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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-23
(54)【発明の名称】乳由来製品を製造する方法
(51)【国際特許分類】
A23C 7/04 20060101AFI20250116BHJP
A23C 9/12 20060101ALI20250116BHJP
A23C 23/00 20060101ALI20250116BHJP
C12N 9/38 20060101ALN20250116BHJP
【ＦＩ】
A23C7/04
A23C9/12
A23C23/00
C12N9/38 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537121
(86)(22)【出願日】2022-12-22
(85)【翻訳文提出日】2024-06-24
(86)【国際出願番号】 EP2022087482
(87)【国際公開番号】W WO2023118436
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21216998.1
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】500586299
【氏名又は名称】ノボザイムス アクティーゼルスカブ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】イェッペ ウェグナー タムス
(72)【発明者】
【氏名】アリ オスマン
(72)【発明者】
【氏名】ニコライ スポッツベルグ
(72)【発明者】
【氏名】イェスパー サロモン
(72)【発明者】
【氏名】ユリー ビリー ラナース
(72)【発明者】
【氏名】ヤン キョエルヘーデ ベスター
(72)【発明者】
【氏名】フランク ウィンター ラスムッセン
(72)【発明者】
【氏名】アネット ヘレ ヨハンセン
(72)【発明者】
【氏名】ローランド アレクサンダー パケ
(57)【要約】
本発明は、ラクターゼによる乳由来基質の処理、及び加熱処理の実施を含む、ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）前記酵素の添加後、少なくとも１秒間の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で前記乳由来基質を保持することにより、前記乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で少なくとも４日にわたり前記加熱処理乳由来製品を保存すること
を含み、
工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｗ）であり、工程ｃ）の後に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法。
【請求項2】
工程ｂ）を、工程ａ）の後であり且つ工程ｂ）の前に専用のインキュベーション工程を行なうことなく、工程ａ）の直後に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記乳由来基質が、プロセスパイプ等のプロセス装置を通って流れている間に、前記乳由来基質に前記酵素を添加するために、ポンプ装置が設置されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記酵素の添加から工程ｂ）の保持温度に達するまでの時間は、最高５分であり、好ましくは最高２分であり、より好ましくは最高１分である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記酵素の添加から、前記加熱処理乳由来製品が最高４０℃の温度まで冷却されており、好ましくは最高３５℃の温度まで冷却されており、より好ましくは最高３０℃の温度まで冷却されているまでの時間は、最高３．５分であり、好ましくは最高３分であり、より好ましくは最高２．５分であり、例えば最高２分であるか、又は最高１分である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記乳由来基質は、２～３０％（ｗ／ｗ）のラクトースを含み、好ましく２～１７％（ｗ／ｗ）のラクトースを含み、、より好ましくは４～５．５％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記乳由来基質は、４～５．５％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記加熱処理は、ＥＳＬ処理、超低温殺菌、又はＵＨＬ処理であり、好ましくはＵＨＬ処理である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記加熱処理は、２５～３５秒にわたり１２８～１３２℃の温度で実施するか、２～５秒にわたり１３８～１４０℃の温度で実施するか、又は１～２秒にわたり１４４～１４６℃の温度で実施するＵＨＴ処理である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記工程ｂ）の保持時間の後、前記乳由来基質を、好ましくは５分以内に、より好ましくは３分以内に、さらにより好ましくは２分以内、例えば１分以内に、最高４０℃まで冷却し、好ましくは最高３５℃まで冷却し、より好ましくは最高３０℃まで冷却する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品を無菌的に包装する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程ｂ）の後に、前記酵素は、前記酵素の初期活性の少なくとも０．１％を保持しており、好ましくは少なくとも０．５％を保持しており、より好ましくは少なくとも１％を保持しており、より好ましくは少なくとも２％を保持しており、より好ましくは少なくとも１０％を保持しており、より好ましくは少なくとも５０％を保持しており、さらにより好ましくは少なくとも８０％を保持しており、最も好ましくは少なくとも９０％を保持している、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ラクターゼ活性を有する酵素は、前記酵素のアミノ酸配列中に、モチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］を含み、好ましくは、さらに、モチーフＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ及び／又は［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤの少なくとも一方を含み、より好ましくは両方を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ラクターゼ活性を有する酵素は、最適温度が３０～６０℃であり、好ましくは３５～５５℃である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ラクターゼ活性を有する酵素は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃での、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中におけるインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後に、残存活性が、少なくとも０．５％であり、好ましくは少なくとも１％、少なくとも２％、又は少なくとも３％であり、より好ましくは少なくとも５％であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％であり、前記残存活性は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃でのインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションを行なわない脱脂乳中における同一の酵素の活性に対して相対的である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本出願には、コンピュータ可読形式の配列表が含まれる。このコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願には、コンピュータ可読形式の配列表が含まれる。このコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、ラクターゼによる乳由来基質の処理、及び加熱処理の実施を含む方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ラクトースが低減されいてるか又はラクトースフリーの乳由来製品のほとんどは、バッチプロセスで製造されており、即ち、乳にラクターゼを添加し、次いで、ラクトース含有量を０．０１％未満又は０．１％未満（ほとんどの国で、例えば、乳にラクトースフリーというラベルを付すことが可能となる）まで低減させるのに十分な時間にわたり、この乳を低温（通常は１０℃未満）でインキュベートし、続いて、低温殺菌、ＵＨＴ処理、又はＥＳＬ（最高３５日間の長期保存可能期間）処理等の加熱処理を行なう。ラクターゼのバッチ適用に関連する欠点の一部として、下記が挙げられる：
（１）インキュベーション時間は、最高２４時間であり得、場合によってはさらに長く、これにより、ラクトースフリーの乳製品の需要増加に対応するための新たなインキュベーションタンクの容量及び設備投資に関する懸念が生じる。
（２）長時間のインキュベーション時間により、向精神微生物（ｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅ）が増殖して酵素（特にプロテアーゼ）を分泌する機会が与えられるが、この酵素の内の一部は、熱に安定であり、保存期間中に最終製品の品質を劣化させる場合がある。
（３）ラクトース加水分解、続いてＵＨＴ適用等での厳しい加熱処理により、メイラード反応が加速的に進行する。ラクトースがグルコース及びガラクトースへと加水分解されると、還元末端を有する糖の濃度が２倍となり、特に、ガラクトースは、ラクトースと比べて反応性がはるかに高い。
（１）インキュベーション時間は、最高２４時間であり得、場合によってはさらに長く、これにより、ラクトースフリーの乳製品の需要増加に対応するための新たなインキュベーションタンクの容量及び設備投資に関する懸念が生じる。
（２）長時間のインキュベーション時間により、向精神微生物（ｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅ）が増殖して酵素（特にプロテアーゼ）を分泌する機会が与えられるが、この酵素の内の一部は、熱に安定であり、保存期間中に最終製品の品質を劣化させる場合がある。
（３）ラクトース加水分解、続いてＵＨＴ適用等での厳しい加熱処理により、メイラード反応が加速的に進行する。ラクトースがグルコース及びガラクトースへと加水分解されると、還元末端を有する糖の濃度が２倍となり、特に、ガラクトースは、ラクトースと比べて反応性がはるかに高い。
【0004】
最近、特に、ラクトースフリーのＥＳＬ乳飲料及びＵＨＴ乳飲料の場合には、無菌投与装置の形態での高度なプロセスエンジニアリング技術に大きな関心が集まっており、バッチプロセスに関連する懸念の多くが克服される可能性が出てきた。そのような無菌投与装置により、ＥＳＬ／ＵＨＴ処理後にラクターゼを添加することが可能となる。そのような無菌投与装置の例は、Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ａｌｄｏｓｅシステム、Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ｆｌｅｘｄｏｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ、及びＧＥＡ Ｖａｒｉｄｏｓｅシステムである。これらのシステムの利点は、下記である：
（１）加熱処理工程後に、乳の流れに、高精度で少量の無菌ラクターゼを投与し、これにより、保存の最初の数日中にラクトース加水分解が生じることが可能となる。
（２）特に、適切に制御された保存条件が適用される場合には、ラクトースフリー乳飲料におけるメイラード反応、褐色化、及び糖化最終産物（ＡＧＥ）の形成の程度が減少する。
（３）バッチプロセスと比較してプレインキュベーションを省略し、それにより容量の問題が解決され、向精神微生物の活性のリスクが低減される。
（１）加熱処理工程後に、乳の流れに、高精度で少量の無菌ラクターゼを投与し、これにより、保存の最初の数日中にラクトース加水分解が生じることが可能となる。
（２）特に、適切に制御された保存条件が適用される場合には、ラクトースフリー乳飲料におけるメイラード反応、褐色化、及び糖化最終産物（ＡＧＥ）の形成の程度が減少する。
（３）バッチプロセスと比較してプレインキュベーションを省略し、それにより容量の問題が解決され、向精神微生物の活性のリスクが低減される。
【0005】
無菌投与システムの上記利点にもかかわらず、その使用に関連しては、下記のようないくつかの欠点がある：
（１）ラクターゼは、加熱処理工程後に添加されることから、この製剤は、可能な限り最高純度でなければならない。これは、特にＵＨＴ製品の場合に、製剤中の任意の有害な副作用が長い保存可能期間中に最終製品に大きな悪影響を及ぼす場合があるからである。
（２）Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ｆｌｅｘｄｏｓｅ及びＧＥＡ Ｖａｒｉｄｏｓｅシステムの場合には、ラクターゼ酵素は、無菌のバケツ及び袋に無菌的に充填すべきである。
（３）上記（１）及び（２）での要件は、これらの無菌ラクターゼは、バッチプロセスで使用されるラクターゼと比較して、活性の単位当たりのコストが高いことを意味する。
（４）この無菌投与システムの平均資本コストは、相当なものである。
（５）Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ｆｌｅｘｄｏｓｅ及びＧＥＡ Ｖａｒｉｄｏｓｅシステムを使用する場合には、消耗品に関連した追加のランニングコストが発生する。例えば、無菌バケツを交換するたびにホース及び針を交換することである。
（６）Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ａｌｄｏｓｅ システムでは、酵素製剤は、最初は無菌ではない。これを、水で希釈し、次いで少なくとも２つのフィルタを使用してインライン（搾乳場）でろ過して、酵素の流れの無菌性を確保した後に、乳の流れと混合する。従って、インラインで導入されたフィルタに、濾過性が低い酵素製剤が詰まる場合があり、操作に多くの支障をきたす場合がることから、問題が生じる可能性がある。酵素製剤の濾過性が期待通りに機能する場合であっても、依然として、フィルタを定期的に（通常は毎日）交換する必要がある。
（１）ラクターゼは、加熱処理工程後に添加されることから、この製剤は、可能な限り最高純度でなければならない。これは、特にＵＨＴ製品の場合に、製剤中の任意の有害な副作用が長い保存可能期間中に最終製品に大きな悪影響を及ぼす場合があるからである。
（２）Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ｆｌｅｘｄｏｓｅ及びＧＥＡ Ｖａｒｉｄｏｓｅシステムの場合には、ラクターゼ酵素は、無菌のバケツ及び袋に無菌的に充填すべきである。
（３）上記（１）及び（２）での要件は、これらの無菌ラクターゼは、バッチプロセスで使用されるラクターゼと比較して、活性の単位当たりのコストが高いことを意味する。
（４）この無菌投与システムの平均資本コストは、相当なものである。
（５）Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ｆｌｅｘｄｏｓｅ及びＧＥＡ Ｖａｒｉｄｏｓｅシステムを使用する場合には、消耗品に関連した追加のランニングコストが発生する。例えば、無菌バケツを交換するたびにホース及び針を交換することである。
（６）Ｔｅｔｒａ Ｐａｋ Ａｌｄｏｓｅ システムでは、酵素製剤は、最初は無菌ではない。これを、水で希釈し、次いで少なくとも２つのフィルタを使用してインライン（搾乳場）でろ過して、酵素の流れの無菌性を確保した後に、乳の流れと混合する。従って、インラインで導入されたフィルタに、濾過性が低い酵素製剤が詰まる場合があり、操作に多くの支障をきたす場合がることから、問題が生じる可能性がある。酵素製剤の濾過性が期待通りに機能する場合であっても、依然として、フィルタを定期的に（通常は毎日）交換する必要がある。
【0006】
バッチ投与プロセス及び無菌投与プロセスの両方における上記の制限全てを克服する、ラクトースフリーのＵＨＴ製品及びＥＳＬ製品でラクターゼを適用することの迅速でスムーズであり、実装が容易であり、トラブルフリーであり、コスト効率がよい解決策は、まだ存在していない。
【0007】
国際公開第２００９／０７１５３９号パンフレット（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）は、ラクターゼ活性を有する酵素を使用して乳製品を製造する方法に関する。開示されているのは、高温（即ち、少なくとも６０℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃、少なくとも６７℃、少なくとも７０℃、又は少なくとも７５℃）にて、ラクトースで乳由来基質を処理することにより、低ラクトース乳製品を製造する方法である。
【0008】
国際公開第２０１８／１８９２３８号パンフレット（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ）では、広範囲の温度及びｐＨ値にて比較的高い活性で安定していると言われているベータ－ガラクトシダーゼが開示されている。開示されているのは、乳ベースの基質をベータ－ガラクトシダーゼで処理することにより乳製品を製造する方法であって、この処理、又はこの処理の一部を、高温で行ない得る、方法である。ベータ－ガラクトシダーゼの添加後３～３０分で、ラクトース濃度が０．２％未満のラクトースになり得る。
【0009】
国際公開第２０２０／１７６７３４号パンフレット（ＤｕＰｏｎｔ）は、高温で乳由来基質とラクターゼ（例えば、耐熱性ラクターゼ）とを接触させることにより、この基質中のラクトースの量を低減する方法に関する。開示されているのは、中性ラクターゼ活性を有する酵素により乳由来基質からラクトースフリー乳製品を製造する方法であって、１５秒にわたる７２℃での低温殺菌後に、この乳由来基質中に２０％超のラクターゼ活性が残存している、方法である。そのような低温殺菌はまた、高温短時間（ＨＴＳＴ）低温殺菌とも称されることがある。
【0010】
米国特許出願公開第２０１０／０２１５８２８号明細書は、保存性に優れる低ラクトースの、ラクトースフリーの、又は炭水化物フリーの乳製品を調製する方法であって、糖及びタンパク質を別々の画分に分離し、少なくともタンパク質画分を加熱処理して、天然プラスミン酵素系、及び他の有害酵素を不活性化し、タンパク質画分及び糖画分を、（メイラード反応を回避するために）別々に加熱処理し、１つ又は複数の画分を組み合わせて、所望の組成及び甘味を有する乳製品を得る、方法に関する。加熱処理を、低温殺菌により実施し得るか、高温低温殺菌により実施し得るか、ＥＳＬ処理を使用して実施し得るか、又はＵＨＴ処理を使用して実施し得る。必要に応じて、糖画分中のラクトースを、加水分解し得る。ラクターゼを使用する加水分解に続いて、３７℃で４時間にわたりインキュベートした後に、加熱処理する。
【0011】
米国特許出願公開第２０１３／０１４２９０４号明細書（Ａｒｌａ）は、包装された、ラクトースが低減された乳関連製品を製造する方法であって、ラクトースが低減された乳関連飼料を高温処理に供して包装する、方法に関する。
【0012】
Ｄｅｅｔｈ（２０１７）“Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｓｈｅｌｆ－Ｌｉｆｅ（ＥＳＬ）Ｍｉｌｋ”，Ｆｏｏｄｓ ６（１１）：１０２では、長期保存可能期間（ＥＳＬ）乳の最適な加熱処理が概説されている。Ｄｅｅｔｈは、ＥＳＬ乳又は超低温殺菌乳が、従来の高温短時間（ＨＴＳＴ）低温殺菌で使用されるものと、超高温（ＵＨＴ）殺菌に使用されるものとの間の条件を使用する加熱処理により製造されることを説明している。ＥＳＬ乳は、３０日超の冷蔵保存可能期間を有すべきである。このことを達成するために、加熱処理は、かなり強力でなければならない。ほとんどの国では少なくとも１５秒にわたる少なくとも７２℃と指定されている低温殺菌の温度－時間条件とは異なり、ＥＳＬ処理に関しては、一般に、そのような条件は指定されていない。Ｄｅｅｔｈ（２０１７）によれば、報告されているＥＳＬ乳の商業的な処理条件は、ほとんどが、１～５秒にわたる１２３～１２７℃の範囲である。米国の規制では、「超低温殺菌」のプロセスは、少なくとも２秒わたる少なくとも１３８℃での乳の加熱と定義されている。
【0013】
ＵＨＴ処理は、例えば、１３０℃で３０秒にわたる加熱処理であり得るか、１４０℃で３～４秒にわたる加熱処理であり得るか、又は１４５℃で１秒にわたる加熱処理であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明は、乳由来基質と、ラクターゼ活性を有する酵素との広範囲なプレインキュベーションを実施する必要がなく、且つ加熱処理後に酵素を添加するための無菌投与システムを使用する必要がなく、この酵素を使用して、ラクターゼが低減された加熱処理乳由来製品（例えば、乳）を製造する方法を提供する。
【0015】
本発明は、ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、
ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）前記酵素の添加後、少なくとも１秒間の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で前記乳由来基質を保持することにより、乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日にわたり、例えば少なくとも３日にわたり、より好ましくは少なくとも４日にわたり、加熱処理乳由来製品を保存すること
を含み、
工程ｃ）の後に、乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法を提供する。
ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）前記酵素の添加後、少なくとも１秒間の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で前記乳由来基質を保持することにより、乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日にわたり、例えば少なくとも３日にわたり、より好ましくは少なくとも４日にわたり、加熱処理乳由来製品を保存すること
を含み、
工程ｃ）の後に、乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法を提供する。
【0016】
好ましくは、工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、乳由来製品のラクトース含有量は、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）である。
【0017】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素を、加熱処置（例えば、ＵＨＴ処理）の直前に投与する。加熱処理（例えば、ＵＨＴ処理）後、この酵素は、低温又は周囲温度での保存中に、所望の低ラクトースレベルまでラクトースを確実に分解する、ある程度の残存活性を有する。好ましくは、この酵素は、最適温度が３０～６０℃であり、より好ましくは３５～５５℃である。理論に拘束されることを望まないが、最適温度がより高く、おそらく加熱処理中であっても活性である酵素は、やや硬い構造を有し、且つ低温又は周囲温度での保存中に十分な活性を有していないだろう。再度理論に拘束されることを望まないが、本発明の方法で使用される、最適温度が３０～６０℃であり、より好ましくは３５～５５℃である酵素は、加熱処理中に折り畳まれず不活性であり得るが、その後に再び折り畳まれて再活性化される能力を有しており、従って、乳由来製品の保存中にラクトースを確実に分解する測定可能な又は実質的な残存活性を有する。ＵＨＴ処理等の加熱処理後の本発明のラクターゼ酵素のかなり高い残存活性は、温度が下がると再び折り畳んで再活性化される能力に起因し得ると考えられる。
【0018】
好ましくは、酵素は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃での、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中におけるインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後に、残存活性が、少なくとも０．５％であり、好ましくは少なくとも１％、少なくとも２％、又は少なくとも３％であり、より好ましくは少なくとも５％であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％であり、この残存活性は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃でのインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションを行なわない脱脂乳中における同一の酵素の活性に対して相対的である。
【0019】
好ましくは、乳由来基質を、ラクターゼの添加から乳由来基質が加熱処理の保持温度に達するまでの時間（プロセス装置による）を除いて、加熱処理前に、ラクターゼと共にインキュベートしない。好ましくは、工程ｂ）を、専用のインキュベーション工程を行なうことなく、工程ａ）の直後に実施する。
【0020】
本方法に従って、下記の少なくとも３つの主要なプロセスオプションを適用し得る。
【0021】
第１のオプションでは、乳由来基質をラクターゼと混合し、次いで、この乳由来基質をラクターゼと共にインキュベートする必要なく、ＵＨＴ条件又はＥＳＬ条件下で直接処理し得る。
【0022】
第２のオプションでは、乳由来基質を、ＵＨＴ条件又はＥＳＬ条件下直接処理し得、この場合、乳由来基質が、加熱処理工程直前にプロセスパイプを通って流れている間に、任意選択的に、乳由来基質の温度が、加熱処理工程の温度に向かって上昇している間に、この乳由来基質にラクターゼを添加する。ラクターゼを、ＵＨＴ／ＥＳＬ処理の直前に、乳由来基質の温度が１～９５℃であり、好ましくは７０～９０℃である任意の時点で添加し得る。ラクターゼの添加を、主要な乳流チューブに接続されているチューブを介して、単純な投与ポンプにより行ない得る。乳由来基質の流れに添加すると、温度は、ＥＳＬ又はＵＨＴ処理条件まで（さらに）上昇する。乳由来基質には直接接触せず、装置の接触面により分離されている加熱媒体（例えば、プレート熱交換器又はチューブ熱交換器）を使用し得る。このことは、間接加熱処理（好ましくは、間接ＵＨＴ処理）と称され得る。
【0023】
第３のオプションでは、加熱処理を、高圧蒸気を使用するスチームインジェクション又はスチームインフュージョン（好ましくは、スチームインジェクション）により実施して、乳由来基質を加熱し、酵素を、蒸気と共に添加し得る。このことは、直接加熱処理（好ましくは、直接ＵＨＴ処理）と称され得る。工程ｂ）の保持時間の後に、蒸気を含む乳由来基質を真空中でフラッシュ冷却して、使用した凝縮蒸気の量に相当する水を除去し得る。スチームインジェクション又はスチームインフュージョンによる乳由来基質の加熱に加えて、例えば、プレート熱交換器又はチューブ熱交換器を使用して、間接加熱も適用し得る。
【0024】
いずれの場合でも、加熱処理後のラクターゼの残存活性により、保存の初期段階（例えば、最高２週間、例えば、最初の２又は３日間）中に、ラクトースレベルが、ラクトースが低減されたレベルまで確実に低下し、好ましくはラクトースフリーレベル（例えば、０．１％未満、又は０．０１％未満）まで確実に低下する。
【0025】
本発明の方法には、ＥＳＬ乳又はＵＨＴ乳等のＥＳＬ処理乳由来製品及びＵＨＴ処理乳由来製品の製造に今日使用されているプロセスと比べて、多くの利点がある。
【0026】
今日適用されているバッチプロセスと比較して、本発明のプロセスにより、メイラード反応の低減に起因して、ラクトースが低減されているか又はラクトースフリーの乳由来製品の色及び品質が改善される。プレインキュベーションを行なうことなく、加熱処理を生き残る可能性がある、プロテアーゼ等の酵素を分泌する向精神菌（ｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖が低減され、従って、乳由来製品は、保存可能期間がより長くなり得る。さらに、プレインキュベーションを行なわないことから、容量コスト及びプロセス時間が削減される。本発明の方法はまた、ラクトースレベルが０．１％又は０．０１％を下回るまでタンクをモニタリングする必要がないことから、操作も容易である。
【0027】
今日適用されている無菌投与プロセスと比較して、本発明のプロセスでは、無菌投与装置に投資する必要がなく、且つ例えば、無菌バケツを定期的に交換する必要がない。さらに、現在の無菌ラクターゼは、保存可能期間が約１年であるが、本発明の方法で使用される酵素は、保存可能期間が２年以上であり得る。本発明の方法は、無菌投与システムのいずれかのモニタリング又はトラブルシューティングを行なう必要がないことから、操作が容易であり、手間がかからない。乳由来基質の最終品質は、色及びメイラード反応に関して同じである。
【0028】
本発明の方法は、工業レベルでの適用が容易であり、且つこの実施には障害がない。
【0029】
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＡＺｙデータベースＧＨ２ファミリクレードＤＹＬＧＥ由来のラクターゼ酵素が、本発明の方法で使用するのに特に適していることを発見している。従って、好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、クレードＤＹＬＧＥ由来のＧＨ２ラクターゼであり、好ましくは、クレードＤＹＬＧＥ由来の細菌性ＧＨ２ラクターゼである。
【0030】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、そのアミノ酸配列中に、モチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］を含む。
