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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-22
(54)【発明の名称】レバウジオシドの製造
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20250115BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20250115BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250115BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250115BHJP
C12P 7/40 20060101ALI20250115BHJP
C12N 9/26 20060101ALN20250115BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10
C12P19/04 Z ZNA
C12N1/19
C12N1/21
C12P7/40
C12N9/26 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538436
(86)(22)【出願日】2022-12-26
(85)【翻訳文提出日】2024-06-24
(86)【国際出願番号】 KR2022021326
(87)【国際公開番号】W WO2023121426
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】10-2021-0187435
(32)【優先日】2021-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500578515
【氏名又は名称】サムヤン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コ，ヒョクジン
(72)【発明者】
【氏名】ムン，ジュンホ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジョンミン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ミンヨン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ブス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD07
4B064AF11
4B064BA10
4B064BB01
4B064BB11
4B064BB21
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC24
4B064DA10
4B065AA26X
4B065AA77X
4B065AA79X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD11
4B065CA27
4B065CA41
(57)【要約】
本明細書は、ＵＤＰ－グリコシル転移酵素とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を利用してレバウジオシドＭを高純度に含むステビオール配糖体を製造するための組成物、およびこれを利用したステビオール配糖体の製造方法に関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移する第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒、および反応基質を含み、レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上で含まれる、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物。
【請求項2】
前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目および２０２番目のアミノ酸からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸が、セリンおよびバリンからなる群より選択された１種以上のアミノ酸で置換されたアミノ酸を含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記生触媒は、スクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）タンパク質を追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記スクロース合成酵素は、第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素およびＵＧＴ７６Ｇ１酵素からなる群より選択された１種以上の酵素と、直接またはリンカーを介して連結された融合タンパク質で提供されるものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の５０重量％以上で含まれる請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記生触媒は、前記酵素タンパク質、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移する第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒、および反応基質を含み、前記生触媒は、前記酵素タンパク質を産生する微生物の菌体、および前記菌体の乾燥物からなる群より選択された１種以上である、
レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上で含まれる、請求項１に記載のレバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物。
【請求項8】
前記菌体の乾燥物が、Ｒｅｂ Ｍ転換率とＲｅｂ Ｄの合計転換率が３０％以上を有するものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記菌体の乾燥物が、常温で９週間保管後、菌体の酵素活性が、乾燥直後菌体のレバウジオシドＭ転換活性の９０％以上である請求項７に記載の組成物。
【請求項10】
前記凍結乾燥菌体は、－６０～４０℃の温度および減圧条件で凍結乾燥された乾燥物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項11】
前記組成物は、エチレンジアミンテトラ酢酸を追加的に含む請求項７に記載の組成物。
【請求項12】
前記エチレンジアミンテトラ酢酸の濃度は、１～２０ｍＭである請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記反応基質は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上のステビオール配糖体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
前記反応基質は、１５～１５０ｇ／Ｌで提供される請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
前記生触媒は、大腸菌、サッカロマイセス属菌株またはピキア属菌株である請求項１に記載の組成物。
【請求項16】
前記微生物は、ｉｎｖｅｒｔａｓｅ酵素をコードするＳＵＣ２遺伝子が欠失されたサッカロマイセス属微生物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
前記組成物は、ＭｇＣｌ2またはＭｎＣｌ2を追加的に含む請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＵＤＰ）およびスクロースからなる群より選択された１種以上を追加的に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項19】
前記スクロースを５００～２０００ｍＭの濃度で含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記反応基質は、ｐＨ４～９である、請求項１に記載の組成物。
【請求項21】
ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上を含む反応基質と、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を反応する工程を含む、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であり、
レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上で含まれる、方法。
【請求項22】
前記生触媒は、前記酵素タンパク質、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上を含む反応基質と、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を反応する工程を含む、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であり、
前記生触媒は、前記酵素タンパク質を産生する微生物の菌体、および前記菌体の乾燥物からなる群より選択された１種以上である、
請求項２１に記載のレバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法。
【請求項24】
前記反応温度は、２０～６０℃であり、反応ｐＨは、ｐＨ４～９で行われる請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記反応基質は、１５～１５０ｇ／Ｌで提供される請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記菌体の乾燥物が、Ｒｅｂ Ｍ転換率とＲｅｂ Ｄの合計転換率が３０％以上を有する、請求項２３に記載の方法
【請求項27】
前記菌体の乾燥物が、常温で９週間保管後、菌体の酵素活性が、保管開始時点菌体のレバウジオシドＭ転換活性の９０％以上である請求項２３に記載の方法。
【請求項28】
前記菌体の乾燥物は、－６０～４０℃の温度および減圧条件で凍結乾燥された乾燥物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項29】
前記反応する工程は、エチレンジアミンテトラ酢酸を１～２０ｍＭ濃度で添加して行う、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生触媒反応を利用したレバウジオシド製造、例えばレバウジオシド製造用微生物、およびこれを利用したレバウジオシド製造方法に関し、より詳細にはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを含むレバウジオシド製造用組換え微生物と、前記微生物を利用して高濃度ステビア抽出物からレバウジオシドを製造する方法に関する。
また、本発明は、改善されたレバウジオシドの製造方法に関し、特に長期間安定的に酵素活性を維持する凍結乾燥菌体を利用した、レバウジオシド製造用微生物およびこれを利用したレバウジオシド製造方法に関する。
また、本発明は、改善されたレバウジオシドの製造方法に関し、特に長期間安定的に酵素活性を維持する凍結乾燥菌体を利用した、レバウジオシド製造用微生物およびこれを利用したレバウジオシド製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
甘味料は、食品、飲料、または菓子産業で最も一般的に利用される成分として知られている。甘味料は、製造の間、最終食品産物に組み込まれたり、または単独用途で適切に希釈させた際に、食卓甘味料またはベ－キングにおける砂糖の代用品として家庭で利用することができる。甘味料は例えば、スクロース、高果糖コーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜のような天然甘味料や、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース（ｓｕｃｒａｌｏｓｅ）のような人工甘味料を含む。
【0003】
ステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物は、多年生低木、ステビアレバウジアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）から抽出できる天然甘味料である。様々なレベルで精製されたステビア抽出物は、食品およびブレンドで高感度調味料として使用されたり単独で食卓甘味料として市販されている。
【0004】
ステビア植物の抽出物は、レバウジオシドおよび甘味に寄与するその他ステビオール配糖体を含有するが、従来の市販製品は、主にレバウジオシドＡであり、少量のレバウジオシドＣ、Ｄ、およびＦのようなその他グリコシド（配糖体）がある。植物から抽出したステビア抽出物は、異臭（ｏｆｆ－ｆｌａｖｏｒｓ）の原因となる誘導された化合物のような汚染物質を含有し得る。このような異臭は、選択された食品システムまたは用途によっては、問題になる可能性がある。
【0005】
また、ステビア抽出物の組成物は、植物が成長する土壌および気候によって非常に多様である。原料植物、気候条件、および抽出工程に応じて、商業的製造過程でレバウジオシドＡの量は総ステビオールグリコシド含有量の２０～９７％と多様であると報告されている。また他のステビオールグリコシドがステビア抽出物内に様々な量で存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
但し、ステビア植物から製造されたステビア抽出物は、多数のステビオール配糖体と異臭の原因になる化合物を含有しており、回収および精製が労働集約的で非効率的であるため、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｍのようなステビオール配糖体を高収率で製造するおよび蓄積できる製造システムが求められている。
特に、Ｒｅｂ Ｍは、砂糖の２００～３５０倍の甘味を有し、後味が少し苦いか甘草の香りがするすっきりした甘味を有している。近年、食品添加物および香料に関するＥＦＳＡパネルは、Ｒｅｂ Ｍが食品添加物として安全であると発表した。Ｒｅｂ Ｍは、ブレンドに適して様々な食品および飲料製品に適用可能であるため、大きな関心を集めることができ、グローバル食品産業の天然甘味料として持続的な需要を呼び起こることができる。
また、ステビオール配糖体の転換活性を有する酵素を産生する微生物の菌体のような生触媒に含まれた水分を除去する製造工程および条件を確立して、転換活性が維持される保管性および流通性に優れた生触媒を提供し、前記生触媒を利用したステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの大量製造工程が切実に必要な実情である。
特に、Ｒｅｂ Ｍは、砂糖の２００～３５０倍の甘味を有し、後味が少し苦いか甘草の香りがするすっきりした甘味を有している。近年、食品添加物および香料に関するＥＦＳＡパネルは、Ｒｅｂ Ｍが食品添加物として安全であると発表した。Ｒｅｂ Ｍは、ブレンドに適して様々な食品および飲料製品に適用可能であるため、大きな関心を集めることができ、グローバル食品産業の天然甘味料として持続的な需要を呼び起こることができる。
また、ステビオール配糖体の転換活性を有する酵素を産生する微生物の菌体のような生触媒に含まれた水分を除去する製造工程および条件を確立して、転換活性が維持される保管性および流通性に優れた生触媒を提供し、前記生触媒を利用したステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの大量製造工程が切実に必要な実情である。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一例は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移する第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒、および反応基質を含み、レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上で含まれる、ステビオール配糖体製造用組成物、またはその製造方法に関する。
【0008】
本発明の一例は、新規なＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを含むレバウジオシド製造用組換え微生物、好ましくはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅおよびＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１を含むか、より好ましくはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１およびスクロース合成酵素を含有する生触媒を含む、高純度レバウジオシドＭを製造するための組成物を提供する。
【0009】
本発明の一例は新規なＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを含むレバウジオシド製造用組換え微生物、好ましくはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１を含むか、より好ましくはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１およびスクロース合成酵素を含有する生触媒を含む、レバウジオシドＭがステビオール配糖体反応生成物の５０重量％以上で含まれる、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物に関する。
【0010】
本発明の追加一例は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上を含む反応基質と、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を反応する工程を含む、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
【0011】
本発明の追加例は、微生物が有している酵素活性を乾燥状態で長期間安定して維持できる凍結乾燥微生物菌体を利用したレバウジオシド製造用微生物およびこれを利用したレバウジオシド製造方法に関する。
【0012】
本発明の追加例は、ステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの転換活性を有する微生物菌体またはその乾燥菌体であってもよい。
【0013】
本発明の追加例は、ステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの転換活性を有する微生物菌体またはその乾燥菌体を含むステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの製造用組成物またはステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【0014】
本発明は、外来ＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１およびスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）からなる群より選択された１種以上の酵素を発現する、ステビアからレバウジオシドＭ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｍ）転換活性を有する、形質転換微生物、およびこれを利用したレバウジオシドＭの製造方法に関し、前記形質転換微生物は高いレバウジオシドＭ生産性を有する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の一例に係るＴａＵＧＴｍ酵素を産生する酵母菌株の製造のためのベクターの開裂地図（ｃｌｅａｖａｇｅ ｍａｐ）である。
【図2】本発明の一例に係るＴａＵＧＴｍ酵素の反応生成物をＨＰＬＣ分析で分析して得られた結果グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書は、新規なＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを含むレバウジオシド製造用組換え微生物、好ましくはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１を含むか、より好ましくはＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１およびスクロース合成酵素を含有する生触媒を利用して、レバウジオシドＭを高純度で含むステビオール配糖体製造用組成物、およびこれを利用したステビオール配糖体の製造方法に関する。
【0017】
本願の一例は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、具体的に配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移する第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒、および反応基質を含み、レバウジオシドＭがステビオール配糖体反応生成物の５０重量％以上で含まれる、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物に関する。
【0018】
本願の追加例は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移する第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒、および反応基質を含み、
前記生触媒は、前記酵素タンパク質を産生する微生物の菌体、および前記菌体の乾燥物からなる群より選択された１種以上である、
レバウジオシドＭがステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上で含まれる、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物に関する。
前記生触媒は、前記酵素タンパク質を産生する微生物の菌体、および前記菌体の乾燥物からなる群より選択された１種以上である、
レバウジオシドＭがステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上で含まれる、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物に関する。
【0019】
また、前記レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物を使用して転換反応を行うる場合、例えばＲｅｂ Ａおよびステビオシドを含む原料基質を使用する場合、レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の１０重量％以上、１５重量％以上、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、８６重量％以上、８７重量％以上、または９０重量％以上であってもよい。前記レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物は、Ｒｅｂ Ｍ転換率とＲｅｂ Ｄの合計転換率が３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上または５０重量％以上であってもよい。
【0020】
前記組成物は、好ましくはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を追加的に含むことができ、例えば１～２０ｍＭ、３～２０ｍＭ、４～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、３～１５ｍＭ、４～１５ｍＭ、１～１０ｍＭ、３～１０ｍＭ、または４～１０ｍＭであってもよい。前記レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物がＥＤＴＡを含む場合、前記レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体製造用組成物を使用して転換反応を行うる場合、例えばＲｅｂ Ａおよびステビオシドを含む原料基質を使用する場合、レバウジオシドＭが、ステビオール配糖体反応生成物の５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、８６重量％以上、８７重量％以上、または９０重量％以上であってもよい。
【0021】
前記組成物は、ステビア抽出物、ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｏｓｅ（ＵＤＰ）およびスクロースからなる群より選択された１種以上を含む反応原料物質を追加的に含むことができる。一実施様態で、前記ステビオール配糖体製造用組成物でｒｅｂ Ａのｒｅｂ Ｄへの転換にはＭｇＣｌ2および／またはＭｎＣｌ2を追加的に含むことができる。
【0022】
本願のさらに他の例は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上を含む反応基質と、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を反応する工程を含む、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法であって、
前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
【0023】
本発明の一例は、第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択された１種以上の基質をグルコースドナーの存在下で反応してＲｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択された１種以上のステビオール配糖体を製造する工程、および
前記製造されたステビオール配糖体、第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、グルコースドナーの存在下で反応する工程を含む、ステビオール配糖体のＲｅｂ Ｍの製造方法に関する。
前記製造されたステビオール配糖体、第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上と、グルコースドナーの存在下で反応する工程を含む、ステビオール配糖体のＲｅｂ Ｍの製造方法に関する。
【0024】
本発明のさらに他の一例は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上を含む反応基質と、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素とＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を反応する工程を含む、レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法であって、
前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であり、
前記生触媒は、前記酵素タンパク質を産生する微生物の菌体、および前記菌体の乾燥物からなる群より選択された１種以上である、
レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であり、
前記生触媒は、前記酵素タンパク質を産生する微生物の菌体、および前記菌体の乾燥物からなる群より選択された１種以上である、
レバウジオシドＭを含むステビオール配糖体の製造方法に関する。
【0025】
前記Ｒｅｂ Ｍの製造工程で使用された第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素タンパク質は、ＵＧＴ７６Ｇ１などであってもよい。
【0026】
本発明に係るステビオール配糖体の製造方法は、製造周期を顕著に短縮し、製造能力を向上させ、コストが低く、より高純度の製品を提供できるため、食品、飲料業界によって経済的に利用することができる。
【0027】
本発明において、反応生成物であるレバウジオシドＭを含むステビオール配糖体で、レバウジオシドＭの純度は５０重量％以上であってもよい。
【0028】
前記反応基質は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上のステビオール配糖体を含むものであり、または１５～２００ｇ／Ｌで提供されるものである。前記反応基質は、ステビオールモノシド、ルブソシド、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＣ１、レバウジオシド１、ステビオシド、レバウジオシドＤ、合成ステビオールグリコシド、およびこれらの組み合わせからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
【0029】
Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａでステビオール配糖体の多様性は、活性化したドナー（ｄｏｎｏｒ）、主にウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－グルコースで、収容体分子に糖残基を伝達するＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ、ＵＤＰ－グルコシル転移酵素）によって触媒されるグリコシル化反応に起因する。ＲｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＭ（Ｒｅｂ Ｍ）は、ステビアレバウジアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の葉に含有量が非常に少ない好ましい天然無カロリー高効能甘味料である。本発明に係るステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法によれば、Ｒｅｂ Ｍを高純度および高い転換率で製造することができる。
【0030】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明に係るステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法は、新規第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素と第２ＵＤＰ－グリコシル転移酵素であるＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を使用することができる。前記生触媒は、追加的に「スクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を含むことができ、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素および／またはＵＤＰ－グリコシル転移酵素と融合タンパク質を含むことができる。
本発明に係るステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法は、新規第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素と第２ＵＤＰ－グリコシル転移酵素であるＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を使用することができる。前記生触媒は、追加的に「スクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を含むことができ、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素および／またはＵＤＰ－グリコシル転移酵素と融合タンパク質を含むことができる。
【0031】
他の実施形態において、第３のＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼとして、レバウジオシドＡに少なくとも一つのグルコース単位を付加してレバウジオシドＤを形成することができる酵素、例えばＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２を追加的に含むことができる。
【0032】
本明細書において、前記酵素を含む生触媒は、前記酵素タンパク質、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含むことができる。
【0033】
本明細書において、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であってもよい。
【0034】
前記第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素は、ステビオシド（ＳＴＥ）をＲｅｂ Ｅに転換および／またはＲｅｂ ＡをＲｅｄ Ｄに転換して、Ｒｅｂ Ｄおよび／またはＲｅｂ Ｅを製造することができる。
【0035】
詳しくは、本発明に係る第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、グルコースドナーの存在下で、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａからなる群より選択される１種以上の基質からステビオール配糖体、例えばＲｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅからなる群より選択される１種以上に転換する活性を有し、さらに詳しくは、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｄに転換し、ステビオシドをＲｅｂ Ｅに転換することができ、Ｒｅｂ Ａおよびステビオシドの単独基質または混合基質に対してはいずれも転換活性を有する。
【0036】
また、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄへの転換は、ステビオール環（Ｓｔｅｖｉｏｌ ｒｉｎｇ）でｂｅｔａ１－２ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄの結合により、グルコースを転移するもので、主にステビオール環の１９番位置で糖化が起こる。ステビオール配糖体は、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）がβ結合で１～３個が結合したものである。
【0037】
Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄへの転換反応は、グルコースが１分子さらに添加される反応で、ＵＧＴ酵素によって起きる。この反応に必要なグルコースは、活性形態であるＵＤＰ－グルコースが必要であり、ＵＧＴ酵素がＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移してステビオール配糖体を製造する。
【0038】
前記第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（小麦）に由来した酵素（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（以下、ＴａＵＧＴという）、またはその変異酵素（以下、ＴａＵＧＴｍという）であってもよい。詳しくは、前記第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と９２％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ステビオール配糖体基質にグルコースを転移するＵＤＰ－グリコシル転移活性を有する酵素タンパク質であり、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質は野生型酵素であってもよい。
【0039】
本発明の野生型ＴａＵＧＴの核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を暗号化する核酸配列であることもありながら、具体的に配列番号２の核酸配列であるが、これに制限されない。
【0040】
前記第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と配列同一性が９２％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または９９．５％以上のアミノ酸配列を含むことができ、酵素タンパク質と同等の効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を含む変異型酵素タンパク質も含む。
【0041】
前記第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を暗号化するポリヌクレオチド配列と配列同一性が４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上のポリヌクレオチド配列によって暗号化されるものであってもよい。
【0042】
前記において、用語「相同性」または「一致性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、百分率で表される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」または「％同一性」で表される。
【0043】
前記変異型第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型酵素のレバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）基質をレバウジオシドＤ（Ｒｅｂ Ｄ）に転換する活性１００％を基準に、１０１％以上、例えば１０１％～２００％の活性を有するものであってもよい。すなわち、酵素の活性向上のために、突然変異による酵素改良を実施して、Ｒｅｂ ＤとＲｅｂ Ｅの製造速度を向上させ、第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素、例えばステビア由来のＵＧＴ７６Ｇ１と反応して、レバウジオシドＭ（Ｒｅｂ Ｍ）を製造することができる。これにより、酵素転換反応を通じたＲｅｂ ＤとＲｅｂ Ｅの生産性を増加させて、これを利用してＲｅｂ Ｍという高機能性糖を高い生産性で製造することができる。
【0044】
前記変異型第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目のトレオニンがセリンに置換、２０２番目のバリンがロイシンに置換または２０１番目のトレオニンがセリンに置換と２０２番目バリンがロイシンに置換を含むものであり、さらに詳しくは配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。
【0045】
また、前記変異酵素を暗号化する核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から２０１番目のトレオニンがセリンに置換、２０２番目のバリンがロイシンに置換または２０１番目のトレオニンがセリンに置換と２０２番目バリンがロイシンに置換を含むものであり、さらに詳しくは配列番号３のアミノ酸配列によって暗号化される核酸配列を含むことができる。配列番号３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列を暗号化する核酸配列を含む変異酵素で、前記アミノ酸配列を暗号化する核酸配列は、配列番号３の核酸配列であってもよい。
【0046】
本発明に係る変異酵素ＴａＵＧＴｍ（Ｔ２０１Ｓ）は、配列番号１の野生型酵素アミノ酸配列でＮ－末端から２０１番に位置するＴｈｒがＳｅｒに置換されたものであり、例えばＡＣＣがＴＣＡに置換され、ＴａＵＧＴｍ（Ｖ２０２Ｌ）は、２０１番に位置するＶａｌがＬｅｕに置換されたものであり、例えばＧＴＡがＴＴＡに置換されたもので、またはＴａＵＧＴｍ（Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ）は、配列番号１の野生型酵素アミノ酸配列でＮ－末端から２０１番および２０２番のアミノ酸に該当するＴｈｒ－ＶａｌがＳｅｒ－Ｌｅｕに置換されたものであり、さらに詳しくは配列番号２のポリヌクレオチド配列でＡＣＣＧＴＡがＴＣＡＴＴＡに置換されるものであってもよい。
【0047】
本発明に係る変異型第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、２時間～２４時間酵素反応で、Ｒｅｂ Ａの４５重量％以上がＲｅｂ Ｄに転換する活性を有し、具体的にＲｅｂ Ａの４５重量％以上、５０重量％以上、７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上または９５重量％以上が、Ｒｅｂ Ｄに転換する活性を有し、好ましくは０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上または９５重量％以上がＲｅｂ Ｄに転換する活性を有する。さらに詳しくは前記酵素の転換活性は３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で測定されたものである。前記Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）は、下記数式１に従って計算され、詳細は実施例４に記載されている。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
【0048】
本発明に係る変異型第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素に比べて、２時間～２４時間の酵素反応で、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性として、Ｒｅｂ Ｄの相対転換率が１０１％以上、１０３％以上、１０５％以上、１０７％以上、１０８％以上、１０９％以上、または１１０％以上を有し、さらに好ましくは１０５％以上、１０７％以上、１０８％以上、１０９％以上、１１０％以上、１１５％以上、１２０％以上または１２５％以上を有する。前記酵素の転換活性は、３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍの条件で測定されたものである。前記酵素のＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、数式１に従って計算する。詳しい測定基準は下記実施例４に記載されている。
【0049】
また、第１変異型ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質で２時間～２４時間酵素反応で、Ｒｅｂ Ａおよびステビオシドを含む混合基質の５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、７９重量％以上、８０重量％以上、８１重量％以上、８２重量％以上、８３重量％以上、８５重量％以上、または８７重量％以上がＲｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅに転換する活性（Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率）を有する。さらに詳しくは前記酵素の転換活性は、３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で測定されたものである。
【0050】
