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特表2025-501810フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20250117BHJP
B09C 1/10 20060101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
C12N1/20 F
B09C1/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565131
(86)(22)【出願日】2023-03-20
(85)【翻訳文提出日】2023-10-22
(86)【国際出願番号】 CN2023082500
(87)【国際公開番号】W WO2024130870
(87)【国際公開日】2024-06-27
(31)【優先権主張番号】202211669461.9
(32)【優先日】2022-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507255592
【氏名又は名称】南京▲農業▼大学
(74)【代理人】
【識別番号】100216471
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬戸 麻希
(72)【発明者】
【氏名】高彦征
(72)【発明者】
【氏名】王建
(72)【発明者】
【氏名】陸▲うぇん▼逸
(72)【発明者】
【氏名】張帥
【テーマコード（参考）】
4B065
4D004
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AC14
4B065BD30
4B065CA54
4D004AA41
4D004AB05
4D004CA18
4D004CC07
(57)【要約】
本発明は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株およびその用途を提供し
、環境汚染物質の生物学的処理の技術分野に属する。グルタミン酸バチルスＡ４株は中国
典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その保蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２
１８５０である。グルタミン酸バチルスＡ４株は、フタル酸エステル分解用の製剤の調製
に使用され、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジブチルテレフタレー
ト、ブチルベンジルフタレートを効率的に分解する能力を有する。
【選択図】図２
、環境汚染物質の生物学的処理の技術分野に属する。グルタミン酸バチルスＡ４株は中国
典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その保蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２
１８５０である。グルタミン酸バチルスＡ４株は、フタル酸エステル分解用の製剤の調製
に使用され、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジブチルテレフタレー
ト、ブチルベンジルフタレートを効率的に分解する能力を有する。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その保蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２１８５０である、ことを特徴とするフタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ
４株。
【請求項2】
フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートである、ことを特徴とする請求項１に記載のフタ
ル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株。
【請求項3】
請求項１に記載のフタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株の用途であって、フタル酸エステル分解用の製剤の調製に使用される、ことを特徴とする用途。
【請求項4】
フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレートおよび／またはジエチルテレフタレートおよび／またはジブチルテレフタレートおよび／またはブチルベンジルフタレートである、
ことを特徴とする請求項３に記載の用途。
【請求項5】
前記製剤の調製プロセスは、以下のとおりであり：ＳＢ１、５００μＬのグルタミン酸バチルスＡ４株を１００ｍｌのＬＢ培地に移し、３０
℃、１５０ｒｐｍ環境下で２４ｈ培養した後８０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離して培養
菌液を得て、
ＳＢ２、前記菌液をＭＳＭで２回洗浄した後細菌のＯＤ６００値を１．０に調整して製剤
を得て、４℃環境温度下で一時保存する、ことを特徴とする請求項４に記載の用途。
【請求項6】
前記製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された媒体に投入することである、ことを特徴とする請求項５に記載の用途。
【請求項7】
前記媒体は、水、土壌である、ことを特徴とする請求項５に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環境汚染物質生物学的処理の技術分野に関し、具体的に、フタル酸分解能を有
するグルタミン酸バチルスＡ４株およびその用途に関する。
するグルタミン酸バチルスＡ４株およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
フタル酸エステル（Ｐｈｔｈａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒｓ、ＰＡＥｓ）は、最も広
く使用されている可塑剤の１つであり、内分泌撹乱作用を有する環境汚染物質として最も
広く研究されているものの一つであり、フタル酸エステルはプラスチック、塗料、化粧品
などの産業で広く使用されている。２０１８年、プラスチック製品の世界生産量は約３億
５９００万トン増加し、そのうち３０％は中国からのものである。大量のプラスチック廃
棄物のうち、リサイクルされるのはわずか９％で、７９％が埋め立て地や環境に直接投棄
され、プラスチック破片の急速な蓄積につながっている。マイクロプラスチック（ＭＰｓ
）には、可塑剤のような有害な添加物が大量に含まれている。その大きな比表面積と強い
疎水性により、重金属、抗生物質、農薬、その他の残留性有機汚染物質がマイクロプラス
チックの表面に吸着し、土壌を危険にさらし、人間の健康に悪影響を及ぼす。マイクロプ
ラスチックの増加に伴い、これらの汚染物質は土壌微生物の活動や栄養循環といった生態
系機能に影響を与える。ＰＡＥｓはプラスチック製品の柔軟性を向上させる添加剤であり
、一般的に使用される可塑剤である。しかし、ＰＡＥｓには発がん性、催奇形性、変異原
性の危険性がある。環境中に放出された場合、ＰＡＥｓは土壌中の微生物の活動を阻害し
、例えば細菌群集を妨害し、ウレアーゼ活性を低下させ、濃縮によって食物連鎖に入り込
み、さらに人間の健康を脅かす。そのため、ＰＡＥｓは多くの国で規制有機汚染物質に分
類されている。ＰＡＥｓが生態系や人間の健康に及ぼす影響は注目されており、環境科学
や環境生態学のホットトピックとなっている。
自然環境におけるＰＡＥｓの分解過程は主に加水分解、光分解、微生物分解であるが、自
然環境では加水分解と光分解は弱く、分解速度も遅い。現在、ＤＭＰ、ＤＥＨＰ、ＤＢＰ
などのフタル酸系汚染物質を環境中で分解できる菌株が分離されている。
しかし、報告されている分解菌のほとんどは、１種類のフタル酸エステルに対してのみ効
率的な分解能力を有しており、短鎖ＰＡＥｓ（例えばＤＭＰ、ＤＥＰなど）と長鎖ＰＡＥ
ｓ（例えばＤＢＰ、ＢＢＰなど）の両方を効率的に分解できる分解菌の生殖資源はほとん
ど見つかっていない。
く使用されている可塑剤の１つであり、内分泌撹乱作用を有する環境汚染物質として最も
広く研究されているものの一つであり、フタル酸エステルはプラスチック、塗料、化粧品
