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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-22
(54)【発明の名称】最適化されたＣＹＰ４Ｖ２遺伝子およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20250115BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250115BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20250115BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20250115BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250115BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250115BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20250115BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250115BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250115BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20250115BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20250115BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20250115BHJP
A61K 35/765 20150101ALI20250115BHJP
A61K 35/766 20150101ALI20250115BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20250115BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20250115BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20250115BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/86 Z
C12N7/01
A61K48/00
A61P43/00 111
A61P27/02
A61K31/7088
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/763
A61K35/765
A61K35/766
A61K47/69
C12N15/864 100Z
C12N15/09 110
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538654
(86)(22)【出願日】2022-12-21
(85)【翻訳文提出日】2024-06-21
(86)【国際出願番号】 CN2022140586
(87)【国際公開番号】W WO2023116745
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】202111580873.0
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524237951
【氏名又は名称】蘇州諾潔貝生物技術有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】曹青
(72)【発明者】
【氏名】張海
(72)【発明者】
【氏名】文聖梅
(72)【発明者】
【氏名】蒋立新
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA44
4C076AA94
4C076BB24
4C076CC10
4C076CC41
4C076EE56
4C076EE59
4C076FF31
4C084AA13
4C084AA17
4C084MA02
4C084MA58
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA58
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZC75
(57)【要約】
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する最適化されたＣＹＰ４Ｖ２遺伝子およびその使用を提供する。本開示は、また、眼の網膜色素上皮層において効率的、持続的かつ安定的な発現を実現でき、ＢＣＤを治療するための遺伝子治療薬物の用量および起こり得る副作用を効果的に低減し、治療効果を改善し得る、前記遺伝子を含む発現ベクターに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるものであり、
より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されるものである、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項2】
請求項１に記載のポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターとを含む発現カセット。
【請求項3】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項4】
発現制御エレメントをさらに含み、前記ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記発現制御エレメントに作動可能に連結されており、好ましくは、前記発現制御エレメントは、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｐｏｌｙ Ａシグナル、ＩＴＲ、インシュレーター、ＲＮＡプロセシングシグナル、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の安定性を増強するエレメントから選択された１種または複数種であり、
好ましくは、前記発現ベクターは複製起点を含み、好ましくは、前記複製起点の配列は、ｆ１ファージｏｒｉ、ＲＫ２ｏｒｉＶ、ｐＵＣ ｏｒｉ、およびｐＳＣ１０１ｏｒｉから選択され、
好ましくは、前記発現ベクターは、５’ＩＴＲをさらに含み、好ましくは、前記５’ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるものであり、
好ましくは、前記発現ベクターは、３’ＩＴＲをさらに含み、好ましくは、前記３’ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示されるものであり、
好ましくは、前記発現ベクターは、エンハンサーをさらに含み、好ましくは、前記エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーであり、より好ましくは、前記エンハンサーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド列を含み、より好ましくは、９８％以上または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるものであり、
好ましくは、前記発現ベクターは、プロモーターをさらに含み、好ましくは、前記プロモーターは、特異的または非特異的プロモーターであり、好ましくは、前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＰＧＫプロモーターおよびＴＲＥ３ＧＳプロモーターから選択され、より好ましくは、前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーターであり、好ましくは、前記ＣＢＡプロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されるものであり、好ましくは、前記プロモーターは誘導可能プロモーターであり、好ましくは、前記誘導可能系は、テトラサイクリン調節プロモーター、アルコール調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、病原性調節プロモーター、温度／熱誘導型プロモーター、および光調節プロモーター、ＩＰＴＧ誘導型系のうちの１種または複数種を含み、好ましくは、前記テトラサイクリン調節プロモーターは、Ｔｅｔ ｏｎプロモーター、Ｔｅｔ ｏｆｆプロモーター、およびＴｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒプロモーターから選択され、好ましくは、前記アルコール調節プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータータンパク質（ＡｌｃＲ）に応答するプロモーターから選択され；好ましくは、前記ステロイド調節プロモーターは、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター、ヒトエストロゲン受容体プロモーター、蛾エクジステロイド受容体プロモーター、レチノイドプロモーター、および甲状腺受容体スーパーファミリープロモーターから選択され、好ましくは、前記金属調節プロモーターは、酵母、マウスおよびヒトのメタロチオネインプロモーターから選択され、好ましくは、前記病原性調節プロモーターは、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーターおよびベンゾチアジアゾール調節（ＢＴＨ）プロモーターから選択され、好ましくは、前記温度／熱誘導型プロモーターは、ＨＳＰ－７０プロモーター、ＨＳＰ－９０プロモーターおよび大豆熱ショックプロモーターから選択され、好ましくは、前記光調節プロモーターは、植物細胞の光応答型プロモーターであり、
好ましくは、前記発現ベクターは、エクソンおよびイントロンをさらに含み、好ましくは、前記エクソンおよびイントロンは、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロンであり、好ましくは、前記エクソンおよびイントロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるものであり、
好ましくは、前記発現ベクターは、ｐｏｌｙＡシグナルをさらに含み、好ましくは、前記ｐｏｌｙＡシグナルは、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙ Ａ（ＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ）、ショートｐｏｌｙ Ａ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ、および／またはヒトβ－ビーズタンパク質ｐｏｌｙ Ａであり；好ましくは、前記ｐｏｌｙＡシグナルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示されるものであり、
好ましくは、前記発現ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６に示される通りであり、
好ましくは、前記ベクターは、転写後調節エレメントを含み、好ましくは、前記転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であり、
好ましくは、前記ベクターは、マーカーをコードする遺伝子をさらに含み、好ましくは、前記マーカーは、抗生物質耐性タンパク質、毒素耐性タンパク質、着色または蛍光または発光タンパク質、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質から選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記抗生物質は、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシンおよびブラストサイジンから選択され、
好ましくは、前記毒素は、炭疽毒素およびジフテリア毒素から選択され、
好ましくは、前記着色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびフルオレセイナーゼから選択され、好ましくは、前記の増強された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）である、
請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項5】
前記発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、ＲＮＡベクター、または、線状もしくは円形のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子から選択され、好ましくは、前記プラスミドは、ｐＣＩ、ｐｕｃ５７、ｐｃＤＮＡ３、ｐＳＧ５、ｐＪ６０３およびｐＣＭＶから選択され、
好ましくは、前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、ネガティブストランドＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルスおよびセンダイウイルス）、ポジティブストランドＲＮＡウイルス、例えば、小分子ＲＮＡウイルスおよびアルファウイルス、および二本鎖ＤＮＡウイルスから選択され、前記二本鎖ＤＮＡウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、牛痘ウイルス、鶏痘ウイルス、およびカナリアポックスウイルス）、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、バキュロウイルス、および肝炎ウイルスを含み、
好ましくは、前記レトロウイルスは、鳥類白血球産生組織過形成肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ集合、レンチウイルスおよびフォーミーウイルスから選択され、
好ましくは、前記レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびヒツジ脱髄性白質脳炎レンチウイルスから選択される、
請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項6】
アデノ随伴ウイルスであり、好ましくは、前記アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、鳥ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶから選択され、
好ましくは、前記発現ベクターは、短縮されたキメライントロンおよびＫｏｚａｋ開始配列をさらに含み、
好ましくは、前記短縮されたキメライントロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示され、
好ましくは、前記Ｋｏｚａｋ開始配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７に示される、
請求項３～５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項7】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載の発現カセットおよび／または請求項３～６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項8】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載の発現カセット、請求項３～６のいずれか１項に記載の発現ベクターおよび／または請求項７に記載のウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む、ＢＣＤの治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が野生型またはコドンが最適化されたＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する、
医薬組成物。
【請求項9】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を治療するものの調製における、請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載の発現カセット、請求項３～６のいずれか１項に記載の発現ベクター、請求項７に記載のウイルス粒子、および／または、請求項８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項10】
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを設計するステップ（１）、ステップ（１）で得られた前記ｓｇＲＮＡをＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターに構築し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを得るステップ（２）、おようび、
ステップ（２）で得られた前記Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを細胞に導入し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞を得るステップ（３）、
を含むＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤ細胞モデルを構築する方法であって、
好ましくは、前記方法は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞をスクリーニングするステップ（４）をさらに含み、
好ましくは、前記方法は、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異細胞を同定するステップ（５）をさらに含み、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １８～２１のうちの１種または複数種から選択され、
好ましくは、前記同定は、細胞増殖の同定、オートファジー変化の同定、および脂肪粒子沈着の同定から選択される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、遺伝子治療の分野に属し、具体的に、ビエッティ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を標的とする遺伝子治療に用いられるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子発現の最適化に関する。
【背景技術】
【0002】
ビエッティ結晶性ジストロフィー（Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＢＣＤ、ヒトメンデル遺伝病ＯＭＩＭ２１０３７０）は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の両対立遺伝子変異によって引き起こされる稀な遺伝的常染色体劣性疾患である。本疾患は、１９３７年にイタリアの医師Ｇ．Ｂ．ビエッティによって初めて報告された。この疾患は、網膜の後極に多数の小さな光沢のある黄白色の結晶体様沈着物が存在すること、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＲＰＥ）の萎縮、色素凝固および脈絡膜硬化によって特徴づけられる。この疾患の進行は、最終的に視力低下、夜盲症、視野欠損、色覚障害を引き起こす。この疾患の発症は思春期から３０歳までに起こるが、３０歳以降に起こることもある。病気の進行に伴い、周辺視力、中枢視力、またはその両方が低下し、最終的にはほとんどの患者は、法的な失明に至る（Ｇａｒｃｉａ－Ｇａｒｃｉａ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｒｕｂｉｏ ｅｔ ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｃｌｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １３： １３７９－１３９９．）。
