乳類生物の主要な構造的構成成分であり、動物体の皮膚および他の部分の総タンパク質含有量の大部分を占める。ヒトにおいて、コラーゲンは、創傷治癒過程および自然老化の過程に特に重要である。隆起（ｂｕｍｐ）、手術、感染、および事故等の様々な皮膚外傷は、コラーゲンに富みかつプロテオグリカン含有量の増加を有する線維性組織の不規則な蓄積によってしばしば特徴付けられる。損傷を受けているまたは破壊されている正常組織の置き換えに加えて、新しい組織の過度でかつ外観を損なう沈着が、治癒過程の間に形成されることがある。
【0003】
数多くの疾患および病状が、過度のコラーゲン沈着、およびコラーゲンに富む線維性組織の不規則な蓄積と関連する。そのような疾患および病状は、本明細書において集合的に「コラーゲン媒介性疾患」と称される。コラゲナーゼは、コラーゲンを消化する特異的能力を有する酵素である。コラゲナーゼは、ペイロニー病およびデュピュイトラン病等の多様なコラーゲン媒介性疾患を治療するために、ならびに創傷から壊死組織を除去するために使用されている。
【0004】
さらに、コラゲナーゼおよび他のプロテアーゼ（例えば、中性プロテアーゼおよび／またはクロストリパイン等）は、組織解離、ならびに例えば膵島細胞、肝細胞、および腫瘍細胞等の多様な細胞の単離のためにインビトロで使用される。これらの細胞には、研究および診療において多数の用途が見出されている。粗コラゲナーゼまたはプロテアーゼの混合物の１つの一般的な供給源は、細菌発酵過程由来、とりわけＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の発酵由来のものである。
【0005】
Ｈａｔｈｅｗａｙａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）は、グラム陽性細菌の属である。Ｈａｔｈｅｗａｙａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）細菌は嫌気性であり、土、水に、ならびにヒトおよび他の動物の腸管によく見られる。Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）種は、コラーゲン分解酵素、ならびに例えばコラゲナーゼ（ＥＣ ３．４．２４．３）、中性プロテアーゼ、およびクロストリパイン（ＥＣ ３．４．２２．８）等、タンパク質分解活性を有する他の酵素を産生し得る。増殖過程の重要な産物は、コラーゲンに対するタンパク質分解活性を所有する細菌性コラゲナーゼである。これらの酵素は、それらの相対的活性に従って、ＩおよびＩＩ型コラゲナーゼ（以降、「コラゲナーゼＩ」および「コラゲナーゼＩＩ」）としてＢｏｎｄら（非特許文献１参照）によって分類されている。コラゲナーゼおよび他のプロテアーゼは培養培地に分泌され、培養上清から獲得され得る。
【0006】
バイオテクノロジー産業では、薬学的用途における使用のための多数の酵素が、大規模な発酵過程において産生される。例えば、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）は、例えばコラゲナーゼ、中性プロテアーゼ、および／またはクロストリパインを含めたプロテアーゼを産生するために増殖される。通常、そのような過程において、培養培地（栄養培地、発酵培地）は、ウシまたはブタ起源の肉（組織）ペプトン等の動物由来構成要素を含む。動物由来成長培地を起源とする外来因子（例えば、ウイルス）が最終産物に存在し得るため、哺乳類病原性因子を含んでいない培養培地を開発することが望ましい。プリオンおよびＢＳＥに関する特定の安全性関連の懸念がある。近年、規制当局は、これらの懸念が対処されることを要請している。それゆえ、産業界は、動物性物質を含んでいない培養培地に向けられる傾向にある。
【0007】
特許文献１には、水、魚ゼラチン、および魚ペプトンが排除されている非哺乳類供給源由来のペプトンを含む、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）に対する成長培地が開示されている。非哺乳類供給源由来のペプトンに関する唯一の例は、植物ペプトンである。この成長培地は、魚ゼラチンおよび非哺乳類供給源由来のペプトンが、そのほとんどが不明である多種多様な化合物を含む複合成分であるという事実は悩ましい。さらに、これら成長培地は天然供給源から調製され、それゆえ、それらの含有量の天然変動に供される。
【0008】
酵母抽出物および植物ペプトンは、近年、動物由来の培養培地構成要素の代替物と見なされている。しかしながら、酵母抽出物単独では、ある特定の細菌の十分な成長に必要なすべての栄養素を提供し得ない。特許文献２には、水、非動物起源ペプトンまたはその誘導体、酵母抽出物、ならびにアミノ酸システインおよびアルギニンを含む、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（現在はＨａｔｈｅｗａｙａ）属、とりわけＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ（現在はＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）の細菌に対する動物産物を含んでいない培養培地が開示されている。非動物起源ペプトンは植物に由来する（植物ペプトン）。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを産生するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ（現在はＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）の発酵に、特許文献３に従って植物性ペプトンが使用される。植物ペプトンは、これらが複雑でかつ不確定な混合物であるという、およびとりわけ気象条件または植え付け領域が変化した場合、原材料の産生が大きなバッチ変動性にしばしば供されるという欠点を有する。さらに、植物ペプトンの組成は、産生過程および供給元に応じてかなり変動し得る。ゆえに、一定の産物品質を獲得することまたは代替供給元を見出すことは、困難であるまたは単に可能でない。これらの理由で、植物ペプトンは、細菌の増殖のためのほとんどの産業的過程に対する成分として望ましくない。このことは、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の増殖、およびプロテアーゼの産生にとりわけ当てはまる。Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）は、増殖中に、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、クロストリパイン、および中性プロテアーゼを分泌する。上清におけるこれらすべての酵素の活性は、増殖に使用される植物ペプトンの組成によって強く影響を受け、植物ペプトンの供給源または原材料、メーカー、産生過程に応じて、およびバッチに応じて５倍以上変動し得る。上で概説されるように、そのような産物変動性および単一の供給元への依存は、とりわけ医薬品産業における産業的産生過程にとって最適とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】欧州特許出願公開第２１３３４１５号明細書
【特許文献2】欧州特許出願公開第２８６５７４８号明細書
【特許文献3】国際公開第２００７／０８９８５１号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｂｏｎｄ，Ｍ．Ｄ．，ｖａｎ Ｗａｒｔ，Ｈ．Ｅ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，３０７７－９１（１９８４）
【発明の概要】
【0011】
発明の課題
本発明の目的は、（ｉ）細菌の成長を支援し、（ｉｉ）培養培地へのタンパク質分解活性を有する酵素の分泌を刺激し、（ｉｉｉ）産物および過程変動性を低下させる、液体培地および／または液体飼料組成物を提供することである。培地が、培養上清における高い容積活性（培養容積あたりの酵素活性）を刺激することが特に好ましい。本発明のさらなる目的は、動物由来構成要素および／または植物由来構成要素の添加なしで、細菌の増殖を可能にする新しいタイプの培養培地を提供することである。培地は、さらに、望ましくない物質によるいかなる汚染も回避するために、および発酵過程に対する過剰に複雑な影響を回避するために、可能な限り少ない構成要素を含むべきである。そのような培養培地は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）種の有効な増殖、ならびに１種または複数のプロテアーゼ、例えばコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、および／またはクロストリパインの産生を可能にすることがとりわけ望ましい。その中に含まれる１種または複数のプロテアーゼの単離に使用され得る、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）液体培養物の上清を提供することは、本発明のさらなる目標である。プロテアーゼの分解が低い、プロテアーゼの産生のための過程を提供することも本発明の目標である。加えて、培養培地は、以下の利益を提供し得る：ａ）動物ペプトンまたは植物ペプトンを含む培養培地よりも高いバッチ信頼度；ｂ）すべての構成要素が、複数の供給元から適切でかつ一定の品質で獲得され得る；ｃ）Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の上清におけるコラゲナーゼの活性が４００Ｕ／Ｌ以上である（ＰＺ活性）。
本発明の目的は、（ｉ）細菌の成長を支援し、（ｉｉ）培養培地へのタンパク質分解活性を有する酵素の分泌を刺激し、（ｉｉｉ）産物および過程変動性を低下させる、液体培地および／または液体飼料組成物を提供することである。培地が、培養上清における高い容積活性（培養容積あたりの酵素活性）を刺激することが特に好ましい。本発明のさらなる目的は、動物由来構成要素および／または植物由来構成要素の添加なしで、細菌の増殖を可能にする新しいタイプの培養培地を提供することである。培地は、さらに、望ましくない物質によるいかなる汚染も回避するために、および発酵過程に対する過剰に複雑な影響を回避するために、可能な限り少ない構成要素を含むべきである。そのような培養培地は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）種の有効な増殖、ならびに１種または複数のプロテアーゼ、例えばコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、および／またはクロストリパインの産生を可能にすることがとりわけ望ましい。その中に含まれる１種または複数のプロテアーゼの単離に使用され得る、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）液体培養物の上清を提供することは、本発明のさらなる目標である。プロテアーゼの分解が低い、プロテアーゼの産生のための過程を提供することも本発明の目標である。加えて、培養培地は、以下の利益を提供し得る：ａ）動物ペプトンまたは植物ペプトンを含む培養培地よりも高いバッチ信頼度；ｂ）すべての構成要素が、複数の供給元から適切でかつ一定の品質で獲得され得る；ｃ）Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の上清におけるコラゲナーゼの活性が４００Ｕ／Ｌ以上である（ＰＺ活性）。
