特表 2025-501913 血管新生阻害剤結合抗Ｃ３ｂ抗体又は抗Ｃ５抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-24

(54)【発明の名称】血管新生阻害剤結合抗Ｃ３ｂ抗体又は抗Ｃ５抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20250117BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20250117BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250117BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250117BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250117BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20250117BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/22

C07K16/18

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/17

A61K39/395 N

A61P27/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538390

(86)(22)【出願日】2022-12-27

(85)【翻訳文提出日】2024-08-08

(86)【国際出願番号】 KR2022021371

(87)【国際公開番号】W WO2023132547

(87)【国際公開日】2023-07-13

(31)【優先権主張番号】10-2022-0001647

(32)【優先日】2022-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523005531

【氏名又は名称】カナプ セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＫＡＮＡＰＨ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】チュン， ウ ドゥム

(72)【発明者】

【氏名】リュ， スミン

(72)【発明者】

【氏名】キム， ドンゴン

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ジフン

(72)【発明者】

【氏名】リー， ビョン チュル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084CA53

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZB052

4C084ZB072

4C084ZB112

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA21

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、抗Ｃ３ｂ抗体又は抗Ｃ５抗体及び血管新生阻害剤を含む融合タンパク質、並びにそれを使用して眼疾患、特に黄斑変性を治療するための組成物に関する。本タンパク質は補体関連経路を阻害することができるだけでなく、血管新生を効果的に調節することもできる。したがって、融合タンパク質二量体は、補体関連疾患、特に黄斑変性などの眼疾患の治療及び予防に効果的に使用することができ、したがって、産業上の利用可能性が高い。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃ３ｂ（補体成分３ｂ）又はＣ５（補体成分５）に特異的に結合する抗体断片、及びＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質。

【請求項2】

Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する前記抗体断片、及びＶＥＧＦに特異的に結合する前記タンパク質が、リンカーによって連結されている、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記リンカーが、ペプチドリンカー、免疫グロブリン断片又はこれらの組み合わせである、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記免疫グロブリン断片がＤＡＮＧ変異を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記免疫グロブリン断片が配列番号６２～６８のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

ＶＥＧＦに特異的に結合する前記タンパク質が、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体若しくはその断片、又はＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ受容体１又はＶＥＧＦ受容体２である、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインが配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

以下の構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン又はそのバリアント－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン又はそのバリアント－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
からなり、
構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
Ｎ’は前記融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は前記融合タンパク質のＣ末端であり、
ＸはＣ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する前記抗体断片であり、
ＹはＶＥＧＦに特異的に結合する前記タンパク質であり、
前記リンカー（１）及び（２）はペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立的に０又は１である、
請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記リンカー（１）が配列番号５３～５７のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記リンカー（２）が配列番号５８～６１のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

ＸがＣ３ｂ又はＣ５に特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖである、請求項９に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

Ｃ３ｂに特異的に結合する前記Ｆａｂ又はｓｃＦｖが、
ｉ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
ｉｉ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３１のＬＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣＤＲ２及び配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２及び配列番号３８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

Ｃ３ｂに特異的に結合する前記Ｆａｂ又はｓｃＦｖが、
ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

Ｃ５に特異的に結合する前記Ｆａｂ又はｓｃＦｖが、
配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、又は
配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４８のＬＣＤＲ２及び配列番号４９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

Ｃ５に特異的に結合する前記Ｆａｂ又はｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

配列番号２のポリペプチド及び配列番号９のポリペプチド；配列番号４のポリペプチド及び配列番号１０のポリペプチド；配列番号６のポリペプチド及び配列番号１１のポリペプチド；配列番号８のポリペプチド及び配列番号１２のポリペプチド；配列番号１３のポリペプチド；配列番号１４のポリペプチド；配列番号１５のポリペプチド；又は配列番号１６のポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の２つの融合タンパク質が互いに結合した、融合タンパク質二量体。

【請求項19】

ホモ二量体である、請求項１８に記載の融合タンパク質二量体。

【請求項20】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項21】

請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項22】

請求項２１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項23】

請求項１に記載の融合タンパク質又は請求項１９に記載の融合タンパク質二量体を有効成分として含む、眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項24】

前記眼疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病網膜症及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生並びに網膜血管新生からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２３に記載の眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項25】

医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項２３に記載の眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗Ｃ３ｂ抗体又は抗Ｃ５抗体及び血管新生阻害剤を含む融合タンパク質、並びにそれを使用して眼疾患、特に黄斑変性を治療するための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

黄斑変性（加齢性黄斑変性症、ＡＭＤ）は、５０歳以上の人の失明の主な原因であり、黄斑の損傷により中心視力が低下する眼科疾患である。黄斑変性はおおまかに湿潤型又は乾燥型黄斑変性に分けられる。初期の段階では、乾燥型黄斑変性が起こり、黄斑の下に異常な細胞外沈着物であるドルーゼンが現れ、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に色素変化が起こる。湿潤型黄斑変性は、脈絡膜新生血管、色素上皮剥離、黄斑浮腫、網膜出血、及び網膜滲出を引き起こし、網膜神経細胞の死滅によって失明に至る。

【0003】

一方、補体系は、微生物感染に対する先天免疫の重要な要素であり、通常は血清中に不活性状況で存在するタンパク質群を含む。このタンパク質は、古典的経路、レクチン経路及び代替経路を通じて活性化される。微生物の表面上の分子は、この経路を活性化して、Ｃ３転換酵素として公知であるプロテアーゼ複合体の形成をもたらす。

【0004】

補体経路の活性化は、白血球の走化性における炎症反応、マクロファージ、好中球、血小板、肥満細胞、及び内皮細胞の活性化、増大した血管透過性、細胞溶解、並びに組織損傷を媒介する補体タンパク質の生物学的に活性な断片、例えばＣ３ａ及びＣ５ａ及びＣ５ｂ－９細胞膜侵襲複合体（ＭＡＣ）などのアナフィラトキシンを生成する。

【0005】

さらに、最近の研究では、補体成分Ｃ３及びＣ５がＡＭＤ患者のドルーゼンの主要成分であることが証明されている（Ｍｕｌｌｉｎｇ，Ｒ．Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１４、８３５－４６、２０００）。また、日本特許第４８９７６９０号では、眼疾患の中には補体が関係しているものがあることが報告されている。しかし、現在に至るまで、眼疾患、特に黄斑変性を効果的に治療する薬物の必要性は高まっており、黄斑変性の治療剤の研究は続けられている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、本発明者らは、眼疾患、特に黄斑変性を効果的に治療及び予防するための研究を行った。その結果、本発明者らは、補体関連経路及び新生血管経路を遮断する融合タンパク質を黄斑変性の治療剤として使用できることを見出し、それによって、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様では、Ｃ３ｂ（補体成分３ｂ）又はＣ５（補体成分５）に特異的に結合する抗体断片、及びＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質が提供される。

【0008】

本発明の別の態様では、２つの融合タンパク質が互いに結合した融合タンパク質二量体が提供される。

【0009】

本発明のさらに別の態様では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0010】

本発明のさらになお別の態様では、該ポリヌクレオチドを含有するベクターが提供される。

【0011】

本発明のさらになお別の態様では、該ベクターが導入された形質転換宿主細胞が提供される。

【0012】

本発明のさらになお別の態様では、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体を有効成分として含む、眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明によるＣ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片、及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質は、補体関連機構を効率的に阻害するだけでなく、血管新生を効果的に阻害することができる。したがって、補体系によって引き起こされる眼疾患及び血管新生によって引き起こされる眼疾患を効果的に治療又は予防することができる。したがって、黄斑変性、特に、乾燥型黄斑変性と湿潤型黄斑変性症の両方を効果的に治療するために、融合タンパク質を有効に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1a】調製したＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、Ｓ７７、エクリズマブ、ＰＲＯ２３６、及びＰＲＯ２３７をＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定して得られた結果を示す図である。

【図1b】調製したＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、及びＰＲＯ２４３をＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定して得られた結果を示す図である。

【図1c】調製したＰＲＯ０１７、ＫＮＰ－３０１、及びアフリベルセプトをＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定して得られた結果を示す図である。

