特表 2025-502345 エキソソームの生産性を増加させる方法、およびそれにより生産されたエキソソームを含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-24

(54)【発明の名称】エキソソームの生産性を増加させる方法、およびそれにより生産されたエキソソームを含む組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20250117BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20250117BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20250117BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20250117BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20250117BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALN20250117BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20250117BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 D

C12N5/074

C12N5/0735

C12N5/0775

C12N5/0789

C12N5/0797

C12N5/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024542248

(86)(22)【出願日】2023-01-16

(85)【翻訳文提出日】2024-07-12

(86)【国際出願番号】 KR2023000753

(87)【国際公開番号】W WO2023136691

(87)【国際公開日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】10-2022-0005693

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0082798

(32)【優先日】2022-07-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0098866

(32)【優先日】2022-08-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524265518

【氏名又は名称】キム、スン チャン

【氏名又は名称原語表記】ＫＩＭ，Ｓｅｕｎｇ Ｃｈａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】キム、スン チャン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BC06

4B065BD50

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、高圧酸素を処理してエキソソームの生産性を向上させる方法、およびそれにより生産されたエキソソームを含む組成物に関し、本発明の方法を利用する場合、エキソソームの生産性を効果的に向上させることができるので、これをエキソソームを活用する診断および治療などに非常に有用に利用してもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞が含まれた試料を第１の気圧の環境で培養するステップと、
前記第１の気圧より高い第２の気圧の環境で前記試料を培養するステップと、を含み、
前記第２の気圧条件は、高圧の酸素によって組成される、エキソソームの生産性を向上させる方法。

【請求項2】

前記試料からエキソソームを抽出するステップと、をさらに含む、請求項１に記載のエキソソームの生産性を向上させる方法。

【請求項3】

前記細胞は幹細胞である、請求項１に記載のエキソソームの生産性を向上させる方法。

【請求項4】

前記第１の気圧の環境で培養するステップ、および前記第２の気圧の環境で培養するステップが２回以上繰り返して行われる、請求項１に記載のエキソソームの生産性を向上させる方法。

【請求項5】

前記第２の気圧は、１ないし５ＡＴＡである、請求項１に記載のエキソソームの生産性を向上させる方法。

【請求項6】

前記第２の気圧の環境で試料を培養するステップは、６０ないし１２０分にかけて行われる、請求項１に記載のエキソソームの生産性を向上させる方法。

【請求項7】

エキソソームを含む組成物であって、
１ｍｌ当たり５×１０^９個以上のエキソソーム個数濃度を有するエキソソームを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高圧酸素処理を利用してエキソソームの生産性を増加させる方法、およびそれにより生産されたエキソソームを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

エキソソームは様々な種類の細胞から分泌される膜構造の小さな小胞である。エキソソームの直径はおおよそ３０ないし３００ｎｍであることが報告されている。エキソソームは、電子顕微鏡を介した研究において、原形質膜から直接的に分離されるものではなく、多小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ；ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内の特定区画から起源して細胞外に放出、分泌されることが観察された。すなわち、多小胞体と原形質膜が融合されると、小胞は細胞外の環境に放出され、これをエキソソームと呼ぶ。このようなエキソソームがどのような分子的機序によって作られるかははっきりと明らかにされていないが、赤血球細胞だけでなく、Ｂ－リンパ球、Ｔリンパ球、樹枝状細胞、血小板、マクロファージなどを含む様々な種類の免疫細胞と、腫瘍細胞、幹細胞なども生きている状態でエキソソームを生産して分泌すると知られている。

【0003】

また、最近の研究によると、エキソソームは、細胞間信号伝達および廃棄管理のような過程において重要な役割を果たしていると報告された（非特許文献１）。エキソソームは疾病の予後、治療および健康と疾病のためのバイオマーカーとして用いられてもよい潜在力を有しており、最近、臨床適用への関心が増加している。

【0004】

発明の背景となる技術は、本発明に対する理解をより容易にするために作成された。発明の背景となる技術に記載されている事項が先行技術として存在すると認めるものと理解されてはならない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｅｄｗｉｎ ｖａｎ ｄｅｒ ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｊｕｌｙ ２０１２、６４（３）６７６～７０５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

