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特表2025-501740ワクチンにおけるアジュバントとしてのインターフェロンの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-23
(54)【発明の名称】ワクチンにおけるアジュバントとしてのインターフェロンの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/19 20060101AFI20250116BHJP
C12N 15/33 20060101ALI20250116BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250116BHJP
C12N 15/45 20060101ALI20250116BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20250116BHJP
C12N 15/47 20060101ALI20250116BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20250116BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20250116BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250116BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20250116BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20250116BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20250116BHJP
A61K 39/205 20060101ALI20250116BHJP
A61K 39/23 20060101ALI20250116BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20250116BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250116BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20250116BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250116BHJP
A01K 61/13 20170101ALI20250116BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20250116BHJP
【ＦＩ】
C12N15/19 ZNA
C12N15/33
C12N15/62 Z
C12N15/45
C12N15/44
C12N15/47
C12N15/50
C12Q1/686 Z
C12N15/63 Z
C12Q1/02
A61K39/155
A61K39/145
A61K39/205
A61K39/23
A61K39/245
A61P31/14
A61P31/22
A61P43/00 171
A01K61/13
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537378
(86)(22)【出願日】2022-12-19
(85)【翻訳文提出日】2024-08-15
(86)【国際出願番号】 US2022081916
(87)【国際公開番号】W WO2023122526
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】63/291,585
(32)【優先日】2021-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515230154
【氏名又は名称】ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ハウグランド，オイビンド
(72)【発明者】
【氏名】カルセン，マリウス・アンドレ・デ・フェイテル
(72)【発明者】
【氏名】ハウゲ，リンダ・ヘレナ
(72)【発明者】
【氏名】ロウデ，マリト
【テーマコード（参考）】
2B104
4B063
4B065
4C085
【Ｆターム（参考）】
2B104AA02
2B104BA14
4B063QA13
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QS25
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA45
4C085AA03
4C085BA55
4C085BA57
4C085BA64
4C085BA75
4C085BA78
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
(57)【要約】
魚ワクチンにおけるアジュバントとして有用なサケインターフェロン配列が開示される。また、当該インターフェロン配列を利用した魚ワクチン、及びこれらのワクチンを利用した魚の感染の予防のための方法も開示される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号６若しくは５０、又は配列番号６若しくは配列番号５０に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が、配列番号１８に対して６５～９０％同一、又は配列番号１９に対して６５～９０％同一であり、コドン頻度が、前記核酸配列中に保存される、核酸配列。
【請求項2】
前記核酸配列が、配列番号１８又は配列番号１９に対して７０～７９％同一である、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項3】
前記アミノ酸配列が、配列番号６又は配列番号５０に対して少なくとも９８％同一である、請求項１又は２に記載の核酸配列。
【請求項4】
配列番号６又は配列番号５０と異なるアミノ酸の少なくとも５０％が、保存的置換である、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項5】
配列番号２０又は配列番号１７に対して少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項6】
配列番号２０又は配列番号１７に対して少なくとも９５％同一である、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項7】
第２のプロモーターの作動可能な制御下の、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、発現カセット。
【請求項8】
前記第２のプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー及びプロモーターである、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項9】
抗原をコードする核酸配列を更に含む、請求項７又は８に記載の発現カセット。
【請求項10】
前記抗原が、非エンベロープウイルスの構造タンパク質、又は前記構造タンパク質の部分を含み、前記部分が、防御免疫応答を誘発することができる、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項11】
前記抗原が、融合タンパク質であって、ａ）前記抗原の前記アミノ酸配列の上流の分泌タンパク質又は第１の膜結合タンパク質のＮ末端分泌シグナル配列、
ｂ）前記抗原の前記アミノ酸配列の下流の第２の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを含む、融合タンパク質として発現する、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項12】
前記第１及び第２のタンパク質が、タイセイヨウサケパラミクソウイルス融合タンパク質、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）のヘマグルチニン（ＨＥ）タンパク質、及びウイルス性出血性敗血症ウイルスＧ－タンパク質（ＶＨＳＶ－Ｇ）からなる群から独立して選択される、請求項１１に記載の発現カセット。
【請求項13】
前記第１の膜結合タンパク質が、前記第２の膜結合タンパク質と同一である、請求項１１又は１２に記載の発現カセット。
【請求項14】
前記膜結合タンパク質が、ウイルス性出血性敗血症ウイルスＧ－タンパク質（ＶＨＳＶ－Ｇ）である、請求項１３に記載の発現カセット。
【請求項15】
前記Ｎ末端分泌シグナル配列が、配列番号７若しくは４８に対して少なくとも９０％同一であるか、又は前記分泌シグナル配列が、配列番号４８、若しくは配列番号４８に対して少なくとも９０％同一の配列の部分を含み、前記部分が、配列番号７、若しくは配列番号７に対して少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１４に記載の発現カセット。
【請求項16】
前記Ｎ末端分泌シグナルにおける異なるアミノ酸の少なくとも半分が、保存的置換である、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項17】
前記膜貫通ドメインが、配列番号８若しくは４９に対して少なくとも９０％同一であるか、又は前記膜貫通断片が、配列番号４９、若しくは配列番号４９に対して少なくとも９０％同一の配列の部分を含み、前記部分が、配列番号８、若しくは配列番号８に対して少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項18】
前記膜貫通ドメインにおける異なるアミノ酸の少なくとも半分が、保存的置換である、請求項１７に記載の発現カセット。
【請求項19】
前記構造タンパク質が、カプシドタンパク質である、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項20】
前記非エンベロープウイルスが、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）である、請求項１０～１８に記載の発現カセット。
【請求項21】
前記抗原が、配列番号１、又はそれに対して９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の発現カセット。
【請求項22】
魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原が、Ｎ末端からＣ末端に、ａ．配列番号又は配列番号３５に対して少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９１％同一、若しくは少なくとも９２％同一、若しくは少なくとも９３％同一、若しくは少なくとも９４％同一、若しくは少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９６％同一、若しくは少なくとも９７％同一、若しくは少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一である配列と、
ｂ．配列番号２５～３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列と、を含み、
ｉ）前記魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１５、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一の配列を欠き、かつ／又は
ｉｉ）配列番号１と比較して、前記魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含む、請求項２０に記載の発現カセット。
【請求項23】
前記抗原が、配列番号１５、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列と、配列番号４、５、２５、２６、２７、２９、３０、３２のうちのいずれか１つ、又は配列番号４、５、２５、２６、２７、２９、３０、若しくは３２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、を含み、配列番号１と比較して、前記タンパク質が、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含み、任意選択的に、前記タンパク質が、前記内部欠失の代わりにリンカーを含む、請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項24】
配列番号２５に対して少なくとも９５％同一である配列を含み、配列番号１４、又は配列番号１４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く、請求項２２に記載の魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原。
【請求項25】
前記抗原が、配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号４６に対して少なくとも９５％同一である、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項26】
前記抗原と配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号４６との間で異なるアミノ酸の少なくとも５０％が、保存的置換である、請求項２５に記載の発現カセット。
【請求項27】
前記抗原が、エンベロープウイルスの外表面タンパク質、又は前記外表面タンパク質の断片であり、前記断片が、防御免疫応答を誘発することができる、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項28】
前記エンベロープウイルスが、コロナウイルスであり、前記外表面タンパク質が、スパイクタンパク質である、請求項２７に記載の発現カセット。
【請求項29】
前記抗原が、フナムシの中腸由来のタンパク質又はその断片を含み、前記断片が、配列番号２１に対して少なくとも９０％同一である、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項30】
前記抗原をコードする前記核酸配列が、第１のプロモーターの作動可能な制御下にある、請求項９～２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項31】
前記第１のプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー及びプロモーターである、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項32】
請求項９～３１のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ワクチン。
【請求項33】
請求項７又は８に記載の発現カセットを含み、抗原を更に含む、ワクチン。
【請求項34】
感染に対してサケ科の魚にワクチン接種する方法であって、請求項３２又は３３に記載のワクチンを前記サケ科の魚に投与することを含む、方法。
【請求項35】
前記ベクターが、前記抗原をコードする前記核酸配列を含む発現カセットを含み、前記抗原が、非エンベロープウイルスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記非エンベロープウイルスが、ＰＭＣＶである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記サケ科の魚が、１５～２００グラムの重量がある、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記サケ科の魚が、４０～１１０グラムの重量がある、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記サケ科の魚が、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、又はギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ）である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記サケ科の魚が、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒである、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
アジュバントとしてのＩ型インターフェロンの効率を評価する方法であって、前記方法が、ａ）インターフェロンをコードする核酸配列を供給源細胞にトランスフェクションすることと、
ｂ）前記供給源細胞を培養することであって、前記インターフェロンが、供給源細胞培地中に分泌される、培養することと、
ｃ）培養された標的細胞を前記供給源細胞培地の少なくとも部分と接触させることであって、前記標的細胞が、インターフェロンに応答してＭｘ遺伝子を自然に発現させる、接触させることと、かつ
ｄ）Ｍｘ遺伝子発現を測定することと、を含む、方法。
【請求項42】
前記１型インターフェロンが、インターフェロンＢである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
インターフェロンをコードする前記核酸が、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸配列である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記供給源細胞が、ＣＨＨ－１細胞である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記標的細胞が、ＴＯ－細胞である、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記Ｍｘ遺伝子発現を測定する工程が、ＲＴ－ＰＣＲを含む、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
同じＩ型インターフェロンをコードするＮ個の配列（Ｎ＞１）の群におけるどの核酸配列が、より効率的な発現を付与するかを決定する方法であって、前記方法が、Ｎ個の配列の群の各メンバーについて、ａ）インターフェロンをコードするＮ番目の核酸配列を供給源細胞のＮ番目のバッチにトランスフェクションすることと、
ｂ）前記Ｎ番目のバッチの供給源細胞を培養することであって、前記インターフェロンが、供給源細胞培地に分泌される、培養することと、
ｃ）培養された標的細胞のＮ番目のバッチを、前記供給源細胞の前記Ｎ番目のバッチからの前記供給源細胞培地の少なくとも部分と接触させることであって、前記標的細胞が、インターフェロンに応答してＭｘ遺伝子を自然に発現させる、接触させることと、
ｄ）前記標的細胞の前記Ｎ番目のバッチにおけるＭｘ遺伝子発現を測定することと、
ｅ）１～Ｎの前記標的細胞の各バッチにおける前記Ｍｘ遺伝子発現を比較することと、を含む、方法。
【請求項48】
前記１型インターフェロンが、インターフェロンＢである、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