【図2】本発明の二重特異性抗体の一例を示す模式図である。

【図3a】図３ａ及び３ｂは、ＥＬＩＳＡによるヒトＣ３ｂへのＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の結合親和性を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図3b】図３ａ及び３ｂは、ＥＬＩＳＡによるヒトＣ３ｂへのＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の結合親和性を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図4】ＥＬＩＳＡによるヒトＣ５へのＰＲＯ２３９、エクリズマブ、及びＰＲＯ０１７の結合親和性を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図5a】図５ａ及び５ｂは、ＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦ１６５へのアフリベルセプト、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ０１７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、及びＰＲＯ２４２の結合親和性を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図5b】図５ａ及び５ｂは、ＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦ１６５へのアフリベルセプト、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ０１７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、及びＰＲＯ２４２の結合親和性を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図6a】図６ａ～６ｃは、溶血アッセイ（ＡＨ５０）による、ＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の代替補体経路阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図6b】図６ａ～６ｃは、溶血アッセイ（ＡＨ５０）による、ＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の代替補体経路阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図6c】図６ａ～６ｃは、溶血アッセイ（ＡＨ５０）による、ＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の代替補体経路阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図7a】図７ａ～７ｃは、溶血アッセイ（ＣＨ５０）による、ＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の古典的補体経路阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図7b】図７ａ～７ｃ溶血アッセイ（ＣＨ５０）による、ＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の古典的補体経路阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図7c】図７ａ～７ｃ溶血アッセイ（ＣＨ５０）による、ＫＮＰ－３０１、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、エクリズマブ、ＭＯＲ０９６１１、及びＭＯＲ０９６７５の古典的補体経路阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図8a】レポーター細胞を使用した、アフリベルセプト、ＰＲＯ２３６及び、ＰＲＯ２３７のＶＥＧＦシグナリング阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図8b】レポーター細胞を使用した、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、及びＰＲＯ２４１のＶＥＧＦシグナリング阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【図8c】レポーター細胞を使用した、ＰＲＯ２４２及びＰＲＯ０１７のＶＥＧＦシグナリング阻害効果を測定して得られた結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片を含む融合タンパク質
本発明の一態様では、Ｃ３ｂ（補体成分３ｂ）又はＣ５（補体成分５）に特異的に結合する抗体断片、及びＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質が提供される。

【0016】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃ３ｂ（補体成分３ｂ）」は、Ｃ３転換酵素によって補体成分Ｃ３を切断することによって形成されるＣ３の断片を指し、「補体Ｃ３ｂタンパク質」と互換的に使用することができる。特にＣ３ｂは補体系の中心的役割を果たし、細胞表面に結合してマーカーとして働く。さらに、Ｃ３ｂ受容体を持つ食細胞に認識させ、細胞毒性を引き起こすオプソニン化作用もある。さらに、Ｃ５を活性化し、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する（ｋｕｂｉ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【0017】

本明細書で使用する場合、用語「補体成分」、「補体タンパク質」又は「補体成分タンパク質」は、補体系の活性化に関与する分子を指す。古典的な経路成分には、例えばＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、及びＣ５ｂ－９複合体が含まれる。代替経路の構成要素には、例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、プロペルジン、Ｈ因子、及びＩ因子が含まれる。

【0018】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃ３ｂに特異的に結合する抗体断片」は、「抗Ｃ３ｂ抗体」と互換的に使用することができ、補体Ｃ３ｂタンパク質又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗体を指す。

【0019】

Ｃ３ｂに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、補体成分Ｃ３ｂに特異的に結合し、補体経路の活性化を遮断する。したがって、補体経路の活性化に関連する疾患、例えば、黄斑変性関連疾患（例えば、ＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底ジストロフィー、シュタルガルト病、模様ジストロフィー、ベスト病、優性ドルーゼン及びＭａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（放射状ドルーゼン）、黄斑変性及び／又は機能不全の前後に起こる黄斑外変化、網膜剥離、脈絡膜変性、網膜変性、視細胞変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、錐体変性などを含む）の治療に使用することができる。

【0020】

「Ｃ３ｂに特異的に結合する抗体」は、少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、ジスルフィド結合で連結されている。重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域からなり、軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。

【0021】

「Ｃ３ｂに特異的に結合する抗体の抗原結合断片」は、所定の抗原、すなわちＣ３ｂに特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ又は複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例としては、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、トリアボディ、ｓｄＡｂ、及びＶ_ＨＨが挙げられる。

【0022】

一実施形態では、Ｃ３ｂ又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗体は、配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、抗体は、配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号３１のＬＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣＤＲ２及び配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、抗体は、配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２及び配列番号３８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0023】

別の実施形態では、Ｃ３ｂ又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0024】

抗Ｃ３ｂ抗体は、限定されることなく、当業者に公知の任意の抗体を指すことができる。別の例として、抗体は、米国特許出願公開第２０１０－０２９１１０６号又は米国特許第８，３７７，４３７号に開示された抗Ｃ３ｂ抗体又はその断片であってもよい。

【0025】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃ５（補体成分５）」は、「補体Ｃ５タンパク質」と互換的に使用することができ、Ｃ５転換酵素によってＣ５ａ及びＣ５ｂ断片に切断されて放出されるタンパク質である。Ｃ５ａは好中球及び炎症を媒介するサイトカインを放出するアナフィラトキシンであり、Ｃ５ｂはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９と結合して膜侵襲複合体を形成し、それによって細胞膜を破壊する。体内のＣ５ａ濃度が高く維持されると、ＩＬ－１７及びＩＬ－２２の発現が増加し、ＩＬ－１７及びＩＬ－２２の発現増加は炎症因子として作用し、ＶＥＧＦと血管新生を誘導することが知られている（Ｌｉｕ Ｂ．ら、Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、２０１１；９：１－１２）。

【0026】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃ５に特異的に結合する抗体断片」は、「抗Ｃ５抗体」と互換的に使用することができ、補体Ｃ５タンパク質又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗体を指す。

【0027】

Ｃ５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、補体成分Ｃ５に特異的に結合し、補体経路の活性化を遮断する。したがって、黄斑変性関連疾患などの補体経路の活性化に関連する疾患の治療に使用することができる。

【0028】

「Ｃ５に特異的に結合する抗体」は、少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、ジスルフィド結合で連結されている。重鎖及び軽鎖は前述の通りである。

【0029】

「Ｃ５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片」は、所定の抗原、すなわちＣ５に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ又は複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例としては、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、トリアボディ、ｓｄＡｂ、及びＶ_ＨＨが挙げられる。

【0030】

一実施形態では、Ｃ５又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗体は、配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４８のＬＣＤＲ２及び配列番号４９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0031】

別の実施形態では、Ｃ５又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0032】

抗Ｃ５抗体は、限定されることなく、当業者に公知の任意の抗体を指すことができる。別の例として、抗体は、米国特許第６，３５５，２４５号又は米国特許出願公開第２０１９－０１７７４３６号に開示された抗Ｃ５抗体又はその断片であってもよい。

【0033】

本明細書で使用する場合、用語「ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）」は、血管内皮増殖因子と呼ばれ、その受容体であるＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ受容体）に結合することによって血管新生を引き起こす。ＶＥＧＦは様々なシグナル伝達カスケードを活性化することにより、内皮細胞の増殖、移動、及び分化を誘導する役割を担っている。病態下では、ＶＥＧＦは異常な血管新生を誘導し、腫瘍細胞及び網膜細胞の増殖及び血管漏出を促進し、それによって腫瘍の増殖及び転移、糖尿病網膜症、並びに加齢性黄斑変性症などを引き起こす。

【0034】

さらに、本明細書では、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦファミリータンパク質を総称して「ＶＥＧＦ」と表現する。ＶＥＧＦファミリータンパク質は、ＶＥＧＦと同等又は類似の活性を有してもよい。この時、「活性」とは、例えば、ＶＥＧＦ受容体への特異的結合を意味し得、この特異的結合は、当業者に既知の方法によって測定することができる。

【0035】

ＶＥＧＦファミリータンパク質は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）及び組換えＶＥＧＦからなる群から選択される１つ又は複数であってもよい。好ましくは、ＶＥＧＦは血管新生に優先的に必要なＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、又はＰｌＧＦであってもよい。