【0031】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、そのアミノ酸配列中に、モチーフＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ及び／又は［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤを含む。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（配列番号１）の用量反応曲線を示す。Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼを、下記の投与量で脱脂乳に添加し：脱脂乳１リットル当たり酵素タンパク質（ｅｐ）２．０３、１．６３、１．３０、１．０４、０．８３２、０．６６６、０．５３２、０．４２６、０．３４１、０．２７３、０．２１８、０．１７４、０．１４０、０．１１２、０．０８９３、０．０７１５ｍｇ、（ＵＨＴ処理を行なうことなく）２３℃で３日にわたりインキュベートした。各サンプルの残存ラクトースを、％（脱脂乳 １００ｍｌ当たりのラクトース ｇ）で決定し、用量／反応曲線を作成した。この曲線を使用して、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの活性に対する％でのＵＨＴ処理ラクターゼの相対活性を決定し得る。試験するラクターゼを、脱脂乳１リットル当たりラクターゼｅｐ ｘｍｇの投与量で脱脂乳に添加し、ＵＨＴ処理を実施し、続いて２３℃で３日にわたりインキュベートし、残存ラクトースを％（脱脂乳 １００ｍｌ当たりのラクトース ｇ）で決定する。用量／反応曲線を使用して、２３℃での３日にわたる脱脂乳中でのインキュベーション後に同一の残存ラクトースが得られるであろう非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの「対応する投与量」ｙ（脱脂乳 １リットル当たりのラクターゼｅｐ ｍｇ）を決定する。非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの活性に対する％でのＵＨＴ処理ラクターゼの相対活性を、ｙ／ｘ＊１００％として算出する。
【発明を実施するための形態】
【0033】
定義
この詳細な説明に従って、下記の定義が適用される。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。
この詳細な説明に従って、下記の定義が適用される。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。
【0034】
別途定義されない限り、又は文脈によって明確に指示されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【0035】
ＧＨ２ラクターゼ：本発明に関連する「ＧＨ２ラクターゼ」、「ＧＨ２酵素」、又は「ＧＨ２ポリペプチド」という用語は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺｙｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）においてグリコシドヒドロラーゼファミリ２のメンバーとして分類されているラクターゼ酵素を意味する。
【0036】
単離された：「単離された」という用語は、ポリペプチド、核酸、細胞、又は他の特定の物質若しくは構成成分であって、他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない少なくとも１種の他の物質又は構成成分から分離されてるものを意味する。そのため、単離されたポリペプチド、核酸、細胞、又は他の物質は、天然には存在していない形態である。単離されたポリペプチドとして、宿主細胞中で発現されて分泌されたポリペプチドを含有する培養ブロスが挙げられるが、これに限定されない。
【0037】
ラクターゼ：「ラクターゼ」という用語は、二糖であるラクトースを構成成分であるガラクトース単量体及びグルコース単量体に加水分解する能力を有するグリコシドヒドロラーゼを意味する。ラクターゼのグループは、サブクラスＥＣ３．２．１．２３及びＥＣ３．２．１．１０８に割り当てられる酵素を含むが、これらに限定されない。例えばＥＣ３．２．１．２１等の他のサブクラスに割り当てられる酵素も、本発明に関連するクターゼであり得る。本発明に関連するラクターゼは、例えばトランスガラクトシル化活性等のラクトース加水分解活性以外の活性を有し得る。本発明に関連して、ラクターゼのラクトース加水分解活性は、そのラクターゼ活性、そのベータガラクトシダーゼ活性、又はその加水分解活性と称され得る。
【0038】
ラクターゼ活性：ラクターゼ活性を、例えばＬＡＵ（Ｂ）アッセイを使用して決定し得る。特定のラクターゼのＬＡＵ（Ｂ）中の活性を、ｐＨ６．５及び３０℃での、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、４５０ｍｇ／Ｌ Ｂｒｉｊ ３５中に１．４６ｍｇ／ｍｌ 基質を含む緩衝液中におけるｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）から放出されるｏ－ニトロフェニル（ＯＮＰ）の直接測定により決定し得る。６００秒間のインキュベーション後、この反応を、０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を添加することにより停止させ、１２６秒間のインキュベーションの後に、放出されたＯＮＰを４０５ｎｍで測定する。活性を、活性が既知のラクターゼで実行された標準曲線と比較することにより得られ、これから、未知のサンプルの活性を算出する。活性が既知のラクターゼは、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから得られるＳａｐｈｅｒａ（登録商標）であり得る。ラクターゼ活性を、乳中のラクトース加水分解の量を測定することにより決定し得、例えば、ラクトースピークが既知の濃度のラクトース標準に関連付けられているＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを使用する「残存ラクトース含有量の分析」段落で実施例４において説明されている方法により決定し得る。次いで、ラクトース加水分解を、添加したラクターゼの量（例えば、酵素タンパク質１ｍｇ当たりの量、又は酵素１モル当たりの量）に関連付け得る。ラクターゼ活性を測定する他の方法も既知であり、当技術分野で日常的に使用されている。
【0039】
成熟ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング及び／又はＣ末端プロセシング（例えば、シグナルペプチドの除去）の後の成熟した形態のポリペプチドを意味する。
【0040】
乳：「乳」という意味は、あらゆる哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、又はラクダ）の搾乳により得られる乳分泌物を意味する。
【0041】
乳由来製品：「乳由来製品」という用語は、乳をベースとする乳製品及び他の製品を指す。本文脈では、この用語は、特に加熱処理乳由来製品を含むことが明らかであり、この加熱処理乳由来製品として、低温殺菌乳だけでなく、低温殺菌で典型的に使用されるものと比べて高温に供される乳（例えば、超低温殺菌乳、ＵＨＴ（超高温）乳、及びＥＳＬ（長期保存可能期間）乳）も挙げられる。
【0042】
精製された：「精製された」という用語は、当技術分野で公知の分析技術により決定された場合に、他の構成成分を実質的に含まない核酸、ポリペプチド、又は細胞を意味する（例えば、精製されたポリペプチド又は核酸は、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離に供された媒体中で、分離したバンドを形成し得る）。精製された核酸又はポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、又はより純粋（例えば、重量又はモル濃度基準のパーセント）である。関連する意味において、組成物は、精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度の実質的な増加がある場合には、この分子に関して濃縮されている。「濃縮された」という用語は、出発組成物と比べて高い相対濃度又は絶対濃度で組成物中に存在している化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の指定の物質若しくは構成成分を指す。
【0043】
一態様では、「精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、産生生物由来の構成成分（特に、不溶性構成成分）を本質的に含まないポリペプチド又は細胞を指す。他の態様では、「精製された」という用語は、ポリペプチドであって、このポリペプチドが得られる天然生物由来の不溶性構成成分（特に不溶性構成成分）を本質的に含まないポリペプチドを指す。一態様では、ポリペプチドは、このポリペプチドが回収される生物及び培養培地の可能性構成成分の一部から分離されている。ポリペプチドを、単位操作であるろ過、沈殿、又はクロマトグラフィー内の１つ又は複数により精製し得る（即ち、分離し得る）。
【0044】
従って、ポリペプチドを、存在する他のタンパク質（具体的には、他のポリペプチド）がほんのわずかな量であるように精製し得る。「精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの起源の細胞中に存在している他の構成成分（具体的には、他のタンパク質、最も具体的には、他の酵素）の除去を指し得る。ポリペプチドは、「実質的に純粋」であり得、即ち、このポリペプチドを産生する生物（例えば、組換えにより産生されたポリペプチドの場合には宿主生物）由来の他の構成成分を含み得ない。一態様では、ポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の重量で少なくとも４０％純粋である。一態様では、ポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の重量で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％純粋である。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、このポリペプチドが天然に又は組換えにより会合している他のポリペプチド物質を重量で最高１０％含み、好ましくは最高８％含み、より好ましくは最高６％含み、より好ましくは最高５％含み、より好ましくは最高４％含み、より好ましくは最高３％含み、さらにより好ましくは最高２％含み、最も好ましくは最高１％含み、さらに最も好ましくは最高５％を含むポリペプチド調製物を指し得る。
【0045】
従って、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の重量で少なくとも９２％純粋であり、好ましくは少なくとも９４％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９６％純粋であり、より好ましくは少なくとも９７％純粋であり、より好ましくは少なくとも９８％純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも９９％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９．５％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態である（即ち、調製物は、天然に又は組換えにより会合している他のポリペプチド物質を本質的に含まない）。このことは、例えば、公知の組換え方法又は古典的な精製方法によりポリペプチドを調製することによって達成され得る。
【0046】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータにより説明される。
【0047】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン６．６．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３－４５３）を使用して、「最長の同一性」の出力として決定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティが１０であり、ギャップエクステンションペナルティが０．５であり、そしてＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅプログラムが最長の同一性を報告するために、ｎｏｂｒｉｅｆオプションをコマンドラインで指定しなければならない。「最長の同一性」と標識されるＮｅｅｄｌｅの出力は、下記のように算出される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの合計数）。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの合計数）。
【0048】
バリアント：「バリアント」という用語は、ラクターゼ活性を有するポリペプチドであって、１箇所又は複数箇所の位置で人為的変異（即ち、置換、挿入（伸長を含む）、及び／又は欠失（例えばトランケーション））を含むポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味しており；欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味しており；挿入は、ある位置を占めるアミノ酸に隣接しており且つその直後に続く１～５個のアミノ酸（例えば、１～３個のアミノ酸、具体的には１個のアミノ酸）の付加を意味する。
【0049】
野生型：アミノ酸配列又は核酸配列に関する「野生型」という用語は、アミノ酸配列又は核酸配列が天然の配列又は天然に存在する配列であることを意味する。本明細書で使用される場合、「天然に存在する」という用語は、自然界で見出されるもの（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）を指す。逆に、「天然には存在しない」という用語は、自然界では見出されないもの（例えば、研究室で生成された組換え核酸及びタンパク質配列、又は野生型配列の改変）を指す。
【0050】
バリアントの命名のための規約：
本発明の目的のために、選択された野生型配列を有するポリペプチドを使用して、別のラクターゼの対応するアミノ酸位置を決定し得る。別のラクターゼのアミノ酸配列を、選択された野生型配列を有するポリペプチドとアラインさせ、このアラインメントに基づいて、選択された野生型配列を有するポリペプチド内の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ；Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６；２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３－４５３）を使用して決定する。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティが１０であり、ギャップエクステンションペナルティが０．５であり、そしてＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
本発明の目的のために、選択された野生型配列を有するポリペプチドを使用して、別のラクターゼの対応するアミノ酸位置を決定し得る。別のラクターゼのアミノ酸配列を、選択された野生型配列を有するポリペプチドとアラインさせ、このアラインメントに基づいて、選択された野生型配列を有するポリペプチド内の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ；Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６；２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３－４５３）を使用して決定する。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティが１０であり、ギャップエクステンションペナルティが０．５であり、そしてＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【0051】
本発明のバリアントの説明では、参照を容易にするために、下記で説明する命名法が適応される。承認されたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字のアミノ酸略号が採用される。本明細書で開示されているバリアントのアミノ酸ナンバリングは、いずれの場合においても、関連する野生型配列のナンバリングに基づく。
【0052】
アミノ酸置換に関して、下記の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、２２６位でのスレオニンのアラニンへの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と命名される。複数の変異は、追加の印（「＋」）又は単にスペースで区切られており、例えば、２０５位及び４１１位でのグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）への置換及びセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換は、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」、「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」、又は「Ｇ２０５Ｒ Ｓ４１１Ｆ」と表され得る。
【0053】
本発明の詳細な説明
本発明は、ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、
ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）この酵素の添加後、少なくとも１秒間の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で乳由来基質を保持することにより、乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日にわたり、例えば少なくとも３日にわたり、より好ましくは少なくとも４日にわたり、加熱処理乳由来製品を保存すること
を含み、
工程のｃ）の後に、乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法を提供する。
本発明は、ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、
ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）この酵素の添加後、少なくとも１秒間の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で乳由来基質を保持することにより、乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日にわたり、例えば少なくとも３日にわたり、より好ましくは少なくとも４日にわたり、加熱処理乳由来製品を保存すること
を含み、
工程のｃ）の後に、乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法を提供する。
【0054】
好ましくは、工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、乳由来製品のラクトース含有量は、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）である。
【0055】
乳由来基質は、好ましくは、２～３０％のラクトースを含み、好ましくは２～１７％（ｗ／ｗ）のラクトースを含み、より好ましくは４～５．５％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む。
【0056】
乳由来基質は、任意の生乳及び／又は加工乳原料であり得る。有用な乳由来基質として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ラクトースを含む任意の乳又は乳様製品の溶液／懸濁液、例えば、全乳又は低脂肪乳、脱脂乳、バターミルク、フレーバーミルク、例えばチョコレートミルク、還元乳粉末、練乳、ドライミルクの溶液、脱脂粉乳を含む乳、ミルクパーミエート、ホエー、ホエーパーミエート、酸ホエー、又はクリーム。
【0057】
乳由来基質は、乳であり得、例えば、生乳（例えば、工程ａ）の前に低温殺菌されていない生乳）であり得る。
【0058】
好ましい実施形態では、乳由来基質は、乳、練乳、又は脱脂粉乳を含む乳である。
【0059】
より好ましい実施形態では、乳由来基質は、４．５～５％（好ましくは４．５～５％）（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳である。
【0060】
一実施形態では、乳由来基質は、生乳であり、好ましくは、工程ａの前に低温殺菌されていない生乳である。
【0061】
一実施形態では、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、乳由来基質を、最高４時間にわたりインキュベートし、好ましくは最高６０分にわたりインキュベートし、より好ましくは最高１０分にわたりインキュベートし、さらにより好ましくは最高５分にわたりインキュベートする。そのようなインキュベーションを、最高１０℃の温度で実施し得、好ましくは最高７℃の温度で実施し得る。
【0062】
しかしながら、好ましくは、工程ｂ）を、専用のインキュベーション工程を行なうことなく、工程ａ）の直後に実施する。
【0063】
好ましくは、酵素の添加から工程ｂ）の保持温度に達するまでの時間は、最高５分であり、より好ましくは最高２分であり、さらにより好ましくは最高１分である。
【0064】
好ましい実施形態では、加熱処理を、間接加熱処理として実施し、好ましくは間接ＵＨＴ処理として実施する。乳由来基質が、プロセスパイプ等のプロセス装置を通って流れている間に、前記乳由来基質に酵素を添加するために、ポンプ装置が設置されている場合がある。乳由来基質には直接接触せず、装置の接触面により分離されている加熱媒体（例えば、プレート熱交換器又はチューブ熱交換器）を使用し得る。好ましくは、任意選択的に乳由来基質の温度が工程ｂ）の保持温度に向かって上昇している間に、加熱処理工程の直前（例えば、保持温度に到達する直前）に、酵素を乳由来基質に添加する。
【0065】
別の好ましい実施形態では、加熱処理を、直接加熱処理として実施し、好ましくは直接ＵＨＴ処理として実施する。この加熱処理を、高圧蒸気を使用するスチームインジェクション又はスチームインフュージョンにより実施し、好ましくはスチームインジェクションにより実施して、乳由来基質を加熱し得る。好ましい実施形態では、酵素を、蒸気と共に添加する。好ましくは、ｂ）の保持時間の後に、蒸気を含む乳由来基質を真空中でフラッシュ冷却して、使用した凝縮蒸気の量に相当する水を除去する。
【0066】
直接間接処理と間接加熱処理との組み合わせも、使用し得る。
【0067】
加熱処理は、ＥＳＬ処理、超低温殺菌、又はＵＨＬ処理であり得る。
【0068】
加熱処理を、１２０～１５０℃の温度で実施し得る。
【0069】
一実施形態では、加熱処理を、少なくとも１２３℃の温度で実施し、好ましくは１２３～１４５℃の温度で実施する。
【0070】
一実施形態では、加熱処理を、少なくとも１３０℃の温度で実施し、好ましくは１３０～１４５℃の温度で実施する。
【0071】
一実施形態では、加熱処理を、少なくとも１３８℃の温度で実施し、好ましくは１３８～１４５℃の温度で実施し、より好ましくは１３８～１４２℃の温度で実施する。
【0072】
工程ｂ）の保持時間は、１～３０秒であり得、好ましくは１～１０秒であり得、より好ましくは１～５秒であり得る。
【0073】
一実施形態では、加熱処理は、ＵＨＴ処理であり、好ましくは、１～３０秒の時間にわたり１３０～１４５℃の温度で実施され、より好ましくは、１～１０秒の時間にわたり１３８～１４５℃の温度で実施され、さらにより好ましくは、１～５秒の時間にわたり１３８～１４４℃の温度で実施されるＵＨＴ処理である。
【0074】
一実施形態では、加熱処理は、２５～３５秒にわたり１２８～１３２℃の温度で実施するか、２～５秒にわたり１３８～１４０℃の温度で実施するか、又は０．５～２秒にわたり１４４～１４６℃の温度で実施するＵＨＴ処理である。
【0075】
一実施形態では、加熱処理は、ＥＳＬ処理又は超低温殺菌であり、好ましくは、１～５秒の時間にわたり１２０～１４０℃の温度で実施するＥＳＬ処理又は超低温殺菌であり、より好ましくは、１～５秒にわたり１２０～１３０℃の温度で実施するか又は２～４秒にわたり１３８～１４０℃の温度で実施するＥＳＬ処理又は超低温殺菌である。
【0076】
好ましくは、工程ｂ）の後に、例えば、工程ｂ）の保持時間の後に、乳由来製品に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加しない。より好ましくは、工程ｂ）の後に、例えば、工程ｂ）の保持時間の後に、乳由来製品に酵素を添加しない。さらにより好ましくは、工程ｂ）の後に、例えば、工程ｂ）の保持時間の後に、乳由来製品に何も添加しない。この理由は、加熱処理後に、乳由来製品は無菌であり、たとえ無菌であると見なされるものであっても何かを添加することは、この製品が汚染されるリスクとなるからである。
【0077】
工程ｂ）の保持時間の後に、乳由来製品を、好ましくは５分以内に、より好ましくは３分以内に、さらにより好ましくは２分以内に、例えば１分以内に、最高４０℃まで冷却し、好ましくは最高３５℃まで冷却し、より好ましくは最高３０℃まで冷却する。
【0078】
好ましくは、酵素の添加から、加熱処理乳由来製品が最高４０℃の温度まで冷却されており、好ましくは最高３５℃の温度まで冷却されており、より好ましくは最高３０℃の温度まで冷却されているまでの時間は、最高３．５分であり、好ましくは最高３分であり、より好ましくは最高２．５分であり、例えば最高２分であるか、又は最高１分である。
【0079】
工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、乳由来製品を均質化し得る。
【0080】
或いは、均質化を、工程ｂ）の保持温度に達する前に実施し得る。間接ＵＨＴ処理（例えば、チューブ交換又はプレート交換）では、均質化を、好ましくは上流で実施する。直接ＵＨＴ処理（例えば、スチームインジェクション又はスチームインフュージョン）では、均質化を、好ましくは下流で実施する。
【0081】
好ましくは、工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、乳由来製品を無菌的に包装する。
【0082】
好ましい実施形態では、乳由来製品は、ＵＨＴ乳である。本発明に関連するＵＨＴ乳とは、細菌胞子を含む全ての微生物を死滅させることが意図されている滅菌手順に供されている乳のことである。
【0083】
好ましくは、工程ｂ）が完了した場合に、ラクトースの８０％未満が加水分解されており、１週間後に、ラクトースの９０％超が加水分解されている。より好ましくは、工程ｂ）が完了した場合に、ラクトースの６０％未満が加水分解されており、１週間後に、ラクトースの９５％超が加水分解されている。
【0084】
好ましくは、工程ｂ）の後に、酵素は、この酵素の初期活性の少なくとも０．０１％を保持しており、より好ましくは少なくとも０．１％を保持しており、より好ましくは少なくとも１％を保持しており、より好ましくは少なくとも２％を保持しており、より好ましくは少なくとも１０％を保持しており、より好ましくは少なくとも５０％を保持しており、さらにより好ましくは少なくとも８０％を保持しており、最も好ましくは少なくとも９０％を保持している。酵素を添加した場合の酵素活性に対する百分率での、工程ｂ）の後に保持されている酵素活性を、例えば、本実施例の「残存活性アッセイ」を使用して決定し得る。
【0085】
好ましくは、工程ｃ）を、２～４０℃の温度で実施し、好ましくは１５～４０℃の温度で実施し、より好ましくは１８～４０℃の温度で実施し、最も好ましくは１８～３０℃の温度で実施する。好ましい実施形態では、工程ｃ）を、保存期間中に変動し得る室温で実施する。
【0086】
好ましい実施形態では、工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、乳由来製品のラクトース含有量は、少なくとも１％（ｗ／ｗ）であり、例えば、少なくとも２％（ｗ／ｗ）、少なくとも３％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも４％（ｗ／ｗ）である。
【0087】
別の好ましい実施形態では、工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、最高８０％低減されており、好ましくは最高５０％低減されており、より好ましくは最高２０％低減されている。
【0088】
工程ｃ）では、加熱処理乳由来製品を、少なくとも２４時間にわたり保存し、好ましくは少なくとも２日（例えば、少なくとも３日）にわたり保存し、より好ましくは少なくとも４日（例えば、少なくとも７日）にわたり保存し、さらにより好ましくは少なくとも１４日（例えば、少なくとも２１日）にわたり保存する。ラクターゼの残存活性によりラクトースレベルが所望のレベルまで低下するのは、主にこの保存期間中である。
【0089】
好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２１日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0090】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、１４日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0091】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、７日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0092】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、４日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0093】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、３日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0094】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0095】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２４時間にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である。
【0096】