【0003】
ＢＣＤは、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異により引き起こされるものである。この遺伝子は、ヒト第４染色体の長腕に位置し、シトクロムＰ４５０（ファミリー４、サブファミリーＩＶ、ポリペプチド２）の重要なメンバーで、脂肪酸代謝に関与する５２５アミノ酸を有するタンパク質をコードする（Ｌｉ，Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）．“Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｏｒｎｅｏｒｅｔｉｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ＣＹＰ４Ｖ２．”Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７４（５）：８１７－８２６）。ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、網膜と角膜の上皮細胞に存在し、該酵素は、小胞体に局在している。この酵素は、中鎖飽和脂肪酸に対する典型的なＣＹＰ４のω－ヒドロキシラーゼ活性を持つ。ＣＹＰ４Ｖ２は、網膜細胞に有意なレベルで存在する唯一のＣＹＰ４であり、網膜細胞における多価不飽和脂肪酸代謝に重要な役割を果たしている可能性がある。ＣＹＰ４Ｖ２の触媒機能欠損につながる変異は、眼脂質の分解を阻害し、その結果、ＢＣＤ患者の眼に蓄積物が形成される（Ｈａｔａ，Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）．“Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｃｕｅｓ Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１５（１５）： ３９３６－３９４１；Ｚｈａｎｇ，Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）．“ＰＳＣｓ Ｒｅｖｅａｌ ＰＵＦＡ－Ｐｒｏｖｏｋｅｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｓ ａ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｏｄｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ＲＰＥ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２８（１２）：２６４２－２６６１）。一部の患者では、全身性の脂質封入体も見られる（Ｌａｉ，Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｕｎａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ＣＹＰ４Ｖ２ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．”Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５１（２）：１０９２－１０９７）。
【0004】
ＢＣＤは、６７，０００人につき１人が発症すると推定されている。これは、東アジア系、特に中国や日本系の人々によく見られる。中国には２１，０００人、米国には約５，０００人の患者がいると推定されている。ＢＣＤの症状は、網膜を徐々に損傷する他の眼疾患の症状と類似しているため、過小診断されている可能性がある。現在、ＢＣＤに用いられる有効な治療法はない（Ｎｇ，Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）．“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂｉｅｔｔｉ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ａｓｉａ Ｐａｃ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ （Ｐｈｉｌａ） ５（４）：２４５－２５２；Ｗａｎｇ，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２１）．“Ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ＣＹＰ４Ｖ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｏｒｎｅｏｒｅｔｉｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｇｅｎｅ ７９０：１４５６９８．）。
【0005】
ＢＣＤに対する遺伝子治療戦略は、現在開発中である。高脂肪食（ＨＦＤ）誘発ＢＣＤマウスモデルにおいて、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって運ばれたヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子は、網膜下注射によってＲＰＥ層で発現され、いくつかの生理的および機能的欠損が効果的に回復され、ＢＣＤ疾患に対する遺伝子治療の有効性が概念的に実証された（Ｑｕ， Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０２０）．“Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ－ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２７（７－８）：３７０－３８２）。
【0006】
ＡＡＶ媒介ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療は、現在、いくつかの製薬会社で研究開発の初期段階にある。現在までのところ、有効な治療効果を達するよう生体内でＣＹＰ４Ｖ２を十分かつ持続的に発現させることが可能であることを証明した報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本開示は、先行技術の問題点を解決するために、眼の網膜のＲＰＥ層においてヒトＣＹＰ４Ｖ２を効率的、持続的かつ安定的に発現させ、かつＢＣＤの治療に用いるための、遺伝子発現を最適化したウイルスベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一態様において、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有し、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％または９９％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0009】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるものである。
【0010】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されるものである。
【0011】
もう一つの態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。
【0012】
もう一つの態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現カセットを含む前記態様のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0013】
本開示のいくつかの実施形態において、前記のＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記発現制御エレメントに作動可能に連結される。
【0014】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現制御エレメントは、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｐｏｌｙ Ａシグナル、ＩＴＲ、絶縁体、ＲＮＡプロセシングシグナル、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の安定性を増強するエレメントから選択される１種または複数である。
【0015】
もう一つの態様において、本開示は、前記発現ベクターを含む細胞を提供する。
【0016】
もう一つの態様において、本開示は、前記発現ベクターを含むウイルス粒子を提供する。
【0017】
もう一つの態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、前記発現ベクターおよび／または前記ウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む、ＢＣＤの治療のための、野生型またはコドン最適化されたＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する医薬組成物を提供する。
【0018】
もう一つの態様において、本開示は、ビエッティ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を治療するものの調製における、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、前記発現ベクター、前記ウイルス粒子、および／または前記医薬組成物の使用を提供する。
【0019】
もう一つの態様において、本開示は、有効量の前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、前記発現ベクター、前記ウイルス粒子、および／または前記医薬組成物を被験者に投与することを含むビエッティ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を治療する方法を提供する。
【0020】
もう一つの態様において、本開示は、
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを設計するステップ（１）、
ステップ（１）で得られた前記ｓｇＲＮＡをＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターに構築し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを得るステップ（２）、及び、
ステップ（２）で得られたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを細胞に導入し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞を得るステップ（３）、
を含む、ＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤ細胞モデルを構築する方法を提供する。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを設計するステップ（１）、
ステップ（１）で得られた前記ｓｇＲＮＡをＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターに構築し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを得るステップ（２）、及び、
ステップ（２）で得られたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを細胞に導入し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞を得るステップ（３）、
を含む、ＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤ細胞モデルを構築する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターＣＹＰ４Ｖ２発現カセットの構造模式図である。
【図2】プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるコドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を示す。ここで、（Ａ）は、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のウェスタンブロットの代表的な画像であり、（Ｂ）は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２およびＧＦＰ（プラスミドトランスフェクション対照）の発現レベルを検出するためのＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のウェスタンブロットによる定量である。ここで、ＷＴまたはｏｐｔ遺伝子およびＧＦＰは、ＣＡＧ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＷＴ／ｏｐｔおよびＣＭＶ－ＥＧＦＰ二重プラスミドを用いて発現させた。プラスミドを等量トランスフェクションしてから２日後に細胞溶解液を採取した。等量の総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、免疫ブロットを行った。ＣＹＰ４Ｖ２の発現レベルをＧＦＰで標準化し、ＷＴ発現レベルに対する比を算出した。
【図3】ＡＡＶ２をトランスフェクトしたＡＲＰＥ－１９細胞におけるコドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を示す。ここで、（Ａ）は、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のウェスタンブロットの代表的な画像であり、（Ｂ）は、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２およびＧＡＰＤＨ（内部コントロール）の発現レベルを検出するためのＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のウェスタンブロットによる定量であり、ここで、ＷＴまたはｏｐｔ遺伝子またはＥＧＦＰコントロールは、等量のＡＡＶ２ウイルス粒子（ＭＯＩ＝２０，０００）によって媒介された。ウイルス粒子感染の２日後に細胞溶解液を採取した。等量の全タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、免疫ブロットを行った。ＣＹＰ４Ｖ２の発現レベルをＧＡＰＤＨで標準化し、ＷＴ発現レベルとの比を算出した（ＷＴ発現レベルとの比較：＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；ｎ＝３，ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ）。
【図4】ＢＣＤ細胞モデルにおけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を示す。ＨＥＫ２９３ ＣＹＰ４Ｖ２変異細胞モデルの構築と表現型の同定を示す。ＣＹＰ４Ｖ２変異ＨＥＫ２９３細胞は欠陥のある細胞表現型を表す。ここで、（Ａ）は、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９法を用いて作製したＣＹＰ４Ｖ２エクソン５変異の模式図である。（Ｂ）は、ＨＥＫ２９３エクソン５変異細胞クローン１４（５－Ｃ１４）におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子標的部位のＳａｎｇｅｒシークエンシング結果である。（Ｃ）は、ＨＥＫ２９３ ＷＴおよび変異５－Ｃ１４細胞の６日間培養の細胞増殖率を評価した（ＷＴとの比較：＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００５；ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ；ｎ＝４）。（Ｄ－Ｅ）は、バフィロマイシンＡ１（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ－Ａ１）（Ｂａｆ、１００ｎＭ、２時間）の添加または無添加で処理したＨＥＫ２９３ ＷＴ細胞および変異細胞におけるオートファジーマーカーＬＣ３Ｂ－Ｉ／ＩＩの評価である。（Ｄ）は、タンパク質ブロットの代表的な画像である。（Ｅ）は、ＬＣ３Ｂ－ＩＩタンパク質レベルの定量化である。ＧＡＰＤＨで標準化し、Ｂａｆ（ＮＴ）を添加しないＷＴ細胞の場合との比として計算した（＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ：有意差なし；ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ；ｎ＝３）。
【図5】ＢＣＤ細胞モデルにおけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を示す。ＣＹＰ４Ｖ２変異ＡＲＰＥ－１９細胞モデルの構築、表現型の同定、およびＡＲＰＥ－１９変異細胞モデルの表現型に対するＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよび最適化遺伝子ｏｐｔ１８の影響を示す。ＣＹＰ４Ｖ２エクソン５変異はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いて作製した。ここで、（Ａ）は、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子標的部位のＳａｎｇｅｒシークエンシングである。（Ｂ）は、ＷＴおよび変異５－Ｃ１３細胞の６日間の培養期間の細胞増殖率を評価した。＊＊＊，Ｐ＜０．０１；ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ；ｎ ＝６。（Ｃ）は、細胞脂質の沈着である。ＷＴ、変異５－Ｃ１３細胞、ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはｏｐｔ１８を５－Ｃ１３細胞にＭＯＩ ２００００で感染させた。アラキドン酸（ＡＡ）処理後、細胞を脂質とＤＡＰＩで染色した。レーザー共焦点顕微鏡の代表画像である。スケールバー：２５μｍ。（Ｄ）は、細胞内脂肪粒子沈着の定量化である。変異細胞にＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ ＷＴおよびｏｐｔ１８を感染した後、脂肪粒子沈着は有意に減少した。ｏｐｔ１８は、脂肪粒子沈着減少効果がＷＴよりも優れていた（＊＊＊，ｐ＜０．００５；＊＊＊＊，ｐ＜０．００１；ｎ＝５０，ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ）。（Ｅ）ＷＴおよび変異細胞５－Ｃ１３の電子顕微鏡写真であり、オートファジー液胞（黒矢印）と空胞（白矢印）を示す。スケールバー：５００ｎｍ。