【0036】

本明細書で使用する場合、用語「ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）」は、染色体２ｐ２１－ｐ１６にコードされる膜貫通タンパク質を指す。ＰｌＧＦはＶＥＧＦＲ－１に対する選択的リガンドとして作用し、且つ血管新生を促進することができる。ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦのアミノ酸組成と少なくとも４０％同一である。一実施形態では、ＰｌＧＦはＰｌＧＦ－１又はＰｌＧＦ－２であってもよい。

【0037】

本明細書で使用する場合、用語「組換えＶＥＧＦ」は、選択的エクソンスプライシングによって組み換えられたＶＥＧＦを指す。組換えＶＥＧＦは、アミノ酸の番号に従って、例えば、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＦＧ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９又はＶＥＧＦ２０６であってもよいが、これらに限定されない。

【0038】

本明細書で使用する場合、用語「ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質」は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を指す。

【0039】

本明細書で使用する場合、用語「ＶＥＧＦ受容体」は、ＶＥＧＦに結合する受容体を指し、ＶＥＧＦの生物学的機能は、ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）、及びＶＥＧＦＲ－３（Ｆｌｔ－４）を介して媒介される。ＶＥＧＦＲは、７つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、制御膜近傍ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びその他いくつかのチロシン残基からなる。具体的には、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２の細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインは、ＶＥＧＦと結合するドメインとして知られている。

【0040】

本発明では、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）又はＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0041】

本明細書で使用する場合、用語「ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン」は、ＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦ受容体のドメインを指す。具体的には、ＶＥＧＦ受容体の膜貫通領域及び細胞質領域を除いた、ＶＥＧＦのリガンドを含む細胞外ドメイン部分を指す。

【0042】

具体的には、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦ受容体の断片であってもよい。さらに、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ又はＰｌＧＦに結合することによって血管新生を阻害することができる。この時、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一実施形態は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み得る。さらに、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、配列番号５２を含むＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部が切断されているか又は変化している形態であってもよい。

【0043】

本明細書で使用する場合、用語「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」は、ＶＥＧＦに特異的に結合して抗原抗体反応を引き起こす抗体又はその断片を指し、抗ＶＥＧＦ抗体とも呼ばれる。

【0044】

抗体は、ＶＥＧＦに特異的な抗原抗体結合できる分子の総称である。さらに、抗体は、抗体がＶＥＧＦに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む限り、任意の形態で使用することができる。抗体又はその断片は、Ｆａｂ（抗原結合断片）、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はこれらのバリアントであってもよい。

【0045】

抗ＶＥＧＦ抗体は、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ラムシルマブ、ブロルシズマブ、ファリシマブ、ＫＳＩ－３０１、バヌシズマブ、ＢＩ－８３６８８０、ＨｕＭａｂ Ｇ６－３１、Ｂ２０－４．１、ＢＡＴ－５９０６、ナビシキシズマブ、ジルパキマブ、ｈＰＶ－１９及びＡＴ－００１からなる群から選択されるいずれか１つの可変部位を含み得る。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、ＫＳＩ－３０１、バヌシズマブ、ＢＩ－８３６８８０又はＢＡＴ－５９０６の可変領域を含み得る。

【0046】

この時、アフリベルセプトは、血管においてＶＥＧＦ－Ａ及びＰｌＧＦを阻害する組換えヒト化融合タンパク質を指す。アフリベルセプトを眼に直接注射することができる。ベバシズマブは、血管内でＶＥＧＦ－Ａを阻害することによって血管の増殖を阻害する血管新生阻害剤である抗体である。黄斑変性の治療には、ベバシズマブを眼に直接注射することができる。ラニビズマブは、血管新生を阻害することによって湿潤型黄斑変性の治療に有効なＦａｂである。ラムシルマブは、血管新生を媒介する物質又はＶＥＧＦ受容体２を阻害する抗体である。ブロルシズマブは、ＶＥＧＦ－Ａに結合し、血管新生を阻害し、湿潤型黄斑変性症を治療するｓｃＦｖである。ファリシマブは、ＶＥＧＦ－Ａ及びアンジオポエチン－２を阻害する二重特異性抗体である。

【0047】

さらに、ＫＳＩ－３０１は湿潤型黄斑変性の治療に有効な抗体である。バヌシズマブは、ＶＥＧＦ－Ａ及びアンジオポエチン－２を阻害する二重特異性ヒト化モノクローナル抗体である。ＢＩ－８３６８８０は、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン－２を阻害するヒト化二重特異性ナノボディである。ＨｕＭａｂ Ｇ６－３１は、ヒトＶＥＧＦを阻害するＦａｂ断片である。Ｂ２０－４．１は、ヒトＶＥＧＦを阻害するｓｃＦｖ断片である。

【0048】

さらに、ＢＡＴ－５９０６は湿潤型黄斑変性の治療に有効な抗体である。ナビシキシズマブは抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。ジルパキマブは抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重特異性抗体であり、ＡＢＴ－１６５とも称される。ｈＰＶ－１９は、抗血管新生及び抗腫瘍活性を有する抗ＶＥＧＦ抗体である。ＡＴ－００１はヒトＶＥＧＦ受容体３を阻害することにより血管新生を阻害する抗体である。

【0049】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＢＩ－８３６８８０の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は配列番号８８のＣＤＲ１、配列番号８９のＣＤＲ２及び配列番号９０のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み得る。

【0050】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号９１のＨＣＤＲ１、配列番号９２のＨＣＤＲ２及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号９４のＬＣＤＲ１、配列番号９５のＬＣＤＲ２及び配列番号９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0051】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はラニビズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号９７のＨＣＤＲ１、配列番号９８のＨＣＤＲ２及び配列番号９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１００のＬＣＤＲ１、配列番号１０１のＬＣＤＲ２及び配列番号１０２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0052】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はラムシルマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１０３のＨＣＤＲ１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２及び配列番号１０５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0053】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はファリシマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１０９のＨＣＤＲ１、配列番号１１０のＨＣＤＲ２及び配列番号１１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１１２のＬＣＤＲ１、配列番号１１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0054】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＫＳＩ－３０１の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１１５のＨＣＤＲ１、配列番号１１６のＨＣＤＲ２及び配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２及び配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0055】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はバヌシズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１２１のＨＣＤＲ１、配列番号１２２のＨＣＤＲ２及び配列番号１２３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１２４のＬＣＤＲ１、配列番号１２５のＬＣＤＲ２及び配列番号１２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0056】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＢＡＴ－５９０６の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１２７のＨＣＤＲ１、配列番号１２８のＨＣＤＲ２及び配列番号１２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１３０のＬＣＤＲ１、配列番号１３１のＬＣＤＲ２及び配列番号１３２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0057】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はナビシキシズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１３３のＨＣＤＲ１、配列番号１３４のＨＣＤＲ２及び配列番号１３５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１３６のＬＣＤＲ１、配列番号１３７のＬＣＤＲ２及び配列番号１３８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0058】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はジルパキマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１３９のＨＣＤＲ１、配列番号１４０のＨＣＤＲ２及び配列番号１４１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１４２のＬＣＤＲ１、配列番号１４３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0059】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はｈＰＶ－１９の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１４５のＨＣＤＲ１、配列番号１４６のＨＣＤＲ２及び配列番号１４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１４８のＬＣＤＲ１、配列番号１４９のＬＣＤＲ２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0060】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＡＴ－００１の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１５１のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２及び配列番号１５３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１５４のＬＣＤＲ１、配列番号１５５のＬＣＤＲ２及び配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0061】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１５７の重鎖及び配列番号１５８の軽鎖；配列番号１５９の重鎖可変領域及び配列番号１６０の軽鎖；配列番号１６１の重鎖及び配列番号１６２の軽鎖；配列番号１６３の重鎖及び配列番号１６４の軽鎖；配列番号１６５の重鎖及び配列番号１６６の軽鎖；配列番号１６７の重鎖及び配列番号１６８の軽鎖；配列番号１６９の重鎖及び配列番号１７０の軽鎖；配列番号１７１の重鎖及び配列番号１７２の軽鎖；配列番号１７３の重鎖及び配列番号１７４の軽鎖；配列番号１７５の重鎖可変領域及び配列番号１７６の軽鎖可変領域；又は配列番号１７７の重鎖可変領域及び配列番号１７８の軽鎖可変領域を含み得る。