インターフェロンをコードする前記核酸が、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸配列である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記供給源細胞が、ＣＨＨ－１細胞である、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記標的細胞が、ＴＯ－細胞である、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記Ｍｘ遺伝子発現を測定する工程が、ＲＴ－ＰＣＲを含む、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
サケ科の魚を感染から保護する方法で使用するための、請求項３２又は３３に記載のワクチン。
【請求項54】
前記ベクターが、前記抗原をコードする前記核酸配列を含む発現カセットを含み、前記抗原が、非エンベロープウイルスである、請求項５３に記載のワクチン。
【請求項55】
前記非エンベロープウイルスが、ＰＭＣＶである、請求項５４に記載のワクチン。
【請求項56】
前記サケ科の魚が、１５～２００グラムの重量がある、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項57】
前記サケ科の魚が、４０～１１０グラムの重量がある、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項58】
前記サケ科の魚が、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、又はギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ）である、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記サケ科の魚が、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒである、請求項５８に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、水産養殖ワクチンの分野におけるものである。
【背景技術】
【0002】
水産養殖は、生産の観点から大幅な成長を遂げており、１９９０年～２０１８年の期間で５２７％超を占めている。２０１８年には、水産養殖は、世界の水生生物の総生産量（１７９Ｍトン）の約４６％、並びに人間の消費のための魚介類（魚類、甲殻類、軟体動物、並びに水生哺乳動物、爬虫類、海藻、及び他の水生植物を除く他の水生動物）の５２％に寄与した。
【0003】
商業的水産養殖は、主に細菌、ウイルス、寄生虫、及びそれほどではないが真菌によって引き起こされる感染性疾患の影響を受ける。細菌性疾患は、著しい生物学的損失、したがって、経済的損失を与える可能性がある。これらは通常、抗生物質で制御可能であるが、これらの医薬品の見境のない使用は、細菌種（そのうちのいくつかは、ヒト病原体でもある）の間での耐性機序の発達及び伝達により、最終的にはヒトの健康への脅威である。
【0004】
魚のワクチン接種は、疾患の蔓延を予防又は軽減することができ、多くの関連する病原体に対する有効性が証明されている。より効率的なワクチンを設計する際の障害の１つは、好適なアジュバントの欠如である。ほとんどの場合、油中水型エマルジョンが使用されるが、このアジュバントタイプは、全てのワクチンに好適なわけではない。近年、インターフェロン（ＩＦＮ）が、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）に対するＤＮＡワクチンと組み合わせて、強力なアジュバント活性を示したことが報告されている。
【0005】
哺乳動物と同様に、ウイルス感染に応答する異なるサケＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）の発現は、それらのプロモーター、ウイルスの特性、並びに核酸受容体及びインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）の細胞の発現に依存している。ＩＦＮａが主に局所抗ウイルス活性を示す一方で、ＩＦＮｂ及びＩＦＮｃは、全身性抗ウイルス活性を示す。加えて、サケは、異なるＩＦＮ－Ｉの結合における選択性を示すいくつかのＩＦＮ－Ｉ受容体を有するようである。ＩＦＮ－Ｉ及び受容体におけるこの複雑さは、サケＩＦＮ－Ｉの機能における大きな変動を可能にする。
【0006】
タイセイヨウサケ及び他の養殖魚の疾患と闘うためのより効率的なワクチンを設計するために、Ｉ型インターフェロンの免疫調節効果を更に研究する必要がある。
【発明の概要】
【0007】
第１の態様では、本出願は、配列番号６若しくは配列番号５０、又は配列番号６若しくは５０に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供し、当該核酸配列は、配列番号１８に対して６５～９０％同一、又は配列番号１９に対して６５～９０％同一であり、コドン頻度は、当該核酸配列中に保存される。ある特定の実施形態では、当該核酸配列は、配列番号１８又は配列番号１９に対して７０～７９％同一である。
【0008】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも４０％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から３０％を超えて逸脱せず、かつ／又は本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも３０％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から２５％を超えて逸脱せず、かつ／又は本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも２５％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から２０％を超えて逸脱しない。
【0009】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２０又は配列番号１７に対して少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一、又は少なくとも９９％同一、又は１００％同一である。
【0010】
ある特定の実施形態では、本発明による核酸配列によってコードされたアミノ酸配列は、配列番号６に対して少なくとも９７％同一、又は配列番号６に対して少なくとも９９％同一である。ある特定の実施形態では、配列番号６における対応するアミノ酸と異なるアミノ酸の少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）は、保存的置換である。
【0011】
ある特定の実施形態では、本発明による核酸配列によってコードされたアミノ酸配列は、配列番号５０に対して少なくとも９７％同一、又は配列番号５０に対して少なくとも９９％同一である。ある特定の実施形態では、配列番号５０における対応するアミノ酸と異なるアミノ酸の少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）は、保存的置換である。
【0012】
第２の態様では、発現カセットが提供され、当該発現カセットは、第２のプロモーターの作動可能な制御下で、第１の態様のいずれかの実施形態による核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー及びプロモーターである。ある特定の実施形態では、発現カセットは、第１のプロモーターの作動可能な制御で、抗原をコードする核酸配列を更に含む。ある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー及びプロモーターである。
【0013】
ある特定の実施形態では、抗原は、ウイルス起源である。ある特定の実施形態では、ウイルスは、非エンベロープウイルスである。特定の一連の実施形態では、ウイルスは、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）であり、抗原は、ＯＲＦ－１によってコードされたアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列の断片であり、当該断片は、防御免疫応答を誘発することができる。
【0014】
ある特定の実施形態では、抗原は、配列番号１、又はそれに対して９５％同一であるアミノ酸配列である。
【0015】
いくつかの他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ．配列番号３４又は配列番号３５に対して少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９１％同一、若しくは少なくとも９２％同一、若しくは少なくとも９３％同一、若しくは少なくとも９４％同一、若しくは少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９６％同一、若しくは少なくとも９７％同一、若しくは少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一である配列と、
ｂ．配列番号２５～３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列と、を含み、
ｉ）当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１５、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一の配列を欠き、かつ／又は
ｉｉ）配列番号１と比較して、当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含む。
ａ．配列番号３４又は配列番号３５に対して少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９１％同一、若しくは少なくとも９２％同一、若しくは少なくとも９３％同一、若しくは少なくとも９４％同一、若しくは少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９６％同一、若しくは少なくとも９７％同一、若しくは少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一である配列と、
ｂ．配列番号２５～３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列と、を含み、
ｉ）当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１５、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一の配列を欠き、かつ／又は
ｉｉ）配列番号１と比較して、当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含む。
【0016】
ある特定の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号４６に対して少なくとも９０％同一である。
【0017】
他の実施形態では、抗原は、細菌起源であり、当該細菌の外表面上に存在するタンパク質、又は防御免疫応答を誘発することができる当該タンパク質の断片を含む。
【0018】
他の実施形態では、抗原は、寄生起起源であり、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科のフナムシの腸由来のタンパク質である。ある特定の実施形態では、抗原は、配列番号２１、又はそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0019】
第３の態様では、本開示は、本発明の第２の態様のいずれかの実施形態による発現カセットを含む、ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターである。好ましい実施形態のセットでは、ベクターは、実施例に記載されるように、ＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又はそのバリアントである。
【0020】
第４の態様では、本開示は、本発明の第３の態様のいずれかの実施形態によるベクターを含む、ワクチンを提供する。
【0021】
第５の態様では、本開示は、サケ科の魚を感染から保護する方法を提供し、方法は、それを必要とするサケ科の魚に、本発明の第４の態様のいずれかの実施形態によるワクチンを投与することを含む。
【0022】
ある特定の実施形態では、サケ科の魚は、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、又はギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ）からなる群から選択される。一連の実施形態では、サケ科の魚は、タイセイヨウサケである。
【0023】
ある特定の実施形態では、サケ科の魚は、約２５～約２００グラム、好ましくは約１５～約２００グラムの重量である。
【0024】
第６の態様では、本発明は、アジュバントとしてのインターフェロンの効率を評価する方法を提供し、方法は、
ａ）インターフェロンをコードする核酸配列を供給源細胞にトランスフェクションすることと、
ｂ）当該供給源細胞を培養することであって、当該インターフェロンが、供給源細胞培地中に分泌される、培養することと、
ｃ）培養された標的細胞を当該供給源細胞培地の少なくとも部分と接触させることであって、当該標的細胞が、インターフェロンに応答してＭｘ遺伝子を自然に発現させる、接触させることと、かつ
ｄ）Ｍｘ遺伝子発現を測定することと、を含む。
ａ）インターフェロンをコードする核酸配列を供給源細胞にトランスフェクションすることと、
ｂ）当該供給源細胞を培養することであって、当該インターフェロンが、供給源細胞培地中に分泌される、培養することと、
ｃ）培養された標的細胞を当該供給源細胞培地の少なくとも部分と接触させることであって、当該標的細胞が、インターフェロンに応答してＭｘ遺伝子を自然に発現させる、接触させることと、かつ
ｄ）Ｍｘ遺伝子発現を測定することと、を含む。
【0025】
第７の態様では、本発明は、同じＩ型インターフェロンをコードする配列群におけるどの核酸配列が、より効率的な発現を付与するかを決定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図3】図３Ａは、透過処理されていない細胞におけるＰＭＣＶ ＯＲＦ１の検出を示す写真である。図３Ｂは、完全長ＰＭＣＶ ＯＲＦ－１を細胞表面にルーティングするために使用した異なる発現カセットで得られた結果を示す。
【図4】図４Ａは、トランスフェクトされたＣＨＨ－１細胞のＩＦ染色による、切断カプシドバリアントの蛍光強度の評価である。図４Ｂは、免疫沈降による膜画分からのウェスタンブロッティング検出（ＩＰ－ウェスタン）によるタンパク質発現の図である。２つのブロットは、２つの異なる実験を表す。
【図5】トランスフェクトされたＣＨＨ－１細胞の全細胞溶解物からの免疫沈降及びウェスタンブロッティングによる、５つの異なるプラスミド骨格におけるタンパク質発現の評価である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
［0031］本発明をよりよく説明するために、以下の定義が提供される。
【0028】
［0032］参照数字に適用される「約」という用語は、当該値のプラス又はマイナス１０パーセントの参照数字を指す。
【0029】
［0033］「コドン頻度は、当該核酸配列中に保存される」という用語は、本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも５０％の頻度が、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から４０％を超えて逸脱しない、核酸配列を説明する。例えば、宿主ゲノム中の所与のコドンの頻度が、例えば、２０％であるとき、本発明による核酸配列中の同じコドンの頻度が、１２％（２０％よりも４０％少ない）～２８％（２０％よりも４０％多い）である場合、このコドンは、頻度が宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から４０％を超えて逸脱しないコドンの少なくとも５０％の１つに数えられる。
【0030】
［0034］例えば、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）のゲノム中のコドン頻度が、表１に提供される。
【表1-1】
【表1-2】
【0031】
［0035］コドンＣＧＣは、頻度２０．０８％％でアルギニンをコードし、すなわち、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒのゲノム中のアルギニン残基の２０．０８％が、ＣＧＣによってコードされる。アルギニン残基の１２．０４８％～２８．１１２％の核酸配列が、ＣＧＣによってコードされる場合、コドンＣＧＣは、頻度がＳａｌｍｏ ｓａｌａｒのゲノム中の同じコドンの頻度から４０％を超えて逸脱しないコドンの少なくとも５０％の１つに数えられる。
【0032】
［0036］「治療有効量」は、ウイルス又は細菌などの病原体による感染によって引き起こされた、健康への悪影響又はその合併症を含む、疾患の徴候又は症状を予防又は軽減するのに十分である、抗原又はワクチンを受けた対象において免疫応答を誘導するであろう抗原又はワクチンの量を指す。液性免疫若しくは細胞媒介免疫、又は液性免疫及び細胞媒介免疫の両方が、誘導され得る。ワクチンに対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを通して間接的に、又は野生型株による攻撃接種（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後の徴候及び症状のモニタリングを通して直接的に評価され得る。ワクチンによって付与される防御免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、体温、全体的な身体状態、並びに全体的な健康及び能力などの臨床的徴候の軽減を測定することによって評価され得る。治療上有効であるワクチンの量は、使用される特定のアジュバント、使用される特定の抗原、又は対象の状態に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。
【0033】
［0037］「治療すること」は、そのような用語が適用される障害、状態、若しくは疾患を予防すること、又はそのような障害、状態、若しくは疾患の１つ以上の症状を予防若しくは軽減することを指す。
【0034】
［0038］第１の態様では、本発明は、配列番号６若しくは配列番号５０、又は配列番号６（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒのインターフェロンＢ）若しくは配列番号５０（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒのインターフェロンＢ）に対して少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸配列を提供し、当該核酸配列は、配列番号１８に対して６５～９０％同一、又は配列番号１９に対して６５～９０％同一であり、コドン頻度は、当該核酸配列中に保存される。
【0035】
［0039］ある特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号６又は配列番号５０に対して９６、９７、９８、９９、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする。差は、挿入、欠失、又は置換の形態であり得る。好ましくは、変異は、置換であり、より好ましくは、これらの置換の少なくともいくつかは、保存的置換である。
【0036】
