特表 2025-501742 中枢神経系への細胞特異的輸送のための二重標的化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-23

(54)【発明の名称】中枢神経系への細胞特異的輸送のための二重標的化

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20250116BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20250116BHJP

【ＦＩ】

C07K14/00 ZNA

C07K7/08

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537440

(86)(22)【出願日】2022-12-20

(85)【翻訳文提出日】2024-08-20

(86)【国際出願番号】 US2022082091

(87)【国際公開番号】W WO2023122632

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/292,370

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/412,220

(32)【優先日】2022-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ

(71)【出願人】

【識別番号】501228071

【氏名又は名称】エスアールアイ インターナショナル

【氏名又は名称原語表記】ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ

【住所又は居所原語表記】３３３ Ｒａｖｅｎｓｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４０２５， Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100081961

【弁理士】

【氏名又は名称】木内 光春

(74)【代理人】

【識別番号】100112564

【弁理士】

【氏名又は名称】大熊 考一

(74)【代理人】

【識別番号】100163500

【弁理士】

【氏名又は名称】片桐 貞典

(74)【代理人】

【識別番号】230115598

【弁護士】

【氏名又は名称】木内 加奈子

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，キャスリン シー．

(72)【発明者】

【氏名】ヴェヌゴパル，インドゥ

(72)【発明者】

【氏名】マグワイア，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】シュウ，ウェイリャン

(72)【発明者】

【氏名】パウエル，アマンダ

(72)【発明者】

【氏名】リー，イートン

(72)【発明者】

【氏名】マラフィーノ，ジョン

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA57

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA33

(57)【要約】

【課題】
【解決手段】ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、リンカー、及びその任意の組み合わせを含む組み合わせが開示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドが開示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＴＳペプチドが開示される。少なくとも１つのＭＴＳペプチドに共役する少なくとも１つのＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備える。いくつかの様態において、開示される組成物は、１つ以上のリンカーをさらに備える。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドは、Ｎ末端保護基を有する、請求項１のペプチド。

【請求項3】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項２のペプチド。

【請求項4】

前記ペプチドは、リンカーをさらに備える、請求項１乃至３のペプチド。

【請求項5】

前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾシクロオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４のペプチド。

【請求項6】

前記ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ１２又はＰＥＧ１４である、請求項５のペプチド。

【請求項7】

前記リンカーは、前記ペプチドのＣ末端に結合する、請求項４乃至６のペプチド。

【請求項8】

少なくとも１つの分子輸送配列（ＭＴＳ）ペプチドに共役する少なくとも１つの分子誘導配列（ＭＧＳ）ペプチドを備え、
前記ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備える、
組成物。

【請求項9】

２つ以上の分子輸送配列（ＭＴＳ）ペプチドに共役する２つ以上の分子誘導配列（ＭＧＳ）ペプチドを備え、
前記ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備える、
組成物。

【請求項10】

前記２つ以上のＭＧＳペプチドは、４つのＭＧＳペプチドである、請求項９の組成物。

【請求項11】

前記２つ以上のＭＧＳペプチドは、同じＭＧＳペプチドである、請求項１０の組成物。

【請求項12】

前記２つ以上のＭＴＳペプチドは、同じＭＴＳペプチドである、請求項９乃至１１の組成物。

【請求項13】

前記ＭＧＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有する、請求項８乃至１２の組成物。

【請求項14】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項１３の組成物。

【請求項15】

第１のリンカーをさらに備える、請求項８乃至１４の組成物。

【請求項16】

前記第１のリンカーは、前記ＭＧＳペプチドのＣ末端に結合する、請求項１５の組成物。

【請求項17】

第２のリンカーをさらに備える、請求項１５及び１６の組成物。

【請求項18】

前記第２のリンカーは、前記第１のリンカーに結合する、請求項１７の組成物。

【請求項19】

第３のリンカーをさらに備える、請求項１７又は１８の組成物。

【請求項20】

前記第３のリンカーは、前記第２のリンカーに結合する、請求項１９の組成物。

【請求項21】

前記第３のリンカーは、前記ＭＴＳペプチドのＣ末端に結合する、請求項１７乃至２０の組成物。

【請求項22】

前記第１のリンカー、及び／又は前記第２のリンカー、及び／又は前記第３のリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾシクロオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１５乃至２１の組成物。

【請求項23】

前記リンカーは、ＰＥＧリンカーを含む、請求項２２の組成物。

【請求項24】

カーゴをさらに備える、請求項８乃至２３の組成物。

【請求項25】

前記カーゴは、前記第１のリンカー、前記第２のリンカー、及び／又は前記第３のリンカーに結合する、請求項２４の組成物。

【請求項26】

前記カーゴは、核酸配列、ペプチド、タンパク質、又は小分子である、請求項２４又は２５の組成物。

【請求項27】

前記カーゴは、画像化剤、抗体、及び／又はｓｉＲＮＡである、請求項２４乃至２６の組成物。

【請求項28】

前記ＭＴＳペプチドは、中枢神経系を標的化する、請求項８乃至２７の組成物。

【請求項29】

前記ＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える、請求項８乃至２８の組成物。

【請求項30】

前記ＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を備える、請求項８乃至２９の組成物。

【請求項31】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項３０の組成物。

【請求項32】

２つの分子輸送配列（ＭＴＳ）ペプチドに共役する４つの分子誘導配列（ＭＧＳ）ペプチドを備え、
前記ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備え、
前記ＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える、
組成物。

【請求項33】

前記４つのＭＧＳペプチドは、同じ又は異なるＭＧＳペプチドである、請求項３２の組成物。

【請求項34】

前記２つのＭＴＳペプチドは、同じ又は異なるＭＴＳペプチドである、請求項３２の組成物。

【請求項35】

前記ＭＧＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有する、請求項３２乃至３４の組成物。

【請求項36】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項３５の組成物。

【請求項37】

第１のリンカーをさらに備える、請求項３２乃至３６の組成物。

【請求項38】

前記第１のリンカーは、前記ＭＧＳペプチドのＣ末端に結合する、請求項３７の組成物。

【請求項39】

第２のリンカーをさらに備える、請求項３７又は３８の組成物。

【請求項40】

前記第２のリンカーは、前記第１のリンカーに結合する、請求項３９の組成物。

【請求項41】

第３のリンカーをさらに備える、請求項３９又は４０の組成物。

【請求項42】

前記第３のリンカーは、前記第２のリンカーに結合する、請求項４１の組成物。

【請求項43】

前記第３のリンカーは、前記ＭＴＳペプチドの少なくとも１つのＣ末端に結合する、請求項４１又は４２の組成物。

【請求項44】

前記第１のリンカー及び／又は前記第２のリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを含む、請求項３７乃至４３の組成物。

【請求項45】

前記ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧＰＥＧ１２又はＰＥＧ１４である、請求項４４の組成物。

【請求項46】

カーゴをさらに備える、請求項３２乃至４５の組成物。

【請求項47】

前記カーゴは、前記第１のリンカー、前記第２のリンカー、及び／又は前記第３のリンカーに結合する、請求項４６の組成物。

【請求項48】

前記カーゴは、核酸配列、ペプチド、タンパク質、又は小分子である、請求項４６又は４７の組成物。

【請求項49】

前記カーゴは、画像化剤、抗体、及び／又はｓｉＲＮＡである、請求項４８の組成物。

【請求項50】

前記ＭＴＳペプチドは、中枢神経系を標的化する、請求項３２乃至４９の組成物。

【請求項51】

前記ＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を備える、請求項３２乃至５０の組成物。

【請求項52】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項５１の組成物。

【請求項53】

請求項２４乃至３１又は４６乃至５２の組成物の１つ以上を、当該組成物を必要とする前記対象に投与することを備え、
前記カーゴに共役する前記ペプチドは、前記ＣＮＳに入る、
前記カーゴを前記対象の前記ＣＮＳへと輸送する方法。

【請求項54】

前記組成物は、脈絡叢に入る、請求項５３の方法。

【請求項55】

前記組成物は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に入る、請求項５３又は５４の方法。

【請求項56】

前記ＣＳＦは、前記組成物を、前記ＣＮＳ全体に輸送する、請求項５５の方法。

【請求項57】

前記ＭＧＳは、カーゴを、特定のＣＮＳ細胞に標的化する、請求項５３乃至５６の方法。

【請求項58】

前記ＣＮＳ細胞は、神経細胞又はミクログリアである、請求項５７の方法。

【請求項59】

前記カーゴは、前記ＣＮＳ内部で機能活性を保持する、請求項５３乃至５８の方法。

【請求項60】

投与は、静脈内投与又は髄腔内投与である、請求項５３乃至５９の方法。

【請求項61】

請求項２４乃至３１又は４６乃至５２の組成物の１つ以上を、当該組成物を必要とする対象に投与することを備え、
前記カーゴは、ＣＮＳ障害又は傷害の治療薬である、
前記対象の前記ＣＮＳ障害又は傷害を治療する方法

【請求項62】

前記ＣＮＳ障害又は傷害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、膠芽腫、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、又は外傷性脳損傷である、請求項６１の方法。

【請求項63】

前記ＣＮＳ障害の治療薬は、抗体又は遺伝子治療である、請求項６１又は６２の方法。

【請求項64】

請求項２４乃至３１又は４６乃至５２の組成物の１つ以上を、当該組成物を必要とする対象に投与することを備え、
前記カーゴは、画像化剤である、
前記対象の前記ＣＮＳを画像化する方法。

【請求項65】

前記組成物は、脈絡叢に入る、請求項６１乃至６４の方法。

【請求項66】

前記組成物は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に入る、請求項６１乃至６５の方法。

【請求項67】

前記ＣＳＦは、前記組成物を、前記ＣＮＳ全体に輸送する、請求項６６の方法。

【請求項68】

前記ＭＧＳは、前記カーゴを、特定のＣＮＳ細胞に標的化する、請求項６１乃至６７の方法。

【請求項69】

前記ＣＮＳ細胞は、神経細胞又はミクログリアである、請求項６８の方法。

【請求項70】

前記カーゴは、前記ＣＮＳ内部で機能活性を保持する、請求項６１乃至６９の方法。

【請求項71】

投与は、静脈内投与又は髄腔内投与である、請求項６１乃至７０の方法。

【請求項72】

（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基と、
（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基と、
を備えるリンカー。

【請求項73】

前記リンカーは、脂質部分をさらに備える、請求項７２のリンカー。

【請求項74】

前記リンカーは、２～４つのＰＥＧリンカーと、少なくとも２つのＰＥＧリンカーの間の反応性基とを備える、請求項７２又は７３のリンカー。

【請求項75】

前記リンカーは、アミノ酸、ペプチド、アルキル基、マレイミド、チオール、ヒドラゾン、及びアミドを含む、請求項７２乃至７４のリンカー。

【請求項76】

前記アミノ酸は、修飾アミノ酸である、請求項７５のリンカー。

【請求項77】

前記修飾アミノ酸は、官能化リジン、官能化システイン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸である、請求項７６のリンカー。

【請求項78】

前記リンカーは、
［式１２］

の構造を備え、
Ｘは、ペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項７２乃至７７のリンカー。

【請求項79】

前記リンカーは、
［式１３］

の構造を備え、
Ｘは、ペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項７２乃至７７のリンカー。

【請求項80】

前記リンカーは、
［式１４］

の構造を備え、
Ｘは、ペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項７２乃至７７のリンカー。

【請求項81】

前記リンカーは、
［式１５］

の構造を備え、
Ｘは、ペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項７２乃至７７のリンカー。

【請求項82】

前記反応性基は、カルボン酸、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、クロロホルメート、アルデヒド、アルキン、（アセチレン性水素を有さない）アルキン、アミド及びイミド、アミン、ホスフィン、及びピリジン、無水物、アゾ、ジアゾ、アジド、ヒドラジン、及びアジド化合物、カルバメート、エポキシド、エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、エステル、チオリン酸エステル、及びホウ酸エステル、ハロゲン化有機化合物、イソシアネート及びイソチオシアネート、ケトン、オキシム、スルフィド（有機）である、請求項７２乃至８１のリンカー。

【請求項83】

前記部分は、カーゴであり、
前記カーゴは、色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、ペプチド、又は脂質である、
請求項７１乃至８２のリンカー。

【請求項84】

前記部分は、リンカーである、請求項７２乃至８３のリンカー。

【請求項85】

ａ．ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＧＳ）と、
ｂ．（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第１のリンカーと、
ｃ．第２のリンカーと、
ｄ．（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第３のリンカーと、
ｅ．ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＧＳ）と、
を備える組成物。

【請求項86】

ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備える前記ペプチド（ＭＧＳ）のＣ’末端は、前記第１のリンカーに結合する、請求項８５の組成物。

【請求項87】

前記第１のリンカーは、前記第２のリンカーに結合する、請求項８５又は８６の組成物。

【請求項88】

前記第２のリンカーは、前記第３のリンカーに結合する、請求項８５乃至８７の組成物。

【請求項89】

前記第３のリンカーは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える前記ペプチド（ＭＴＳ）のＣ末端と結合する、請求項８５乃至８８の組成物。

【請求項90】

ａ．反応性基を介して第１のリンカーに結合する、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＧＳ）を備える、請求項８５乃至８９の組成物。

【請求項91】

組成物は、
［式１６］

の構造を備え、
Ｘ’は、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、
Ｘは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項８５乃至９０の組成物。

【請求項92】

組成物は、
［式１７］

の構造を備え、
Ｘ’は、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、
Ｘは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項８５乃至９０の組成物。

【請求項93】

組成物は、
［式１８］

の構造を備え、
Ｘ’は、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、
Ｘは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、
Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である、
請求項８５乃至９０の組成物。

【請求項94】

前記ＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有する、請求項８５乃至９３の組成物。

【請求項95】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基であり、請求項９４の組成物。

【請求項96】

前記ＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有する、請求項８５乃至９３の組成物。

【請求項97】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項９６の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２９２，３７０号及び２０２２年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／４１２，２２０号の利益を主張するものであり、これらの出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

２０２２年１２月２０日に作成された「３７７９４＿００９９Ｐ１．ｘｍｌ」という名称のＳＴ．２６ファイルとして提出され、２０２２年１２月２０日に作成され、１８２５１バイトのサイズを有する配列リストは、連邦規則集第３７編第１．５２条（ｅ）（５）に従い、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

中枢神経系（ＣＮＳ）へのアクセスは、神経治療の開発におけるボトルネックである。これは、中枢神経系（ＣＮＳ）を保護する一連の特殊かつ高度に選択的な細胞障壁である血液脳関門（ＢＢＢ）に起因する。正常な生理学の下において必要ではあるが、ＢＢＢは神経治療薬等の多くの化学物質の脳への侵入を妨げている。その結果、低分子薬品のうち、ＢＢＢを通過するものは５％以下である。さらに、抗体や遺伝子治療等の新しい生物学的療法は、ＢＢＢが原因で中枢神経系から基本的に排除される。ＢＢＢは１００年以上前に発見されたにも関わらず、ＣＮＳへの輸送に関する一般的な解決策は生み出されていない。そのため、多くの中枢神経系疾患には治療の選択肢がない。