【0062】

抗ＶＥＧＦ抗体の断片はｓｃＦｖ（単鎖可変断片）であってもよい。この時、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結した形態を指す。具体的には、ｓｃＦｖは、配列番号１７９のＣＤＲ１、配列番号１８０のＣＤＲ２、配列番号１８１のＣＤＲ３、配列番号１８２のＣＤＲ４、配列番号１８３のＣＤＲ５及び配列番号１８４のＣＤＲ６を含む可変領域を含み得る。さらに、ｓｃＦｖは配列番号１８５のアミノ酸配列を含み得る。この時、ｓｃＦｖの一実施形態はブロルシズマブであってもよい。

【0063】

抗ＶＥＧＦ抗体はＨｕＭａｂ Ｇ６－３１又はＢ２０－４．１の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１８６のＨＣＤＲ１、配列番号１８７のＨＣＤＲ２及び配列番号１８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１８９のＬＣＤＲ１、配列番号１９０のＬＣＤＲ２及び配列番号１９１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、該抗体は、配列番号１９２のＨＣＤＲ１、配列番号１９３のＨＣＤＲ２及び配列番号１９４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１９５のＬＣＤＲ１、配列番号１９６のＬＣＤＲ２及び配列番号１９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0064】

ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、限定されることなく、当業者に公知の任意の抗体を指すことができる。別の例として、抗体は、米国特許第９，５２７，９２５号、米国特許第８，２６８，３１４号又は米国特許出願公開第２０１９－０１６７７９０号に開示された抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片であってもよい。

【0065】

リンカー及びＦｃバリアント
Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片、及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、リンカーによって連結されていてもよい。この時、リンカーはペプチドリンカー、免疫グロブリン断片、又はそれらの組み合わせであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0066】

リンカーは２つのタンパク質を連結する。リンカーの一実施形態は、１～５０個のアミノ酸、アルブミン又はその断片、免疫グロブリンのＦｃドメインなどを含み得る。この時、免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域並びに軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を指す。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってもよく、好ましくはＩｇＧ１であってもよい。この時、野生型免疫グロブリンＧ１のＦｃドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を有し得る。本明細書で使用する場合、Ｆｃドメインは、ヒンジ領域を除いて、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む領域を指し得る。

【0067】

さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインだけでなく、Ｆｃドメインバリアントであってもよい。さらに、本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃドメインバリアント」は、グリコシル化パターンの点で野生型Ｆｃドメインとは異なる形態、野生型Ｆｃドメインと比較して高いグリコシル化を有する形態、又は野生型Ｆｃドメインと比較して低いグリコシル化を有する形態、又は脱グリコシル化形態を指し得る。さらに、グリコシル化されていないＦｃドメインが本明細書に含まれる。Ｆｃドメイン又はこれらのバリアントは、宿主の培養条件又は遺伝子操作を通じて、調整された数のシアル酸、フコシル化又はグリコシル化を有するように調整され得る。

【0068】

さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインのグリコシル化を従来の方法、例えば、化学的方法、酵素的方法及び微生物を使用する遺伝子工学的方法によって修飾することができる。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭのそれぞれのＦｃ領域が混合された形態であってもよい。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸が他のアミノ酸で置換された形態であってもよい。

【0069】

本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃドメインバリアント」は、野生型Ｆｃドメインのグリコシル化が変化し、Ｆｃドメイン間の配列が混合され、又は野生型Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸が欠失、変更、置換、及び／若しくは付加されたＦｃドメインを指す。野生型Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸の欠失、変化、置換及び／又は付加は、当業者に既知の方法によって行うことができる。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、野生型Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸配列が置換及び／又は付加されたものであってもよい。

【0070】

置換及び／又は付加によって導入される「アミノ酸」は、リジン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。

【0071】

Ｆｃドメイン変異は、抗体の活性又は機能を調節するためであり得る。一実施形態では、Ｆｃドメイン変異は、抗体のエフェクター機能又は抗体細胞毒性活性を調節するためであり得る。

【0072】

一実施形態では、ＦｃドメインバリアントはＤＡＮＧ変異を含み得る。この時、「ＤＡＮＧ変異」は、ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａのエフェクター機能を除去するＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇ変異を指す。

【0073】

ＩｇＧ分子のＦｃ領域によって媒介されるエフェクター機能には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。一般に、これらのエフェクター機能は、Ｆｃ領域と結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）との結合を必要とする。

【0074】

エフェクター機能は、変異していないＦｃ領域のアミノ酸配列の置換によって変化させることができ、エフェクター機能が変化するＦｃ領域は、例えば、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合を改変することによって設計することができ、それによってＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を変化させることができる。すなわち、「ＤＡＮＧ変異」とは、Ｆｃ領域によって媒介されるエフェクター機能がＩｇＧ分子から除去され、抗体産生時に望ましくないエフェクター機能低下が起こらないようにすることを意味する。

【0075】

Ｆｃドメインバリアントの一実施形態は、配列番号６８のアミノ酸配列におけるＤ２７Ａ、Ｎ５９Ｇ、Ｄ１１８Ｅ、Ｌ１２０Ｍ、Ｄ２７Ａ／Ｎ５９Ｇ、又はＤ２７Ａ／Ｎ５９Ｇ／Ｄ１１８Ｅ／Ｌ１２０Ｍの置換であり得る。さらに、配列番号６８のアミノ酸配列の２０９位にリジン（Ｋ）を付加してもよい。具体的には、Ｆｃドメインバリアントの一実施形態は、配列番号６２～６７のアミノ酸配列のいずれか１つを有し得る。

【0076】

融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカーとして使用して、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質が連結された構造、或いはＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質及びＣ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片が、それぞれそのＮ末端及びＣ末端に連結された構造を有し得る。ＦｃドメインのＮ末端又はＣ末端と、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片、或いはＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質との間の連結は、場合によりリンカーペプチドによって達成することができる。

【0077】

融合タンパク質の構造
具体的には、融合タンパク質は、以下の構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン又はそのバリアント－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン又はそのバリアント－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
からなってもよく、
構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
ＸはＣ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片であり、
ＹはＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質であり、
リンカー（１）及び（２）はペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立的に０又は１である。

【0078】

Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質、及びＦｃドメインは、それぞれ上述の通りである。

【0079】

本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」は、タンパク質内で特定の機能を担う２つ以上のタンパク質又はドメインが、各タンパク質又はドメインがそれ自身の機能を果たすように連結された組換えタンパク質を指す。２つ以上のタンパク質又はドメインの間には、一般的に柔軟な構造を有するリンカーペプチドを挿入することができる。

【0080】

この時、ペプチドリンカー（１）は、５～８０個の連続したアミノ酸、７～７０個の連続したアミノ酸、又は１０～６０個の連続したアミノ酸又は１２～５０個のアミノ酸からなり得る。一実施形態では、ペプチドリンカー（１）は３０個のアミノ酸からなり得る。さらに、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも１つのシステインを含み得る。具体的には、１、２、又は３個のシステインを含み得る。さらに、ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジに由来するものであってもよく、（Ｇ_４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１～１０の整数である）をさらに含んでいてもよい。一実施形態では、ペプチドリンカー（１）は、配列番号５３～５７のアミノ酸配列のいずれか１つからなるペプチドリンカーであってもよい。

【0081】

ペプチドリンカー（２）は、１～５０個の連続したアミノ酸、又は３～３０個の連続したアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸からなり得る。一実施形態では、ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ_４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１～１０の整数である）であり得る。この時、（Ｇ_４Ｓ）ｎのｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい。一実施形態では、ペプチドリンカー（２）は、配列番号５８～６１のアミノ酸配列のいずれか１つからなるペプチドリンカーであってもよい。

【0082】

一実施形態では、抗体断片は、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖであってもよい。

【0083】

具体的には、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0084】

さらに、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号３１のＬＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣＤＲ２及び配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0085】

さらに、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２及び配列番号３８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0086】

一実施形態では、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、Ｃ３ｂに特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0087】

一実施形態では、抗体断片は、Ｃ５に特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖであってもよい。

【0088】

具体的には、Ｃ５に特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４８のＬＣＤＲ２及び配列番号４９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0089】

一実施形態では、Ｃ５に特異的に結合するＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0090】

本発明の融合タンパク質は、抗Ｃ３ｂ抗体の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、並びに抗Ｃ３ｂ抗体の重鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）、Ｆｃドメイン、並びにＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質を含み得る。この時、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つのタンパク質が抗Ｃ３ｂ抗体に含まれていてもよい。さらに、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、抗Ｃ３ｂ抗体のＣ末端に結合していてもよい。