【発明を実施するための形態】
【0012】
第１の態様において、本発明は、
２．５～１００ｇ／Ｌの酵母抽出物、
１．０～３０ｇ／Ｌのグリシン、
１．０～３５ｇ／Ｌのアルギニン、
０．２０～０．８０ｇ／Ｌのグルタミン、
０．２０～１．０ｇ／Ｌのセリン、
０．３～３．０ｇ／Ｌのトレオニン、
０．４～１２ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、例えば１００～３０００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、
０．３４～３．４ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、例えば５０～５００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、
０．０００９５～０．０１５２ｍｍｏｌ／Ｌのセレン、例えば０．２５～４．００ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、および
水
を含む、これから本質的になる、またはこれからなる液体培養培地に関する。
２．５～１００ｇ／Ｌの酵母抽出物、
１．０～３０ｇ／Ｌのグリシン、
１．０～３５ｇ／Ｌのアルギニン、
０．２０～０．８０ｇ／Ｌのグルタミン、
０．２０～１．０ｇ／Ｌのセリン、
０．３～３．０ｇ／Ｌのトレオニン、
０．４～１２ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、例えば１００～３０００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、
０．３４～３．４ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、例えば５０～５００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、
０．０００９５～０．０１５２ｍｍｏｌ／Ｌのセレン、例えば０．２５～４．００ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、および
水
を含む、これから本質的になる、またはこれからなる液体培養培地に関する。
【0013】
本明細書において使用される「から本質的になる」という用語は、組成物が、（ａ）列挙された成分を必ず含み、（ｂ）組成物の基本的なおよび新規の特性に著しく影響を及ぼさない列挙されていない成分を受け入れることを意味するものとする。
【0014】
本発明に従った液体培養培地は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の細菌に対する培養培地として、とりわけＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））に対する培養培地として適切である。これは、細菌の十分な成長に、ならびに、任意選択で本発明に従った飼料組成物との組合せで、例えばコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、および／またはクロストリパイン等の１種または複数のプロテアーゼの有効な産生に要される栄養素を提供する。一実施形態において、本発明の培養培地を用いた、および任意選択で本発明の飼料組成物を用いたＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の発酵により、上清におけるコラゲナーゼの活性は、４００ＰＺ単位／Ｌ以上、別の実施形態では６００ＰＺ単位／Ｌ以上、別の実施形態では１２００ＰＺ単位／Ｌ以上である。Ｗｕｅｎｓｃｈに従った１ＰＺ単位は、２５℃、ｐＨ７．１で１分間あたり１μｍｏｌの４－フェニルアゾベンジル－オキシカルボニル－Ｌ－プロリル－Ｌ－ロイシル－グリシル－Ｌ－プロリル－Ｄ－アルギニン（ＰＺ）の加水分解を触媒する（Ｗｕｅｎｓｃｈ，Ｅ．＆Ｈｅｉｄｒｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．（１９６３）Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３３３，１４９－５１）。
【0015】
２．５ｇ／Ｌよりも低い濃度の酵母抽出物の使用は、原理上可能であるが、細菌成長および産物収率を低下させ得る。１００ｇ／Ｌよりも高い濃度の酵母抽出物の使用は、原理上可能であるが、細菌成長またはプロテアーゼの分泌という点で大した利益を提供し得ない。一部の実施形態において、液体培養培地における酵母抽出物の濃度は、２．５～８０、５．０～６０、または１０～３０ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、液体培養培地における酵母抽出物の濃度は１７～２５ｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む。
【0016】
原理上、任意の酵母抽出物が使用され得る。酵母抽出物および調製のための方法は、当技術分野において周知である。動物ペプトンまたは植物ペプトンとは逆に、酵母抽出物は、産業用バイオリアクターにおける酵母の発酵を含む、より制御された産業的過程によって産生される。この理由で、バッチ信頼度は、植物または動物由来構成要素に対してよりも高い。同じ過程によって産生された異なるバッチの酵母抽出物は、細菌成長およびプロテアーゼの産生という点で同様の性能を提供する。さらに、異なる過程および／または異なる生産者によって産生された酵母抽出物は、互いに代わりになり得、細菌成長およびプロテアーゼの産生という点で同様の性能を提供し得る。要約すると、酵母抽出物は、動物ペプトンおよび植物ペプトンと比して過程堅牢性の増加を提供する。
【0017】
とりわけ、任意の市販の酵母抽出物が使用され得る。非限定的な例は、「ＢＤ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ、ＵＳＡ、品番：２８８６１０）、「ＢＤ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番：２１２７３０）、「ＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番：２１２７３０）である。「ＢＤ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番：２８８６１０）は、コラゲナーゼおよび他のプロテアーゼの高い収率を提供し、この酵母抽出物を用いた発酵は再現性が良い。さらなる適切な酵母抽出物は、例えば「Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ｌｏｗ－ｄｕｓｔｉｎｇ（ＬＤ）、品番：２１０９３３」、Ｏｈｌｙによって産生された酵母抽出物、Ｋｅｒｒｙ ＨＹ－Ｙｅａｓｔシリーズ、およびＡｐｐｌｉＣｈｅｍ製のＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ品番：Ａ１５５２である。
【0018】
本文において別様に言及されない場合、コラゲナーゼの収率および濃度は、上清のＰＺ活性によって測定される。上清における中性プロテアーゼの活性は、例えばＬｉｎ，Ｙ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４，７８９－９３；もしくはＫｕｎｉｔｚ，Ｍ．１９４７．Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．ＩＩ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０：２９１－３１０に従って；または実施例１に記載されるように測定され得る。上清におけるクロストリパインの活性は、例えばＫｅｚｄｙ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５，４，２３０２－２３０８に記載されるように；または実施例２に記載されるように測定され得る。
【0019】
本発明の液体培養培地は、１．０～３０ｇ／Ｌの濃度のグリシンまたはその薬学的に許容される塩を含む。１．０ｇ／Ｌよりも低い濃度のグリシンの使用は、原理上可能であるが、細菌成長を低下させ得、上清におけるより低いＰＺ活性をもたらし得る。３０ｇ／Ｌよりも高い濃度のグリシンは、細胞成長または上清におけるＰＺ活性に対してほとんど利益を有し得ない。１つの実施形態において、本発明の液体培養培地におけるグリシンの濃度は５～８ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、液体培養培地におけるグリシンの濃度は５～７ｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、６．５ｇ／Ｌのグリシンを含む。
【0020】
本発明の液体培養培地は、１．０～３５ｇ／Ｌの濃度のアルギニンまたはその薬学的に許容される塩を含む。１．０ｇ／Ｌよりも低い濃度のアルギニンの使用は、原理上可能であるが、細菌成長を低下させ得、上清におけるより低いＰＺ活性をもたらし得る。３５ｇ／Ｌよりも高い濃度のアルギニンは、細胞成長または上清におけるＰＺ活性に対してほとんど利益を有し得ない。１つの実施形態において、本発明の液体培養培地におけるアルギニンの濃度は５～８ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、本発明の液体培養培地におけるアルギニンの濃度は６～７ｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、６．７ｇ／Ｌのアルギニンを含む。
【0021】
本発明の液体培養培地は、０．２０～０．８０ｇ／Ｌの濃度のグルタミンまたはその薬学的に許容される塩を含む。グルタミンは、細菌成長に対しておよび上清におけるＰＺ活性に対してプラスの影響を有する。０．２０ｇ／Ｌよりも低い濃度のグルタミンの使用は、原理上可能であるが、細菌成長を低下させ得、上清におけるより低いＰＺ活性をもたらし得る。０．８０ｇ／Ｌよりも高い濃度のグルタミンは、細胞成長または上清におけるＰＺ活性に対してほとんど利益を有し得ない。１つの実施形態において、本発明の液体培養培地におけるグルタミンの濃度は０．２５～０．４０ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、本発明の液体培養培地におけるグルタミンの濃度は０．３０～０．３５ｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、０．３２ｇ／Ｌのグルタミンを含む。
【0022】
本発明の液体培養培地は、０．２０～１．０ｇ／Ｌの濃度のセリンまたはその薬学的に許容される塩を含む。セリンは、細菌成長に対してプラスの影響を有するが、産生力に対してマイナスの影響を有する。本明細書において規定される産生力とは、ＰＺ活性対細菌成長の比である。細菌成長は、公知の方法によって、例えば濁度を測定することによって判定され得る。一部の実施形態において、細菌成長は、６００ｎｍにおける光学密度を測定することによって判定される。０．２０ｇ／Ｌよりも低い濃度のセリンの使用は、原理上可能であるが、より低い細菌成長をもたらし得る。１．０ｇ／Ｌよりも高いセリン濃度は、産生力を低下させ得る。一実施形態において、本発明の液体培養培地におけるセリンの濃度は０．３７～０．５０ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、本発明の液体培養培地におけるセリンの濃度は０．３７～０．４７ｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、０．４２ｇ／Ｌのセリンを含む。