好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２１日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0097】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、１４日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0098】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、７日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0099】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、４日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0100】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、３日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0101】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0102】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２４時間にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％低減されている。
【0103】
好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２１日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0104】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、１４日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0105】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、７日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0106】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、４日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0107】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、３日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0108】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２日にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0109】
別の好ましい実施形態では、２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２４時間にわたり加熱処理乳由来製品を保存した後に、この乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである。
【0110】
工程ｃ）の後、ラクトースが低減された加熱処理乳製品を、必要に応じて凍結乾燥させ得る。
【0111】
ラクターゼ活性を有する酵素を、乳由来基質 １リットル当たり１００～５０，０００ＬＡＵ（Ｂ）の濃度で添加し得、好ましくは５００～４０，０００ＬＡＵ（Ｂ）の濃度で添加し得る。
【0112】
ラクターゼ活性を有する酵素を、乳由来基質 １リットル当たり酵素タンパク質 １～１５０ｍｇの濃度で添加し得、好ましくは、乳由来基質 １リットル当たり酵素タンパク質 １～１００ｍｇの濃度で添加し得、より好ましくは、乳由来基質 １リットル当たり酵素タンパク質 ２～５０又は５～５０ｍｇの濃度で添加し得る。
【0113】
工程ｂ）の前に、乳由来基質に還元剤を添加し得、好ましくは、食品用に認可されている還元剤を添加し得、より好ましくは、Ｌ－システイン、亜硫酸塩、及びグルタチオンから選択される還元剤を添加し得る。還元剤を、酵素と共に添加し得、例えば、還元剤は、酵素製剤の一部であり得る。還元剤を添加して、例えば、ジスルフィド架橋の一部を形成していないラクターゼ酵素中のシステイン（「遊離システイン」と称されることもある）の酸化を低下させ得るか、又は防止し得る。そのような遊離システインの酸化により、ＵＨＴ処理等の加熱処理後に、酵素が再び折り畳む能力が低下する場合がる。
【0114】
配列番号１のラクターゼ酵素は、Ｃ３７２位で遊離システイン残基を有しており、この酸化により、この酵素が再び折り畳む能力が低下することが分かっており、対応するシステイン残基を、クレードＤＹＬＧＥの多くの他のＧＨ２ラクターゼ酵素において、これらのアミノ酸配列と配列番号１とをアラインすることにより同定し得る。好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１のＣ３７２に対応するシステインのアミノ酸置換を有しており、好ましくは、セリン、アラニン、又はグリシンへのアミノ酸置換を有する。
【0115】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素は、ラクターゼである。好ましくは、この酵素は、酵素クラス３．２．１．２１、３．２．１．２３、又は３．２．１．１０８に属しており、より好ましくは３．２．１．２３又は３．２．１．１０８に属している。
【0116】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、中性ラクターゼである。
【0117】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、精製されている。
【0118】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、単離されている。
【0119】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素は、細菌性ラクターゼである。
【0120】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素は、ＧＨ２ラクターゼであり、より好ましくは、クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ラクターゼである。１９９８年からオンライン化されているＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）は、炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙｍｅ）をファミリに分類する専門データベースである（Ｌｏｍｂａｒｄ Ｖ，Ｇｏｌａｃｏｎｄａ Ｒａｍｕｌｕ Ｈ，Ｄｒｕｌａ Ｅ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ＰＭ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ（２０１４）Ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ （ＣＡＺｙ），２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２：Ｄ４９０－Ｄ４９５；Ｅｌｏｄｉｅ Ｄｒｕｌａ，Ｍａｒｉｅ－Ｌｉｎｅ Ｇａｒｒｏｎ，Ｓｕｚａｎ Ｄｏｇａｎ，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｔｅｒｒａｐｏｎ，Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ５０，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１，７ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２２，Ｐａｇｅｓ Ｄ５７１－Ｄ５７７）。
【0121】
グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリは、グリコシド結合の加水分解及び／又は転位を触媒する酵素からなり、これらは、ＧＨ２等の（サブ）ファミリにさらに分類され、これらも先と同様に、配列モチーフに基づいてクレードへと細分化され得る。クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２に分類されるラクターゼは、加熱処理後に活性を保持することに特に優れており、従って、本発明の方法に特に適していることが、本発明者らにより発見されている。
【0122】
ＤＹＬＧＥクレードのＧＨ２ラクターゼは、モチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］を含む。このモチーフ中のグルタミン酸Ｅは、ガラクトースの結合に関与している。ＤＹＬＧＥクレードのラクターゼはまた、追加の短いペプチドモチーフＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ及び／又は［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤも含み得、これらは両方とも、ＧＨ２ Ｎ末端ガラクトース結合ドメインに位置しており、基質結合に重要である。
【0123】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、そのアミノ酸配列中に、モチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］を含む。
【0124】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、そのアミノ酸配列中に、モチーフＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ及び／又は［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤを含む。
【0125】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素は、最適温度が３０～６０℃であり、好ましくは３５～５５℃である。この最適温度を、実施例２の方法２を使用して決定し得る。
【0126】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素は、ｐＨ６での熱シフトにより決定される融点Ｔｍが５０～７０℃である。別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ｐＨ７での熱シフトにより決定される融点Ｔｍが５０～７０℃である。この融点Ｔｍを、実施例５の熱シフトアッセイを使用して決定し得る。
【0127】
好ましくは、ラクターゼ活性を有する酵素は、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中における、３０秒にわたる７０℃及び５秒にわたる１４０℃でのインキュベーション後に、残存活性が少なくとも１％であり、好ましくは少なくとも２％であり、より好ましくは少なくとも５％であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％である。この残存活性を、実施例３と同様に決定し得る。
【0128】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５の内のいずれか、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドと少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0129】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0130】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号４と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0131】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号５と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0132】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号６と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0133】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0134】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所若しくは複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／若しくは挿入を有しており、例えば、１、若しくは２、若しくは３、若しくは４、若しくは５、若しくは６、若しくは７、若しくは８、若しくは９、若しくは１０、若しくは１１、若しくは１２、若しくは１３、若しくは１４、若しくは１５、若しくは１６、若しくは１７、若しくは１８、若しくは１９、若しくは２０、若しくは２１、若しくは２２、若しくは２３、若しくは２４、若しくは２５、若しくは２６、若しくは２７、若しくは２８、若しくは２９、若しくは３０個の改変しており、特に置換を有する、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５の内のいずれかに由来するポリペプチド、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドに由来するポリペプチドである。
【0135】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所又は複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入を有しており、例えば、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０個の改変を有しており、特に置換を有する、配列番号１に由来するポリペプチドである。
【0136】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所又は複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入を有しており、例えば、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０個の改変を有しており、特に置換を有する、配列番号４に由来するポリペプチドである。
【0137】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所又は複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入を有しており、例えば、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０個の改変を有しており、特に置換を有する、配列番号５に由来するポリペプチドである。
【0138】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所又は複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入を有しており、例えば、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０個の改変を有しており、特に置換を有する、配列番号６に由来するポリペプチドである。
【0139】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所又は複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入を有しており、例えば、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０個の改変を有しており、特に置換を有する、配列番号１１に由来するポリペプチドである。
【0140】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失、又は付加により、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の内のいずれかに由来する。
【0141】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失、又は付加により、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の内のいずれかの成熟ポリペプチドに由来する。
【0142】
一実施形態では、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の内のいずれかのポリペプチドに導入されるアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入の数は、最大１５個であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個である。
【0143】
アミノ酸変化は、軽微な性質のものであり得、これは、タンパク質の折り畳み及び／若しくは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換若しくは挿入；典型的には１～３０個のアミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基等の小型のアミノ末端延長若しくはカルボキシル末端延長；最大２０～２５個の残基の小型のリンカーペプチド；又は正味電荷、又はポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ、若しくは結合モジュール等の別の機能を変化させることにより精製を容易にする小規模な延長である。
【0144】
ポリペプチドにおいて必須のアミノ酸を、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発等の当技術分野で既知の手順に従って同定し得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５）。後者の技術では、分子の活性に極めて重要なアミノ酸残基を同定するために、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入して、結果として生じる分子をラクターゼ活性に関して試験する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９－４７０８も参照されたい。酵素の活性部位、又は他の生物学的相互作用をまた、推定される接触部位アミノ酸の変異との組み合わせにより、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折、又は光親和性標識等の技術によって決定される構造の物理的分析によっても判定し得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５；３０６－３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４；８９９－９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４を参照されたい。必須アミノ酸の同定をまた、関連するポリペプチドとのアラインメントからも推定し得、並びに／又は関連するポリペプチドとの配列相同性、及び保存された触媒機構からも推定し得、又は典型的には、類似の三次元構造、機能、及び有意な配列類似性を有する、共通の祖先から派生するポリペプチド／タンパク質を有するポリペプチドファミリ若しくはタンパク質ファミリ内でも推定し得る。加えて、又は或いは、必須アミノ酸及び／又はポリペプチドの活性部位を同定するためのタンパク質構造モデリングに、タンパク質構造予測ツールを使用し得る。例えば、Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１，“Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ”，Ｎａｔｕｒｅ ５９６：５８３－５８９を参照されたい。
【0145】
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を、既知の変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングの方法、続いてＲｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６；２１５２－２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットに開示されているもの等の関連するスクリーニング手順を使用して行ない得、且つ試験し得る。使用され得る他の方法として、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０；１０８３２－１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６；１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７；１２７）が挙げられる。
【0146】
変異誘発／シャッフリング法を、ハイスループットな自動化されたスクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞により発現された、クローニングされ、変異誘発されたポリペプチドの活性を検出し得る（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７；８９３－８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子を、宿主細胞から回収し、当技術分野の標準法を使用して迅速に配列決定し得る。これらの方法により、ポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することが可能となる。
【0147】
アミノ酸改変はまた、酵素に１つ又は複数の所望の特性を付与する非保存的改変（例えば、非保存的な置換、欠失、及び／又は挿入、典型的には、置換）でもあり得る。そのような所望の特性の非限定的な例として、高温に曝露された後の残存活性の改善、変性後に再び折り畳む能力、及び比活性が挙げられる。
【0148】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、この酵素が、この酵素が由来する酵素と比較してＵＨＴ処理後に残存活性が高くなるように、１～３０個（好ましくは１～２０個）のアミノ酸が置換されることにより、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の内のいずれかに由来しており、好ましくは、配列番号１、４、５、６、又は１１の内のいずれかに由来する。
【0149】
ラクターゼ活性を有する酵素を、任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的のために、「から得られる」という用語は、所与の供給源に関連して本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、供給源により生成されるか、又は本発明のポリヌクレオチドが挿入されている株により生成されることを意味するものとする。一態様では、所与の供給源から得られたポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【0150】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）、ビフィドバクテリウム・エアロフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、若しくはビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）から得られるか、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られ、好ましくは、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、若しくはバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｓ３から得られるか、バリバクラム属種（Ｖａｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）から得られるか、ウルミテラ属（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ）から得られ、好ましくは、ウルミテラ・チモネンシス（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）から得られるか、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）から得られ、好ましくは、ストレプトコッカス・エンテリクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）ＤＳＭ １４４４６から得られるか、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から得られ、好ましくは、ストレプトマイセス・シラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｒｒａｔｕｓ）から得られるか、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）から得られ、好ましくは、クロストリジウム・ネクサイル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ）ＣＡＧ：３４８から得られるか、又はネオバチルス属（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られ、好ましくは、ネオバチルス・バタビエンシス（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｖｉｅｎｓｉｓ）、ネオバチルス・メソナエ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｓｏｎａｅ）、若しくはネオバチルス・ニアシニ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉａｃｉｎｉ）から得られるか、又はこれらの属若しくは種の内のいずれかから得られる酵素のバリアントである。
【0151】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）若しくはビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）から得られるか、又はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）若しくはビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）から得られる、ラクターゼ活性を有する酵素のバリアントである。
【0152】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ウルミテラ属（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ）から得られ、好ましくは、ウルミテラ・チモネンシス（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）から得られるか、又はウルミテラ属（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ）から得られ、好ましくは、ウルミテラ・チモネンシス（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）から得られる、ラクターゼ活性を有する酵素のバリアントである。
【0153】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）から得られ、好ましくは、ストレプトコッカス・エンテリクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）から得られるか、又はストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）から得られ、好ましくは、ストレプトコッカス・エンテリクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）から得られる、ラクターゼ活性を有する酵素のバリアントである。
【0154】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、バリバクラム属種（Ｖａｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）から得られるか、又はバリバクラム属種（Ｖａｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）から得られる、ラクターゼ活性を有する酵素のバリアントである。
【0155】
前述の種に関して、本発明は、完全な状態及び不完全な状態の両方、並びにそれらが知られている種の名称にかかわらず、他の分類学上の均等物（例えばアナモルフ）を包含することが理解されるであろう。当業者であれば、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
【0156】
酵素を、上記のプローブを用いて、自然界（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物又は天然の物質（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルを含む他の供給源から同定し且つ得ることができる。微生物及びＤＮＡを自然生息地から直接単離する技術は、当技術分野で公知である。次に、酵素をコードするポリヌクレオチドを、別の微生物のゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリ、又は混合ＤＮＡサンプルを同様にスクリーニングすることによって得ることができる。プローブを用いて、酵素をコードするポリヌクレオチドを検出してから、当業者に既知の技術を利用することにより、ポリヌクレオチドを単離し得るか、又はクローン化し得る（例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい）。
