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特表2025-502310免疫療法の毒性を予測するための細胞状態のリキッドバイオプシー分析
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】免疫療法の毒性を予測するための細胞状態のリキッドバイオプシー分析
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20250117BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542149
(86)(22)【出願日】2023-01-12
(85)【翻訳文提出日】2024-09-13
(86)【国際出願番号】 US2023060573
(87)【国際公開番号】W WO2023137390
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】63/299,377
(32)【優先日】2022-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597025806
【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(71)【出願人】
【識別番号】515158308
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チャウドゥリー， アーデル
(72)【発明者】
【氏名】ニューマン， アーロン
(72)【発明者】
【氏名】ロザーノ， アレクサンダー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR58
4B063QR62
4B063QX01
(57)【要約】
黒色腫患者において免疫療法の施行に伴って重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を、患者から得た末梢血試料中の活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性に基づいて予測するための方法が開示される。本発明は、免疫療法を受ける患者において重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を、免疫療法を受ける前の患者から得た末梢血試料に由来するバイオマーカーに基づいて予測するための方法および組成物を含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫療法を受ける患者において重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を予測するための方法であって、ａ．免疫療法による処置を受ける前の対象から末梢血試料を得るステップと、
ｂ．前記末梢血試料中の活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性を定量するステップと、
ｃ．前記活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量とＴＣＲの量の組合せが閾値を超える場合、前記患者を、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
既知の臨床的標準を参照することによって前記閾値を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量および前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性が、バルクＲＮＡシーケンシング（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘおよびＭｉＸＣＲ）、飛行時間によるマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）ＴＣＲ－βプロファイリング、液滴ベースのｓｃＲＮＡシーケンシングおよびｓｃＴＣＲシーケンシング、および活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞を標的とするＲＮＡパネルを使用した標的化ＲＮＡシーケンシングのうちの少なくとも１つを使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
免疫療法を受ける患者において重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を予測するための方法であって、ａ．免疫療法による処置を受ける前の対象から第１の末梢血試料を得、前記患者に前記免疫療法を施行した後に第２の末梢血試料を得るステップと、
ｂ．前記第１の末梢血試料から第１のＴＣＲ多様性レベルを定量し、前記第２の末梢血試料から第２のＴＣＲ多様性レベルを定量するステップと、
ｃ．前記第２のＴＣＲ多様性レベルから前記第１のＴＣＲ多様性レベルを差し引くことによってＴＣＲ拡大の程度を得るステップと、
ｄ．前記ＴＣＲ拡大の程度が閾値を超える場合、前記患者を、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップと
を含む、方法。
【請求項5】
前記ＴＣＲ拡大の程度に基づいて前記重度のｉｒＡＲが発症する時点を予測するステップをさらに含み、ＴＣＲ拡大の程度がより高いことにより、重度のｉｒＡＲの発症がより早いことが予測される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１のＴＣＲ多様性および前記第２のＴＣＲ多様性が、バルクＲＮＡシーケンシング（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘおよびＭｉＸＣＲ）、飛行時間によるマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）ＴＣＲ－βプロファイリング、液滴ベースのｓｃＲＮＡシーケンシングおよびｓｃＴＣＲシーケンシング、および活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞を標的とするＲＮＡパネルを使用した標的化ＲＮＡシーケンシングのうちの少なくとも１つを使用して決定される、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年１月１３日に出願された米国仮出願第６３／２９９，３７７号の優先権を主張するものである。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年１月１３日に出願された米国仮出願第６３／２９９，３７７号の優先権を主張するものである。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与されたＣＡ１８７１９２およびＣＡ２３８７１１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与されたＣＡ１８７１９２およびＣＡ２３８７１１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【0003】
参照により組み込まれる材料
該当なし。
該当なし。
【0004】
発明の分野
本開示は、一般には、患者における免疫療法の毒性を予測するための方法に関する。
本開示は、一般には、患者における免疫療法の毒性を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【0005】
発明の背景
ＩＣＩにより、がん処置に大変革がもたらされたが、ＩＣＩによる処置を受けた黒色腫患者のおよそ１０～６０％に重度の免疫関連性毒性が一般に発生しており、毒性の率は施行された特定の療法に密接に関連する。ＩＣＩ誘導性毒性は、ｉｒＡＥとしても公知であり、肺、肝臓、心臓、皮膚、下垂体、および胃腸管を含めた様々な器官系に影響を及ぼし、緊急の医療介入を必要とする実質的な病的状態を伴う恐れがある。そのような病的状態は、抗がん処置の停止、および最も重度の場合には、死亡に至る恐れがある。ｉｒＡＥの生物学的駆動因子は、十分には特徴付けられておらず、標準的な診療においてｉｒＡＥの発生のリスクが最も高い患者を同定する方法は存在しない。
ＩＣＩにより、がん処置に大変革がもたらされたが、ＩＣＩによる処置を受けた黒色腫患者のおよそ１０～６０％に重度の免疫関連性毒性が一般に発生しており、毒性の率は施行された特定の療法に密接に関連する。ＩＣＩ誘導性毒性は、ｉｒＡＥとしても公知であり、肺、肝臓、心臓、皮膚、下垂体、および胃腸管を含めた様々な器官系に影響を及ぼし、緊急の医療介入を必要とする実質的な病的状態を伴う恐れがある。そのような病的状態は、抗がん処置の停止、および最も重度の場合には、死亡に至る恐れがある。ｉｒＡＥの生物学的駆動因子は、十分には特徴付けられておらず、標準的な診療においてｉｒＡＥの発生のリスクが最も高い患者を同定する方法は存在しない。
【0006】
したがって、ＩＣＩ誘導性毒性の潜在的なバイオマーカーの血液または腫瘍の分析に基づく調査がいくつかのグループによって行われた。しかし、これらの研究は一般に処置中の初期段階での予測または単一器官系に焦点を当てたものであり、患部器官系に関係なく、処置前の状況でのｉｒＡＥの予測性能はわずかであった。最近、肺臓炎のみのｉｒＡＥバイオマーカー候補が、腫瘍免疫組織化学的検査を使用して報告されたが、このバイオマーカーは、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓによって間接的に同定されたものであり、毒性に関するアノテーションがされておらず、また、低グレードｉｒＡＥが含まれない症例対照の状況で評価された。別のグループにより、マイクロＲＮＡ－１４６ａをコードする遺伝子内の一塩基多型が同定され、重度のｉｒＡＥ発生に関連付けられた。さらに、他のグループが、ｉｒＡＥの調査を伴わずにＩＣＩ応答バイオマーカーを同定した。
【0007】
ＩＣＩ誘導性ｉｒＡＥのタイミング、重症度、および場所の変動性を含めた、その相当な不均一性を考慮すると、ＩＣＩ誘導性ｉｒＡＥを引き起こす因子を決定することは依然として困難なままである。既存の自己抗体、自己反応性組織常在性Ｔ細胞、および、慢性ウイルス感染症から生じる、ウイルス抗原に対する特異性を有するＴ細胞は全てｉｒＡＥに関係付けられている。結腸インターロイキン－１β発現の増大をもたらす腸内マイクロバイオームの変化も、ＩＣＩ誘導性大腸炎に関して最近報告されている。これらの観察を考慮して、いくつかのグループが、ｉｒＡＥと自己免疫疾患の類似点を調査した。実際に、症例報告から、ＩＣＩが明白な自己免疫を引き起こし得ることが示されており、これにより、ｉｒＡＥが患者の一部において不顕性自己免疫となっている可能性が示唆される。しかし、ＩＣＩ誘導性毒性の別個の顕在化に先立って共通の免疫学的状態が生じるかどうかは不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明の要旨
本開示の種々の態様として、免疫療法を受ける患者において重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を、免疫療法を受ける前の患者から得た末梢血試料に由来するバイオマーカーに基づいて予測するための方法および組成物が挙げられる。一態様では、開示される方法は、免疫療法による処置を受ける前の対象から末梢血試料を得るステップと、末梢血試料中の活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性を定量するステップとを含む。好ましい方法は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性の組合せが閾値（本明細書では、モデル指数と称されることもある）を超える場合、患者を、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップとをさらに含む。閾値は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞およびＴＣＲ多様性のレベルを同定し、それを超えると患者がｉｒＡＲを生じやすいという上限を表す値の範囲を提供するモデル指数を使用して決定することができる。一態様では、所定の閾値を超えるモデル指数の値（ＣＤ４メモリーＴ細胞値とＴＣＲ多様性値の組合せ）により、より重度のｉｒＡＲが予測される。追加的な態様では、本方法は、既知の臨床的標準を参照することによって閾値を決定するステップをさらに含む。別の態様では、開示される方法は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性を、バルクＲＮＡシーケンシング（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘおよびＭｉＸＣＲ）、飛行時間によるマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）ＴＣＲ－βプロファイリング、液滴ベースのｓｃＲＮＡシーケンシングおよびｓｃＴＣＲシーケンシング、および活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞を標的とするＲＮＡパネルを使用した標的化ＲＮＡシーケンシングのうちの少なくとも１つを使用して決定するステップを含む。
本開示の種々の態様として、免疫療法を受ける患者において重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を、免疫療法を受ける前の患者から得た末梢血試料に由来するバイオマーカーに基づいて予測するための方法および組成物が挙げられる。一態様では、開示される方法は、免疫療法による処置を受ける前の対象から末梢血試料を得るステップと、末梢血試料中の活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性を定量するステップとを含む。好ましい方法は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性の組合せが閾値（本明細書では、モデル指数と称されることもある）を超える場合、患者を、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップとをさらに含む。閾値は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞およびＴＣＲ多様性のレベルを同定し、それを超えると患者がｉｒＡＲを生じやすいという上限を表す値の範囲を提供するモデル指数を使用して決定することができる。一態様では、所定の閾値を超えるモデル指数の値（ＣＤ４メモリーＴ細胞値とＴＣＲ多様性値の組合せ）により、より重度のｉｒＡＲが予測される。追加的な態様では、本方法は、既知の臨床的標準を参照することによって閾値を決定するステップをさらに含む。別の態様では、開示される方法は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性を、バルクＲＮＡシーケンシング（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘおよびＭｉＸＣＲ）、飛行時間によるマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）ＴＣＲ－βプロファイリング、液滴ベースのｓｃＲＮＡシーケンシングおよびｓｃＴＣＲシーケンシング、および活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞を標的とするＲＮＡパネルを使用した標的化ＲＮＡシーケンシングのうちの少なくとも１つを使用して決定するステップを含む。
【0009】
本開示の他の態様では、免疫療法を受ける患者において重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を予測するための方法が開示される。一態様では、本方法は、免疫療法による処置を受ける前の対象から第１の末梢血試料を得、免疫療法を施行した後に第２の末梢血試料を得るステップを含む。これらの他の態様において開示される方法は、第１の末梢血試料から第１のＴＣＲ多様性レベルを定量し、第２の末梢血試料から第２のＴＣＲ多様性レベルを定量するステップを含む。開示される方法は、第２のＴＣＲ多様性レベルから第１のＴＣＲ多様性レベルを差し引くことによってＴＣＲ拡大の程度を得るステップをさらに含む。開示される方法は、ＴＣＲ拡大の程度が閾値を超える場合、患者を、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップをさらに含む。一態様では、本方法は、ＴＣＲ拡大の程度に基づいて重度のｉｒＡＲが発症する時点を予測するステップを含み、ＴＣＲ拡大の程度がより高いことにより、重度のｉｒＡＲの発症がより早いことが予測される。一態様では、本方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性レベルを、バルクＲＮＡシーケンシング（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘおよびＭｉＸＣＲ）、飛行時間によるマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）ＴＣＲ－βプロファイリング、液滴ベースのｓｃＲＮＡシーケンシングおよびｓｃＴＣＲシーケンシング、および活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞を標的とするＲＮＡパネルを使用した標的化ＲＮＡシーケンシングのうちの少なくとも１つを使用して決定するステップを含む。
【0010】
他の目的および特色は、一部は明白であり、一部は以下に挙げられる。
【0011】
下記の図面は、単に例示するためのものであることが当業者には理解されよう。図面は、本教示の範囲をいかようにも限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、本開示に記載されている試験の概要の概略図である。本試験に含められた患者の概要、当該患者のｉｒＡＥの状況の要約、除外基準、および実施した下流の分析が含まれる。総計７８例の適格患者のうち、７１例が、除外基準の適用後にｉｒＡＥの分析について評価可能であった。
【図2A-B】図２Ａは、図１のシングルセル発見コホートの特徴を表す色分けチャートのセットである。免疫療法の開始後の生じた最も高いｉｒＡＥグレードおよび長続きする臨床応答の状態が含まれる。図２Ｂは、ＣｙＴＯＦによって分析した末梢血液細胞のｖｉＳＮＥ投影のＵＭＡＰチャートである。ｔ－ＳＮＥ、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法。
【図2C-D】図２Ｃは、（左）今後のｉｒＡＥの状況によって群分けされた、１８例の患者におけるＣｙＴＯＦによって同定された２０種の細胞状態の相対的な存在量を示すヒートマップ、ならびに（右）細胞状態の存在量と重度のｉｒＡＥ発生の関連性を示すグラフである。統計的有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定し、方向を有する－ｌｏｇ１０ Ｐ値によって表した。重度のｉｒＡＥなしとの関連性については、－ｌｏｇ１０ Ｐ値に－１をかけた。Ｑ値をＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法によって決定した。図２Ｄは、今後のｉｒＡＥの状況によって層別化された患者（重度のｉｒＡＥなし、ｎ＝１０例の患者；重度のｉｒＡＥ、ｎ＝８例の患者）の処置前末梢血におけるＣＤ４ ＴＥＭ細胞（ＣｙＴＯＦ）の出現頻度のグラフである。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。統計的有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定した。
【図3A】図３Ａは、細胞型、患者、および状態（ｎ＝３２）によって色分けされた、ＣｙＴＯＦによって共分析された１３例の患者からの、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイリングされた（図２Ａ）末梢血液細胞のＵＭＡＰである。Ｔ／ＮＫＴ、ＮＫ様Ｔ細胞。
【図3B】図３Ｂは、今後のｉｒＡＥの状況およびＣＤ４ ＴＥＭ細胞の出現頻度（ＣｙＴＯＦ）に対する細胞状態の存在量（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）のＵＭＡＰである。前者は、両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって定量し、－ｌｏｇ１０ Ｐ値として表した。重度のｉｒＡＥなしとの関連性については、－ｌｏｇ１０ Ｐ値に－１をかけた。ＣＤ４ Ｔ細胞状態５および３はまとめてＣＤ４ Ｔ ５＋３として示されている。
【図3C】図３Ｃは、ＣＤ４ Ｔ細胞状態５および３と他のＣＤ４ Ｔ細胞状態の間のＤＥＧ（Ｐａｄｊ＜０．０５）のヒートマップである。各状態内で、列は、個々の患者からの平均発現をｚ－スコアに変換したものを表す。
【図3D】図３Ｄは、（左）重度のｉｒＡＥの状況なし（ｎ＝７）および重度のｉｒＡＥの状況（ｎ＝６）によって層別化された１３例の患者におけるＣＤ４ Ｔ ５＋３細胞状態の候補活性化サブセットおよび静止サブセットの出現頻度。１００万ごとの計数（ＣＰＭ）が＞０の活性化マーカーを発現しているとみなした。有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定した、ならびに（右）重度のｉｒＡＥ発生を予測するための、ＣＤ４ Ｔ ５＋３サブセット（左側のパネル）の性能を示す受信者動作特性曲線プロット。ＮＳ、有意でない、の２つのグラフのセットである。
【図3E】図３Ｅは、今後のｉｒＡＥの状況によって群分けされた、各Ｔ細胞状態、総Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、および活性化ＣＤ４ Ｔ ５＋３細胞と静止ＣＤ４ Ｔ ５＋３細胞とにおける処置前ＴＣＲクローン型多様性を示すグラフである（図３Ｄにおいて定義されている）。少なくとも１００のＴＣＲクローンを有する全ての患者（ｎ＝９）についてＴＣＲ多様性を算出した。状態を、ＴＣＲ多様性と重度のｉｒＡＥの状況の間のＡＵＣによって順序付けた。
【図3F】図３Ｆは、ＣＤ４ Ｔ細胞状態における重要な系列および活性化遺伝子の平均発現の色分けチャートである。箱内の状態はＴＥＭおよびＴＥＭ様表現型と一致する。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。
【図4A-B】図４Ａは、バルクコホート１（ｎ＝２６例の患者）およびバルクコホート２（ｎ＝２７例の患者）における処置前末梢血白血球組成（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ）と重度のｉｒＡＥ発生の間の関連性を示すグラフである（図１）。有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定し、－ｌｏｇ１０ Ｐ値として表した。重度のｉｒＡＥなしとの関連性については、－ｌｏｇ１０ Ｐ値に－１をかけた。図４Ｂは、今後のｉｒＡＥの状況（重度のｉｒＡＥなし、ｎ＝３６；重度のｉｒＡＥ、ｎ＝１７）によって層別化された、両方のバルクコホート（ｎ＝５３例の患者）におけるＴＣＲクローン型多様性（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）を示すグラフである。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定した。
【図4C】図４Ｃは、処置前末梢血トランスクリプトームによる活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞の存在量およびＴＣＲクローン型多様性を、バルクコホート１で訓練し、両方のコホートにわたって示したモデルスコアを統合した、重度のｉｒＡＥを予測するための複合モデルの開発を示すグラフである。高／低スコアのカットポイントをバルクコホート１に対してＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用して最適化した。
【図4D】図４Ｄは、（左）全ての患者（両方の療法、ｎ＝２７）、併用療法患者（ｎ＝１１）またはＰＤ－１単独療法患者（ｎ＝１６）のいずれに適用したかにかかわらず、バルクコホート２（ホールドアウト検証）における複合モデル性能を示すＲＯＣプロット、ならびに（右）ＰＤ－１患者（ｎ＝２９）で訓練し、併用療法患者（ｎ＝２４）でテストしたか、またはその逆であるかにかかわらず、バルクコホート１および２における複合モデル性能を示すＲＯＣプロット、の２つのグラフのセットである。各ＲＯＣ曲線についてＡＵＣが示されている。
【図4E】図４Ｅは、患者ごとの最も高いｉｒＡＥグレードによって群分けした、モデルを重度のｉｒＡＥ発生についてＬＯＯＣＶを用いて訓練した（図１３）後の全てのバルクコホート患者（ｎ＝５３）の複合モデルスコアのグラフである。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×四分位範囲内の最小値および最大値を示す。統計的有意性をクラスカル・ワリス検定によって決定した。
【図5A-B】図５Ａは、併用療法を用いた処置を受けた患者における重度のｉｒＡＥ発症までの時間の処置前予測を示すグラフである。カットポイントを、ＬＯＯＣＶを用いて訓練した複合モデルスコアを使用して最適化した。初期段階の進行が生じなかったバルクコホート１および２の患者のみを分析した（ｎ＝２３）。統計的有意性を両側ログランク検定によって評定した。図５Ｂは、併用療法を用いた処置を受けた患者におけるＴＣＲクローンダイナミクスを重度のｉｒＡＥ発生との関連で示す２つのグラフのセットである。左：１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度によって測定された併用療法の開始後のベースラインからのＴＣＲクローン性の変化。今後のｉｒＡＥの状況が色で示されている。右：左と同じであるが、今後のｉｒＡＥの状況に応じたクローン性の変化を示す。有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定した。
