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特表2025-502171セリン／スレオニンライゲーションによる強力で安定なポリペプチド類似体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】セリン／スレオニンライゲーションによる強力で安定なポリペプチド類似体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/605 20060101AFI20250117BHJP
C07K 14/635 20060101ALI20250117BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20250117BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20250117BHJP
A61K 38/29 20060101ALI20250117BHJP
A61K 38/26 20060101ALI20250117BHJP
A61K 47/50 20170101ALI20250117BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20250117BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250117BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20250117BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C07K14/605 ZNA
C07K14/635
A61K38/02
A61K38/16
A61K38/29
A61K38/26
A61K47/50
A61K47/60
A61K47/68
A61K47/64
A61K47/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024541675
(86)(22)【出願日】2023-01-12
(85)【翻訳文提出日】2024-08-20
(86)【国際出願番号】 US2023060522
(87)【国際公開番号】W WO2023137355
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】63/299,884
(32)【優先日】2022-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514104933
【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(72)【発明者】
【氏名】ベイカー，デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】クラヴェン，ティモシー
(72)【発明者】
【氏名】リヴィン，ポール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF63
4C076FF65
4C084BA02
4C084BA03
4C084BA19
4C084CA59
4C084DB32
4C084DB35
4C084NA03
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA18
4H045BA55
4H045BA57
4H045DA30
4H045EA28
4H045FA50
(57)【要約】
Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチド、修飾ポリペプチドを含むバイオコンジュゲート、およびバイオコンジュゲートを製造するための方法が開示される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチド。
【請求項2】
前記Ｎ６－Ｌ－セリル－官能化リジン（例えば、【化1】
【化2】
【請求項3】
前記Ｎ６－Ｌ－スレオニル－官能化リジン（例えば、【化3】
【化4】
【請求項4】
前記ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１フラグメント７－３７（ＧＬＰ－１（７－３７））と少なくとも９０％、または９２％、または９４％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項5】
前記ポリペプチドは、副甲状腺ホルモンフラグメント１－３４（ＰＴＨ（１－３４））と少なくとも９０％、または９２％、または９４％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む、または、前記ポリペプチドは、ペプチドＹＹ３－３６（ＰＹＹ（３－３６））と少なくとも８５％、または９０％、または９２％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項6】
前記ポリペプチドはＮ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を含むように修飾された、表１に列挙される治療ペプチドからなる群より選択されるペプチド治療薬を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項7】
前記Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は、天然リジンの代わりに前記アミノ酸配列に組み込まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項8】
前記Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は、リジン以外の天然アミノ酸の代わりに前記アミノ酸配列に組み込まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項9】
前記天然アミノ酸はセリンである、請求項８に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチドおよび官能性部分を含むバイオコンジュゲートであって、前記官能性部分は前記修飾ポリペプチドに、前記Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体上のセリルまたはスレオニル基でコンジュゲートされる、バイオコンジュゲート。
【請求項11】
前記官能性部分は、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、蛍光分子、化学発光分子、リン光分子、放射性同位体、酵素、酵素基質、親和性分子、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、発色性基質、造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴ標識、リン光標識、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項12】
前記官能性部分は蛍光分子、ビオチン、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項13】
前記官能性部分は下記を含む、請求項１０に記載のバイオコンジュゲート：【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【請求項14】
前記官能性部分は、前記バイオコンジュゲートの生体内安定性を、前記天然ポリペプチドの生体内安定性と比べて増加させる、請求項１０－１３のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の１つ以上のポリペプチドおよび／またはバイオコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される担体、溶媒、アジュバント、および／または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項16】
バイオコンジュゲートを調製する方法であって、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチドを官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させること
を含み、
前記サリチルアルデヒドエステルは、前記Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体上の前記セリルまたはスレオニル基と反応し、前記バイオコンジュゲートが得られる、方法。
【請求項17】
前記官能化サリチルアルデヒドエステルは下記式を有し：【化9】
【請求項18】
前記官能化サリチルアルデヒドエステルは下記式を有する、請求項１６に記載の方法：【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【請求項19】
Ｒ部分は、前記バイオコンジュゲートの生体内安定性を、前記修飾ポリペプチドの生体内安定性と比べて増加させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記修飾ポリペプチドは請求項２～９のいずれかに記載される通りである、請求項１６～１９のいずれかに記載の方法。
【請求項21】
前記修飾ポリペプチドは、前記官能化サリチルアルデヒドエステルとピリジン／酢酸溶液中で接触させられる；または、前記修飾ポリペプチドは前記官能化サリチルアルデヒドエステルと１：１ｖ／ｖ比のピリジン／酢酸溶液中で接触させられる、請求項１６～２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記修飾ポリペプチドは、前記官能化サリチルアルデヒドエステルと、約１８℃～２７℃の範囲の温度で、Ｎ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体を形成するのに十分な期間の間、接触させられる、請求項１６～２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
前記Ｎ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体は、酸性条件下で、前記バイオコンジュゲートが形成させるのに十分な期間の間、反応させられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