【0091】

さらに、本発明の融合タンパク質は、抗Ｃ５抗体の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、並びに抗Ｃ５抗体の重鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）、Ｆｃドメイン、並びにＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質を含み得る。この時、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つのタンパク質が抗Ｃ５抗体に含まれていてもよい。さらに、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、抗Ｃ５抗体のＣ末端に結合していてもよい。

【0092】

一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のポリペプチド及び配列番号９のポリペプチド；配列番号４のポリペプチド及び配列番号１０のポリペプチド；配列番号６のポリペプチド及び配列番号１１のポリペプチド；配列番号８のポリペプチド及び配列番号１２のポリペプチド；配列番号１３のポリペプチド；配列番号１４のポリペプチド；配列番号１５のポリペプチド；又は配列番号１６のポリペプチドを含み得る。

【0093】

具体的には、配列番号２、４、及び６は、それぞれ抗Ｃ３ｂ抗体の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む融合タンパク質のアミノ酸配列である。さらに、配列番号９、１０、及び１１は、それぞれｉ）抗Ｃ３ｂ抗体の重鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）、ｉｉ）Ｆｃドメイン、並びにｉｉｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含むアミノ酸配列である。

【0094】

さらに、配列番号８は抗Ｃ５抗体の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む融合タンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号１２はｉ）抗Ｃ５抗体の重鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）、ｉｉ）Ｆｃドメイン、並びにｉｉｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含むアミノ酸配列である。

【0095】

この時、配列番号２と９との組み合わせ、配列番号４と１０との組み合わせ、配列番号６と１１との組み合わせ、及び配列番号８と１２との組み合わせは、それぞれジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）結合によって連結され、非共有結合的相互作用によって一緒に維持される。

【0096】

具体的には、配列番号１３、１４、及び１５はそれぞれ、ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質、ｉｉ）Ｆｃドメイン、ｉｉｉ）抗Ｃ３ｂ抗体の重鎖可変領域、及びｉｖ）抗Ｃ３ｂ抗体の軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖを含むアミノ酸配列である。

【0097】

さらに、配列番号１６は、ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質、ｉｉ）Ｆｃドメイン、ｉｉｉ）抗Ｃ５抗体の重鎖可変領域、及びｉｖ）抗Ｃ５抗体の軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖを含むアミノ酸配列である。

【0098】

別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のポリペプチド及び配列番号９のポリペプチド；配列番号４のポリペプチド及び配列番号１０のポリペプチド；配列番号６のポリペプチド及び配列番号１１のポリペプチド；配列番号８のポリペプチド及び配列番号１２のポリペプチド；配列番号１３のポリペプチド；配列番号１４のポリペプチド；配列番号１５のポリペプチド；又は配列番号１６のポリペプチドと８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。この時、同一性は、例えば、パーセント相同性であり、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアなどの相同性比較ソフトウェアによって決定することができる。

【0099】

融合タンパク質二量体
本発明の別の態様では、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む２つの融合タンパク質が互いに結合した融合タンパク質二量体が提供される。

【0100】

この時、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、これに限定されないがリンカーに存在するシステインによって形成されるジスルフィド結合によって達成され得る。二量体を構成する融合タンパク質は同じであっても互いに異なっていてもよい。好ましくは、二量体はホモ二量体であってもよい。

【0101】

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様では、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。具体的には、ポリヌクレオチドは、配列番号７７のポリヌクレオチド及び配列番号７０のポリヌクレオチド；配列番号７８のポリヌクレオチド及び配列番号７２のポリヌクレオチド；配列番号７９のポリヌクレオチド及び配列番号７４のポリヌクレオチド；配列番号８０のポリヌクレオチド及び配列番号７６のポリヌクレオチド；配列番号８１のポリヌクレオチド；配列番号８２のポリヌクレオチド；配列番号８３のポリヌクレオチド；又は配列番号８４のポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドでは、１つ又は複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又はそれらの組み合わせによって変異していてもよい。ヌクレオチド配列が化学合成によって調製される場合、当技術分野で公知の合成法、例えば、Ｅｎｇｅｌｓ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ＩｎｔＥｄ Ｅｎｇｌ．、３７：７３－１２７， １９８８）に記載された合成法を使用することができる。このような方法としては、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホルアミダイト法及びＨ－ホスフェート法、ＰＣＲ法及び他のオートプライマー法、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成法などを挙げることができる。

【0102】

一実施形態によると、ポリヌクレオチドは、配列番号７７のポリヌクレオチド及び配列番号７０のポリヌクレオチド；配列番号７８のポリヌクレオチド及び配列番号７２のポリヌクレオチド；配列番号７９のポリヌクレオチド及び配列番号７４のポリヌクレオチド；配列番号８０のポリヌクレオチド及び配列番号７６のポリヌクレオチド；配列番号８１のポリヌクレオチド；配列番号８２のポリヌクレオチド；配列番号８３のポリヌクレオチド；又は配列番号８４のポリヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％の同一性を有する核酸配列を含み得る。

【0103】

ポリヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列をコードする核酸をさらに含み得る。本明細書で使用する場合、用語「シグナル配列」は、標的タンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドを指す。シグナルペプチドは翻訳され、次いで、宿主細胞内で切断される。具体的には、シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）膜を横断したタンパク質の移動を起こすアミノ酸配列である。

【0104】

シグナル配列は、その特性について当技術分野でよく知られている。このようなシグナル配列は、典型的には１６～３０のアミノ酸残基を含み、このようなアミノ酸残基よりも多い又は少ないアミノ酸残基を含み得る。典型的なシグナルペプチドは、３領域、すなわち、Ｎ末端領域；中央疎水性領域；及びより極性のＣ末端領域から構成される。中央疎水性領域は、未熟なポリペプチドが膜脂質二重層を移動する際にシグナル配列を固定化する４～１２の疎水性残基を含む。

【0105】

開始後、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼとして一般に公知である細胞酵素によってＥＲの内腔で切断される。この時、シグナル配列は、ｔＰａ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、ＨＳＶ ｇＤｓ（単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄのシグナル配列）、又は成長ホルモンの分泌シグナル配列であってもよい。好ましくは、哺乳動物などを含めた高等真核細胞で使用される分泌シグナル配列を使用することができる。

【0106】

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを搭載したベクター
本発明の別の態様では、該ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

【0107】

ベクターは、宿主細胞に導入され、宿主細胞のゲノム中に組み換えられ、挿入され得る。或いは、ベクターは、エピソームとして自発的に複製可能なポリヌクレオチド配列を含む核酸手段と理解される。ベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター及びこれらの類似体が挙げられる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0108】

具体的には、ベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどを挙げることができ、商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰなど）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰなど）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなど）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルスなど）を挙げることができる。ベクターは宿主細胞に応じて異なるタンパク質の発現レベル及び修飾を示すので、目的に最も適した宿主細胞を選択及び使用することが好ましい。

【0109】

本明細書で使用する場合、標的タンパク質の「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、及び融合タンパク質生成物又はその断片の分泌を意味すると理解される。有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）又はそのバリアントであり得る。発現ベクターは、哺乳動物細胞で標的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及び転写後にＲＮＡの定常レベルを増加させるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含み得る。

【0110】

融合タンパク質を発現する形質転換細胞
本発明の別の態様では、該ベクターが導入された形質転換宿主細胞が提供される。

【0111】

形質転換細胞の宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞、及び哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は細胞起源の細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。原核細胞の例として、大腸菌を使用することができる。さらに、真核細胞の例として、酵母を使用することができる。さらに、哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などを使用することができる。しかし、哺乳動物細胞はこれに限定されるものではなく、哺乳動物宿主細胞として使用可能であることが当業者に公知の細胞であれば、どのような細胞でも使用することができる。

【0112】

さらに、発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、ＣａＣｌ_２沈殿法、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの還元物剤をＣａＣｌ_２沈殿法で使用することによって効率が高められるＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラスト融合法、炭化ケイ素繊維を使用する撹拌法、アグロバクテリウム媒介性形質転換法、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミンを使用する形質転換法、及び乾燥／阻害媒介性形質転換法などを使用することができる。