本発明に係る変異型第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素に比べて、ステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質で２時間～２４時間酵素反応で、Ｒｅｂ Ａおよびステビオシドを含む混合基質の５０重量％以上がＲｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｅに転換する活性（Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率）をＲｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性とステビオシドをＲｅｂ Ｅに転換する活性の合計活性として、Ｒｅｂ Ｄ／Ｅの相対転換率が１０３重量％以上、１０５重量％以上、１０６重量％以上、１０８重量％以上、１０９重量％以上、または１１０重量％以上を有する。さらに詳しくは前記酵素の転換活性は、３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件およびｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ：ＳＴＥ（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）=４０：６０を有する混合基質を使用して測定されたものである。前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計相対転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ転換率１００重量％を基準に換算した野生型酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ転換率を意味する。すなわち、混合基質に対するＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率は。下記数式２に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅの相対的合計転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率１００重量％を基準に換算した変異型ＴａＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
【0051】
本発明に係る第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素の野生型酵素は、植物由来の酵素を探索して得られた、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の酵素に関する。前記タンパク質の機能を明らかにしてＵＧＴ酵素活性を確認し、ステビオシドまたはＲｅｂ Ａを、それぞれＲｅｂ ＥまたはＲｅｂ Ｄに転換する酵素活性を確認した。
【0052】
高甘味度を有するＲｅｂ Ｄは、ステビア植物体に少量存在する糖であり、Ｒｅｂ Ａから生成され、この生成過程に関与する既知の酵素は、ステビアのＵＧＴ９１Ｄ２である。これと類似の活性を有する酵素が、米に存在するＥＵＧＴ１１酵素である。ステビアのＵＧＴ９１Ｄ２の場合、ステビオールグリコシドのＲｅｂ ＡをＲｅｂ Ｄに転換する活性を有するが、転換活性が低く高濃度のＲｅｂ Ｍを高収率で製造することは困難がある。
【0053】
また、従来知られているＵＧＴ酵素としては、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）に由来するＵＧＴ（以下、ＳｒＵＧＴ）、稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来するＵＧＴ（以下、ＥＵＧＴ１１という）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）に由来するＵＧＴ（以下、ＨｖＵＧＴという）がある。本発明に係るＵＤＰ－グルコシル転移酵素、従来知られているＥＵＧＴ１１およびＨｖＵＧＴに比べて、ステビオール配糖体の複数の基質に作用する基質特異性を有し、反応副産物を作らない長所がある。前記ＥＵＧＴ１１酵素のアミノ酸配列を配列番号１２で表し、ポリヌクレオチド配列は配列番号１３で表している。
【0054】
前記ＨｖＵＧＴ酵素のアミノ酸配列を配列番号１４で表し、ポリヌクレオチド配列は配列番号１５で表している。
【0055】
前記配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素は、ＨｖＵＧＴおよびＥＵＧＴ１１とアミノ酸配列と配列同一性を分析した結果、ＨｖＵＧＴとは９１％、ＥＵＧＴとは６６％のアミノ酸配列同一性を有し、ポリヌクレオチド配列同一性を分析した結果、ＨｖＵＧＴとは３６％、ＥＵＧＴ１１とは３７％のポリヌクレオチド配列同一性を有することが分析された。
【0056】
本発明に係るステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法は、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素と共に第２ＵＤＰ－グリコシル転移酵素であるＵＧＴ７６Ｇ１を含む生触媒を使用することができる。本発明のＳｒＵＧＴ７６Ｇ１はＳｒＵＧＴの一種で、７６Ｇ１のファミリー番号を有する酵素で、配列番号３１のアミノ酸配列であるが、これに制限されない。前記ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の核酸配列は、配列番号３１のアミノ酸配列を暗号化する核酸配列であり、具体的に配列番号３２の核酸配列であるが、これに制限されない。
【0057】
本発明において、第２ＵＤＰ－グリコシル転移酵素のＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａで、Ｒｅｂ Ｍ製造を担当する主要酵素であるＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７６Ｇ１（Ｓｔｅｖｉａ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＵＧＴ７６Ｇ１）であり、Ｒｅｂ ＤからＲｅｂ Ｍ生合成について報告された唯一の酵素である。ＵＧＴ７６Ｇ１は広範囲な基質特異性を有することが知られており、具体的にステビオール配糖体の生合成で８種類の異なる反応を触媒することが明らかになり、これらは全てステビオールＣ１３およびＣ１９結合グルコースの１，３－グルコシル化を含む。例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオシド（ＳＴＥ）をＲｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ（Ｒｅｂ Ａ）に転換、ＲｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＤ（Ｒｅｄ Ｄ）をＲｅｂ Ｍに転換、ＲｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＥ（Ｒｅｂ Ｅ）をＲｅｂ Ｍに転換することができる。
前記ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１は、レバウジオシドＡをレバウジオシドＩに転換させる活性を有し、レバウジオシドＩは、レバウジオシドＭに転換が困難であるため、ステビア（例えば、ステビア抽出物）および／またはレバウジオシドＡから高い収率でレバウジオシドＭを収得するために、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＡをレバウジオシドＤに転換させる活性を有するＴａＵＧＴｍを共に使用し、高い収率でレバウジオシドＭを収得することができる。
前記ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１は、レバウジオシドＡをレバウジオシドＩに転換させる活性を有し、レバウジオシドＩは、レバウジオシドＭに転換が困難であるため、ステビア（例えば、ステビア抽出物）および／またはレバウジオシドＡから高い収率でレバウジオシドＭを収得するために、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＡをレバウジオシドＤに転換させる活性を有するＴａＵＧＴｍを共に使用し、高い収率でレバウジオシドＭを収得することができる。
【0058】
本発明に係るステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法は、第１ＵＤＰ－グリコシル転移酵素および第２ＵＤＰ－グリコシル転移酵素であるＵＧＴ７６Ｇ１に加えて、Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素を追加的に含む生触媒を使用することができる。
【0059】
Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ）酵素は、スクロースを分解してフルクトースとＵＤＰ－グルコースを作る酵素である。したがってＲｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄに転換する反応、あるいはステビオシドからＲｅｂ Ｅに転換する反応にＳＵＳ酵素を導入し、ＵＧＴ酵素にＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを供給すれば、より経済的にＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを供給し反応を進めることができる。ＳＵＳ酵素を生触媒に含む場合、酵素を産生する微生物は、ｉｎｖｅｒｔａｓｅ酵素をコードするＳＵＣ２遺伝子が欠失したサッカロマイセス属微生物であることがさらに好ましい。
【0060】
前記ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓからなる群より選択された１種以上の微生物由来ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅであるが、これに限定されず、当業界に知られているｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅを全て本発明に適用することができる。さらに詳しくは前記ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ＳＵＳ１酵素であり、例えば配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号４のアミノ酸配列によって暗号化される核酸配列、または配列番号５の核酸配列を有するものであってもよい。また、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘから由来した前記ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅであり、例えば配列番号３３のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号３３のアミノ酸配列によって暗号化される核酸配列ｍまたは配列番号３４の核酸配列を有するものであってもよい。
【0061】
具体的な一例において、ＵＧＴにＳＵＳを融合タンパク質で製造して前記転換反応を行うと、二つの反応が一つのチャンネルを形成して酵素反応が一つで起こるため、効果的な転換反応を起こすことができる。
【0062】
例えば、ＵＧＴにＳＵＳを融合タンパク質で製造して前記転換反応を行うと、二つの反応が一つのチャンネルを形成して酵素反応が一つで起こるため、効果的な転換反応を起こすことができる。
【0063】
また、ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を利用する場合、基質に対して１／１０のＵＤＰを使用して転換が可能で、ＵＤＰの場合、ＲＡ４０に対して１／１００より低い量を利用した反応が可能である。融合酵素を利用した転換反応を通じて経済的な酵素転換が可能であり、高濃度基質反応を通じたステビオール配糖体を生成することができる。
【0064】
さらに詳しくは、本発明に係る第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素および第２ＵＤＰ－グルコシル転移酵素（例、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素）からなる群より選択された１種以上の酵素と、直接またはリンカーを介してｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅと融合することができ、前記リンカーは、アミノ酸４～１５個で構成されたペプチドであり、さらに詳しくはＧ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）およびＰ（Ｐｒｏ）からなる群より選択された１種以上のアミノ酸を４～１５個で含むものあり、具体的にＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）、またはＧＧＧＧＰＳＰＧＧＧＧＳ（配列番号１１）である。
【0065】
本発明の具体的な一例において、前記第１ＵＤＰ－グルコシル転移酵素と、リンカー（ＧＧＧＧＳＧ）を介してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ＳＵＳ１酵素と連結する融合タンパク質であり、具体的に配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または配列番号７のアミノ酸配列によって暗号化される核酸配列または配列番号８の核酸配列を有することができる。
【0066】
本明細書に記載の具体的酵素配列を下記表１に例示的に示し、下記表１において、変異酵素ＴａＵＧＴｍはＵＧＴ（Ｔ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌ）を示す。
【0067】
【表1-1】
【0068】
【表1-2】
【0069】
【表1-3】
【0070】
【表1-4】
【0071】
【表1-5】
【0072】
本明細書において、前記酵素を含む生触媒は、前記酵素タンパク質、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含むことができる。
【0073】
前記生触媒は、第１ＵＤＰ－グリコシル伝達酵素を含む組換え微生物に関し、追加的にＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ７６Ｇ１（ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１）およびスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）からなる群より選択された１種以上の酵素を発現する、組換え微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上である。また、前記生触媒は、ＴａＵＧＴまたはＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１およびスクロース合成酵素を全て発現し、ステビアからレバウジオシドＭ転換活性を有する、形質転換微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上である。
【0074】
前記破砕物は、ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物の菌体を破砕した破砕物、または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液を意味し、前記ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物から産生された酵素を含むものである。
【0075】
前記菌株の培養物は、前記ＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物から産生された酵素を含むもので、前記微生物菌体を含むか、または含まない無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）形態であってもよい。本明細書において、特に記載しない限り、使用されるＵＤＰ－グルコシル転移酵素を産生する微生物は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌体の破砕物、前記破砕物の上澄み液、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含むことを意味する。
【0076】
本発明に係る生触媒は、酵素活性を有する微生物菌体またはその乾燥菌体であってもよい。本発明に係る乾燥菌体は、水分含有量が低く、保管安定性および高い転換活性を有する。前記乾燥菌体は、同一重量の菌体が有する水分含有量が減少することで、保管および流通が容易で、長期間安定的に転換活性を維持し、特に大量生産に適している。
【0077】
本発明に係る酵母菌体乾燥粉末は、組換え酵母の転換活性を乾燥状態で長期間安定して維持することができる。すなわち、室温で保存しても、乾燥時の酵素力価を過度に低下させることなく保管、維持できるものである。
【0078】
また、本発明に係るステビオール配糖体の製造は、ステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの転換活性を有する微生物菌体またはその乾燥菌体そのものを利用する全細胞反応で行うことができる。前記生触媒は、ステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの転換活性を有するだけでなく、前細胞転換反応で高い転換率でステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭを製造することができる。
【0079】
本発明に係るステビオール配糖体、特にレバウジオシドＭの転換活性を有する微生物が酵母である場合、厚い細胞壁により全細胞反応で低い転換活性を示すため、微生物培養で分離した菌体自体に比べて乾燥菌体を利用した全細胞反応の高い転換率を有する。さらに、全細胞転換反応は、転換対象基質を含む液状原料で提供可能で、前記液状原料と菌体または乾株菌体を混合して行うことができるため、菌体の細胞壁が液状基質に対する高い透過性を有するように菌体に処理したり、組換え酵母菌体の細胞壁透過性を増加させることができる物質を添加することができる。菌体の細胞壁が液状基質に対する高い透過性を有するように菌体に処理する方法の一例は、乾燥処理を行うことである。本発明方法は、このような微生物の生存性を高めて維持するなどの目的はなく、むしろ、微生物自体は死滅して、微生物が有していた酵素活性のみが保存されることが好ましい。
【0080】
本発明の一例において、菌体の乾燥方法を特に限定されず、例えば凍結乾燥、空気または風を利用した熱風乾燥、噴霧乾燥などを使用することができるがこれに限られない。前記菌体乾燥処理として、液状基質に対する高い透過性を有する乾燥処理がさらに好ましく、例えば凍結乾燥であってもよい。熱風乾燥または噴霧乾燥の場合、乾燥機の入口および出口の温度は酵素の活性が顕著に低くならない範囲で行うことができる。
【0081】
前記菌体の凍結乾燥は、通常の凍結乾燥方法で行うことができるが、酵素の転換活性を維持することが重要であるため、－９０～４０℃、または－９０℃～－５℃の温度範囲、好ましくは－６０～４０℃、－５０～４０℃、－６０～２０℃、－５０～２０℃の温度範囲で凍結し、１０ｍｔｏｒｒ未満の圧力下で－６０℃～４０℃の温度範囲で乾燥することが好ましい。また、菌体の凍結乾燥処理工程において、凍結防止剤などを添加しなくてもよい。凍結乾燥期で凍結したビーズの水分を完全除去して乾燥されたビーズを製造した。
【0082】
本発明で得られる微生物菌体乾燥粉末は、常温（２５℃）で保存しても、１年以上にわたって乾燥直後の微生物が有していた転換活性を維持したり、少なくとも９０％以上維持することができる長所がある。すなわち、乾燥直後の菌体の転換活性１００％を基準に、９週間常温で保管した場合、保管開始時点の菌体のステビオール配糖体転換活性１００％を基準に、９０％以上、９５％以上、９７以上、または９８％以上を有するこができる。これにより、本発明に係る凍結乾燥菌体は、長期間高い転換活性を維持することができる。これとは異なり、細胞破砕液またはこれから得られた助酵素液は、細胞破砕後２４時間が経過すると、酵素活性がほとんど失活し、残存活性が１０％以下に減少するようになる。
【0083】
本願に記載された組換え微生物は、真菌類細胞またはバクテリア細胞を含む。一態様において、バクテリア細胞は、エシェリキア属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、コルネバクテリウム属、アセトバクター属、アシネトバクター属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、またはシュドモナス属微生物を含む。前記真菌類細胞は酵母細胞であり、例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アシュィビア（Ａｓｈｂｙａ）属、シベルリンドネラ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属微生物などを含む。具体的に、前記微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サッカロマイセス属菌株（例えば、サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはピキア属菌株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などを含むが、これに限られない。
【0084】
本発明が提供する形質転換微生物は、ＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１および／またはスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）発現のために、外来ＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１および／またはスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子が形質転換されたものであってもよい。前記ＴａＵＧＴまたはＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１および／またはスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子は、ベクターでクローニングされて微生物に形質転換されるものであるが、これに制限されない。