【図6】ＢＣＤ細胞モデルにおけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を示す。ＨＥＫ２９３ ＣＹＰ４Ｖ２ 変異細胞モデルの表現型に対するＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよび最適化遺伝子の影響を示す。（Ａ）ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはｏｐｔ１８またはＥＧＦＰコントロールＭＯＩ ２００００で細胞を感染させた２日後に、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質発現レベルをウェスタンブロットで検出した。（Ｂ）感染した後、細胞増殖率を６日間の時間経過で評価した。（Ｃ）６日目にＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ１８またはＥＧＦＰコントロールをＭＯＩ ５０００または２００００で感染されたＨＥＫ２９３変異細胞における細胞増殖である。（Ｄ）６日目に、野生型ＨＥＫ２９３細胞と、ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ１８およびＥＧＦＰコントロールをＭＯＩ ２００００で感染したＨＥＫ２９３変異細胞における細胞増殖の比較（＊，ｐ＜０．０５；＊＊＊＊，ｐ＜０．００１；ｎ＝６，ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ）。（Ｅ－Ｆ）ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴ ｏｐｔ１８およびＥＧＦＰコントロールをＭＯＩ ２００００で感染したＨＥＫ２９３変異細胞において、Ｂａｆの添加または無添加で処理した条件でのオートファジーマーカーＬＣ３Ｂ－Ｉ／ＩＩを評価した。（Ｅ）タンパク質ブロットの代表的な画像である。（Ｆ）ＬＣ３Ｂ－ＩＩタンパク質レベルの定量化である。ＧＡＰＤＨで標準化し、ＥＧＦＰ ＮＴケースの比率として計算した（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；ｎｓ：有意差なし；ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ；ｎ＝３）。
【図7】コドン最適化ＡＡＶ－ＣＹＰ４Ｖ２の、網膜下注射によるマウスの眼におけるｉｎ ｖｉｖｏ発現を示す。（Ａ）マウス眼におけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２野生型および最適化遺伝子の発現である。野生型マウスの眼球に、５×１０１２ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはｏｐｔ組換えウイルス粒子１μＬを網膜下腔から注入した。４週間後、眼球組織を摘出し、網膜を分離し、ホモジナイズして溶解した。等量の総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、免疫ブロットを行った。（Ａ）：ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のウェスタンブロットの代表的な画像である。（Ｂ）：ＣＹＰ４Ｖ２およびＧＡＰＤＨ（内部コントロール）の発現量を検出するためのウェスタンブロットによるＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の定量であり、ＣＹＰ４Ｖ２の発現レベルをＧＡＰＤＨで標準化し、ＷＴ発現レベルとの比を算出した（ＷＴ発現レベルとの比較：＊，ｐ＜０．０５；ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ；ｎ＝６～９）。Ｓｔｄ：精製された組換えヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質標準サンプル。ＮＣ：未注射マウス眼陰性コントロール。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本開示において、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、特に断りのない限り、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるタンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語および実験手順は、それぞれの分野で広く使用されている用語および通常の手順である。また、本開示をよりよく理解するために、関連用語の定義および説明を以下提供する。
【0023】
本明細書で使用される、「約」ある値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体の実施形態を含む（説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【0024】
本明細書で使用される、特に断りのない限り、単数形の冠詞「一種」、「一個」および「前記」は、複数の指示対象を含む。
【0025】
本明細書で使用される「ベクター」とは、宿主細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）に導入される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
【0026】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、ポリマー形態の任意の長さのヌクレオチドを指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、多本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然もしくは誘導体のヌクレオチド塩基からなるポリマーが含まれるが、これらに限定されない。核酸の骨格は、糖およびリン酸基（通常ＲＮＡまたはＤＮＡに見出される）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含んでいてもよい。代替的に、核酸の骨格は、アミノリン酸のポリマーなどの合成サブユニットを含んでいてもよく、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドアミノホスフェート（Ｐ－ＮＨ２）または混合したアミノホスフェート－ホスホジエステルオリゴマーであってもよい。さらに、二本鎖核酸は、化学的に合成された（適切な条件下で相補鎖を合成し、その鎖をアニーリングすることによって、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマーを用いて相補鎖を一から合成することによって）一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。
【0027】
「組換えウイルスベクター」とは、１種または複数種の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを意味する。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸には少なくとも１つ、好ましくは２つの逆末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接されている。
【0028】
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」とは、一つ以上の異種配列（すなわち、非ＡＡＶ起源の核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターであって、それに少なくとも一つ、好ましくは二つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接されているものを指す。適切なヘルパーウイルスに感染し（または適切なヘルパー機能を発現し）、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞内に存在する場合、当該ｒＡＡＶベクターは複製され、感染ウイルス粒子にパッケージ化され得る。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体中、またはクローニングやトランスフェクションのためのプラスミドなどの別のベクター中）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは「プロベクター（ｐｒｏ－ｖｅｃｔｏｒ）」と呼ばれ、ＡＡＶパッケージング機能および適切なヘルパー機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」することができる。ｒＡＡＶベクターは様々な形態のいずれであってもよく、これにはプラスミド、線状人工染色体が含まれるが、これらに限定されない；それらはリポソームと複合体化されていてもよく、リポソーム内に封入されていてもよく、実施形態においては、ウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子内に封入されていてもよい。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。ＡＡＶヘルパー機能（すなわち、ＡＡＶが宿主細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にする機能）は、ＡＡＶの複製およびパッケージングを補助するヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含むがこれらに限定されない、様々な形態のいずれかで提供され得る。他のＡＡＶヘルパー機能は当該技術分野で知られている。
【0029】
「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質とカプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムからなるウイルス粒子を意味する。
【0030】
「異種」とは、それが比較されるか、またはそれが導入もしくは組み込まれる実体の残りの部分とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学的手法によって異なる細胞型に導入された核酸は、異種核酸である（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれた細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部）は、ベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。
【0031】
ウイルスタイターに関して使用される場合、「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」または「ゲノムコピー」という用語は、感染性または機能性にかかわらず、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含むウイルス粒子の数を指す。特定のベクター調製中のゲノム粒子の数は、本明細書または例えばＣｌａｒｋら（１９９９） Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２－２７８に記載されている方法によって測定することができる。
【0032】
ウイルスタイターに関して使用される場合、「感染単位（ｉｕ）」、「感染粒子」または「複製単位」という用語は、例えばＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３－１９７３に記載されているように、感染中心アッセイ（複製中心アッセイとも呼ばれる）によって測定される、感染および複製する能力を有する組換えＡＡＶベクターの粒子の数を指す。
【0033】
ウイルスタイターに関して使用される場合、「トランスダクション単位（ｔｕ）」という用語は、本明細書の実施形態または例えばＸｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３－１２４；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されているように、機能的アッセイにおいて測定されるように、機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
【0034】
「逆方向末端反復」配列または「ＩＴＲ」配列は、当技術分野で周知の用語であり、ウイルスゲノムの末端に見られる反対方向の比較的短い配列を指す。
【0035】
「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在する約１４５ヌクレオチドの配列で、当技術分野で周知の用語である。ＩＴＲの最外部の１２５ヌクレオチドは、二つの交換可能な方向のいずれかで存在することができ、その結果、異なるＡＡＶゲノム間および単一ＡＡＶゲノムの両端の間の異種性が生じる。最外部の１２５ヌクレオチドは、自己相補的ないくつかの短いドメイン（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄドメインと呼ばれる）をさらに含み、このＩＴＲ部分内で鎖間塩基対合が起こることが可能である。
【0036】
ＡＡＶに対する「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（欠陥のあるマイクロウイルスである）が宿主細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、および牛痘ウイルスなどのポックスウイルスを含む、様々なヘルパーウイルスが同定されている。アデノウイルスには複数の異なるサブクラスを包含するが、サブクラスＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類、鳥類由来の様々なアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能なヘルペスウイルスのファミリーとしては、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ，ＨＳＶ）、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓｅｓ，ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＣＭＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ，ＰＲＶ）などを含む。
【0037】
参照されるペプチドまたは核酸配列に対する「配列同一性パーセンテージ（％）」とは、配列のアラインメントおよびギャップ導入（必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するために、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない）後の、参照ペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列または核酸配列の同一性のパーセンテージを決定するためのアラインメントは、当技術分野において様々な方法で達成することができ、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７），Ｓｕｐｐ．３０，セクション７．７．１８，表７．７．１に記載されているＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含む、通常入手可能なコンピューターソフトウェアプログラムを使用することにより達成することができる。好ましいアラインメントソフトウェアは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書において、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、％アミノ酸配列同一性（これは、代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂと、または所与のアミノ酸配列Ｂに対して、ある一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、アミノ酸配列Ａと称され得る）は、以下のように計算される：１００に分数Ｘ／Ｙを乗じたものであり、ここで、Ｘは、ＡとＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムによって一致とスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性とは等しくないことを理解される。本明細書において、所与の核酸配列Ｃの、所与の核酸配列Ｄとの、または所与の核酸配列Ｄに対する、％核酸配列同一性（これは、代替的に、所与の核酸配列Ｄと、または所与の核酸配列Ｄに対して、ある一定の％核酸配列同一性を有する、または含む、所与の核酸配列Ｃと称され得る）は、以下のように計算される：１００に分数Ｗ／Ｚを乗じたものであり、ここで、Ｗは、ＣとＤのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムによって一致とスコアされたヌクレオチドの数であり、ＺはＤ中のヌクレオチドの総数である。ここで、核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない、Ｃ対Ｄの％核酸配列同一性は、Ｄ対Ｃの％核酸配列同一性とは等しくないことを理解される。
【0038】
「有効量」とは、臨床結果（例えば、症状の改善、臨床エンドポイントの達成など）を含む有益な結果または所望の結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回に分けて投与することができる。疾患状態に関して、有効量は、疾患の進行を改善、安定化または遅延させるのに十分な量である。例えば、有効量のｒＡＡＶ粒子は、治療用ペプチドまたは治療用核酸などの異種核酸の予想量を発現する。
【0039】
「個体」または「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜化動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または被験者はヒトである。
【0040】
本明細書で使用される場合、「治療」とは、有益または所望の臨床結果を得るために使用される方式である。本開示の目的のために、有益なまたは期待される臨床結果には、症状の改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、悪化しない）、疾患の広がり（例えば、転移）の防止、疾患の進行の遅延または減速、疾患の状態の改善または緩和、および寛解（部分的であるか全体的であるかを問わない）（検出可能であるか検出不可能であるかを問わない）が含まれるが、これらに限定されない。また、「治療」とは、治療を行わない場合に予想される生存率と比較して生存率が延長することを意味する場合もある。
【0041】
一態様において、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0042】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるものである。
【0043】
別の態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。
【0044】
別の態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現カセットを含む発現ベクターを提供する。
【0045】
本開示のいくつかの実施形態において、前記のＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記発現制御エレメントに作動可能に連結される。
【0046】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現制御エレメントは、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｐｏｌｙ Ａシグナル、ＩＴＲ、絶縁体、ＲＮＡプロセシングシグナル、およびｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の安定性を増強するエレメントから選択される１種または複数種である。
【0047】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、複製起点を含み；好ましくは、前記複製起点配列は、ｆ１ファージｏｒｉ、ＲＫ２ｏｒｉＶ、ｐＵＣ ｏｒｉ、およびｐＳＣ１０１ｏｒｉから選択される。
【0048】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、５’ＩＴＲをさらに含み；好ましくは、前記５’ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるものである。
