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▶ ハンミ ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-23
(54)【発明の名称】コロナウイルスワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20250116BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20250116BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250116BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20250116BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20250116BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250116BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250116BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20250116BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250116BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20250116BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20250116BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20250116BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/50
C12N5/10
C12N7/01
A61K9/51
A61P37/04
A61P31/14
A61K31/7115
A61K31/7088
A61K47/28
A61K47/24
A61K47/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538501
(86)(22)【出願日】2022-12-14
(85)【翻訳文提出日】2024-06-24
(86)【国際出願番号】 KR2022020354
(87)【国際公開番号】W WO2023121131
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】10-2021-0185374
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516132149
【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハン、ソン ス
(72)【発明者】
【氏名】パク、ダ ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】オ、ウ リム
(72)【発明者】
【氏名】ホ、ヨン ホ
(72)【発明者】
【氏名】シン、ソン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】リム、チャン ギュ
(72)【発明者】
【氏名】イ、チョン ソ
(72)【発明者】
【氏名】チェ、チェ ヒョク
(72)【発明者】
【氏名】ホン、スン ヒ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA45
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB25
4C076BB27
4C076CC07
4C076CC35
4C076DD50
4C076DD63
4C076DD70
4C076FF31
4C076FF68
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB33
(57)【要約】
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）及び３’非翻訳領域ヌクレオチド、並びにその用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチドであり、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された上流プロモーター領域ヌクレオチド配列、前記プロモーターに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものであり、
前記転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものを含み、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列であるものを含み、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチドであるものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列をコーディングする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
発現構造体またはベクターである、請求項１～１１のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
テンプレートとして、請求項１～１２のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られる、ＲＮＡ。
【請求項14】
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドであり、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されており、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の下流において、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項15】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項19】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項20】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列によってなるものを含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってなるものを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項21】
前記ポリヌクレオチドのうち１以上のＵが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものを含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項22】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものを含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項24】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項25】
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項26】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項27】
５’末端は、５’キャップ構造を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項28】
１以上の変形されたヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項29】
前記変形されたヌクレオチドは、Ｕの代わりに、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項30】
請求項１～１３のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法。
【請求項31】
請求項１～１３のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写体を生産する段階を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
請求項３０に記載の方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を得る方法。
【請求項33】
請求項１～１３のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を生産する段階を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
活性成分として、請求項１４～２９のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を個体に伝達するための組成物。
【請求項35】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するためのものである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項37】
活性成分として、請求項１４～２９のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための組成物。
【請求項38】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項39】
活性成分として、請求項１４～２９のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための組成物。
【請求項40】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
請求項１４～２９のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む前記ポリヌクレオチドを利用する、方法。
【請求項42】
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記宿主細胞は、樹枝状細胞を含む抗原提供細胞、モノサイトまたはマクロファージである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
請求項１４～２９のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを個体に投与する段階を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記個体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体に対して免疫化する、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記個体において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、請求項４３に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ：untranslated region）及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ：untranslated region）、並びにその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸ワクチンは、ＤＮＡまたはＲＮＡによってコーディングされた抗原に依存する。ＤＮＡワクチンは、真核細胞プロモーター調節下として、バクテリアプラスミドに挿入された抗原コーディング遺伝子を一般的に含む。なお、ＲＮＡワクチンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または他の抗原コーディングＲＮＡを利用する。タンパク質ワクチンと類似して、核酸ワクチンは、筋肉、皮下、粘膜または経皮の伝達のような多様な経路を介して伝達されうる。
【0003】
ＤＮＡワクチンは、ペプチドワクチン、細胞ワクチン、ウイルスベクターワクチン及びＲＮＡワクチンに比べ、免疫反応を少なく誘導すると知られている。また、該ＤＮＡワクチンは、免疫原性が低いだけではなく、宿主ゲノムに挿入され、癌誘発（oncogenesis）を誘導する可能性がある。それにより、ＲＮＡ基盤ワクチンに対する要求がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
一態様は、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0005】
他の態様は、テンプレートとして、前述の第１態様のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られるＲＮＡを提供する。
【0006】
他の態様は、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0007】
他の態様は、前記ポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法を提供する。
【0008】
他の態様は、前記方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ポリペプチドを得る方法を提供する。
【0009】
他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチドを個体に伝達するための組成物を提供する。
【0010】
他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチドに対する免疫反応を誘導するための組成物を提供する。
【0011】
他の態様は、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む前記ポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと係わり、用語「同一性（identity）」は、配列を比較して決定される２以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を示す。前記同一性は、２以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基のストリング（string）間のマッチング数によって決定される配列関連度（sequence relatedness）の程度を示す。関連するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性は、周知の方法によって計算されうる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに適用される「％同一性」は、候補のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列につき、第２配列との最大パーセント同一性を得るために、整列（aligning）させ、必要であるならば、ギャップを導入した後、該第２配列の残基と同一である候補配列中の残基の百分率として定義される。前記整列のための方法及びプログラムは、周知である。前記プログラムは、例えば、ＢＬＡＳＴ、Smith-Waterman algorithmまたはNeedleman-Wunsch algorithmでもある。
【0013】
本明細書において、「５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ：untranslated region）」は、ポリペプチドをコーディングしない開始コドン、すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写体の最初コドンから、直接上流（すなわち、５’）であるｍＲＮＡの領域を示す。
【0014】
本明細書において、「３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ：untranslated region）」は、ポリペプチドをコーディングしない中断コドン（stop codon）、すなわち、翻訳終結（termination）を合図をするｍＲＮＡ転写体のコドンから、直接下流（すなわち、３’）であるｍＲＮＡの領域を示す。
【0015】
本明細書において、「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：open reading frame）」は、開始コドン、例えば、メチオニンコドン（ＡＴＧ）によって始まり、中断コドン、例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡで終わり、ポリペプチドをコーディングするＤＮＡの連続領域を示す。
【0016】