【0085】
本明細書において、用語「形質転換」は、標的タンパク質を暗号化する核酸を含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記核酸が暗号化するタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換された核酸は、宿主細胞内で発現することができる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なしにこれら全てを含むことができる。また、前記核酸は、標的タンパク質を暗号化するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記核酸は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態で導入されてもよい。例えば、前記核酸は、自ら発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体の発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、通常前記核酸に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位および翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記核酸は、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞での発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり、これに限られない。
【0086】
本出願で使用されるベクターは特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。細胞内染色体挿入用ベクターを介して目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって行われるが、これに限定されない。前記染色体挿入の有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。
【0087】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本発明の目的タンパク質を暗号化する核酸の転写を開始および媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0088】
本発明の一例によるステビオール配糖体にグルコースを転移する糖転移酵素タンパク質を暗号化する核酸分子を含む組換えベクターの一例は、図１の開裂地図に示されている。例えば、本発明に係る酵素を暗号化する核酸分子と、前記核酸分子に連結されて作動可能な転写調節配列としてＧＡＬ１０プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターなどを含むことができる。前記転写プロモーターは、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＴＥＦ１、ＧＰＤ１、およびＴＤＨ３プロモーターなどを含むことができ、前記転写ターミネーターは、ＣＹＣ１、ＴＥＦ１およびＰＧＫ１などを含むことができる。
【0089】
本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するある方法も含まれ、宿主細胞に応じて、当分野に公知の通り適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈澱、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【0090】
本発明において、ステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法は、高い基質濃度に転換反応を行って、レバウジオシドＭでの転換率が高く、産業的に大量生産が可能である。
【0091】
本明細書において、ステビオール配糖体製造のための転換反応に使用される反応基質（反応原料）は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡからなる群より選択された１種以上のステビオール配糖体基質を含むものであり、例えばステビオシドまたはＲｅｂ Ａ単独基質、またはこれらの混合基質であってもよい。前記混合基質は、ステビオシドまたはＲｅｂ Ａを混合したり、ステビオシドまたはＲｅｂ Ａを含むステビア抽出物であってもよい。
【0092】
本明細書における「ステビア」は、ステビア抽出物を意味し、具体的にレバウジオシドＡがステビア抽出物に含まれているステビオール配糖体の全体質量基準に、３０（ｗ／ｗ）％以上、３５（ｗ／ｗ）％以上、４０（ｗ／ｗ）％以上、５０（ｗ／ｗ）％以上、５５（ｗ／ｗ）％以上、５８（ｗ／ｗ）％以上、６０（ｗ／ｗ）％以上、７０（ｗ／ｗ）％以上、または８０（ｗ／ｗ）％以上であり、具体的に５０～９９．５（ｗ／ｗ）％、５０～９９（ｗ／ｗ）％、５０～９５（ｗ／ｗ）％、５０～９０（ｗ／ｗ）％、５０～８５（ｗ／ｗ）％、５０～８０（ｗ／ｗ）％、５０～７０（ｗ／ｗ）％、５０～６５（ｗ／ｗ）％、５０～６２（ｗ／ｗ）％、５５～９９．５（ｗ／ｗ％、５５～９９（ｗ／ｗ）％、５５～９５（ｗ／ｗ）％、５５～９０（ｗ／ｗ）％、５５～８５（ｗ／ｗ）％、５５～８０（ｗ／ｗ）％、５５～７０（ｗ／ｗ）％、５５～６５（ｗ／ｗ）％、５５～６２（ｗ／ｗ）％、５８～９９．５（ｗ／ｗ）％、５８～９９（ｗ／ｗ）％、５８～９５（ｗ／ｗ）％、５８～９０（ｗ／ｗ）％、５８～８５（ｗ／ｗ）％、５８～８０（ｗ／ｗ）％、５８～７０（ｗ／ｗ）％、５８～６５（ｗ／ｗ）％、５８～６２（ｗ／ｗ）％、例えば、６０（ｗ／ｗ）％の含有量を含むことができ、ステビオシドが、ステビア抽出物全体体積基準に前記レバウジオシドＡ含有量以外の含有量で含まれ、具体的にステビオール配糖体１００重量％を基準に３０～５０（ｗ／ｗ）％、３０～４５（ｗ／ｗ）％、３０～４２（ｗ／ｗ）％、３５～５０（ｗ／ｗ）％、３５～４５（ｗ／ｗ）％、３５～４２（ｗ／ｗ）％、３８～５０（ｗ／ｗ）％、３８～４５（ｗ／ｗ）％または３８～４２（ｗ／ｗ）％、例えば、４０（ｗ／ｗ）％の含有量で含まれるが、これに制限されない。
【0093】
本発明は多量の反応基質を使用する産業的に適用可能な大量生産工程において、高い転換率と生産性でＲｅｂ Ｍを高い純度で製造することができる。本明細書において、ステビオール配糖体製造のための転換反応に使用される反応基質は、液状で提供することができ、１５ｇ／Ｌ以上、２０ｇ／Ｌ以上、２５ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、７５ｇ／Ｌ以上または１００ｇ／Ｌ以上であり、例えば１５～２００ｇ／Ｌ、２０～２００ｇ／Ｌ、３０～２００ｇ／Ｌ、４０～２００ｇ／Ｌ、５０～２００ｇ／Ｌ、６０～２００ｇ／Ｌ、７０～２００ｇ／Ｌ、８０～２００ｇ／Ｌ、９０～２００ｇ／Ｌ、１５～１５０ｇ／Ｌ、２０～１５０ｇ／Ｌ、３０～１５０ｇ／Ｌ、４０～１５０ｇ／Ｌ、５０～１５０ｇ／Ｌ、６０～１５０ｇ／Ｌ、７０～１５０ｇ／Ｌ、８０～１５０ｇ／Ｌ、または９０～１５０ｇ／Ｌの量で提供することができる。
【0094】
ステビア抽出物、ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｏｓｅ（ＵＤＰ）およびスクロースからなる群より選択された１種以上を含む反応原料物質を追加的に含むことができる。一実施様態で、前記ステビオール配糖体製造用組成物でｒｅｂ ＡのＲｅｂ Ｄへの転換にはＭｇＣｌ2および／またはＭｎＣｌ2を追加的に含むことができる。
【0095】
本発明のステビア抽出物は、ステビオール配糖体を８０～９９（ｗ／ｗ）％、８０～９７（ｗ／ｗ）％、８０～９６（ｗ／ｗ）％、８０～９５（ｗ／ｗ）％、８５～９９（ｗ／ｗ）％、８５～９７（ｗ／ｗ）％、８５～９６（ｗ／ｗ）％、８５～９５（ｗ／ｗ）％、９０～９９（ｗ／ｗ）％、９０～９７（ｗ／ｗ）％、９０～９６（ｗ／ｗ）％、９０～９５（ｗ／ｗ）％、９３～９９（ｗ／ｗ）％、９３～９７（ｗ／ｗ）％、９３～９６（ｗ／ｗ）％、９３～９５（ｗ／ｗ）％、９４～９９（ｗ／ｗ）％、９４～９７（ｗ／ｗ）％、９４～９６（ｗ／ｗ）％、９４～９５（ｗ／ｗ）％、９５～９９（／ｗ）％、９５～９７（ｗ／ｗ）％、または９５～９６（ｗ／ｖ）％、例えば、９５（ｗ／ｗｖ）％の含有量で含むことができるが、これに制限されない。前記ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡとステビオシドを含むものであってもよい。
【0096】
本発明が提供するレバウジオシドＭ製造用組成物の反応原料物質および／または本発明が提供するレバウジオシドＭの製造方法で使用された反応原料物質は、反応原料溶液であり、スクロースを、前記反応原料物質を基準に５００～２０００ｍＭ、５００～１５００ｍＭ、５００～１２００ｍＭ、５００～１１００ｍＭ、５００～１０５０ｍＭ、５００～１０００ｍＭ、６００～２０００ｍＭ、６００～１５００ｍＭ、６００～１２００ｍＭ、６００～１１００ｍＭ、６００～１０５０ｍＭ、６００～１０００ｍＭの濃度で含むが、これに制限されない。
【0097】
前記組成物は、ステビア抽出物、ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｏｓｅ（ＵＤＰ）およびスクロースからなる群より選択された１種以上を含む反応原料物質を追加的に含むことができる。一実施様態で、前記ステビオール配糖体製造用組成物でｒｅｂ ＡのＲｅｂ Ｄへの転換にはＭｇＣｌ2および／またはＭｎＣｌ2を追加的に含むことができる。
【0098】
本発明において、反応生成物であるレバウジオシドＭを含むステビオール配糖体で、レバウジオシドＭの純度は、５０重量％以上、５５重量％以上、６０重量％以上、６５重量％以上、７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上または８５重量％以上であり、具体的に、５０重量％～９９重量％、５５重量％～９９重量％、６０重量％～９９重量％、６５重量％～９９重量％、７０重量％～９９重量％、７５重量％～９９重量％、８０重量％～９９重量％、８５重量％～９９重量％、または８７～９９重量％であってもよい。
【0099】
前記反応原料物質に含まれるステビア抽出物重量対比本発明が提供するレバウジオシドＭ製造用組成物および／または本発明が提供するレバウジオシドＭの製造方法によって生産および／または製造されるレバウジオシドＭへの転換率は、１１０％～２００％、１１５％～２００％、１２０％～２００％、１２５％～２００％、１３０％～２００％または１３５％～２００％、例えば、１２５％、１２９％、１３５％または１３６％であるが、これに制限されない。
【0100】
本発明が提供するレバウジオシドＭ製造用組成物および／または本発明が提供するレバウジオシドＭの製造方法によって製造されたステビオール配糖体内レバウジオシドＭの含有量は８０～９９重量％、８５～９９重量％、８７～９９重量％、９０～９９重量％、９４～９９重量％または９５～９９重量％であり、例えば、８７．７重量％、９０．２重量％、９４．８重量％または９５．重量４％であってもよい。
【0101】
本発明に係る転換反応温度２０～６０℃およびｐＨ４～９の水系中で行うことができる。好ましくは、反応温度２５～４０℃およびｐＨ６．０～８．０の水系（ａｑｕｅｏｕｓｓｙｓｔｅｍ）中で、より好ましくは反応を温度３０℃およびｐＨ７．２の水系中で行うことができる。発明の好ましい一例によれば、反応をｐＨ７．２のリン酸緩衝液中で行うことができる。
【0102】
本発明が提供するレバウジオシドＭ製造用組成物の反応原料物質に含まれたステビア抽出物のｐＨはまたは転換反応のｐＨは、ｐＨ４～９、ｐＨ４～８．５、ｐＨ４～８．２、ｐＨ４～８、ｐＨ４～７．８、ｐＨ４～７．５、ｐＨ４～７、ｐＨ４～６．７、ｐＨ４～６．５、ｐＨ４～６．３、ｐＨ４～６．２、ｐＨ５～７、ｐＨ５～６．７、ｐＨ５～６．５、ｐＨ５～６．３、ｐＨ５～６．２、ｐＨ５．５～７、ｐＨ５．５～６．７、ｐＨ５．５～６．５、ｐＨ５．５～６．３、ｐＨ５．５～６．２、ｐＨ５．７～７、ｐＨ５．７～６７、ｐＨ５．７～６．５、ｐＨ５．７～６．３、ｐＨ５．７～６．２、ｐＨ５．９～７、ｐＨ５．９～６．７、ｐＨ５．９～６．５、ｐＨ５．９～６．３、ｐＨ５．９～６．２、ｐＨ６．０～７、ｐＨ６．０～６．７、ｐＨ６．０～６．５、ｐＨ６．０～６．３、ｐＨ６．０～６．２であるが、これに制限されない。
【0103】
本明細書において、本発明に係るステビオール配糖体製造用組成物またはステビオール配糖体の製造方法で、反応温度は２０～６０℃、２０～５０℃、２０～４５℃、２０～４０℃、２０～３７℃、２０～３５℃の温度条件で行われてもよい。
【実施例】
【0104】
本発明は、下記実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、下記実施例により権利範囲が限定されない。
【0105】
実施例１
野生型酵素を発現する微生物作製
１－１： 野生型酵素を発現するベクター作製
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素タンパク質をコードする遺伝子を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、合成された遺伝子のポリヌクレオチド配列は配列番号２に示す。合成された遺伝子は発現が可能な形態を作るためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現するｐｌａｓｍｉｄにｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇした。
具体的に、タンパク質の活性を確認するために製造したｖｅｃｔｏｒはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで選別が可能なＵｒａａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ（選別マーカ）を含むｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒを使用し、ｐｒｏｍｏｔｅｒとしては、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
このｐｌａｓｍｉｄに新しく合成した（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋ）配列番号２の遺伝子をクローニングした。ＴａＵＧＴ遺伝子のクローニングのために、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号１６）とｃｙｃ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒＢ（配列番号１７）と重なるようにプライマー対（配列番号１９および配列番号１９）を作製し、ＰＣＲ増幅を通じて酵素遺伝子を増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＨＩＦｉ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ）を通じて遺伝子をサブクローニングし、使用されたプライマー情報を下記表２に示した。
サブクローニングしたプラスミド形態の遺伝子は、大腸菌（ＤＨ５ａ）に形質転換して選別および増幅し、増幅されたプラスミドの配列を分析して当該酵素の発現遺伝子が正確にサブクローニングされたことを確認した。
野生型酵素を発現する微生物作製
１－１： 野生型酵素を発現するベクター作製
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素タンパク質をコードする遺伝子を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、合成された遺伝子のポリヌクレオチド配列は配列番号２に示す。合成された遺伝子は発現が可能な形態を作るためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現するｐｌａｓｍｉｄにｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇした。
具体的に、タンパク質の活性を確認するために製造したｖｅｃｔｏｒはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで選別が可能なＵｒａａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ（選別マーカ）を含むｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒを使用し、ｐｒｏｍｏｔｅｒとしては、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
このｐｌａｓｍｉｄに新しく合成した（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋ）配列番号２の遺伝子をクローニングした。ＴａＵＧＴ遺伝子のクローニングのために、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号１６）とｃｙｃ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒＢ（配列番号１７）と重なるようにプライマー対（配列番号１９および配列番号１９）を作製し、ＰＣＲ増幅を通じて酵素遺伝子を増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＨＩＦｉ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ）を通じて遺伝子をサブクローニングし、使用されたプライマー情報を下記表２に示した。
サブクローニングしたプラスミド形態の遺伝子は、大腸菌（ＤＨ５ａ）に形質転換して選別および増幅し、増幅されたプラスミドの配列を分析して当該酵素の発現遺伝子が正確にサブクローニングされたことを確認した。
【0106】
【表2】
【0107】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に遺伝子を導入する形質転換方法は、ＬｉＡｃ（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅｅ）を０．１Ｍ処理して熱衝撃により導入した。導入された菌株は、ＳＣ_Ｕｒａ培地で選別し、選別されたコロニーは培養を通じて酵素の活性を確認した。
製造された組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）菌株に形質転換した。ＳＣ－Ｕｒａ固体培地（ＳＣ_Ｕｒａ培地＋２％ａｇａｒ）で選別マーカを通じて遺伝子カセット挿入された組換え菌株を選別した。ＳＣ－Ｕｒａ固体培地の組成は、ＹＮＢ６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘ０．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ５０ｇ／Ｌおよびａｇａｒ２０ｇ／Ｌを含み、ｐＨを６．０に調整した。
製造された組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）菌株に形質転換した。ＳＣ－Ｕｒａ固体培地（ＳＣ_Ｕｒａ培地＋２％ａｇａｒ）で選別マーカを通じて遺伝子カセット挿入された組換え菌株を選別した。ＳＣ－Ｕｒａ固体培地の組成は、ＹＮＢ６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘ０．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ５０ｇ／Ｌおよびａｇａｒ２０ｇ／Ｌを含み、ｐＨを６．０に調整した。
【0108】
１－２： 微生物培養
前記実施例１－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
具体的に、ＳＣ_Ｕｒａ固体培地で選別されたコロニーを３ｍＬＳＣ_Ｕｒａ液体培地が含まれた試験管に接種し、一夜培養した。培養した菌体の濃度を、ＯＤ600吸光度を測定して確認し、２５ｍＬのＳＣ－Ｕｒａ液体培地を入れた２５０ｍＬフラスコにＯＤ600吸光度が最終的に０．１（ｆｉｎａｌ）になるように接種し、２４時間１次培養（３０℃、２４０ｒｐｍ）した。
１次培養した菌体の酵素発現を誘導するために、ＹＰＧ培地を同量添加して２４時間２次培養した。前記２次培養した菌体は、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って集めた。ＳＣ_Ｕｒａ液体培地の組成は、ＹＮＢ（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｅ ｂａｓｅ）６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ｍｉｘ０．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ５０ｇ／ＬおよびＭＥＳ５０ｍＭを含み、ＮａＯＨを利用して培地ｐＨを６．０に調整した。前記ＹＰＧ培地組成は、Ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ２０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ２０ｇ／ＬおよびＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）１００ｍＭを含み、培地のｐＨを６．０に調整した。
前記実施例１－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
具体的に、ＳＣ_Ｕｒａ固体培地で選別されたコロニーを３ｍＬＳＣ_Ｕｒａ液体培地が含まれた試験管に接種し、一夜培養した。培養した菌体の濃度を、ＯＤ600吸光度を測定して確認し、２５ｍＬのＳＣ－Ｕｒａ液体培地を入れた２５０ｍＬフラスコにＯＤ600吸光度が最終的に０．１（ｆｉｎａｌ）になるように接種し、２４時間１次培養（３０℃、２４０ｒｐｍ）した。
