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▶ コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカスの特許一覧 ▶ ワンチェーン イミュノセラピューティクス エセ．エレの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】Ｖデルタ１＋Ｔ細胞を産生する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20250117BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20250117BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20250117BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20250117BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20250117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250117BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250117BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N5/0789
C12N1/00 B
C12Q1/02
C12Q1/6888 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K35/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024541611
(86)(22)【出願日】2023-01-12
(85)【翻訳文提出日】2024-08-05
(86)【国際出願番号】 EP2023050665
(87)【国際公開番号】W WO2023135225
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】22382013.5
(32)【優先日】2022-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504339734
【氏名又は名称】コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス
(71)【出願人】
【識別番号】522357334
【氏名又は名称】ワンチェーン イミュノセラピューティクス エセ．エレ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア レオン マリア ヘスス
(72)【発明者】
【氏名】フエンテス ビジャレホ パトリシア
(72)【発明者】
【氏名】アルカイン サンチェス フアン
(72)【発明者】
【氏名】トリビオ ガルシア マリア ルイサ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア ペレス ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】ディアス コルテス ビクトル マヌエル
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QQ02
4B063QR16
4B063QR72
4B063QS40
4B063QX02
4B065AA94X
4B065BA25
4B065BA30
4B065BD39
4B065BD50
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087MA17
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB33
(57)【要約】
本発明は、癌に対する養子免疫療法への臨床的適用に最適なγδＴ細胞、好ましくはヒトＶδ１＋γδＴ細胞の大規模な選択的生成のための新規かつ効率的な方法に関する。この要点に関しては、臨床で幹細胞の供給源として現在選択されているヒト臍帯血ＨＰＣ及びヒト初期胸腺前駆細胞のどちらも、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に応答して、最も効率的にはＮｏｔｃｈリガンドＪａｇ２に応答して、ｄｅ ｎｏｖｏヒトγδＴ細胞を効率的に生成し得ることを考慮して、この方法は、臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）及び／又はヒトＣＤ３４＋初期胸腺前駆細胞の分化を、これらの前駆細胞をＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドを用いて活性化することによって誘導することを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の拡大集団を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法が、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生じさせる第１の工程であって、該第１の工程が、
ａ．前記ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む前記細胞集団を、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はそのアゴニストを含む適切な培養培地中で生育することと、
ｂ．前記細胞を、前記γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって培養物中で維持することと、
なお、持続時間が約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、前記Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、前記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含み、
前記第１の工程によってもたらされる前記細胞組成物が、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含むことを特徴とする、第１の工程を含み、前記方法が、
前記ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともに、その増殖を誘導する第２の工程であって、該第２の工程が、
前記第１の工程後に得られた前記細胞を、適切な培養培地中、γδＴＣＲアゴニストの存在下、及び少なくともＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で生育して、総γδＴ細胞の少なくとも４０％が拡大及び活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞であることを特徴とする細胞集団を得ることを含み、前記ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団が、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とし、
前記マーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい、第２の工程を更に含む、方法。
【請求項2】
前記第２の工程が、前記第１の工程後に得られた前記細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及び少なくともＩＬ２１の存在下で５日間生育することと、
５日目、好ましくは７日目に、ＩＬ１５を前記培養培地に添加し、前記細胞を、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、ＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で少なくとも７日間培養することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストを０．５μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌの間の濃度で添加し、ＩＬ２１を７ｎｇ／ｍｌから１５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で添加し、ＩＬ１５を７０ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で添加する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ヒトＨＰＣが、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣに由来するものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の工程後に得られた活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞が、ＣＤ２５及び／又はＣＤ６９活性化マーカーを発現するが、ＬＡＧ３及び／又はＣＴＬＡ４疲弊マーカーは発現しないことを更に特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記第２の工程後に得られた活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞が、ＣＤ８マーカーを発現し、Ｔエフェクター表現型を有することを特徴とし、前記Ｔエフェクター表現型が、ＣＤ４５ＲＡマーカーの発現及びＣＤ６２Ｌマーカーの発現の欠如を特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法の前記第２の工程後に得られた又は得ることができるｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδを含む細胞組成物。
【請求項8】
ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴを含む細胞組成物であって、活性化されたＶδ１＋γδＴ細胞が、Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とし、
前記マーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい、
細胞組成物。
【請求項9】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法の前記第１の工程後に得られた又は得ることができる、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物。
【請求項10】
前記第１の工程後に生成されたＶδ１＋γδＴ細胞の集団がここでは、ａ．未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現することを特徴とする第１の細胞集団（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）と、
ｂ．未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現しないことを特徴とする第２の細胞集団（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）と、
を含むことを特徴とする、請求項９に記載の細胞組成物。
【請求項11】
前記第１の細胞集団が、細胞が表面細胞マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄを発現しないことを特徴とする、請求項１０に記載の細胞組成物。
【請求項12】
前記第２の細胞集団が、細胞が表面マーカーであるＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の細胞組成物。
【請求項13】
請求項７から１２のいずれか一項に記載の細胞組成物を使用して得られた又は得ることができるＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項14】
請求項７から１２のいずれか一項に記載の細胞組成物、又は請求項１３に記載のＣＡＲ Ｔ細胞を含み、薬学的に許容可能な作用物質又は担体を更に含む医薬組成物。
【請求項15】
療法に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学分野に関し、特に、本発明は、癌に対する養子免疫療法への臨床的適用に最適なヒトＶδ１＋γδＴ細胞の大規模な選択的生成のための新規かつ効率的な方法に関する。
【背景技術】
【0002】
養子Ｔ細胞療法の使用はＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）不一致によって生じる障壁により制限されることも多い。したがって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）等のＴ細胞製品の現行の臨床的適用は、個別的な自己Ｔ細胞産生に依拠している。しかし、患者Ｔ細胞は多くの場合、侵襲的な薬物療法の連続的な投与に起因して機能的に損傷を受けている。また、個別化されたオーダーメードの自己Ｔ細胞産生プロセスでは、Ｔ細胞の広範な適用がＴ細胞腫瘍等の特定の腫瘍型に狭められる。したがって、大規模な臨床的適用のための「既製」のすぐに使える治療剤としての機能を果たし得るＴ細胞製品を調製するためには、ユニバーサルな同種Ｔ細胞が必要である。
【0003】
最近、γδＴ細胞が、腫瘍関連ペプチドのＭＨＣによる提示の制約を受けず、また、限定された同種反応潜在性を示すことから、細胞免疫療法のためにαβＴ細胞の代替として浮上した。それにもかかわらず、γδＴ細胞は、ウイルス感染及び腫瘍増悪の間に重要な役割を果たし、頑健で長続きする抗腫瘍応答をもたらす（非特許文献１、非特許文献２）。特に、Ｖδ１＋γδＴ細胞は、通常、腫瘍浸潤に関して優勢であり（Ｖδ２＋に対して）、活性化により誘導される細胞死を受けにくく、また、腫瘍反応性リンパ球として長期間持続し得るので、癌の養子細胞療法のための非常に魅力的な候補である（非特許文献３）。しかし、出生時に広く行き渡っているγδＴ細胞のＶδ１＋Ｔ細胞亜型であるＶδ１＋γδＴ細胞は（非特許文献４）、末梢血では乏しく、また、好適な拡大／分化方法がないことにより、それらの治療への使用が妨げられている。この要点に関しては、末梢血から単離された細胞傷害性Ｖδ１Ｔ細胞を選択的に拡大させるために、ＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを使用する臨床グレードの方法がBruno Silva-Santosのグループによって最近開発された（非特許文献５、非特許文献６）。この細胞製品はＤｅｌｔａ Ｏｎｅ Ｔ（ＤＯＴ）細胞と名付けられ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の前臨床モデルにおいて治療上の潜在性を示し、癌に対する養子免疫療法へのそれらの臨床的適用の原理証明がもたらされた。
【0004】
それでもやはり、末梢血から単離することができるＶδ１＋Ｔ細胞の数が限定されていることから、細胞傷害性Ｖδ１＋抗腫瘍性Ｔ細胞の頑健な生成／拡大のための補完的なプロトコルを開発する必要に迫られている。より重要なことに、新生児Ｖδ１＋Ｔ細胞の焦点が絞られていない多様なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーは、ＣＭＶ等による末梢免疫攻撃に応答したクローン性拡大（非特許文献７）に起因して、成人期までに数種の優勢のクローン型に強く制限され、焦点が絞られる（非特許文献８）。Ｖδ１＋細胞のクローン性拡大により、ナイーブＶδ１Ｔ細胞から、ＣＤ２７の下方調節を特徴とするＶδ１Ｔ細胞エフェクター／メモリー表現型への分化が導かれる（非特許文献９）。ヒトナイーブ由来エフェクターＴ細胞はより長いテロメアを保持するので、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける拡大及びＴ細胞受容体導入遺伝子の発現が最も可能であり、また、臨床試験におけるより高い有効性に関連付けられており、ナイーブ細胞が最終分化又は「疲弊」に抵抗し、高い複製潜在性を維持し、したがって、養子免疫療法に使用するための優れたサブセットになり得ることが仮定されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Vantourout and Hayday, Nat Rev Immunol., 2013
【非特許文献2】Silva-Santos et al., Nat. Rev. Immunol., 2015
【非特許文献3】Siegers et al., Mol. Ther. 2014
【非特許文献4】Morita et al., J. Immunol. 1994
【非特許文献5】Correia et al., Blood 2011
【非特許文献6】Almeida et al. Clin. Cancer Res. 2016
【非特許文献7】Ravens et al., Nature Immunol. 2017
【非特許文献8】Davey et al., Nature Commun. 2016
【非特許文献9】Davey et al., Trends Immunol. 2018
【非特許文献10】Hinrichs et al., Blood 2011
【発明の概要】
【0006】
上記の課題を解決するために定めた本発明の目的は、癌に対する養子免疫療法への臨床的適用に最適なヒトＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくは同種ヒトＶδ１＋γδＴ細胞の大規模な選択的生成のための新規かつ効率的な方法に関するものである。この要点に関しては、臨床で造血幹細胞の供給源として現在選択されているヒト臍帯血（umbilical cord blood）ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞（ＨＰＣ）及びヒトＣＤ３４＋初期胸腺前駆細胞（ＥＴＰ）のどちらも、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に応答してｄｅ ｎｏｖｏヒトＶδ１＋γδＴ細胞を効率的に生成し得るという本発明の知見を考慮して、本発明の方法は、ヒトＨＰＣ、好ましくは臍帯血（cord blood）ＣＤ３４＋ＨＰＣ、及び／又はヒトＣＤ３４＋ＥＴＰの分化を、これらの細胞をＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドを用いて活性化することによって誘導することを含み、ここで、上記リガンドを骨髄由来間質細胞株の表面上に高発現させる。この方法は、ヒトＨＰＣ、好ましくは臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣ、又はヒトＣＤ３４＋ＥＴＰを、Ｊａｇ２を高発現する間質細胞上で、好ましくはＦｌｔ３＋ＳＣＦ＋ＩＬ－７を補充して、最長９週間にわたって共培養することを含むことが好ましい。次いで、上記の通りＮｏｔｃｈ依存性ＴＣＲ非依存性様式で生じさせたＶδ１＋γδＴ細胞（ＳＴＥＰ１）を、当該技術分野で既知の任意の方法に従って、例えば、抗ＣＤ３ ｍＡｂ並びにＩＬ－４、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１５を含めたサイトカインを使用することによって活性化及び拡大して、ＴＣＲ活性化に際したＶδ１＋γδＴ細胞の増殖を誘導する（非特許文献６）（ＳＴＥＰ２）。
【0007】
本発明は、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の拡大集団を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、上記方法が、
γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生じさせる第１の工程であって、該第１の工程が、
ａ．ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む細胞集団を、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はそのアゴニストを含む適切な培養培地中で生育することと、
ｂ．細胞を、γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって培養物中で維持することと、
なお、持続時間が約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含み、
第１の工程によってもたらされる細胞組成物が、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含むことを特徴とする、第１の工程を含み、上記方法が、
上記ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともに、その増殖を誘導する第２の工程であって、該第２の工程が、
第１の工程後に得られた細胞を、適切な培養培地中、γδＴＣＲアゴニストの存在下、及び少なくともＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で生育して、総γδＴ細胞の少なくとも４０％が拡大及び活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞であることを特徴とする細胞集団を得ることを含み、上記ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団が、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とし、
上記のマーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい、
第２の工程を更に含む、方法に関する。
γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生じさせる第１の工程であって、該第１の工程が、
ａ．ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む細胞集団を、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はそのアゴニストを含む適切な培養培地中で生育することと、
ｂ．細胞を、γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって培養物中で維持することと、
なお、持続時間が約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含み、
第１の工程によってもたらされる細胞組成物が、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含むことを特徴とする、第１の工程を含み、上記方法が、
上記ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともに、その増殖を誘導する第２の工程であって、該第２の工程が、
第１の工程後に得られた細胞を、適切な培養培地中、γδＴＣＲアゴニストの存在下、及び少なくともＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で生育して、総γδＴ細胞の少なくとも４０％が拡大及び活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞であることを特徴とする細胞集団を得ることを含み、上記ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団が、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とし、
上記のマーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい、
第２の工程を更に含む、方法に関する。
【0008】
好ましくは、第２の工程は、
第１の工程後に得られた細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及び少なくともＩＬ２１の存在下で５日間生育することと、
５日目、好ましくは７日目に、ＩＬ１５を培養培地に添加し、細胞を、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、ＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で少なくとも７日間培養することと、
を含む。
第１の工程後に得られた細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及び少なくともＩＬ２１の存在下で５日間生育することと、
５日目、好ましくは７日目に、ＩＬ１５を培養培地に添加し、細胞を、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、ＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で少なくとも７日間培養することと、
を含む。
【0009】
好ましくは、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストを０．５μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌの間の濃度で添加し、ＩＬ２１を７ｎｇ／ｍｌから１５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で添加し、ＩＬ１５を７０ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で添加する。
【0010】
好ましくは、ヒトＨＰＣは、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣである。
【0011】
好ましくは、第２の工程後に得られた活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞は、ＣＤ２５及び／又はＣＤ６９活性化マーカーを発現するが、ＬＡＧ３及び／又はＣＴＬＡ４疲弊マーカーは発現しないことを更に特徴とする。
【0012】
好ましくは、第２の工程後に得られた活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞は、ＣＤ８マーカーを発現し、Ｔエフェクター表現型を有することを特徴とし、Ｔエフェクター表現型は、ＣＤ４５ＲＡマーカーの発現及びＣＤ６２Ｌマーカーの発現の欠如を特徴とする。