【0049】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、３’ＩＴＲをさらに含み、好ましくは、前記３’ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示されるものである。
【0050】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、エンハンサーをさらに含み、好ましくは、前記エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーであり、より好ましくは、前記エンハンサーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるものである。
【0051】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、プロモーターをさらに含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記プロモーターは、特異的または非特異的プロモーターである。本開示のいくつかの実施形態において、前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、およびＴＲＥ３ＧＳプロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーターであり、好ましくは、前記ＣＢＡプロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されるものである。本開示のいくつかの実施形態において、前記プロモーターは、誘導可能プロモーターであり、好ましくは、前記誘導可能システムは、テトラサイクリン調節プロモーター、アルコール調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、病原性調節プロモーター、温度／熱誘導型プロモーター、光調節プロモーター、ＩＰＴＧ誘導型システムのうちの１種以上を含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記テトラサイクリン調節プロモーターは、Ｔｅｔ ｏｎプロモーター、Ｔｅｔ ｏｆｆプロモーター、およびＴｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒプロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記アルコール調節プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータータンパク質（ＡｌｃＲ）に応答するプロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記ステロイド調節プロモーターは、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター、ヒトエストロゲン受容体プロモーター、蛾エクジステロイド受容体プロモーター、レチノイドプロモーター、および甲状腺受容体スーパーファミリープロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記金属調節プロモーターは、酵母、マウスおよびヒトのメタロチオネインプロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記病原性調節プロモーターは、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、およびベンゾチアジアゾール制御（ＢＴＨ）プロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記温度／熱誘導型プロモーターは、ＨＳＰ－７０プロモーター、ＨＳＰ－９０プロモーター、および大豆熱ショックプロモーターから選択される。本開示のいくつかの実施形態において、前記光調節プロモーターは、植物細胞の光応答型プロモーターである。
【0052】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、エクソンおよびイントロンをさらに含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記エクソンおよびイントロンは、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロンである。本開示のいくつかの実施形態において、前記エクソンおよびイントロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド列を含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるものである。
【0053】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、ｐｏｌｙ Ａシグナルをさらに含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記ｐｏｌｙ Ａシグナルは、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙ Ａ（ＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ）、ショートｐｏｌｙ Ａ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ、および／またはヒトβビーズタンパク質ｐｏｌｙ Ａである。本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリＡシグナルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド列を含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示されるものである。
【0054】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６、に示されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列含み、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、９８％または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６に示されるものである。
【0055】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ベクターは、転写後調節エレメントを含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
【0056】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ベクターは、マーカーをコードする遺伝子をさらに含む。本開示のいくつかの実施形態において、前記マーカーは、抗生物質耐性タンパク質、毒素耐性タンパク質、着色または蛍光または発光タンパク質、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質から選択される１種または複数種である。
【0057】
本開示のいくつかの実施形態において、前記抗生物質は、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、およびプラスチジンから選択される。
【0058】
本開示のいくつかの実施形態において、前記毒素は、炭疽毒素およびジフテリア毒素から選択される。
【0059】
本開示のいくつかの実施形態において、前記着色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、およびルシフェラーゼからなる群より選択される。本開示のいくつかの実施形態において、増強された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介する前記タンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）である。
【0060】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、ＲＮＡベクター、または線状もしくは円形のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子から選択される。
【0061】
本開示のいくつかの実施形態において、前記プラスミドは、ｐＣＩ、ｐｕｃ５７、ｐｃＤＮＡ３、ｐＳＧ５、ｐＪ６０３、およびｐＣＭＶから選択される。
【0062】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、ネガティブストランドＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルスおよびセンダイウイルス）、ポジティブストランドＲＮＡウイルス、例えば、小分子ＲＮＡウイルスおよびアルファウイルス、および二本鎖ＤＮＡウイルスから選択され、前記二本鎖ＤＮＡウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、牛痘ウイルス、鶏痘ウイルス、およびカナリアポックスウイルス）、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、バキュロウイルス、および肝炎ウイルスを含む。
【0063】
本開示のいくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、鳥類白血球産生組織過形成肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ集合、レンチウイルス、およびフォーミーウイルスから選択される。
【0064】
本開示のいくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、およびヒツジ脱髄性白質脳炎レンチウイルスから選択される。
【0065】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、アデノ関連ウイルスである。
【0066】
本開示のいくつかの実施形態において、前記アデノ関連ウイルスは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、鳥ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶから選択される。
【0067】
本開示のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、短縮されたキメライントロンおよびＫｏｚａｋ開始配列をさらに含む。
【0068】
本開示のいくつかの実施形態において、前記短縮されたキメライントロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示される。
【0069】
本開示のいくつかの実施形態において、前記Ｋｏｚａｋ開始配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７に示される。
【0070】
別の態様において、本開示は、前記発現ベクターを含むウイルス粒子を提供する。
【0071】
別の態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、前記発現ベクターおよび／または前記ウイルス粒子のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む、ＢＣＤの治療のための、野生型またはコドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する医薬組成物を提供する。
【0072】
別の態様において、本開示は、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を治療するためのものの調製における、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、前記発現ベクター、前記ウイルス粒子、および／または前記医薬組成物の使用を提供する。
【0073】
別の態様において、本開示は、有効量の前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、前記発現ベクター、前記ウイルス粒子、および／または前記医薬組成物を被験者に投与することを含むＢｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を治療する方法を提供する。
【0074】
別の態様において、本開示は、
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを設計するステップ（１）、
ステップ（１）で得られた前記ｓｇＲＮＡをＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターに構築し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを得るステップ（２）、及び
前記ステップ（２）で得られたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを細胞に導入し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞を得るステップ（３）、
を含む、ＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤ細胞モデルを構築する方法を提供する。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを設計するステップ（１）、
ステップ（１）で得られた前記ｓｇＲＮＡをＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターに構築し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを得るステップ（２）、及び
前記ステップ（２）で得られたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを細胞に導入し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞を得るステップ（３）、
を含む、ＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤ細胞モデルを構築する方法を提供する。
【0075】
本開示のいくつかの実施形態において、前記方法は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異を有する細胞をスクリーニングするステップ（４）をさらに含む。
【0076】
本開示のいくつかの実施形態において、前記方法は、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異細胞を同定するステップ（５）をさらに含む。
【0077】
本開示のいくつかの実施形態において、前記同定は、細胞増殖の同定、オートファジー変化の同定、および脂肪粒子沈着の同定から選択される。
【0078】
本開示のいくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １８－２１から選択される１種または複数種である。
【0079】
本開示は、眼の網膜色素上皮において効率的で持続的かつ安定的な発現を実現するための、コドンが最適化されたＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を発現するアデノ関連ウイルスベクターを提供する。本開示は、ＢＣＤを治療するために使用される遺伝子治療薬の用量および起こり得る副作用を効果的に低減し、治療効果を高めることができる。
【0080】
明確かつ簡潔な説明のために、本明細書では、特徴を、同一または別個のいくつかの実施形態の一部として記載するが、本開示の範囲は、記載された特徴の全てまたは一部の組み合わせを有するいくつかの実施形態を包含し得ることが理解されるであろう。
【0081】
以下、特定の実施例を参照して本開示をより詳細に説明するが、実施例は説明のためのものであり、本開示に関して限定するものではない。
【0082】
実験材料と方法
ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットおよびＡＡＶベクター
本研究で使用されたＤＮＡ配列は、すべてＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成した。コドンの最適化は、ＧｅｎＳｍａｒｔ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｏｌを用いて改善された。ＡＡＶベクター媒介ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、図１に示されている。この発現カセット配列をシャトルプラスミドベクターにクローニングし、ＡＡＶベクターにより媒介されるＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子の発現を含むシャトルプラスミドを得た。
ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットおよびＡＡＶベクター
本研究で使用されたＤＮＡ配列は、すべてＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成した。コドンの最適化は、ＧｅｎＳｍａｒｔ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｏｌを用いて改善された。ＡＡＶベクター媒介ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、図１に示されている。この発現カセット配列をシャトルプラスミドベクターにクローニングし、ＡＡＶベクターにより媒介されるＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子の発現を含むシャトルプラスミドを得た。
【0083】
ＡＡＶベクターの生産および精製方法
ＡＡＶベクターは、３プラスミドシステムを採用して生産され、すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子を含むシャトルプラスミド、ＡＡＶベクターのｒｅｐｃａｐ遺伝子を含むｐＲｅｐＣａｐプラスミド、および補助プラスミドｐＨｅｌｐｅｒを用い、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、組換えによりＡＡＶウイルスベクターをパッケージングした。トランスフェクション後４８～７２時間で収穫し、収穫液を精製してある純度の組換えＡＡＶウイルスベクターを得た。精製方法は以下の通りである。
ＡＡＶベクターは、３プラスミドシステムを採用して生産され、すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子を含むシャトルプラスミド、ＡＡＶベクターのｒｅｐｃａｐ遺伝子を含むｐＲｅｐＣａｐプラスミド、および補助プラスミドｐＨｅｌｐｅｒを用い、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、組換えによりＡＡＶウイルスベクターをパッケージングした。トランスフェクション後４８～７２時間で収穫し、収穫液を精製してある純度の組換えＡＡＶウイルスベクターを得た。精製方法は以下の通りである。
【0084】
まず、収穫液を予備処理する。ＨＥＫ２９３細胞を完全に溶解して細胞内のＡＡＶウイルスベクターを遊離させ、ヌクレアーゼを加えて遊離核酸を消化する。消化が終了した後、深層ろ過を行って大分子不純物や細胞破片を除去し、深層ろ過後の濾液を二次ろ過してアフィニティークロマトグラフィーサンプリング用の清澄液を得る。
【0085】