【図5C-D】図５Ｃは、図５Ｂにおいて分析した患者３例から得た処置前ＰＢＭＣ試料由来のＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ４ Ｔ ５＋３遺伝子シグネチャーの富化を示すグラフである。これらの患者は全てＩＣＩ開始後に重度のｉｒＡＥが発生し、またＴＣＲクローン拡大を示した（図１５Ｄ）。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数ならびに最小値および最大値を示す。点は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイリングされ、Ａｚｉｍｕｔｈ（ＣＤ４ナイーブ、ｎ＝２４５の細胞；ＣＤ４ ＴＣＭ、ｎ＝３２０の細胞）またはベースラインから処置中の初期段階の時点までのそれらのクローン持続性（持続性ＣＤ４、ｎ＝１９０の細胞）のいずれかによってアノテーションされた細胞を示す。本分析において最も持続性が高かったＣＤ４クローン型ではクローン拡大の証拠が示された（図１５ＦおよびＧ）。有意性を持続性細胞に対して両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定した。ｓｓＧＳＥＡ、単一試料ＧＳＥＡ。図５Ｄは、１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度の変化によって測定された、併用療法の開始後のＴＣＲクローン拡大の程度によって層別化した重度のｉｒＡＥの非存在の差異のグラフである。患者を以下の三分位に群分けした：クローン拡大なし（ｎ＝５）、中間（ｎ＝５）、および高クローン拡大（ｎ＝５）。統計的有意性を両側ログランク検定によって評定した。
【図6】図６は、自己免疫疾患における循環中の白血球の大規模評定を示す色分けチャートである。健康対照と比べた２つの自己免疫障害における循環中の白血球レベルの富化。白血球組成をＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって決定した。有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定および統合メタｚ－スコアによって決定した。分析ワークフローおよび基礎をなすデータセットの詳細は図１６に示されている。
【図7A-C】図７Ａは、主要な細胞系列、重度のｉｒＡＥの状況、ｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑによるＴＣＲ発現、およびｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑによるＢＣＲ発現（図３Ａに関連する）によって色分けされた、液滴ベースのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によってプロファイリングされた１３例の転移性黒色腫患者由来の処置前末梢血白血球のＵＭＡＰ表示である。図７Ｂは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから同定されたＣＤ４ Ｔ細胞クラスター当たりの平均ｌｏｇ２トランスクリプトームの教師なし階層的クラスタリング（平均連結法）の概略図である。図７Ｃは、ＣＤ４ Ｔ細胞クラスターにおける重要な活性化マーカー（ＨＬＡ－ＤＸ、ＭＫＩ６７）および系列マーカー（ＳＥＬＬ、ＣＣＲ７）の平均発現を示すドットプロットである。
【図7D-E】図７Ｄは、分析した主要細胞型（Ｂ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球）のそれぞれの中でのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑクラスターの全てのペアワイズ組合せを示す、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから同定されたＣＤ４ Ｔ細胞クラスター当たりの平均ｌｏｇ２トランスクリプトームの教師なし階層的クラスタリング（平均連結法）のグラフである。８２通りの可能性のあるペアワイズ組合せにわたって、ＣＤ４ Ｔ ５＋３で、ＣｙＴＯＦによって列挙されたＣＤ４ ＴＥＭレベルに対する最も高いスピアマン相関および重度のｉｒＡＥ発生との最も強い関連性が実現された。「Ｔ／ＮＫＴ」としてアノテーションされた細胞はＣＤ８ Ｔ細胞に入れた。図７Ｅは、単位分散正規化（平均０および標準偏差１）後の各特色の平均によって順位付けした全てのペアワイズ組合せを示す、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから同定されたＣＤ４ Ｔ細胞クラスター当たりの平均ｌｏｇ２トランスクリプトームの教師なし階層的クラスタリング（平均連結法）のグラフである。本分析では、重度のｉｒＡＥとの関連性についての－ｌｏｇ１０ Ｐ値（両側、対応のないウィルコクソン順位和検定）を、関連性の方向を考慮に入れず、単位分散に対して正規化した。
【図8A】図８Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび２２８種の抗体によってプロファイリングされた１６２，０００個の細胞の参照ＰＢＭＣアトラスを使用してＡｚｉｍｕｔｈにより埋め込みラベリングした、本研究において生成したｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータのＵＭＡＰ投影を示す。
【図8B-C】図８Ｂは、マーカー遺伝子および教師なしクラスタリングによって決定された表現型ラベリング（行；図３Ａおよび図７Ａに関連する）とＡｚｉｍｕｔｈを用いた参照誘導アノテーション（列）の一致を示す混同行列である。全部で、Ａｚｉｍｕｔｈによって主要系列群（Ｂ細胞、ＣＤ４ Ｔ、ＣＤ８ Ｔ、ＮＫ細胞、単球）に割り当てられた単一細胞の８５％が、基準マーカー遺伝子評定によって同じ同一性に割り当てられた。Ａｚｉｍｕｔｈに使用した参照アトラスにはＮＫＴ細胞が存在しないことを考慮して、教師なし分析によって定義されたＴ／ＮＫＴクラスターはＣＤ８ Ｔ細胞に再ラベリングした。図８Ｃは、図３Ｂのものと同じ分析であるが、Ａｚｉｍｕｔｈによって同定された２７種全ての表現型状態を示すグラフである。これらの状態の中で、ＣＤ４ ＴＥＭが、重度のｉｒＡＥおよびＣｙＴＯＦにより列挙されたＣＤ４ ＴＥＭと最も大きく関連した。ＣＤ４ ＴＥＭとＣＤ４増殖性状態が組み合わさった集団も重度のｉｒＡＥと強力に関連した。後者は、ＨＬＡ－ＤＸの最高発現およびＳＥＬＬの最低発現を示し（パネルｄ）、これは、活性化ＣＤ４ ＴＥＭ表現型と一致する。
【図8D-E】図８Ｄは、ＡｚｉｍｕｔｈによってアノテーションされたＣＤ４ Ｔ細胞状態の中での重要な活性化マーカーおよび系列マーカーを示すドットプロットである。図８Ｅは、図８ＣおよびＦのＣＤ４ ＴＥＭ状態とＣＤ４増殖性状態の組合せを支持する、抗体由来のタグ（ＡＤＴ）データを使用したＡｚｉｍｕｔｈによるタンパク質発現レベルを示すバイオリンプロットのセットである。
【図8F】図８Ｆは、重度のｉｒＡＥの予測に関する、Ａｚｉｍｕｔｈおよび教師なしクラスタリングによって同定された最上位の細胞サブセットの性能を示すグリッドである。組合せＣＤ４ Ｔ ５＋３クラスター（図３Ｂ）は、重度のｉｒＡＥおよびＣｙＴＯＦと、最上位の参照誘導集団よりも大きく関連した（図３Ｃ）。統計的有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定を使用して算出した。示されている全てのパネル中のデータは、図３においてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイリングされた１３例の試料からのものである。
【図9A】図９Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイリングされた１３例のＰＢＭＣ試料（図１および３Ａ）における、重度のｉｒＡＥ発生と、教師なしクラスタリングによって同定されたＴ細胞状態の処置前レベル（左）およびＡｚｉｍｕｔｈによって同定されたメモリー様Ｔ細胞状態（右）の間の関連性を示すグラフである。活性化細胞をＨＬＡ－ＤＸまたはＭＫＩ６７を発現する細胞（ＣＰＭ＞０）と定義し；静止細胞をＨＬＡ－ＤＸおよびＭＫＩ６７発現が存在しないこと（ＣＰＭ＝０）によって定義した。
【図9B】図９Ｂは、活性化、静止、および親Ｔ細胞サブセットの重度のｉｒＡＥ発生との関連の分析を示すグラフのセットである。左：シングルセル発見コホートにおいて分析された（図１および２Ａ）１８例の患者全てについて、ＣｙＴＯＦによって定量された、重度のｉｒＡＥ発生と、メモリーＴ細胞サブセット、総ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞、および総Ｔ細胞の処置前レベルの間の関連性。活性化表現型をＣＤ３８＋またはＨＬＡ－ＤＲ＋またはＫｉ６７＋と定義した。静止表現型をＣＤ３８－ＨＬＡ－ＤＲ－Ｋｉ６７－と定義した。右：重度のｉｒＡＥ発生の予測に関する、活性化ＣＤ４ ＴＥＭサブセットおよび静止ＣＤ４ ＴＥＭサブセット（左側のパネル）の性能を示すＲＯＣプロット。細胞画分を、総ＰＢＭＣ含量に対して評定した。ａ、ｂにおける統計的有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定し、名目上の－ｌｏｇ１０ Ｐ値が示されている。重度のｉｒＡＥなしとの関連性については－ｌｏｇ１０ Ｐ値にさらに－１をかけた。
【図10A-B】図１０Ａは、重要なＴＣＲ多様性評価基準、ならびにそのような評価基準に対する細胞の存在量、ＴＣＲの豊富さ、および別個のクローンのレパートリーの影響を示す概略図である。仮定上のＣＤ４ナイーブおよびＴＥＭ細胞サブセットが例として示されている。大きさで差異を示す三角形は一定の縮尺では描かれていない。図１０Ｂは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの教師なしクラスタリングによって同定された各ＣＤ４ Ｔ細胞状態についての平均クローン性（１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度）に対する平均Ｓｈａｎｎｏｎエントロピーのグラフである。活性化細胞が富化されたＴＥＭ状態であるＣＤ４ Ｔ ５＋３（図３ＢおよびＣ）は、この表現型について予測される通り、他のＣＤ４状態と比べてクローン性の上昇を示す一方で、より高い多様性（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）も示し、それにより豊富さの増大も示される。
【図10C-E】図１０Ｃは、利用可能なｓｃＴＣＲクローン型データを用いた、ＥＭ様ＣＤ４ Ｔ細胞状態（図３Ｆ）の分布を示す概略図である。図１０Ｄは、処置前血液由来の偽性バルクＴ細胞における重度のｉｒＡＥ発生とＴＣＲ多様性（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）の間の関連性を示すグラフのセットである。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって同定された全てのＴ細胞状態（左）および図１０Ｃに示されているＥＭ様状態を除去した後のＴ細胞状態が示されている（重度のｉｒＡＥなし、ｎ＝５例の患者；重度のｉｒＡＥ、ｎ＝４例の患者）。箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。図１０Ｅは、図１０Ｄにおけるものと同じ関連性を示すが、ＥＭ様状態を単独で示すグラフである。箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。
【図10F-G】図１０Ｆは、処置前末梢性ＴＣＲ多様性（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）と重度のｉｒＡＥ発生の間の関連性についての曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。活性化細胞（ＨＬＡ－ＤＸまたはＭＫＩ６７についてＣＰＭ＞０）に制限した後の組合せＣＤ４ Ｔ ５＋３クラスターを含めた、ｅにおける構成する細胞状態の全ての組合せについて示されている。注目すべきことに、本分析において、活性化ＥＭ様状態の他の組合せではＡＵＣ＞０．８５は実現されなかった。図１０Ｇは、ＢＣＲクローン型多様性（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）を示すグラフである。教師なしクラスタリングによって同定された各Ｂ細胞状態（図３Ａ）について示されている。図１０ＢおよびＤ～Ｆでは、少なくとも１００種のＴＣＲクローンを有する患者のみを分析した（ｎ＝９）。一貫性のために図１０Ｇでも同じ患者について分析した。箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。
【図11A-B】図１１Ａは、ＬＭ２２シグネチャー行列（ＭＡＳ５で正規化）からの主要なＣＤ４ Ｔ細胞サブセットにおける発生的に調節されるマーカー遺伝子の発現を示すグラフである。活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞についてのＬＭ２２参照シグネチャーがＴＥＭプロファイルを有することが示されている。図１１Ｂは、１７例の転移性黒色腫患者の処置前末梢血における活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の列挙についての、マスサイトメトリーに対するＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを示すグラフである。９５％信頼度の帯を伴う線形回帰線が示されている。一致および有意性をそれぞれピアソンｒおよび両側ｔ検定によって決定した。このプロットでは、ＣｙＴＯＦによって定量化された活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞がＣＤ３８発現によって定義されたが、他の活性化ＣＤ４ ＴＥＭサブセットもＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘと有意に相関した（図１１Ｃ）。
【図11C-D】図１１Ｃは、ＣｙＴＯＦおよびＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって決定されたリンパ球サブセット出現頻度の相互相関プロットである。Ａｃｔ．、活性化された。図１１Ｄは、１７例の転移性黒色腫患者由来のＰＢＭＣにおける、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって推測された活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞レベルと、ＣｙＴＯＦによってプロファイリングされた、各集団内の手動でゲーティングしたＣＤ３８＋活性化サブセットを含めた１４種のメモリーＴ細胞状態の間の相関を示す相互相関プロットである。
【図11E-F】図１１Ｅは、バルクＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイリングされた５例の健康な対象由来の末梢血試料における、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘおよびフローサイトメトリーによって列挙されたリンパ球サブセットの包括的な相関を示す散布図である。９５％信頼度の帯を伴う線形回帰線が示されている。一致および有意性をそれぞれピアソンｒおよび両側ｔ検定によって決定した。単球はサイトメトリーでは全血球計算値と比較して可変的に少なく見積もられたので、ｂ～ｅにおける結果は全て、総リンパ球に対して表されている。図１１Ｆは、本研究における各モダリティによってプロファイリングされたｉｒＡＥについて評価可能な試料全てにわたる、ＣｙＴＯＦ（ＣＤ３８＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋またはＫｉ６７＋ＣＤ４ ＴＥＭ細胞、ｎ＝２８例の患者）、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（ＣＤ４ Ｔクラスター５および３内のＨＬＡ－ＤＸ＋またはＭＫＩ６７＋細胞、ｎ＝１３例の患者）、およびＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ（ｎ＝６０例の患者）によって定量化された活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞レベルの分布を示すグラフである。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。統計的有意性をクラスカル・ワリス検定によって決定した。ｎ．ｓ．、有意でない（Ｐ＞０．０５）。
【図12A】図１２Ａは、Ｓｈａｎｎｏｎエントロピーについて示され、治療型によって層別化された、バルクコホート１および２の各患者についてのベースラインバルクＴＣＲ多様性と観察された最も高いｉｒＡＥグレードの間の関連性を示すグラフである。併用療法を用いた処置を受けた患者が今後のｉｒＡＥの状況によって層別化されている：重度のｉｒＡＥなし（ｎ＝１０）と重度のｉｒＡＥ（ｎ＝１４例の患者）（左）ならびにｉｒＡＥグレード（右）：０／１（ｎ＝３）、２（ｎ＝７）、３（ｎ＝１２）、および４（ｎ＝２）。２群間比較を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって評定した。ｎ．ｓ．、有意でない（Ｐ＞０．０５）。線形回帰を適用して、ｉｒＡＥグレードによって群分けされた各評価基準の中央値を評価した（挿入図）。線形一致の有意性を両側ｔ検定によって決定した。グレード０および１はそれぞれ毒性なしおよび無症候性毒性を反映し、これらを併合した。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。
【図12B】図１２Ｂは、Ｇｉｎｉ－Ｓｉｍｐｓｏｎ指数について示され、治療型によって層別化された、バルクコホート１および２の各患者についてのベースラインバルクＴＣＲ多様性と観察された最も高いｉｒＡＥグレードの間の関連性を示すグラフである。併用療法を用いた処置を受けた患者が今後のｉｒＡＥの状況：重度のｉｒＡＥなし（ｎ＝１０）と重度のｉｒＡＥ（ｎ＝１４例の患者）（左）およびｉｒＡＥグレード（右）：０／１（ｎ＝３）、２（ｎ＝７）、３（ｎ＝１２）、および４（ｎ＝２）によって層別化されている。２群間比較を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって評定した。ｎ．ｓ．、有意でない（Ｐ＞０．０５）。線形回帰を適用して、ｉｒＡＥグレードによって群分けされた各評価基準の中央値を評価した（挿入図）。線形一致の有意性を両側ｔ検定によって決定した。グレード０および１はそれぞれ毒性なしおよび無症候性毒性を反映し、これらを併合した。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。
【図12C】図１２Ｃは、Ｓｈａｎｎｏｎエントロピーについて示され、治療型によって層別化された、バルクコホート１および２の各患者についてのベースラインバルクＴＣＲ多様性と観察された最も高いｉｒＡＥグレードの関連性を示すグラフである。ＰＤ１単独療法を用いた処置を受けた患者が今後のｉｒＡＥの状況：重度のｉｒＡＥなし（ｎ＝２６）と重度のｉｒＡＥ（ｎ＝３例の患者）（左）およびｉｒＡＥグレード（右）：０／１（ｎ＝１９）、２（ｎ＝７）、３（ｎ＝２）、および４（ｎ＝１）によって層別化されている。２群間比較を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって評定した。ｎ．ｓ．、有意でない（Ｐ＞０．０５）。線形回帰を適用して、ｉｒＡＥグレードによって群分けされた各評価基準の中央値を評価した（挿入図）。線形一致の有意性を両側ｔ検定によって決定した。グレード０および１はそれぞれ毒性なしおよび無症候性毒性を反映し、これらを併合した。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。
【図12D】図１２Ｄは、Ｇｉｎｉ－Ｓｉｍｐｓｏｎ指数について示され、治療型によって層別化された、バルクコホート１および２の各患者についてのベースラインバルクＴＣＲ多様性と観察された最も高いｉｒＡＥグレードの関連性を示すグラフである。２群間比較を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって評定した。ｎ．ｓ．、有意でない（Ｐ＞０．０５）。線形回帰を適用して、ｉｒＡＥグレードによって群分けされた各評価基準の中央値を評価した（挿入図）。線形一致の有意性を両側ｔ検定によって決定した。グレード０および１はそれぞれ毒性なしおよび無症候性毒性を反映し、これらを併合した。箱の中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。
【図13A-B】図１３Ａは、図４Ｄにおいて見られるものと同様であるが、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）を使用した、両方のバルクコホート（ｎ＝５３例の患者）に適用されるグラフである。図１３Ｂは、図４Ｃにおいて見られるものと同様であるが、ＬＯＯＣＶによって決定されたモデルスコアについて示すグラフである。
【図13C】図１３Ｃは、重度のｉｒＡＥ発生の予測に関する、複合モデルの性能と、他の候補処置前因子の性能とを示すプロットである。示されている通り、複合モデルをバルクコホート１（ＢＣ１）において訓練し、バルクコホート２（ＢＣ２）において検証したか、または逆に、バルクコホート２（ＢＣ２）において訓練し、バルクコホート１（ＢＣ１）において検証した。
【図13D】図１３Ｄは、バルクコホート２からの異なる患者サブグループにおける重度のｉｒＡＥの予測に関する、バルクコホート１で訓練した複合モデルの性能を示すグラフである。ＤＣＢ、長続きする臨床的利益；ＮＤＢ、長続きしない臨床的利益；ＧＩ、胃腸。
【図13E-F】図１３Ｅは、今後のｉｒＡＥグレード：０／１（ｎ＝３）、２（ｎ＝７）、３（ｎ＝１２）、および４（ｎ＝２）によって層別化された、併用療法を用いた処置を受けた全てのバルクコホート患者（ｎ＝２４）についてのＬＯＯＣＶによって決定された複合モデルスコアを示すグラフである。中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。統計的有意性をクラスカル・ワリス検定によって決定した。図１３Ｆは、図１３Ｅのスコアを使用した併用療法患者におけるグレード２＋、３＋、または４のｉｒＡＥ発生の予測に関する、モデル性能を示すグラフである。
【図13G-H】図１３Ｇは、患者当たりの症候性ｉｒＡＥ（グレード２＋）の数に対する両方のバルクコホート（ｎ＝５３例の患者）のＬＯＯＣＶによって決定された複合モデルスコアを示すグラフである。中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。統計的有意性をクラスカル・ワリス検定によって決定した。図１３Ｈは、患者当たりの器官系毒性の数に対する両方のバルクコホート（ｎ＝５３例の患者）におけるＬＯＯＣＶによって決定された複合モデルスコアを示すグラフである。中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに箱の上限下限の１．５×ＩＱＲ（四分位範囲）内の最小値および最大値を示す。統計的有意性をクラスカル・ワリス検定によって決定した。
【図13I】図１３Ｉは、患者および器官系にわたるｉｒＡＥの分布を示すプロットである。バルクコホート１および２の患者を、ＬＯＯＣＶによって決定された複合モデルスコアを低下させることによって体系化する。高／低スコアを区別する線を、ＬＯＯＣＶを使用して最適化した。
【図13J】図１３Ｊは、図１３Ｉの閾値によって層別化された、少なくとも２つの器官系にｉｒＡＥが発生した両方のバルクコホートの患者のフラクションと、発生しなかった患者のフラクションとを示すグラフである。有意性を両側フィッシャーの直接検定によって決定した。
【図14A】図１４は、検証バルクコホート２における重度のｉｒＡＥまでの時間の予測に関する複合モデル性能を示すグラフのセットである。 図１４ａ～ｃは、複合モデルスコアによって層別化された、バルクコホート２における、併用もしくはＰＤ１免疫チェックポイント遮断（ａ）、併用療法（ｂ）、またはＰＤ１単独療法（ｃ）を用いた処置を受けた患者についての重度のｉｒＡＥの非存在についてのカプラン・マイヤー分析を示すグラフである。統計的有意性を両側ログランク検定によって算出した。全てのパネルに関して、訓練をバルクコホート１に対して実施し、重度のｉｒＡＥの予測のカットポイントを、ＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用してバルクコホート１に対して最適化した。とりわけ、ａ～ｃの分析では、処置開始と処置開始後３カ月の間が目印となり、この期間内に全ての重度のｉｒＡＥが生じた。カプラン・マイヤープロットは、いかなる重度のｉｒＡＥも発生しなかった患者の延長追跡調査を考慮して４カ月まで示されている。 図１４Ａは、複合モデルスコアによって層別化された、バルクコホート２における、併用またはＰＤ１免疫チェックポイント遮断を用いた処置を受けた患者についての重度のｉｒＡＥの非存在についてのカプラン・マイヤー分析を示すグラフである。統計的有意性を両側ログランク検定によって算出した。全てのパネルに関して、訓練をバルクコホート１に対して実施し、重度のｉｒＡＥの予測のカットポイントを、ＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用してバルクコホート１に対して最適化した。とりわけ、本分析では、処置開始と処置開始後３カ月の間が目印となり、この期間内に全ての重度のｉｒＡＥが生じた。カプラン・マイヤープロットは、いかなる重度のｉｒＡＥも発生しなかった患者の延長追跡調査を考慮して４カ月まで示されている。
【図14B】図１４Ｂは、複合モデルスコアによって層別化された、バルクコホート２における、併用療法を用いた処置を受けた患者についての重度のｉｒＡＥの非存在についてのカプラン・マイヤー分析を示すグラフである。統計的有意性を両側ログランク検定によって算出した。全てのパネルに関して、訓練をバルクコホート１に対して実施し、重度のｉｒＡＥの予測のカットポイントを、ＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用してバルクコホート１に対して最適化した。とりわけ、図１４Ａ～Ｃの分析では、処置開始と処置開始後３カ月の間が目印となり、この期間内に全ての重度のｉｒＡＥが生じた。カプラン・マイヤープロットは、いかなる重度のｉｒＡＥも発生しなかった患者の延長追跡調査を考慮して４カ月まで示されている。
【図14C】図１４Ｃは、複合モデルスコアによって層別化された、バルクコホート２における、ＰＤ１単独療法を用いた処置を受けた患者についての重度のｉｒＡＥの非存在についてのカプラン・マイヤー分析を示すグラフである。統計的有意性を両側ログランク検定によって算出した。全てのパネルに関して、訓練をバルクコホート１に対して実施し、重度のｉｒＡＥの予測のカットポイントを、ＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用してバルクコホート１に対して最適化した。とりわけ、ａ～ｃの分析では、処置開始と処置開始後３カ月の間が目印となり、この期間内に全ての重度のｉｒＡＥが生じた。カプラン・マイヤープロットは、いかなる重度のｉｒＡＥも発生しなかった患者の延長追跡調査を考慮して４カ月まで示されている。