【0113】

上記のように、治療剤としての融合タンパク質の特性を最適化するため、又は他の目的のために、当業者に公知の方法を介して宿主細胞が有するグリコシル化関連遺伝子を操作することによって、融合タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、シアル酸、フコシル化、グリコシル化）を調整することができる。

【0114】

融合タンパク質を生成するための方法
本発明の別の態様では、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質を生成する方法が提供され、該方法は、形質転換細胞を培養する工程を含む。具体的には、生成方法は、ｉ）形質転換細胞を培養して培養産物を得る工程；及びｉｉ）培養産物から融合タンパク質を回収する工程を含み得る。

【0115】

形質転換細胞を培養するための方法は、当技術分野で広く既知である方法を使用して行うことができる。具体的には、培養は、バッチプロセスで行うことができ、又はフェドバッチ若しくは反復フェドバッチプロセスで連続的に行うことができる。

【0116】

融合タンパク質又はその二量体の使用
本発明の別の態様では、眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質、又は２つの融合タンパク質が互いに結合した融合タンパク質二量体を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。

【0117】

融合タンパク質及び融合タンパク質二量体は上記の通りである。

【0118】

本明細書で使用する場合、用語「眼疾患」は、眼に起こる疾患の総称であり得る。眼疾患は、補体活性若しくは血管新生によって誘発されるか若しくは悪化する眼疾患又は主な状態として過剰な血管新生を含む眼疾患を指し得る。眼疾患は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病網膜症及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生並びに網膜血管新生からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。

【0119】

医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の形態、投与の経路及び継続期間に応じて変動し、当業者が適切に選択することができる。本発明の眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物において、有効成分は、有効成分が眼疾患を治療する活性を示すか、又は特に、黄斑変性に対して治療効果を示すことができる限り、使用、剤形、調合目的などに従って任意の量（有効量）で含めることができる。従来の有効量は、組成物の総重量に基づいて、０．００１ｗｔ％～２０．０ｗｔ％の範囲内で決定されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、眼疾患の状況を改善又は治療する効果、特に、黄斑変性の状況を改善又は治療する効果を誘導することができる有効成分の量を指す。そのような有効量は、当業者の常識の範囲内で実験的に決定することができる。

【0120】

本明細書で使用する場合、用語「治療」は、療法的治療と予防的治療の両方を含むという意味で使用することができる。この時、予防は、対象の病態又は疾患を緩和する又は低減させることを意味するように使用することができる。一実施形態では、用語「治療」は、ヒトを含めた哺乳動物で疾患を治療するための適用又は投与の任意の形態の両方を含む。さらに、本用語は、疾患又は疾患の進行を阻害又は緩徐化することを含み、且つ部分的若しくは完全に疾患を緩和するために、損なわれたか若しくは失われた機能を回復させるか若しくは修復する；非効率的なプロセスを刺激する；又は重大な疾患を緩和する意味を含む。

【0121】

バイオアベイラビリティなどの薬物動態パラメーター及びクリアランス速度などの根底にあるパラメーターも有効性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、「増強された有効性」（例えば、有効性の向上）は、向上した薬物動態パラメーター及び向上した有効性による可能性があり、実験動物又はヒト対象においてクリアランス速度及び眼疾患の治療又は改善などのパラメーターを比較することによって、測定することができる。

【0122】

本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」又は「医薬的有効量」は、目的の疾患を予防又は治療するのに有効な化合物又は組成物の量を指し、医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険比で疾患を治療するのに十分であり、且つ副作用を引き起こさない。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類及び重症度、薬物の活性、薬物に対する患者の感受性、投与様式、投与時間、投与経路及び排出速度、治療期間、組み合わせ又は同時に使用される薬物、並びに医療分野で周知の他の因子を含めた因子に従って、決定することができる。一実施形態では、治療有効量は、眼疾患を治療するのに有効な薬物の量を意味する。

【0123】

この時、医薬組成物は医薬的に許容可能な担体をさらに含み得る。医薬的に許容可能な担体は、担体が患者への送達に適した非有害物質である限り、いかなる担体であってもよい。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性な固体を担体として含有することができる。医薬的に許容可能な補助剤（バッファー、分散剤）も医薬組成物中に含有することができる。

【0124】

具体的には、有効成分に加えて医薬的に許容可能な担体を含むことにより、医薬組成物は、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、投与経路に従って非経口剤形で調製することができる。この時、用語「医薬的に許容可能な」は、有効成分の活性を阻害せず、且つ適用（処方）される対象が適合可能なものを越えた毒性を担体が持たないことを意味する。

【0125】

医薬組成物が非経口製剤で調製される場合、適切な担体と共に、当技術分野で公知の方法に従って、注射剤、経皮パッチ剤、鼻吸入剤、及び坐剤の形態で製剤化することができる。注射として製剤化される場合、滅菌水、エタノール、ポリオール、例えば、グリセロール若しくはプロピレングリコール又はこれらの混合物を適切な担体として使用することができ、等張液、例えば、リンゲル溶液、トリエタノールアミン含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、注射用無菌水又は５％デキストロースなどを好ましく使用することができる。医薬組成物の製剤は当技術分野で既知であり、具体的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、１９９５）などを参照することができる。本文献は、本明細書の一部と考えられる。

【0126】

医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態、体重、性別、年齢、患者の重症度、及び投与経路に従って、１日あたり０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲又は０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であってもよい。投与は１日１回でも、１日数回に分けてもよい。そのような投薬量は、いかなる態様においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0127】

医薬組成物を適用する（処方する）ことができる対象は哺乳動物及びヒトであり、ヒトが特に好ましい。有効成分に加えて、本発明の医薬組成物は、眼疾患、特に黄斑変性に対して治療効果を有することが公知である任意の化合物又は天然抽出物をさらに含み得る。

【0128】

本発明の別の態様では、眼疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質又はその二量体を含む融合タンパク質の使用を提供する。

【0129】

本発明の別の態様では、眼疾患を治療又は予防するための方法であって、Ｃ３ｂ又はＣ５に特異的に結合する抗体断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質又は二量体を含む融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0130】

融合タンパク質、２つの融合タンパク質が互いに結合した融合タンパク質二量体、及び眼疾患は上記の通りである。この場合、対象は、眼疾患を罹患する対象であってもよい。さらに、対象は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトであってもよい。

【0131】

融合タンパク質又は融合タンパク質二量体の投与経路、投薬量及び投与頻度は、患者の状態及び副作用の有無に従って、様々な様式及び量で行うことができるので、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、様々な方法及び量で対象に投与することができる。最適な投与方法、投薬量、及び投与頻度は、当業者が適切な範囲内で選択することができる。さらに、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、治療される疾患に関して治療効果が公知である他の薬物若しくは生理活性物質と組み合わせて投与することができるか、又は他の薬物との配合製剤の形態で製剤化することができる。

【実施例】

【0132】

以下に、以下の実施例により本発明をより詳細に記載する。しかし、以下の実施例は本発明を説明するためだけであり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

【0133】

調製実施例１．融合タンパク質の調製

【0134】

【表1】

【0135】

［配列番号１］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６１１の重鎖配列である。

【0136】

［配列番号２］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６１１の軽鎖配列である。

【0137】

［配列番号３］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６７５の重鎖配列である。

【0138】

［配列番号４］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６７５の軽鎖配列である。

【0139】

［配列番号５］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７の重鎖可変領域配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域配列、及びＤＡＮＧ変異（Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ）によりエフェクター機能が除去されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃから構成される。

【0140】

［配列番号６］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７の軽鎖配列である。

【0141】

［配列番号７］はヒト抗Ｃ５（抗Ｃ５）抗体エクリズマブの重鎖可変領域配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域配列、及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧから構成される。

【0142】

［配列番号８］はヒト抗Ｃ５抗体エクリズマブの軽鎖配列である。

【0143】

［配列番号９］はヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６１１の重鎖可変領域配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域配列、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５９）、及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位から構成される。

【0144】

［配列番号１０］は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６７５の重鎖可変領域配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域配列、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位から構成される。

【0145】

［配列番号１１］は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７の重鎖可変領域配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域配列、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位から構成される。

【0146】

［配列番号１２］は、ヒト抗Ｃ５抗体エクリズマブの重鎖可変領域配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域配列、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位から構成される。