一方、細胞が生成するエキソソームが微量であるので、これを効率的に多量に得るためのエキソソームの生産性を増加させることができる方法が要求されている実情である。
そこで、本発明者らは、エキソソームの生産性を効果的に増加させることができる方法を開発しようとした。

【0007】

その結果、本発明の発明者らは、幹細胞を培養する時、高圧酸素を処理してエキソソームの生産性を増加させる方法を開発するのに至った。
これに対し、本発明において解決しようとする課題は、幹細胞の培養過程において高圧酸素を処理してエキソソームの生産性を増加させる方法を提供することである。

【0008】

本発明の課題は、以上において言及した課題に制限されるものではなく、言及されていないまた他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解できるものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前述のような課題を解決するために、細胞が含まれた試料を第１の気圧の環境で培養するステップと、前記第１の気圧より高い第２の気圧の環境で前記試料を培養するステップと、を含み、前記第２の気圧条件は、高圧の酸素によって組成される方法が提示される。

【0010】

本発明における「細胞」は、身体から得たあらゆる種類の体細胞であってもよく、例えば、皮膚、毛嚢、歯根、脂肪、血液、小便、粘液、唾液、涙、血漿、血清、尿、喀痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引物、リンパ液、気道液、腸液、および泌尿生殖管液、母乳、リンパ系体液、精液、脳脊髄液、器官系内体液、腹水、嚢胞性腫瘍体液、羊水液およびその組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つであってもよく、エキソソームを分泌する細胞であれば、これに限定されるものではない。また、「細胞」は、身体から得た体細胞の他に、植物、動物などのヒトとは異なる個体から得た細胞であってもよい。

【0011】

本発明における「エキソソーム」は、細胞によって放出されるエンドソーム由来の脂質二重層を有する小さな膜小胞を意味し、エキソソームは、細胞間信号を伝達するために、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを有して細胞外に分泌される小さな小胞を示してもよく、例えば、タンパク質、脂質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびゲノムＤＮＡを含んでもよい。

【0012】

一具現例において、前記幹細胞由来のエキソソームは、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたマーカータンパク質を含んでもよいが、これに制限されるものではない。

【0013】

具体的に、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１は、エキソソームの代表的なポジティブマーカーであるので、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の含量とエキソソームの含量は互いに線形性を有し、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１含量の増加は、エキソソーム含量の比例的な増加を意味する。

【0014】

一具体例において、エキソソームは制限されないが、脂肪、ヒト血液から由来、抽出または分離されたものであってもよい。または、エキソソームは、幹細胞または免疫細胞から抽出されてもよい。前記幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）、成体幹細胞、胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞、または誘導多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞であってもよい。前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、細胞毒性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ）、樹枝状細胞またはマクロファージであってもよい。また、エキソソームは身体から得た細胞の他に、植物、動物などのヒトとは異なる個体から得た細胞から由来、抽出または分離されたものであってもよい。

【0015】

また、本発明を限定しない例示として、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系基質細胞、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞で構成された群から選択される１種以上の成体幹細胞であってもよい。前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、ホウォートンゼリーおよび胎盤で構成された群から選択される１種以上の組織から由来した間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、例えば、脂肪、骨髄、臍帯または臍帯血由来の幹細胞であってもよく、より好ましくは、脂肪由来の幹細胞であってもよい。

【0016】

一具体例として、前記エキソソームが幹細胞から抽出されるものである場合、前記幹細胞は、脂肪組織（例えば、ヒトの脂肪組織）から分離された幹細胞（例えば、ヒト脂肪由来の幹細胞）であってもよいが、これに制限されるものではなく、脂肪、骨、軟骨、筋繊維などの一つ以上の間葉系細胞に分化できる細胞を全て含んでもよい。前記脂肪由来の幹細胞（ＡＤＳＣ）は、脂肪前駆細胞、基質細胞、多分化能脂肪由来細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）または脂肪由来の成体幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）のうち少なくとも１種であってもよい。