【図15A-B】図１５Ａは、対をなす処置前ＰＢＭＣ試料（ｎ＝１５例の併用療法患者）からの、ＭｉＸＣＲ（バルクＲＮＡ－ｓｅｑ）およびｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）（ゲノムＤＮＡ）によってアセンブルされたＴＣＲレパートリーの均衡度（Ｐｉｅｌｏｕの指数）を示すグラフである。一致および有意性をそれぞれスピアマンρおよび両側ｔ検定によって決定した。図１５Ｂは、図５Ｂのものと同様であるが、各処置前ＰＢＭＣ試料および処置中ＰＢＭＣ試料についてのクローン性を示すグラフである。統計的有意性を両側、対応のあるウィルコクソン順位和検定によって決定した。ｎｓ、有意でない（Ｐ＞０．０５）。
【図15C】図１５Ｃは、重度のｉｒＡＥの状況なし（ｎ＝６）および重度のｉｒＡＥの状況（ｎ＝９）によって層別化された、１５例の併用療法患者において処置中に検出された処置前末梢血ＴＣＲクローン型のフラクションを示すグラフである。マッチする増殖的ＣＤＲ３ β鎖ヌクレオチド配列を有するクローン型を同一とみなした。中央の線、箱の上端と下端、およびひげは、それぞれ中央値、第１四分位数および第３四分位数、ならびに最小値および最大値を示す。有意性を両側、対応のないウィルコクソン順位和検定によって決定した。
【図15D-E】図１５Ｄは、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）によって同定された持続性Ｔ細胞クローンと、全員が併用療法を受け、重度のＩＣＩ誘導性毒性が発生した同じ３例の患者（ＹＵＡＬＯＥ、ＹＵＮＡＮＣＹ、ＹＵＨＯＮＥＹ）由来の処置前ＰＢＭＣのｓｃＴＣＲ－ｓｅｑデータおよびｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータとの相互参照を示す概略図である。図１５Ｅは、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞に分類された持続性クローンと共にＡｚｉｍｕｔｈによってアノテーションされた主要なＴ細胞状態にわたる重要な系列マーカーおよび活性化マーカーのｌｏｇ２発現を示すドットプロットである。
【図15F】図１５Ｆは、系列（ｎ＝２の細胞型）および患者（ｎ＝３）によって層別化された、持続性クローン型の増殖的出現頻度のベースラインからの総計の変化を示すグラフである。増殖的出現頻度の差異（処置中％－処置前％）の合計を、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）データから算出した。棒は平均＋／－ＳＤを示す。
【図15G】図１５Ｇは、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）を用いた末梢血ＴＣＲ－βプロファイリングを示すグラフのセットである。上：ベースラインからのバルクＴＣＲクローン性の変化（図５ｂ）。下：図１５Ｆと同じであるが、基礎をなすクローン型を示し、円のサイズは処置前のクローン出現頻度に比例する（ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標））。
【図16】図１６は、健康対照に対する、自己免疫障害における末梢血白血球の大規模評定の図式である。健康対照と比べた、自己免疫障害における個々の循環中の白血球サブセットの富化を評価するためのワークフローおよび統計的メタ分析を記載する図式（図６）。簡単に述べると、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用して、全身性エリテマトーデス５７－５９（ＳＬＥ；ｎ＝２３９）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ；ｎ＝３４８）のいずれかを有する患者由来の末梢血試料のバルクＲＮＡ－ｓｅｑまたはマイクロアレイプロファイルにおける１５種の白血球サブセットを健康対照と比較して列挙した。各データセットおよび細胞サブセットについて、両側、対応のないウィルコクソン順位和検定を適用して、健康と疾患表現型の間の相対的な存在量の差異を評定した。その後、結果をメタ－ｚ統計値による試験にわたって併合した。
【図17A】図１７Ａは、処置前ＰＢＭＣからＣｙＴＯＦによってプロファイリングされた、ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットおよびＮＫＴ細胞についてのゲーティング階層および染色結果を示す概略図である。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）以外の全てのＣＤ４ Ｔ細胞サブセットはＣＤ８ Ｔ細胞と類似的にゲーティングした。ＴＣＭ、セントラルメモリーＴ細胞；ＴＥＭ、エフェクターメモリーＴ細胞；ＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＡ＋最終分化したエフェクターメモリーＴ細胞。
【図18A-B】図１８は、ＣｙＴＯＦデータからの自動細胞状態定量化と手動細胞状態定量化の比較を示すグラフのセットである。 図１８Ａは、示されている末梢血液細胞型についての自動ゲーティング（Ａｓｔｒｏｌａｂｅ）と手動ゲーティングの間の出現頻度の一致を示す散布図である。一致をピアソン相関および線形回帰（９５％信頼度の帯が示されている）によって評定した。両側ｔ検定を使用して、統計的有意性を評定した。データは図１においてＣｙＴＯＦによって分析した患者からのものである（ｎ＝１８）。 図１８Ｂは、図１８Ａにおいて見られるものと同様であるが、ＣＤ４ ＴＥＭ細胞についての散布図である。ＣＤ４ ＴＥＭについての代表的なゲーティングスキームが図７Ａに示されている。一致をピアソン相関および線形回帰（９５％信頼度の帯が示されている）によって評定した。両側ｔ検定を使用して、統計的有意性を評定した。データは図１においてＣｙＴＯＦによって分析した患者からのものである（ｎ＝１８）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
発明の詳細な説明
重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の組合せを用いた処置を受けた黒色腫患者の約６０％に生じ、処置関連性の病的状態および死亡の原因となる。しかし、重度のｉｒＡＥの発生またはそのタイミングを予測するための信頼できる方式は存在しない。
重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の組合せを用いた処置を受けた黒色腫患者の約６０％に生じ、処置関連性の病的状態および死亡の原因となる。しかし、重度のｉｒＡＥの発生またはそのタイミングを予測するための信頼できる方式は存在しない。
【0014】
細胞状態およびＴ細胞受容体の処置前および処置中分析により、免疫療法の毒性の発症およびそのタイミングが予測される。具体的には、末梢血中の活性化ＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞の存在量とＴ細胞受容体レパートリーの多様性を組み合わせて、免疫療法の毒性を予測する複合バイオマーカーを得る。処置前から処置中までのクローン拡大により、重度の毒性のタイミングが予測される。標的化ＲＮＡシーケンシングパネルにより、この分析が実用的かつ費用効果が大きい様式で可能になる。
【0015】
免疫療法の毒性（免疫関連有害事象）は、重度の、危険な、生命を脅かす、および致命的なものであり得る。実際には、早期または処置前にこれらの毒性を確実に予測する方式は存在しない。それができれば、毒性予測、より早期の介入、およびより個別化された精密な免疫療法の施行が容易になる。
【0016】
種々の態様では、患者における免疫療法の毒性を予測する方法が開示される。開示される方法は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量レベルおよびバルクＴＣＲ多様性を含む、末梢血試料の分析から引き出される２つの因子が、重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の発生と強力に相関するという発見に基づく。種々の態様では、免疫療法による処置を受ける前の対象から末梢血試料を得るステップを含む、患者における免疫療法の毒性を予測するリキッドバイオプシー法が開示される。種々の態様では、本方法は、末梢血試料中の活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性を定量するステップをさらに含む。一部の態様では、本方法は、患者に重度のｉｒＡＲが発生する可能性を予測するモデル指数を決定するステップをさらに含み、モデル指数は、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様性の組合せを含む。本方法は、患者を、モデル指数の値が閾値を超える場合、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップをさらに含む。一部の態様では、本方法は、モデル指数の値に基づいてｉｒＡＲの重症度を予測するステップをさらに含み、より高いモデル指数の値により、より重度のｉｒＡＲが予測される。より高いモデル指数の値の閾値は、経験的に、または既知の臨床的標準を参照することによって、決定することができる。
【0017】
種々の他の態様では、免疫療法の初期段階にわたってＴＣＲの多様性が処置前ＴＣＲの多様性と比べて増大することと本明細書では定義される、ＴＣＲ拡大の程度に基づいて、患者における免疫療法の毒性を予測する方法が開示される。本方法は、患者から、免疫療法の開始前に第１の末梢血試料を得、患者への免疫療法の施行の初期段階で第２の末梢血試料を得るステップを含む。本方法は、第１の末梢血試料から第１のＴＣＲ多様性を得、第２の末梢血試料から第２のＴＣＲ多様性を得るステップをさらに含む。本方法は、第２のＴＣＲ多様性から第１のＴＣＲ多様性を差し引いて、ＴＣＲ拡大の程度を得るステップをさらに含む。一部の態様では、本方法は、ＴＣＲ拡大の程度が閾値を超える場合、患者を、重度のｉｒＡＲが発生する可能性が高いと分類するステップをさらに含む。一部の態様では、本方法は、ＴＣＲ拡大の程度に基づいて重度のｉｒＡＲが発症する時点を予測するステップをさらに含む。
【0018】
分子操作
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義するため、および本発明の実施に関する当業者に対する手引きのために提示するものである。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用に従って理解される。
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義するため、および本発明の実施に関する当業者に対する手引きのために提示するものである。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用に従って理解される。
【0019】
「異種ＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」または「異種核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ、特定の宿主細胞に対して外来である供給源を起源とする、または、同じ供給源由来の場合は、その元の形態から改変されている配列を指す。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用によって改変されている遺伝子を包含する。この用語は、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない多数のコピーも包含する。したがって、この用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるＤＮＡセグメント、または、細胞と相同であるが、宿主細胞の核酸内の、当該エレメントが通常は見いだされない位置に存在するＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントが発現されて外因性ポリペプチドが生じる。「相同な」ＤＮＡ配列は、それが導入される宿主細胞に天然に付随するＤＮＡ配列である。
【0020】
発現ベクター、発現構築物、プラスミド、または組換えＤＮＡ構築物は、一般に、組換え手段または直接化学合成によるものを含めた人為的な介入によって生成された、例えば宿主細胞における特定の核酸の転写または翻訳を可能にする一連の特定の核酸エレメントを伴う核酸を指すと理解される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であってよい。一般には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、転写される核酸を含んでよい。
【0021】
「プロモーター」は、一般に、核酸の転写を方向付ける核酸制御配列と理解される。誘導性プロモーターは、一般に、特定の刺激に応答して、作動可能に連結した遺伝子の転写を媒介するプロモーターと理解される。プロモーターは、転写開始部位の付近の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合ではＴＡＴＡエレメントを含んでよい。プロモーターは、必要に応じて、遠位部のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでよく、これらは、転写開始部位から数千塩基対もの所に位置し得る。
【0022】
「転写可能な核酸分子」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ分子に転写することが可能な任意の核酸分子を指す。転写可能な核酸分子が、翻訳され、したがってタンパク質産物として発現される機能的なｍＲＮＡ分子に転写されるように構築物を細胞に導入するための方法は公知である。目的の特定のＲＮＡ分子の翻訳を阻害するために、アンチセンスＲＮＡ分子の発現が可能になるように構築物を構築することもできる。本開示の実施に関しては、構築物および宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法が当業者には周知である（例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717；Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929；Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773；Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754を参照されたい）。
【0023】
「転写開始部位」または「開始部位」は、＋１位とも定義される、転写される配列の一部である最初のヌクレオチドを囲む位置である。遺伝子の他の全ての配列およびその制御領域に、この開始部位を基準として番号を付すことができる。下流の配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）をプラスで命名することができ、上流の配列（５’方向にある制御領域の大部分）をマイナスで命名される。
【0024】
「作動可能に連結」または「機能的に連結」とは、単一の核酸断片上の核酸配列の、一方の機能が他方の影響を受ける関連性を指すことが好ましい。例えば、調節性ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、それらの２つの配列が、調節性ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼす（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）ように置かれている場合、「作動可能に連結」または「関連」していると言える。コード配列は、調節性配列とセンスまたはアンチセンス方向性に作動可能に連結していてよい。２つの核酸分子は、単一の連続した核酸分子の一部であってよく、また、隣接していてもよい。例えば、プロモーターが細胞における目的の遺伝子の転写を調節または媒介する場合、プロモーターは目的の遺伝子と作動可能に連結している。
【0025】
「構築物」は、一般に、任意の供給源に由来し、ゲノムへの組込みまたは自律複製が可能であり、１つまたは複数の核酸分子が作動可能に連結した核酸分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製核酸分子、ファージ、または、直鎖状または環状一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子などの任意の組換え核酸分子と理解される。
【0026】
本開示の構築物は、３’転写終結核酸分子と作動可能に連結した転写可能な核酸分子と作動可能に連結したプロモーターを含有し得る。構築物は、これだけに限定されないが、例えば３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）由来の追加的な調節性核酸分子も含み得る。構築物は、これだけに限定されないが、翻訳開始において重要な役割を果たし得、また、発現構築物内の遺伝成分でもあり得る、ｍＲＮＡ核酸分子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み得る。これらの追加的な上流および下流の調節性核酸分子は、プロモーター構築物上の他のエレメントに対してネイティブまたは異種の供給源に由来するものであってよい。
【0027】
「形質転換」という用語は、宿主細胞のゲノム内に核酸断片を移入し、それにより、遺伝学的に安定した遺伝をもたらすことを指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主細胞は「トランスジェニック」細胞と称され、トランスジェニック細胞を含む生物体は「トランスジェニック生物体」と称される。
【0028】
「形質転換された」、「トランスジェニック」、および「組換え」は、異種核酸分子が導入された細菌、シアノバクテリア、動物、または植物などの宿主細胞または生物体を指す。当技術分野で一般に知られており、開示されている通り、核酸分子をゲノム内に安定に組み込むことができる（Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis & Gelfand 1999）。公知のＰＣＲ法としては、これだけに限定されないが、対をなすプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチを有するプライマーなどを使用する方法が挙げられる。「形質転換されていない」という用語は、形質転換プロセスを経ていない通常の細胞を指す。
【0029】
「野生型」は、いかなる公知の変異も伴わない、天然に見いだされるウイルスまたは生物体を指す。
【0030】
発現されたタンパク質に対して上記の求められるパーセント同一性を有し、発現されたタンパク質の求められる活性を保持するバリアントヌクレオチド、およびそれらにコードされるポリペプチドの設計、生成、および試験は当技術分野の技術の範囲内に入る。例えば、変異体の定向進化および迅速単離は、これだけに限定されないが、Link et al. (2007) Nature Reviews 5(9), 680-688；Sanger et al. (1991) Gene 97(1), 119-123；Ghadessy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (8) 4552-4557を含めた参考文献に記載されている方法に従うことができる。したがって、当業者は、例えば、本明細書に記載の参照配列に対して少なくとも９５～９９％の同一性を有する多数のヌクレオチドおよび／またはポリペプチドバリアントを生成し、そのようなバリアントを所望の表現型について当技術分野における常套的な方法に従ってスクリーニングすることができる。
【0031】
ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性パーセント（％）は、候補配列と参照配列の２つの配列をアラインメントした場合に、参照配列と比較して、候補配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージと理解される。パーセント同一性を決定するために、配列をアラインメントし、必要であれば、ギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を実現する。パーセント同一性を決定するための配列アラインメント手順は、当業者には周知である。多くの場合、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、配列をアラインメントする。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。配列がアラインメントされたら、所与の配列Ａの所与の配列Ｂに対するパーセント配列同一性（あるいは、所与の配列Ｂに対してある特定のパーセント配列同一性を有するまたは含む所与の配列Ａと表現することができる）を、パーセント配列同一性＝Ｘ／Ｙ１００（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムによるＡとＢのアラインメントによって同一マッチとスコア化された残基の数であり、Ｙは、Ｂ内の残基の総数である）として算出することができる。配列Ａの長さと配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するパーセント配列同一性は、ＢのＡに対するパーセント配列同一性と等しくない。
【0032】
一般に、求められる活性が保持される限りは、任意の位置において保存的置換がなされてよい。置き換えられるアミノ酸が元のアミノ酸と同様の特性を有する、いわゆる保存的交換、例えば、ＧｌｕのＡｓｐによる交換、ＧｌｎのＡｓｎによる交換、ＶａｌのＩｌｅによる交換、ＬｅｕのＩｌｅによる交換、およびＳｅｒのＴｈｒによる交換を行うことができる。例えば、同様の特性を有するアミノ酸は、脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；ヒドロキシルまたは硫黄／セレン含有アミノ酸（例えば、セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、メチオニン）；環状アミノ酸（例えば、プロリン）；芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；塩基性アミノ酸（例えば、ヒスチジン、リシン、アルギニン）；または酸性アミノ酸およびそれらのアミド（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）であり得る。欠失は、アミノ酸の直接結合による置換えである。欠失の位置としては、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメインの間の連結が挙げられる。挿入は、直接結合が１つまたは複数のアミノ酸によって形式的に置き換えられる、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入である。アミノ酸配列を、当技術分野で公知のコンピュータシミュレーションプログラムを利用してモジュレートすることができ、それにより、例えば、活性の改善または調節の変更を伴うポリペプチドを生じさせることができる。これらの人工的に生成されたポリペプチド配列に基づいて、そのようなモジュレートされたポリペプチドをコードする対応する核酸分子を、所望の宿主細胞の特異的なコドン使用を使用してｉｎ－ｖｉｔｒｏで合成することができる。
【0033】
「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、６５℃、６×ＳＳＣ緩衝液（すなわち、０．９Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０９Ｍのクエン酸ナトリウム）中でのハイブリダイゼーションと定義される。これらの条件を考慮し、所与の配列のセットがハイブリダイズするかどうかに関して、２つの配列間のＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を算出することによって決定を行うことができる。特定の二重鎖が、６×ＳＳＣの塩条件下で６５℃未満の融解温度を有する場合、２つの配列はハイブリダイズしない。他方では、同じ塩条件下で融解温度が６５℃を超える場合、それらの配列はハイブリダイズする。一般に、任意のハイブリダイズしたＤＮＡ：ＤＮＡ配列の融解温度は、次式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ／Ｃ含量）－０．６３（％ホルムアミド）－（６００／ｌ）を使用して決定することができる。さらに、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴｍは、ヌクレオチド同一性が１％低下するごとに１～１．５℃低下する（例えば、Sambrook and Russel, 2006を参照されたい）。
【0034】
宿主細胞の形質転換を当技術分野で公知の種々の標準的な技法を使用して行うことができる（例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717；Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929；Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773；Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754を参照されたい）。そのような技法としては、これだけに限定されないが、ウイルス感染、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子銃媒介性送達、受容体媒介性取り込み、細胞融合、エレクトロポレーションなどが挙げられる。トランスフェクトされた細胞を選択し、増やして、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞をもたらすことができる。
【表1-1】
【表1-2】
【0035】