トリフルオロ酢酸が使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
Ｎ６－セリル－リジンまたはその誘導体あるいはＮ６－スレオニル－リジンまたはその誘導体を、前記修飾ポリペプチド合成中に導入することをさらに含む、請求項１６～２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
前記修飾ポリペプチドは、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを含み、前記方法は、前記Ｎ末端セリンまたはスレオニンを保護基で、前記官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させる前に保護することをさらに含む、請求項１６～２４のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
前記保護基は、アリルセリンおよびＮ末端アセチル化から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２２年１月１４日に出願された米国仮特許出願番号第６３／２９９，８８４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
本出願は、２０２２年１月１４日に出願された米国仮特許出願番号第６３／２９９，８８４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【0002】
配列表ステートメント
配列表のコンピュータ可読形態が本出願と共に、電子申請により出願され、参照により全体として本出願に組み込まれる。配列表は、ファイル名「２１－１６２４－ＷＯ．ｘｍｌ」を有する、２０２２年１２月２３日に作成されたファイルに含まれ、サイズが７ｋｂである。
配列表のコンピュータ可読形態が本出願と共に、電子申請により出願され、参照により全体として本出願に組み込まれる。配列表は、ファイル名「２１－１６２４－ＷＯ．ｘｍｌ」を有する、２０２２年１２月２３日に作成されたファイルに含まれ、サイズが７ｋｂである。
【背景技術】
【0003】
ペプチド治療薬は、高い親和性および特異性でそれらの標的に結合するそれらの能力のために、臨床使用が急速に認可されつつある。多くのペプチド薬物、例えば、テリパラチドおよびアンジオテンシンＩＩが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されているが、それらはしばしば、内在性酵素によるタンパク質分解から生じる可能性のある、インビボでの不十分な薬物動態プロファイルに苦しんでいる。例えば、ＧＬＰ－１（７－３７）はＮ末端アラニン８でのジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ－４）切断による分解のために、たった約２分の半減期を有する。安定性の問題に対処することを目指した現在の戦略は不十分であり、というのも、それらはしばしば、安定性を犠牲にして効力を損なうからである。
【発明の概要】
【0004】
１つの態様では、本開示は、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチドを提供する。様々な実施形態では、修飾ポリペプチドは、Ｎ６－Ｌ－セリル－官能化リジン（例えば、
Ｎ６－Ｌ－セリル－官能化リジン誘導体（例えば、
Ｎ６－Ｌ－スレオニル－官能化リジン（例えば、
またはＮ６－Ｌ－スレオニル－官能化リジン誘導体（例えば、
を含む。
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【0005】
ある一定の実施形態では、ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１フラグメント７－３７（ＧＬＰ－１（７－３７））、副甲状腺ホルモンフラグメント１－３４（ＰＴＨ（１－３４））、またはペプチドＹＹ３－３６（ＰＹＹ（３－３６））と少なくとも９０％、または９２％、または９４％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を含むように修飾された、表１に列挙される治療ペプチドからなる群より選択されるペプチド治療薬を含む。様々な実施形態では、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は天然リジンの代わりに、またはリジン以外の天然アミノ酸、例えば、限定はされないが、セリンの代わりに、アミノ酸配列に組み込まれる。
【0006】
別の実施形態では、本開示は、本明細書における任意の実施形態または実施形態の組み合わせの修飾ポリペプチドおよび官能性部分を含むバイオコンジュゲートを提供し、官能性部分は、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体上のセリルまたはスレオニル基で修飾ポリペプチドにコンジュゲートされる。様々な実施形態では、官能性部分は、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、蛍光分子、化学発光分子、リン光分子、放射性同位体、酵素、酵素基質、親和性分子、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、発色性基質、造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴ標識、リン光標識、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ある一定の実施形態では、官能性部分は下記を含む：
（例えば、
（例えば、
（式中、Ｒ＝ＮＨ２、ＯＨ、またはＯＣＨ３である）（例えば、
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【0007】
本開示はまた、本明細書における任意の実施形態または実施形態の組み合わせによる１つ以上のポリペプチドおよび／またはバイオコンジュゲートならびに薬学的に許容される担体、溶媒、アジュバント、および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【0008】
別の態様では、本開示は、バイオコンジュゲートを調製する方法を提供し、方法は、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチドを官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させることを含み、サリチルアルデヒドエステルは、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体上のセリルまたはスレオニル基と反応し、バイオコンジュゲートが得られる。１つの実施形態では、官能化サリチルアルデヒドエステルは下記式を有し：
式中、Ｒは、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、蛍光分子、化学発光分子、リン光分子、放射性同位体、酵素、酵素基質、親和性分子、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、発色性基質、造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴ標識、リン光標識、またはそれらの組み合わせ；または蛍光分子、ビオチン、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、またはそれらの組み合わせ）を含む部分である。
【化9】
【0009】
別の実施形態では、官能化サリチルアルデヒドエステルは下記式を有し：
（例えば、
（例えば、
（式中、Ｒ＝ＮＨ２、ＯＨ、またはＯＣＨ３である）（例えば、
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【0010】
様々な実施形態では、方法は、修飾ポリペプチド合成中に、Ｎ６－セリル－リジンまたはその誘導体またはＮ６－スレオニル－リジンまたはその誘導体を導入することをさらに含む。他の実施形態では、修飾ポリペプチドは、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを含み、方法は、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを保護基で、官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させる前に保護することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】セリンでの化学ライゲーションを示す。（上部）以前の取り組みでは主に、タンパク質化学合成、半合成、またはペプチド環化においてセリン／スレオニンライゲーション（ＳＴＬ）を使用した。（下部）ライゲーションに必要な１－アミノ－２－ヒドロキシ官能基を含む非標準アミノ酸を使用し、部位特異的修飾を内部で生成する方法のカートゥーン。
【図2】ＧＬＰ－１ペプチド類似体の設計。ＧＬＰ－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびセマグルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の一次配列。ここでＳＴＬを介して合成した、ペプチドＧ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびＧ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、位置２６のＣ１８－ＰＥＧ４修飾を、位置８のＡｉｂ残基と共に、または、位置１８のＣ１８－ＰＥＧ４修飾のみを含む。
【図3】脂質化は細胞活性に影響を与えず、ＧＬＰ－１をタンパク質分解から安定化し、インビボでのグルコースクリアランスを改善する。（ａ）脂質単独、または、Ａｉｂ置換と共に、未修飾ＧＬＰ－１（ｎ＝３）と比べて、ｃＡＭＰ生成のＥＣ５０に影響しない。（）全長（ｂ）ＧＬＰ－１Ｒ－セマグルチド、（ｃ）ＧＬＰ－１Ｒ－Ｇ１、および（ｄ）ＧＬＰ－１Ｒ－Ｇ２複合体のモデル。
【図4】スキーム１．ＳＴＬによる非保護モデルペプチドの部位特異的な修飾。全ての反応をピリジン／酢酸（１：１ｖ／ｖ）中１０ｍＭの濃度で実施し、続いて、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉ－Ｐｒ３ＳｉＨ（９４／５／１、ｖ／ｖ／ｖ）を使用して切断した。
【発明を実施するための形態】
【0012】