アフィニティークロマトグラフィーは、リガンドとタンパク質の特異的吸着を利用して、収穫液におけるＡＡＶウイルスベクターを捕捉し、プロセス関連の不純物の大部分を除去して濃縮と不純物の除去効果を達成する。収集された溶出液を均一に混合し、中和バッファーで中和した後、陰イオンクロマトグラフィー用サンプルとして無菌リザーバーボトルに保存する。
【0086】
陰イオンクロマトグラフィーは、異なる成分の等電点の違いを利用して中実ＡＡＶウイルスと空殻ＡＡＶウイルスを分離し、同時に引き続き残留不純物を除去しながら、溶出液を新しい滅菌リザーバーボトルに回収し、さらに限外濾過で緩衝液を製剤的に安定な緩衝液に置き換えながら、ウイルス力価を約５×１０１２ｖｇ／ｍＬまで濃縮し、最後に滅菌濾過し、分注して置く。
【0087】
ＡＡＶベクターリザーバーの力価の定量化
ＡＡＶウイルスの精製が完了した後、ウイルス含量を測定する必要があり、ゲノム力価はＡＡＶの物理的力価を特徴付ける最も古典的な基準となっている。ｒＡＡＶのゲノム配列を標的としたプライマープローブを設計し、次いでＱ－ＰＣＲを行う方法は、ゲノム力価を測定するための最も一般的な方法である。
ＡＡＶウイルスの精製が完了した後、ウイルス含量を測定する必要があり、ゲノム力価はＡＡＶの物理的力価を特徴付ける最も古典的な基準となっている。ｒＡＡＶのゲノム配列を標的としたプライマープローブを設計し、次いでＱ－ＰＣＲを行う方法は、ゲノム力価を測定するための最も一般的な方法である。
【0088】
本開示におけるＯＲＦコードフレームのコドン最適化には複数のベクター構造のスクリーニングが含まれることを考慮して、異なるベクター構造間の定量の安定性と精度を確保するために、ベクターに共通する配列を選択してプライマープローブを設計する。ＣＭＶエンハンサー配列はＣＡＧプロモーターの一部であり、コドン最適化の過程では、この部分は、異なるベクター構造の共通部分となるため、この配列に対してプライマープローブを設計する。
【0089】
ゲノムの力価を検出する過程では、まず標準曲線を確立する必要があり、陽性標準プラスミドをサンプル希釈液で２×１０７、２×１０６、２×１０５、２×１０４、２×１０３、２×１０２コピー／μＬに希釈し、標準曲線のテンプレートとし、標準曲線は、直線性と増幅効率をコントロールする必要があり、一般的にＲ２＞０．９９と増幅効率が９０％～１１０％の間であることが要求される。その後、予備処理されたｒＡＡＶサンプルを希釈した後、ＱＰＣＲ検出を行い、サンプルの検出Ｃｔ値が標準曲線の範囲内にあることを確保し、サンプルのＣｔ値を標準曲線に代入してｒＡＡＶサンプルのゲノム力価を計算し、製品の含有量を標識した。
【0090】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞プラスミドトランスフェクション実験
ＨＥＫ２９３細胞を１日前に消化処理し、６ウェルプレートに７．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種した。一晩培養した後、プラスミドトランスフェクションを行った。プラスミドおよびトランスフェクション試薬を以下の量で混合した：１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，３１９８５－０７０）１２５μＬ、ＣＹＰ４Ｖ２－ｏｐｔ／ＷＴ発現プラスミド２μｇ、ＣＭＶ－ＥＧＦＰプラスミド２００ｎｇ、およびＰ３０００ ５μＬを加え、均一に混合してプラスミドチューブを得、別の１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬとＬｉｐｏ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｌ３００００１５）５μＬを加え、均一に混合した後、プラスミドチューブに加え、室温で１５分間静置インキュベートした。この混合液を６ウェルプレートのＨＥＫ２９３細胞にゆっくりと滴下し、引き続きＣＯ２恒温インキュベーターに入れて４８時間培養した。
ＨＥＫ２９３細胞を１日前に消化処理し、６ウェルプレートに７．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種した。一晩培養した後、プラスミドトランスフェクションを行った。プラスミドおよびトランスフェクション試薬を以下の量で混合した：１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，３１９８５－０７０）１２５μＬ、ＣＹＰ４Ｖ２－ｏｐｔ／ＷＴ発現プラスミド２μｇ、ＣＭＶ－ＥＧＦＰプラスミド２００ｎｇ、およびＰ３０００ ５μＬを加え、均一に混合してプラスミドチューブを得、別の１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬとＬｉｐｏ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｌ３００００１５）５μＬを加え、均一に混合した後、プラスミドチューブに加え、室温で１５分間静置インキュベートした。この混合液を６ウェルプレートのＨＥＫ２９３細胞にゆっくりと滴下し、引き続きＣＯ２恒温インキュベーターに入れて４８時間培養した。
【0091】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ウイルス感染実験
ＡＲＰＥ－１９細胞を１日前に消化処理し、６ウェルプレートに３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種した。２４時間培養した後、ＡＡＶ２ウイルス感染実験を行った。１ウェルの細胞を消化し、計数し、２００００ＭＯＩの感染パラメータに従って必要なウイルスＶｇ数を算出し、必要量のウイルスをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で１ｍＬに希釈した。次いで、一晩接種した６ウェルプレートの細胞培養液を完全に吸引し、希釈したウイルス液を１ ｍＬ加え、引き続きＣＯ２恒温インキュベーターで培養した。４時間後、ＤＭＥＭ完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％二重抗生物質培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＳＶ３００１０））を１ｍＬ添加し、ＣＯ２恒温インキュベーターに入れて４８時間培養した。
ＡＲＰＥ－１９細胞を１日前に消化処理し、６ウェルプレートに３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種した。２４時間培養した後、ＡＡＶ２ウイルス感染実験を行った。１ウェルの細胞を消化し、計数し、２００００ＭＯＩの感染パラメータに従って必要なウイルスＶｇ数を算出し、必要量のウイルスをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で１ｍＬに希釈した。次いで、一晩接種した６ウェルプレートの細胞培養液を完全に吸引し、希釈したウイルス液を１ ｍＬ加え、引き続きＣＯ２恒温インキュベーターで培養した。４時間後、ＤＭＥＭ完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％二重抗生物質培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＳＶ３００１０））を１ｍＬ添加し、ＣＯ２恒温インキュベーターに入れて４８時間培養した。
【0092】
ＣＹＰ４Ｖ２変異を導入したＢＣＤ細胞モデルの構築
ＣＹＰ４Ｖ２変異を導入したＢＣＤ細胞モデルは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法により以下のように構築した：１日前にＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を消化処理し、細胞を６ウェルプレートに７．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種し、２４時間後プラスミドトランスフェクション実験をに行い、プラスミドサンプルの希釈準備として、１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬ、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５８７６６）２μｇ、Ｐ３０００（ＣＹＰ４Ｖ２－ｓｓＤＮＡ ３μｇを補充したＥｘｏｎ７－ｓｇＲＮＡ１－ＨＤＲ修復構築物）５μＬを加え、均一に混合し、Ｌｉｐｏ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｌ３００００１５）の希釈準備として、１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬとＬｉｐｏ ３０００ ５μＬを加え、均一に混合した後、プラスミドサンプル希釈チューブに加え、均一に混合し、室温で１５分間インキュベートした。混合液を６ウェルプレート内のトランスフェクションする細胞にゆっくりと滴下し、軽く振ってよく混ぜた後、ＣＯ２恒温インキュベーターに入れて培養した。トランスフェクション４８時間後、蛍光写真を撮影してトランスフェクション効率を確認した後、６ウェルプレート内の細胞を消化し、５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を含むＤＭＥＭ完全培地を加え、加圧培養し、その間、培地として５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＤＭＥＭ－Ｆuｌｌ培地を毎日交換し、７２時間培養した後、６ウェルプレート内の細胞培養液を廃棄し、ピューロマイシンを含まないＤＭＥＭ培地を加えて培養した。４８時間培養した後、細胞を消化して計数し、９６ウェルプレート（２００μＬ ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％二重抗生物質培地を含む）に細胞を１細胞／ウェルで選別し、培養した。２～３週間培養後、クローン形成スポットの成長を観察し、９６ウェルプレート→２４ウェルプレート→６ウェルプレートと徐々にクローン形成スポットを拡大した。６ウェルプレート内に細胞がいっぱいになった後、一部の細胞を採取して細胞ゲノムＤＮＡ（Ｔｉａｎｇｅｎ，ＤＰ３０４－０３）を抽出し、ＰＣＲで増幅した後、ゲルを切って回収してＳａｎｇｅｒシークエンシングで検証し、ＳｅｑＭａｎソフトウェアを用いてモノクローナル細胞の遺伝子型を分析した。残りの細胞は、実験上の必要性に応じて増殖させ、凍結保存した。
ＣＹＰ４Ｖ２変異を導入したＢＣＤ細胞モデルは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法により以下のように構築した：１日前にＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を消化処理し、細胞を６ウェルプレートに７．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種し、２４時間後プラスミドトランスフェクション実験をに行い、プラスミドサンプルの希釈準備として、１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬ、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５８７６６）２μｇ、Ｐ３０００（ＣＹＰ４Ｖ２－ｓｓＤＮＡ ３μｇを補充したＥｘｏｎ７－ｓｇＲＮＡ１－ＨＤＲ修復構築物）５μＬを加え、均一に混合し、Ｌｉｐｏ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｌ３００００１５）の希釈準備として、１．５ｍＬ遠心チューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬとＬｉｐｏ ３０００ ５μＬを加え、均一に混合した後、プラスミドサンプル希釈チューブに加え、均一に混合し、室温で１５分間インキュベートした。混合液を６ウェルプレート内のトランスフェクションする細胞にゆっくりと滴下し、軽く振ってよく混ぜた後、ＣＯ２恒温インキュベーターに入れて培養した。トランスフェクション４８時間後、蛍光写真を撮影してトランスフェクション効率を確認した後、６ウェルプレート内の細胞を消化し、５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を含むＤＭＥＭ完全培地を加え、加圧培養し、その間、培地として５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＤＭＥＭ－Ｆuｌｌ培地を毎日交換し、７２時間培養した後、６ウェルプレート内の細胞培養液を廃棄し、ピューロマイシンを含まないＤＭＥＭ培地を加えて培養した。４８時間培養した後、細胞を消化して計数し、９６ウェルプレート（２００μＬ ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％二重抗生物質培地を含む）に細胞を１細胞／ウェルで選別し、培養した。２～３週間培養後、クローン形成スポットの成長を観察し、９６ウェルプレート→２４ウェルプレート→６ウェルプレートと徐々にクローン形成スポットを拡大した。６ウェルプレート内に細胞がいっぱいになった後、一部の細胞を採取して細胞ゲノムＤＮＡ（Ｔｉａｎｇｅｎ，ＤＰ３０４－０３）を抽出し、ＰＣＲで増幅した後、ゲルを切って回収してＳａｎｇｅｒシークエンシングで検証し、ＳｅｑＭａｎソフトウェアを用いてモノクローナル細胞の遺伝子型を分析した。残りの細胞は、実験上の必要性に応じて増殖させ、凍結保存した。
【0093】
ウェスタンブロット分析
細胞を接種培養した６ウェルプレートの各ウェルに、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．，Ｐ００１３Ｂ）２００μＬを加え、細胞を氷上で５分間完全に溶解した。１．５ｍＬ遠心チューブに細胞溶解液を集め、氷上に３０分間置いた後、４℃、１５０００ｇで２０分間遠心し、上清を採取した。タンパク質サンプルをＰＢＳで１０倍に希釈し、十分に混合した。タンパク質の定量は、ＢＣＡタンパク質定量キット（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，２３２２５））を用いて行った。５×ＳＤＳロード緩衝液をタンパク質サンプルに加え、十分に混合した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、タンパク質サンプル ３０μｇを分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルク（ＰＢＳ調製）で１時間室温ブロッキングした後、抗体をインキュベートし、ＥＣＬで検出した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによりイメージング分析を実行した。
細胞を接種培養した６ウェルプレートの各ウェルに、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．，Ｐ００１３Ｂ）２００μＬを加え、細胞を氷上で５分間完全に溶解した。１．５ｍＬ遠心チューブに細胞溶解液を集め、氷上に３０分間置いた後、４℃、１５０００ｇで２０分間遠心し、上清を採取した。タンパク質サンプルをＰＢＳで１０倍に希釈し、十分に混合した。タンパク質の定量は、ＢＣＡタンパク質定量キット（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，２３２２５））を用いて行った。５×ＳＤＳロード緩衝液をタンパク質サンプルに加え、十分に混合した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、タンパク質サンプル ３０μｇを分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルク（ＰＢＳ調製）で１時間室温ブロッキングした後、抗体をインキュベートし、ＥＣＬで検出した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによりイメージング分析を実行した。
【0094】
細胞増殖分析
ＣＹＰ４Ｖ２変異細胞と野生型細胞を消化し、カウントした。細胞密度を調整した細胞懸濁液を十分に混合し、９６ウェルプレートに接種し、１細胞あたり４レプリケートウェルを設けた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果アッセイでは、プレート播種から２４時間後にウイルス感染を行った。プレート播種後４８時間からＣＣＫ－８アッセイを行い、アッセイ実施日を、それぞれＤａｙ２、Ｄａｙ３、Ｄａｙ４、Ｄａｙ５、Ｄａｙ６とした。アッセイ当日、分析するウェルの総数を数え、ＣＣＫ－８試薬を含む適量のＤＭＥＭ培地を調製した。ＣＣＫ－８試薬（同仁化学所、ＣＫ０４）とＤＭＥＭ培地を１：１０の割合で調製し、ＣＣＫ－８試薬を含むＤＭＥＭ培地１００μＬを各ウェルに加え、３７℃の細胞培養インキュベーターで１．５時間培養した後、マルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ＳＹＮＥＲＧＹ／ＬＸ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計的に分析した。
ＣＹＰ４Ｖ２変異細胞と野生型細胞を消化し、カウントした。細胞密度を調整した細胞懸濁液を十分に混合し、９６ウェルプレートに接種し、１細胞あたり４レプリケートウェルを設けた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果アッセイでは、プレート播種から２４時間後にウイルス感染を行った。プレート播種後４８時間からＣＣＫ－８アッセイを行い、アッセイ実施日を、それぞれＤａｙ２、Ｄａｙ３、Ｄａｙ４、Ｄａｙ５、Ｄａｙ６とした。アッセイ当日、分析するウェルの総数を数え、ＣＣＫ－８試薬を含む適量のＤＭＥＭ培地を調製した。ＣＣＫ－８試薬（同仁化学所、ＣＫ０４）とＤＭＥＭ培地を１：１０の割合で調製し、ＣＣＫ－８試薬を含むＤＭＥＭ培地１００μＬを各ウェルに加え、３７℃の細胞培養インキュベーターで１．５時間培養した後、マルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ＳＹＮＥＲＧＹ／ＬＸ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計的に分析した。
【0095】
オートファゴソーム機能アッセイ
野生型細胞、変異型細胞、ウイルス感染細胞を、それぞれ１００ｎＭのＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ－Ａ１（Ｂａｆ）を含む培地、または薬物を含まない培地で２時間処理し、細胞内タンパク質を抽出し、ＷＢアッセイでＬＣ３Ｂ－ＩＩ／ＧＡＰＤＨ比を分析することにより、細胞内オートファジーのフラックスが阻害されていないかどうかを判定した。
野生型細胞、変異型細胞、ウイルス感染細胞を、それぞれ１００ｎＭのＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ－Ａ１（Ｂａｆ）を含む培地、または薬物を含まない培地で２時間処理し、細胞内タンパク質を抽出し、ＷＢアッセイでＬＣ３Ｂ－ＩＩ／ＧＡＰＤＨ比を分析することにより、細胞内オートファジーのフラックスが阻害されていないかどうかを判定した。
【0096】
脂質沈着染色
細胞を１６０μＭのアラキドン酸（ＡＡ）で４日間連続処理し、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間室温で固定した。３μＭのＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３で細胞を２０分間３７℃で染色した。５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩで１０分間対比染色した。レーザー共焦点顕微鏡で写真を撮った。各実験群について５０個の細胞を選択し、細胞内脂質沈着粒子の面積および細胞単位面積あたりの脂質沈着粒子数をＩｍａｇｅ ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェアで分析した。