【0017】

前記幹細胞または前記免疫細胞の種類は、病原体による感染の危険がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、好ましくは、ヒト由来の幹細胞またはヒト由来の免疫細胞であってもよい。

【0018】

しかしながら、当業界において用いられているか、追って用いられ得る様々な動物細胞、植物細胞を含んでもよく、後述する実施例において用いられた脂肪幹細胞は、本発明において用いられ得る動物細胞の一例として理解されなければならず、これに制限されるものではない。

【0019】

本発明における「試料」は、身体から得た血液、小便、粘液、唾液、涙、血漿、血清、尿、喀痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引物、リンパ液、気道液、腸液、および泌尿生殖管液、母乳、リンパ系体液、精液、脳脊髄液、器官係内体液、腹水、嚢胞性腫瘍体液、羊水液およびその組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つであってもよく、また、培養細胞の培地を含んでもよく、また、エキソソームを分泌する試料であれば、これに限定されない。ここで、培地としては、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）が含まれたものを用いてもよいが、これに限定されるものではなく、商業的に入手可能なエックセルセラピューティックス社のＣｅｌｌＣｏｒ^ＴＭＣＤ ＭＳＣ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＭｅｓｅｎＣｕｌｔ^ＴＭｐｌｕｓ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社のｅｐｒｏＧｒｏｗ^ＴＭｈＭＳＣ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）Ｍｅｄｉａ、ＢＩ／Ｓａｔｏｒｉｕｓ社のＭＳＣ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）シリーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ社のＳｔｅｍＭＡＣＳ^ＴＭ、Ｒｏｏｓｔｅｒｂｉｏ社のＲｏｏｓｔｅｒＮｏｕｒｉｓｈ^ＴＭ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社のＳｔｅｍＸＶｉｖｏ^ＴＭ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社のＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）ＭＳＣ ＸＦ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＦＵＪＩ社のＰＲＩＭＥ－ＸＶ ＸＳＦＭまたはＰＲＩＭＥ－ＸＶ ＳＦＭ、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社のＳｔｅｍＦｉｔ ｆｏｒ ＭＳＣ、Ｌｏｎｚａ社のＴｈｅｒａＰＥＡＫ^ＴＭ、Ｃｅｌｌｎｔｅｃ社のＣｎＴ－ＰＲ－ＭＳＣ－ＸＦなどが用いられてもよい。

【0020】

一実施例において、血液は、体内の細胞に酸素と栄養素を供給し、細胞の新陳代謝によって発生する二酸化炭素と老廃物を回収して運搬する役割を果たす体液のことである。血漿（ｐｌａｓｍａ）は、血液を構成する液体成分であり、タンパク質を始めとして多種多様な有機物や無機物が溶けている溶媒の役割を果たす。血清または漿液（ｓｅｒｕｍ）は、血液の一部成分であって血漿からフィブリノーゲンが除去された残りの黄色い液体成分のことである。

【0021】

本発明の一具体例のエキソソームの生産性の向上方法は、エキソソームの生産効率および收得率を増加させるために、幹細胞が培養される過程で一般培養条件と有利な条件間の環境条件、例えば、培養基内部の圧力条件、酸素濃度条件、二酸化炭素濃度条件、窒素濃度条件、空気組成条件、光源の波長条件、温度条件などを変化させて生産効率および收得率の増加を達成することができ、より具体的には、高圧酸素を処理することを特徴とする。

【0022】

一具体例において、細胞が含まれた試料を第１の気圧の環境で培養するステップと、前記第１の気圧より高い第２の気圧の環境で前記試料を培養するステップと、を含み、前記第２の気圧条件は、高圧の酸素によって組成されることで、エキソソームの生産効率および收得率を増加させるものであってもよく、これに制限されるものではない。

【0023】

より具体的に、前記試料からエキソソームを抽出するステップと、をさらに含んでもよいが、これに制限されるものではない。
より具体的に、前記細胞は幹細胞であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0024】

より具体的に、前記第１の気圧の環境で培養するステップ、および前記第２の気圧の環境で培養するステップが２回以上繰り返して行われてもよいが、これに制限されるものではない。

