特表 2025-502241 オルガノイド組成物を使用する腸傷害修復方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-24

(54)【発明の名称】オルガノイド組成物を使用する腸傷害修復方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/545 20150101AFI20250117BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20250117BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20250117BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20250117BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20250117BHJP

   A61K 35/38 20150101ALI20250117BHJP

   A61K 35/54 20150101ALI20250117BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20250117BHJP

   A61K 35/15 20250101ALI20250117BHJP

【ＦＩ】

A61K35/545

C12N5/077 ZNA

C12N5/071

C12N5/078

A61P1/04

A61K35/38

A61K35/54

A61K35/36

A61K35/15

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024541924

(86)(22)【出願日】2023-01-13

(85)【翻訳文提出日】2024-09-03

(86)【国際出願番号】 US2023060687

(87)【国際公開番号】W WO2023137467

(87)【国際公開日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】63/299,842

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500469235

【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル メディカル センター

(74)【代理人】

【識別番号】100104411

【弁理士】

【氏名又は名称】矢口 太郎

(72)【発明者】

【氏名】ポーリング、ホリー、エム．

(72)【発明者】

【氏名】スンダラム、ナンビラジャン

(72)【発明者】

【氏名】ヘルムラス、マイケル、エー．

(72)【発明者】

【氏名】ウェルズ、ジェームス、マコーマック

(72)【発明者】

【氏名】マヘ、マキシム、ミカエル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB34

4C087BB48

4C087BB50

4C087BB57

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA23

4C087MA56

4C087MA59

4C087MA60

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZA68

(57)【要約】

腸傷害及び損傷の治療のための、オルガノイド組成物及びその使用方法が、本明細書で開示されている。方法は、上皮及び間葉系構成要素の両方を含む、幹細胞由来オルガノイドに由来する細胞組成物の管腔内投与を含む。投与された細胞は、レシピエントの腸組織の適切な領域への安定した生着を示す。幹細胞由来オルガノイドから存在する複数の細胞型の組み込みは、腸傷害のより完全な治癒をもたらす。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腸損傷の治療を必要とする対象において前記腸損傷を治療する方法であって、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離されている解離細胞集団を前記対象の前記腸の管腔壁に投与することを含み、前記腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された前記細胞集団が、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含み、前記対象の前記腸が、小腸及び／又は結腸を含む、方法。

【請求項2】

前記解離細胞集団を前記対象の前記腸の前記管腔壁に投与することが、前記細胞集団を、前記腸損傷によって影響を受けた前記腸の管腔の位置に投与することを含み、任意選択で、前記位置が、前記腸損傷によって影響を受けた前記腸に直接隣接するか又はその近くであり、任意選択で、前記管腔壁の表面に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記解離細胞集団が、細胞懸濁液として前記対象の前記腸の前記管腔壁に投与される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記解離細胞集団を前記対象の前記腸の前記管腔壁に投与することが、前記細胞集団を経腸カテーテル、経鼻カテーテル、又は浣腸によって投与することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、前記対象に対して同種である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、前記対象から単離された細胞に由来しており、前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、前記対象に対して自家である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、前記対象から単離された前記細胞に由来する人工多能性幹細胞に由来している、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記対象から単離された前記細胞が、前記対象からの皮膚線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記解離細胞集団が、前記腸及び／又は結腸オルガノイドの酵素的解離及び／又は機械的解離によって調製される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

酵素的解離が、前記腸及び／又は結腸オルガノイドを、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせで解離させることを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

機械的解離が、前記腸及び／又は結腸オルガノイドを、連続的により狭くなる径のチャネルに通すことを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

前記解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージが、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％であるか、又は約それらであるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージが、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、若しくは１５％であるか、又は約それらであるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記解離細胞集団が、影響を受けた腸表面積１ｍｍ^２当たり５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、若しくは１００００細胞であるか、又は約それらである濃度、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の１ｍｍ^２当たりの任意の細胞量で投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記解離細胞集団は、前記腸損傷の改善が観察されるまで複数回にわたって前記対象に投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記解離細胞集団が、前記対象に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回投与される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記解離細胞集団の細胞が、前記対象の前記腸の粘膜及び筋層に組み込む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記対象の前記腸に組み込まれた前記解離細胞集団の細胞が、それらの腸及び／又は結腸の領域性を維持する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記対象の前記腸に組み込まれた前記解離細胞集団の細胞又はその亜集団が、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性平滑筋細胞型に分化する、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記解離細胞集団が、前記対象の前記腸に組み込み、前記腸損傷の治癒を促進する増殖マーカーＫＩ６７＋（ＭＫＩ６７＋）増殖性細胞を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記解離細胞集団が、投与後にインタクトな腸バリアの形成を促進する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記解離細胞集団が、前記腸損傷によって影響を受けた前記対象の前記腸の前記管腔壁の表面積の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは５０％、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージの表面積に組み込む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記腸損傷が、腸潰瘍を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記腸損傷が、化学的及び／又は機械的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記腸損傷が、胃腸の病気に関連する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記胃腸の病気が、クローン病、潰瘍性大腸炎、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）又は他の薬剤に関連する腸疾患、放射線誘発性腸疾患、及び結核などの病原性感染に関連する腸疾患から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、哺乳動物のものである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、ヒトのものである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記対象が、哺乳動物である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が、ヒトである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドを解離させて、前記解離細胞集団を作製することを更に含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記解離細胞集団が、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の多細胞断片の形態であるか、又は少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の多細胞断片の形態である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドをインビトロで、任意選択で多能性幹細胞から産生することを更に含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法における使用のための、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団。

【請求項36】

上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む解離細胞集団を含む、細胞懸濁液。

【請求項37】

前記間葉系細胞型が、ビメンチン（ＶＩＭ）及び／又はエラスチンミクロフィブリルインターフェーサ１（ＥＭＩＬＩＮ１）を発現し、前記上皮細胞型が、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）及び／又は尾側型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）を発現する、請求項３６に記載の細胞懸濁液。

【請求項38】

前記解離細胞集団が、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離され、前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む、請求項３６又は３７に記載の細胞懸濁液。

【請求項39】

前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来している、請求項３８に記載の細胞懸濁液。

【請求項40】

前記細胞懸濁液又は前記腸及び／若しくは結腸オルガノイドが、対象に対して同種である、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項41】

前記細胞懸濁液又は前記腸及び／若しくは結腸オルガノイドが、対象からの細胞に由来しており、前記腸及び／又は結腸オルガノイドが、前記対象に対して自家である、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項42】

前記細胞懸濁液又は前記腸及び／若しくは結腸オルガノイドが、前記対象から単離された前記細胞に由来する人工多能性幹細胞に由来している、請求項４１に記載の細胞懸濁液。

【請求項43】

前記解離細胞集団が、前記腸及び／又は結腸オルガノイドの酵素的解離及び／又は機械的解離によって調製される、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項44】

酵素的解離が、前記腸及び／又は結腸オルガノイドを、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせで解離させることを含む、請求項４３に記載の細胞懸濁液。

【請求項45】

機械的解離が、前記腸及び／又は結腸オルガノイドを、連続的により狭くなる径のチャネルに通すことを含む、請求項４３又は４４に記載の細胞懸濁液。

【請求項46】

前記解離細胞集団が、ＭＫＩ６７＋増殖性細胞を含む、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項47】

前記解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージが、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージである、請求項３５～４６のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項48】

前記解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージが、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、若しくは１５％以下、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージである、請求項３５～４７のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項49】

前記細胞懸濁液中の前記解離細胞集団の濃度が、約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬ、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度である、請求項３５～４８のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項50】

前記解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞の濃度が、約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬ、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度である、請求項３５～４９のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項51】

前記解離細胞集団が、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の多細胞断片の形態、又は少なくともそれらの多細胞断片の形態、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージである、請求項３５～４９のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。

【請求項52】

有効量の請求項３５～５１のいずれか一項に記載の細胞懸濁液と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項53】

腸損傷の前記治療における使用のための、請求項３５～５１のいずれか一項に記載の細胞懸濁液又は請求項５２に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（連邦政府が支援する研究開発に関する声明）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与されたＵ０１ ＤＫ１０３１１７及びＮＩＨ Ｐ３０ ＤＫ０７８２９２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対してある特定の権利を有する。

【0002】

（配列表の参照）
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、ＣＨＭＣ６３＿０４５ＷＯ．ｘｍｌという名称のファイルとして提供され、２０２３年１月１２日に作成され、最終更新され、サイズは６０２１バイトである。電子的な配列表の形式は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

（発明の分野）
本開示の態様は、概して、腸損傷の治療のためのオルガノイド組成物及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

広範な腸疾患が、腸組織の潰瘍形成に関連している。腸潰瘍をもたらす及び／又は腸潰瘍に関連する一般的な適応症としては、クローン病、潰瘍性大腸炎、非ステロイド性抗炎症薬（non-steroidal anti-inflammatory drug、ＮＳＡＩＤ）及び他の薬剤に関連する腸疾患、放射線誘発性腸疾患、並びに結核を含む病原性感染に関連するものが挙げられる。しかしながら、原因が不明な腸管の慢性潰瘍も報告されている。腸潰瘍の検出は、カプセル内視鏡検査及びバルーン内視鏡検査などの内視鏡的アプローチの使用によって改善されてきたが、これらの潰瘍の治療のための簡単なアプローチが依然として欠如している。いくつかの状況では、関連する副作用を伴う疑わしい薬剤の使用の終了後に改善が見られる場合があるが、進行した場合には外科的切除が必要な場合がある。腸の非治癒性潰瘍領域をもたらす慢性腸損傷は、完全な回復治療の選択肢が現在欠如しているので、臨床上の難題をもたらしている。したがって、腸の潰瘍形成及び傷害の異なる兆候に広く適用可能であり、長く持続する効果を有する療法に対する持続する必要性がある。

【0005】

一般に、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍と称される消化性潰瘍疾患（Peptic Ulcer Disease、ＰＵＤ）は、小腸上皮のびらんを特徴とする慢性の潜在的に生命を脅かす状態である。一般に、細菌又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の過剰使用によって引き起こされたＰＵＤは、一般集団の最大１０％に影響を及ぼし、最大１０％の死亡率を有する。Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉの治療における最近の進歩及びＮＳＡＩＤのより注意深い使用は、ＰＵＤの発生率を減少させたが、全体的な死亡率は減少しなかった。実際に、高い死亡率を伴う特発性出血性潰瘍の発生率が増加している。ＰＵＤの治療計画はますます複雑になってきており、新規な治療法の進歩の機会を指摘している。Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉの抗生物質耐性が増加しており、従来の薬理学的治療は、潰瘍領域を健康な組織状態に完全に回復させることなく、多数の有害な副作用をもたらす可能性がある。これらの患者のために利用可能な治療モダリティを広げるため、並びに特発性出血性潰瘍を有する患者のための治療を開発するために、新規の治療戦略を開発することが重要である。これらの戦略の開発はまた、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び慢性の潰瘍障害を含む他の主要な状態の管理及び治療に拡張される可能性がある。

【発明の概要】

【0006】

本明細書の開示は、腸オルガノイド、結腸オルガノイド、又はその両方に由来する解離細胞集団又は組成物、並びに対象における腸損傷を治療するためのそれらを使用する方法に関する。これらの腸オルガノイド及び結腸オルガノイドは、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞に由来し、その結果、オルガノイドは、小腸及び結腸に通常見られる多くの細胞型から構成され、特に上皮及び間葉系細胞型の両方を含む。解離細胞集団又は組成物は、腸オルガノイド及び結腸オルガノイドの解離又は断片化により作製され、いくつかの実施形態では、解離細胞集団又は組成物は、腸オルガノイド又は結腸オルガノイドの断片を表す生細胞の凝集塊（本明細書において「断片」とも称される）から全体又は大部分が構成される。解離細胞集団又は組成物は、対象の腸の管腔壁に投与され、これは、様々なアプローチにより行われ得る。解離細胞集団又は組成物中の間葉系細胞の存在は、対象の腸への優れた生着、及び対象における腸損傷の治癒をもたらす。

【0007】

腸損傷の治療を必要とする対象において腸損傷を治療する方法が、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、方法は、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離されている解離細胞集団を、対象の腸の管腔壁に投与することを含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む。いくつかの実施形態では、対象の腸は、小腸及び／又は結腸を含む。

【0008】

腸損傷の治療を必要とする対象において腸損傷を治療する方法も、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、方法は、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む腸及び／又は結腸オルガノイドを産生すること、腸及び／又は結腸オルガノイドを解離させて上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む細胞集団を作製すること、並びに細胞集団を対象の腸の管腔に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象の腸は、小腸及び／又は結腸を含む。

【0009】

胃腸の病気の治療を必要とする対象において胃腸の病気を治療する方法における使用のための、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離される解離細胞集団も、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、方法は、解離細胞集団を、対象の腸の管腔壁に投与することを含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む。いくつかの実施形態では、対象の腸は、小腸及び／又は結腸を含む。

【0010】

上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む解離細胞集団を含む細胞懸濁液も、本明細書で開示されている。本明細書で開示されている細胞懸濁液又は解離細胞集団のうちのいずれかを含む医薬製剤も、本明細書で開示されている。