１次培養した菌体の酵素発現を誘導するために、ＹＰＧ培地を同量添加して２４時間２次培養した。前記２次培養した菌体は、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って集めた。ＳＣ_Ｕｒａ液体培地の組成は、ＹＮＢ（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｅ ｂａｓｅ）６．７ｇ／Ｌ、Ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ｍｉｘ０．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ５０ｇ／ＬおよびＭＥＳ５０ｍＭを含み、ＮａＯＨを利用して培地ｐＨを６．０に調整した。前記ＹＰＧ培地組成は、Ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ２０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ２０ｇ／ＬおよびＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）１００ｍＭを含み、培地のｐＨを６．０に調整した。
【0109】
１－３： ＥＵＧＴ１１およびＨｖＵＧＴを発現する微生物製造
既存の活性が知られているＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ＥＵＧＴ１１遺伝子（配列番号１３）とＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来ＨｖＵＧＴの遺伝子（配列番号１５）を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、ＴａＵＧＴ遺伝子と同様に遺伝子を増幅し、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。同じ条件で酵素発現を誘導するために、ｐｒｏｍｏｔｅｒはＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
具体的に、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＥＵＧＴ１１の正方向プライマー（配列番号２０）、ＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＥＵＧＴ１１の逆方向プライマー（配列番号２１）、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＨｖＵＧＴの正方向プライマー（配列番号２２）、およびＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＨｖＵＧＴの逆方向プライマー（配列番号２３）を使用し、使用されたプライマー情報は、前記表２に示し、ＳｃはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを意味する。
その後、実施例１－１および１－２の方法と実質的に同じ方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に形質転換し、菌株選別および微生物培養を行った。
既存の活性が知られているＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ＥＵＧＴ１１遺伝子（配列番号１３）とＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来ＨｖＵＧＴの遺伝子（配列番号１５）を合成（Ｇｂｌｏｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、ＴａＵＧＴ遺伝子と同様に遺伝子を増幅し、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。同じ条件で酵素発現を誘導するために、ｐｒｏｍｏｔｅｒはＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用し、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＣＹＣ１を使用した。
具体的に、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＥＵＧＴ１１の正方向プライマー（配列番号２０）、ＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＥＵＧＴ１１の逆方向プライマー（配列番号２１）、ＧＡＬ１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結するＨｖＵＧＴの正方向プライマー（配列番号２２）、およびＣＹＣ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと連結するＨｖＵＧＴの逆方向プライマー（配列番号２３）を使用し、使用されたプライマー情報は、前記表２に示し、ＳｃはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを意味する。
その後、実施例１－１および１－２の方法と実質的に同じ方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に形質転換し、菌株選別および微生物培養を行った。
【0110】
１－４： 酵素活性評価
前記実施例１－２および実施例１－３で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集めて同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）が２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅが４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して、反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定した。
具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析に使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｄｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで確認した。移動相は０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水とアセトニトリルをそれぞれ利用してＧｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分分析して確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件を下記表３に示した。
前記実施例１－２および実施例１－３で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集めて同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）が２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅが４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して、反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定した。
具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析に使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｄｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで確認した。移動相は０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水とアセトニトリルをそれぞれ利用してＧｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分分析して確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件を下記表３に示した。
【0111】
【表3】
【0112】
前記転換生成物のＨＰＬＣ分析グラフは表４に示す。下記表４に示されたＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、下記数式１に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ相対転換率は、ＥＵＧＴ１１のＲｅｂ Ｄ転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴまたはＨｖＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
【0113】
【表4】
【0114】
表４に示したように、酵素反応による転換率は、初期３時間反応の結果、ＴａＵＧＴはＥＵＧＴ１１と類似するようにＲｅｂ ＡのＲｅｂ Ｄ転換を４０～４５％転換し、ＨｖＵＧＴ（３０～３５％転換）よりも３０％程度の活性向上を有する酵素であることを確認した。
また、１８時間の酵素反応液の生成されたＲｅｂ Ｄの含有量を分析した結果、３つの酵素の転換率の大きさ順が、３時間反応と類似の傾向を示した。
前記ＴａＵＧＴ酵素の核酸配列を（株）マクロジェンの塩基配列分析サービスによって分析し、塩基配列に基づいてアミノ酸配列を分析し、その結果アミノ酸配列は、配列番号１に、核酸配列は配列番号２に示す。
また、１８時間の酵素反応液の生成されたＲｅｂ Ｄの含有量を分析した結果、３つの酵素の転換率の大きさ順が、３時間反応と類似の傾向を示した。
前記ＴａＵＧＴ酵素の核酸配列を（株）マクロジェンの塩基配列分析サービスによって分析し、塩基配列に基づいてアミノ酸配列を分析し、その結果アミノ酸配列は、配列番号１に、核酸配列は配列番号２に示す。
【0115】
実施例２ 酵素変異体を発現する微生物作製
２－１： 酵素変異体発現のためのベクター作製
前記実施例１のＴａＵＧＴ酵素の突然変異を開発するために、既存のＥＵＧＴ１１遺伝子を基本にして突然変異を探索した。Ａｌｉｇｎｍｅｎｔを通じてｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎを確認し、ＵＧＴのＮ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ａｃｃｅｐｔｏｒとＣ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ｄｏｎｏｒ機能をするｄｏｍａｉｎとの間の位置にアミノ酸の差を比較した。そのうち２０１番残基のトレオニンと２０２番残基のバリンの場合（ＥＵＧＴ１１ではそれぞれセリンとロイシンアミノ酸が位置）、トレオニンはセリンに、バリンはアラニンまたはロイシンに変えた。突然変異方法は、ＴａＵＧＴの該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２４および２５）し、該当部位の塩基配列を変える突然変異遺伝子増幅（ＰＣＲ）を実施し、増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じてｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。
結果として得られたｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされた酵素変異体をＴａＵＧＴＴ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌと命名した。本実施例で使用したプライマーの配列は下記表５に記載した。
２－１： 酵素変異体発現のためのベクター作製
前記実施例１のＴａＵＧＴ酵素の突然変異を開発するために、既存のＥＵＧＴ１１遺伝子を基本にして突然変異を探索した。Ａｌｉｇｎｍｅｎｔを通じてｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎを確認し、ＵＧＴのＮ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ａｃｃｅｐｔｏｒとＣ－ｔｅｒｍのｓｕｇａｒ ｄｏｎｏｒ機能をするｄｏｍａｉｎとの間の位置にアミノ酸の差を比較した。そのうち２０１番残基のトレオニンと２０２番残基のバリンの場合（ＥＵＧＴ１１ではそれぞれセリンとロイシンアミノ酸が位置）、トレオニンはセリンに、バリンはアラニンまたはロイシンに変えた。突然変異方法は、ＴａＵＧＴの該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２４および２５）し、該当部位の塩基配列を変える突然変異遺伝子増幅（ＰＣＲ）を実施し、増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じてｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。
結果として得られたｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされた酵素変異体をＴａＵＧＴＴ２０１Ｓ／Ｖ２０２Ｌと命名した。本実施例で使用したプライマーの配列は下記表５に記載した。
【0116】
【表5】
【0117】
２－２： 酵素変異体発現菌株作製
前記実施例１－２と実質的に同じ方法で、酵素の発現を確認するために、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされたＴａＵＧＴT201S/V202Lは、ＬｉＡｃ方法で同様に酵母菌株に形質転換して選別した。形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は、液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
前記実施例１－２と実質的に同じ方法で、酵素の発現を確認するために、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングされたＴａＵＧＴT201S/V202Lは、ＬｉＡｃ方法で同様に酵母菌株に形質転換して選別した。形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は、液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
【0118】
実施例３： 酵素変異体の転換活性評価
実施例２－２で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集め、同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は、基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）が２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅが４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、前記実施例１－４と実質的に同じ方法でＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定し、ＨＰＬＣ分析グラフを図２に示した。
下記表６に示されたＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、下記数式１に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ相対転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ変異型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
前記ＴａＵＧＴの変異酵素とＲｅｂ Ａ基質を含む反応液利用して酵素反応を１８時間行い、得られた転換生成物をＨＰＬＣ分析法で分析した。前記ＨＰＬＣ分析法で利用したＴａＵＧＴの変異酵素の活性分析結果は、下記表６および図２に示す。図２は、ＴａＵＧＴの変異酵素の利用したＲｅｂ Ｄ転換反応の反応生成物を分析したＨＰＬＣグラフである。
実施例２－２で得られた組換え菌株の培養物で菌体を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して回収した。前記回収した菌体を１０ｍＬ集め、同量の水で２回洗浄した。前記洗浄された菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
酵素活性評価のための反応液は、基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記助酵素液０．１ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質Ｒｅｂ Ａ（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）が２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅが４ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、反応開始後、３時間と１８時間にそれぞれ試料を採取して反応時間に応じた反応程度を確認した。
前記酵素反応液を５分間沸騰させて酵素反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を分析して酵素反応生成物を確認した。具体的に、酵素反応生成物の分析は、前記実施例１－４と実質的に同じ方法でＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して分析して生成物の転換比率を確認した。前記組換え菌株の菌体破砕物から得られた助酵素液は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換する活性を示すため、Ｒｅｂ Ｄの生成比率を確認して活性を測定し、ＨＰＬＣ分析グラフを図２に示した。
下記表６に示されたＲｅｂ Ａ単独基質からＲｅｄ Ｄに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ転換率は、下記数式１に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ相対転換率は、野生型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ変異型酵素のＲｅｂ Ｄ転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
前記ＴａＵＧＴの変異酵素とＲｅｂ Ａ基質を含む反応液利用して酵素反応を１８時間行い、得られた転換生成物をＨＰＬＣ分析法で分析した。前記ＨＰＬＣ分析法で利用したＴａＵＧＴの変異酵素の活性分析結果は、下記表６および図２に示す。図２は、ＴａＵＧＴの変異酵素の利用したＲｅｂ Ｄ転換反応の反応生成物を分析したＨＰＬＣグラフである。
【0119】
【表6】
【0120】
実施例４ 混合基質を利用した転換反応
実施例３と同様に、Ｒｅｂ Ａを利用した酵素活性評価の場合、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄにだけ転換され、酵素の活性確認が明確である。しかし、実際の産業生産で混合基質を使用するため、混合基質を使用した産業用途に酵素の使用の可能性を評価しようとステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質に対する転換反応を行った。すなわち、混合基質を使用する場合、ステビオシドはＲｅｂ Ｅに、Ｒｅｂ ＡはＲｅｂ Ｄに転換する反応が行われる。
混合基質に対する酵素活性を評価しようと、実施例２－２で得られた組換え菌株の菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を得て、助酵素液として使用した。
酵素活性評価のための反応液は、基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ：ＳＴＥ（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）=４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記実施例３に係る助酵素液０．２ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）が２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅが４ｍＭになるようにした。
前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、反応開始後１８時間に反応程度を確認した。実施例３の方法と実質的に同じ方法で、前記転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析した。
下記表７に示されたＲＡ４０混合基質に対するＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率は、下記数式２に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅの相対的合計転換率は、ＥＵＧＴ１１の全Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
実施例３と同様に、Ｒｅｂ Ａを利用した酵素活性評価の場合、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｄにだけ転換され、酵素の活性確認が明確である。しかし、実際の産業生産で混合基質を使用するため、混合基質を使用した産業用途に酵素の使用の可能性を評価しようとステビオシドおよびＲｅｂ Ａを含む混合基質に対する転換反応を行った。すなわち、混合基質を使用する場合、ステビオシドはＲｅｂ Ｅに、Ｒｅｂ ＡはＲｅｂ Ｄに転換する反応が行われる。