【0023】
本発明の液体培養培地は、０．３～３．０ｇ／Ｌの濃度のトレオニンまたはその薬学的に許容される塩を含む。この範囲内でより低い濃度のトレオニンは、この範囲内でより高い濃度よりも、上清において高いＰＺ活性を提供する。０．３ｇ／Ｌよりも低い濃度のトレオニンの使用は、より低い細菌成長をもたらすであろう。３．０ｇ／Ｌよりも高い濃度のトレオニンは、産生力を低下させ得る。一実施形態において、トレオニンの濃度は３．０ｇ／Ｌよりも高くない。１つの実施形態において、本発明の液体培養培地におけるトレオニンの濃度は０．５～１．５０ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、本発明の液体培養培地におけるトレオニンの濃度は０．８～１．２ｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、１ｇ／Ｌのトレオニンを含む。
【0024】
本発明に従った液体培養培地は、０．４～１２ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、例えば１００～３０００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）を含む。一実施形態において、本発明に従った液体培養培地は、１．２～６．９ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含む。一実施形態において、液体培養培地における硫酸マグネシウム七水和物の濃度は３００～１７００ｍｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、本発明に従った液体培養培地は、２．８～５．３ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含む。別の実施形態において、硫酸マグネシウム七水和物濃度は７００～１３００ｍｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、９９５ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物を含む。本発明に従った液体培養培地は、０．３４～３．４ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、例えば５０～５００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）を含む。一実施形態において、本発明に従った液体培養培地は、０．６８～２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を含む。一実施形態において、液体培養培地における塩化カルシウム二水和物の濃度は１００～３００ｍｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態において、本発明に従った液体培養培地は、１．０～２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を含む。別の実施形態において、塩化カルシウム二水和物濃度は１５０～３００ｍｇ／Ｌの範囲にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、２６０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物を含む。１つの実施形態において、マグネシウムおよびカルシウムイオンに対するアニオンは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、および酢酸塩からなる群から選択され得る。他の実施形態において、硫酸マグネシウムがマグネシウムイオンに使用され得、かつ／または塩化カルシウムがカルシウムイオンに使用され得る。本発明に従った液体培養培地は、０．０００９５～０．０１５２ｍｍｏｌ／Ｌのセレン、例えば０．２５～４．００ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）を含む。一実施形態において、本発明に従った液体培養培地は、０．００２７～０．００６１ｍｍｏｌ／Ｌのセレンを含む。一実施形態において、液体培養培地における亜セレン酸ナトリウム五水和物の濃度は０．７０～１．６０ｍｇ／Ｌの域にある。別の実施形態において、本発明に従った液体培養培地は、０．００３８～０．００５３ｍｍｏｌ／Ｌのセレンを含む。別の実施形態において、亜セレン酸ナトリウム五水和物濃度は１．００～１．４０ｍｇ／Ｌの域にある。一部の実施形態において、液体培養培地は、１．１７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物を含む。一部の実施形態において、亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｅＯ３）またはその五水和物を使用して、本発明の液体培養培地にセレンを提供する、すなわち、培地は亜セレン酸ナトリウムを含む。他のセレン含有化合物または組成物が使用され得る。セレンの適切な形態を選定することは、当技術分野における熟練者の十分に知識の範囲内にある。培地に導入されたセレンが、十分な生体利用率を有する適切な形態にあり得ることは周知である。このことにより、培地に含まれるセレンが細菌にとって使用可能になる。化合物または組成物が培地に十分なセレンを提供するかどうかは、発酵における所望のプロテアーゼの収率の比較によって簡単に判定され得る。この収率は、亜セレン酸ナトリウムの使用により獲得された収率と比較され得る。必要な場合には、セレンを提供するために使用される亜セレン酸ナトリウムまたはその五水和物以外の化合物または組成物の量を、同じまたは同様の結果が獲得されるように調整し得る。
【0025】
本明細書に記載される本発明の液体培養培地は、水、例えば精製水または注射用水を含み得る。精製水とは、不純物を除去し、それを使用、とりわけ薬学的使用に適切にするために、機械的に濾過されているまたは処理されている水である。注射用水は、さらにより精製され、例えば欧州または米国薬局方においてさらに規定される。１つの実施形態において、液体培養培地は、液体培養培地の全重量に基づき、少なくとも５０、６０、または７０重量パーセントの量の水を含む。一部の実施形態において、液体培養培地は、少なくとも７８重量％の量の、または少なくとも９０重量％の量の、または少なくとも９５重量％の量の水を含む。一部の実施形態において、水は、液体培養培地の残部である。一部の実施形態において、液体培養培地は、例えば上で指定される量の、欧州または米国薬局方に従った精製水または注射用水を含む。
【0026】
一部の実施形態において、液体培養培地は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の発酵、ならびにコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、およびクロストリパインからなる群から選択される少なくとも１種のプロテアーゼの産生に使用される。
【0027】
一部の実施形態において、液体培養培地は、１０～３０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５～８ｇ／Ｌのグリシン、５～８ｇ／Ｌのアルギニン、０．２５～０．４０ｇ／Ｌのグルタミン、０．３７～０．５０ｇ／Ｌのセリン、０．５０～１．５０ｇ／Ｌのトレオニン、１．２～６．９ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、０．６８～２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、０．００２７～０．００６１ｍｍｏｌ／Ｌのセレン、および水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。一部の実施形態において、液体培養培地は、１０～３０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５～８ｇ／Ｌのグリシン、５～８ｇ／Ｌのアルギニン、０．２５～０．４０ｇ／Ｌのグルタミン、０．３７～０．５０ｇ／Ｌのセリン、０．５０～１．５０ｇ／Ｌのトレオニン、３００～１７００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、１００～３００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、０．７０～１．６０ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、および水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。一部の実施形態において、液体培養培地は、１７～２５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５～７ｇ／Ｌのグリシン、６～７ｇ／Ｌのアルギニン、０．３０～０．３５ｇ／Ｌのグルタミン、０．３７～０．４７ｇ／Ｌのセリン、０．８～１．２ｇ／Ｌのトレオニン、２．８～５．３ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、１．０～２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、０．００３８～０．００５３ｍｍｏｌ／Ｌのセレン、および水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。一部の実施形態において、液体培養培地は、１７～２５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５～７ｇ／Ｌのグリシン、６～７ｇ／Ｌのアルギニン、０．３０～０．３５ｇ／Ｌのグルタミン、０．３７～０．４７ｇ／Ｌのセリン、０．８～１．２ｇ／Ｌのトレオニン、７００～１３００ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、１５０～３００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、１．００～１．４０ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物、および水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。一部の実施形態において、液体培養培地は、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、６．５ｇ／Ｌのグリシン、６．７ｇ／Ｌのアルギニン、０．３２ｇ／Ｌのグルタミン、０．４２ｇ／Ｌのセリン、１ｇ／Ｌのトレオニン、９９５ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、２６０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、および１．１７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物、ならびに水（例えば、精製水）を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。