［0040］当業者は、コードするタンパク質のアミノ酸配列の改変をもたらす核酸配列の変化が、タンパク質の結果として生じる三次元構造に、あったとしてもほとんど影響を及ぼさない可能性があることを更に認識するであろう。例えば、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のコドンは、グリシンなどの別のより疎水性の低い残基、又はバリン、ロイシン、若しくはイソロイシンなどのより疎水性の高い残基をコードするコドンによって置換され得る。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸など、１つの負に荷電した残基をもう１つの代わりに、又はアルギニンの代わりのリジンなど、１つの正に荷電した残基をもう１つの代わりに置換することをもたらす変化はまた、実質的に同じ機能活性を有するタンパク質を産生することが予想され得る。
【0037】
［0041］以下の６つの群は各々、互いにとって典型的な保存的置換であるアミノ酸を含有する：［１］アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、［２］アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、［３］アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、［４］アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、［５］イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び［６］フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、米国特許公開第２０１０／０２９１５４９号を参照されたい）。
【0038】
［0042］ある特定の実施形態では、参照配列と異なるアミノ酸の少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％全てが、保存的置換である。
【0039】
［0043］タンパク質及び／又は核酸配列同一性は、当該技術分野で既知の様々な配列比較アルゴリズム及びプログラムのうちのいずれかを使用して評価され得る。配列比較のために、典型的には１つの配列が、参照配列（例えば、本明細書に開示される配列）として機能し、これに対して試験配列が比較される。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列について配列同一性パーセントを計算する。
【0040】
［0044］２つのアミノ酸又は２つの核酸配列の同一性パーセントは、例えば、コンピュータプログラムＧＡＰ、すなわち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７－９５）を使用して、配列情報を比較することによって決定され得る。パーセント同一性を計算する際に、比較される配列は、典型的には、配列間で最大の一致を与える方式で整列される。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータは、以下を含む：（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一性に対して１及び非同一性に対して０の値を含有する）のＧＣＧ実行、並びにＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）に記載されるようなＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）の加重アミノ酸比較マトリックス、又は他の同等の比較マトリックス、（２）アミノ酸配列について、各ギャップに対して８のペナルティ及び各ギャップ中の各記号に対して２の追加ペナルティ、又は核酸配列について、各ギャップに対して５０のペナルティ及び各ギャップ中の各記号に対して３の追加ペナルティ、（３）最後のギャップに対してペナルティなし、並びに（４）長いギャップに対して最大ペナルティなし。
【0041】
［0045］配列同一性及び／又は類似性はまた、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）を使用することによって決定され得る。
【0042】
［0046］有用なアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的ペアワイズアラインメントを使用して関連配列の群から多数の配列アラインメントを作成する。これは、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０の漸進的アラインメント法の単純化を使用し、この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３によって記載された方法と類似している。３．００のデフォルトギャップ重み、０．１０のデフォルトギャップ長重み、及び重み付けエンドギャップを含む、有用なＰＩＬＥＵＰパラメータ。
【0043】
［0047］有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から得られるＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのうちのほとんどが、デフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩで設定される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成、及び目的の配列が検索されている特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立されるが、これらの値は、感度を高めるために調整され得る。
【0044】
［0048］追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されたようなギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメータは、９に設定され、ギャップなし伸長をもたらすツーヒット法は、ｋのギャップ長に１０＋ｋのコストを課し、Ｘｕは、１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、及びアルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによってもたらされる。
【0045】
［0049］本発明の核酸配列は、配列番号１８又は配列番号１９に対して６５～９０％同一であり、ただし、コドン頻度が、インターフェロンをコードする当該核酸配列中に保存されることを条件とする。ある特定の実施形態では、本発明のアミノ酸は、配列番号１８又は配列番号１９に対して７０～７９％又は７３～７７％同一であり、ただし、コドン頻度が、当該核酸配列中に保存されることを条件とする。
【0046】
［0050］上記に開示されるように、本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも５０％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から４０％を超えて逸脱しない。ある特定の実施形態では、本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも４０％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から３０％を超えて逸脱せず、かつ／又は本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも３０％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から２５％を超えて逸脱せず、かつ／又は本発明の核酸配列中のコドンの少なくとも２５％の頻度は、宿主のゲノム中の同じコドンの頻度から２０％を超えて逸脱しない。宿主が、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒである場合、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ中のコドン頻度が、表１に提供される。
【0047】
［0051］本発明のこの第１の態様のある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１７若しくは配列番号２０を含むか、又は配列番号１７若しくは配列番号２０のうちの１つに対して少なくとも９０％同一（すなわち、９１％超同一、９２％超同一、９３％超同一、９４％超同一、９５％超同一、９６％超同一、９７％超同一、９８％超同一、若しくは９９％超同一）であり、当該核酸配列は、上記のように、配列番号６若しくは５０、又は配列番号６若しくは５０に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列。
【0048】
［0052］第２の態様では、発現カセットが開示され、カセットは、第２のプロモーターの作動可能な制御下で、本発明の第１の態様による実施形態のいずれかによる核酸配列を含む。概して、第２のプロモーターは、宿主生物における転写を開始することができるはずである。宿主が、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒなどのサケ科の魚である実施形態では、好適なプロモーターとしては、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１Ａ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、及びＣＭＶ初期エンハンサーと結合したニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。概して、本発明の発現カセットはまた、本発明の核酸配列の転写を終結させるポリアデニル化シグナルを含む。
【0049】
［0053］ある特定の実施形態では、この第２の態様による発現カセットは、第１のプロモーターの作動可能な制御で、抗原をコードする核酸配列を更に含む。第２のプロモーターと同様に、第１のプロモーターは、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１Ａ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、及びＣＭＶ初期エンハンサーと結合したニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）などの例示的なプロモーターから選択され得る。概して、本発明の発現カセットはまた、抗原をコードする核酸配列の転写を終結させるポリアデニル化シグナルを含む。
【0050】
［0054］複数の抗原が、本明細書に記載されるカセットに好適であり得る。一般に、抗原は、ウイルス、細菌、原虫、又は寄生虫起源を有し得る。好適なウイルスとしては、ＰＭＣＶ、ＩＳＡ、ＩＰＮＶ、ＡＳＰＶ（タイセイヨウサケポックスウイルス）、ＩＨＮＶ（伝染性造血器壊死ウイルス）、ＶＨＳＶ（ウイルス性出血性敗血症ウイルス）、及びＰＲＶが挙げられる。エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルス由来の抗原が含まれ得る。ある特定の実施形態では、抗原は、ウイルス構造タンパク質若しくはカプシドタンパク質、又は外表面タンパク質である。防御免疫応答を誘発することができるこれらのタンパク質の断片もまた、好適である。
【0051】
［0055］ある特定の実施形態では、抗原は、配列番号１、又は配列番号１に対して少なくとも９０％同一、例えば、配列番号１に対して少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むタンパク質などの、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原である。配列は、配列番号１と、欠失、挿入、又は置換によって異なり得る。好ましくは、少なくともいくつかの置換は、保存的置換である。ある特定の実施形態では、置換されたアミノ酸の少なくとも５０％（すなわち、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）は、保存的置換である。
【0052】
［0056］本発明者らは、配列番号１のＮ末端部分、すなわち、配列番号１のアミノ酸１～約３９９、又はより好ましくはアミノ酸１～４２５、又はより好ましくはアミノ酸１～４５０、又はより好ましくはアミノ酸１～４７５、又は最も好ましくは配列番号１のアミノ酸１～４９９が、抗原を細胞表面に標的化するために必要かつ十分であることを発見した。
【0053】
［0057］同時に、本発明者らは、以下である場合、本発明による抗原が、ウイルス負荷及び／又は組織学スコアによって測定されたとき、よりよい免疫応答を誘発することを驚くべきことに発見した
ａ）配列番号２７、配列番号２８、若しくは配列番号３１が保持されている一方で、配列番号２５（ｉｎｔＤｅｌ１４、１５）は、欠失している、又は
ｂ）配列番号２５が保持されている一方で、配列番号２７、配列番号２８、若しくは配列番号３１は、欠失している、又は
ｃ）配列番号３２が保持されている一方で、配列番号１４は、欠失している。
ａ）配列番号２７、配列番号２８、若しくは配列番号３１が保持されている一方で、配列番号２５（ｉｎｔＤｅｌ１４、１５）は、欠失している、又は
ｂ）配列番号２５が保持されている一方で、配列番号２７、配列番号２８、若しくは配列番号３１は、欠失している、又は
ｃ）配列番号３２が保持されている一方で、配列番号１４は、欠失している。
【0054】
［0058］また、配列番号３２が欠失していた場合、配列番号１５の存在が、適切な免疫応答を付与するのに十分ではなかったことも発見されている。
【0055】
［0059］したがって、ある特定の実施形態では、抗原は、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）配列番号３４又は配列番号３５に対して少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９１％同一、若しくは少なくとも９２％同一、若しくは少なくとも９３％同一、若しくは少なくとも９４％同一、若しくは少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９６％同一、若しくは少なくとも９７％同一、若しくは少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一である配列と、かつ
ｂ）配列番号２５～３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列と、を含む魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原であり、
ｉ）当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１５、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一の配列を欠き、かつ／又は
ｉｉ）配列番号１と比較して、当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含む。
ａ）配列番号３４又は配列番号３５に対して少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９１％同一、若しくは少なくとも９２％同一、若しくは少なくとも９３％同一、若しくは少なくとも９４％同一、若しくは少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９６％同一、若しくは少なくとも９７％同一、若しくは少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一である配列と、かつ
ｂ）配列番号２５～３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列と、を含む魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原であり、
ｉ）当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１５、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一の配列を欠き、かつ／又は
ｉｉ）配列番号１と比較して、当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含む。
【0056】
［0060］実施形態の全てにおいて、参照配列との差（配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５など）は、欠失、挿入、又は置換であり得る。好ましくは、少なくともいくつかの置換は、保存的置換である。ある特定の実施形態では、置換されたアミノ酸の少なくとも５０％（すなわち、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）は、保存的置換である。
【0057】
［0061］魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原が、配列番号１５を欠く実施形態では、より大きな欠失、例えば、Ｃ末端切断もまた、抗原において作製され得ることが理解されるべきである。ある特定の実施形態では、そのようなより大きなＣ末端切断は、配列番号１３を含むか、又はそれからなる。
【0058】
［0062］ある特定の実施形態では、上記の魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号２５、又は配列番号２５に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、当該ＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原は、配列番号４、若しくは配列番号５、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５、又は配列番号４、若しくは配列番号５、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0059】
［0063］他の実施形態では、上記の魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号２９に対して少なくとも９５％同一である配列（又は配列番号２９に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列）を含み、当該ＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原は、配列番号５、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５、又は配列番号５、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0060】
［0064］他の実施形態では、上記の魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号３２に対して少なくとも９５％同一である配列、又は配列番号３２に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、当該ＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原は、配列番号１４若しくは配列番号１５、又は配列番号１４若しくは配列番号１５に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0061】