【0157】
ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５の内のいずれかに由来するポリペプチドであり得るか、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドに由来するポリペプチドであり得、ここで、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端が、１つ若しくは複数のアミノ酸の付加により伸長されているか、又は１つ若しくは複数のアミノ酸が、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端から欠失している。
【0158】
ラクターゼ活性を有する酵素は、この酵素が得られる野生型酵素と比較して、Ｃ末端がトランケートされている場合がある。
【0159】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、長さが最高約１５００個のアミノ酸であり、例えば最高約１４００個のアミノ酸又は最高約１３５０個のアミノ酸であり、例えば８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは８５０～１４００個のアミノ酸であり、例えば８５０～１３５０又は１１００～１４００個のアミノ酸である。
【0160】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、Ｃ末端がトランケートされていて、長さが最高約１５００個のアミノ酸であり、例えば最高約１４００個のアミノ酸又は最高約１３５０個のアミノ酸であり、例えば８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは８５０～１４００個のアミノ酸であり、例えば８５０～１３５０又は１１００～１４００個のアミノ酸である。
【0161】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるか、又はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは８５０～１３５０個のアミノ酸であり、より好ましくは８８０～１３５０、８８０～１３２０、又は８８５～１３１０個のアミノ酸である。
【0162】
別の実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるか、又はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１５００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３５０個のアミノ酸であり、さらにより好ましくは１３００～１３０５個のアミノ酸であり、例えば１３０２又は１３０４個のアミノ酸である。
【0163】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）から得られるか、又はビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２８０～１３２０個のアミノ酸であり、例えば１２９０～１３１０個のアミノ酸である。
【0164】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ストレプトコッカス・エンテリクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）ＤＳＭ １４４４６から得られるか、又はストレプトコッカス・エンテリクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）ＤＳＭ １４４４６から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２７０～１３１０個のアミノ酸であり、例えば１２８０～１３００個のアミノ酸である。
【0165】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、バリバクラム属種（Ｖａｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）から得られるか、又はバリバクラム属種（Ｖａｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３３０個のアミノ酸であり、例えば１３００～１３２０個のアミノ酸である。
【0166】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ウルミテラ・チモネンシス（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）から得られるか、又はウルミテラ・チモネンシス（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３３０個のアミノ酸であり、例えば１３００～１３２０個のアミノ酸である。
【0167】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｓ３から得られるか、又はバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｓ３から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３３０個のアミノ酸であり、例えば１３００～１３２０個のアミノ酸である。
【0168】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・エアロフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）から得られるか、又はビフィドバクテリウム・エアロフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２８０～１３２０個のアミノ酸であり、例えば１２９０～１３１０個のアミノ酸である。
【0169】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）から得られるか、又はビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２８０～１３２０個のアミノ酸であり、例えば１２９０～１３１０個のアミノ酸である。
【0170】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・ネクサイル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ）ＣＡＧ：３４８から得られるか、又はクロストリジウム・ネクサイル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ）ＣＡＧ：３４８から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２７０～１３１０個のアミノ酸であり、例えば１２８０～１３００個のアミノ酸である。
【0171】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ネオバチルス・バタビエンシス（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｖｉｅｎｓｉｓ）から得られるか、又はネオバチルス・バタビエンシス（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｖｉｅｎｓｉｓ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８００～１４００個のアミノ酸であり、好ましくは１０００～１２００個のアミノ酸であり、より好ましくは１１００～１２００又は１１１０～１１５０個のアミノ酸であり、例えば１１２０～１１４０個のアミノ酸である。
【0172】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ネオバチルス・メソナエ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｓｏｎａｅ）から得られるか、又はネオバチルス・メソナエ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｓｏｎａｅ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３３０個のアミノ酸であり、例えば１３００～１３２０個のアミノ酸である。
【0173】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ネオバチルス・ニアシニ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉａｃｉｎｉ）から得られるか、又はネオバチルス・ニアシニ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉａｃｉｎｉ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１４００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３３０個のアミノ酸であり、例えば１３００～１３２０個のアミノ酸である。
【0174】
一実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、ストレプトマイセス・シラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｒｒａｔｕｓ）から得られるか、又はストレプトマイセス・シラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｒｒａｔｕｓ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントであり、且つＣ末端がトランケートされていて、長さが１２００～１９００個のアミノ酸であり、好ましくは１６００～１８００個のアミノ酸であり、より好ましくは１６５０～１７５０又は１６６０～１７００個のアミノ酸であり、例えば１６７０～１６９０個のアミノ酸である。
【0175】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトース代謝回転が少なくとも１０個／秒／酵素分子である。この初期ラクトース代謝回転を、例えば、ラクトースの０～１０％が加水分解されている場合に決定し得る。１つの酵素分子当たりの初期ラクトース代謝回転を決定する方法は、当業者に既知であるだろう。例えば、この方法は、ＨＰＬＣを使用するラクトースの直接測定、又はグルコース検出法を使用する間接測定であり得る。
【0176】
５℃での乳中における１つの酵素分子当たりの初期ラクトース代謝回転は、Ｌａｃｔｏｚｙｍ（登録商標）Ｐｕｒｅの場合には３６秒－１であり、Ｓａｐｈｅｒａ（登録商標）の場合には８９秒－１である。
【0177】
より好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトース代謝回転が少なくとも２０個／秒／酵素分子であり、好ましくは少なくとも５０個／秒／酵素分子であり、より好ましくは少なくとも８０個／秒／酵素分子である。
【0178】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトースからの平均ラクトース代謝回転（好ましくは、約４．７％のラクトースから０．１％の残存ラクトースへ）が少なくとも１０個／秒／酵素分子である。
【0179】
４．７％の初期ラクトースから０．１％の残存ラクトースへの平均ラクトース代謝回転は、Ｌａｃｔｏｚｙｍ（登録商標）Ｐｕｒｅの場合には約９秒－１であり、Ｓａｐｈｅｒａ（登録商標）の場合には約２３秒－１である。初期速度（４．７％から４．２３％へ）と比較して４．７％から０．１％への平均ラクトース代謝回転が低いことは、いくつかの要因（例えば、より高い生成物阻害、及び０．１％近いより低い基質濃度）の組み合わせが理由である。
【0180】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトースからの平均ラクトース代謝回転（好ましくは、約４．７％から０．０１％への残存ラクトースへ）が少なくとも５個／秒／酵素分子である。
【0181】
４．７％から０．０１％の残存ラクトースへの初期ラクトースからの平均ラクトース代謝回転は、Ｌａｃｔｏｚｙｍ（登録商標）Ｐｕｒｅの場合には約５秒－１であり、Ｓａｐｈｅｒａ（登録商標）の場合には約１８秒－１である。
【0182】
好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃でのミカエリス定数ＫＭが最高４０ｍＭであり、好ましくは最高３０ｍＭであり、より好ましくは最高２０ｍＭである。
【0183】
別の好ましい実施形態では、ラクターゼ活性を有する酵素は、３７℃でのミカエリス定数ＫＭが最高４０ｍＭであり、好ましくは最高３０ｍＭであり、より好ましくは最高２０ｍＭである。
【0184】
ミカエリス定数ＫＭは、反応速度が最大半値となる基質濃度（この場合はラクトース濃度）であり、酵素に対する基質の親和性の尺度である。小さいＫＭは、高親和性を示し、このことは、速度が、ＫＭがより大きい場合と比べて、基質濃度がより低い場合に最大に近づくことを意味する。
【0185】
ミカエリス定数ＫＭを、国際公開第０９０７１５３９Ａ１号パンフレットの実施例５の方法に従って決定し得る。この実施例では、５℃でのＫＭは、実験的なビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ラクターゼの場合には８ｍＭと決定されており、Ｌａｃｔｏｚｙｍ（Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ラクターゼ）の場合には３０ｍＭと決定されており、３７℃でのＫＭは、実験的なビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ラクターゼの場合には１３ｍＭと決定されており、Ｌａｃｔｏｚｙｍの場合には３０ｍＭと決定されている。
【0186】
好ましい実施形態
１．ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、
ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）前記酵素の添加後、少なくとも１秒の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で前記乳由来基質を保持することにより、前記乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日にわたり、例えば少なくとも３日にわたり、より好ましくは少なくとも４日にわたり、前記加熱処理乳由来製品を保存すること、
を含み、
工程ｃ）の後に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法。
１．ラクトースが低減された加熱処理乳由来製品を製造する方法であって、
ａ）少なくとも２％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳由来基質に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加すること、
ｂ）前記酵素の添加後、少なくとも１秒の保持時間にわたり少なくとも１２０℃の保持温度で前記乳由来基質を保持することにより、前記乳由来基質の加熱処理を実施し、その後に冷却して加熱処理乳由来製品を製造すること、
及び
ｃ）最高４０℃の温度で、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日にわたり、例えば少なくとも３日にわたり、より好ましくは少なくとも４日にわたり、前記加熱処理乳由来製品を保存すること、
を含み、
工程ｃ）の後に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）である、
方法。
【0187】
２．工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）である、実施形態１に記載の方法。
【0188】
３．工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、前記乳由来基質を、最高４時間にわたりインキュベートし、好ましくは最高６０分にわたりインキュベートし、より好ましくは最高１０分にわたりインキュベートし、さらにより好ましくは最高５分にわたりインキュベートする、実施形態１又は２に記載の方法。
【0189】
４．工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、前記乳由来基質を、最高１０℃の温度でインキュベートし、好ましくは最高７℃の温度でインキュベートする、実施形態３に記載の方法。
【0190】
５．工程ｂ）を、専用のインキュベーション工程を行なうことなく、工程ａ）の直後に実施する、実施形態１又は２に記載の方法。
【0191】
６．工程ｂ）を、工程ａ）の後であり且つ工程ｂ）の前に専用のインキュベーション工程を行なうことなく、工程ａ）の直後に実施する、実施形態１又は２に記載の方法。
【0192】
７．前記乳由来基質が、プロセスパイプ等のプロセス装置を通って流れている間に、前記乳由来基質に前記酵素を添加するために、ポンプ装置が設置されている、実施形態１若しくは２、又は５若しくは６に記載の方法。
【0193】
８．前記酵素の添加から工程ｂ）の保持温度に達するまでの時間は、最高５分であり、好ましくは最高２分であり、より好ましくは最高１分である、実施形態１若しくは２、又は５～７のいずれか一つに記載の方法。
【0194】
９．前記酵素の添加から、前記加熱処理乳由来製品が最高４０℃の温度まで冷却されており、好ましくは最高３５℃の温度まで冷却されており、より好ましくは最高３０℃の温度まで冷却されているまでの時間は、最高３．５分であり、好ましくは最高３分であり、より好ましくは最高２．５分であり、例えば最高２分であるか、又は最高１分である、実施形態１若しくは２、又は５～８のいずれか一つに記載の方法。
【0195】
１０．任意選択的に前記乳由来基質の温度が工程ｂ）の保持温度に向かって上昇している間に、前記加熱処理工程の直前に、前記乳由来基質が、プロセスパイプ等のプロセス装置を通っている流れている間に、前記酵素を前記乳由来基質に添加する、実施形態５～９のいずれか一つに記載の方法。
【0196】
１１．前記乳由来基質には直接接触せず、装置の接触面により分離されている加熱媒体を使用し、好ましくは、前記加熱媒体は、プレート熱交換器又はチューブ熱交換器である、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の方法。
【0197】
１２．前記加熱処理を、間接加熱処理として実施し、好ましくは間接ＵＨＴ処理として実施する、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の方法。
【0198】
１３．前記加熱処理を、高圧蒸気を使用するスチームインジェクション又はスチームインフュージョンにより実施し、好ましくはスチームインジェクションにより実施して、前記乳由来基質を加熱する、実施形態１～９のいずれか一つに記載の方法。
【0199】
１４．工程ｂ）を、専用のインキュベーション工程を行なうことなく、工程ａ）の直後に実施し、前記酵素を、前記蒸気と共に添加する、実施形態１３に記載の方法。
【0200】
１５．工程ｂ）の前記保持時間の後に、前記蒸気を含む前記乳由来基質を真空中でフラッシュ冷却して、使用した凝縮蒸気の量に相当する水を除去する、実施形態１３又は１４に記載の方法。
【0201】
１６．前記加熱処理を、直接加熱処理として実施し、好ましくは直接ＵＨＴ処理として実施する、実施形態１３～１５のいずれか一つに記載の方法。
【0202】
１７．プレート熱交換器又はチューブ熱交換器を使用する間接加熱も適用する、実施形態１３～１６のいずれか一つに記載の方法。
【0203】
１８．前記乳由来基質は、２～３０％（ｗ／ｗ）のラクトースを含み、好ましくは２～１７％（ｗ／ｗ）のラクトースを含み、より好ましくは４～５．５％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の方法。
【0204】
１９．前記乳由来基質は、４～５．５％（ｗ／ｗ）のラクトースを含む乳である、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の方法。
【0205】
２０．前記乳由来基質は、生乳であり、好ましくは、工程ａ）の前に低温殺菌されていない生乳である、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。
【0206】
２１．前記加熱処理は、ＥＳＬ処理、超低温殺菌、又はＵＨＬ処理である、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の方法。
【0207】
２２．前記加熱処理を、１２０～１５０℃の温度で実施する、実施形態１～２１のいずれか一つに記載の方法。
【0208】
２３．前記加熱処理を、少なくとも１２３℃の温度で実施し、好ましくは１２３～１４５℃の温度で実施する、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
【0209】
２４．前記加熱処理を、少なくとも１３０℃の温度で実施し、好ましくは１３０～１４５℃の温度で実施する、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
【0210】
２５．前記加熱処理を、少なくとも１３８℃の温度で実施し、好ましくは１３８～１４５℃の温度で実施し、より好ましくは１３８～１４２℃の温度で実施する、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
【0211】
２６．工程ｂ）の前記保持時間は、１～３０秒であり、好ましくは１～１０秒であり、より好ましくは１～５秒である、実施形態１～２５のいずれか一つに記載の方法。
【0212】
２７．前記加熱処理は、ＵＨＴ処理であり、好ましくは、１～３０秒の時間にわたり１３０～１４５℃の温度で実施され、より好ましくは、１～１０秒の時間にわたり１３８～１４５℃の温度で実施され、さらにより好ましくは、１～５秒の時間にわたり１３８～１４４℃の温度で実施されるＵＨＴ処理である、実施形態１～２６のいずれか一つに記載の方法。
【0213】
２８．前記加熱処理は、２５～３５秒にわたり１２８～１３２℃の温度で実施するか、２～５秒にわたり１３８～１４０℃の温度で実施するか、又は１～２秒にわたり１４４～１４６℃の温度で実施するＵＨＴ処理である、実施形態１～２７のいずれか一つに記載の方法。
【0214】
２９．前記加熱処理は、ＥＳＬ処理又は超低温殺菌であり、好ましくは、１～５秒の時間にわたり１２０～１４０℃の温度で実施するＥＳＬ処理又は超低温殺菌であり、より好ましくは、１～５秒にわたり１２０～１３０℃の温度で実施するか又は２～４秒にわたり１３８～１４０℃の温度で実施するＥＳＬ処理又は超低温殺菌である、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
【0215】
３０．工程ｂ）の後に、好ましくは、工程ｂ）の前記保持時間の後に、前記乳由来製品に、ラクターゼ活性を有する酵素を添加しない、実施形態１～２９のいずれか一つに記載の方法。
【0216】
３１．工程ｂ）の後に、好ましくは、工程ｂ）の前記保持時間の後に、前記乳由来製品に酵素を添加しない、実施形態１～３０のいずれか一つに記載の方法。
【0217】
３２．工程ｂ）の後に、好ましくは、工程ｂ）の前記保持時間の後に、前記乳由来製品に何も添加しない、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の方法。
【0218】
３３．工程ｂ）の前記保持時間の後に、前記乳由来製品を、好ましくは５分以内に、より好ましくは３分以内に、さらにより好ましくは２分以内に、例えば１分以内に、最高４０℃まで冷却し、好ましくは最高３５℃まで冷却し、より好ましくは最高３０℃まで冷却する、実施形態１～３２のいずれか一つに記載の方法。
【0219】
３４．工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品を無菌的に包装する、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の方法。
【0220】
３５．工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品を均質化する、実施形態１～３４のいずれか一つに記載の方法。
【0221】
３６．前記乳由来製品は、ＵＨＴ乳である、実施形態１～３５のいずれか一つに記載の方法。
【0222】
３７．工程ｂ）の後に、前記酵素は、前記酵素の初期活性の少なくとも０．１％を保持しており、好ましくは少なくとも１％を保持しており、より好ましくは少なくとも２％を保持しており、より好ましくは少なくとも１０％を保持しており、より好ましくは少なくとも５０％を保持しており、さらにより好ましくは少なくとも８０％を保持しており、最も好ましくは少なくとも９０％を保持している、実施形態１～３６のいずれか一つに記載の方法。
【0223】
３８．前記初期活性は、工程ｂ）の前の活性である、実施形態１～３７のいずれか一つに記載の方法。
【0224】
３９．工程ｃ）を、２～４０℃の温度で実施し、好ましくは１５～４０℃の温度で実施し、より好ましくは１８～４０℃の温度で実施し、最も好ましくは１８～３０℃の温度で実施する、実施形態１～３８のいずれか一つに記載の方法。
【0225】
４０．工程ｃ）を、保存期間中に変動し得る室温で実施する、実施形態１～３９のいずれか一つに記載の方法。
【0226】
４１．工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、少なくとも１％（ｗ／ｗ）であり、例えば、少なくとも２％（ｗ／ｗ）、少なくとも３％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも４％（ｗ／ｗ）である、実施形態１～４０のいずれか一つに記載の方法。
【0227】
４２．工程ｂ）の後であるが工程ｃ）の前に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、最高８０％低減されており、好ましくは最高５０％低減されており、より好ましくは最高２０％低減されている、実施形態１～４１のいずれか一つに記載の方法。
【0228】
４３．工程ｃ）において、前記加熱処理乳由来製品を、少なくとも７日にわたり保存し、好ましくは少なくとも１４日にわたり保存し、より好ましくは少なくとも２１日にわたり保存する、実施形態１～４２のいずれか一つに記載の方法。
【0229】
４４．２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２１日にわたり、好ましくは１４日にわたり、より好ましくは７日にわたり、さらにより好ましくは４日にわたり、最も好ましくは３日にわたり、前記加熱処理乳由来製品を保存した後に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、最高０．２％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは最高０．１％であり、より好ましくは最高０．０１％である、実施形態１～４３のいずれか一つに記載の方法。
【0230】
４５．２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２１日にわたり、好ましくは１４日にわたり、より好ましくは７日にわたり、さらにより好ましくは４日にわたり、最も好ましくは３日にわたり、前記加熱処理乳由来製品を保存した後に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、工程ａ）の前のラクトース含有量と比較して、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減されており、好ましくは、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７％低減されており、より好ましくは少なくとも９８％低減されており、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％低減されており、最も好ましくは少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％％低減されている、実施形態１～４４のいずれか一つに記載の方法。
【0231】
４６．２～４０℃の温度で、好ましくは１５～４０℃の温度で、より好ましくは１８～４０℃の温度で、最も好ましくは１８～３０℃の温度で、２１日にわたり、好ましくは１４日にわたり、より好ましくは７日にわたり、さらにより好ましくは４日にわたり、最も好ましくは３日にわたり、前記加熱処理乳由来製品を保存した後に、前記乳由来製品のラクトース含有量は、最高１０００ｐｐｍであり、好ましくは最高１００ｐｐｍである、実施形態１～４５のいずれか一つに記載の方法。
【0232】
４７．工程ｃ）の後に、前記ラクトースが低減された加熱処理乳製品を凍結乾燥させる、実施形態１～４６のいずれか一つに記載の方法。
【0233】
４８．工程ｂ）の前に、前記乳由来製品に、還元剤を添加し、好ましくは、食品用に認可されている還元剤を添加し、より好ましくは、Ｌ－システイン、亜硫酸塩、及びグルタチオンから選択される還元剤を添加する、実施形態１～４７のいずれか一つに記載の方法。
【0234】
４９．前記ラクターゼ活性を有する酵素を、乳由来基質 １リットル当たり１００～５０，０００ＬＡＵ（Ｂ）の濃度で添加し、好ましくは５００～４０，０００ＬＡＵ（Ｂ）の濃度で添加する、実施形態１～４８のいずれか一つに記載の方法。
【0235】
５０．前記ラクターゼ活性を有する酵素を、乳由来基質 １リットル当たり１～１５０ｍｇの酵素タンパク質の濃度で添加し、乳由来基質 １リットル当たり好ましくは１～１００ｍｇの酵素タンパク質の濃度で添加し、より好ましくは２～５０又は５～５０ｍｇの酵素タンパク質の濃度で添加する、実施形態１～４９のいずれか一つに記載の方法。
【0236】
５１．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ラクターゼである、実施形態１～５０のいずれか一つに記載の方法。
【0237】
５２．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、酵素クラス３．２．１．２１、３．２．１．２３、又は３．２．１．１０８に属しており、好ましくは３．２．１．２３又は３．２．１．１０８に属している、実施形態１～５１のいずれか一つに記載の方法。
【0238】
５３．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、中性ラクターゼである、実施形態１～５２のいずれか一つに記載の方法。
【0239】
５４．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、精製されている、実施形態１～５３のいずれか一つに記載の方法。