宿主細胞に導入することができる例示的な核酸としては、例えば、別の種由来のＤＮＡ配列もしくは遺伝子、またはさらには、同じ種を起源とするもしくは同じ種に存在するが、遺伝子操作方法によってレシピエント細胞に組み入れられた遺伝子もしくは配列が挙げられる。「外因性」という用語はまた、形質転換される細胞に通常は存在しない、もしくはおそらく単に形質転換用ＤＮＡセグメントもしくは遺伝子において見いだされるような形態、構造などでは存在しない遺伝子、または、通常存在し、天然の発現パターンとは異なる様式で発現させる、例えば、高発現させることが望まれる遺伝子も指すものとする。したがって、「外因性」遺伝子またはＤＮＡという用語は、レシピエント細胞に導入される任意の遺伝子またはＤＮＡセグメントを指すものとし、同様の遺伝子がそのような細胞にすでに存在し得るかどうかは問わない。外因性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの型としては、細胞にすでに存在するＤＮＡ、同じ型の生物体の別の個体由来のＤＮＡ、異なる生物体由来のＤＮＡ、または、外部から生成されたＤＮＡ、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ配列、もしくは合成または改変バージョンの遺伝子をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。
【0036】
本明細書に記載の手法に従って作出された宿主株を当技術分野で公知のいくつかの手段によって評価することができる（例えば、Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234；Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363；Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253を参照されたい）。
【0037】
遺伝子を下方調節またはサイレンシングする方法が当技術分野で公知である。例えば、発現されるタンパク質活性を、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質アプタマー、ヌクレオチドアプタマー、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して下方調節または排除することができる（例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよび低分子ヘアピンＲＮＡが記載されているFanning and Symonds (2006) Handb Exp Pharmacol. 173, 289-303G；デオキシリボヌクレオチド配列のターゲティングが記載されているHelene, C., et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36；Maher (1992) Bioassays 14 (12): 807-15；アプタマーが記載されているLee et al. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8；ＲＮＡｉが記載されているReynolds et al. (2004) Nature Biotechnology 22 (3), 326-330；ＲＮＡｉが記載されているPushparaj and Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6), 504-510；ＲＮＡｉが記載されているDillon et al. (2005) Annual Review of Physiology 67, 147-173；ＲＮＡｉが記載されているDykxhoorn and Lieberman (2005) Annual Review of Medicine 56, 401-423を参照されたい）。ＲＮＡｉ分子は、種々の供給源から市販されている（例えば、Ａｍｂｉｏｎ、ＴＸ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。種々のアルゴリズムを使用するいくつかのｓｉＲＮＡ分子設計プログラムが当技術分野で公知である（例えば、Ｃｅｎｉｘ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ａｍｂｉｏｎ；ＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｓｉＲＮＡ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇを参照されたい）。最適なｓｉＲＮＡ配列の定義に関して影響力の大きい形質として、ｓｉＲＮＡの末端におけるＧ／Ｃ含量、ｓｉＲＮＡの特定の内部ドメインのＴｍ、ｓｉＲＮＡの長さ、ＣＤＳ（コード領域）内の標的配列の位置、および３’オーバーハングのヌクレオチド含量が挙げられる。
【0038】
本明細書に記載の定義および方法は、本開示をより良好に定義するため、および本開示の実施に関する当業者に対する手引きのために提示するものである。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用に従って理解される。
【0039】
一部の実施形態では、本開示のある特定の実施形態の記載および特許請求のために使用される成分の分量を表す数字、分子量などの特性、反応条件などは、一部の場合では「約」という用語によって修飾されるものと理解される。一部の実施形態では、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使用されたデバイスまたは方法の平均値の標準偏差を包含することを示すために使用される。一部の実施形態では、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る、概数である。一部の実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁の数字を踏まえ、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本開示の広範囲の一部の実施形態を記載する数値範囲およびパラメータは概数であるにもかかわらず、特定の実施例において記載されている数値は、実行可能に精密に報告されている。本開示の一部の実施形態において提示されている数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見いだされる標準偏差に起因して必ず生じるある特定の誤差を含有し得る。本明細書における値の範囲の列挙は、ただ単に、その範囲内に入る別々の値それぞれを個々に参照する簡潔な方法としての機能を果たすものとする。本明細書において別段の指定のない限り、個々の値それぞれが、本明細書に個々に記載されているものと同じく本明細書に組み込まれる。
【0040】
一部の実施形態では、特定の実施形態が記載される文脈で（特に、下の特許請求の範囲のある特定の文脈で）使用される「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語および同様の言及は、特に記載がなければ、単数と複数の両方を包含すると解釈され得る。一部の実施形態では、「または（ｏｒ）」という用語は、特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される場合、代替物のみを指すまたは代替物が相互排他的であることが明示されていなければ、「および／または」を意味するように使用される。
【0041】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、オープンエンドの連結動詞である。これらの動詞の１つまたは複数のあらゆる形態または時制、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」も同じくオープンエンドである。例えば、１つまたは複数のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の方法は、それらの１つまたは複数のステップのみを有することに限定されず、他の列挙されていないステップも包含し得る。同様に、１つまたは複数の特色を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の組成物またはデバイスは、それらの１つまたは複数の特色のみを有することに限定されず、他の列挙されていない特色を包含し得る。
【0042】
本明細書に記載の方法は全て、本明細書において別段の指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書においてある特定の実施形態に関して提供されるあらゆる例、または例示する言葉（例えば、「例えば／などの」）の使用は、ただ単に、本開示をよりよく照らし出すことを意図したものであり、別に特許請求される本開示の範囲に対する限定を提起するものではない。本明細書のどの言葉も、本開示の実施のために必須である特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0043】
本明細書に開示される本開示の代替要素または実施形態の群分けは、限定とは解釈されない。各群のメンバーが、個々にまたは本明細書に見いだされる群の他のメンバーもしくは他の要素との任意の組合せで言及および特許請求され得る。群の１つまたは複数のメンバーを利便性または特許性のために群に包含することもでき、群から除外することもできる。何らかのそのような包含または除外がなされる場合、本明細書は、ここでは改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の記載を満たすとみなされる。
【0044】
上記明細書に基づいて理解される通り、本開示の上記の態様は、コンピュータソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、またはこれらの任意の組合せもしくはサブセットを含めたコンピュータプログラミングまたは操作技法を使用して実行することができる。コンピュータ可読コード手段を有するそのような結果得られたプログラムはいずれも、本開示の考察された態様に応じて、１つまたは複数のコンピュータ可読媒体内に具体化または提供し、それにより、コンピュータプログラム製品、すなわち、製造品を作製することができる。コンピュータ可読媒体は、例えば、これだけに限定されないが、固定（ハード）ドライブ、ディスケット、光ディスク、磁気テープ、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）などの半導体メモリ、および／または、インターネットもしくは他の通信ネットワークもしくはリンクなどの任意の送信／受信媒体であってよい。コンピュータコードを含有する製造品は、１つの媒体から直接コードを実行することによって、１つの媒体から別の媒体にコードをコピーすることによって、またはコードをネットワークで送信することによって、作製および／または使用することができる。
【0045】
これらのコンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、「ａｐｐ」、またはコードとしても公知）は、プログラム可能なプロセッサに対する機械命令を含み、高水準手続き型および／もしくはオブジェクト指向型プログラミング言語で、ならびに／または、アセンブリ言語／機械語でインプリメントすることができる。本明細書で使用される場合、「機械可読媒体」および／または「コンピュータ可読媒体」という用語は、機械命令を機械可読シグナルとして受け取る機械可読媒体を含めたプログラム可能なプロセッサに機械命令および／またはデータを提供するために使用される任意のコンピュータプログラム製品、装置および／またはデバイス（例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ、プログラム可能論理デバイス（ＰＬＤ））を指す。しかし、「機械可読媒体」および「コンピュータ可読媒体」は、一時的シグナルを包含しない。「機械可読シグナル」という用語は、プログラム可能なプロセッサに機械命令および／またはデータを提供するために使用される任意のシグナルを指す。
【0046】
本明細書で使用される場合、プロセッサは、マイクロコントローラーを使用するシステム、縮小命令セット回路（ＲＩＳＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、論理回路、および本明細書に記載の機能を実行することが可能な任意の他の回路またはプロセッサを含めた任意のプログラム可能なシステムを含むことができる。上記の例は単なる例であり、したがって、「プロセッサ」という用語の定義および／または意味をいかようにも限定するものではない。
【0047】
本明細書で使用される場合、「ソフトウェア」および「ファームウェア」という用語は、互換的であり、プロセッサによる実行のためにＲＡＭメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、および不揮発性ＲＡＭ（ＮＶＲＡＭ）メモリを含めたメモリに保存されている任意のコンピュータプログラムを包含する。上記のメモリの型は単なる例であり、したがって、コンピュータプログラムの保存のために使用可能なメモリの型に関して限定するものではない。
【0048】
一態様では、コンピュータプログラムが提供され、プログラムがコンピュータ可読媒体上に具体化される。一態様では、システムは単一のコンピュータシステムで実行され、サーバーコンピュータへの接続は必要ない。さらなる態様では、システムをＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）環境（ＷｉｎｄｏｗｓはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎの登録商標である）で走らせる。さらに別の態様では、システムをメインフレーム環境およびＵＮＩＸ（登録商標）サーバー環境（ＵＮＩＸはＲｅａｄｉｎｇ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ ＫｉｎｇｄｏｍにあるＸ／Ｏｐｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄの登録商標である）で走らせる。アプリケーションは、順応性があり、種々の異なる環境でいかなる主要な機能性も損なわずに走るように設計される。
【0049】
一部の態様では、システムは、複数のコンピューティングデバイスに分配される複数の構成要素を含む。１つまたは複数の構成要素は、コンピュータ可読媒体に具体化されたコンピュータで実行可能な命令の形態であってよい。システムおよびプロセスは、本明細書に記載の特定の態様に限定されない。さらに、各システムおよび各プロセスの構成要素は、本明細書に記載の他の構成要素およびプロセスとは独立して、別々に実施することができる。各構成要素およびプロセスを他のアセンブリパッケージおよびプロセスと組み合わせて使用することもできる。本態様により、コンピュータおよび／またはコンピュータシステムの機能性および機能を増強することができる。
【0050】
本出願において引用されている刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は全て、個々の刊行物、特許、特許出願、または他の参考文献がそれぞれ具体的にかつ個別にあらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれることが示されたものと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本開示の先行技術であることの容認と解釈されるべきではない。
【0051】
本開示を詳細に記載したので、添付の特許請求の範囲において定義される本開示の範囲から逸脱することなく、改変、変形、および等価の実施形態が可能であることが明らかになろう。さらに、本開示における例は全て非限定的な例として提示されていることが理解されるべきである。
【実施例】
【0052】
以下の非限定的な例は、本開示をさらに例示するために提示される。実施例に開示されている技法は、本開示の実施において十分に機能することが本発明者らにより見いだされた代表的な手法に従ったものであり、したがって、それを実施するための形式の例を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【0053】
（実施例１）
黒色腫患者における免疫チェックポイント遮断に対する毒性に関連するＴ細胞の特徴
以下の実施例は、黒色腫患者において免疫療法の施行に伴って重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を予測するための方法を記載するものである。
黒色腫患者における免疫チェックポイント遮断に対する毒性に関連するＴ細胞の特徴
以下の実施例は、黒色腫患者において免疫療法の施行に伴って重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が発生する可能性を予測するための方法を記載するものである。
【0054】
要約：
免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を用いた処置を受けた黒色腫患者の６０％に至るまでにおいて重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が生じる。しかし、ｉｒＡＥ発生に先立って共通のベースライン免疫学的状態が生じるかどうかは不明である。本実施例では、飛行時間によるマスサイトメトリー、シングルセルＲＮＡシーケンシング、シングルセルＶ（Ｄ）Ｊシーケンシング、バルクＲＮＡシーケンシング、およびバルクＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシングを適用して、抗ＰＤ－１単独療法または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４の併用ＩＣＩを用いた処置を受けた黒色腫患者由来の末梢血試料を試験した。ＩＣＩを受ける前およびＩＣＩを受けている初期段階の血液試料９３例、ならびに３つの患者コホート（ｎ＝２７、２６、および１８）を分析することにより、循環中の２つの処置前因子、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴＣＲ多様性が、器官系関与にかかわらず重度のｉｒＡＥ発生に関連することが見いだされた。併用療法を受けている患者の間でのＴＣＲクローン性の処置中の変化についても探究し、知見がｉｒＡＥ発症の重症度およびタイミングと関連付けられた。これらの結果から、ＩＣＩ誘導性毒性に関連する循環中のＴ細胞の特徴が実証され、診断および臨床管理の改善が示唆される。
免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を用いた処置を受けた黒色腫患者の６０％に至るまでにおいて重度の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）が生じる。しかし、ｉｒＡＥ発生に先立って共通のベースライン免疫学的状態が生じるかどうかは不明である。本実施例では、飛行時間によるマスサイトメトリー、シングルセルＲＮＡシーケンシング、シングルセルＶ（Ｄ）Ｊシーケンシング、バルクＲＮＡシーケンシング、およびバルクＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシングを適用して、抗ＰＤ－１単独療法または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４の併用ＩＣＩを用いた処置を受けた黒色腫患者由来の末梢血試料を試験した。ＩＣＩを受ける前およびＩＣＩを受けている初期段階の血液試料９３例、ならびに３つの患者コホート（ｎ＝２７、２６、および１８）を分析することにより、循環中の２つの処置前因子、活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞の存在量およびＴＣＲ多様性が、器官系関与にかかわらず重度のｉｒＡＥ発生に関連することが見いだされた。併用療法を受けている患者の間でのＴＣＲクローン性の処置中の変化についても探究し、知見がｉｒＡＥ発症の重症度およびタイミングと関連付けられた。これらの結果から、ＩＣＩ誘導性毒性に関連する循環中のＴ細胞の特徴が実証され、診断および臨床管理の改善が示唆される。
【0055】
結果：
本試験では、転移性黒色腫患者におけるＩＣＩ誘導性毒性に関連する末梢血の免疫学的特色を体系的に評価した。別個のシングルセルおよびバルクプロファイリングモダリティにわたって、処置開始から３カ月以内に重度のｉｒＡＥの発生と関係する共通のＴ細胞の特色が同定された。これらの特色は、長続きする臨床応答および抗ＰＤ－１単独療法または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４の併用療法を用いた処置を含めた重要な臨床的変数とは無関係であった。これらの知見を活用し、ｉｒＡＥ発生の予測モデルを開発し、処置前および処置中の初期段階でのＩＣＩ誘導性毒性の同定に関するそれらの有用性を探究した。
本試験では、転移性黒色腫患者におけるＩＣＩ誘導性毒性に関連する末梢血の免疫学的特色を体系的に評価した。別個のシングルセルおよびバルクプロファイリングモダリティにわたって、処置開始から３カ月以内に重度のｉｒＡＥの発生と関係する共通のＴ細胞の特色が同定された。これらの特色は、長続きする臨床応答および抗ＰＤ－１単独療法または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４の併用療法を用いた処置を含めた重要な臨床的変数とは無関係であった。これらの知見を活用し、ｉｒＡＥ発生の予測モデルを開発し、処置前および処置中の初期段階でのＩＣＩ誘導性毒性の同定に関するそれらの有用性を探究した。
【0056】
臨床コホートの特徴。
重度の（グレード３＋）ｉｒＡＥ発生に関連する候補危険因子を試験するために、転移性黒色腫の７８例の患者を同定し、除外基準の適用後、そのうち７１例が評価可能であった（図１）。これらの患者のうち、３３例が抗ＰＤ－１単独療法を用いた処置を受け、３８例が抗ＰＤ－１プラス抗ＣＴＬＡ－４併用療法を用いた処置を受けた。また、９０％が以前のＩＣＩ歴を有さなかった。患者全員を、ＩＣＩによる処置中および処置後にｉｒＡＥ発生について注意深くモニタリングした（追跡調査期間の中央値１４．９カ月；グレード３＋ｉｒＡＥまでの時間の中央値１．５カ月）。大多数の患者に軽度（グレード１）～生命を脅かす（グレード４）の１つまたは複数のｉｒＡＥが生じ、多様な器官系が影響を受け、それらを認定臨床医が標準化された基準（ＣＴＣＡＥ ｖ．５．０）に従って分類した。７１例の患者を、３つの重複しないコホート、シングルセル発見コホート、および訓練セットと検証セットに分割されるより大きなバルクコホートに層別化した（図１）。
重度の（グレード３＋）ｉｒＡＥ発生に関連する候補危険因子を試験するために、転移性黒色腫の７８例の患者を同定し、除外基準の適用後、そのうち７１例が評価可能であった（図１）。これらの患者のうち、３３例が抗ＰＤ－１単独療法を用いた処置を受け、３８例が抗ＰＤ－１プラス抗ＣＴＬＡ－４併用療法を用いた処置を受けた。また、９０％が以前のＩＣＩ歴を有さなかった。患者全員を、ＩＣＩによる処置中および処置後にｉｒＡＥ発生について注意深くモニタリングした（追跡調査期間の中央値１４．９カ月；グレード３＋ｉｒＡＥまでの時間の中央値１．５カ月）。大多数の患者に軽度（グレード１）～生命を脅かす（グレード４）の１つまたは複数のｉｒＡＥが生じ、多様な器官系が影響を受け、それらを認定臨床医が標準化された基準（ＣＴＣＡＥ ｖ．５．０）に従って分類した。７１例の患者を、３つの重複しないコホート、シングルセル発見コホート、および訓練セットと検証セットに分割されるより大きなバルクコホートに層別化した（図１）。
【0057】
処置前血液からの重度のｉｒＡＥの決定因子。
マスサイトメトリーを使用して処置前末梢血を分析して、重度のｉｒＡＥの細胞内決定因子を同定した。
マスサイトメトリーを使用して処置前末梢血を分析して、重度のｉｒＡＥの細胞内決定因子を同定した。
【0058】
まず、１８例の患者由来の処置前末梢血試料の高次元シングルセルプロファイリングを実施し（シングルセル発見コホート、図１および２Ａ）、そのうち８例の患者で処置開始後に重度のｉｒＡＥが生じた。各試料中の３５種の白血球マーカーをプロファイリングするために飛行時間によるマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）を適用することにより、ほぼ８００，０００個の評価可能な細胞から２０の別個の亜集団を分析し、それらには７種の主要な単核系列（Ｂ細胞、形質芽球、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、単球）が包含された（図２Ｂ、２Ｃ、７、および８Ａ）。次に、各亜集団を重度のｉｒＡＥ転帰に関して調べた（図２ｃ）。全ての亜集団のうち、ＣＤ４エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞のみが多重仮説補正後に有意であり、処置前血液中のレベルがより高いことが重度のｉｒＡＥ発生に関連した（ｐ＝０．０００２；Ｑ＝０．００４；図２Ｃ、２Ｄ、７Ｂ、８Ｂ、および８Ｃ）。この知見を確証するために、１３例の患者由来の同じ末梢血試料を、５’液滴ベースの１０×クロムシングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）をＴＣＲおよびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）クローン型のシングルセルＶ（Ｄ）Ｊシーケンシング（ｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑ）と対にして使用して調査した。品質管理後（図７Ａ）、５’アッセイにより、２４，８０７個の細胞、および基準マーカー遺伝子発現に基づいて分類された７種の主要系列が得られた（図３Ａ）。教師なしクラスタリングを使用し、７種の細胞型にわたって３２種の別個の転写状態を同定した（図３Ａ）。次いで、細胞状態の存在量と重度のｉｒＡＥの発生の関連性を算出した。驚くべきことに、これらの３２種の細胞状態にわたって、ＣＣＲ７およびＳＥＬＬ（ＣＤ６２Ｌ）の発現を欠き、ＣＤ４ ＴＥＭ細胞と一致するＣＤ４ Ｔ細胞状態５が、重度のｉｒＡＥ発生と最も強力に関連することが見いだされた（名目上のＰ＝０．０５、両側、対応のないウィルコクソン順位和検定；図３Ｂ）。この状態はまた、ＣｙＴＯＦによって測定されたＣＤ４ ＴＥＭレベルと最も相関した（図３Ｂ）。この結果の同時確率を並べ替え検定によって検討したところ、経験的Ｐ値０．００３が算出された。さらなる分析により、教師なし階層的クラスタリングによって状態５と密接に関連付けられる（図７Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞状態３もまた、ＣＤ４ ＴＥＭと一致する発現プロファイルを示すことが明らかになった（図３Ｃおよび７Ｃ）。状態５と組み合わせたところ、得られたクラスター（ＣＤ４ Ｔ ５＋３）は重度のｉｒＡＥ発生およびＣｙＴＯＦによって列挙されたＣＤ４ ＴＥＭレベルとより有意に関連した（図３Ｂ）。実際、８２通りの可能性のある各主要細胞型内の細胞状態のペアワイズ組合せ全てにわたって、ＣＤ４ Ｔ ５＋３により、ＣｙＴＯＦによって列挙されたＣＤ４ ＴＥＭレベルに対する最も高いスピアマン相関と、重度のｉｒＡＥ発生との最も強い関連性の両方が実現された（図７Ｄおよび７Ｅ）。