【0025】

より具体的に、前記第２の気圧は、１ないし５ＡＴＡであってもよいが、これに制限されるものではない。
より具体的に、前記第２の気圧の環境で試料を培養するステップは、６０ないし１２０分にかけて行われてもよいが、これに制限されるものではない。

【0026】

本明細書において用いられた用語「生産性」および「收得率」は、一定試料から得られるエキソソーム量を意味するものであって、本実施例において説明した実験方法を含む一般的な定量化方法によって測定されたことを意味する。

【0027】

一具体例において、エキソソームの生産効率および收得率の向上方法において、前記生産効率および收得率は、エキソソーム培養液１ｍｌ当たりのエキソソームの粒子数で定義されてもよい。

【0028】

以下、実施例によって本発明をより詳しく説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解析されてはならない。

【発明の効果】

【0029】

本発明の一実施例によるエキソソームの生産性を増加させる方法は、幹細胞の培養過程において相対的に苛酷な条件と相対的に有利な条件との間の環境条件、例えば、有利な条件として高圧酸素を処理して培養することで、生産効率および收得率が増加する効果を有する。

【0030】

より具体的に、有利な条件として高圧酸素処理は、１ないし５ＡＴＡ条件で６０分ないし１２０分間、１回ないし５回処理されるものであってもよく、好ましくは、３ＡＴＡ条件で９０分間、３回処理されるものであってもよく、これによってエキソソームの生産効率および收得率が増加することを確認した。

【0031】

本発明による効果は、以上において例示された内容によって制限されず、さらに様々な効果が本明細書内に含まれている。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】本発明の一実施例による高温酸素処理方法を図式化したものである。

【図2】対照群（Ａ０）でのナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＮＴＡ）の結果によるエキソソームのサイズと濃度分布を示した図である。

【図3】実験群（Ａ１）でのナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＮＴＡ）の結果によるエキソソームのサイズと濃度分布を示した図である。

【図4】実験群（Ａ２）でのナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＮＴＡ）の結果によるエキソソームのサイズと濃度分布を示した図である。

【図5】実験群（Ａ３）でのナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＮＴＡ）の結果によるエキソソームのサイズと濃度分布を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

以上、添付図面を参照して、本発明の実施例をより詳しく説明したが、本発明は、必ずこのような実施例に限るのではなく、本発明の技術思想から外れない範囲内で多様に変形実施されてもよい。

【0034】

従って、本発明に開示されている実施例は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく、説明するためのものであって、このような実施例によって本発明の技術思想の範囲が限定されるものではない。そのため、以上において記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないことが理解されなければならない。本発明の保護範囲は、以下の請求の範囲によって解析されなければならず、それと同等な範囲内にあるあらゆる技術思想は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されなければならない。

【0035】

以下、実施例によってより詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は、一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0036】

実施例１．細胞培養
エキソソームを抽出するために、３０ないし４０歳の健康な成人男性の下腹部から各７０ｃｃの脂肪を吸入して間質血管細胞群（ＳＶＦ；ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を抽出した後、大気圧力を有する－１９６℃の窒素タンクで冷凍処理した。

【0037】

以後、前記冷凍処理した間質血管細胞群を解凍し、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００ユニット（Ｕｎｉｔｓ）／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地として用いてフラスコに接種し、３７℃、Ａｉｒ、５％のＣＯ_２培養基で７日間培養し、十分な幹細胞を確保するために同じ条件でさらに１８日を培養した。

【0038】

実施例２．高圧酸素処理
前記実施例１において培養した細胞を４つの群（Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３）に分けて高圧酸素処理回数を異にして以下のように処理した。

【0039】

各サンプルは、各１ウェル（１０ｍｌ）当たり１０^５ｃｅｌｌｓ数になるように分注し、対照群および実験群は、それぞれ２つのウェルで実験を進めた。
高圧酸素処理は、高圧酸素チャンバで３ＡＴＡ、９０分にかけて細胞を培養することで行われており、高圧酸素処理をしない場合は、３７℃、Ａｉｒ、５％のＣＯ_２条件の一般インキュベーターで培養した。