引用される参考文献は全て、本明細書でその全体が参照により組み込まれる。
【0013】
本明細書では、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別記されない限り、複数の指示対象を含む。「および」は本明細書では、明示的に別段の記載がない限り、「または」と同じ意味で使用される。
【0014】
本明細書では、アミノ酸残基は下記のように省略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、およびαアミノイソ酪酸（ＡＩＢ、Ｂ）。
【0015】
発明の任意の態様の全ての実施形態は、文脈で明確に別記されない限り、組み合わせて使用することができる。
【0016】
第１の態様では、本開示は、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチドを提供する。下記実施例に示されるように、発明者らは、そのような修飾ポリペプチドは、化学生物学における様々な用途のために容易に内部的、および、部位特異的に修飾することができることを証明しており、セマグルチドを用いた研究により非限定的に例示される強力で安定な変異体の生成が含まれる。
【0017】
ポリペプチドは官能化リジンまたは官能化リジン誘導体を含むことができる。Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化することができる任意のリジン誘導体が使用され得る。様々な実施形態では、リジンの誘導体としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：
【化14】
【0018】
例えば、ある一定の実施形態では、修飾ポリペプチドは、下記を含む：Ｎ６－Ｌ－セリル－官能化リジン（例えば、
または、Ｎ６－Ｌ－セリル－官能化リジン誘導体（例えば、
ある一定の実施形態では、修飾ポリペプチドは、下記を含む：Ｎ６－Ｌ－スレオニル－官能化リジン（例えば、
またはＮ６－Ｌ－スレオニル－官能化リジン誘導体（例えば、
いくつかの実施形態では、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は保護基を含む。例えば、Ｎ６－官能化リジンは、Ｂｏｃ－保護基またはｔ－ブチル保護基、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【0019】
好適なＮ６－官能化リジンは当技術分野で知られているように調製することができる。例えば、ある一定の官能化リジンペプチド、例えば、セリン－リジンコンジュゲートの調製は、Ｃ． Ｈ． Ｐ． Ｃｈｅｕｎｇ， Ｊ． Ｘｕ， Ｃ． Ｌ． Ｌｅｅ， Ｙ． Ｚｈａｎｇ， Ｒ． Ｗｅｉ， Ｄ． Ｂｉｅｒｅｒ， Ｘ． Ｈｕｎａｇ， ａｎｄ Ｘ． Ｌｉ， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２０２１， １２， ７０９１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。
【0020】
当業者により理解されるように、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は天然リジンの代わりに、または、別の天然アミノ酸の代わりにアミノ酸配列に組み込まれる。Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は未修飾ポリペプチドにおける任意のアミノ酸の代わりに組み込まれ得る。１つの実施形態では、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は、未修飾ポリペプチドにおけるリジン残基の代わりに組み込まれる。別の実施形態では、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体は、未修飾ポリペプチドにおけるセリン残基の代わりに組み込まれる。１つの実施形態では、修飾ポリペプチドは２つ以上のＮ６－官能化リジンまたはその誘導体を含むことができる。
【0021】
ポリペプチドは、官能化から利益を得ることができ、安定性または他のポリペプチド特性が改善される任意のポリペプチドであってもよい。様々な非限定的実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を含むように修飾された、表１に列挙される治療ペプチドからなる群より選択されるペプチド治療薬の改変バージョンを含むことができる。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、または９２％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％またはそれ以上同一である
【表1】
【0022】
１つの非限定的実施形態では、修飾ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１フラグメント７－３７（ＧＬＰ－１（７－３７））（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも９０％、または９２％、または９４％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。ＧＬＰ－１（７－３７）のアミノ酸配列が図２に示される。
【0023】
別の実施形態では、ポリペプチドは、副甲状腺ホルモンフラグメント１－３４（ＰＴＨ（１－３４））（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と少なくとも９０％、または９２％、または９４％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
【0024】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、ペプチドＹＹ３－３６（ＰＹＹ（３－３６））（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と少なくとも８５％、または９０％、または９２％、または９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
【0025】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載される本開示の修飾ポリペプチド、および、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体上のセリルまたはスレオニル基で修飾ポリペプチドにコンジュゲートされる官能性部分を含むバイオコンジュゲートを提供する。本開示の修飾ポリペプチドは使用目的に適切と見なされる任意の官能性部分を受容することができる。非限定的実施形態では、官能性部分はポリエチレングリコール分子、脂質分子、蛍光分子、化学発光分子、リン光分子、放射性同位体、酵素、酵素基質、親和性分子、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、発色性基質、造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴ標識、リン光標識、またはそれらの組み合わせを含むことができる。１つの特定の実施形態では、官能性部分は蛍光分子、ビオチン、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、またはそれらの組み合わせを含むことができる。他の実施形態では、官能性部分は下記からなる群より選択される部分を含むことができる：
（例えば、
（例えば、
（式中、Ｒ＝ＮＨ２、ＯＨ、またはＯＣＨ３である）（例えば、
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【0026】
様々なこれらの実施形態では、官能性部分はバイオコンジュゲートの生体内安定性を、天然（未修飾）ポリペプチドの生体内安定性と比べて増加させる。下記実施例に示されるように、セマグルチドを用いた研究により非限定的に例示される、本開示のバイオコンジュゲートは未修飾ポリペプチドの強力で安定な類似体であり、未修飾ポリペプチドに比べ改善された安定性を有する。
【0027】
本開示はまた、本明細書で記載される本開示による１つ以上のポリペプチドおよび／またはバイオコンジュゲートを含む医薬組成物を提供し、修飾ポリペプチドは、治療タンパク質またはペプチド、および薬学的に許容される担体、溶媒、アジュバント、および／または希釈剤を含む。本開示の医薬組成物は、例えば、ポリペプチドが治療するように設計されている障害のための治療の必要がある被験体を治療するための方法において使用することができる。医薬組成物は本開示のポリペプチドまたはバイオコンジュゲートに加えて（ａ）凍結乾燥保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）張度調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存剤および／または（ｇ）緩衝液を含むことができる。
【0028】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。医薬組成物はまた、凍結乾燥保護剤、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含んでもよい。ある一定の実施形態では、医薬組成物は、保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびそれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロクサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート（ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはそれらの組み合わせを含む。医薬組成物はまた、張度調整剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物を含み得る。例示的な張度調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物はさらに、安定剤、例えば、対象となるタンパク質と合わせられると、凍結乾燥または液体形態の対象となるタンパク質の化学および／または物理的不安定性を実質的に防止または低減させる分子を含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が挙げられる。
【0029】