細胞を１６０μＭのアラキドン酸（ＡＡ）で４日間連続処理し、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間室温で固定した。３μＭのＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３で細胞を２０分間３７℃で染色した。５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩで１０分間対比染色した。レーザー共焦点顕微鏡で写真を撮った。各実験群について５０個の細胞を選択し、細胞内脂質沈着粒子の面積および細胞単位面積あたりの脂質沈着粒子数をＩｍａｇｅ ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェアで分析した。
【0097】
マウス網膜下腔注射
マウスを全身麻酔した後、十分に散瞳し、眼科専用の手術用顕微鏡の直視下で、虹彩と水晶体を傷つけないように角膜強膜縁の外側に３０ １／２ゲージのディスポーザブル鋭針で強膜を穿刺し、３３ゲージの平針を備えたマイクロインジェクタを用いて穿刺口に沿って強膜に針を刺し、水晶体を迂回して硝子体に到達させた後、網膜神経層と網膜色素上皮（ＲＰＥ）層の間の潜在的な網膜腔に針を徐々に挿入し、ゆっくりと押し込みながら注入し、注入量は１μＬとした。０．１％フルオレセインナトリウム色素（安全濃度）を注入キャリア懸濁液に加え、注入の成功と網膜剥離の程度を観察しやすくした。いつでも眼底を観察できるように、注射中は２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースを点眼した。手術用顕微鏡で丸い網膜の膨らみがはっきり見え、網膜の膨らみの下に緑色が見えたら、注入が成功したことが証明される。一定時間後、バブルは消失し、局所的な網膜の膨らみは平らになる。網膜の膨らみやその下に緑色が確認できない場合、あるいは手術中に網膜出血などの合併症が確認された場合は、別のマウスを選んで再び注入を行った。手術後、炎症反応の軽減と感染予防のため、１％アトロピン眼軟膏とテトラサイクリンコルチゾン眼軟膏を塗布し、１日おきに計３回繰り返した。
マウスを全身麻酔した後、十分に散瞳し、眼科専用の手術用顕微鏡の直視下で、虹彩と水晶体を傷つけないように角膜強膜縁の外側に３０ １／２ゲージのディスポーザブル鋭針で強膜を穿刺し、３３ゲージの平針を備えたマイクロインジェクタを用いて穿刺口に沿って強膜に針を刺し、水晶体を迂回して硝子体に到達させた後、網膜神経層と網膜色素上皮（ＲＰＥ）層の間の潜在的な網膜腔に針を徐々に挿入し、ゆっくりと押し込みながら注入し、注入量は１μＬとした。０．１％フルオレセインナトリウム色素（安全濃度）を注入キャリア懸濁液に加え、注入の成功と網膜剥離の程度を観察しやすくした。いつでも眼底を観察できるように、注射中は２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースを点眼した。手術用顕微鏡で丸い網膜の膨らみがはっきり見え、網膜の膨らみの下に緑色が見えたら、注入が成功したことが証明される。一定時間後、バブルは消失し、局所的な網膜の膨らみは平らになる。網膜の膨らみやその下に緑色が確認できない場合、あるいは手術中に網膜出血などの合併症が確認された場合は、別のマウスを選んで再び注入を行った。手術後、炎症反応の軽減と感染予防のため、１％アトロピン眼軟膏とテトラサイクリンコルチゾン眼軟膏を塗布し、１日おきに計３回繰り返した。
【0098】
マウス眼球網膜サンプル抽出
マウス眼組織を採取し、角膜と水晶体を除去した後、ＡＴＬ溶液（ＱＩＡＧＥＮ，１９０７６）１００μＬを加え、２分間ホモジナイズした。ＤＮＡサンプル抽出として、ホモジネート液を１０μＬ吸引し、ＡＴＬ溶液１０μＬとプロテイナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ，１９１３３）２μＬを加えてよく混合し、ＡＬ溶液（ＱＩＡＧＥＮ，１９０７５）２０μＬを加えてよく混合した後、５６℃で１０分間インキュベートし、ＤＮＡ検出用サンプルを得、タンパク質抽出として、残りのホモジネート５０μＬを吸引し、５μＬの１０×ＲＩＰＡ ｌｙｓａｔｅ（ＣＳＴ）とプロテアーゼ阻害剤（Ｂｉｙｕｎ Ｔｉａｎ）を加えてよく混合し、氷上で３０分間溶解し、４℃、１５，０００ｇで３０分間遠心し、上清を回収し、タンパク質を定量してＷＢアッセイを行った。
マウス眼組織を採取し、角膜と水晶体を除去した後、ＡＴＬ溶液（ＱＩＡＧＥＮ，１９０７６）１００μＬを加え、２分間ホモジナイズした。ＤＮＡサンプル抽出として、ホモジネート液を１０μＬ吸引し、ＡＴＬ溶液１０μＬとプロテイナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ，１９１３３）２μＬを加えてよく混合し、ＡＬ溶液（ＱＩＡＧＥＮ，１９０７５）２０μＬを加えてよく混合した後、５６℃で１０分間インキュベートし、ＤＮＡ検出用サンプルを得、タンパク質抽出として、残りのホモジネート５０μＬを吸引し、５μＬの１０×ＲＩＰＡ ｌｙｓａｔｅ（ＣＳＴ）とプロテアーゼ阻害剤（Ｂｉｙｕｎ Ｔｉａｎ）を加えてよく混合し、氷上で３０分間溶解し、４℃、１５，０００ｇで３０分間遠心し、上清を回収し、タンパク質を定量してＷＢアッセイを行った。
【0099】
ベクターゲノムコピー数解析
ＤＮＡアッセイサンプル５μＬを取り、サンプル希釈液４５μＬ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ，２４０４００３２）５μＬとｔＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ７１１９）２μＬをＲＮＡａｓｅフリー水１ｍＬに溶解したもの）を加え、混合した後、希釈液を５μＬ吸引し、サンプル希釈液４５μＬを加えて混合し、被検ＤＮＡサンプルの１００倍希釈液を得た。直線化され、絶対定量されたプラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を標準として用いて標準曲線をプロットした。以下の反応系に従ってｑＰＣＲ反応液を調製する：Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ Ｍｉｘ、上流プライマー（１０μＭ）、下流プライマー（１０μＭ）、プローブ（１０μＭ）、ＤＮＡテンプレート。ｑＰＣＲ反応は、以下の反応条件に従って行った：５０℃、２分間；９５℃、１０分間；９５℃、１５秒間；６０℃、３０秒間、４０サイクル；３７℃、２秒間。反応終了後、標準物質のＣｔ値から標準曲線を作成し、直線回帰により各被検サンプルのＶｇ数を算出した。
ＤＮＡアッセイサンプル５μＬを取り、サンプル希釈液４５μＬ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ，２４０４００３２）５μＬとｔＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ７１１９）２μＬをＲＮＡａｓｅフリー水１ｍＬに溶解したもの）を加え、混合した後、希釈液を５μＬ吸引し、サンプル希釈液４５μＬを加えて混合し、被検ＤＮＡサンプルの１００倍希釈液を得た。直線化され、絶対定量されたプラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を標準として用いて標準曲線をプロットした。以下の反応系に従ってｑＰＣＲ反応液を調製する：Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ Ｍｉｘ、上流プライマー（１０μＭ）、下流プライマー（１０μＭ）、プローブ（１０μＭ）、ＤＮＡテンプレート。ｑＰＣＲ反応は、以下の反応条件に従って行った：５０℃、２分間；９５℃、１０分間；９５℃、１５秒間；６０℃、３０秒間、４０サイクル；３７℃、２秒間。反応終了後、標準物質のＣｔ値から標準曲線を作成し、直線回帰により各被検サンプルのＶｇ数を算出した。
【0100】
マウスＯＣＴ検査
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）検査：麻酔をかけた動物を昇降台に乗せ、複合トロピカミド点眼液で常法散瞳し、塩酸プロパラカイン点眼液で表面麻酔を行い、眼の位置を揃え、瞳が大きな状態になった後、医療用カルボマー点眼ジェルを被検角膜に塗布し、眼科用超顕微鏡イメージングシステムの光源を調節してピントを合わせ、レンズの焦点位置を網膜に合わせ、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）検査を行った。各実験動物の両眼を撮影した。実験終了後、両目を生理食塩水で洗浄し、感染予防のためにレボフロキサシン点眼液で点眼した。
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）検査：麻酔をかけた動物を昇降台に乗せ、複合トロピカミド点眼液で常法散瞳し、塩酸プロパラカイン点眼液で表面麻酔を行い、眼の位置を揃え、瞳が大きな状態になった後、医療用カルボマー点眼ジェルを被検角膜に塗布し、眼科用超顕微鏡イメージングシステムの光源を調節してピントを合わせ、レンズの焦点位置を網膜に合わせ、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）検査を行った。各実験動物の両眼を撮影した。実験終了後、両目を生理食塩水で洗浄し、感染予防のためにレボフロキサシン点眼液で点眼した。
【0101】
マウスＥＲＧアッセイ
被検マウスを３日間暗室で飼育し、実験時点に達したマウスを暗室内で網膜電図（ＥＲＧ）波形収集を行った。マウスに麻酔をかけて瞳を大きくさせた後、角膜を保護するために０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を両眼に点眼し、マウスをヒーティングパッド付きの手術台に乗せ、赤線電極をマウスの眉間中央の皮膚表皮下に、黒色接地電極をマウスの尾部表皮下に挿入し、全網膜眼電図Ｇａｎｚｆｅｌｄ ＥＲＧシステム（Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ，Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＥＲＧ画像収集を行い、該システムのソフトウェアによる自動解析により、各刺激強度に対するａ波とｂ波の平均振幅を求め、統計分析を行った。網膜電図の波形は、網膜ニューロンの伝導機能を反映することができ、測定された波形は主に負のａ波と正のｂ波からなり、ａ波は網膜一次ニューロン、すなわち光受容細胞の機能を反映し、ｂ波は網膜二次ニューロン、すなわち双極細胞の機能を反映していた。
被検マウスを３日間暗室で飼育し、実験時点に達したマウスを暗室内で網膜電図（ＥＲＧ）波形収集を行った。マウスに麻酔をかけて瞳を大きくさせた後、角膜を保護するために０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を両眼に点眼し、マウスをヒーティングパッド付きの手術台に乗せ、赤線電極をマウスの眉間中央の皮膚表皮下に、黒色接地電極をマウスの尾部表皮下に挿入し、全網膜眼電図Ｇａｎｚｆｅｌｄ ＥＲＧシステム（Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ，Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＥＲＧ画像収集を行い、該システムのソフトウェアによる自動解析により、各刺激強度に対するａ波とｂ波の平均振幅を求め、統計分析を行った。網膜電図の波形は、網膜ニューロンの伝導機能を反映することができ、測定された波形は主に負のａ波と正のｂ波からなり、ａ波は網膜一次ニューロン、すなわち光受容細胞の機能を反映し、ｂ波は網膜二次ニューロン、すなわち双極細胞の機能を反映していた。
【0102】
実施例
実施例１：アデノウイルスベクターの構築と単離精製
１．１ アデノウイルスベクターの構築
ＣＹＰ４Ｖ２ 発現カセットの構造を図１に示す。前記ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、５’末端から３’末端の順に、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡエクソン１＆イントロン１、Ｋｏｚａｋ配列、標的遺伝子：野生型ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｈＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたは最適化ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ｈＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ、ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ）および３’ＩＴＲを含む。ここで、
５’ＩＴＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示され、
ＣＭＶエンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントであり、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示され、
ＣＢＡプロモーターは、ニワトリβ－アクチン遺伝子プロモーターであり、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示され、
ＣＢＡエクソン１＆イントロン１は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロンであり、それらのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示される；
ｈＣＹＰ４Ｖ２ＷＴ遺伝子は野生型ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：２８５４４０）に由来し、その遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示され、それがコードする野生型ｈＣＹＰ４Ｖ２ＷＴタンパク質のＮＣＢＩ登録番号はＮＰ＿９９７２３５．３である。
実施例１：アデノウイルスベクターの構築と単離精製
１．１ アデノウイルスベクターの構築
ＣＹＰ４Ｖ２ 発現カセットの構造を図１に示す。前記ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、５’末端から３’末端の順に、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡエクソン１＆イントロン１、Ｋｏｚａｋ配列、標的遺伝子：野生型ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｈＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたは最適化ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ｈＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ、ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ）および３’ＩＴＲを含む。ここで、
５’ＩＴＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示され、
ＣＭＶエンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントであり、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示され、
ＣＢＡプロモーターは、ニワトリβ－アクチン遺伝子プロモーターであり、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示され、
ＣＢＡエクソン１＆イントロン１は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロンであり、それらのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示される；
ｈＣＹＰ４Ｖ２ＷＴ遺伝子は野生型ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：２８５４４０）に由来し、その遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示され、それがコードする野生型ｈＣＹＰ４Ｖ２ＷＴタンパク質のＮＣＢＩ登録番号はＮＰ＿９９７２３５．３である。
【0103】
最適化ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｈＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔは、野生型ｈＣＹＰ４Ｖ２ＷＴタンパク質をコードするコドン最適化遺伝子ｏｐｔ１８、ｏｐｔ７、ｏｐｔ８およびｏｐｔ６であり、そのヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８である。
【0104】
ＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルであり、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示される。
【0105】
３’ＩＴＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示される。
【0106】
Ｋｏｚａｋ配列は、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ配列の前に挿入され、その配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７（ＧＣＣＡＣＣ）に示され。
【0107】
野生型ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｈＣＹＰ４Ｖ２ＷＴを含む発現カセットをプラスミドｐＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴとして構築した。
【0108】
最適化ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含む発現カセットは、プラスミドｐＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔとして構築された。ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２は、コドン最適化遺伝子ｏｐｔ６を含む発現カセットのヌクレオチド配列を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３は、コドン最適化遺伝子ｏｐｔ７を含む発現カセットのヌクレオチド配列を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４は、コドン最適化遺伝子ｏｐｔ８を含む発現カセットのヌクレオチド配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５はコドン最適化遺伝子ｏｐｔ１８を含む発現カセットのヌクレオチド配列を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６は、ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴを含む発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
【0109】
ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、ｒＡＡＶにおける任意のＡＡＶ血清型またはそのハイブリッドもしくは変異体からのカプシドを有するベクターにパッケージされることができる。
【0110】
ウイルスベクターはプラスミドコトランスフェクション法によって取得した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＡＡＶ２カプシドタンパク質遺伝子およびＡＡＶの複製を補助できる遺伝子を含むヘルパープラスミド、およびＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子発現カセットを含むシャトルプラスミドｐＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴ、またはプラスミドｐＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔをコトランスフェクションすることにより、予めに組換えアデノ随伴ウイルスベクターを形成した。