【0013】
本発明は、上で定義された方法の第２の工程後に得られた又は得ることができるｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδを含む細胞組成物を更に提供する。好ましくは、活性化されたＶδ１＋γδＴ細胞は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とし、
上記のマーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とし、
上記のマーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
【0014】
本発明は、上で定義された方法の第１の工程後に得られた又は得ることができる、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を更に提供する。好ましくは、細胞組成物は、第１の工程後に生成されたＶδ１＋γδＴの集団がここでは、
ａ．未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現することを特徴とする第１の細胞集団（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）と、
ｂ．未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現しないことを特徴とする第２の細胞集団（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）と、
を含むことを特徴とする。
ａ．未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現することを特徴とする第１の細胞集団（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）と、
ｂ．未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現しないことを特徴とする第２の細胞集団（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）と、
を含むことを特徴とする。
【0015】
好ましくは、第１の細胞集団は、細胞が表面細胞マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄを発現しないことを特徴とする。好ましくは、第２の細胞集団は、細胞が表面マーカーであるＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを特徴とする。
【0016】
本発明は、上で定義された細胞組成物を使用して得られた又は得ることができるＣＡＲ Ｔ細胞を更に提供する。
【0017】
本発明は、上で定義された細胞組成物、又はＣＡＲ Ｔ細胞を含み、薬学的に許容可能な作用物質又は担体を更に含む、医薬組成物を更に提供する。
【0018】
本発明は、療法に使用するための上で定義された医薬組成物を更に提供する。好ましくは、使用は細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療におけるものである。
【0019】
以下の図面は、説明を例示するための好ましい実施形態を提示するものであり、発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＣＤ３４＋ヒト初期胸腺前駆細胞（ＥＴＰ）からの、Ｎｏｔｃｈにより誘導されたγδ（及びαβ）Ｔ細胞生成を示すグラフである。Ｊａｇ２がγδＴ細胞生成のための最も効率的なリガンドである。Ｊａｇ２により、培養３０日目までにＣＤ３４＋ヒトＥＴＰから２５０倍～３００倍のγδＴ細胞生成収率が誘導される。
【図2】Ｊａｇ２－Ｎｏｔｃｈシグナル伝達によりＥＴＰからのＶδ１＋γδＴ細胞生成が支持されることを示すグラフである。培養３０日目までにヒトＣＤ３４＋ＥＴＰから生成された、Ｊａｇ２により誘導されたＶδ１＋γδＴ細胞（１００倍の収率）は、ＩＦＮγを産生するが、ＩＬ－１７は産生しない。
【図3】ヒトＣＤ３４＋ＥＴＰからのＪａｇ２媒介性ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｖδ１＋γδＴ細胞産生の効率を示す図である。
【図4】ヒトＣＤ３４＋臍帯血造血幹／前駆細胞（ＨＰＣ）からの、Ｊａｇ２－Ｎｏｔｃｈにより誘導されたＶδ１＋γδＴ細胞生成を示すグラフである。ヒトＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣからＪａｇ２によって誘導された総細胞拡大及びγδＴ細胞生成のカイネティクスが示されている。ドットプロットは、５０日目までにｄｅ ｎｏｖｏ生成されたγδＴ細胞におけるＶδ１の発現を示す。
【図5】９週間の培養での、Ｊａｇ２－Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に際してヒトＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣから総γδＴ細胞及びＶδ１＋γδＴ細胞が生じる効率（ＳＴＥＰ１）を示す図である。
【図6】ヒトＪａｇ２シグナル伝達を受けたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣ（ＣＢ－Ｊａｇ２）、又は臍帯血からｅｘ ｖｉｖｏで単離されたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣ（ＣＢ ｅｘ ｖｉｖｏ）若しくは末梢血からｅｘ ｖｉｖｏで単離されたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣ（ＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏ）のいずれかから生成された、ＣＤ３＋Ｔ細胞内の総γδＴ細胞の割合（左）及びＶδ１＋γδＴ細胞の割合（中央）、並びにＶδ１＋γδＴ細胞内のＣＤ１ａ＋細胞の割合（右）を示すグラフである。各ドットは、１つの独立した実験又は生体試料を表す（ｎ＝４）。
【図7】ＣＤ３４＋ヒト初期胸腺前駆細胞（ＥＴＰ）からの、Ｎｏｔｃｈにより誘導されたγδ（及びαβ）Ｔ細胞生成を示すグラフである。ヒトＮｏｔｃｈリガンドを欠く間質細胞（ＯＰ９－ＧＦＰ）はＥＴＰ細胞拡大／分化を支持することができない。
【図8】ヒトＪａｇ２シグナル伝達を受けたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣから生成されたＶδ１＋γδＴ細胞の表現型を示すグラフである。（Ａ）Ｖδ１＋γδＴ細胞は、ＣＤ４＋表現型、又はＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）表現型、又はＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ（ＤＮ）表現型のいずれかを示すＣＤ１ａ＋未成熟γδＴサブセット、及びＤＮ又はＣＤ８＋細胞のＣＤ１ａ－成熟γδＴ細胞サブセットを含む。（Ｂ）成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞は、γδＴ細胞分化マーカーであるＣＤ７３並びに別個のレベルのＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０及びＮＫＧ２Ｄ細胞傷害性ＮＫ受容体を発現するナイーブＣＤ２７＋である。
【図9】ヒトＪａｇ２シグナル伝達を受けたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣから生成された成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδナイーブＴ細胞が、ＰＢ中に存在するＶδ１＋細胞（ＣＤ１ａ－）とは、ＣＤ７３及び細胞傷害性ＮＫ受容体の発現に関して異なることを示すグラフである。各ドットは、１つの独立した実験又は生体試料を表す。
【図10】形質導入されたＯＰ９細胞におけるＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドの発現の増大（高発現）を示すグラフである。数字は、形質導入されていないＯＰ９間質細胞（左側の突出）又はＪａｇ２が形質導入されたＯＰ９間質細胞（右側の突出）のいずれかの細胞表面上に発現されたＪａｇ２の平均蛍光強度を示す。細胞を、ＰＥとカップリングしたヒトＪａｇ２に対するｍＡｂで標識し、フローサイトメトリーによって分析した。
【図11】ヒト胸腺に存在する又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＥＴＰから発生させたγδＴ細胞のＶδサブセットの不均一性を示すグラフである。（Ａ）棒グラフは、ヒト胸腺においてｉｎ ｖｉｖｏで存在する総γδＴ細胞（左）に対する示されているＶδ亜集団の頻度の平均値＋／－ＳＥＭを表す；右：ヒト胸腺におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＶδ１及びＶδ２γδＴ細胞サブセット内のＣＤ１ａ＋、ＣＤ１ａ低発現のＣＤ１ａｉｎｔ及びＣＤ１ａ－の頻度の平均値＋／－ＳＥＭ。（Ｂ）示されているＮｏｔｃｈリガンドＯＰ９細胞株と共培養したヒトＥＴＰ胸腺細胞において発現されるＶδ１及びＶδ２のフローサイトメトリーカイネティクス分析。四分の一区分内の数字は、示されている細胞サブセットの頻度の平均値＋／－ＳＥＭを示す。（Ｃ）Ｂと同様に３１日間培養したＥＴＰから生成されたＶδ１＋、Ｖδ２＋及びＶδ１－Ｖδ２－γδＴ細胞の絶対数のカイネティクス。データは、３つの独立した実験による細胞数の平均値＋／－ＳＥＭを示す。
【図12】ＣＢ ＨＰＣからのヒトＶδ１＋γδＴ細胞の生成（ＳＴＥＰ１）及び拡大（ＳＴＥＰ２）のための二段階プロトコルを示す図である。ヒトＣＢ試料から単離されたＣＤ３４＋ＨＰＣをＪａｇ２発現ＯＰ９細胞上で、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ及びＩＬ－７を伴って最大８週間共培養した（ＳＴＥＰ１）。ＳＴＥＰ１で得られた細胞（ＣＢ－Ｊａｇ２）及びヒトＣＢ又はヒト末梢血（ＰＢ）のいずれかからｅｘ ｖｉｖｏで単離し、ＴＣＲαβ＋細胞を枯渇させた細胞浮遊液を、抗ＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを補充した浮遊培養物中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大させた（ＳＴＥＰ２）。
【図13】大多数のＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２ Ｖδ１＋γδＴ細胞がＣＤ８＋ＣＤ１ａ－成熟エフェクター細胞であることを示すグラフである。ＤＯＴプロトコル（上のパネル）又はＣＳＩＣ ＳＴＥＰ２プロトコル（下のパネル）のいずれかを使用して拡大させた、示されているＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２集団、ＣＢ－ＳＴＥＰ２集団及びＰＢ－ＳＴＥＰ２集団に含まれるＶδ１＋γδＴ細胞サブセットにおけるＣＤ８、ＣＤ１ａ、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌの発現を分析した。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡの発現を使用して、以下のＴ細胞の表現型を決定した（Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）：ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＡ－；Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）：ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ－）；Ｔナイーブ（ＴＮ）：ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋；及びＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）：ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＡ＋）。棒は平均値＋／－ＳＥＭを表す。ドットは、独立した実験又は生体試料を表す：ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２、ｎ＝３；ＣＢ－ＳＴＥＰ２、ｎ＝４；ＰＢ－ＳＴＥＰ２、ｎ＝６。一元配置ＡＮＯＶＡ、クラスカルワリス検定（＊ｐ＜０．０５）を実施して、統計的有意性を評価した。
【図14】ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２ Ｖδ１＋γδＴ細胞が低疲弊細胞プロファイルを有する活性化Ｔ細胞であることを示すグラフである。ＳＴＥＰ２ ＤＯＴプロトコル（上のパネル）又はＳＴＥＰ２ ＣＳＩＣプロトコル（下のパネル）を使用して拡大させたＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２集団、ＣＢ－ＳＴＥＰ２集団及びＰＢ－ＳＴＥＰ２集団に含まれるＶδ１＋でゲーティングしたγδＴ細胞における活性化（ＣＤ２５及びＣＤ６９）マーカー及び疲弊関連表面マーカー（ＬＡＧ３及びＣＴＬＡ４）の発現。各ドットは、１つの独立した実験又は生体試料を表す：ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２、ｎ＝２～３；ＣＢ－ＳＴＥＰ２、ｎ＝３～４；ＰＢ－ＳＴＥＰ２、ｎ＝６。一元配置ＡＮＯＶＡ、クラスカルワリス検定（＊ｐ＜０．０５）を実施して、統計的有意性を評価した。
【図15】大多数のＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２ Ｖδ１＋細胞が細胞傷害性関連活性化受容体を示すことを示すグラフである。ＳＴＥＰ２ ＤＯＴプロトコル（上のパネル）又はＳＴＥＰ２ ＣＳＩＣプロトコル（下のパネル）を使用して拡大させた、示されているＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２集団、ＣＢ－ＳＴＥＰ２集団及びＰＢ－ＳＴＥＰ２集団に含まれるＶδ１＋γδＴ細胞サブセットにおける細胞傷害性関連表面マーカーの発現。各ドットは、１つの独立した実験又は生体試料を表す：ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２、ｎ＝２～３；ＣＢ－ＳＴＥＰ２、ｎ＝３～４；ＰＢ－ＳＴＥＰ２、ｎ＝６。一元配置ＡＮＯＶＡ、クラスカルワリス検定（＊ｐ＜０．０５）を実施して、統計的有意性を評価した。
【図16】ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２細胞が白血病細胞株に対して高いｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害潜在性を示すことを示すグラフである。ＳＴＥＰ２ ＤＯＴプロトコル（上のパネル）又はＳＴＥＰ２ ＣＳＩＣプロトコル（下のパネル）に従って拡大させたＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２集団、ＣＢ－ＳＴＥＰ２集団及びＰＢ－ＳＴＥＰ２集団を、Ｊｕｒｋａｔ及びＭｏｌｍ１３白血病細胞に対する細胞傷害性について、示されているＥ：Ｔ比で４８ｈアッセイにおいてアッセイした。（ｎ＝３）、平均値＋／－ＳＤデータが示されている。ホルムシダック多重比較ｔ検定を使用して統計解析を実施した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図17】ＳＴＥＰ１後（ＣＢ－Ｊａｇ２）及びＳＴＥＰ１＋ＳＴＥＰ２（ＤＯＴ又はＣＳＩＣプロトコル）培養後の、ＣＢ細胞からのヒトＶδ１＋ＣＤ１ａ－γδＴ細胞の生成の効率を示すグラフである。Ｊａｇ２発現ＯＰ９間質上で８週間培養した際（ＳＴＥＰ１）及びＤＯＴ又はＣＳＩＣプロトコルに従って更に拡大した際の（ＳＴＥＰ２）、総ＣＢ細胞（１０６個）から単離されたＣＤ３４＋ＨＰＣから生成されたＶδ１＋ＣＤ１ａ－γδＴ細胞の数（ｎ＝４）（左側のパネル）。ＳＴＥＰ２ ＤＯＴ及びＣＳＩＣプロトコル後に回収されたＴ細胞内のγδＴＣＲ＋細胞のパーセンテージが中央のパネルに示されており、γδＴＣＲ＋細胞内のＶδ１＋細胞のパーセンテージが右側のパネルに示されている（ｎ＝３）。
【図18】ＳＴＥＰ２ ＤＯＴ及びＣＳＩＣ拡大プロトコルの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
定義
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に提示される定義が他のいかなる定義よりも優先される。さらに、文脈上他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、同様に複数形の用語は単数形を含むものとする。
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に提示される定義が他のいかなる定義よりも優先される。さらに、文脈上他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、同様に複数形の用語は単数形を含むものとする。
【0022】
本開示において、「含む」（"comprises," "comprising,"）、「含有する（containing）」及び「有する（having）」等は、欧州及び米国の特許法においてそれらに付与された意味を有し、「含む」（"includes," "including,"）等を意味する場合がある。「から本質的になる」（"consisting essentially of" or "consists essentially"）は、同様に欧州及び米国の特許法において付与された意味を有し、この用語はオープンエンドであり、列挙されるものの基本的な又は新規の特性が列挙されるもの以外のものの存在によって変化しない限りにおいて、列挙されるもの以外のものの存在を許容するが、従来技術の実施形態は除外される。
【0023】
本発明は、主にＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から分化させたＮｏｔｃｈにより誘導されたＶδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成に関する。「ｄｅ ｎｏｖｏ」は、「新規の」又は「初めから」のラテン語表現である、すなわち、本明細書で使用される場合、ｄｅ ｎｏｖｏは、以前から存在していたＶδ１＋γδＴ細胞に基づくものではなく、新規のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞の創出と理解されるものとする。
【0024】
本発明の文脈において、「Ｎｏｔｃｈリガンド」は、造血前駆細胞の活性化及び分化を含めた細胞の運命決定を媒介する細胞シグナルをもたらす表面Ｎｏｔｃｈ受容体に結合することができるタンパク質と理解される（Artavanis-Tsakonas et al., Science 1999）。したがって、この用語は、本明細書で使用される場合、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄファミリーリガンド等の天然に存在するタンパク質リガンド、並びに、天然リガンドに対応する生物学的効果を有する、Ｎｏｔｃｈ受容体に対する抗体、ペプチド模倣体及び小分子を含めた工学的に作製されたＮｏｔｃｈリガンド及びＮｏｔｃｈアゴニストを包含する。いくつかの実施形態では、ＮｏｔｃｈリガンドはＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドである。好ましいＮｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１又はＪａｇ２からなる群から選択される。
【0025】
本明細書で使用される場合、「ＤＬＬ１」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｎｏｔｃｈ Ｄｅｌｔａリガンドの天然に存在するヒトホモログ（Ｄｅｌｔａ様１）と理解される。この用語は、天然Ｄｅｌｔａ様１リガンドの生物学的効果を有する工学的に作製されたＮｏｔｃｈリガンド及びＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを包含し得ることが更に好ましい。
【0026】
本明細書で使用される場合、「ＤＬＬ４」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｎｏｔｃｈ Ｄｅｌｔａリガンドの天然に存在するヒトホモログ（Ｄｅｌｔａ様４）と理解される。この用語は、天然Ｄｅｌｔａ様４リガンドの生物学的効果を有する工学的に作製されたＮｏｔｃｈリガンド及びＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを包含し得ることが更に好ましい。
【0027】
本明細書で使用される場合、「Ｊａｇ１」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｎｏｔｃｈ Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドの天然に存在するヒトホモログ（Ｊａｇｇｅｄ１）と理解される。この用語は、天然Ｊａｇｇｅｄ１リガンドの生物学的効果を有する工学的に作製されたＮｏｔｃｈリガンド及びＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを包含し得ることが更に好ましい。
【0028】
本明細書で使用される場合、「Ｊａｇ２」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｎｏｔｃｈ Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドの天然に存在するヒトホモログ（Ｊａｇｇｅｄ２）と理解される。この用語は、天然Ｊａｇｇｅｄ２リガンドの生物学的効果を有する工学的に作製されたＮｏｔｃｈリガンド及びＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを包含し得ることが更に好ましい。
【0029】
本明細書で使用される場合、「Ｖδ１＋γδＴ細胞」は、γ鎖と、Ｖδ１可変領域を発現するδ鎖、及びＣＤ３成分とが結合して構成されたＴＣＲを発現するＴ細胞と理解される。Ｖδ１＋γδＴ細胞は、特異的な抗Ｖδ１抗体を使用した表現型解析によって、又はＶδ領域の配列決定によって同定することができる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「γδＴＣＲアゴニスト」は、ＴＣＲγδヘテロ二量体、又はＴＣＲγδのＶδ１ドメイン、又はＴＣＲと会合したＣＤ３成分、主にＣＤ３ε成分のいずれかに特異的に結合し、細胞活性化及び増殖を誘導する抗体、ペプチド模倣体、及び小分子と理解される。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ヒト造血幹／前駆細胞（ＨＰＣ）」は、抗ＣＤ３４抗体を用いた表現型解析によって同定され、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてヒト臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄若しくは胎児肝臓から得られる、又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞から導き出される、ヒトＣＤ３４＋細胞と理解される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋初期胸腺前駆細胞（ＥＴＰ）」は、抗ＣＤ３４抗体を用いた表現型解析によって同定され、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてヒト胎児、新生児又は出生後胸腺から得られるヒトＣＤ３４＋細胞と理解される。
【0033】
本発明の文脈において、「機能的な天然細胞傷害性受容体」（ＮＣＲ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって発現され、またヒトγδＴ細胞によっても、ほぼ排他的にＶδ１＋γδＴ細胞サブセットによって、ＩＬ－２又はＩＬ－１５の存在下での強力なＴＣＲアゴニスト又はマイトジェンによる刺激後に発現される、表面受容体と理解されるものとする（非特許文献５）。ＮＣＲ誘発は、細胞活性化において中心的な役割を果たし、初代白血病細胞及び腫瘍細胞株に対する細胞傷害性を調節し、また、ＩＦＮ－γの発現を増強する。
【0034】
「高発現」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの発現の、参照細胞における上記Ｎｏｔｃｈリガンドの基礎発現レベルと比較して統計的に有意な増大を指す。細胞は、哺乳動物細胞であることが好ましく、間質細胞であることがより好ましい。基礎レベルを上回る発現には、上記Ｎｏｔｃｈリガンドの薬理学的な及び人工的な上方調節及び高発現が含まれる。細胞におけるＮｏｔｃｈリガンド又はそのアゴニストの高発現は、異なる手段によって、例えば、細胞に、該細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの発現に適したプロモーターと作動可能に連結したＮｏｔｃｈリガンドの遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって、又は、上記Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする遺伝子を細胞のゲノムにＣｒｉｓｐｒ、組込み型ウイルスベクター、若しくは相同組換え法等の遺伝子操作手法を使用することにより導入することによって、実現することができる。「参照の細胞」又は「参照細胞」という用語は、無処置の対照細胞、すなわち、上記Ｎｏｔｃｈリガンドの発現を細胞が有し得る天然の発現（すなわち、基礎発現）を超えて誘導する遺伝子改変も人工的操作もされていない細胞を指す。参照細胞は、参照間質細胞であることが好ましい。したがって、参照間質細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現しない、又はＮｏｔｃｈリガンドを基礎レベルで発現する。細胞において高発現される、又は細胞の基礎発現レベルと比較して統計的に有意な発現の増大を有するＮｏｔｃｈリガンド遺伝子は、ＲＮＡ発現技法（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法等）又はタンパク質発現技法（ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等）によって検出することができる。