【0011】

本明細書で提供される本開示の実施形態は、以下の番号が付された実施形態によって説明される。
１．腸損傷の治療を必要とする対象において腸損傷を治療する方法であって、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離されている解離細胞集団を対象の腸の管腔壁に投与することを含み、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された細胞集団が、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含み、対象の腸が、小腸及び／又は結腸を含む、方法。
２．解離細胞集団を対象の腸の管腔壁に投与することが、細胞集団を、腸損傷によって影響を受けた腸の管腔の位置に投与することを含み、任意選択で、位置が、腸損傷によって影響を受けた腸に直接隣接するか又はその近くであり、任意選択で、管腔壁の表面に投与される、実施形態１に記載の方法。
３．解離細胞集団が、細胞懸濁液として対象の腸の管腔壁に投与される、実施形態１又は２に記載の方法。
４．解離細胞集団を対象の腸の管腔壁に投与することが、細胞集団を経腸カテーテル、経鼻カテーテル、又は浣腸によって投与することを含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．腸及び／又は結腸オルガノイドが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来している、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．腸及び／又は結腸オルガノイドが、対象に対して同種である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．腸及び／又は結腸オルガノイドが、対象から単離された細胞に由来しており、腸及び／又は結腸オルガノイドが、対象に対して自家である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
８．腸及び／又は結腸オルガノイドが、対象から単離された細胞に由来する人工多能性幹細胞に由来している、実施形態７に記載の方法。
９．対象から単離された細胞が、対象からの皮膚線維芽細胞又は末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）を含む、実施形態８に記載の方法。
１０．解離細胞集団が、腸及び／又は結腸オルガノイドの酵素的解離及び／又は機械的解離によって調製される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．酵素的解離が、腸及び／又は結腸オルガノイドを、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせで解離させることを含む、実施形態１０に記載の方法。
１２．機械的解離が、腸及び／又は結腸オルガノイドを、連続的により狭くなる径のチャネルに通すことを含む、実施形態１０又は１１に記載の方法。
１３．解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージが、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％であるか、又は約それらであるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージである、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージが、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、若しくは１５％であるか、又は約それらであるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．解離細胞集団が、影響を受けた腸表面積１ｍｍ^２当たり５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、若しくは１００００細胞であるか、又は約それらである濃度、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の１ｍｍ^２当たりの任意の細胞量で投与される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．解離細胞集団が、腸損傷の改善が観察されるまで複数回にわたって対象に投与される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．解離細胞集団が、対象に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回投与される、実施形態１６に記載の方法。
１８．解離細胞集団の細胞が、対象の腸の粘膜及び筋層に組み込む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．対象の腸に組み込まれた解離細胞集団の細胞が、それらの腸及び／又は結腸の領域性を維持する、実施形態１８に記載の方法。
２０．対象の腸に組み込まれた解離細胞集団の細胞又はその亜集団が、平滑筋アクチン（smooth muscle actin、ＳＭＡ）陽性平滑筋細胞型に分化する、実施形態１８又は１９に記載の方法。
２１．解離細胞集団が、対象の腸に組み込み、腸損傷の治癒を促進する増殖マーカーＫＩ６７＋（Marker of Proliferation KI67＋、ＭＫＩ６７＋）増殖性細胞を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．解離細胞集団が、投与後にインタクトな腸バリアの形成を促進する、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．解離細胞集団が、腸損傷によって影響を受けた対象の腸の管腔壁の表面積の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは５０％、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージの表面積に組み込む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．腸損傷が、腸潰瘍を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．腸損傷が、化学的及び／又は機械的である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．腸損傷が、胃腸の病気に関連する、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．胃腸の病気が、クローン病、潰瘍性大腸炎、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）又は他の薬剤に関連する腸疾患、放射線誘発性腸疾患、及び結核などの病原性感染に関連する腸疾患から選択される、実施形態２６に記載の方法。
２８．腸及び／又は結腸オルガノイドが、哺乳動物のものである、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．腸及び／又は結腸オルガノイドが、ヒトのものである、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．対象が哺乳動物である、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．対象がヒトである、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．腸及び／又は結腸オルガノイドを解離させて、解離細胞集団を作製することを更に含む、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．解離細胞集団が、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の多細胞断片の形態であるか、又は少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の多細胞断片の形態である、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．腸及び／又は結腸オルガノイドをインビトロで、任意選択で多能性幹細胞から産生することを更に含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法における使用のための、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団。
３６．上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む解離細胞集団を含む、細胞懸濁液。
３７．間葉系細胞型が、ビメンチン（ＶＩＭ）及び／又はエラスチンミクロフィブリルインターフェーサ１（elastin microfibril interfacer 1、ＥＭＩＬＩＮ１）を発現し、上皮細胞型が、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）及び／又は尾側型ホメオボックス２（caudal type homeobox 2、ＣＤＸ２）を発現する、実施形態３６に記載の細胞懸濁液。
３８．解離細胞集団が腸及び／又は結腸オルガノイドから解離され、腸及び／又は結腸オルガノイドが上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む、実施形態３６又は３７に記載の細胞懸濁液。
３９．腸及び／又は結腸オルガノイドが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来している、実施形態３８に記載の細胞懸濁液。
４０．細胞懸濁液又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドが、対象に対して同種である、実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
４１．細胞懸濁液又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドが、対象からの細胞に由来しており、腸及び／又は結腸オルガノイドが、対象に対して自家である、実施形態３５～４０のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
４２．細胞懸濁液又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドが、対象から単離された細胞に由来する人工多能性幹細胞に由来している、実施形態４１に記載の細胞懸濁液。
４３．解離細胞集団が、腸及び／又は結腸オルガノイドの酵素的解離及び／又は機械的解離によって調製される、実施形態３５～４２のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
４４．酵素的解離が、腸及び／又は結腸オルガノイドを、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせで解離させることを含む、実施形態４３に記載の細胞懸濁液。
４５．機械的解離が、腸及び／又は結腸オルガノイドを、連続的により狭くなる径のチャネルに通すことを含む、実施形態４３又は４４に記載の細胞懸濁液。
４６．解離細胞集団が、ＭＫＩ６７＋増殖性細胞を含む、実施形態３５～４５のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
４７．解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージが、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージである、実施形態３５～４６のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
４８．解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージが、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、若しくは１５％以下、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージである、実施形態３５～４７のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
４９．細胞懸濁液中の解離細胞集団の濃度が、約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬ、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度である、実施形態３５～４８のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
５０．解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞の濃度が、約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬ、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度である、実施形態３５～４９のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
５１．解離細胞集団が、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の多細胞断片の形態、又は少なくともそれらの多細胞断片の形態、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージである、実施形態３５～４９のいずれか１つに記載の細胞懸濁液。
５２．有効量の実施形態３５～５１のいずれか１つに記載の細胞懸濁液と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
５３．腸損傷の治療における使用のための、実施形態３５～５１のいずれか１つに記載の細胞懸濁液又は実施形態５２に記載の医薬組成物。

【図面の簡単な説明】

【0012】

本明細書に記載の特徴に加えて、追加の特徴及び変形例は、以下の図面及び例示的な実施形態の説明から容易に明らかになるであろう。これらの図面は実施形態を描画しており、範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。

【図1A】損傷した腸のインビボでの組織再生に寄与する、解離されたＨＩＯの実施形態を描画する。図１Ａは、実験設計の概略の実施形態を描画する。

【図1B-G】損傷した腸のインビボでの組織再生に寄与する、解離されたＨＩＯの実施形態を描画する。図１Ｂは、採取された再シードしたループの明視野（左パネル）及びＧＦＰ（右パネル）画像を描画する。生存－ＧＦＰの存在により、術後１０週でループ内に取り込まれたＧＦＰ－ＨＩＯ断片を実証している。黒色及び白色の破線は、ループの外周を示す。ＧＦＰ画像の白色破線内の破線は、ループ内の生存－ＧＦＰ発現領域の外周を示す。スケールバー＝１ｍｍ。図１Ｃは、図１Ｂに写っている、ループ内の生存－ＧＦＰ発現領域の定量化の実施形態を描画する。生存－ＧＦＰを発現するループ表面積の、全ループのパーセンテージとしてのバイオリンプロット、ｎ＝７。図１Ｄは、図１Ｂに写っている、生存－ＧＦＰが存在する切開された領域内のヒト細胞に対する免疫染色の実施形態を描画する。図１Ｅは、断片化されたエンテロイドを用いて再シードした、採取されたループの明視野画像（左）及びＧＦＰ画像（右）の実施形態を描画する。生存－ＧＦＰの存在により、術後１０週でループ内に取り込まれたＧＦＰ－エンテロイド断片を実証している。黒色及び白色の破線は、ループの外周を示す。スケールバー＝１ｍｍ。図１Ｆは、図１Ｅに写っている、ループ内の生存－ＧＦＰ発現領域の定量化の実施形態を描画する。生存－ＧＦＰを発現するループ表面積の、全ループのパーセンテージとしてのバイオリンプロット、ｎ＝７。図１Ｇは、図１Ｅで生存－ＧＦＰが存在する切開された領域内のヒト細胞に対する免疫染色の実施形態を描画する。

【図1H】損傷した腸のインビボでの組織再生に寄与する、解離されたＨＩＯの実施形態を描画する。図１Ｈは、ヒト特異的マーカー（ＫＵ８０）及び核（ヘマトキシリン）について染色された、損傷したシャムループの代表的なタイルスキャンの実施形態を描画し、スケールバー＝０．５ｃｍ、ｎ＝３。ヒト起源の細胞は、シャムループの組織全体にわたって観察されなかった。

【図2A-D】図２Ａは、ヒト特異的マーカー（ＫＵ８０）及び核（ヘマトキシリン）について染色された、損傷及び再シードしたループの代表的なタイルスキャンの実施形態を描画し、スケールバー＝０．５ｃｍ、ｎ＝７。ヒト起源の細胞は、再シードしたループ全体にわたって観察された。図２Ｂは、図２Ａにおける粘膜及び筋層領域の高倍率画像の実施形態を描画し、スケールバー＝１００μｍ。図２Ｃは、アクチンアルファ２、平滑筋（Actin Alpha 2、ＡＣＴＡ２）、ＧＦＰ、及び核（ＤＡＰＩ）について染色された、シャム手術したループ及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画し、スケールバー＝５０μｍ、両グループともｎ＝３。図２Ｄは、チューブリンベータ３クラスＩＩＩ（Tubulin Beta 3 Class III、ＴＵＢＢ３）及び核（ヘマトキシリン）について染色された、シャム手術したループ及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画し、スケールバー＝５０μｍ、両グループともｎ＝３。矢じりは、ラット宿主からの神経束を示す。

【図3A】遺伝子編集後に正常な核型を保持するＨ１－ＧＦＰ細胞株の実施形態を描画する。Ｇバンドの核型分析により、ＧＦＰ挿入後のＨ１胚性幹細胞株の正常な（４６、ＸＹ）核型を実証している。

【図3B】合格結果を示す、ＧＦＰ挿入後のＨ１胚性幹細胞株のショートタンデムリピート分析の電気泳動図の実施形態を描画する。

【図4】粘膜切除手術中の重要な工程の写真の実施形態を描画する。パネルＡは、ループ創出及び吻合を描画し、矢じりは吻合部位を指し示す。パネルＢは、遠位端がブルドッグクランプで閉じられている間に、開いた近位端からループを化学的に損傷することを描画する。パネルＣは、歯科用侵入型フロッサーでループを機械的に損傷することを描画する。パネルＤは、遠位端が吸収性縫合糸で閉じられている間に、近位開口部からループを再シードすることを描画し、矢じりは吸収性縫合糸を指し示す。パネルＥは、エンドツーサイドのループの得られた解剖学的構造を描画し、破線の白色の輪郭はループ構造を示す。

【図5】急性経壁腸損傷モデルの実施形態を描画する。パネルＡは、健康なラット空腸（左）及び新たに損傷したラット空腸ループ（右）の代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色切片を描画し、スケールバー＝５０μｍ、両グループともｎ＝３。パネルＢは、健康な空腸（左）及び新たに損傷した空腸ループ右）の代表的な走査型電子顕微鏡写真を描画する。スケールバー＝１００μｍ。上皮は、化学的及び機械的損傷モデルに起因して、筋層に目に見える分裂を伴って大部分が剥がれている。

【図6A】術後１０週をエンドポイントとする粘膜切除手順に関連する生存率の実施形態を描画する。図６Ａは、術後１０週をエンドポイントとする粘膜切除手順に関するカプラン・マイヤー曲線の実施形態を描画する。シャム／培地再シードｎ＝３、断片化されたＨＩＯ再シードｎ＝１７（１１）、及び断片化されたエンテロイド再シードｎ＝１２（８）の合計３２の手順を実行した。図６Ｂは、術後１０週のエンドツーサイドのブラインドループの代表的な採取時画像の実施形態を描画する。

【図6B】術後１０週をエンドポイントとする粘膜切除手順に関連する生存率の実施形態を描画する。図６Ａは、術後１０週をエンドポイントとする粘膜切除手順に関するカプラン・マイヤー曲線の実施形態を描画する。シャム／培地再シードｎ＝３、断片化されたＨＩＯ再シードｎ＝１７（１１）、及び断片化されたエンテロイド再シードｎ＝１２（８）の合計３２の手順を実行した。図６Ｂは、術後１０週のエンドツーサイドのブラインドループの代表的な採取時画像の実施形態を描画する。

【図7A】経時的に幹細胞ニッチを再生するＨＩＯの初期ループ生着の実施形態を描画する。図７Ａは、ヒト特異的マーカー（ＫＵ８０）及び核（ヘマトキシリン）について染色された培地単独若しくは断片ＨＩＯ（上パネル）、又は上皮マーカー（ＣＤＨ１）、増殖マーカー（ＭＫＩ６７）、及び核（ＤＡＰＩ）（下パネル）で再シードした７日後のループの代表的な画像の実施形態を描画する。生着したヒトの寄与物は、解離されたＨＩＯで再シードしたループのみであった。両グループともｎ＝４。図７Ｂは、増殖マーカー（ＭＫＩ６７）、上皮マーカー（ＣＤＨ１）、幹細胞活性の代理マーカー（ＯＬＦＭ４）、及びテロサイトマーカー（Ｆ３）について染色された、１０週間後の対照ヒト空腸及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画する。両グループともｎ＝３。全てのスケールバー＝１００μｍ。

【図7B】経時的に幹細胞ニッチを再生するＨＩＯの初期ループ生着の実施形態を描画する。図７Ａは、ヒト特異的マーカー（ＫＵ８０）及び核（ヘマトキシリン）について染色された培地単独若しくは断片ＨＩＯ（上パネル）、又は上皮マーカー（ＣＤＨ１）、増殖マーカー（ＭＫＩ６７）、及び核（ＤＡＰＩ）（下パネル）で再シードした７日後のループの代表的な画像の実施形態を描画する。生着したヒトの寄与物は、解離されたＨＩＯで再シードしたループのみであった。両グループともｎ＝４。図７Ｂは、増殖マーカー（ＭＫＩ６７）、上皮マーカー（ＣＤＨ１）、幹細胞活性の代理マーカー（ＯＬＦＭ４）、及びテロサイトマーカー（Ｆ３）について染色された、１０週間後の対照ヒト空腸及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画する。両グループともｎ＝３。全てのスケールバー＝１００μｍ。

【図8A】生着したＨＩＯの領域同一性が維持されていることを示す画像の実施形態を描画する。図８Ａは、近位腸上皮転写因子（ＧＡＴＡ４）及び上皮（ＣＤＨ１）（左パネル）、パネート細胞マーカー（ＤＥＦＡ５）（中央パネル）、並びに炭水化物消化に関与する酵素（ＳＩ）（右パネル）について染色された、ヒト空腸及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画する。図８Ｂは、遠位回腸及び結腸に存在するＤＮＡ結合タンパク質（ＳＡＴＢ２）、コロノサイトマーカー（ＭＳ４Ａ１２）、及び結腸ムチン（ＭＵＣ５Ｂ）について染色された、ヒト結腸及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画する。全てのスケールバー＝１００μｍ、全グループｎ＝３。

【図8B】生着したＨＩＯの領域同一性が維持されていることを示す画像の実施形態を描画する。図８Ａは、近位腸上皮転写因子（ＧＡＴＡ４）及び上皮（ＣＤＨ１）（左パネル）、パネート細胞マーカー（ＤＥＦＡ５）（中央パネル）、並びに炭水化物消化に関与する酵素（ＳＩ）（右パネル）について染色された、ヒト空腸及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画する。図８Ｂは、遠位回腸及び結腸に存在するＤＮＡ結合タンパク質（ＳＡＴＢ２）、コロノサイトマーカー（ＭＳ４Ａ１２）、及び結腸ムチン（ＭＵＣ５Ｂ）について染色された、ヒト結腸及び再シードしたループの代表的な画像の実施形態を描画する。全てのスケールバー＝１００μｍ、全グループｎ＝３。

【図9A-D】再シードしたループの新生上皮が化学刺激に応答することを示すデータの実施形態を描画する。図９Ａは、ウッシングアッセイのためにスライダに取り付けられた健康なラット空腸（ループの近位）の代表的な明視野（左パネル）及び生存ＧＦＰ（右パネル）画像の実施形態を描画し、破線円＝サイダー（sider）の開口部。図９Ｂは、ウッシングアッセイのためにスライダに達した再シードしたループの代表的な明視野（左パネル）及び生存ＧＦＰ（右パネル）画像の実施形態を描画し、破線円＝スライダの開口部。ＧＦＰの発現により、セグメントの再シードの成功及び細胞の起源を検証する。図９Ｃ～図９Ｄは、健康な空腸（図９Ｃ）及びＧＦＰ＋再シードしたループ（図９Ｄ）を使用した、ウッシングチャンバ実験において測定された短絡電流（Ｉ_ｓｃ）の代表的な時間経過の実施形態を描画する。

【図9E-H】再シードしたループの新生上皮が化学刺激に応答することを示すデータの実施形態を描画する。図９Ｅは、１０μＭのフォルスコリン、１００μＭのＩＢＭＸ、及び１００μＭのブメタニドに応答した、Ｉ_ｓｃの計算された変化のグラフの実施形態を描画する。図９Ｆは、健康なラット空腸及びＧＦＰ＋再シードしたループのベースライン経上皮電気抵抗のグラフの実施形態を描画する。図９Ｇは、３時間にわたる健康なラット空腸及びＧＦＰ＋再シードしたループのＦＩＴＣ－デキストラン透過性のグラフの実施形態を描画する（上の線はループである）。図９Ｈは、図９Ｇのグラフから計算されたＦＩＴＣフラックスの実施形態を描画する。ウィルコクソン符号順位検定を使用して、図９Ｅ、図９Ｆ、及び図９Ｈにおけるグループ間の統計的有意性を求めた。両グループともｎ＝５。