などの産業で広く使用されている。２０１８年、プラスチック製品の世界生産量は約３億
５９００万トン増加し、そのうち３０％は中国からのものである。大量のプラスチック廃
棄物のうち、リサイクルされるのはわずか９％で、７９％が埋め立て地や環境に直接投棄
され、プラスチック破片の急速な蓄積につながっている。マイクロプラスチック（ＭＰｓ
）には、可塑剤のような有害な添加物が大量に含まれている。その大きな比表面積と強い
疎水性により、重金属、抗生物質、農薬、その他の残留性有機汚染物質がマイクロプラス
チックの表面に吸着し、土壌を危険にさらし、人間の健康に悪影響を及ぼす。マイクロプ
ラスチックの増加に伴い、これらの汚染物質は土壌微生物の活動や栄養循環といった生態
系機能に影響を与える。ＰＡＥｓはプラスチック製品の柔軟性を向上させる添加剤であり
、一般的に使用される可塑剤である。しかし、ＰＡＥｓには発がん性、催奇形性、変異原
性の危険性がある。環境中に放出された場合、ＰＡＥｓは土壌中の微生物の活動を阻害し
、例えば細菌群集を妨害し、ウレアーゼ活性を低下させ、濃縮によって食物連鎖に入り込
み、さらに人間の健康を脅かす。そのため、ＰＡＥｓは多くの国で規制有機汚染物質に分
類されている。ＰＡＥｓが生態系や人間の健康に及ぼす影響は注目されており、環境科学
や環境生態学のホットトピックとなっている。
自然環境におけるＰＡＥｓの分解過程は主に加水分解、光分解、微生物分解であるが、自
然環境では加水分解と光分解は弱く、分解速度も遅い。現在、ＤＭＰ、ＤＥＨＰ、ＤＢＰ
などのフタル酸系汚染物質を環境中で分解できる菌株が分離されている。
しかし、報告されている分解菌のほとんどは、１種類のフタル酸エステルに対してのみ効
率的な分解能力を有しており、短鎖ＰＡＥｓ（例えばＤＭＰ、ＤＥＰなど）と長鎖ＰＡＥ
ｓ（例えばＤＢＰ、ＢＢＰなど）の両方を効率的に分解できる分解菌の生殖資源はほとん
ど見つかっていない。
【発明の概要】
【0003】
本発明が解決しようとする技術的課題は、報告されている分解菌のほとんどは、１種類の
フタル酸エステルに対してのみ効率的な分解能力を有しており、短鎖ＰＡＥｓと長鎖ＰＡ
Ｅｓの両方を効率的に分解できる分解菌の生殖資源はほとんど見つかっていない。
上記問題を解決するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりであり：
本発明は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐ． Ａ４を提供し、中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その保
蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２１８５０である。
さらに、フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジブ
チルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートである。
説明：グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４は、短鎖フ
タル酸エステル（ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート）と長鎖フタル酸エ
ステル（ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレート）を効果的に分解すること
ができる。
本発明は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株の用途をさらに提供し、
すなわち、フタル酸エステル分解用の製剤の調製に使用される。
好ましくは、フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレートおよび／またはジエチルテレ
フタレートおよび／またはジブチルテレフタレートおよび／またはブチルベンジルフタレ
ートである。
説明：フタル酸エステル分解用の製剤は、短鎖フタル酸エステル（ジメチルテレフタレー
ト、ジエチルテレフタレート）と長鎖フタル酸エステル（ジブチルテレフタレート、ブチ
ルベンジルフタレート）を効果的に分解することができる。
好ましくは、製剤の調製プロセスは、以下のとおりであり：
ＳＢ１、５００μＬのグルタミン酸バチルスＡ４株を１００ｍｌのＬＢ培地に移し、３０
℃、１５０ｒｐｍ環境下で２４ｈ培養した後８０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離して培養
菌液を得、
ＳＢ２、菌液をＭＳＭで２回洗浄した後細菌のＯＤ６００値を１．０に調整して菌懸濁液
とし、４℃環境温度下で一時保存する。
上記プロセスにおいて、ＯＤ６００値とは、ある溶液の６００ｎｍ波長における吸光度を
意味する。
説明：上記用途は、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ
４を１０～１６ｈ活性化させ、対数期まで振盪培養し、細菌を収集し、実際の必要に応じ
て細菌含有量を調整して菌懸濁液を調製し、調製された菌懸濁液をフタル酸エステルによ
って汚染された水または土壌に投入する。
好ましくは、製剤の適用プロセスは、菌懸濁液をフタル酸エステルによって汚染された媒
体に投入する。
説明：製剤の適用方法は比較的簡単であり、反応の環境要件が低い。
好ましくは、上記媒体は水、土壌である。
説明：製剤は汚染された水および汚染された土壌の両方に適用可能である。
より好ましくは、製剤の施用量は、媒体質量の５％～２０％である。
説明：媒体質量の５％～２０％の製剤を投入してから７２時間以内に、４種のフタル酸エ
ステルはほぼ完全に分解され、短鎖フタル酸エステルの分解率はいずれも９８％を超え、
長鎖フタル酸エステルの分解率も７５％以上に達し、これは、製剤が４種のＰＡＥｓを効
率的に分解する能力を有することを示している。
フタル酸エステルに対してのみ効率的な分解能力を有しており、短鎖ＰＡＥｓと長鎖ＰＡ
Ｅｓの両方を効率的に分解できる分解菌の生殖資源はほとんど見つかっていない。
上記問題を解決するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりであり：
本発明は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐ． Ａ４を提供し、中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その保
蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２１８５０である。
さらに、フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジブ
チルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートである。
説明：グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４は、短鎖フ
タル酸エステル（ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート）と長鎖フタル酸エ
ステル（ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレート）を効果的に分解すること
ができる。
本発明は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株の用途をさらに提供し、
すなわち、フタル酸エステル分解用の製剤の調製に使用される。
好ましくは、フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレートおよび／またはジエチルテレ
フタレートおよび／またはジブチルテレフタレートおよび／またはブチルベンジルフタレ
ートである。
説明：フタル酸エステル分解用の製剤は、短鎖フタル酸エステル（ジメチルテレフタレー
ト、ジエチルテレフタレート）と長鎖フタル酸エステル（ジブチルテレフタレート、ブチ
ルベンジルフタレート）を効果的に分解することができる。
好ましくは、製剤の調製プロセスは、以下のとおりであり：
ＳＢ１、５００μＬのグルタミン酸バチルスＡ４株を１００ｍｌのＬＢ培地に移し、３０