［0065］他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号２６、又は配列番号２６に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、配列番号５、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号２４、又は配列番号５、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号２４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0062】
［0066］他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号３０、又は配列番号３０に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、配列番号１４、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号２４、又は配列番号１４、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号２４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0063】
［0067］他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号３３、又は配列番号３３に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、配列番号２４、又は配列番号２４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0064】
［0068］他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号２７、又は配列番号２７に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、配列番号３、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号２４、又は配列番号３、若しくは配列番号１４、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号２４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0065】
［0069］他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号３１、又は配列番号３１に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、配列番号３若しくは配列番号２４、又は配列番号３若しくは配列番号２４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0066】
［0070］他の実施形態では、魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、配列番号２８、又は配列番号２８に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含み、配列番号３、若しくは配列番号４、若しくは配列番号１４、又は配列番号３、若しくは配列番号４、若しくは配列番号１４に対して少なくとも９０％同一である配列を欠く。
【0067】
［0071］他の実施形態では、タンパク質は、配列番号１５、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、及び配列番号４、５、２５、２６、２７、２９、３０、３２のうちのいずれか１つ（又は配列番号４、５、２５、２６、２７、２９、３０、若しくは３２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）を含み、配列番号１と比較して、当該タンパク質は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含み、任意選択的に、当該タンパク質は、当該内部欠失の代わりにリンカーを含む。
【0068】
［0072］更に他の実施形態では、タンパク質は、配列番号１３、又は配列番号１３に対して少なくとも９０％同一である配列を欠き、配列番号２５、又は配列番号２５に対して少なくとも９５％、若しくは９６％、若しくは９７％、若しくは９８％、若しくは９９％同一の配列を含有する。
【0069】
［0073］配列番号１と比較して、当該魚類心筋炎ウイルス（ＰＭＣＶ）ＯＲＦ－１抗原は、少なくとも４つの連続したアミノ酸長である内部欠失を含み得る。一般に、内部欠失は、最大２５０アミノ酸長であり得る。好ましくは、内部欠失は、約１０アミノ酸長、又は１０～２５０アミノ酸長、又は２５～２５０アミノ酸長、又は５０～２５０アミノ酸長、又は１００～２５０アミノ酸長、又は１５０～２５０アミノ酸長、又は１０～２００アミノ酸長、又は２５～２００アミノ酸長、又は５０～２００アミノ酸長、又は１００～２００アミノ酸長、又は１５０～２００アミノ酸長、又は約２００アミノ酸長、又は約５０アミノ酸長、又は５０～１５０アミノ酸長、又は５０～１００アミノ酸長、又は約１００アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、内部欠失は、配列番号２、配列番号３、又は配列番号１４を含むか、又はそれらからなる。
【0070】
［0074］ある特定の実施形態では、リンカーは、当該内部欠失の代わりに存在し得る。内部欠失及びリンカーの長さは、同じである必要はない。例えば、リンカーは、３～５０アミノ酸長、又は３～４０アミノ酸長、又は３～３０アミノ酸長、又は３～２０アミノ酸長、又は３～１０アミノ酸長、又は約５アミノ酸長、又は約１０アミノ酸長、又は約２０アミノ酸長であり得る。リンカーの正確な配列は、あまり重要ではない。一般に、好ましいアミノ酸は、天然にコードされたアミノ酸の約５０％を構成する、極性の非荷電又は荷電残基である。より具体的には、スレオニン、セリン、及びグリシンが、それらの小さいサイズにより良好な柔軟性を提供し得、また、水との水素結合の形成を通して、水性溶媒中のリンカー構造の安定性を維持するのに役立ち得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、グリシン及び／又はセリンが豊富である。ある特定の実施形態では、リンカーは、５アミノ酸長であり、配列番号３６を含み得る。配列番号３６は、配列番号３７によってコードされ得る。
【0071】
［0075］他の実施形態では、抗原は、配列番号１１若しくは配列番号１２若しくは配列番号４６、又は配列番号１１若しくは配列番号１２若しくは配列番号４６に対して少なくとも９０％、若しくは少なくとも９１％、若しくは少なくとも９２％、若しくは少なくとも９３％、若しくは少なくとも９４％、若しくは少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、差は、置換であり、より好ましくは、置換されたアミノ酸の少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）は、保存的置換である。
【0072】
［0076］好適な細菌としては、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ亜種Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｖｉｂｒｉｏ（Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ）ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｖｉｓｃｏｓａ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉが挙げられるが、これらに限定されない。この場合もやはり、細菌の外表面上に存在するタンパク質、並びに防御免疫応答を誘発することができるこれらのタンパク質は、好ましい。
【0073】
［0077］好適な寄生虫としては、フナムシ（Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科、好ましくはＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属又はＣａｌｉｇｕｓ属）が挙げられる。フナムシに由来し、防御免疫応答を誘発することができるタンパク質が記載されており、配列番号２１、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列が挙げられるがこれらに限定されない、腸ペプチド又はその断片を含む。
【0074】
［0078］ある特定の実施形態では、本発明による抗原は、標的細胞表面に操作され得る。したがって、そのような操作された抗原は、それらが宿主の免疫系によって認識され得る細胞表面に有利に局在化し、したがって、防御免疫応答が生成されるであろう。
【0075】
［0079］ある特定の実施形態では、抗原は、融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）分泌タンパク質又は第１の膜結合タンパク質のＮ末端分泌シグナル配列、
ｂ）非エンベロープウイルス、好ましくは、上記の実施形態のいずれかによるＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原を含む、例えば、ＰＭＣＶなどの魚に感染するようなウイルスのうちの１つに由来する抗原、
ｃ）第２の膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン、を含む融合タンパク質として提示され得る。
ａ）分泌タンパク質又は第１の膜結合タンパク質のＮ末端分泌シグナル配列、
ｂ）非エンベロープウイルス、好ましくは、上記の実施形態のいずれかによるＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原を含む、例えば、ＰＭＣＶなどの魚に感染するようなウイルスのうちの１つに由来する抗原、
ｃ）第２の膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン、を含む融合タンパク質として提示され得る。
【0076】
［0080］ある特定の実施形態では、当該第１のタンパク質は、インターフェロンａ、インターフェロンｂ、インターフェロンｃ、インターフェロンｄ、インターフェロンガンマ、インターロイキン－２、インターロイキン４、インターロイキン－１２からなる群から選択され得る。第１及び第２のタンパク質は、互いに同一であり得るか又は異なり得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のタンパク質は、タイセイヨウサケパラミクソウイルスの融合タンパク質であり得、その分泌シグナル伝達配列及び膜貫通ドメイン配列は、それぞれ配列番号３８及び３９である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタンパク質は、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）のヘマグルチニン（ＨＥ）タンパク質であり得、その分泌シグナル伝達配列及び膜貫通ドメイン配列は、それぞれ配列番号４０及び４１である。
【0077】
［0081］いくつかの実施形態では、第１の膜タンパク質は、第２の膜タンパク質に対して同一であり、ウイルス性出血性敗血症ウイルスＧ－タンパク質（ＶＨＳＶ－Ｇ）であり、その分泌シグナル伝達ペプチド配列及び膜貫通ドメイン配列は、それぞれ配列番号７及び８である。
【0078】
［0082］したがって、いくつかの実施形態では、当該Ｎ末端分泌シグナル配列は、配列番号７に対して少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【0079】
［0083］上記のように、好ましくは、配列番号７との差につながる変異は、置換である。ある特定の有利な実施形態では、当該Ｎ末端分泌シグナルにおける異なるアミノ酸の少なくとも半分（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）は、保存的置換である。
【0080】
［0084］実施形態では、ＶＨＳＶ－Ｇタンパク質が、Ｎ末端分泌シグナル及び膜貫通ドメインの両方の供給源である場合、当該膜貫通ドメインは、配列番号８に対して少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【0081】
［0085］上記のように、好ましくは、配列番号７及び８との差につながる変異は、置換である。ある特定の有利な実施形態では、当該膜貫通ドメインにおける異なるアミノ酸の少なくとも半分（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）は、保存的置換である。
【0082】
［0086］第１及び／又は第２のタンパク質の追加の断片もまた含まれ得る。したがって、ある特定の実施形態では、配列番号７、又は配列番号７に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質は、配列番号４８、又は配列番号４８に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、又はその断片内に含まれ得る。当該断片が、配列番号７、又は配列番号７に対して少なくとも９０％同一である配列を含むであろうことを理解されたい。
【0083】
［0087］独立して、配列番号８、又は配列番号８に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質は、配列番号４９、又は配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、又はその断片内に含まれ得る。当該断片が、配列番号８、又は配列番号８に対して少なくとも９０％同一である配列を含むであろうことを理解されたい。
【0084】
［0088］配列番号７及び８と同様に、配列番号４８及び４９との差につながる変異は、置換である。ある特定の有利な実施形態では、当該Ｎ末端分泌シグナル伝達配列及び／又は膜貫通ドメインにおける異なるアミノ酸の少なくとも半分（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）は、保存的置換である。
【0085】
［0089］第３の態様では、本出願は、本発明の第２の態様の実施形態のいずれかによるカセットを含む、ベクターを開示する。
【0086】
［0090］プラスミドベクター及びウイルスベクターの両方を含む、本発明に好適な異なるベクターが、当該技術分野で既知である。好適なプラスミドとしては、ｐＵＣベースのベクター、ｐＶＡＸベクター、ｐｃＤＮＡベクター、ＮＴＣベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態のセットでは、ベクターは、実施例に記載されるように、ＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又はそのバリアントである。
【0087】
［0091］他の実施形態では、比較的新しい「ドギーボーン」又はＤＢＤＮＡ（商標）プラスミドが、ベクターとして使用され得る。ＤＢＤＮＡ（商標）プラスミド並びにこれらのプラスミドを作製するプロセスは、少なくともＷＯ２０１８／０３３７３０、ＷＯ２０１６／０３４８４９、ＷＯ２０１９／１９３３６１、ＷＯ２０１２／０１７２１０、及びＷＯ２０２１／１６１０５１に記載されている。このアプローチの利点は、ベクターが無細胞プロセスで合成され得、したがって、製造効率が改善されることである。無細胞プロセスは、好ましくは、鎖置換複製を介した鋳型の増幅を伴う。この合成は、一本鎖ＤＮＡを放出し、これが次いで、ポリメラーゼを使用して、二本鎖ＤＮＡにコピーされ得る。代替的に、鎖置換は、ＤＮＡポリメラーゼ及び別個のヘリカーゼを供給することによって達成され得る。複製ヘリカーゼは、二本鎖ＤＮＡを開き、リーディング鎖ポリメラーゼの前進を促進し得る。結果として生じる二本鎖ＤＮＡコンカテマーが酵素的に切断され、ライゲーションされ、したがって、ドギーボーン様形状のＤＮＡ構築物を形成する。
【0088】
［0092］好適なウイルスベクターとしては、ＳＡＶなどのアルファウイルス、ＶＨＳＶ及びＩＨＮＶなどのラブドウイルス、ＡＳＰなどのパラミクソウイルス、アデノウイルス、サケエラポックスウイルスなどのポックスウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのウイルスは、複製に関与するウイルスゲノムの部分を除去するために遺伝子改変され得る。したがって、結果として生じるウイルスは、魚細胞に感染し、抗原の産生に好適であるが、病原性ではないであろう。
【0089】
［0093］ある特定の実施形態では、ベクターは、上記の発現カセット及び追加の抗原、例えば、サケ科の魚アルファウイルス抗原を含有し得る。ベクターが、インターフェロンの異なるバリアントをコードする追加の核酸配列を含有する可能性もある
【0090】
［0094］当業者は、それぞれ本発明の第１、第２、及び第３の態様に記載される核酸、発現カセット、及びベクターを作製するための複数の方法が存在することを理解するであろう。例えば、核酸配列は、ソフトウェアツール、例えば、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用して設計され、人工的に合成されるか、又は標的変異誘発を使用して生成され得る。これらの配列は、当業者に広く利用可能な遺伝子工学技法を使用して、発現カセット及びベクターにサブクローニングされ得る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ：２０００，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）、及びＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８＋ ｕｐｄａｔｅｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＩＳＢＮ：０４７１６２５９４９）を参照されたい。
【0091】
［0095］第４の態様では、本出願は、本発明の第３の態様の実施形態のいずれかによるベクターを含む、ワクチンを開示する。ワクチンは、一価又は多価であり得る。概して、一価ワクチンの１用量は、第３の態様の実施形態のいずれかによる少なくとも１μｇのベクターを含有し得る。ある特定の実施形態では、ワクチンの１用量は、１μｇ～約２５μｇのベクターを含有し得る。他の実施形態では、ワクチンの１用量は、１～約２０μｇのベクター、又は約５～約２０μｇのベクター、又は約５～約１５μｇのベクター、又は約１０～約２０μｇのベクター、又は約５～約１０μｇのベクターを含有し得る。
【0092】
［0096］本発明によるワクチンに好適な複数の抗原が、上に記載されている。これらの抗原は、上記のベクター及び発現カセットを含むＤＮＡワクチンの形態で投与され得る。他の実施形態では、これらの抗原は、サブユニット（すなわち、精製された又は部分的に精製されたタンパク質）の形態で投与され得る。更に他の実施形態では、抗原は、不活性化又は弱毒化生物を含み得る。
【0093】