【0028】
酵母抽出物は、再現性のある方式で調製され得るため、本発明の液体培養培地は、高いバッチ安定性を有する安定でかつ再現性のある培養培地を提供し、これは、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の増殖の高い過程堅牢性、ならびに例えばコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、およびクロストリパイン等のプロテアーゼの産生を提供する。一部の実施形態において、液体培養培地は、動物または植物に由来するいかなる構成要素も含んでいない。そのような動物もしくは植物由来成分は外来因子を含み得、かつ／またはこれらの成分は、メーカー間で、および同じメーカーの異なるバッチ間でさえ変動し得る。Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の増殖およびプロテアーゼの産生のために、動物または植物由来成分なしの液体培養培地を使用することは、プロテアーゼの最終消費者により多くの安全性を提供し、発酵における本発明の液体培養培地の信頼度を向上させる。
【0029】
本明細書において使用される「動物に由来する」または「動物由来の（ａｎｉｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ）」または「動物由来の（ａｎｉｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ）」という用語は、動物起源の任意の物質を意味するものとする。本明細書において使用される「植物に由来する」または「植物由来の（ｐｌａｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ）」または「植物由来の（ｐｌａｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ）」という用語は、植物起源の任意の物質を意味するものとする。一部の実施形態において、本明細書において使用される「動物に由来する」または「動物由来の（ａｎｉｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ）」または「動物由来の（ａｎｉｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ）」という用語は、動物起源の任意の物質、および１種または複数の動物由来の物質（例えば、動物由来の酵素）を使用して処理された非動物起源の任意の物質を意味するものとする。一部の実施形態において、本明細書において使用される「植物に由来する」または「植物由来の（ｐｌａｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ）」または「植物由来の（ｐｌａｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ）」という用語は、植物起源の任意の物質、および１種または複数の植物由来の物質（例えば、植物由来の酵素）を使用して処理された非植物起源の任意の物質を意味するものとする。本明細書において使用される「構成要素」または「成分」という用語は、液体培養培地または液体飼料組成物の内容物の任意の物質を意味するものとする。
【0030】
一部の実施形態において、液体培養培地または液体飼料組成物はグルコースを含まない。一部の実施形態において、液体培養培地または液体飼料組成物は、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マンノース、ラフィノース、フコース、スクロース、およびアラビノースからなる群から選択される糖類を含まない。一部の実施形態において、液体培養培地または液体飼料組成物はいかなる糖類も含まない。
【0031】
さらなる実施形態において、液体培養培地は消泡剤を含む。消泡剤は、培養培地におけるおよび発酵の間の泡の発生を抑制する。任意の市販の消泡剤が使用され得る。１つの適切な消泡剤は、Ｄｏｗ社製のＸＩＡＭＥＴＥＲ（商標）ＡＣＰ－１５００（ＥＵ）消泡化合物である。消泡剤は、発泡を許容されるレベルまで抑制するのに適切な量で添加され得る。小規模での発酵は、消泡剤の添加なしで行われ得る。大規模の発酵では、消泡剤が添加され得る。
【0032】
一部の実施形態において、液体培養培地は、６．５～８．２の範囲内のｐＨ値を有する。一部の実施形態において、液体培養培地のｐＨ値は、７．２～８．１または７．５～８．０の範囲にある。ｐＨ値は、任意の公知の方法によって、例えば適切な緩衝能を有する緩衝剤の添加によってまたは酸もしくは塩基の添加によって調節され得る。一部の実施形態において、例えば約０．５リットル以下の容積を有する上清を用いた前培養ではおよび発酵では、緩衝剤が添加され得る。例えば、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤（ＭＯＰＳ緩衝剤）が使用され得る。一部の実施形態において、例えば上清の容積が約１リットルを上回るフェドバッチ過程ではおよび／または発酵過程では、ｐＨ値は継続的に測定され得、酸または塩基（または、増殖過程の時間経過では両方）を添加して、ｐＨ値を所望の範囲に保つ。例えば、リン酸および／または水酸化ナトリウムが使用され得る。一部の実施形態において、例えば上清の容積が約０．５～約１Ｌである発酵過程では、２種の方法のいずれかが使用され得る。
【0033】
さらなる実施形態において、液体培養培地は滅菌される。一部の実施形態において、組成物は、いかなる自己複製生物も含んでいない。滅菌は、当業者に公知の標準的方法によって、例えばオートクレーブ等の例えば熱処理によって達成され得る。一部の実施形態において、滅菌された液体培養培地は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の接種源を含む。一部の実施形態において、液体培養培地は、いかなる自己複製生物も含んでいないが、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を含んでいる。一部の実施形態において、そのような組成物は、本発明の滅菌された液体培養培地にＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の接種源を添加することによって調製される。
【0034】
第２の態様において、本発明は、
少なくとも２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、
少なくとも３ｇ／Ｌのトレオニン、
少なくとも１．５ｇ／Ｌのセリン、および
水
を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、例えばＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の増殖のためのフェドバッチ過程における飼料としての使用のための液体飼料組成物に関する。
少なくとも２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、
少なくとも３ｇ／Ｌのトレオニン、
少なくとも１．５ｇ／Ｌのセリン、および
水
を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、例えばＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の増殖のためのフェドバッチ過程における飼料としての使用のための液体飼料組成物に関する。
【0035】
本明細書において使用される「フェドバッチ培養」という用語は、増殖の間に、１種または複数の栄養素が、容器、例えばバイオリアクターに与えられ（供給され）、産物はランの終了まで容器にとどまる、バイオテクノロジー過程における操作技法を意味するものとする。フェドバッチ過程についてのさらなる詳細に関しては、例えばＴｓｕｎｅｏ ＹａｍａｎｅおよびＳｈｏｉｃｈｉ Ｓｈｉｍｉｚｕ（Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９８４，３０：１４７－１９４）を参照されたい。
【0036】
液体飼料組成物および液体培養培地は、異なる組成物である。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、少なくとも３０、４０、または５０ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０ｇ／Ｌのトレオニンを含む。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、少なくとも２．０、２．５、３．０、４．５、５．０ｇ／Ｌのセリンを含む。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、５０～２００ｇ／Ｌの酵母抽出物、３～６０ｇ／Ｌのトレオニンおよび１．５～４０ｇ／Ｌのセリン、ならびに水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、７０～１３０ｇ／Ｌの酵母抽出物、３～１０ｇ／Ｌのトレオニンおよび１．５～１０ｇ／Ｌのセリン、ならびに水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、１００ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトレオニンおよび２．５ｇ／Ｌのセリン、ならびに水を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。本明細書に記載される本発明の液体飼料組成物は、液体飼料組成物の全重量に対して、少なくとも５０、６０、または６５重量パーセントの量の水、例えば精製水または注射用水を含む。一部の実施形態において、液体飼料組成物は、少なくとも７０重量％、または少なくとも８０重量％、または少なくとも９５重量％の量の水、例えば精製水または注射用水を含む。一部の実施形態において、水は、液体飼料組成物の残部である。
【0037】
一部の実施形態において、液体飼料組成物は、６．５～８．２の域内のｐＨ値を有する。
【0038】
さらなる実施形態において、液体飼料組成物は滅菌される。一部の実施形態において、組成物は、いかなる自己複製生物も含んでいない。滅菌は、当業者に公知の標準的方法によって、例えばオートクレーブ等の例えば熱処理によって達成され得る。
【0039】
第３の態様において、本発明は、本発明の液体培養培地および本発明の液体飼料組成物を含むパーツのキットに関する。この組み合わせは、例えばフェドバッチ過程における、例えばＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））の発酵、および１種または複数のプロテアーゼの産生に有用である。
【0040】