【0035】
「統計的に有意なＮｏｔｃｈリガンドの発現の増大」は、本明細書では、発現レベルの増大が偶然だけでは説明できないという分析者による決定を指す。当業者がこの決定を行うための方法が統計学的仮説検定である。この検定では、結果が真に偶然のみに帰するものと仮定して、データにおける結果と同様の極端な結果が観察される確率である、ｐ値がもたらされる。本明細書では、０．１以下（好ましくは０．０５、０．０１、０．００１又はそれよりも小さい）ｐ値が統計的に有意であるとみなされる。例えば、細胞、好ましくは間質細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの発現の増大は、統計的検定を行って、細胞、好ましくは間質細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの発現を上で定義された参照細胞、好ましくは参照間質細胞の基礎発現レベルと比較し、上記統計的検定から得られたｐ値が０．１以下、好ましくは０．０５、０．０１、０．００１又はそれよりも小さければ、統計的に有意である。
【0036】
本明細書で使用される場合、「適切な培地」という用語は、任意の好適な哺乳動物細胞培養培地と理解されるものとする。任意の培養培地、好ましくは、本発明の方法のＳＴＥＰ１のための、２０％ウシ胎仔血清及び好ましくはＬ－グルタミン（すなわち、約２ｍｍｏｌ／ｌの濃度で）及び動物由来成分不使用組換えヒト（ｒｈ）サイトカイン、例えばＩＬ－７（２００ＩＵ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１００ＩＵ／ｍｌ）及びＳＣＦ（１００ＩＵ／ｍｌ）を補充した無血清培養培地（α－ＭＥＭ）；又は、本発明の方法のＳＴＥＰ２のための、自己血漿（すなわち、５％自己血漿）又はヒトＡＢ血清及び好ましくはＬ－グルタミン及び動物由来成分不使用組換えヒト（ｒｈ）サイトカイン、例えばｒｈＩＬ－４（約１００ｎｇ／ｍｌの濃度が好ましい）、ＩＦＮ－γ（約７０ｎｇ／ｍｌの濃度が好ましい）、ＩＬ－２１（約７ｎｇ／ｍｌの濃度が好ましい）、及びＩＬ－１β（約１５ｎｇ／ｍｌの濃度が好ましい）を任意選択で補充した無血清培養培地（ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ－ＣＴＳ）が好ましい。なお、γδＴ細胞の増殖に使用するために適した多数の基本培養培地、特に、ＡＩＭ－Ｖ、イスコフ培地及びＲＰＭＩ－１６４０（Life Technologies）等の完全培地が利用可能である。培地は、他の培地因子、例えば、血清、血清タンパク質、及び、抗生物質等の選択用作用物質を補充したものであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、２ｍＭのグルタミン、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Life Technologies）、非必須アミノ酸（例えば、１００μΜのＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ及びＳｅｒ；１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、Life Technologies）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地。基本培地は、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５を、当業者が常套的な実験によって容易に決定することができる標準的な濃度で補充したものであってもよい。
【0037】
「治療すること（treating）」、「治療すること（to treat）」又は「治療（treatment）」とは、これだけに限定することなく、疾患の成長を制止、限定、低減、安定化、又は緩徐化することを意味する。
【0038】
「医薬」又は「医薬品」とは、広く認められているように、ヒトを含む動物における疾患を治癒、治療又は予防するために使用される任意の医薬組成物又は動物用組成物（薬剤、投薬又は単に薬物とも称される）を意味する。
【0039】
「医薬組成物」とは、予防及び／又は治療用途の最終医薬品を調製することを意図した活性物質又は活性物質の組合せを意味する。
【0040】
「薬学的に許容可能な」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はかかる組成物の成分のいずれかと有害に相互作用することなく、本発明の組成物とともに材料を被験体に投与することができる。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」及び「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、同義であり、有害作用なしに被験体及び／又は環境に投与することができる医薬組成物の活性物質を含めるためのビヒクルを指す。好適な薬学的に許容可能な担体としては、滅菌水、精製水、生理食塩水、グルコース、デキストロース又は緩衝溶液が挙げられるが、これらに限定されない。担体は、希釈剤、安定化剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）、粘度添加剤等を含むが、これらに限定されない助剤を含んでいてもよい。
【0041】
本明細書で使用される場合、「自己」は、ドナー及びレシピエントが同じ個体である細胞調製物を指すものとして理解される。本明細書で使用される場合、「同種」は、ドナー及びレシピエントが同じ個体でない細胞調製物を指すものとして理解される。
【0042】
「単離された」という用語は、それが指す細胞又は細胞集団が、その自然環境にないことを示す。この細胞又は細胞集団は、周囲組織から実質的に分離されている。
【0043】
本発明において言及される細胞組成物製品のマーカープロファイルは、付加的なマーカーの存在及び／又は非存在、又は存在及び非存在マーカーの組合せの特定のプロファイルによって更に規定することができる。いずれの場合にも、マーカーの特定の組合せが、細胞集団内の特定のプロファイル及び／又は集団内の個々の細胞上のマーカーの特定のプロファイルとして存在する可能性がある。
【0044】
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、その存在、濃度、活性又はリン酸化状態を検出し、細胞の表現型を同定するために用いることができる任意の生体分子を包含する。
【0045】
この場合、本発明の細胞は、或る特定の表現型マーカーについて陽性であり、他のマーカーについて陰性である。「陽性」とは、マーカーが細胞内で発現されることを意味する。発現されているとみなされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在する必要がある。
【0046】
「発現された」という用語は、細胞の表面上又は細胞内のマーカーの存在を表すために用いられる。発現されているとみなされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在する必要がある。「検出可能なレベル」とは、ＰＣＲ、ブロッティング、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析等の標準的な実験室的方法論の１つを用いてマーカーを検出することができることを意味する。「発現された」は、検出可能なタンパク質の存在、タンパク質のリン酸化状態又はタンパク質をコードするｍＲＮＡを指す場合があるが、これらに限定されない。遺伝子は、発現を２５回のＰＣＲサイクル後、好ましくは３０回のＰＣＲサイクル後に十分に検出することができる場合に（細胞１個当たり少なくとも約７５コピー～１００コピーの細胞中の発現レベルに相当する）、本発明の細胞又は本発明の集団の細胞によって発現されるとみなされる。「発現する」及び「発現」という用語は、対応する意味を有する。この閾値未満の発現レベルでは、マーカーは発現されているとはみなされない。
【0047】
本明細書において定義されている細胞集団は、細胞集団の細胞の少なくとも約６０％、好ましくは約８０％がマーカーの検出可能な発現を示す場合、そのマーカーを発現するとみなされる。集団の細胞の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％又は少なくとも約９７％又は少なくとも約９８％又はそれよりも多くがマーカーの検出可能な発現を示すことが好ましい。或る特定の態様では、集団の細胞の少なくとも約９９％又は１００％がマーカーの検出可能な発現を示す。発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫ブロッティング、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡ等の任意の好適な手段を使用することによって、又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）若しくはフローサイトメトリーによって検出することができる。この列挙は単に例として提示するものであり、限定的なものではないことが理解されるべきである。本明細書において定義されている細胞集団は、図１３に示されている通り、本発明の細胞におけるマーカーの発現レベルが、対照細胞、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで単離された細胞又はｄｅ ｎｏｖｏ生成されたものではない細胞、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ ＰＢ又はＣＢにおける発現レベルよりも高い場合、そのマーカーを発現するとみなされる。この文脈において「よりも高い」とは、本発明の細胞集団におけるマーカー発現レベルが対照細胞におけるレベルの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍であることを意味する。
【0048】
本明細書において定義されている細胞の集団を特徴付ける別のやり方は、特定のマーカー又は組合せ又は複数のマーカーの検出可能なレベルでの発現の欠如によるものである。本明細書で定義されている通り、これらのマーカーは、陰性マーカーであると言える。いくつかの実施形態では、本明細書において定義されている細胞集団は、細胞集団の細胞の少なくとも約６０％、好ましくは約８０％がマーカーの検出可能な発現を示さない場合に、そのマーカーを発現しないとみなされる。他の実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％又は少なくとも約９７％又は少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％又は１００％がマーカーのいかなる検出可能な発現も示さない。同様に、検出可能な発現の欠如は、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫ブロッティング、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡを使用し、又はＦＡＣＳ若しくはフローサイトメトリーを使用して証明することができる。
【0049】
本明細書に記載のマーカーは、細胞における発現レベルが細胞当たり約１００コピー未満であることに対応する、３０サイクルのＰＣＲのレベルで発現を合理的に検出することができない、及び／又は、免疫蛍光法、免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡ若しくはＦＡＣＳによって容易に検出することができない場合、細胞によって発現されないとみなされる。
【0050】
本明細書において定義されている細胞集団のマーカープロファイルを、マーカーの存在及び／又は非存在によって、又は存在及び非存在マーカーの組合せの特定のプロファイルによって更に定義することができる。それぞれの場合において、マーカーの特定の組合せが、細胞の集団内の特定のプロファイルとして及び／又は集団内の個々の細胞に関するマーカーの特定のプロファイルとして存在し得る。
【0051】
「細胞集団」という用語は、細胞の群を指す。細胞集団は、異なる細胞の群を含む場合、不均一であり、各群は他の群と１つ以上の識別的特徴の存在、例えば、特定のマーカーの発現の有無、又は異なる機能の存在によって弁別される。
【0052】
「間質細胞」という用語は、骨髄由来間質細胞株を指す。
【0053】
説明
以下に、本発明の有益な実施形態を添付の図面を参照して具体的に記載する。
以下に、本発明の有益な実施形態を添付の図面を参照して具体的に記載する。
【0054】
胸腺は、ＨＰＣからの主要なαβＴ細胞サブセット及びより少ないγδＴ細胞サブセットの両方のｄｅ ｎｏｖｏ生成のための主要器官である。Ｖδ１＋γδＴ細胞は、出生後胸腺では優勢なγδＴ細胞サブセットであるが、末梢血ではより少ないγδＴ細胞サブセットである。胸腺におけるαβＴ細胞及びγδＴ細胞のどちらの生成も、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞コミットメント及び発生のためにＤｌｌ４が不可欠であるＮｏｔｃｈシグナル伝達に依存する（Koch et al., J. Exp. Med. 2008；Hozumi et al., J. Exp. Med. 2008）。本発明では、ヒトＮｏｔｃｈリガンドＪａｇ２の高発現によって特異的にもたらされる強力かつ維持されるＮｏｔｃｈシグナル伝達がαβＴ細胞生成よりもγδＴ細胞生成に好都合であり、一方、他のＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇ１、Ｄｌｌ４及びＤｌｌ１）のいずれかを使用したＮｏｔｃｈシグナル伝達の高発現はγδＴ細胞生成よりもαβＴ細胞生成に好都合であることが示される（図１参照）。これらの根拠に基づいて、またＣＤ３４＋ＥＴＰ等のヒト胸腺前駆細胞からヒトＴ細胞をｄｅ ｎｏｖｏに産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する本発明者らの知見に基づいて、任意の生体試料から、例えば胸腺前駆細胞から及び臍帯血造血前駆細胞から得たＣＤ３４＋造血前駆細胞からのヒトγδＴ細胞（とりわけＶδ１＋γδＴ細胞）の優先的生成を支持する培養法を開発した。この方法は、上記ＣＤ３４＋細胞をヒトＪａｇ２を形質導入したマウスＯＰ９間質細胞株上で共培養することを含む。最初に、４種のリガンド（すなわち、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２）からの、ヒト胸腺において発現されたＯＰ９細胞におけるそれらの高発現によってもたらされる強力なＮｏｔｃｈシグナルを受け取るＥＴＰ（Garcia-Leon et al. Development 2018）はαβＴ細胞及びγδＴ細胞のどちらにも分化し得るが、一方、形質導入されていないＯＰ９細胞上で培養したＥＴＰはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存すること及び／又は分化することができず、培養物から消失することを見いだした（図７参照）。しかし、ヒトＪａｇ２シグナル伝達が、他のＮｏｔｃｈリガンドの存在下で観察されたものとは別個の、非常に乏しいαβＴ細胞が生じ、γδＴ細胞に優先的に分化すること（３０日目までに３００倍に至るまで富化された）を伴うＥＴＰの分化パターンを選択的に誘導する唯一のＮｏｔｃｈリガンドであることも見いだした（図１参照）。出生後ヒト胸腺においてｉｎ ｖｉｖｏで見いだされた通り（図１１）、ＥＴＰから、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＯＰ９細胞において高発現したヒトＪａｇ２シグナル伝達に応答して分化したγδＴ細胞では、優勢なＶδ１の発現が示され、Ｖδ１＋細胞が培養中にＪａｇ２に応答して優勢に拡大した（図１１）。γδＴ細胞の約３５％がＶδ１＋であったことから（図２）、ＯＰ９細胞におけるＪａｇ２の高発現により、４週間の培養後に１００倍のＶδ１＋Ｔ細胞収率がもたらされることが示される（図３）。
【0055】
さらに、驚くべきことに、図４に示されている通り、ヒトＪａｇ２－Ｎｏｔｃｈシグナル伝達により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣからのγδＴ細胞生成も支持され、ＥＴＰからのγδＴ細胞生成と効率が同様であることが本明細書において実証される。実際、臍帯血ＨＰＣから生じた総γδＴ細胞は、ＯＰ９－Ｊａｇ２培養物では９週間後に２１０倍～２５０倍の富化になり、Ｖδ１＋γδＴ細胞は４０％までになった（図４）。したがって、その後に養子細胞療法のために拡大させることができるヒトＶδ１＋Ｔ細胞を多数（約１００倍の収率に至るまで）生成するためのＣＤ３４＋前駆細胞の最適な供給源として臍帯血を使用することを更に提唱する（図５）。細胞の表現型解析により、得られたＶδ１＋Ｔ細胞集団が、出生後ヒト胸腺においてｉｎ ｖｉｖｏで見いだされる通り（図１１）、ＣＤ４＋、ダブルポジティブ（ＤＰ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋又はＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ（ＤＮ）表現型のいずれかを示す未成熟ＣＤ１ａ＋細胞である主要なサブセットを含む活性化されていないＣＤ２５ナイーブγδＴ細胞（図８）と、大部分がＤＮ又はＣＤ８＋細胞で構成される成熟ＣＤ１ａ－γδＴ細胞の軽微な集団とを含む不均一な細胞集団であることが示された。特に、成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞は、ナイーブＣＤ２７＋表現型を示し、γδＴ細胞分化マーカーであるＣＤ７３及び別個のレベルのいくつかの細胞傷害性ＮＫ受容体を主に発現し（図８参照）、したがって、成体末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞よりも臍帯血中に存在するナイーブＶδ１＋胎児細胞に類似したものである（図９参照）。単一ＣＢ単位から単離され、ヒトＪａｇ２シグナル伝達を受け取ったＣＤ３４＋ＨＰＣからｄｅ ｎｏｖｏ生成されたナイーブＶδ１＋γδＴ細胞の割合及び数は、単一ＣＢ若しくは末梢血単位から、又は同数の出発ＣＢ若しくはＰＢ総細胞から、ｅｘ ｖｉｖｏで得られたものよりも有意に高い（表２）。
【0056】
したがって、本発明の目的は、癌に対する養子免疫療法への臨床的適用に最適な、ヒトγδＴ細胞、より好ましくは同種ヒトＶδ１＋γδＴ細胞の大規模な選択的生成のための新規かつ効率的な方法に関する。この要点に関しては、臨床で好ましい幹細胞の供給源として現在選択されているヒト臍帯血ＨＰＣ及びヒトＥＴＰのどちらも、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に応答してｄｅ ｎｏｖｏヒトγδＴ細胞を効率的に生成し得ることを考慮すると、この方法は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣ及び／又はヒト胸腺ＥＴＰ等の造血幹／前駆細胞を含む任意の生物学的供給源の分化を、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１又はＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド、より好ましくはＪａｇ２によって媒介されるＮｏｔｃｈ活性化によって誘導することを含む。特に、この方法は、ＨＰＣ、好ましくはヒトＣＤ３４＋ＨＰＣ細胞又はヒトＥＴＰを、Ｎｏｔｃｈリガンドを高発現する細胞、好ましくはヒトＪａｇ２を高発現する間質細胞上で、好ましくはＦｌｔ３、ＳＣＦ及びＩＬ－７を補充して、好ましくは最長１５週間にわたって、好ましくは最長１０週間、最長９週間、最長８週間、最長７週間、最長６週間、最長５週間又は最長４週間にわたって、共培養することを含む。次いで、上記の通りＴＣＲ非依存性Ｎｏｔｃｈ依存性様式で（本明細書ではＳＴＥＰ１と称される）得られた、Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団を含む生成されたγδＴ細胞を、例えば、抗ＣＤ３ ｍＡｂ並びにＩＬ－４、ＩＦＮγ及びＩＬ－１５を含むサイトカインを使用することにより、当該技術分野で既知の任意の方法に従って拡大させて、上記Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化する及びその増殖を誘導する（本明細書ではＳＴＥＰ２と称される）（非特許文献６）。
【0057】
したがって、本発明の第１の態様（ＳＴＥＰ１とも称される）は、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含むｄｅ ｎｏｖｏ細胞組成物を生成するための、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２を細胞、好ましくは間質細胞において発現させることが好ましく、ここで、上記細胞は、参照細胞、好ましくは参照間質細胞における上記リガンドの基礎発現レベルと比較して上記Ｎｏｔｃｈリガンドの発現の統計的に有意な増大を示している。したがって、細胞において、好ましくはその表面上に、基礎レベルを超えて発現させ、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団からγδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含むｄｅ ｎｏｖｏ細胞組成物を生成するために使用されるＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２が本明細書に提示される。Ｎｏｔｃｈリガンドを高発現させる細胞は、間質細胞株であることが好ましく、ＯＰ９細胞であることが最も好ましい。「参照細胞」及び「統計的に有意な発現の増大」という用語は、上で定義されており、特許の記載全体を通して適用される。
【0058】
細胞、好ましくは間質細胞におけるＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２の高発現の程度は、参照細胞、好ましくは参照間質細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの基礎発現レベルと比較して約１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１００００倍、１０００００倍の発現の増大であり得る。図１０は、参照（形質導入されていない）間質細胞と比較した、Ｊａｇ２が形質導入された間質細胞における５００倍の高発現を示す。Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２の、基礎レベルを超える発現（すなわち、高発現）は、当業者に既知の任意の方法によって実現することができる。例として、ネイティブなゲノムＮｏｔｃｈリガンドの調節をモジュレートすることにより、基礎レベルを上回る発現を誘導することができる。基礎レベルを上回る発現の誘導は、Ｎｏｔｃｈリガンドの転写及び／又は翻訳を増大させることによって、及び／又は異種調節配列をＮｏｔｃｈリガンドのネイティブな調節領域内に若しくはそれに隣接させて導入することによって、及び／又は、Ｎｏｔｃｈリガンドのネイティブな調節領域を例えば相同組換えによってそのような異種調節配列で置き換えることによって、及び／又は、上記Ｎｏｔｃｈリガンドの転写、翻訳若しくは機能を負に調節する、遮断する若しくは下方調節する分子を妨害若しくは下方調節することによって、行ってもよい。
【0059】
基礎レベルを超えるＮｏｔｃｈリガンドの転写は、細胞、好ましくは間質細胞に、例えば、細胞にそのような活性化因子を接触させることにより、又は、活性化因子をコードする核酸を用いて細胞を形質転換することにより、転写活性化因子のレベルの上昇をもたらすことによって増大させることができる。あるいは、Ｎｏｔｃｈリガンドの転写阻害因子に対するアンチセンス核酸を用いて細胞を形質転換することによって転写を増大させてもよい。
【0060】
内在性Ｎｏｔｃｈリガンドの転写及び／又は翻訳を増大させる代わりに又はそれに加えて、Ｎｏｔｃｈリガンドの１つ以上の追加のコピーを細胞、好ましくは間質細胞に、例えば、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする核酸を細胞にトランスフェクト又は形質導入することによって導入することにより、基礎レベルを超えるＮｏｔｃｈリガンドの発現を引き起こしてもよい。形質転換用Ｎｏｔｃｈリガンドは、ゲノム外ベクター上に含有させてもよく、ゲノム内に、好ましくは安定に、組み入れてもよい。形質転換用Ｎｏｔｃｈリガンドは、細胞における基礎レベルを上回るその発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結していてもよい。「作動可能に連結」とは、同じ核酸分子の一部として接合しており、プロモーターからの転写が開始されるように好適に配置され、向き付けられていることを意味する。
【0061】
遺伝子を細胞に導入する方法は、当業者には既知である。Ｎｏｔｃｈリガンドを細胞に導入するためにベクターを使用することができ、Ｎｏｔｃｈリガンドがベクター上に残るか又はゲノム内に組み入れられるかは問わない。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列を含めた適当な調節配列を含有する好適なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じてマーカー遺伝子及び他の配列を含有してもよい。調節配列は、細胞内でのＮｏｔｃｈリガンドの発現を駆動するものであってよい。例えば、ベクターはゲノム外発現ベクターであってもよく、又は調節配列をＮｏｔｃｈリガンドとともにゲノム内に組み入れてもよい。ベクターはプラスミド又はウイルスベクターであってもよい。
【0062】
Ｎｏｔｃｈリガンドのコード配列を含む核酸を細胞、好ましくは間質細胞のゲノムに組み込むことができる。標準的な技法に従って、ゲノムの組換えを促進する配列を形質導入又はトランスフェクト用核酸に含めることにより、組込みを促進することができる。組み込まれる核酸は、基礎レベルを超えるＮｏｔｃｈリガンドの発現を駆動することができる調節配列を含んでもよい。核酸は、その組込みを、ゲノム内の、Ｎｏｔｃｈリガンドコード配列が細胞内でのその発現を駆動する及び／又は制御することができる調節エレメントの制御下にある部位に方向付ける配列を含んでもよい。組み込まれる核酸は、Ｎｏｔｃｈリガンド核酸を細胞に形質導入又はトランスフェクトするために使用されるベクターから引き出されてもよい。
【0063】