混合基質に対する酵素活性を評価しようと、実施例２－２で得られた組換え菌株の菌体を１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、ＯＤ600値が１００になるようにした後、０．４～０．６ｍｍ粒径を有するｇｌａｓｓ ｂｅａｄ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ量をｃａｐ ｔｕｂｅに入れ、１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加した。菌体をｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで３０秒間５回繰り返して破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を得て、助酵素液として使用した。
酵素活性評価のための反応液は、基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅＡ：ＳＴＥ（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）=４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅを含み、これに前記実施例３に係る助酵素液０．２ｍＬを添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液で基質ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）が２ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が３ｍＭ、およびＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅが４ｍＭになるようにした。
前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、反応開始後１８時間に反応程度を確認した。実施例３の方法と実質的に同じ方法で、前記転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析した。
下記表７に示されたＲＡ４０混合基質に対するＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換する前記酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率は、下記数式２に従って計算し、酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅの相対的合計転換率は、ＥＵＧＴ１１の全Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率１００％を基準に換算したＴａＵＧＴ酵素のＲｅｂ Ｄ／Ｅ合計転換率を意味する。
Ｒｅｂ Ｄ／Ｅ転換率（％）＝Ｒｅｂ Ｄ／ＥのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式２）
【0121】
【表7】
【0122】
前記実験結果、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ２０１番をＳｅｒｉｎｅに変えた突然変異酵素の場合、野生型酵素を基準に相対転換率が１０６％であり、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ２０１番のＳｅｒｉｎｅへ、Ｖａｌｉｎｅ２０２番のＬｅｕｃｉｎｅへの変形を全て含む２重突然変異酵素は、野生型酵素を基準に相対転換率が１１４％に増加し、これにより、突然変異によって活性が向上する残基を確認し、活性が増加された変異酵素を確保した。
【0123】
実施例５ ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素作製および活性確認
５－１： ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を産生する組換え酵母の製造
実施例３で活性向上が確認されたＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を利用したステビオール配糖体の糖転移反応のために、必要なグルコースドナー（ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ）を供給しようと、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）酵素と融合タンパク質を製造した。前記ＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を暗号化する核酸配列を前記表１の配列番号３０の核酸配列であり、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）は、前記表１の配列番号５の核酸配列を使用した。
融合酵素の作製はｐｒｉｍｅｒを合成してＴａＵＧＴｍとＳＵＳとの間に連結アミノ酸配列をリンカー（ＧＧＧＧＳＧ、配列番号８）を使用し、それぞれの遺伝子は該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２６、配列番号２７）して、当該部位の塩基配列増幅（ＰＣＲ）を実施した。
遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を実施して増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じて、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングしてｐＲＳ４２６ＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳを作製した。前記使用されたＳＵＳ酵素タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４に示し、前記酵素タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列は、配列番号５に示し、前記融合酵素タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、前記融合タンパク質製造に使用されたリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧ（配列番号８）を有し、前記ＳＵＳ１酵素タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列、および使用されたプライマー情報は下記表８に示す。
５－１： ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を産生する組換え酵母の製造
実施例３で活性向上が確認されたＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を利用したステビオール配糖体の糖転移反応のために、必要なグルコースドナー（ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｏｓｅ）を供給しようと、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）酵素と融合タンパク質を製造した。前記ＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素を暗号化する核酸配列を前記表１の配列番号３０の核酸配列であり、ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＵＳ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）は、前記表１の配列番号５の核酸配列を使用した。
融合酵素の作製はｐｒｉｍｅｒを合成してＴａＵＧＴｍとＳＵＳとの間に連結アミノ酸配列をリンカー（ＧＧＧＧＳＧ、配列番号８）を使用し、それぞれの遺伝子は該当位置のｐｒｉｍｅｒを合成（配列番号２６、配列番号２７）して、当該部位の塩基配列増幅（ＰＣＲ）を実施した。
遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を実施して増幅された遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じて、ｐＲＳ４２６ ｖｅｃｔｏｒにクローニングしてｐＲＳ４２６ＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳを作製した。前記使用されたＳＵＳ酵素タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４に示し、前記酵素タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列は、配列番号５に示し、前記融合酵素タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、前記融合タンパク質製造に使用されたリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧ（配列番号８）を有し、前記ＳＵＳ１酵素タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列、および使用されたプライマー情報は下記表８に示す。
【0124】
【表8】
【0125】
前記実施例１－２と同様な方法で、前記作製された融合酵素発現ベクターは酵母に形質転換して、前記融合酵素を発現する組換え酵母を確保した。
【0126】
５－２： 組換え酵母の培養および酵素準備
前記形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は、液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
実施例３と実質的に同じ方法で、組換え菌株の培養物で遠心分離を利用して回収した菌体を回収し、ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｅｒで菌体を破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
前記形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別し、選別された酵母は、液体培養を通じて酵素発現を誘導した。
実施例３と実質的に同じ方法で、組換え菌株の培養物で遠心分離を利用して回収した菌体を回収し、ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｅｒで菌体を破砕した。前記菌体破砕液を冷蔵状態で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上澄み液を助酵素液として得た。
【0127】
５－３： 融合酵素の転換活性評価
転換反応のための反応原料液は、基質ＲＡ４０反応基質（９０重量％純度）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ、ｓｕｃｒｏｓｅを混合し、これに前記実施例５－２で準備したＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳ融合酵素の助酵素液をそれぞれ０．１ｍＬ添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液でＲＡ４０反応基質が１０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が１ｍＭ、およびＵＤＰが１ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅが１２５ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、２０時間反応して酵素転換を確認した。
前記実施例１－４と実質的に同じ方法で、反応液の転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析して確認し、融合酵素の場合、ＵＤＰを利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ供給によってＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０）をＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換したことを確認した。ＳＴＥはステビオシドを示す。
反応前基質１００重量％に対して、初期融合酵素の転換反応で３３重量％程度の基質がＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換された。混合基質（ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０））の転換反応により、Ｒｅｂ Ｄ（Ｄ誘導体含む）とＲｅｂ Ｅは、それぞれ２１．７％と１２．１％に転換された。融合酵素の砂糖を利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ生成とこれを利用した基質の糖化により、ステビオール配糖体転換を確認し、基質の量と反応条件最適化により、酵素の転換反応を増加させることが可能であることを確認した。
融合酵素を利用した転換の場合、ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０）の転換のために、１０ｇ／Ｌ基質の場合、約１０ｍＭに該当する基質に転換反応する場合、１０～２０ｍＭ以上のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅが必要である。したがって、高濃度多量の転換をする場合、高価のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅの過剰量が必要である。高濃度基質を利用した酵素反応する場合、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅを過剰に使用すべきで、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ過剰量によって酵素活性を阻害するため好ましくない。
本実験によれば、ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を利用する場合、基質に対して１／１０のＵＤＰを使用して転換が可能であり、ＵＤＰの場合、ＲＡ４０に対して１／１００よりも低い量を利用した反応が可能である。融合酵素を利用した転換反応を通じて、経済的な酵素転換が可能であり、高濃度基質反応によるステビオール配糖体の生成が誘導されることを確認した。
転換反応のための反応原料液は、基質ＲＡ４０反応基質（９０重量％純度）、ＭｇＣｌ2およびＵＤＰ、ｓｕｃｒｏｓｅを混合し、これに前記実施例５－２で準備したＴａＵＧＴｍ_ＳＵＳ融合酵素の助酵素液をそれぞれ０．１ｍＬ添加して全体反応体積０．５ｍＬを製造し、前記最終反応液でＲＡ４０反応基質が１０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2が１ｍＭ、およびＵＤＰが１ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅが１２５ｍＭになるようにした。前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．２および１５０ｒｐｍ条件で酵素反応を行い、２０時間反応して酵素転換を確認した。
前記実施例１－４と実質的に同じ方法で、反応液の転換生成物はＨＰＬＣ分析法で分析して確認し、融合酵素の場合、ＵＤＰを利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ供給によってＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０）をＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換したことを確認した。ＳＴＥはステビオシドを示す。
反応前基質１００重量％に対して、初期融合酵素の転換反応で３３重量％程度の基質がＲｅｂ Ｄ／Ｅに転換された。混合基質（ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０））の転換反応により、Ｒｅｂ Ｄ（Ｄ誘導体含む）とＲｅｂ Ｅは、それぞれ２１．７％と１２．１％に転換された。融合酵素の砂糖を利用したＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ生成とこれを利用した基質の糖化により、ステビオール配糖体転換を確認し、基質の量と反応条件最適化により、酵素の転換反応を増加させることが可能であることを確認した。
融合酵素を利用した転換の場合、ＲＡ４０（Ｒｅｂ Ａ：ＳＴＥ=４０：６０）の転換のために、１０ｇ／Ｌ基質の場合、約１０ｍＭに該当する基質に転換反応する場合、１０～２０ｍＭ以上のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅが必要である。したがって、高濃度多量の転換をする場合、高価のＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅの過剰量が必要である。高濃度基質を利用した酵素反応する場合、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅを過剰に使用すべきで、ＵＤＰ_Ｇｌｕｃｏｓｅ過剰量によって酵素活性を阻害するため好ましくない。
本実験によれば、ＴａＵＧＴ_ＳＵＳ融合酵素を利用する場合、基質に対して１／１０のＵＤＰを使用して転換が可能であり、ＵＤＰの場合、ＲＡ４０に対して１／１００よりも低い量を利用した反応が可能である。融合酵素を利用した転換反応を通じて、経済的な酵素転換が可能であり、高濃度基質反応によるステビオール配糖体の生成が誘導されることを確認した。
【0128】
実施例６ ＵＧＴおよびＳＵＳ酵素を発現する微生物製造
６－１： 酵素遺伝子を導入したベクターの製造
レバウジオシドＭ転換反応を行うために、ＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１およびＳｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅの３種を全て産生する組換え酵母を製造しようと、前記遺伝子が導入されたベクターをまず製造した。
具体的に、実施例５－１と実質的に同じ製造方法、プライマーおよびリンカーを利用して、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＧｍＳＵＳの融合酵素に関するベクターとしてｐＲＳ４２３_ＵＧＴ７６Ｇ１_ＧｍＳＵＳ、およびＴａＵＧＴｍおよびＧｍＳＵＳの融合酵素に関するベクターとしてｐＲＳ４２６_ＴａＵＧＴｍ_ＧｍＳＵＳベクターを製造した。前記ＴａＵＧＴｍは、実施例５と同様にＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素であり、ただしスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）はＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）由来酵素であり、前記表１の配列番号３４の核酸配列を使用した。また、前記使用された酵素ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ステビア植物）由来ＵＤＰ－グリコシル伝達酵素（ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）として、前記表１の配列番号３２で表示された核酸配列を利用して融合酵素を暗号化する核酸配列にベクターに導入した。
６－１： 酵素遺伝子を導入したベクターの製造
レバウジオシドＭ転換反応を行うために、ＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１およびＳｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅの３種を全て産生する組換え酵母を製造しようと、前記遺伝子が導入されたベクターをまず製造した。
具体的に、実施例５－１と実質的に同じ製造方法、プライマーおよびリンカーを利用して、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＧｍＳＵＳの融合酵素に関するベクターとしてｐＲＳ４２３_ＵＧＴ７６Ｇ１_ＧｍＳＵＳ、およびＴａＵＧＴｍおよびＧｍＳＵＳの融合酵素に関するベクターとしてｐＲＳ４２６_ＴａＵＧＴｍ_ＧｍＳＵＳベクターを製造した。前記ＴａＵＧＴｍは、実施例５と同様にＴａＵＧＴ_Ｔ２０１ＳＶ２０２Ｌ（ＴａＵＧＴｍ）変異酵素であり、ただしスクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）はＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）由来酵素であり、前記表１の配列番号３４の核酸配列を使用した。また、前記使用された酵素ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ステビア植物）由来ＵＤＰ－グリコシル伝達酵素（ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）として、前記表１の配列番号３２で表示された核酸配列を利用して融合酵素を暗号化する核酸配列にベクターに導入した。
【0129】
６－２： 宿主細胞の準備
前記製造されたベクターを導入するための宿主細胞の酵母は、酵母細胞に内在するｉｎｖｅｒｔａｓｅによるスクロース分解を防止するために、ｉｎｖｅｒｔａｓｅ酵素をコードするＳＵＣ２遺伝子を除去し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）△ｇａｌ８０△ＳＵＣ２を製造して使用した。