本発明の第４の態様は、本発明の液体培養培地および／または本発明の液体飼料組成物、ならびに１種または複数のプロテアーゼを含む、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））液体培養物の上清である。１種または複数のプロテアーゼは、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、およびクロストリパインからなる群から選択され得る。一部の実施形態において、本発明の液体培養培地および／または液体飼料組成物を使用して調製されたＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）液体培養物の上清は、少なくとも４００ＰＺ単位／Ｌ（Ｗｕｅｎｓｃｈ単位）、または少なくとも５００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも６００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも７００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも８００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも９００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも１０００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも１１０００ＰＺ単位／Ｌ、または少なくとも１２００ＰＺ単位／Ｌのコラゲナーゼ活性を有する。
【0041】
本発明のこの態様の実施形態は、（ａ）本発明に従った滅菌された液体培養培地に、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の接種源を提供し、（ｂ）細菌を増殖させ、それによって細菌は液相に１種または複数のプロテアーゼを分泌し；（ｃ）液相から固体、例えば細胞物質および他の粒子状物質を分離し；それによって、１種または複数のプロテアーゼを含むＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の培養上清を獲得する方法によって獲得可能な１種または複数のプロテアーゼを含む、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の培養上清である。一部の実施形態において、上清は、液体フェドバッチ培養から獲得される。したがって、一部の実施形態において、上清は、（ａ）本発明に従った滅菌された液体培養培地に、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の接種源を提供し、（ｂ）フェドバッチ操作によって細菌を増殖させ、（ｃ）本発明の液体飼料組成物を添加し、（ｄ）液相から固体、例えば細胞物質および他の粒子状物質を分離し；それによって、１種または複数のプロテアーゼを含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の培養上清を獲得する方法によって獲得可能である。一部の実施形態において、１種または複数のプロテアーゼは、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、およびクロストリパインを含む群から選択され得る。
【0042】
第５の態様において、本発明は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））を増殖させ、培養上清から少なくとも１種のプロテアーゼ、例えばコラゲナーゼＩおよび／またはコラゲナーゼＩＩおよび／または中性プロテアーゼおよび／またはクロストリパイン等、コラゲナーゼ活性を有するプロテアーゼを獲得するための、本発明の液体培養培地の使用に関する。第６の態様において、本発明は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））を増殖させ、培養上清から少なくとも１種のプロテアーゼ、例えばコラゲナーゼＩおよび／またはコラゲナーゼＩＩおよび／または中性プロテアーゼおよび／またはクロストリパイン等、コラゲナーゼ活性を有するプロテアーゼを獲得するための、本発明の液体飼料組成物の使用に関する。
【0043】
第７の態様において、本発明は、
－ 本発明の液体培養培地においてＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））を増殖させ、培養上清から少なくとも１種のプロテアーゼを獲得する
工程を含む方法に関する。
－ 本発明の液体培養培地においてＨａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））を増殖させ、培養上清から少なくとも１種のプロテアーゼを獲得する
工程を含む方法に関する。
【0044】
一部の実施形態において、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性プロテアーゼ、および／またはクロストリパインは、上述の方法を用いて獲得される。本発明の方法の一部の実施形態において、培養物のｐＨ値は、これが６．５～８．２の範囲にあるように制御される。一部の実施形態において、培養物のｐＨ値は、これが７．２～８．１または７．５～８の範囲にあるように制御される。
【0045】
本発明の方法の一部の実施形態において、増殖は、好ましくは、飼料としての本明細書に記載される滅菌された液体飼料組成物の使用によって、フェドバッチ操作において好ましくは実施される。そのようなフェドバッチ過程の一部の実施形態において、培養物のｐＨ値は、これが７．２～７．８の域にあるように制御される。
【0046】
一部の実施形態において、本発明に従った方法は、
（ａ）本発明に従った滅菌された液体培養培地に、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ細菌；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））の接種源を提供し；
（ｂ）細菌を増殖させ、任意選択で本発明に従った液体飼料組成物を添加し、それによって細菌は液相に１種または複数のプロテアーゼを分泌し；
（ｃ）液相から固体、例えば細胞物質および他の粒子状物質を分離し、それによって上清を獲得し；
（ｄ）上清から１種または複数のプロテアーゼを獲得し；それによって、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から１種または複数のプロテアーゼを産生する
工程を含む。
（ａ）本発明に従った滅菌された液体培養培地に、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ細菌；例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））の接種源を提供し；
（ｂ）細菌を増殖させ、任意選択で本発明に従った液体飼料組成物を添加し、それによって細菌は液相に１種または複数のプロテアーゼを分泌し；
（ｃ）液相から固体、例えば細胞物質および他の粒子状物質を分離し、それによって上清を獲得し；
（ｄ）上清から１種または複数のプロテアーゼを獲得し；それによって、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から１種または複数のプロテアーゼを産生する
工程を含む。
【0047】
発酵過程の培養は、増殖の間に継続的にまたは１回もしくは複数の時点で、例えば濁度を判定することによって、および／または培養上清のサンプル（増殖の間に１回または複数の時点で採取され得る）中のプロテアーゼ活性を判定することによってモニターされ得る。一部の実施形態において、液体飼料組成物の添加は、細菌成長速度が指数期に達した時点で開始する。一部の実施形態において、液体飼料組成物の添加は、細菌成長速度が、最大濁度の約４０％、５０％、６０％、または７０％に達した時点で開始する。細菌は、１５～１９時間増殖され得る。酵素比は経時的に変化するため、増殖時間は、１種または複数の標的酵素に従って適合され得る。増殖および細菌成長期をモニターする適切な方法は、例えば特許文献１に開示される。１種または複数のプロテアーゼは、例えば粗形態でまたは精製された状態で、任意の公知の方法によって培養上清から獲得され得る。したがって、一部の実施形態において、工程（ｄ）は、例えば濾過および／またはカラムクロマトグラフィー等の１種または複数の精製工程を含み得る。国際公開第２０２０／１６４７２１号は、Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の培養上清から１種または複数のプロテアーゼを獲得するためのいくつかの例となる手順を記載する。
【実施例】
【0048】
分析法：
上清におけるＷｕｅｎｓｃｈ活性の判定は、Ｗｕｅｎｓｃｈ，Ｅ．，Ｈｅｉｄｒｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．；Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３３３，１４９－５１（１９６３）に従って行われてた。Ｗｕｅｎｓｃｈに従った１ＰＺ単位活性とは、２５℃、ｐＨ７．１で１分間あたり１μｍｏｌの４－フェニル－アゾベンジルオキシカルボニル－Ｌ－プロリル－Ｌ－ロイシル－グリシル－Ｌ－プロリル－Ｄ－アルギニンの加水分解を触媒する活性である。本明細書におけるＷｕｅｎｓｃｈ単位のすべての値は、別様に記述されない場合、ＰＺ単位／リットル（Ｕ／Ｌ）、すなわち培養培地リットルあたりのＷｕｅｎｓｃｈ単位で与えられる。
上清におけるＷｕｅｎｓｃｈ活性の判定は、Ｗｕｅｎｓｃｈ，Ｅ．，Ｈｅｉｄｒｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．；Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３３３，１４９－５１（１９６３）に従って行われてた。Ｗｕｅｎｓｃｈに従った１ＰＺ単位活性とは、２５℃、ｐＨ７．１で１分間あたり１μｍｏｌの４－フェニル－アゾベンジルオキシカルボニル－Ｌ－プロリル－Ｌ－ロイシル－グリシル－Ｌ－プロリル－Ｄ－アルギニンの加水分解を触媒する活性である。本明細書におけるＷｕｅｎｓｃｈ単位のすべての値は、別様に記述されない場合、ＰＺ単位／リットル（Ｕ／Ｌ）、すなわち培養培地リットルあたりのＷｕｅｎｓｃｈ単位で与えられる。
【0049】
クロストリパインおよび中性プロテアーゼの活性は、実施例１および２に記載されるように判定された。
【0050】
濁度を、６００ｎｍ（ＯＤ６００）でＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計ＵＶ５Ｎａｎｏにおいてオフラインで測定した。濁度を、空のサンプル（接種源なしの培地）に対して測定する。必要な場合には、測定値が最大で０．６のＯＤ６００の測定域にあるように、溶液は希釈されなければならない。
【0051】
材料：
すべての実験において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）を使用した。ＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）は、ＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関）で入手可能である。酵母抽出物として、「ＢＤ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番：２８８６１０）を使用した。下で記載される実験において、すべての培養物に、２容積パーセントの前培養物を接種した。１ｍＬの液体培養培地と混合された凍結乾燥Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））の１バイアル（バイアルは、最低１０６ＣＦＵを含有すると規定された；分析によれば、バイアルは３５×１０６ＣＦＵ／バイアルを含有した）の内容物を用いた液体培養培地の接種、および振とうフラスコにおける３７℃での嫌気的インキュベーションによって、前培養物を調製した。