［0097］抗原に加えて、本発明のワクチンは、配列番号６若しくは配列番号５０のインターフェロン、又は配列番号６若しくは５０に対して９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列に加えて、アジュバント、すなわち、免疫応答を増強又は調節する物質を更に含み得る。そのようなアジュバントは、当該技術分野で周知である。好適な非限定的なアジュバントとしては、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、オリゴリボヌクレオチド、サイトカイン、ＢＡＹ（登録商標）１００５などの糖脂質、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（以下、「ＤＤＡ」）などの四級アミンが挙げられる。サポニン、ステロール（例えば、コレステロール）、及び任意選択的に、リン脂質を含む複合体は、当該技術分野において記載されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びサポニン、ＣｐＧ及びコレステロール、並びにＣｐＧ及びミョウバンの組み合わせは、相乗効果を誘発することが報告されている。
【0094】
［0098］抗原及び任意選択的な追加のアジュバントに加えて、ワクチンは、好適な薬学的担体も含み得る。適切な担体は、当業者には明白であり、大部分が投与経路に依存するであろう。本発明において存在し得る追加の成分は、アジュバント、防腐剤、表面活性剤、化学的安定剤、懸濁化剤又は分散剤である。典型的には、安定剤、アジュバント、及び防腐剤は、標的対象における有効性のための最良の製剤を決定するように最適化される。
【0095】
［0099］ある特定の実施形態では、ワクチンは、細胞膜にわたるベクターの輸送を促進し、したがって、抗原及び／又は分子免疫調節因子の発現の増加をもたらすための、リポソームアジュバント及び／又は担体を含み得る。そのようなリポソームアジュバント／担体系の好適な非限定的な例は、例えば、米国特許第１０，４５６，４５９号に記載されている。
【0096】
［00100］したがって、第５の態様では、本出願は、サケ科の魚を感染から保護する方法を開示し、方法は、それを必要とするサケ科の魚に、本発明の第４の態様の実施形態のいずれかによるワクチンを投与することを含む。したがって、本開示はまた、サケ科の魚を感染から保護する際に使用するための、第４の態様の実施形態のいずれかによるワクチンを提供する。
【0097】
［00101］抗原（複数可）がワクチン中に存在する感染が、ワクチンが保護するであろう発明を決定づけることは、当業者には明らかであるはずである。したがって、例えば、限定されないが、ワクチンがＰＭＣＶ抗原をコードする核酸配列を含む場合、ワクチンは、ＰＭＣＶによって引き起こされる感染に対して使用されるであろう。
【0098】
［00102］本発明によるワクチンは、筋肉内を含むがこれに限定されない、様々な経路によってサケ科の魚に投与され得る。好ましくは、ワクチンは、１用量の体積が５００μｌ未満、又は４００μｌ未満、又は３００μｌ未満、又は２００μｌ未満、又は約１００μｌ、又は約１００μｌ未満、又は約５０μｌ、又は約２５μｌであるようなマイクロドーズで投与される。
【0099】
［00103］本明細書に開示されたワクチンは、複数のサケ科の種を感染から保護する際に使用され得る。好適なサケ科の魚としては、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、ギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、ベニザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｎｅｒｋａ）、マスノスケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、及び他の種が挙げられるが、これらに限定されない。
【0100】
［00104］異なる年齢（又は重量）のサケ科の魚が、本発明に従ってワクチン接種され得る。ある特定の実施形態では、サケ科の魚は、ワクチン接種時に約１５～約２００グラムの重量である。したがって、ワクチン接種時のサケ科の魚の重量は、約１５～約２００グラム、又は約４０～約１１０グラム、又は約５０～約１００グラムであり得る。
【0101】
［00105］第６の態様では、本発明は、アジュバントとしてのＩ型インターフェロンの効率を評価する方法を提供する。「アジュバントとしてのＩ型インターフェロンの効率を評価すること」という語句は、所与の核酸配列からのインターフェロンタンパク質についてのアミノ酸の発現レベル及びインターフェロンのアジュバント活性の両方を指す。この試験の原理は、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＭｘ発現（ＩＦＮ誘導性遺伝子）を定量化することである。Ｍｘタンパク質は、広範囲のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を有する大きなＧＴＰａｓｅのスーパーファミリーに属する。インビボでは、Ｍｘ遺伝子の発現は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在によって厳密に調整され、それらの誘導は、いくつかのウイルス感染中に記載されている。
【0102】
［00106］一般に、本方法は、
ａ）インターフェロンをコードする核酸配列を供給源細胞にトランスフェクションすることと、
ｂ）当該供給源細胞を培養することであって、当該インターフェロンが、供給源細胞培地中に分泌される、培養することと、
ｃ）培養された標的細胞を当該供給源細胞培地の少なくとも部分と接触させることであって、当該標的細胞が、インターフェロンに応答してＭｘ遺伝子を自然に発現させる、接触させることと、かつ
ｄ）Ｍｘ遺伝子発現を測定することと、を含む。
ａ）インターフェロンをコードする核酸配列を供給源細胞にトランスフェクションすることと、
ｂ）当該供給源細胞を培養することであって、当該インターフェロンが、供給源細胞培地中に分泌される、培養することと、
ｃ）培養された標的細胞を当該供給源細胞培地の少なくとも部分と接触させることであって、当該標的細胞が、インターフェロンに応答してＭｘ遺伝子を自然に発現させる、接触させることと、かつ
ｄ）Ｍｘ遺伝子発現を測定することと、を含む。
【0103】
［00107］本方法では、より高いＭｘ遺伝子発現は、アジュバントとしての試験されたＩ型インターフェロンのより高い効率を示す。インターフェロンＡ（アルファインターフェロンとしても知られる）及びインターフェロンＢ（ベータインターフェロンとしても知られる）、及びインターフェロンＣを含むがこれらに限定されない、複数のＩ型インターフェロンが、本方法で試験されるのに適している。タイセイヨウサケにおいて、１１個のＩＦＮ遺伝子が、２つのＩＦＮａ（ＩＦＮａｌ及びＩＦＮａ３）、４つのＩＦＮｂ（ＩＦＮｂ１～ｂ４）、及び５つのＩＦＮｃ（ＩＦＮｃ１～ｃ４）遺伝子をコードする同じゲノム領域において特定された。例えば、ＥＰ２９５０８１６Ｂを参照されたい。
【0104】
［00108］ある特定の実施形態では、１型インターフェロンは、本発明の第１の態様による核酸配列によってコードされたインターフェロンを含むがこれらに限定されない、ＩＦＮｂインターフェロンである。
【0105】
［00109］当該１型インターフェロンをコードする核酸配列は、供給源細胞における発現を可能にするプロモーターの制御下で、発現カセット、又は概して上記のプラスミドベクター若しくはウイルスベクターなどのベクターにクローニングされ得る。そのようなプロモーターは、上記にも記載されており、ＣＭＶ初期後期プロモーターを含むが、これらに限定されない。トランスフェクション技法もまた周知であり、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、及び例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）などの脂質ベースの化合物を含むが、これらに限定されない。
【0106】
［00110］本方法は、標的細胞を容易にトランスフェクトすることができない状況、若しくは供給源細胞がＩ型インターフェロンによる刺激に応答してＭｘを発現させない状況、又はその両方において特に適している。
【0107】
［00111］水産養殖ワクチンの文脈におけるインターフェロンのアジュバント可能性を試験するに特に好適なある特定の実施形態では、供給源細胞は、魚の心血管ＣＨＨ－１細胞であり、標的細胞は、ＣＨＨ－１細胞がＩＦＮｂ刺激に応答してＭｘを発現させず、ＴＯ－細胞を容易にトランスフェクトすることができないようなＴＯ－細胞である。ＴＯ細胞及びＣＨＨ－１細胞の両方が、文献に記載されている。ＣＨＨ－１細胞は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。このアッセイでは、他の細胞株も使用され得る。供給源細胞の好適な非限定的な例は、ＣＨＳＥ細胞であり、標的細胞の好適な非限定的な例は、ＳＨＫ及びＡＳＫ細胞である。
【0108】
［00112］Ｍｘ遺伝子の発現は、複数の方法で測定され得る。例えば、イムノアッセイを使用してタンパク質の量を測定することができるか、又は定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの増幅ベースのアッセイを使用してＭｘ ＲＮＡの量を測定することができる。Ｍｘ遺伝子の核酸配列が既知であるため、当業者は、当該技術分野で既知の技法を使用して、Ｍｘ ｍＲＮＡを増幅及び検出するためのプライマー及び／又はプローブを設計することができる。
【0109】
［00113］第７の態様では、本発明は、同じＩ型インターフェロンをコードする配列群におけるどの核酸配列が、より効率的な発現を付与するかを決定する方法を提供する。本方法は、試験されるのに好適なインターフェロン、当該インターフェロンをコードする核酸配列、好適なベクター、供給源細胞、標的細胞、トランスフェクション技法、及びＭｘ遺伝子発現のレベルを測定するための方法を含む、上記の本発明の第６の態様に記載される技法を利用する。
【0110】
［00114］簡潔に述べると、同じＩ型インターフェロンアミノ酸配列をコードするＮ（Ｎ＞１）個の核酸配列の群がある場合、試験されている核酸配列においてのみ異なるＮ個のベクターを調製する。次いで、同じ量のこれらのＮ個のベクターが、同じ技法を使用して、同じ条件下で培養した同じ供給源細胞のＮ個のバッチにトランスフェクトされる。
【0111】
［00115］次いで、培養された供給源細胞からの同じ体積の培地（Ｎ個の試料）を標的細胞のＮ個のバッチと接触させ、これらの標的細胞の各バッチは、同一条件下で培養される。第１の試料を標的細胞の第１のバッチと接触させ、第２の試料を標的細胞の第２のバッチと接触させるなどである。Ｎ番目の試料を標的細胞のＮ番目のバッチと接触させる。次いで、Ｎ個のバッチにおけるＭｘ遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定する。
【実施例】
【0112】
実施例１．表面標的化発現系の調製
［00116］タイセイヨウサケ用の全てのＤＮＡワクチンの成功は、エンベロープウイルスに由来しており、膜結合抗原に基づく。したがって、細胞の表面上の抗原の曝露は、有効性のために重要であり得る。
［00116］タイセイヨウサケ用の全てのＤＮＡワクチンの成功は、エンベロープウイルスに由来しており、膜結合抗原に基づく。したがって、細胞の表面上の抗原の曝露は、有効性のために重要であり得る。
【0113】
［00117］ＰＭＣＶは、３つの予測されるオープンリーディングフレームを有する６．７ｋｂのｄｓＲＮＡゲノムを含有する裸のウイルスである（図１）。カプシドタンパク質（ＣＰ）が、ＯＲＦ１から翻訳される一方、ＯＲＦ２は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする。ＯＲＦ３タンパク質の機能は、まだ不明であるが、細胞培養で過剰発現したときに細胞毒性効果を有するタンパク質をコードし、ウイルス粒子の集合に必要ではない。
【0114】
［00118］ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（カプシドタンパク質）及びＰＭＣＶ ＯＲＦ３（機能未知タンパク質）を発現させるＤＮＡワクチンは、保護を提供することなく既に試験されていた（データは示さず）。ＰＭＣＶは、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１タンパク質について予測された膜貫通領域を有しない裸のウイルスであり、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１タンパク質が細胞内でのみ発現することが実証されたため（データは示さず）、発現したＯＲＦ１カプシドタンパク質が細胞膜に標的化される場合、応答が誘発され得るという仮説が立てられた。
【0115】
［00119］この実験の目的は、ＰＭＣＶカプシドタンパク質（又はその一部）を細胞表面発現抗原として発現するＤＮＡワクチンを構築することであった。この戦略は、配列番号７によるウイルス出血性敗血症ウイルスＧ－タンパク質（ＶＨＳＶ－Ｇ）のＮ末端分泌シグナルペプチドを、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１抗原Ｎ末端の上流で融合させることであった。追加的に、図２Ａに示されるように、配列番号８によるＶＨＳＶ－ＧのＣ末端膜貫通ドメインを、抗原Ｃ末端の下流で融合させて、細胞表面において抗原を組み込んだ（ｖｏｎ Ｇｅｒｓｄｏｒｆｆ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ワクチン抗原の分泌バージョンも、Ｎ末端分泌シグナルペプチドのみを使用し、Ｃ末端膜貫通ドメインの使用を省略して調製した（図２Ｂ）。
【0116】
［00120］代わりに、タイセイヨウサケパラミクソウイルス融合タンパク質のシグナルペプチド配列及び膜貫通ドメイン配列（それぞれ配列番号３８及び３９）、又は伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）のヘマグルチニン（ＨＥ）タンパク質（それぞれ配列番号４０及び４１）を使用した場合を除き、追加の構築物を図２Ａに示される構築物と同様に調製した。
【0117】
［00121］様々なＤＮＡワクチン構築物を用いたＣＨＨ－１細胞のトランスフェクションの６日後の免疫蛍光（ＩＦ）染色によって、抗原発現のルーティングを研究した。トランスフェクションは、１２ウェルプレート中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（登録商標）３０００キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して行った。この実験では、ｐＶＡＸ１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して、ＤＮＡワクチンを構築し、１μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションに使用した。細胞を、表面抗原発現のために３．７％ホルムアルデヒドのみで固定したか、又は３．７％ホルムアルデヒドで固定した後、細胞内発現タンパク質の染色のために０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して細胞を透過処理した。ワクチン抗原を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を使用して検出した。適切な蛍光標識二次抗体（ウサギ抗マウスＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ Ｆ０２６１）又はポリクローナルヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ３２７３１）を、検出のために使用した。透過処理された細胞を染色して、細胞内発現抗原を検出することを、プロトコルの陽性対照として日常的に含んだ。
【0118】
［00122］図３に示されるように、ＶＨＳＶ Ｇ－タンパク質の使用は、ＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原の発現を細胞表面にルーティングするために使用され得る。伝染性サケ貧血ウイルスのヘマグルチニン（ＨＥ）タンパク質からのシグナルタンパク質及び膜貫通ドメインの使用はまた、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１タンパク質の膜染色をもたらしたが、タイセイヨウサケパラミクソウイルスの融合タンパク質からの領域の使用は、成功しなかった。
【0119】
［00123］次の実験では、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）におけるインビボ試験を行った。抗原の２つのバリアントである完全長カプシドタンパク質（Ｇ－ＯＲＦ１）、及びカプシドタンパク質の前半（配列番号１６のＰＭＣＶ ＯＲＦ１位置１～１２９３）を発現させる切断カプシドタンパク質（Ｇ－ＯＲＦ１－デルタＤ）を試験した。両方の抗原を、標準発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）において、及びサケ科の魚アルファウイルス３（ＳＡＶ－３）に基づくアルファウイルスレプリコンワクチンとして発現させた。ＰＢＳ及びｐｃＤＮＡ－ｅＧＦＰを、陰性ワクチン対照群として含んだ。
【0120】
［00124］本研究における全てのワクチンについて、抗原コード遺伝子を、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。全てのプラスミドを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇの総用量を受けた。２つの非免疫化対照群を含み、１つの群は、２０μｇの対照ワクチン（ｐｃＤＮＡ３．１中のｅＧＦＰ）を受け、１つの群は、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表2】
【0121】
［00125］魚（１群当たりｎ＝４５）は、淡水で保持され、４８グラムの平均重量を有した。ワクチン接種の前に、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２℃（明：暗１２：１２）で４９日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された脾臓（単離体ＩＤ ＡＬ Ｖ１２２３脾臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚を、攻撃接種の１０日後、２０日後、及び５０日後の３つの時点でサンプリングした（１サンプリング時点当たり、１群当たりｎ＝１５）。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（５０日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｂｅｒｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｂｅｒｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0122】
［00126］細胞表面にルーティングされたＰＭＣＶの完全長ＯＲＦ１を発現させるワクチンは、対照群と比較して、攻撃接種に対する顕著な保護を示した（心房における組織構造についてのダネットの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。これは、感染後早期の腎臓及び心臓におけるＣｔ値の増加（結果は示さず）、及び感染の５０日後の組織病理学スコアの低減の両方として示された（表３）。カプシドタンパク質の前半（Ｇ－ＯＲＦ１－デルタＤ、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１位置１～１２９３）に基づく抗原は、保護を提供することができず、標準発現ベクターとは対照的に、サケアルファウイルスレプリコンを使用して、保護の更なる増加は提供されなかった。
【表3】
【0123】