Ｎｏｔｃｈリガンドを含む核酸の導入は、核酸が直鎖状であるか分枝状であるか環状であるかにかかわらず、一般に、これだけに限定することなく、「トランスフェクション」又は「形質導入」と称される。任意の利用可能な技法を使用することができる。好適な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、微量注射等の機械的技法、直接ＤＮＡ取り込み、受容体媒介性ＤＮＡ移入、レトロウイルス又は別のウイルスを使用する形質導入、及びリポソーム媒介性トランスフェクションを挙げることができる。選択された遺伝子構築物を細胞に導入する際には、当業者に既知の或る特定の事項を考慮しなければならない。
【0064】
上記Ｎｏｔｃｈリガンドを高発現する細胞、好ましくは間質細胞をもたらすための、細胞、好ましくは間質細胞へのＮｏｔｃｈリガンドのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション又は形質導入のための好適なベクター及び技法は当業者には既知である。好適なベクターとしては、アデノウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス及びレトロウイルスが挙げられる。無効化ウイルスベクターを、感染性ウイルス粒子の産生のために必要な遺伝子が発現されるヘルパー細胞株において産生させることができる。好適なヘルパー細胞株は、当業者には既知である。
【0065】
好ましい実施形態では、細胞、好ましくは間質細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの高発現、すなわちＮｏｔｃｈリガンドの発現レベルの統計的に有意な増大は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター等の強力な発現プロモーターに作動可能に連結した、上記Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはヒトＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする遺伝子を含む核酸を、上記細胞に形質導入又はトランスフェクトすることによって実現される。したがって、本発明の第１の態様の或る実施形態では、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを、細胞株、好ましくは間質細胞株、好ましくはＯＰ９細胞において高発現させたＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはヒトＪａｇ２を含む培地で培養し、ここで、上記細胞株は、細胞における上記Ｎｏｔｃｈリガンドの高発現を駆動する上記Ｎｏｔｃｈリガンドの遺伝子を含む核酸を形質導入又はトランスフェクトしたものである。
【0066】
本発明において有用なＣＤ３４＋ＨＰＣを含む有用な供給源は、骨髄及び／又は、ＨＰＣ、好ましくは骨髄から動員されたＨＰＣを含む末梢血である。ＨＰＣを含む他の供給源として、胎盤血及び胎児肝臓並びにｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞が挙げられ、これらも同様に本発明の実施に適し得る。ＨＰＣを含む他の供給源として、胎盤血、胎児肝臓又はｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞が挙げられ、これらも同様に本発明の実施に適し得る。Ｎｏｔｃｈにより誘導され分化したγδＴ細胞、好ましくはＶδ１＋γδＴ細胞が引き出される、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団は、実質的に純粋又は均一な集団であることが好ましい。本発明の文脈において、実質的に純粋な集団とは、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰが実質的に単離された細胞であり得る集団である。一実施形態では、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣは、組成物中の細胞の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％に相当する。別の実施形態では、ヒトＣＤ３４＋ＥＴＰは、組成物中の細胞の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％に相当する。
【0067】
本発明の第１の態様の他の実施形態では、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを、工学的に作製されたＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、若しくは、天然リガンドの生物学的効果を有する、Ｎｏｔｃｈ受容体に対する抗体、ペプチド模倣体、及び小分子を含めたＮｏｔｃｈアゴニストを高発現する細胞、好ましくは間質細胞の集団を含む培地で培養する、又は、基材上（すなわち、プラスチック表面上又はマイクロビーズ上）に固定化したそのような化合物とともに培養する。ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを、細胞株に固定化した、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、又は、天然リガンドの生物学的効果を有する、Ｎｏｔｃｈ受容体に対する抗体、ペプチド模倣体、及び小分子を含めたＮｏｔｃｈアゴニストを含む培地で更に培養してもよいことが好ましい。Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒトＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはヒトＪａｇ２であることが好ましい。本発明のいくつかの態様では、Ｎｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈアゴニストを、培地中に浮遊させた固体基材に固定化することができ、それにより、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰとＮｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈアゴニストとの相互作用が容易になる。この方法は、細胞を培養物中、Ｖδ１＋γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって維持することを更に含む。いくつかの実施形態では、持続時間は、約２週間から約１５週間の間、好ましくは約２週間から約９週間の間である。
【0068】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、又はＮｏｔｃｈアゴニストを固定化するために、無細胞系を使用する。上記無細胞系には、臨床的適用のために容易に拡張可能であるという利点がある。無細胞系は、３Ｄ足場を含むことが好ましい。本明細書で使用される場合、「３Ｄ足場」とは、その上に細胞が埋め込まれる又は播種され、３次元細胞増殖及び分化を支持することができる、人工的な生体適合性の可鍛性構造を指す。さらに、足場を、生化学的因子、例えば、分化誘導リガンド、増殖因子、細胞栄養分を体内に送達するため、器官又は組織の新規の細胞の成長を支持し、方向付けるために使用することができる。足場は、天然材料のものであっても合成材料のものであってよく、また、恒久性であっても生分解性であっても生体吸収性であってもよい。天然足場材料の例としては、アガロース、コラーゲン、一部の直鎖状脂肪族ポリエステル、キトサン及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンが挙げられる。一般に使用される合成生分解性足場材料としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）；ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＧＬＡ）及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）が挙げられる。足場は、一般に、構造全体を通した細胞の播種及び拡散が容易になるように、高多孔度を有する。或る実施形態では、３Ｄ足場は、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、又はそのアゴニストを含む又はそれとコンジュゲートしており、したがって、培養される細胞は上記Ｎｏｔｃｈリガンドによって刺激される。
【0069】
別の実施形態では、無細胞系は、浮遊支持体を含む。「浮遊支持体」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、又はアゴニストとコンジュゲートした場合、Ｎｏｔｃｈリガンド（又はそのアゴニスト）が培養培地中に浮遊することを可能にする任意の材料を指す。浮遊支持体は、多種多様な材料製であってよく、また、様々な形式であってよい。浮遊支持体として使用することができる支持体の例としては、これだけに限定されないが、粒子、ビーズ（マイクロビーズを含む）、タンパク質、脂質、核酸分子、フィルター、繊維、スクリーン、メッシュ、チューブ、中空繊維、生体組織及びこれらの任意の組合せが挙げられる。一実施形態では、浮遊支持体は粒子である。粒子は、これだけに限定されないが、球体、卵形、棒状、又は四角形を含めた任意の形状であってよい。粒子は、これだけに限定されないが、天然又は合成ポリマー、天然又は合成ワックス、セラミックス、金属、生物材料又はこれらの組合せを含めた種々の材料のものであってよい。一実施形態では、浮遊支持体は、マイクロビーズを含む。「マイクロビーズ」という用語は、本明細書で使用される場合、直径が０．０１ｐｍ（１０ｎｍ）～５００ｐｍ、任意選択で１ｐｍから２００ｐｍまでである球状又は実質的に球状のビーズを指す。別の実施形態では、マイクロビーズの直径は、６．５ｐｍ～１００ｐｍ、任意選択で２０ｐｍ～３０ｐｍ、２４ｐｍ～２６ｐｍ又は２５ｐｍである。
【0070】
種々の型のマイクロビーズが本明細書において意図されている。一実施形態では、マイクロビーズは、ポリマー、シリカ又は磁性、超常磁性、常磁性又は強磁性マイクロビーズである。他の実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンマイクロビーズ又は金ナノ粒子である。別の実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンと架橋結合したもの又は酸化鉄コーティングされたものである。別の実施形態では、マイクロビーズは、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）でコーティングされたものである。
【0071】
Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、又はそのアゴニストを３Ｄ足場又は浮遊支持体にコンジュゲートすることが好ましい。タンパク質を支持体にコンジュゲートする種々の手段が当該技術分野で既知である。「コンジュゲーション」は、本明細書では、２つの化合物、例えばマイクロビーズとＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドが連結している状態を指す。タンパク質は、浮遊支持体又は３Ｄ足場、例えばマイクロビーズに直接的にコンジュゲートしていてもよく、間接的にコンジュゲートしていてもよい。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドを浮遊支持体又は３Ｄ足場にビオチン／ストレプトアビジン系を使用してコンジュゲートする。その場合、Ｎｏｔｃｈリガンドをビオチン化し、次いで、ストレプトアビジンでコーティングした浮遊支持体又は３Ｄ足場（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロビーズ）にコンジュゲートする。別の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドを浮遊支持体又は３Ｄ足場にプロテインＧ又はプロテインＡを介してコンジュゲートする。浮遊培養では、培養培地中を自由に漂わせて細胞を成長させる。対照的に、３Ｄ足場培養では、細胞を人工的基材上で単層として成長させる。
【0072】
ヒトＨＰＣを含む細胞集団を本明細書に記載の好適な条件下で培養して、γδＴ細胞を含む集団を生成する。ヒトＨＰＣを含む細胞集団を１種のＮｏｔｃｈリガンド又はアゴニストの存在下で、好ましくはＪａｇ２の存在下で培養することが好ましく、ここで、Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストを浮遊支持体又は３Ｄ足場にコンジュゲートし、上記細胞を、上記Ｎｏｔｃｈリガンドと接触させて、γδＴ細胞系列の細胞が形成されるのに十分な時間にわたって培養する。Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２を浮遊支持体とコンジュゲート、好ましくは浮遊支持体に含まれるマイクロビーズにコンジュゲートし、したがって、ヒトＨＰＣを含む細胞集団を、浮遊液中でＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２と接触させて培養することが好ましい。別の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２を３Ｄ足場とコンジュゲート、好ましくは上記３Ｄ足場に含まれるマイクロビーズとコンジュゲートし、したがって、ヒトＨＰＣを含む細胞集団を、足場の人工基材上で、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２と接触させて培養する。
【0073】
別の実施形態では、ヒトＨＰＣを含む細胞集団を、任意選択で閉鎖系のＧａｓ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ（Ｇ－Ｒｅｘ）システムバイオリアクターであってよいバイオリアクター中、又は閉鎖系の自動化バイオリアクター中で、浮遊支持体又は３Ｄ足場にコンジュゲートしたＮｏｔｃｈリガンドとともに培養する。一実施形態では、浮遊支持体又は３Ｄ足場は、マイクロビーズにコンジュゲートしたＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２を含み、ここで、マイクロビーズの直径はバイオリアクターと適合させる。種々のバイオリアクターが当該技術分野で既知であり、それらとして、バッチ、流加バッチ又は連続バイオリアクターを挙げることができる。連続バイオリアクターの例は、連続撹拌槽型反応器モデルである。
【0074】
浮遊支持体又は３Ｄ足場に対するＮｏｔｃｈリガンドの位置付けを方向付けることにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を増強することができる。したがって、一実施形態では、ＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端を浮遊支持体又は３Ｄ足場にコンジュゲートする。これは、例えば、ＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端に、ビオチン分子と酵素的にコンジュゲートすることができる配列を付加することにより、工学的に作製することができる。別の実施形態では、融合タンパク質Ｎｏｔｃｈリガンド－ＦｃのＣ末端領域に存在するＦｃセグメントを、浮遊支持体又は３Ｄ足場とコンジュゲートしたプロテインＡ又はプロテインＧに直接結合させてもよい。それぞれが浮遊支持体又は３Ｄ足場とコンジュゲートした１つ以上の追加的な分子を培養物に添加してもよい。一実施形態では、追加的な分子は、Ｔ細胞共刺激分子とも称される、Ｔ細胞発生を促進する（例えば、Ｔ細胞系列の細胞のコミットメント及び分化を促進する）分子である。
【0075】
培養条件には、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣを含む細胞集団を、γδＴ細胞がαβＴ細胞よりも多量に生成されるように、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２と接触させて十分な期間にわたって培養することが伴う。細胞を、本明細書に記載の所望の細胞組成物を実現するために必要な好適な期間にわたって維持することができることが理解されよう。培養時間は、３０日以上、好ましくは３５日以上、好ましくは３０日～５０日であることが好ましい。
【0076】
細胞とマイクロビーズの比（マイクロビーズと細胞の比とも称される）は、培養条件並びに細胞の増殖及び分化のためにもたらされる刺激に応じて変動させることができる。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、又はそのアゴニストをマイクロビーズにコンジュゲートし、ここで、マイクロビーズにコンジュゲートしたＮｏｔｃｈリガンドとヒトＨＰＣの比は、１：１から２７：１の間、任意選択で５：１～１５：１、８：１～１０：１又は９：１である。当業者は、培養条件に応じて最良のマイクロビーズと細胞の比の確立の仕方を承知している。
【0077】
あるいは、本発明の第１の態様は、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ、及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法にも関する。本方法に有用なＨＰＣを含む別の供給源は、骨髄又は末梢血、好ましくは骨髄から動員されたＨＰＣを含む末梢血である。ＨＰＣを含む他の供給源として、胎盤血、胎児肝臓又はｉＰＳＣ等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞が挙げられ、これらも同様に本方法の実施に適し得る。この方法は、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団を、適切な培養培地、好ましくは、基材上に固定化した又は細胞株において高発現させたＮｏｔｃｈリガンド（好ましくはＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１又はＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド、より好ましくはＪａｇ２）又はＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを含む培地で生育することを含むことが好ましい。本発明のいくつかの態様では、Ｎｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈアゴニストを培地中に浮遊させた固体基材上に固定化することができ、それにより、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰとＮｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈアゴニストとの相互作用が容易になる。いくつかの他の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２を間質細胞株において高発現させる。この方法は、細胞を培養物中で、γδＴ細胞、好ましくはＶδ１＋γδＴ細胞が富化された組成物が生じるのに十分な持続時間にわたって維持することを更に含む。いくつかの実施形態では、持続時間は、約２週間から約１５週間の間、好ましくは約２週間から９週間の間である。上記Ｎｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈアゴニストを、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に存在させる又は添加することができる。好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２、最も好ましくはヒトＪａｇ２を細胞株、好ましくは間質細胞において、好ましくはそれらの表面上に高発現させ、上記細胞を、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団と共培養して相互作用させる。「高発現」という用語は上で説明されており、ここでも適用される。
【0078】
上記を考慮して、本発明の第１の態様は、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含み、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ、及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から得られる細胞組成物を生成するための、高発現させたＮｏｔｃｈリガンド、好ましくはＪａｇ２の使用、及び方法を提供する。実施例、特に実施例１において及び図１～図３において示されている通り、ヒトＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドは、間質細胞株において高発現されると、γδＴ細胞がαβＴ細胞よりも高い割合で生じる分化パターンを選択的に誘導する、唯一のリガンドである。したがって、上で定義された使用及び方法のどちらにも適用することができる第１の態様の或る実施形態では、高発現させたＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドを本発明において使用して、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団からのγδＴ細胞の生成をαβＴ細胞の生成よりも有利にする。γδＴ細胞が富化された細胞組成物は、γδＴ細胞とαβＴ細胞の両方を含むＴ細胞の集団であり、第１の態様の使用及び方法に従った少なくとも３０日間の培養後、好ましくは６０日間の培養後、γδＴ細胞が総Ｔ細胞の少なくとも８０％～９５％、好ましくは９０％～９５％に相当することが好ましい。或る実施形態では、第１の態様の使用及び方法に従った少なくとも３０日間の培養後、好ましくは６０日間の培養後に、αβＴ細胞は、総Ｔ細胞の１５％未満、好ましくは５％～１０％に相当する。γδＴ細胞の少なくとも３０％、好ましくは３０％～４０％がＶδ１＋γδＴ細胞であることが好ましい。Ｖδ１＋γδＴ細胞は、同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞であることが好ましい。第１の態様の使用及び方法に従って得られた又は得ることができるγδＴ細胞のより詳細な説明を本発明の第２の態様において提示する。
【0079】
本発明の第２の態様は、第１の態様の使用及び方法により得られた又は得ることができる、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物に関する。第１の態様の使用及び方法に従った少なくとも３０日間の培養後、好ましくは６０日間の培養後に、細胞組成物のＴ細胞の総数の少なくとも８０％～９５％、好ましくは９０％～９５％がγδＴ細胞であることが好ましい。或る実施形態では、第１の態様の使用及び方法に従った少なくとも３０日間の培養後、好ましくは６０日間の培養後に細胞組成物に含まれるＴ細胞の総数の１５％未満、好ましくは５％～１０％がαβＴ細胞である。
【0080】
第２の態様の或る実施形態では、細胞組成物に含まれるγδＴ細胞がここでは不均一な細胞集団であり、
ｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも３０％、好ましくは３０％～４０％がＶδ１＋γδＴ細胞であり、
ｉｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも４％、好ましくは４％～７％がＶδ２＋γδＴ細胞であり、
ｉｉｉ）γδＴ細胞の総数の約５０％がＶδ２＋細胞でもＶδ１＋細胞でもない。
ｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも３０％、好ましくは３０％～４０％がＶδ１＋γδＴ細胞であり、
ｉｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも４％、好ましくは４％～７％がＶδ２＋γδＴ細胞であり、
ｉｉｉ）γδＴ細胞の総数の約５０％がＶδ２＋細胞でもＶδ１＋細胞でもない。
【0081】
さらに、好ましい実施形態では、Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはｉ）のＶδ１＋γδＴ細胞もまた、ここでは以下の細胞集団：
ａ）未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現することを特徴とする第１の細胞集団（以降ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞と称する）と、
ｂ）未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現しないことを特徴とする第２の細胞集団（以降ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞と称する）と、
を含む不均一な細胞集団である。
ａ）未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現することを特徴とする第１の細胞集団（以降ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞と称する）と、
ｂ）未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現しないことを特徴とする第２の細胞集団（以降ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞と称する）と、
を含む不均一な細胞集団である。
【0082】
【0083】
或る実施形態では、第１のＴ細胞の集団（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）は、不均一なＶδ１＋γδＴ細胞集団に含まれるＶδ１＋γδＴ細胞の大部分に相当する。Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは８５％～９５％がＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞（第１の集団）であることが好ましい。したがって、Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞が富化されたものである。Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の８％～１２％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第２の集団）であることが好ましい。Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７０％超がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第１の集団）であることが好ましい。