本明細書において、「ポリアデニレート配列（polyadenylate sequence）」または「ポリＡテール（polyA tail）」は、複数の連続したアデノシンモノホスフェートを含む３’ＵＴＲから下流、例えば、直接下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域を示す。前記ポリＡテールは、１０～３００個のアデノシンモノホスフェートを含むものでもある。例えば、前記ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００個のアデノシンモノホスフェートを含むものでもある。前記ポリＡテールは、例えば、５０～２５０個のアデノシンモノホスフェートを含むものでもある。細胞または個体のような生体内において、前記ポリＡテールは、酵素、例えば、細胞質にある酵素攻撃からｍＲＮＡを保護し、転写終結、核からのｍＲＮＡ排出（export）、及び翻訳を助ける役割が行うことができる。
【0017】
本明細書において、用語「作動的に連結された（operatively linked）」は、１つの機能が他のものによって影響を受けるように、単一核酸断片上において、ヌクレオチド配列が連結されていることを示す。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現に影響を及ぼしうる場合（すなわち、コーディング配列が、前記プロモーターの転写調節下にある場合）、コーディング配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））に作動可能に連結されているのである。該コーディング配列は、センス方向またはアンチセンス方向に、調節配列に作動可能に連結されてもいる。
【0018】
本明細書において、ヌクレオチド配列の位置と係わり、取り立てての言及がなければ、 ５’末端から３’末端の方向に連結されるか、あるいは位置することを示す。
【0019】
本明細書において、用語「ベクター（vector）」または「核酸構造体（nucleic acid construct）」は、遺伝子、あるいはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはＤＮＡ断片を細胞に運ぶことができる任意の核酸を示す。前記ベクターは、例えば、細胞で複製されうるものでもある。前記ベクターは、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、または酵母人工染色体（ＹＡＣ：yeast artificial chromosome）・バクテリア人工染色体（ＢＡＣ：bacterial artificial chromosome）・植物人工染色体（ＰＬＡＣ：plant artificial chromosome）のような人工染色体（artificial chromosome）でもある。
【0020】
第１態様は、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0021】
前述の分離されたポリヌクレオチドは、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び非天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを含むものでもある。前述の分離されたポリヌクレオチドは、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを含むものでもある。
【0022】
前述の分離されたポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチドでもある。
【0023】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、非天然ヌクレオチド配列を含むものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２、またはその組み合わせを含むものでもある。これら５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、ポリリボヌクレオチドでもある。前記非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３、またはその組み合わせを含むものでもある。これら配列は、ポリデオキシリボヌクレオチドでもある。
【0024】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、非天然ヌクレオチド配列または天然ヌクレオチド配列を含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するもの、または配列番号２０のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０、またはその組み合わせを含むものでもある。前記非天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）または前記天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０またはその組み合わせを含むものでもある。
【0025】
前記非天然非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）または前記天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、制限酵素認識配列を追加して含むものでもある。前記制限酵素は、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩ、またはＸｈｏＩ及びＮｈｅＩでもある。
【0026】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された上流プロモーター領域ヌクレオチド配列をさらに含むものでもある。
【0027】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。
【0028】
前記転写可能なヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはＲＮＡをコーディングする配列であるものでもある。前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原性ポリペプチドでもある。前記ウイルス抗原性ポリペプチドは、１以上のＢｅｔａＣｏＶ（Betacoronavirus）抗原性ポリペプチド、１以上のＲＳＶ（respiratory syncytial virus）抗原性ポリペプチド、１以上のＭｅＶ（measles virus）抗原性ポリペプチド、１以上のｈＭＰＶ（human Metapneumovirus）抗原性ポリペプチド、１以上のＰＩＶ（human parainfluenza virus）抗原性ポリペプチド、それらの抗原性断片、またはそれらの組み合わせでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年に確認されたものであり、ＣＯＶＩＤ－１９とも言う。前記抗原性ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質、またはその免疫原性断片でもある。前記治療的ポリペプチドは、例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、その誘導体、またはそれらの組み合わせでもある。
【0029】
前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、クローニングサイトでもある。前記クローニングサイトは、多重クローニングサイトでもある。該クローニングサイトは、制限酵素の認識部位、切断部位、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0030】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するように連結されたものでもある。
【0031】
前述のプロモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するように連結されたものでもある。
【0032】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号（poly(A) attachment signal）ヌクレオチド配列をさらに含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。
【0033】
前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するか、あるいは共通の転写体の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）下流に、ポリＡテールを添加するように連結されたものでもある。
【0034】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものでもある。例えば、前記ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列の順序で連結されたものでもある。
【0035】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものでもある。その場合、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものでもある。
【0036】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列を含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むものでもある。その場合、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものでもある。また、前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列を含むものでもある。
【0037】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列をコーディングするものでもある。
【0038】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された上流プロモーター領域ヌクレオチド配列、前記プロモーターに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものでもある。例えば、前記ポリヌクレオチドは、プロモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列の順序で連結されたものでもある。
【0039】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するか、あるいは形成された共通の転写体の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）下流に、ポリＡテールを添加するように連結されたものでもある。
【0040】
前述のプロモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するか、あるいは形成された共通の転写体の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）下流に、ポリＡテールを添加するように連結されたものでもある。
【0041】
前記ポリヌクレオチドは、核酸構造体またはベクターでもある。本明細書において、「ポリアデニレート付着信号」は、未成熟ｍＲＮＡにポリアデニレートを添加させるヌクレオチド配列でもある。前記核酸構造体またはベクターは、前記ポリヌクレオチドを発現するのに必要な調節配列を含むものでもある。前記発現は、転写、翻訳、またはその組み合わせでもある。
【0042】
第２態様は、テンプレート（template）として、前述の第１態様のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られるＲＮＡを提供する。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、信号配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものでもある。
【0043】
前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のヌクレオシドまたはヌクレオチド変形を含むものでもある。変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された分解を示しうる。また、変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された免疫原性（例えば、低減された先天反応（innate response））を示しうる。
【0044】
変形されたシトシンを有するヌクレオシドは、ａｃ４Ｃ（N4-acetyl-cytidine ）、ｍ５Ｃ（5-methyl-cytidine ）、５－ハロシチジン（5-halo-cytidine）（例：５－ヨードシチジン（5-iodo-cytidine））、ｈｍ５Ｃ（5-hydroxymethyl-cytidine）、１－メチル－シュードイソシチジン（1-methyl-pseudoisocytidine）、ｓ２Ｃ（2-thio-cytidine）、２－チオ－５－メチル－シチジン（2-thio-5-methyl-cytidine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0045】
変形されたアデニンを有するヌクレオシドは、７－デアザ－アデニン（7-deaza-adenine）、ｍ１Ａ（1-methyl-adenosine）、ｍ２Ａ（2-methyl-adenine）、ｍ６Ａ（N6-methyl-adenosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0046】
変形されたグアニンを有するヌクレオ塩基またはヌクレオシドは、Ｉ（inosine）、ｍ１Ｉ（1-methyl-inosine）、ｉｍＧ（wyosine）、ｍｉｍＧ（methylwyosine）、７－デアザ－グアノシン（7-deaza-guanosine）、ｐｒｅＱ０（7-cyano-7-deaza-guanosine）、ｐｒｅＱ１（7-aminomethyl-7-deaza-guanosine）、ｍ７Ｇ（7-methyl-guanosine）、ｍ１Ｇ（1-methyl-guanosine）、８－オキソ－グアノシン（8-oxo-guanosine）、７－メチル－８－オキソ－グアノシン（7-methyl-8-oxo-guanosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0047】
前記化学的変形を有するヌクレオチドは、シュードウリジン（pseudouridine）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（N1-methylpseudouridine）、Ｎ１－エチルシュードウリジン（N1-ethylpseudouridine）、２－チオウリジン（2-thiouridine）、４’－チオウリジン（4’-thiouridine）、５－メチルシトシン（5-methylcytosine）、５－メチルウリジン（5-methyluridine）、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン（2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン（2-thio-1-methyl-pseudouridine）、２－チオ－５－アザ－ウリジン（2-thio-5-aza-uridine）、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン（2-thio-dihydropseudouridine）、２－チオ－ジヒドロウリジン（2-thio-dihydrouridine, ）、２－チオ－シュードウリジン（2-thio-pseudouridine）、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン（4-methoxy-2-thio-pseudouridine）、４－メトキシ－シュードウリジン（4-methoxy-pseudouridine）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン（4-thio-1-methyl-pseudouridine）、４－チオ－シュードウリジン（4-thio-pseudouridine）、５－アザ－ウリジン（5-aza-uridine）、ジヒドロシュードウリジン（dihydropseudouridine）、５－メトキシウリジン（5-methoxyuridine）、２’－Ｏ－メチルウリジン（2’-O-methyluridine）、またはそれらの組み合わせでもある。前記化学的変形は、ウラシルの５位置にありうる。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－メチルシュードウリジン（N1-methylpseudouridine）への変形でもある。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－エチルシュードウリジン（N1-ethylpseudouridine）への変形でもある。
【0048】
前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のＵが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、５’末端のＧＡは、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）のキャップ構造を有するものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、すべてのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されてもいる。前記ｍＲＮＡは、すべてのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されており、５’末端のＧＡは、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）のキャップ構造を有するものでもある。