ポリペプチドおよび／またはバイオコンジュゲートは医薬組成物中の唯一の活性剤であってもよく、または、組成物は、使用目的に好適な１つ以上の他の活性剤をさらに含み得る。
【0030】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載される本開示のバイオコンジュゲートを調製する方法を提供する。そのような方法は、Ｎ６でセリルまたはスレオニル基により官能化されたリジンまたはその誘導体を有するアミノ酸配列を含む修飾ポリペプチドを官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させることを含み、サリチルアルデヒドエステルは、Ｎ６－官能化リジンまたはその誘導体上のセリルまたはスレオニル基と反応し、バイオコンジュゲートが得られる。修飾ポリペプチドが、保護基を含む実施形態では、バイオコンジュゲートを調製する方法は、修飾ポリペプチドを処理して、保護基を除去する工程をさらに含み得る。
【0031】
任意の好適な官能化サリチルアルデヒドエステルが、方法において使用され得る。１つの実施形態では、官能化サリチルアルデヒドエステルは下記式を有し：
式中、Ｒは、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、蛍光分子、化学発光分子、リン光分子、放射性同位体、酵素、酵素基質、親和性分子、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、発色性基質、造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴ標識、リン光標識、またはそれらの組み合わせを含む部分である。
【化23】
【0032】
１つの実施形態では、Ｒは蛍光分子、ビオチン、ポリエチレングリコール分子、脂質分子、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、官能化サリチルアルデヒドエステルは下記からなる群より選択される式を有する：
（例えば、
（例えば、
（式中、Ｒ＝ＮＨ２、ＯＨ、またはＯＣＨ３である）（例えば、
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【0033】
多くのペプチド系治療薬はプロテアーゼ触媒分解のために不安定である。さらなる実施形態では、Ｒ部分はバイオコンジュゲートの生体内安定性を、修飾ポリペプチドの生体内安定性と比べて増加させる。修飾ポリペプチドは、本明細書で記載される任意の実施形態または実施形態の組み合わせに従ってもよい。生体内安定性は、ペプチドをヒト血清中でインキュベートし、ペプチドをクロマトグラフィー、例えば、逆相ＨＰＬＣによりモニタすることにより決定することができる。特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ヒト血清中で少なくとも１２時間、例えば、少なくとも１６時間、または少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間の半減期を有する。
【0034】
修飾ポリペプチドは、任意の好適な溶液中で、官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させることができる。１つの実施形態では、修飾ポリペプチドは、窒素塩基および有機酸を含む溶液、例えば、ピリジン／酢酸溶液中で、官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させられる。ピリジン／酢酸は溶液中で任意の好適な比であってもよく、例えば、０．２：１～５：１ｖ／ｖピリジン：酢酸の範囲、例えば、限定はされないが、１：１ｖ／ｖ比である。
【0035】
修飾ポリペプチドは、任意の好適な温度範囲で、官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させられてもよい。１つの実施形態では、修飾ポリペプチドは官能化サリチルアルデヒドエステルと、約１８℃～２７℃の範囲の温度でＮ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体を形成するのに十分な期間の間、接触させられる。さらなる実施形態では、Ｎ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体は酸性条件下でバイオコンジュゲートを形成するのに十分な期間の間反応させられる。任意の好適な酸性条件が使用され得る。１つの実施形態では、酸性条件はトリフルオロ酢酸の使用を含む。
【0036】
さらなる実施形態では、方法は、Ｎ６－セリル－リジンまたはその誘導体またはＮ６－スレオニル－リジンまたはその誘導体を修飾ポリペプチド合成中に導入することをさらに含む。
【0037】
別の実施形態では、修飾ポリペプチドが、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを含む場合、方法は、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを保護基で、官能化サリチルアルデヒドエステルと接触させる前に保護することをさらに含み得る。任意の好適な保護基が使用でき、アリルセリンまたはＮ末端アセチル化が挙げられるが、それに限定されない。
【0038】
対象化合物、ポリペプチド、またはバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスのいずれか中、関係する分子のいずれか上の感受性基または反応基を保護することが必要である、および／または望ましい可能性がある。これは、標準研究、例えば、Ｊ． Ｆ． Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ， “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７３， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” 第３版， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９９，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”； Ｖｏｌｕｍｅ ３ （編集者： Ｅ． Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８１，“Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ，” Ｈｏｕｂｅｎ－Ｗｅｙｌ， ４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １５／ｌ， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ １９７４， ｉｎ Ｈ．－Ｄ． Ｊａｋｕｂｋｅ ａｎｄ Ｈ． Ｊｅｓｃｈｅｉｔ， “Ａｍｉｎｏｓａｕｒｅｎ， Ｐｅｐｔｉｄｅ， Ｐｒｏｔｅｉｎｅ，” Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ Ｂｅａｃｈ， ａｎｄ Ｂａｓｅｌ １９８２，および／またはＪｏｃｈｅｎ Ｌｅｈｍａｎｎ， “Ｃｈｅｍｉｅ ｄｅｒ Ｋｏｈｌｅｎｈｙｄｒａｔｅ： Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｅ，” Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ １９７４において記載される従来の保護基により達成することができる。保護基は、好都合なその後の段階で、当技術分野で公知の方法を使用して除去することができる。
【0039】
実施例
ペプチドおよびタンパク質バイオコンジュゲーションにより、異なる用途、例えば、プロテオミクスおよび高分解能撮像のための様々な官能基の部位特異的な導入が可能になる。１つのそのような方法はＳｅｒ／Ｔｈｒライゲーション（ＳＴＬ）であり、これはＣ末端サリチルアルデヒドエステルと、アルデヒド捕獲を介して可逆イミン形成を受けるセリンまたはスレオニン残基を含むＮ末端フラグメントの間で起こる化学選択的反応である。アシルシフト後、安定なＮ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体が、酸により切断され、ライゲーション部位で天然セリン／スレオニン結合が解放される。例えば、Ｎ－末端セリンまたはスレオニンのために存在する、１－アミノ－２－ヒドロキシ官能基の存在下では、Ｎ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体のみが形成する。ここで我々は、１－アミノ－２－ヒドロキシ官能基を含む非標準アミノ酸を使用し、化学生物学における様々な用途、例えば、ＧＬＰ－１（７－３７）の強力で安定な変異体の生成のためにペプチドを内部的に、および、部位特異的に修飾する（図１）。
ペプチドおよびタンパク質バイオコンジュゲーションにより、異なる用途、例えば、プロテオミクスおよび高分解能撮像のための様々な官能基の部位特異的な導入が可能になる。１つのそのような方法はＳｅｒ／Ｔｈｒライゲーション（ＳＴＬ）であり、これはＣ末端サリチルアルデヒドエステルと、アルデヒド捕獲を介して可逆イミン形成を受けるセリンまたはスレオニン残基を含むＮ末端フラグメントの間で起こる化学選択的反応である。アシルシフト後、安定なＮ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体が、酸により切断され、ライゲーション部位で天然セリン／スレオニン結合が解放される。例えば、Ｎ－末端セリンまたはスレオニンのために存在する、１－アミノ－２－ヒドロキシ官能基の存在下では、Ｎ，Ｏ－ベンジリデンアセタール中間体のみが形成する。ここで我々は、１－アミノ－２－ヒドロキシ官能基を含む非標準アミノ酸を使用し、化学生物学における様々な用途、例えば、ＧＬＰ－１（７－３７）の強力で安定な変異体の生成のためにペプチドを内部的に、および、部位特異的に修飾する（図１）。
【0040】
このアプローチの範囲および普遍性を評価するために、我々は最初に市販開始材料から一段階でビオチン、シアニン－３、パルミチン酸類似体、および単分散ポリエチレングリコールサリチルアルデヒドエステルを合成した。ついで、全てのプローブを１－アミノ－２－ヒドロキシ非標準アミノ酸を含むモデルペプチド上に部位特異的に組み込んだ（スキーム１；図４）。高速液体クロマトグラフィーによりモニタした、バイオコンジュゲーション後に、全ての生成物をエレクトロスプレーイオン化質量分析により特徴付けた。
【0041】