【0084】
好ましい実施形態では、第１の態様の方法及び使用から得ることができる又は得られた細胞組成物は、少なくとも３０日間の培養後、好ましくは６０日間の培養後に、Ｔ細胞の総数の少なくとも８０％～９５％、好ましくは９０％～９５％がγδＴ細胞であるので、γδＴ細胞が富化された不均一な細胞集団であり、
ｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも３０％、好ましくは３０％～４０％がＶδ１＋γδＴ細胞であり、
ｉｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも４％、好ましくは４％～７％がＶδ２＋γδＴであり、
ｉｉｉ）γδＴ細胞の総数の約５０％がＶδ２＋細胞でもＶδ１＋細胞でもなく、
ｉ）の集団は、総Ｖδ１＋γδＴ細胞の８５％～９５％がＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞であり、総Ｖδ１＋γδＴ細胞の８％～１２％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞であるので、ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞が富化されたものである。
ｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも３０％、好ましくは３０％～４０％がＶδ１＋γδＴ細胞であり、
ｉｉ）γδＴ細胞の総数の少なくとも４％、好ましくは４％～７％がＶδ２＋γδＴであり、
ｉｉｉ）γδＴ細胞の総数の約５０％がＶδ２＋細胞でもＶδ１＋細胞でもなく、
ｉ）の集団は、総Ｖδ１＋γδＴ細胞の８５％～９５％がＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞であり、総Ｖδ１＋γδＴ細胞の８％～１２％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞であるので、ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞が富化されたものである。
【0085】
Ｖδ１＋γδＴ細胞は、ＩＦＮγを産生するが、ＩＬ－１７は産生しないことが好ましい。図２参照。
【0086】
上記の細胞集団それぞれ及びそれらの割合を測定する方法は当該技術分野で既知であり、本発明の説明において確立されている。特に、Ｔ細胞の型それぞれの測定方法は、自動化細胞計数器を用いた総細胞計数及び分画細胞計数を使用して行われる。細胞のパーセンテージ及びＣＤ１ａ発現細胞のパーセンテージは、フローサイトメーターを使用して決定することができる。
【0087】
第２の態様の或る実施形態では、細胞の第１の集団（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）は、以下の表面マーカー、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを発現しないことを更に特徴とする。或る実施形態では、第１の集団の細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、又は両方を発現するもの又は発現しないものであり得る、すなわち、ＣＤ４＋ＣＤ８－、ＣＤ４－ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋又はＣＤ４－ＣＤ８－であり得る。図８及び図９参照。
【0088】
第２の態様の或る実施形態では、細胞の第２の集団（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）は、以下の表面マーカー、ＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを更に特徴とする。図８及び図９参照。
【0089】
第２の態様による細胞組成物は、本発明の第１の態様に従って得られた又は得ることができるヒト同種細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含むことが好ましい。
【0090】
本発明の第３の態様は、第２の態様において定義されたＶδ１＋γδＴ細胞の第１の集団を含む細胞組成物に関する。したがって、第３の態様による細胞組成物は、少なくともＣＤ１ａ表面マーカーを発現し、好ましくは、以下の表面マーカー、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを発現しないことを特徴とするＶδ１＋γδＴ細胞を含む。本発明の第４の態様は、第２の態様において定義されたＶδ１＋γδＴ細胞の第２の集団を含む細胞組成物に関する。したがって、第４の態様による細胞組成物は、ＣＤ１ａ表面マーカーを発現せず、好ましくは、以下の表面マーカー、ＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを特徴とするＶδ１＋γδＴ細胞を含む。
【0091】
好ましい実施形態では、第３の態様及び第４の態様の細胞集団は、実質的に純粋又は均一な集団である。本発明の文脈において、実質的に純粋な集団は、細胞が、実質的に単離された細胞であり得る集団である。一実施形態では、細胞又は細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％に相当する。「実質的に純粋」という用語は、「完全に純粋」を包含し、この用語と区別なく使用され得る。
【0092】
本発明の第５の態様は、自己又は同種Ｖδ１＋γδＴ細胞の不均一な細胞集団に関するものであり、ここで、上記不均一な細胞集団は、Ｖδ１＋γδＴ細胞の第１の亜集団及び第２の亜集団を含み、第１の亜集団は、未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現する細胞（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）を含み、第２の亜集団は、未成熟表面細胞マーカーＣＤ１ａを発現しない細胞（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）を含む。或る実施形態では、第１の細胞の亜集団（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）は、不均一な細胞集団に含まれる細胞の大部分に相当する。第１の細胞の亜集団は、不均一な細胞組成物に含まれる総Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％に相当することが好ましい。上記の細胞亜集団それぞれ及びそれらの割合の測定方法は、当該技術分野で既知であり、本発明の説明において確立されている。特に、Ｖδ１＋γδＴ細胞それぞれの測定方法は、自動化細胞計数器を用いた総細胞計数及び分画細胞計数を使用して行われる。細胞のパーセンテージ及びＣＤ１ａ発現細胞のパーセンテージは、フローサイトメーターを使用して決定することができる。
【0093】
第５の態様の或る実施形態では、第１の亜集団の細胞（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）は、以下の表面マーカー、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを発現しないことを更に特徴とする。或る実施形態では、第１の亜集団の細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、又は両方を発現するもの又は発現しないものであり得る、すなわち、ＣＤ４＋ＣＤ８－、ＣＤ４－ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋又はＣＤ４－ＣＤ８－であり得る。図８参照。
【0094】
第５の態様の或る実施形態では、第２の亜集団の細胞（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）は、以下の表面マーカー、ＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを更に特徴とする。図８参照。
【0095】
本発明の第６の態様は、第５の態様において定義された第１の細胞の亜集団を含む細胞組成物に関する。したがって、第６の態様による細胞組成物は、少なくともＣＤ１ａ表面マーカーを発現し、好ましくは、以下の表面マーカー：ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを発現しないことを特徴とするＶδ１＋γδＴ細胞を含む。本発明の第７の態様は、第５の態様において定義された第２の細胞の亜集団を含む細胞組成物に関する。したがって、第５の態様による細胞組成物は、少なくともＣＤ１ａ表面マーカーを発現せず、好ましくは、以下の表面マーカー、ＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを特徴とするＶδ１＋γδＴ細胞を含む。
【0096】
好ましい実施形態では、第６の態様及び第７の態様の細胞の集団は、実質的に純粋又は均一な集団である。本発明の文脈において、実質的に純粋な集団は、細胞が、実質的に単離された細胞であり得る集団である。一実施形態では、細胞又は細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％に相当する。
【0097】
したがって、第１の態様（ＳＴＥＰ１）の方法を使用して、ＣＤ３４＋細胞から、好ましくは臍帯血ＣＤ３４＋細胞から、Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団を生成することができる。上記Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、本明細書において第２の態様～第７の態様で定義されている、ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞（第１の集団）とＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第２の集団）とを含む不均一な集団である。ＣＤ３４＋前駆細胞が臍帯血由来のものである場合、第１の態様の方法又は使用で得られる細胞は、本明細書ではＣＢ－Ｊａｇ２細胞と称される。
【0098】
第１の態様（ＳＴＥＰ１）に従ってｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＶδ１＋γδＴ細胞、特に、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含む第２の集団を、それらを活性化させる、及びそれらの増殖を誘導する目的で、第２の工程（ＳＴＥＰ２）において更に拡大させることができる。完全な二段階プロトコルが図１２に示されており、該プロトコルでは、ヒト臍帯血から単離したＣＤ３４＋ＨＰＣをＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で最長８週間培養し（ＳＴＥＰ１又は第１の態様の方法）、その結果、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様、及び第７の態様において定義されている細胞組成物に対応する細胞であるＣＢ－Ｊａｇ２細胞がもたらされる。次いで、上記ＣＢ－Ｊａｇ２細胞を、ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２細胞と称される、拡大した、高度に細胞傷害性のＶδ１＋γδＴ細胞の集団をもたらす目的で、拡大及び活性化させる（ＳＴＥＰ２）。なお、ＣＢ ｅｘ ｖｉｖｏ及びＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏは、ＣＢ及びＰＢ中に既に存在しているＶδ１＋γδＴ細胞であり、したがって、ＣＤ３４＋造血前駆細胞からｄｅ ｎｏｖｏ生成されたものではないので、ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＢ又はＰＢから得られたＶδ１＋γδＴ細胞（図１２においてＣＢ ｅｘ ｖｉｖｏ及びＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏと称される）は、態様１～態様７において定義されているＶδ１＋γδＴ細胞ではない。
【0099】
二段階方法で得られた結果から、ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２細胞（すなわち、第１の態様～第７の態様において定義されている通り、ｄｅ ｎｏｖｏで得られ、その後、ＳＴＥＰ２において拡大させた細胞）内のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞は、ＰＢ及びＣＢから得られたｅｘ ｖｉｖｏで単離された細胞を、その後ＳＴＥＰ２において拡大させたもの（ＣＢ－ＳＴＥＰ２及びＰＢ－ＳＴＥＰ２）の集団内のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞よりもＣＤ８＋エフェクター細胞を多く含むことが示された。図１３参照。ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２細胞はまた、ＣＢ－ＳＴＥＰ２及びＰＢ－ＳＴＥＰ２内で生成されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞と比して、ＬＡＧ３及びＣＴＬＡ－４の低発現によって評価される通り、低疲弊細胞プロファイルを示した。図１４参照。ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２細胞はまた、図１５に示されている通り、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋ＣＢ－ＳＴＥＰ２及びＰＢ－ＳＴＥＰ２ γδＴ細胞よりも高レベルの細胞傷害性関連活性化受容体を示した。最後に、ＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２は、白血病細胞株に対して、それぞれＣＢ及びＰＢから単離されたｅｘ ｖｉｖｏ細胞のＳＴＥＰ２拡大によって得られたＣＢ－ＳＴＥＰ２細胞及びＰＢ－ＳＴＥＰ２細胞よりも高いｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解潜在性を示した。
【0100】
これらの結果から、
臍帯血由来であることが好ましい造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）の使用と、
ＳＴＥＰ１（第１の態様の方法又は使用）を使用したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成と、
ＳＴＥＰ１で得られた上記ｄｅ ｎｏｖｏ ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞のＳＴＥＰ２を使用した拡大及び活性化と、
を組み合わせることにより、細胞傷害潜在性がより高く、疲弊プロファイルが低減されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団がもたらされると結論付けた。
臍帯血由来であることが好ましい造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）の使用と、
ＳＴＥＰ１（第１の態様の方法又は使用）を使用したＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成と、
ＳＴＥＰ１で得られた上記ｄｅ ｎｏｖｏ ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞のＳＴＥＰ２を使用した拡大及び活性化と、
を組み合わせることにより、細胞傷害潜在性がより高く、疲弊プロファイルが低減されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団がもたらされると結論付けた。
【0101】
上記の結果を考慮して、本発明の第８の態様は、本発明の第２の態様、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様及び第７の態様において定義されているＶδ１＋γδＴ細胞を活性化させる、及びその増殖を誘導する方法（ＳＴＥＰ２とも称される）に関する。上で強調された通り、Ｖδ１＋γδＴ細胞（ＳＴＥＰ１（本発明の第１の態様）後に得られたもの）は、不均一なＶδ１＋γδＴ細胞の集団であり、それらの一部はＣＤ１ａマーカーを発現し（ＣＤ１ａ＋）（第１の集団）、それらの一部はＣＤ１ａ－である（第２の集団）。本発明のＳＴＥＰ２（すなわち、第８の態様の方法）は、特にＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団を活性化及び拡大させること（すなわち、増殖させること）に関することが好ましい。
【0102】
したがって、ＳＴＥＰ２の活性化及び増殖を特にＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞のサブセット（上で定義されている第２の集団）に対して実施することが好ましい。第８の態様の方法は、これだけに限定されないが抗ＣＤ３ ｍＡｂを含めたγδＴＣＲアゴニスト等の活性化剤、並びにこれだけに限定されないがＩＬ－４、ＩＦＮγ及びＩＬ－１５を含めたサイトカインの使用を含んでもよいことが好ましい。この目的のために、及び実施例１又は２に示されている通り、本発明の第１の態様に従って得られた又は得ることができるＶδ１＋γδＴ細胞を含む細胞組成物は、抗ＴＣＲαβ ｍＡｂ及び磁性ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用した磁気細胞選別等の任意の有用な技法によってαβＴ細胞を枯渇させることが好ましい。ＴＣＲαβを枯渇させた細胞浮遊液を、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地中、抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３等の活性化剤＋サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１βの存在下で７日間培養する（細胞２．５×１０５個／ｍｌ）。次いで、細胞を任意選択で洗浄し、再度、活性化剤及び１種以上のサイトカインとともに１回又は複数回培養する。培養を、通常１０日目～３０日目、好ましくは１０日目～２５日目、より好ましくは１５日目～２５日目、より好ましくは１５日目～１６日目までに停止させるか、又は、細胞を、任意選択で希釈し、活性化剤及び１種以上のサイトカインの存在下で拡大の第２ラウンドに供してもよい。なお、本発明の第１の態様と第８の態様の組合せ（すなわち、ＳＴＥＰ１とＳＴＥＰ２の組合せ）により、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋Ｔ細胞収率の向上（２５０×１０６個～９５０×１０６個のＣＢ－Ｊａｇ２－ＳＴＥＰ２細胞／１０６個のＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣ）を可能にすることが予想される二段階方法が構成される。
【0103】
なお、本発明の第８の態様から得られたＶδ１＋γδＴ細胞の最終的なサブセットは、リンパ性白血病細胞に対する細胞傷害性の増強を伴う天然の機能的な細胞傷害性受容体を安定に発現するはずである。上記サブセットは、細胞傷害性かつ拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞であることが好ましく、本発明の第９の態様において更に定義される。
【0104】
本発明の第２の態様、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様及び第７の態様において定義されている、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第２の集団）のものであることが好ましいＶδ１＋γδＴ細胞を活性化する及びその増殖を誘導する、単に例示的な別の潜在的に有用な方法は、これらの細胞を、適切な培養培地中、γδＴＣＲアゴニストの存在下、好ましくは、可溶性又は固定化されたものであることが好ましい上記アゴニストを一定間隔ごとに添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、かつ、少なくとも１種のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１βからなる群から選択されるサイトカインの存在下で、好ましくは上記サイトカイン（単数又は複数）を一定間隔で添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、生育することによるものである。上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを上記細胞培養物に、培養時に、かつ培養期間全体を通して、好ましくは３日～６日ごとに添加し、したがって、上記培養物中のγδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインの濃度が一般にはゼロを常に超えるようにする。上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインの添加を、細胞の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで行うことができる。より好ましい実施形態では、上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインの添加を、天然細胞傷害性受容体、すなわちＮＫｐ３０を含む又はそれのみからなる天然細胞傷害性受容体を発現する生存可能かつ機能的な細胞が５０００万個を超える、１億個を超える、２憶個を超えることが実現されるまで行うことができる。上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインの添加を、細胞の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、１００％がＮＫｐ３０を発現するまで行うことができることが好ましい。開示される方法の好ましい実施形態では、上記サイトカインは、一般的なサイトカイン、好ましくはインターロイキン、すなわち、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β又はそれらの混合物、とりわけ、好ましくはＩＬ－７又はＩＬ１５を意味する。使用されるインターロイキンは、ヒト起源又は動物起源のもの、好ましくはヒト起源のものであってよい。使用されるインターロイキンは、野生型タンパク質であっても、生物活性のある、つまり、本発明による方法の条件下でその受容体に結合し、γδＴ細胞の活性化を誘導することが可能である、任意の断片又はバリアントであってもよい。サイトカインは、可溶性の形態であってもよく、別の分子、例えばペプチド、ポリペプチド又は生物活性のあるタンパク質等と融合又は複合体形成していてもよいことがより好ましい。ヒト組換えサイトカインを使用することが好ましい。インターロイキン濃度の範囲を１Ｕ／ｍｌから１００００Ｕ／ｍｌの間、なおより好ましくは１００Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌの間で変動させてもよいことがより好ましい。開示される方法の他の好ましい実施形態では、上記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ－サイトカインの一定間隔での添加を、２日間～６０日間、より好ましくは９日間～２５日間、なおより好ましくは１５日間～２５日間、すなわち、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間又は２１日間、実施することができる。細胞を３６℃～３８℃、好ましくは３７℃の温度で培養することが好ましい。
【0105】
第８の態様の方法は、Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法、好ましくは、本発明の第２の態様、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様及び第７の態様において定義されているＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第２の集団）を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法であって、上記Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストの存在下で、好ましくは、可溶性又は固定化されたものであることが好ましい上記アゴニストを一定間隔ごとに添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、かつ少なくともＩＬ２１及びＩＬ１５の存在下で、生育して、Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含む拡大及び活性化された細胞集団を得る工程を含む、方法であることが最も好ましい。Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を、まず、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストの存在下かつ少なくともＩＬ２１の存在下で、少なくとも５日間、好ましくは少なくとも７日間生育し、培養５日目、好ましくは７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加する一方で、培養培地中に少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、及び少なくともＩＬ２１が存在することを維持することが好ましい。ＩＬ１５を添加した後、細胞を少なくとも７日間、好ましくは少なくとも９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、又は１６日間超の期間にわたって培養して、Ｖδ１＋γδＴ細胞を含む、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含む拡大及び活性化された細胞集団を得ることが好ましい。
【0106】