【図10A-D】再シードのためのインビトロでのＨＩＯ及びエンテロイド断片化、並びに細胞数の決定の実施形態を描画する。図１０Ａは、インタクトなＨＩＯ（左パネル）及び２５Ｇで終わる一連のニードルを通して剪断することによって作製されたＨＩＯ断片（右パネル）の代表的な明視野及びＧＦＰ画像の実施形態を描画する。スケールバー＝５００μｍ。図１０Ｂは、図１０Ａと同じであるが、ＨＩＯの代わりにエンテロイドを使用したものを描画する。図１０Ｃは、解離されたＨＩＯ又はエンテロイドの自動細胞計数の定量化中に取得された代表的な明視野画像の実施形態を描画する。図１０Ｄは、単一核調製物から計算されたＨＩＯ又はエンテロイド当たりの平均の細胞数のグラフの実施形態を描画する。ｎ＝３のＨＩＯ及びｎ＝４のエンテロイド調製物。

【図11A-B】ＨＩＯの実施形態が、それらの宿主内で生体内分布を示さなかったことを描画する。図１１Ａは、ヒト特異的マーカー（ＫＵ８０、茶色）及び核（ヘマトキシリン、青色）について染色された、術後１０週での組織の代表的な画像の実施形態を描画する。移植されたＨＩＯでは、主にＫＵ８０＋細胞が存在するが、シードした粘膜切除手順を受けたラットの様々な器官では、ＫＵ８０＋細胞は観察されなかった。スケールバー＝１００μｍ。図１１Ｂは、図１１Ａに示されるように、ラットから収集された器官に対するＡｌｕ ＰＣＲからのＣｔ値のドットプロットの実施形態を描画する。点線は、陽性シグナル（ヒト細胞の存在）についてのＣｔ値の閾値を示す。白丸は、未定値又は４０より大きいＣｔを示す。ヒト細胞の存在の範囲内に入るデータ点はなかった。グループ当たりｎ＝３。

【発明を実施するための形態】

【0013】

多能性幹細胞から生成された腸オルガノイド又は結腸オルガノイドからの解離細胞を使用する、腸の再構成及び傷害修復のための臨床的に意義のある方法及びプロトコルが、本明細書で開示されている。ヒト多能性幹細胞に由来するヒト腸オルガノイド（human intestinal organoid、ＨＩＯ）及びヒト結腸オルガノイド（human colonic organoid、ＨＣＯ）などの腸オルガノイド又は結腸オルガノイドから解離された細胞は、インビボで宿主の腸の損傷したループ内に生着し、再生に寄与し、粘膜及び筋層の両方を再構成することができる。慢性の屈折性腸疾患のための新しい治療戦略は経壁再生能を必要とするので、臨床的観点から、このデータは刺激的である。本明細書で開示されているように、器官表面積の実質的な生着が１０週以内に達成され（エンテロイドを使用した場合のわずか１．６８％と比較して、１０週後に表面積で１６．９３％の平均生着）、腸オルガノイド又は結腸オルガノイドのシード材料が経時的に排除され又は洗い流されず、上皮のみのシード材料よりも効率的であることを示す。

【0014】

以前の研究では、Ｙｕｉらが、エンテロイド（すなわち、上皮のみを含み間葉を含まない成体腸組織に由来するオルガノイド様構造体）を使用した場合、移植後４週で、大腸炎マウスにおけるドナー細胞の生着／増殖速度を、マウス当たり０．０２％細胞又は約１００細胞として報告している。いくつかの類似の報告もまた、腸及び結腸の治癒に寄与するエンテロイドの能力を実証しているが、効率はほとんど報告されていない。ごく最近では、Ｓｕｇｉｍｏｔｏらが、マウス結腸内での回腸エンテロイドの生着を実証した。

【0015】

本明細書の開示は、潜在的な細胞療法としてインビボでの腸修復を達成するための、上皮及び間葉の両方を含む多系統シード材料を使用する最初の報告である。ここでの方法は、上皮幹細胞ニッチが、天然組織が機能していないか又は損傷を受けた領域において、シード材料によって排他的に生成されることを可能にする。取り込まれると、上皮幹細胞コンパートメントは１０週までに再出現し、生着したＨＩＯ断片の領域同一性は保持された。ループの新生上皮は機能的であり、エクスビボでの生理学的ウッシングチャンバアッセイで観察されるように、適切なバリア完全性を伴って化学刺激に応答した。腸（gut）のより多様で特異的な領域を表す多能性幹細胞由来のオルガノイドを使用して、プラットフォームを、結腸のような胃腸管の追加の領域に拡張することができる。

【0016】

特にヒトのための多能性幹細胞由来のオルガノイド技術は、過去１０年間にわたって組織工学の状況を変えてきた。組織工学の基本的な目標は、生成された材料が、損傷した組織又は器官全体を機能的に回復又は改善する能力にある。インビボでの腸の経壁傷害モデルを使用して、腸オルガノイドの治療能力を調査した。ｈＰＳＣからデノボで生成されたＨＩＯは、上皮及び間葉系構成要素の両方を含む。異種移植前臨床損傷モデルでは、管腔由来の解離されたＨＩＯは、再生プロセス中に生着し、増殖することが実証された。粘膜層の回復が観察されただけでなく、筋層全体にわたって著しい取り込みも観察された。更なる分析により、小腸領域化の恒常的再生及び保持のための上皮幹細胞／前駆体系の再出現が明らかになった。エクスビボでの生理学的読み取りを通して観察されたように、新生上皮は化学刺激に応答し、その透過性は健康な隣接する宿主の腸と同様であった。これらの知見は、完全な回復治療の選択肢が現在欠如している慢性非治癒性潰瘍性腸傷害を治療するための、ＨＩＯの治療的使用のための興味深い概念実証を提供する。

【0017】

腸損傷を治癒するための２つの潜在的な細胞療法の供給源は、エンテロイド及びヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）である。エンテロイドは、インビトロで、患者の腸又は移植されたＨＩＯから単離された陰窩に由来する上皮のみの構造体である。それらは、全ての分化した上皮細胞サブタイプ、例えば、エンテロサイト、杯細胞、パネート細胞、及び腸内分泌細胞を含み得るが、それらは、ヒト腸に存在する間葉系、神経系、及び免疫コンパートメントを欠く。いくつかのエビデンスは、エンテロイドを使用して、損傷した腸上皮を置き換えることができることを示すが、それらは、経壁傷害に完全に対処することはできない。エンテロイドとは異なり、ＨＩＯは、子宮内の胎児腸組織の分化を促進する同じ小分子成長因子を使用して、ヒト多能性幹細胞の段階的分化を介して生成される。ＨＩＯは、上皮及び間葉系細胞型の両方を含み、これらは移植の際に積層構造を形成する。生着及び成熟のためのバイオリアクターとして免疫無防備状態の宿主を利用して、移植されたＨＩＯは、陰窩／絨毛軸、血管系、粘膜筋板、並びに内輪及び外縦平滑筋層の両方を含む、ヒト腸を連想させる構造体に発生する。前臨床のげっ歯類損傷モデルにおいて、エンテロイド及びＨＩＯの両方が損傷した腸を再生する能力が調査された。

【0018】

オルガノイド又はエンテロイドを作製する方法は、米国特許第９，７１９，０６８号及び同第１０，１７４，２８９号、並びにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１８３９２０号、同第ＷＯ２０１６／０６１４６４号、同第ＷＯ２０１７／１９２９９７号、同第ＷＯ２０１８／０８５６１５号、同第ＷＯ２０１８／０８５６２２号、同第ＷＯ２０１８／０８５６２３号、同第ＷＯ２０１８／２２６２６７号、同第ＷＯ２０１８／１０６６２８号、同第ＷＯ２０１８／２００４８１号、同第ＷＯ２０１８／１９１６７３号、同第ＷＯ２０１９／０７４７９３号、同第ＷＯ２０１９／１２６６２６号、同第ＷＯ２０２０／０５６１５８号、同第ＷＯ２０２０／０２３２４５号、同第ＷＯ２０２０／１６０３７１号、同第ＷＯ２０２０／２４３６１３号、同第ＷＯ２０２１／０３０３７３号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0019】

定義
以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、典型的には、類似の記号は類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載された例解的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般に記載され、図に例解される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、結合、分離、及び設計することができ、それらは全て、本明細書に明示的に企図されることが容易に理解されよう。

【0020】

別段の定めがない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって本開示に照らして閲読されると、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の目的のために、次の用語を以下に説明する。

【0021】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

【0022】

「約」は、参照する量（quantity）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（amount）、重量又は長さに対し１０％と同程度に変動する量（quantity）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（amount）、重量又は長さを意味する。

【0023】

本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと（comprising）」という言葉は、記載された工程若しくは要素又は工程若しくは要素のグループを包含することを意味するが、いかなる他の工程若しくは要素又は工程若しくは要素のグループも排除しないことを意味することが理解されよう。「からなる（consisting of）」とは、「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。「本質的にからなる（consisting essentially of）」とは、この語句の後に列挙されたあらゆる要素の包含を意味しており、この列挙された要素に関して本開示で明示される活性若しくは作用を妨げない又はこの活性若しくは作用に寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的にからなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性若しくは作用に実質的な影響を及ぼすか否かに応じて存在してもよく、又は存在しなくてもよいことを示す。

【0024】

本明細書で使用される「個体」、「対象」、又は「患者」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類、又はトリ、例えば、ニワトリ、並びに任意の他の脊椎動物又は無脊椎動物を意味する。「哺乳動物」という用語は、通常の生物学的意味で使用される。したがって、これには、具体的には、サル（simian）（チンパンジー、類人猿、サル（monkey））及びヒトを含む霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

本明細書で使用される「有効量」又は「有効用量」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、観察可能な効果をもたらす記述された組成物又は化合物のその量を指す。現在開示されている主題の活性組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象及び／又は用途に対して所望の応答を達成するのに有効である活性組成物又は化合物の量を投与するために変えることができる。選択される投与量レベルは、組成物の活性、配合物、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、並びに治療される対象の身体的状態及び病歴が挙げられるが、これらに限定されない様々な要因に依存するであろう。いくつかの実施形態では、最小用量が投与され、用量制限毒性がない場合、用量は最小有効量に増量される。本明細書では、有効用量の決定及び調整、並びにそのような調整をいつどのように行うかの評価が企図されている。

【0026】

本明細書で使用される「機能」及び「機能的」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、生物学的、酵素的、又は治療的機能を指す。

【0027】

本明細書で使用される「阻害する」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、生物学的活性の減少又は防止を指すことができる。減少は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるパーセンテージ、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある量であり得る。本明細書で使用される場合、「遅延」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、生物学的事象の、そうでない場合に予想されるよりも遅い時間への遅れ、延期、又は先送りを指す。遅延は、０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるパーセンテージ、又は前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある量の遅延であり得る。阻害及び遅延という用語は、必ずしも１００％の阻害又は遅延を示すとは限らない。部分的な阻害又は遅延が実現され得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、（１）最初に産生されたとき（自然界及び／又は実験環境で）に、それが関連付けられた構成要素の少なくともいくつかから分離された、かつ／又は（２）人間の手によって産生、調製、及び／若しくは製造された、物質及び／又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、それらが最初に関連していた他の構成要素の１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％と等しいか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるもの（又は前述の値を含む及び／又はまたがる範囲）から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％純粋であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下（又は前述の値を含む及び／又はまたがる範囲）である。本明細書で使用される場合、「単離された」物質は、「純粋」であり得る（例えば、他の構成要素を実質的に含まない）。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物又は組織に含まれない細胞を指してもよい。

【0029】

本明細書で使用される場合、「インビボ」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、組織抽出物又は死んだ生物とは対照的に、生きている生物、通常は動物、ヒトを含む哺乳動物、及び植物内での方法の実行を指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「エクスビボ」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、自然条件のほとんど変化のない生体外での方法の実行を指す。

【0031】

本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、生物学的条件の外、例えばペトリ皿又は試験管内での方法の実行を指す。

【0032】

本明細書で使用される「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）又はリボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、自然に細胞内に現れるもの、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によって生成された断片、及びライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のうちのいずれかによって産生された断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）であるモノマー、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー形態）、又は両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有することができる。糖修飾には、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による置き換えが含まれるか、又は糖をエーテル若しくはエステルとして官能化することができる。更に、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体的並びに電子的に類似した構造に置き換えることができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体によって結合することができる。ホスホジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、又はホスホルアミデートが挙げられる。「核酸分子」という用語はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、これは、ポリアミド骨格に結合した天然に存在する又は修飾された核酸塩基を含む。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。「オリゴヌクレオチド」は、核酸と互換的に使用することができ、二本鎖若しくは一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを指すことができる。核酸は、様々な生物学的システムにおける核酸の増幅及び／又は発現に使用することができる核酸ベクター又は核酸構築物（例えば、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、フォスミド、ファージミド、細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome、ＢＡＣ）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome、ＹＡＣ）、又はヒト人工染色体（human artificial chromosome、ＨＡＣ））中に含有され得る。典型的には、ベクター又は構築物はまた、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インデューサー、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、複製起点、クローニング部位、多重クローニング部位、制限酵素部位、エピトープ、レポーター遺伝子、選択マーカー、抗生物質選択マーカー、標的化配列、ペプチド精製タグ、若しくはアクセサリー遺伝子、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されないエレメントも含有するであろう。

【0033】

核酸又は核酸分子は、異なるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする１つ以上の配列を含むことができる。これらの１つ以上の配列は、同じ核酸若しくは核酸分子内で隣接して、あるいは例えば、リンカー、リピート、若しくは制限酵素部位間の余分な核酸と、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００個の塩基長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の長さである任意の他の配列と、結合することができる。本明細書で使用される核酸に関する「下流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の前の配列の３’末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「上流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の後続の配列の５’末端の前にある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「グループ化」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、直接、あるいは例えば、リンカー、リピート、若しくは制限酵素部位間の余分な核酸、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００個の塩基長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の長さである任意の他の配列とのいずれかで近接して生じるが、一般に、機能的若しくは触媒的ポリペプチド、タンパク質、又はタンパク質ドメインをコードする間にある配列とは生じない、２つ以上の配列を指す。

【0034】

本明細書に記載の核酸は、核酸塩基を含む。一次、標準、天然、又は未修飾の塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルである。他の核酸塩基としては、プリン、ピリミジン、修飾された核酸塩基、５－メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ブロモウラシル、イソグアニン、イソシトシン、アミノアリル塩基、色素標識塩基、蛍光塩基、又はビオチン標識塩基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から構成される高分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質の多くの機能は当該技術分野において知られており、酵素、構造、輸送、防御、ホルモン、又はシグナル伝達が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、常にではないが、多くの場合、核酸テンプレートを使用してリボソーム複合体によって生物学的に産生されるが、化学合成も利用できる。核酸テンプレートを操作することにより、２つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の置換、欠失、短縮、付加、複製、又は融合などのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質変異を実行することができる。２つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のこれらの融合は、同じ分子内で隣接して、あるいは、例えば、リンカー、リピート、エピトープ、若しくはタグ間の余分なアミノ酸、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００個の塩基長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の長さである任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「下流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、前の配列のＣ末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「上流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、後続の配列のＮ末端の前にある配列を指す。