【0240】
５５．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、単離されている、実施形態１～５４のいずれか一つに記載の方法。
【0241】
５６．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、細菌性ラクターゼである、実施形態１～５５のいずれか一つに記載の方法。
【0242】
５７．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ＧＨ２ラクターゼであり、好ましくは、クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ラクターゼである、実施形態１～５６のいずれか一つに記載の方法。
【0243】
５８．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、前記酵素のアミノ酸配列中に、モチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］を含む、実施形態１～５７のいずれか一つに記載の方法。
【0244】
５９．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、前記酵素のアミノ酸配列中に、モチーフＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ及び／又は［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤを含む、実施形態１～５８のいずれか一つに記載の方法。
【0245】
６０．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ＣＢＭ３２又はＣＢＭ７１を有しており、好ましくはＣＢＭ３２を有する、実施形態１～５９のいずれか一つに記載の方法。
【0246】
６１．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、最適温度が３０～６０℃であり、好ましくは３５～５５℃である、実施形態１～６０のいずれか一つに記載の方法。
【0247】
６２．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ｐＨ６での熱シフトにより決定される融点Ｔｍが５０～７０℃である、実施形態１～６１のいずれか一つに記載の方法。
【0248】
６３．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ｐＨ７での熱シフトにより決定される融点Ｔｍが５０～７０℃である、実施形態１～６２のいずれか一つに記載の方法。
【0249】
６４．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中における、３０秒にわたる７０℃及び５秒にわたる１４０℃でのインキュベーション後に、残存活性が少なくとも１％であり、好ましくは少なくとも２％であり、より好ましくは少なくとも５％であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％である、実施形態１～６３のいずれか一つに記載の方法。
【0250】
６５．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃での、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中におけるインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の０．５時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後に、残存活性が、少なくとも０．１％であり、好ましくは少なくとも０．５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％であり、より好ましくは少なくとも５％であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％であり、前記残存活性は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃でのインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の０．５時間にわたる２３℃でのインキュベーションを行なわない脱脂乳中における同一の酵素の活性に対して相対的である、実施形態１～６４のいずれか一つに記載の方法。
【0251】
６６．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃での、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中におけるインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後に、残存活性が、少なくとも０．５％であり、好ましくは少なくとも１％、少なくとも２％、又は少なくとも３％であり、より好ましくは少なくとも５％であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％であり、前記残存活性は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃でのインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションを行なわない脱脂乳中における同一の酵素の活性に対して相対的である、実施形態１～６５のいずれか一つに記載の方法。
【0252】
６７．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃での、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中におけるインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後に、３０秒にわたる９０℃での、５秒にわたる１４０℃での、及び３０秒にわたる７０℃での、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳中におけるインキュベーション、その後の０～１０℃までの冷却、その後の０．５時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後の活性と比べて少なくとも２０％高い活性を有する、実施形態１～６６のいずれか一つに記載の方法。
【0253】
６８．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、若しくは配列番号１５の内のいずれか、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドと少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、実施形態１～６７のいずれか一つに記載の方法。
【0254】
６９．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号１１の内のいずれか、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドと少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、実施形態１～６８のいずれか一つに記載の方法。
【0255】
７０．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、
ａ）配列番号１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つＰ６５Ａ、Ｎ２７５Ｓ、Ｃ３７２Ａ、Ｍ３８６Ｑ、Ｒ３８９Ａ、Ｇ４８２Ａ、Ｔ５２３Ｎ、Ｐ６１５Ｔ、Ｔ７５６Ｋ、Ａ９３６Ｓ、Ｔ９７２Ｃ、Ｉ１０３５Ｃ、Ｔ１０７６Ｃ、Ｙ１１２２Ｃ、Ａ１１２９Ｃ、Ｆ１１３２Ｃ、Ｋ１１６８Ｃ、Ｓ１１９５Ｃ、及びＣ１１９９Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換の内の２つ以上を含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号１に基づく、酵素、
ｂ）配列番号４と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つＰ６５Ａ、Ｃ３７２Ａ、Ｐ６１５Ｔ、Ａ１０７３Ｃ、Ｈ１１２２Ｃ、及びＣ１１９５Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換の内の２つ以上を含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号４に基づく、酵素、
ｃ）配列番号１１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つＰ５２Ａ、Ｇ６０７Ｔ、Ｌ１０６４Ｃ、及びＹ１１１０Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換の内の２つ以上を含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号１１に基づく、酵素、
並びに
ｄ）配列番号５と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つ置換Ｇ３８６Ｑ及び／又はＰ６２０Ｔを含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号５に基づく、酵素
からなる群から選択される、実施形態１～６９のいずれか一つに記載の方法。
ａ）配列番号１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つＰ６５Ａ、Ｎ２７５Ｓ、Ｃ３７２Ａ、Ｍ３８６Ｑ、Ｒ３８９Ａ、Ｇ４８２Ａ、Ｔ５２３Ｎ、Ｐ６１５Ｔ、Ｔ７５６Ｋ、Ａ９３６Ｓ、Ｔ９７２Ｃ、Ｉ１０３５Ｃ、Ｔ１０７６Ｃ、Ｙ１１２２Ｃ、Ａ１１２９Ｃ、Ｆ１１３２Ｃ、Ｋ１１６８Ｃ、Ｓ１１９５Ｃ、及びＣ１１９９Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換の内の２つ以上を含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号１に基づく、酵素、
ｂ）配列番号４と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つＰ６５Ａ、Ｃ３７２Ａ、Ｐ６１５Ｔ、Ａ１０７３Ｃ、Ｈ１１２２Ｃ、及びＣ１１９５Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換の内の２つ以上を含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号４に基づく、酵素、
ｃ）配列番号１１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つＰ５２Ａ、Ｇ６０７Ｔ、Ｌ１０６４Ｃ、及びＹ１１１０Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換の内の２つ以上を含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号１１に基づく、酵素、
並びに
ｄ）配列番号５と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であり、且つ置換Ｇ３８６Ｑ及び／又はＰ６２０Ｔを含むアミノ酸配列を有する酵素であって、ナンバリングは、配列番号５に基づく、酵素
からなる群から選択される、実施形態１～６９のいずれか一つに記載の方法。
【0256】
７１．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１のＣ３７２に対応するシステインのアミノ酸置換を有しており、好ましくは、セリン、アラニン、又はグリシンへのアミノ酸置換を有している、実施形態１～７０のいずれか一つに記載の方法。
【0257】
７２．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）、ビフィドバクテリウム・エアロフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、若しくはビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）から得られるか、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られ、好ましくは、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、若しくはバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｓ３から得られるか、バリバクラム属種（Ｖａｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）から得られるか、ウルミテラ属（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ）から得られ、好ましくは、ウルミテラ・チモネンシス（Ｕｒｍｉｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）から得られるか、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）から得られ、好ましくは、ストレプトコッカス・エンテリクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）ＤＳＭ １４４４６から得られるか、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から得られ、好ましくは、ストレプトマイセス・シラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｒｒａｔｕｓ）から得られるか、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）から得られ、好ましくは、クロストリジウム・ネクサイル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ）ＣＡＧ：３４８から得られるか、又はネオバチルス属（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られ、好ましくは、ネオバチルス・バタビエンシス（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｖｉｅｎｓｉｓ）、ネオバチルス・メソナエ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｓｏｎａｅ）、若しくはネオバチルス・ニアシニ（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉａｃｉｎｉ）から得られるか、又はこれらの属若しくは種の内のいずれかから得られる酵素のバリアントである、実施形態１～７１のいずれか一つに記載の方法。
【0258】
７３．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、長さが最大約１５００個のアミノ酸であり、例えば、最大約１４００個のアミノ酸、又は最大約１３５０個のアミノ酸であり、例えば、８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは８５０～１４００個のアミノ酸であり、例えば、８５０～１３５０又は１１００～１４００個のアミノ酸である、実施形態１～７２のいずれか一つに記載の方法。
【0259】
７４．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１若しくは２の内のいずれか又は配列番号１若しくは２の内のいずれの成熟ポリペプチドと少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、実施形態１～７３のいずれか一つに記載の方法。
【0260】
７５．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１と少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、実施形態１～７４のいずれか一つに記載の方法。
【0261】
７６．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所若しくは複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／若しくは挿入を有しており、例えば、１、若しくは２、若しくは３、若しくは４、若しくは５、若しくは６、若しくは７、若しくは８、若しくは９、若しくは１０、若しくは１１、若しくは１２、若しくは１３、若しくは１４、若しくは１５、若しくは１６、若しくは１７、若しくは１８、若しくは１９、若しくは２０、若しくは２１、若しくは２２、若しくは２３、若しくは２４、若しくは２５、若しくは２６、若しくは２７、若しくは２８、若しくは２９、若しくは３０個の改変しており、特に置換を有する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５の内のいずれかに由来するポリペプチド、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドに由来するポリペプチドである、実施形態１～７５のいずれか一つに記載の方法。
【0262】
７７．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、１箇所又は複数箇所の位置で、１～３０個の改変を有しており、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入を有しており、例えば、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０個の改変を有しており、特に置換を有する、配列番号１に由来するポリペプチドである、実施形態１～７６のいずれか一つに記載の方法。
【0263】
７８．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５の内のいずれかに由来するポリペプチドであるか、又はこれらの内のいずれかの成熟ポリペプチドであって、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端が、１つ若しくは複数のアミノ酸の付加により伸長されているか、又は１つ若しくは複数のアミノ酸が、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端から欠失されている、成熟ポリペプチドに由来するポリペプチドである、実施形態１～７７のいずれか一つに記載の方法。
【0264】
７９．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、前記酵素が得られる野生型酵素と比較して、Ｃ末端がトランケートされている、実施形態１～７８のいずれか一つに記載の方法。
【0265】
８０．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるか、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られ、好ましくは、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）から得られるか、又はバリアントであって、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるか、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られ、好ましくは、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントである、実施形態１～７９のいずれか一つに記載の方法。
【0266】
８１．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるか、又はバリアントであって、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ、好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）から得られるラクターゼ活性を有する酵素のバリアントである、実施形態１～８０のいずれか一つに記載の方法。
【0267】
８２．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは８５０～１３５０個のアミノ酸であり、より好ましくは８８０～１３５０、８８０～１３２０、又は８８５～１３１０個のアミノ酸である、実施形態１～８１のいずれか一つに記載の方法。
【0268】
８３．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、長さが８５０～１５００個のアミノ酸であり、好ましくは１２５０～１５００個のアミノ酸であり、より好ましくは１２５０～１３５０又は１２９０～１３５０個のアミノ酸であり、さらにより好ましくは１３００～１３０５個のアミノ酸であり、例えば１３０２又は１３０４個のアミノ酸である、実施形態１～８２のいずれか一つに記載の方法。
【0269】
８４．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトース代謝回転が少なくとも１０個／秒／酵素分子である、実施形態１～８３のいずれか一つに記載の方法。
【0270】
８５．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトース代謝回転が少なくとも２０個／秒／酵素分子であり、好ましくは少なくとも５０個／秒／酵素分子であり、より好ましくは少なくとも８０個／秒／酵素分子である、実施形態１～８４のいずれか一つに記載の方法。
【0271】
８６．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトースからの平均ラクトース代謝回転（好ましくは、約４．７％のラクトースから０．１％の残存ラクトースへ）が少なくとも１０個／秒／酵素分子である、実施形態１～８５のいずれか一つに記載の方法。
【0272】
８７．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃での乳中において、初期ラクトースからの平均ラクトース代謝回転（好ましくは、約４．７％から０．０１％の残存ラクトースへ）が少なくとも５個／秒／酵素分子である、実施形態１～８６のいずれか一つに記載の方法。
【0273】
８８．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、５℃でのミカエリス定数ＫＭが最高４０ｍＭであり、好ましくは最高３０ｍＭであり、より好ましくは最高２０ｍＭである、実施形態１～８７のいずれか一つに記載の方法。
【0274】
８９．前記ラクターゼ活性を有する酵素は、３７℃でのミカエリス定数ＫＭが最高４０ｍＭであり、好ましくは最高３０ｍＭであり、より好ましくは最高２０ｍＭである、実施形態１～８８のいずれか一つに記載の方法。
【実施例】
【0275】
方法１：
ＬＡＵ（Ｂ）アッセイ
特定のラクターゼのＬＡＵ－Ｂ／ｇでの活性を、ｐＨ６．５及び３０℃で、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、４５０ｍｇ／Ｌ Ｂｒｉｊ ３５中に、１．４６ｍｇ／ｍｌ 基質を含む緩衝液中のｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）から放出されたｏ－ニトロフェニル（ＯＮＰ）を直接測定することにより決定し得る。６００秒間のインキュベーション後、０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を添加して反応を停止させ、１２６秒間のインキュベーション後に、放出されたＯＮＰを４０５ｎｍで測定する。この活性は、活性が既知のラクターゼで実行された標準曲線と比較することにより得られ、これから、未知のサンプルの活性を算出する。活性が既知のラクターゼは、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから得られるＳａｐｈｅｒａ（登録商標）であり得る。
ＬＡＵ（Ｂ）アッセイ
特定のラクターゼのＬＡＵ－Ｂ／ｇでの活性を、ｐＨ６．５及び３０℃で、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、４５０ｍｇ／Ｌ Ｂｒｉｊ ３５中に、１．４６ｍｇ／ｍｌ 基質を含む緩衝液中のｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）から放出されたｏ－ニトロフェニル（ＯＮＰ）を直接測定することにより決定し得る。６００秒間のインキュベーション後、０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を添加して反応を停止させ、１２６秒間のインキュベーション後に、放出されたＯＮＰを４０５ｎｍで測定する。この活性は、活性が既知のラクターゼで実行された標準曲線と比較することにより得られ、これから、未知のサンプルの活性を算出する。活性が既知のラクターゼは、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから得られるＳａｐｈｅｒａ（登録商標）であり得る。
【0276】
方法２：
最適温度を決定するためのアッセイ
温度プロファイル３５℃～７５℃を決定するためのアッセイ
最適温度を決定するための温度プロファイルを、希釈した酵素サンプル（５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈） １０μｌをＰＣＲチューブ入れることにより調製する。次いで、基質（１６７ｍＭ ラクトース、５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．５）９０μｌを添加し、このＰＣＲチューブを、（ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌサーモサイクラー、Ｂｉｏｍｅｔｒａを使用して）温度勾配３５～７５℃の予熱ＰＣＲブロックに入れ、３５～７５℃（勾配）で３０分にわたりインキュベートし、次いで氷上に置く。０．２５Ｍ ＮａＯＨ １００μｌを添加することにより、反応を停止させる。２０μｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＧＯＤ－Ｐｅｒｉｄ（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、０．６ｇ／ｌ グルコースオキシダーゼ、０．０２ｇ／ｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、１．０ｇ／ｌ ＡＢＴＳ）溶液 ２３０μＬを添加する。室温での暗所における３０分後、吸光度を４２０ｎｍで測定する。酵素の初期希釈を、最適温度での最終４２０ｎｍ読取り値がＡｂｓ０．５～２．５であるように調整すべきである。４２０ｎｍでのデルタＡｂｓが最高の温度（「酵素ありのＡｂｓ ４２０ｎｍ」－「酵素なしのＡｂｓ ４２０ｎｍ」、即ち、バックグラウンド）を１００％とし、次いで、読み取るデルタＡｂｓ ４２０ｎｍを、最高値でのデルタＡｂｓ ４２０ｎｍに関連付ける。
最適温度を決定するためのアッセイ
温度プロファイル３５℃～７５℃を決定するためのアッセイ
最適温度を決定するための温度プロファイルを、希釈した酵素サンプル（５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈） １０μｌをＰＣＲチューブ入れることにより調製する。次いで、基質（１６７ｍＭ ラクトース、５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．５）９０μｌを添加し、このＰＣＲチューブを、（ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌサーモサイクラー、Ｂｉｏｍｅｔｒａを使用して）温度勾配３５～７５℃の予熱ＰＣＲブロックに入れ、３５～７５℃（勾配）で３０分にわたりインキュベートし、次いで氷上に置く。０．２５Ｍ ＮａＯＨ １００μｌを添加することにより、反応を停止させる。２０μｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＧＯＤ－Ｐｅｒｉｄ（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、０．６ｇ／ｌ グルコースオキシダーゼ、０．０２ｇ／ｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、１．０ｇ／ｌ ＡＢＴＳ）溶液 ２３０μＬを添加する。室温での暗所における３０分後、吸光度を４２０ｎｍで測定する。酵素の初期希釈を、最適温度での最終４２０ｎｍ読取り値がＡｂｓ０．５～２．５であるように調整すべきである。４２０ｎｍでのデルタＡｂｓが最高の温度（「酵素ありのＡｂｓ ４２０ｎｍ」－「酵素なしのＡｂｓ ４２０ｎｍ」、即ち、バックグラウンド）を１００％とし、次いで、読み取るデルタＡｂｓ ４２０ｎｍを、最高値でのデルタＡｂｓ ４２０ｎｍに関連付ける。
【0277】
実施例１
使用するラクターゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／ＳのＳａｐｈｅｒａ ２６００Ｌ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、配列番号１）であり、活性が２６００ＬＡＵ（Ｂ）／ｇであると公表されている。
使用するラクターゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／ＳのＳａｐｈｅｒａ ２６００Ｌ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、配列番号１）であり、活性が２６００ＬＡＵ（Ｂ）／ｇであると公表されている。
【0278】
試験１
脱脂乳 ２４８．５リットルをインキュベーションタンクにポンプで注入し、次いで５℃まで冷却した。
脱脂乳 ２４８．５リットルをインキュベーションタンクにポンプで注入し、次いで５℃まで冷却した。
【0279】
この乳に、Ｓａｐｈｅｒａ １．５ｋｇ（乳１リットル当たり１５，６００ＬＡＵ（Ｂ）に相当する０．６％の投与量）を添加し、次いで、乳を、１８時間にわたり約５０ｒｐｍで撹拌した。
【0280】
インキュベーションの終了時に、この乳を、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴで処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流の２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0281】