【0049】
第３態様は、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、非天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列または天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0050】
第３態様のポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２、またはその組み合わせを含むものでもある。前記非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0051】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するもの、または配列番号２０のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０、またはその組み合わせを含むものでもある。前記非天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）または前記天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0052】
第３態様のポリヌクレオチドは、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）とを含むものでもある。
【0053】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原性ポリペプチドでもある。前記ウイルス抗原性ポリペプチドは、１以上のＢｅｔａＣｏＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＲＳＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＭｅＶ抗原性ポリペプチド、１以上のｈＭＰＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＰＩＶ抗原性ポリペプチド、それらの抗原性断片、またはそれらの組み合わせでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質またはその免疫原性断片でもある。前記ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然スパイクタンパク質または変異体でもある。前記変異体は、アルファ（α）変異体、ベータ（β）変異体、ガンマ（γ）変異体、デルタ（δ）変異体、エプシロン（ε）変異体及びオミクロン（ο）変異体を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然スパイクタンパク質、またはそのアルファ（α）変異体、ベータ（β）変異体、ガンマ（γ）変異体、デルタ（δ）変異体、エプシロン（ε）変異体及びオミクロン（ο）変異体は、それぞれ配列番号４２～４８のアミノ酸配列を含むものでもある。前記治療的ポリペプチドは、例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、その誘導体、またはそれらの組み合わせでもある。
【0054】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、及びポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、共通の転写体として連結されたものでもある。
【0055】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含むものでもある。該ポリアデニレートヌクレオチド配列は、例えば、２０個以上、４０個以上、８０個以上、または１００個以上、及び５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、または１５０個以下のアデニルヌクレオチドを含むものでもある。
【0056】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列の上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、リボヌクレオチド配列、例えば、ｍＲＮＡでもある。
【0057】
前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、共通の転写体として連結されたものでもある。
【0058】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものでもある。
【0059】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、及びポリＡは、共通の転写体として連結されたものでもある。
【0060】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）または前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、及び／または天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）が使用された場合に比べ、翻訳効率、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の安定性、またはその組み合わせを増加させる活性を有するものでもある。
【0061】
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。前記ポリヌクレオチドは、５’キャップを含むものでもある。用語「５’キャップ（5’-cap）」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端で発見されるキャップ構造を示す。前記５’キャップは、異例な（unusual）５’に対する５’トリホスフェート連結（triphosphate linkage）を介し、ｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドを含むものでもある。前記グアノシンは、７位置にメチル化されたもの、例えば、ｍ７Ｇ、または３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇでもある。用語「一般的５’キャップ（conventional 5’-cap）」は、天然に存在するＲＮＡ ５’キャップ、例えば、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）を示す。本明細書において、用語「５’キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に類似しており、ＲＮＡに付着する場合、例えば、インビボ及び／または細胞において、ＲＮＡを安定化させる能力を有するように変形された５’キャップアナログを含む。ＲＮＡへの、５’キャップまたは５’キャップアナログの提供は、ＤＮＡテンプレートを、５’キャップまたは５’キャップアナログの存在下においてインビトロ転写し、前記５’キャップまたは５’キャップアナログが生成されるＲＮＡ鎖に共同転写（co-transcriptionally）挿入によって行われるか、あるいは５’キャップまたは５’キャップアナログを転写した後（post-transcriptionally）、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して生成されうる。前記５’末端キャップ構造は、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＩｍｐＮｐ、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧでもある。
【0062】
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものでもある。前記ＲＮＡは、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列によってなるものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってなるものでもある。前記ＲＮＡは、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列を含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含むものであり、前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号１０１のヌクレオチド配列を含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、制限酵素認識配列を追加して含むものでもある。前記制限酵素は、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩ、またはＸｈｏＩ及びＮｈｅＩを含むものでもある。
【0063】
前記ポリヌクレオチド中のＵのうち１以上が、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものでもある。
【0064】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものであり、前記ポリヌクレオチド中のＵのうち１以上が、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものでもある。前記ポリヌクレオチドは、そのうち全てのＵが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものでもある。
【0065】
また、前記ポリヌクレオチドは、５’末端に、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）キャップ構造を有するものでもある。
【0066】
第４態様は、第１態様のポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法を提供する。前記転写は、インビトロ転写、エクスビボ転写またはインビボ転写を含むものでもある。前記インビボ転写は、個体内転写を含むものでもある。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のヌクレオシドまたはヌクレオチド変形を含むものでもある。変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された分解を示しうる。また、変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された免疫原性（例えば、低減された先天反応（innate response））を示しうる。
【0067】
変形されたシトシンを有するヌクレオシドは、ａｃ４Ｃ（N4-acetyl-cytidine ）、ｍ５Ｃ（5-methyl-cytidine ）、５－ハロシチジン（5-halo-cytidine）（例：５－ヨードシチジン（5-iodo-cytidine））、ｈｍ５Ｃ（5-hydroxymethyl-cytidine）、１－メチル－シュードイソシチジン（1-methyl-pseudoisocytidine）、ｓ２Ｃ（2-thio-cytidine）、２－チオ－５－メチル－シチジン（2-thio-5-methyl-cytidine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0068】
変形されたアデニンを有するヌクレオシドは、７－デアザ－アデニン（7-deaza-adenine）、ｍ１Ａ（1-methyl-adenosine）、ｍ２Ａ（2-methyl-adenine）、ｍ６Ａ（N6-methyl-adenosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0069】
変形されたグアニンを有するヌクレオ塩基またはヌクレオシドは、Ｉ（inosine）、ｍ１Ｉ（1-methyl-inosine）、ｉｍＧ（wyosine）、ｍｉｍＧ（methylwyosine）、７－デアザ－グアノシン（7-deaza-guanosine）、ｐｒｅＱ０（7-cyano-7-deaza-guanosine）、ｐｒｅＱ１（7-aminomethyl-7-deaza-guanosine）、ｍ７Ｇ（7-methyl-guanosine）、ｍ１Ｇ（1-methyl-guanosine）、８－オキソ－グアノシン（8-oxo-guanosine）、７－メチル－８－オキソ－グアノシン（7-methyl-8-oxo-guanosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0070】
前記化学的変形を有するヌクレオチドは、シュードウリジン（pseudouridine）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（N1-methylpseudouridine）、Ｎ１－エチルシュードウリジン（N1-ethylpseudouridine）、２－チオウリジン（2-thiouridine）、４’－チオウリジン（4’-thiouridine）、５－メチルシトシン（5-methylcytosine）、５－メチルウリジン（5-methyluridine）、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン（2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン（2-thio-1-methyl-pseudouridine）、２－チオ－５－アザ－ウリジン（2-thio-5-aza-uridine）、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン（2-thio-dihydropseudouridine）、２－チオ－ジヒドロウリジン（2-thio-dihydrouridine, ）、２－チオ－シュードウリジン（2-thio-pseudouridine）、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン（4-methoxy-2-thio-pseudouridine）、４－メトキシ－シュードウリジン（4-methoxy-pseudouridine）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン（4-thio-1-methyl-pseudouridine）、４－チオ－シュードウリジン（4-thio-pseudouridine）、５－アザ－ウリジン（5-aza-uridine）、ジヒドロシュードウリジン（dihydropseudouridine）、５－メトキシウリジン（5-methoxyuridine）、２’－Ｏ－メチルウリジン（2’-O-methyluridine）、またはそれらの組み合わせでもある。前記化学的変形は、ウラシルの５位置にありうる。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－メチルシュードウリジン（N1-methylpseudouridine）への変形でもある。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－エチルシュードウリジン（N1-ethylpseudouridine）への変形でもある。前記変形は、Ｕが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、５’末端のＧＡは、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）のキャップ構造を有するものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されてもいる。前記ｍＲＮＡは、全てのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されており、５’末端のＧＡは、５’－［１，２－［（３’－Ｏ－メチル）ｍ７Ｇ－（５’→５’）－ｐｐｐ－Ａｍ］］のキャップ構造を有するものでもある。前記構造において、Ａｍは、２’－Ｏ－メチルアデノシンを示す。しかしながら、前記ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、該構造に限定されるものではなく、周知の天然５’キャップ構造または５’キャップアナログで置換されうる。
【0071】
用語「インビトロ転写」または「ＲＮＡインビトロ転写」は、無細胞システム、すなわち、インビトロにおいて、ｍＲＮＡを含むＲＮＡが合成される過程を示す。プラスミドＤＮＡベクターを含むクローニングベクターＤＮＡが、ＲＮＡ転写体生成のためのテンプレートとして適用されうる。それらクローニングベクターは、一般的に、転写ベクター（transcription vector）とも言う。ＲＮＡは、適切なＤＮＡテンプレートのＤＮＡ依存性インビトロ転写によって得られる。前記ＤＮＡテンプレートは、線形化されたプラスミドＤＮＡテンプレートでもある。ＲＮＡインビトロ転写を制御するプロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターでもある。前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、またはその組み合わせでもある。該ＲＮＡインビトロ転写のためのＤＮＡテンプレートは、核酸をクローニングし、それをＲＮＡインビトロ転写のためのベクターに導入して得られる。前記ＤＮＡは、インビトロ転写される各ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むものでもある。前記ＲＮＡインビトロ転写のためのベクターは、環状プラスミドＤＮＡでもある。前記ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写または化学合成によって得られる。