［00127］完全長抗原を細胞表面に標的化するＤＮＡワクチン候補は、組織病理学的スコアの約５０％の低減をもたらし、腎臓及び心臓におけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）の低減を伴った。
【0124】
［00128］フォローアップインビボ試験は、細胞表面発現抗原、分泌抗原、又は細胞内発現抗原として、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１完全長タンパク質を発現させるＤＮＡワクチンの有効性を比較した。加えて、配列番号４５によってコードされた完全長カプシドタンパク質のコドン最適化バージョンを含んだ。この研究は、タイセイヨウサケの５つの群を各々有する２つの並行免疫タンクを含有した（１タンク当たり、１群当たりｎ＝３０）。
【0125】
［00129］本研究における全てのワクチンについて、抗原コード遺伝子を、真核発現ベクターＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。全てのプラスミドを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇの総用量を受けた。非免疫化対照群が含まれ、表４に要約されるように、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表4】
【0126】
［00130］魚は、淡水で保持され、ワクチン接種時に２６グラムの平均重量を有した。試験ワクチンの投与中、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で３９日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬ Ｖ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１時点当たり、１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の２１日後及び５６日後にサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（５６日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0127】
［00131］結果は、ＰＭＣＶ感染に対する顕著な保護が、細胞表面にルーティングされたＰＭＣＶの完全長ＯＲＦ１を発現させるワクチン（Ｇ－ＯＲＦ１及びＧ－ＯＲＦ１コドン最適化）を用いて達成されたことを示した。ＰＭＣＶ ＯＲＦ１のその天然型（細胞内タンパク質）における発現は、検出可能な保護を提供しなかった。分泌による発現は、ある程度の保護を提供した（２０日目に腎臓で差は検出されなかった。表５、６を参照されたい）。
【表5】
【表6】
【0128】
実施例２：ＣＭＳ抗原の調製及び抗原活性の決定
［00132］細胞膜上でＰＭＣＶ ＯＲＦ１完全長タンパク質を発現させることは、攻撃接種モデルにおいて部分的な保護を提供した。この発見にもかかわらず、インビトロでは、抗原の発現レベルが、対照ＧＦＰ構築物の発現レベルよりも著しく低いことが観察された。このプロジェクトは、領域を欠失させることによってカプシドタンパク質の切断されたバージョンを発現させることが、ワクチン抗原の発現レベル及び免疫原性を高めることができるかどうかを調査した。
［00132］細胞膜上でＰＭＣＶ ＯＲＦ１完全長タンパク質を発現させることは、攻撃接種モデルにおいて部分的な保護を提供した。この発見にもかかわらず、インビトロでは、抗原の発現レベルが、対照ＧＦＰ構築物の発現レベルよりも著しく低いことが観察された。このプロジェクトは、領域を欠失させることによってカプシドタンパク質の切断されたバージョンを発現させることが、ワクチン抗原の発現レベル及び免疫原性を高めることができるかどうかを調査した。
【0129】
［00133］実施例１に記載された発現系（ＶＨＳＶ－Ｇシグナルペプチド及び膜貫通ドメイン配列を使用して）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ－１抗原に基づいて異なる構築物で調製した。
【0130】
［00134］ＶＨＳＶ－Ｇ発現カセットから膜結合ＰＭＣＶカプシド抗原を発現させる最初の研究は、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１タンパク質配列の第１の部分を含むことが、成功のために極めて重要であったことを示した。カプシドタンパク質を３分割した場合、膜結合タンパク質は、最初の３分の１を含む構築物についてのみ成功裏に達成された（データは示さず）。
【0131】
［00135］ＰＭＣＶ ＯＲＦ１カプシド欠失バリアントの構築後、これらを、ＩＦ染色及びトランスフェクション細胞のウェスタンブロットによって試験した。全ての欠失構築物について、欠失したＰＭＣＶ ＯＲＦ１配列をＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３６）で置き換えた。様々な欠失バリアントを作製するための戦略は、以下の通りであった。
（１）第１のラウンドでは、比較的大きな欠失を試験した（ＩｎｔＤｅｌ１～７。１６２アミノ酸長であったＩｎｔＤｅｌ７を除き、１００アミノ酸によって重複する２００アミノ酸長）。あるＮ末端配列の包含が、細胞膜への発現タンパク質のルーティングの成功に必要であることが見出されたため、第１の欠失（ＩｎｔＤｅｌ１）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（配列番号１６）内のヌクレオチド位置２９８～８９７で作製した。
（２）第２のラウンドでは、ＩｎｔＤｅｌ４～７によってカバーされる領域に焦点を当てて、より小さな欠失バリアントを作製した（ＩｎｔＤｅｌ１１～１８、ＩｎｔＤｅｌ４内で開始する、隣接した非重複５０アミノ酸長）。これらの欠失のうちの最初（ＩｎｔＤｅｌ１１）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（配列番号１６）内のヌクレオチド位置１３８４～１５３３で構築した。
（３）第３のラウンドでは、非常に小さい隣接した重複欠失を有する抗原バリアントを作製した（ＩｎｔＤｅｌ２１～４２。２アミノ酸によって重複する１０アミノ酸長）。これらの欠失のうちの最初（ＩｎｔＤｅｌ２１）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（配列番号１６）内のヌクレオチド位置１９３６～１９６５で構築した。
（１）第１のラウンドでは、比較的大きな欠失を試験した（ＩｎｔＤｅｌ１～７。１６２アミノ酸長であったＩｎｔＤｅｌ７を除き、１００アミノ酸によって重複する２００アミノ酸長）。あるＮ末端配列の包含が、細胞膜への発現タンパク質のルーティングの成功に必要であることが見出されたため、第１の欠失（ＩｎｔＤｅｌ１）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（配列番号１６）内のヌクレオチド位置２９８～８９７で作製した。
（２）第２のラウンドでは、ＩｎｔＤｅｌ４～７によってカバーされる領域に焦点を当てて、より小さな欠失バリアントを作製した（ＩｎｔＤｅｌ１１～１８、ＩｎｔＤｅｌ４内で開始する、隣接した非重複５０アミノ酸長）。これらの欠失のうちの最初（ＩｎｔＤｅｌ１１）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（配列番号１６）内のヌクレオチド位置１３８４～１５３３で構築した。
（３）第３のラウンドでは、非常に小さい隣接した重複欠失を有する抗原バリアントを作製した（ＩｎｔＤｅｌ２１～４２。２アミノ酸によって重複する１０アミノ酸長）。これらの欠失のうちの最初（ＩｎｔＤｅｌ２１）を、ＰＭＣＶ ＯＲＦ１（配列番号１６）内のヌクレオチド位置１９３６～１９６５で構築した。
【0132】
［00136］ＩＦ染色及びウェスタンブロットによる、ＣＨＨ－１細胞中のＰＭＣＶ ＯＲＦ１カプシド欠失バリアントの発現。細胞の免疫蛍光染色のための手順は、以下の通りであった：ＣＨＨ－１細胞をトリプシン処理し、１２ウェルプレート（１ウェル当たり１５００００細胞及び１ｍｌの細胞培地）に播種した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、１５℃ ＯＮでインキュベートした。細胞を、製造業者の指示に従って、１μｇのプラスミド／ウェル及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、播種の翌日にトランスフェクトした。細胞の免疫染色前に、細胞をＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、１５℃で５日間インキュベートした。細胞培地を全てのウェルから注意深く除去し、全てのウェルをＰＢＳで注意深く洗浄した。細胞を、室温で１５分間、３．７％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中で希釈）でインキュベートすることによって固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳で１時間ブロックした。マウス抗ＨＩＳ（１：１５００希釈の６ｘ－Ｈｉｓ Ｔａｇモノクローナル抗体（４Ａ１２Ｅ４）Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３７－２９００、及びマウス抗ＰＭＣＶ ＯＲＦ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ番号１０、１：２００希釈）の両方を、一次抗体として使用し、室温で１時間インキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲートポリクローナルウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ Ｆ０２６１）を、二次抗体として１：１０００の希釈で使用し、更に１時間インキュベートした。細胞の染色を蛍光顕微鏡によって評価した。
【0133】
［00137］ウェスタンブロッティングによるＰＭＣＶ ＯＲＦ１欠失構築物の発現レベルの評価を、以下のように行った：ＣＨＨ－１細胞をトリプシン処理し、６ウェルプレート（１ウェル当たり１００００００細胞及び３ｍｌの細胞培地）に播種した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、１５℃ ＯＮでインキュベートした。細胞を、製造業者の指示に従って、２．５μｇのプラスミド／ウェル及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、播種の翌日にトランスフェクトした。細胞を密封袋に戻し入れ、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、１５℃で６日間インキュベートした後、更なる分析を行った。次いで、プレートを氷上に置き、培地を除去した。細胞を、最初に氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。膜溶解物を調製するために、最初に、プロテアーゼ阻害剤を含む２００μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加して細胞を採取し、細胞を注意深く擦り取り、細胞懸濁液を予め冷却されたチューブに移した。次いで、ウェルを、更に１００μｌ、及び１トランスフェクション当たり合計３００μｌの細胞懸濁液で洗い流した。これは、洗剤を含まない緩衝液であるため、細胞をシリンジ先端（２５Ｇ、約５回）に通すことによって、細胞を溶解し、１２０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、膜ペレットを１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いて、３００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ａｂｃａｍ、番号１５６０３４）中に溶解して、膜結合タンパク質を放出した。チューブを軽く叩くことによってペレットを時々再懸濁しながら、試料を４℃で３０分間インキュベートした。チューブを１２０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、膜画分溶解物を新鮮なチューブに移し、免疫沈降まで氷上で保持した。氷上で、１μｇのマウスＩｇＧ１抗６ｘ－Ｈｉｓモノクローナル抗体４Ｅ３Ｄ１０Ｈ２／Ｅ３（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５４４２８９０、１ｍｇ／ｍｌ）を各試料に添加し、ローテーター上で一晩、４℃でインキュベートした。約１ｍｌの冷ＰＢＳＴで３～５回、固定化ビーズを洗浄することによって、タンパク質Ｇ結合ビーズを調製し（２５μｌ／試料）、１アリコート当たりプロテアーゼ阻害剤を含む２５μｌのＰＢＳＴ中に再懸濁した。氷上で、２５μｌの予め平衡化されたビーズを各試料に添加し、試料－ビーズ混合物を回転させながら室温で１時間インキュベートした。プロテアーゼ阻害剤を含む５００μｌの氷冷ＰＢＳＴで３～５回、ビーズを洗浄して、各洗浄の間にビーズを穏やかに混合して、非特異的結合を除去した。最後の洗浄後、できるだけ多くの緩衝液をビーズから除去し、４０μｌの１ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ番号１６１－０７３７）を添加した（２０μｌの２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを２μｌのβ－メルカプトエタノール及び１８μｌのｄＨ２Ｏと混合することによって調製した）。試料を７０℃で１０分間インキュベートし、迅速に遠心分離及び磁化し、溶離液を新しいバイアルに移動させた。４～２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｇｅｌ上に充填する前に、全ての試料を９８℃で５分間変性させた。ゲルを、約４５分間、２００Ｖで泳動し、ＴＲＡＮＳ－ＢＬＯＴ（登録商標）ＴＵＲＢＯ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）、及びＴＲＡＮＳ－ＢＬＯＴ（登録商標）ＴＵＲＢＯ（商標）Ｍｉｄｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ番号１７０－４１５７を使用してブロットした。７分間のターボプログラムを使用した。膜を直ちにブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中の５％脱脂乳）に入れた。ブロッキングを室温で１時間実施した。ブロットを、１％の脱脂乳／ＰＢＳＴ中で１：５００希釈した一次抗体ウサギ抗デルタＰＭＣＶ ＯＲＦ１と、ローテーターで一晩、４℃でインキュベートした。翌日、ブロットをＰＢＳＴで２×１５分洗浄し、２％脱脂乳中で１：１０００希釈した二次抗体ポリクローナルブタ抗ウサギ（ＤＡＫＯ番号Ｐ０２１７）免疫グロブリンＨＲＰ及びＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＰＲＯＴＥＩＮ（商標）ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ－ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ １：１００００（ラダーを可視化するため）と、室温で１時間インキュベートした。Ｃｌａｒｉｔｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（ＢｉｏＲａｄ番号１７０－５０６０）によるシグナルの検出前に、ブロットをＰＢＳＴで２×１５分間洗浄した。
【0134】
［00138］結果は、以下のように要約することができる。第１のラウンド（２００アミノ酸長の欠失）の後、細胞膜での発現は、構築物ＩｎｔＤｅｌ４～７からの抗原でのみ達成された。したがって、Ｎ末端部分は、抗原を細胞膜にルーティングするために必要である。したがって、第２のラウンド（５０アミノ酸長の欠失）で作製された構築物は、ＩｎｔＤｅｌ４～７によってカバーされた領域に焦点を当てた。ＩｎｔＤｅｌ１８（配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を欠く構築物）について、細胞表面発現がより低かったことを除き、これらの構築物は全て、細胞膜での抗原の発現に成功した。欠失構築物（ＩｎｔＤｅｌ１５～１７）は、膜発現レベルの上昇をもたらした。第１のラウンドからのＩｎｔＤｅｌ６（配列番号１のアミノ酸５００～６９９を欠く構築物）もまた、より高い発現レベルを有することが見出された。他のものよりもわずかに優れているＩｎｔＤｅｌ４２（配列番号１４に記載されるアミノ酸を欠く構築物）を除き、それ以上の候補は、第３のラウンドでは明らかにされなかった。結果は、図４に示される。
【0135】
［00139］免疫蛍光染色及びウェスタンブロッティングの評価からの組み合わせた結果に基づいて、いくつかの欠失候補が、プロジェクトにおけるいくつかのワクチン試験からの結果に基づいて選択されている。第１の研究における全てのワクチンについて、抗原コード遺伝子を、真核発現ベクターＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。全てのプラスミドを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇの総用量を受けた。非免疫化対照群が含まれ、表７に要約されるように、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表7】
【0136】
［00140］淡水で保持され、２０グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝３０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で４８日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬ Ｖ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１サンプリング時点当たり、１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の１９日後及び４９日後の２つの時点でサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（４９日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0137】
［00141］攻撃接種の３週間後のウイルス負荷及び攻撃接種の７週間後のヒストスコアの結果は、それぞれ表８及び９に示される。全ての結果の組み合わせたデータは、ＩｎｔＤｅｌバリアント１５、１６、及び１７（それぞれ、抗原が配列番号３、４、又は５に記載されるアミノ酸配列を欠いていた）が、完全長カプシドタンパク質（Ｇ－ＯＲＦ１）よりも良好に機能したことを示した。
【表8】
【表9】
【0138】
［00142］３つの新しい抗原欠失候補を評価するために、追加の臨床試験を実施した。第１の研究における全てのワクチンについて、抗原コード遺伝子を、真核発現ベクターＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。全てのプラスミドを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇの総用量を受けた。非免疫化対照群が含まれ、表１０に要約されるように、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表10】
【0139】