【0036】

本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、又は材料の「純度」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量と比較した物質、化合物、又は材料の実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物、又は材料は、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％純粋であり得、その間の全ての小数を含む。純度は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞破片、小分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクル、若しくは汚染物質、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない望ましくない不純物の影響を受ける場合がある。いくつかの実施形態では、物質、化合物、又は材料は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、プラスミドＤＮＡ、汚染ウイルス、プロテアソーム、宿主細胞培養構成要素、プロセス関連構成要素、マイコプラズマ、発熱物質、細菌内毒素、及び外来性感染性因子を実質的に含まない。純度は、電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、キャピラリ電気泳動、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、クロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィ、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、分光法、ＵＶ－可視分光法、赤外線分光法、質量分析法、核磁気共鳴、重量測定、若しくは滴定、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない技術を使用して測定することができる。

【0037】

本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、又は材料の「収率」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される総量に対する物質、化合物、又は材料の実際の総量を指す。例えば、物質、化合物、又は材料の収率は、予想される総量の８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であり、その間の全ての小数を含む。収率は、反応又はプロセスの効率、望ましくない副反応、分解、投入物質、化合物、若しくは材料の品質、又は生産の任意の工程中での所望の物質、化合物、若しくは材料の損失によって影響を受ける場合がある。

【0038】

本明細書で使用される「腸オルガノイド」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、生物の小腸の多くの特性を提示する三次元細胞構造体を指す。いくつかの実施形態では、腸オルガノイドは、ヒト細胞に由来するものに関し、ヒト小腸の特性を示す。しかしながら、他の哺乳動物からの腸オルガノイドも包含される。本明細書で使用される腸オルガノイドは、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞）又はその中間体（例えば、胚体内胚葉）に由来し、ここで、多能性幹細胞を胚体内胚葉、次いで後腸内胚葉（スフェロイドの形態であってもよい）、最終的に腸オルガノイドに分化させるプロセスは、天然に発生した腸に似た組成、構造、及び機能を有する細胞構造体をもたらす。本明細書で使用される腸オルガノイドと、成体腸上皮に由来する細胞構造体であるエンテロイドと、非多能性成体腸幹細胞から作製される他のいわゆるオルガノイドとの間の著しい差異は、本明細書で使用される腸オルガノイドが上皮及び間葉の両方を含むことである。間葉は上皮に対して重要な支持的役割を果たし、腸オルガノイドの生存能力及び頑強な機能を大幅に増強する。本明細書で使用される腸オルガノイドは、正常な腸に非常に似た上皮絨毛様巻き込みを有する管腔、及び蠕動挙動を示し得る。多能性幹細胞からの分化プロセスの結果として、本明細書で使用される腸オルガノイドはまた、エンテロサイト、杯細胞、パネート細胞、及び腸内分泌細胞を含む特殊化された腸細胞型も含む。本明細書での使用に好適な腸オルガノイドの実施形態を開示する参考文献としては、国際公開第２０１１／１４０４４１号、同第２０１６／０６１４６４号、同第２０１８／２００４８１号、同第２０２０／１６０３７１号、及び同第２０２１／０３０３７３号が挙げられ、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0039】

本明細書で使用される「結腸オルガノイド」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、生物の結腸の多くの特性を提示する三次元細胞構造体を指す。いくつかの実施形態では、結腸オルガノイドは、ヒト細胞に由来するものに関し、ヒト結腸の特性を示す。しかしながら、他の哺乳動物からの結腸オルガノイドも包含される。本明細書で使用される結腸オルガノイドは、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞）又はその中間体（例えば、胚体内胚葉）に由来し、ここで、多能性幹細胞を胚体内胚葉、次いで後腸内胚葉（スフェロイドの形態であってもよい）、最終的に結腸オルガノイドに分化させるプロセスは、天然に発生した結腸に似た組成、構造、及び機能を有する構造体をもたらす。本明細書で使用される結腸オルガノイドと、成体結腸上皮に由来する細胞構造体であるコロノイドと、非多能性成体結腸幹細胞から作製される他のいわゆるオルガノイドとの間の著しい差異は、本明細書で使用される結腸オルガノイドが上皮及び間葉の両方を含むことである。間葉は上皮に対して重要な支持的役割を果たし、結腸オルガノイドの生存能力及び頑強な機能を大幅に増強する。本明細書で使用される結腸オルガノイドは、陰窩を有するが、絨毛様構造を実質的に含まない管腔を示し得る。多能性幹細胞からの分化プロセスの結果として、本明細書で使用される結腸オルガノイドはまた、多数の杯細胞（腸オルガノイドと比較して）及び結腸腸内分泌細胞を含む特殊化された結腸細胞型を含むが、パネート細胞を実質的に含まない。本明細書での使用に好適な結腸オルガノイドの実施形態を開示する参考文献としては、国際公開第２０１８／１０６６２８号が挙げられ、それは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0040】

本明細書で使用される「断片化」、「断片化された」、「解離」、及び「解離された」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、解離されたオルガノイドの全て又は大部分がインタクトかつ健康な細胞を含むように、細胞を過度に剪断又は損傷することなく、単一細胞及び生存可能な多細胞構造体、断片、又は凝集塊の集団を作製するためのオルガノイド又は他の三次元多細胞構造体の部分的又は完全な断片化又は解離を指す。したがって、「断片化された」などは、一般に、例えば、遊離した細胞内内容物又は非生存小胞などの単一細胞の非生存細胞内構成要素又は断片を指さないが、これらの構成要素は、細胞の自然なアポトーシス又はオルガノイドの解離中の意図しない損傷によって断片化されたオルガノイド組成物の実施形態において存在し得る。オルガノイドの断片化又は解離は、当該技術分野において一般的に知られている様々な方法で行うことができる。断片化又は解離のプロセスは、得られた細胞の一部が、単一細胞としてではなく、小さい多細胞凝集塊／断片として見出されるようなものであり得る。単一細胞間で多細胞凝集塊／断片を含む解離細胞の集団が、本明細書での使用のために企図される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団又は組成物は、多細胞凝集塊／断片として排他的に存在する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団又は組成物は、多細胞凝集塊／断片を含まない単一細胞として排他的に存在する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団又は組成物は、主に（例えば、細胞の７０％、８０％、又は９０％超）多細胞凝集塊／断片であり、比較的少ない単一細胞を含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団又は組成物は、単一細胞及び多細胞凝集塊／断片の混合物として存在する。

【0041】

本明細書で使用される「酵素的解離」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、１つ以上の酵素の触媒活性を使用するオルガノイド又は他の三次元多細胞構造体の断片化又は解離を指す。当該技術分野において一般的に周知のプロセスである酵素的解離は、通常、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）、又は表面若しくは細胞間結合への付着に関与する他の分子に特異的な酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）の使用を含む。

【0042】

本明細書で使用される「機械的解離」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、機械的力を使用するオルガノイド又は他の三次元多細胞構造体の断片化又は解離を指す。当該技術分野において一般的に周知のプロセスである機械的解離は、例えば、ピペット、ニードル、マイクロ流体チャネルなどの形態であってもよい狭い径のチャネルを通した粉砕によって達成されてもよい。

【0043】

本明細書で使用される「多細胞凝集塊」、「細胞の凝集塊」、「多細胞断片」、「多細胞オルガノイド断片」などの用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、天然に産生される細胞外マトリックスなどの付着力によって収集される細胞を指し、一般に、これらの細胞の収集物は、単一の実体として（例えば、水性懸濁液内を）移動する。これらの多細胞凝集塊又はオルガノイド断片は、本明細書に記載されるように、古典的な酵素的及び／又は機械的解離手段によるオルガノイド及び／又はエンテロイドの解離によって生成される。したがって、当業者は、これらの解離手段によって生成された多細胞凝集塊／断片のおよそのパラメータ（例えば、凝集塊／断片当たりの細胞数、サイズ、直径、体積、最大寸法など）を求めることができる。例えば、機械的解離のために使用される狭い径のチャネルの径サイズは、凝集塊／断片の得られるサイズに影響を及ぼし得る。これらのパラメータは、顕微鏡法又はフローサイトメトリーなどの従来の方法によって定量化することができる。また本明細書で考察されるように、これらの「多細胞断片」は、オルガノイドなどのより大きい三次元細胞構造体の断片化又は分化に由来する生細胞のグループを指し、細胞以下の構成要素を指さないが、これらの細胞以下の構成要素は、より大きい三次元細胞構造体の断片化又は解離の方法に起因して組成物中に存在し得る。

【0044】

本明細書の開示に適用されるように、オルガノイド及び／又はエンテロイドの解離から作製された多細胞凝集塊／断片は、凝集塊／断片当たりの細胞数に関して定量化することができる。いくつかの実施形態では、多細胞凝集塊／断片は、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、若しくは１０^６細胞であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の細胞数のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞数、例えば、１０^２～１０^６細胞、１０^２～１０^４細胞、１０^４～１０^６細胞、又は１０^３～１０^５細胞である細胞数を含み得る。いくつかの実施形態において本明細書で開示されているものに適用されるように、オルガノイド及び／又はエンテロイドの解離から作製される多細胞凝集塊／断片は、多細胞凝集塊／断片のおよその直径（又はより一般的には、不規則に細胞化された凝集塊／断片の最大寸法の長さ）に関して定量化することができる。いくつかの実施形態では、多細胞凝集塊／断片は、直径（又は最大寸法の長さ）が、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、若しくは４００μｍであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲の間の任意の直径（又は最大寸法の長さ）、例えば、１００～４００μｍ、１００～２５０μｍ、１５０～３００μｍ、２００～４００μｍ、又は２００～２５０μｍである、およその直径及び／又は最大寸法を有し得る。

【0045】

本明細書で使用される「粘膜」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、胃腸管の最も内側の層を指す。上皮は、粘膜の最も内側の層であり、上皮細胞及び杯細胞などの他の特殊化された細胞が見出される場所である。上皮はまた、腸の絨毛構造を形成する。上皮は、固有層と呼ばれる結合組織、及び平滑筋の薄層によって囲まれている。

【0046】

本明細書で使用される「筋層」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、胃腸管の筋固有層を指す。筋層は、腸及び結腸の蠕動挙動を調節し、発生中の新生腸管の間葉層に由来する。

【0047】

本明細書で使用される「領域性」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、ある細胞型から別の細胞型を区別する品質及び特徴を指す。腸及び結腸（及び他の胃腸器官）の文脈において、両方の器官は、同じ胚体内胚葉に由来するが、早期の特定化は、２つの器官及びそれらの機能に相応する構成細胞の適切な発生及び分化をもたらす。その結果、腸組織は、結腸組織とは異なる領域性を示す。本明細書で示されるように、腸傷害モデルにおいて生着のために使用される腸及び結腸オルガノイドは、異なる器官（例えば、宿主結腸組織への腸オルガノイド又は宿主腸組織への結腸オルガノイド）の細胞層への取り込み後であっても、それぞれの品質を保持する。

【0048】

本明細書で使用される「腸バリア」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、栄養素の交換を依然として可能にしながら、胃腸管の管腔内内容物を周囲の組織及び循環系から分離する細胞性及び粘膜バリアを指す。このバリアは、上皮の細胞間の細胞内接合によって媒介される。腸損傷中、このバリアは破壊され得、腸の異常な機能、潜在的に病原性微生物又は抗原の身体への通過、並びに血液及び分子の管腔への漏出をもたらす。

【0049】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、用いられる投与量及び濃度で曝露されている細胞若しくは哺乳動物に対して無毒であるか、又は許容可能なレベルの毒性を有する担体、賦形剤、及び／又は安定剤を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される」「希釈剤」、「賦形剤」、及び／又は「担体」は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ヒト、ネコ、イヌ、又は他の脊椎動物宿主への投与と適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図している。典型的には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、ヒト並びにネコ及びイヌなどの非ヒト哺乳動物を含む動物で使用するために、連邦政府、州政府の規制当局、若しくは他の規制当局によって承認されたか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に列挙された希釈剤、賦形剤、及び／又は担体である。希釈剤、賦形剤、及び／又は「担体」という用語は、医薬組成物が投与される際に用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指すことができる。そのような医薬希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、石油、動物、植物又は合成由来のものを含む、水及び油などの無菌液体であり得る。水、生理食塩水、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液は、特に注射可能な溶液用に、液体希釈剤、賦形剤、及び／又は担体として用いることができる。好適な医薬希釈剤及び／又は賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。生理学的に許容される担体の非限定的な例は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体はまた、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、アミノ酸、グルコース、マンノース、又はデキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）のうちの１つ以上を含み得る。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤などの形態をとることができる。製剤は、典型的には、投与様式に適合している。

【0050】

抗凍結剤は、大きい氷の結晶の形成を防止することによって、低温凍結保存の効率及び収率を改善するための、細胞組成物添加剤である。抗凍結剤としては、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、トレハロース、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、グリセロール３－リン酸、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、スクロース、トリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、又はヒドロキシエチルデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。抗凍結剤は、細胞の解凍後の生存率を高めるための栄養素（例えば、アルブミン、血清、ウシ血清、ウシ胎児血清［fetal calf serum、ＦＣＳ］）などの他の構成要素を含む凍結保存培地の一部として使用され得る。これらの凍結保存培地において、少なくとも１つの抗凍結剤は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下である濃度、あるいは前述の数のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され得る。

【0051】

望ましい特性を有する追加の賦形剤としては、保存剤、アジュバント、安定剤、溶媒、緩衝液、希釈剤、可溶化剤、洗浄剤、界面活性剤、キレート剤、抗酸化剤、アルコール、ケトン、アルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）、クエン酸、塩、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム糖、デキストロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、ソルビトール、セルロース、血清、アミノ酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、オクチルフェノールエトキシレート、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、ゼラチン、エステル、エーテル、２－フェノキシエタノール、尿素、又はビタミン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの賦形剤は、血清、アルブミン、オボアルブミン、抗生物質、不活性化剤、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、β－プロピオラクトン、ゼラチン、細胞破片、核酸、ペプチド、アミノ酸、又は成長培地構成要素又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、製造プロセスからの残留量又は汚染物質であり得る。賦形剤の量は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるパーセンテージ、又は前述の数のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の重量パーセンテージで組成物中に見出され得る。

【0052】

「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、鎮痛剤、治療剤、他の材料などを含むがこれらに限定されない、組成物又は賦形剤の比較的非毒性の無機及び有機酸又は塩基付加塩を含む。薬学的に許容される塩の例としては、塩酸及び硫酸などの鉱酸に由来するもの、及びエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などの有機酸に由来するものが挙げられる。塩の形成のために好適な無機塩基の例としては、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛などの水酸化物、炭酸塩、及び重炭酸塩が挙げられる。塩はまた、非毒性であり、そのような塩を形成するのに十分強いものを含む、好適な有機塩基で形成され得る。例えば、そのような有機塩基のクラスには、メチルアミン、ジメチルアミン、及びトリエチルアミンを含む、モノ－、ジ－、及びトリアルキルアミン、モノ－、ジ－、及びトリエタノールアミンを含む、モノ－、ジ－、又はトリヒドロキシアルキルアミン、グリシン、アルギニン、及びリジンを含む、アミノ酸、グアニジン、Ｎ－メチルグルコサミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｌ－グルタミン、Ｎ－メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、トリヒドロキシメチルアミノエタンが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0053】

適切な製剤は、選択した投与経路によって異なる。本明細書に記載の化合物の製剤及び投与のための技法は、当業者に知られている。化合物を投与する複数の技法が、経腸、経口、直腸、局所、舌下、口腔、耳内、硬膜外、皮内、エアロゾル、非経口送達（筋肉内、皮下、動脈内、静脈内を含む）、門脈内、関節内、皮内、腹膜、髄内注射、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注射を含む当該技術分野に存在し、これらに限定されない。医薬組成物は、一般に、特定の意図された投与経路に合わせて調整されるであろう。