すべての実験において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１および／またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）を使用した。ＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）は、ＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関）で入手可能である。酵母抽出物として、「ＢＤ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番：２８８６１０）を使用した。下で記載される実験において、すべての培養物に、２容積パーセントの前培養物を接種した。１ｍＬの液体培養培地と混合された凍結乾燥Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標））の１バイアル（バイアルは、最低１０６ＣＦＵを含有すると規定された；分析によれば、バイアルは３５×１０６ＣＦＵ／バイアルを含有した）の内容物を用いた液体培養培地の接種、および振とうフラスコにおける３７℃での嫌気的インキュベーションによって、前培養物を調製した。
【0052】
バイオリアクターとして、Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓバイオリアクター（Ｉｎｆｏｒｓ ＧｍｂＨ製、Ｅｉｎｓｂａｃｈ、独国）を使用した。さらなる材料、試薬、および装置は、下の実施例に記載される。
【0053】
実施例１：基質Ｎ－（３－［フリル］アクリロイル）－グリシンロイシンアミド（ＦＡＧＬＡ）を用いた継続的な測光アッセイを使用した、中性プロテアーゼの活性アッセイ
原理：Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼは、アミノ酸グリシンとロイシンとの間で基質ＦＡＧＬＡ中のペプチド結合の加水分解を触媒する。測光アッセイにおいて、基質変換を、３４５ｎｍにおける減少する吸光度によって継続的に測定した。ゆえに、吸光度の減少または結果として生じる負の勾配は、基質変換の、ゆえに酵素活性の直接的尺度である。
原理：Ｈａｔｈｅｗａｙａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼは、アミノ酸グリシンとロイシンとの間で基質ＦＡＧＬＡ中のペプチド結合の加水分解を触媒する。測光アッセイにおいて、基質変換を、３４５ｎｍにおける減少する吸光度によって継続的に測定した。ゆえに、吸光度の減少または結果として生じる負の勾配は、基質変換の、ゆえに酵素活性の直接的尺度である。
【0054】
単位規定：１ＦＡＧＬＡ単位（１Ｕ）は、１分間あたりの１μｍｏｌのＮ－［３－（２－フリル）アクリロイル］－グリシン－Ｌ－ロイシンアミドの加水分解として規定される。
【0055】
装置：温度制御型ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計（例えば、Ｃａｒｙ ５０、６０、または１００、Ａｇｉｌｅｎｔ）、円形振とう器（例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２）、ＵＶキュベットセミマイクロ（例えば、Ｂｒａｎｄ、品番７５９１５０）、セミマイクロ石英キュベット（例えば、Ｈｅｌｌｍａ）、ＰＤ－１０脱塩カラム（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、品番１７－０８５１－０１）。
【0056】
試薬：精製水、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）、２－モルホリノエタンスルホン酸一水和物、略語ＭＥＳ（例えば、Ｍｅｒｃｋ、品番７ １．０６０１２６）、塩化カルシウム二水和物（例えば、Ｍｅｒｃｋ、品番１．０２３８２）、分光法用のジメチルスルホキシド、略語ＤＭＳＯ（例えば、Ｍｅｒｃｋ、品番１．０２９５０．）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、品番２３，４７２－９）、２－プロパノール（例えば、Ｍｅｒｃｋ、品番１．０１０４０）、１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液（Ｍｅｒｃｋ、品番１．０９１３７）、ＦＡ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－ＮＨ２（例えば、Ｂａｃｈｅｍ、品番４００３６１５）、現行参照物質中性プロテアーゼＮＢ（ＲＥＦ００２３６）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、略語Ｔｒｉｓ（例えば、Ｍｅｒｃｋ、品番１．０８３８２．）、１ｍｏｌ／ｌ塩酸（例えば、Ｍｅｒｃｋ、品番１．０９０５７）。
【0057】
試薬溶液：
ａ）ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５：１０．６７ｇ（０．０５ｍｏｌ）の２－モルホリノエタンスルホン酸一水和物および０．７３５ｇ（０．００５ｍｏｌ）の塩化カルシウム二水和物を、およそ８００ｍｌの精製水に溶解した。次いで、１０ｍｌの２－プロパノール（１％（ｖ／ｖ））を緩衝液混合物に添加した。１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを室温で６．５に調整し、精製水で最大で１０００ｍｌまで充填した。１００μｌピストンストロークピペットを使用することによって撹拌しながら、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を緩衝液に添加して、高粘性Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液（０．０１％（ｖ／ｖ））をゆっくりとピペッティングした。界面活性剤を緩衝液混合物に添加し、最後に先端を緩衝液に入れた。均一に達するまで溶液を撹拌した。獲得された緩衝溶液は、０．０５ｍｏｌ／ｌの２－モルホリノエタンスルホン酸および０．００５ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウムの濃度を有する。
ａ）ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５：１０．６７ｇ（０．０５ｍｏｌ）の２－モルホリノエタンスルホン酸一水和物および０．７３５ｇ（０．００５ｍｏｌ）の塩化カルシウム二水和物を、およそ８００ｍｌの精製水に溶解した。次いで、１０ｍｌの２－プロパノール（１％（ｖ／ｖ））を緩衝液混合物に添加した。１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを室温で６．５に調整し、精製水で最大で１０００ｍｌまで充填した。１００μｌピストンストロークピペットを使用することによって撹拌しながら、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を緩衝液に添加して、高粘性Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液（０．０１％（ｖ／ｖ））をゆっくりとピペッティングした。界面活性剤を緩衝液混合物に添加し、最後に先端を緩衝液に入れた。均一に達するまで溶液を撹拌した。獲得された緩衝溶液は、０．０５ｍｏｌ／ｌの２－モルホリノエタンスルホン酸および０．００５ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウムの濃度を有する。
【0058】
ｂ）ＦＡＧＬＡ基質溶液（濃度＝２．５ｍｍｏｌ／ｌ）：まず、０．１Ｍ ＦＡＧＬＡ溶液を調製した（３６．９ｍｇのＦＡＧＬＡを１．２ｍｌジメチルスルホキシドに溶解した）。次いで、１ｍｌの０．１Ｍ ＦＡＧＬＡ溶液を、ａ）に記載される３９ｍｌのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５と混合した。
【0059】
ｃ）参照物質：およそ１２～２０ｍｇの参照物質中性プロテアーゼＮＢ（Ｎｏｒｄｍａｒｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｅｔｅｒｓｅｎ、独国）を計量し、ａ）に記載されるＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５を用いて１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した。この溶液を氷上で保存した。さらなる希釈物（下に記載される妥当な作業範囲にある）を、ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５を用いてこの溶液から調製した。およそ２．５～３．６ｍｇ／ｍｌの参照物質を使用した。吸光度変化は、妥当な作業範囲内になければならない。分析物溶液を、ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５を用いた判定の直前に室温で調製し、すぐに測定した。参照物質の活性を、妥当な作業範囲内の少なくとも１種の希釈物に対して二重測定を行った。
【0060】
ｄ）トリス緩衝液ｐＨ９．５：０．６０６ｇ（０．００５ｍｏｌ）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび０．３７ｇ（０．００２５ｍｏｌ）の塩化カルシウム二水和物を、およそ４００ｍｌの精製水に溶解した。１ｍｏｌ／ｌ塩酸を用いてｐＨを室温で９．５に調整し、精製水で最大で５００ｍｌまで充填した。結果として生じた緩衝液は、０．０１ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび０．００５ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウムの濃度を有した。
【0061】
サンプル調製：
少なくとも１回の二重測定を行った。活性に応じて、サンプルを、妥当な作業範囲となるように希釈した（下を参照されたい）。無細胞培養上清の濃縮物からのサンプルを、測定前に、トリス緩衝液ｐＨ９．５で平衡化されたＰＤ－１０カラムで再緩衝化した。
少なくとも１回の二重測定を行った。活性に応じて、サンプルを、妥当な作業範囲となるように希釈した（下を参照されたい）。無細胞培養上清の濃縮物からのサンプルを、測定前に、トリス緩衝液ｐＨ９．５で平衡化されたＰＤ－１０カラムで再緩衝化した。
【0062】
実行：
温度制御型ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計において＋３０℃および３４５ｎｍの波長で、試験を実施した。３４５ｎｍにおける吸光度変化を、５分間の時間間隔で判定した。
温度制御型ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計において＋３０℃および３４５ｎｍの波長で、試験を実施した。３４５ｎｍにおける吸光度変化を、５分間の時間間隔で判定した。
【0063】