【0072】
前記転写ベクターは、プロモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングする配列、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリＡを含むものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうち１以上を含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列のうち１以上を含むものでもある。前記転写ベクターは、また大腸菌複製原点ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ、選択マーカー遺伝子、またはその組み合わせを含むものでもある。前記プロモーターは、Ｔ７プロモーターでもある。前記選択マーカーは、抗生物質、例えば、カナマイシン抵抗性酵素でもある。
【0073】
前記インビトロ転写は、前記転写ベクターを、宿主細胞、例えば、大腸菌に導入して形質転換された宿主細胞を得て、得られた宿主細胞を培養し、ｍＲＮＡのテンプレートになるプラスミドＤＮＡを含んでいる宿主細胞を増殖させる段階を含むものでもある。前記インビトロ転写は、増殖された宿主細胞、例えば、大腸菌から、前記プラスミドＤＮＡを分離する段階を含むものでもある。前記プラスミドＤＮＡを分離する段階は、培養物のうちから細胞層を分離し、細胞からプラスミドＤＮＡを分離することを含むものでもある。該細胞層分離は、遠心分離、分離、沈澱、またはその組み合わせによって行われうる。細胞からのプラスミドＤＮＡ分離は、周知の方法、例えば、アルカリ抽出法、親和性クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、電気泳動、またはその組み合わせによって行われうる。
【0074】
前記ＲＮＡを得る方法は、第１態様のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写体を生産する段階を含むものでもある。前記ＲＮＡ転写体は、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のＵが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、５’末端のＧＡは、５’－［１，２－［（３’－Ｏ－メチル）ｍ７Ｇ－（５’→５’）－ｐｐｐ－Ａｍ］］のキャップ構造を有するものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されてもいる。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されており、５’末端のＧＡは、５’－［１，２－［（３’－Ｏ－メチル）ｍ７Ｇ－（５’→５’）－ｐｐｐ－Ａｍ］］のキャップ構造を有するものでもある。しかしながら、前記ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、該構造に限定されるものではなく、周知の天然５’キャップ構造または５’キャップアナログで置換されうる。
【0075】
第５態様は、第３態様のＲＮＡ、または第４態様の方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ポリペプチドを得る方法を提供する。第３態様のＲＮＡ、または第４態様の方法によって得られたＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡでもある。
【0076】
前記方法は、第１態様のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリペプチドを生産する段階を含むものでもある。
【0077】
第６態様は、活性成分（active ingredient）として、第３態様のポリヌクレオチドを含むポリペプチドを個体に伝達するための組成物を提供する。第３態様のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。第３態様のポリヌクレオチドは、第４態様の方法によって得られたＲＮＡでもある。
【0078】
第７態様は、活性成分として、第３態様のポリヌクレオチドを含む前記ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するための組成物を提供する。第３態様のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。第３態様のポリヌクレオチドは、第４態様の方法によって得られたＲＮＡでもある。
【0079】
第６態様及び第７態様において、前記組成物は、免疫原性または疾病を治療するためのものでもある。前記疾病は、選択されたポリペプチドによって異なりうる。前記疾病は、例えば、ウイルスまたは外来細胞による感染症、癌、代謝性疾患、抗炎症、胃腸菅疾患、内分泌疾患、敗血症または自己免疫疾患でもある。前記疾病は、ハンター症侯群、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ファブリー病（Fabry disease）のように、酵素欠乏によって生じ、酵素代替療法で治療が可能な疾患でもある。前記疾病において、前記外来細胞は、原核細胞または真核細胞でもある。前記外来細胞は、バクテリアでもある。
【0080】
前記ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原性ポリペプチドでもある。前記ウイルス抗原性ポリペプチドは、１以上のＢｅｔａＣｏＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＲＳＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＭｅＶ抗原性ポリペプチド、１以上のｈＭＰＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＰＩＶ抗原性ポリペプチド、それらの抗原性断片、またはそれらの組み合わせでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質またはその免疫原性断片でもある。前記治療的ポリペプチドは、例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、その誘導体、またはそれらの組み合わせでもある。前記組成物は、個体において、症状または感染を予防、治療または診断するためのものでもある。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。前記感染は、バクテリア感染またはウイルス感染でもある。前記ウイルスは、ＢｅｔａＣｏＶ、ＲＳＶ、ＭｅＶ、ｈＭＰＶ、またはＰＩＶでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記組成物は、免疫エフェクタ細胞（immune effector cell）をプライミング（priming）するのに使用されうる。例えば、前記組成物は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をエクスビボ活性化させ、個体に注入する（infuse）のに使用されうる。前記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変異体に対する免疫反応を誘導するのに使用するためのものでもある。前記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変異体の感染症を予防するのに使用するためのものでもある。
【0081】
前記組成物は、個体に投与され、ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビボで翻訳され、抗原性ポリペプチドを生産しうる。
【0082】
抗原性ポリペプチドをコーディングする１以上の翻訳可能な領域を有するポリヌクレオチドを含む「効果量（effective amount）」の前記組成物は、細胞、組織または個体と接触されうる。
【0083】
前記効果量は、標的組織、標的細胞、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、大きさ、及び変形されたヌクレオシドの含量など）、並びに組成物の他の成分に基づいて定められうる。一般的に、効果量の前記組成物は、細胞において、抗原生産の関数として誘導されたり（induced）ブスートされたり（boosted）する免疫反応を引き起こさせうる。
【0084】
前記組成物は、他の予防的または治療的な化合物と共に投与されうる。前述の予防的または治療的な化合物は、例えば、アジュバントまたはブースター（booster）でもある。本明細書において、ワクチンのような、予防的組成物を参照するとき、用語「ブースター（booster）」は、前記予防的組成物の追加的投与を示す。ブースターまたはブースターワクチンは、前記予防的組成物の早い投与後に与えられうる。前記予防的組成物の初期投与と、前記ブースターとの間の投与時間は、１週、２週、３週、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月または１年でもある。また、前記組成物は、アジュバントを含まないものでもある。
【0085】
前記組成物は、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔または肺に投与されうる。
【0086】
前記組成物は、１以上の薬剤学的に許容可能な賦形剤を含むものでもある。前記組成物においてポリヌクレオチドは、前記賦形剤と剤形化されるか、あるいは複合体化されてもいる。前記賦形剤は、当業界に周知のものでもある。
【0087】
本明細書において、用語「活性成分（active ingredient）」は、前記組成物、またはそれに含まれたポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含むＲＮＡポリヌクレオチドを示す。前記ＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドをコーディングするものでもある。
【0088】
前記組成物に含まれる活性成分、薬剤学的に許容可能な賦形剤、及び／または他の付加的成分の相対的量は、治療される個体のアデンティティ（identity）、大きさ及び／または条件、並びに投与される経路によって異なりうる。例えば、前記組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５％～５０％、１．０％～３０％、５．０％～８０％、または８０％（ｗ／ｗ）以上の活性成分を含むものでもある。
【0089】
前記組成物において、前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）及び／または３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む安定化エレメントを含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、５’キャップ構造または３’ポリＡテールのような追加の構造をさらに含むものでもある。５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、一般的に、ゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’キャップ及び３’ポリＡテールのような成熟したｍＲＮＡの構造的特徴（feature）は、ｍＲＮＡ加工過程間に転写された（未成熟）ｍＲＮＡに、一般的に添加される。前記ポリＡテールは、一般的に、転写されたｍＲＮＡに添加されたアデニンヌクレオチドの領域（stretch）である。前記ポリＡテールは、例えば、４００個アデニンヌクレオチド以下を含むものでもある。一部具体例において、前記３’ポリＡテールの長さは、個別ｍＲＮＡの安定性において、必須エレメントでもある。
【0090】
前記組成物は、ナノ粒子として剤形化されたものでもある。前記ナノ粒子は、ｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドを細胞に伝達するためのものとして周知のものでもある。例えば、前記ナノ粒子は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する免疫反応を誘導するために使用されるワクチン、例えば、ＲＮＡワクチンに使用される周知のナノ粒子でもある。前記ナノ粒子は、リピドナノ粒子（ＬＮＰ：lipid nanoparticle）でもある。前記組成物は、リピドナノ粒子（ＬＮＰ）として剤形化されたもの、またはリピドナノ粒子（ＬＮＰ）に結合されているものでもある。前記結合は、リピドナノ粒子（ＬＮＰ）内またはその表面に結合するものを含む。例えば、前記組成物は、リピドポリ陽イオン（lipid polycation）複合体内に剤形化されたもの、または該リピドポリ陽イオン複合体に結合されているものでもある。前記リピドポリ陽イオン複合体は、陽イオン性リピドナノ粒子（cationic lipid nanoparticle）とも言う。前記ポリ陽イオンは、MC3、Lipid 319、C12-200、5A2-SC8、306Oi10、Moderna Lipid 5、Acuitas A9、SM-102、ALC-0315、Arcturus Lipid 2,2 (8,8) 4C CH3、Genevant CL1、ポリリシン、ポリオルニチン及び／またはポリアルギニンのような陽イオン性ポリペプチドを含むものでもある。また、前記組成物は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２-ジステアロイル-Ｓｎ-グリセロール-３-ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロールのようなステロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような非陽イオン性リピドを含むリピドナノ粒子に剤形化されるか、あるいは結合されてもいる。また、前記組成物は、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000）、ＡＬＣ－０１５９（2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide）、ＰＥＧ－ＤＭＡ（polyethylene glycol dimethacrylate）のようなＰＥＧリピドを含むリピドナノ粒子に剤形化されるか、あるいは結合されてもいる。
【0091】
リピドナノ粒子剤形は、陽イオン性脂質、リン脂質、コレステロールのようなステロール、ＰＥＧ脂質、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。該リピドナノ粒子剤形は、例えば、陽イオン性脂質、リン脂質、コレステロールのようなステロール、及びＰＥＧ脂質を含むものでもある。また、該リピドナノ粒子は、ＰＥＧ変形されたリピド、非陽イオン性リピド、ステロール、及びイオン化可能なリピド、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。前記リピドナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％ ＰＥＧ変形されたリピド、５～２５ｍｏｌ％非陽イオン性リピド、２５～５５ｍｏｌ％ステロール、及び２０～６０ｍｏｌ％イオン化可能なリピドを含むものでもある。前記ＰＥＧ変形されたリピドは、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）であり、該非陽イオン性リピドは、１，２-ジステアロイル-Ｓｎ-グリセロール-３-ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、該ステロールは、コレステロールであり、前記イオン化可能な陽イオン性リピドは、下記構造の化合物１でもある。
【0092】
【化1】
【0093】
前記ＰＥＧ変形されたリピドは、下記構造の化合物２（ＡＬＣ－０１５９）であり、非陽イオン性リピドは、１，２-ジステアロイル-Ｓｎ-グリセロール-３-ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、前記イオン化可能な陽イオン性リピドは、下記構造の化合物３（ＡＬＣ－０３１５）でもある。
【0094】
【化2】
【0095】
【化3】
【0096】
前記組成物は、活性成分として、前記ポリヌクレオチド、及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変異体に対する免疫反応を誘導するための組成物でもある。前記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変異体の感染症を予防するためのものでもある。
【0097】
第８態様は、第３態様のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む、前記ポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。第３態様のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。第３態様のポリヌクレオチドは、第４態様の方法によって得られたＲＮＡでもある。
【0098】