【0004】

現在、ＣＮＳへの輸送についていくつかのアプローチが採用されている。アプローチの１つは、ＢＢＢ透過性化合物の使用である。ＢＢＢ透過性化合物を使用することの問題点として、ＢＢＢ透過性化合物は、（多くの場合に高脂溶性の傾向があるため）生体内分布特性が乏しく、オフターゲット効果を有する傾向がある。また、ＢＢＢを透過する低分子は５％未満であるため、ＢＢＢ透過性化合物は少ない。ＢＢＢ透過性薬剤の適応症も限られている。

【0005】

ＣＮＳにアクセスする別のアプローチは、脊髄や脳への直接注射である。この方法は侵襲的であり、周辺組織に構造的損傷を与える危険性があり、感染の危険性も増大する。

【0006】

また、別の方法として、ＢＢＢの破壊も用いられる。この方法は、化合物、細胞、及び病原体のＣＮＳへの大量輸送を可能にする。この方法は、神経細胞の機能障害、及び構造的損傷を引き起こす可能性がある。

【0007】

また、経鼻投与も使用されている。この方法は親油性の低分子薬品に限られている。経鼻投与はＣＮＳにわたる分布が乏しいことが示されている。さらに、経鼻投与は、投与量と患者の間で吸収が変動する。

【0008】

また、受容体介在輸送（トロイの木馬）法も採用されている。この方法は、しばしば単一のカーゴにしか有効でないため、汎用性に欠ける。受容体は複数の組織で発現するため、ＣＮＳへの取り込みが乏しく、毒性を引き起こす。さらに、受容体介在輸送は、一度ＢＢＢを通って輸送されると細胞特異性が無く、ＣＮＳ全体にわたる分布は一定しない。

【0009】

血液脳脊髄液関門を越えてカーゴを輸送するための脈絡叢輸送剤又は代替方法は知られておらず、薬品及び高分子のＣＮＳへの輸送に影響を与えるまたとない開発機会を提供する。従って、本明細書は、ＣＮＳを標的とする組成物及び方法を開示する。

【発明の概要】

【0010】

表１に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドが開示される。

【0011】

本明細書において、ＭＴＳペプチドが開示される。表２に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＴＳペプチドが開示される。

【0012】

いくつかの様態において、リンカーは、
［式１］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの様態において、この構造は、２つのペプチドを繋ぐことができるため、二量体コアと呼ばれる。

【0013】

いくつかの様態において、リンカーは、
［式２］

又は
［式３］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの様態において、この構造は、４つのペプチドを繋ぐことができるため、四量体コアと呼ばれる。四量体コアの別の例は、
［式４］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。
少なくとも１つのＭＴＳペプチドに共役する少なくとも１つのＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備える。

【0014】

２つ以上のＭＴＳペプチドに共役する２つ以上のＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、２つ以上のＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備える。

【0015】

２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備え、２つのＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える。

【0016】

ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドと、（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第１のリンカーと、第２のリンカーと、（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第３のリンカーと、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるＭＴＳペプチドと、を備える組成物が開示される。

【0017】

本明細書に開示される組成物の１つ以上を、それを必要とする対象に投与することを備える、対象のＣＮＳへとカーゴを輸送する方法が開示され、カーゴに共役したペプチドはＣＮＳに入る。

【0018】

本明細書に開示される組成物の１つ以上を、それを必要とする対象に投与することを備える、対象のＣＮＳ障害又は傷害を治療する方法が開示され、カーゴは、ＣＮＳ障害又は傷害の治療薬である

【0019】

本明細書に開示される組成物の１つ以上を、それを必要とする対象に投与することを備える、対象のＣＮＳを画像化する方法が開示され、カーゴは、画像化剤である。

【0020】

開示される方法及び組成物の追加の利点は、以下の説明において部分的に記載される、当該説明から部分的には説明から理解される、又は開示される方法及び組成物の実施により学習され得る。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせにより実現及び達成される。上記の一般的な説明及び下記の詳細な説明は、両方とも例示的及び説明的なものに過ぎず、請求される発明を限定するものではないことが理解される。

【0021】

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示される方法及び組成物のいくつかの実施形態を図示し、明細書と共に、開示される方法及び組成物の原理を説明することに供される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、ＣＨ３ＣＯ－ＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＭＧＳ２＿Ｖ４の構造の例を示す。

【0023】

【図2】図２は、ＣＨ３－ＣＯ－ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２の例を示す。

【0024】

【図3】図３Ａ及び３Ｂは、二量体コア（Ａ）リンカー及び四量体リンカー（Ｂ）を示し、Ｘは特にＭＧＳ又はＭＴＳである任意のペプチドであり、Ｒは色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、炭水化物、その他のペプチド、脂質、又はその他の化学修飾等のカーゴの結合ポイントである。

【0025】

【図4】図４Ａ乃至４Ｃは、ＭＴＳペプチドの構造の例を示し、図４Ａは、ＭＴＳ１＿Ｖ２とも呼ばれるＭＴＳペプチドＡｃ－ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰの例を示し、図４Ｂは、ＭＴＳ２＿Ｖ１とも呼ばれるＭＴＳペプチドＡｃ－ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱの例を示し、図４Ｃは、ＭＴＳ３＿Ｖ１とも呼ばれるＭＴＳペプチドＡｃ－ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳの例を示す。

【0026】

【図5】図５は、脂肪酸で修飾された二量体コアの構造の例を示し、得られたＭＴＳペプチドはＭＴＳ３＿Ｖ２－２と呼ばれ、この修飾は、ＭＴＳ１及びＭＴＳ２についても同様に行うことができる。

【0027】

【図6】図６は、イン・ビボにおけるＣＮＳへのＭＴＳ輸送を解決する実験的なワークフローの概略を示す。

【0028】

【図7】図７Ａ及び７Ｂは、Ｃ１６脂肪酸を備えるＭＴＳ３の脂質化がＣＳＦ（Ａ）及び脳（Ｂ）への輸送を増加させることを示し、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２は、二量体Ａｃ－ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）であり、ＭＴＳ３＿Ｖ２－２は、Ａｃ－ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を有する二量体Ｃ１６脂肪酸修飾コアであり、ｓｃＭＴＳ３＿Ｖ２－２は、スクランブルＭＴＳ３配列（ｓｃＭＴＳ３：ＲＫＳＡＹＮＱＨＳＳＱＭＲＥＥＴ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を有する二量体Ｃ１６脂肪酸修飾コアである。

【0029】

【図8】図８は、脳の切片化及び蛍光イメージングにより証明される、親ＭＴＳ３＿Ｖ１－２と比較して、ＭＴＳ３＿Ｖ２－２の脳蓄積が増加していることを示し、両方のバージョンは、同じ近赤外色素に共役し、循環時間は各パネル内に示され、強度のスケールバーは、比較のために全ての画像において一定に保たれて示される。

【0030】

【図9】図９Ａ乃至９Ｃは、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２がミクログリア細胞に特異的であり、高レベルの細胞取り込みを促進することを示し、図９Ａは、様々な濃度のＭＧＳ２＿Ｖ４－２と共に、３７℃で一時間インキュベートしたＨＭＣ３細胞（ヒトミクログリア細胞株）を示し、ＥＣ５０（半数取り込み）は７．３ｎＭであり、図９Ｂは、一時間におけるＭＧＳ２＿Ｖ４－２の取り込みは、静止又は活性化表現型を示すＨＭＣ３細胞上で決定されたことを示し、両方の細胞状態で、平均≒６００００分子のＭＧＳ２＿Ｖ４－２が内在化し、これは、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２が両方の表現型状態においてミクログリア細胞への輸送に有効であることを示し、図９Ｃは、ＨＭＣ３細胞において、取り込みが中枢神経系の他の細胞よりも顕著に高いことを示し、ミクログリア細胞に対するＭＧＳ２＿Ｖ４－２の特異性を示し、全ての細胞株は、３７℃で一時間、２５ｎＭのＭＧＳ２＿Ｖ４－２と共にインキュベートした。

【0031】

【図10】図１０は、最適化されたＭＧＳ２＿Ｖ４－２がヒト血清中で安定していることを示す。

【0032】

【図11】図１１は、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラの構造を示し、Ｘ＝ＭＧＳ２＿Ｖ４であり、Ｘ’＝ＭＴＳ３＿Ｖ１であり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、その他のペプチド、炭水化物、及び／又は脂質の結合ポイントである。

【0033】

【図12】図１２は、ＭＴＳ－ＭＧＳキメラ（ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２）がミクログリアに内在化している二重標的化の例を示す。

【0034】

【図13】図１３Ａ乃至１３Ｃは、共焦点顕微鏡により証明される、ＭＴＳ－ＭＧＳキメラ剤（ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２）がミクログリアに内在化している二重標的化の一例を示し、シングルＺスライスが示され、スケールバー＝１０μｍである。

【0035】

【図14】図１４Ａ乃至１４Ｃは、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラがＣＮＳのミクログリアを標的化する二重標的化を示し、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２共役体を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（赤）でラベル付けし、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの側尾静脈に注射（０．０９ｎｍｏｌ／ｇ）し、２時間の循環時間の後、動物を安楽死させ、脳を経心筋灌流で固定し、摘出し、凍結保護し、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０で１５μｍ切片に凍結切片化し、画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８００で撮影し、ミクログリアをＩｂａ－１（灰色）で染色し、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）で染色し、図１４Ａ及び１４Ｂは、核周囲の染色から明らかなように、隣接する非ミクログリア細胞ではなく、ミクログリアに内在化したＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２共役体の単一ｚスライス画像を図示し、図１４Ｃは、周囲の非ミクログリア細胞ではなく、ミクログリアに内在化しているＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２共役体の３Ｄレンダリングである（全ての画像の倍率＝６３０倍である）。

【0036】

【図15】図１５は、フローサイトメトリーにより証明される、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラがＣＮＳのミクログリアを標的化する二重標的化を示す。

【0037】

【図16】図１６は、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－４キメラの構造を示し、Ｘ＝ＭＧＳ２＿Ｖ４であり、Ｘ’＝ＭＴＳ３＿Ｖ１であり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、その他のペプチド、炭水化物、及び／又は脂質の結合ポイントである。

【0038】

【図17】図１７は、図１６と比較して、代替結合を使用するＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－４キメラの構造を示し、Ｘ＝ＭＧＳ２＿Ｖ４であり、Ｘ’＝ＭＴＳ３＿Ｖ１又はＭＴＳ２＿Ｖ１であり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、その他のペプチド、炭水化物、及び／又は脂質の結合ポイントである。

【0039】

【図18】図１８Ａ及び１８Ｂは、ミクログリアにおけるＭＧＳ２－ＭＴＳ３キメラによるｓｉＲＮＡ輸送の例を提供し、図１８Ａは、クリックケミストリーを用いて試験ｓｉＲＮＡに共役させたキメラＭＧＳ２＿Ｖ４－４（四量体）－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２を示し、図１８Ｂは、ＭＧＳ２＿Ｖ４－４－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２及びＭＧＳ２＿Ｖ４－４－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ｓｉＲＮＡの取り込みを示す。

【0040】

【図19】図１９は、四量体ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４コアの構造を示し、Ｘ＝ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２ペプチド配列ＣＨ３ＣＯ－ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）であり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、及びその他のペプチドの結合ポイントである。

【0041】

【図20】図２０は、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２ペプチド配列の構造を示し、配列は、ＣＨ３－ＣＯ－ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）である。

【0042】

【図21】図２１Ａ乃至２１Ｃは、四量体ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４が神経細胞に対して特異的であり、高レベルの細胞取り込みを促進することを示し、図２１Ａは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４が２つの神経細胞株に結合するが、ミクログリア又はアストロサイト細胞株には結合しないことを示し、図２１Ｂは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みが濃度依存性であり、高レベルで内在化していることを示し、図２１Ｃは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みが少なくとも２４時間継続し、細胞内濃度≒１μＭに達したことを示す。

【0043】

【図22】図２２は、ＮＯＥ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の細胞受容体がリサイクルされることを示し、クロロキンは、受容体のリサイクルを阻害し、シクロヘキシミドは、新しいタンパク質合成を阻害する。

【0044】

【図23】図２３Ａ乃至２３Ｃは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４が神経細胞内に内在化していることを示し、スケールバーは１０μｍを表す。

【0045】

【図24】図２４Ａ乃至２４Ｃは、髄腔内注射後にＭＧＳ＿ＮＯＥ３－Ｖ２－４がＣＮＳの細胞と関連することを示し、（Ａ）は、全脳細胞対残骸のゲーティング戦略であり、（Ｂ）は、細胞ダブレットを除くためのゲーティング戦略であり、図２４Ｃは、在来動物と比較した、髄腔内注射後に脳細胞に内在化したＭＧＳ＿ＮＯＥ３－Ｖ２－４の蛍光強度を示す。

【0046】

【図25】図２５は、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラの構造を示し、Ｘ＝ｍｇｓ＿ｎｏｅ３＿ｖ２であり、Ｘ’＝ＭＴＳ３＿Ｖ１であり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、及びその他のペプチドの結合ポイントである。

【0047】

【図26】図２６Ａ乃至２６Ｃは、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラがＨＴ２２神経細胞に内在化していることを示し、図２６Ａは、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラ、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４又はＭＴＳ３＿Ｖ１－２をＨＴ２２細胞と共に２００ｎＭで一時間インキュベートし、ペプチド取り込みデータは、定量的フローサイトメトリーアッセイにより取得され、図２６Ｂは、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラのＨＴ２２細胞への取り込みを経時的に評価し、細胞を２００ｎＭでインキュベートし、細胞当たりの平均取り込みを決定し、図２６Ｃは、ＨＴ２２細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けしたＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラと共に、２００ ｎＭ、３７℃で指示された時間インキュベートした。細胞膜のラベル付けにはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８共役小麦胚芽アグルチニンを用い、核の染色にはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用い、ライブセルイメージングを行い、代表的な画像を示す。

【0048】

【図27】図２７は、ＭＴＳ２＿Ｖ１－２がトランスフェリン受容体に結合してＣＮＳにアクセスし、一方でＭＴＳ３＿Ｖ１－２が輸送のために新規でありまだ同定されていない細胞受容体を利用することを示す。

【0049】

【図28】図２８Ａ乃至２８Ｅは、ＰＥＧリンカーを備えるコアアーキテクチャであり、ａ）は、ＰＥＧリンカーを備える単量体コアであり、ｂ）は、ＰＥＧリンカーを備える二量体コアであり、ｃ）は、マレイミドを備える二量体コアでありｄ）は、ＰＥＧリンカーを備える四量体コアであり、ｅ）は、マレイミドを備える四量体コアであり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、その他のペプチド、炭水化物、及び／又は脂質の結合ポイントであり、Ｘ＝任意のＭＧＳ、ＭＴＳ、ＭＧＳ又はＭＴＳと結合したコア、及び／又はリンカーである。