次に、我々はどのようにこのバイオコンジュゲーション戦略を利用して、ペプチド治療薬の安定性を増強させることができるか調査した。ペプチドおよびタンパク質治療薬の半減期を延ばす最も一般的な戦略はペグ化および脂質化である。２つのＧＬＰ－１（７－３７）薬物、セマグルチドおよびリラグルチドは脂質化され、現在のところ、２型糖尿病の治療のために血糖を管理するように使用されている。ペグ化および脂質化はどちらも、プロテアーゼ触媒分解からの保護を提供する。加えて、脂質化は循環ヒトアルブミンへの結合を促進し、これにより、遅い一定の速度で薬物が放出される。
【0042】
この点を考慮して、我々はＳＴＬを使用して、ハイブリッドＰＥＧおよび脂肪酸側鎖を含む、セマグルチドに類似するＧＬＰ－１の２つの類似体を合成した（図２）。第１のペプチド（Ｇ１）はリジン２６、セマグルチドと同じ位置で修飾した。この部位はアラニン８のＤＰＰ－４切断部位からさらに離れているので、我々はまたアラニン８の代わりに２－アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）を含め（セマグルチドと同様）、追加の安定性を提供した。セマグルチドとＧ１の間の主な違いは、わずかな側鎖修飾の他に、Ｇ１は天然リジン３４を維持することであり、コンジュゲーションがＳＴＬにより部位特異的であるからである。第２のペプチド（Ｇ２）はセリン１８で修飾した。この特別な場合、アラニン８でＡｉｂを省略することを選択する。というのも、脂質がＮ末端により近く、タンパク質分解をより良好の遮蔽する可能性があるからでる。２つの類似体についてのキャラクタリゼーションデータは表２にまとめて示される。
【表2】
【0043】
多くの生化学および構造研究により、ＧＬＰ－１内の拡張両親媒性α－ヘリックスがＧＬＰ受容体の細胞外ドメインとの高親和性結合相互作用に関与することが示されている。これらの修飾がどのように二次構造を破壊するかを評価するために、我々は円二色性（ＣＤ）分光法を使用して、ＧＬＰ－１に対する変化を観察した。ＧＬＰ－１（特徴的ならせん状折り畳みを示す）に対して、Ｇ１およびＧ２はどちらもまた、らせん構造を示すが、しかしながら天然ＧＬＰ－１より少ない。このデータは、セマグルチド上で見出される脂質修飾と一致し、この構造の損失は脂質修飾によって誘導されると考えられる。
【0044】
ＧＬＰ－１のＧＬＰ－１Ｒへの内在性結合は細胞内再配列という結果になり、これにより、Ｇ－タンパク質の動員が可能になり、その後、ＡＴＰからのサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生を刺激し、グルコース刺激性インスリン分泌につながる。１９脂質修飾ＧＬＰ－１類似体Ｇ１およびＧ２の、ヒトＧＬＰ－１Ｒを活性化する能力を評価するために、ｃＡＭＰ蓄積をヒトＧＬＰ－１Ｒを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞において測定した。細胞を最初に、参照アゴニストとして天然ＧＬＰ－１およびセマグルチドで処理した。それらは、それぞれ、３．３±０．６ｎＭおよび０．６０±０．２ｎＭ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）のＥＣ５０を示した（図３ａ）。比較すると、Ｇ１およびＧ２はどちらも未修飾ペプチドよりも良好に作用し、セマグルチドと大体等価であり、それぞれ、０．９７±０．２ｎＭおよび０．７３±０．２ｎＭのＥＣ５０を有した（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）。このデータにより、Ｌｙｓ２６またはＳｅｒ１８上の脂質修飾はどちらも内在性機能を著しくは乱さないことが示唆される。脂質修飾ＧＬＰ－１類似体Ｇ１およびＧ２のインビトロ薬理学的プロファイリングを補完するために、ヒト血清における天然ＧＬＰ－１およびセマグルチドに対する化合物の安定性を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して比較した（データ示さず）。予想通りに、天然ＧＬＰ－１はこのアッセイにおいて比較的短い半減期を示し、ｔ１／２＝約３．５時間、というのも、Ｎ末端Ａｌａ８残基が容易に切断されるからである。対照的に、セマグルチドは４８時間まで分解の兆候をほとんど示さず、というのも、その安定性がＡｌａ８でのＡｉｂ付加および脂質修飾により著しく増強されるからである。これらの半減期は前の報告と一致する。天然ＧＬＰ－１に対して、Ｇ１は著しく改善された安定性プロファイル、ｔ１／２＝約４０時間を示した。Ｇ１はＤＰＰ４による切断を防止するためにＡｌａ８で置換されたＡｉｂを含むが、このデータにより、ヒト血清中に存在する他のプロテアーゼは、他の部位でＧ１を分解することができることが示唆される。最後に、Ｇ２は、非常に安定であることが証明され、天然ＧＬＰ－１に対して安定性が１４倍以上増加し、セマグルチドに非常に匹敵する。
【0045】
有望な活性化および安定性データを考慮して、ペプチドをインビボで、標準ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を使用して試験した。Ｇ１およびＧ２はどちらも、未修飾ＧＬＰ－１（データ示さず）に比べ改善されたグルコース処理効率を示し、それらのインビトロデータと一致した。これらのデータは、脂質化の、効力を損なわないで安定性を著しく増加させる能力を強調し、よって、グルコース処理のマウスモデルにおける改善されたインビボ活性が得られる。
【0046】
どのようにＧ１およびＧ２がＧＬＰ－１Ｒと相互作用するかについての分子洞察を得るために、我々は、実験的方法で記載されるように、対応するリガンド－受容体複合体の計算モデリングを実施した。ＧＬＰ－１Ｒペプチド結合モデルは、未修飾ＧＬＰ－１ペプチドと複合体化されたＧＬＰ－１Ｒの、最近公開されたＣｒｙｏ－ＥＭ構造に基づいている。ＧＬＰ－１Ｒとのそれらの複合体におけるセマグルチド、Ｇ１、およびＧ２の作成されたモデルにより、セリン１８かまたはリジン２６のいずれかでの脂質化は溶媒曝露され、おそらく、結合または活性化に関与する重要な接触を妨害しないであろうことが示唆される（図３ｂ－ｄ）。加えて、Ｇ１の脂質修飾はペプチドのＮ末端により近く、おそらく、Ｃ末端Ａｉｂ残基と脂質修飾の間に曝露される分解部位が存在することが示唆される。
【0047】
結論として、我々は、「セリンライゲーション」に頼る強固な部位特異的なバイオコンジュゲーション戦略を導入する。多数のサリチルアルデヒド（ｓａｌｉｃｙａｌｄｅｈｙｄｅ）エステルプローブが市販のカルボン酸から一段階で容易に合成することができ、化学生物学および医薬における様々な用途のための安定な結合を有するペプチドが生成される。セマグルチド上で脂質官能基を導入するために現在のところ使用されている化学選択的化学（これは、天然配列における任意の他の天然リジン残基の突然変異を伴う）とは異なり、我々の部位特異的な戦略はこれを必要としない。ペプチドにおけるＮ末端セリンまたはスレオニン残基は修飾のために競合する可能性があり；しかしながら、これは、単純な保護基戦略、例えば、アリルセリンまたはＮ末端アセチル化を使用することにより回避することができる。我々はこの技術を適用して、広く使用される糖尿病薬セマグルチドに類似するハイブリッドＰＥＧおよび脂肪酸側鎖を取り付けた、強力で安定なＧＬＰ－１類似体を生成させた。どちらの化合物も、ＧＬＰ－１Ｒを活性化するそれらの能力において、セマグルチドと等しい効力を有し、天然ＧＬＰ－１に対してヒト血清中で著しく改善された安定性プロファイルを示し、インビボでＧＬＰ－１をしのいだ。
【0048】
ある一定の実施形態では、ＳＴＬバイオコンジュゲーション戦略が他のＧＰＣＲ、例えば、ＰＴＨ（１－３４）の強力で安定な類似体を作製するために使用され得る。加えて、ある一定の実施形態では、ＳＴＬバイオコンジュゲーションをアンバー終止コドン技術と組み合わせ、固相ペプチド合成を排除することにより本開示の修飾ペプチドの生成を拡大させる。このアプローチは、治療ペプチドに重点をおいて、様々な用途のペプチドを作製する可能性を証明する。
【0049】
略語
ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質共役受容体；ＤＰＰ－４、ジペプチジルペプチダーゼ；ＳＴＬ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒライゲーション；Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸；ＧＴＴ、ブドウ糖負荷試験。
ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質共役受容体；ＤＰＰ－４、ジペプチジルペプチダーゼ；ＳＴＬ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒライゲーション；Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸；ＧＴＴ、ブドウ糖負荷試験。
【0050】
材料：ビオチンをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｃｙａｎｉｎｅ３酸をｌｕｍｉｐｒｏｂｅから購入した。Ｃ１８－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨおよびｔ－ｂｏｃ－Ｎ－アミド－ｓＰＥＧ８－酸を、それぞれ、ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓおよびＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから購入した。セマグルチド酢酸塩をＢａｃｈｅｍから購入した。Ｌｙｓ－Ｓｅｒジペプチドの合成を、ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃにより前に報告されたように実施した（Ｃ． Ｈ． Ｐ． Ｃｈｅｕｎｇ， Ｊ． Ｘｕ， Ｃ． Ｌ． Ｌｅｅ， Ｙ． Ｚｈａｎｇ， Ｒ． Ｗｅｉ， Ｄ． Ｂｉｅｒｅｒ， Ｘ． Ｈｕｎａｇ， ａｎｄ Ｘ． Ｌｉ， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２０２１， １２， ７０９１）。全ての他の試薬を商業的供給元から入手し、さらに精製せずに使用した。全ての水溶液を、社内ＥＬＧＡ水精製システムから得られた、超高純度研究室グレード水（脱イオン、濾過、および滅菌）を使用して調製した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を、ダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０シリーズＨＰＬＣ機器を用いて実施した。分析解析のために、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを使用した（Ｈｉｇｇｉｎｓ）。試料を５－９５％アセトニトリル／水グラジエント（０．１％ＴＦＡ）を用いて４５分で、１ｍＬ／分の流速で溶出し、２１４ｎｍでモニタした。精製のために、セミ分取Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを使用した（Ｈｉｇｇｉｎｓ）。試料を５－６５％または２５－９５％アセトニトリル／水グラジエント（０．１％ＴＦＡ）を用いて３５分で、５．０ｍＬ／分の流速で溶出し、２２０ｎｍでモニタした。質量スペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ－ＴＯＦまたはＴｈｅｒｍｏ ＥＳＩ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃで取得した。