【0147】

［配列番号１３］は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位、リンカーＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６０）、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６１１の重鎖可変領域配列、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）、及びＭＯＲ０９６１１の軽鎖可変領域配列から構成される。

【0148】

［配列番号１４］は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位、リンカーＧＧＧＧＳ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６７５の重鎖可変領域配列、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及びＭＯＲ０９６７５の軽鎖可変領域配列から構成される。

【0149】

［配列番号１５］は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位、リンカーＧＧＧＧＳ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７の重鎖可変領域配列、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及びＳ７７の軽鎖可変領域配列から構成される。

【0150】

［配列番号１６］は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位、リンカーＧＧＧＧＳ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ヒト抗Ｃ５抗体エクリズマブの軽鎖可変領域配列、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及びエクリズマブの重鎖可変領域配列から構成される。

【0151】

［配列番号１７］は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧから構成される。

【0152】

［配列番号１８］は、ヒトＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～２８３）、リンカーＧＧＧＧＳ、及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧから構成される。

【0153】

［配列番号１９］は、アフリベルセプトの配列から構成される。

【0154】

ＭＯＲ０９６１１（配列番号１及び２）は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体である。

【0155】

ＭＯＲ０９６７５（配列番号３及び４）は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体である。

【0156】

Ｓ７７（配列番号５及び６）は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体である。

【0157】

エクリズマブ（配列番号７及び８）は、ヒト抗Ｃ５抗体である。

【0158】

ＰＲＯ２３６（配列番号２及び９）は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６１１及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0159】

ＰＲＯ２３７（配列番号４及び１０）は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６７５及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0160】

ＰＲＯ２３８（配列番号６及び１１）は、ヒト抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0161】

ＰＲＯ２３９（配列番号８及び１２）は、ヒト抗Ｃ５抗体エクリズマブ及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0162】

ＰＲＯ２４０（配列番号１３）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位及びヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６１１の単鎖可変領域断片（単鎖可変断片、ｓｃＦｖ）配列がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0163】

ＰＲＯ２４１（配列番号１４）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位及びヒト抗Ｃ３ｂ抗体ＭＯＲ０９６７５配列の単鎖可変領域断片配列がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0164】

ＰＲＯ２４２（配列番号１５）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位及びヒト抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７の単鎖可変領域断片配列がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0165】

ＰＲＯ２４３（配列番号１６）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位及びヒト抗Ｃ５抗体エクリズマブの単鎖可変領域断片配列がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去した二重特異性抗体である。

【0166】

ＫＮＰ－３０１（配列番号１８）は、ヒトＣＲＩｇの細胞外ドメイン領域及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合部位がそれぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、エフェクター機能を除去したＦｃ融合タンパク質二量体である。

【0167】

［配列番号１］抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６１１）ＨＣ

【化1】

【0168】

［配列番号２］抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６１１）ＬＣ

【化2】

【0169】

［配列番号３］抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６７５）ＨＣ

【化3】

【0170】

［配列番号４］抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６７５）ＬＣ

【化4】

【0171】

［配列番号５］抗Ｃ３ｂ（Ｓ７７）ＨＣ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ

【化5】

【0172】

［配列番号６］抗Ｃ３ｂ（Ｓ７７）ＬＣ

【化6】

【0173】

［配列番号７］抗Ｃ５（エクリズマブ）ＨＣ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ

【化7】

【0174】

［配列番号８］抗Ｃ５（エクリズマブ）ＬＣ

【化8】

【0175】

［配列番号９］抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６１１）ＨＣ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー

【化9】

【0176】

［配列番号１０］抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６７５）ＨＣ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー

【化10】

【0177】

［配列番号１１］抗Ｃ３ｂ（Ｓ７７）ＨＣ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー

【化11】

【0178】

［配列番号１２］抗Ｃ５（エクリズマブ）ＨＣ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー

【化12】

【0179】

［配列番号１３］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６１１）ｓｃＦｖ

【化13】

【0180】

［配列番号１４］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－抗Ｃ３ｂ（ＭＯＲ０９６７５）ｓｃＦｖ

【化14】

【0181】

［配列番号１５］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－抗Ｃ３ｂ（Ｓ７７）ｓｃＦｖ

【化15】

【0182】

［配列番号１６］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－抗Ｃ５（エクリズマブ）ｓｃＦｖ

【化16】

【0183】

［配列番号１７］ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ

【化17】

【0184】

［配列番号１８］ｈｕ ＣＲＩｇ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー

【化18】

【0185】

［配列番号１９］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ

【化19】

【0186】

調製実施例２．タンパク質の調製

【0187】

調製実施例２．１．ベクター組成及びプラスミドマキシプレップ
使用される試薬及び機器は、以下の表２及び３に記載されている。

【0188】

【表2】

【0189】

【表3】

【0190】

合成ＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物をゲルによって精製した。ｐＴＴ５ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、次いで、ゲルを精製した。インフュージョンキットを使用して、各ＰＣＲ産物及び直鎖状ベクターをライゲーションした。生成したベクターでＥＣＯＳ１０１ ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、該細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ寒天プレートで培養した。すべての操作プロセスは、標準的な形質転換プロトコールに従って行った。コロニーＰＣＲによって陽性の組換え産物を同定し、組換えプラスミドに対して配列検証シークエンシングを行った。単一コロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２×ＹＴ培地に種培養物を播種した。３７℃で８時間振盪培養した。

【0191】

その後、２００ｍＬの２×ＹＴ選択培地に１：１，０００の比で種培養物を希釈した。３７℃で１６時間振盪培養した。４℃で４，７００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって細菌細胞を採取した。細菌ペレットを１２ｍＬのＲＥＳ－ＥＦバッファーに再懸濁した。その後、１２ｍＬのＬＹＳ－ＥＦバッファーを加え、密閉したチューブを勢いよく反転させて十分に混合し、次いで、室温で５分間インキュベートした。１２ｍＬのＮＥＵ－ＥＦバッファーを可溶化液に加え、勢いよく反転させて、十分且つ迅速に混合した。ヌクレオボンド（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ）（登録商標）エクストラ（Ｘｔｒａ）カラムフィルターに可溶化液を注入する前に、フィルターの目詰りを防止するために、可溶化液チューブを３回反転させることによって沈殿物の均一な懸濁液を調製した。

【0192】

その後、ヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムフィルター及びヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムを１０ｍＬのフィルター洗浄バッファーＦＩＬ－ＥＦで洗浄した。カラムを引き抜くか又は反転させることによってヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムフィルターを除去した。ヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムを９０ｍＬの洗浄バッファーＥＮＤＯで洗浄した。

【0193】

ヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムを４５ｍＬの洗浄バッファーＷＡＳＨ－ＥＦで洗浄した。プラスミドＤＮＡを１５ｍＬの溶出バッファーＥＬＵで溶出した。溶出液を５０ｍＬの遠心チューブに収集した。１０．５ｍＬの室温のイソプロパノールを加えて、溶出したプラスミドＤＮＡを沈殿させた。ボルテックスした後、混合物を２分間放置した。

【0194】

その後、５ｍＬの７０％エタノールをペレットに加えた。ピペットチップを使用して、エタノールを慎重且つ完全にチューブから除去した。室温（２０～２５℃）でペレットを乾燥させた。その後、１，０００μＬの精製水でＤＮＡペレットを溶解した。

【0195】

調製実施例２．２．細胞トランスフェクション及びタンパク質発現
使用される材料及び試薬は、以下の表４に記載されている。

【0196】

【表4】

【0197】

完全培地を含有する２９３Ｆ種株を１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で維持した。０．３×１０^６細胞／ｍｌ～０．４×１０^６細胞／ｍＬの密度で細胞を培養し、２～３日ごとに培地を交換した。トランスフェクションの２４時間前に、新しく継代培養された２９３Ｆ細胞を２．６×１０^６細胞／ｍＬで調製した。調製した細胞を１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で培養した。

【0198】

トランスフェクションの当日に、新鮮な培地を使用して、細胞の密度を５．０×１０^６細胞／ｍＬに調整した。調整は、３Ｌシェーカーフラスコ中で１Ｌの全量で行った。０．４ｍｇのＨＣプラスミド及び０．６ｍｇのＬＣプラスミドを５０ｍＬのＯＰＴＩ ＭＥＭ Ｉで希釈しこれを０．２２μｍのフィルターで濾過した。その後、２ｍｇのＰＥＩを５０ｍＬのＯＰＴＩ ＭＥＭ Ｉで希釈して、トランスフェクション試薬を調製した。