【0050】

【図29】図２９は、マレイミドコア（二量体（図示）又は四量体）と２．２ｅｑのペプチド（任意のコアアーキテクチャ（二量体を図示））との間の結合の例を示し、Ｘ ＝ ＭＧＳ又はＭＴＳであり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、その他のペプチド、炭水化物、及び／又は脂質の結合ポイントである。

【0051】

【図30】図３０は、１．２ｅｑのマレイミド－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯを１ｅｑのペプチド（任意のコアアーキテクチャ（二量体を図示））に添加する概略図を示し、Ｘ＝ＭＧＳ又はＭＴＳである。

【0052】

【図31】図３１は、ＤＢＣＯが結合した１ｅｑのペプチド（任意のコアアーキテクチャ（二量体を図示）と、コアに修飾リジンを備える１．２ｅｑのペプチド（任意のコアアーキテクチャ（二量体を図示））との間のキメラペプチド合成の例を示し、Ｘ＝ＭＧＳ又はＭＴＳであり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、炭水化物、その他のペプチド、及び／又は脂質の結合ポイントである。

【0053】

【図32】図３２は、遊離ＤＢＣＯを備える１．２ｅｑのキメラペプチド（任意のコアアーキテクチャ（四量体／二量体キメラを図示）からなる）と、遊離アジドを備える１ｅｑのｓｉＲＮＡとの間の共役の例を示し、Ｘ＝ＭＧＳ又はＭＴＳであり、Ｒ＝色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、その他のペプチド、炭水化物、及び／又は脂質の結合ポイントである。

【発明を実施するための形態】

【0054】

開示される方法及び組成物は、特定の実施形態及びそこに含まれる実施例の以下の詳細な説明、並びに図面及びその前後の説明を参照してより容易に理解され得る。

【0055】

開示される方法及び組成物は、特に指定されない限り、特定の合成方法、特定の分析技術、又は特定の試薬に限定されず、従って、変化し得ることが理解される。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定する意図はないことが理解される。

【0056】

開示される方法及び組成物に使用可能であり、それらと組み合わせて使用可能であり、それらを調製するために使用可能であり、それらの生成物である材料、組成物、及び成分が開示される。これら及び他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物の各種の個々及び集合的な組み合わせ及び置換の具体的な参照が明示的に開示されないとしても、各々は、本明細書において具体的に考慮及び記載されることが理解される。従って、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラス並びに分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラスが開示され、例として組み合わせ分子Ａ－Ｄが開示される場合、各々が個々に記載されていなくとも、それらは個々及び集合的に考慮される。従って、この例において、各組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、Ｃ－Ｆが具体的に考慮され、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びに例示的な組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されると考えられるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に考慮及び開示される。従って、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、及びＣ－Ｅのサブグループが具体的に考慮され、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びに例示的な組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されると考えられるべきである。この概念は、開示される組成物を生成及び使用する方法における工程を含む本出願の全ての様態に適用されるが、これらに限定されない。従って、実施可能な様々な追加の工程がある場合、これらの追加の各工程は、開示される方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実施可能であること、及びそのような各組み合わせは、具体的に考慮され、開示されたとみなされるべきであることが理解される。

【0057】

見出しは、便宜上提供されるだけであり、いかなる方法においても本発明を限定すると解釈されるものではない。本開示の任意の見出し又は任意の部分に示される実施形態は、本開示の同じ若しくは他の見出し又は他の部分に示される実施形態と組み合わせることができる。

【0058】

Ａ．定義
開示される方法及び組成物は、これらが変化し得るため、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことが理解される。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によりのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解される。

【0059】

なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに示されない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「ＭＧＳペプチド」への参照は、そのようなＭＧＳペプチドの複数を含み、「リンカー」への参照は、当業者に公知の１つ以上のリンカー及びその同等体への参照である。

【0060】

本明細書において使用する場合、「治療」は、疾患又は病状の影響の悪化を予防又は遅延させるために、又は疾患又は病状の影響を部分的に又は完全に逆転させるために、疾患又は病状を有するヒト又は他の哺乳動物（例えば、動物モデル）等の被験体に本発明の組成物を投与することを意味する。いくつかの態様において、疾患又は病状は、ＣＮＳ関連疾患若しくは病状、又はＣＮＳ障害若しくは傷害であってよい。治療は、疾患、障害、及び／若しくは病状の徴候を示さない対象に対して、並びに／または疾患、障害、及び／若しくは病状の初期徴候のみを示す対象に対して、疾患、障害、及び／若しくは病状に関連する病態を発症するリスクを低下させる目的で施されてよい。いくつかの実施形態において、治療は、開示される１つ以上の組成物を対象に輸送することを含む。

【0061】

本明細書において使用する場合、「予防」は、疾患、障害、又は病状を発症しやすくなっている対象が疾患、障害、又は病状を発症する可能性を最小限に抑えることを意味する。

【0062】

本明細書において使用する場合、「対象」の用語は、ヒト等の投与対象を指す。従って、開示される方法の対象は、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、又は両生類等の脊椎動物であってよい。また、「対象」の用語は、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ミバエ等）を含む。一つの態様において、対象は哺乳類である。別の態様において、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢又は性別を示さない。従って、成人、小児、思春期、新生児、及び男性又は女性に関わらず、胎児を含むことが意図される。

【0063】

本明細書において使用する場合、「患者」の用語は、疾患又は障害に罹患している対象を指す。「患者」の用語は、ヒト及び獣医用の対象を含む。開示される方法のいくつかの態様において、「患者」は、投与工程の前に治療の必要性が診断されている。いくつかの態様において、患者及び対象は互換的に使用されてよい。

【0064】

本明細書で使用する場合、「アミノ酸配列」の用語は、アミノ酸残基を表す略語、文字、記号、又は単語のリストを指す。本明細書において使用されるアミノ酸の略称は、アミノ酸の従来の１文字コードであり、以下の：Ａアラニン；Ｃシステイン；Ｄアスパラギン酸；Ｅグルタミン酸；Ｆフェニルアラニン；Ｇグリシン；Ｈヒスチジン；Ｉイソロイシン；Ｋリジン；Ｌロイシン；Ｍメチオニン；Ｎアスパラギン；Ｐプロリン；Ｑグルタミン；Ｒアルギニン；Ｓセリン；Ｔスレオニン；Ｖバリン；Ｗトリプトファン；Ｙチロシンのように表される。

【0065】

本明細書で使用する「ポリペプチド」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、又はタンパク質を指す。ポリペプチドは、連続したアミノ酸から構成される。「ポリペプチド」の用語は、天然に存在する分子又は合成分子を含む。

【0066】

さらに、本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチドイソステア等のペプチド結合又は修飾ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸を指し、２０の遺伝子にコードされたアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含んでよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシング等の天然プロセス、又は当技術分野で公知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されてよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端、又はカルボキシル末端等、ポリペプチドのどこでも起こり得る。同じ種類の修飾が、与えられるポリペプチドのいくつかの部位において、同じ又は様々な程度で存在してよい。また、与えられるポリペプチドは、多くの種類の修飾を有してよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、共有結合架橋又は環化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスフィチジルイノシトールの共有結合、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン又はピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストリル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等の転移ＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸付加を含むが、これらに限定されない（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（第２版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９９３年；及びＢ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８３年、１～１２ページを参照）

【0067】

本明細書で使用する「核酸配列」の語句は、一本鎖又は二本鎖、センス又はアンチセンスのＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのいずれであっても、ワトソン－クリック塩基対形成により相補的核酸にハイブリダイズ可能な天然又は合成のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。また、本発明の核酸配列は、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＢｒｄＵ）、及びヌクレオシド間の非ホスホジエステル結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はチオジエステル結合）を含んでよい。特に、核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0068】

本明細書で使用する場合、組成物の「有効量」は、所望の効果を提供するための組成物の十分な量を意味する。正確な必要量は、対象の種、年齢、及び一般的な状態、治療される疾患（又はその基礎にある遺伝的欠陥）の重症度、使用される具体的な化合物、その投与様式等に応じて、対象ごとに異なる。従って、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、適切な「有効量」は、当業者であれば、日常的な実験のみにより決定できる。

【0069】

本明細書で使用する場合、「選択的に結合する」は、ＭＧＳ又はＭＴＳがその標的（例えば、特定の細胞型）を認識して物理的に相互作用し、他の標的を有意に認識せず、相互作用しないことを意味する。

【0070】

「パーセント（％）相同性」の用語は、本明細書において「パーセント（％）同一性」の用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して野生型配列又は目的の配列により配置された時の核酸又はアミノ酸配列の同一性レベルを指す。例えば、本明細書で使用する場合、８０％相同性は、定義されたアルゴリズムにより決定される８０％の配列同一性と同じことを意味し、従って、与えられる配列の相同体は、与えられた配列にわたって８０％より大きい配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルは、本明細書に記載される任意のＭＴＳ配列等の与えられる配列に対して８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性を含むが、これらに限定されない。２つの配列間の同一性を決定するために使用されてよいコンピュータプログラムの例は、インターネット上で公的に入手可能なＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＴＢＬＡＳＴＮであるが、これらに限定されない。また、１９９０年のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．および１９９７年のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．も参照される。典型的には、配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ及び他の公開データベース内の核酸配列に対して与えられる核酸配列を評価する場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ及び他の公開データベース内のアミノ酸配列に対して、全リーディングフレームで翻訳された核酸配列の検索に好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸは、１１．０のオープンギャップペナルティ、１．０のエクステンデッドギャップペナルティのデフォルトパラメータを用いて実行され、ＢＬＯＳＵＭ－６２ｍａｔｒｉｘを利用する（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、１９９７を参照）。例えば、２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するために選択された配列の好ましいアラインメントは、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７のＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗプログラムを用いて実行され、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンデッドギャップペナルティ、及びＢＬＯＳＵＭ３０類似性マトリックスを含むデフォルトパラメータで操作される。

【0071】

最終的な誘導体、変異体、又はアナログに到達するために、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせが使用されてよい。一般的に、これらの変更は、分子の変化を最小にするために、数個のヌクレオチドに対して行われる。しかしながら、状況によっては、より大きな変更が許容され得る。

【0072】

一般的に、個々の変異配列間のヌクレオチド同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。従って、「変異体配列」は、本発明の親配列又は参照配列（例えば、野生型配列）に対して特定の同一性を有し、親配列の特異性及び／又は活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含むがこれに限定されない生物学的機能を共有する。例えば、「変異体配列」は、本発明の親配列又は参照配列と比較して、１つ、２つ、又は３つ、４つのヌクレオチド塩基の変更を含む配列であり、親配列の生物学的機能、特異性及び／又は活性を共有又は改善する配列であってよい。従って、「変異体配列」は、本発明の親配列に対して特定の同一性を有し、親配列の特異性及び／又は活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含むがこれに限定されない生物学的機能を共有するものであってよい。また、変異体配列は、参照配列（例えば、ＭＴＳ配列）の特異性及び／又は活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を共有してよい。

【0073】

「任意の」又は「任意に」は、その後に記載される事象、状況、又は材料が発生しない又は存在しなくともよく、事象、状況、又は材料が発生する又は存在する事例と、発生しない又は存在しない事例とが記載に含まれることを意味する。

【0074】

本明細書において、範囲は、「約」特定の値のから、及び／又は「約」別の特定の値までと表現され得る。また、このような範囲が表現される場合、文脈において具体的に示さない限り、１つの特定の値から、及び／又は別の特定の値までの範囲が具体的に考慮され、開示されるとみなされる。同様に、値が概算値として表現される場合、先行詞「約」を使用することにより、文脈において具体的に示さない限り、特定の値は、開示されたとみなされるべき具体的に考慮される別の実施形態を形成することが理解される。さらに、各範囲の端点は、文脈において具体的に示さない限り、他の端点と関係する場合、及び他の端点と独立する場合の両方において有意であることが理解される。最後に、明示的に開示される範囲内に含まれる個々の値及び値のサブ範囲の全てが、文脈において具体的に示さない限り、具体的に考慮され、開示されたとみなされるべきであることが理解される。上記は、特定の場合において、これらの実施形態の一部又は全てが明示的に開示されているか否かに関係なく適用される。

【0075】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料が、本方法及び組成物の実施又は試験において使用され得るが、特に有用な方法、装置、及び材料は記載される通りである。本明細書において引用される刊行物及びそれらが引用する材料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明によりかかる開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されない。いかなる文献も先行技術であることを認めるものではない。参考文献の説明は、その著者が主張することを述べたものであり、出願人は、引用文献の正確性及び妥当性に異議を唱える権利を留保する。 本明細書において多くの刊行物が参照されるが、このような参照は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではないことを明確に理解される。

【0076】

本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、「備える」の語句及び「備え」、「備えて」等の語句の変形は、「含むが、これに限定されない」ことを意味し、例えば他の添加剤、成分、整数、又は工程を除外することを意図しない。具体的には、１つ以上の工程又は動作を備えると記載される方法において、各工程は、（当該工程が「からなる」等の限定用語を含まない限り）記載されるものを備えることが特に意図され、各工程は、例えば、当該工程に記載されない他の添加剤、成分、整数、又は工程を除外することを意図しないことを意味する。

【0077】

Ｂ．分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド
本明細書において、ＭＧＳペプチドが開示される。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、特定の細胞腫に選択的に結合してよい。例えば、本明細書において、神経細胞及びミクログリア細胞等のＣＮＳの細胞に選択的に結合し得るＭＧＳペプチドが開示される。

【0078】

本開示は、神経細胞への治療分子の効率的な輸送を可能にする、高い親和性及び特異性を備える神経細胞標的化分子誘導システム（「ＭＧＳ」）ペプチドをスクリーニングするファージディスプレイの使用を開示する。そして、この技術により、神経細胞標的化に使用可能なペプチド配列を迅速かつ効率的にスクリーニングできる。神経細胞標的化ＭＧＳペプチドは、神経細胞に対して高い親和性を示し、神経細胞内に内在化できる。さらに、神経細胞標的化ＭＧＳペプチドは、脳細胞（例えば、アストロサイト、ミクログリア）において選択性を示した。

【0079】

神経細胞標的化ＭＧＳペプチドは、治療目的のために、低分子、核酸、及び抗体と共役してよい。さらに、ペプチド配列の多様な化学的性質により、神経細胞標的化の感度及び特異性を高める修飾と、デュアル又はマルチ標的化のための他のペプチドとの組み合わせ（例えば、血液脳関門通過ペプチドとの組み合わせ）が可能となる。また、これらの神経細胞標的化ペプチドは、高い神経細胞標的化感度及び特異性を誘導する能力を有する。従って、この神経細胞標的化ペプチドは、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経疾患に対する治療のための誘導系としての可能性を有する。

