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▶ エピジェニック・セラピューティクス・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】ＶＥＧＦを調節する方法およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20250117BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20250117BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250117BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20250117BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20250117BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20250117BHJP
C12N 9/22 20060101ALN20250117BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20250117BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20250117BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
A61P27/02
A61K48/00
A61K35/76
C12N15/12 ZNA
C12N15/113 Z
C12N9/22
C12N15/88 Z
C12N15/864 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542251
(86)(22)【出願日】2023-01-10
(85)【翻訳文提出日】2024-09-11
(86)【国際出願番号】 CN2023071521
(87)【国際公開番号】W WO2023134658
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/071930
(32)【優先日】2022-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524265552
【氏名又は名称】エピジェニック・セラピューティクス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＧＥＮＩＣ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ，チャンヤン
(72)【発明者】
【氏名】スン，イーディー
(72)【発明者】
【氏名】マオ，シャオシュアイ
(72)【発明者】
【氏名】ポン，ウェンボー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084DC01
4C084MA24
4C084MA41
4C084MA58
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZB211
4C084ZB212
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA24
4C087MA41
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZB21
(57)【要約】
本発明は、特に少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子を含む組成物を提供し、融合分子はＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内のゲノム領域を標的とし、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、前記ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供する。本発明はまた、インビボにおけるＶＥＧＦ遺伝子産物の低減または排除の方法、およびそれらの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または前記融合分子をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記融合分子がＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内のゲノム領域を標的とし、遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、前記ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供し、遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼもしくはその一部、またはジンクフィンガータンパク質系転写因子もしくはその一部、またはそれらの組合せを含み、
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質が、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩヌクレアーゼ、またはＭｅｇａＴａｌヌクレアーゼである、組成物。
【請求項2】
前記ＶＥＧＦ遺伝子がＶＥＧＦ－Ａ遺伝子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＶＥＧＦ制御エレメントが、転写開始部位、コアプロモーター、近位プロモーター、遠位エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターエレメント、境界エレメント、または遺伝子座制御領域である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変が、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内上流に位置している、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変が、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内下流に位置している、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変が、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の５００ｂｐ上流から５００ｂｐ下流まで以内に位置している、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変が、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の３００ｂｐ上流から３００ｂｐ下流まで以内に位置している、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変が、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の１０００ｂｐ以内上流から転写開始部位の３００ｂｐ以内下流に位置している、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項9】
前記少なくとも１つのヌクレオチドの改変がＤＮＡのメチル化である、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ジンクフィンガータンパク質系転写因子、それらの一部、およびそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはその一部、およびジンクフィンガータンパク質系転写因子またはその一部を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ１、またはＤＮＭＴ２である、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＤＮＭＴ３Ａが配列番号２３のアミノ酸配列を含み、および／または前記ＤＮＭＴ３Ｌが配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ジンクフィンガータンパク質系転写因子がＫｒｕｐｐｅｌ関連抑制ボックス（ＫＲＡＢ）である、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＫＲＡＢが配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌならびにそれらの組合せから選択され、ジンクフィンガータンパク質系転写因子がＫＲＡＢである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質が、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩヌクレアーゼ、またはＭｅｇａＴａｌヌクレアーゼである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項18】