【0059】
他のＣＤ４ Ｔ細胞状態に対する差次的遺伝子発現分析により、ＣＤ４ Ｔ ５および３では、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＭＫＩ６７、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＣＣＬ５、およびＩＬ３２を含む活性化エフェクター細胞のマーカーが富化されており、ＴＣＭ細胞のマーカー（ＳＥＬＬ／ＣＤ６２Ｌ）およびナイーブＴ細胞のマーカー（ＣＣＲ７、ＴＣＦ７）が枯渇していることが明らかになった（図３Ｃおよび７Ｃ）。参照誘導細胞ラベリングのためにＳｅｕｒａｔ Ａｚｉｍｕｔｈを使用し、ＣＤ４ ＴＥＭ細胞が重度のｉｒＡＥと最も大きく関連し、ｄｅ ｎｏｖｏ分析によって同定されたＣＤ４ Ｔ ５＋３集団とほぼ同様であることが確認された（図８）。さらに、ＣＤ４ Ｔ ５＋３集団を基準活性化マーカー（ＨＬＡ－ＤＸ、ＭＫＩ６７）の発現に基づいて活性化サブセットと静止サブセットに細分したところ、活性化サブセットは重度のｉｒＡＥ発生との最も強い関連性を示した（Ｐ＝０．００２、両側、対応のないウィルコクソン順位和検定；図３Ｄおよび９Ａ）。この知見を、Ａｚｉｍｕｔｈを用いた、およびＣｙＴＯＦを用いた参照誘導アノテーションを使用して検証し（図９Ａおよび９Ｂ）、それにより、活性化ＣＤ４ ＴＥＭ細胞が優先的に重度のＩＣＩ毒性の基礎をなすことが示唆された。
【0060】
この観察を考慮して、活性化ＣＤ４ ＴＥＭ細胞における処置前ＴＣＲ多様性も重度のＩＣＩ毒性と相関し得るかどうかという疑問が生じた。実際に、活性化ＣＤ４ Ｔ ５＋３細胞のシングルセルＴＣＲクローン型多様性（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）は重度のｉｒＡＥが生じた患者において上昇していた（受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）＝０．９０、Ｐ＝０．０５；図３Ｅ）。このことから、活性化ＣＤ４ ＴＥＭ細胞を総末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して定量した場合、試料中の独特のクローン型の数、およびＳｈａｎｎｏｎエントロピーを含めた多様性メトリクスの重要な構成要素によって定義されるＴＣＲの豊富さにより、クローン拡大に起因する多様性の喪失が覆い隠されることが示唆される（図１０ＡおよびＢ）。言い換えれば、総ＰＢＭＣの中で、活性化ＣＤ４ ＴＥＭ細胞のＴＣＲの豊富さが、重度のｉｒＡＥが発生することになる患者における処置前ＴＣＲ多様性の全体的な増大の基礎をなす。とりわけ、豊富さを組み入れるクローン型多様性の定義に関しては、循環中のＴ細胞および腫瘍浸潤性Ｔ細胞に関する試験を含め、以前の文献に実質的な先例があり、本研究におけるそれらの適用の強力な基盤がもたらされる。
【0061】
全ての評価可能なＴ細胞を組み合わせた場合、このＴＣＲ多様性と重度のｉｒＡＥ発生の関連性は他のＴ細胞亜集団においては減弱したまたは存在しなかったが、処置前の試料中のバルクＴＣＲ多様性と重度のｉｒＡＥ発生の間には著しい傾向が観察された（ＡＵＣ＝０．８０；図３Ｅ）。さらに、この関連性は、エフェクターメモリープロファイル（低ＣＣＲ７およびＳＥＬＬ）を有するＣＤ４ Ｔ細胞に主に起因するものであった（図３Ｆおよび１０Ｃ～Ｆ）。対照的に、重度のｉｒＡＥ発生と関係する末梢血ＢＣＲ多様性の差異の顕著さはより低かった（図１０Ｇ）。集合的に、これらの知見から、バルク末梢血に広範に反映される、ベースライン時のＣＤ４ ＴＥＭ細胞におけるより多様なＴＣＲレパートリーが、重度のＩＣＩ毒性の発生と関連することが示唆される。
【0062】
ｉｒＡＥに関連するＴ細胞の特色の広範な分析。
重度のｉｒＡＥ発生に関する処置前の決定因子の候補が同定されたので、より大きな独立した患者の群において知見を検証した。サンプルサイズ推定値に基づいて、単一薬剤（抗ＰＤ－１、ｎ＝２９）または薬剤併用（抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４、ｎ＝２４）によるチェックポイント遮断を用いて処置した２つのコホート（ｎ＝２６および２７）にわたる５３例の追加的な転移性黒色腫患者由来の処置前末梢血試料に対してバルクＲＮＡシーケンシング（バルクＲＮＡ－ｓｅｑ）を適用した（図１）。循環中の免疫学的特色をバルクトランスクリプトームプロファイルで評定するために、バルク組織発現プロファイルから細胞サブセットを列挙するための機械学習手法であるＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、およびバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータからのＶ（Ｄ）Ｊクローン型アセンブリおよび定量化のためのコンピュータによる手法であるＭｉＸＣＲを適用した。サイトメトリーアッセイと直接比較することにより、１７例の黒色腫患者由来の末梢血を使用した活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞（ＴＭ）シグネチャーの活性化ＣＤ４ ＴＥＭ細胞に対する特異性（ＣｙＴＯＦ）を含め、主要な血液系列のデコンボリューションに関するＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの正解度を確認した（図１１）。驚くべきことに、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって評価可能であった１３例のＰＢＭＣサブセットのうち、活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞レベルのみが重度のｉｒＡＥ発生と関連した（図４Ａ；併用およびＰＤ－１についてそれぞれＰ＜０．０２５、ＨＲ＝８．３および１４．８；図１４ＢおよびＣ）またはＬＯＯＣＶによるコホートにわたって（併用療法についてＰ＝０．００２８およびＨＲ＝１２．２、図５Ａ；ＰＤ－１治療についてＰ＝０．０３およびＨＲ＝９．０）。このモデルにより、独立に、治療型、年齢、性別、および他の重要なパラメータの多変量モデルで、重度のｉｒＡＥまでの時間も予測した。
重度のｉｒＡＥ発生に関する処置前の決定因子の候補が同定されたので、より大きな独立した患者の群において知見を検証した。サンプルサイズ推定値に基づいて、単一薬剤（抗ＰＤ－１、ｎ＝２９）または薬剤併用（抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４、ｎ＝２４）によるチェックポイント遮断を用いて処置した２つのコホート（ｎ＝２６および２７）にわたる５３例の追加的な転移性黒色腫患者由来の処置前末梢血試料に対してバルクＲＮＡシーケンシング（バルクＲＮＡ－ｓｅｑ）を適用した（図１）。循環中の免疫学的特色をバルクトランスクリプトームプロファイルで評定するために、バルク組織発現プロファイルから細胞サブセットを列挙するための機械学習手法であるＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、およびバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータからのＶ（Ｄ）Ｊクローン型アセンブリおよび定量化のためのコンピュータによる手法であるＭｉＸＣＲを適用した。サイトメトリーアッセイと直接比較することにより、１７例の黒色腫患者由来の末梢血を使用した活性化ＣＤ４メモリーＴ細胞（ＴＭ）シグネチャーの活性化ＣＤ４ ＴＥＭ細胞に対する特異性（ＣｙＴＯＦ）を含め、主要な血液系列のデコンボリューションに関するＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの正解度を確認した（図１１）。驚くべきことに、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって評価可能であった１３例のＰＢＭＣサブセットのうち、活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞レベルのみが重度のｉｒＡＥ発生と関連した（図４Ａ；併用およびＰＤ－１についてそれぞれＰ＜０．０２５、ＨＲ＝８．３および１４．８；図１４ＢおよびＣ）またはＬＯＯＣＶによるコホートにわたって（併用療法についてＰ＝０．００２８およびＨＲ＝１２．２、図５Ａ；ＰＤ－１治療についてＰ＝０．０３およびＨＲ＝９．０）。このモデルにより、独立に、治療型、年齢、性別、および他の重要なパラメータの多変量モデルで、重度のｉｒＡＥまでの時間も予測した。
【0063】
重度のｉｒＡＥと関係する末梢ＴＣＲクローン拡大。
致命的なＩＣＩ媒介性毒性が生じた黒色腫患者に関する以前の症例報告により、患部組織におけるクローン拡大した自己反応性またはウイルス反応性Ｔ細胞の証拠が示され、これにより、自己認識および病原体認識Ｔ細胞クローンと致死的毒性が関係付けられる。したがって、末梢血中の処置前ＴＣＲクローン型が、ＩＣＩ処置開始後に重度のｉｒＡＥが発生することになる患者においてより強い拡大の傾向を示し得ることが仮定された。これを調査するために、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱを適用して、併用療法を用いた処置を受けた転移性黒色腫患者１５例から採取された、対をなす処置前ＰＢＭＣ試料と処置中の初期段階のＰＢＭＣ試料におけるバルクＴＣＲ－βレパートリーをプロファイリングした。捕捉されるクローンの数の変動に対してロバストなＴＣＲクローン性指数（Ｐｉｅｌｏｕの均衡度）を使用し、これらの１５例の患者由来の処置前の試料に関してＭｉＸＣＲ（バルクＲＮＡ－ｓｅｑ）とｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（ＤＮＡ）の間の有意な一致が確認され、それにより、バルクコホート１および２における複合モデルの完全性が強調された（図１５Ａ）。次いで、処置開始後の、１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度の増加によって測定されるＴＣＲクローン拡大（すなわち、クローン優位性）を評定した。仮説の裏付けとして、重度のｉｒＡＥが発生した患者において、重度のｉｒＡＥが発生しなかった患者と比較して、ＴＣＲクローン拡大の有意な増大およびベースラインクローンの持続性の両方が観察された（図５Ｂ、１５Ｂ、１５Ｃ）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびシングルセルＴＣＲシーケンシング（ｓｃＴＣＲ－ｓｅｑ）を実施した重度のｉｒＡＥ患者（ｎ＝３）では、両方の採取血において検出されたクローンの間で、活性化ＣＤ４ ＴＥＭコンパートメントの優先的な拡大が観察された（図１５Ｄ～Ｇ）。さらに、持続性ＣＤ４ Ｔ細胞クローンでは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析による同定で、ＣＤ４ Ｔ ５＋３集団が高度に富化されていた（図５Ｃおよび１５Ｅ）。
致命的なＩＣＩ媒介性毒性が生じた黒色腫患者に関する以前の症例報告により、患部組織におけるクローン拡大した自己反応性またはウイルス反応性Ｔ細胞の証拠が示され、これにより、自己認識および病原体認識Ｔ細胞クローンと致死的毒性が関係付けられる。したがって、末梢血中の処置前ＴＣＲクローン型が、ＩＣＩ処置開始後に重度のｉｒＡＥが発生することになる患者においてより強い拡大の傾向を示し得ることが仮定された。これを調査するために、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱを適用して、併用療法を用いた処置を受けた転移性黒色腫患者１５例から採取された、対をなす処置前ＰＢＭＣ試料と処置中の初期段階のＰＢＭＣ試料におけるバルクＴＣＲ－βレパートリーをプロファイリングした。捕捉されるクローンの数の変動に対してロバストなＴＣＲクローン性指数（Ｐｉｅｌｏｕの均衡度）を使用し、これらの１５例の患者由来の処置前の試料に関してＭｉＸＣＲ（バルクＲＮＡ－ｓｅｑ）とｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（ＤＮＡ）の間の有意な一致が確認され、それにより、バルクコホート１および２における複合モデルの完全性が強調された（図１５Ａ）。次いで、処置開始後の、１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度の増加によって測定されるＴＣＲクローン拡大（すなわち、クローン優位性）を評定した。仮説の裏付けとして、重度のｉｒＡＥが発生した患者において、重度のｉｒＡＥが発生しなかった患者と比較して、ＴＣＲクローン拡大の有意な増大およびベースラインクローンの持続性の両方が観察された（図５Ｂ、１５Ｂ、１５Ｃ）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびシングルセルＴＣＲシーケンシング（ｓｃＴＣＲ－ｓｅｑ）を実施した重度のｉｒＡＥ患者（ｎ＝３）では、両方の採取血において検出されたクローンの間で、活性化ＣＤ４ ＴＥＭコンパートメントの優先的な拡大が観察された（図１５Ｄ～Ｇ）。さらに、持続性ＣＤ４ Ｔ細胞クローンでは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析による同定で、ＣＤ４ Ｔ ５＋３集団が高度に富化されていた（図５Ｃおよび１５Ｅ）。
【0064】
処置中の初期段階におけるＴＣＲクローン拡大の程度が重度のｉｒＡＥ発生のタイミングと相関するかどうかをさらに探究した。実際に、ログランク検定によって三分位値で評定したかまたはコックス比例ハザード回帰によって順位により評定したかにかかわらず、ＴＣＲクローン拡大の規模がより大きい患者では重度のｉｒＡＥがより早く発生した（Ｐ＝０．００３、ログランク検定；図５Ｄ）。これらの結果は、分析を、ＩＣＩサイクル１から１カ月以内に得た処置中の採取血に制限した場合、採取血間の時間とは有意に独立していた（図１５Ｈ）。
【0065】
自己免疫疾患における循環中の白血球。
最後に、重度のｉｒＡＥが発生するリスクがある患者のベースライン末梢血プロファイルが臨床的自己免疫と対応するかどうかを問われた。この目的のために、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用して、６つの試験、および１９１例の健康対照に対して全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のいずれかを有する５８７例の患者にわたるバルク末梢血トランスクリプトームにおいて１５の白血球サブセットを調査した。メタ分析フレームワークを使用して、試験および病的逸脱にわたってＰ値を組み込み（図１６）、それにより、循環中の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞が、健康な個体と比べて自己免疫障害と最も有意に関連することが見いだされた（図６）。これらのデータから、重度のｉｒＡＥが、ＩＣＩ投与により臨床的に表に現れる不顕性または潜在型の自己免疫の状態を表し得ることが示唆され、これは、免疫チェックポイント遮断を用いた処置を受けた自己免疫患者が自己免疫症状として発赤を生じる傾向があることを示す最近の症例報告および多施設データと一致する。
最後に、重度のｉｒＡＥが発生するリスクがある患者のベースライン末梢血プロファイルが臨床的自己免疫と対応するかどうかを問われた。この目的のために、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用して、６つの試験、および１９１例の健康対照に対して全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のいずれかを有する５８７例の患者にわたるバルク末梢血トランスクリプトームにおいて１５の白血球サブセットを調査した。メタ分析フレームワークを使用して、試験および病的逸脱にわたってＰ値を組み込み（図１６）、それにより、循環中の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞が、健康な個体と比べて自己免疫障害と最も有意に関連することが見いだされた（図６）。これらのデータから、重度のｉｒＡＥが、ＩＣＩ投与により臨床的に表に現れる不顕性または潜在型の自己免疫の状態を表し得ることが示唆され、これは、免疫チェックポイント遮断を用いた処置を受けた自己免疫患者が自己免疫症状として発赤を生じる傾向があることを示す最近の症例報告および多施設データと一致する。
【0066】
考察
本試験では、２つのベースライン特色－末梢血中の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞の存在量およびクローン的により多様なＴＣＲレパートリー－が、転移性黒色腫患者におけるＩＣＩ誘導性ｉｒＡＥに関する有望な決定因子として同定された。以前の試験において（１）死後組織における活性化Ｔ細胞およびクローン拡大したＴＣＲが致死的ｉｒＡＥ（心筋炎、脳炎）と関係付けられ、（２）エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞が器官特異的ｉｒＡＥ（破壊性甲状腺炎、肝炎）に関係付けられたが、本研究は、これらの知見の範囲を、多様な器官系におけるｉｒＡＥ発生における処置前のＴ細胞の特徴に拡大するものである。これらの特色を複合モデルに組み込むことにより、重度のｉｒＡＥのより高いリスクが予測され、異なるｉｒＡＥグレードおよび負荷量を区別するために十分な粒度が実証された。
本試験では、２つのベースライン特色－末梢血中の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞の存在量およびクローン的により多様なＴＣＲレパートリー－が、転移性黒色腫患者におけるＩＣＩ誘導性ｉｒＡＥに関する有望な決定因子として同定された。以前の試験において（１）死後組織における活性化Ｔ細胞およびクローン拡大したＴＣＲが致死的ｉｒＡＥ（心筋炎、脳炎）と関係付けられ、（２）エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞が器官特異的ｉｒＡＥ（破壊性甲状腺炎、肝炎）に関係付けられたが、本研究は、これらの知見の範囲を、多様な器官系におけるｉｒＡＥ発生における処置前のＴ細胞の特徴に拡大するものである。これらの特色を複合モデルに組み込むことにより、重度のｉｒＡＥのより高いリスクが予測され、異なるｉｒＡＥグレードおよび負荷量を区別するために十分な粒度が実証された。
【0067】
併用療法を用いた処置を受けた患者における初期のＴ細胞クローン拡大と重度のｉｒＡＥ発症のタイミングにも著しい相関が同定された。この知見をさらに特徴付け、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のｉｒＡＥ関連性クローンダイナミクスに対する相対的な寄与を解明するために、今後の試験が必要である。
【0068】
ｉｒＡＥ発生および自己免疫の両方の基礎をなす共通の免疫学的機構の可能性と一致して、ＳＬＥまたはＩＢＤを有する患者における活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞のレベルの上昇もさらに観察された。以前の自己免疫を有する患者では活性化ＣＤ４ Ｔ細胞レベルがより高く、ＩＣＩによる重度のｉｒＡＥの率がより高くなると予測することが合理的であるが、当該コホートの患者はいずれも、実証された既存の自己免疫を有していなかった。さらに、そのような患者では、ＩＣＩの開始前に、ベースラインｉｒＡＥリスクを変化させる代償的な免疫調節性機構が発生する可能性がある。それにもかかわらず、このつながりを今後の試験においてさらに詳細に試験し、重度のＩＣＩ毒性のリスクがある患者において循環中の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞が自己抗原を認識する傾向の増大を示すかどうかを決定することが重要である。実際に、発赤のリスクは、併用免疫療法を用いた処置を受けた自己免疫疾患患者、特に、胃腸またはリウマチ性の状態を有する患者においてより高い。ＩＣＩの決定を行う間にこれらのリスクがある患者をより確実に同定することにより、その患者の転帰が改善され得る。
【0069】
本試験にはいくつかの限界がある。第１に、保存臨床試料を使用した遡及的設計を使用した。第２に、患者は、抗ＰＤ－１単独療法または抗ＰＤ－１プラス抗ＣＴＬＡ－４併用療法のいずれかを受けたが、これらに関連する重度のｉｒＡＥ発生のリスクプロファイルは異なる。第３に、大多数のｉｒＡＥはＩＣＩによる処置を開始してから最初の３カ月以内に生じるが、一部はもっと後に生じる。本発明者らのコホートにおける重度のｉｒＡＥ発生までの時間の中央値は６．４週間（臨床試験データと一致する）であり、３カ月を超えてからｉｒＡＥは生じなかったので、この知見が遅発性ｉｒＡＥに一般化されるかどうか調査する必要がある。第４に、免疫療法の間の処置中末梢血採取の処置開始に対するタイミングが均一ではなかった。最後に、知見が他のがん型におけるＩＣＩ関連性ｉｒＡＥリスクに一般化されるかどうかは依然として不明である。
【0070】
今後の試験で、免疫療法前および免疫療法中の初期段階の両方のシングルセルプロファイリングのより大きな適用と共にこれらの限界に対処すべきである。さらに、本発明者らの発見をより大きな多施設でのコホートで確認し、ＩＣＩ誘導性毒性の循環中の免疫学的決定因子が、関与する可能性が最も高い器官に応じて変動するかどうかを評定することが重要になる。前向きに検証すれば、これらの知見により、処置の適応を容易にして、免疫チェックポイント遮断のリスクプロファイルを改善することができ、ＩＣＩ媒介性毒性の予測および潜在的予防のために意味を有する。
【0071】
方法
試験設計および参加者。
本試験で分析した試料は、黒色腫に焦点を当てた観察に基づく登録試験の一部として、ヘルシンキ宣言（２０１３）に従い、研究への使用に関して同意を取得して採取し、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの機関審査委員会の承認を得たものであった。１８歳を超える、転移性黒色腫を有する適格患者を、抗ＰＤ－１遮断（ニボルマブもしくはペムブロリズマブ）または免疫チェックポイント遮断の組合せ（抗ＰＤ－１（ニボルマブ）および抗ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）；図１）のいずれかからなるＩＣＩによる処置を用いて処置した。患者の９０パーセントが、処置前血液採取時に、以前にいかなる免疫チェックポイント遮断も受けたことがなかった。患者全員が、ｉｒＡＥおよび応答について認定腫瘍内科医による常套的な臨床的評定を受けた。サーベイランスを、ＩＣＩによる処置の各サイクルの前（およそ３週間ごと）に、およびいくつかの症例ではより頻繁に行った（例えば、重度のｉｒＡＥで入院した患者に関して、入院患者のための医療従事者によって）。サーベイランスはまた、適用可能な場合、処置コースの完了後にも継続した。全てのｉｒＡＥを、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによる有害事象共通用語基準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）（ＣＴＣＡＥ）ｖ．５．０に従って分類し、グレード≧２および≧３をそれぞれ症候性および重度とみなした。患者コホート内で、および患者コホートにわたって、ｉｒＡＥは胃腸管、皮膚、肝臓、下垂体、甲状腺、副腎、筋骨格、眼、膵臓、および心臓系を含めた多様な器官系にわたった（図１３Ｉ）。３例の患者に、ＩＣＩ投与に関連する全身性炎症症候群が生じた（ＹＵＧＩＭ、ＹＵＨＥＲＮ、およびＹＵＴＯＲＹ）。重度のｉｒＡＥは全て、このコホート内の患者に死亡が認められない目印期間であったＩＣＩの開始後３カ月以内に生じた。応答を、以前に定義された通り、長続きする臨床的利益、長続きする利益なし、または評価不可能としてスコア化した。上述の適格性基準を満たす３つの患者コホートを同定し、抗ＰＤ－１または併用ＩＣＩ投与の最初のサイクルの直前に、処置前ＰＢＭＣ試料を採取した（中央値０日；０～２カ月の範囲）。図１に示されている通り、各コホートからのＰＢＭＣ（全ての患者について処置前、および１５例の患者について処置前／処置中の対）を分析した。
試験設計および参加者。
本試験で分析した試料は、黒色腫に焦点を当てた観察に基づく登録試験の一部として、ヘルシンキ宣言（２０１３）に従い、研究への使用に関して同意を取得して採取し、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの機関審査委員会の承認を得たものであった。１８歳を超える、転移性黒色腫を有する適格患者を、抗ＰＤ－１遮断（ニボルマブもしくはペムブロリズマブ）または免疫チェックポイント遮断の組合せ（抗ＰＤ－１（ニボルマブ）および抗ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）；図１）のいずれかからなるＩＣＩによる処置を用いて処置した。患者の９０パーセントが、処置前血液採取時に、以前にいかなる免疫チェックポイント遮断も受けたことがなかった。患者全員が、ｉｒＡＥおよび応答について認定腫瘍内科医による常套的な臨床的評定を受けた。サーベイランスを、ＩＣＩによる処置の各サイクルの前（およそ３週間ごと）に、およびいくつかの症例ではより頻繁に行った（例えば、重度のｉｒＡＥで入院した患者に関して、入院患者のための医療従事者によって）。サーベイランスはまた、適用可能な場合、処置コースの完了後にも継続した。全てのｉｒＡＥを、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによる有害事象共通用語基準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）（ＣＴＣＡＥ）ｖ．５．０に従って分類し、グレード≧２および≧３をそれぞれ症候性および重度とみなした。患者コホート内で、および患者コホートにわたって、ｉｒＡＥは胃腸管、皮膚、肝臓、下垂体、甲状腺、副腎、筋骨格、眼、膵臓、および心臓系を含めた多様な器官系にわたった（図１３Ｉ）。３例の患者に、ＩＣＩ投与に関連する全身性炎症症候群が生じた（ＹＵＧＩＭ、ＹＵＨＥＲＮ、およびＹＵＴＯＲＹ）。重度のｉｒＡＥは全て、このコホート内の患者に死亡が認められない目印期間であったＩＣＩの開始後３カ月以内に生じた。応答を、以前に定義された通り、長続きする臨床的利益、長続きする利益なし、または評価不可能としてスコア化した。上述の適格性基準を満たす３つの患者コホートを同定し、抗ＰＤ－１または併用ＩＣＩ投与の最初のサイクルの直前に、処置前ＰＢＭＣ試料を採取した（中央値０日；０～２カ月の範囲）。図１に示されている通り、各コホートからのＰＢＭＣ（全ての患者について処置前、および１５例の患者について処置前／処置中の対）を分析した。