【0054】

本明細書で使用される場合、「担体」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、細胞、組織及び／又は身体器官への化合物の通過、送達、及び／又は取り込みを促進する化合物、粒子、固体、半固体、液体、又は希釈剤を指す。

【0055】

本明細書で使用される場合、「希釈剤」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、薬理学的活性を欠くが薬学的に必要又は望ましい場合がある医薬組成物中の成分を指す。例えば、希釈剤を使用して、その質量が製造及び／又は投与するには小さすぎる強力な薬物のバルクを増加させることができる。それはまた、注射、摂取又は吸入によって投与される薬物の溶解のための液体であり得る。当該技術分野における希釈剤の一般的な形態は、ヒトの血液の組成を模倣するリン酸緩衝生理食塩水などであるが、これに限定されない緩衝水溶液である。

【0056】

本明細書の開示は、多くの実施形態を説明するために肯定的な言葉を使用している。本開示はまた、物質若しくは材料、方法工程及び条件、プロトコル、又は手順などの、主題が完全に又は部分的に除外される実施形態を含む。

【0057】

本明細書で使用される「ｗ／ｗ％」又は「重量／重量％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、組成物の全重量に対する成分又は薬剤の重量に１００を掛けたものに関して表されたパーセンテージを指す。本明細書で使用される「ｖ／ｖ％」又は「体積／体積％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、組成物の全液体体積に対する化合物、物質、成分又は薬剤の液体体積に１００を掛けたものに関して表されたパーセンテージを指す。

【0058】

幹細胞
本明細書で使用される「全能性（totipotent）幹細胞」（全能性（omnipotent）幹細胞としても知られている）という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、胚性及び胚外細胞型へと分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子及び精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数分割によって産生される細胞も全能性である。

【0059】

本明細書で使用される「胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳＣ）」という用語は、一般にＥＳ細胞とも略され、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、多能性であり、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本開示の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞を包含するために広義で使用される場合がある。

【0060】

本明細書で使用される「多能性幹細胞（pluripotent stem cell、ＰＳＣ）」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、身体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のうちのいずれかに由来する細胞へと分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内部細胞塊細胞の子孫であり得るか、又はある特定の遺伝子の発現を強制することによって、非多能性細胞、例えば成体体細胞の誘導によって得られてもよい。多能性幹細胞は、任意の好適な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例には、ヒト、げっ歯類、ブタ、及びウシを含む哺乳動物の供給源が挙げられる。

【0061】

本明細書で使用される「人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）」という用語は、一般にｉＰＳ細胞とも略され、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、ある特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、成体体細胞などの通常は非多能性細胞から人工的に導かれる多能性幹細胞の一種を指す。理論的には、人工多能性幹細胞は、任意のタイプの成体体細胞から再プログラムすることができる。典型的には、単離することが比較的容易である体細胞を使用して、ｉＰＳＣへと再プログラムする。例えば、皮膚線維芽細胞は皮膚生検によって対象から単離することができ、末梢血単核細胞は対象の末梢血から単離することができる。ｈｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣを指す。当該技術分野において知られているいくつかの方法では、ｉＰＳＣは、ある特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞などの非多能性細胞へのトランスフェクションによって導かれ得る。トランスフェクションは、レトロウイルス又はレンチウイルスなどのウイルスを使用してウイルス形質導入によって達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）及びＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子も誘導の効率を向上させ得る。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的及び生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間、又はレポーター遺伝子及び抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用される場合、ｉＰＳＣは、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、及びヒト人工多能性幹細胞を含む。いくつかの方法では、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃを使用して多能性幹細胞にヒト線維芽細胞を形質転換するためにレトロウイルス系が使用される。他の方法では、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８で形質転換するためにレンチウイルス系が使用される。ｉＰＳＣにおいて発現が誘導される遺伝子としては、Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、及びＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｆｔｈ１１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、若しくはＥ－カドヘリン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。

【0062】

本明細書で使用される「前駆細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含し、方法を通じて、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、又は１つ以上の特殊化された細胞型へと分化する能力を獲得する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性であるか、又は多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、全能性（totipotent）（又は全能性（omnipotent））幹細胞、多能性幹細胞（人工又は非人工）、多分化能性（multipotent）幹細胞、少能性（oligopotent）幹細胞、及び単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、胚、乳児、小児、又は成人由来であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、遺伝子操作又はタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。前駆細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性がん腫細胞（embryonic carcinoma cell、ＥＣ）、及び胚盤葉上層幹細胞（epiblast stem cell、ＥｐｉＳＣ）が挙げられる。

【0063】

いくつかの実施形態では、１つの工程は、多能性であるか又は多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を導くための方法は、当該技術分野において周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Human embryonic stem cells H9、Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本出願に記載の例示的な実施形態で使用されるが、本明細書に記載の方法及び系が、任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解されるであろう。

【0064】

本開示による実施形態において使用され得る追加の幹細胞としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のＨｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒによってホストされるデータベース、Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣセルバンク、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのテクニオン（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）、並びにＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによってホストされるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅによって提供されるか、又はそれらに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示による実施形態において使用され得る例示的な胚性幹細胞としては、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣＯｌ（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（ＨＩ）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト多能性細胞株としては、ＴｋＤＡ３－４、１２３１Ａ３、３１７－Ｄ６、３１７－Ａ４、ＣＤＨ１、５－Ｔ－３、３－３４－１、ＮＡＦＬＤ２７、ＮＡＦＬＤ７７、ＮＡＦＬＤ１５０、ＷＤ９０、ＷＤ９１、ＷＤ９２、Ｌ２００１２、Ｃ２１３、１３８３Ｄ６、ＦＦ、又は３１７－１２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

発生生物学では、細胞分化は、より特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、「有向分化」という用語は、より特殊化されていない細胞が特定の特殊化された標的細胞型になるプロセスを記載する。特殊化された標的細胞型の特殊性は、最初の細胞の運命を定義又は改変するために使用することができる、任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法としては、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、及び核酸処理が挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

いくつかの実施形態では、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子を輸送し、胚性幹細胞と実質的に同一のｉＰＳＣをもたらすことができる。アデノウイルスは、それ自体の遺伝子を標的の宿主のうちのいずれとも組み合わせないため、腫瘍を創出する危険性が排除される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを生成するために非ウイルスベースの技術が用いられる。いくつかの実施形態では、非常に低い効率ではあるが、いずれのウイルストランスフェクション系も全く使用せずに、プラスミドを介して再プログラミングを達成することができる。他の実施形態では、タンパク質の直接送達を使用してｉＰＳＣを生成し、したがってウイルス又は遺伝子修飾の必要性を排除する。いくつかの実施形態では、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である：ポリアルギニンアンカーを介して細胞に運ばれるある特定のタンパク質による細胞の繰り返し処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態では、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによって多能性誘導遺伝子の発現を増加させることもできる。

【0067】

本明細書で使用される「胚体内胚葉」又は「ＤＥ」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、腸管並びに食道、胃、小腸、結腸、肝臓、及び膵臓を含む結果として生じる胃腸器官を生じる発生細胞型を指す。前方ＤＥは、前腸、並びに肝臓及び膵臓を含むそれに関連する器官を形成し、後方ＤＥは、中腸及び後腸を形成し、これは、小腸及び大腸、並びに泌尿生殖器系の部を形成する。ＤＥのマーカーとしては、ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２が挙げられる。発生中、Ｗｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路は、ＤＥの前方パターン形成と後方パターン形成との間の領域化を確立する。多能性幹細胞は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、又はノーダルなどの１つ以上のトランスフォーミング成長因子β（transforming growth factor β、ＴＧＦβ）成長因子ファミリーメンバーとともに多能性幹細胞を培養することによって、胚体内胚葉に分化させることができる。以前に調査されたように、胚体内胚葉は、下流の胃腸器官に似た三次元オルガノイド構造体に分化することができる。

【0068】

本明細書で使用される「フィーダ細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、成長因子を培地に分泌するか、又は細胞表面に表示することなどによって、多能性幹細胞の成長を支援する細胞を指す。フィーダ細胞は一般に付着細胞であり、成長が停止する場合もある。例えば、フィーダ細胞は、照射（例えば、ガンマ線）、マイトマイシン－Ｃ処理、電気パルス、又は穏やかな化学固定（例えば、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドによる）によって成長が停止される。しかしながら、フィーダ細胞は、必ずしも成長を停止するとは限らない。フィーダ細胞は、成長因子の分泌、細胞表面への成長因子の表示、培養培地の無害化、又は細胞外マトリックスタンパク質の合成などの目的に役立ち得る。いくつかの実施形態では、フィーダ細胞は、支持された標的幹細胞に対して同種又は異種であり、これは、下流の用途に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、フィーダ細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダ細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダ細胞は、マウス線維芽細胞、マウス胚性線維芽細胞、マウスＳＴＯ細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＳＮＬ ７６／７細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト前皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト脂肪間葉系細胞、ヒト骨髄間葉系細胞、ヒト羊膜間葉系細胞、ヒト羊膜上皮細胞、ヒト臍帯間葉系細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、又はヒト成人ファロピウス管上皮細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダ細胞から調製された馴化培地は、フィーダ細胞共培養の代わりに、又はフィーダ細胞共培養と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、フィーダ細胞は、標的幹細胞の増殖中には使用されない。

【0069】

腸及び結腸オルガノイド並びに作る方法
本明細書で開示されている腸及び結腸オルガノイドは、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞）又はその中間体（例えば、胚体内胚葉）からの分化プロセスによって産生され、腸又は結腸の特殊化された細胞型とともに、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む。腸及び結腸オルガノイドを作るための例示的な方法は、米国特許第９，７１９，０６８号及び同第１０，１７４，２８９号、並びにＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１６／０６１４６４号、同第ＷＯ２０１８／１０６６２８号、同第ＷＯ２０１８／２００４８１号、同第ＷＯ２０１９／１２６６２６号、同第ＷＯ２０２０／１６０３７１号、同第ＷＯ２０２１／０３０３７３号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0070】

いくつかの実施形態では、腸及び結腸オルガノイドは、胚体内胚葉細胞の培養によって分化する。これらの胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉を、ノーダル、アクチビン、及び／又は成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーのＢＭＰサブグループと接触させることによって、多能性細胞から分化させることができる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞を、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、多能性幹細胞を胚体内胚葉に分化させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞をアクチビンＡと接触させて、多能性幹細胞を胚体内胚葉に分化させる。

【0071】

胚体内胚葉をＦＧＦ／Ｗｎｔ誘導性後方内胚葉パターニングに更に供して、後腸特異化に向けることができる。

【0072】

いくつかの実施形態では、腸及び結腸オルガノイドを産生するために、まず、胚体内胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子及びＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子と接触させて、胚体内胚葉を後腸内胚葉に後方化する。この培養プロセス中、後腸内胚葉は単層として成長するが、懸濁液中で後腸スフェロイドと呼ばれる細胞の凝集塊として自発的に出芽する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、若しくはＷｎｔ１６、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ３ａである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子として作用するグリコーゲン合成酵素キナーゼ－３（glycogen synthase kinase-3、ＧＳＫ３）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５（ＦＧＦ１９、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９）、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ４である。産生された後腸内胚葉及び後腸スフェロイドは、ＣＤＸ２＋間葉に囲まれたＣＤＸ２＋分極上皮を含み、前腸内胚葉を示すＡｌｂ及びＰｄｘ１を欠く。

【0073】

懸濁液中で操作され、三次元培養のために基底膜マトリックス（例えば、マトリゲル）中に包埋され得る後腸内胚葉又は後腸スフェロイドの形成後、ＢＭＰシグナル伝達経路は、異なる領域型の腸の形成を調節する。後腸段階後のＢＭＰシグナル伝達の阻害は、近位腸細胞の運命（十二指腸／空腸）を促進する。後腸段階後のＢＭＰシグナル伝達の活性化は、より遠位の腸細胞の運命（盲腸／結腸）を促進する。いくつかの実施形態では、後腸内胚葉をＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させて、後腸内胚葉を腸オルガノイドに分化させる。いくつかの実施形態では、後腸内胚葉をＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させて、後腸内胚葉を結腸オルガノイドに分化させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、若しくはＩＤＥ２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ２を含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、若しくはＳＢ４３１５４２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ノギンを含む。

【0074】

解離されたオルガノイド組成物
上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む解離細胞集団を含む細胞懸濁液が、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は腸及び／又は結腸オルガノイドから解離され、腸及び／又は結腸オルガノイドは上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む。いくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドは、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来している。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドは、対象に対して同種である。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドは、対象からの細胞に由来しており、腸及び／又は結腸オルガノイドは、対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドは、対象から単離された細胞に由来する人工多能性幹細胞に由来している。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、腸及び／又は結腸オルガノイドの酵素的解離及び／又は機械的解離によって調製される。いくつかの実施形態では、酵素的解離は、腸及び／又は結腸オルガノイドを、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせで解離させることを含む。いくつかの実施形態では、機械的解離は、腸及び／又は結腸オルガノイドを、連続的により狭くなる径のチャネルに通すことを含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、ＭＫＩ６７＋増殖性細胞を含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージ、例えば、１０～５０％、４０～８０％、７０～９５％、８５～９５％、又は３０～９５％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、８５～９５％、８５～９０％、９０～９５％、又は８８～９２％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の細胞の残りのパーセンテージは、上皮細胞型から構成される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージは、０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、若しくは７５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージ、例えば、０～７５％、０～２５％、０～１５％、５～２５％、５～１５％、１０～５０％、又は５０～７５％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージは、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、若しくは１５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、５～１５％、５～１０％、１０～１５％、又は８～１２％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の細胞の残りのパーセンテージは、間葉系細胞型から構成される。

【0075】

いくつかの実施形態では、細胞懸濁液中の解離細胞集団の濃度は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度、例えば、１０^５～１０^１１、１０^５～１０^８、１０^９～１０^１１、又は１０^６～１０^１０細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞濃度は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度、例えば、１０^５～１０^１１、１０^５～１０^８、１０^９～１０^１１、又は１０^６～１０^１０細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞濃度は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度、例えば、１０^５～１０^１１、１０^５～１０^８、１０^９～１０^１１、又は１０^６～１０^１０細胞／ｍＬである。

【0076】

いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、解離細胞集団中の総細胞の３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、３０～１００％、５０～１００％、７５～１００％、９０～１００％、３０～７５％、又は５０～９５％であるパーセンテージの多細胞断片から構成される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の多細胞断片の形態である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の多細胞断片の形態である。

【0077】

いくつかの実施形態では、解離細胞集団の間葉系細胞型は、ビメンチン（ＶＩＭ）及び／又はエラスチンミクロフィブリルインターフェーサ１（ＥＭＩＬＩＮ１）を発現する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団の上皮細胞型は、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）及び／又は尾側型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）を発現する。

【0078】

有効量の本明細書で開示されている細胞懸濁液及び／又は解離細胞集団のいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む医薬組成物も、本明細書で開示されている。

【0079】

使用方法
いくつかの実施形態では、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む、本明細書で開示されているような、又はそうでなければ当該技術分野において知られている腸及び結腸オルガノイドが、本明細書で開示されている腸損傷を修復する方法において使用される。

【0080】

本明細書で提供されるように、方法は、腸損傷を治療することを対象とする。腸損傷の治療は、損傷した腸組織の健康な状態への回復若しくは緩和、又は腸損傷の進行若しくは発生の遅延、阻害、予防、若しくは抑止を包含する。また、腸損傷に関連する１つ以上の症候の改善も包含される。本明細書において、腸損傷は、腸組織の傷害（injured）を受けた状態を指す場合があり、これは、必ずしもではないが、機械的及び／又は化学的傷害（insult）に起因する場合があり、必ずしもではないが、腸組織のアポトーシス及び／又は壊死挙動に関連する場合がある。他の形態の腸損傷及びその症候も想定される。