【0080】

表１に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドが開示される。

【表1】

【0081】

表１は単量体ＭＧＳペプチド配列のみを示すが、ＭＧＳペプチドは、二量体、四量体等の多量体として使用されてもよい。いくつかの様態において、ペプチド名の末尾に「－２」がついていると、二量体ＭＧＳペプチドを指す。いくつかの様態において、ペプチド名の末尾に「－４」がついていると、四量体ＭＧＳペプチドを指す。例えば、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ１－２は、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）配列の二量体バージョンを指す。いくつかの様態において、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ１－４は、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）配列の四量体バージョンを指す。いくつかの様態において、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－２は、Ａｃ－ＧＦＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列の二量体バージョンを指す。いくつかの様態において、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４は、Ａｃ－ＧＦＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列の四量体バージョンを指す。従って、ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）についても同様であり、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ１＿Ｖ１－２は二量体であり、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ１＿Ｖ１－４は四量体である。従って、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ１＿Ｖ２、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ２＿Ｖ１、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ２＿Ｖ２、ＭＧＳ２＿Ｖ３、及びＭＧＳ２＿Ｖ４が、表１に示されるペプチドの単量体形態である場合、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ１＿Ｖ２－２、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ２＿Ｖ１－２．ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ１＿Ｖ２－２、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ２＿Ｖ２－２、ＭＧＳ２＿Ｖ３－２、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２はそれぞれ二量体であり、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ１＿Ｖ２－４、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ２＿Ｖ１－４、ＭＧＳ＿Ｎｅｕｒｏｎ２＿Ｖ２－４、ＭＧＳ２＿Ｖ３－４、ＭＧＳ２＿Ｖ４－４は四量体である。

【0082】

いくつかの様態において、１つ以上のＭＧＳペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８の配列のいずれかと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの様態において、１つ以上のＭＧＳペプチドは、ペプチドの活性部分において１００％の同一性を有し、活性部分は、ＣＮＳ細胞を標的化する能力を保持する部分である。従って、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドのいずれかとの少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性は、活性部分の外側で生じる。

【0083】

いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは修飾されてよい。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドの修飾は、ペプチドを最適化すること又はペプチドを安定化させることを含む。いくつかの態様において、ＭＴＳペプチドは最適化されてよい。最適化されたペプチドは、個々の親ペプチド配列に修飾を加えることにより得ることができる。これらの修飾は、血液からＣＳＦへの移動に必要な親配列内の必須アミノ酸を同定するために用いることができる。これらの修飾は、親ペプチドのアミノ末端領域及びＣ末端領域のアラニンスキャニングと短縮との組み合わせにより得ることができる。ＰＥＧは、ＭＧＳペプチドのＣ末端を保護し、ペプチドとＣ末端のシステインを介して結合したカーゴ分子との間にスペーサーを提供し、ＭＧＳペプチドの溶解性を高めることができる。アセチル化（ＣＨ３ＣＯ－）、ｄ（Ｌｅｕ）等のｄ－アミノ酸によるアミノ末端の修飾は、血液中のペプチダーゼによる分解から保護することができる。全てのＭＧＳペプチドに適用できる最適化されたペプチド長は一様ではなく、ペプチドの取り込み及び安定性への影響を確認するために、全ての変更が試験されてよい。従って、いくつかの態様において、ＭＧＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有してよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、プロテアーゼがＮ末端からアミノ酸を短縮することを防ぐものであれば何でもよい。いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＧＳペプチドは、アセチル化によりＮ末端が修飾されてよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基はアセチル基（Ａｃ＝ＣＨ３ＣＯ）である。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、ＰＥＧ、ホルミル、ＣＨ３－（ＣＨ）ｎ－ＣＯ、フルオロフォア、脂肪酸、アルキルアミン、アリール基、炭水化物、スルホンアミド、又はカルバメートであってよいが、これらに限定されない。

【0084】

いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＧＳペプチドは、別のＭＧＳペプチド、カーゴ、及び／又は別のリンカーと化学的に共役してよい。いくつかの様態において、化学的共役体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってよい。従って、いくつかの態様において、本明細書に開示されるＭＧＳペプチドはペギル化されてよい。いくつかの様態において、ＰＥＧユニットの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はそれ以上であってよい。いくつかの態様において、ＰＥＧユニットの数は、１つ以上のＭＧＳペプチドとカーゴとの間の立体的干渉を防ぐように、１つ以上のＭＧＳペプチドをカーゴから離すために十分な長さであってよい。従って、いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＧＳペプチドは、リンカーをさらに備えてよい。例えば、リンカーと化学的共役体は、互換的に用いられてよい。いくつかの様態において、リンカーは、ＭＧＳペプチドのＣ末端上にある。１つの様態において、本明細書に開示されるＭＧＳペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８の配列の１つ以上を備え、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８は、Ｃ末端で上のＰＥＧ又は別のリンカーと化学的に共役してよい。いくつかの様態において、リンカーは、２つ以上のＭＧＳペプチドを連結してよい。いくつかの態様において、リンカーは、カーゴと共役してよい。例として、リンカーを備えるＭＧＳペプチドは、図３に示される構造を備えてよく、ＸはＭＧＳペプチドであり、Ｒは、カーゴ又は別のリンカーと共役し得る反応性基である。

【0085】

いくつかの態様において、リンカーは、本明細書に記載されるいずれでもよい。例えば、リンカーは、ＭＧＳペプチドと別の何かとの共役を可能にし、立体障害を防止する任意の長さであってよい。

【0086】

いくつかの様態において、リンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。

【0087】

いくつかの態様において、ＭＧＳペプチドの構造の例を図１及び図２に示す。図１は、ＭＧＳ２＿Ｖ４ペプチド配列：ＣＨ３ＣＯ－ＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の構造を示す。図２は、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２ペプチド配列：ＣＨ３－ＣＯ－ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の構造を示す。

【0088】

いくつかの態様において、開示されるＭＧＳペプチドは二量体であってよく、２つのＭＧＳペプチドが共役してよい。図３Ａは、二量体ＭＧＳコアの構造の例を示す。いくつかの様態において、２つのＭＧＳペプチドは、同じＭＧＳペプチド又は２つの異なるＭＧＳペプチドであってよい。いくつかの態様において、２つのＭＧＳペプチドは、リンカーを介して共役する。

【0089】

いくつかの態様において、開示されるＭＧＳペプチドは四量体であってよく、４つのＭＧＳペプチドが共役してよい。図３Ｂは、四量体ＭＧＳコアの構造の例を示す。いくつかの様態において、４つのＭＧＳペプチドは、同じＭＧＳペプチド又は異なるＭＧＳペプチドの組み合わせであってよい。いくつかの態様において、４つのＭＧＳペプチドは、リンカーを介して共役する。

【0090】

いくつかの態様において、反応性基は、カルボン酸、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、クロロホルメート、アルデヒド、アルキン、（アセチレン性水素を有さない）アルキン、アミド及びイミド、アミン、ホスフィン、及びピリジン、無水物、アゾ、ジアゾ、アジド、ヒドラジン、及びアジド化合物、カルバメート、エポキシド、エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、エステル、チオリン酸エステル、及びホウ酸エステル、ハロゲン化有機化合物、イソシアネート及びイソチオシアネート、ケトン、オキシム、スルフィド（有機）であってよいが、これらに限定されない。

【0091】

Ｃ．分子輸送システム（ＭＴＳ）ペプチド
血液脳脊髄液関門を通過するカーゴの輸送は、カーゴ（例えば、薬品及び高分子）のＣＮＳへの輸送に影響を与えるまたとない機会を提供する。従って、本明細書は、しばしば分子輸送システム（ＭＴＳ）ペプチドと呼ばれる、ＣＮＳを標的とするためのペプチドである。

【0092】

本明細書は、ＭＴＳペプチドを開示する。表２に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＴＳペプチドが開示される。

【表2】

【0093】

表２は単量体ＭＴＳペプチド配列のみを示すが、ＭＴＳペプチドは、二量体等の多量体として使用されてもよい。いくつかの様態において、ペプチド名の末尾に「－２」がついていると、二量体ＭＴＳペプチドを指す。例えば、ＭＴＳ１＿Ｖ２－２は、Ａｃ－ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）配列の二量体バージョンを指す。いくつかの様態において、ＭＴＳ２＿Ｖ１－２及びＭＴＳ３＿Ｖ１－２は、それぞれ、ＭＴＳ２＿Ｖ１およびＭＴＳ３＿Ｖ１の二量体バージョンである。いくつかの態様において、脂質化等のさらなる最適化が加えられる場合、そのペプチドの次のバージョン又は「Ｖ」を指す。例えば、ＭＴＳ３＿Ｖ２－２は、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２の脂質化バージョンである。

【0094】

いくつかの様態において、１つ以上のＭＴＳペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－１４の配列のいずれかと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの様態において、１つ以上のＭＴＳペプチドは、ペプチドの活性部分において１００％の同一性を有し、活性部分は、血液からＣＳＦへと移動する能力を保持する部分である。従って、いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドのいずれかとの少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性は、活性部分の外側で生じる。

【0095】

いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは修飾されてよい。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドの修飾は、ペプチドを最適化すること又はペプチドを安定化させることを含む。

【0096】

いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、合成及び／又は保存中にＭＴＳペプチドがインタクト（例えば、分解しない）であるように安定化されてよい。いくつかの態様において、ＭＴＳペプチドは、グリシンをアラニンに変えることにより安定化する。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又は１０の２位のグリシンは、アラニンに変えることにより安定化させることができる。

【0097】

いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは最適化されてよい。最適化されたペプチドは、個々の親ペプチド配列に修飾を加えることにより得ることができる。これらの修飾は、血液からＣＳＦへの移動に必要な親配列内の必須アミノ酸を同定するために用いることができる。これらの修飾は、親ペプチドのアミノ末端領域及びＣ末端領域のアラニンスキャニングと短縮との組み合わせにより得ることができる。ＰＥＧ１２は、ＭＴＳペプチドのＣ末端を保護し、ペプチドとＣ末端のシステインを介して結合したカーゴ分子との間にスペーサーを提供し、ＭＴＳペプチドの溶解性を高めることができる。アセチル化（ＣＨ３ＣＯ－）及び／又はｄ（Ｌｅｕ）等のｄ－アミノ酸によるＭＴＳペプチドのＮ末端の修飾は、血液中のペプチダーゼによる分解から保護することができる。全てのＭＴＳペプチドに適用できる最適化されたペプチド長は一様ではなく、ペプチドの取り込み及び安定性への影響を確認するために、全ての変更が試験されてよい。

【0098】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有してよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、プロテアーゼがＮ末端からアミノ酸を短縮することを防ぐものであれば何でもよい。いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、アセチル化によりＮ末端が修飾されてよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基はアセチル基である。従って、いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、アセチル化されてよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、ＰＥＧ、ホルミル、ＣＨ３－（ＣＨ）ｎ－ＣＯ、フルオロフォア、脂肪酸、アルキルアミン、スルホンアミド、アリール基、炭水化物、Ｄ－アミノ酸、又はカルバメートであってよいが、これらに限定されない。

【0099】

いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、別のＭＧＳペプチド、カーゴ、及び／又は別のリンカーと化学的に共役してよい。いくつかの様態において、化学的共役体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってよい。従って、いくつかの態様において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドはペギル化されてよい。いくつかの様態において、ＰＥＧユニットの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はそれ以上であってよい。いくつかの態様において、ＰＥＧユニットの数は、１つ以上のＭＴＳペプチドとカーゴとの間の立体的干渉を防ぐように、１つ以上のＭＧＴペプチドをカーゴから離すために十分な長さであってよい。従って、いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、リンカーをさらに備えてよい。例えば、リンカーと化学的共役体は、互換的に用いられてよい。いくつかの様態において、リンカーは、ＭＴＳペプチドのＣ末端上にある。１つの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－１４の配列の１つ以上を備え、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－１４は、Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端で上のＰＥＧ又は別のリンカーと化学的に共役してよい。いくつかの様態において、リンカーは、２つ以上のＭＴＳペプチドを連結してよい。いくつかの態様において、リンカーは、カーゴと共役してよい。例として、リンカーを備えるＭＴＳペプチドは、図３に示される構造を備えてよく、ＸはＭＴＳペプチドであり、Ｒは、カーゴ又は別のリンカーと共役し得る反応性基である。

【0100】

いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは短縮されてよい。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドは、ＭＴＳペプチドの活性部分を除く全てのアミノ酸を除去するために短縮される。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドの活性部分は、開示される組成物及び方法において用いられてよい。いくつかの態様において、活性部分は、例えばアラニンスキャニング又は短縮研究等の当技術分野で公知の技術を用いて決定できる。ＭＴＳペプチドの活性部分は、血液からＣＳＦに移動する能力を保持する部分である。例えば、ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）は、Ｎ末端を４つのアミノ酸まで短縮できる。いくつかの様態において、アミノ酸配列ＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）は、ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の活性部分である。

【0101】

いくつかの様態において、本明細書に開示されるＭＴＳペプチドの安定化又は最適化された変異体が開示される。

【0102】

図４は、ＭＴＳペプチドの例を示す。図４Ａは、ＭＴＳ１＿Ｖ２とも呼ばれるＭＴＳペプチドＡｃ－ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の例を示す。図４Ｂは、ＭＴＳ１＿Ｖ２とも呼ばれるＭＴＳペプチドＡｃ－ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の例を示す。図４Ｃは、ＭＴＳ３＿Ｖ１とも呼ばれるＭＴＳペプチドＡｃ－ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）の例を示す。

【0103】

いくつかの態様において、開示されるＭＴＳペプチドは二量体であってよく、２つのＭＧＳペプチドが共役してよい。図３Ａは、二量体ＭＴＳコアの構造の例を示す。いくつかの様態において、２つのＭＧＳペプチドは、同じＭＴＳペプチド又は２つの異なるＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの態様において、２つのＭＴＳペプチドは、リンカーを介して共役する。

【0104】

いくつかの態様において、反応性基は、カルボン酸、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、クロロホルメート、アルデヒド、アルキン、（アセチレン性水素を有さない）アルキン、アミド及びイミド、アミン、ホスフィン、及びピリジン、無水物、アゾ、ジアゾ、アジド、ヒドラジン、及びアジド化合物、カルバメート、エポキシド、エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、エステル、チオリン酸エステル、及びホウ酸エステル、ハロゲン化有機化合物、イソシアネート及びイソチオシアネート、ケトン、オキシム、スルフィド（有機）であってよいが、これらに限定されない。

【0105】

Ｄ．リンカー
リンカーが開示される。いくつかの様態において、リンカーは、２つ以上のＭＧＳペプチド、２つ以上のＭＴＳペプチド、２つ以上のリンカー、又はリンカー若しくはペプチドとカーゴとを共役又は結合させることができる。

【0106】

いくつかの様態において、２つ以上のＭＧＳペプチド又は２つ以上のＭＴＳペプチドを共役するリンカーは、（２つのペプチドに結合する場合）二量体コア、又は（４つのペプチドに結合する場合）四量体コアとも呼ばれてよい。図３は、二量体コア及び四量体コアの両方の構造の例を示す。図３において、リンカーはＰＥＧ１２を備えるが、いくつかの様態において、任意の長さのＰＥＧが用いられてよい。例えば、ＰＥＧ１～ＰＥＧ３０のいずれかが用いられてよい。いくつかの様態において、１～５０００の長さのＰＥＧが用いられてよい。いくつかの様態において、二量体コア又は四量体コアのＰＥＧ１２の位置において任意のリンカーが用いられてよい。