【0072】
血液採取および処理。
末梢血検体をＫ２ＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に採取し、採血手技から１時間以内に処理した。ＰＢＭＣ抽出を、塩化アンモニウムプロトコールまたはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プロトコールのいずれかによって行った。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐプロトコールは製造業者の指示に従って適用した。塩化アンモニウムプロトコールを用いた場合、血液４～８ｍｌを低温の塩化アンモニウム溶解緩衝液（０．１Ｍの塩化アンモニウム、０．０１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）２０ｍｌと混合し、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、低温のＰＢＳ５ｍｌで洗浄した。ＰＢＭＣ試料を１０％ジメチルスルホキシド／９０％ＦＢＳ中に入れて凍結保存した。クライオバイアルをＮａｌｇｅｎｅ Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れて２４時間置き、次いで、発現分析のために細胞およびＲＮＡ処理を行うまで液体窒素中で保管した。
末梢血検体をＫ２ＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に採取し、採血手技から１時間以内に処理した。ＰＢＭＣ抽出を、塩化アンモニウムプロトコールまたはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プロトコールのいずれかによって行った。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐプロトコールは製造業者の指示に従って適用した。塩化アンモニウムプロトコールを用いた場合、血液４～８ｍｌを低温の塩化アンモニウム溶解緩衝液（０．１Ｍの塩化アンモニウム、０．０１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）２０ｍｌと混合し、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、低温のＰＢＳ５ｍｌで洗浄した。ＰＢＭＣ試料を１０％ジメチルスルホキシド／９０％ＦＢＳ中に入れて凍結保存した。クライオバイアルをＮａｌｇｅｎｅ Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れて２４時間置き、次いで、発現分析のために細胞およびＲＮＡ処理を行うまで液体窒素中で保管した。
【0073】
マスサイトメトリー。
金属コンジュゲート抗体を、予めコンジュゲートされたものをＦｌｕｉｄｉｇｍから購入したか、または精製品をＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、またはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、その後、Ｍａｘｐａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用し、製造業者の指示に従って金属とコンジュゲートした。２８例の患者それぞれからのＰＢＭＣをＣｙＴＯＦのために調製した。凍結保存しておいた細胞懸濁液を、まず、クライオバイアルを３７℃のウォーターバス中、キャップを浸さずに１～２分間保持することによって解凍した。その後、単一細胞懸濁液中１～３×１０６個のＰＢＭＣを、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と一緒に室温で１０分間インキュベートして、非特異的抗体結合を遮断し、その後、細胞表面分子に対する金属コンジュゲート抗体と一緒に氷上で２０分間インキュベートした。細胞をまた、Ｃｅｌｌ－ＩＤ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）と一緒に製造業者の指示に従ってインキュベートして、生存細胞を同定した。細胞内固定緩衝液および透過処理緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理した後、細胞を、細胞内タンパク質に対する金属コンジュゲート抗体と一緒にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１．６％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＢＳ中に希釈したＣｅｌｌ－ＩＤ Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ－Ｉｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で染色し、取得を行うまで４℃で保管した。洗浄ステップ後、次いで、試料取得を、Ｈｅｌｉｏｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用し、＜４００ｓ－１の事象速度で実施した。
金属コンジュゲート抗体を、予めコンジュゲートされたものをＦｌｕｉｄｉｇｍから購入したか、または精製品をＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、またはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、その後、Ｍａｘｐａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用し、製造業者の指示に従って金属とコンジュゲートした。２８例の患者それぞれからのＰＢＭＣをＣｙＴＯＦのために調製した。凍結保存しておいた細胞懸濁液を、まず、クライオバイアルを３７℃のウォーターバス中、キャップを浸さずに１～２分間保持することによって解凍した。その後、単一細胞懸濁液中１～３×１０６個のＰＢＭＣを、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と一緒に室温で１０分間インキュベートして、非特異的抗体結合を遮断し、その後、細胞表面分子に対する金属コンジュゲート抗体と一緒に氷上で２０分間インキュベートした。細胞をまた、Ｃｅｌｌ－ＩＤ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）と一緒に製造業者の指示に従ってインキュベートして、生存細胞を同定した。細胞内固定緩衝液および透過処理緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理した後、細胞を、細胞内タンパク質に対する金属コンジュゲート抗体と一緒にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１．６％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＢＳ中に希釈したＣｅｌｌ－ＩＤ Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ－Ｉｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で染色し、取得を行うまで４℃で保管した。洗浄ステップ後、次いで、試料取得を、Ｈｅｌｉｏｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用し、＜４００ｓ－１の事象速度で実施した。
【0074】
試料間の技術的変動を減少させるために、各試料にＣｅビーズを使用し、Ｂｅａｄ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ ｖ０．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎｏｌａｎｌａｂ／ｂｅａｄ－ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ／ｗｉｋｉ／Ｉｎｓｔａｌｌｉｎｇ－ｔｈｅ－Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）を使用してファイルをまとめて正規化した。技術的変動性をさらに最小限にするために、試料処理および取得バッチを４つに限定し、全ての試料にわたって同じ試薬ロットを使用し、Ｈｅｌｉｏｓ較正に対する大きな調整は行わなかった。Ａｓｔｒｏｌａｂｅでは試料間の数値強度が比較されないことにも留意した；そうではなく、基礎をなすマーカー強度がシフトするか否かにかかわらず所与のサブセットが同じであると仮定して、各試料を別々に分析した。したがって、このプラットフォームはバッチの影響に対して抵抗性であると報告されている。
【0075】
マスサイトメトリーデータ分析。
ＣｙＴＯＦデータを、最初にＣｙｔｏｂａｎｋ ｖ８．０およびｖ８．１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用い、階層的クラスター最適化のためにＦｌｏｗＳＯＭアルゴリズム、および高次元データの可視化のためにｖｉＳＮＥアルゴリズム（ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ＝５，０００、ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙ＝１００）を使用して分析した。その後の細胞亜集団の同定およびデータ可視化を、細胞亜集団を自動ラベリングするための、知識に基づく階層的アノテーション戦略と教師なしクラスタリングを併せたものであるＥｋ’Ｂａｌａｍアルゴリズム７１を活用するＡｓｔｒｏｌａｂｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｖ３．６およびｖ４．０（Ａｓｔｒｏｌａｂｅ）を使用して実施した。全部で、末梢血における主要な単核系列にわたる２０種の細胞亜集団を同定し、定量した。各患者試料について、細胞亜集団レベルを合計で１になるように正規化し、タンパク質マーカー発現に基づいて分類不能の細胞を分析から除外した。Ａｓｔｒｏｌａｂｅを確証するために、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用して、ＣＤ４ ＴＥＭ細胞を含む主要な細胞集団の盲検化手動ゲーティングを実施した（図１７、１８Ａ、および１８Ｂ）。総ＰＢＭＣまたは循環中のＴ細胞のいずれに対するフラクションとしてかにはかかわらず、しかしＣＤ４ Ｔ細胞に対するフラクションとしてではなく算出したＣＤ４ ＴＥＭ細胞の総存在量は重度のｉｒＡＥ発生と有意に関連した（図１８Ｃ）。
ＣｙＴＯＦデータを、最初にＣｙｔｏｂａｎｋ ｖ８．０およびｖ８．１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用い、階層的クラスター最適化のためにＦｌｏｗＳＯＭアルゴリズム、および高次元データの可視化のためにｖｉＳＮＥアルゴリズム（ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ＝５，０００、ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙ＝１００）を使用して分析した。その後の細胞亜集団の同定およびデータ可視化を、細胞亜集団を自動ラベリングするための、知識に基づく階層的アノテーション戦略と教師なしクラスタリングを併せたものであるＥｋ’Ｂａｌａｍアルゴリズム７１を活用するＡｓｔｒｏｌａｂｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｖ３．６およびｖ４．０（Ａｓｔｒｏｌａｂｅ）を使用して実施した。全部で、末梢血における主要な単核系列にわたる２０種の細胞亜集団を同定し、定量した。各患者試料について、細胞亜集団レベルを合計で１になるように正規化し、タンパク質マーカー発現に基づいて分類不能の細胞を分析から除外した。Ａｓｔｒｏｌａｂｅを確証するために、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用して、ＣＤ４ ＴＥＭ細胞を含む主要な細胞集団の盲検化手動ゲーティングを実施した（図１７、１８Ａ、および１８Ｂ）。総ＰＢＭＣまたは循環中のＴ細胞のいずれに対するフラクションとしてかにはかかわらず、しかしＣＤ４ Ｔ細胞に対するフラクションとしてではなく算出したＣＤ４ ＴＥＭ細胞の総存在量は重度のｉｒＡＥ発生と有意に関連した（図１８Ｃ）。
【0076】
フローサイトメトリー。
健康なドナー５例から採取したＰＢＭＣをフローサイトメトリーによって分析した（図１１Ｅ）。簡単に述べると、２００万～５００万個のＰＢＭＣ細胞を、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて室温で１０分間処理して、Ｆｃ受容体を遮断し、次いで、フルオロフォアでタグ付けした表面抗体を用いて室温で３０分にわたって染色した。以下の抗体を使用して細胞を染色した：ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４５（クローン２Ｄ１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＡＦ７００とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＡＰＣとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＰＥ／Ｃｙ７とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ８（クローンＳＫ１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＡＰＣ－Ｃｙ７とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＰｅｒＣｐ／Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１４（クローンＨＣＤ１４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；およびＢＶ６０５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ５６（クローン５．１Ｈ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳベースの緩衝液（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色して、細胞生存能を評価した。抗体捕捉ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、実験における各フルオロフォアを相殺した。染色された細胞を、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｉｔｅｍａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅにおいて、ＭｏＦｌｏ Ｌｅｇａｃｙ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したオペレーター補助を伴ってフローサイトメトリーによって分析した。ＤＡＰＩ陽性細胞および推定ダブレットを前方散乱および側方散乱分析に基づいて除外した後、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用し、Ｂ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む主要なリンパ球集団を総リンパ球に対するパーセンテージとして列挙した。
健康なドナー５例から採取したＰＢＭＣをフローサイトメトリーによって分析した（図１１Ｅ）。簡単に述べると、２００万～５００万個のＰＢＭＣ細胞を、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて室温で１０分間処理して、Ｆｃ受容体を遮断し、次いで、フルオロフォアでタグ付けした表面抗体を用いて室温で３０分にわたって染色した。以下の抗体を使用して細胞を染色した：ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４５（クローン２Ｄ１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＡＦ７００とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＡＰＣとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＰＥ／Ｃｙ７とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ８（クローンＳＫ１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＡＰＣ－Ｃｙ７とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＰｅｒＣｐ／Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１４（クローンＨＣＤ１４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；およびＢＶ６０５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ５６（クローン５．１Ｈ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳベースの緩衝液（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色して、細胞生存能を評価した。抗体捕捉ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、実験における各フルオロフォアを相殺した。染色された細胞を、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｉｔｅｍａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅにおいて、ＭｏＦｌｏ Ｌｅｇａｃｙ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したオペレーター補助を伴ってフローサイトメトリーによって分析した。ＤＡＰＩ陽性細胞および推定ダブレットを前方散乱および側方散乱分析に基づいて除外した後、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用し、Ｂ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む主要なリンパ球集団を総リンパ球に対するパーセンテージとして列挙した。
【0077】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑライブラリー調製およびシーケンシング。
ＰＢＭＣ試料由来の単一細胞懸濁液を上記の通り得、細胞計数のためにヘモサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、製造業者の指示に従って、１μｌ当たり７００～１，２００個の生存細胞の濃度に調製した。その後、単一細胞懸濁液を、ＴＣＲおよびＢＣＲクローン型に対するｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑと対をなすｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのために、５’トランスクリプトームキット（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用し、製造業者の指示に従ってライブラリー調製に供した。相補ＤＮＡライブラリーのシーケンシングをＮｏｖａＳｅｑ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において細胞当たり平均２０，０００リードを標的とする２×９２塩基対（ｂｐ）ペアエンドリードで行った。
ＰＢＭＣ試料由来の単一細胞懸濁液を上記の通り得、細胞計数のためにヘモサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、製造業者の指示に従って、１μｌ当たり７００～１，２００個の生存細胞の濃度に調製した。その後、単一細胞懸濁液を、ＴＣＲおよびＢＣＲクローン型に対するｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑと対をなすｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのために、５’トランスクリプトームキット（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用し、製造業者の指示に従ってライブラリー調製に供した。相補ＤＮＡライブラリーのシーケンシングをＮｏｖａＳｅｑ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において細胞当たり平均２０，０００リードを標的とする２×９２塩基対（ｂｐ）ペアエンドリードで行った。
【0078】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析（発見コホート）。
生ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑリードをバーコードにより重複排除し、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．３．１．０を使用してｈｇ３８参照ゲノムに対してアラインメントし、低密度デジタル計数行列を得、それをＳｅｕｒａｔ ｖ．３．１．５またはｖ．３．２．１（参考文献７２）を使用して分析して、細胞型および細胞状態を同定した。以下の基準に基づいて外れ値の細胞を同定し、除外した：（１）ミトコンドリア含量が＞２５％、または（２）試料－レベル分布に応じて、発現された遺伝子が１００未満または１，５００～３，０００超の細胞。正規化（ＮｏｒｍａｌｉｚｅＤａｔａ）および可変特色の同定（ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ、ｎ＝２，０００の特色）後、ＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒｓ（ｄｉｍｓ＝１：３０）を適用してアンカーを同定し、また、ＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａ（デフォルトパラメータを用いる）を適用して、バッチ補正を実施した。統合されたら、２，０００種の最も可変性の遺伝子および上位３０種の主成分を使用して主成分分析（ＰＣＡ）および均一マニホールド近似投影（ＵＭＡＰ）を適用した。ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓを分解能パラメータを３に設定して適用して、細胞型および細胞状態を同定し、３７種のクラスターを得た。
生ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑリードをバーコードにより重複排除し、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．３．１．０を使用してｈｇ３８参照ゲノムに対してアラインメントし、低密度デジタル計数行列を得、それをＳｅｕｒａｔ ｖ．３．１．５またはｖ．３．２．１（参考文献７２）を使用して分析して、細胞型および細胞状態を同定した。以下の基準に基づいて外れ値の細胞を同定し、除外した：（１）ミトコンドリア含量が＞２５％、または（２）試料－レベル分布に応じて、発現された遺伝子が１００未満または１，５００～３，０００超の細胞。正規化（ＮｏｒｍａｌｉｚｅＤａｔａ）および可変特色の同定（ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ、ｎ＝２，０００の特色）後、ＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒｓ（ｄｉｍｓ＝１：３０）を適用してアンカーを同定し、また、ＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａ（デフォルトパラメータを用いる）を適用して、バッチ補正を実施した。統合されたら、２，０００種の最も可変性の遺伝子および上位３０種の主成分を使用して主成分分析（ＰＣＡ）および均一マニホールド近似投影（ＵＭＡＰ）を適用した。ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓを分解能パラメータを３に設定して適用して、細胞型および細胞状態を同定し、３７種のクラスターを得た。
【0079】