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質がｄＣａｓ９である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記ｄＣａｓ９が、スタフィロコッカス・アウレウスｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９、カンピロバクター・ジェジュニｄＣａｓ９、コリネバクテリウム・ジフテリアｄＣａｓ９、ユーバクテリウム・ベントリオスムｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・パスチュリアヌスｄＣａｓ９、ラクトバチルス・ファルシミニスｄＣａｓ９、スピロヘータ・グローブスｄＣａｓ９、アゾスピリルム（例えばＢ５１０株）ｄＣａｓ９、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスｄＣａｓ９、ネイセリア・シネレアｄＣａｓ９、ロゼブリア・インテスティナリスｄＣａｓ９、パルビバクルム・ラバメンチボランスｄＣａｓ９、ニトラチフラクター・サルスギニス（例えばＤＳＭ １６５１１株）ｄＣａｓ９、カンピロバクター・ラリ（例えばＣＦ８９－１２株）ｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィルス（例えばＬＭＤ－９株）ｄＣａｓ９を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記ｄＣａｓ９が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項21】
前記融合分子が、前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方に融合した遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項22】
遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質に直接融合している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、非モジュレーター、第２のモジュレーター、またはリンカーを介して、前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質と間接的に融合している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項24】
前記融合分子が、Ｃ末端でＫＲＡＢと、Ｎ末端でＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌと融合したｄＣａｓ９を含む、請求項２１から２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項25】
前記融合分子が配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記融合分子が少なくとも１つの核局在化配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項27】
前記少なくとも１つの核局在化配列が、前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方に直接または間接的に融合している、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記融合分子をコードする核酸配列が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項29】
前記ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の標的ＤＮＡ配列と相補的である少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項30】
前記標的ＤＮＡ配列が、ＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦ－Ａ）遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６０0ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内上流または下流に位置している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
前記ｓｇＲＮＡが配列番号２９～５８および６０～８４の核酸配列を含む、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項32】
前記融合分子がリポソームまたは脂質ナノ粒子の中にパッケージングされている、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項33】
前記融合分子およびｓｇＲＮＡが、リポソームまたは脂質ナノ粒子の中にパッケージングされている、請求項２９から３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項34】
前記融合分子およびｓｇＲＮＡが、同じリポソームもしくは脂質ナノ粒子、または異なるリポソームもしくは脂質ナノ粒子の中にパッケージングされている、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子が、イオン化可能な脂質（モル比２０％～７０％）、ＰＥＧ化脂質（モル比０％～３０％）、支持脂質（モル比３０％～５０％）、およびコレステロール（モル比１０％～５０％）からなっている、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
前記イオン化可能な脂質が、ｐＨ応答性のイオン化可能な脂質、熱応答性のイオン化可能な脂質、および光応答性のイオン化可能な脂質からなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項37】
前記融合分子がＡＡＶベクターの中にパッケージングされている、請求項１から３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項38】
前記融合分子およびｓｇＲＮＡが、ＡＡＶベクターの中にパッケージングされている、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項39】
前記融合分子およびｓｇＲＮＡが、同じＡＡＶベクターの中または異なるＡＡＶベクターの中にパッケージングされている、請求項３８に記載の組成物。
【請求項40】
薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項41】
ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内に位置し、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の５００ｂｐ上流から５００ｂｐ下流まで以内に位置してもよい、標的ＤＮＡ配列と相補的な配列を含むｓｇＲＮＡ。
【請求項42】
配列番号２９～５８および６０～８４のいずれか１つの核酸配列を含み、配列番号５９で説明されるｔｒａｃｒ配列をさらに含んでもよい、請求項４１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項43】
前記ＶＥＧＦ遺伝子が、哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、およびウサギ由来のＶＥＧＦ－Ａ遺伝子である、請求項４１または４２に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項44】
請求項４１から４３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項45】
（ａ）少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または前記融合分子をコードする核酸配列、および（ｂ）請求項４１から４３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡおよび前記少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質に結合することができるタンパク質結合配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードする核酸配列
を含む組成物であって、
遺伝子発現の前記少なくとも１つのモジュレーターが、前記ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内に少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供する、組成物。
【請求項46】