【0107】

ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基と、部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基とを備えるリンカーが開示される。

【0108】

いくつかの態様において、リンカーはＰＥＧ５０００までの長さを有する。ＰＥＧリンカーについて、いくつかの様態において、リンカーの長さは、５０００ＰＥＧまで全て単一のＰＥＧであってよい。いくつかの態様において、ペプチドとカーゴとの間のリンカーは、２つのＭＧＳ又はＭＴＳペプチド間のリンカーよりも長くてよい。いくつかの態様において、リンカーは２～４つのＰＥＧリンカーを備える。いくつかの態様において、２つのＰＥＧリンカーを備えるリンカーは、二量体コアと呼ばれてよい。いくつかの態様において、４つのＰＥＧリンカーを備えるリンカーは、四量体コアと呼ばれてよい。

【0109】

いくつかの様態において、リンカーは、少なくとも２つのＰＥＧリンカーと、少なくとも２つのＰＥＧリンカーの間の反応性基とを備える。いくつかの様態において、反応性基は、少なくとも２つのＰＥＧリンカーを接続する。

【0110】

いくつかの様態において、リンカーは、アミノ酸、ペプチド、アルキル基、マレイミド、チオール、ヒドラゾン、又はアミドを含む。いくつかの様態において、アミド酸は、修飾アミノ酸であってよい。例えば、修飾アミノ酸は、官能化リジン、官能化システイン、官能化グルタミン酸、又は官能化アスパラギン酸であってよい。いくつかの様態において、リンカーは、ビオチンを備える。

【0111】

いくつかの様態において、リンカーは、
［式５］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの様態において、この構造は、２つのペプチドを結合させることができるため、二量体コアと呼ばれてよい。

【0112】

いくつかの様態において、リンカーは、脂質部分をさらに備えてよい。例えば、二量体コアからのＲ基の１つは、脂質部部と反応してよい。従って、いくつかの様態において、リンカーは、
［式６］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。

【0113】

いくつかの様態において、リンカーは、
［式７］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの様態において、この構造は、４つのペプチドを結合させることができるため、四量体コアと呼ばれてよい。四量体コアの別の例は、
［式８］

の構造を備え、Ｘはペプチドであり、Ｒは部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、Ｘは、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドであってよい。いくつかの様態において、反応性基は、カルボン酸、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、クロロホルメート、アルデヒド、アルキン、（アセチレン性水素を有さない）アルキン、アミド及びイミド、アミン、ホスフィン、及びピリジン、無水物、アゾ、ジアゾ、アジド、ヒドラジン、及びアジド化合物、カルバメート、エポキシド、エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、チオリン酸エステル、及びホウ酸エステル、ハロゲン化有機化合物、イソシアネート及びイソチオシアネート、ケトン、オキシム、スルフィド（有機）であってよいが、これらに限定されない。

【0114】

いくつかの様態において、部分は、カーゴであってよい。いくつかの様態において、カーゴは、色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、アミノ酸、ペプチド、脂質、抗体、放射性核種、炭水化物、又はナノ粒子であってよいが、これらに限定されない。いくつかの様態において、部分は、リンカーであってよい。従って、いくつかの様態において、リンカーを備えるリンカーが開示される。例えば、リンカーが四量体コアのである場合（すなわち、第１のリンカー）、四量体コアは、第２のリンカーである部分を備えてよい。いくつかの様態において、第２のリンカーは、四量体コアと同じ又は異なる要素を備えてよい。いくつかの様態において、第２のリンカーは、四量体コア（すなわち、第３のリンカー）を二量体コアに共役させる。

【0115】

いくつかの様態において、第１、第２、及び第３のリンカーのいずれかは、アミノ酸、ペプチド、アルキル基、マレイミド、チオール、ヒドラゾン、ジベンゾシクロオクチン、アジド、又はアミドを備えてよい。

【0116】

Ｅ．組成物
開示されるＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、リンカー、及び／又はそれらの組み合わせの１つ以上を備える組成物が開示される。

【0117】

少なくとも１つ以上のＭＴＳペプチドに共役する少なくとも１つのＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を含む。

【0118】

２つ以上のＭＴＳペプチドに共役する２つ以上のＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、ＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を含む。

【0119】

いくつかの様態において、２つ以上のＭＧＳペプチドは、４つのＭＧＳペプチドである。従って、例えば、少なくとも２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を含む。

【0120】

２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を含み；２つのＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を含む。

【0121】

いくつかの様態において、２つ以上のＭＧＳペプチドは、同じＭＧＳペプチドである。例えば、いくつかの様態において、組成物に４つのＭＧＳペプチドがある場合、４つのＭＧＳペプチド全てが同じＭＧＳペプチドである。いくつかの様態において、少なくとも１つのＭＧＳペプチドは、他のＭＧＳペプチドとは異なる。いくつかの様態において、各ＭＧＳペプチドは、他と異なる。

【0122】

いくつかの様態において、２つ以上のＭＴＳペプチドは、同じＭＴＳペプチドである。例えば、いくつかの様態において、開示される組成物に２つのＭＴＳペプチドがあり、ＭＴＳペプチドの両方とも同じＭＴＳペプチドである。いくつかの様態において、開示される組成物に２つのＭＴＳペプチドがあり、２つのＭＴＳペプチドは互いに異なる。

【0123】

いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド及び／又はＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を有する。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、アセチル基である。

【0124】

いくつかの様態において、開示される組成物は、１つ以上のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、開示される組成物は、第１のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第１のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドを別のＭＧＳペプチドに結合する、又はＭＧＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＧＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＧＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＧＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0125】

いくつかの様態において、組成物は、第２のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第１のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第３のリンカーに結合してよい。従って、いくつかの様態において、組成物は、第３のリンカーをさらに備える。

【0126】

いくつかの様態において、第３のリンカーは、第２のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドを別のＭＴＳペプチドに結合する、又はＭＴＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＴＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＴＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＴＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0127】

いくつかの様態において、第１のリンカー、及び／又は第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチン、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの様態において、第１、第２、及び／又は第３のリンカーは、ＰＥＧリンカーを含む。いくつかの様態において、任意の長さのＰＥＧリンカーが用いられてよい。例えば、ＰＥＧ１～ＰＥＧ３０のいずれかが用いられてよい。いくつかの様態において、１～５０００の長さのＰＥＧが用いられてよい。

【0128】

いくつかの様態において、組成物は、カーゴをさらに備える。いくつかの様態において、カーゴは、色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、アミノ酸、ペプチド、脂質、小分子、抗体、放射性核種、炭水化物、又はナノ粒子であってよいが、これらに限定されない。例えば、いくつかの様態において、カーゴは、画像化剤、抗体、及び／又はｓｉＲＮＡである。いくつかの様態において、カーゴは、第１のリンカー、第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーに結合する。従って、いくつかの様態において、開示される組成物は、１つ以上のカーゴを備えてよい。いくつかの様態において、１つ以上のリンカーは、カーゴを備えてよい。

【0129】

いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、記載される任意のＭＴＳペプチドである。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、中枢神経系を標的化する。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－１４のいずれかのアミノ酸配列を備える。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、Ｎ末端保護基を備えてよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、プロテアーゼがＮ末端からアミノ酸を短縮することを防ぐものであれば何でもよい。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、アセチル基である。いくつかの様態において、Ｎ末端保護基は、ＰＥＧ、ホルミル、ＣＨ３－（ＣＨ）ｎ－ＣＯ、アリール基、炭水化物、Ｄ－アミノ酸、フルオロフォア、脂肪酸、アルキルアミン、スルホンアミド、又はカルバメートであってよいが、これらに限定されない。

【0130】

いくつかの様態において、組成物は、２つのＭＴＳペプチドを備える。いくつかの様態において、２つのＭＴＳペプチドは、記載される二量体コアを介して結合される。

【0131】

ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドと、（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第１のリンカーと、第２のリンカーと、（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第３のリンカーと、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるＭＴＳペプチドと、を備える組成物が開示される。

【0132】

いくつかの様態において、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドのＣ末端は、第１のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第１のリンカーは、第２のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第３のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＴＳ）のＣ末端に結合する。

【0133】

従って、いくつかの様態において、反応性基を介して第１のリンカーに結合する、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドを備える組成物が開示され、第１のリンカーは、第２のリンカーに結合し、第２のリンカーは、第３のリンカーに結合し、第３のリンカーは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＴＳ）のＣ末端に結合する。

【0134】

いくつかの様態において、組成物は、
［式９］

の構造を備え、Ｘは、ＭＧＳペプチドであり、Ｘ’は、ＭＴＳペプチドであり、Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、表１に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備える。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、表２に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備える。

【0135】

いくつかの様態において、組成物は、
［式１０］

の構造を備え、Ｘ’は、ＭＴＳペプチドであり、Ｘは、ＭＧＳペプチドであり、Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、表１に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備える。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、表２に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備える。

【0136】

いくつかの様態において、組成物は、
［式１１］

の構造を備え、Ｘ’は、ＭＴＳペプチドであり、Ｘは、ＭＧＳペプチドであり、Ｒは、部分と化学的に反応し得る反応性基である。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、表１に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備える。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、表２に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備える。

【0137】

いくつかの様態において、反応性基は、カルボン酸、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、クロロホルメート、アルデヒド、アルキン、（アセチレン性水素を有さない）アルキン、アミド及びイミド、アミン、ホスフィン、及びピリジン、無水物、アゾ、ジアゾ、アジド、ヒドラジン、及びアジド化合物、カルバメート、エポキシド、エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、エステル、チオリン酸エステル、及びホウ酸エステル、ハロゲン化有機化合物、イソシアネート及びイソチオシアネート、ケトン、オキシム、スルフィド（有機）であってよいが、これらに限定されない。

【0138】

医薬組成物が開示される。従って、開示される組成物は、薬学的に許容される担体をさらに備える。表１に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＧＳペプチドと、薬学的に許容される担体とを備える組成物が開示される。表２に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１４の配列のいずれかのアミノ酸配列を備えるＭＴＳペプチドと、薬学的に許容される担体とを備える組成物が開示される。２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドと、薬学的に許容される担体とを備える組成物が開示され、４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備え、２つのＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える。

【0139】

１．組成物の輸送
本明細書に記載される方法において、本明細書に開示されるペプチド又は組成物の輸送（又は投与）は、様々なメカニズムを介してよい。上記において定義されるように、本明細書は、薬学的に許容される担体等の担体も含み得る組成物を作成するために使用され得る、本明細書に記載される任意の１つ以上のペプチドを備える組成物であってよい。例えば、本明細書に開示されるペプチドと、薬学的に許容される担体とを備える医薬組成物が開示される。

【0140】

例えば、本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体を備えてよい。「薬学的に許容される」は、当業者に周知であるように、活性成分のいかなる分解をも最小限に抑え、対象における副作用を最小限に抑えるように選択されるであろう材料又は担体を意味する。担体の例は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水、又は多胞リポソームを含む。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチド又はＰＣ：ペプチドが、本発明における担体として使用されてよい。他の好適な薬学的に許容される担体及びその製剤は、Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、１９９５年に記載される。典型的には、製剤を等張にするために、製剤中に適切な量の薬学的に許容される塩が使用される。薬学的に許容される担体の他の例は、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液であるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５～約８、又は約７～約７．５であってよい。さらなる担体は、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス等の徐放性製剤であり、当該マトリックスは、例えば、フィルム、（血管形成手術中に血管にインプラントされる）ステント、リポソーム、又は微粒子の形態である。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて特定の担体がより好ましくてよいことが、当業者にとって明らかである。最も典型的には、これらは、滅菌水、生理食塩水、生理的ｐＨの緩衝液等の溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体である。

【0141】

また、医薬組成物は、本開示のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図された活性が損なわれない限り、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤等を含んでよい。また、医薬組成物は、（本開示の組成物に加えて）抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等の１つ以上の有効成分を含んでよい。医薬組成物は、局所的治療が所望されるか全身的治療が所望されるか、そして治療される部位に応じて、多くの方法で投与されてよい。

【0142】

非経口投与の製剤の調製は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、生理食塩水及びバッファ媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤、又は懸濁液である。非経口用ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油を含む。静脈注射用ビヒクルは、体液及び栄養補給剤、（リンゲルブドウ糖をベースとするもの等の）電解質補給剤などである。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等の保存剤及び他の添加剤も存在してよい。

【0143】

光学投与用の製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、散剤、液剤、粉剤を含んでよい。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性ベース、増粘剤等が必要である又は望ましい。

【0144】

経口投与用の組成物は、粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性媒体中の懸濁液若しくは溶液、カプセル剤、分包剤、又は錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい。組成物の一部は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸等の無機酸、及びギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸等の有機酸との反応により形成される、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、モノ－、ジ－、トリアルキル、アリールアミン、置換エタノールアミン等の有機塩基との反応により形成される、薬学的に許容される酸又は塩基付加塩として投与されてよい。

【0145】

開示される輸送技術は、開示される組成物だけではなく、開示される核酸配列及びベクターのために使用されてよい。

【0146】

Ｆ．カーゴの輸送方法
本明細書に開示される組成物の１つ以上を、それを必要とする対象に投与することを備える、対象のＣＮＳへとカーゴを輸送する方法であり、カーゴに結合したペプチドはＣＮＳに入る。

【0147】

いくつかの様態において、カーゴは、色素、画像化剤、治療薬、タンパク質、核酸、アミノ酸、ペプチド、脂質、小分子、抗体、放射性核種、炭水化物、又はナノ粒子であってよいが、これらに限定されない。例えば、いくつかの様態において、カーゴは、画像化剤、抗体、及び／又はｓｉＲＮＡである。

【0148】

いくつかの様態において、組成物、従ってカーゴは、脈絡叢に入る。いくつかの様態において、組成物、従ってカーゴは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に入る。いくつかの様態において、ＣＳＦは、組成物、従ってカーゴをＣＮＳ全体に輸送する。

【0149】

いくつかの様態において、ＭＴＳペプチドは、組成物が血液脳関門を超えてＣＮＳに入ることを可能にする。いくつかの様態において、ＭＧＳペプチドは、カーゴを、特定のＣＮＳ細胞に標的化する。いくつかの様態において、ＣＮＳ細胞は、神経細胞又はミクログリアである。

【0150】

いくつかの様態において、カーゴは、ＣＮＳ内部で機能活性を保持する。

【0151】

いくつかの様態において、投与は、静脈内投与又は髄腔内投与である。いくつかの態様において、本明細書に記載される任意の輸送方法が使用されてよい。

【0152】

いくつかの様態において、組成物は、２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドを備える組成物であり、４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備え、２つのＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える。