【0051】
ペプチド合成：全てのペプチドを、標準Ｆｍｏｃ固相化学を使用し、２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ ＰｒｏＴｉｄｅ（ＣＥＭ、０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）またはＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（ＰＣＡＳ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ、０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂のいずれか上で、ＣＥＭ製のＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅペプチドシンセサイザーを使用して合成した。カップリングをＤＩＣ（５当量、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）およびＯｘｙｍａ（１０当量、Ｓｉｇｍａ）をＤＭＦ中で使用して実施し、続いて、２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ脱保護を実施した。次いで、全てのペプチドを（９５：２．５：２．５ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン）３．５時間室温で切断し、冷エーテルから沈殿させ、逆相ＨＰＬＣにより、分取クロマトグラフィーを使用して精製した。全てのペプチドを質量分析によりＥＳＩ－ＭＳを使用して特徴づけ、配列純度を分析用ＨＰＬＣにより評価した。
【0052】
円二色性分光法：円二色性スペクトルを、Ｊａｓｃｏ Ｊ－１５００ ＣＤ分光計上で記録した。ペプチドを新たに、試料測定前に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中５０μＭの最終濃度まで希釈した。スペクトルを２５０から１９０ｎｍまで０．１ｎｍデータピッチ、５０ｎｍ分－１走査速度、４秒データ統合時間、１ｎｍバンド幅、および１ｍｍパス長で、３蓄積を用いて、２５℃で記録した。全てのデータは、リン酸緩衝液のみを含む試料からバックグラウンド減算した。
【0053】
ＧＬＰ－１ ｃＡＭＰ蓄積アッセイ：ＧＬＰ－１受容体活性化を、ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ ｅＸｐｒｅｓｓアッセイキット（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃９５－００６２Ｅ２ＣＰ２Ｍ）を使用してヒトＧＬＰ１Ｒを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞中で測定した。全ての試薬を別記されない限りアッセイキット由来とした。全てを製造者の指示に従い実施した。全てのデータをＰｒｉｓｍ８．３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用して解析した。
【0054】
サリチルアルデヒドエステルの合成およびライゲーション反応条件：
サリチルアルデヒドエステルの合成：ビオチン、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃ１８－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨ、およびｔ－ｂｏｃ－Ｎ－アミド－ｓＰＥＧ８－酸をサリチルアルデヒド（１．１ｅｑ．）、ＤＩＣ（１．２ｅｑ）、およびＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を含む乾燥ＤＣＭ（２－４ｍＬ）に添加した。反応（複数可）を一晩進行させると、サリチルアルデヒドエステルが得られ、これらをセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。
サリチルアルデヒドエステルの合成：ビオチン、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃ１８－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨ、およびｔ－ｂｏｃ－Ｎ－アミド－ｓＰＥＧ８－酸をサリチルアルデヒド（１．１ｅｑ．）、ＤＩＣ（１．２ｅｑ）、およびＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を含む乾燥ＤＣＭ（２－４ｍＬ）に添加した。反応（複数可）を一晩進行させると、サリチルアルデヒドエステルが得られ、これらをセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。
【0055】
モデルペプチドへのライゲーションのための一般手順：サリチルアルデヒドエステル（１当量）およびペプチド断片（１．０当量）をピリジン／酢酸（１：１ｖ／ｖ）に溶解し、約０．０２５－０．０５Ｍの最終濃度とした。反応物（複数可）を室温で撹拌し、ＬＣ／ＭＳを使用してモニタした。反応の完了後、溶媒を凍結乾燥により除去し、中間生成物をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉ－Ｐｒ３ＳｉＨ（９４／５／１、ｖ／ｖ／ｖ）で１０分間（ｂｏｃを有するＰｅｇについては２時間）処理し、ライゲーション部位に天然アミド結合を含む生成物を得た。
【0056】
ＧＬＰ－１（７－３７）へのライゲーションのための一般手順：ＧＬＰ－１（７－３７）（１０ｍｇ）をピリジン／酢酸（１：１ｖ／ｖ）に溶解し、約１０ｍＭの最終濃度とし、対応するサリチルアルデヒドエステル（１当量）を添加した。反応物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣを使用してモニタした。反応の完了後、溶媒を凍結乾燥により除去し、中間体をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉ－Ｐｒ３ＳｉＨ（９４／５／１、ｖ／ｖ／ｖ）で１５分間、Ｂｏｃ保護ＰＥＧについては２時間処理し、ライゲーション部位に天然アミド結合を含む生成物を得た。
【0057】
参考文献
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（５）Ｇｒｅｅｎ， Ｂ． Ｄ．； Ｍｏｏｎｅｙ， Ｍ． Ｈ．； Ｇａｕｌｔ， Ｖ． Ａ．； Ｉｒｗｉｎ， Ｎ．； Ｂａｉｌｅｙ， Ｃ． Ｊ．； Ｈａｒｒｉｏｔｔ， Ｐ．； Ｇｒｅｅｒ， Ｂ．； Ｏ’Ｈａｒｔｅ， Ｆ． Ｐ． Ｍ．； Ｆｌａｔｔ， Ｐ． Ｒ． Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ（７）－Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１（７－３６） Ａｍｉｄｅ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ－Ｓｔａｂｌｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２００４， １８０ （３）， ３７９－３８８。
（６）Ｃｈｅｎ， Ｘ．； Ｍｉｅｔｌｉｃｋｉ－Ｂａａｓｅ， Ｅ． Ｇ．； Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｔ． Ｍ．； ＭｃＧｒａｔｈ， Ｌ． Ｅ．； Ｋｏｃｈ－Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ， Ｋ．； Ｆｅｒｒｉｅ， Ｊ． Ｊ．； Ｈａｙｅｓ， Ｍ． Ｒ．； Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｅ． Ｊ． Ｔｈｉｏａｍｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１７， １３９ （４６）， １６６８８－１６６９５。
（７）Ｌｉｎ， Ｓ．， Ｙａｎｇ， Ｘ．， Ｊｉａ， Ｓ．， Ｗｅｅｋｓ， Ａ． Ｍ．， Ｈｏｒｎｓｂｙ， Ｍ．， Ｌｅｅ， Ｐ． Ｓ．， Ｎｉｃｈｉｐｏｒｕｋ， Ｒ． Ｖ．， Ｉａｖａｒｏｎｅ， Ａ． Ｔ．， Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ．， Ｔｏｓｔｅ， Ｆ． Ｄ．， ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， Ｃ． Ｊ． Ｒｅｄｏｘ－Ｂａｓｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１７， ３５５， ５９７－６０２。
（８）Ｇｕｐｔａ， Ａ．； Ｒｉｖｅｒａ－Ｍｏｌｉｎａ， Ｆ．； Ｘｉ， Ｚ．； Ｔｏｏｍｒｅ， Ｄ．； Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， Ａ． Ｅｎｄｏｓｏｍｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ａｔ Ｓｕｐｅｒ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＩＤＥ Ｐｒｏｂｅｓ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０２０， １６， ４０８－４１４。