前記方法において、前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡでもある。前記宿主細胞は、個体由来の任意の細胞でもある。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。前記細胞は、例えば、幹細胞、生殖細胞または体細胞でもある。前記方法において、前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記宿主細胞は、樹枝状細胞を含む抗原提供細胞、モノサイトまたはマクロファージでもある。
【0099】
前記方法は、第３態様のポリヌクレオチドを個体に投与する段階を含むものでもある。前記投与は、非経口投与または経口投与でもある。前記投与は、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔または肺内への投与でもある。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。
【0100】
前記方法は、個体を、前記ポリペプチドに対して免疫化するものでもある。また、前記方法は、個体において、疾病を治療するものでもある。前記ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶの抗原タンパク質でもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記方法は、個体において、ＢｅｔａＣｏＶ、例えば、そのスパイクタンパク質またはその変異体、あるいはサブユニットに対して免疫反応を誘導するものでもある。前記方法は、個体において、ＢｅｔａＣｏＶ、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせの感染症を予防するものでもある。
【0101】
前述の第３態様～第８態様において、前記ポリヌクレオチドは、５’末端キャップを含むものでもある。前記５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＩｍｐＮｐ、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧでもある。
【0102】
前述の第３態様～第７態様において、前記ポリヌクレオチドは、１以上の化学的変形を有するヌクレオチドを含むものでもある。前記変形は、前記ヌクレオチドにわたり、均一に（uniformly）なされたものでもある。本明細書において、「化学的変形（chemical modification）」及び「化学的に変形された（chemically modified）」は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）のリボヌクレオチドまたはジオキシヌクレオチドに対するそれらの位置、パターン、百分率または母集団（population）のうち１以上における変形を示す。一般的に、それら用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップモイエティにおいて、リボヌクレオチド変形を示さない。
【0103】
ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含むＲＮＡは、１以上の他の変形を含むものでもある。該ポリヌクレオチドの特定領域は、１以上のヌクレオシドまたはヌクレオチド変形を含むものでもある。変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された分解を示しうる。また、変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された免疫原性（例えば、低減された先天反応（innate response））を示しうる。
【0104】
変形されたシトシンを有するヌクレオシドは、ａｃ４Ｃ（N4-acetyl-cytidine ）、ｍ５Ｃ（5-methyl-cytidine ）、５－ハロシチジン（5-halo-cytidine）（例：５－ヨードシチジン（5-iodo-cytidine））、ｈｍ５Ｃ（5-hydroxymethyl-cytidine）、１－メチル－シュードイソシチジン（1-methyl-pseudoisocytidine）、ｓ２Ｃ（2-thio-cytidine）、２－チオ－５－メチル－シチジン（2-thio-5-methyl-cytidine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0105】
変形されたアデニンを有するヌクレオシドは、７－デアザ－アデニン（7-deaza-adenine）、ｍ１Ａ（1-methyl-adenosine）、ｍ２Ａ（2-methyl-adenine）、ｍ６Ａ（N6-methyl-adenosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0106】
変形されたグアニンを有するヌクレオ塩基またはヌクレオシドは、Ｉ（inosine）、ｍ１Ｉ（1-methyl-inosine）、ｉｍＧ（wyosine）、ｍｉｍＧ（methylwyosine）、７－デアザ－グアノシン（7-deaza-guanosine）、ｐｒｅＱ０（7-cyano-7-deaza-guanosine）、ｐｒｅＱ１（7-aminomethyl-7-deaza-guanosine）、ｍ７Ｇ（7-methyl-guanosine）、ｍ１Ｇ（1-methyl-guanosine）、８－オキソ－グアノシン（8-oxo-guanosine）、７－メチル－８－オキソ－グアノシン（7-methyl-8-oxo-guanosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。
【0107】
前記化学的変形を有するヌクレオチドは、シュードウリジン（pseudouridine）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（N1-methylpseudouridine）、Ｎ１－エチルシュードウリジン（N1-ethylpseudouridine）、２－チオウリジン（2-thiouridine）、４’－チオウリジン（4’-thiouridine）、５－メチルシトシン（5-methylcytosine）、５－メチルウリジン（5-methyluridine）、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン（2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン（2-thio-1-methyl-pseudouridine）、２－チオ－５－アザ－ウリジン（2-thio-5-aza-uridine）、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン（2-thio-dihydropseudouridine）、２－チオ－ジヒドロウリジン（2-thio-dihydrouridine, ）、２－チオ－シュードウリジン（2-thio-pseudouridine）、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン（4-methoxy-2-thio-pseudouridine）、４－メトキシ－シュードウリジン（4-methoxy-pseudouridine）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン（4-thio-1-methyl-pseudouridine）、４－チオ－シュードウリジン（4-thio-pseudouridine）、５－アザ－ウリジン（5-aza-uridine）、ジヒドロシュードウリジン（dihydropseudouridine）、５－メトキシウリジン（5-methoxyuridine）、２’－Ｏ－メチルウリジン（2’-O-methyluridine）、またはそれらの組み合わせでもある。前記化学的変形は、ウラシルの５位置にありうる。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－メチルシュードウリジン（N1-methylpseudouridine）への変形でもある。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－エチルシュードウリジン（N1-ethylpseudouridine）への変形でもある。
【発明の効果】
【0108】
一態様による非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、非天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）または天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを安定化させ、それにより、翻訳効率を上昇させるのに使用されうる。
【0109】
他の態様によるＲＮＡは、相対的に安定して翻訳効率が高く、ＲＮＡを効率的に翻訳するのに使用されうる。
【0110】
他の態様による分離されたポリヌクレオチドは、相対的に安定して翻訳効率が高く、ＲＮＡを効率的に翻訳するのに使用されうる。
【0111】
他の態様によるＲＮＡを得る方法によれば、ＲＮＡを効率的に得ることができる。
【0112】
他の態様によるポリペプチドを得る方法によれば、ポリペプチドを効率的に得ることができる。
【0113】
他の態様による免疫原性組成物は、個体を効率的に免疫化するのに使用されうる。
【0114】
他の態様によるポリヌクレオチドを利用する方法は、個体を効率的に免疫化するのに使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【0115】
【図1】作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするｍＲＮＡを生産するためのベクターを示した図である。
【図2A】生産されたｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図である。
【図2B】生産されたｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図である。
【図2C】生産されたｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図である。
【図3】生産されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが細胞に導入される場合、スパイクタンパク質が発現されることをウェスタンブロット（Western blot）を介して確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0116】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【0117】
実施例１：ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列
ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を設計した。
ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を設計した。
【0118】
その結果、配列番号１～１２のヌクレオチド配列を有する１２個の非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を得た。配列番号２のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列において、安定したヘアピン構造を形成する配列（ＧＵＣＣＣＵＣＵＧＡ（配列番号１３））の位置を前方に移動させた配列である。配列番号３のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列において、グアニン一部をウリジンで置換した配列である。
【0119】
配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列において、一部を、連続されたウリジンで置換した配列である。配列番号５，６，７及び８のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１のヌクレオチド配列において、一部を、アデニンが豊富な配列で置換した配列である。配列番号９，１０及び１１のヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列において、一部を、ランダムに他のヌクレオチドで置換した配列である。
【0120】
配列番号１２のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列において、グアニンを追加した配列である。
【0121】
配列番号１～１２のヌクレオチド配列において、各ヌクレオチドは、天然型から変形されたものでもある。例えば、前記配列において、１以上のＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されうる。前記配列において、全てのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されうる。
【0122】
実施例２：ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子発現を増大させる３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列
ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を設計した。
ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を設計した。
【0123】
その結果、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列を有する７個の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を得た。
【0124】
配列番号１４のヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ結合予測部位を含まない配列でもある。配列番号１５及び１８のヌクレオチド配列は、ＣＵリッチエレメント（ＵＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＵＣＵＣＣ（配列番号２１））を含むものでもある。
【0125】
配列番号１６及び１９のヌクレオチド配列は、抗原Ｒ結合エレメント（ＵＵＧＧＵＵＵ）を含むものでもある。
【0126】
配列番号１４～２０のヌクレオチド配列において、各ヌクレオチドは、天然型から変形されたものでもある。例えば、前記配列において、１以上のＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されうる。前記配列において、全てのＵは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されうる。
【0127】
実施例３：非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を使用したテンプレートベクター作製
実施例１及び実施例２で得られた配列番号１～１２のヌクレオチド配列を含む非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列をコーディングする配列のうち１以上、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列を含む３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列をコーディングする配列のうち１以上、及びポリペプチドをコーディングする遺伝子を作動可能に連結して製造されたベクターを製造した。
実施例１及び実施例２で得られた配列番号１～１２のヌクレオチド配列を含む非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列をコーディングする配列のうち１以上、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列を含む３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列をコーディングする配列のうち１以上、及びポリペプチドをコーディングする遺伝子を作動可能に連結して製造されたベクターを製造した。
【0128】
具体的には、前記ベクターは、プロモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリＡが連結されたものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうち１以上を使用した。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列のうち１以上を使用した。配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列は、それぞれ５’末端に、ＸｈｏＩ酵素認識配列を含み、３’末端に、ＮｈｅＩ酵素認識配列を含む配列番号３４～４０のヌクレオチド配列に該当する配列である。
【0129】
前記ポリＡをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列を有する。前記ベクターは、また大腸菌複製原点ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ及び選択マーカー遺伝子を含むものでもある。前記プロモーターは、Ｔ７プロモーターでもある。前記選択マーカーは、カナマイシン抵抗性酵素でもある。
【0130】