［00143］淡水の１つのタンクで保持され、２８グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝３０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で５８日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬ Ｖ１２８９）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の３週間後及び７週間後の２つの時点でサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（７週目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～４にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、４は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0140】
［00144］３週目及び７週目の結果は、それぞれ表１１及び１２に要約される。
【表11】
【表12】
【0141】
実施例３：ワクチン骨格選択
［00145］ワクチンの有効性を最適化するために、ベクターサイズ及び機能要素などのプラスミド骨格の特性も重要である。３つのベクター候補を、インビトロ抗原発現に関して比較した。候補には、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＶＡＸ１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））、ＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び先天性免疫刺激要素を共発現するＮＴＣ９３８５Ｒの２つのバリアント：Ｉ型インターフェロン誘導性アジュバントとして機能するＲＩＧ－Ｉアゴニスト（ＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈ）及びＲＩＧ－Ｉアゴニスト、並びにＴｏｌｌ様受容体９刺激ＣｐＧモチーフ（ＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈ－ＣｐＧ）が含まれた。ＮＴＣ９３８５Ｒ ＮＡＮＯＰＬＡＳＭＩＤ（商標）は、他の従来のベクターよりもサイズが小さく、トランスフェクトされた細胞における改善された取り込み及び持続を可能にし、抗原発現を増強すると主張された改変プロモーターを保有する。これは、製造プロセスにおける抗生物質の使用を置き換えるＲＮＡベースのスクロース選択抗生物質フリーマーカー（ＲＮＡ－ＯＵＴ）と、安全性の観点から有益である特定のＥ．ｃｏｌｉ産生株でのみ、プラスミドが複製することができることを保証する改変された複製起点と、を含む。より小さなサイズは、トランスフェクション効率、並びに発現のレベル及び持続時間に影響を及ぼし得る。追加的に、耐性マーカー遺伝子のようないくつかの細菌領域タンパク質マーカー遺伝子は、ベクター発現を劇的に低減することが示されている。１キロベースを超える細菌領域は、肝臓などの静止組織における導入遺伝子発現をサイレンシングし、これが、真核領域に広がり、プロモーターを不活性化する、転写されていない細菌領域が媒介するヘテロクロマチン形成に起因する可能性が高いことが示されている（Ｓｕｓｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
［00145］ワクチンの有効性を最適化するために、ベクターサイズ及び機能要素などのプラスミド骨格の特性も重要である。３つのベクター候補を、インビトロ抗原発現に関して比較した。候補には、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＶＡＸ１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））、ＮＴＣ９３８５Ｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び先天性免疫刺激要素を共発現するＮＴＣ９３８５Ｒの２つのバリアント：Ｉ型インターフェロン誘導性アジュバントとして機能するＲＩＧ－Ｉアゴニスト（ＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈ）及びＲＩＧ－Ｉアゴニスト、並びにＴｏｌｌ様受容体９刺激ＣｐＧモチーフ（ＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈ－ＣｐＧ）が含まれた。ＮＴＣ９３８５Ｒ ＮＡＮＯＰＬＡＳＭＩＤ（商標）は、他の従来のベクターよりもサイズが小さく、トランスフェクトされた細胞における改善された取り込み及び持続を可能にし、抗原発現を増強すると主張された改変プロモーターを保有する。これは、製造プロセスにおける抗生物質の使用を置き換えるＲＮＡベースのスクロース選択抗生物質フリーマーカー（ＲＮＡ－ＯＵＴ）と、安全性の観点から有益である特定のＥ．ｃｏｌｉ産生株でのみ、プラスミドが複製することができることを保証する改変された複製起点と、を含む。より小さなサイズは、トランスフェクション効率、並びに発現のレベル及び持続時間に影響を及ぼし得る。追加的に、耐性マーカー遺伝子のようないくつかの細菌領域タンパク質マーカー遺伝子は、ベクター発現を劇的に低減することが示されている。１キロベースを超える細菌領域は、肝臓などの静止組織における導入遺伝子発現をサイレンシングし、これが、真核領域に広がり、プロモーターを不活性化する、転写されていない細菌領域が媒介するヘテロクロマチン形成に起因する可能性が高いことが示されている（Ｓｕｓｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0142】
［00146］ウェスタンブロッティングによって、５つの異なるプラスミド骨格におけるワクチン抗原Ｇ－ＯＲＦ１のインビトロ発現レベルを、以下のように評価した：ＣＨＨ－１細胞をトリプシン処理し、６ウェルプレート（１ウェル当たり１００００００細胞及び３ｍｌの細胞培地）に播種した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、１５℃ ＯＮでインキュベートした。細胞を、製造業者の指示に従って、２．５μｇのプラスミド／ウェル及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、播種の翌日にトランスフェクトした。細胞を密封袋に戻し入れ、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、１５℃で５日間インキュベートした後、更なる分析を行った。次いで、プレートを氷上に置き、培地を除去した。細胞を、最初に氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、番号１６９７４９８）を含む１５０μｌのＮＰ４０溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号ＦＮＮ０２１）をウェルに直接添加することによって、全細胞溶解物を調製した。溶解物を予め冷却したエッペンドルフチューブに移し、チューブを時々軽く叩くことによって細胞を再懸濁しながら、４℃で３０分間インキュベートし、１２０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移し、免疫沈降まで氷上で保持した。氷上で、１μｇのマウスＩｇＧ１抗６ｘ－Ｈｉｓモノクローナル抗体４Ｅ３Ｄ１０Ｈ２／Ｅ３（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５４４２８９０、１ｍｇ／ｍｌ）を各試料に添加し、ローテーター上で一晩、４℃でインキュベートした。約１ｍｌの冷ＰＢＳＴで３～５回、固定化ビーズを洗浄することによって、タンパク質Ｇ結合ビーズを調製し（２５μｌ／試料）、１アリコート当たりプロテアーゼ阻害剤を含む２５μｌのＰＢＳＴ中に再懸濁した。氷上で、２５μｌの予め平衡化されたビーズを各試料に添加し、試料－ビーズ混合物を回転させながら室温で１時間インキュベートした。プロテアーゼ阻害剤を含む５００μｌの氷冷ＰＢＳＴで３～５回、ビーズを洗浄して、各洗浄の間にビーズを穏やかに混合して、非特異的結合を除去した。最後の洗浄後、できるだけ多くの緩衝液をビーズから除去し、４０μｌの１ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ番号１６１－０７３７）を添加した（２０μｌの２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを２μｌのβ－メルカプトエタノール及び１８μｌのｄＨ２Ｏと混合することによって調製した）。試料を７０℃で１０分間インキュベートし、迅速に遠心分離及び磁化し、溶離液を新しいバイアルに移動させた。４～２０％のＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ＴＧＸ ＳＴＡＩＮ－ＦＲＥＥ（商標）Ｇｅｌ上に充填する前に、全ての試料を９８℃で５分間変性させた。ゲルを、約４５分間、２００Ｖで泳動し、ＴＲＡＮＳ－ＢＬＯＴ（登録商標）ＴＵＲＢＯ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）、及びＴＲＡＮＳ－ＢＬＯＴ（登録商標）ＴＵＲＢＯ（商標）Ｍｉｄｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ番号１７０－４１５７を使用してブロットした。７分間のターボプログラムを使用した。膜を直ちにブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中の５％脱脂乳）に入れた。ブロッキングを室温で１時間実施した。ブロットを、１％の脱脂乳／ＰＢＳＴ中で１：５００希釈した一次抗体ウサギ抗デルタＰＭＣＶ ＯＲＦ１と、ローテーターで一晩、４℃でインキュベートした。翌日、ブロットをＰＢＳＴで２×１５分洗浄し、２％脱脂乳中で１：１０００希釈した二次抗体ポリクローナルブタ抗ウサギ（ＤＡＫＯ番号Ｐ０２１７）免疫グロブリンＨＲＰ及びＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＰＲＯＴＥＩＮ（商標）ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ－ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ １：１００００（ラダーを可視化するため）と、室温で１時間インキュベートした。Ｃｌａｒｉｔｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（ＢｉｏＲａｄ番号１７０－５０６０）によるシグナルの検出前に、ブロットをＰＢＳＴで２×１５分間洗浄した。
【0143】
［00147］本研究における全てのワクチンについて、細胞膜での発現のためにルーティングされた完全長ＰＭＣＶ ＯＲＦ１カプシド遺伝子（Ｇ－ＯＲＦ１）を、以下の表に従って、異なる真核発現ベクター中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。全てのプラスミドを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇの総用量を受けた。非免疫化対照群が含まれ、表１３に要約されるように、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表13】
【0144】
［00148］淡水で保持され、２９グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝３０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で５９日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬ Ｖ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の２０日後及び４８日後の２つの時点でサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（４８日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0145】
［00149］トランスフェクトされたＣＨＨ－１細胞のウェスタンブロット分析は、３つ全てのＮＴＣ９３８５Ｒプラスミドバリアントが、ｐｃＤＮＡ３．１及びｐＶＡＸ１プラスミド骨格と比較して、優れた抗原発現を媒介したことを示した（図５）。臨床試験は、ＮＴＣ９３８５Ｒベースのワクチンについて、ｐｃＤＮＡ３．１／ｐＶＡＸ１に基づくワクチンと少なくとも同等の良好な保護を示した（３週間及び７週間のそれぞれについて表１４及び表１５を参照されたい）。組み合わせたデータセットは、ＮＴＣ９３８５Ｒベースのワクチン骨格による優れた保護の傾向を示した。免疫刺激要素を有するＮＴＣ９３８５Ｒプラスミドは、追加の効果を提供しなかった。
【表14】
【表15】
【0146】
実施例４：アジュバント選択
［00150］分子アジュバントは、免疫原性を高めること、及び免疫応答の寿命を延ばすことの両方においてかなりの見込みを示し、サイトカイン、ケモカイン、又は共刺激分子を発現させるこれらの分子アジュバントは、抗原をコードするＤＮＡワクチンプラスミドと共投与され得る。分子アジュバントプラスミドによってトランスフェクトされた細胞は、アジュバントを周囲領域に分泌し、局所抗原提示細胞を刺激する（Ｓｕｓｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。魚のＩ型インターフェロンのアジュバント活性は、タイセイヨウサケにおける伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）のウイルスＤＮＡワクチン接種モデルにおいて既に示されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。この論文では、Ｉ型ＩＦＮが、ＩＳＡＶ－ヘマグルチニンタンパク質に対する抗体応答を増強し、ウイルス攻撃接種に対する保護の増加を提供したことが実証された。
［00150］分子アジュバントは、免疫原性を高めること、及び免疫応答の寿命を延ばすことの両方においてかなりの見込みを示し、サイトカイン、ケモカイン、又は共刺激分子を発現させるこれらの分子アジュバントは、抗原をコードするＤＮＡワクチンプラスミドと共投与され得る。分子アジュバントプラスミドによってトランスフェクトされた細胞は、アジュバントを周囲領域に分泌し、局所抗原提示細胞を刺激する（Ｓｕｓｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。魚のＩ型インターフェロンのアジュバント活性は、タイセイヨウサケにおける伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）のウイルスＤＮＡワクチン接種モデルにおいて既に示されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。この論文では、Ｉ型ＩＦＮが、ＩＳＡＶ－ヘマグルチニンタンパク質に対する抗体応答を増強し、ウイルス攻撃接種に対する保護の増加を提供したことが実証された。
【0147】
［00151］以下の分子アジュバント：ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｃ、ＩＦＮｄ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、及びＶＨＳＶ－Ｇを、候補者の迅速な有効性スクリーニングのためのハイスループットモデルを使用して、アジュバント活性について、完全長ＰＭＣＶ ＯＲＦ１ワクチン抗原（Ｇ－ＯＲＦ１）とともにインビボで試験した。
【0148】
［00152］このモデルは、攻撃接種の５０日後の組織病理学的病変の差が、攻撃接種の２０日後の同じ群の心臓及び腎臓におけるウイルスＲＮＡレベルによって予測され得るという驚くべき発見に基づく。したがって、多くの群の迅速なスクリーニングのために、攻撃接種の３週間後の１つのサンプリング時点のみが、使用される必要がある。
【0149】
［00153］アジュバントのインビボスクリーニング研究における全ての群について、ワクチン抗原及びプラスミドコードアジュバントを別個のプラスミド上で投与した。抗原をコードする遺伝子（Ｇ－ＯＲＦ１）及び様々なプラスミドコードアジュバント遺伝子を全て、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。プラスミドを、以下の表に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇのプラスミドの総用量を受けた（抗原＋アジュバントを与えられた場合、２０μｇの各プラスミド）を受けた。表１６に要約されるように、２つの非免疫化対照群を含み、１つの群は、２０μｇの対照ワクチン（ｐｃＤＮＡ３．１中のｅＧＦＰ）を受け、１つの群は、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【0150】
［00154］淡水で保持され、３１グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝１５）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で５０日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬＶ１２２３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の２１日後にサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。
【0151】
［00155］７週間の免疫化及び３週間の攻撃接種の後、モデルは、アジュバント戦略の大部分が有効性の改善に失敗した一方で、１つのアジュバント、ＩＦＮｂが、効果のレベルを顕著に高めたことを見出した。結果は、表１７に列挙される。
【表16-1】
【表16-2】
【表17】
【0152】
［00156］ＩＦＮｂ及びＩＦＮｃを、フォローアップの魚の試験のために選択した。この試験の全ての群について、ワクチン抗原及びプラスミドコードアジュバントを別個のプラスミド上で投与した。抗原をコードする遺伝子（Ｇ－ＯＲＦ１）及びプラスミドコードアジュバント遺伝子（ＩＦＮｂ又はＩＦＮｃ）を全て、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。プラスミドを、以下の表に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇのプラスミドの総用量を受けた（抗原＋アジュバントを与えられた場合、２０μｇの各プラスミド）を受けた。非免疫化対照群が含まれ、表１８に要約されるように、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表18】
【0153】
［00157］淡水で保持され、２９グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝３０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で５９日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬＶ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の２０日後及び４８日後の２つの時点でサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（４８日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0154】