℃、１５０ｒｐｍ環境下で２４ｈ培養した後８０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離して培養
菌液を得、
ＳＢ２、菌液をＭＳＭで２回洗浄した後細菌のＯＤ６００値を１．０に調整して菌懸濁液
とし、４℃環境温度下で一時保存する。
上記プロセスにおいて、ＯＤ６００値とは、ある溶液の６００ｎｍ波長における吸光度を
意味する。
説明：上記用途は、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ
４を１０～１６ｈ活性化させ、対数期まで振盪培養し、細菌を収集し、実際の必要に応じ
て細菌含有量を調整して菌懸濁液を調製し、調製された菌懸濁液をフタル酸エステルによ
って汚染された水または土壌に投入する。
好ましくは、製剤の適用プロセスは、菌懸濁液をフタル酸エステルによって汚染された媒
体に投入する。
説明：製剤の適用方法は比較的簡単であり、反応の環境要件が低い。
好ましくは、上記媒体は水、土壌である。
説明：製剤は汚染された水および汚染された土壌の両方に適用可能である。
より好ましくは、製剤の施用量は、媒体質量の５％～２０％である。
説明：媒体質量の５％～２０％の製剤を投入してから７２時間以内に、４種のフタル酸エ
ステルはほぼ完全に分解され、短鎖フタル酸エステルの分解率はいずれも９８％を超え、
長鎖フタル酸エステルの分解率も７５％以上に達し、これは、製剤が４種のＰＡＥｓを効
率的に分解する能力を有することを示している。
【発明の効果】
【0004】
本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明は、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４および
フタル酸エステルの分解における用途を提供し、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃ
ｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４は、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレートおよびブチルベンジルフタレートを唯一の炭素源およびエネルギ
ー源として増殖することができ、純粋な培養条件下でこの細菌は無機塩培地中の２０ｍｇ
／Ｌの混合フタル酸エステル（それぞれ２０ｍｇ／Ｌのジメチルテレフタレート、ジエチ
ルテレフタレート、ジブチルテレフタレートおよびブチルベンジルフタレートを含有）を
４８ｈでほぼ完全に分解でき、分解率が７５％を超え、本発明に記載の用途は、環境汚染
物質の生物学的処理に幅広い見通しが期待されている。
本発明は、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４および
フタル酸エステルの分解における用途を提供し、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃ
ｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４は、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレートおよびブチルベンジルフタレートを唯一の炭素源およびエネルギ
ー源として増殖することができ、純粋な培養条件下でこの細菌は無機塩培地中の２０ｍｇ
／Ｌの混合フタル酸エステル（それぞれ２０ｍｇ／Ｌのジメチルテレフタレート、ジエチ
ルテレフタレート、ジブチルテレフタレートおよびブチルベンジルフタレートを含有）を
４８ｈでほぼ完全に分解でき、分解率が７５％を超え、本発明に記載の用途は、環境汚染
物質の生物学的処理に幅広い見通しが期待されている。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】実施例２のＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４をＬＢ培地で５日間培養したときの増殖形態を示す。
【図2】実施例２のＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図3】実施例２のＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４の１６Ｓ ｒＤＮＡの系統樹を示す概略図である。
【図4】実施例５のＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４のフタル酸エステルに対する分解効果図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本発明の目的、技術的解決策および利点をより明確にするために、以下、添付図面を参照
しながら本発明をより詳細に説明するが、明らかに、説明される実施例は本発明の一部の
実施例に過ぎず、すべての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者は創造的
な労働をすることなく得られた他の実施例は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の実施例で使用される用語は、特定の実施例を説明する目的でのみ使用され、本発
明を限定するものではない。本発明の実施例および特許請求の範囲に使用される「１種」
、「前記」および「該」などの単数形は、文脈上でそうでないことを明示しない限り、複
数形を含み、「複数」は一般に少なくとも２つを含む。
実施例１
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４を提供し、中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その
保蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２１８５０であり、保蔵場所：湖北省武漢市武昌区八一
路珞珈山である。
上記グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４は、南京市南
京の農業大学牌楼汚染土壌から分離し、濃縮培養して得られたものである。
上記グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４の遺伝子配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、
ＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧ
ＣＣＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡ
ＣＡＣＧＴＧＡＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＣＣＧＧＧ
ＡＡＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＴＧＡＣＣＴＣＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧ
ＴＧＣＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＡＣＴＣＧＣＧ
ＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧ
ＡＣＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧ
ＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ
ＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣ
ＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴ
ＴＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡ
ＡＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴ
ＡＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣ
ＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣ
ＴＣＡＡＣＣＴＣＧＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＧＴＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＴＧ
ＡＴＧＴＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧ
ＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴ
ＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧ
ＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧ
ＴＴＧＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＴＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＧＣ
ＣＧＴＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣ
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ＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣ
ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＡ
ＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＧＡ
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ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＡ
ＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＡＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＴＡＡＣＣＡＣＣＴＴＧ
ＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＧＣＣＧＴＴ。
しながら本発明をより詳細に説明するが、明らかに、説明される実施例は本発明の一部の
実施例に過ぎず、すべての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者は創造的
な労働をすることなく得られた他の実施例は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の実施例で使用される用語は、特定の実施例を説明する目的でのみ使用され、本発
明を限定するものではない。本発明の実施例および特許請求の範囲に使用される「１種」
、「前記」および「該」などの単数形は、文脈上でそうでないことを明示しない限り、複
数形を含み、「複数」は一般に少なくとも２つを含む。
実施例１
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４を提供し、中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その
保蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２１８５０であり、保蔵場所：湖北省武漢市武昌区八一
路珞珈山である。
上記グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４は、南京市南
京の農業大学牌楼汚染土壌から分離し、濃縮培養して得られたものである。
上記グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４の遺伝子配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、
ＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧ
ＣＣＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡ
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ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＡ
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ＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＧＣＣＧＴＴ。
【0007】
実施例２
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の調製方法を提供し、実施例１のグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍ
ｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４に基づいて、以下のステップを含み：
Ｓ１、菌株を分離および培養し、以下のステップを含み：
Ｓ１-１、約５ｇ試験土壌を２５０ｍＬコニカルフラスコに加え、１００ｍＬ超純水を加
え、３０℃、１５０ｒｐｍシェーカーに入れ、遮光して８ｈ振盪培養した後取り出し、２
時間静置し、得られた上清を濃縮した初期土着微生物とし、
Ｓ１-２、５ｍＬ上清を９５ｍＬのフタル酸エステル含有の無機塩液体培地に移し、前記
無機塩液体培地中のフタル酸エステル含有量は５ｍｇ／Ｌであり、３０℃、１５０ｒｐｍ
条件下でシェーカーで５日間振盪培養した後、５ｍＬ上清の投入量で、無機塩液体培地を
連続的に濃縮培養し、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量を調整し、上記プロ
セスを１回投入とし、合計５回投入し、１回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エ
ステルの含有量は５ｍｇ／Ｌ、２回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は１０ｍｇ／Ｌ、３回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量
は２０ｍｇ／Ｌ、４回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量は４０
ｍｇ／Ｌ、５回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量は８０ｍｇ／
Ｌであり、
Ｓ１-３、５回投入した後の無機塩液体培地中の培養液を１０３倍に希釈し、希釈後の培
養液をフタル酸エステル含有量２０ｍｇ／Ｌの無機塩固体培地に塗布し、３０℃の環境温
度下で１日間転倒培養し、
Ｓ１-４、無機塩固体培地上で単一コロニーが生育した後、単一コロニーを数回スクラッ
チすることにより精製し、細菌株を単離し、Ａ４株と番号付け、その後、Ａ４株をＬＢ固
体培地に移し、３０℃の環境温度下で５日間転倒培養し、Ａ４株のコロニー形態を観察す
る。
上記ステップＳ１-２において、１回目投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は５ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジ
ブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも５ｍｇ／Ｌである
ことを意味する。
上記ステップＳ１-２において、２回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステル
の含有量は１０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート
、ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも１０ｍｇ／Ｌ
であることを意味する。
上記ステップＳ１-２において、３回目の投入後無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は２０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも２０ｍｇ／Ｌで