選抜された非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び／または３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコーディングする配列と連結された場合、前記ポリペプチド生産が増大するだけではなく、非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列、ポリペプチドをコーディングする配列、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡの安定性が顕著に増大した。前記ポリペプチドは、配列番号４２～４８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはそのアルファ（α）変異体、ベータ（β）変異体、ガンマ（γ）変異体、デルタ（δ）変異体、エプシロン（ε）変異体及びオミクロン（ο）変異体でもある。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはそのアルファ（α）変異体、ベータ（β）変異体、ガンマ（γ）変異体、デルタ（δ）変異体、エプシロン（ε）変異体及びオミクロン（ο）変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列を有するものであり、そのｍＲＮＡは、それぞれ配列番号５６～６２のヌクレオチド配列を有するものでもある。前記ポリペプチド、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするｍＲＮＡのクローニング過程は、次の通りである。
【0131】
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及びその変異体ｍＲＮＡ生産のためのテンプレートベクター作製
設計された１２個５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチドのうち一つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列のうち一つ、７個３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列のうち一つ、及びポリＡを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体ｍＲＮＡ、並びに／またはそのタンパク質産物の生産用ベクターを作製し、該ベクターを微生物細胞に導入して得られた微生物細胞を培養し、クローニングベクターを生産した。生産されたベクターをテンプレートにしたインビトロ転写を介し、ｍＲＮＡを生産した。前記変異体は、アルファ（α）変異体、ベータ（β）変異体、ガンマ（γ）変異体、デルタ（δ）変異体、エプシロン（ε）変異体及びオミクロン（ο）変異体を含む。
設計された１２個５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチドのうち一つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列のうち一つ、７個３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列のうち一つ、及びポリＡを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体ｍＲＮＡ、並びに／またはそのタンパク質産物の生産用ベクターを作製し、該ベクターを微生物細胞に導入して得られた微生物細胞を培養し、クローニングベクターを生産した。生産されたベクターをテンプレートにしたインビトロ転写を介し、ｍＲＮＡを生産した。前記変異体は、アルファ（α）変異体、ベータ（β）変異体、ガンマ（γ）変異体、デルタ（δ）変異体、エプシロン（ε）変異体及びオミクロン（ο）変異体を含む。
【0132】
具体的には、まず、ｐＵＣ５７－ＡｍｐＲベクター（Addgene社）から、抗生物質抵抗遺伝子をカナマイシン抵抗性遺伝子で置換されたベクターｐＵＣ５７－ＫａｎＲを作製した。作製されたｐＵＣ５７－ＫａｎＲベクターを、制限酵素ＨｉｎｄIII及び制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して切断した後、切断されたベクターを、合成作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするポリヌクレオチドとリガーゼ（ligase）とを使用して連結し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列が挿入されたｐＵＣ５７－ＫａｎＲベクターを得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列を有する。挿入されたスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列とを含んでおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のヌクレオチド配列の５’から８７９番目ヌクレオチドには、ＢａｍＨＩ制限酵素認識配列が存在し、追って、該認識配列を切断し、前記設計された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列を導入するのに使用した。
【0133】
（２）５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列との連結
前記作製されたテンプレートベクターの５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を、配列番号１～１２の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列で置換するために、当該配列を含むプライマー、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＢａｍＨＩ制限酵素認識部位配列を含むプライマーをプライマーセットにし、前記テンプレートベクターをテンプレートにしたＰＣＲ反応を介し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を得た。５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を、さらに安定して確保するために、１つの配列当たり、ＰＣＲ反応を２段階にわたって進めた。一次プライマーを利用し、ＰＣＲを進めた後、得られた遺伝子をテンプレートにし、二次プライマーを使用し、２回目ＰＣＲを遂行し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を得た。そこに使用されたプライマー配列は、配列番号７７～１００のポリヌクレオチドであった。
前記作製されたテンプレートベクターの５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を、配列番号１～１２の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列で置換するために、当該配列を含むプライマー、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＢａｍＨＩ制限酵素認識部位配列を含むプライマーをプライマーセットにし、前記テンプレートベクターをテンプレートにしたＰＣＲ反応を介し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を得た。５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を、さらに安定して確保するために、１つの配列当たり、ＰＣＲ反応を２段階にわたって進めた。一次プライマーを利用し、ＰＣＲを進めた後、得られた遺伝子をテンプレートにし、二次プライマーを使用し、２回目ＰＣＲを遂行し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を得た。そこに使用されたプライマー配列は、配列番号７７～１００のポリヌクレオチドであった。
【0134】
ＰＣＲ反応を介して確保された前記１２個５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片それぞれと、（１）で作製されたテンプレートベクターとを、制限酵素ＨｉｎｄIIIと制限酵素ＢａｍＨＩとで処理して切断し、それら切断された配列を、リガーゼを使用して連結した。その結果、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、配列番号１～１２のそれぞれ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列で置換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするベクターを作製した。
【0135】
（３）３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の連結
（２）で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、配列番号２２～３３のそれぞれ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列で置換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするベクターにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列の３’末端に、配列番号１０９～１１５のそれぞれ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを連結した。配列番号１０９～１１５のそれぞれヌクレオチド配列は、各５’末端に、ＸｈｏＩ酵素認識配列を含み、３’末端に、ＮｈｅＩ酵素認識配列を含む配列番号３４～４０のヌクレオチド配列に該当する配列である。
（２）で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、配列番号２２～３３のそれぞれ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列で置換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするベクターにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列の３’末端に、配列番号１０９～１１５のそれぞれ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを連結した。配列番号１０９～１１５のそれぞれヌクレオチド配列は、各５’末端に、ＸｈｏＩ酵素認識配列を含み、３’末端に、ＮｈｅＩ酵素認識配列を含む配列番号３４～４０のヌクレオチド配列に該当する配列である。
【0136】
具体的には、配列番号１０９～１１５のそれぞれ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、合成を介して確保した。配列番号１０２～１０８の配列は、配列番号１０９～１１５の配列に対応するＲＮＡ配列である。
【0137】
確保された配列と、（２）で作製された前記テンプレートベクターとを、ＸｈｏＩ制限酵素及びＮｈｅＩ制限酵素で切断した後、その産物を、ＤＮＡリガーゼを利用して連結した。その結果、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の構造を含むベクターを作製した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列は、配列番号２２～３３のそれぞれ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列を示す。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列は、配列番号１０９～１１５のそれぞれ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列は、配列番号４２～４８のそれぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体のアミノ酸配列を示す。
【0138】
（４）連続されたアデニンヌクレオチドの連結
（３）で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の構造を含むベクターにおいて、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の３’末端部分に連続されたアデニンヌクレオチド配列を連結した。
（３）で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の構造を含むベクターにおいて、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の３’末端部分に連続されたアデニンヌクレオチド配列を連結した。
【0139】
配列番号４１の連続されたアデニレート配列において、５’末端と３’末端とに、それぞれＮｈｅＩ配列とＥｃｏＲＩ配列とが追加されたポリアデニレートを、合成を介して得た。確保された配列とテンプレートベクターとを、ＮｈｅＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素でそれぞれ切断し、切断された産物をＤＮＡリガーゼを使用して連結した。
【0140】
その結果、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ポリＡの構造を含むベクターを作製した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列については、前述の通りである。また、ポリＡは、配列番号４１のヌクレオチド配列を有する。
【0141】
図１は、作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするｍＲＮＡを生産するためのベクターを示した図面である。
【0142】
実施例４：非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を使用した遺伝子産物の生産
実施例３で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ポリＡの構造を含むベクターを大腸菌に導入して形質転換された大腸菌を得て、得られた大腸菌を培養し、ｍＲＮＡのテンプレートになるプラスミドＤＮＡを含んでいる大腸菌を増殖させた。増殖された大腸菌は、高速遠心分離を介して培養液と分離された後、既存に周知のアルカリ抽出法を使用し、細胞由来テンプレートＤＮＡを確保した。確保されたテンプレートＤＮＡは、ポリＡ末端に位置した制限酵素認識配列を利用して線形化させた。線形化された細胞由来テンプレートＤＮＡを利用し、インビトロ転写を介し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）－ポリＡのヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを生産した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、ポリＡ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列については、前述の通りである。
実施例３で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ポリＡの構造を含むベクターを大腸菌に導入して形質転換された大腸菌を得て、得られた大腸菌を培養し、ｍＲＮＡのテンプレートになるプラスミドＤＮＡを含んでいる大腸菌を増殖させた。増殖された大腸菌は、高速遠心分離を介して培養液と分離された後、既存に周知のアルカリ抽出法を使用し、細胞由来テンプレートＤＮＡを確保した。確保されたテンプレートＤＮＡは、ポリＡ末端に位置した制限酵素認識配列を利用して線形化させた。線形化された細胞由来テンプレートＤＮＡを利用し、インビトロ転写を介し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）－ポリＡのヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを生産した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、ポリＡ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体をコーディングする配列については、前述の通りである。
【0143】
具体的には、線形化されたプラスミドＤＮＡ １０ｎｇ／μｌ、CleanCap（登録商標） Reagent AG ４ｍＭ、ＮＴＰ ５ｍＭ、Ｎ１－メチルシュードウリジン５ｍＭ、マグネシウムイオン塩２０ｍＭ、ＤＴＴ １０ｍＭ、無機ピロリン酸分解酵素（inorganic ＰＰａｓｅ（pyrophosphatase））０．０１Ｕ／μｌ、及びＲＮＡ分解酵素抑制剤１Ｕ／μｌ含有水性溶液に、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素５Ｕ／μｌを添加して得られた反応混合物を、３７℃で１時間以上インキュベーションし、インビトロ転写反応が進められるようにした。CleanCap（登録商標） Reagent AGは、ｍＲＮＡ転写との同時キャッピング（co-transcriptional capping）のための試薬であり、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧキャップ構造が形成されるようにする。反応物をＤＮＡ分解酵素で処理し、Monarch（登録商標） RNA Cleanup Kit（New England Biolabs社）を介してＲＮＡを精製した。その結果、配列番号６３～７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを生産した。それらｍＲＮＡに含まれた５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、及びポリＡのヌクレオチド配列構成は、以下の表１の通りである。