【0153】

本明細書に記載されるように、組成物は、１つ以上のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、開示される組成物は、第１のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第１のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含んでよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドを別のＭＧＳペプチドに結合する、又はＭＧＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＧＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＧＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＧＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0154】

いくつかの様態において、組成物は、第２のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第１のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第３のリンカーにさらに結合する。従って、いくつかの様態において、組成物は、第３のリンカーをさらに備える。

【0155】

いくつかの様態において、第３のリンカーは、第２のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ペプチドリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含んでよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドを別のＭＴＳペプチドに結合する、又はＭＴＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＴＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＴＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＴＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0156】

いくつかの様態において、第１のリンカー、及び／又は第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの様態において、第１、第２、及び／又は第３のリンカーは、ＰＥＧリンカーを含む。いくつかの様態において、任意の長さのリンカーが用いられてよい。例えば、ＰＥＧ１～ＰＥＧ３０のいずれかが用いられてよい。いくつかの様態において、１～５０００の長さのＰＥＧが用いられてよい。

【0157】

いくつかの様態において、カーゴは、第１のリンカー、第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーに結合する。従って、いくつかの様態において、開示される組成物は、１つ以上のカーゴを備えてよい。いくつかの様態において、１つ以上のリンカーは、カーゴを備えてよい。

【0158】

いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、又は両方は、Ｎ末端が保護される。例えば、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、又は両方は、Ｎ末端がアセチル化される。従って、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドは、表１及び／又は表２中のいずれかであってよい。

【0159】

Ｇ．治療方法
本明細書に開示される組成物の１つ以上を、それを必要とする対象に投与することを備える、対象のＣＮＳ障害又は傷害を治療する方法が開示され、カーゴは、ＣＮＳ障害又は傷害の治療薬である。

【0160】

いくつかの様態において、ＣＮＳ障害又は傷害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、膠芽腫、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、又は外傷性脳損傷である。従って、いくつかの態様において、ＣＮＳ障害治療薬は、抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異性）、遺伝子治療薬、化合物、核酸配列、小分子、リボ核タンパク質、又はペプチド（又はタンパク質）である。いくつかの態様において、ＣＮＳ障害又は傷害治療薬の具体例は、Ｎ－メチルＤ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）拮抗薬、化学療法薬、グルタミン酸拮抗薬、又は免疫調節薬（例えば、免疫抑制薬又は免疫活性化薬）であってよいが、これらに限定されない。いくつかの態様において、遺伝子治療は、治療分子をコードする遺伝物質の輸送を可能にする。いくつかの態様において、遺伝子治療は、疾患の治療又は治癒を目的として、遺伝子配列を調節、修復、置換、付加、又は欠失させるために対象に投与される、組換え核酸を含む生物学的医薬品の投与を含む。いくつかの態様において、核酸は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）等の小分子ＲＮＡであってよいが、これらに限定されない。いくつかの態様において、治療薬は、Ａβペプチド／プラーク（Ｄｏｎａｎｅｍａｂ、Ｌｅｃａｎｅｍａｂなど）、タウもつれ、βセクレターゼ、γセクレターゼ、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）を標的とする抗体であってよい。いくつかの態様において、Ａβペプチド、タウもつれ、βセクレターゼ、γセクレターゼ、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）、ＣＤ２２の発現を低下させる核酸治療を用いられてよい

【0161】

いくつかの様態において、組成物は、２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドを備える組成物であり、４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備え、２つのＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える。

【0162】

本明細書に記載されるように、組成物は、１つ以上のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、開示される組成物は、第１のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第１のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含んでよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドを別のＭＧＳペプチドに結合する、又はＭＧＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＧＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＧＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＧＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0163】

いくつかの様態において、組成物は、第２のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第１のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第３のリンカーにさらに結合する。従って、いくつかの様態において、組成物は、第３のリンカーをさらに備える。

【0164】

いくつかの様態において、第３のリンカーは、第２のリンカーに結合する。

【0165】

いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含んでよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドを別のＭＴＳペプチドに結合する、又はＭＴＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＴＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＴＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＴＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0166】

いくつかの様態において、第１のリンカー、及び／又は第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの様態において、第１、第２、及び／又は第３のリンカーは、ＰＥＧリンカーを含む。いくつかの様態において、任意の長さのリンカーが用いられてよい。例えば、ＰＥＧ１～ＰＥＧ３０のいずれかが用いられてよい。いくつかの様態において、１～５０００の長さのＰＥＧが用いられてよい。

【0167】

いくつかの様態において、カーゴは、第１のリンカー、第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーに結合する。従って、いくつかの様態において、開示される組成物は、１つ以上のカーゴを備えてよい。いくつかの様態において、１つ以上のリンカーは、カーゴを備えてよい。

【0168】

いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、又は両方は、Ｎ末端が保護される。例えば、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、又は両方は、Ｎ末端がアセチル化される。従って、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドは、表１及び／又は表２中のいずれかであってよい。

【0169】

Ｈ．画像化方法
本明細書に開示される組成物の１つ以上を、それを必要とする対象に投与することを備える、対象のＣＮＳを画像化する方法が開示され、カーゴは、画像化剤である。いくつかの様態において、画像化剤は、色素、放射性核種、造影剤、蛍光タンパク質又は蛍光分子であってよいが、これらに限定されない。いくつかの様態において、画像化剤は、タンパク質。ペプチド、又は核酸に結合する。

【0170】

いくつかの様態において、組成物は、２つのＭＴＳペプチドに共役する４つのＭＧＳペプチドを備える組成物であり、４つのＭＧＳペプチドは、ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；又はＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列を備え、２つのＭＴＳペプチドは、ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備える。

【0171】

本明細書に記載されるように、組成物は、１つ以上のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、開示される組成物は、第１のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第１のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含んでよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、ＭＧＳペプチドを別のＭＧＳペプチドに結合する、又はＭＧＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＧＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第１のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＧＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＧＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。

【0172】

いくつかの様態において、組成物は、第２のリンカーをさらに備えてよい。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第１のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第２のリンカーは、第３のリンカーにさらに結合する。従って、いくつかの様態において、組成物は、第３のリンカーをさらに備える。

【0173】

いくつかの様態において、第３のリンカーは、第２のリンカーに結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドのＣ末端に結合する。いくつかの様態において、第３のリンカーは、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、アミドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含んでよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、ＭＴＳペプチドを別のＭＴＳペプチドに結合する、又はＭＴＳペプチドをカーゴに結合する、又はＭＴＳペプチドを別のリンカーに結合してよい。いくつかの様態において、第３のリンカーは、図３に示される構造の１つ以上を備えてよい。例えば、各ＭＴＳペプチドは、（任意の長さの）ＰＥＧ等のリンカーに結合してよい。次に、各ＭＴＳペプチド－ＰＥＧは、本明細書に記載の二量体又は四量体コアを作成可能な１つ以上のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はリンカーを用いて結合してよい。例えば、いくつかの様態において、ＰＥＧは、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成中に、脱保護されたリジン（側鎖のε－アミノ基及びアミノ末端の両方）に付加されてよい。これにより、ＰＥＧを結合させる２つの遊離アミノ基が得られ、二量体が得られる。四量体の場合、完全に脱保護されたリジンを、ペプチド合成中に別のリジンと結合させてよい。この結果、ＰＥＧを結合させるために用いることができる遊離アミノ基を４つ得ることができる。

【0174】

いくつかの様態において、第１のリンカー、及び／又は第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの様態において、第１、第２、及び／又は第３のリンカーは、ＰＥＧリンカーを含む。いくつかの様態において、任意の長さのリンカーが用いられてよい。例えば、ＰＥＧ１～ＰＥＧ３０のいずれかが用いられてよい。いくつかの様態において、１～５０００の長さのＰＥＧが用いられてよい。

【0175】

いくつかの様態において、カーゴは、第１のリンカー、第２のリンカー、及び／又は第３のリンカーに結合する。従って、いくつかの様態において、開示される組成物は、１つ以上のカーゴを備えてよい。いくつかの様態において、１つ以上のリンカーは、カーゴを備えてよい。

【0176】

いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、又は両方は、Ｎ末端が保護される。例えば、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、又は両方は、Ｎ末端がアセチル化される。従って、いくつかの様態において、ＭＧＳペプチド又はＭＴＳペプチドは、表１及び／又は表２中のいずれかであってよい。

【0177】

Ｉ．用量
開示される組成物又はペプチドの１つ以上を単回用量で、それを必要とする対象に投与することを備える投与レジメンが開示され、単回用量は、ＣＮＳに入り、特定のＣＮＳ細胞型を標的化するために有効な量を含む。

【0178】

開示される組成物又はペプチドの１つ以上を少なくとも２回用量で、それを必要とする対象に投与することを備える投与レジメンが開示され、各用量は、同じ濃度である。いくつかの様態において、最初の用量の後の各用量は減らされてよい。いくつかの態様において、最初の用量の後の各用量は増やされてよい。

【0179】

いくつかの様態において、単回用量は、連続投与であってよい。いくつかの様態において、連続投与は、数時間、数日、数週間、又は数ヶ月であってよい。いくつかの様態において、２回以上の用量があってよい。いくつかの様態において、２回以上の用量は、数日、数週間、または数ヶ月間隔で投与されてよい。

【0180】

Ｊ．キット
上記の材料及び他の材料は、開示される方法を実行するため、又はその実行を補助するために有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで共にパッケージングすることができる。与えられるキットのキット構成要素が、開示される方法において共に使用するように設計及び適合されていれば有用である。例えば、開示されるＭＧＳペプチド、ＭＴＳペプチド、リンカー、又はそれらの組み合わせの１つ以上を備えるキットが開示される。例えば、開示される組成物のいずれかを備えるキットが開示される。

【0181】

Ａ．実施例１：二重標的化
図５は、脂肪酸で修飾された二量体コアの構造の例を示す。ＸがＣＨ３Ｏ－ＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）である場合、構造はＭＴＳ３＿Ｖ２－２と呼ばれる。ＸがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＭＴＳ１）、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（アセチル化ＭＴＳ１）、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＭＴＳ２）、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（アセチル化ＭＴＳ２）の場合でも、同様の構造が得られる。

【0182】

図６は、ＣＮＳへの開示される組成物の輸送を評価するために用いられる一般的な実験的フローの概略図を示す。

【0183】

Ｃ１６脂肪酸によるＭＴＳ３の脂質化は、ＣＳＦ及び脳への輸送を増加させる（図７）。近赤外色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０でラベル付けしたＭＴＳ変異体を、１μｇＭＴＳ／ｋｇラット体重でＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの尾静脈に注射した。指示された時間に、大槽の毛細管穿刺によりＣＳＦを分離した。図７Ａは、指示されたイン・ビボ循環時間後のＣＳＦを分離したＭＴＳ３変異体の濃度を示す。Ｃ１６脂肪酸修飾を含むＭＴＳ３＿Ｖ２は、非脂質化ＭＴＳ３＿Ｖ１－２よりも２．２～７．６倍高いＣＳＦ濃度を示した。脂肪酸がＣＮＳへの輸送を促進していないことを確認するために、ＭＴＳ３のアミノ酸組成を含むが配列がスクランブルされた対照ペプチドｓｃＭＴＳ３＿Ｖ２－２を脂質化した。ＭＴＳ３＿Ｖ２－２の取り込みはｓｃＭＴＳ３＿Ｖ２－２より９～２３倍高く、輸送が脂肪酸修飾ではなくＭＴＳ３配列に依存していることを示した。図７Ｂは、指示された循環時間後の脳ホモジネート中の同じＭＴＳ３変異体の濃度を示す。ＭＴＳ３＿Ｖ２－２の脳実質への輸送は、非修飾ＭＴＳ３＿Ｖ１－２より１０～１２倍高く、これはスクランブル対照であるｓｃＭＴＳ３＿Ｖ２－２より１７～３１倍高い。ＭＴＳ３＿Ｖ１－２の濃度は２４時間で検出限界未満となった。脳組織における濃度は、ＣＳＦにおける濃度より高く、脳全体に拡散し、洗い流しが遅いことを示した。

【0184】

脳蓄積は、脳の切片化及び蛍光画像化により証明されるように、親ＭＴＳ３＿Ｖ１－２と比較してＭＴＳ３＿Ｖ２－２では向上した（図８）。冠状スライスは、１ｍｍであり、前方（左上）から後方（右下）に配置された。脳ホモジネートからのデータと一致して、ＭＴＳ３＿Ｖ２－２（Ｃ１６脂肪酸修飾）は、全ての時点においてＭＴＳ３＿Ｖ１－２と比較して脳の取り込みが増加した。蛍光シグナルは脳全体に見られ、実質内の拡散を示した。

【0185】

図３は、下記に示されるミクログリア標的化実験に用いられるコア構造の例を示す。図３Ａは、二量体コアを示し、図３Ｂは、四量体コアを示す。示されるコア構造は、Ｘとして表現されるＭＧＳペプチドを備えた。下記の実験において用いられた特定のＭＧＳペプチドは、ＭＧＳ２＿Ｖ４、ＣＨ３ＣＯ－ＹＡＡＷＰＡＳＧＡＷＴであった。具体的には、四量体コアＭＧＳ２＿Ｖ４－４が用いられた。
ＣＨ３Ｏ－ＳＳ

【0186】

ＭＧＳ２＿Ｖ４－２は、ミクログリア細胞に特異的であり、高レベルの細胞取り込みを促進した（図９）。図９Ａは、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２がミクログリア細胞に高い親和性で結合し、内在化したことを示し、図９Ｂは、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２が静止及び活性化ミクログリア細胞に結合し、内在化したことを示す。ＭＧＳ２＿Ｖ４－２は、神経細胞、シュワン細胞、及びアストロサイトと比較して、ミクログリア細胞に特異的であった（図９Ｃ）。

【0187】

図１０は、最適化されたＭＧＳ２＿Ｖ４－２がヒト血清中で安定であることを示す。Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けしたＭＧＳ２＿Ｖ４－２を、ヒト血清中、３７℃でインキュベートした。指示された時間に、アリコートを除去し、血清タンパク質を沈殿させ、得られた上清を６５０ｎｍの吸光度をモニタリングする逆相ＨＰＬＣで分析した。各時点におけるクロマトグラムを示す。不活性ペプチドの保持時間は、１１．８６４であった。保持時間１０．００５分の新種が１時間で観察され、時間経過とともに増加し続けた。ピークを積分して、不活性ペプチドの割合及び観察された分解生成物の量を決定した。２４時間の後、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２の７５％以上が不活性のままであった。１０．００５分の保持時間で生じたペプチド生成物に対してエレクトロスプレー質量分析を行った。この新種の質量は、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２の両分岐上の３つのアミノ酸の損失に対応した。