あることを意味する。
上記ステップＳ１-２において、４回目の投入後無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は４０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも４０ｍｇ／Ｌで
あることを意味する。
上記ステップＳ１-２において、５回目の投入後無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は８０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも８０ｍｇ／Ｌで
あることを意味する。
本実施例では、Ａ４株をＬＢ固体培地上で５日間スクラッチ培養し、コロニーが淡黄色、
円形、粘液状の不透明で、縁が整頓されておらず、表面が盛り上がり、湿潤で平滑であり
、その具体的な形態は図１に示される。
Ｓ２、走査型電子顕微鏡観察により菌株を同定し、以下のステップを含み：
Ｓ２-１、ＬＢ固体培地上で精製したＡ４株をＬＢ液体培地に接種し、１０～１６ｈ活性
化させ、
Ｓ２-２、ＬＢ液体培地から１ｍＬ菌液を吸引し、８０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し
、上清を除去し、減菌ＭＳＭ培地を加えて３回細菌を洗浄し、得られた細菌沈殿に１ｍＬ
の２．５％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒドを加えて均一に混合し、４℃環境温度下で１
０ｈ静置し、
Ｓ２-３、一晩静置した溶液を遠心分離した後上清を流し、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＰＢ
Ｓ緩衝液で３回細菌を洗浄し、各洗浄時間は１５ｍｉｎであり、最後に１％のオスミウム
酸溶液でサンプルを１ｈ固定し、
Ｓ２-４、オスミウム酸廃液を流し、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液でサンプルを
３回洗浄し、各洗浄時間は１５ｍｉｎであり、勾配濃度のエタノール溶液でサンプルを脱
水処理し、前記勾配濃度は３０％、５０％、７０％、８０％、９０％および９５％の５種
の濃度であり、各濃度のエタノール溶液の処理時間はいずれも１５ｍｉｎであり、最後に
１００％のエタノールでサンプルを２０ｍｉｎ脱水処理し、
Ｓ２-５、純アセトンでサンプルを浸透処理し、処理時間は２０ｍｉｎであり、体積比１
：１のｓｕｐｅｒエポキシ樹脂とアセトン混合液でサンプルを１ｈ浸透させ、体積比３：
１のｓｕｐｅｒエポキシ樹脂とアセトン混合液でサンプルを３ｈ浸透させ、その後純ｓｕ
ｐｅｒエポキシ樹脂でサンプルを１２ｈ浸透させ、浸透処理したサンプルをカプセル化し
、カプセル化サンプルを得、
Ｓ２-６、カプセル化後のサンプルを超薄スライサーでスライスし、厚さ７０～９０ｎｍ
のスライスを得、スライスを鉛濃度１％のクエン酸鉛溶液と酢酸ジオキシラニル５０％エ
タノール飽和溶液で各５ｍｉｎ染色し、染色後のスライスを風乾した後、透過型電子顕微
鏡でスライスを観察する。
本実施例では、走査型電子顕微鏡観察による形態特徴は楕円形であり、その具体的な形態
特徴は図２に示される。
上記ステップＳ１およびステップＳ２において：
無機塩液体培地は無機塩培養液であり、無機塩培養液成分は、濃度１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ
４）２ＳＯ４、濃度０．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、濃度１．９１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・
３Ｈ２Ｏ、濃度０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、濃度０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含
み、無機塩培養液のｐＨ値は７．０である。
無機塩固体培地は、無機塩液体培地に１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天粉末を加えて得られる。
ＬＢ液体培地およびＬＢ固体培地の調製プロセスは、以下のとおりであり：
ＳＡ１、５．０ｇ酵母エキス、１０．０ｇトリプトン、１０．０ｇ塩化ナトリウムに超純
水を加えて１Ｌとし、ｐＨを７．０に調整し、１２１℃温度環境下で２０分間減菌してＬ
Ｂ液体培地を得、
ＳＡ２、ＬＢ液体培地をベースに、１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天粉末を加えてＬＢ固体培地を
得る。
Ｓ３、菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ分子を同定し、以下のステップを含み：
Ｓ３-１、スライス中の菌株の全ＤＮＡを抽出し、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡユニバーサルプ
ライマーで菌株ゲノミクスをＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を得、
Ｓ３-２、ＰＣＲ産物の配列を決定し、配列結果をＧｅｎＢａｎｋで報告されている１６
Ｓ ｒＤＮＡ配列と比較して相同性を調べ、関連する菌種を選択して進化樹分析と同定を
行い、菌株の種を決定する。
上記ステップにおいて、進化樹分析の結果は図３に示され、菌株Ａ４の１６Ｓ ｒＤＮＡ
配列はＮＣＢＩオフィシャルサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴプログラムを通じて他の登録された細菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ配
列と比較され、その結果、該菌株はＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と最も類似
しており、相同率は９９％であった。
したがって、本実施例でスクリーニングして得られた菌株をグルタミン酸バチルス（Ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ）と同定し、Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ
４と命名した。
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の調製方法を提供し、実施例１のグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍ
ｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４に基づいて、以下のステップを含み：
Ｓ１、菌株を分離および培養し、以下のステップを含み：
Ｓ１-１、約５ｇ試験土壌を２５０ｍＬコニカルフラスコに加え、１００ｍＬ超純水を加
え、３０℃、１５０ｒｐｍシェーカーに入れ、遮光して８ｈ振盪培養した後取り出し、２
時間静置し、得られた上清を濃縮した初期土着微生物とし、
Ｓ１-２、５ｍＬ上清を９５ｍＬのフタル酸エステル含有の無機塩液体培地に移し、前記
無機塩液体培地中のフタル酸エステル含有量は５ｍｇ／Ｌであり、３０℃、１５０ｒｐｍ
条件下でシェーカーで５日間振盪培養した後、５ｍＬ上清の投入量で、無機塩液体培地を
連続的に濃縮培養し、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量を調整し、上記プロ
セスを１回投入とし、合計５回投入し、１回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エ
ステルの含有量は５ｍｇ／Ｌ、２回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は１０ｍｇ／Ｌ、３回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量
は２０ｍｇ／Ｌ、４回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量は４０