【0144】
【表1】
【0145】
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、生産されたｍＲＮＡにおいて、配列番号６７，７０，及び７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図面である。図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃにおいて、最大のピーク（main）が、それぞれ配列番号６７，７０及び７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを示す。図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示されているように、配列番号６７，７０及び７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡの純度は、それぞれ８３．０％、８１．９％及び８３．１％であった。
【0146】
実施例５：遺伝子産物ｍＲＮＡがローディングされた脂質ナノ粒子の製造
イオン化可能な脂質として、ＡＬＣ－０３１５、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)）（BLDpharm Ltd.（中国））、リン脂質として、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ（distearoylphosphatidylcholine））（Avanti（米国））、コレステロールとして、Synthechol（Sigma（米国））、脂質ＰＥＧ接合体として、ＡＬＣ－０１５９（2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide）（SINOPEG（中国））を、４６．３：９．４：４２．７：１．６のモル比でエタノールに溶かし、脂質複合体溶液を準備した。
イオン化可能な脂質として、ＡＬＣ－０３１５、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)）（BLDpharm Ltd.（中国））、リン脂質として、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ（distearoylphosphatidylcholine））（Avanti（米国））、コレステロールとして、Synthechol（Sigma（米国））、脂質ＰＥＧ接合体として、ＡＬＣ－０１５９（2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide）（SINOPEG（中国））を、４６．３：９．４：４２．７：１．６のモル比でエタノールに溶かし、脂質複合体溶液を準備した。
【0147】
実施例４で作られたｍＲＮＡ ０．３ｍｇを、１００ｍＭ酢酸ナトリウムに、０．０８ｍｇ／ｍＬになるように希釈させ、ｍＲＮＡ含有溶液を得た。得られたｍＲＮＡ溶液と、前記脂質複合体溶液とを、ｍＲＮＡと脂質との複合体の重量比１：２５．４になるように、５：１の体積比で、マイクロ流体装置（microfluidic device）（Ignite Nanoassemblr（ＰＮＩ（カナダ）））の各マイクロチャネルに、１２ｍＬ／分の流速で注入させ、ｍＲＮＡ溶液と前記脂質複合体溶液とを混合させた。前記混合により、脂質複合体溶液において、エタノールは、臨界エタノール濃度（critical ethanol concentration）に希釈され、ｍＲＮＡローディングされた脂質ナノ粒子が形成されることになる。該マイクロ流体装置は、２個マイクロチャネルが収束されて形成されたマイクロチャネルを含み、１つのマイクロチャネルにｍＲＮＡ溶液を流し、他のマイクロチャネルに脂質複合体溶液を流し、２つの溶液が流れながら混合されるようにする装置である。該マイクロ流体装置のマイクロチャネルを介して溶出された混合物は、ｍＲＮＡがローディングされた脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｍＲＮＡ loaded ＬＮＰ（lipid nanoparticle））である。
【0148】
製造されたｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）を１０，０００Ｄａの遠心分離フィルタに積載し、０．４５ｍＭ塩化カリウム、０．２４ｍＭ一塩基性リン酸カリウム、２０．５３ｍＭ塩化ナトリウム、１．３１ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム及び２％スクロース（ｐＨ６．９～７．９）含有のバッファでバッファ交換をさせた。その後、前記バッファにおいて、ｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）溶液を、０．２μｍフィルタで濾過し、最終ｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）を製造した。
【0149】
実施例６：脂質ナノ粒子の特性確認
（１）脂質ナノ粒子のカプセル化効率の確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）（以下、「ｍＲＮＡ－ＬＮＰ」ともいう）のローディング効率またはカプセル化効率（encapsulation efficiency（％））は、Quant-iT RiboGreen RNA Kit（Invitrogen（米国））を、製造メーカー指針によって使用して確認した。具体的には、前記キット中のTriton Ｘと、ｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）とを混合し、リピドナノ粒子（ＬＮＰ）を変性させ、ｍＲＮＡが放出されるようにした。前記混合溶液を、Ribogreen試薬が含有されたウェルに添加し、Ribogreen試薬から放出される蛍光を検出し、放出されたｍＲＮＡを検出した。カプセル化効率は、下記数式によって計算した。
（１）脂質ナノ粒子のカプセル化効率の確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）（以下、「ｍＲＮＡ－ＬＮＰ」ともいう）のローディング効率またはカプセル化効率（encapsulation efficiency（％））は、Quant-iT RiboGreen RNA Kit（Invitrogen（米国））を、製造メーカー指針によって使用して確認した。具体的には、前記キット中のTriton Ｘと、ｍＲＮＡローディングされたリピドナノ粒子（ＬＮＰ）とを混合し、リピドナノ粒子（ＬＮＰ）を変性させ、ｍＲＮＡが放出されるようにした。前記混合溶液を、Ribogreen試薬が含有されたウェルに添加し、Ribogreen試薬から放出される蛍光を検出し、放出されたｍＲＮＡを検出した。カプセル化効率は、下記数式によって計算した。
【0150】
【数1】
【0151】
【表2】
【0152】
表２に示されているように、野生型Ｓ、デルタ（δ）Ｓ及びオミクロン（ο）Ｓ ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、高いカプセル化効率でもって、ｍＲＮＡをローディングしていることを確認した。
【0153】
（２）脂質ナノ粒子の大きさ確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒子サイズと多分散指数（ＰＤＩ：polydispersity index）とを、Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments（英国））を利用して確認した。Zetasizerは、動的光散乱技術を利用し、粒子サイズと粒度分布とを定める装置である。表３は、粒子サイズと多分散指数との測定結果を示した表である。
実施例５で製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒子サイズと多分散指数（ＰＤＩ：polydispersity index）とを、Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments（英国））を利用して確認した。Zetasizerは、動的光散乱技術を利用し、粒子サイズと粒度分布とを定める装置である。表３は、粒子サイズと多分散指数との測定結果を示した表である。
【0154】
【表3】
【0155】
表３に示されているように、野生型Ｓ，デルタ（δ）Ｓ及びオミクロン（ο）Ｓ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒子サイズ、は８０ｎｍ～１００ｎｍの範囲であった。
【0156】
実施例７：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現の確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡ含有脂質ナノ粒子を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に伝達し、ｍＲＮＡ発現を確認した。そのために、以下のように、試験管内（in vitro）実験を進めた。
実施例５で製造されたｍＲＮＡ含有脂質ナノ粒子を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に伝達し、ｍＲＮＡ発現を確認した。そのために、以下のように、試験管内（in vitro）実験を進めた。
【0157】
６ウェルプレートに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ｘ１０５細胞／２ｍＬ／ウェルでシーディング（seeding）した後、２４時間後、脂質ナノ粒子それぞれを、０．５μｇあるいは２μｇを添加し、２４時間培養した。該培養は、培地内において、３７℃で遂った。培養終了後、破裂バッファ（lysis buffer）、Ｍ－ＰＥＲ（商標）（mammalian protein extraction reagent）（Cat No. 78501（Thermo Scientific（商標）））１６０μｌ／ウェルをウェルに添加し、細胞を破裂させ、タンパク質を抽出した後、Pierce（商標）BCA Protein Assay Kit（Cat No. 23225（Thermo Scientific（商標）））を使用し、ＢＣＡタンパク質定量を実施した。得られた試料を、破裂バッファ及び５ｘ還元染料（reducing dye）（１０％ ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、０．５％２－メルカプトエタノール、２５０ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８））に希釈し、タンパク質濃度を同一にした。得られた希釈された試料につき、Anti-SARS-CoV-2 Spike S1 Subunit monoclonal antibody（Cat No. MAB105403（R&D systems）)を利用し、ウェスタンブロット（Western blot）実験を行った。
【0158】
図３は、生産されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが細胞に導入される場合、スパイクタンパク質が発現することを、ウェスタンブロットを介して確認した結果を示す図面である。図３に示されているように、Ｓタンパク質は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ処理濃度上昇によって発現が増大した。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0158】
図３は、生産されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが細胞に導入される場合、スパイクタンパク質が発現することを、ウェスタンブロットを介して確認した結果を示す図面である。図３に示されているように、Ｓタンパク質は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ処理濃度上昇によって発現が増大した。
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチドであり、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された上流プロモーター領域ヌクレオチド配列、前記プロモーターに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものであり、
前記転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
＜２＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜４＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜５＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜６＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものを含み、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜７＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列であるものを含み、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチドであるものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜８＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
＜９＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列をさらに含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１０＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１１＞
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列をコーディングする、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１２＞
発現構造体またはベクターである、＜１＞～＜１１＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
＜１３＞
テンプレートとして、＜１＞～＜１２＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られる、ＲＮＡ。
＜１４＞
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、
前記ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドであり、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されており、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の下流において、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
＜１５＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１６＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、＜１５＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１７＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１８＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、＜１７＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１９＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２０＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列によってなるものを含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってなるものを含む、＜１９＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２１＞
前記ポリヌクレオチドのうち１以上のＵが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものを含む、＜２０＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２２＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものを含む、＜２０＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２３＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２４＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２５＞