具体的に、前記ＳＵＣ２遺伝子の除去は酵母の相同組換え方法を利用し、ＳＵＣ２遺伝子のｕｐｓｔｒｅａｍ、ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍのＤＮＡ配列５００－ｂｐをそれぞれＱ５ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を使用し、９８℃（１ｍ）－[９８℃（１０ｓ）－５５℃（３０ｓ）－７２℃（５ｍ）]３０ｃｙｌｃｅｓ－７２℃（５ｍ）－１６℃（保管）条件でＰＣＲを行って増幅し、使用されたｕｐｓｔｒｅａｍおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍの情報を下記表９に示した。
前記製造されたベクターを導入するための宿主細胞の酵母は、酵母細胞に内在するｉｎｖｅｒｔａｓｅによるスクロース分解を防止するために、ｉｎｖｅｒｔａｓｅ酵素をコードするＳＵＣ２遺伝子を除去し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）△ｇａｌ８０△ＳＵＣ２を製造して使用した。
具体的に、前記ＳＵＣ２遺伝子の除去は酵母の相同組換え方法を利用し、ＳＵＣ２遺伝子のｕｐｓｔｒｅａｍ、ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍのＤＮＡ配列５００－ｂｐをそれぞれＱ５ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を使用し、９８℃（１ｍ）－[９８℃（１０ｓ）－５５℃（３０ｓ）－７２℃（５ｍ）]３０ｃｙｌｃｅｓ－７２℃（５ｍ）－１６℃（保管）条件でＰＣＲを行って増幅し、使用されたｕｐｓｔｒｅａｍおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍの情報を下記表９に示した。
【0130】
【表9】
【0131】
前記ＰＣＲを行って増幅した後、ＰＣＲ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法を使用して、それぞれの増幅されたＤＮＡの断片を連結した。連結されたＤＮＡの断片は、ｐＲＳ２６ベクターでクローニングし、ＬｉＡｃ法を使用して酵母形質転換を行い、確保された形質転換菌体をコロニーＰＣＲにより、ＳＵＣ２遺伝子が除去された菌株を選別した。
【0132】
６－３： 形質転換酵母の製造
実施例５と実質的に同じ方法で、前記６－１で製造されたｐＲＳ４２３_ＵＧＴ７６Ｇ１_ＧｍＳＵＳおよびｐＲＳ４２６_ＴａＵＧＴｍ_ＧｍＳＵＳベクターを、６－２で製造されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）△ｇａｌ８０△ＳＵＣ２にＬｉＡｃ法によって形質転換した。
前記形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別した。
前記選別された形質転換酵母を５Ｌ発酵培養により３種の酵素を細胞内で製造した。前記培養時使用された製造培地の容量は２Ｌであり、前記使用された製造培地組成は、下記表１０の通りであり、下記表１１の組成を有するｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを発酵培養時追加的に添加し、製造培地内ビタミン１０００ｘおよびＴｒａｃｅ ｍｅｔａｌ １０００ｘ情報を下記表１２および１３にそれぞれ示した。
実施例５と実質的に同じ方法で、前記６－１で製造されたｐＲＳ４２３_ＵＧＴ７６Ｇ１_ＧｍＳＵＳおよびｐＲＳ４２６_ＴａＵＧＴｍ_ＧｍＳＵＳベクターを、６－２で製造されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮＰＫ２－１ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）△ｇａｌ８０△ＳＵＣ２にＬｉＡｃ法によって形質転換した。
前記形質転換された菌株は、実施例１－２の方法と実質的に同じ方法で培養した。前記実施例２－１で製造されたＰｌａｓｍｉｄが形質転換された酵母をＵＲＡ－ｄｒｏｐ ｏｕｔ ｍｉｘを利用したＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地で選別した。
前記選別された形質転換酵母を５Ｌ発酵培養により３種の酵素を細胞内で製造した。前記培養時使用された製造培地の容量は２Ｌであり、前記使用された製造培地組成は、下記表１０の通りであり、下記表１１の組成を有するｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを発酵培養時追加的に添加し、製造培地内ビタミン１０００ｘおよびＴｒａｃｅ ｍｅｔａｌ １０００ｘ情報を下記表１２および１３にそれぞれ示した。
【0133】
【表10】
【0134】
【表11】
【0135】
【表12】
【0136】
【表13】
【0137】
３種の酵素の遺伝子が形質転換された酵母細胞は、発酵培養後最終ＯＤ600値が約１２０／ｍＬになるように菌体量を確保した。その後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）によって培養液と細胞を分離した。
【0138】
６－４： 助酵素液を利用した転換反応
前記分離された細胞を５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）５００ｍＬに再懸濁し、高圧分散器（ＧＥＡ Ｌａｂ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｐａｎｄａ ＰＬＵＳ ２０００）を使用して細胞を破砕し、破砕された細胞は別途の遠心分離過程なしに直ちに酵素源として使用した。
ステビア抽出物である５０ｇ／ＬのＲＡ６０_ＳＧ９５（Ｓｉｎｏｃｈｅｍ、Ｃｈｉｎａ）、７５０ｍＭスクロース、０．５ｍＭｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＵＤＰ）および３ｍＭ ＭｇＣｌ2を、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）５００ｍＬに溶解して転換反応のための反応溶液を製造した。前記ＲＡ６０_ＳＧ９５は、有効成分としてステビオール配糖体を９５（ｗ／ｖ）％の含有量で含み、ステビオール配糖体１００重量％を基準にＲｅｂ Ａの含有量が６０（ｗ／ｗ）％であり、ステビオシドの含有量が４０（ｗ／ｗ）％で含むステビア抽出物を意味する。
前記酵素を含む細胞破砕物と転換反応のために前記準備した原料物質（反応溶液）を混合して３０℃で２４時間攪拌してレバウジオシドＭ転換反応を行った。前記転換反応後反応を止めるために、反応液を５分間沸騰させた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）し、遠心分離によって得られた上澄み液を分析して生成物を確認した。
生成物分析は、ＨＰＬＣを利用して定性および定量後、生成されたステビオール配糖体含有量を確認した。ＨＰＬＣで使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｄｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで行われた。移動相は、０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水と１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）をそれぞれ利用して、Ｇｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分の分析を通じて確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件は下記表１４に示した。
前記分離された細胞を５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）５００ｍＬに再懸濁し、高圧分散器（ＧＥＡ Ｌａｂ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｐａｎｄａ ＰＬＵＳ ２０００）を使用して細胞を破砕し、破砕された細胞は別途の遠心分離過程なしに直ちに酵素源として使用した。
ステビア抽出物である５０ｇ／ＬのＲＡ６０_ＳＧ９５（Ｓｉｎｏｃｈｅｍ、Ｃｈｉｎａ）、７５０ｍＭスクロース、０．５ｍＭｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＵＤＰ）および３ｍＭ ＭｇＣｌ2を、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）５００ｍＬに溶解して転換反応のための反応溶液を製造した。前記ＲＡ６０_ＳＧ９５は、有効成分としてステビオール配糖体を９５（ｗ／ｖ）％の含有量で含み、ステビオール配糖体１００重量％を基準にＲｅｂ Ａの含有量が６０（ｗ／ｗ）％であり、ステビオシドの含有量が４０（ｗ／ｗ）％で含むステビア抽出物を意味する。
前記酵素を含む細胞破砕物と転換反応のために前記準備した原料物質（反応溶液）を混合して３０℃で２４時間攪拌してレバウジオシドＭ転換反応を行った。前記転換反応後反応を止めるために、反応液を５分間沸騰させた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）し、遠心分離によって得られた上澄み液を分析して生成物を確認した。
生成物分析は、ＨＰＬＣを利用して定性および定量後、生成されたステビオール配糖体含有量を確認した。ＨＰＬＣで使用されたｃｏｌｕｍｎは、ＵＧ１２０（Ｃ１８２５０ｍｍ×４６ｍｍ、５ｕｍ １１０ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｈｉｄｅｉｄｏ）を利用し、分析は２１０ｎｍで行われた。移動相は、０．０１％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を含む水と１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）をそれぞれ利用して、Ｇｒａｄｉｅｎｔで分析し、移動相は１ｍＬ／ｍｉｎで流し、合計４０分の分析を通じて確認した。前記ＨＰＬＣ分析条件は下記表１４に示した。
【0139】
【表14】
【0140】
前記分析結果は、ＨＰＬＣ分析で得られる滞留時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）は、基質でＳＴＥは１５．３分、Ｒｅｂ Ａ１５．１分であり、生成物に含まれたＲｅｂ Ｅは１０．６分、Ｒｅｂ Ｉは１４．７分、Ｒｅｂ Ｄ１０．９分、Ｒｅｂ Ｍは１１．６分であった。
【0141】
実施例７ 転換反応のｐＨ条件確認
実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）を使用して、ステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換反応の反応ｐＨ最適化を行った。
具体的に、前記実施例６で製造した転換反応のための原料（反応原料溶液）と同様に製造するが、ただし５ＮＮａＯＨを利用して前記実施例６の反応溶液のｐＨを５．８、６．０、６．２または６．５に調節した。
前記ｐＨが調節された反応溶液を利用して、前記実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量を分析した。前記分析結果を下記表１５に示した。下記表１５の数値は、生成されたステビオール配糖体１００重量％を基準に各ステビオール配糖体の組成を重量％に表示したものである。
実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）を使用して、ステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換反応の反応ｐＨ最適化を行った。
具体的に、前記実施例６で製造した転換反応のための原料（反応原料溶液）と同様に製造するが、ただし５ＮＮａＯＨを利用して前記実施例６の反応溶液のｐＨを５．８、６．０、６．２または６．５に調節した。
前記ｐＨが調節された反応溶液を利用して、前記実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量を分析した。前記分析結果を下記表１５に示した。下記表１５の数値は、生成されたステビオール配糖体１００重量％を基準に各ステビオール配糖体の組成を重量％に表示したものである。
【0142】
【表15】
【0143】
前記生成物のステビオール配糖体含有量を分析した結果、糖転移酵素によるステビオールでの糖転移位置は、炭素原子１３番と１９番で行われ、実際反応でｐＨ６．０以上の場合、Ｃ１９での糖転移速度が速く、ｐＨ６．０以下の場合Ｃ１３での糖転移速度が速いことを確認した。
使用された３種の酵素のＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、およびスクロース合成酵素を利用した酵素反応で最適ｐＨ条件が相補的に作用し、ｐＨ６．０～６．２の間にステビア抽出物からレバウジオシドＭ製造量が最も多いことを確認した。
使用された３種の酵素のＴａＵＧＴｍ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、およびスクロース合成酵素を利用した酵素反応で最適ｐＨ条件が相補的に作用し、ｐＨ６．０～６．２の間にステビア抽出物からレバウジオシドＭ製造量が最も多いことを確認した。
【0144】
実施例８
転換反応の温度条件確認
実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）を使用してステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換反応の反応温度最適化を行った。
具体的に、実施例６で製造した転換反応のための原料（反応原料溶液）と同様に製造するが、５ＮＮａＯＨを利用して転換反応のための基質原料のｐＨを６．０に調節し、実施例６の細胞破砕物を混合して３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で攪拌した。その他の条件は実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量を分析した。
前記反応時間に応じたステビオール配糖体含有量の分析結果を下記表１６に示した。
前記Ｒｅｂ Ｍの含有量は、ＨＰＬＣ ｐｅａｋでＲｅｂ Ｍ（ｇ／Ｌ）のｐｅａｋに該当する第３ｐｅａｋの面積を利用して、下記数式３に従って転換率で計算した。
Ｒｅｂ Ｍ含有量＝（［ＨＰＬＣ Ａｒｅａ］－６３２４）／９３８４４２ （数式３）
下記表１６の数値はＲｅｂ Ｍの含有量（ｇ／Ｌ）を示す。
転換反応の温度条件確認
実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）を使用してステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換反応の反応温度最適化を行った。
具体的に、実施例６で製造した転換反応のための原料（反応原料溶液）と同様に製造するが、５ＮＮａＯＨを利用して転換反応のための基質原料のｐＨを６．０に調節し、実施例６の細胞破砕物を混合して３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で攪拌した。その他の条件は実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量を分析した。
前記反応時間に応じたステビオール配糖体含有量の分析結果を下記表１６に示した。
前記Ｒｅｂ Ｍの含有量は、ＨＰＬＣ ｐｅａｋでＲｅｂ Ｍ（ｇ／Ｌ）のｐｅａｋに該当する第３ｐｅａｋの面積を利用して、下記数式３に従って転換率で計算した。
Ｒｅｂ Ｍ含有量＝（［ＨＰＬＣ Ａｒｅａ］－６３２４）／９３８４４２ （数式３）
下記表１６の数値はＲｅｂ Ｍの含有量（ｇ／Ｌ）を示す。
【0145】
【表16】
【0146】
反応温度に応じたレバウジオシドＭ転換反応を分析した結果、反応温度が増加するほど初期転換反応速度は増加したが、それにより急速に酵素失活が発生して最終的に３５℃でレバウジオシドＭの転換率が最も高く確認された。
【0147】
実施例９ 転換反応のスクロース濃度確認
実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）を使用したレバウジオシドＭ転換反応の糖転移過程でのＵＤＰ－グルコース供給のための基質として使用されるスクロースの濃度に応じた転換反応の阻害程度を確認した。
５０ｇ／Ｌのステビア抽出物に対するレバウジオシドＭへの転換に要求される理論的なＵＤＰ－グルコース量は、３２０ｍＭ程度と予想されるが、実際転換反応で細胞破砕物内の他の酵素によって２００ｍＭ程度のスクロース分解が発生するため、転換反応に使用されるスクロースの濃度は、少なくとも５００ｍＭ以上でスクロース濃度の最適化を開始した。
具体的に、実施例６で使用した転換反応のための原料と同様に製造するが、ただし実施例６の転換反応に使用された７５０ｍＭのスクロースの代わりに６００、８００、１０００または１２００ｍＭのスクロース濃度で使用した反応原料を準備し、５ＮＮａＯＨを利用して基質原料のｐＨを６．０に調節した。前記準備された反応原料を、実施例６－４で得られた３種酵素を産生する組換え酵母の細胞破砕液（助酵素液）と混合して３５℃で攪拌した。その他の条件を実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量を分析した。前記スクロース使用量に応じたステビオール配糖体含有量の分析結果を下記表１７に示した。下記表１７の数値はＲｅｂ Ｍの転換率（％）を示す。
Ｒｅｂ Ｍ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＭのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式４）
実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）を使用したレバウジオシドＭ転換反応の糖転移過程でのＵＤＰ－グルコース供給のための基質として使用されるスクロースの濃度に応じた転換反応の阻害程度を確認した。
５０ｇ／Ｌのステビア抽出物に対するレバウジオシドＭへの転換に要求される理論的なＵＤＰ－グルコース量は、３２０ｍＭ程度と予想されるが、実際転換反応で細胞破砕物内の他の酵素によって２００ｍＭ程度のスクロース分解が発生するため、転換反応に使用されるスクロースの濃度は、少なくとも５００ｍＭ以上でスクロース濃度の最適化を開始した。
具体的に、実施例６で使用した転換反応のための原料と同様に製造するが、ただし実施例６の転換反応に使用された７５０ｍＭのスクロースの代わりに６００、８００、１０００または１２００ｍＭのスクロース濃度で使用した反応原料を準備し、５ＮＮａＯＨを利用して基質原料のｐＨを６．０に調節した。前記準備された反応原料を、実施例６－４で得られた３種酵素を産生する組換え酵母の細胞破砕液（助酵素液）と混合して３５℃で攪拌した。その他の条件を実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量を分析した。前記スクロース使用量に応じたステビオール配糖体含有量の分析結果を下記表１７に示した。下記表１７の数値はＲｅｂ Ｍの転換率（％）を示す。
Ｒｅｂ Ｍ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＭのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式４）
【0148】
【表17】
【0149】
前記実験結果から、転換反応の原料に含まれたスクロース濃度が１０００ｍＭでレバウジオシドＭが最も高い転換率を確認し、これ以上の濃度ではｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ酵素に対する阻害が発生して全体的な転換率が減少した。
【0150】
実施例１０ 高濃度ステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換反応
実施例６～９で確認した反応条件を基に、高濃度ステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換率を比較した。
実施例６に係る３種の酵素を利用したレバウジオシドＭ製造での全体的な転換反応式は下記反応式１の通りである。
ＳＵＳ： Ｓｕｃｒｏｓｅ＋ＵＤＰ＋[Ｈ+]→Ｆｒｕｃｔｏｓｅ＋ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ
ＵＧＴ： Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ＋ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ→Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ－[ｇｌｕｃｏｓｅ]＋ＵＤＰ＋[Ｈ+] （反応式１）
実施例６～９で確認した最適化反応条件で実験を行うために、実施例６で使用された転換反応原料の製造に使用されたＲＡ６０_ＳＧ９５（ステビア抽出物）基質濃度５０ｇ／Ｌの代わりに、２５、５０、７５または１００ｇ／Ｌの４種類濃度で準備して、スクロースを１０００ｍＭ濃度にして、ｐＨを６．０に調節して原料を準備した。
前記準備された反応原料を、実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）と混合して３５℃で攪拌した。その他の条件を実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量と、生成物のステビオール配糖体内成分の含有量比率分析結果を得た。
前記転換反応で得られた、レバウジオシドＭ製造量（ｇ／Ｌ）を下記表１８に示した。また、生成物のステビオール配糖体内成分の含有量比率分析結果を表１９および図１に示し、下記表１９に記載された数値は、ＳＴＥ、Ｒｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｅ、Ｒｅｂ Ｉ、Ｒｅｂ Ｄ、およびＲｅｂ Ｍの合計１００重量％を基準に各ステビオール配糖体の含有量比率（重量％）を示す。
実施例６～９で確認した反応条件を基に、高濃度ステビア抽出物からレバウジオシドＭ転換率を比較した。
実施例６に係る３種の酵素を利用したレバウジオシドＭ製造での全体的な転換反応式は下記反応式１の通りである。