ｍｇ／Ｌ、５回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの含有量は８０ｍｇ／
Ｌであり、
Ｓ１-３、５回投入した後の無機塩液体培地中の培養液を１０３倍に希釈し、希釈後の培
養液をフタル酸エステル含有量２０ｍｇ／Ｌの無機塩固体培地に塗布し、３０℃の環境温
度下で１日間転倒培養し、
Ｓ１-４、無機塩固体培地上で単一コロニーが生育した後、単一コロニーを数回スクラッ
チすることにより精製し、細菌株を単離し、Ａ４株と番号付け、その後、Ａ４株をＬＢ固
体培地に移し、３０℃の環境温度下で５日間転倒培養し、Ａ４株のコロニー形態を観察す
る。
上記ステップＳ１-２において、１回目投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は５ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジ
ブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも５ｍｇ／Ｌである
ことを意味する。
上記ステップＳ１-２において、２回目の投入後、無機塩液体培地中のフタル酸エステル
の含有量は１０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート
、ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも１０ｍｇ／Ｌ
であることを意味する。
上記ステップＳ１-２において、３回目の投入後無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は２０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも２０ｍｇ／Ｌで
あることを意味する。
上記ステップＳ１-２において、４回目の投入後無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は４０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも４０ｍｇ／Ｌで
あることを意味する。
上記ステップＳ１-２において、５回目の投入後無機塩液体培地中のフタル酸エステルの
含有量は８０ｍｇ／Ｌであるとは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、
ジブチルテレフタレート、ブチルベンジルフタレートの含有量はいずれも８０ｍｇ／Ｌで
あることを意味する。
本実施例では、Ａ４株をＬＢ固体培地上で５日間スクラッチ培養し、コロニーが淡黄色、
円形、粘液状の不透明で、縁が整頓されておらず、表面が盛り上がり、湿潤で平滑であり
、その具体的な形態は図１に示される。
Ｓ２、走査型電子顕微鏡観察により菌株を同定し、以下のステップを含み：
Ｓ２-１、ＬＢ固体培地上で精製したＡ４株をＬＢ液体培地に接種し、１０～１６ｈ活性
化させ、
Ｓ２-２、ＬＢ液体培地から１ｍＬ菌液を吸引し、８０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し
、上清を除去し、減菌ＭＳＭ培地を加えて３回細菌を洗浄し、得られた細菌沈殿に１ｍＬ
の２．５％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒドを加えて均一に混合し、４℃環境温度下で１
０ｈ静置し、
Ｓ２-３、一晩静置した溶液を遠心分離した後上清を流し、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＰＢ
Ｓ緩衝液で３回細菌を洗浄し、各洗浄時間は１５ｍｉｎであり、最後に１％のオスミウム
酸溶液でサンプルを１ｈ固定し、
Ｓ２-４、オスミウム酸廃液を流し、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液でサンプルを
３回洗浄し、各洗浄時間は１５ｍｉｎであり、勾配濃度のエタノール溶液でサンプルを脱
水処理し、前記勾配濃度は３０％、５０％、７０％、８０％、９０％および９５％の５種
の濃度であり、各濃度のエタノール溶液の処理時間はいずれも１５ｍｉｎであり、最後に
１００％のエタノールでサンプルを２０ｍｉｎ脱水処理し、
Ｓ２-５、純アセトンでサンプルを浸透処理し、処理時間は２０ｍｉｎであり、体積比１
：１のｓｕｐｅｒエポキシ樹脂とアセトン混合液でサンプルを１ｈ浸透させ、体積比３：
１のｓｕｐｅｒエポキシ樹脂とアセトン混合液でサンプルを３ｈ浸透させ、その後純ｓｕ
ｐｅｒエポキシ樹脂でサンプルを１２ｈ浸透させ、浸透処理したサンプルをカプセル化し
、カプセル化サンプルを得、
Ｓ２-６、カプセル化後のサンプルを超薄スライサーでスライスし、厚さ７０～９０ｎｍ
のスライスを得、スライスを鉛濃度１％のクエン酸鉛溶液と酢酸ジオキシラニル５０％エ
タノール飽和溶液で各５ｍｉｎ染色し、染色後のスライスを風乾した後、透過型電子顕微
鏡でスライスを観察する。
本実施例では、走査型電子顕微鏡観察による形態特徴は楕円形であり、その具体的な形態
特徴は図２に示される。
上記ステップＳ１およびステップＳ２において：
無機塩液体培地は無機塩培養液であり、無機塩培養液成分は、濃度１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ
４）２ＳＯ４、濃度０．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、濃度１．９１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・
３Ｈ２Ｏ、濃度０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、濃度０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含
み、無機塩培養液のｐＨ値は７．０である。
無機塩固体培地は、無機塩液体培地に１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天粉末を加えて得られる。
ＬＢ液体培地およびＬＢ固体培地の調製プロセスは、以下のとおりであり：
ＳＡ１、５．０ｇ酵母エキス、１０．０ｇトリプトン、１０．０ｇ塩化ナトリウムに超純
水を加えて１Ｌとし、ｐＨを７．０に調整し、１２１℃温度環境下で２０分間減菌してＬ
Ｂ液体培地を得、
ＳＡ２、ＬＢ液体培地をベースに、１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天粉末を加えてＬＢ固体培地を
得る。
Ｓ３、菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ分子を同定し、以下のステップを含み：
Ｓ３-１、スライス中の菌株の全ＤＮＡを抽出し、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡユニバーサルプ
ライマーで菌株ゲノミクスをＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を得、
Ｓ３-２、ＰＣＲ産物の配列を決定し、配列結果をＧｅｎＢａｎｋで報告されている１６
Ｓ ｒＤＮＡ配列と比較して相同性を調べ、関連する菌種を選択して進化樹分析と同定を
行い、菌株の種を決定する。
上記ステップにおいて、進化樹分析の結果は図３に示され、菌株Ａ４の１６Ｓ ｒＤＮＡ
配列はＮＣＢＩオフィシャルサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴプログラムを通じて他の登録された細菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ配
列と比較され、その結果、該菌株はＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と最も類似
しており、相同率は９９％であった。
したがって、本実施例でスクリーニングして得られた菌株をグルタミン酸バチルス（Ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ）と同定し、Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ
４と命名した。
【0008】
実施例３