【0199】

希釈したＰＥＩをＤＮＡ混合物に加え、次いで、直ちに混合した。その後、室温で１５分間培養した。２．６×１０^６細胞／ｍＬで調製した２９３Ｆ細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を加えた。その後、１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で２４時間細胞を連続培養した。トランスフェクション後２４時間目に、１０％ペプトンを１／２０の培養溶液に加え、その結果、終濃度が０．５％になった。その後、細胞を１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で培養した。トランスフェクションから２～５日後の期間に、細胞密度／生存率を毎日測定し、記録した。トランスフェクションから７日後に、又は細胞生存率が７０％未満の時に、精製のために細胞を採取した。

【0200】

調製実施例２．３．タンパク質精製
タンパク質精製に使用される、試薬、各バッファーの組成及び機器は、以下の表５～７に記載されている。

【0201】

【表5】

【0202】

【表6】

【0203】

【表7】

【0204】

マブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ）カラムを使用してタンパク質を精製した。具体的には、４℃、２，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって、上清を収集した。その後、ザルトポア２フィルターで上清を濾過した。バッファーＡで平衡化した５ｍＬマブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ）カラムに浄化した上清をロードした。その後、Ａ２８０吸光度がベースラインに達するまでバッファーＡでカラムを洗浄した。さらに、カラムを１０ＣＶのバッファーＢで洗浄した。さらに、カラムを１０ＣＶのバッファーＡで洗浄した。結合したタンパク質を６ＣＶのバッファーＣで溶出し、１／６量のバッファーＤを加えて溶出物質を中和した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析を行った。

【0205】

その後、ＳＥＣカラムを使用してタンパク質を精製した。具体的には、上清を最終バッファーで平衡化したＳＥＣカラムにロードし、最終バッファーでタンパク質を溶出した。

【0206】

その結果、図１ａ～１ｃに示すように、精製された融合タンパク質二量体ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、Ｓ７７、エクリズマブ、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ０１７、ＫＮＰ－３０１、及びアフリベルセプトがＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定された。

【0207】

実験実施例１．ＥＬＩＳＡによる補体タンパク質及びＶＥＧＦへの融合タンパク質の結合親和性の同定
一実施形態の融合タンパク質二量体が補体経路を阻害するかどうかを決定するために、酵素免疫測定法によって、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブがＣ３ｂタンパク質に結合するかどうか、並びにＰＲＯ２３９、エクリズマブ、及びＰＲＯ０１７がＣ５に結合するかどうかを決定した。

【0208】

具体的には、ヒトＣ３ｂタンパク質をプレートに固定化し、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブを結合させた。次に、抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体及び抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を順次結合させた。さらに、ヒトＣ５タンパク質をプレートに固定化し、ＰＲＯ２３９、エクリズマブ、及びＰＲＯ０１７をヒトＣ５に結合させた。

【0209】

その結果、図３ａ及び３ｂに示すように、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、及びＳ７７は濃度依存的にヒトＣ３ｂに結合することが見出された。さらに、図４に示すように、ＰＲＯ２３９及びエクリズマブは濃度依存的にヒトＣ５に結合することが見出された。

【0210】

一実施形態による融合タンパク質が抗ＶＥＧＦ効果を有するかどうかを確認するために、融合タンパク質とヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質との結合を酵素免疫測定法により決定し、ヒトＶＥＧＦ１６５へのＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、及びＰＲＯ０１７の結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定した。

【0211】

具体的には、ヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質をプレートに固定化し、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、ＰＲＯ０１７、及び対照群としてアフリベルセプトを結合させた。次に、抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体及び抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を順次結合させた。

【0212】

その結果、図５ａ及び５ｂに示すように、抗ＶＥＧＦを有するアフリベルセプト、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、及びＰＲＯ２４２は濃度依存的にヒトＶＥＧＦ１６５に結合することが見出された。

【0213】

実験実施例２．溶血解析による代替補体経路阻害効果の解析
一実施形態による融合タンパク質二量体が代替補体経路を阻害するかどうかを決定するために、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブを溶血アッセイ（ＡＨ５０）に供した。具体的には、０．５ｍＬのウサギ赤血球を、４００×ｇで１０分間、遠心分離機を用いてＴＢＳで洗浄した。このプロセスを２回繰り返した後、４００×ｇで１０分間の遠心分離を使用してウサギ赤血球をＧＶＢ ＥＧＴＡバッファーで再度洗浄した。その後、ＧＶＢ ＥＧＴＡバッファーを使用してウサギ赤血球の濃度を１×１０^９細胞／ｍＬに調整した。

【0214】

感作赤血球によってＡＨ５０を解析するために、１２％のヒトＣ１ｑ枯渇血清を９６ウェルプレートに加えた（５０μＬ／ウェル）。さらに、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブを様々な濃度で処理した。４℃で３０分間インキュベーションした後、ウサギ赤血球を加えた（２×１０^６細胞／ウェル、５０μＬ／ウェル）。細胞を３７℃で１．５時間培養し、６００×ｇで１０分間遠心分離した。１１０μＬの上清を収集し、ＯＤ４１５値を測定した。

【0215】

ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブの代替補体経路阻害効果をＡＨ５０溶血アッセイによって同定した。

【0216】

その結果、図６ａ～６ｃに示すように、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブは濃度依存的に代替補体経路による溶血を阻害することが見出された。

【0217】

実験実施例３．溶血解析による古典的補体経路阻害効果の解析
一実施形態による融合タンパク質二量体が代替補体経路を阻害しないかどうかを決定するために、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブを溶血アッセイ（ＣＨ５０）に供した。

【0218】

具体的には、ヒツジのＡｂ感作赤血球をＴＢＳ中で４００×ｇ、１０分間遠心分離し、このプロセスを２回繰り返した後、ヒツジの赤血球をＧＶＢ＋＋バッファーで４００×ｇ、１０分間遠心分離して洗浄した。次に、ヒツジの感作赤血球を、ＧＶＢ＋＋バッファーを使用して１×１０^９個／ｍＬの濃度に調整した。

【0219】

感作赤血球によってＣＨ５０を解析するために、４．５％のヒトＢ因子枯渇血清を９６ウェルプレートに加え（５０μＬ／ウェル）、次いで、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、Ｓ７７、及びエクリズマブを様々な濃度で処理した。４℃で３０分間インキュベーションした後、ヒツジの感作赤血球を加えた（２．５×１０^６細胞／ウェル、５０μＬ／ウェル）。細胞を３７℃で３０分間培養した。１１０μＬの上清を６００×ｇで１０分間遠心分離して収集し、ＯＤ４１５値を測定した。

【0220】

その結果、図７ａ～７ｃに示すように、ＫＮＰ－３０１、ＭＯＲ０９６１１、ＭＯＲ０９６７５、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、及びＳ７７は古典的補体経路による溶血を阻害しないが、ＰＲＯ２３９及びエクリズマブは溶血を阻害することが見出された。

【0221】

実験実施例４．ＶＥＧＦレポーター細胞を使用した、融合タンパク質二量体の有効性の解析
一実施形態の融合タンパク質二量体がＶＥＧＦタンパク質を効果的に阻害するかどうかを決定するために、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体の間の結合を阻害するかどうかを決定した。

【0222】

レポーター細胞を使用して、アフリベルセプト、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、及びＰＲＯ２４２のＶＥＧＦシグナリング阻害効果を同定した。具体的には、ＶＥＧＦが結合すると、受容体媒介性シグナリングによって発光性の光を生成するＶＥＧＦレポーター細胞（ＧＡ３００１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、アフリベルセプト、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４２、及びＰＲＯ０１７がＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との結合を阻害するかどうかを発光の程度で確認した。

【0223】

その結果、図８ａ～８ｃに示すように、アフリベルセプト、ＰＲＯ２３６、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ２３９、ＰＲＯ２４１、及びＰＲＯ２４２は、濃度依存的にＶＥＧＦによる受容体媒介性シグナリングを阻害することが見出された。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【配列表】

2025501913000001.xml

【国際調査報告】