第８の態様の方法は、Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法、好ましくは本発明の第２の態様、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様及び第７の態様において定義されているＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第２の集団）を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法であって、該方法が、
上記Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストの存在下かつ少なくともＩＬ２１の存在下で少なくとも５日間生育することと、
上記培養が、可溶性又は固定化されたものであることが好ましい上記アゴニスト及びサイトカインを一定間隔で添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより実施されることが好ましい；
培養５日目、好ましくは培養７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加する一方で、培養培地中に少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及びＩＬ２１が存在することを維持することと、
を含み、
培養時間が、総γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞になるまで実行される、及び／又は、培養時間が、少なくとも７日間、８日間、好ましくは９日間、１０日間、１１日間、１２日間、好ましくは１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、又は２０日間実行される、
方法であることが最も好ましい。
上記Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストの存在下かつ少なくともＩＬ２１の存在下で少なくとも５日間生育することと、
上記培養が、可溶性又は固定化されたものであることが好ましい上記アゴニスト及びサイトカインを一定間隔で添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより実施されることが好ましい；
培養５日目、好ましくは培養７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加する一方で、培養培地中に少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及びＩＬ２１が存在することを維持することと、
を含み、
培養時間が、総γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞になるまで実行される、及び／又は、培養時間が、少なくとも７日間、８日間、好ましくは９日間、１０日間、１１日間、１２日間、好ましくは１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、又は２０日間実行される、
方法であることが最も好ましい。
【0107】
或る実施形態では、第８の態様の方法は、
第１の態様の方法から得られた、又は態様１～態様７のいずれかにおいて定義されている細胞を、血漿、好ましくは自己血漿又はヒト血清を補充した無血清培養培地中、抗ＴＣＲγδｍＡｂ及びＩＬ－２１の存在下で少なくとも７日間培養する工程と、
培養７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加し、任意選択で、ＩＬ－２１及び抗ＴＣＲγδｍＡｂを新鮮な抗ＴＣＲγδｍＡｂ及びＩＬ－２１と交換する工程と、
細胞を更に少なくとも７日間（すなわち、培養１４日目まで）、好ましくは培養１５日目～１６日目まで培養して、活性化された、細胞傷害性のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を得る工程と、
任意選択で、拡大の第２ラウンドを行う工程であって、細胞を、少なくとも抗ＴＣＲγδｍＡｂ、ＩＬ－１５及びＩＦＮ－γの存在下で１８日目～２１日目まで培養する、工程と、
を含む。
第１の態様の方法から得られた、又は態様１～態様７のいずれかにおいて定義されている細胞を、血漿、好ましくは自己血漿又はヒト血清を補充した無血清培養培地中、抗ＴＣＲγδｍＡｂ及びＩＬ－２１の存在下で少なくとも７日間培養する工程と、
培養７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加し、任意選択で、ＩＬ－２１及び抗ＴＣＲγδｍＡｂを新鮮な抗ＴＣＲγδｍＡｂ及びＩＬ－２１と交換する工程と、
細胞を更に少なくとも７日間（すなわち、培養１４日目まで）、好ましくは培養１５日目～１６日目まで培養して、活性化された、細胞傷害性のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を得る工程と、
任意選択で、拡大の第２ラウンドを行う工程であって、細胞を、少なくとも抗ＴＣＲγδｍＡｂ、ＩＬ－１５及びＩＦＮ－γの存在下で１８日目～２１日目まで培養する、工程と、
を含む。
【0108】
第８の態様の方法は、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法、好ましくは本発明の第２の態様、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様及び第７の態様において定義されているＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（第２の集団）を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法であって、該方法が、
上記Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストの存在下かつ少なくともＩＬ２１、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１及びＩＬ－１βの存在下で少なくとも５日間、好ましくは７日間、生育することと、
なお、上記培養が、可溶性又は固定化されたものであることが好ましい上記アゴニスト及びサイトカインを一定間隔で添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより実施されることが好ましい；
培養５日目、好ましくは培養７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加する一方で、培養培地中に少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及びＩＬ２１が存在することを維持することと、
を含み、
培養時間が、総γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞になるまで実行される、及び／又は、培養時間が、少なくとも７日間、８日間、好ましくは９日間、１０日間、１１日間、１２日間、好ましくは１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、又は２０日間実行される、
方法であることが最も好ましい。
上記Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストの存在下かつ少なくともＩＬ２１、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１及びＩＬ－１βの存在下で少なくとも５日間、好ましくは７日間、生育することと、
なお、上記培養が、可溶性又は固定化されたものであることが好ましい上記アゴニスト及びサイトカインを一定間隔で添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより実施されることが好ましい；
培養５日目、好ましくは培養７日目に、ＩＬ－１５を培養培地に添加する一方で、培養培地中に少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト及びＩＬ２１が存在することを維持することと、
を含み、
培養時間が、総γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞になるまで実行される、及び／又は、培養時間が、少なくとも７日間、８日間、好ましくは９日間、１０日間、１１日間、１２日間、好ましくは１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、又は２０日間実行される、
方法であることが最も好ましい。
【0109】
別の実施形態では、第８の態様の方法は、本発明の第２の態様、第３の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様及び第７の態様において定義されているＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を活性化させるとともに、その増殖を誘導する方法であって、該方法が、
上記Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３ ｍＡｂの存在下かつ少なくともサイトカインＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１及びＩＬ－１βの存在下で生育することと、
培養５日目、好ましくは培養６日目又は７日目に、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３を含み、かつＩＬ２１及びＩＬ１５を含む新しい（新鮮な）培養培地を添加することと、
培養１０日目、好ましくは培養１１日目又は１２日目に、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３を含み、かつＩＬ１５を含む新しい（新鮮な）培養培地を添加することと、
任意選択で、培養１５日目、好ましくは培養１６日目に、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３を含み、かつＩＬ１５及びＩＦＮ－γを含む新しい（新鮮な）培養培地を添加することと、
を含む、方法である。
上記Ｖδ１＋γδＴ細胞を、適切な培養培地中、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３ ｍＡｂの存在下かつ少なくともサイトカインＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１及びＩＬ－１βの存在下で生育することと、
培養５日目、好ましくは培養６日目又は７日目に、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３を含み、かつＩＬ２１及びＩＬ１５を含む新しい（新鮮な）培養培地を添加することと、
培養１０日目、好ましくは培養１１日目又は１２日目に、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３を含み、かつＩＬ１５を含む新しい（新鮮な）培養培地を添加することと、
任意選択で、培養１５日目、好ましくは培養１６日目に、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニスト、好ましくはＯＫＴ３等の抗ＣＤ３を含み、かつＩＬ１５及びＩＦＮ－γを含む新しい（新鮮な）培養培地を添加することと、
を含む、方法である。
【0110】
第８の態様の或る実施形態では、少なくとも１種のγδＴＣＲアゴニストを、０．５μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌの間、好ましくは２μｇ／ｍｌの濃度で添加する。第８の態様の或る実施形態では、ＩＬ２１を、７ｎｇ／ｍｌから１５ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１３ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。第８の態様の或る実施形態では、ＩＬ１５を、７０ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。第８の態様の或る実施形態では、ＩＦＮ－γを、３０ｎｇ／ｍｌから８０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは７０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。第８の態様の或る実施形態では、ＩＬ－４を、５０ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。第８の態様の或る実施形態では、ＩＬ－１βを、５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。任意選択で、細胞を無血清培養培地で培養し、血漿若しくはヒト血清、及び／又はグルタミンを任意選択で補充してもよい。
【0111】
或る実施形態では、ＳＴＥＰ１細胞の拡大によってＳＴＥＰ２後（すなわち、本発明の第８の態様後）に得られた細胞の集団は、臍帯血又は末梢血等の単離された生体試料からＳＴＥＰ２後に得られた細胞よりも細胞傷害性が高く、ここで、細胞傷害性は、図１６に示されている通りＪｕｒｋａｔ及び／又はＭＯＬＭ１３標的細胞を使用して測定されることが好ましい。第８の態様の方法後に得られた細胞の集団の細胞傷害性は、第８の態様の方法に従って活性化及び拡大させた、単離された生体試料、好ましくは臍帯血又は末梢血から得られた細胞の細胞傷害性の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、８倍、又は１０倍であることが好ましく、ここで、細胞傷害性は、白血病細胞、好ましくはＪｕｒｋａｔ又はＭｏｌｍ１３細胞株を使用し、エフェクター標的（Ｅ：Ｔ）比１：８又は１：４で、少なくとも２４時間、好ましくは４８時間の共培養後に測定されることが好ましい。
【0112】
さらに、ｄｅ ｎｏｖｏで得られた細胞の集団が、単離された生体試料からＳＴＥＰ２後に得られた細胞よりも細胞傷害性が高いだけでなく、ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（ＣＤ３４＋前駆細胞からｄｅ ｎｏｖｏで生成され、得られた上記集団に含まれるもの）も、臍帯血又は末梢血から得られたｅｘ ｖｉｖｏで単離された細胞からＳＴＥＰ２に従って拡大させた等価のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞（ＣＢ－ＳＴＥＰ２、ＰＢ－ＳＴＥＰ２）よりも良好な細胞傷害性プロファイル（細胞傷害性マーカーの存在によって測定して）を有する。図１５参照。したがって、本発明の第９の態様は、本発明の第８の態様に従って得られた又は得ることができる、活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞の集団を含む、好ましくは活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団を含む組成物に関する。本発明は、本発明の第８の態様に従って得られた又は得ることができる、同種の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞の集団、好ましくは同種の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団を含む組成物に関することが好ましい。図１７に示されている通り、第９の態様の細胞集団は、γδＴ細胞である総細胞の少なくとも３０％～９０％、好ましくは約４０％～６０％を構成し、そのうちの少なくとも４０％、好ましくは約４０％～６０％、好ましくは５０％超がＣＤ１ａ－かつＶδ１＋である（すなわち、Ｖδ１＋γδＴ細胞である）ことが好ましい。
【0113】
好ましい実施形態では、図１３に示されている通り、第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞を含む。好ましい実施形態では、第９の態様のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％が、ＣＤ８マーカーを発現する。好ましい実施形態では、第９の態様のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％がＴエフェクター表現型を示し、ここで、Ｔエフェクター表現型は、ＣＤ４５ＲＡマーカーの発現及び／又はＣＤ６２Ｌマーカーの発現の欠如を特徴とする。好ましい実施形態では、第９の態様のＶδ１＋γδＴ細胞の６０％未満、好ましくは５０％未満、４０％未満、３０％未満又は２０％未満がＣＤ２７マーカーを発現する。
【0114】
好ましい実施形態では、第９の態様の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、疲弊表現型を有さないことを特徴とし、ここで、疲弊表現型は、図１４に示されている通り、ＬＡＧ３及び／又はＣＴＬＡ４等の疲弊関連表面マーカーの発現によって測定される。第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％がＬＡＧ３及び／又はＣＴＬＡ４疲弊マーカーを検出可能なレベルでは発現しないことが好ましい。第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満がＬＡＧ３マーカーを検出可能なレベルで発現することが好ましい。第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満がＣＴＬＡ４マーカー＋を検出可能なレベルで発現することが好ましい。
【0115】
第９の態様の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、活性化された表現型を有することを更に特徴とし、ここで、活性化された表現型は、表面活性化マーカーであるＣＤ２５及び／又はＣＤ６９の発現によって測定される。図１４参照。第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％がＣＤ２５マーカーを検出可能なレベルで発現することが好ましい。第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％がＣＤ６９マーカーを検出可能なレベルで発現することが好ましい。
【0116】
好ましい実施形態では、第９の態様の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、図１５に示されている通り、細胞傷害性関連活性化受容体を含むことを特徴とする。上記Ｖδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞は、細胞傷害性関連マーカーであるＣＤ５６、Ｎｋｐ４４、Ｎｋｐ３０、ＮｋＧ２Ｄ及びＤＮＡＭ－１のうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを含むことを更に特徴とする。一実施形態では、第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％が、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄマーカーのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを検出可能なレベルで発現する。特定の一実施形態では、第９の態様の活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、ＣＤ５６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ及びＤＮＡＭ－１マーカーのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを検出可能なレベルで発現する。
【0117】
或る実施形態では、第９の態様の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６を発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現すること、
を特徴とし、
ここで、表面マーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６を発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現すること、
を特徴とし、
ここで、表面マーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
【0118】
第９の態様の拡大及び活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴの集団は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とすることが好ましく、
ここで、上記のマーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とすることが好ましく、
ここで、上記のマーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
【0119】
本発明の第１０の態様は、第９の態様において定義されているｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導し分化させ、拡大させたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導し分化させ、拡大させたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団を含む組成物に関する。したがって、第１０の態様による細胞組成物は、疲弊マーカーの低発現を伴う、高度に細胞傷害性であり、かつ活性化されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞を含む。第１０の態様の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、ＣＤ５６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ及びＤＮＡＭ－１マーカーのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを検出可能なレベルで発現することを特徴とすることが好ましい。
【0120】
第１０の態様の活性化及び拡大されたＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくはＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６を発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現すること、
を特徴とすることが好ましく、
ここで、表面マーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６を発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現すること、又は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現すること、
を特徴とすることが好ましく、
ここで、表面マーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
【0121】
第１０の態様の拡大及び活性化されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団は、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とすることが好ましく、
ここで、上記のマーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％又は６０％が、ＣＤ５６マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ４４マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は８０％が、ＮＫｐ３０マーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも７０％、好ましくは８０％～１００％が、ＮＫＧ２Ｄマーカーを発現することと、
Ｖδ１＋γδＴ細胞の総数の少なくとも８０％、好ましくは９０％～１００％が、ＤＮＡＭ－１マーカーを発現することと、
を特徴とすることが好ましく、
ここで、上記のマーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって測定されることが好ましい。
【0122】
本発明の好ましい実施形態では、第２の態様～第７の態様又は第９の態様又は第１０の態様の組成物を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を生じさせる。
【0123】
本発明の第１１の態様は、本発明の第２の態様～第７の態様又は第９の態様又は第１０の態様の組成物のいずれかを用いて得られた又は得ることができるＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物に関する。
【0124】
本発明の好ましい実施形態では、第２の態様～第７の態様又は第９の態様又は第１０の態様の組成物は、注射用である。好ましい実施形態では、注射用組成物は、８０％超、すなわち、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超が機能的な天然細胞傷害性受容体を発現する本発明の機能的Ｖδ１＋γδ細胞で構成される細胞集団を含み、ここで、注射用組成物は、機能的な天然細胞傷害性受容体を発現する本発明のＶδ１＋γδ細胞を１億個よりも多く含むことが好ましい。組成物はまた、薬学的に許容可能な作用物質又は担体、より好ましくは安定化剤、具体的にはヒト血清アルブミンも含むことが好ましい。細胞は、自己、つまり、同じ生物学的調製物（又は同じドナー）に由来するものであってもよいが、細胞は、同種性であること、つまり、同じ生物学的調製物（又は同じドナー）に由来するものではないことがより好ましい。細胞は、開示される主題によって記載される方法等の方法によって得ることがより好ましい。開示される主題の別の態様は、本発明の第２の態様～第７の態様、第９の態様又は第１０の態様の細胞を含む組成物の医薬における使用である。
【0125】