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２６＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２７＞
５’末端は、５’キャップ構造を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２８＞
１以上の変形されたヌクレオチドを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２９＞
前記変形されたヌクレオチドは、Ｕの代わりに、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）を含む、＜２８＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３０＞
＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法。
＜３１＞
＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写体を生産する段階を含む、＜３０＞に記載の方法。
＜３２＞
＜３０＞に記載の方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を得る方法。
＜３３＞
＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を生産する段階を含む、＜３２＞に記載の方法。
＜３４＞
活性成分として、＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を個体に伝達するための組成物。
＜３５＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するためのものである、＜３４＞に記載の組成物。
＜３６＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜３４＞に記載の組成物。
＜３７＞
活性成分として、＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための組成物。
＜３８＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜３７＞に記載の組成物。
＜３９＞
活性成分として、＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための組成物。
＜４０＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜３９＞に記載の組成物。
＜４１＞
＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む前記ポリヌクレオチドを利用する、方法。
＜４２＞
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記宿主細胞は、樹枝状細胞を含む抗原提供細胞、モノサイトまたはマクロファージである、＜４１＞に記載の方法。
＜４３＞
＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを個体に投与する段階を含む、＜４１＞に記載の方法。
＜４４＞
前記個体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体に対して免疫化する、＜４３＞に記載の方法。
＜４５＞
前記個体において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜４３＞に記載の方法。
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチドであり、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された上流プロモーター領域ヌクレオチド配列、前記プロモーターに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものであり、
前記転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
＜２＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜４＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜５＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜６＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものを含み、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜７＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列であるものを含み、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチドであるものを含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜８＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
＜９＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列をさらに含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１０＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１１＞
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列をコーディングする、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１２＞
発現構造体またはベクターである、＜１＞～＜１１＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
＜１３＞
テンプレートとして、＜１＞～＜１２＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られる、ＲＮＡ。
＜１４＞
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、
前記ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドであり、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されており、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の下流において、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
＜１５＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１６＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、＜１５＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１７＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１８＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、＜１７＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１９＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列によってなる群のうちから選択されたものを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２０＞
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列によってなるものを含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってなるものを含む、＜１９＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２１＞
前記ポリヌクレオチドのうち１以上のＵが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）で置換されたものを含む、＜２０＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２２＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものを含む、＜２０＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２３＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２４＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２５＞
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２６＞
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２７＞
５’末端は、５’キャップ構造を有する、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２８＞
１以上の変形されたヌクレオチドを含む、＜１４＞に記載のポリヌクレオチド。
＜２９＞
前記変形されたヌクレオチドは、Ｕの代わりに、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）を含む、＜２８＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３０＞
＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法。
＜３１＞
＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写体を生産する段階を含む、＜３０＞に記載の方法。
＜３２＞
＜３０＞に記載の方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を得る方法。
＜３３＞
＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を生産する段階を含む、＜３２＞に記載の方法。
＜３４＞
活性成分として、＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を個体に伝達するための組成物。
＜３５＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するためのものである、＜３４＞に記載の組成物。
＜３６＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜３４＞に記載の組成物。
＜３７＞
活性成分として、＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための組成物。
＜３８＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜３７＞に記載の組成物。
＜３９＞
活性成分として、＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための組成物。
＜４０＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜３９＞に記載の組成物。
＜４１＞
＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む前記ポリヌクレオチドを利用する、方法。
＜４２＞
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記宿主細胞は、樹枝状細胞を含む抗原提供細胞、モノサイトまたはマクロファージである、＜４１＞に記載の方法。
＜４３＞
＜１４＞～＜２９＞のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを個体に投与する段階を含む、＜４１＞に記載の方法。
＜４４＞
前記個体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体に対して免疫化する、＜４３＞に記載の方法。
＜４５＞
前記個体において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、＜４３＞に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、転写可能なヌクレオチド配列、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）には、上流プロモーター領域ヌクレオチド配列が作動可能に連結されており、
前記転写可能なヌクレオチド配列は、前記上流プロモーター領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、前記転写可能なヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の下流側で、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）には、下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号ヌクレオチド配列が作動可能に連結されており、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の上流側で、前記転写可能なヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
前記転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含み、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列をコーディングする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
発現構造体またはベクターである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
非天然５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、
前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列の下流側で、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されており、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の下流側で、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４２のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列を含み、
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１～１２のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列、及び配列番号１０２～１０８のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体は、配列番号４２～４８のアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号５６～６２のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列に作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
５’末端は、５’キャップ構造を有する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
１以上の変形されたヌクレオチドを含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項19】
前記変形されたヌクレオチドは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（N1-methyl-pseudouridine）を含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項20】
活性成分として、請求項８～１９のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質またはその変異体を個体に伝達するための組成物。
【請求項21】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するためのものである、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防するためのものである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
さらに脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項２０に記載の組成物。
【国際調査報告】