この乳の温度を瞬時に（約１秒で）９０度まで低下させるフラッシュ冷却法で、この乳を、１４０度から約９０度まで冷却した。この後、約３０秒かけて温度を約６０度まで低下させ（下流の均質化を含む）、次いで、再び約３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0282】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0283】
試験２
脱脂乳 ２４８．８７５リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ １．１２５ｋｇ（０．４５％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。この酵素及び乳を、４５分にわたり混合し、次いで、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流の２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
脱脂乳 ２４８．８７５リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ １．１２５ｋｇ（０．４５％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。この酵素及び乳を、４５分にわたり混合し、次いで、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流の２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0284】
フラッシュ冷却を使用して、この乳を、約１秒で１４０度から約９０度まで冷却した。この後、約３０秒かけて温度を約６０度まで低下させ（下流の均質化を含む）、次いで、再び約３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0285】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0286】
試験３
脱脂乳 ２４８．５リットルを、ＵＨＴユニットにポンプで注入した。乳の温度が７０℃に達すると、乳の流れがＵＨＴ処理に向かう途中で、この高温の乳の流れ（７０℃）にＳａｐｈｅｒａ １．５ｋｇ（０．６％投与量）をポンプで注入した。ＵＨＴ条件は、下記のスチームインジェクションであった：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流の２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
脱脂乳 ２４８．５リットルを、ＵＨＴユニットにポンプで注入した。乳の温度が７０℃に達すると、乳の流れがＵＨＴ処理に向かう途中で、この高温の乳の流れ（７０℃）にＳａｐｈｅｒａ １．５ｋｇ（０．６％投与量）をポンプで注入した。ＵＨＴ条件は、下記のスチームインジェクションであった：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流の２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0287】
酵素の添加後、乳を瞬時に高温蒸気に触れさせて、この乳の温度を瞬時に（約１秒で）１４０度に上昇させ、続いて、１４０度で４秒間保持し、１秒間（フラッシュ冷却）で温度を約９０度まで低下させ、３０秒かけて温度をさらに約６０度まで低下させ（この段階中に、下流の均質化を実施した）、３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0288】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0289】
試験４
脱脂乳 ２４８．５リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ １．５ｋｇ（０．６％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。この酵素及び乳を、１０分にわたり混合し、次いで、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
脱脂乳 ２４８．５リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ １．５ｋｇ（０．６％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。この酵素及び乳を、１０分にわたり混合し、次いで、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0290】
フラッシュ冷却を使用して、この乳を、約１秒で１４０度から約９０度まで冷却した。この後、約３０秒かけて温度を約６０度まで低下させ（下流の均質化を含む）、次いで、再び約３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0291】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0292】
試験５
脱脂乳 ２４７リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ ３ｋｇ（１．２％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。乳を、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で瞬時に処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
脱脂乳 ２４７リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ ３ｋｇ（１．２％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。乳を、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で瞬時に処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0293】
フラッシュ冷却を使用して、この乳を、約１秒で１４０度から約９０度まで冷却した。この後、約３０秒かけて温度を約６０度まで低下させ（下流の均質化を含む）、次いで、再び約３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0294】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0295】
試験６
脱脂乳 ２４９．２５リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ ０．７５ｋｇ（０．３％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。乳を、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で瞬時に処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
脱脂乳 ２４９．２５リットルを、Ｓａｐｈｅｒａ ０．７５ｋｇ（０．３％投与量）と低温（５℃）で十分に混合した。乳を、スチームインジェクションを使用して、下記のＵＨＴ条件で瞬時に処理した：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）、及び下流２段階均質化（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0296】
フラッシュ冷却を使用して、この乳を、約１秒で１４０度から約９０度まで冷却した。この後、約３０秒かけて温度を約６０度まで低下させ（下流の均質化を含む）、次いで、再び約３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0297】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0298】
試験７
脱脂乳 ２４７リットルを、ＵＨＴユニットにポンプで注入した。乳の温度が９０℃に達すると、この乳を、保持チューブ中で約９０℃にて２分にわたりインキュベートした。次いで、乳の流れがＵＨＴ処理に向かう途中で、この高温の乳の流れ（９０℃）にＳａｐｈｅｒａ ３ｋｇ（１．２％投与量）をポンプで注入した。ＵＨＴ条件は、下記のチューブ交換加熱であった：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）。ここで、２段階均質化を上流で行なった（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
脱脂乳 ２４７リットルを、ＵＨＴユニットにポンプで注入した。乳の温度が９０℃に達すると、この乳を、保持チューブ中で約９０℃にて２分にわたりインキュベートした。次いで、乳の流れがＵＨＴ処理に向かう途中で、この高温の乳の流れ（９０℃）にＳａｐｈｅｒａ ３ｋｇ（１．２％投与量）をポンプで注入した。ＵＨＴ条件は、下記のチューブ交換加熱であった：ＵＨＴ条件（１４０℃／４秒）。ここで、２段階均質化を上流で行なった（７０℃ ２００／５０ｂａｒ）。
【0299】
酵素の添加後、約３０秒かけて１４０度まで加熱し、１４０度で４秒間保持し、約４０秒かけて温度を約４５度まで低下させ、次いでさらに３０秒かけて温度を室温（約２０℃）まで低下させた後に、充填した。
【0300】
ＵＨＴ後にサンプルを回収し、２つのサンプルを、分析するまで凍結させ、残りのサンプルを、最高３週間にわたり室温で保存し、残存ラクトースに関して分析した。
【0301】
残存ラクトース含有量の分析
残存ラクトースの分析を、パルスアンペロメトリー検出器を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）で実施した。
残存ラクトースの分析を、パルスアンペロメトリー検出器を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）で実施した。
【0302】
ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤのためのサンプル調製：
サンプル ５０ｕｌを、ＭＱ水 ５００ｕｌが入った５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。Ｃａｒｒｅｚ Ｉ溶液 １０ｕｌを添加して混合し、次いでＣａｒｒｅｚ ＩＩ溶液 １０ｕｌを添加して混合した。次いで、ＭＱ水 ４．４３ｍｌ（総量５ｍｌ）を、添加して混合した。遠心分離を、５分にわたり１４２００ｒｐｍで実行した。上清を５倍に希釈し、その後、一部のサンプルに関しては２０倍に希釈した。これらのサンプルを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで分析した。
サンプル ５０ｕｌを、ＭＱ水 ５００ｕｌが入った５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。Ｃａｒｒｅｚ Ｉ溶液 １０ｕｌを添加して混合し、次いでＣａｒｒｅｚ ＩＩ溶液 １０ｕｌを添加して混合した。次いで、ＭＱ水 ４．４３ｍｌ（総量５ｍｌ）を、添加して混合した。遠心分離を、５分にわたり１４２００ｒｐｍで実行した。上清を５倍に希釈し、その後、一部のサンプルに関しては２０倍に希釈した。これらのサンプルを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで分析した。
【0303】
分析方法：
装置：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣ－５０００
ポンプ：ＩＣＳ－５０００シングルポンプモデルＳＰ－５，Ｓ／Ｎ １１１１３７８７
オートサンプラ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＳ－ＡＰ，Ｐ／Ｎ ０７４９２５，Ｓ／Ｎ １２１０１１４７
オーブン ＩＣＳ－５０００検出器／クロマトグラフィーモジュールモデルＤＣ－５，Ｓ／Ｎ：１１１０２６９５
検出器：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣ－５０００ ＥＣＤ，Ｐ／Ｎ ０７２０４３，Ｓ／Ｎ １１１１３９７４，ＥＣＤセル Ｐ／Ｎ ０７２０４４，Ｓ／Ｎ １０１９８ 非使い捨て金電極 Ｐ／Ｎ ０６３４９４，Ｓ／Ｎ ５０４３５を備えている。
カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０ Ｇｕａｒｄカラム，３×３０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ／Ｎ ０６０１４４）と連結されたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラム，３×１５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ／Ｎ ０６０１４２）
溶離液：
Ａ：ＭＱ水
Ｂ：２００ｍＭ ＮａＯＨ
Ｃ：２００ｍＭ ＮａＯＨ中の１００ｍＭ 酢酸ナトリウム
Ｄ：２００ｍＭ ＮａＯＨ中の１ｍＭ 酢酸ナトリウム
装置：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣ－５０００
ポンプ：ＩＣＳ－５０００シングルポンプモデルＳＰ－５，Ｓ／Ｎ １１１１３７８７
オートサンプラ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＳ－ＡＰ，Ｐ／Ｎ ０７４９２５，Ｓ／Ｎ １２１０１１４７
オーブン ＩＣＳ－５０００検出器／クロマトグラフィーモジュールモデルＤＣ－５，Ｓ／Ｎ：１１１０２６９５
検出器：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣ－５０００ ＥＣＤ，Ｐ／Ｎ ０７２０４３，Ｓ／Ｎ １１１１３９７４，ＥＣＤセル Ｐ／Ｎ ０７２０４４，Ｓ／Ｎ １０１９８ 非使い捨て金電極 Ｐ／Ｎ ０６３４９４，Ｓ／Ｎ ５０４３５を備えている。
カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０ Ｇｕａｒｄカラム，３×３０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ／Ｎ ０６０１４４）と連結されたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラム，３×１５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ／Ｎ ０６０１４２）
溶離液：
Ａ：ＭＱ水
Ｂ：２００ｍＭ ＮａＯＨ
Ｃ：２００ｍＭ ＮａＯＨ中の１００ｍＭ 酢酸ナトリウム
Ｄ：２００ｍＭ ＮａＯＨ中の１ｍＭ 酢酸ナトリウム
【0304】
【表1】
【0305】
【表2】
【0306】
【表3】
【0307】
実施例２
ＵＨＴ処理
１％（ｗ／ｖ）Ｓａｐｈｅｒａ ２６００Ｌ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、配列番号１）、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｂｉｏｌａｃｔａ Ｎ５（バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、配列番号２）、１％（ｗ／ｖ）Ｂｏｎｌａｃｔａ（ラクトバシラス・デルブリュッキイ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、配列番号３）、及び１％（ｗ／ｖ）Ｌａｃｔｏｚｙｍ Ｐｕｒｅ ６５００Ｌ（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ））をそれぞれ、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳に添加し、ＵＨＴ工程があるにもかかわらず、取り扱い／チューブ等が完全に無菌ではないことから、微生物の増殖を避けるために、アジ化ナトリウム＊を０．０２５％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加した。この乳サンプルを、下記で説明するように、実験室規模のＵＨＴ装置に適用した。乳サンプル １０ｍｌが入ったシリンジを、長いテフロンチューブに接続し、このチューブを、３つの槽に順次浸した。シリコーン製の最初の槽は、７０℃であり、テフロンチューブ ３ｍを備えており、２番目に接続された槽もまた、シリコーン製であり、１４０℃であり、且つテフロンチューブ ５０ｃｍを備えており、最後の槽は、１４０℃処理後に乳を冷却するための１ｍの氷／水槽（０℃）であった。シリンジで３ｍｌ／分の流量を適用し、乳サンプルを、３０秒にわたり７０℃で確実にインキュベートし、５秒にわたり１４０℃で確実にインキュベートした後、氷／水槽中で１０秒にわたり冷却して、この乳を０～１０℃まで冷却した。最後に、乳を、氷／水槽後に１０ｍｌシリンジで回収し、サンプルを、残存活性に関してアッセイした。
ＵＨＴ処理
１％（ｗ／ｖ）Ｓａｐｈｅｒａ ２６００Ｌ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、配列番号１）、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｂｉｏｌａｃｔａ Ｎ５（バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、配列番号２）、１％（ｗ／ｖ）Ｂｏｎｌａｃｔａ（ラクトバシラス・デルブリュッキイ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、配列番号３）、及び１％（ｗ／ｖ）Ｌａｃｔｏｚｙｍ Ｐｕｒｅ ６５００Ｌ（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ））をそれぞれ、ラクトース含有量が４．７％である脱脂乳に添加し、ＵＨＴ工程があるにもかかわらず、取り扱い／チューブ等が完全に無菌ではないことから、微生物の増殖を避けるために、アジ化ナトリウム＊を０．０２５％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加した。この乳サンプルを、下記で説明するように、実験室規模のＵＨＴ装置に適用した。乳サンプル １０ｍｌが入ったシリンジを、長いテフロンチューブに接続し、このチューブを、３つの槽に順次浸した。シリコーン製の最初の槽は、７０℃であり、テフロンチューブ ３ｍを備えており、２番目に接続された槽もまた、シリコーン製であり、１４０℃であり、且つテフロンチューブ ５０ｃｍを備えており、最後の槽は、１４０℃処理後に乳を冷却するための１ｍの氷／水槽（０℃）であった。シリンジで３ｍｌ／分の流量を適用し、乳サンプルを、３０秒にわたり７０℃で確実にインキュベートし、５秒にわたり１４０℃で確実にインキュベートした後、氷／水槽中で１０秒にわたり冷却して、この乳を０～１０℃まで冷却した。最後に、乳を、氷／水槽後に１０ｍｌシリンジで回収し、サンプルを、残存活性に関してアッセイした。
【0308】
＊アジ化ナトリウムは、無菌性が確保されている商業プロセスでは使用されないが、完全に無菌ではない可能性があり且つ乳が消費されないこの研究室設定では使用される。
【0309】
残存活性アッセイ
サンプルを、５℃で４５分にわたり、予冷した遠心分離機で２０，６００ｇにて遠心分離し、上清を、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム及び０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈して、４０５ｎｍで１．５未満の吸光度読取り値を測定可能にした。各サンプル ２５μｌを、ＯＮＰＧ基質（１．６７ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラトピラノシド、約５．５ｍＭ）、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５） １７５μｌと混合し、４０℃で２．５時間にわたりインキュベートし、Ｎａ２ＣＯ３ ５０μｌ＋５ｍＭ Ｎａ４ＥＤＴＡを添加して停止させ、４０５ｎｍで測定した。残存活性（％）を、式＝（（Ａｂｓ４０５加熱処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）／（（Ａｂｓ４０５非処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）＊１００％を使用して算出した。
サンプルを、５℃で４５分にわたり、予冷した遠心分離機で２０，６００ｇにて遠心分離し、上清を、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム及び０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈して、４０５ｎｍで１．５未満の吸光度読取り値を測定可能にした。各サンプル ２５μｌを、ＯＮＰＧ基質（１．６７ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラトピラノシド、約５．５ｍＭ）、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５） １７５μｌと混合し、４０℃で２．５時間にわたりインキュベートし、Ｎａ２ＣＯ３ ５０μｌ＋５ｍＭ Ｎａ４ＥＤＴＡを添加して停止させ、４０５ｎｍで測定した。残存活性（％）を、式＝（（Ａｂｓ４０５加熱処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）／（（Ａｂｓ４０５非処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）＊１００％を使用して算出した。
【0310】
加熱処理サンプルは、上記で説明したように、脱脂乳及びアジ化ナトリウムと混合し、ＵＨＴ処理及びその後の冷却に供した酵素である。非処理サンプルは、脱脂乳及びアジ化ナトリウムと混合したがＵＨＴ処理を行なっていない同一の酵素である。これらのサンプルの両方を、４０５ｎｍでの吸光度が０．５～１．０の範囲になるように希釈した。ブランクは、酵素を含まないサンプルであり、酵素を含むサンプルと同一の希釈係数を使用している。
【0311】
【表4】
【0312】
表３は、ラクターゼがＵＨＴ処理に対してさまざまな程度まで耐え得ることを示しており、最高の残留活性を、下記の順で見出し得る（最高の残存活性が最初）：Ｂｉｏｌａｃｔａ Ｎ５、Ｓａｐｈｅｒａ ２６００Ｌ、Ｌａｃｔｏｚｙｍ ｐｕｒｅ ６５００Ｌ、及びＢｏｎｌａｃｔａ。
【0313】
Ｂｉｏｌａｃｔａ（登録商標）Ｎ５（配列番号２）及びＳａｐｈｅｒａ（登録商標）２６００Ｌ（配列番号１）は、クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ラクターゼであり、Ｌａｃｔｏｚｙｍ（登録商標）Ｐｕｒｅ ６５００Ｌ（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の酵母ラクターゼ）、及びＢｏｎｌａｃｔａ（登録商標）（配列番号３）は、クレードＭＧＮのＧＨ２ラクターゼである。
【0314】
実施例３：
ＵＨＴ処理
表４に示すアミノ酸置換を有するＳａｐｈｅｒａ（配列番号１）のＰＥバリアントのバッチを、０．０２５％ アジ化ナトリウムを含む脱脂乳に、最終濃度５％（ｖ／ｖ）まで添加した。５％（ｖ／ｖ）は、ほぼ、Ｓａｐｈｅｒａ ２６００Ｌの１％（ｗ／ｖ）と同量の酵素に相当する。この乳サンプルを、下記で説明するように、実験室規模のＵＨＴ設定に適用した。乳サンプル １０ｍｌが入ったシリンジを、長いテフロンチューブに接続し、このチューブを、３つの槽に順次浸した。シリコーン製の最初の槽は、７０℃であり、テフロンチューブ ３ｍを備えており、２番目に接続された槽もまた、シリコーン製であり、１４０℃であり、且つテフロンチューブ ５０ｃｍを備えており、最後の槽は、１４０℃処理後に乳を冷却するための１ｍの氷／水槽（０℃）であった。シリンジで３ｍｌ／分の流量を適用し、乳サンプルを、３０秒にわたり７０℃で確実にインキュベートし、５秒にわたり１４０℃で確実にインキュベートした後、氷／水槽中で１０秒にわたり冷却して、この乳を０～１０℃まで冷却した。最後に、乳を、氷／水槽後に１０ｍｌシリンジで回収し、サンプルを、残存活性に関してアッセイした。
ＵＨＴ処理
表４に示すアミノ酸置換を有するＳａｐｈｅｒａ（配列番号１）のＰＥバリアントのバッチを、０．０２５％ アジ化ナトリウムを含む脱脂乳に、最終濃度５％（ｖ／ｖ）まで添加した。５％（ｖ／ｖ）は、ほぼ、Ｓａｐｈｅｒａ ２６００Ｌの１％（ｗ／ｖ）と同量の酵素に相当する。この乳サンプルを、下記で説明するように、実験室規模のＵＨＴ設定に適用した。乳サンプル １０ｍｌが入ったシリンジを、長いテフロンチューブに接続し、このチューブを、３つの槽に順次浸した。シリコーン製の最初の槽は、７０℃であり、テフロンチューブ ３ｍを備えており、２番目に接続された槽もまた、シリコーン製であり、１４０℃であり、且つテフロンチューブ ５０ｃｍを備えており、最後の槽は、１４０℃処理後に乳を冷却するための１ｍの氷／水槽（０℃）であった。シリンジで３ｍｌ／分の流量を適用し、乳サンプルを、３０秒にわたり７０℃で確実にインキュベートし、５秒にわたり１４０℃で確実にインキュベートした後、氷／水槽中で１０秒にわたり冷却して、この乳を０～１０℃まで冷却した。最後に、乳を、氷／水槽後に１０ｍｌシリンジで回収し、サンプルを、残存活性に関してアッセイした。
【0315】
残存活性アッセイ
サンプルを、５℃で４５分にわたり、予冷した遠心分離機で２０，６００ｇにて遠心分離し、上清を、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム及び０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈して、４０５ｎｍで１．５未満の吸光度読取り値を測定可能にした。各サンプル ２５μｌを、ＯＮＰＧ基質（１．６７ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラトピラノシド、約５．５ｍＭ）、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５（好ましくは、ＮａＯＨで調整した）） １７５μｌと混合し、４０℃で２．５時間にわたりインキュベートし、Ｎａ２ＣＯ３ ５０μｌ＋５ｍＭ Ｎａ４ＥＤＴＡを添加して停止させ、４０５ｎｍで測定した。残存活性（％）を、式＝（（Ａｂｓ４０５加熱処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）／（（Ａｂｓ４０５非処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）＊１００％を使用して算出した。
サンプルを、５℃で４５分にわたり、予冷した遠心分離機で２０，６００ｇにて遠心分離し、上清を、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム及び０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈して、４０５ｎｍで１．５未満の吸光度読取り値を測定可能にした。各サンプル ２５μｌを、ＯＮＰＧ基質（１．６７ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラトピラノシド、約５．５ｍＭ）、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５（好ましくは、ＮａＯＨで調整した）） １７５μｌと混合し、４０℃で２．５時間にわたりインキュベートし、Ｎａ２ＣＯ３ ５０μｌ＋５ｍＭ Ｎａ４ＥＤＴＡを添加して停止させ、４０５ｎｍで測定した。残存活性（％）を、式＝（（Ａｂｓ４０５加熱処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）／（（Ａｂｓ４０５非処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）＊１００％を使用して算出した。
【0316】
次いで、各バリアントの残存活性を、下記式＝（バリアントの残存活性％）／（配列番号１のラクターゼの残存活性％）＊１００％を使用して、配列番号１のラクターゼの残留活性と関連付けており、この数値を、表４に示す。
【0317】
【表5】
【0318】
表４は、Ｖ１～Ｖ１０の１０種全てのバリアントが、配列番号１のラクターゼと比較して残存活性が改善されていることを示す。特に、Ｖ９は、配列番号１のラクターゼと比較して６倍を超えて高い残存活性を有した。
【0319】
実施例４：
ＵＨＴ処理後に高い残存活性を有する新たに同定されたラクターゼ
この実施例では、多くの新たに同定されたラクターゼ及びこれらのバリアントは、本発明の方法で有用であることが実証されている。ラクターゼは、ＵＨＴ処理の直前に乳に添加されており、室温で数日間保存する間に乳中のラクトースを効率的に加水分解するのに十分な、ＵＨＴ処理後の残存活性を有することが示されている。
ＵＨＴ処理後に高い残存活性を有する新たに同定されたラクターゼ
この実施例では、多くの新たに同定されたラクターゼ及びこれらのバリアントは、本発明の方法で有用であることが実証されている。ラクターゼは、ＵＨＴ処理の直前に乳に添加されており、室温で数日間保存する間に乳中のラクトースを効率的に加水分解するのに十分な、ＵＨＴ処理後の残存活性を有することが示されている。
【0320】
一部のラクターゼは、分泌された酵素としての発現を容易にするためにＣ末端がトランケートされている新たに同定された野生型酵素であるが、他は、確立されているタンパク質操作（ＰＥ）技術を使用して１つ又は複数のアミノ酸が置換されている、これらの野生型酵素のバリアントである。この実施例で試験されている酵素を、下記の表５に列挙し、トランケートされた野生型酵素間の配列同一性のマトリックスを、表６に示す。
【0321】
一部の新たに同定された、Ｃ末端がトランケートされた野生型酵素は、２０２２年１２月２２日に出願された欧州特許出願第２２２１５７７６号明細書の優先権を主張する同時係属出願でさらに説明されている。
【0322】
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現