【0081】

腸損傷の治療を必要とする対象において腸損傷を治療する方法が、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、方法は、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団を、対象の腸の管腔壁に投与することを含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団の間葉系細胞型は、ビメンチン（ＶＩＭ）及び／又はエラスチンミクロフィブリルインターフェーサ１（ＥＭＩＬＩＮ１）を発現する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団の上皮細胞型は、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）及び／又は尾側型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）を発現する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは先行するパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージ、例えば、１０～５０％、４０～８０％、７０～９５％、８５％～９５％、又は３０～９５％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞のパーセンテージは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、８５～９５％、８５～９０％、９０～９５％、又は８８～９２％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の細胞の残りのパーセンテージは、上皮細胞型から構成される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージは、０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、若しくは７５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内のパーセンテージ、例えば、０～７５％、０～２５％、０～１５％、５～２５％、５～１５％、１０～５０％、又は５０～７５％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞のパーセンテージは、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、若しくは１５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、５～１５％、５～１０％、１０～１５％、又は８～１２％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の細胞の残りのパーセンテージは、間葉系細胞型から構成される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、細胞懸濁液として投与される。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液中の解離細胞集団の濃度は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度、例えば、１０^５～１０^１１、１０^５～１０^８、１０^９～１０^１１、又は１０^６～１０^１０細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の間葉系細胞型である細胞濃度は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度、例えば、１０^５～１０^１１、１０^５～１０^８、１０^９～１０^１１、又は１０^６～１０^１０細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、解離細胞集団中の上皮細胞型である細胞濃度は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１細胞／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細胞濃度、例えば、１０^５～１０^１１、１０^５～１０^８、１０^９～１０^１１、又は１０^６～１０^１０細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ここで企図される対象の腸は、小腸及び／又は結腸を含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団を対象の腸の管腔壁に投与することは、細胞集団を、腸損傷によって影響を受けた腸の管腔の位置に投与することを含む。いくつかの実施形態では、位置は、腸損傷によって影響を受けた腸に直接隣接するか又はその近くである。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、管腔壁の表面に投与される。

【0082】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、解離細胞集団は、細胞懸濁液として対象の腸の管腔壁に投与される。いくつかの実施形態では、懸濁液は生理食塩水又は乳酸リンゲル溶液などの等張溶液中にある。いくつかの実施形態では、細胞集団を対象の腸の管腔壁に投与することは、非侵襲性又は低侵襲性プロセスによって細胞集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、経腸カテーテル、経鼻カテーテル、又は浣腸によって投与される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、直接管腔内注射によって投与される。

【0083】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドは、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来している。腸及び／又は結腸オルガノイドにおいて、対象に対して同種である。いくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドは、対象から単離された細胞に由来している。いくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドは、対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドは、対象から単離された細胞に由来する人工多能性幹細胞に由来している。いくつかの実施形態では、対象から単離された細胞は、多能性再プログラミングに適した任意の細胞であり得る。使用される多能性再プログラミングに適した一般的な細胞としては、皮膚線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から単離された細胞は、対象からの皮膚線維芽細胞又はＰＢＭＣを含む。

【0084】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団は、腸及び／又は結腸オルガノイドの酵素的解離及び／又は機械的解離によって調製される。いくつかの実施形態では、酵素的解離は、腸及び／又は結腸オルガノイドを、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、若しくはそれらの任意の組み合わせ、又はそうでなければ当該技術分野において知られている任意の他の細胞解離酵素若しくは試薬で解離させることを含む。いくつかの実施形態では、機械的解離は、腸及び／又は結腸オルガノイドを、連続的により狭くなる径のチャネルに通すことを含む。いくつかの実施形態では、チャネルは、ニードル、マイクロ流体チャネル、毛細管、又はチューブであってもよい。いくつかの実施形態では、連続的により狭くなる径のチャネルは、１８ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、若しくは２５ゲージチャネル、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、連続的により狭くなる径のチャネルは、１８ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、及び２５ゲージチャネル、あるいは前述のゲージチャネルのうちのいずれか１つ、２つ、若しくは３つを含む又は欠く一連のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、連続的により狭くなる径のチャネルは、１８ゲージチャネルを含むか、及び／又はそれから始まる。いくつかの実施形態では、連続的により狭くなる径のチャネルは、２０ゲージチャネルを含む。いくつかの実施形態では、連続的により狭くなる径のチャネルは、２５ゲージチャネルを含むか、及び／又はそれで終わる。いくつかの実施形態では、連続的により狭くなる径のチャネルは、１８ゲージ、２０ゲージ、及び２５ゲージチャネルを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。

【0085】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団は、影響を受けた腸表面積１ｍｍ^２当たり５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、若しくは１００００細胞であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の１ｍｍ^２当たりの任意の細胞量、例えば、１ｍｍ^２当たり５０～１００００細胞、１ｍｍ^２当たり５０～５０００細胞、１ｍｍ^２当たり５０～１０００細胞、１ｍｍ^２当たり５０００～１００００細胞、１ｍｍ^２当たり２０００～８０００細胞、又は１ｍｍ^２当たり５００～５０００細胞である濃度で対象に投与される。影響を受けた腸の表面積は、当業者による従来の方法を通じて、例えば、腸の外表面又は内表面のいずれかを巨視的に測定することによって求めることができ、ここで、絨毛突起による表面積の見かけの増加は無視又は考慮され得る。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、腸損傷の改善が観察されるまで複数回にわたって対象に投与される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下である回数にわたって、対象に投与される。

【0086】

．本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、解離細胞集団の細胞は、対象の腸の粘膜及び筋層に組み込む。いくつかの実施形態では、対象の腸に組み込まれた解離細胞集団の細胞は、それらの腸及び／又は結腸の領域性を維持する。いくつかの実施形態では、対象の腸に組み込まれた解離細胞集団の細胞又はその亜集団は、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性平滑筋細胞型に分化する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、対象の腸に組み込み、腸損傷の治癒を促進する増殖マーカーＫＩ６７＋（ＭＫＩ６７＋）増殖性細胞を含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、対象への投与後に、対象の腸における腸バリアを改善する。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、対象への投与後に、対象の腸におけるインタクトな腸バリアの形成を促進する。いくつかの実施形態では、対象の腸に組み込む解離細胞集団のパーセンテージは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、又は先行する値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１０～５０％、４０～８０％、７０～９５％、又は３０～９５％である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団の細胞は、対象の腸の管腔壁の全表面積若しくは損傷した表面積の１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは５０％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の表面積の任意のパーセンテージ、例えば、表面積の１０％～５０％、表面積の１０％～２５％、表面積の２５％～５０％、又は表面積の１５％～３５％である、対象の腸の管腔壁の表面積に組み込む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団からの細胞で構成される修復された腸組織のパーセンテージは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、５０～９９％、５０～７５％、５０～６０％、７５～９９％、又は６５～８５％である。

【0087】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書で開示されている方法を使用して、腸損傷の治療を必要とする対象において腸損傷を治療する。いくつかの実施形態では、腸損傷は、腸潰瘍を含む。いくつかの実施形態では、腸潰瘍は、血液又はタンパク質の腸の管腔への漏出に関連し得る。いくつかの実施形態では、腸損傷は、化学的及び／又は機械的である。いくつかの実施形態では、腸損傷は、胃腸の病気に関連する。いくつかの実施形態では、胃腸の病気は、クローン病、潰瘍性大腸炎、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）又は他の薬剤に関連する腸疾患、放射線誘発性腸疾患、及び結核などの病原性感染に関連する腸疾患から選択される。

【0088】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、腸及び／若しくは結腸オルガノイド又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団は、哺乳動物のものである。いくつかの実施形態では、腸及び／若しくは結腸オルガノイド又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団は、ヒトのものである。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0089】

本明細書で開示されている方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む腸及び／若しくは結腸オルガノイドを作製すること、並びに／又は腸及び／若しくは結腸オルガノイドを解離させて、上皮細胞型及び間葉系細胞型を含む解離細胞集団を作製することを更に含む。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、解離細胞集団中の総細胞の３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であるか、あるいは前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、３０～１００％、５０～１００％、７５～１００％、９０～１００％、３０～７５％、又は５０～９５％であるパーセンテージの多細胞断片から構成される。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の多細胞断片の形態である。いくつかの実施形態では、解離細胞集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の多細胞断片の形態である。いくつかの実施形態では、腸及び／又は結腸オルガノイドは、多能性幹細胞から産生される。腸及び／又は結腸オルガノイドは、本明細書で開示されている方法、又はそうでなければ当該技術分野において知られている方法によって産生されてもよい。

【0090】

本明細書で記載されるように、胃腸の病気の治療を必要とする対象において胃腸の病気を治療する方法における使用のための、腸及び／又は結腸オルガノイドから解離された解離細胞集団、並びにその医薬組成物も、本明細書で開示されている。

【0091】

本明細書に記載のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の、有効量の解離細胞集団若しくは組成物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、若しくはそれらの組み合わせとを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる医薬組成物に関する。本明細書に記載の医薬組成物は、ヒト及び／又は獣医学の用途に好適である。

【0092】

腸損傷の治療における使用のための、本明細書で提供される細胞懸濁液又は医薬組成物も、本明細書で開示されている。

【実施例】

【0093】

本明細書で考察される実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例で更に詳細に開示されており、これらは、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。当業者は、本明細書及び特許請求の範囲に記載されているように、多くの他の実施形態も本開示の範囲内に収まることを理解するであろう。

【0094】

実施例１．腸傷害修復のための解離されたＨＩＯの投与
初期発生及び小腸特異化を模倣するように成長因子を操作することによる、多能性幹細胞からのヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）の生成は、以前に記載されている（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．（２０１１）４７０：１０５－１０９、ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．（２０１１）６：１９２０－１９２８、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１４）２０：１３１０－１３１４）。分化の際に、ＨＩＯは、全ての主要な細胞型を含む複雑な上皮層だけでなく、免疫無防備状態の宿主に移植された場合に、機能的な積層構造を形成する間葉系構成要素も生じる。本明細書では、インビトロでのＨＩＯの治療可能性を評価した。緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰを構成的に発現するように改変されたＨ１胚性幹細胞株を、損傷した腸の前臨床モデルにおける下流異種移植片分析を容易にするために使用した。しかしながら、他の多能性幹細胞、例えば、他の胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞）が使用され得ることが想定される。Ｈ１細胞におけるＧＦＰの構成的発現は、それらの核型に干渉しないことが確認された（図３Ａ）。改変された細胞株を使用前に特徴付け、品質管理基準に合格することを見極めた（図３Ａ～図３Ｂ）。免疫無防備状態のＲａｇ１及びＩｌ２ｇノックアウト（Rag1 and Il2g knockout、ＲＲＧ）ラットを宿主対象として利用して、遠位小腸のブラインドセグメントを外科的に創出し、その後、解離されたＨＩＯ又は移植されたＨＩＯに由来するエンテロイドでの即時再シードの間に化学的及び機械的傷害を受けた（図１Ａ）。実行した外科的手順は、ブラインドエンドツーサイド「Ｙ」セグメント又はループをもたらし、これは、セグメントが宿主の腸管に遠位に排出し得るように、吸収性縫合糸で結ばれた（図４、パネルＡ～Ｅ）。この吸収性縫合糸を使用することにより、ＨＩＯ保持、上皮の回復、及び生着が起こるための短いウィンドウをもたらした。続いて、腸排出及び管腔内容物露出のより生理学的な状態が生じた。傷害は、健康なラット空腸と比較した場合に、組織学的に及びトポグラフィ顕微鏡写真によって観察されるように、露出した間葉を有する上皮が主に剥がれた腸のセグメントをもたらした（図５、パネルＡ～Ｂ）。この手順を受けたいくつかのラットにおいて、１週間以内の早期死亡が観察された。合計で、ラットの６８～７０％が術後１０週の時点まで生存した（図６Ａ）。これは、獣医学的剖検によって示されるように、主に敗血症に起因し、管腔細菌に曝露された場合に、有効な上皮バリア及びトランスロケーションを再確立することができないループにおける傷害の重症度におそらく起因した。

【0095】

術後１０週の時点で、ループを採取し、評価した（図６Ｂ）。培地単独で再シードしたシャムループでは、治癒が組織学的に観察された。ヒト特異的マーカー、Ｋｕ自己抗原、８０ｋＤａ（Ku autoantigen,80kDa、ＫＵ８０）についての免疫組織化学は、シャムループにおいて検出されず、ヒト細胞内容物の不在を示した（図１Ｈ）。観察された治癒は、小腸が固有の回復能力を有すること、並びに上皮の回復及びバリア機能の再確立は、時間が与えられた場合に起こり得ることを例解した。しかしながら、解離されたＧＦＰ ＨＩＯで再シードしたループでは、生存－ＧＦＰを発現する領域が観察され、ループの表面積の平均１６．９３％を構成した（図１Ｂ～図１Ｃ）。ＫＵ８０についての免疫組織化学では、再シードしたループの切開されたＧＦＰ＋領域内への安定したヒト細胞取り込みを明らかにした（図１Ｄ）。ＫＵ８０＋細胞は、腸の厚さ全体にわたって観察された。断片化されたＧＦＰエンテロイドで再シードしたループでは、生存－ＧＦＰを発現する領域も観察されたが、それらは著しくより小さく、平均してループの表面積の１．６８％しか占めなかった（図１Ｅ～図１Ｆ）。再び、ヒト細胞取り込みが、エンテロイド断片で再シードしたループの切開されたＧＦＰ＋領域内で観察され、安定性は、生存－ＧＦＰ発現観察に従って減少した（図１Ｇ）。ここでは、ＫＵ８０＋細胞の生着は、腸上皮に限定された。これらの実験を実行する際に、上皮細胞数のみの間で識別するのではなく、細胞の総数に対して再シードされた細胞含量を標準化した（図１０Ａ～図１０Ｄ）。細胞療法の供給源としてのＨＩＯ及びエンテロイドの両方の有効性を比較した後、細胞の供給源としての断片化されたＨＩＯの使用のみを継続したが、これは、それらの生着効率の増加、その全層にわたる腸の回復への寄与の拡大、したがって臨床用途のより大きい可能性のためである。

【0096】

断片化されたＧＦＰ ＨＩＯで再シードしたループ内のヒト細胞の寄与の程度を更に実証するために、ヒトマーカーＫＵ８０について染色されたＧＦＰ＋ループの領域に対してタイルスキャンを実行した（図２Ａ）。ヒト細胞の寄与は、粘膜及び筋層内で観察され、これは、適切な輪走及び縦走筋層の整列を示した（図２Ｂ）。筋層のヒト化は、ＧＦＰ及びアクチンアルファ２、平滑筋（ＡＣＴＡ２）の両方に対する免疫染色によって更に強調され、繊維は、シャム（細胞内容物のない培地で再シードしたループ）及び再シードしたループの両方において垂直に示されたが、ＧＦＰの存在は、再シードしたループにおいてのみ観察された（図２Ｃ）。臨床的に、これは、粘膜を越えて損傷をもたらす状態（例えば、非治癒性潰瘍及び瘻孔形成性クローン病）に対する潜在的な細胞療法の用途を広げるので、重要な特徴である。

【0097】

宿主の神経支配及び運動性を含む様々な機能を担う腸神経系（enteric nervous system、ＥＮＳ）に関する腸傷害モデルへのＨＩＯの生着の効果を評価した。腸筋神経叢が２つの新たに形成されたヒト筋層の界面に残っているか否か、又はそれが細胞増殖及びリモデリングプロセス中に置き換えられた否かを評価した。間葉を含む追加の細胞型を含む本明細書のＨＩＯではなく、上皮のみ又はエンテロイド構造体を使用した場合のＥＮＳに対する筋層ヒト化に対する効果は未知であったので、これは考慮すべき重要な一面であった。汎ニューロンマーカーであるチューブリンベータ３クラスＩＩＩ（ＴＵＢＢ３）に対する免疫染色により、宿主の神経支配がヒト細胞の再構成後に置き換えられなかったことが確認され、このことは、その機能も保存されていることを示唆している（図２Ｄ）。