（９）Ｚｈａｎｇ， Ｙ．； Ｘｕ， Ｃ．； Ｌａｍ， Ｈ． Ｙ．； Ｌｅｅ， Ｃ． Ｌ．； Ｌｉ， Ｘ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０１３， １１０ （３７）， ６６５７－６６６２。
（１０）Ｌｅｖｉｎｅ， Ｐ． Ｍ．； Ｃｒａｖｅｎ， Ｔ． Ｗ．； Ｂｏｎｎｅａｕ， Ｒ．； Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｋ． ｅｍｉ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｏｉｄ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｔ Ｓｅｒｉｎｅ． Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ２０１４， １６ （２）， ５１２－５１５。
（１１）Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｌ． Ｂ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ． Ｆ．； Ｈｕｕｓｆｅｌｄｔ， Ｐ． Ｏ．； Ｊｏｈａｎｓｅｎ， Ｎ． Ｌ．； Ｍａｄｓｅｎ， Ｋ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｆ． Ｚ．； Ｔｈｏｅｇｅｒｓｅｎ， Ｈ．； Ｗｉｌｋｅｎ， Ｍ．； Ａｇｅｒｓｏｅ， Ｈ． Ｐｏｔｅｎｔ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１ ｗｉｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ Ｏｎｃｅ Ｄａｉｌｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０００， ４３ （９）， １６６４－１６６９。
（１２）Ｊｅｎｓｅｎ， Ｌ．； Ｈｅｌｌｅｂｅｒｇ， Ｈ．； Ｒｏｆｆｅｌ， Ａ．； Ｖａｎ Ｌｉｅｒ Ｊ． Ｊ．； Ｂｊｏｅｒｎｓｄｏｔｔｉｒ， Ｉ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｐ． Ｊ．； Ｒｏｗｅ， Ｅ．； Ｄｅｒｖｉｎｇ Ｋａｒｓｂｏｌ， Ｊ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ｌ．； Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＬＰ－１ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ２０１７， １０４， ３１－４１。
（１３）Ｍｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒ， Ｒ．； Ｄｅｃｋｅｒ， Ｊ． Ｓ．； Ｈｅｎｎｉｇａｎ， Ｊ． Ｎ．； Ｌｙｎｃｈ， Ｍ． Ｄ．； Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１９， １０ （２９５）， １－１２。
（１４）Ｓｐｅｃｔｏｒ， Ａ． Ａ． Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｐｌａｓｍａ Ａｌｂｕｍｉｎ． Ｊ． Ｌｉｐｉ． Ｒｅｓ． １９７５， １６ （３）， １６５－１７９。
（１５）Ｚｈａｎｇ， Ｙ．； Ｓｕｎ， Ｂ．； Ｆｅｎｇ， Ｄ．； Ｈｕ， Ｈ．； Ｃｈｕ， Ｍ．； Ｑｕ， Ｑ．； Ｔａｒｒａｓｃｈ， Ｊ． Ｔ．； Ｌｉ， Ｓ．； Ｓｕｎ Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｔ．； Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｂ． Ｋ．； Ｓｋｉｎｉｏｔｉｓ， Ｇ． Ｃｒｙｏ－ＥＭ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＧＬＰ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１７， ５４６ （７６５７）， ２４８－２５３。
（１６）Ｌｅｖｉｎｅ， Ｐ． Ｍ．； Ｂａｌａｎａ， Ａ． Ｔ．； Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ， Ｅ．； Ｋｏｏｌｅ， Ｃ．； Ｎｏｄａ， Ｈ．； Ｚａｒｚｙｃｋａ， Ｂ．； Ｄａｌｅｙ， Ｅ． Ｊ．； Ｔｒｕｏｎｇ， Ｔ． Ｔ．； Ｋａｔｒｉｔｃｈ， Ｖ．； Ｇａｒｄｅｌｌａ， Ｔ． Ｊ．； Ｗｏｏｔｔｅｎ， Ｄ．； Ｓｅｘｔｏｎ， Ｐ． Ｍ．； ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｐ．； Ｐｒａｔｔ， Ｍ． Ｒ． Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＧＰＣＲ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ａｇｏｎｉｓｔｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１９， １４１， １４２１０－１４２１９。
（１７）Ａｄｅｌｈｏｒｓｔ， Ｋ．； Ｈｅｄｅｇａａｒｄ， Ｂ． Ｂ．； Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｌ． Ｂ．， Ｋｉｒｋ， Ｏ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９ （９）， ６２７５－６２７８。
（１８）Ｖｅｎａｎｚｉ， Ｍ．； Ｓａｖｉｏｌｉ， Ｍ．； Ｃｉｍｉｎｏ， Ｒ．； Ｇａｔｔｏ， Ｅ．； Ｐａｌｌｅｓｃｈｉ， Ａ．； Ｒｉｐａｎｉ， Ｇ．； Ｃｉｃｅｒｏ， Ｄ．； Ｐｌａｃｉｄｉ， Ｅ．； Ｏｒｖｉｅｔｏ， Ｆ．； Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｅ． Ａ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａ Ｌｏｎｇ－Ｌａｓｔｉｎｇ Ｌｉｐｉｄａｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ： Ｔｈｅ Ｃａｓｅ ｏｆ Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ． Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ． ２０２０， １６， １０１２２－１０１３１。
（１９）Ｚｈａｎｇ， Ｒ．； Ｘｉｅ， Ｘ． Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＧＰＣＲ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎ． ２０１２， ３３ （３）， ３７２－３８４。
（２０）Ｆｒａｈｅｒ， Ｌ． Ｊ．； Ｋｌｅｉｎ， Ｋ．； Ｍａｒｉｅｒ， Ｒ．； Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｄ．； Ｈｅｎｄｙ， Ｇ． Ｎ．； Ｇｏｌｔｚｍａｎ， Ｄ．； Ｈｏｄｓｍａｎ， Ａ． Ｂ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ－（１－３４） ［ＰＴＨ－（１－３４）］ ａｎｄ ＰＴＨ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ－（１－３４） ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｙｏｕｎｇ Ｈｕｍａｎｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １９９５， ８０ （１）， ６０－６４。
（１）Ｍｕｔｔｅｎｔｈａｌｌｅｒ， Ｍ．； Ｋｉｎｇ， Ｇ． Ｆ．； Ａｄａｍｓ， Ｄ． Ｊ．； Ａｌｅｗｏｏｄ， Ｐ． Ｆ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０２１， ２０， ３０９－３２５。
（２）Ｔｒｕｊｉｌｌｏ， Ｊ． Ｍ．； Ｎｕｆｆｅｒ， Ｗ．； Ｅｌｌｉｓ， Ｓ． Ｌ． ＧＬＰ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔｓ： ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｔｈｅｒ． Ａｄｖ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ２０１５， ６ （１）， １９－２８。
（３）Ａｌ－Ｍｅｒａｎｉ， Ａ． Ｓ．； Ｂｒｏｏｋｓ， Ｐ． Ｄ．； Ｃｈａｐｍａｎ， Ｊ． Ｂ．； Ｍｕｎｄａｙ， Ａ． Ｋ． Ｔｈｅ Ｈａｌｆ－Ｌｉｖｅｓ ｏｆ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ， Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ－Ａｍｉｄｅ， Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩＩ， Ｓａｒ１－Ａｌａ８－ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ａｎｄ Ｒｅｎｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｔ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９７８， ２７８， ４７１－４９０。
（４）Ｌｏｖｓｈｉｎ， Ｊ． Ａ．； Ｄｒｕｃｋｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｉｎｃｒｅｔｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２００９， ５ （５）， ２６２－２６９。