ＦＡＧＬＡ基質溶液を、実際の測定の前に、＋３０℃の水槽においておよそ３０分間予熱した。代替的には、０．８ｍｌ基質溶液を含むセミマイクロキュベットを、測定の前に、少なくとも１０分間ＵＶ－ＶＩＳ光度計において直接予熱し得る。一連の測定を開始する前に、光度計を、基質溶液なしのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に対して校正した。測定に関しては、０．８ｍｌの予熱された基質溶液をキュベットに入れた。次いで、０．２ｍｌサンプル溶液を添加し、ピペットで吸い上げる（およそ３回のピストンストローク）ことによって直ちに予混合し、反応混合物全体を使い捨て撹拌スパチュラで混合した。次いで、測定を直ちに開始した。試験における最終容積は１ｍｌであった。各サンプルに関して、少なくとも１回の二重測定を行った。２ｍｍｏｌ／ｌの特定の基質濃度は飽和値を下回った、すなわち、測定される特異的活性は基質濃度に依存する。それゆえ、アッセイにおける基質濃度は厳密に守られなければならず、同一の基質濃度で判定された活性のみが比較可能である。
【0064】
妥当な作業範囲：
評価可能な活性測定の前提条件は、－０．０１～－０．０３５の妥当な作業範囲における１分間あたりの吸光度変化（ΔＡ ３４５ｎｍ／分）であり、負の勾配の方向は線形でなければならない。値（ΔＡ ３４５ｎｍ／分）が高すぎる場合には、より強力な希釈が使用されなければならず、値が低すぎる場合には、より低い希釈が使用されるべきである。
評価可能な活性測定の前提条件は、－０．０１～－０．０３５の妥当な作業範囲における１分間あたりの吸光度変化（ΔＡ ３４５ｎｍ／分）であり、負の勾配の方向は線形でなければならない。値（ΔＡ ３４５ｎｍ／分）が高すぎる場合には、より強力な希釈が使用されなければならず、値が低すぎる場合には、より低い希釈が使用されるべきである。
【0065】
評価：
現行参照物質を評価した。まず、標的値および許容基準を規定した。二重測定の平均値から参照物質およびサンプルの活性を算出した。測定結果の負の吸光度変化（ΔＡ／分）を算出するために、０～５分間の値を評価した。評価のための許容基準：全測定値のΔＡ ３４５ｎｍ／分は、線形の作業域内になければならない。最大偏差は、平均値の≦８％であり得る。大きな偏差がある場合には、測定を繰り返した。
現行参照物質を評価した。まず、標的値および許容基準を規定した。二重測定の平均値から参照物質およびサンプルの活性を算出した。測定結果の負の吸光度変化（ΔＡ／分）を算出するために、０～５分間の値を評価した。評価のための許容基準：全測定値のΔＡ ３４５ｎｍ／分は、線形の作業域内になければならない。最大偏差は、平均値の≦８％であり得る。大きな偏差がある場合には、測定を繰り返した。
【0066】
以下の式を使用して、未知の濃度を有するサンプルの活性を算出した：
【0067】
【数1】
【0068】
以下の式を使用して、既知の重量を有するサンプルの活性を算出した：
【0069】
【数2】
【0070】
ΔＡ＝３４５ｎｍにおける１分間あたりの吸収変化
ＶＦ＝サンプルの希釈倍率
Ｖ＝１ｍｌ（総容積）
ｖ＝０．２ｍｌ（サンプル容積）
ε＝－０．３１７ｍＭ－１ｃｍ－１ ＦＡＧＬＡの吸光係数
ｍ＝ｍｇ単位のサンプル重量
ＶＦ＝サンプルの希釈倍率
Ｖ＝１ｍｌ（総容積）
ｖ＝０．２ｍｌ（サンプル容積）
ε＝－０．３１７ｍＭ－１ｃｍ－１ ＦＡＧＬＡの吸光係数
ｍ＝ｍｇ単位のサンプル重量
【0071】
実施例２：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の培養上清におけるクロストリパイン活性の判定
原理：
酵素クロストリパインは、２５５ｎｍで光度的に測定される、カルシウムおよび還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、ベンゾイル－Ｌ－アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）の加水分解を触媒する（Ｋｅｚｄｙ ＦＪ，Ｌｏｒａｎｄ Ｌ，Ｍｉｌｌｅｒ ＫＤ．Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｃｅｎｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６５；４：２３０２－２３０８）。反応が擬０次のものである場合、つまり反応が一定である場合、単位時間あたりの吸光度の増加は、酵素濃度の直接的尺度である。１単位は、２．５ｍＭ ＤＴＴの存在下において、２５℃およびｐＨ７．８で１分間あたり１μｍｏｌ ＢＡＥＥの加水分解を触媒する酵素活性の量である。
原理：
酵素クロストリパインは、２５５ｎｍで光度的に測定される、カルシウムおよび還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、ベンゾイル－Ｌ－アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）の加水分解を触媒する（Ｋｅｚｄｙ ＦＪ，Ｌｏｒａｎｄ Ｌ，Ｍｉｌｌｅｒ ＫＤ．Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｃｅｎｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６５；４：２３０２－２３０８）。反応が擬０次のものである場合、つまり反応が一定である場合、単位時間あたりの吸光度の増加は、酵素濃度の直接的尺度である。１単位は、２．５ｍＭ ＤＴＴの存在下において、２５℃およびｐＨ７．８で１分間あたり１μｍｏｌ ＢＡＥＥの加水分解を触媒する酵素活性の量である。
【0072】
装置：温度制御型キュベットブロックボルテックス、回転子、石英キュベット、ｄ＝１０ｍｍを有する分光光度計Ｃａｒｙ ５０（Ｖａｒｉａｎ）。
【0073】
試薬：精製水、欧州薬局方およびＵＳＰ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｅｒｖａ、品番２０７１０）、Ｎａ－ベンゾイル－Ｌ－アルギニン－エチルエステルＨＣｌ（ＢＡＥＥ）（Ｓｅｒｖａ、品番１４６００）、リン酸二水素ナトリウム一水和物（Ｍｅｒｃｋ、品番６３４６）、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（Ｍｅｒｃｋ、品番０９１３７）、酢酸カルシウム水和物（Ｋｒａｆｔ、品番１５２０８）
【0074】
試薬溶液：７．５ｍＭ ＤＴＴ溶液：５７．８ｍｇ ＤＴＴを５０ｍｌ精製水に溶解した。溶液を毎日新たに調製した。１．５ｍＭ ＢＡＥＥ溶液：５１．８ｍｇ ＢＡＥＥを１００ｍｌ精製水に溶解した。溶液を毎日新たに調製した。７５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８：１０．３５ｇのリン酸二水素ナトリウムをおよそ８００ｍｌの精製水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを室温でｐＨ７，８に精確に調整した。次いで、溶液を精製水で最大で１０００ｍｌまで充填した。
【0075】
酵素溶媒：溶液Ａ（活性化なし）：１．０ｍＭ Ｃａ（ＯＡｃ）２：４０ｍｇ酢酸カルシウム水和物を２５０ｍｌ精製水に溶解した。溶液Ｂ（活性化あり）：５ｍＭ ＤＴＴを有する１．０ｍＭ Ｃａ（ＯＡｃ）２：３８．４ｍｇ ＤＴＴを溶液Ａで５０ｍｌに溶解した。溶液Ｃ（活性化あり）：２．５ｍＭ ＤＴＴを有する１．０ｍＭ Ｃａ（ＯＡｃ）２：１９．２ｍｇ ＤＴＴを溶液Ａで５０ｍｌに溶解した。溶液を毎日新たに調製した。
【0076】
参照物質：各分析に関して、同一性のための参照物質としてのコラゲナーゼＮＢ１（Ｎｏｒｄｍａｒｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｅｔｅｒｓｅｎ、独国）も分析した。
【0077】
サンプル調製：無細胞培養上清中のタンパク質濃度を、分光光度法によって２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって判定した。無細胞培養上清の３つのサンプルを採取し、各サンプルを、溶液Ｂの１ｍｌあたり２０ｍｇのサンプルの濃度に溶液Ｂで希釈した。
【0078】
これらの希釈されたサンプルのそれぞれを以下のように分割した：
【0079】
【数3】
【0080】
サンプルＸおよびサンプルＹを＋４℃で４０分間～４時間インキュベートし、次いで１００μｌのサンプルＸを９００μｌの溶液Ｃでさらに希釈し、２００μｌのサンプルＹを２００μｌの溶液Ａでさらに希釈して、測定に備えたサンプルＸおよびＹを獲得する（「サンプルＸｍ」および「サンプルＹｍ」）。
【0081】
実行：
活性化サンプルＸｍおよび非活性化サンプルＹｍを並行して測定した。加えて、ゼロ測定を実施した。以下の量の試薬（２５℃に事前に予熱された）を石英キュベットにピペットで入れた：
活性化サンプルＸｍおよび非活性化サンプルＹｍを並行して測定した。加えて、ゼロ測定を実施した。以下の量の試薬（２５℃に事前に予熱された）を石英キュベットにピペットで入れた：
【0082】
【表1】
【0083】
サンプルＸｍおよびサンプルＹｍをそれぞれ最後に添加し、キュベットの内容物を混合し、２５℃で５分間混合した直後に２５５ｎｍで吸光度の変化を測定した。勾配ΔＡ ２５５ｎｍ／分を、曲線の線形領域において評価した。サンプルの１分間あたりの２５５ｎｍにおける吸光度の測定された勾配は、５分間全体にわたって線形でなければならず、そうでなければ希釈が適合されなければならない。
【0084】
活性の算出：
以下の式を使用して、活性を算出した：
以下の式を使用して、活性を算出した：
【0085】
【数4】
【0086】
ΔＡ２５５ｎｍ：２５５ｎｍにおける１分間あたりの勾配
ＶＧ：試験において使用された総容積（ＶＧ＝３．１ｍｌ）
ＶＰ：試験において使用されたサンプルの容積（ＶＰ＝０．１ｍｌ）
０．８１：２５５ｎｍにおけるベンゾイル－Ｌ－アルギニンに対するＢＡＥＥのモル吸収差、すなわち８１０Ｍ－１ｃｍ－１
希釈倍率：無細胞培養上清のサンプルから始まり測定までのすべての希釈の倍率
ＶＧ：試験において使用された総容積（ＶＧ＝３．１ｍｌ）
ＶＰ：試験において使用されたサンプルの容積（ＶＰ＝０．１ｍｌ）
０．８１：２５５ｎｍにおけるベンゾイル－Ｌ－アルギニンに対するＢＡＥＥのモル吸収差、すなわち８１０Ｍ－１ｃｍ－１
希釈倍率：無細胞培養上清のサンプルから始まり測定までのすべての希釈の倍率
【0087】
実施例３：液体培養培地の調製
２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、６．５ｇ／Ｌのグリシン、６．７ｇ／Ｌのアルギニン、０．３２ｇ／Ｌのグルタミン、０．４２ｇ／Ｌのセリン、１．００ｇ／Ｌのトレオニン、９９５ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、２６０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、および１．１７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、ならびに１０ｍｇのシリコーンベースの消泡剤（ＸＩＡＭＥＴＥＲ（商標）ＡＣＰ－１５００（ＥＵ）消泡化合物）を、約６００ｍｌの精製水が事前に充填された１リットルフラスコに添加し、その後フラスコを、最大で１リットルの液体培養培地の全容積まで撹拌下にて精製水で充填した。最後に、液体培養培地をオートクレーブにおいて滅菌した。滅菌後、水中１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加によって、ｐＨを７．５に調整した。