［00158］結果は、ＩＦＮｂがＩＦＮｃよりも優れていたことを示した（表１９）。２つのアジュバント間の差は、攻撃接種の７週間後のサンプリング時点で最も顕著であった（より早い時点からのデータは示さず）。アジュバントのみを受けた群も部分的に保護され、ＩＦＮが先天性免疫応答及び適応免疫応答の両方の重要なエフェクターであることを反映した。
【表19】
【0155】
実施例５－アジュバント送達
［00159］この実験の目的は、抗原及び分子アジュバントを送達する最良の方法を決定することであった。
［00159］この実験の目的は、抗原及び分子アジュバントを送達する最良の方法を決定することであった。
【0156】
［00160］プラスミドコードアジュバントは、別個のプラスミド上で送達され得るか、又は抗原をコードするものと同じプラスミド上に含まれ得る。抗原と同じプラスミドから発現する場合、これは、例えば、以下の方法で行われ得る。
１．ワクチン抗原とは別個であるが同一のプロモーターから。
２．ワクチン抗原とは別個の同様（だが同一ではない）プロモーターから。
３．自己切断を促進するために、Ｐ２Ａペプチド配列によって分離された抗原との融合タンパク質として。
１．ワクチン抗原とは別個であるが同一のプロモーターから。
２．ワクチン抗原とは別個の同様（だが同一ではない）プロモーターから。
３．自己切断を促進するために、Ｐ２Ａペプチド配列によって分離された抗原との融合タンパク質として。
【0157】
［00161］本実施例では、アジュバントの異なる送達選択肢を試験した。細胞表面発現ＰＭＣＶ ＯＲＦ１抗原（Ｇ－ＯＲＦ１）を全ての群に与えた。アジュバントを以下の方法で提供した。
１．別のプラスミド上（Ｇ－ＯＲＦ１＋ＩＦＮｂ）
２．抗原とともに発現し、同じＣＭＶプロモーターの下流にあり、自己切断２Ａペプチドによって抗原から分離されている（Ｇ－ＯＲＦ１－Ｐ２Ａ－ＩＦＮｂ）
３．抗原と同じプラスミド上ではあるが、第２のＣＭＶプロモーターの下流で発現する（Ｇ－ＯＲＦ１－ＣＭＶ－ＩＦＮｂ）
４．１つの群は、抗原（Ｇ－ＯＲＦ１）のみでアジュバントを受けなかった。
５．ＰＢＳを受ける非ワクチン接種対照群も含んだ。
１．別のプラスミド上（Ｇ－ＯＲＦ１＋ＩＦＮｂ）
２．抗原とともに発現し、同じＣＭＶプロモーターの下流にあり、自己切断２Ａペプチドによって抗原から分離されている（Ｇ－ＯＲＦ１－Ｐ２Ａ－ＩＦＮｂ）
３．抗原と同じプラスミド上ではあるが、第２のＣＭＶプロモーターの下流で発現する（Ｇ－ＯＲＦ１－ＣＭＶ－ＩＦＮｂ）
４．１つの群は、抗原（Ｇ－ＯＲＦ１）のみでアジュバントを受けなかった。
５．ＰＢＳを受ける非ワクチン接種対照群も含んだ。
【0158】
［00162］本研究における全てのワクチンについて、遺伝子を、真核発現ベクターｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。使用した抗原は、Ｇ－ＯＲＦ１（Ｇ－ＰＭＣＶ＿ＯＲＦ１＿完全長＿１－２５８３）であった。全てのワクチンを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５０μｌの注入体積当たり１０μｇに希釈した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射、及び２０μｇの総用量を受けた。別個のプラスミド上の抗原及びプラスミドコードアジュバントを受ける魚について、各プラスミドの用量は、２０μｇであった。非免疫化対照群が含まれ、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。加えて、１つの群は、表２０に要約されるように、プラスミドコードアジュバントのコドン変化バージョンを受けた。
【表20】
【0159】
［00163］淡水で保持され、２５グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝３０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で４９日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬＶ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の１９日後及び４７日後の２つの時点でサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（４７日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0160】
［00164］臨床試験からの結果は、攻撃接種の７週間後の心臓からのヒストスコアデータによって例示される（表２１）。
【表21】
【0161】
［00165］異なる構築物についての抗原発現レベル及びアジュバント活性も、インビトロで評価されている（結果は示さず）。組み合わせた結果は、好ましいアプローチが、抗原と同一であるが別個のプロモーター下で、抗原と同じプラスミド上でアジュバントを提供することであるが、異なるプラスミド上での送達もまた有効であり得ることを示唆する。
【0162】
実施例６－ワクチン有効性の持続期間
［00166］初期の研究は、アジュバントのみを受ける魚が部分的に保護されたことを示し、ＩＦＮが先天性免疫応答及び適応性免疫応答の両方の重要なエフェクターであることを反映している。ＤＮＡ構築物に分子アジュバントを含むことによって得られる保護の持続時間を研究するために、長期フォローアップワクチン試験を実施した。
［00166］初期の研究は、アジュバントのみを受ける魚が部分的に保護されたことを示し、ＩＦＮが先天性免疫応答及び適応性免疫応答の両方の重要なエフェクターであることを反映している。ＤＮＡ構築物に分子アジュバントを含むことによって得られる保護の持続時間を研究するために、長期フォローアップワクチン試験を実施した。
【0163】
［00167］本研究における全てのワクチンについて、遺伝子を、Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＴＣ）からの真核発現ベクター中のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。骨格は、ＮＴＣ９３８５Ｒ又はＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈ－ＣｐＧのいずれかであった。抗原及びプラスミドコードアジュバントの両方を受ける群について、これらを別個のプラスミド（各プラスミド２０μｇ）又は同じプラスミド（２０μｇ）のいずれかで提供した。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射（０．０５ｍｌ）を受けた。非免疫化対照群が含まれ、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。ワクチン群の詳細については、以下の表２２を参照されたい。
【表22】
【0164】
［00168］淡水で保持され、１７グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝６０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。次いで、魚を貯蔵タンクで保持し、ここで、免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で７８日間、１２０日間、又は１８３日間発達させた。これらの時点の各々において、魚のコホート（７８ｄｐｖ及び１８３ｄｐｖの時点で１群当たりｎ＝１５、並びに１２０ｄｐｖの時点で１群当たりｎ＝３０）を、攻撃接種タンクに移動させた。魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬＶ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の３週後にサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。ワクチン接種の１２０日後に攻撃接種したコホートについて、攻撃接種の７週間後に追加のサンプリングを行った。ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）のための心臓及び腎臓に加えて、心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、この最後のサンプリング時点（７週目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0165】
［00169］ワクチンの有効性を、最大２６週間の免疫化後の攻撃接種（免疫化の１２、１８、及び２６週間後の攻撃接種）によって評価した。１８週目の攻撃接種を、攻撃接種の２０及び５０日後の２つのサンプリング時点を用いて５０日間追跡し、心臓及び腎臓組織を、ｑＰＣＲによる分析及び上記の心臓における組織病理の評価のためにサンプリングした。
【0166】
［00170］結果は、ＰＭＣＶ感染に対する顕著な保護の後１８３日／２１９６度日後、最後の攻撃接種までに、全てのワクチンで達成されたことを示した。Ｇ－ＯＲＦ１及びＩＦＮｂの組み合わせは、別個の２つの成分よりも優れた保護を提供した（表２３、２４）。全体的な結果は、ワクチンが長期的かつ持続的な保護を提供することを示す。
【表23】
【表24】
【表25】
【表26】
【0167】
実施例７－アジュバント効率の最適化
［00171］ＩＦＮｂのアジュバントの可能性を更に最適化するために、本発明者らは、タイセイヨウサケ及び密接に関連する種において相同遺伝子を特定した。サケ科の魚は、進化的な近年の全ゲノム重複を経験しているため、多くのサケ遺伝子が重複して見られる（分岐したホモログ）。最初に試験したＩＦＮｂアジュバントと類似しているが同一ではない３つの新しい遺伝子を選択した（表２７）。これらは、以下であった：
－タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）－ＩＦＮｂ１（分岐したパラログ遺伝子）
－ブラウントラウト（Ｓａｌｍｏ ｔｒｕｔｔａ）－ＩＦＮ ａ３様遺伝子
－ベニザケ（Ｏｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｎｅｒｋａ）－ＩＦＮａ３様遺伝子。
［00171］ＩＦＮｂのアジュバントの可能性を更に最適化するために、本発明者らは、タイセイヨウサケ及び密接に関連する種において相同遺伝子を特定した。サケ科の魚は、進化的な近年の全ゲノム重複を経験しているため、多くのサケ遺伝子が重複して見られる（分岐したホモログ）。最初に試験したＩＦＮｂアジュバントと類似しているが同一ではない３つの新しい遺伝子を選択した（表２７）。これらは、以下であった：
－タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）－ＩＦＮｂ１（分岐したパラログ遺伝子）
－ブラウントラウト（Ｓａｌｍｏ ｔｒｕｔｔａ）－ＩＦＮ ａ３様遺伝子
－ベニザケ（Ｏｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｎｅｒｋａ）－ＩＦＮａ３様遺伝子。
【表27】
【0168】
［00172］相同組換えを通したサケゲノムへのワクチン組み込みが懸念される可能性があるため、アジュバントとサケゲノムとの間の配列類似性を低減することによって、リスク軽減が得られ得る。これを、最初にプラスミドコードアジュバントをタンパク質配列に翻訳することによって行った。その後、これらの配列を、コドン頻度分布（タイセイヨウサケでの使用頻度によって与えられた確率で割り当てられたコドン）に基づいて、タンパク質からヌクレオチド配列に逆翻訳して戻した（逆翻訳）。頻度分布に基づいてコドンを使用するためのソフトウェア設定を伴うＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、逆変換を行った。
【0169】
［00173］この手順の後に返された新しいアジュバント配列は、ヌクレオチドで野生型ＩＦＮｂ配列に対して７４～８０％同一であった。次いで、インビトロアッセイを使用して、４つのコドン変化バージョン（ＲＴと称される）を含む、４つの元の天然アジュバント候補の活性を比較した。
【0170】
［00174］したがって、ＩＦＮｂの野生型核酸配列（配列番号１８）は、ＩＦＮｂのＲＴ核酸配列（配列番号１７）に対して約７６％同一であり、ＩＦＮｂ１の野生型核酸配列（配列番号１９）は、ＩＦＮｂ１のＲＴ核酸配列（配列番号２０）に対して約７８％同一であった
【0171】
［00175］異なるＩＦＮｂ候補の試験を促進し、それらのアジュバントの可能性を評価するために、インビトロスクリーニングアッセイを確立した。この試験の原理は、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＭｘ発現（ＩＦＮ誘導性遺伝子）を定量化することである。Ｍｘタンパク質は、広範囲のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を有する大きなＧＴＰａｓｅのスーパーファミリーに属する。インビボでは、Ｍｘ遺伝子の発現は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在によって厳密に調整され、それらの誘導は、いくつかのウイルス感染中に記載されている。ＣＨＨ－１細胞は、ＩＦＮｂ刺激に応答してＭｘを発現せず（受容体を欠く潜在的な結果）、ＴＯ細胞を容易にトランスフェクトすることができないため、アッセイは、以下の方法で設定されている。
【0172】
［00176］ＣＨＨ－１細胞を、非アジュバント構築物を陰性対照として含んだ様々なアジュバント構築物でトランスフェクトすることによって、ＩＦＮｂ遺伝子の機能性／活性を研究した。トランスフェクションの７日後、ＣＨＨ－１細胞トランスフェクタントから分泌されたＩＦＮ分子を含有する細胞培養培地を採取し、異なる希釈で別の魚細胞株（ＴＯ細胞）に移した。ＴＯ細胞のインキュベーションに使用した馴化培地の最終比は、典型的には１：６、１：６０、１：６００、及び１：６０００であり、インビトロモデルもアジュバント活性の定量的尺度を提供することを可能にする。馴化培地での３日間のインキュベーション後、細胞培養培地を注意深く除去し、細胞からＲＮＡを抽出することによって、ＴＯ細胞をサンプリングした。ＩＦＮｂによって誘導されたＭｘ応答を、以下のプライマー／プローブを使用して、ｑＰＣＲによって分析した。
配列番号４２ Ｍｘ順方向：ＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴＴＡ
配列番号４３ Ｍｘ逆方向：ＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡ
配列番号４４ Ｍｘプローブ：６－ＦＡＭ－ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴ－ＭＧＢ
配列番号４２ Ｍｘ順方向：ＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴＴＡ
配列番号４３ Ｍｘ逆方向：ＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡ
配列番号４４ Ｍｘプローブ：６－ＦＡＭ－ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴ－ＭＧＢ
【0173】
［00177］結果は、以下の表２８に示される。
【表28】
【0174】
［00178］これらの結果は、ＲＴ構築物が、野生型配列と比較してわずかにより高い免疫調節活性を有することを実証する。結果はまた、ＩＦＮｂ１がＩＦＮｂよりも高い免疫調節活性を有することを明らかに示す。
【0175】
［00179］インビトロ研究に基づいて、４つのＲＴ ＩＮＦｂアジュバントを、魚におけるワクチンアジュバントとして試験するために選択した（２つの別個のプラスミド上のＰＭＣＶカプシド抗原（Ｇ－ＯＲＦ１）及びアジュバントを受ける全ての群）。加えて、１つの群は、陰性アジュバント対照群として、Ｇ－ＯＲＦ１ワクチン抗原＋ｅＧＦＰコードプラスミドを受けた。全ての魚は、魚の両側に１回の筋肉内注射を受けた。全ての魚は、別個のプラスミド上の抗原及びプラスミドコードアジュバントを受け、各プラスミドの用量は、２０μｇであった。非免疫化対照群が含まれ、表２９に要約されるように、２×５０μｌのＰＢＳを受けた。
【表29】
【0176】
［00180］淡水で保持され、２０グラム平均重量を有するタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）（１群当たりｎ＝３０）を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して麻酔し、脂びれ及び／又は上顎の短縮によってタグ付けし、群に割り当て、同じ麻酔期間（魚の両側に１回の注射）の下で、０．０５ｍｌの試験ワクチンを２回筋肉内注射した。免疫を１２Ｃ（明：暗１２：１２）で４８日間発達させた後、魚を、Ｔｒｉｃａｉｎ（ＰＨＡＲＭＡＱ）を使用して再び麻酔し、ＣＭＳのノルウェー領域の発生に由来する０．１ｍｌの均質化された心臓（単離体ＩＤ ＡＬＶ１２７３心臓）の腹腔内注射によって、伝染性ＰＭＣＶで攻撃接種した。次いで、魚（１群当たりｎ＝１５）を、攻撃接種の１９日後及び４９日後の２つの時点でサンプリングした。心室及び腎臓を、その後のＲＮＡ抽出のために、全てのサンプリングされた魚からＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上で採取した。心臓（心室及び心房）も、病理組織学的分析のために、最後のサンプリング時点（４９日目）に全ての魚からホルマリンで固定した。ＲＮＡを、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）上に保存された全ての試料から抽出し、ＰＭＣＶ ＲＮＡの存在について、ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ（Ｎｏｒｗａｙ）からの市販のサービスを使用して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ホルマリン上に保存された心臓を切片化し、重症度に従って組織病理を０～３にスコアリングし、０は、病理学的所見なしを示し、３は、重度の病理の存在を示す（ＰＨＡＲＭＡＱ Ａｎａｌｙｔｉｑ、Ｎｏｒｗａｙによって提供されたサービス）。
【0177】
［00181］結果は、以下の表３０及び３１に示される。
【表30】
【表31】
【0178】
［00182］全体的な結論は、試験した全ての試験されたＲＴアジュバントが、同様の保護を提供するが、ＩＦＮｂ１ ＲＴ構築物を使用して誘発された保護が、ＩＦＮｂ ＲＴ構築物によって誘発された保護よりもわずかに高かったということである。これらのアジュバントのコドン変化バージョンは、相同組換えのリスクを低減するために好ましい。
【0179】
［00183］アジュバントを送達する最良の方法は、抗原とは別個であるが同一のプロモーターを使用しながらの、抗原と同じプラスミド上での送達であるが、異なるプラスミドを使用した抗原及びアジュバントの送達も有効である。
【0180】
［00184］本明細書に列挙される全ての刊行物、特許刊行物及び非特許刊行物の両方は、本発明が関連する技術分野の当業者の技能レベルを示す。これら全ての刊行物は、各個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【0181】
［00185］本明細書における本発明は、特定の実施形態を参照して説明されてきたが、これらの実施形態は、本発明の原理及び適用の例示にすぎないことを理解されたい。したがって、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に多数の修正が加えられ得ること、及び他の構成が考案され得ることを理解されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】