【0111】
１．２ アデノウイルスベクターの単離と精製
ＡＡＶベクターは、３プラスミドシステムを用いて生産され、すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子を含むシャトルプラスミド、ＡＡＶベクターのｒｅｐｃａｐ遺伝子を含むｐＲｅｐＣａｐプラスミド及びヘルパープラスミドであるｐＨｅｌｐｅｒを採用し、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションし、組換えによりＡＡＶウイルスベクターをパッケージングした。収穫はトランスフェクション後４８～７２時間経ってから行い、収穫した液をアフィニティークロマトグラフィーで精製し、陰イオンクロマトグラフィーでさらに精製し、限外濾過で濃縮し、緩衝液で置換した。精製された組換えＡＡＶウイルスベクターのゲノム力価を測定し、滅菌濾過し、分注して使用に供した。
ＡＡＶベクターは、３プラスミドシステムを用いて生産され、すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２標的遺伝子を含むシャトルプラスミド、ＡＡＶベクターのｒｅｐｃａｐ遺伝子を含むｐＲｅｐＣａｐプラスミド及びヘルパープラスミドであるｐＨｅｌｐｅｒを採用し、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションし、組換えによりＡＡＶウイルスベクターをパッケージングした。収穫はトランスフェクション後４８～７２時間経ってから行い、収穫した液をアフィニティークロマトグラフィーで精製し、陰イオンクロマトグラフィーでさらに精製し、限外濾過で濃縮し、緩衝液で置換した。精製された組換えＡＡＶウイルスベクターのゲノム力価を測定し、滅菌濾過し、分注して使用に供した。
【0112】
実施例２：コドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現アッセイ
本実施例では、コドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルを、ＨＥＫ２９３とＡＲＰＥ－１９の２種の細胞株で評価した。ここで、ＨＥＫ２９３細胞株においてはプラスミドトランスフェクションを行い、ＡＲＰＥ－１９細胞株においてはＡＡＶ ウイルスの感染を行い、標的遺伝子を細胞内に導入した。
本実施例では、コドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルを、ＨＥＫ２９３とＡＲＰＥ－１９の２種の細胞株で評価した。ここで、ＨＥＫ２９３細胞株においてはプラスミドトランスフェクションを行い、ＡＲＰＥ－１９細胞株においてはＡＡＶ ウイルスの感染を行い、標的遺伝子を細胞内に導入した。
【0113】
ＨＥＫ２９３では、ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴを発現するプラスミドＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔを発現するプラスミドＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔを一過性にトランスフェクションし、細胞溶解物中のタンパク質発現をウェスタンブロット分析により評価した（図２）。コドンが最適化されたＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｏｐｔ６、ｏｐｔ７、ｏｐｔ８、ｏｐｔ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８，６，７，５）のＨＥＫ２９３細胞における発現レベルはすべて野生型ヒト由来ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ＷＴ）よりも有意に高かった。
【0114】
ＡＲＰＥ－１９では、プラスミドＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはプラスミドＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔによる感染後、細胞溶解液中のタンパク質発現をウェスタンブロット分析により評価した（図３）。
【0115】
【0116】
実施例３：ＢＣＤ細胞モデルの構築と同定
ＢＣＤ遺伝子治療におけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔ遺伝子の有効性を評価するため、本実施例ではＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法を用いて、ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９の２種の細胞株にＣＹＰ４Ｖ２変異を導入した細胞モデルを構築した（図４および図５）。
ＢＣＤ遺伝子治療におけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔ遺伝子の有効性を評価するため、本実施例ではＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法を用いて、ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９の２種の細胞株にＣＹＰ４Ｖ２変異を導入した細胞モデルを構築した（図４および図５）。
【0117】
細胞モデルの構築方策を図４Ａに示す。Ｅｘｏｎ５－ｓｇＲＮＡ１（そのヌクレオチド配列を表１に示す）をエクソン５付近に設計し、Ｅｘｏｎ７－ｓｇＲＮＡ１、Ｅｘｏｎ７－ｓｇＲＮＡ２、およびＥｘｏｎ７－ｓｇＲＮＡ３（それらのヌクレオチド配列をそれぞれ表１に示す）をエクソン７付近に設計し、４種類のｓｇＲＮＡをすべてＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，＃５８７６６）に構築し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドを得た。前記Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３とＡＲＰＥ－１９の２種類の細胞にそれぞれ一過性にトランスフェクションし、トランスフェクションから４８時間後、ピューロマイシンを添加してトランスフェクションに失敗した細胞を除去した後、限界希釈法により９６ウェル培養プレートに細胞を接種し、培養し、２～３週間後、ＰＣＲを行い、９６ウェルプレート中のモノクローナル細胞の遺伝子型を同定した。使用したプライマー配列の詳細を表１に示した。
【表1】
【0118】
モノクローナル細胞をスクリーニングして増幅した後、遺伝子配列決定によって正しい変異を持つ細胞クローンを検証し、その結果を図４Ｂと５Ａに示した。細胞クローンの遺伝子型、タンパク質産物の説明を表２に示す。野生型ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の全長配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２７に、そのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２８に示す。ＣＹＰ４Ｖ２のエクソン５の変異細胞は、全長配列の２２３－２２４ａａで、エクソン７の変異細胞は、２６８－２７１ａａでフレームシフト変異を有し、野生型よりもトランケートされたタンパク質を発現する。
【表2-1】
【表2-2】
【0119】
ＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＨＥＫ２９３細胞の表現型を、細胞増殖およびオートファゴソーム機能の検査により同定した。ＢＣＤ患者のｉＰＳＣ細胞から分化したＲＰＥ細胞には細胞増殖率の低下とオートファゴソーム機能の欠損があることが文献に報告されている（Ｈａｔａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｃｕｅｓ Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１５（１５）：３９３６－３９４１）。本発明者らは、ＨＥＫ２９３変異細胞がＨＥＫ２９３ ＷＴ細胞と比較して細胞増殖率が有意に低下したことを見出した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３ ＷＴ細胞および変異細胞におけるオートファゴソームマーカーである微小管関連タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３）のタンパク質レベルを評価した。ＬＣ３タンパク質のＣ末端プロセシングによりＬＣ３－Ｉが生成される。オートファゴソームを形成する時に修飾が起こり、ＬＣ３－ＩをＬＣ３－ＩＩに変化させた。その結果、ＨＥＫ２９３変異細胞におけるＬＣ３－ＩＩタンパク質の発現レベルは、ＨＥＫ２９３ ＷＴ細胞における発現よりも高いことが示された。液胞Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ阻害剤であるＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ－Ａ１は、ＷＴ細胞におけるＬＣ３－ＩＩタンパク質レベルを増加させたが、変異細胞におけるＬＣ３－ＩＩタンパク質レベルを増加させなかった。このことから、変異細胞ではオートファゴソームが蓄積しているが、オートファジーのフラックスが損なわれていることが示された。これらの観察結果は、ＣＹＰ４Ｖ２変異が細胞の正常な機能の喪失を引き起こし、ＨＥＫ２９３細胞における細胞増殖の減少およびオートファゴソーム機能の欠損をもたらすことを示した（図４Ｃ～Ｅ）。図４は、代表として５～Ｃ１４細胞の同定結果を示した。他の細胞クローンも類似の表現型結果を示した。
【0120】
ＲＰＥ細胞により近い特徴を持つＡＲＰＥ－１９細胞株においても、ＣＹＰ４Ｖ２変異は細胞の表現型に変化を引き起こした。ＡＲＰＥ－１９細胞はヒト網膜色素上皮細胞由来であり、細胞表面にはＲＰＥ細胞の表面マーカーであるＣＲＡＬＢＰとＲＰＥ－６５の発現が見られる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いてＣＹＰ４Ｖ２変異ＡＲＰＥ－１９細胞（図５Ａ）を得、ＡＲＰＥ－１９変異細胞の細胞増殖率は、ＡＲＰＥ－１９ ＷＴ細胞と比較して有意に低下した（図５Ｂ）。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子は、眼ＲＰＥ細胞層において、脂肪酸代謝に関与する水酸化酵素をコードし、網膜ポリ不飽和脂肪酸の恒常的なバランスを維持している。ＣＹＰ４Ｖ２変異ＡＲＰＥ－１９細胞株に対して、細胞を１６０μＭアラキドン酸（ＡＡ）で４日間連続的に処理し、そして５μＭ ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３で脂質染色した後、脂肪粒子の沈着が野生型細胞よりも有意に高いことが見られた（図５Ｃ－５Ｄ）。透過型電子顕微鏡で観察した結果、変異細胞においてより多くのオートファジー液胞が存在することが示された（図５Ｅ）。これらの観察結果から、ＣＹＰ４Ｖ２変異は細胞の正常な機能の欠損を引き起こし、ＡＲＰＥ－１９細胞において細胞増殖の低下、脂質代謝異常、オートファゴソーム機能の欠損を引き起こすことが示唆された。図５は、代表として５－Ｃ１３細胞の同定結果を示した。
【0121】
実施例４：ＢＣＤ細胞モデルにおけるコドン最適化ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効評価
ＣＹＰ４Ｖ２変異を有する２種のＢＣＤ細胞モデル、ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９において、ＡＡＶウイルスを用いた感染により、コドン最適化したＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を評価した。
ＣＹＰ４Ｖ２変異を有する２種のＢＣＤ細胞モデル、ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９において、ＡＡＶウイルスを用いた感染により、コドン最適化したＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を評価した。
【0122】
ＨＥＫ２９３ ＣＹＰ４Ｖ２変異ＢＣＤ細胞モデルにおけるＡＡＶ２媒介ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔの発現を図６Ａに示した。同量のウイルス感染下で、感染されたＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔは、発現量がＷＴより高かった。
【0123】
ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔの発現は、ＨＥＫ２９３ ＢＣＤ細胞モデルにおける変異細胞の細胞増殖速度欠損を用量依存的に修復した（図６Ｂ－Ｃ）。ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔによる変異細胞の機能修復後の細胞増殖レベルは、依然として野生型ＨＥＫ２９３細胞より低く、このことから、ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔの発現が細胞を過剰活性化しなかったことが示唆された（図６Ｄ）。
【0124】
細胞増殖低下の部分的修復と一致して、ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔの発現は、変異細胞における欠損したオートファゴソーム機能の一部も修復した。変異細胞におけるＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはｏｐｔの発現は、ＥＧＦＰ対照（Ｂａｆ処理なし場合：ＮＴ条件）と比較して、オートファゴソームの蓄積が有意に修復されなかった。しかし、ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴまたはｏｐｔの発現を有する変異細胞では、Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ－Ａ１（Ｂａｆ）処理条件下で、オートファジーのフラックスが有意に増加し、オートファジー機能の一部が回復されたことが示された（図６Ｅ～Ｆ）。
【0125】
同様に、ＡＡＶ２媒介ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔは、ＡＲＰＥ－１９ ＣＹＰ４Ｖ２変異ＢＣＤ細胞モデルにおいても治療効果を示した。ＡＡＶ２－ＷＴおよびＡＡＶ２－ｏｐｔ１８ウイルスが感染したＡＲＰＥ－１９変異細胞５－Ｃ１３は、図５Ｃ～５Ｄに示すように、ＡＡＶ２－ＷＴおよびＡＡＶ２－ｏｐｔ１８ウイルスが感染したＡＲＰＥ－１９変異細胞５－Ｃ１３内の脂質沈着粒子は、感染していない変異細胞と比べて、野生型ＡＲＰＥ－１９細胞のレベルまで有意に減少した。最適化した遺伝子ｏｐｔ１８の脂質沈着低減効果は、ＷＴと比較してより良好であり、統計学的に有意差があった（図５Ｃ～５Ｄ）。
【0126】
図５～６に代表としてＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ１８の結果を示した。他のｏｐｔ遺伝子の発現も類似する表現型結果が得られた。
【0127】
これらの結果から、ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９ ＢＣＤ細胞モデルで観察された表現型の欠損は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の機能喪失に起因することが示唆された。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の発現を補充することで、これらの細胞機能欠損の回復が実現され、ＢＣＤに対する治療効果がある。
【0128】
実施例５：コドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｖｏ発現アッセイ
４週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼球に、網膜下注射により１μＬ １．５×１０１２ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔ組換えウイルス粒子を注射し、注射後４週間ごとに眼球組織を採取し、マウス眼球組織をホモジナイズした後、ＲＩＰＡ溶解液を加えて組織を溶解し、ホモジナイズして溶解した。等量の総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、次いで免疫ブロットを行い、タンパク質を定量した後、ＣＹＰ４Ｖ２の発現レベルをウェスタンで検出した。遺伝子発現レベルはウェスタンブロットアッセイで分析した。コドン最適化後のＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ遺伝子のタンパク質発現レベルをＷＴと比較した。注射後４週間での結果は、ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ遺伝子がマウス眼においてＷＴよりも高いレベルで発現していることを示した（図７）。
４週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼球に、網膜下注射により１μＬ １．５×１０１２ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ＷＴおよびｏｐｔ組換えウイルス粒子を注射し、注射後４週間ごとに眼球組織を採取し、マウス眼球組織をホモジナイズした後、ＲＩＰＡ溶解液を加えて組織を溶解し、ホモジナイズして溶解した。等量の総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、次いで免疫ブロットを行い、タンパク質を定量した後、ＣＹＰ４Ｖ２の発現レベルをウェスタンで検出した。遺伝子発現レベルはウェスタンブロットアッセイで分析した。コドン最適化後のＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ遺伝子のタンパク質発現レベルをＷＴと比較した。注射後４週間での結果は、ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔ遺伝子がマウス眼においてＷＴよりも高いレベルで発現していることを示した（図７）。
【0129】
実施例６：高脂肪食ＣＹＰ４Ｖ３ ＫＯ ＢＣＤマウスモデルの表現型同定
ＢＣＤ患者と比較して、ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のマウスにおけるオルソログＣＹＰ４Ｖ３ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ、ＫＯ）モデルは、生理的及び機能的な変化が少なく、表現型が患者よりもはるかに遅く現れる。生後６ヵ月のマウス（ヒトの２０～３０歳に相当）では眼に散発的な脂質沈着がみられ、生後１２ヵ月のマウス（ヒトの５０歳に相当、眼失明を発症）では脂質沈着が顕著であるが、眼球ＥＲＧ機能や視力の障害はみられない（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５５（９）：５５７２－５５８１）。高脂肪食（ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ，ＨＦＤ）投与後、ＣＹＰ４Ｖ３ ＫＯマウスモデルでは網膜症発症が促進され、凝集する（Ｑｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ－ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２７（７－８）：３７０－３８２）。この実施例では、マウスが生後断乳してからＨＦＤ飼育を行い、生後４週以降に眼底画像観察、ＯＣＴ、ＥＲＧ機能検査を４週間ごとに行った。