より好ましい実施形態では、第２の態様～第７の態様又は第９の態様又は第１０の態様に開示される組成物を、自己若しくは同種養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療において、又は、とりわけ、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のために使用することができる。第２の態様～第７の態様、第９の態様又は第１０の態様に開示される組成物を、自己若しくは同種養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療において、又は、とりわけ、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のために使用することができることがより好ましい。
【0126】
より好ましい実施形態では、本発明に開示される組成物をウイルス感染症の治療のために使用することができる。
【0127】
本発明は、以下の項目を更に含む：
１．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から、ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくは同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞を生成するための、Ｎｏｔｃｈリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用であって、Ｎｏｔｃｈリガンドが、Ｊａｇ２（Ｊａｇｇｅｄ２）である、使用。
２．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくは同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法が、
ａ．ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む細胞集団を、基材又は細胞株上に固定化されていることが好ましいＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを含む適切な培養培地中で生育することと、
ｂ．細胞を培養物中、Ｖδ１＋γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって維持することと、
なお、持続時間が、約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、上記Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含む、方法。
３．ヒトＨＰＣが、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ、ＣＤ３４＋骨髄ＨＰＣ、ＣＤ３４＋末梢血ＨＰＣに由来するものである、又はｉＰＳＣ等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞に由来するものである、項目１又は２のいずれかによる方法。
４．ヒト造血前駆細胞が、ヒトＣＤ３４＋ＥＴＰである、項目１又は３のいずれかによる方法。
５．項目１から４までのいずれかに従って得られた又は得ることができるヒト細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含む細胞組成物。
６．項目１から５までのいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともにその増殖を誘導する方法であって、該方法が、
ａ．項目２から４までのいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を含む細胞組成物を、適切な培養培地中、可溶性又は固定化されたものであることが好ましいγδＴＣＲアゴニストの存在下、好ましくは上記アゴニストを一定間隔ごとに添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、かつ、少なくとも１種のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１βからなる群から選択されるサイトカインの存在下で生育することと、
ｂ．上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを、細胞の少なくとも４０％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、より好ましくは細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、添加することと、
を含む、方法。
７．項目６に従って得られた又は得ることができるヒト細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含む細胞組成物。
８．８０％超が機能的な天然細胞傷害性受容体を発現する機能的Ｖδ１＋γδ細胞で構成される細胞集団を含み、機能的な天然細胞傷害性受容体を発現するＶδ１＋γδ細胞を１億個よりも多く含むことが好ましい、項目７の組成物。
９．薬学的に許容可能な作用物質又は担体、より好ましくは安定化剤、具体的にはヒト血清アルブミンも含む医薬組成物である、項目７又は８のいずれかの組成物。
１０．同種養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目７から９までのいずれかの組成物。
１１．自己養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目７から９までのいずれかの組成物。
１２．ＣＡＲ Ｔ細胞の製造のための、項目７又は８のいずれかの組成物の使用。
１３．項目１２に従って得られた又は得ることができるヒト細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含むＣＡＲ Ｔ細胞組成物。
１４．薬学的に許容可能な作用物質又は担体、より好ましくは安定化剤、具体的にはヒト血清アルブミンも含む医薬組成物である、項目１３の組成物。
１５．同種養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目１３又は１４のいずれかの組成物。
１６．自己養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目１３又は１４のいずれかの組成物。
１．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から、ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくは同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞を生成するための、Ｎｏｔｃｈリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用であって、Ｎｏｔｃｈリガンドが、Ｊａｇ２（Ｊａｇｇｅｄ２）である、使用。
２．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、ｄｅ ｎｏｖｏのＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞、好ましくは同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したＶδ１＋γδＴ細胞を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法が、
ａ．ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む細胞集団を、基材又は細胞株上に固定化されていることが好ましいＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈ受容体アゴニストを含む適切な培養培地中で生育することと、
ｂ．細胞を培養物中、Ｖδ１＋γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって維持することと、
なお、持続時間が、約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、上記Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含む、方法。
３．ヒトＨＰＣが、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ、ＣＤ３４＋骨髄ＨＰＣ、ＣＤ３４＋末梢血ＨＰＣに由来するものである、又はｉＰＳＣ等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞に由来するものである、項目１又は２のいずれかによる方法。
４．ヒト造血前駆細胞が、ヒトＣＤ３４＋ＥＴＰである、項目１又は３のいずれかによる方法。
５．項目１から４までのいずれかに従って得られた又は得ることができるヒト細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含む細胞組成物。
６．項目１から５までのいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともにその増殖を誘導する方法であって、該方法が、
ａ．項目２から４までのいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を含む細胞組成物を、適切な培養培地中、可溶性又は固定化されたものであることが好ましいγδＴＣＲアゴニストの存在下、好ましくは上記アゴニストを一定間隔ごとに添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、かつ、少なくとも１種のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１βからなる群から選択されるサイトカインの存在下で生育することと、
ｂ．上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを、細胞の少なくとも４０％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、より好ましくは細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、添加することと、
を含む、方法。
７．項目６に従って得られた又は得ることができるヒト細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含む細胞組成物。
８．８０％超が機能的な天然細胞傷害性受容体を発現する機能的Ｖδ１＋γδ細胞で構成される細胞集団を含み、機能的な天然細胞傷害性受容体を発現するＶδ１＋γδ細胞を１億個よりも多く含むことが好ましい、項目７の組成物。
９．薬学的に許容可能な作用物質又は担体、より好ましくは安定化剤、具体的にはヒト血清アルブミンも含む医薬組成物である、項目７又は８のいずれかの組成物。
１０．同種養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目７から９までのいずれかの組成物。
１１．自己養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目７から９までのいずれかの組成物。
１２．ＣＡＲ Ｔ細胞の製造のための、項目７又は８のいずれかの組成物の使用。
１３．項目１２に従って得られた又は得ることができるヒト細胞傷害性Ｖδ１＋γδ細胞を含むＣＡＲ Ｔ細胞組成物。
１４．薬学的に許容可能な作用物質又は担体、より好ましくは安定化剤、具体的にはヒト血清アルブミンも含む医薬組成物である、項目１３の組成物。
１５．同種養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目１３又は１４のいずれかの組成物。
１６．自己養子細胞療法、腫瘍若しくは癌治療、腫瘍若しくは癌免疫療法、及び／又は白血病治療における使用のためのもの、又は急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、若しくは皮膚黒色腫の治療のためのものである、項目１３又は１４のいずれかの組成物。
【0128】
本発明は、以下の項目を更に含む：
１．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生成するための、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用であって、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドが、間質細胞株の表面上に発現され、上記間質細胞株が、参照間質細胞と比較して、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドの発現の統計的に有意な増大を示し、上記参照間質細胞が、基礎レベルの上記リガンドを発現する間質細胞である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
２．間質細胞株が、ＯＰ９細胞株である、項目１による使用。
３．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、γδＴ細胞、好ましくは同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したγδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法が、
ａ．ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む細胞集団を、間質細胞株の細胞集団を含む適切な培養培地中で生育することと、
なお、上記間質細胞株が、参照間質細胞と比較して、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドの発現の統計的に有意な増大を示し、上記参照間質細胞が、基礎レベルの上記リガンドを発現する間質細胞である；
ｂ．細胞を、γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって培養物中で維持することと、
なお、持続時間が、約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、上記Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含む、方法。
４．ヒトＨＰＣが、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ、ＣＤ３４＋骨髄ＨＰＣ、ＣＤ３４＋末梢血ＨＰＣに由来するものである、又はｉＰＳＣ等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞に由来するものである、項目３による方法。
５．ヒト造血前駆細胞が、ヒトＣＤ３４＋ＥＴＰである、項目３又は４のいずれかによる方法。
６．γδＴ細胞の少なくとも３０％がＶδ１＋γδＴ細胞である、項目３から５までのいずれかによる方法。
７．項目３から６のいずれかに従って得られた又は得ることができる、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物。
８．γδＴ細胞の少なくとも３０％がＶδ１＋γδＴ細胞であることを特徴とする、項目７による細胞組成物。
９．Ｖδ１＋γδＴの集団がここでは、
ａ．未成熟細胞表面マーカーであるＣＤ１ａ（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）を発現することを特徴とする第１の細胞集団と、
ｂ．未成熟細胞表面マーカーであるＣＤ１ａ（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）を発現しないことを特徴とする第２の細胞集団と、
を含むことを特徴とする、項目８による細胞組成物。
１０．第１の細胞集団が、細胞が細胞表面マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄを発現しないことを特徴とする、項目８による細胞組成物。
１１．第２の細胞集団が、細胞表面マーカーであるＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを特徴とする、項目９又は１０による細胞組成物。
１２．第１の細胞集団が、細胞組成物に含まれる総Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも９０％に相当する、項目７から１１のいずれかによる細胞組成物。
１３．項目３から６のいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともにその増殖を誘導する方法であって、該方法が、
ａ．項目３から６のいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を含む細胞組成物を、適切な培養培地中、可溶性又は固定化されたものであることが好ましいγδＴＣＲアゴニストの存在下、好ましくは上記アゴニストを一定間隔ごとに添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、かつ、少なくとも１種のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１βからなる群から選択されるサイトカインの存在下で生育することと、
ｂ．上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを、細胞の少なくとも４０％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、より好ましくは細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、添加することと、
を含む、方法。
１．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はＣＤ３４＋ＥＴＰを含む細胞集団から、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生成するための、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用であって、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドが、間質細胞株の表面上に発現され、上記間質細胞株が、参照間質細胞と比較して、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドの発現の統計的に有意な増大を示し、上記参照間質細胞が、基礎レベルの上記リガンドを発現する間質細胞である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
２．間質細胞株が、ＯＰ９細胞株である、項目１による使用。
３．ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ等のヒトＨＰＣ及び／又はヒトＥＴＰを含む細胞集団から、γδＴ細胞、好ましくは同種のＮｏｔｃｈにより誘導され分化したγδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法が、
ａ．ＨＰＣ及び／又はＥＴＰを含む細胞集団を、間質細胞株の細胞集団を含む適切な培養培地中で生育することと、
なお、上記間質細胞株が、参照間質細胞と比較して、Ｊａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドの発現の統計的に有意な増大を示し、上記参照間質細胞が、基礎レベルの上記リガンドを発現する間質細胞である；
ｂ．細胞を、γδＴ細胞が生じるのに十分な持続時間にわたって培養物中で維持することと、
なお、持続時間が、約２週間から約１５週間の間であることが好ましく、上記Ｎｏｔｃｈリガンド又はアゴニストが、培養時に、かつ培養期間全体を通して、上記細胞培養物中に十分な量で存在する又は添加されるべきである；
を含む、方法。
４．ヒトＨＰＣが、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＰＣ、ＣＤ３４＋骨髄ＨＰＣ、ＣＤ３４＋末梢血ＨＰＣに由来するものである、又はｉＰＳＣ等の多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞に由来するものである、項目３による方法。
５．ヒト造血前駆細胞が、ヒトＣＤ３４＋ＥＴＰである、項目３又は４のいずれかによる方法。
６．γδＴ細胞の少なくとも３０％がＶδ１＋γδＴ細胞である、項目３から５までのいずれかによる方法。
７．項目３から６のいずれかに従って得られた又は得ることができる、γδＴ細胞をαβＴ細胞よりも多量に含む細胞組成物。
８．γδＴ細胞の少なくとも３０％がＶδ１＋γδＴ細胞であることを特徴とする、項目７による細胞組成物。
９．Ｖδ１＋γδＴの集団がここでは、
ａ．未成熟細胞表面マーカーであるＣＤ１ａ（ＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞）を発現することを特徴とする第１の細胞集団と、
ｂ．未成熟細胞表面マーカーであるＣＤ１ａ（ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞）を発現しないことを特徴とする第２の細胞集団と、
を含むことを特徴とする、項目８による細胞組成物。
１０．第１の細胞集団が、細胞が細胞表面マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ２７、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄを発現しないことを特徴とする、項目８による細胞組成物。
１１．第２の細胞集団が、細胞表面マーカーであるＣＤ２７、ＣＤ７３、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄのうちの少なくとも１つ、又は少なくとも、２つ以上の組合せ、好ましくは全てを発現することを特徴とする、項目９又は１０による細胞組成物。
１２．第１の細胞集団が、細胞組成物に含まれる総Ｖδ１＋γδＴ細胞の少なくとも９０％に相当する、項目７から１１のいずれかによる細胞組成物。
１３．項目３から６のいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を活性化するとともにその増殖を誘導する方法であって、該方法が、
ａ．項目３から６のいずれかの方法によって得られたＶδ１＋γδＴ細胞を含む細胞組成物を、適切な培養培地中、可溶性又は固定化されたものであることが好ましいγδＴＣＲアゴニストの存在下、好ましくは上記アゴニストを一定間隔ごとに添加する（より好ましくは連続的に添加する）ことにより、かつ、少なくとも１種のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１βからなる群から選択されるサイトカインの存在下で生育することと、
ｂ．上記γδＴＣＲアゴニスト及びサイトカインを、細胞の少なくとも４０％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、より好ましくは細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％が天然細胞傷害性受容体を発現するようになるまで、添加することと、
を含む、方法。
【0129】
以下の実施例は、ただ単に本発明を例示する役割を果たすものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【0130】
実施例１．ヒトＣＤ３４＋初期胸腺前駆細胞（ＥＴＰ）からのＶδ１＋ヒトＴ細胞の生成
Ｊａｇ２を用いて活性化したヒトＣＤ３４＋ＥＴＰからのＶδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件（ＳＴＥＰ１）
３日齢～４歳の患者から、ヘルシンキ宣言に従い、同意を得た後、矯正心臓手術中に取り出した胸腺組織を、機械的に破壊し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）；ATOM）遠心分離を行うことにより、ヒト出生後胸腺細胞を単離した。Spanish Research Council（CSIC）の研究倫理委員会（Research Ethics Board）によって確立された、承認されたガイドラインに従って実験を実施した。ＣＤ３４＋ＥＴＰを、胸腺細胞の細胞浮遊液からＣＤ３４－磁気細胞選別（Ｄｙｎａｌ、ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Invitrogen）、並びに、さらに抗ＣＤ１ａ及び抗ＣＤ１２３マイクロビーズ（ＡｕｔｏＭＡＣＳ、Miltenyi Biotec）を使用したＣＤ３４＋ＣＤ１ａ＋前駆細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ１２３＋前駆細胞の枯渇によって単離した。単離されたＣＤ３４＋ＥＴＰ（９６％超のＣＤ３４＋ＣＤ１ａ－ＣＤ１２３－）を、同様の表面レベルで発現することが示された、細胞トレーサーとしてのＧＦＰ及びＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１若しくはＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドのいずれかを形質導入したか、又は対照としてＧＦＰを単独で形質導入したＯＰ９間質細胞を播種したｐ２４ウェルプレートで培養した（細胞１０５個／ウェル）。ＧＦＰ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１又はＪａｇ２をコードするプラスミドを用いたＯＰ９細胞への形質導入により、上記タンパク質の細胞における高発現、特に、Ｎｏｔｃｈリガンドの場合では細胞表面上での高発現がもたらされる。特に、形質導入されたＯＰ９細胞におけるＪａｇ２の発現の増大は、フローサイトメトリーによって測定して約５００倍の発現の増大であった（図１０）。培養を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミン、２００ＩＵ／ｍｌの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－７（NIBSC）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＦｌｔ３Ｌ（PeproTech）を補充したα－ＭＥＭ培地（Gibco）で行った。最長３０日間にわたり、３日～４日ごとに、培養物を再播種し、γδＴ細胞の生成についてフローサイトメトリーによって分析した。これらの分析から、Ｊａｇ２が、γδＴ細胞の分化を促進する最も効率的なＮｏｔｃｈリガンドであることが示され（図１）、一方、ＯＰ９細胞にＧＦＰのみを発現させた場合には細胞分化は誘導されなかった（図７）。実際、Ｊａｇ２媒介性シグナル伝達により、αβＴ細胞が生じるよりも優先的にγδＴ細胞が生じ、３０日間での収率はそれぞれ２０倍に対して３００倍であった。驚くべきことに、抗Ｖδ１ ｍＡｂ及び抗Ｖδ２ ｍＡｂを用いて実施したフローサイトメトリー分析では、ＥＴＰからヒトＪａｇ２シグナル伝達に応答して分化したγδＴ細胞は優先的にＶδ１＋細胞であり、ＩＦＮγを産生するが、ＩＬ－１７は産生しないことが明らかになった（図２）。したがって、Ｊａｇ２を用いて活性化した単一のヒトＥＴＰから、１００個に至るまでの、抗腫瘍末梢γδＴ細胞の特色を示すＶδ１＋γδＴ細胞を生成することができる（図３）。