【0098】

実施例２．再シードしたＨＩＯは、傷害治癒中に早期生着を受け、領域性を維持する
再シードしたＨＩＯによって１０週までに腸治癒への著しい寄与が観察されているので、生着のより早期段階を評価するために、７日の時点で追加の実験を実行した。ＫＵ８０についての免疫組織化学では、再び、シャムループにおけるヒト細胞の寄与の不在を明らかにしたが、ヒト細胞の寄与は、７日目で、再シードしたループの上皮及び間葉の両方において見出された（図７Ａ）。シャムループにおける上皮構造化のレベルは、再シードしたループにおいて観察されたものほど広範囲ではなかった。更に、増殖マーカーＫＩ６７（ＭＫＩ６７）に対する免疫染色により、シャム手術ループでは、７日の時点での治癒の主な機構が、活発に循環しかつＭＫＩ６７＋である細胞がほとんどない遊走に起因したことを明らかにした（図７Ｂ、左パネル）。しかしながら、再シードしたループでは、ＭＫＩ６７＋細胞がより広く観察され、ＨＩＯ断片が腸の初期生着及び回復中に積極的な役割を果たすことを示した（図７Ｂ、右パネル）。

【0099】

次に、生着したＨＩＯの再生プロセスが、恒常的再生のための上皮幹／前駆体系の後期再構築をもたらすか否かを、タンパク質発現によって判定した。ループにおけるＭＫＩ６７に対する免疫染色は、ヒト空腸対照と同様のありふれた増殖性帯状分布を示した（図７Ｂ）。腸における幹細胞及び前駆細胞に関連する抗アポトーシスタンパク質、オルファクトメジン４（ＯＬＦＭ４）の発現は、ヒト空腸対照において観察される発現パターンと同様に、ループの陰窩様領域内に限定されることが観察された（図７Ｂ）。凝固因子ＩＩＩ、組織因子（Ｆ３）によってマーキングされるように、腸の幹細胞及び上皮へのニッチシグナルの重要な供給源である上皮下テロサイトはまた、ループ及びヒト空腸対照内で同様に上皮に隣接して局在することが観察された（図７Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＨＩＯ由来の新生上皮における上皮幹細胞コンパートメント及びニッチの再出現を支持する。

【0100】

その後、ループのＨＩＯ新生上皮の小腸運命が保存されたか否かを、タンパク質発現によって調べた。近位領域マーカー、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（GATA binding protein 4、ＧＡＴＡ４）に対する免疫染色により、ヒト空腸対照と同様に、ループにおける陽性発現を明らかにした（図８Ａ、左パネル）。抗菌ペプチドであるデフェンシンアルファ５（Defensin Alpha 5、ＤＥＦＡ５）発現によって実証されるように、小腸クリプトに局在する特殊化された分泌細胞であるパネート細胞が検出され、ヒト空腸対照において観察されるように、ループにおいて陰窩様構造体に局在した（図８Ａ、中央パネル）。小腸内の炭水化物消化に関与する酵素、スクラーゼイソマルターゼ（Sucrase Isomaltase、Ｓ１）も観察され、ヒト空腸対照においても見られるように、ループの刷子縁に局在した（図８Ａ、右パネル）。更なる検証として、より遠位の小腸及び結腸に限定されたタンパク質の発現も調査した。遠位領域マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質ＳＡＴＢホメオボックス２（SATB Homeobox 2、ＳＡＴＢ２）に対する免疫染色は、ループでは観察されなかったが、ヒト結腸対照の上皮全体に存在することが見出された（図８Ｂ、左パネル）。主にコロノサイトの頂端膜に局在するカルシウムチャネルである膜貫通４ドメインＡ１２（Membrane Spanning 4-Domains A12、ＭＳ４Ａ１２）は、ループでは観察されなかったが、ヒト結腸対照の上皮全体に存在した（図８Ｂ、中央パネル）。結腸全体にわたるゲル形成粘液であるムチン５Ｂ（ＭＵＣ５Ｂ）もループには存在しなかったが、ヒト結腸対照の杯細胞では観察された（図８Ｂ、右パネル）。まとめると、遠位マーカーの不在とともに近位腸マーカーの正のタンパク質発現は、ループのＨＩＯ新生上皮の領域性が、ＨＩＯ断片の生着及び拡大中に維持されたことを示唆する。

【0101】

実施例３．再シードしたＨＩＯの生着は、インタクトな上皮バリアを形成する
機能的洞察を得るために、ウッシングチャンバアッセイを、生存－ＧＦＰ発現ループ領域及び健康なラット空腸の上皮に対して術後１０週に実行した（吻合部位の近位及びループの外側）（図９Ａ～図９Ｂ）。電気物理的特性を連続的に記録しながら、上皮を一連の化学刺激に曝露した。ループ及びラット空腸上皮の両方は、リアルタイム記録で観察されるように、フォルスコリン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（3-isobutyl-1-methylxanthine、ＩＢＭＸ）、及びブメタニドでのチャレンジに対して応答性であった（図９Ｃ～図９Ｄ）。能動イオン輸送の反映である短絡電流（Ｉ_ｓｃ）の変化は、両グループに適用された各化合物の知られている作用方法と一致した。このことは、新生上皮におけるイオンチャネルの適切な環状アデノシン一リン酸調節及び機能が起こっていたことを実証した。更に、生存－ＧＦＰ発現領域である新生上皮は、健康なラット空腸と比較した場合、フォルスコリン及びＩＢＭＸの両方に対してより高い感受性を実証した。ラット空腸の経上皮電気抵抗（transepithelial electrical resistance、ＴＥＥＲ）のベースライン読み取り値をそれらの確立された範囲内で、測定し、観察した（図９Ｆ）。筋層及び漿膜層を伴わない抵抗値は、ラットの小腸について２０～４５Ω^＊ｃｍ^２であることが以前に実証されている。成人のヒト小腸の場合、ＴＥＥＲ値は、以前に５０～１００Ω^＊ｃｍ^２であると報告されている。ループのＴＥＥＲ値のいくつかは成人のヒト小腸に対して確立されたＴＥＥＲ範囲内に入るが、他のものはより低いことが観察された。この差異は、生着に使用されたＨＩＯの知られている胎児状態又は宿主の管腔内容物とのヒト上皮相互作用の結果と関連し得る。

【0102】

ループの新生上皮の完全性及び安定性を更に評価するために、傍細胞透過性を評価した。フルオレセインイソチオシアネート（Fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）－デキストランを各標本の頂端チャンバに添加し、経時的な蛍光強度の評価のために３０分ごとに側底チャンバからサンプルを収集した（図９Ｇ）。このデータセットから、ＦＩＴＣ－デキストランフラックス値を計算し、グループ間の差は観察されなかった（図９Ｈ）。これは、ループの新生上皮が治癒プロセス中に十分なバリアを確立したことを示す。

【0103】

実施例４．Ｈ１細胞の生体内分布及び潜在的増殖
細胞療法として断片化されたＨＩＯを受けたラット内のＨ１ ＧＦＰ細胞の生体内分布及び潜在的増殖を調査した。術後１０週のラットからの様々なオフターゲット器官からサンプルを収集した。脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、及び小腸の部分を、組織学及びＰＣＲのために収集した。採取された器官のいずれにおいても、肉眼的異常及び腫瘍形成は観察されなかった。２ｍｍの組織厚にわたる連続切片にわたってのヒトマーカーＫＵ８０に対する免疫染色の場合、ＫＵ８０＋細胞は、移植されたＨＩＯ陽性対照においてのみ観察された（図１１Ａ～図１１Ｄ）。ヒト細胞の存在を更に調査するために、ＡｌｕベースのリアルタイムＰＣＲのゴールドスタンダードを実行して、ヒトをげっ歯類細胞から識別した。有意性の閾値を求めるために、知られているヒトｇＤＮＡサンプルに対して滴定を実行し、細胞当量に関連付け戻した（表１）。次いで、Ｈ１ ＧＦＰ細胞株及び様々なオフターゲット器官を含む実験サンプルを行った。Ｃｔのデータ点は、ヒト細胞の存在のＣｔ値閾値未満では見出されず（図１１Ｂ）、これは、実験設定内でヒト細胞の生体内分布がほとんどないか全くないことを示唆している。

【0104】

実施例４．方法論
ヒト組織：ヒト組織の収集は、治験審査委員会の事前承認を得て実行した。病理学的に正常な成人のヒト小腸及び結腸の外科的サンプルを、１４歳～２５歳の肥満又は修正／切除手順を受けている患者から得た。インフォームドコンセント又は同意を、必要に応じて、全ての患者及び／又は親／法的養育者から得た。病理学的に正常な結腸の追加の匿名化サンプルを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｔｏｇｅｔｈｅｒ Ｂｉｏｂａｎｋ ｏｆ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒを介して得た。全てのヒト組織を、施設の倫理ガイドラインに従って利用した。

【0105】

ラット：全ての動物手順及び実験は、施設の実験動物委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の事前承認を得て実行した。雄及び雌の両方を、実験に利用した。３～６ヶ月齢のＲａｇ１及びＩｌ２ｒｇ遺伝子欠失（ＲＲＧ）を有する成体免疫不全ラットを、粘膜切除術実験に使用した（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ Ｒａｔ ＩｍｍｕｎｏＰｈｅｎｏｍｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅのファウンダー、自家育種）。ラットをバリア動物飼育場に収容し、実験動物の取り扱いに関するＮＩＨ基準（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従って人道的に取り扱った。ＲＲＧラットに、標準的なオートクレーブ処理した飼料を主に与え、フルコナゾール（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ Ｒｘ、ＬＬＣ）を補充した水ボトルを提供した。餌及び水の両方を、手術の前後に自由に与えた。単回用量のカルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を、粘膜切除手順の最後に疼痛管理のために投与した。ラットを疼痛及び苦痛の兆候について術後３日間毎日モニターし、必要に応じて追加の鎮痛剤を投与した。

【0106】

Ｈ１－ＧＦＰ細胞株の生成：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を、改変された以前に公開された試薬を使用して、市販のＨ１ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）のＡＡＶＳ１セーフハーバー部位への緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列の導入のために使用した。簡潔に述べると、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするための、検証されたガイドＲＮＡ配列（５’－ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ－３’、配列番号１）をコードする一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（single-stranded donor oligonucleotide、ｓｓＯＤＮ）を、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｏｒｅによって生成されたｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ（ＰＸ４５８Ｍ、Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８１３８）の改変バージョンであるＰＸ４５８Ｍ－ＨＦ（これは、最適化されたシングルガイドＲＮＡを保有する）にアニールし、サブクローニングした。ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬を製造業者の推奨に従って使用して、１０μＭのＹ－２７６３２３を含有するｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中で、ｈＥＳＣ適合マトリゲル（登録商標）コーティングしたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））でトランスフェクションを実行した。トランスフェクションの４時間後、培地を除去し、１０μＭのＹ－２７６３２を含有するマウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）馴化ｈＥＳＣ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ノックアウト血清代替物（knockout serum replacement、ＫＯＳＲ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（nonessential amino acid、ＮＥＡＡ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、及び４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ）と置き換え、毎日培地をＭＥＦ馴化ｈＥＳＣ培地と交換した。トランスフェクションの２日後に、細胞の単一細胞懸濁液をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて生成し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８）選択のためにおよそ１０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で再播種した。トランスフェクションの３日後から始めて、Ｇ４１８選択（１００μｇ／ｍＬ）を８日間実行し、その後、ｍＴｅＳＲ１を使用して毎日フィードを実行した。２週間後、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して残存するＧ４１８耐性コロニーを採取し、ＣｌｏｎｅＲ（登録商標）サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むｍＴｅＳＲ（登録商標）にクローニング密度で播種した。回復したクローンを手動で取り出し、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中で増殖させ、遺伝子型決定に供した。ＡＡＶＳ１遺伝子座における２Ａ－ＮｅｏＲ－ＣＡＧ－ＧＦＰカセットの正確に標的化された挿入を、ＰＣＲ、サンガー配列決定、コピー数分析、及びＧＦＰ発現によって実行した。この細胞株を、全ての実験で使用した。毎月のマイコプラズマ試験を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｐｌｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びＣｏｎｔｒｏｌ Ｓｅｔ（Ｌｏｎｚａ＃ＬＴ０７－７０５及びＬＴ０７－５１８）を使用して、全ての細胞培養物に対して実行したところ、結果は一貫して陰性であった。

【0107】

ヒト腸オルガノイドの生成：ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を、以前に記載されたように生成し、維持した（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１４）２０：１３１０－１３１４、Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７０：１０５－１０９、ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１１）６：１９２０－１９２８）。簡潔に述べると、Ｈ１－ＧＦＰ細胞を、マトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））でコーティングした６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ（登録商標）表面プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））中、フィーダフリー条件で増殖させ、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））中で維持した。胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ、ＤＥ）誘導のために、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて生成した単一細胞懸濁液として継代し、２４ウェルＮｕｎｃ（登録商標）プレートにおよそ１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中で２日間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで３日間処理した。次いで、ＤＥを、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））及び３μＭのＣＨＩＲＯＮ９９０２１（ＣＨＩＲ９９０２１、Ｔｏｃｒｉｓ（登録商標））とともに、後腸誘導培地（ＲＰＭＩ１６４０、１００ｘ ＮＥＡＡ、２％透析ウシ胎児血清（dialyzed fetal calf serum、ｄＦＣＳ））で処理して、中後腸スフェロイドを誘導した。次いで、スフェロイドを成長因子低減（Growth Factor Reduced、ＧＦＲ）マトリゲル（登録商標）に播種し、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した腸成長培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン）中で維持して、ＨＩＯを生成した。培地を週２回交換し、ＨＩＯを１４日目に新しいマトリゲル（登録商標）に再播種した。ＨＩＯを、２８～３４日目の間に外科的移植に利用した。

【0108】

移植されたヒト腸オルガノイドからのエンテロイドの生成：以前に記載されているように（４０）、陰窩を、移植されたＨＩＯから単離した。簡潔に述べると、ＨＩＯ組織のセグメントを、ＳＹＬＧＡＲＤ１８４（Ｄｏｗ）コーティングしたペトリ皿にピン留めし、穏やかにこすり取って絨毛を除去し、２ｍＭのキレート化緩衝液で洗浄した後、２ｍＭのキレート化緩衝液中で３０分間インキュベートした。次いで、陰窩を放出させるために、組織を再び穏やかにこすり取った。陰窩を含むキレート化緩衝液をペトリ皿から取り出し、１５０μｍのナイロンメッシュを通して濾過し、５０ｇで５分間、４℃でスピンダウンして、細胞培養で使用するために陰窩をペレット化した。陰窩をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、ＩｎｔｅｓｉＣｕｌｔ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してエンテロイドを生成した。培地を週２回交換し、継代を７～１０日ごとに行った。

【0109】

粘膜切除手術手順：粘膜切除手順は、以前に公開された研究からここでの目的のために最適化した（Ａｖａｎｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｇｅｒｙ（２００６）１４０：４２３－４３４）。