ＢＣＤ患者と比較して、ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のマウスにおけるオルソログＣＹＰ４Ｖ３ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ、ＫＯ）モデルは、生理的及び機能的な変化が少なく、表現型が患者よりもはるかに遅く現れる。生後６ヵ月のマウス（ヒトの２０～３０歳に相当）では眼に散発的な脂質沈着がみられ、生後１２ヵ月のマウス（ヒトの５０歳に相当、眼失明を発症）では脂質沈着が顕著であるが、眼球ＥＲＧ機能や視力の障害はみられない（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５５（９）：５５７２－５５８１）。高脂肪食（ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ，ＨＦＤ）投与後、ＣＹＰ４Ｖ３ ＫＯマウスモデルでは網膜症発症が促進され、凝集する（Ｑｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ－ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２７（７－８）：３７０－３８２）。この実施例では、マウスが生後断乳してからＨＦＤ飼育を行い、生後４週以降に眼底画像観察、ＯＣＴ、ＥＲＧ機能検査を４週間ごとに行った。
【0130】
実施例７：ＢＣＤマウスモデルにおけるコドン最適化ＡＡＶ２－ＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔのｉｎ ｖｉｖｏ薬効評価
高脂肪食による眼底病理学的変化を起こしたＣＹＰ４Ｖ３ ＫＯ ＢＣＤマウスの眼球に、５ｅ１２ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔウイルス粒子１μＬを網膜下腔注射により注入した。注入後４週間ごとにＯＣＴおよびＥＲＧ機能検査を行い、ＡＡＶ２－ＧＦＰおよびＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔウイルス粒子の治療効果を比較分析した。
高脂肪食による眼底病理学的変化を起こしたＣＹＰ４Ｖ３ ＫＯ ＢＣＤマウスの眼球に、５ｅ１２ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔウイルス粒子１μＬを網膜下腔注射により注入した。注入後４週間ごとにＯＣＴおよびＥＲＧ機能検査を行い、ＡＡＶ２－ＧＦＰおよびＣＹＰ４Ｖ２ ｏｐｔウイルス粒子の治療効果を比較分析した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されるヌクレオチド配列を有する、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項2】
請求項１に記載のポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターとを含む発現カセット。
【請求項3】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項4】
発現制御エレメントをさらに含み、前記ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記発現制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項5】
前記発現制御エレメントは、複製起点、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｐｏｌｙＡシグナル、ＩＴＲ、インシュレータから選択される１種または複数である、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項6】
複製起点をさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項7】
前記複製起点の配列は、ｆ１ファージｏｒｉ、ＲＫ２ｏｒｉＶ、ｐＵＣ ｏｒｉまたはｐＳＣ１０１ｏｒｉから選択される、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項8】
５’ＩＴＲをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項9】
前記５’ＩＴＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるものである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項10】
３’ＩＴＲをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項11】
前記３’ＩＴＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示されるものである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項12】
エンハンサーをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項13】
前記エンハンサーはＣＭＶエンハンサーである、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項14】
前記エンハンサーのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるものである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項15】
プロモーターをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項16】
前記プロモーターは特異的または非特異的プロモーターである、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項17】
前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＰＧＫプロモーターまたはＴＲＥ３ＧＳプロモーターから選択される、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項18】
前記プロモーターはＣＢＡプロモーターである、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項19】
前記ＣＢＡプロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されるものである、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項20】
前記プロモーターは誘導可能プロモーターである、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項21】
前記誘導可能プロモーターは、テトラサイクリン調節プロモーター、アルコール調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、病原性調節プロモーター、温度／熱誘導型プロモーター、光調節プロモーター、ＩＰＴＧ誘導型プロモーターから選択される１種または複数種である、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項22】
前記テトラサイクリン調節プロモーターは、Ｔｅｔ ｏｎプロモーター、Ｔｅｔ ｏｆｆプロモーター、またはＴｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒプロモーターから選択される、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項23】
前記アルコール調節プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータータンパク質に応答するプロモーターから選択される、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項24】
前記ステロイド調節プロモーターは、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター、ヒトエストロゲン受容体プロモーター、蛾エクジステロイド受容体プロモーター、レチノイドプロモーター、または甲状腺受容体スーパーファミリープロモーターから選択される、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項25】
前記金属調節プロモーターは、酵母、マウスまたはヒトのメタロチオネインプロモーターから選択される、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項26】
前記病原性調節プロモーターは、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーターまたはベンゾチアジアゾール調節プロモーターから選択される、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項27】
前記温度／熱誘導型プロモーターは、ＨＳＰ－７０プロモーター、ＨＳＰ－９０プロモーターまたは大豆熱ショックプロモーターから選択される、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項28】
前記光調節プロモーターは植物細胞の光応答型プロモーターである、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項29】
エクソンおよびイントロンをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項30】
前記エクソンおよびイントロンは、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロンである、請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項31】
前記エクソンおよびイントロンのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるものである請求項３０に記載の発現ベクター。
【請求項32】
ｐｏｌｙＡシグナルをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項33】
前記ｐｏｌｙＡシグナルは、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡまたはヒトβ－ビーズタンパク質ｐｏｌｙＡである、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項34】
前記ｐｏｌｙＡシグナルのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるものである、請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項35】
ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６に示されるものである、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項36】
転写後調節エレメントをさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項37】
前記転写後調節エレメントはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントである、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項38】
マーカーをコードする遺伝子をさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項39】
前記マーカーは、抗生物質耐性タンパク質、毒素耐性タンパク質、着色または蛍光タンパク質から選択される１種または複数種である、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項40】
前記抗生物質は、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシンまたはブラストサイジンから選択される、請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項41】
前記毒素は、炭疽毒素またはジフテリア毒素から選択される、請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項42】
前記着色または蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質またはフルオレセイナーゼから選択される、請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項43】
前記マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素である、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項44】
前記発現ベクターはプラスミドである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項45】
前記発現ベクターはコスミドである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項46】
前記発現ベクターはウイルスベクターである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項47】
前記発現ベクターはＲＮＡベクターである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項48】
前記発現ベクターは線状もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項49】
前記プラスミドは、ｐＣＩ、ｐｕｃ５７、ｐｃＤＮＡ３、ｐＳＧ５、ｐＪ６０３またはｐＣＭＶから選択される、請求項４４に記載の発現ベクター。
【請求項50】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、アルファウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス、牛痘ウイルス、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、バキュロウイルスまたは肝炎ウイルスから選択される、請求項４６に記載の発現ベクター。
【請求項51】
前記ウイルスベクターはＲＮＡベクターである、請求項４６に記載の発現ベクター。
【請求項52】
前記レトロウイルスは、哺乳動物Ｃ型、レンチウイルスまたはフォーミーウイルスから選択される、請求項５０に記載の発現ベクター。
【請求項53】
前記レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはヒツジ脱髄性白質脳炎レンチウイルスから選択される、請求項５２に記載の発現ベクター。
【請求項54】
アデノ随伴ウイルスである、請求項５０に記載の発現ベクター。
【請求項55】
前記アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、およびＡＡＶ １０型から選択される、請求項５４に記載の発現ベクター。
【請求項56】
短縮されたキメライントロンおよびＫｏｚａｋ開始配列をさらに含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項57】
前記短縮されたキメライントロンのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるものである、請求項５６に記載の発現ベクター。
【請求項58】
前記Ｋｏｚａｋ開始配列のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７に示されるものである、請求項５６に記載の発現ベクター。
【請求項59】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載の発現カセットを含む、ウイルス粒子。
【請求項60】
請求項３に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項61】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載の発現カセット、および薬学的に許容される担体を含む、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーの治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物がコドン最適化されたＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する、
医薬組成物。
【請求項62】
請求項３に記載の発現ベクター、および薬学的に許容される担体を含む、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーの治療のための医薬組成物であって、
前記医薬組成物がコドン最適化されたＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する、
医薬組成物。
【請求項63】
請求項５９に記載のウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーの治療のための医薬組成物であって、
前記医薬組成物がコドン最適化されたＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する、
医薬組成物。
【請求項64】
請求項６０に記載のウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーの治療のための医薬組成物であって、
前記医薬組成物がコドン最適化されたＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現する、
医薬組成物。
【請求項65】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）を治療するものの調製における、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載の発現カセットの使用。
【請求項66】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項３に記載の発現ベクターの使用。
【請求項67】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項５９に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項68】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項６０に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項69】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項６１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項70】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項６２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項71】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項６３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項72】
Ｂｉｅｔｔｉ結晶性ジストロフィーを治療する薬物の調製における、請求項６４に記載の医薬組成物の使用。
【国際調査報告】