同定されたクラスターを全て、基準マーカー遺伝子の発現に基づいて主要な細胞系列に割り当てた：ＣＤ３Ｄ／ＣＤ３Ｅｈｉ＝Ｔ細胞；ＣＤ８Ａ／ＣＤ８ＢｈｉおよびＮＫＧ７／ＧＮＬＹｌｏ＝ＣＤ８ Ｔ細胞；高ＩＬ７Ｒ発現および低ＮＫＧ７／ＧＮＬＹを有する非ＣＤ８ Ｔ細胞＝ＣＤ４ Ｔ細胞；ＮＫＧ７／ＧＮＬＹｈｉおよびＣＤ３Ｄ／ＣＤ３Ｅｌｏ＝ＮＫ細胞；ＣＤ１４またはＦＣＧＲ３Ａｈｉ＝単球；ＦＣＥＲ１Ａｈｉ＝樹状細胞（ＤＣ）；ＭＳ４Ａ１ｈｉ＝Ｂ細胞；ＨＢＢｈｉ＝赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）；ＰＰＢＰｈｉ＝血小板。ＣＤ８／ＣＤ４ Ｔ細胞にアノテーションされなかった、ＣＤ３Ｄ／ＥおよびＧＮＬＹ／ＮＫＧ７の高発現を有する細胞はＴまたはＮＫＴ細胞群に含め、Ｔ／ＮＫＴと称した。赤血球または血小板にアノテーションされたクラスターはさらなる分析から外した。実効ダブレット率を評定するために、細胞バーコードをシングルセルＢＣＲ（ｓｃＢＣＲ）およびＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）クローン型と相互参照した。（１）ＴＣＲクローン型に異常にマッピングされた非Ｔ細胞のパーセンテージ（ｍで示される）および（２）マッチするｓｃＴＣＲクローン型にアノテーションされたＴ細胞の出現頻度（すなわち、回収率）（ｆで示される）を決定することにより、実効ダブレット率（ｍ／ｆ）を２．２％と算出した。非Ｂ細胞にマッピングされたｓｃＢＣＲクローン型について算出された実効ダブレット率は同じであった（同じく２．２％）。実効ダブレット率が適度に低かったので、ＴＣＲまたはＢＣＲクローン型配列の異常発現を有する単一細胞を全て除外した。次いで、ＰＣＡ、ＵＭＡＰおよびＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓを上記の通り繰り返し、３２のクラスターを得た。非常に高いＨＢＢ発現を特徴とする２つの赤血球クラスターを残し、分析からは除外し、その後、ＰＣＡ、ＵＭＡＰ、およびＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓの最終ラウンドを１回行い、３２のクラスター（すなわち、状態）の最終セットを得た。低次元埋め込みが図３Ａおよび７Ａに示されている。
【0080】
３２種の状態全てを、それらと重度のｉｒＡＥ発生（図３Ｂのｘ軸）との関連性およびＣｙＴＯＦによって測定されたＣＤ４ ＴＥＭ存在量（図３Ｂのｙ軸）について評定した。それらの中で、ＣＤ４ Ｔクラスター５が両方の変数と最も強力に相関した（図３Ｂ）。この結果の統計的有意性を決定するために、（１）各評価基準によって１位に順位付けられ、かつ（２）少なくともＣＤ４ Ｔクラスター５と同様に強力なＰ値およびスピアマン相関係数が実現される同時確率を算出した。この確率を経験的に算出するために、各ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑクラスターに関連付けられる細胞画分を全ての患者試料にわたって独立にシャッフルし、次いで、上記の（１）および（２）について評価する並べ替えスキームをインプリメントした。このプロセスを１０，０００回繰り返すことにより、ＣＤ４ Ｔクラスター５について経験的Ｐ値０．００３が算出された。ペアワイズコンビナトリアル分析も実施し、生物学的一貫性が維持されるように細胞状態の対を同じ主要細胞型に制限し（Ｂ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球）、８２種の可能性のある細胞クラスターの組合せのそれぞれを、ＣｙＴＯＦによって列挙されたＣＤ４ ＴＥＭレベルおよび重度のｉｒＡＥ発生と比較した（図７ＤおよびＥ）。ＣＤ４ Ｔ細胞クラスター５および３が最上位の対として現れた。上記の統計的手法を使用し、この結果について経験的Ｐ値０．００２が算出された。図３Ｃの差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を同定するために、Ｓｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓを、デフォルトパラメータを用い、ＣＤ４ Ｔ ５＋３集団と、他のＣＤ４ Ｔ細胞状態とに適用した。
【0081】
ｉｒＡＥ発生の細胞内決定因子を描写するための教師なしクラスタリングの相対的な有用性を評価するために、Ｓｅｕｒａｔ ｖ．４．０．１（Ａｚｉｍｕｔｈ）内の参照誘導アノテーションフレームワークを活用して、本発明者らのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび２２０種を超えるタンパク質マーカーの共検出を用いて定義された６種の主要系列および２７種のより細かい粒度のサブセットにわたる１６１，７６４の細胞のＰＢＭＣアトラスに投影した。まず、クエリデータセットを上記の品質管理ステップに従って前処理し、２４，８０７の細胞を得た。次いで、クエリデータセットをＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍによって正規化し、ＦｉｎｄＴｒａｎｓｆｅｒＡｎｃｈｏｒｓを、５０次元の予めコンピュータ処理した教師ありＰＣＡ変換を使用してクエリデータセットおよび参照データセットに適用し、次いで、ＭａｐＱｕｅｒｙを適用して、クエリデータセットを参照することにより細胞型ラベリングおよびＵＭＡＰ構造をマッピングした。
【0082】
Ａｚｉｍｕｔｈによって同定された２７種の細胞状態の中で（図８Ａ）、ＣＤ４ ＴＥＭが重度のｉｒＡＥ発生と最も強力に関連し、ＣｙＴＯＦによって列挙されたＣＤ４ ＴＥＭ細胞と最も相関した（図８Ｃ）。Ａｚｉｍｕｔｈによって同定された２種の他のＣＤ４ ＴＥＭ様サブセット（ＣＤ４ ＣＴＬ、ＣＤ４増殖性）の中で、ＣＤ４増殖性がＨＬＡ－ＤＸの最高発現およびＳＥＬＬの最低発現を示し（図８Ｄ）、これは、活性化ＣＤ４ ＴＥＭ表現型と一致する。さらに、抗体由来のタグデータからＡｚｉｍｕｔｈによるタンパク質発現を調査したところ、ＣＤ４ ＴＥＭおよびＣＤ４増殖性状態のみがＴＥＭ細胞の特質を示した（ＣＤ４５ＲＯｈｉＣＤ４５ＲＡｌｏＣＤ２７ｌｏ；図８Ｅ）。実際に、ＣＤ４ ＴＥＭとＣＤ４増殖性が組み合わさった集団は、重度のｉｒＡＥ発生と最も大きく関連した（図８Ｃ）。超幾何学的試験を適用して、組合せＣＤ４ ＴＥＭ＋ＣＤ４増殖性集団（Ａｚｉｍｕｔｈ）とｄｅ ｎｏｖｏクラスタリングによって定義される状態の間の細胞バーコードの重複を評定した。ＣＤ４ Ｔ ５＋３が１位のヒットとして現れた（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇにより調整したＰ＝２．５×１０－７）。教師なし手法と教師あり手法の間の強力な重複にもかかわらず、ＣＤ４ Ｔ ５＋３は、参照誘導アノテーションによってラベリングされた集団よりも大きく重度のｉｒＡＥ発生およびＣｙＴＯＦと関連した（図８Ｆ）。
【0083】
バルクＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製、シーケンシング、および定量。
凍結保存しておいた細胞懸濁液を上記の通り解凍した。その後、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ＆ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて品質を評定した。全ての試料が、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｅｘｏｍｅ分析のために十分に高い品質であり（ＤＶ２００＞３０％）、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｅｘｏｍｅ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用し、製造業者の指示に従って調製した。ハイブリッド捕捉後、ｃＤＮＡライブラリーをプールし、ＨｉＳｅｑ ２５００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において、２×１５０ｂｐのペアエンドリードを使用し、試料当たり２０００万～２５００万リードを標的としてシーケンシングを行った。生リードを、Ｓａｌｍｏｎ ｖ．０．１２．０を用い、ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ．２９参照トランスクリプトームを使用して定量した；以下のコマンドライン引数を使用し、その他はデフォルトパラメータを使用した：－－ｓｅｑＢｉａｓ－－ｇｃＢｉａｓ－－ｐｏｓＢｉａｓ－－ｖａｌｉｄａｔｅＭａｐｐｉｎｇｓ－－ｒａｎｇｅＦａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎＢｉｎｓ ４。リードカウントを、ｔｘｉｍｐｏｒｔ ｖ．１．１０．１を使用して遺伝子レベルの１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）に対して正規化した。マッピング率が≧６０％であり、ＴＣＲアセンブリが上首尾である（下のＶ（Ｄ）Ｊ受容体プロファイリングおよびクローン型分析を参照されたい）試料のみをさらなる分析に含め、例外として、マッピング率が＞４０％（しかし＜６０％）であり、ＴＣＲアセンブリが上首尾である３つの試料を含めた。全部で、バルクコホート１および２内の５３のシーケンシングされた試料（８８％）がこれらの基準を満たした（図１）。
凍結保存しておいた細胞懸濁液を上記の通り解凍した。その後、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ＆ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて品質を評定した。全ての試料が、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｅｘｏｍｅ分析のために十分に高い品質であり（ＤＶ２００＞３０％）、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｅｘｏｍｅ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用し、製造業者の指示に従って調製した。ハイブリッド捕捉後、ｃＤＮＡライブラリーをプールし、ＨｉＳｅｑ ２５００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において、２×１５０ｂｐのペアエンドリードを使用し、試料当たり２０００万～２５００万リードを標的としてシーケンシングを行った。生リードを、Ｓａｌｍｏｎ ｖ．０．１２．０を用い、ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ．２９参照トランスクリプトームを使用して定量した；以下のコマンドライン引数を使用し、その他はデフォルトパラメータを使用した：－－ｓｅｑＢｉａｓ－－ｇｃＢｉａｓ－－ｐｏｓＢｉａｓ－－ｖａｌｉｄａｔｅＭａｐｐｉｎｇｓ－－ｒａｎｇｅＦａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎＢｉｎｓ ４。リードカウントを、ｔｘｉｍｐｏｒｔ ｖ．１．１０．１を使用して遺伝子レベルの１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）に対して正規化した。マッピング率が≧６０％であり、ＴＣＲアセンブリが上首尾である（下のＶ（Ｄ）Ｊ受容体プロファイリングおよびクローン型分析を参照されたい）試料のみをさらなる分析に含め、例外として、マッピング率が＞４０％（しかし＜６０％）であり、ＴＣＲアセンブリが上首尾である３つの試料を含めた。全部で、バルクコホート１および２内の５３のシーケンシングされた試料（８８％）がこれらの基準を満たした（図１）。
【0084】
バルクＲＮＡ－ｓｅｑデコンボリューション。
ＰＢＭＣのバルクＲＮＡ－ｓｅｑプロファイルにおける白血球組成を決定するために、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ ｖ．１．０．４１（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｉｂｅｒｓｏｒｔｘ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）を、ＬＭ２２シグネチャー行列と共に各コホートのＴＰＭ行列に適用した（図１）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを、Ｂモードバッチ補正と共に、分位正規化なしで各シーケンシングバッチに別々に適用した。２２種の機能的に定義されたヒト造血サブセットを区別するための高度に最適化された参照プロファイルからなるＬＭ２２は、ＲＮＡ－ｓｅｑまたはマイクロアレイのいずれでプロファイリングされたかにかかわらず全血およびＰＢＭＣ中の白血球サブセットを正確に列挙するためのフローサイトメトリーに対して広範に検証されている。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、およびＬＭ２２による活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞プロファイルの性能を本研究において遺伝子発現分析によってさらに確証し（ＣＣＲ５、ＳＥＬＬ、ＴＣＦ７、およびＣＤ２７；図１１Ａ）、黒色腫患者由来のＰＢＭＣ試料を使用し、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、マスサイトメトリー、フローサイトメトリーおよびｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの間で比較を行った（図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、および１１Ｆ）。顆粒球サブセットおよびマクロファージサブセット以外の全てのＬＭ２２サブセットを本研究において評価し（ｎ＝１５；図４Ａ）、各試料のそれらの相対的なフラクションを合計で１になるように再度正規化した。合計１５種のサブセットを評価したが、２種はＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって低密度に検出され（調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ガンマデルタＴ細胞）、図４Ａのウィルコクソン順位和検定によって評定することができなかった。
ＰＢＭＣのバルクＲＮＡ－ｓｅｑプロファイルにおける白血球組成を決定するために、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ ｖ．１．０．４１（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｉｂｅｒｓｏｒｔｘ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）を、ＬＭ２２シグネチャー行列と共に各コホートのＴＰＭ行列に適用した（図１）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを、Ｂモードバッチ補正と共に、分位正規化なしで各シーケンシングバッチに別々に適用した。２２種の機能的に定義されたヒト造血サブセットを区別するための高度に最適化された参照プロファイルからなるＬＭ２２は、ＲＮＡ－ｓｅｑまたはマイクロアレイのいずれでプロファイリングされたかにかかわらず全血およびＰＢＭＣ中の白血球サブセットを正確に列挙するためのフローサイトメトリーに対して広範に検証されている。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、およびＬＭ２２による活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞プロファイルの性能を本研究において遺伝子発現分析によってさらに確証し（ＣＣＲ５、ＳＥＬＬ、ＴＣＦ７、およびＣＤ２７；図１１Ａ）、黒色腫患者由来のＰＢＭＣ試料を使用し、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、マスサイトメトリー、フローサイトメトリーおよびｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの間で比較を行った（図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、および１１Ｆ）。顆粒球サブセットおよびマクロファージサブセット以外の全てのＬＭ２２サブセットを本研究において評価し（ｎ＝１５；図４Ａ）、各試料のそれらの相対的なフラクションを合計で１になるように再度正規化した。合計１５種のサブセットを評価したが、２種はＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって低密度に検出され（調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ガンマデルタＴ細胞）、図４Ａのウィルコクソン順位和検定によって評定することができなかった。
【0085】
Ｖ（Ｄ）Ｊ受容体プロファイリングおよびクローン型分析。
シングルセル発見コホートについて、生ｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑリードを、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．３．１．０を用いて参照ｒｅｆｄａｔａ－ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ－ｖｄｊ－ＧＲＣｈ３８－ａｌｔｓｅｎｓｅｍｂｌ－４．０．０にマッピングし、得られたクローン型アセンブリをＬｏｕｐｅ Ｖ（Ｄ）Ｊブラウザｖ．３．０．０（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）からダウンロードした。活性化ＴＭ細胞がクローン拡大によって生じることを考慮すると、活性化ＴＭ細胞はそれらのナイーブ対応物よりも低いＴＣＲ多様性を有することが予想されるが、ただし、（１）どちらの集団由来の細胞も等しくサンプリングされる（すなわち、それらの計数が等価である）または（２）総Ｔ細胞計数の変動を正規化によりなくすことを条件とする（図１０Ａ）。しかし、総Ｔ細胞出現頻度の変動を度外視することにより、そのようなサンプリングでは、集団内の独特の種（クローン型）の数であり、免疫レパートリー多様性の基礎をなす重要な因子である、豊富さが無視される。したがって、本研究では、均衡度と豊富さを単一評価基準として組み合わせた理論的計量情報であるＳｈａｎｎｏｎエントロピーを最初に使用して、免疫レパートリー多様性を特徴付けた（図１０Ａ）。シングルセル発見コホート内の各評価可能な患者試料について（図１および２Ａ）、ＴＣＲクローン型レパートリーをランダムにサンプリングして（非復元）、患者にわたって評価可能なＰＢＭＣ細胞の数を等しくすると同時に、ＴＣＲ回収率の技術的変動に対処した。サンプリングのために利用可能なＴＣＲクローンのプールを最大にするために、１００未満のＴＣＲクローンを有する患者を除外した（ｎ＝４；ＹＵＴＡＵＲ、ＹＵＴＯＲＹ、ＹＵＨＥＲＮ、およびＹＵＴＨＥＡ）。次いで、残りの９例の患者について、各Ｔ細胞サブセットについてＳｈａｎｎｏｎエントロピー（Ｒパッケージｖｅｇａｎ ｖ．２．５－６（参考文献７８））を総ＰＢＭＣに対して算出し、得られた値をこの手順の１００回の反復にわたって平均した（図３Ｅ、１０Ｂおよび１０Ｄ～Ｆ）。同じ９例の患者に関してＳｈａｎｎｏｎエントロピーをＩＧＫ、ＩＧＬ、およびＩＧＨ鎖にわたるｓｃＢＣＲクローン型について上記の通り分析した（図１０Ｇ）。
シングルセル発見コホートについて、生ｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑリードを、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．３．１．０を用いて参照ｒｅｆｄａｔａ－ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ－ｖｄｊ－ＧＲＣｈ３８－ａｌｔｓｅｎｓｅｍｂｌ－４．０．０にマッピングし、得られたクローン型アセンブリをＬｏｕｐｅ Ｖ（Ｄ）Ｊブラウザｖ．３．０．０（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）からダウンロードした。活性化ＴＭ細胞がクローン拡大によって生じることを考慮すると、活性化ＴＭ細胞はそれらのナイーブ対応物よりも低いＴＣＲ多様性を有することが予想されるが、ただし、（１）どちらの集団由来の細胞も等しくサンプリングされる（すなわち、それらの計数が等価である）または（２）総Ｔ細胞計数の変動を正規化によりなくすことを条件とする（図１０Ａ）。しかし、総Ｔ細胞出現頻度の変動を度外視することにより、そのようなサンプリングでは、集団内の独特の種（クローン型）の数であり、免疫レパートリー多様性の基礎をなす重要な因子である、豊富さが無視される。したがって、本研究では、均衡度と豊富さを単一評価基準として組み合わせた理論的計量情報であるＳｈａｎｎｏｎエントロピーを最初に使用して、免疫レパートリー多様性を特徴付けた（図１０Ａ）。シングルセル発見コホート内の各評価可能な患者試料について（図１および２Ａ）、ＴＣＲクローン型レパートリーをランダムにサンプリングして（非復元）、患者にわたって評価可能なＰＢＭＣ細胞の数を等しくすると同時に、ＴＣＲ回収率の技術的変動に対処した。サンプリングのために利用可能なＴＣＲクローンのプールを最大にするために、１００未満のＴＣＲクローンを有する患者を除外した（ｎ＝４；ＹＵＴＡＵＲ、ＹＵＴＯＲＹ、ＹＵＨＥＲＮ、およびＹＵＴＨＥＡ）。次いで、残りの９例の患者について、各Ｔ細胞サブセットについてＳｈａｎｎｏｎエントロピー（Ｒパッケージｖｅｇａｎ ｖ．２．５－６（参考文献７８））を総ＰＢＭＣに対して算出し、得られた値をこの手順の１００回の反復にわたって平均した（図３Ｅ、１０Ｂおよび１０Ｄ～Ｆ）。同じ９例の患者に関してＳｈａｎｎｏｎエントロピーをＩＧＫ、ＩＧＬ、およびＩＧＨ鎖にわたるｓｃＢＣＲクローン型について上記の通り分析した（図１０Ｇ）。
【0086】
バルクコホート１および２について、Ｓｋｅｗｅｒ ｖ．０．２．２を使用してアダプター配列をトリミングした後、ＴＣＲクローン型をアセンブルし、ＭｉＸＣＲ ｖ．３．０．１２５を用い、以下のコマンドを使用して定量化した：ｍｉｘｃｒ ａｌｉｇｎ －ｐ ｒｎａ－ｓｅｑ －ｓ ｈｓａ －Ｏ ａｌｌｏｗＰａｒｔｉａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ＝ｔｒｕｅ ｄａｔａ＿Ｒ１．ｆａｓｔｑ．ｇｚ ｄａｔａ＿Ｒ２．ｆａｓｔｑ．ｇｚ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．ｖｄｊｃａ。各患者試料について、ＴＣＲクローン型多様性を、ＴＣＲ－α鎖およびＴＣＲ－β鎖について全体として、Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー（Ｒパッケージ ｖｅｇａｎ ｖ．２．５－６）を使用して測定し、患者間での比較をｉｒＡＥ重症度に基づいて行った（図４Ｂ、４Ｃ、１２Ａ、および１２Ｃ）。Ｒパッケージｉｍｍｕｎａｒｃｈ ｖ．０．６．５（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．３３６７２００）を使用して算出したＧｉｎｉ－Ｓｉｍｐｓｏｎ指数をさらに適用して、バルクＴＣＲ多様性をｉｒＡＥ重症度に照らして評価した（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。注目すべきことに、ＴＣＲの豊富さがＳｈａｎｎｏｎエントロピーおよびＧｉｎｉ－Ｓｉｍｐｓｏｎ指数の両方を算出するための重要な構成要素である。
【0087】
バルクＰＢＭＣからのＴ細胞クローンダイナミクスの分析。
併用ＩＣＩを用いた処置を受けた１５例の患者由来の対をなす処置前ＰＢＭＣおよび処置中の初期段階ＰＢＭＣに対して、バルクＴＣＲ－β鎖プロファイリングを実施した。処置中末梢血が重度のｉｒＡＥの発症後に採取された患者はいなかった。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、調査分解能のｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にかけた。増殖的ＴＣＲ－β鎖再構成からのデータをｉｍｍｕｎｏＳＥＱ Ａｎａｌｙｚｅｒオンラインツールを使用してエクスポートし、ＴＣＲ－βレパートリーの豊富さおよび多様性についてＰｉｅｌｏｕの均衡度を使用して評価し、１－均衡度の増加をクローン性の上昇に関連付けた。ｉｍｍｕｎｏＳＥＱプロファイリングから得られたＰｉｅｌｏｕの均衡度をバルクＲＮＡ－ｓｅｑ（ＭｉＸＣＲ）と比較し、一致することが明らかになった（図１５Ａ）。全ての処置前の試料と処置中の試料が適切に対をなすことも、ＴＣＲ－β ＣＤＲ３配列の交差比較によって検証した。対をなす処置中時点と処置前時点の間での各試料における１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度と定義されるクローン性の差異を分析することにより、クローン拡大が推測された（図５Ｂおよび１５Ｂ）。より詳細には、ベースラインからのクローン性の変化を算出するために、処置前のクローン性を処置中のクローン性から対をなす様式で差し引き、それにより、全ての処置前の試料をゼロに対して正規化した（図５Ｂ、左）。図１５Ｂにおいて、図５Ｂからのデータについて、処置中の試料の対をなす処置前の試料に対する正規化を伴わない分析も行った。
併用ＩＣＩを用いた処置を受けた１５例の患者由来の対をなす処置前ＰＢＭＣおよび処置中の初期段階ＰＢＭＣに対して、バルクＴＣＲ－β鎖プロファイリングを実施した。処置中末梢血が重度のｉｒＡＥの発症後に採取された患者はいなかった。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、調査分解能のｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にかけた。増殖的ＴＣＲ－β鎖再構成からのデータをｉｍｍｕｎｏＳＥＱ Ａｎａｌｙｚｅｒオンラインツールを使用してエクスポートし、ＴＣＲ－βレパートリーの豊富さおよび多様性についてＰｉｅｌｏｕの均衡度を使用して評価し、１－均衡度の増加をクローン性の上昇に関連付けた。ｉｍｍｕｎｏＳＥＱプロファイリングから得られたＰｉｅｌｏｕの均衡度をバルクＲＮＡ－ｓｅｑ（ＭｉＸＣＲ）と比較し、一致することが明らかになった（図１５Ａ）。全ての処置前の試料と処置中の試料が適切に対をなすことも、ＴＣＲ－β ＣＤＲ３配列の交差比較によって検証した。対をなす処置中時点と処置前時点の間での各試料における１－Ｐｉｅｌｏｕの均衡度と定義されるクローン性の差異を分析することにより、クローン拡大が推測された（図５Ｂおよび１５Ｂ）。より詳細には、ベースラインからのクローン性の変化を算出するために、処置前のクローン性を処置中のクローン性から対をなす様式で差し引き、それにより、全ての処置前の試料をゼロに対して正規化した（図５Ｂ、左）。図１５Ｂにおいて、図５Ｂからのデータについて、処置中の試料の対をなす処置前の試料に対する正規化を伴わない分析も行った。
【0088】
重度のｉｒＡＥの非存在を評定するために、δと示されるクローン拡大の程度を、Ｒパッケージｄｐｌｙｒ ｖ．１．０．７を使用して三分位値に均等に分割した（図５Ｄおよび１５Ｈ）。これにより、以下の群を得た：クローン拡大なし、δ＜０、ｎ＝５；中間、０＜δ＜０．００９、ｎ＝５；および高クローン拡大、δ＞０．００９、ｎ＝５。これらの閾値を完全なｉｍｍｕｎｏＳＥＱコホート（ｎ＝１５；図５Ｄ）、および、ＩＣＩによる処置中、１日目および＜１カ月後に血液試料を得た患者（ｎ＝７；図１５Ｈ）に適用した。さらに、順位空間で表した場合、クローン拡大の程度は、コックス回帰モデルにおいて重度のｉｒＡＥ発生までの時間と有意に関連し、採取血間の時間、検出された増殖的ＴＣＲクローンの数、ならびに各患者の年齢および性別とは無関係であった。