【0188】

図１２は、ＣＮＳの特定の細胞種に対する二重標的化の一般的概念を示す。図１２のグラフは、ＨＭＣ３細胞上で決定されたＭＧＳ２＿Ｖ４－２、ＭＧＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラ、及びＭＴＳ３＿Ｖ１－２の取り込みの例を示す。細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けされた各ペプチド構築物の指示された濃度でインキュベートした。３７℃で１時間インキュベートした後、定量的フローサイトメトリーにより取り込みを測定した。ＭＧＳ２＿Ｖ４－２及びＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラは、同じＥＣ５０及び細胞内取り込み量を示し、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２の結合はＭＧＳ２＿Ｖ４－２の細胞有効性に影響を与えないことを示した。予想されたように、試験したどの濃度においても、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２は有意な細胞内取り込みを示さなかった。従って、取り込みは、ＭＴＳではなく、ＭＧＳにより起こった。

【0189】

図１３は、共焦点顕微鏡により証明される、ＭＴＳ－ＭＧＳキメラ剤（ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２）がミクログリアに内在化している二重標的化を示す。ＨＭＣ３細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けした２５ｎＭのＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２共役体と共にインキュベートした。１時間後、ペプチド溶液を除去した。細胞膜のラベル付けにはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８共役小麦胚芽アグルチニンを用い、核の染色にはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いた。ライブセル画像化はＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００で行った。代表的なシングルＺスライス画像が示される。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素のみ（図１３Ａ）又はＭＧＳ２ペプチドのスクランブル配列バージョンＳＡＷＡＧＡＹＰＷＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）で作製したキメラ構築物（図１３Ｂ）により治療した細胞は、細胞への取り込みを示すＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色を示さなかった。対照的に、細胞周囲の点状染色（図１３Ｃ）により証明されるように、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２は、ＨＭＣ３細胞に内在化された。これは、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２はＨＭＣ３細胞への細胞内在化を仲介したことを示し、取り込みを定量化したフローサイトメトリーアッセイと一致していた。

【0190】

図１４は、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラがＣＮＳのミクログリアを標的化する二重標的化を示す。染色はミクログリアにおいてのみ観察された。ミクログリアの染色は、ＭＴＳのみ、ＭＧＳのみ、又は共役体のスクランブル対照バージョンでは観察されなかった。

【0191】

図１５は、フローサイトメトリーにより証明される、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２キメラがＣＮＳのミクログリアを標的化する二重標的化を示す。ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２共役体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（赤）でラベル付けし、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの側尾静脈に注射した（０．０９ｎｍｏｌ／ｇ）。２時間の循環時間の後、動物を安楽死させ、脳組織を採取した。ミルテニーバイオテク社のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて脳を解離した。脳細胞全体をＣＤ１１ｂ／ｃ（ミクログリア）Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ミルテニーバイオテク）と共にインキュベートし、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを用いて脳の残りの部分から分離した。その後、ミクログリアをＩｂａ１ミクログリアマーカーにより染色した。フローサイトメトリーデータをＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで収集した。ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－２共役体で治療した動物は、ミクログリア細胞（ＩＢＡ１陽性）では陽性シフトを示したが、他のＣＮＳ細胞（ＩＢＡ１陰性；図１５）では示さなかった。

【0192】

図１６は、図１８に示されるｓｉＲＮＡ輸送実験に使用されたＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－４キメラの構造を示す。図１７は、代替結合を用いるＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ２＿Ｖ４－４キメラの類似構造を示す。

【0193】

ミクログリアにおけるＭＧＳ２－ＭＴＳ３キメラを用いたｓｉＲＮＡデリバリーの例を図１８に示す。図１８Ａは、キメラＭＧＳ２＿Ｖ４－４（四量体）－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２が、クリックケミストリーを用いて試験ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた構造を示す。驚くべきことに、ＭＧＳ２＿Ｖ４－２（二量体）－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２にｓｉＲＮＡを結合させると、ＨＭＣ３細胞への結合が失われた。しかしながら、この多機能キメラのターゲティングペプチドとして４量体のＭＧＳ２＿Ｖ４－４を用いると、結合は回復した（パネルＡに示す）。ＭＧＳ２＿Ｖ４－４－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２およびＭＧＳ２＿Ｖ４－４－ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ｓｉＲＮＡの取り込みをパネルＢに示す。

【0194】

図１９は、神経細胞標的化を示す図２０乃至２４に使用される四量体ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の構造を示す。

【0195】

図２０は、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２ペプチド配列の構造を示す。配列は、ＣＨ３－ＣＯ－ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩであった。ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ１は、同じ配列であるが、Ｎ末端保護基を含有しなかった。従って、図２０の構造は、図１９のＸが置換された。

【0196】

図２１は、神経細胞に対して特異的であり、高レベルの細胞取り込みを促進する四量体ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４を示す。単量体及び二量体ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４は、結合しない。作用するためには、四量体コアでなければならない。図２１Ａは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ１－４の取り込みを示し、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４は、指示された細胞株と共に、２０ｎＭで１時間インキュベートされた。細胞当たりの内在化されたペプチドの分子の数は、定量的フローサイトメトリーアッセイにより決定された。取り込みは、ＣＴＸ ＴＮＡ２（ラット前頭皮質からのアストロサイト）、ＨＭＣ３（ヒトミクログリア細胞株）、Ｈ１２９９及びＨ６４０（共にヒト非小細胞肺癌細胞）よりも、ＨＴ２２（マウスの海馬神経細胞）及びＧＴ１／７（マウスの視床下部神経細胞）の２つの神経細胞株において顕著に高かった。ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ１－４及びＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４は、アストロサイトよりも神経に対して５～６倍の特異性、ミクログリアと比較して３倍の特異性を示した。図２１Ｂは、ＨＴ２２へのＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みが、濃度の上昇ともに増加したことを示す。また、取り込みは、単量体（ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－１）及び二量体（ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－２）バージョンについても評価され、ＨＴ２２細胞では取り込みが見られず、神経への結合及び取り込みを誘発するためには、四量体コアでなければならないことが示された。図２１Ｃは、のＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みが経時的に増加したことを示す。ＨＴ２２細胞を、２００ｎＭのＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４と共に、３７℃で指示された時間インキュベートした。取り込みをフローサイトメトリーアッセイにより測定した。

【0197】

ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の細胞受容体をリサイクルした（図２２）。ＨＴ－２２細胞を、１００μＭのクロロキン又は５０μＭのシクロヘキシミドの存在下で、１００ｎＭのＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４を含む培養液と共に、指示された時間インキュベートした。細胞の取り込みをフローサイトメトリーにより解析した。新たなタンパク質合成を阻害するシクロヘキシミドは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みに影響を与えず、新たなタンパク質合成は継続的な取り込みに必要ないことが示された。しかしまがら、エンドソームの酸性化及び輸送を阻害するクロロキンは、１時間のインキュベーションから取り込みを大きく減少させ、２４時間までＭＧＳの内在化を抑制し続けた。ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の継続的な取り込みには、エンドソームの酸性化が必要であった。ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みは、時間とともに継続する。総合すると、これらのデータは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の細胞内受容体は、内在化し、その後、細胞表面に戻り、そこでより多くのＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の内在化を繰り返した。

【0198】

ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４は、ニューロン細胞に内在化された（図２３）。ＨＴ２２細胞を、２００ｎＭのＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４－ストレプトアビジン－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役体と共に、３７℃で指示された時間インキュベートした。細胞膜のラベル付けにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８共役小麦胚芽アグルチニンを用い、核の染色にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いた。生細胞イメージングを行い、代表的な画像を示す。細胞内の赤色点状染色は４時間で観察され（図２３Ｂ）、時間と共に増加し続けた（図２３Ｃ）。ストレプトアビジン６４７を含むがＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４を含まない対照サンプルをパネルＡに示す。赤色染色の欠如は、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４が細胞への取り込みを媒介したことを示す。細胞の周囲に位置する赤色染色（緑色染色）は、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の細胞内への内在化を示す。

【0199】

図２４Ａ乃至２４Ｃは、髄腔内注射後にＭＧＳ＿ＮＯＥ３－Ｖ２－４がＣＮＳの細胞と会合したことを示す。ＭＧＳ＿ＮＯＥ３－Ｖ２－４をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに髄腔内注射した。ペプチドを１時間循環させた後、動物を安楽死させ、脳組織を採取した。その後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて全脳を解離させた。脳細胞に内在化したＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４分子の数をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ）により解析した。

【0200】

図３５は、図２６及び２７に示される実験に用いられたＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラを示す。

【0201】

図２６Ａ乃至２６Ｃは、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラがＨＴ２２神経細胞に内在化されたことを示す。細胞内の穿孔染色は１時間で観察され、時間と共に増加し続けた。図２６Ａは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を含むがＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４を含まない対照サンプルとＨＴ２２細胞単体とを示す。二重標的化キメラＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４は、細胞膜の境界内の染色により分かるように、ＨＴ２２細胞に内在化された（図２６Ｃの右下）。二重標的化キメラＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みは、ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４のみと比較して３倍減少したが、依然として有意であった。二重標的化キメラＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４の取り込みは、経時的に継続し、２４時間でほぼ２５０，０００分子／細胞（≒２５０ｎＭ）に達した。総合すると、これらのデータは、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２－ＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４キメラは神経細胞内に取り込まれる能力を保持しており、２４時間後で細胞内レベルが≒２５０ｎＭに達し、この取り込みはキメラのＭＧＳ＿ＮＯＥ３＿Ｖ２－４成分により駆動されることを示す。

【0202】

図２７は、ＭＴＳ２＿Ｖ１－２がトランスフェリン受容体に結合してＣＮＳにアクセスし、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２が輸送のために新規で未だ同定されていない細胞受容体を利用することを示す。リコンビナントヒトトランスフェリン受容体を１μｇ／ｍＬの高結合ＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。ビオチン化ＭＴＳ２＿Ｖ１－２又はＭＴＳ３＿Ｖ１－２を様々な濃度で１時間インキュベートした後、サンプルを除去し、プレートを洗浄して過剰なペプチドを除去した。保持されたＭＴＳペプチドを、ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ試薬を用いて検出した。吸光度は４５０ｎｍで測定され、トランスフェリン受容体に捕捉されたＭＴＳペプチドの量に比例した。示されるように、ＭＴＳ２＿Ｖ１－２は、濃度依存的にヒトトランスフェリンに結合し、濃度が高くなると飽和した。比較として、ＭＴＳ３＿Ｖ１－２とＭＴＳ２＿Ｖ１－２のスクランブル対照ペプチドとは結合を示さなかった。トランスフェリン受容体に対するＭＴＳ２＿Ｖ１－２の結合親和性は、ＯｃｔｅｔＲＥＤ ９６システムを用いた生物層干渉法により測定した。ビオチン化ＭＴＳ２＿Ｖ１－２ペプチドをストレプトアビジンプローブに捕捉した。ヒト又はマウストランスフェリン受容体の様々な濃度でｋｏｎとｋｏｆｆ率を測定し、解離定数を決定した。トランスフェリン受容体に結合するＭＴＳ２＿Ｖ１－２のＫｄは、ヒトタンパク質では２１０ｎＭ、マウス受容体では１２ｎＭであった。総合すると、これらのデータは、トランスフェリン受容体がＭＴＳ２＿Ｖ１－２の標的であったことが支持される。ＭＴＳ３＿Ｖ１－２の受容体は不明のままであるが、データはトランスフェリン受容体ではないことを示し、このペプチドはＭＴＳ２＿Ｖ１－２とは異なるメカニズムでＣＮＳにアクセスしている可能性が高い。

【0203】

１．材料及び方法
ｉ．細胞におけるペプチド内在化を定量する一般的な方法
細胞を、完全培地中、３７℃で、３Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けした所望のペプチド（ＭＧＳ、ＭＴＳ、又はＭＧＳ－ＭＴＳ共役体）と共にインキュベートした。ペプチド濃度、インキュベーション時間、及び使用した細胞株は、各図に示される。ペプチドを除去し、細胞を、ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で三回、０．９％ ＮａＣｌ中の０．１Ｍ ＨＣｌ－グリシンｐＨ２．２で二回、ＰＢＳリンスで一回洗浄した。細胞をトリプシン処理により除去した。ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａによりフローサイトメトリーを行い、データをＦｌｏｗＪｏ＿ｖ１０．８により分析した。細胞を、前方散乱と側方散乱に基づいてゲーティングして生存細胞のみが含ませ、最低１０，０００イベントがカウントされた。細胞当たりの絶対的なペプチド取り込みについて、Ｑｕａｎｔｕｍ^ＴＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７微小球を用いて標準曲線を作成した。ＭＦＩは、ピーク高さの５０％で決定した。細胞当たりの内在化分子を、ＭＥＳＦとＭＦＩを関連付ける標準曲線により決定し、色素分子数／ＭＧＳ結合体で割算した。ＥＣ５０を算出するための非線形回帰曲線フィッティングには、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用した。

【0204】

細胞受容体がリサイクルされたかどうかを決定する実験のために、細胞を、１００μＭのクロロキン又は２５０μＭのシクロヘキシミドの存在下でペプチドにより処理した。示された時点において、細胞を洗浄し、上記のように分析した。

【0205】

ｉｉ．取り込み研究に用いられたＣＮＳ細胞株
全ての細胞株は、製造者のプロトコル及び培地供給により維持された。

【表3】

ＨＭＣ３細胞を、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）（１０ｎｇ／ｍｌ、２４時間）により活性化した。安静時の表現型は、ＩＢＡ１、エンドトキシン受容体ＣＤ１４の発現により特徴付けられたが、アストロサイトマーカーＧＦＡＰは陰性であった。活性化ミクログリアのマーカー、すなわちＭＨＣＩＩ、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂは、安静時のＨＭＣ３細胞では陰性であったが、活性化後は発現が上昇した。

【0206】

ｉｉｉ．イン・ビボＭＴＳ及びＭＴＳ－ＭＧＳ標的化実験
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０色素に直接共役したＭＴＳペプチド（１μｇ／ｇ 体重）を、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに側尾静脈から注射し、指示された時間（２０分、１時間、６時間、２４時間）循環させた。時間終了の１０分前に動物に麻酔をかけ、２００倍ヘパリン化生理食塩水を腹腔内に２ｍＬ注射した。ＣＳＦを採取するために、頸部背面を鈍的に剥離し、脳槽を覆っている透明な硬膜を露出させた。ガラス製マイクロピペットを用い、指示された時点で大脳胞からＣＳＦを吸引した。ＣＳＦ採取後、ヘパリンを含む５００ｍＬの氷冷１ｘＰＢＳでフラッシュして経心筋灌流を行い、体内の血液を除去した。脳とその他の組織とを分離した。脳を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて溶解バッファ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中でホモジナイズし、可溶性画分を回収した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０に共役したＭＴＳペプチドを用いて標準曲線を作成し、髄液及び脳の色素量を測定した。

【0207】

組織の切片化に脳を使用する場合、最初の灌流に続いて、５００ｍＬの氷冷５％パラホルムアルデヒドにより灌流を行う。脳マトリックスを用いて厚さ１ｍｍの冠状切片を作製した。このスライスをＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒで画像化し、８００ｎｍの蛍光シグナルを収集した。