【0040】

より具体的に、図１に示されているように、対照群であるＡ０は、高圧酸素の処理なしに一般インキュベーターで４日間培養し、実験群のうちＡ１は、培養１日目に１回の高圧酸素チャンバ内の培養を施行した後、一般インキュベーターで７０．５時間培養し、実験群のうちＡ２は、培養１日目および２日目に各１回ずつ、計２回の高圧酸素チャンバ内の培養を施行した後、４６．５時間にかけて一般インキュベーターで培養しており、実験群のうちＡ３は、培養１日目、２日目および３日目に各１回ずつ、計３回の高圧酸素チャンバ内の培養を施行した後、２２．５時間を一般インキュベーターでさらに培養した。以後、培養４日目に対照群Ａ０および実験群Ａ１ないしＡ３を全て回収し、計８つのウェル培養液を－１９６℃の窒素タンクで冷凍した。

【0041】

実施例３．エキソソーム抽出および特性分析
前記実施例１において培養した細胞および実施例２のように高温酸素を処理した幹細胞からエキソソームの生産性および收得率を測定するために、各対照群および実験群から培養液を得た後、ＡＴＰＳ（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ－Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）方法によりエキソソームを分離した。

【0042】

前記分離したエキソソームはナノ粒子追跡分析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ）を実施し、粒子の大きさと濃度を測定した。
その結果、図２ないし５および表１に示したように、分離されたエキソソームは、おおよそ２００ｎｍ前後の大きさ範囲（通常のエキソソームの大きさ範囲）に分布し、粒径分布が概ね均一で、エキソソームの大きさや分布特性を満たすことが確認できた。また、表１に示したように、高圧酸素を処理したＡ１ないしＡ３の場合、高圧酸素処理回数が増加するにつれてエキソソームの個数濃度が増加し、エキソソームの生産性が向上することを確認した。

【0043】

【表1】

【0044】

また、分離されたエキソソームに対して流動細胞分析を実施し、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１マーカーの存在を確認した。
ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１は、エキソソームの代表的なポジティブマーカーであるので、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の含量とエキソソームの含量は互いに線形性を有し、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の含量の増加は、エキソソーム含量の比例的な増加を意味する。

【0045】

具体的に、ＣＤ８１に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するために、エキソソーム－ヒューマンＣＤ８１分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造社の指示に従って用いており、ＰＥ－マウス抗－ヒトＣＤ９抗体（ＰＥ－Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ９；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ－マウス抗－ヒトＣＤ６３抗体（ＰＥ－Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ６３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＥ－マウス抗－ヒトＣＤ８１抗体（ＰＥ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてマーカーを染めた後、流動細胞分析器（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して分析した。その結果、図６に示されているように、実施例２において、分離されたエキソソームは陽性マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１に対して陽性であることを確認した。このような結果は、前記分離されたエキソソームがエキソソームに必ず存在しなければならない特異的マーカー特性を満たしていることを示す。

【0046】

従って、本発明を利用する場合、高い歩留まりで効果的にエキソソームを修得および大量生産できることを確認した。
一方、上述の実験は、一般培養基と高圧酸素処理が可能な培養基で行われていたが、これに限定されるものではなく、本発明による方法は、内部で圧力調節が可能なバイオリアクターで実行されてもよい。すなわち、試料を二つの圧力条件を有する培養基の間で交互に培養する方式で本発明の方法を行ってもよく、バイオリアクター内の空間内で圧力条件を変化させ、本発明の方法を行ってもよい。

【0047】

以上、本発明の実施例をさらに詳しく説明したが、本発明は、必ずこのような実施例に限るものではなく、本発明の技術思想から外れない範囲内で多様に変形実施されてもよい。従って、本発明に開示されている実施例は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく、説明するためのものであって、このような実施例によって本発明の技術思想の範囲が限定されるものではない。そのため、以上において記述した実施例は、全ての面において例示的なものであって、限定的ではないことが理解されなければならない。本発明の保護範囲は、以下の請求の範囲によって解析されなければならず、それと同等な範囲内にある全ての技術思想は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されなければならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】