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の調製方法であり、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ１-３において、５回投入後の無機塩液体培地中の培養液を１０４倍希釈した
。
ステップＳ１-３において、３０℃環境温度下で２日間転倒培養した。
ステップＳ２-１において、ＬＢ固体培地上で精製したＡ４株をＬＢ液体培地に接種して
１３ｈ活性化させた。
ステップＳ２-２において、８０００ｒｐｍで４ｍｉｎ遠心分離し、４℃環境温度下で１
３ｈ静置した。
ステップＳ２-３において、最後に１％のオスミウム酸溶液でサンプルを１．５ｈ固定し
た。
ステップＳ２-５において、純ｓｕｐｅｒエポキシ樹脂でサンプルを１４ｈ浸透した。
ステップＳ２-６において、スライスを鉛濃度１％のクエン酸鉛溶液と酢酸ジオキシラニ
ル５０％エタノール飽和溶液でそれぞれ８ｍｉｎ染色した。
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の調製方法であり、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ１-３において、５回投入後の無機塩液体培地中の培養液を１０４倍希釈した
。
ステップＳ１-３において、３０℃環境温度下で２日間転倒培養した。
ステップＳ２-１において、ＬＢ固体培地上で精製したＡ４株をＬＢ液体培地に接種して
１３ｈ活性化させた。
ステップＳ２-２において、８０００ｒｐｍで４ｍｉｎ遠心分離し、４℃環境温度下で１
３ｈ静置した。
ステップＳ２-３において、最後に１％のオスミウム酸溶液でサンプルを１．５ｈ固定し
た。
ステップＳ２-５において、純ｓｕｐｅｒエポキシ樹脂でサンプルを１４ｈ浸透した。
ステップＳ２-６において、スライスを鉛濃度１％のクエン酸鉛溶液と酢酸ジオキシラニ
ル５０％エタノール飽和溶液でそれぞれ８ｍｉｎ染色した。
【0009】
実施例４
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の調製方法を提供し、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ１-３において、３０℃環境温度下で３日間転倒培養した。
ステップＳ２-３において、最後に１％のオスミウム酸溶液でサンプルを２ｈ固定した。
ステップＳ２-１において、ＬＢ固体培地上で精製したＡ４株をＬＢ液体培地に接種し、
１６ｈ活性化させた。
ステップＳ２-２において、８０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、４℃環境温度下で１
６ｈ静置した。
ステップＳ２-３において、最後に１％のオスミウム酸溶液でサンプルを２ｈ固定した。
ステップＳ２-５において、純ｓｕｐｅｒエポキシ樹脂でサンプルを１６ｈ浸透した。
ステップＳ２-６において、スライスを鉛濃度１％のクエン酸鉛溶液と酢酸ジオキシラニ
ル５０％エタノール飽和溶液でそれぞれ１０ｍｉｎ染色した。
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の調製方法を提供し、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ１-３において、３０℃環境温度下で３日間転倒培養した。
ステップＳ２-３において、最後に１％のオスミウム酸溶液でサンプルを２ｈ固定した。
ステップＳ２-１において、ＬＢ固体培地上で精製したＡ４株をＬＢ液体培地に接種し、
１６ｈ活性化させた。
ステップＳ２-２において、８０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、４℃環境温度下で１
６ｈ静置した。
ステップＳ２-３において、最後に１％のオスミウム酸溶液でサンプルを２ｈ固定した。
ステップＳ２-５において、純ｓｕｐｅｒエポキシ樹脂でサンプルを１６ｈ浸透した。
ステップＳ２-６において、スライスを鉛濃度１％のクエン酸鉛溶液と酢酸ジオキシラニ
ル５０％エタノール飽和溶液でそれぞれ１０ｍｉｎ染色した。
【0010】
実施例５
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の用途を提供し、実施例１のグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃ
ｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４に基づいて、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４をフタル酸エステル分解用の製剤の調製に使用した。
製剤の調製プロセスは、以下のとおりであり：
ＳＢ１、５００μＬのグルタミン酸バチルスＡ４株を１００ｍｌのＬＢ培地に移し、３０
℃、１５０ｒｐｍ環境下で２４ｈ培養した後８０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離して培養
菌液を得、
ＳＢ２、菌液をＭＳＭで２回洗浄した後細菌のＯＤ６００値を１．０に調整して菌懸濁液
とし、４℃環境温度下で一時保存する。
本実施例は、製剤の１つの調製方法のみを示したが、実際の応用では、グルタミン酸バチ
ルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４を１０～１６ｈ活性化させ、対数期
まで振盪培養し、細菌を収集し、実際の必要に応じて細菌含有量を調整して菌懸濁液を調
製し、調製された細菌懸濁液をフタル酸エステルによって汚染された水または土壌に投入
する。
本実施例において、製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された水に
施用し、製剤の施用量は水の質量の１５％である。
Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４菌の分解性能測定：
２０ｍｇ／Ｌ濃度のＰＡＥｓ（すなわち２０ｍｇ／Ｌ ＤＭＰ、２０ｍｇ／Ｌ ＤＥＰ、
２０ｍｇ／Ｌ ＤＢＰおよび２０ｍｇ／Ｌ ＢＢＰを含有）を含む１９ｍＬ ＭＳＭ培養
液に上記菌懸濁液１ｍＬを投入し、接種しない対照組を用意し、ｐＨを７．０に調整し、
各組で３回重複した。３０℃、１５０ｒｐｍ恒温シェーカーで４８ｈ培養し、それぞれ１
、３、６、１２、２４、４８、７２ｈでサンプリングし、取り出したコニカルフラスコに
４０ｍＬクロマトグラフィー用純メタノールを加え、水浴で１ｈ超音波振盪し、超音波処
理終了後、ボルテックスで振盪した後、上清を０．２２μｍ有機相フィルタ膜で濾過し、
２ｍＬ褐色液相バイアルに移し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
クロマトグラフィー条件：ＬＣ-２０ＡＴ高速液相クロマトグラフィー（ＳＰＤ-２Ａ紫外
線検出器付き）を使用した。検出時間は４０ｍｉｎであり、注入システムの注入量は２０
μＬであり、分離システムはアセトニトリル-水を移動相とし、初期流速は１．０ｍＬ／
ｍｉｎであり、グラジエント溶出でＰＡＥｓを分離し、クロマトグラフィーカラムはΦ４
．６×２５０ｍｍ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-Ｐ液体クロマトグラフィーカラムを使用
し、カラム温度は４０℃であり、検出システムは紫外検出器を使用し、それぞれ２０５ｎ
ｍ、２２５ｎｍの二波長検出モードで検出した。
Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４菌の４種の混合ＰＡＥｓに対する分解効
果は図４に示され、この細菌を３日間振盪培養下で４種ＰＡＥｓに対して顕著な分解効果
が認められた。特に、短鎖ＰＡＥｓ（例えばＤＭＰ、ＤＥＰ）に対して、上記ＰＡＥｓに
対するＡ４の１日目の分解率は９５％を超え、２日目の分解率は９８％を超えた。長鎖Ｐ
ＡＥｓ（例えばＤＢＰ、ＢＢＰ）の分解速度は素体的に遅く、ＤＢＰの分解率が１日目９
０％に達し、ＢＢＰの分解率が約７０％であったが、２日目、ＢＢＰの分解率が約８０％
に達した。７２ｈ培養した後、４種ＰＡＥｓがほぼ完全に分解され、短鎖ＰＡＥｓ分解率
が９８％を超え、長鎖ＰＡＥｓの分解率も７５％以上に達し、これは、Ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４菌が４種ＰＡＥｓを効率的に分解する能力を有することを
示している。
上記性能測定プロセスにおいて、ＤＭＰはフタル酸エステルの略称であり、ＤＥＰはジエ