２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、６．５ｇ／Ｌのグリシン、６．７ｇ／Ｌのアルギニン、０．３２ｇ／Ｌのグルタミン、０．４２ｇ／Ｌのセリン、１．００ｇ／Ｌのトレオニン、９９５ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、２６０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、および１．１７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、ならびに１０ｍｇのシリコーンベースの消泡剤（ＸＩＡＭＥＴＥＲ（商標）ＡＣＰ－１５００（ＥＵ）消泡化合物）を、約６００ｍｌの精製水が事前に充填された１リットルフラスコに添加し、その後フラスコを、最大で１リットルの液体培養培地の全容積まで撹拌下にて精製水で充填した。最後に、液体培養培地をオートクレーブにおいて滅菌した。滅菌後、水中１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加によって、ｐＨを７．５に調整した。
【0088】
実施例４：前培養のための液体培養培地の調製
２０ｇの酵母抽出物、６．５ｇのグリシン、６．７ｇのアルギニン、０．３２ｇのグルタミン、０．４２ｇのセリン、１．００ｇのトレオニン、９９５ｍｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、２６０ｍｇの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、１．１７ｍｇの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、および４１．８６ｇの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、ならびに１０ｍｇのシリコーンベースの消泡剤（ＸＩＡＭＥＴＥＲ（商標）ＡＣＰ－１５００（ＥＵ）消泡化合物）を、約６００ｍｌの精製水が事前に充填された１リットルフラスコに添加した。その後フラスコを、最大で１リットルの液体培養培地の全容積まで撹拌下にて精製水で充填し、水中１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加によって、ｐＨを７．９に調整した。最後に、液体培養培地をオートクレーブにおいて滅菌した。
２０ｇの酵母抽出物、６．５ｇのグリシン、６．７ｇのアルギニン、０．３２ｇのグルタミン、０．４２ｇのセリン、１．００ｇのトレオニン、９９５ｍｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、２６０ｍｇの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）、１．１７ｍｇの亜セレン酸ナトリウム五水和物（Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ）、および４１．８６ｇの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、ならびに１０ｍｇのシリコーンベースの消泡剤（ＸＩＡＭＥＴＥＲ（商標）ＡＣＰ－１５００（ＥＵ）消泡化合物）を、約６００ｍｌの精製水が事前に充填された１リットルフラスコに添加した。その後フラスコを、最大で１リットルの液体培養培地の全容積まで撹拌下にて精製水で充填し、水中１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加によって、ｐＨを７．９に調整した。最後に、液体培養培地をオートクレーブにおいて滅菌した。
【0089】
実施例５：液体飼料組成物の調製
１００ｇの酵母抽出物、５ｇのトレオニン、および２．５ｇのセリンを、約６００ｍｌの精製水が事前に充填された１リットルフラスコに添加し、その後フラスコを、最大で１リットルの液体培養培地の全容積まで撹拌下にて精製水で充填した。最後に、液体培養培地をオートクレーブにおいて滅菌した。
１００ｇの酵母抽出物、５ｇのトレオニン、および２．５ｇのセリンを、約６００ｍｌの精製水が事前に充填された１リットルフラスコに添加し、その後フラスコを、最大で１リットルの液体培養培地の全容積まで撹拌下にて精製水で充填した。最後に、液体培養培地をオートクレーブにおいて滅菌した。
【0090】
実施例６：第１の前培養
１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、実施例４に従って調製した１００ｍＬ培地を充填した。約１ｍＬの培地をフラスコから取り出し、１バイアルの凍結乾燥Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１（約３５×１０６ＣＦＵ／バイアル）またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）の内容物をその培地と混合した。培地にこの混合物を接種した。このようにして調製された培養物を、振とうなしで２４時間（±１時間）成長させた。成長は、インキュベーターにおける酸素を排除する嫌気的ポット（アネロカルト（Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ）、メーカーＭｅｒｃｋ）において、または嫌気的ガス雰囲気（窒素８５％、二酸化炭素１０％、および水素５％）を有する嫌気的作業台において行われた。周囲温度を３７℃に保った。
１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、実施例４に従って調製した１００ｍＬ培地を充填した。約１ｍＬの培地をフラスコから取り出し、１バイアルの凍結乾燥Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１（約３５×１０６ＣＦＵ／バイアル）またはＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）の内容物をその培地と混合した。培地にこの混合物を接種した。このようにして調製された培養物を、振とうなしで２４時間（±１時間）成長させた。成長は、インキュベーターにおける酸素を排除する嫌気的ポット（アネロカルト（Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ）、メーカーＭｅｒｃｋ）において、または嫌気的ガス雰囲気（窒素８５％、二酸化炭素１０％、および水素５％）を有する嫌気的作業台において行われた。周囲温度を３７℃に保った。
【0091】
実施例７：第２の前培養
１Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、実施例４に従って調製した１００ｍＬ培地を充填した。培地に、５ｍＬの第１の前培養物（第２の前培養培地容積の５％に相当する）を接種した。培養物を、振とうなしで１２時間（±０．５時間）成長させた。成長は、実施例６に開示される嫌気的条件下、および３７℃の周囲温度で行われた。３０Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、第２の前培養物を、実施例４に従って調製した１０００ｍＬ培地が充填された１０００ｍＬフラスコにおいて調製した。培地に、５０ｍＬの第１の前培養物（第２の前培養培地容積の５％に相当する）を接種した。培養物を、振とうなしで１２時間（±０．５時間）成長させた。成長は、実施例６に開示される嫌気的条件下、および３７℃の周囲温度で行われた。
１Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、実施例４に従って調製した１００ｍＬ培地を充填した。培地に、５ｍＬの第１の前培養物（第２の前培養培地容積の５％に相当する）を接種した。培養物を、振とうなしで１２時間（±０．５時間）成長させた。成長は、実施例６に開示される嫌気的条件下、および３７℃の周囲温度で行われた。３０Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、第２の前培養物を、実施例４に従って調製した１０００ｍＬ培地が充填された１０００ｍＬフラスコにおいて調製した。培地に、５０ｍＬの第１の前培養物（第２の前培養培地容積の５％に相当する）を接種した。培養物を、振とうなしで１２時間（±０．５時間）成長させた。成長は、実施例６に開示される嫌気的条件下、および３７℃の周囲温度で行われた。
【0092】
実施例８：バイオリアクターにおける主培養
１Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、開始容積の培地（０．６Ｌ）に、１２ｍＬの第２の前培養物（培地容積の２％に相当する）を接種した。３０Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、開始容積の培地（２７Ｌ）に、５４０ｍＬの第２の前培養物（培地容積の２％に相当する）を接種した。
１Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、開始容積の培地（０．６Ｌ）に、１２ｍＬの第２の前培養物（培地容積の２％に相当する）を接種した。３０Ｌバイオリアクターにおける発酵に関しては、開始容積の培地（２７Ｌ）に、５４０ｍＬの第２の前培養物（培地容積の２％に相当する）を接種した。
【0093】
それぞれのシステムおよびそれぞれの規模に関する発酵パラメーターは、下の表１に示される：
【0094】
表１：２種の異なるバイオリアクターにおける発酵に関するパラメーター
【表2】
【0095】
液体培養培地をバイオリアクターに導入し、滅菌した（オートクレーブにおけるＭｕｌｔｉｆｏｒｓ；Ｔｅｃｈｆｏｒｓリアクターそれ自体）。その後、接種前に、バイオリアクターに窒素をフラッシュし、少なくとも３時間撹拌した。２容積パーセントの接種源を使用した。実施例７の相当する量の第２の前培養物を、滅菌シリンジを使用して第２の前培養物から取り出し、主培養物に、バイオリアクターの接種ポートを介して接種した。３０Ｌ規模に関しては、ホースを介してバイオリアクターに前培養物を注ぎ込んだ（前培養物が入った容器を、接種源の正確な量を判定するために秤に置いた）。培養時間は１５～１９時間、主に１７時間であり、実施例５に従って調製した液体飼料組成物の添加を、９時間の発酵後に開始した。
【0096】
以下の表は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｇ１１を用いた上清において判定されたプロテアーゼの量を示している：
【0097】
【表3】
【0098】
この過程に対するスケールアップは成功し、コラゲナーゼ、クロストリパイン、および中性プロテアーゼのいずれに対する活性を有意に喪失することもなく達成され得ることがはっきりと見られ得る。
【0099】
以下の表は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ（商標）２１０００（商標）を用いた上清において判定されたプロテアーゼの量を示している：
【0100】
【表4】
【0101】
酵素の大規模産生は成功し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍの異なる系統を用いて達成され得ることがはっきりと見られ得る。
【国際調査報告】