ＳＵＳ： Ｓｕｃｒｏｓｅ＋ＵＤＰ＋[Ｈ+]→Ｆｒｕｃｔｏｓｅ＋ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ
ＵＧＴ： Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ＋ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ→Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ－[ｇｌｕｃｏｓｅ]＋ＵＤＰ＋[Ｈ+] （反応式１）
実施例６～９で確認した最適化反応条件で実験を行うために、実施例６で使用された転換反応原料の製造に使用されたＲＡ６０_ＳＧ９５（ステビア抽出物）基質濃度５０ｇ／Ｌの代わりに、２５、５０、７５または１００ｇ／Ｌの４種類濃度で準備して、スクロースを１０００ｍＭ濃度にして、ｐＨを６．０に調節して原料を準備した。
前記準備された反応原料を、実施例６－４で得られた３種酵素を産生する形質転換された酵母細胞の細胞破砕液（助酵素液）と混合して３５℃で攪拌した。その他の条件を実施例６と実質的に同じ方法でレバウジオシドＭ転換反応を行い、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析法で生成物のステビオール配糖体含有量と、生成物のステビオール配糖体内成分の含有量比率分析結果を得た。
前記転換反応で得られた、レバウジオシドＭ製造量（ｇ／Ｌ）を下記表１８に示した。また、生成物のステビオール配糖体内成分の含有量比率分析結果を表１９および図１に示し、下記表１９に記載された数値は、ＳＴＥ、Ｒｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｅ、Ｒｅｂ Ｉ、Ｒｅｂ Ｄ、およびＲｅｂ Ｍの合計１００重量％を基準に各ステビオール配糖体の含有量比率（重量％）を示す。
【0151】
【表18】
【0152】
【表19】
【0153】
実施例６～９で確認した反応温度、反応ｐＨおよびスクロース濃度条件で高濃度ステビオール抽出物を使用して転換反応を行った結果、レバウジオシドＭ絶対的製造量は、基質であるステビオール抽出物の濃度が増加するほど増加した。
表１９に示したように、２５、５０、７５または１００ｇ／Ｌの４種類基質濃度全てにおいて、６種類ステビオール配糖体の中でＲｅｂ Ｍ製造費率が最も高かった。また全体ステビオール配糖体中のレバウジオシドＭの含有量は、基質濃度が増加するほど多少減少するが、産業的に大量生産のための最小濃度である１００ｇ／Ｌ濃度で８７．７％の高い転換率を確認し、高濃度ステビア抽出物での高い転換率を確認した。
また、転換過程を通じて生成されたレバウジオシドＭの絶対的な製造量は、基質の濃度が高くなるほど高くなることを確認し、生成物のステビオール配糖体内レバウジオシドＭの含有量比率が多少低くなっても、絶対的な製造量は増加して産業的に大量生産のための条件において、本発明に係る組換え微生物は非常に優れた特性を有することを確認した。
２５、５０、７５または１００ｇ／Ｌの４種類の基質濃度において全て反応産物内でレバウジオシドＩを含むことを確認し、副産物としてのレバウジオシドＩが含まれることは避けられないことを確認した。
前記結果から、ステビア抽出物をステビオール配糖体に転換させる際に、レバウジオシドＭ転換率側面から、高濃度のステビア抽出物を使用した従来のレバウジオシドＭ転換反応に見られる低い転換率および低い製造量を克服して大量生産が可能になることを確認した。
表１９に示したように、２５、５０、７５または１００ｇ／Ｌの４種類基質濃度全てにおいて、６種類ステビオール配糖体の中でＲｅｂ Ｍ製造費率が最も高かった。また全体ステビオール配糖体中のレバウジオシドＭの含有量は、基質濃度が増加するほど多少減少するが、産業的に大量生産のための最小濃度である１００ｇ／Ｌ濃度で８７．７％の高い転換率を確認し、高濃度ステビア抽出物での高い転換率を確認した。
また、転換過程を通じて生成されたレバウジオシドＭの絶対的な製造量は、基質の濃度が高くなるほど高くなることを確認し、生成物のステビオール配糖体内レバウジオシドＭの含有量比率が多少低くなっても、絶対的な製造量は増加して産業的に大量生産のための条件において、本発明に係る組換え微生物は非常に優れた特性を有することを確認した。
２５、５０、７５または１００ｇ／Ｌの４種類の基質濃度において全て反応産物内でレバウジオシドＩを含むことを確認し、副産物としてのレバウジオシドＩが含まれることは避けられないことを確認した。
前記結果から、ステビア抽出物をステビオール配糖体に転換させる際に、レバウジオシドＭ転換率側面から、高濃度のステビア抽出物を使用した従来のレバウジオシドＭ転換反応に見られる低い転換率および低い製造量を克服して大量生産が可能になることを確認した。
【0154】
実施例１１ ＵＧＴおよびＳＵＳ酵素を発現する微生物の凍結乾燥
１１－１： ＵＧＴおよびＳＵＳ酵素を産生する形質転換酵母菌体の準備
ＵＧＴおよびＳＵＳ酵素を発現する形質転換微生物の菌体は、前記実施例６－１、６－２および６－３の方法で製造して確保した。
１１－１： ＵＧＴおよびＳＵＳ酵素を産生する形質転換酵母菌体の準備
ＵＧＴおよびＳＵＳ酵素を発現する形質転換微生物の菌体は、前記実施例６－１、６－２および６－３の方法で製造して確保した。
【0155】
１１－２： 凍結乾燥微生物の製造
微生物菌体に対する基質透過性を高め、常温で保管安定性を増加させるために、前記実施例１１－１で準備した微生物菌体を凍結乾燥した。凍結乾燥は、真空を維持しながら、凍結乾燥は－４０℃で急速凍結した後、凍結乾燥装置を利用して３２時間凍結乾燥した。
微生物菌体に対する基質透過性を高め、常温で保管安定性を増加させるために、前記実施例１１－１で準備した微生物菌体を凍結乾燥した。凍結乾燥は、真空を維持しながら、凍結乾燥は－４０℃で急速凍結した後、凍結乾燥装置を利用して３２時間凍結乾燥した。
【0156】
実施例１２： 凍結乾燥菌体の転換活性評価
前記実施例１１－２で製造した凍結乾燥菌体を利用した全細胞反応において、反応基質でＲｅｂ Ｍの転換反応を行って、凍結乾燥菌体の転換活性を評価した。対照群として、凍結乾燥を行わない前記実施例１１－１で培養後回収した形質転換微生物菌体であって、凍結乾燥処理を行わない菌体を準備した。
前記菌体の酵素活性を評価するために、２次蒸溜水（ＤＤＷ；Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ）に、基質ＲＡ６０（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）１ｇ／Ｌ、ＵＤＰ１ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ２５０ｍＭを添加して反応原料液１ｍＬを製造した。前記反応原料に実施例１１－２で製造した凍結乾燥前細胞を添加して凍結乾燥細胞（実験区）または実施例１１－１で製造した凍結乾燥をしない細胞（対照群）を添加してそれぞれ９．２ｇ／Ｌの濃度になるように準備した。
前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．０および１５０ｒｐｍ条件で転換反応を行い、反応開始１時間後に、全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて転換反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を利用して全細胞反応生成物を分析した。
全細胞反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙで行い、生成物に含まれたステビオール配糖体の転換比率を確認した。具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析方法は、前記実施例６－４の方法と実質的に同じにように行った。前記組換え微生物は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換し、Ｒｅｂ ＤをＲｅｂ Ｍに転換して、Ｒｅｂ ＤとＲｅｂ Ｍの生成比率を確認した。
前記分析結果、ＲＡ６０基質からＲｅｄ ＤとＲｅｂ Ｍに転換された転換率は下記表に示した。Ｒｅｂ Ｄ転換率とＲｅｂ Ｍ転換率は、下記数式１および４に従って、それぞれ計算した。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
Ｒｅｂ Ｍ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＭのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式４）
前記実施例１１－２で製造した凍結乾燥菌体を利用した全細胞反応において、反応基質でＲｅｂ Ｍの転換反応を行って、凍結乾燥菌体の転換活性を評価した。対照群として、凍結乾燥を行わない前記実施例１１－１で培養後回収した形質転換微生物菌体であって、凍結乾燥処理を行わない菌体を準備した。
前記菌体の酵素活性を評価するために、２次蒸溜水（ＤＤＷ；Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ）に、基質ＲＡ６０（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）１ｇ／Ｌ、ＵＤＰ１ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ２５０ｍＭを添加して反応原料液１ｍＬを製造した。前記反応原料に実施例１１－２で製造した凍結乾燥前細胞を添加して凍結乾燥細胞（実験区）または実施例１１－１で製造した凍結乾燥をしない細胞（対照群）を添加してそれぞれ９．２ｇ／Ｌの濃度になるように準備した。
前記製造された反応液に対して、温度３０℃、ｐＨ７．０および１５０ｒｐｍ条件で転換反応を行い、反応開始１時間後に、全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて転換反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を利用して全細胞反応生成物を分析した。
全細胞反応生成物の分析は、ＨＰＬＣ－Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙで行い、生成物に含まれたステビオール配糖体の転換比率を確認した。具体的に、転換生成物のＨＰＬＣ分析方法は、前記実施例６－４の方法と実質的に同じにように行った。前記組換え微生物は、Ｒｅｂ Ａ基質をＲｅｂ Ｄに転換し、Ｒｅｂ ＤをＲｅｂ Ｍに転換して、Ｒｅｂ ＤとＲｅｂ Ｍの生成比率を確認した。
前記分析結果、ＲＡ６０基質からＲｅｄ ＤとＲｅｂ Ｍに転換された転換率は下記表に示した。Ｒｅｂ Ｄ転換率とＲｅｂ Ｍ転換率は、下記数式１および４に従って、それぞれ計算した。
Ｒｅｂ Ｄ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＤのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式１）
Ｒｅｂ Ｍ転換率（％）＝Ｒｅｂ ＭのＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ／全体ＨＰＬＣ ｐｅａｋ ａｒｅａ （数式４）
【0157】
【表20】
【0158】
Ｒｅｂ Ｄ転換率およびＲｅｂ Ｍ転換率を計算した結果、凍結乾燥しない菌体を利用した転換反応で、Ｒｅｂ ＤとＲｅｂ Ｍが製造されず、凍結乾燥された菌体を利用した転換反応でＲｅｂ ＤとＲｅｂ Ｍが製造されることを確認した。またＲｅｂ Ｍ転換率は１４．７％であり、Ｒｅｂ Ｄの転換率は４７．５％であった。凍結乾燥された全細胞がＲｅｂ ＤとＭを生成することができるのを確認した。前記実施例１０で３種酵素を含む細胞破砕液（助酵素液）を使用する場合、生成物のステビオール配糖体内Ｒｅｂ Ｍ成分の含有量比率は８０％以上であるが、本実施例で前細胞菌体反応を利用した場合、基質の細胞壁透過性が低く、Ｒｅｂ Ｍ生成比率が比較的低い傾向を示した。
【0159】
実施例１３： 凍結乾燥菌体の安定性
実施例１１－２で得られた凍結乾燥微生物の安定性を評価するために、常温（２５℃）で９週間保管後酵素の活性を維持しているか確認した。酵素活性維持を確認するために、前記実施例１２と実質的に同じ方法で酵素の活性を週１回測定した。
前記保管期間の間凍結乾燥された微生物菌体の酵素活性を確認した結果、全体試験器間である９週間の酵素活性が維持されることを確認し、常温で細胞保管が可能であることを確認した。具体的に、９週間の凍結乾燥細胞を保管した場合、菌体の酵素活性は、保管開始時点の活性１００％を基準に９７％以上維持されることを確認した。これとは異なり、実施例１０で転換反応に使用した細胞破砕液またはこれから得られた助酵素液は、細胞破砕後２４時間が経過すると、酵素活性が略失活し、残存活性が１０％以下に減少するようになる。
実施例１１－２で得られた凍結乾燥微生物の安定性を評価するために、常温（２５℃）で９週間保管後酵素の活性を維持しているか確認した。酵素活性維持を確認するために、前記実施例１２と実質的に同じ方法で酵素の活性を週１回測定した。
前記保管期間の間凍結乾燥された微生物菌体の酵素活性を確認した結果、全体試験器間である９週間の酵素活性が維持されることを確認し、常温で細胞保管が可能であることを確認した。具体的に、９週間の凍結乾燥細胞を保管した場合、菌体の酵素活性は、保管開始時点の活性１００％を基準に９７％以上維持されることを確認した。これとは異なり、実施例１０で転換反応に使用した細胞破砕液またはこれから得られた助酵素液は、細胞破砕後２４時間が経過すると、酵素活性が略失活し、残存活性が１０％以下に減少するようになる。
【0160】
実施例１４ 凍結乾燥菌体を利用した前細胞転換反応の最適化
１４－１： 全細胞反応のｐＨ最適化
凍結乾燥された細胞を利用した全細胞反応の最適ｐＨを確認するために、前記実施例１１－２で得られた凍結乾燥微生物菌体を利用して、前記実施例１２と実質的に同じ方法で前細胞転換反応を行ったが、ただしＰｏｔａｓｓｕｉｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを１００ｍＭ添加してｐＨ６．０～７．４条件下であった。その後、全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて全細胞反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を前記実施例１２のＨＰＬＣ条件でＨＰＬＣ分析して全細胞反応生成物を確認した。
相対的転換率は全体ｐＨ範囲内で、Ｒｅｂ Ｍ製造量が最も高い結果を１００に定め、残りを相対比率（％）で示した。その結果を下記表に示した。
１４－１： 全細胞反応のｐＨ最適化
凍結乾燥された細胞を利用した全細胞反応の最適ｐＨを確認するために、前記実施例１１－２で得られた凍結乾燥微生物菌体を利用して、前記実施例１２と実質的に同じ方法で前細胞転換反応を行ったが、ただしＰｏｔａｓｓｕｉｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを１００ｍＭ添加してｐＨ６．０～７．４条件下であった。その後、全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて全細胞反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を前記実施例１２のＨＰＬＣ条件でＨＰＬＣ分析して全細胞反応生成物を確認した。
相対的転換率は全体ｐＨ範囲内で、Ｒｅｂ Ｍ製造量が最も高い結果を１００に定め、残りを相対比率（％）で示した。その結果を下記表に示した。
【0161】
【表21】
【0162】
転換反応のｐＨ条件に応じた全細胞反応の転換率を確認した結果、ｐＨ６．０から始まりｐＨが増加するほど相対的転換率を増加し、ｐＨ７．２で転換率が最も高く確認され、凍結乾燥細胞全細胞反応の最適ｐＨは７．２であることを確認した。
【0163】
１４－２： 全細胞反応の反応温度最適化
凍結乾燥された細胞を利用した全細胞反応の最適温度を確認するために、前記実施例１１－２で得られた凍結乾燥微生物菌体を利用して、前記実施例１２と実質的に同じ方法で前細胞転換反応を行ったが、ただし温度３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５２または５５℃条件でＰｏｔａｓｓｕｉｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを１００ｍＭ添加してｐＨ７．２条件で全細胞反応を行った。
その後、全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて全細胞反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を前記実施例１２－２のＨＰＬＣ条件でＨＰＬＣ分析して全細胞反応生成物を確認し、全体温度範囲内で、Ｒｅｂ Ｍ製造量が最も高い結果を１００に定め、残りを相対比率（％）で示した。その結果を下記表に示した。
凍結乾燥された細胞を利用した全細胞反応の最適温度を確認するために、前記実施例１１－２で得られた凍結乾燥微生物菌体を利用して、前記実施例１２と実質的に同じ方法で前細胞転換反応を行ったが、ただし温度３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５２または５５℃条件でＰｏｔａｓｓｕｉｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを１００ｍＭ添加してｐＨ７．２条件で全細胞反応を行った。
その後、全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて全細胞反応を終了し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して得られた上澄み液を前記実施例１２－２のＨＰＬＣ条件でＨＰＬＣ分析して全細胞反応生成物を確認し、全体温度範囲内で、Ｒｅｂ Ｍ製造量が最も高い結果を１００に定め、残りを相対比率（％）で示した。その結果を下記表に示した。
【0164】
【表22】
【0165】
転換反応の温度条件に応じた全細胞反応の転換率を確認した結果、３０℃から約３５℃まで温度が増加するほど転換率が増加し、その後約５２℃まで安定的に転換反応を行い、４５℃で転換率が最も高く確認され、凍結乾燥細胞全細胞反応の最適温度は４５℃であることを確認した。
【0166】
実施例１５ 凍結乾燥菌体を利用した高純度Ｒｅｂ Ｍの大量生産
実施例１１－２で得られた凍結乾燥菌体を利用して高濃度Ｒｅｂ Ｍを製造できるか否かを試験しようと、全細胞を利用した転換反応を行った。
具体的に、前記高濃度Ｒｅｂ Ｍの製造のための大量生産工程を行うために、２次蒸溜水（ＤＤＷ；Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ）に基質ＲＡ６０（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）７５ｇ／Ｌ、ＵＤＰ０．３ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ７５０ｍＭ、凍結乾燥細胞４５ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ５ｍＭを含む全細胞反応液２Ｌを準備した。
前記準備された反応液に対して、Ｐｏｔａｓｓｕｉｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを５ｍＭ添加してｐＨ７．２に調整し、４５℃の温度、２５０ｒｐｍ条件で全細胞反応を行い、前記全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて全細胞反応を終了し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）して上澄み液を得た。前記上澄み液を利用して前記実施例１２のＨＰＬＣ条件でＨＰＬＣ分析を行い、Ｒｅｂ Ｍの製造量を確認した。
前記分析結果、Ｒｅｂ Ｍ転換率９０．４％、製造量９７ｇ／Ｌを得た。Ｒｅｂ Ｍ生成量を確認した結果、凍結乾燥細胞を利用して純度９０重量％の高濃度Ｒｅｂ Ｍを得ることができることを確認し、高純度Ｒｅｂ Ｍの大量生産が可能であることを確認した。たとえ凍結乾燥菌体のＲｅｂ Ｍの製造活性評価のための少量の基質溶液を使用し、反応条件が多少異なるが、実施例１２のＲｅｂ Ｍに比べて本実施例では、非常に増加された転換率を示すことを確認した。
実施例１１－２で得られた凍結乾燥菌体を利用して高濃度Ｒｅｂ Ｍを製造できるか否かを試験しようと、全細胞を利用した転換反応を行った。
具体的に、前記高濃度Ｒｅｂ Ｍの製造のための大量生産工程を行うために、２次蒸溜水（ＤＤＷ；Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ）に基質ＲＡ６０（９５％、Ｓｉｎｏｃｈｅｍ）７５ｇ／Ｌ、ＵＤＰ０．３ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ７５０ｍＭ、凍結乾燥細胞４５ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ５ｍＭを含む全細胞反応液２Ｌを準備した。
前記準備された反応液に対して、Ｐｏｔａｓｓｕｉｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを５ｍＭ添加してｐＨ７．２に調整し、４５℃の温度、２５０ｒｐｍ条件で全細胞反応を行い、前記全細胞反応液を１００℃で５分間沸騰させて全細胞反応を終了し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）して上澄み液を得た。前記上澄み液を利用して前記実施例１２のＨＰＬＣ条件でＨＰＬＣ分析を行い、Ｒｅｂ Ｍの製造量を確認した。
前記分析結果、Ｒｅｂ Ｍ転換率９０．４％、製造量９７ｇ／Ｌを得た。Ｒｅｂ Ｍ生成量を確認した結果、凍結乾燥細胞を利用して純度９０重量％の高濃度Ｒｅｂ Ｍを得ることができることを確認し、高純度Ｒｅｂ Ｍの大量生産が可能であることを確認した。たとえ凍結乾燥菌体のＲｅｂ Ｍの製造活性評価のための少量の基質溶液を使用し、反応条件が多少異なるが、実施例１２のＲｅｂ Ｍに比べて本実施例では、非常に増加された転換率を示すことを確認した。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】