Ｊａｇ２を用いて活性化したヒトＣＤ３４＋ＥＴＰからのＶδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件（ＳＴＥＰ１）
３日齢～４歳の患者から、ヘルシンキ宣言に従い、同意を得た後、矯正心臓手術中に取り出した胸腺組織を、機械的に破壊し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）；ATOM）遠心分離を行うことにより、ヒト出生後胸腺細胞を単離した。Spanish Research Council（CSIC）の研究倫理委員会（Research Ethics Board）によって確立された、承認されたガイドラインに従って実験を実施した。ＣＤ３４＋ＥＴＰを、胸腺細胞の細胞浮遊液からＣＤ３４－磁気細胞選別（Ｄｙｎａｌ、ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Invitrogen）、並びに、さらに抗ＣＤ１ａ及び抗ＣＤ１２３マイクロビーズ（ＡｕｔｏＭＡＣＳ、Miltenyi Biotec）を使用したＣＤ３４＋ＣＤ１ａ＋前駆細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ１２３＋前駆細胞の枯渇によって単離した。単離されたＣＤ３４＋ＥＴＰ（９６％超のＣＤ３４＋ＣＤ１ａ－ＣＤ１２３－）を、同様の表面レベルで発現することが示された、細胞トレーサーとしてのＧＦＰ及びＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１若しくはＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドのいずれかを形質導入したか、又は対照としてＧＦＰを単独で形質導入したＯＰ９間質細胞を播種したｐ２４ウェルプレートで培養した（細胞１０５個／ウェル）。ＧＦＰ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇ１又はＪａｇ２をコードするプラスミドを用いたＯＰ９細胞への形質導入により、上記タンパク質の細胞における高発現、特に、Ｎｏｔｃｈリガンドの場合では細胞表面上での高発現がもたらされる。特に、形質導入されたＯＰ９細胞におけるＪａｇ２の発現の増大は、フローサイトメトリーによって測定して約５００倍の発現の増大であった（図１０）。培養を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミン、２００ＩＵ／ｍｌの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－７（NIBSC）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＦｌｔ３Ｌ（PeproTech）を補充したα－ＭＥＭ培地（Gibco）で行った。最長３０日間にわたり、３日～４日ごとに、培養物を再播種し、γδＴ細胞の生成についてフローサイトメトリーによって分析した。これらの分析から、Ｊａｇ２が、γδＴ細胞の分化を促進する最も効率的なＮｏｔｃｈリガンドであることが示され（図１）、一方、ＯＰ９細胞にＧＦＰのみを発現させた場合には細胞分化は誘導されなかった（図７）。実際、Ｊａｇ２媒介性シグナル伝達により、αβＴ細胞が生じるよりも優先的にγδＴ細胞が生じ、３０日間での収率はそれぞれ２０倍に対して３００倍であった。驚くべきことに、抗Ｖδ１ ｍＡｂ及び抗Ｖδ２ ｍＡｂを用いて実施したフローサイトメトリー分析では、ＥＴＰからヒトＪａｇ２シグナル伝達に応答して分化したγδＴ細胞は優先的にＶδ１＋細胞であり、ＩＦＮγを産生するが、ＩＬ－１７は産生しないことが明らかになった（図２）。したがって、Ｊａｇ２を用いて活性化した単一のヒトＥＴＰから、１００個に至るまでの、抗腫瘍末梢γδＴ細胞の特色を示すＶδ１＋γδＴ細胞を生成することができる（図３）。
【0131】
実施例２．臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）からのＶδ１＋ヒトＴ細胞の生成
Ｊａｇ２を用いて活性化したヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣからのＶδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件（ＳＴＥＰ１）
臍帯血試料を、CSICの研究倫理委員会によって確立された承認されたガイドラインに従い、Centro de Transfusion de la Comunidad de Madridから入手した。ＨＰＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅにより単離された細胞試料から、ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Miltenyi Biotec）を使用して免疫磁気選別によって得た。選別された集団は９８％超がＣＤ３４＋であり、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、及びＣＤ５６系列マーカーについては陰性である（Ｌｉｎ－）ことが再分析により証明された。単離された臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣを、ヒトＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９間質細胞を播種したｐ２４ウェルプレートにおいて、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミン、及び２００ＩＵ／ｍｌの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－７（NIBSC）、１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＦｌｔ３Ｌ（PeproTech）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（PeproTech）を補充したα－ＭＥＭ培地（Gibco）で培養した（細胞１０５個／ウェル）。分化したγδナイーブＴ細胞の生成を最長９週間にわたって３日～４日ごとに分析し、それにより、４０００倍の総細胞拡大及び２１０倍～２５０倍のγδＴ細胞収率が明らかになった（図４）。これらのＪａｇ２により分化したγδナイーブＴ細胞の４０％に至るまでがＶδ１＋であった（図４）。したがって、Ｊａｇ２を用いて活性化したヒト臍帯血ＨＰＣ １００万個から、１億個に至るまでのＶδ１＋γδＴ細胞を生成することができる（図５）。
Ｊａｇ２を用いて活性化したヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣからのＶδ１＋γδＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件（ＳＴＥＰ１）
臍帯血試料を、CSICの研究倫理委員会によって確立された承認されたガイドラインに従い、Centro de Transfusion de la Comunidad de Madridから入手した。ＨＰＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅにより単離された細胞試料から、ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Miltenyi Biotec）を使用して免疫磁気選別によって得た。選別された集団は９８％超がＣＤ３４＋であり、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、及びＣＤ５６系列マーカーについては陰性である（Ｌｉｎ－）ことが再分析により証明された。単離された臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣを、ヒトＪａｇ２ Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９間質細胞を播種したｐ２４ウェルプレートにおいて、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミン、及び２００ＩＵ／ｍｌの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－７（NIBSC）、１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＦｌｔ３Ｌ（PeproTech）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（PeproTech）を補充したα－ＭＥＭ培地（Gibco）で培養した（細胞１０５個／ウェル）。分化したγδナイーブＴ細胞の生成を最長９週間にわたって３日～４日ごとに分析し、それにより、４０００倍の総細胞拡大及び２１０倍～２５０倍のγδＴ細胞収率が明らかになった（図４）。これらのＪａｇ２により分化したγδナイーブＴ細胞の４０％に至るまでがＶδ１＋であった（図４）。したがって、Ｊａｇ２を用いて活性化したヒト臍帯血ＨＰＣ １００万個から、１億個に至るまでのＶδ１＋γδＴ細胞を生成することができる（図５）。
【0132】
実施例３．成体末梢血中に存在するＶδ１＋γδＴ細胞とは別個の、臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）からの活性化されていないナイーブＶδ１＋ヒトＴ細胞の生成
臍帯血から単離し、Ｊａｇ２を高発現するＯＰ９細胞とともに培養したＣＤ３４＋ＨＰＣから生成されたＶδ１＋γδＴ細胞は、表現型的に未成熟であるＣＤ１ａ＋と成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋細胞とを含む不均一な細胞集団に相当する。成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞サブセットは、活性化されていないナイーブＣＤ２５－ＣＤ２７＋細胞で大部分が構成され（図８）、対照的に、成体末梢血から単離されたＶδ１＋γδＴ細胞は、細胞傷害性ＮＫ受容体であるＮＫｐ３０及びＮＫＧ２Ｄを発現する（図９）。
臍帯血から単離し、Ｊａｇ２を高発現するＯＰ９細胞とともに培養したＣＤ３４＋ＨＰＣから生成されたＶδ１＋γδＴ細胞は、表現型的に未成熟であるＣＤ１ａ＋と成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋細胞とを含む不均一な細胞集団に相当する。成熟ＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞サブセットは、活性化されていないナイーブＣＤ２５－ＣＤ２７＋細胞で大部分が構成され（図８）、対照的に、成体末梢血から単離されたＶδ１＋γδＴ細胞は、細胞傷害性ＮＫ受容体であるＮＫｐ３０及びＮＫＧ２Ｄを発現する（図９）。
【0133】
以下の表１及び図６に、ヒトＪａｇ２シグナル伝達を受けたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣから生成されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＣＢ－Ｊａｇ２）、又はＣＢからｅｘ ｖｉｖｏで単離されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＣＢ ｅｘ ｖｉｖｏ）若しくは末梢血からｅｘ ｖｉｖｏで単離されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏ）の比較的な細胞収率及び表現型を示す。単一ＣＢ単位由来のＣＢ－Ｊａｇ２細胞（ｎ＝４）から、又はそれぞれ単一ＣＢ若しくはＰＢ単位から単離されたＣＢ ｅｘ ｖｉｖｏ細胞（ｎ＝４）、若しくはＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏ細胞（ｎ＝３）から回収されたＴ細胞内のＴＣＲγδ＋細胞及びＶδ１＋細胞の平均±ＳＤパーセンテージ。
【0134】
【表1】
【0135】
さらに、以下の表２に、ヒトＪａｇ２シグナル伝達を受けたヒトＣＤ３４＋ＣＢ ＨＰＣから生成されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＣＢ－Ｊａｇ２）、又は、血液１バッグ（単位）当たりのＣＢからｅｘ ｖｉｖｏで単離されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＣＢ ｅｘ ｖｉｖｏ）若しくは末梢血からｅｘ ｖｉｖｏで単離されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏ）の比較的な、絶対数での細胞収率を示す。
【0136】
ＣＤ３４＋前駆細胞から生成したことに起因して、本発明の方法のＳＴＥＰ１後にｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＶδ１＋γδＴ細胞（ＣＢ－Ｊａｇ２）の収率が、ＣＢ又はＰＢのいずれかからの同じ数の総出発細胞に対して、ＰＢからｅｘ ｖｉｖｏで得られたＶδ１＋γδＴ細胞の収率よりも高いことを認めることができる（表２）。
【0137】
【表2】
【0138】
ＣＢの１バッグ又は単位ごとに、およそ１００万個のＣＤ３４＋前駆細胞が含まれ、そこから平均で７１７５万個のＶδ１＋γδＴ細胞が生じる。他方では、ＰＢの１バッグ又は単位ごとに、平均で３憶個の総細胞が含まれ、そこから、平均で０．５１％がＶδ１＋γδＴ細胞になり、これは、１５３万個のＶδ１＋γδＴ細胞に相当する。したがって、臍帯血（ＣＢ）、及びＪａｇ２を高発現するＯＰ９からＶδ１＋γδＴ細胞を産生する方法は高度に効率的であり、臍帯血前駆細胞（precursors）から、末梢血（ＰＢ）細胞からよりも、平均４６倍多くのＶδ１＋γδＴ細胞が生じる。
【0139】
重要なことに、ＰＢから単離されたＶδ１＋γδＴ細胞は主にＣＤ１ａ－であるが（表１及び図６参照）、一方、ＰＢ ｅｘ ｖｉｖｏからＣＤ１ａ＋であると見いだされたのは細胞の０．４％のみであった。しかし、表１及び図６に示されている通り、ＯＰ９－Ｊａｇ２細胞と共培養したＣＢから生じた細胞の約９％～１０％がＣＤ１ａ－である。これは、１単位のＣＢから得られたＶδ１＋γδＴ細胞からのＣＤ１ａ＋及びＣＤ１ａ－のパーセンテージを測定した以下の代表的な実験（合計で４回の実験から）でも認められた：
【0140】
上記を考慮して、１バッグのＰＢからは約１５３万個のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞が得られるが、一方、１バッグのＣＢから本明細書で特許請求された方法に従うと、平均で７００万個のＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞及び６３００万個のＣＤ１ａ＋Ｖδ１＋γδＴ細胞が得られると結論付けることができる。
【0141】
ＤＯＴについて報告された生成されたＶδ１＋γδナイーブＴ細胞のＴＣＲ依存性活性化及び拡大（ＳＴＥＰ２）
上記の通り臍帯血ＨＳＣからＴＣＲ非依存性Ｊａｇ２－Ｎｏｔｃｈ依存性様式（ＳＴＥＰ１）でｄｅ ｎｏｖｏで生成されたＶδ１＋ナイーブγδＴ細胞を、末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞について示されている通り、本明細書でＳＴＥＰ２と称されるプロトコルに従い、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及びサイトカインを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化及び拡大させる（非特許文献６）。この目的のために、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化させた細胞（ＳＴＥＰ１）を、抗ＴＣＲαβ ｍＡｂ及び磁性ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用した磁気細胞選別によってαβＴ細胞を枯渇させる。ＴＣＲαβを枯渇させた細胞浮遊液を、自己血漿（すなわち、５％自己血漿）又はヒトＡＢ血清及び２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミンを補充した無血清培養培地（ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ－ＣＴＳ）中、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３＋１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－４、７０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γ、７ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１、及び１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β（Peprotech）の存在下で７日間培養する（細胞２．５×１０５個／ｍｌ）。７日目に、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１及び７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有する培地を添加し、細胞を、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１及び７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５とともに更に４日間培養する。１１日目までに、細胞を１／６希釈し、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５の存在下で更に４日間～５日間培養する。培養を１５日目～１６日目までに停止させるか、又は細胞を１／３希釈し、１８日目～２１日目まで、１μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γの存在下で拡大の第２ラウンドに供する。上記のＳＴＥＰ２の拡大及び活性化プロトコルを本明細書ではＤＯＴプロトコルと称する。
上記の通り臍帯血ＨＳＣからＴＣＲ非依存性Ｊａｇ２－Ｎｏｔｃｈ依存性様式（ＳＴＥＰ１）でｄｅ ｎｏｖｏで生成されたＶδ１＋ナイーブγδＴ細胞を、末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞について示されている通り、本明細書でＳＴＥＰ２と称されるプロトコルに従い、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及びサイトカインを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化及び拡大させる（非特許文献６）。この目的のために、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化させた細胞（ＳＴＥＰ１）を、抗ＴＣＲαβ ｍＡｂ及び磁性ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用した磁気細胞選別によってαβＴ細胞を枯渇させる。ＴＣＲαβを枯渇させた細胞浮遊液を、自己血漿（すなわち、５％自己血漿）又はヒトＡＢ血清及び２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミンを補充した無血清培養培地（ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ－ＣＴＳ）中、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３＋１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－４、７０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γ、７ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１、及び１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β（Peprotech）の存在下で７日間培養する（細胞２．５×１０５個／ｍｌ）。７日目に、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１及び７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有する培地を添加し、細胞を、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１及び７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５とともに更に４日間培養する。１１日目までに、細胞を１／６希釈し、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５の存在下で更に４日間～５日間培養する。培養を１５日目～１６日目までに停止させるか、又は細胞を１／３希釈し、１８日目～２１日目まで、１μｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γの存在下で拡大の第２ラウンドに供する。上記のＳＴＥＰ２の拡大及び活性化プロトコルを本明細書ではＤＯＴプロトコルと称する。
【0142】
さらに、本明細書ではＣＳＩＣプロトコルと称される追加的な拡大及び活性化プロトコルを試験した。このプロトコルでは、上記の通り臍帯血ＨＳＣからＴＣＲ非依存性Ｊａｇ２－Ｎｏｔｃｈ依存性様式（ＳＴＥＰ１）でｄｅ ｎｏｖｏで生成されたＶδ１＋ナイーブγδＴ細胞を、図１８に示されている通り、抗ＴＣＲγδｍＡｂ及びサイトカインを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化及び拡大する（ＳＴＥＰ２）。この目的のために、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化させた細胞（ＳＴＥＰ１）を、抗ＴＣＲαβ ｍＡｂ及び磁性ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用した磁気細胞選別によってαβＴ細胞を枯渇させる。ＴＣＲαβを枯渇させた細胞浮遊液を、自己血漿（すなわち、５％自己血漿）又はヒトＡＢ血清及び２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミンを補充した無血清培養培地（ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ－ＣＴＳ）中、２μｇ／ｍｌの抗ＴＣＲγδｍＡｂ＋７ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１（PeproTech）の存在下で７日間培養する（細胞２．５×１０５個／ｍｌ）。７日目に、２μｇ／ｍｌの抗ＴＣＲγδｍＡｂ＋１３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１及び７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有する培地を添加し、細胞を更に７日間培養する。培養を１５日目～１６日目までに停止させるか、又は細胞を１／３希釈し、１８日目～２１日目まで、２μｇ／ｍｌの抗ＴＣＲγδｍＡｂ＋７０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γの存在下で拡大の第２ラウンドに供する。
【0143】
ＣＳＩＣ及びＤＯＴ拡大及び活性化プロトコルの両方が図１８に示されている。
【0144】
したがって、ＳＴＥＰ１後に得られたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ＳＴＥＰ２に従って、特に、本明細書ではＤＯＴ及びＣＳＩＣと称される活性化／拡大プロトコルに従って活性化及び拡大した。その結果得られた活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ＣＤ３４＋前駆細胞とＳＴＥＰ１及びＳＴＥＰ２法の組合せにより、改善されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団がもたらされるかどうかを解明するために、ＳＴＥＰ２で拡大させたｅｘ ｖｉｖｏで単離されたＰＢ及びＣＢ細胞に由来するものと比較した。結果が図１３～図１５に示されており、本発明の方法後に得られたｄｅ ｎｏｖｏ活性化及び拡大されたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞が以下を示すことを認めることができる：
ＣＢ／ＰＢ－ＳＴＥＰ２の細胞よりもＴ細胞エフェクター表現型が多く、また多くのＣＤ８を発現する。図１３参照。
ＣＢ／ＰＢ－ＳＴＥＰ２の細胞よりも活性化された表現型が多く、また、低疲弊プロファイルである。図１４参照。
ＣＢ／ＰＢ－ＳＴＥＰ２の細胞よりも細胞傷害性関連活性化受容体のレベルが高い。図１５参照。
ＣＢ／ＰＢ－ＳＴＥＰ２の細胞よりもＴ細胞エフェクター表現型が多く、また多くのＣＤ８を発現する。図１３参照。
ＣＢ／ＰＢ－ＳＴＥＰ２の細胞よりも活性化された表現型が多く、また、低疲弊プロファイルである。図１４参照。
ＣＢ／ＰＢ－ＳＴＥＰ２の細胞よりも細胞傷害性関連活性化受容体のレベルが高い。図１５参照。
【0145】
上記の結果から、本明細書に記載の方法が、ｅｘ ｖｉｖｏ試料から得られるものよりも優れたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団をもたらすものであることが実証される。上記の結果から、ＳＴＥＰ２のどちらもプロトコルも、すなわち、ＣＳＩＣプロトコルとＤＯＴプロトコルのどちらも、優れたＣＤ１ａ－Ｖδ１＋γδＴ細胞の集団に達するために好適であることも実証される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】