【0089】
持続性Ｔ細胞クローンの分析。
可変レベルのクローン拡大を有する、重度のｉｒＡＥが生じた３例の患者：ＹＵＡＬＯＥ、ＹＵＮＡＮＣＹ、およびＹＵＨＯＮＥＹ（図５Ｃおよび１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｆ、および１５Ｇ）について、対をなす処置前末梢血のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびｓｃＴＣＲ－ｓｅｑを実施した（図５Ｂ）。注目すべきことに、これらの３例の患者由来の試料は、シングルセル発見コホートにおけるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑまたはｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑによる以前のプロファイリングが行われていなかった。シーケンシングライブラリーを、シングルセル発見コホートに関して記載されているものと同様に生成し、品質管理のために処理した。Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．５．０．１を用いてマッピングを実施した。
可変レベルのクローン拡大を有する、重度のｉｒＡＥが生じた３例の患者：ＹＵＡＬＯＥ、ＹＵＮＡＮＣＹ、およびＹＵＨＯＮＥＹ（図５Ｃおよび１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｆ、および１５Ｇ）について、対をなす処置前末梢血のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびｓｃＴＣＲ－ｓｅｑを実施した（図５Ｂ）。注目すべきことに、これらの３例の患者由来の試料は、シングルセル発見コホートにおけるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑまたはｓｃＶ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑによる以前のプロファイリングが行われていなかった。シーケンシングライブラリーを、シングルセル発見コホートに関して記載されているものと同様に生成し、品質管理のために処理した。Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．５．０．１を用いてマッピングを実施した。
【0090】
対をなす処置前血液試料と処置中血液試料の間で共有される増殖的ＴＣＲ－β ＣＤＲ３ヌクレオチド配列と定義された持続性クローンについて分析するために、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱデータを、１つの採取血において少なくとも２つの鋳型（処置前または処置中）および他の採取血において少なくとも１つの鋳型（平均で、共有されるクローン全てのうち６０％）を有する共有されるクローン型について調べた。これにより、拡大したかまたは縮小した持続性クローンに優先的に焦点を当てることが可能になった。得られた配列を、処置前のｓｃＴＣＲ－ｓｅｑライブラリーからのＴＣＲ－β ＣＤＲ３ヌクレオチド配列と相互参照し、それをさらにｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと相互参照し、ＡｚｉｍｕｔｈによってＴ細胞にアノテーションされた細胞（上記の通り適用した）についてフィルタリングした（図１５Ｄ）。全部で、対をなすｉｍｍｕｎｏＳＥＱクローン型データを有するシングルセルトランスクリプトームが１，５０４種同定された。各患者について、処置前のシングルセルとｉｍｍｕｎｏＳＥＱ ＴＣＲクローン型出現頻度の間に有意なスピアマン相関が観察された（ρ＞０．５９；ＣＤ４ Ｔ細胞についてＰ０およびＣＤ８Ａ／Ｂ＝０；ＣＤ８ Ｔ細胞についてＣＤ８ＡまたはＣＤ８Ｂ＞０およびＣＤ４＝０）。全体で、全ての相互参照されたクローン型のうち６９％をこの手法によって明確にラベリングすることができた（図１５Ｅ）。図５Ｃに示されているプロットに関して、ＣＤ４ Ｔ ５と３の間の平均ｌｏｇ２倍率変化をシングルセル発見コホート内の残りのＣＤ４ Ｔ細胞クラスターに対して算出し（図７Ｂ）、次いで、上位２０種の遺伝子をその後の分析のために選択した。この遺伝子セットの富化を、単一試料ＧＳＥＡ（Ｒパッケージｅｓｃａｐｅ ｖ．１．０．１）を使用して決定し、それをＡｚｉｍｕｔｈによってラベリングされたまたは上記の通り持続性ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞についてラベリングされたＴ細胞に適用した。図１５ＦおよびＧに示されている分析のために、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱによって測定された持続性Ｔ細胞クローンの増殖的出現頻度をＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞に群分けし、増殖的出現頻度の差異をクローン型ごとに（図１５Ｇ）または全体として（図１５Ｆ）表し、ベースラインからのバルククローン拡大と比較した（図５Ｂ）。
【0091】
ｉｒＡＥ発生を予測するための統合モデル。
活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞の存在量およびバルクＴＣＲクローン型多様性は、個々に重度のｉｒＡＥ発生と関連した（図４ＡおよびＢ）。したがって、性能を改善する手段として統合モデリングを探究した。ランダムフォレストを用いた非線形モデリングを含めたいくつかの技法を評定したが、ロジスティック回帰（Ｒのｇｌｍ）により同等の性能が実現され、一般化線形モデルは相対的に単純かつロバストであることから、これを選択した。訓練前に、バルクコホート１および２において各特色を外れ値についてＲＯＵＴ検定を使用して偽発見率＝１０％で検定した。８８のデータ点（２つの特色×５３例の試料）のうち、３つの外れ値が検出され、これらは全て、バルクコホート１の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞からのものであった。訓練コホートにかかわらず、検出された外れ値は全て、一定してこれらの３例の試料からのものであった。したがって、各統合モデルについて、訓練コホート内の全ての非外れ値試料の間で活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞レベルの最大画分ｍａｘＦを決定した。次いで、ｍａｘＦを全ての試料についての上限として使用した。
活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞の存在量およびバルクＴＣＲクローン型多様性は、個々に重度のｉｒＡＥ発生と関連した（図４ＡおよびＢ）。したがって、性能を改善する手段として統合モデリングを探究した。ランダムフォレストを用いた非線形モデリングを含めたいくつかの技法を評定したが、ロジスティック回帰（Ｒのｇｌｍ）により同等の性能が実現され、一般化線形モデルは相対的に単純かつロバストであることから、これを選択した。訓練前に、バルクコホート１および２において各特色を外れ値についてＲＯＵＴ検定を使用して偽発見率＝１０％で検定した。８８のデータ点（２つの特色×５３例の試料）のうち、３つの外れ値が検出され、これらは全て、バルクコホート１の活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞からのものであった。訓練コホートにかかわらず、検出された外れ値は全て、一定してこれらの３例の試料からのものであった。したがって、各統合モデルについて、訓練コホート内の全ての非外れ値試料の間で活性化ＣＤ４ ＴＭ細胞レベルの最大画分ｍａｘＦを決定した。次いで、ｍａｘＦを全ての試料についての上限として使用した。
【0092】
複合モデルを、重度のｉｒＡＥ（グレード３＋）発生を予測するようにいくつかの方式で訓練した。これらには、バルクコホート１で訓練し、ホールドアウトされていたバルクコホート２でテストすること（図４Ｄ、左）；１つの治療型で訓練し、別の治療型でテストすること（図４Ｄ、右）；およびＬＯＯＣＶを使用してバルクコホートにわたって訓練することが含まれる。ＬＯＯＣＶによる評定に関しては全てのモデルについて分析をｎ回繰り返した。ここで、ｎは患者の総数である。各反復において、モデルをｉ番目の患者以外の各患者に対して訓練し、ホールドアウトされていたｉ番目の患者に対し評価した。患者をＬＯＯＣＶによって高群および低群に分ける際の過剰適合を軽減するために、ＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を適用して、各訓練コホートにおける感度および特異度が最適化される閾値を決定し、次いで、この閾値に基づいて、ホールドアウトされていたｉ番目の患者を割り当てた。
【0093】
複合モデルスコアを、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によって評定した。重度のｉｒＡＥを非重度のｉｒＡＥと識別するように訓練したモデルを使用して、今後の重度のｉｒＡＥの発生（図４Ｄおよび１３Ａ）、ｉｒＡＥグレード（図４Ｃ、４Ｅ、１３Ｂ、および１３Ｅ）、ｉｒＡＥの影響を受ける器官系の数（図１３Ｈ～Ｊ）ならびに重度のｉｒＡＥ発生までの時間（図５Ａおよび図１４）について予測した。当該モデルを異なる患者サブグループにおいても評定し（図４Ｄおよび１３Ｄ）、バルクＲＮＡ－ｓｅｑで評価した経路および以前に公開されたバイオマーカーと比較した（図１３Ｃ）。複合モデルを異なるｉｒＡＥグレード閾値でさらに検証し（図１３Ｆ）、ｉｒＡＥ発生について予測するように治療型ごとに別々にテストした（図４Ｄ、５Ａ、１３Ａ、１３Ｄ～Ｆ、８Ｂ、８Ｃ）。
【0094】
自己免疫障害における循環中の白血球組成の評定。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑまたはマイクロアレイによってプロファイリングし、ＳＬＥ患者２３９例、ＩＢＤ患者３４８例、および対をなす健康対照１９１例にわたる末梢血遺伝子発現データセットを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）からダウンロードした。ＨｕｎｇらによるＲＮＡ－ｓｅｑデータを前処理された発現行列としてダウンロードし、分析前にＴＰＭで正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータセット（ｎ＝５）をＣＥＬファイルとしてダウンロードし、ＭＡＳ５で正規化し（Ｒのａｆｆｙ ｖ．３．１２（参考文献８２））、各プラットフォームに特異的なカスタムチップ定義ファイルを使用してＥｎｔｒｅｚ遺伝子識別子にマッピングし（ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ＣｕｓｔｏｍＣＤＦ／）、ＨＵＧＯ遺伝子記号に変換した。データセットの１つは入手可能な生ＣＥＬファイルがなく、その代わりに、前処理された発現データをＧＥＯから得た。複数のプローブセットが同じ遺伝子記号にマッピングされた場合には、試料にわたって平均ｌｏｇ２発現が最も高いプローブセットをさらなる分析のために選択した。Ｐａｌｍｅｒらのデータセットでは、対照として同定された一部の試料はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ感染症、小児脂肪便症、またはクローン病への進行を有する対象からのものであった；これらは分析から除外した。Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｏらのデータセットにおける反復実験試料として、最新の試料を選択した。Ｐｅｔｅｒｓらのデータセットに関しては、クローン病の患者由来の処置前血液試料（０週目）のみをさらに分析した。上記の通りＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ４９をＬＭ２２と共にＨｕｎｇらのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータセットに適用し、一方、マイクロアレイデータセットについては（１）分位正規化およびＢモードバッチ補正（非ＨＧ－Ｕ１３３プラットフォーム）または（２）分位正規化、およびバッチ補正なし（ＨＧ－Ｕ１３３プラットフォーム）のいずれかを用いて実行した。白血球サブセットを末梢血中に見いだされる単核サブセットに限定し（顆粒球およびマクロファージを除去した）、各試料について合計で１になるように再度正規化した。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑまたはマイクロアレイによってプロファイリングし、ＳＬＥ患者２３９例、ＩＢＤ患者３４８例、および対をなす健康対照１９１例にわたる末梢血遺伝子発現データセットを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）からダウンロードした。ＨｕｎｇらによるＲＮＡ－ｓｅｑデータを前処理された発現行列としてダウンロードし、分析前にＴＰＭで正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータセット（ｎ＝５）をＣＥＬファイルとしてダウンロードし、ＭＡＳ５で正規化し（Ｒのａｆｆｙ ｖ．３．１２（参考文献８２））、各プラットフォームに特異的なカスタムチップ定義ファイルを使用してＥｎｔｒｅｚ遺伝子識別子にマッピングし（ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ＣｕｓｔｏｍＣＤＦ／）、ＨＵＧＯ遺伝子記号に変換した。データセットの１つは入手可能な生ＣＥＬファイルがなく、その代わりに、前処理された発現データをＧＥＯから得た。複数のプローブセットが同じ遺伝子記号にマッピングされた場合には、試料にわたって平均ｌｏｇ２発現が最も高いプローブセットをさらなる分析のために選択した。Ｐａｌｍｅｒらのデータセットでは、対照として同定された一部の試料はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ感染症、小児脂肪便症、またはクローン病への進行を有する対象からのものであった；これらは分析から除外した。Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｏらのデータセットにおける反復実験試料として、最新の試料を選択した。Ｐｅｔｅｒｓらのデータセットに関しては、クローン病の患者由来の処置前血液試料（０週目）のみをさらに分析した。上記の通りＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ４９をＬＭ２２と共にＨｕｎｇらのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータセットに適用し、一方、マイクロアレイデータセットについては（１）分位正規化およびＢモードバッチ補正（非ＨＧ－Ｕ１３３プラットフォーム）または（２）分位正規化、およびバッチ補正なし（ＨＧ－Ｕ１３３プラットフォーム）のいずれかを用いて実行した。白血球サブセットを末梢血中に見いだされる単核サブセットに限定し（顆粒球およびマクロファージを除去した）、各試料について合計で１になるように再度正規化した。
【0095】
各データセット内で、両側、対応のないウィルコクソン順位和検定を適用して、同じ試験からの疾患を有する個体と健康対照の間で末梢血中の各白血球サブセットのレベルを評価した（図１６）。得られたＰ値を、関連性の方向性を考慮に入れて両側ｚ－スコアに変換した。所与の疾患表現型（ＳＬＥまたはＩＢＤ）内で、ｚ－スコアを、サンプルサイズによって重み付けしたＬｉｐｔａｋ法を使用し、データセットにわたって組み合わせた（図１６）。最後に、ＳＬＥ特異的およびＩＢＤ特異的メタｚ－スコアを、Ｓｔｏｕｆｆｅｒ法を使用して組み合わせ（図１６）、各白血球サブセットについての汎ＳＬＥ／ＩＢＤメタｚ－スコアを得た（図６）。
【0096】
以前の文献および経路分析による候補毒性バイオマーカー。
複合モデルを、重度のｉｒＡＥの予測のための以前に公開されたｉｒＡＥバイオマーカーおよび富化された経路を基準として評価した（図１３Ｃ）。各候補バイオマーカーをバルクコホート１および２において別々に、ＲＯＣ分析によってＡＵＣを決定することにより評定した。以前の文献においてタンパク質発現によって測定された以下の処置前のｉｒＡＥバイオマーカーを、本試験における末梢血中のＲＮＡの代用物：個々に２変数線形回帰を用いて評価したＡＤＰＧＫおよびＬＣＰ１；ＣＤ７４およびＧＮＡＬ１５発現；ならびに、同じ１１種のサイトカイン（ＣＳＦ３、ＣＳＦ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＦＧＦ２、ＩＦＮＡ２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ２、ＩＬ１３）をコードする遺伝子の幾何平均発現として評価したＣＹＴＯＸスコアによって評定した。それとは別に、ＧＳＥＡＰｒｅｒａｎｋｅｄ ｖ．７．１．０によって予め順位付けしたＧＳＥＡ ｖ．４．１．０を適用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｖ７．４ホールマーク経路収集物から、バルクコホート１および２における最もｉｒＡＥにより富化された経路を同定した。インプットとして、重度のｉｒＡＥが発生した患者と重度のｉｒＡＥが発生しなかった患者の間のｌｏｇ２倍率変化によって順位付けしたトランスクリプトームワイド遺伝子一覧をバルクコホート１および２について定義した。ｑ＜０．２５の遺伝子セットを統計的に有意であるとみなした。重度のｉｒＡＥを有する患者において、重度のｉｒＡＥを有さない患者に対して最も富化された２つの遺伝子セット（ＭＹＣ＿ＴＡＲＧＥＴＳ＿Ｖ１；ＯＸＩＤＡＴＩＶＥ＿ＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮ）をバルクコホート１および２において複合モデルと比較した（図１３Ｃ）。
複合モデルを、重度のｉｒＡＥの予測のための以前に公開されたｉｒＡＥバイオマーカーおよび富化された経路を基準として評価した（図１３Ｃ）。各候補バイオマーカーをバルクコホート１および２において別々に、ＲＯＣ分析によってＡＵＣを決定することにより評定した。以前の文献においてタンパク質発現によって測定された以下の処置前のｉｒＡＥバイオマーカーを、本試験における末梢血中のＲＮＡの代用物：個々に２変数線形回帰を用いて評価したＡＤＰＧＫおよびＬＣＰ１；ＣＤ７４およびＧＮＡＬ１５発現；ならびに、同じ１１種のサイトカイン（ＣＳＦ３、ＣＳＦ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＦＧＦ２、ＩＦＮＡ２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ２、ＩＬ１３）をコードする遺伝子の幾何平均発現として評価したＣＹＴＯＸスコアによって評定した。それとは別に、ＧＳＥＡＰｒｅｒａｎｋｅｄ ｖ．７．１．０によって予め順位付けしたＧＳＥＡ ｖ．４．１．０を適用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｖ７．４ホールマーク経路収集物から、バルクコホート１および２における最もｉｒＡＥにより富化された経路を同定した。インプットとして、重度のｉｒＡＥが発生した患者と重度のｉｒＡＥが発生しなかった患者の間のｌｏｇ２倍率変化によって順位付けしたトランスクリプトームワイド遺伝子一覧をバルクコホート１および２について定義した。ｑ＜０．２５の遺伝子セットを統計的に有意であるとみなした。重度のｉｒＡＥを有する患者において、重度のｉｒＡＥを有さない患者に対して最も富化された２つの遺伝子セット（ＭＹＣ＿ＴＡＲＧＥＴＳ＿Ｖ１；ＯＸＩＤＡＴＩＶＥ＿ＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮ）をバルクコホート１および２において複合モデルと比較した（図１３Ｃ）。
【0097】
統計値。
別段の指定のない限り、統計的検定は全て両側検定であった。２群間の統計的差異を評定するためにウィルコクソン順位和検定を使用した。２つよりも多くの群を同時に評定する場合はノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を使用した。別段の指定のない限り、多重仮説検定にはＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を適用した。上記の通り重度のｉｒＡＥ発生およびＣｙＴＯＦ ＣＤ４ ＴＥＭ存在量を用いてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑクラスター相関を評定するために並べ替えスキームをインプリメントした。２つのカテゴリカル変数間の統計的差異を評定するためにフィッシャーの直接検定を適用した。分類の正解度を評定するためにＲＯＣ分析を実施し、ＡＵＣによって定量した。ＡＵＣの統計的有意性を両側ｚ検定によって決定した。ＲＯＣ分析後の最適なカットポイントを同定するためにＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用した。直線的一致をピアソン（ｒ）またはスピアマン（ρ）相関によって決定し、両側ｔ検定を使用して、結果が有意にゼロではないかどうかを評定した。重度のｉｒＡＥまでの時間に関して共変量を評定するためにカプラン・マイヤーおよびコックス回帰分析を使用した。カプラン・マイヤー分析についての有意水準およびＨＲは両側ログランク検定を使用して決定した。図５Ａおよび１４の複合モデルおよび関連する分析には、バルクコホート１および２からの患者を含め（図１）、重度のｉｒＡＥは発生しなかったが、初期段階で疾患進行が生じ、３カ月が経過する前に治療切り換えに至った２例の患者（ＹＵＤＩＭＥおよびＹＵＭＥＤＩＣ）を例外とした。これらの２例の患者は、それぞれ、患者集団において生じた全ての重度のｉｒＡＥのうち７６％が生じた期間である６３日間（２．１カ月間）の免疫チェックポイント遮断を受けたので他の分析に含めた。
別段の指定のない限り、統計的検定は全て両側検定であった。２群間の統計的差異を評定するためにウィルコクソン順位和検定を使用した。２つよりも多くの群を同時に評定する場合はノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を使用した。別段の指定のない限り、多重仮説検定にはＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を適用した。上記の通り重度のｉｒＡＥ発生およびＣｙＴＯＦ ＣＤ４ ＴＥＭ存在量を用いてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑクラスター相関を評定するために並べ替えスキームをインプリメントした。２つのカテゴリカル変数間の統計的差異を評定するためにフィッシャーの直接検定を適用した。分類の正解度を評定するためにＲＯＣ分析を実施し、ＡＵＣによって定量した。ＡＵＣの統計的有意性を両側ｚ検定によって決定した。ＲＯＣ分析後の最適なカットポイントを同定するためにＹｏｕｄｅｎのＪ統計値を使用した。直線的一致をピアソン（ｒ）またはスピアマン（ρ）相関によって決定し、両側ｔ検定を使用して、結果が有意にゼロではないかどうかを評定した。重度のｉｒＡＥまでの時間に関して共変量を評定するためにカプラン・マイヤーおよびコックス回帰分析を使用した。カプラン・マイヤー分析についての有意水準およびＨＲは両側ログランク検定を使用して決定した。図５Ａおよび１４の複合モデルおよび関連する分析には、バルクコホート１および２からの患者を含め（図１）、重度のｉｒＡＥは発生しなかったが、初期段階で疾患進行が生じ、３カ月が経過する前に治療切り換えに至った２例の患者（ＹＵＤＩＭＥおよびＹＵＭＥＤＩＣ）を例外とした。これらの２例の患者は、それぞれ、患者集団において生じた全ての重度のｉｒＡＥのうち７６％が生じた期間である６３日間（２．１カ月間）の免疫チェックポイント遮断を受けたので他の分析に含めた。
【0098】
コックス回帰に関しては、結果をＷａｌｄ統計値（ｚ－スコア）に基づいて分析し、有意性をＷａｌｄ検定によって評定した。コックス回帰に含めた各共変量について比例ハザード仮定を確認してから、Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ残差を評価することによる分析を行った。必要に応じて、統合統計分析のためにＬｉｐｔａｋ法およびＳｔｏｕｆｆｅｒ法を使用した。バルクコホート１および２についてのサンプルサイズ算出をＲ８６のｐｗｒ ｖ．１．３－０を使用して実施した。シングルセル発見コホートにおいて、ＣＤ４ ＴＥＭ細胞の存在量（ＣｙＴＯＦ）と重度のｉｒＡＥ発生の間の関連性の効果量は１．９９であった（図２ＣおよびＤ）。バルクコホート１および２を、α＝０．０５および１－β＝０．８でこの効果量要件を満たす一方で、バルクコホート１において特異度が強調され（重度のｉｒＡＥを有さない患者の数＞重度のｉｒＡＥを有する患者の数）、バルクコホート２において平衡（重度のｉｒＡＥを有さない患者の数≒重度のｉｒＡＥを有する患者の数）が強調されるように設計した。統計分析は全て、Ｒ ｖ．３．５．１＋またはＰｒｉｓｍ ８＋（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実施した。
【図1】
【図2A-B】
【図2C-D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A-B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A-B】
【図5C-D】
【図6】
【図7A-C】
【図7D-E】
【図8A】
【図8B-C】
【図8D-E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図10A-B】
【図10C-E】
【図10F-G】
【図11A-B】
【図11C-D】
【図11E-F】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A-B】
【図13C】
【図13D】
【図13E-F】
【図13G-H】
【図13I】
【図13J】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A-B】
【図15C】
【図15D-E】
【図15F】
【図15G】
【図15H】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図18A-B】
【図18C】
【図19】
【国際調査報告】