細菌ドナー株のゲノム配列（表５）を、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）からダウンロードし、ＣＡＺＹデータベースＧＨ２ファミリ（Ｌｏｍｂａｒｄ Ｖ，Ｇｏｌａｃｏｎｄａ Ｒａｍｕｌｕ Ｈ，Ｄｒｕｌａ Ｅ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ＰＭ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ（２０１４）Ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ），２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２：Ｄ４９０－Ｄ４９５；Ｅｌｏｄｉｅ Ｄｒｕｌａ，Ｍａｒｉｅ－Ｌｉｎｅ Ｇａｒｒｏｎ，Ｓｕｚａｎ Ｄｏｇａｎ，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｔｅｒｒａｐｏｎ，Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ５０，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１，７ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２２，Ｐａｇｅｓ Ｄ５７１－Ｄ５７７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）からの推定ラクターゼに関して分析した。
細菌ドナー株のゲノム配列（表５）を、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）からダウンロードし、ＣＡＺＹデータベースＧＨ２ファミリ（Ｌｏｍｂａｒｄ Ｖ，Ｇｏｌａｃｏｎｄａ Ｒａｍｕｌｕ Ｈ，Ｄｒｕｌａ Ｅ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ＰＭ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ（２０１４）Ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ），２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２：Ｄ４９０－Ｄ４９５；Ｅｌｏｄｉｅ Ｄｒｕｌａ，Ｍａｒｉｅ－Ｌｉｎｅ Ｇａｒｒｏｎ，Ｓｕｚａｎ Ｄｏｇａｎ，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｔｅｒｒａｐｏｎ，Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ５０，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１，７ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２２，Ｐａｇｅｓ Ｄ５７１－Ｄ５７７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）からの推定ラクターゼに関して分析した。
【0323】
表５の酵素をコードする遺伝子を、当技術分野で既知の標準的な方法を使用して、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現に最適化した。或いは、コドン最適化遺伝子を、商業的に購入し得る。配列番号９のラクターゼ（ネオバチルス・バタビエンシス（Ｎｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｖｉｅｎｓｉｓ））及び配列番号１２のラクターゼ（ストレプトマイセス・シラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｒｒａｔｕｓ））の場合には、（トランケートされた成熟ペプチドの）天然ＤＮＡを使用した。この遺伝子を、天然分泌シグナルを置き換えるバチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）分泌シグナルをコードする（下記のアミノ酸配列をコードする：ＭＫＫＰＬＧＫＩＶＡＳＴＡＬＬＩＳＶＡＦＳＳＳＩＡＳＡ（配列番号１６））ＤＮＡと融合させた。さらに、この発現構築物により、成熟ラクターゼに、アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＰＲ（配列番号１７）からなるアミノ末端ポリヒスチジンタグが付加されて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易になる。得られる遺伝子を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの完全に合成により製造されるＤＮＡ断片として注文した。
【0324】
線形統合構築物は、強力なプロモータ及びクロラムフェニコール耐性マーカーと共に２つのＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体領域間の目的の遺伝子の融合により形成されたＳＯＥ－ＰＣＲ融合産物（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，Ｇｅｎｅ ７７：６１－６８）であった。このＳＯＥ ＰＣＲ法はまた、国際公開第２００３０９５６５８号パンフレットでも説明されている。
【0325】
ラクターゼ遺伝子を、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、及び安定化配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡプロモータからのプロモータからなる三重プロモータ系（国際公開第９９／４３８３５号パンフレットで説明されている通り）の制御下で発現させた。
【0326】
ラクターゼ発現構築物のそれぞれに関して、ＳＯＥ－ＰＣＲ産物をバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換させ、ペクチン酸リアーゼ遺伝子座への相同組換えにより染色体に組み込んだ。続いて、組み込まれた発現構築物を含有する組換えバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンを、液体培地中で増殖させた。培養ブロスを遠心分離（２０，０００×ｇ、２０分）し、沈殿物から上清を注意深くデカントして酵素の精製に使用したか、或いは滅菌ろ過上清をアッセイに直接使用した。
【0327】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる組換え酵素の精製
清澄化した上清のｐＨをｐＨ８に調節し、０．２μＭフィルタに通してろ過し、上清を、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ（商標）エクセルカラムにアプライした。ロードする前に、このカラムを、５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８で平衡化した。非結合物質を除去するために、このカラムを、８ＣＶの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８で洗浄し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７＋１０ｍＭイミダゾールを用いて、標的の溶出液を得た。溶出したタンパク質を、３ＣＶの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７＋１００ｍＭ ＮａＣｌを使用して平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムで脱塩させた。この緩衝液をまた、標的の溶出にも使用し、流量は１０ｍｌ／分であった。関連する画分を選択し、クロマトグラム及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。
清澄化した上清のｐＨをｐＨ８に調節し、０．２μＭフィルタに通してろ過し、上清を、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ（商標）エクセルカラムにアプライした。ロードする前に、このカラムを、５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８で平衡化した。非結合物質を除去するために、このカラムを、８ＣＶの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８で洗浄し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７＋１０ｍＭイミダゾールを用いて、標的の溶出液を得た。溶出したタンパク質を、３ＣＶの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７＋１００ｍＭ ＮａＣｌを使用して平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムで脱塩させた。この緩衝液をまた、標的の溶出にも使用し、流量は１０ｍｌ／分であった。関連する画分を選択し、クロマトグラム及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。
【0328】
ＵＨＴ処理
表５の酵素を脱脂乳に添加し、ＵＨＴ処理を実施し、続いて０．５時間及び７２時間にわたり２３℃でインキュベートし、下記で説明するように、これら２つの間隔のそれぞれの後に、ラクターゼ活性及びラクトースの測定を実施した。
表５の酵素を脱脂乳に添加し、ＵＨＴ処理を実施し、続いて０．５時間及び７２時間にわたり２３℃でインキュベートし、下記で説明するように、これら２つの間隔のそれぞれの後に、ラクターゼ活性及びラクトースの測定を実施した。
【0329】
脱脂乳１リットル当たり５．５～３１．６ｍｇの酵素タンパク質（ｅｐ）を、酵素に応じて使用した。ほとんどの酵素に関して、１２．７ｍｇ ｅｐ／Ｌ 脱脂乳を使用した（表７、２列目を参照されたい）。取り扱い等に起因して、ＵＨＴ工程にもかかわらずチューブは完全には無菌ではないことから、アジ化ナトリウムを、試験する全ての乳において０．０２５％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加して、微生物の増殖を回避した。乳サンプルを、下記で説明する実験室規模のＵＨＴ設定に適用した。乳サンプル １０ｍｌが入ったシリンジを、長いテフロンチューブ（内径０．８ｍｍ）に接続し、このチューブを、４つの槽に順次浸した。最初の槽は、９０℃でシリコーンに覆われており、テフロンチューブ ３ｍを備えており、２番目に接続された槽は、１４０℃でシリコーンに覆われており、テフロンチューブ ５０ｃｍを備えており、３番目のシリコーン槽は、７０℃であり、テフロンチューブ ３ｍを備えており、最後の槽は、乳を冷却するための、テフロンチューブ １ｍを備える氷／水槽（０℃）であった。シリンジで３ｍｌ／分の流量を適用し、乳サンプルを、３０秒にわたり９０℃で確実にインキュベートし、５秒にわたり１４０℃及び３０秒にわたり７０℃で確実にインキュベートした後、氷／水槽中で１０秒にわたり冷却して、この乳を０～１０℃の範囲の温度まで冷却した。最後に、乳を、氷／水槽後にチューブに回収し、サンプルを、０．５時間及び７２時間それぞれにわたり２３℃でインキュベートし、次いで、パルスアンペロメトリー検出器を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を使用して、残存活性及びラクトース量に関してアッセイした。
【0330】
残存活性アッセイ
サンプルを、５℃で４５分にわたり、予冷した遠心分離機で２０，６００ｇにて遠心分離し、上清を、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム及び０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈して、４０５ｎｍで１．５未満の吸光度読取り値を測定可能にした。各サンプル ２５μｌを、ＯＮＰＧ基質（１．６７ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラトピラノシド、約５．５ｍＭ）、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５） １７５μｌと混合し、４０℃で２．５時間にわたりインキュベートし、Ｎａ２ＣＯ３ ５０μｌ＋５ｍＭ Ｎａ４ＥＤＴＡを添加して停止させ、４０５ｎｍで測定した。残存活性（％）を、式＝（（Ａｂｓ４０５加熱処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）／（（Ａｂｓ４０５非処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）＊１００％を使用して算出した。
サンプルを、５℃で４５分にわたり、予冷した遠心分離機で２０，６００ｇにて遠心分離し、上清を、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム及び０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈して、４０５ｎｍで１．５未満の吸光度読取り値を測定可能にした。各サンプル ２５μｌを、ＯＮＰＧ基質（１．６７ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニル β－Ｄ－ガラトピラノシド、約５．５ｍＭ）、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５） １７５μｌと混合し、４０℃で２．５時間にわたりインキュベートし、Ｎａ２ＣＯ３ ５０μｌ＋５ｍＭ Ｎａ４ＥＤＴＡを添加して停止させ、４０５ｎｍで測定した。残存活性（％）を、式＝（（Ａｂｓ４０５加熱処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）／（（Ａｂｓ４０５非処理サンプル－Ａｂｓ４０５ブランク）＊希釈係数）＊１００％を使用して算出した。
【0331】
加熱処理サンプルは、上記で説明したように、脱脂乳及びアジ化ナトリウムと混合し、ＵＨＴ処理及びその後の冷却に供し、続いて０．５時間及び７２時間にわたり２３℃でインキュベートした酵素である。非処理サンプルは、脱脂乳及びアジ化ナトリウムと混合したがＵＨＴ処理及びインキュベーションを行なっていない同一の酵素である。これらのサンプルの両方を、４０５ｎｍでの吸光度が０．５～１．０の範囲になるように希釈した。ブランクは、酵素を含まないサンプルであり、酵素を含むサンプルと同一の希釈係数を使用している。結果を、下記の表８に示す。
【0332】
残存ラクトース含有量の分析
残存ラクトースの分析を、パルスアンペロメトリー検出器を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）により実施した。
残存ラクトースの分析を、パルスアンペロメトリー検出器を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）により実施した。
【0333】
ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤのためのサンプル調製：
酵素を、乳サンプル １ｍｌに氷酢酸 ５ｕｌを添加することにより不活性化し、５分にわたり９０℃まで加熱し、１０分にわたり２０，０００ｇで遠心分離した。サンプル ５０ｕｌを、Ｍ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）Ｑ水 ５００ｕｌが入った５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。Ｃａｒｒｅｚ Ｉ溶液 １０ｕｌを添加して混合し、次いでＣａｒｒｅｚ ＩＩ溶液 １０ｕｌを添加して混合した。次いで、ＭＱ水 ４．４３ｍｌ（総量５ｍｌ）を、添加して混合した。遠心分離を、５分にわたり２０，０００ｇで実行した。上清を、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水で５倍希釈した。これらのサンプルを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで分析した。
酵素を、乳サンプル １ｍｌに氷酢酸 ５ｕｌを添加することにより不活性化し、５分にわたり９０℃まで加熱し、１０分にわたり２０，０００ｇで遠心分離した。サンプル ５０ｕｌを、Ｍ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）Ｑ水 ５００ｕｌが入った５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。Ｃａｒｒｅｚ Ｉ溶液 １０ｕｌを添加して混合し、次いでＣａｒｒｅｚ ＩＩ溶液 １０ｕｌを添加して混合した。次いで、ＭＱ水 ４．４３ｍｌ（総量５ｍｌ）を、添加して混合した。遠心分離を、５分にわたり２０，０００ｇで実行した。上清を、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水で５倍希釈した。これらのサンプルを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで分析した。
【0334】
ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを使用するラクトースの決定
実施する分析は、Ｌｅｅｕｗｅｎ Ｓ，Ｋｕｉｐｅｒｓ Ｂ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ Ｌ，Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ７ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｇａｌａｃｔｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＧＯＳ）ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２５（２０１６）４８－５８で本質的に説明されており、若干変更されており、例えば、下記で規定するように、勾配がより短くなっている。Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－６０００ワークステーション（Ｄｉｏｎｅｘ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用しており、これは、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ ４×５０ｍｍ Ｇｕａｒｄカラム（Ｄｉｏｎｅｘ，製品番号０４３０９６）、続いてＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ ４×２５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ，製品番号０３５３９１）及びＩＣＳ－６０００ ＤＣ ＥＣＤ検出器（Ｄｉｏｎｅｘ）を装備しており、Ａ：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水、Ｂ：１００ｍＭ ＮａＯＨ中の６００ｍＭ ＮａＯＡｃ、Ｃ：１００ｍＭ ＮａＯＨ、及びＤ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃの複合勾配を使用した。分画を、８５％Ａ、０％Ｂ、１０％Ｃ、及び５％Ｄ、１０％Ａ、０％Ｂ、４０％Ｃ、及び５０％Ｄへの２５分間の線形勾配、その後の０％Ａ、２５％Ｂ、７５％Ｃ、及び０％Ｄへの２分間の線形勾配、その直後の１００％Ｂによる５分間洗浄、並びに８５％Ａ、０％Ｂ、１０％Ｃ、及び５％Ｄによる１５分にわたる再生で、１．０ｍＬ／分にて実施した。ラクトース標準を使用して、酵素処理サンプル中のラクトースの量を決定した。結果を、下記の表７、３及び４列目に示す。
実施する分析は、Ｌｅｅｕｗｅｎ Ｓ，Ｋｕｉｐｅｒｓ Ｂ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ Ｌ，Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ７ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｇａｌａｃｔｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＧＯＳ）ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２５（２０１６）４８－５８で本質的に説明されており、若干変更されており、例えば、下記で規定するように、勾配がより短くなっている。Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－６０００ワークステーション（Ｄｉｏｎｅｘ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用しており、これは、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ ４×５０ｍｍ Ｇｕａｒｄカラム（Ｄｉｏｎｅｘ，製品番号０４３０９６）、続いてＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ ４×２５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ，製品番号０３５３９１）及びＩＣＳ－６０００ ＤＣ ＥＣＤ検出器（Ｄｉｏｎｅｘ）を装備しており、Ａ：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水、Ｂ：１００ｍＭ ＮａＯＨ中の６００ｍＭ ＮａＯＡｃ、Ｃ：１００ｍＭ ＮａＯＨ、及びＤ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃの複合勾配を使用した。分画を、８５％Ａ、０％Ｂ、１０％Ｃ、及び５％Ｄ、１０％Ａ、０％Ｂ、４０％Ｃ、及び５０％Ｄへの２５分間の線形勾配、その後の０％Ａ、２５％Ｂ、７５％Ｃ、及び０％Ｄへの２分間の線形勾配、その直後の１００％Ｂによる５分間洗浄、並びに８５％Ａ、０％Ｂ、１０％Ｃ、及び５％Ｄによる１５分にわたる再生で、１．０ｍＬ／分にて実施した。ラクトース標準を使用して、酵素処理サンプル中のラクトースの量を決定した。結果を、下記の表７、３及び４列目に示す。
【0335】
非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの用量反応曲線
ＵＨＴ処理サンプル中の酵素の活性と、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１、配列番号１）の活性とを比較可能にするために、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１、配列番号１）の用量／反応曲線を作成した。
ＵＨＴ処理サンプル中の酵素の活性と、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１、配列番号１）の活性とを比較可能にするために、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１、配列番号１）の用量／反応曲線を作成した。
【0336】
脱脂乳（＋０．０２５％アジ化ナトリウム）中のＢ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１）の下記の用量を二重に調製し：２．０３、１．６３、１．３０、１．０４、０．８３２、０．６６６、０．５３２、０．４２６、０．３４１、０．２７３、０．２１８、０．１７４、０．１４０、０．１１２、０．０８９３、０．０７１５ｍｇ ｅｐ／リットル 脱脂乳、この酵素を含む乳を、室温（２３℃）で３日にわたりインキュベートした。各サンプル中の残存ラクトースを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを使用して、上記の段落「残存ラクトース含有量の分析」で説明したように決定した。Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（＃３１）の投与量に対して、測定されたラクトースレベルをプロットすることにより、用量／反応曲線を作成した。図１を参照されたい。
【0337】
この曲線を使用して、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（＃３１）の活性に対する％での各ＵＨＴ処理ラクターゼの相対活性を決定した。表７の２及び４列目のデータを使用した。各ラクターゼに関して、この曲線を使用して、４列目の値（７２時間のインキュベーション後の残存ラクトース（％））を使用して、同一温度での７２時間のインキュベーション後の同一の残存ラクトース（％）に達するのに必要な非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの「対応する量」（ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳）を決定した。非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの活性に対する％でのＵＨＴ処理ラクターゼの相対活性を、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの「対応する量」（ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳）（即ち、７２時間にわたる２３℃でのインキュベーション後の同一の残存ラクトース含有量に達するのに必要な量）の逆数に対する百分率でのＵＨＴ処理ラクターゼの量（ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳）（表７の２列目）の逆数として算出し、前記値を、用量／反応曲線を使用して決定した。実際には、この算出を、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの「対応する量」（ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳）を、表７の２列目で見出されるＵＨＴ処理ラクターゼの量（ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳）で除算し、結果を百分率で表すことにより簡略化し得る。各ラクターゼに関してそのように決定された相対活性を、表７の６列目に示す。
【0338】
そのため、この値は、ＵＨＴ処理及び２３℃での３日間インキュベーションの後での残存ラクトースに基づく「ＵＨＴ処理後の酵素活性の残存」の尺度である。非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（配列番号１）（さらに２３℃で３日にわたりインキュベートされている）の用量／反応曲線を使用して、非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼの「対応する量」を決定する。
【0339】
【表6】
【0340】
【表7】
【0341】
【表8】
【0342】
【表9】
【0343】
【表10】
【0344】
【表11】
【0345】
結果：
表７の３及び４行目は、ＵＨＴ処理、その後の０．５時間及び７２時間それぞれの２３℃でのインキュベーションの後の残存ラクトースを示す。ラクトースの低減は、主に、０．５時間（初期ラクトースの９６％に対応する平均４．５ｇ ラクトース／１００ｍｌ）から７２時間に起こり、酵素＃１、３、及び５は、多くの国でラクトースフリーを主張するのに必要な０．０１％未満の残存ラクトースである。使用した酵素用量（ｍｇ ｅｑ／Ｌ 乳）を、２列目に、各酵素に関して示す。酵素用量が増加すると、７２時間後の残存ラクトースは低減される。
表７の３及び４行目は、ＵＨＴ処理、その後の０．５時間及び７２時間それぞれの２３℃でのインキュベーションの後の残存ラクトースを示す。ラクトースの低減は、主に、０．５時間（初期ラクトースの９６％に対応する平均４．５ｇ ラクトース／１００ｍｌ）から７２時間に起こり、酵素＃１、３、及び５は、多くの国でラクトースフリーを主張するのに必要な０．０１％未満の残存ラクトースである。使用した酵素用量（ｍｇ ｅｑ／Ｌ 乳）を、２列目に、各酵素に関して示す。酵素用量が増加すると、７２時間後の残存ラクトースは低減される。
【0346】
５列目は、（「０．５時間でのｇ／Ｌ ラクトース」－「７２時間でのｇ／Ｌ ラクトース」）／「ｍｇ ｅｐ／Ｌ」として算出された、ＵＨＴ処理後の擬似比活性（酵素タンパク質１ｍｇ当たりに変換されたラクトースのグラム）を示しており、即ち、２列目の値で除算された、３列目の値－４列目の値（但し、ラクトース％ではなくｇ／Ｌで表される）を示す。表７中の酵素＃１０に関するデータを使用する例：（４５ｇ／Ｌ ラクトース－１２．７ｇ／Ｌ ラクトース）／５．５ｍｇ ｅｐ／Ｌ＝５．９ｇ ラクトース／ｍｇ ｅｐ（７１．５時間当たり）。この疑似比活性は、酵素用量に対して残存ラクトースが直線的ではないことから、用量依存的であるという点で偏りがある（図１を参照されたい）。結果として、比較的低い酵素用量により、より高い酵素用量と比較して高い疑似比活性値が得られる。
【0347】
酵素の効率をより良く比較するために、「ストレス無負荷Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（＃３１）の相対活性」を上記のように算出しており、６列目に示す。酵素＃１０の場合の算出例を、図１に示しており、表７に従って、酵素＃１０の５．５ｍｇ ｅｐ／リットル 乳の用量を使用して、７２時間後に残存ラクトースが１．２７％となる（図１の水平矢印を参照されたい）。ストレス無負荷（非ＵＨＴ処理）Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１）の「対応する量」は、０．３９ｍｇ ｅｑとなる（図１の垂直矢印）。これにより、表７の６列目の酵素＃１０に関して示され得るように、７．１％の相対活性（０．３９／５．５＊１００％）が得られる。これは、ＵＨＴ処理及び７２時間にわたる２３℃でのインキュベーションの後のある特定の残存ラクトース含有量を得るのに必要なｅｐ量の逆数（７２時間にわたる２３℃でのインキュベーション後の同一の残存ラクトース含有量を得るのに必要な非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼのｅｐの「対応する量」の逆数に対する百分率）として決定された非ＵＨＴ処理Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（＃３１）と比較して、ＵＨＴ処理後の酵素の相対活性の非常に優れた尺度である。
【0348】