（５）Ｇｒｅｅｎ， Ｂ． Ｄ．； Ｍｏｏｎｅｙ， Ｍ． Ｈ．； Ｇａｕｌｔ， Ｖ． Ａ．； Ｉｒｗｉｎ， Ｎ．； Ｂａｉｌｅｙ， Ｃ． Ｊ．； Ｈａｒｒｉｏｔｔ， Ｐ．； Ｇｒｅｅｒ， Ｂ．； Ｏ’Ｈａｒｔｅ， Ｆ． Ｐ． Ｍ．； Ｆｌａｔｔ， Ｐ． Ｒ． Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ（７）－Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１（７－３６） Ａｍｉｄｅ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ－Ｓｔａｂｌｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２００４， １８０ （３）， ３７９－３８８。
（６）Ｃｈｅｎ， Ｘ．； Ｍｉｅｔｌｉｃｋｉ－Ｂａａｓｅ， Ｅ． Ｇ．； Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｔ． Ｍ．； ＭｃＧｒａｔｈ， Ｌ． Ｅ．； Ｋｏｃｈ－Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ， Ｋ．； Ｆｅｒｒｉｅ， Ｊ． Ｊ．； Ｈａｙｅｓ， Ｍ． Ｒ．； Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｅ． Ｊ． Ｔｈｉｏａｍｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１７， １３９ （４６）， １６６８８－１６６９５。
（７）Ｌｉｎ， Ｓ．， Ｙａｎｇ， Ｘ．， Ｊｉａ， Ｓ．， Ｗｅｅｋｓ， Ａ． Ｍ．， Ｈｏｒｎｓｂｙ， Ｍ．， Ｌｅｅ， Ｐ． Ｓ．， Ｎｉｃｈｉｐｏｒｕｋ， Ｒ． Ｖ．， Ｉａｖａｒｏｎｅ， Ａ． Ｔ．， Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ．， Ｔｏｓｔｅ， Ｆ． Ｄ．， ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， Ｃ． Ｊ． Ｒｅｄｏｘ－Ｂａｓｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１７， ３５５， ５９７－６０２。
（８）Ｇｕｐｔａ， Ａ．； Ｒｉｖｅｒａ－Ｍｏｌｉｎａ， Ｆ．； Ｘｉ， Ｚ．； Ｔｏｏｍｒｅ， Ｄ．； Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， Ａ． Ｅｎｄｏｓｏｍｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ａｔ Ｓｕｐｅｒ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＩＤＥ Ｐｒｏｂｅｓ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０２０， １６， ４０８－４１４。
（９）Ｚｈａｎｇ， Ｙ．； Ｘｕ， Ｃ．； Ｌａｍ， Ｈ． Ｙ．； Ｌｅｅ， Ｃ． Ｌ．； Ｌｉ， Ｘ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０１３， １１０ （３７）， ６６５７－６６６２。
（１０）Ｌｅｖｉｎｅ， Ｐ． Ｍ．； Ｃｒａｖｅｎ， Ｔ． Ｗ．； Ｂｏｎｎｅａｕ， Ｒ．； Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｋ． ｅｍｉ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｏｉｄ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｔ Ｓｅｒｉｎｅ． Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ２０１４， １６ （２）， ５１２－５１５。
（１１）Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｌ． Ｂ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ． Ｆ．； Ｈｕｕｓｆｅｌｄｔ， Ｐ． Ｏ．； Ｊｏｈａｎｓｅｎ， Ｎ． Ｌ．； Ｍａｄｓｅｎ， Ｋ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｆ． Ｚ．； Ｔｈｏｅｇｅｒｓｅｎ， Ｈ．； Ｗｉｌｋｅｎ， Ｍ．； Ａｇｅｒｓｏｅ， Ｈ． Ｐｏｔｅｎｔ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１ ｗｉｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ Ｏｎｃｅ Ｄａｉｌｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０００， ４３ （９）， １６６４－１６６９。
（１２）Ｊｅｎｓｅｎ， Ｌ．； Ｈｅｌｌｅｂｅｒｇ， Ｈ．； Ｒｏｆｆｅｌ， Ａ．； Ｖａｎ Ｌｉｅｒ Ｊ． Ｊ．； Ｂｊｏｅｒｎｓｄｏｔｔｉｒ， Ｉ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｐ． Ｊ．； Ｒｏｗｅ， Ｅ．； Ｄｅｒｖｉｎｇ Ｋａｒｓｂｏｌ， Ｊ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ｌ．； Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＬＰ－１ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ２０１７， １０４， ３１－４１。
（１３）Ｍｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒ， Ｒ．； Ｄｅｃｋｅｒ， Ｊ． Ｓ．； Ｈｅｎｎｉｇａｎ， Ｊ． Ｎ．； Ｌｙｎｃｈ， Ｍ． Ｄ．； Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１９， １０ （２９５）， １－１２。
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（１５）Ｚｈａｎｇ， Ｙ．； Ｓｕｎ， Ｂ．； Ｆｅｎｇ， Ｄ．； Ｈｕ， Ｈ．； Ｃｈｕ， Ｍ．； Ｑｕ， Ｑ．； Ｔａｒｒａｓｃｈ， Ｊ． Ｔ．； Ｌｉ， Ｓ．； Ｓｕｎ Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｔ．； Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｂ． Ｋ．； Ｓｋｉｎｉｏｔｉｓ， Ｇ． Ｃｒｙｏ－ＥＭ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＧＬＰ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１７， ５４６ （７６５７）， ２４８－２５３。
（１６）Ｌｅｖｉｎｅ， Ｐ． Ｍ．； Ｂａｌａｎａ， Ａ． Ｔ．； Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ， Ｅ．； Ｋｏｏｌｅ， Ｃ．； Ｎｏｄａ， Ｈ．； Ｚａｒｚｙｃｋａ， Ｂ．； Ｄａｌｅｙ， Ｅ． Ｊ．； Ｔｒｕｏｎｇ， Ｔ． Ｔ．； Ｋａｔｒｉｔｃｈ， Ｖ．； Ｇａｒｄｅｌｌａ， Ｔ． Ｊ．； Ｗｏｏｔｔｅｎ， Ｄ．； Ｓｅｘｔｏｎ， Ｐ． Ｍ．； ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｐ．； Ｐｒａｔｔ， Ｍ． Ｒ． Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＧＰＣＲ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ａｇｏｎｉｓｔｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１９， １４１， １４２１０－１４２１９。
（１７）Ａｄｅｌｈｏｒｓｔ， Ｋ．； Ｈｅｄｅｇａａｒｄ， Ｂ． Ｂ．； Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｌ． Ｂ．， Ｋｉｒｋ， Ｏ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９ （９）， ６２７５－６２７８。
（１８）Ｖｅｎａｎｚｉ， Ｍ．； Ｓａｖｉｏｌｉ， Ｍ．； Ｃｉｍｉｎｏ， Ｒ．； Ｇａｔｔｏ， Ｅ．； Ｐａｌｌｅｓｃｈｉ， Ａ．； Ｒｉｐａｎｉ， Ｇ．； Ｃｉｃｅｒｏ， Ｄ．； Ｐｌａｃｉｄｉ， Ｅ．； Ｏｒｖｉｅｔｏ， Ｆ．； Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｅ． Ａ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａ Ｌｏｎｇ－Ｌａｓｔｉｎｇ Ｌｉｐｉｄａｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ： Ｔｈｅ Ｃａｓｅ ｏｆ Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ． Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ． ２０２０， １６， １０１２２－１０１３１。
（１９）Ｚｈａｎｇ， Ｒ．； Ｘｉｅ， Ｘ． Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＧＰＣＲ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎ． ２０１２， ３３ （３）， ３７２－３８４。
（２０）Ｆｒａｈｅｒ， Ｌ． Ｊ．； Ｋｌｅｉｎ， Ｋ．； Ｍａｒｉｅｒ， Ｒ．； Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｄ．； Ｈｅｎｄｙ， Ｇ． Ｎ．； Ｇｏｌｔｚｍａｎ， Ｄ．； Ｈｏｄｓｍａｎ， Ａ． Ｂ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ－（１－３４） ［ＰＴＨ－（１－３４）］ ａｎｄ ＰＴＨ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ－（１－３４） ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｙｏｕｎｇ Ｈｕｍａｎｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １９９５， ８０ （１）， ６０－６４。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】