チルテレフタレートの略称であり、ＤＢＰはジブチルテレフタレートの略称であり、ＢＢ
Ｐはブチルベンジルフタレートの略称である。
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の用途を提供し、実施例１のグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃ
ｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４に基づいて、グルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４をフタル酸エステル分解用の製剤の調製に使用した。
製剤の調製プロセスは、以下のとおりであり：
ＳＢ１、５００μＬのグルタミン酸バチルスＡ４株を１００ｍｌのＬＢ培地に移し、３０
℃、１５０ｒｐｍ環境下で２４ｈ培養した後８０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離して培養
菌液を得、
ＳＢ２、菌液をＭＳＭで２回洗浄した後細菌のＯＤ６００値を１．０に調整して菌懸濁液
とし、４℃環境温度下で一時保存する。
本実施例は、製剤の１つの調製方法のみを示したが、実際の応用では、グルタミン酸バチ
ルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４を１０～１６ｈ活性化させ、対数期
まで振盪培養し、細菌を収集し、実際の必要に応じて細菌含有量を調整して菌懸濁液を調
製し、調製された細菌懸濁液をフタル酸エステルによって汚染された水または土壌に投入
する。
本実施例において、製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された水に
施用し、製剤の施用量は水の質量の１５％である。
Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４菌の分解性能測定：
２０ｍｇ／Ｌ濃度のＰＡＥｓ（すなわち２０ｍｇ／Ｌ ＤＭＰ、２０ｍｇ／Ｌ ＤＥＰ、
２０ｍｇ／Ｌ ＤＢＰおよび２０ｍｇ／Ｌ ＢＢＰを含有）を含む１９ｍＬ ＭＳＭ培養
液に上記菌懸濁液１ｍＬを投入し、接種しない対照組を用意し、ｐＨを７．０に調整し、
各組で３回重複した。３０℃、１５０ｒｐｍ恒温シェーカーで４８ｈ培養し、それぞれ１
、３、６、１２、２４、４８、７２ｈでサンプリングし、取り出したコニカルフラスコに
４０ｍＬクロマトグラフィー用純メタノールを加え、水浴で１ｈ超音波振盪し、超音波処
理終了後、ボルテックスで振盪した後、上清を０．２２μｍ有機相フィルタ膜で濾過し、
２ｍＬ褐色液相バイアルに移し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
クロマトグラフィー条件：ＬＣ-２０ＡＴ高速液相クロマトグラフィー（ＳＰＤ-２Ａ紫外
線検出器付き）を使用した。検出時間は４０ｍｉｎであり、注入システムの注入量は２０
μＬであり、分離システムはアセトニトリル-水を移動相とし、初期流速は１．０ｍＬ／
ｍｉｎであり、グラジエント溶出でＰＡＥｓを分離し、クロマトグラフィーカラムはΦ４
．６×２５０ｍｍ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-Ｐ液体クロマトグラフィーカラムを使用
し、カラム温度は４０℃であり、検出システムは紫外検出器を使用し、それぞれ２０５ｎ
ｍ、２２５ｎｍの二波長検出モードで検出した。
Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４菌の４種の混合ＰＡＥｓに対する分解効
果は図４に示され、この細菌を３日間振盪培養下で４種ＰＡＥｓに対して顕著な分解効果
が認められた。特に、短鎖ＰＡＥｓ（例えばＤＭＰ、ＤＥＰ）に対して、上記ＰＡＥｓに
対するＡ４の１日目の分解率は９５％を超え、２日目の分解率は９８％を超えた。長鎖Ｐ
ＡＥｓ（例えばＤＢＰ、ＢＢＰ）の分解速度は素体的に遅く、ＤＢＰの分解率が１日目９
０％に達し、ＢＢＰの分解率が約７０％であったが、２日目、ＢＢＰの分解率が約８０％
に達した。７２ｈ培養した後、４種ＰＡＥｓがほぼ完全に分解され、短鎖ＰＡＥｓ分解率
が９８％を超え、長鎖ＰＡＥｓの分解率も７５％以上に達し、これは、Ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ４菌が４種ＰＡＥｓを効率的に分解する能力を有することを
示している。
上記性能測定プロセスにおいて、ＤＭＰはフタル酸エステルの略称であり、ＤＥＰはジエ
チルテレフタレートの略称であり、ＤＢＰはジブチルテレフタレートの略称であり、ＢＢ
Ｐはブチルベンジルフタレートの略称である。
【0011】
実施例６
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の用途であり、実施例５とは以下の点で異なり：
製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された土壌に投入し、製剤の施
用量は土壌質量の５％である。
実施例７
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の用途を提供し、実施例５とは以下の点で異なり：
製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された土壌に投入し、製剤の施
用量は土壌質量の２０％である。
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の用途であり、実施例５とは以下の点で異なり：
製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された土壌に投入し、製剤の施
用量は土壌質量の５％である。
実施例７
本実施例は、フタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔ
ｅｒ ｓｐ． Ａ４の用途を提供し、実施例５とは以下の点で異なり：
製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された土壌に投入し、製剤の施
用量は土壌質量の２０％である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2025-01-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）に保蔵され、その保蔵番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０２２１８５０である、ことを特徴とするフタル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ
４株。
【請求項2】
フタル酸エステルは、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレート、ジブチルテレフタレート又はブチルベンジルフタレートである、ことを特徴とする請求項１に記載のフ
タル酸分解能を有するグルタミン酸バチルスＡ４株。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のグルタミン酸バチルスＡ４株に基づくフタル酸エステルを分解す
る製剤であって、
前記製剤の調製プロセスは、
ＳＢ１、５００μＬのグルタミン酸バチルスＡ４株を１００ｍｌのＬＢ培地に移し、３０
℃、１５０ｒｐｍ環境下で２４ｈ培養した後８０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離して培養
菌液を得るステップと、
ＳＢ２、前記菌液をＭＳＭで２回洗浄した後細菌のＯＤ ６００ 値を１．０に調整して製剤
を得て、４℃環境温度下で一時保存するステップと、
を含むことを特徴とするフタル酸エステルを分解する製剤。
【請求項4】
前記製剤の施用方法は、製剤をフタル酸エステルによって汚染された媒体に投入することである、ことを特徴とする請求項３に記載のフタル酸エステルを分解する製剤。
【請求項5】
前記媒体は、水、土壌である、ことを特徴とする請求項４に記載のフタル酸エステルを分
解する製剤。
【請求項6】
前記製剤の施用量は、媒体質量の５％～２０％である、ことを特徴とする請求項４に記載のフタル酸エステルを分解する製剤。
【国際調査報告】