７、８、及び９列目は、７２時間にわたる２３℃での保存後に１．４１％の残存ラクトース（胃に優しいレベルは、ラクトースの７０％低減であり得る）、０．１％の残存ラクトース（多くの国で低ラクトースレベルと主張するため）、又は０．０１％の残存ラクトース（多くの国でラクトースフリーレベルと主張するため）に達するのに必要な、算出された酵素用量を示す。これらの数値を、下記の通りに算出する：１．４１％、０．１％、及び０．０１％のラクトースレベルに達するためのＢ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（酵素＃３１）のｍｇ ｅｐ／Ｌは、それぞれ、０．３６１、０．９３４、及び１．５６ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳である（図１の用量反応曲線から決定した）。「ストレス無負荷Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼに対する相対活性（％）」の数値（表７の６列目）を使用して、各酵素に関する対応する数値を予測し、例えば、酵素＃１０の場合には、「ストレス無負荷Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼに対する相対活性（％）」の数値は、７．１％（０．０７１）であり、従って、酵素＃１０に関する酵素タンパク質の対応する量は、０．３６１／０．０７１、０．９３４／０．０７１、及び１．５６／０．０７１ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳であり、これらは、５．１、１３．１、及び２２．０ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳である。
【0349】
５～５０ｍｇ ラクターゼ ｅｐ／Ｌ 乳（４．５～５．０％ラクトース）の酵素用量を、典型的には、４～１０℃での８～２４時間の範囲のタンクインキュベーションにより、工業用バッチラクトース低減用途で使用して、ラクトースレベルが０．０１～０．１％ ラクトースに達した（％＝ｇ ラクトース／１００ｍｌ 乳）。そのため、表７中の上位候補は、ラクトースフリー用途（０．０１％ ラクトース）に非常に適しており、相対活性がより低い他の配列は、ラクトースフリーではなくて低ラクトース用途により適し得る。
【0350】
表８の２及び３列目は、ＵＨＴ処理後０．５時間及び７２時間それぞれでの酵素の残存活性を示す。残存活性の程度は様々であり、驚くべきことに、ほとんどの酵素は、０．５時間と比較して７２時間後に残存活性が増加しており、列挙されている酵素の全てに関して平均３倍超である。
【0351】
実施例２では、配列番号１のラクターゼの残存活性を、冷却前の３０秒にわたる７０℃及び５秒にわたる１４０℃でのインキュベーションの後に、２．１４％と決定した。この実施例では、配列番号１のラクターゼ（酵素＃３１）を含むラクターゼを、冷却前に３０秒にわたり９０℃で、５秒にわたり１４０℃で、及び３０秒にわたり７０℃でインキュベートしており、従って、配列番号１のラクターゼの残存活性は、より低かった。
【0352】
残存活性％（表８）と、表７中の測定された残存ラクトースレベルとの間の相関が比較的低い理由は、各酵素のラクトースに対する比活性が異なるためであると考えられる。ＵＨＴ処理後にラクトースを加水分解する酵素の能力は、ラクトースを変換する酵素の効率（ＵＨＴ処理前の比活性）とＵＨＴ処理後の酵素の活性能力（残存活性％）とによる影響を受ける。
【0353】
アミノ酸変更により、酵素の性能が改善されている。特に、例えば、酵素＃１（ビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）、Ｃ３７２Ａ）での遊離Ｃｙｓ（酵素＃３１のＣ３７２に相同）の置き換え、例えば、酵素＃２及び４におけるジスルフィドの導入、並びに例えば、酵素＃３、６、及び７におけるｃｉｓ－プロリンの置き換え。
【0354】
この実施例は、表５中の酵素が全て、本明細書で特許請求されている方法での使用に適していることを示す。
【0355】
表５中の酵素は全て、クレードＤＹＬＧＥの細菌性ＧＨ２ラクターゼである。これらは全て、モチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］、ＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ、及び［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤを含む。
【0356】
【0357】
【表12】
【0358】
曲線を手作業／目視で読み取る代わりに、下記方程式１、並びに表１０中の「ａ」及び「ｂ」の数値を、見出しで言及されているラクターゼ％と共に使用して、適合方程式を作成した。表９中のラクトース％を使用して算出したｍｇ ｅｐ／Ｌを、表９の３列目に示す。
方程式１：ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳＝ａ＊Ｌｎ（ラクトース％）＋ｂ
方程式１：ｍｇ ｅｐ／Ｌ 乳＝ａ＊Ｌｎ（ラクトース％）＋ｂ
【0359】
【表13】
【0360】
実施例５：
ｐＨ６及び７での熱シフトアッセイ
熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）により、５０％が変性している温度であるタンパク質の融点（Ｔｍ）を測定する。タンパク質の変性を、標的タンパク質が展開するにつれて露出する疎水性残基に結合するＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光の増加によりモニタリングする。
ｐＨ６及び７での熱シフトアッセイ
熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）により、５０％が変性している温度であるタンパク質の融点（Ｔｍ）を測定する。タンパク質の変性を、標的タンパク質が展開するにつれて露出する疎水性残基に結合するＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光の増加によりモニタリングする。
【0361】
精製されたサンプルを、ＭｉｌｌｉＱ水で０．２４ｍｇ／ｍｌまで希釈した。熱シフトアッセイミックスを、ＳｙＰｒｏＯｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｓ６６５０）を、所望のｐＨ緩衝液（１００ｍＭ コハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ グリシン、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ６及び７に調整済）で２００倍希釈することにより調製した。希釈サンプル １０ｕｌを、９６ウェル（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０マルチウェルプレート、Ｒｏｃｈｅ＃０４７２９６９２００１）中のＴＳＡ ミックス ２０ｕｌに添加した。光学テープ（Ｒｏｃｈｅ、＃０４７２９７５７００１）で密封した後、プレートを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）中で２５℃から９５℃まで加熱し（温度上昇：３．２℃／分）、蛍光を連続的に測定した（切除／発光波長：４６５／５１０ｎｍ）。Ｔｍを、蛍光の一次導関数を温度の関数（ｄＦ／ｄＴ）としてプロットし、最大ｄＦ／ｄｔを持つ温度を決定することにより特定する。
【0362】
【表14】
【0363】
実施例６：
温度プロファイル
温度プロファイル３５℃～７５℃を決定するためのアッセイ：
最適温度を決定するための温度プロファイルを、希釈した酵素サンプル（５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈）１０μｌをＰＣＲチューブ入れることにより調製する。次いで、基質（１６７ｍＭ ラクトース、５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．５）９０μｌを添加し、このＰＣＲチューブを、（ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌサーモサイクラー、Ｂｉｏｍｅｔｒａを使用して）温度勾配３５～７５℃の予熱ＰＣＲブロックに入れ、３５～７５℃（勾配）で３０分にわたりインキュベートし、次いで氷上に置く。０．２５Ｍ ＮａＯＨ １００μｌを添加することにより、反応を停止させる。２０μｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＧＯＤ－Ｐｅｒｉｄ（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、０．６ｇ／ｌ グルコースオキシダーゼ、０．０２ｇ／ｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、１．０ｇ／ｌ ＡＢＴＳ）溶液 ２３０μＬを添加する。室温での暗所における３０分後、吸光度を４２０ｎｍで測定する。酵素の初期希釈を、最適温度での最終４２０ｎｍ読取り値が Ａｂｓ０．５～２．５であるように調整すべきである。４２０ｎｍでのデルタＡｂｓが最高の温度（「酵素ありのＡｂｓ ４２０ｎｍ」－「酵素なしのＡｂｓ ４２０ｎｍ」、即ち、バックグラウンド）を１００％とし（最適温度）、最高値のデルタＡｂｓ ４２０ｎｍに対するデルタＡｂｓ ４２０ｎｍに基づく他の温度での相対活性を使用して、温度プロフィアルを決定する。
温度プロファイル
温度プロファイル３５℃～７５℃を決定するためのアッセイ：
最適温度を決定するための温度プロファイルを、希釈した酵素サンプル（５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ６．５で希釈）１０μｌをＰＣＲチューブ入れることにより調製する。次いで、基質（１６７ｍＭ ラクトース、５０ｍＭ コハク酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．５）９０μｌを添加し、このＰＣＲチューブを、（ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌサーモサイクラー、Ｂｉｏｍｅｔｒａを使用して）温度勾配３５～７５℃の予熱ＰＣＲブロックに入れ、３５～７５℃（勾配）で３０分にわたりインキュベートし、次いで氷上に置く。０．２５Ｍ ＮａＯＨ １００μｌを添加することにより、反応を停止させる。２０μｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＧＯＤ－Ｐｅｒｉｄ（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、０．６ｇ／ｌ グルコースオキシダーゼ、０．０２ｇ／ｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、１．０ｇ／ｌ ＡＢＴＳ）溶液 ２３０μＬを添加する。室温での暗所における３０分後、吸光度を４２０ｎｍで測定する。酵素の初期希釈を、最適温度での最終４２０ｎｍ読取り値が Ａｂｓ０．５～２．５であるように調整すべきである。４２０ｎｍでのデルタＡｂｓが最高の温度（「酵素ありのＡｂｓ ４２０ｎｍ」－「酵素なしのＡｂｓ ４２０ｎｍ」、即ち、バックグラウンド）を１００％とし（最適温度）、最高値のデルタＡｂｓ ４２０ｎｍに対するデルタＡｂｓ ４２０ｎｍに基づく他の温度での相対活性を使用して、温度プロフィアルを決定する。
【0364】
下記の表１２に示すラクターゼ酵素を使用して、アッセイを実施した。酵素番号（酵素＃）は、表５に従う。
【0365】
【表15】
【0366】
３５～７５℃の温度プロファイルを、表１２に見出し得、酵素＃９、１１、３０、３１、及び１６それぞれに関して、４３．０℃、４７．５℃、３８．９℃、４３℃、及び３５℃未満に近い最適温度が示されている。５０％の活性が残る温度（最適温度以降）は、それぞれ約５５℃、５５℃、４６℃、５８℃、及び５２℃である（表１２からの評価、アスタリスク＊が付された２つの数値の間）。酵素の展開が完全に可逆的である場合には、最適後の活性の低下は、展開した酵素の量と相関し、表１１に示す「融点」（Ｔｍ、酵素の半分が展開されている）は、この表１２から得られる５０％残存活性に近いはずである。しかしながら、典型的には、展開は不可逆的であり、ラクトース加水分解速度には温度依存性もあり、どちらも活性の低下に影響を及ぼす。実施例５で決定されたＴｍは、酵素＃９、１１、３０、３１、及び１６に関してそれぞれ約５７℃、５５℃、５４℃、５６℃、及び６３℃であることから（表１１を参照されたい）、酵素＃９、１１、及び３１のＴｍと５０％残存活性との間には密接な一致があり、このことから、これらの酵素がアッセイで顕著な量の再折り畳みを有することが示唆されている。
【0367】
高温（７０℃超）での相対活性のわずかな量（２～５％）は、一定であるように見え、これはおそらく、室温から７０℃超への昇温中のラクトース加水分解に起因している（昇温時間は、１分未満と予想される）。
【0368】
実施例７
遊離システインの酸化の除去剤としての還元剤
酵素＃３１には、潜在的に酸化される可能性がある２つの遊離システイン（即ち、ジスルフィド形態ではないシステイン）（Ｃ３７２及びＣ１１９９）が存在しており、そのため再折り畳みが妨げられている。この実験を行なって、還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が、乳中に存在する酸化化合物と反応することにより、このＣｙｓ酸化の除去剤となり得るかどうかを確認した。ＵＨＴ処理及び残存活性（ＲＡ）の測定を、実施例４で説明されているように行なった。下記の表１３に示すように、０．１ｍＭ ＤＴＴの添加によるプラスの効果があり（最後の列を参照されたい（「ＤＴＴありのＲＡ％」／「ＤＴなしのＲＡ％」により算出されている））、このことから、乳中に存在する酸化化合物の除去により、１つ又は複数の遊離システインを含むラクターゼ酵素の残存活性が増加することが示唆されている。０．１ｍＭ ＤＴＴの添加は、システインが異なるアミノ酸に置換されている（それぞれ、Ｃ３７２Ａ及びＣ１１９９Ｓ）２種のバリアントに対しては、それほど顕著な効果がない。これらを野生型（酵素＃３１）と比較すると、ＤＴＴ添加の効果は、より低い。このことから、酵素＃３１での「遊離システイン」の酸化が再折り畳みに影響を及ぼすことが明確に示されている。０．１ｍＭ ＤＴＴでの野生型（酵素＃３１）の残存活性は、ＰＥバリアントＣ３７２Ａとほぼ同一であり、このことから、Ｃ３７２が酸化に対して最も敏感であることが示唆されている。ＤＴＴは、食品摂取には適していないが、食品用に認可されている他の還元剤（例えば、Ｌ－システイン、亜硫酸塩、又はグルタチオン）を、乳又は酵素製剤に添加し得る。
遊離システインの酸化の除去剤としての還元剤
酵素＃３１には、潜在的に酸化される可能性がある２つの遊離システイン（即ち、ジスルフィド形態ではないシステイン）（Ｃ３７２及びＣ１１９９）が存在しており、そのため再折り畳みが妨げられている。この実験を行なって、還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が、乳中に存在する酸化化合物と反応することにより、このＣｙｓ酸化の除去剤となり得るかどうかを確認した。ＵＨＴ処理及び残存活性（ＲＡ）の測定を、実施例４で説明されているように行なった。下記の表１３に示すように、０．１ｍＭ ＤＴＴの添加によるプラスの効果があり（最後の列を参照されたい（「ＤＴＴありのＲＡ％」／「ＤＴなしのＲＡ％」により算出されている））、このことから、乳中に存在する酸化化合物の除去により、１つ又は複数の遊離システインを含むラクターゼ酵素の残存活性が増加することが示唆されている。０．１ｍＭ ＤＴＴの添加は、システインが異なるアミノ酸に置換されている（それぞれ、Ｃ３７２Ａ及びＣ１１９９Ｓ）２種のバリアントに対しては、それほど顕著な効果がない。これらを野生型（酵素＃３１）と比較すると、ＤＴＴ添加の効果は、より低い。このことから、酵素＃３１での「遊離システイン」の酸化が再折り畳みに影響を及ぼすことが明確に示されている。０．１ｍＭ ＤＴＴでの野生型（酵素＃３１）の残存活性は、ＰＥバリアントＣ３７２Ａとほぼ同一であり、このことから、Ｃ３７２が酸化に対して最も敏感であることが示唆されている。ＤＴＴは、食品摂取には適していないが、食品用に認可されている他の還元剤（例えば、Ｌ－システイン、亜硫酸塩、又はグルタチオン）を、乳又は酵素製剤に添加し得る。
【0369】
【表16】
【0370】
実施例８：
工業規模の設定で高タンパク質チョコレート乳にて試験した配列番号１のラクターゼ酵素
４４ｍｇ ｅｐ「配列番号１」／Ｌを、４．５％ ラクトース、８％ 乳タンパク質、及び１％ ココアパウダーを含む高タンパク質チョコレート乳 ４０００Ｌと共に、高剪断ミキサーに入れた。Ｅｌｅｃｓｔｅｒ １０８００ ＵＨＴ装置を使用し（間接ＵＨＴ処理）、流量は約１０，０００Ｌ／ｈ（９０％容量）であり、酵素を、ＵＨＴ処理開始の３０分前に添加した。ＵＨＴ条件を、５秒にわたる１４０～１４２℃での高加熱工程の前の５分にわたる８０℃でのタンパク質安定化と共に実施した（均質化を、７０℃、１５０／５０ｂａｒで上流にて行なった）。ＵＨＴ後にサンプルを回収して凍結させ、１つのサンプルを、１時間後に回収して凍結させ、残りのサンプルを、１～９日にわたり周囲温度で保存し、次いで凍結させた。全てのサンプルを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを使用して、実施例４で説明されているように、残存ラクトースに関して分析した。
工業規模の設定で高タンパク質チョコレート乳にて試験した配列番号１のラクターゼ酵素
４４ｍｇ ｅｐ「配列番号１」／Ｌを、４．５％ ラクトース、８％ 乳タンパク質、及び１％ ココアパウダーを含む高タンパク質チョコレート乳 ４０００Ｌと共に、高剪断ミキサーに入れた。Ｅｌｅｃｓｔｅｒ １０８００ ＵＨＴ装置を使用し（間接ＵＨＴ処理）、流量は約１０，０００Ｌ／ｈ（９０％容量）であり、酵素を、ＵＨＴ処理開始の３０分前に添加した。ＵＨＴ条件を、５秒にわたる１４０～１４２℃での高加熱工程の前の５分にわたる８０℃でのタンパク質安定化と共に実施した（均質化を、７０℃、１５０／５０ｂａｒで上流にて行なった）。ＵＨＴ後にサンプルを回収して凍結させ、１つのサンプルを、１時間後に回収して凍結させ、残りのサンプルを、１～９日にわたり周囲温度で保存し、次いで凍結させた。全てのサンプルを、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを使用して、実施例４で説明されているように、残存ラクトースに関して分析した。
【0371】
【表17】
【0372】
表１４は、ＵＨＴ処理後の残存ラクトースを示す（データは、２回の測定の平均であり、Ａｖｇ．Ｄｅｖ．は、「この平均からのデータ点の絶対偏差の平均」である）。使用した用量により、周囲温度での９日間後に、低ラクトース（０．１％未満のラクトース）と主張し得る。より多くの酵素が添加されると、これに応じて、ラクトースがより早く低減されるだろう。
【0373】
実施例９：
配列番号４のさらなるＰＥバリアント
この実施例では、配列番号４のさらなるＰＥバリアントを、実施例４と同一の条件を使用して試験した。ＵＨＴ処理後に２４時間にわたり２３℃でインキュベートし、次いで残存活性及びラクトース量に関してアッセイしたサンプルを含めた。
配列番号４のさらなるＰＥバリアント
この実施例では、配列番号４のさらなるＰＥバリアントを、実施例４と同一の条件を使用して試験した。ＵＨＴ処理後に２４時間にわたり２３℃でインキュベートし、次いで残存活性及びラクトース量に関してアッセイしたサンプルを含めた。
【0374】
【表18】
【0375】
【表19】
【0376】
【表20】
【0377】
【表21】
【0378】
実施例１０：
クレード及び系統樹の構築
ＧＨ２系統樹
ＣＡＺＹで定義されるように、ＧＨ２ドメインを含む本発明のポリペプチド配列の系統樹を構築した（Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ｅｔ ａｌ，２０１４．Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ） ｉｎ ２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：Ｄ４９０－５，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）。少なくとも１つのＧＨ２ドメインを含む成熟ポリペプチド配列の多重アラインメントから、系統樹を構築した。これらの配列を、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズムバージョン３．８．３１（Ｅｄｇａｒ，２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７）を使用してアラインさせ、この系統樹を、ＦａｓｔＴｒｅｅバージョン２．１．８（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ５（３）：ｅ９４９０）を使用して構築し、ｉＴＯＬ（Ｌｅｔｕｎｉｃ ＆ Ｂｏｒｋ，２００７．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（１）：１２７－１２８）を使用して可視化した。
クレード及び系統樹の構築
ＧＨ２系統樹
ＣＡＺＹで定義されるように、ＧＨ２ドメインを含む本発明のポリペプチド配列の系統樹を構築した（Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ｅｔ ａｌ，２０１４．Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ） ｉｎ ２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：Ｄ４９０－５，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）。少なくとも１つのＧＨ２ドメインを含む成熟ポリペプチド配列の多重アラインメントから、系統樹を構築した。これらの配列を、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズムバージョン３．８．３１（Ｅｄｇａｒ，２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７）を使用してアラインさせ、この系統樹を、ＦａｓｔＴｒｅｅバージョン２．１．８（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ５（３）：ｅ９４９０）を使用して構築し、ｉＴＯＬ（Ｌｅｔｕｎｉｃ ＆ Ｂｏｒｋ，２００７．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（１）：１２７－１２８）を使用して可視化した。
【0379】
ＧＨ２ドメインを含むポリペプチドのサブセットも、ＰｆａｍドメインＩＤ ＰＦ０２８３７で定義されているように、グリコシルヒドロラーゼファミリ２Ｎ末端ドメインも含む（Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ：ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｍｏｒｅ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｆｕｔｕｒｅ：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ｒ．Ｙ．Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ａ．Ｌ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｓ．Ｃ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．Ｐｕｎｔａ，Ｍ．Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ａ．Ｓａｎｇｒａｄｏｒ－Ｖｅｇａｓ，Ｇ．Ａ．Ｓａｌａｚａｒ，Ｊ．Ｔａｔｅ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ４４：Ｄ２７９－Ｄ２８５）。このドメインは、ガラクトースの結合に関与する。本発明の全てのポリペプチドは、このグリコシルヒドロラーゼファミリ２Ｎ末端ドメインに加えて、ＧＨ２ドメインも含む。このグリコシルヒドロラーゼファミリ２Ｎ末端ドメインを、ＧＨ２Ｎドメインとする。一例として、ビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）由来の配列番号４において、ＧＨ２Ｎドメインは、３４～１７８位に位置している。
【0380】
クレードの生成
ＧＨ２ドメインの含有に加えて、本発明のポリペプチドはまた、ラクターゼ活性に重要ないくつかの固有の短いペプチドモチーフも含む。本発明者らのデータから、これらのモチーフはまた、ＵＨＴ処理等の加熱処理後に酵素が再び折り畳む能力にも重要であることが示されている。
ＧＨ２ドメインの含有に加えて、本発明のポリペプチドはまた、ラクターゼ活性に重要ないくつかの固有の短いペプチドモチーフも含む。本発明者らのデータから、これらのモチーフはまた、ＵＨＴ処理等の加熱処理後に酵素が再び折り畳む能力にも重要であることが示されている。
【0381】
一例は、ビフィドバクテリウム・サミリイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｍｉｒｉｉ）（配列番号４）中の５９１～６００位に対応する位置に位置するＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］（配列番号１８）である。
【0382】
ＧＨ２ドメインを含むポリペプチドを、異なるサブクラスタに分け得る。これらのサブクラスタは、１つ又は複数の短い配列モチーフにより定義されており、さらにはＧＨ２ドメインを含む。
【0383】
ＤＹＬＧＥクレードの生成
本発明者らは、短いペプチドモチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］（配列番号１８）を含むあるサブクラスタを、ＤＹＬＧＥクレードとした。配列番号４の５９９位に位置する、このモチーフ中のグルタミン酸Ｅは、ガラクトースの結合に関与する。ＧＨ２ドメイン及びこのモチーフを含む全てのポリペプチド配列を、ＤＹＬＧＥクレードに属するとする。ＤＹＬＧＥクレードはまた、追加の短いペプチドモチーフも含み得る。配列番号４の１６４～１７４位に位置するＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ（配列番号１９）、及び配列番号４の６２～６７位に対応するモチーフ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤ（配列番号２０）。どちらのモチーフも、ＧＨ２Ｎガラクトース結合ドメイン中に位置しており、基質結合に重要である。
本発明者らは、短いペプチドモチーフＷＴＸＸＤＹ［Ｉ／Ｌ／Ｒ］ＧＥ［Ｐ／Ｓ／Ａ］（配列番号１８）を含むあるサブクラスタを、ＤＹＬＧＥクレードとした。配列番号４の５９９位に位置する、このモチーフ中のグルタミン酸Ｅは、ガラクトースの結合に関与する。ＧＨ２ドメイン及びこのモチーフを含む全てのポリペプチド配列を、ＤＹＬＧＥクレードに属するとする。ＤＹＬＧＥクレードはまた、追加の短いペプチドモチーフも含み得る。配列番号４の１６４～１７４位に位置するＳＲ［Ｗ／Ｙ／Ｆ］ＹＳＧＳＧＸ［Ｙ／Ｇ］Ｒ（配列番号１９）、及び配列番号４の６２～６７位に対応するモチーフ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］Ｘ［Ｌ／Ｖ／Ｉ］ＰＨＤ（配列番号２０）。どちらのモチーフも、ＧＨ２Ｎガラクトース結合ドメイン中に位置しており、基質結合に重要である。
【0384】
ＭＧＮクレードの生成
本発明者らは、配列番号３の５３２～５３９位に位置するモチーフＥＹＸＨ［Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｔ］ＭＧ［Ｎ／Ｔ／Ｌ］（配列番号２１）を含むＧＨ２の別のサブクラスタを、ＭＧＮクレードとした。グルタミン酸残基Ｅは、クレード内で完全に保存されており、酵素の活性部位において求核触媒として作用する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔｋｂ／Ｂ３ＧＳ９０／ｅｎｔｒｙ）。
本発明者らは、配列番号３の５３２～５３９位に位置するモチーフＥＹＸＨ［Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｔ］ＭＧ［Ｎ／Ｔ／Ｌ］（配列番号２１）を含むＧＨ２の別のサブクラスタを、ＭＧＮクレードとした。グルタミン酸残基Ｅは、クレード内で完全に保存されており、酵素の活性部位において求核触媒として作用する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔｋｂ／Ｂ３ＧＳ９０／ｅｎｔｒｙ）。
【0385】
ＧＨ２ドメイン及びこのモチーフを含む全てのポリペプチド配列を、ＭＧＮクレードに属するとする。
【0386】
ＭＧＮクレードはまた、１つ又は複数の追加のモチーフも含み得る。モチーフ［Ｉ／Ｖ］ＲＸ［Ａ／Ｃ／Ｓ］ＨＹＰ［Ｎ／Ｐ／Ｄ／Ｑ／Ｔ／Ｓ］［Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｖ］（配列番号２２）は、配列番号３の３８２～３９０位に位置しており、同様に、モチーフＹＧＧ［Ｄ／Ｎ］Ｘ［Ｇ／Ｄ］［Ｅ／Ｄ］（配列番号２３）は、配列番号３の５７７～５８３位に対応しており、ＧＸＸＸＷ［Ｄ／Ｅ］［Ｗ／Ｆ／Ｙ］Ｘ［Ｄ／Ｅ／Ｎ］［Ｑ／Ｅ／Ｈ］］（配列番号２４）は、配列番号３の５５８～５６７位に対応している。これらのモチーフは、配列番号３の活性部位付近で見出されており、基質結合に関与している。
【0387】
実施例１１（比較例）：
クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ではないラクターゼ
例えば高い耐熱性及び／又は高い比活性を有する多くの先行技術のラクターゼは、クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ラクターゼではない。これらの内のいくつかを、表１８に列挙する。
クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ではないラクターゼ
例えば高い耐熱性及び／又は高い比活性を有する多くの先行技術のラクターゼは、クレードＤＹＬＧＥのＧＨ２ラクターゼではない。これらの内のいくつかを、表１８に列挙する。
【0388】
【表22】
【0389】
クレードＭＧＮの多くの細菌性ＧＨ２ファミリラクターゼ酵素を、実施例４でのＧＨ２クレードＤＹＬＧＥラクターゼと同じ方法でＵＨＴ処理した（表７～８）。データを、表１９に示す。
【0390】
【表23】
【0391】
７２時間後にはラクトースレベルにほとんど変化が見られず、従って、ＵＨＴ処理後の酵素タンパク質１ｍｇ当たりに変換されたラクトースのグラムも非常に低くかった（（「０．５時間でのｇ／Ｌ ラクトース」－「７２時間でのｇ／Ｌ ラクトース」）／「ｍｇ ｅｐ／Ｌ」として算出、例えば、酵素＃４０の場合には、（４３．７５－４２．２７）／１５＝０．０９８ｇ ラクトース／ｍｇ ｅｐ）。同様に、非常に低い残存活性も見られた。１つ（酵素＃４２）を除く全てに関して、残存活性は、検出レベル未満であった。
【0392】
これらのデータは、ＧＨ２クレードＤＹＬＧＥ及びＧＨ２クレードＭＧＮの両方がＧＨ２ファミリに属するにもかかわらず、試験したＧＨ２クレードＭＧＮラクターゼ酵素の全てが、実施例４で試験したＧＨ２クレードＤＹＬＧＥラクターゼ酵素と比較して、ＵＨＴ処理後の残存が低いことを示す。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】