【0110】

ループ創出：手順の１日前に、飼料を除去し、ラットをＧｅｌＤｉｅｔ７６Ａ（ＣｌｅａｒＨ_２Ｏ）に置き、術後７日継続した後、飼料に戻した。ラットを２％吸入イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎ）で麻酔し、それらの腹部を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードでコーティングしたスワブを使用して無菌様式で準備した。およそ３ｃｍの正中線開腹術を行った。単回用量のピペラシリン及びタゾバクタム（１００ｍｇ／ｋｇ）を、５ｍＬシリンジに取り付けられた１８Ｇ鈍端フィルニードルを使用して腹腔内に投与した。次いで、盲腸を特定し、３７℃に加温した生理食塩水を使用して腸を摘出して、手順全体を通して組織の水分を維持した。腸の好適なストレッチ（約２～３ｃｍ）を、ブラインドループ創出のために最初に特定した。ループを創出するために、必要に応じてハサミ及びボビーペンを使用して、ループになるものの近位端の腸及び腸間膜をトランスフェクトした。次いで、ハサミを使用してブラインドループの遠位端を部分的に切断した。吻合を、完全にトランスフェクトされた腸の開放端とブラインドループの部分的に切断された遠位端との間で、７－０絹製縫合糸（ＰＥＲＭＡ－ＨＡＮＤ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して、単純な結節様式で実行した。これは、ラットに対して完全な連続性を確立し、ブラインドループの遠位接続を維持する。

【0111】

傷害創出：ブルドッグクランプをブラインドループの遠位端に適用して、連続する腸への流れを遮断した。最初に、化学的損傷を誘発させた。カニューレを備えた２０ｍＬシリンジを使用して、ループを、３７℃に加温した生理食塩水で２分間洗い流した。次いで、カニューレを備えた２０ｍＬシリンジを使用して、ループを、３７℃に加温した生理食塩水中の１ｍＭのジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）で２分間洗い流した。その後、ループを再び加温した生理食塩水で洗い流した後に、カニューレを備えた２０ｍＬシリンジを使用して、３７℃に加温した５ｍＭの等張エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）緩衝液で１０分間洗い流した。およそ５０ｍＬのＥＤＴＡ溶液を、１０分間にわたる洗い流しのために使用した。この一連の洗い流しを繰り返し、次いで、最後の洗い流しは、３７℃に加温した生理食塩水で行った。機械的損傷を誘発するために、適切な直径の歯科用侵入型ブラシフロッサーを、入れる及び出すの間にわずかに捻って、３回挿入及び除去した。傷害の創出後、ブルドッグクランプを取り外し、ブラインドループの遠位端を、４－０吸収性ＣｈｒｏｍｉｃＧｕｔ縫合糸（ＥＴＨＩＬＯＮ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して、縫合した。

【0112】

ループの再シード：ループを、解離されたＨＩＯ又は細胞内容物を含まない培地で再シードした。構造体を断片化するために、ＨＩＯをそれらの培地中に収集し、プールした。次いで、ＨＩＯを、１８Ｇ鈍端フィルニードルを取り付けたシリンジに引き込み、１８Ｇニードルを２０Ｇニードルと交換し、シリンジの内容物を２４ウェルプレートのウェルに排出した。このプロセスを、２５Ｇで終わる、より小さいニードルを順次使用して繰り返した（図１０Ａ）。次いで、ＨＩＯ断片を、カニューレを備えた１ｍＬシリンジに引き込み、調製した腸ループ内に置いた。同じプロセスはまた、エンテロイドを用いて行うこともできる（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、ＨＩＯ又はエンテロイドから解離された細胞の明視野画像を示す。解離のために使用した元のＨＩＯ又はエンテロイド構造体を構成する細胞のおよその数を図１０Ｄに示す。解離されたＨＩＯで再シードするために、腸の長さ４ｍｍ当たりおよそ１００，０００細胞を使用した。再シード後、カニューレを除去する際、ループの近位端を、５－０絹製縫合糸（ＰＥＲＭＡ－ＨＡＮＤ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して閉じた。次いで、腸を腹腔内に注意深く戻した。切開部を閉じるために、筋肉を、４－０コーティング吸収性縫合糸（ＶＩＣＲＹＬ ＲＡＰＩＤＥ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して、連続様式で縫合した。次いで、皮膚を、４－０コーティング吸収性縫合糸（ＶＩＣＲＹＬ ＲＡＰＩＤＥ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して、再び埋没結節様式で閉じた。単回用量のカルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を、手順の最後に疼痛管理のために投与した。組織を、治癒プロセス中の初期時点として術後７日に採取し、長期回復時点として術後１０週に採取した。

【0113】

インビトロでのＨＩＯ細胞の定量化：核を、Ｍｉｎｕｔｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｆｒｅｅ Ｎｕｃｌｅｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者のガイドラインに従って使用して、ＨＩＯから単離した。十分な細胞量を得るために、構造体を単離のためにプールした。４つの２８日目（ｄ２８）のＨＩＯを、１回の核単離のためにプールした。完了直後に、核を、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して自動的に定量化した。次いで、総数を４で割り、ＨＩＯ当たりの細胞数を求めた。

【0114】

走査型電子顕微鏡法：健康なラット空腸及び新たに損傷したラット空腸のセグメントを、０．１７５Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の３％グルタルアルデヒド中で一晩固定した。次いで、サンプルを緩衝液ですすぎ、４℃で１時間、０．１７５Ｍのカコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウムで後固定した。別の緩衝液ですすいだ後、サンプルを、脱水のために段階的エタノール系列（２５％、５０％、７５％、９５％、３×１００％）に通した。次いで、標本をＥＭ ＣＰＤ３００（Ｌｅｉｃａ（登録商標））中で臨界点乾燥させ、スタブマウントし、ＥＭ ＡＣＥ６００（Ｌｅｉｃａ（登録商標））を使用して６０／４０金／パラジウムで１０ｎｍ厚にスパッタコーティングした。ＳＵ８０１０透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ（登録商標））を使用してサンプルを撮像した。

【0115】

組織処理及び免疫染色：サンプルを採取し、４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde、ＰＦＡ）中で一晩固定し、処理し、パラフィンブロックに包埋した。切片を脱パラフィン化し、ヘマトキシリン及びエオシンで直ちに染色するか、又は抗原回復に供し、抗体染色した。抗体インキュベーションは、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン中、４℃で一晩行った。抗体及びそれらのそれぞれの希釈を表３に列挙する。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣシステムを増幅のために使用し、ジアミノベンジジン基質キットをシグナル検出のために使用した（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））。リリー－マイヤーヘマトキシリン（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を対比染色として使用した。生体内分布のために、連続切片を作り、１０枚目ごとのスライドを２ｍｍの組織厚にわたって染色した。

【0116】

【表1】

【0117】

Ｃｔ値に関連するヒトＤＮＡ含量の滴定及び腫瘍原性に使用される細胞存在の当量。

【0118】

【表2】

【0119】

ＨＩＯの生成のために使用されたＨ１ ＧＦＰ細胞株におけるヒトＤＮＡ含量の滴定及びそれらの関連するＣｔ値。再シード材料として使用される断片化されたＨＩＯを用いた粘膜切除手順を受けたラットの主要器官全体にわたるＰＣＲによるヒトＤＮＡ含量の定量化。未定のＣｔ値は、サーモサイクラーの感度に従って４０を超える。２９の決定されたＣｔ閾値未満である値は見出されず、したがって、ヒト細胞の存在はサンプル内に見出されなかった。

【0120】

【表3】

【0121】

【表4】

【0122】

画像取得：手術画像を、ＭＣ１７０ＨＤカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を装備したＭ８０顕微鏡を使用して取得した。採取された構造体の全体画像を、Ｖ４０ ＴｈｉｎＱ（ＬＧ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標））を使用して取得した。採取を、ＤＣＦ７０００ Ｔカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を装備したＭ１６５ＦＣ顕微鏡を使用して実行した。スライドを、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））を使用して撮像し、後続の分析を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））を使用して実行した。

【0123】

エクスビボでの上皮の特徴及び透過性：新たに採取した健康な空腸及び再シードしたループの上皮を、以前に報告されたように（Ｃｌａｒｋｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００９）２９６：Ｇ１１５１－１１６６、Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１７）２３：８２９－８３８、Ｐｏｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．（２０１８）２：４２９－４４２）、漿膜筋層ストリッピングと同様の技法により注意深く切開した。サンプルを開き、切開を氷冷クレブス緩衝液（１１７ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、２５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２、１１ｍＭのグルコース）中で行った。次いで、全層組織セグメントを、硬化したＳｙｌｇａｒｄ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むディッシュにピン留めした。再シードしたループは、更なる切開及びウッシングチャンバアッセイでの使用の前に、ＧＦＰ陽性であることを確認した。次いで、Ｄｕｍｏｎｔ＃５及び＃７鉗子をＶａｎｎａｓハサミ（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．）とともに使用して、漿膜筋層組織を上皮から顕微切開した。全体の組織完全性を、外観の均一性について立体鏡の底部照明を使用して評価し、任意の損傷した領域を除去した。切開後、いくらかの残存上皮下粘膜が残った。次いで、最小量の取り扱いで、上皮の中心部分を、ウッシング装置（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のヘミチャンバ間に取り付けるために配置した。０．０３１ｃｍ^２の組織を、アッセイ全体を通して３７℃で５ｍＬの酸素化クレブス緩衝液に曝露した。経上皮電位差は、３ＭのＫＣｌ中に３．７５％寒天を含む塩橋に固定された２対の電極で検出した。電極をＶＶＣ ＭＣ８電圧クランプ増幅器（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続した。スライダをチャンバ間に取り付ける直前に、電極電位差及び流体抵抗値をゼロに補正した。３０分間で、平衡を確立させた。次いで、組織を０ｍＶで電圧クランプし、短絡電流（Ｉ_ｓｃ）を連続的に測定しながら、化学刺激（１０μＭのフォルスコリン、１００μＭのＩＢＭＸ、及び１００μＭのブメタニド）を適用した。ＦＩＴＣ－デキストラン透過性については、２．２ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－デキストランを頂端側に添加し、サンプルを側底側から３０分ごとに３時間取り、サンプルにわたる圧力を維持するために側底側において同量の新たな改変クレブス緩衝液を置き換えた。全ての水性サンプルを収集したら、それらをプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ２、ＢｉｏＴｅｋ）を用いて定量化した。

【0124】

ヒト特異的Ａｌｕ ＰＣＲプライマー及びプローブ：ヒトＤＮＡの検出を、以前記載されたプライマー及びプローブを使用して行った。簡潔に述べると、Ａｌｕ ＰＣＲを、再シードした粘膜切除術のラットからの様々な器官から抽出したｇＤＮＡ及びＨ１ ＧＦＰ細胞株に対して実行した。フォワードプライマーは、ヒト特異的Ａｌｕ配列の上流にアニールするように設計し（５’－ＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＴ－３’、配列番号２）、リバースプライマーは、ヒト特異的Ａｌｕ配列内に主にアニールするように設計し（５’－ＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣ－３’、配列番号３）、その結果、９６塩基対アンプリコンが得られる。プローブは、２つのプライマー間に結合するように設計した（５’－ＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣ－３’、配列番号４）ｈＡｌｕ特異的配列のクエンチャー－ＭＧＢ－６ＦＡＭ上流。プライマー及びプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから特別注文した。

【0125】

Ａｌｕ ＰＣＲ：定量的リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２００ｎｇの標的テンプレートｇＤＮＡに対して実行した。各サンプルを、ＯｎｅＳｔｅｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、３連で配列決定した。１０倍の連続希釈（２００ｎｇ～０ｎｇ）のｈＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及びＨ１ ＧＦＰ細胞を各ＰＣＲプレートに添加することによって、標準曲線を生成した。ＱｕｎａｔｏＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、標準値に基づいてヒト細胞の存在に関する交差閾値（Ｃｔ）値を計算した。

【0126】

データ表現、統計、及び再現性：バー成長については、データは平均±標準偏差で表され、全ての個々のデータ点が表されている。バイオリンプロットについては、破線は平均及び四分位範囲を示し、全ての個々のデータ点が表されている。対応のあるデータの２つのグループを比較する統計については、ウィルコクソン符号順位検定を実行した。対応のないデータを比較する統計については、スチューデントｔ検定を実行した。統計的有意性のカットオフはｐ<０．０５であり、信頼区間は９５％であった。

【0127】

前述の実施形態の少なくともいくつかでは、一実施形態で使用される１つ以上の要素は、そのような置き換えが技術的に実現可能ではない場合を除いて、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者は、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び構造に対して、様々な他の省略、付加、及び改変を行うことができることを理解されよう。全てのそのような改変及び変更は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、本主題の範囲内に含まれることが意図されている。

【0128】

本明細書における実質的に全ての複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数から単数へと、及び／又は単数から複数へと言い換えることができる。明確にするために、様々な単数／複数の置き換えを本明細書において明確に説明することができる。

【0129】

一般的に、本明細書、及び特に添付された特許請求の範囲（例えば、添付された特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、一般に「オープンな」用語として意図されている（例えば、用語「含む（including）」は、典型的には「含むがこれに限定されない」と解釈され、用語「有する（having）」は、典型的には「少なくとも有する」と解釈され、用語「含む（include）」は、典型的には「含むがこれに限定されない」と解釈されるなど）ことを当業者は理解するであろう。導入される請求項の記述の具体的な数が意図されている場合には、そのような意図は、特許請求の範囲で明示的に記述され、そのような記述が存在しない場合には、そのような意図は存在しないことを当業者は更に理解するであろう。例えば、理解の補助として、下記の添付された特許請求の範囲は、請求項の記述を導入するために、導入的語句「少なくとも１つ」及び「１つ以上」の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような語句の使用は、典型的には、同じ請求項が導入的語句「１つ以上」又は「少なくとも１つ」及び「ａ」又は「ａｎ」などの不定冠詞を含む場合であっても（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、典型的には「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味すると解釈される）、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の記述の導入が、そのような導入された請求項の記述を含む任意の特定の請求項を、ただ１つのそのような記述を含む実施形態に限定することを意味すると解釈され、同じことが、請求項の記述を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、導入された請求項の記述の特定の数が明示的に記述されている場合でも、そのような記述が、典型的には、少なくとも記述された数を意味する（例えば、他の修飾語句なしでの「２つの記述」という単なる記述は、少なくとも２つの記述又は２つ以上の記述を意味する）と解釈されることを当業者は認識するであろう。更に、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つなど」に類似する慣習が使用される場合では、一般に、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味を意図する（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒に有するシステムなどを含むがこれらに限定されないであろう）。「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つなど」に類似する慣習が使用される場合では、一般に、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒に有するシステムなどを含むがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語及び／又は離接語句も、典型的には、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図すると理解されることを当業者は更に理解するであろう。例えば、「Ａ又はＢ」という語句は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。

【0130】

加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループによって説明されている場合、それによって、本開示は、マーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループによっても説明されることを当業者は認識するであろう。

【0131】

当業者に理解され得るように、文書として記述するという観点などのあらゆる目的のために、本明細書で開示されている全ての範囲は、あらゆる可能な部分範囲及びそれらの部分範囲の組み合わせも包含する。あらゆる列挙されている範囲を、少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分解される同じ範囲を十分に説明して可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲を、下３分の１、中３分の１及び上３分の１などに容易に分解することができる。当業者にも理解され得るように、「最大」、「少なくとも」、「超」、「未満」などの全ての言葉は、記述される数を含み、本明細書で考察されるように後に部分範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解され得るように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３つの項目を有するグループは、１、２、又は３つの項目を有するグループを指す。同様に、１～５つの項目を有するグループは、１、２、３、４、又は５つの項目を有するグループを指し、以下同様である。

【0132】

本明細書では様々な態様及び実施形態が開示されているが、当業者には他の態様及び実施形態が明らかであるであろう。本明細書で開示されている様々な態様及び実施形態は例解の目的のためであり、限定することを意図されておらず、真の範囲及び趣旨は下記の特許請求の範囲で示される。

【0133】

公開及び未公開の出願、特許、及び文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、本明細書の一部となる。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲まで、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する、及び／又は優先することを意図している。

【0134】

参考文献
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【図1A】

【図1B-G】

【図1H】

【図2A-D】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A-D】

【図9E-H】

【図10A-D】

【図11A-B】

【配列表】

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【国際調査報告】