【0208】

ｉｖ．共焦点顕微鏡：イン・ビトロ細胞分析
試験細胞を、処理の２４時間前に３５ｍｍ共焦点顕微鏡用ディッシュに播種した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けした試験ペプチドを、培地中で支持された時間、３７℃で細胞上においてインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで三回、０．９％ＮａＣｌ中の０．１Ｍ ＨＣｌ－グリシン ｐＨ ２．２で二回、ＰＢＳで一回洗浄した。細胞膜のラベル付けにはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８共役小麦胚芽アグルチニンを用い、核の染色にはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いた。顕微鏡検査は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００にＰｌｎ Ａｐｏ ６３ｘ／１．４ ｏｉｌ ＤＩＣ ＩＩＩ対物レンズを装着して行った。画像をＺｅｎソフトウェアを用いて処理した。

【0209】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で直接ラベル付けする代わりにビオチン化したペプチドについて、ペプチド－ＳＡ－ＡＦ６４７共役体を、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ６４７共役ストレプトアビジン及びビオチン化ペプチドを等しい分子比で１００μｌのＰＢＳ中で室温で３０分間混合することにより調製した。共役の後、ストレプトアビジン上のすべての結合部位を飽和させるために、ビオチン（６００ ｎＭ）を含む９００ μｌの培養液を混合物に追加した。その後、細胞培養液を、ペプチドを含む混合物に交換した。最終的なペプチド－ＳＡ－ＡＦ６４７は各図に示される。顕微鏡観察は上記のように行った。

【0210】

ｖ．イン・ビボ輸送実験用の共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリー分析
上記のように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７でラベル付けしたＭＴＳ、ＭＧＳ、又はＭＴＳ－ＭＧＳをＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに注射した。２時間の循環時間後、動物を安楽死させ、脳を経心筋灌流により固定し、採取し、凍結保護し、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０で１５μｍの切片に凍結切片化した。画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８００により撮影した。ミクログリアをＩｂａ－１により染色し、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。

【0211】

フローサイトメトリーアッセイのために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて脳を解離した。全ての脳細胞を、ＣＤ１１ｂ／ｃ（ミクログリア）Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ミルテニーバイオテク）と共にインキュベートし、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを介して脳の残りの部分から分離した。その後、Ｉｂａ１ミクログリアマーカーによりミクログリアを染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａによりフローサイトメトリーデータを収集した。

【0212】

代替的に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて脳を解離させ、全てのＣＮＳ細胞を混合物として分析した。ＣＮＳ亜集団の濃縮は行わず、フローサイトメトリーにより細胞を直接分析した。細胞残屑及び細胞ダブレットを除去するために、ゲーティングを行った。

【0213】

ｖｉ．血清安定性
６５１ｎｍにおける吸光度により、色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）に共役したペプチドの溶液の濃度を決定し、～１４ｎｍｏｌのペプチドを凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチド粉末を４００μＬのヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈ６４３０）に溶解させ、３５μＭの溶液とした。サンプルを３７℃でインキュベートし、振盪した。各時点（０、１、２、４、２０、２４時間）において、反応から５０μＬのアリコートを除去し、１００μＬの無水エタノールを追加して血清タンパク質を沈殿させた。サンプルを氷上で１５分間インキュベートした後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、５０μＬの上清を除去し、１５０μＬのＰＢＳで希釈した。最後に、分析ＲＰ－ＨＰＬＣにより、各サンプル１００μＬを分析した。

【0214】

Ｂ．実施例２：反応方法
図２８乃至３２は、開示されるペプチド及び組成物を作成する異なる反応方法の例を示す。

【0215】

二量体コア用の樹脂の調製：２５μモルのペプチド（ＭＧＳ２＿Ｖ２－４）を合成するために、８０ｍｇのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、容量０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）を４５ｍＬ反応容器で量り、自動合成のためにペプチド合成機（ＰｕｒｅＰｅｐ Ｃｈｏｒｕｓ、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に移動させた。樹脂を、６ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｉｓｈｅｒ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ、Ｆｉｓｈｅｒ）の１：１混合物に３０分間膨潤させ、その後、水分を除去した。

【0216】

四量体コア用の樹脂の調製：１２．５μモルのペプチド（ＭＧＳ２＿Ｖ４－４）を合成するために、８０ｍｇのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、容量０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）を４５ｍＬ反応容器で量り、自動合成のためにペプチド合成機（ＰｕｒｅＰｅｐ Ｃｈｏｒｕｓ、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に移動させた。樹脂を、６ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｉｓｈｅｒ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ、Ｆｉｓｈｅｒ）の１：１混合物に３０分間膨潤させ、その後、水分を除去した。

【0217】

修飾アミノ酸の手動添加：（樹脂に対する）手動カップリングカクテルは、概して、１ｍＬのＤＭＦに溶解した、４．４ｅｑのＨＣＴＵ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０ｅｑのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５ｅｑのＯｘｙｍａ ｐｕｒｅ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＦｍｏｃ－Ｓ－ｔｅｒｔ－ブチルチオ－Ｌ－システイン（ＣＨＥＭ－ＩＭＰＥＸ ＩＮＴ’Ｌ ＩＮＣ）、Ｎ α－Ｆｍｏｃ－Ｎ ε－アジド－Ｌ－リジン（ＣＨＥＭ－ＩＭＰＥＸ ＩＮＴ’Ｌ ＩＮＣ）、及びＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（パルミトイル－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＨ（ＢＡＣＨＥＭ）を含むがこれらに限定されない５ｅｑの修飾アミノ酸を含有した。１時間のカップリングの後、ペプチド樹脂を、３ｍＬのＤＭＦで２回、３ｍＬのＤＣＭで２回、３ｍＬのＤＭＦで１回洗浄し、それぞれ２０秒間混合した。

【0218】

リンカーの手動添加：１ｍＬのＤＭＦに溶解した、１６ｅｑのＮ，Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ－Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１６ｅｑのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、８ｅｑのＦｍｏｃ－アミノＰＥＧプロピオン酸（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ）、及び８ｅｑのＯｘｙｍａ ｐｕｒｅ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有した。２時間のカップリングの後、ペプチド樹脂を（上記のように）再度洗浄した。

【0219】

マレイミドプロピオン酸の手動添加：１ｍＬのＤＭＦに溶解した、１６ｅｑのＮ，Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ－Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１６ｅｑのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、８ｅｑの３－マレイミド－プロピオン酸（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ）、及び８ｅｑのＯｘｙｍａ ｐｕｒｅ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有した。２時間のカップリングの後、ペプチド樹脂を（上記のように）再度洗浄した。

【0220】

自動ペプチド合成：Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を用いて、ＰｕｒｅＰｅｐ Ｃｈｏｒｕｓでペプチド（ＭＧＳ２＿Ｖ２－４及びＭＧＳ２＿Ｖ４－４）を合成した。脱保護及びカップリング工程は、混合のために窒素バブルを利用した。全ての工程は室温で行われた。

【0221】

脱保護：脱保護は、０．１ＭのＯｘｙｍａ ｐｕｒｅ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）／ＤＭＦ溶液中の２ｍＬの２０％ピペリジン（シグマアルドリッチ）による２回の連続処理（５分及び１０分）から構成された。脱保護の後、（上記のように）洗浄を行った。

【0222】

カップリング：カップリング工程は、０．２５ＭのＯｘｙｍａ ｐｕｒｅ／ＤＭＦ溶液中の１ｍＬの０．２５ＭのＦｍｏｃ－アミノ酸（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１ｍＬ、ＤＭＦ中の０．５ｍＬの０．４４ＭのＨＣＴＵ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｌ、及びＤＭＦ中の０．５ｍＬの１ＭのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含んだ。３０分及び１時間の連続カップリングの後、ペプチド樹脂を（上記のように）再度洗浄した。全てのカップリング工程が終了した後、ペプチド樹脂を脱保護し、Ｎ末端アミンのアセチル化に備えて洗浄した。

【0223】

アセチル化：Ｎ末端アミンのアセチル化は、
０．２ｍＬの無水酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２ｍＬのＮＭＭ、及び１．６ｍＬのＤＭＦの２ｍＬ溶液による２回の２０分間の処理から構成された。アセチル化の後、３ｍＬのＤＭＦで４回、３ｍＬのＤＣＭで８回洗浄した。その後、ペプチド樹脂をＰｒｅｌｕｄｅ上で１時間真空乾燥した。

【0224】

開裂：ペプチド樹脂を５ｍＬのフィルターシリンジに移動させ、９２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｆｉｓｈｅｒ）、５％トリイソプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２．５％ＭＱ－水の５ｍＬ開裂カクテルで開裂させた。開裂混合物を２～３時間撹拌し、冷ジエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ）に注ぎ、激しく振盪し、ペプチドを沈殿させた。混合物を室温、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をデカントした。粗ペプチドペレットを新鮮なジエチルエーテルで２回洗浄し、ヒュームフードで乾燥させ、真空デシケーターで一晩乾燥させた。

【0225】

ＲＰ－ＨＰＬＣでの粗ペプチド調製及び精製：粗ペプチドを量り、２０～４０％アセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ）、８０～６０％ＭＱ－水、及び０．１％ＴＦＡの溶液に溶解させた。ペプチド溶液をボルテックスし、超音波処理し、１時間攪拌した。溶解した後、ペプチド溶液を０．２ｍｍフィルターシリンジで濾過し、ＲＰ－ＨＰＬＣ及び分析に備えた。Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ ＬＣ ２７６７システムを用いて、移動相としてＭＱ－水中の０．１％ＴＦＡ（バッファＡ）及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（バッファＢ）で、ペプチドの精製を行った。各注入は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ５ｍｍ Ｃ４ ３００Ａカラム（２００ｘ２１２ｍｍ）を用い、室温で、２０－７０％ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂプロファイル（０～３分２０％、３～２５分２０～７０％、２５～３０分９０％、３０～３５分２０％）を用いて１０ｍＬ／分の流速で行った。部分を回収し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳで分析して純率を評価し、凍結乾燥させた。

【0226】

マレイミドコアとペプチド（ＭＧＳ又はＭＴＳ）との共役：凍結乾燥したマレイミドコアを量り、３ＭのＧｕＨＣｌ／ＰＢＳに溶解させた。その後、凍結乾燥したＭＧＳ／ＭＴＳペプチドを３ＭのＧｕＨＣＬ／ＰＢＳに別々に溶解させ、その溶液のｐＨを決定し、（必要であれば）～７に調整した。この溶液を合わせて、マレイミドコアとペプチドを１．０：２．２モルｅｑ．とした。反応物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０）で精製し、その後、３時間撹拌した。ペプチド生成物を回収し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳで特徴を評価し、凍結乾燥させた（図２９）。

【0227】

ＤＢＣＯの添加： ３Ｍの塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ、シグマアルドリッチ）ＰＢＳ溶液に凍結乾燥ペプチドを溶解させ。溶液のｐＨを決定し、（必要に応じて）～６．８に調整した。その後、同じく３ＭのＧｕＨＣｌ／ＰＢＳ溶液に溶解した１．２ｅｑ．のマレイミド－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ（シグマアルドリッチ）をペプチド溶液に加えた。反応物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０）で精製し、その後、３０分間撹拌した。ペプチド生成物を回収し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳで特性を評価し、凍結乾燥させた（図３０）。

【0228】

キメラペプチド合成：
ＤＢＣＯが結合した凍結乾燥ペプチド（ＭＧＳ又はＭＴＳ）及びＮα－Ｆｍｏｃ－Ｎε－アジド－Ｌ－リジンがコアに組み込まれたペプチド（ＭＧＳ又はＭＴＳ）を量り、別々に３ＭのＧｕＨＣｌ／ＰＢＳに溶解させた。各溶液のｐＨを決定し、（必要に応じて）～７に調整した。この溶液を合わせて、ＤＢＣＯが結合したペプチドとＮα－Ｆｍｏｃ－Ｎε－アジド－Ｌ－リジンが結合したペプチドを１．０：２．２モルｅｑ．とした。反応物を一晩撹拌した後、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０）で精製した。ペプチド生成物を回収し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳで特性を評価し、凍結乾燥させた（図３１）。

【0229】

ｓｉＲＮＡとキメラペプチドとの共役：
遊離ＤＢＣＯを有するキメラペプチド（任意のコア構造からなる）をヌクレアーゼフリーのＰＢＳ（ＮＦ－ＰＢＳ）に溶解させ、ｐＨを決定して（必要であれば）～７に調整した。その後、５’末端又は３’末端のいずれかにアジドを組み込んだｓｉＲＮＡをＮＦ－ＰＢＳに溶解させ、２６０ｎｍにおいて吸光度を測定して濃度を決定した。この溶液を合わせて、ｓｉＲＮＡとペプチドが１：１．２モルｅｑ．とした。反応物を３～７日間撹拌し、その後、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２２０）で精製した。部分を回収し、混合し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣで特性を評価し、凍結乾燥させた（図３２）。

【0230】

当業者は、日常的な実験以上のことを行わずに、本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識又は確認することができる。このような同等は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図28E】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-08-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドは、Ｎ末端保護基を有する、請求項１のペプチド。

【請求項3】

前記Ｎ末端保護基は、アセチル基である、請求項２のペプチド。

【請求項4】

前記ペプチドは、リンカーをさらに備える、請求項１乃至３のペプチド。

【請求項5】

前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、マレイミドリンカー、ペプチドリンカー、アミドリンカー、アリールリンカー、ジベンゾシクロオクチンリンカー、アジドリンカー、トリアゾールリンカー、ジベンゾアザシクロオクチンリンカー、８，９－ジヒドロ－１Ｈ－ジベンゾ［１，２，３］トリアゾロ［４，４５－ｄ］アゾシン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４のペプチド。

【請求項6】

前記ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ１２又はＰＥＧ１４である、請求項５のペプチド。

【請求項7】

ａ．ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＧＳ）と、
ｂ．（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第１のリンカーと、
ｃ．第２のリンカーと、
ｄ．（ｉ）ペプチドのＣ末端に結合し得る少なくとも１つの反応性基及び（ｉｉ）部分と化学的に反応し得る少なくとも１つの追加の反応性基を備える第３のリンカーと、
ｅ．ＤＡＹＫＬＱＴＳＬＤＷＱＭＷＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＦＰＳＷＴＳＫＮＱＱＷＴＮＱＲＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；又はＳＫＥＴＹＳＭＮＡＱＲＱＨＥＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を備えるペプチド（ＭＧＳ）と、
を備える組成物。

【請求項8】

ＧＦＨＮＶＹＰＹＴＷＧＧＦＳＤＩＤＬＭＡＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＥＱＲＷＶＱＭＬＨＬＱＴＲＹＡＧＥＷＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又はＦＱＨＮＰＦＰＹＴＹＳＭＥＤＴＤＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列を備える前記ペプチド（ＭＧＳ）のＣ’末端は、前記第１のリンカーに結合する、請求項７の組成物。

【請求項9】

前記第１のリンカーは、前記第２のリンカーに結合する、請求項７又は８の組成物。

【国際調査報告】