細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を低減または排除する方法であって、請求項１から４０および４４)のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に導入し、それにより、前記細胞における前記ＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を低減または排除する工程を含む方法。
【請求項47】
対象におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を低減または排除するインビボの方法であって、請求項１から４０および４４のいずれか一項に記載の組成物を前記対象の細胞に導入し、それにより、前記対象における前記ＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を低減または排除する工程を含む方法。
【請求項48】
対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状を処置または軽減する方法であって、有効量の請求項１から４０および４４のいずれか一項に記載の組成物を前記対象の細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項49】
前記対象が、哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマ、ネコ、およびイヌである、請求項４７または４８のいずれかに記載の方法。
【請求項50】
前記ＶＥＧＦ関連障害が血管新生を伴う、請求項４８または４９のいずれかに記載の方法。
【請求項51】
前記ＶＥＧＦ関連障害が新生血管障害、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む眼科新生血管障害である、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記細胞が、網膜細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、または脈絡膜細胞である、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記融合分子が眼内注射および硝子体内注射等の局所注射によって前記対象に送達される、請求項４７から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状の処置または軽減における使用のための、請求項１から４０および４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項55】
前記ＶＥＧＦ関連障害が新生血管障害、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む眼科新生血管障害である、請求項５４に記載の使用のための組成物。
【請求項56】
対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状の処置または軽減のための医薬の製造における、請求項１から４０および４４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項57】
請求項１から４０および４４のいずれか一項に記載の組成物を含む容器を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は一般に、分子生物学、免疫学、および医学の分野に関する。より詳細には、本開示は、インビボ(in vivo)におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の標的化された低減または排除における使用のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系融合分子およびその使用の方法に関する。
【0002】
本出願は、本出願とともに電子フォーマットで提出され、それにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。
【背景技術】
【0003】
哺乳動物細胞内の任意の遺伝子を標的とするようにカスタマイズすることができる操作されたＤＮＡ結合性タンパク質は生医学研究における急速な進歩を可能にしており、遺伝子治療のための有望なプラットフォームである。ＲＮＡによってガイドされるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、プログラム可能な標的遺伝子制御のための有望なプラットフォームとして出現した。触媒として不活性な「デッド」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインへの融合により、細胞培養実験における標的遺伝子の高度に特異的かつ強力な調節またはサイレンシングが可能な合成リプレッサーが生成される。
【0004】
しかし、合成ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合タンパク質を用いる内因性遺伝子の持続的な調節およびサイレンシングは、インビボ治療における使用のためには困難であった。合成リプレッサーは、ウイルス系ベクターデリバリー法におけるサイズパッケージングの限界を超えている。安全性、毒性、免疫原性、およびオフターゲット効果は、インビボにおける合成リプレッサーの使用を制限する他の困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
遺伝子操作された合成遺伝子リプレッサーを生成するための代替のアプローチおよび治療薬としての使用のための合成遺伝子リプレッサーのインビボデリバリーに対するニーズが当技術で存在する。本開示は、当技術におけるこの満たされていないニーズに対処する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本開示は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の転写開始部位の５００ｂｐ上流から５００ｂｐ下流まで以内に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的な配列を含むｓｇＲＮＡを提供する。
【0007】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号２９～５８および６０～８４のいずれか１つの核酸配列を含む。
【0008】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子は、哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、およびウサギ由来のＶＥＧＦ－Ａ遺伝子である。
【0009】
一態様では、本開示は、本明細書で開示するｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を提供する。
【0010】
一態様では、本開示は、
（ａ）少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列、および
（ｂ）本明細書で開示するｓｇＲＮＡおよび少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質に結合することができるタンパク質結合配列を含むガイド分子、またはガイド分子をコードする核酸配列
を含む組成物を提供し、
遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内に少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供する。
（ａ）少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列、および
（ｂ）本明細書で開示するｓｇＲＮＡおよび少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質に結合することができるタンパク質結合配列を含むガイド分子、またはガイド分子をコードする核酸配列
を含む組成物を提供し、
遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内に少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供する。
【0011】
一部の実施形態では、本明細書に記載する遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の１，０００ｂｐ上流から１，０００ｂｐ下流まで以内に少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供する。
【0012】
一態様では、本開示は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、融合分子はＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内のゲノム領域を標的とし、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供する。
【0013】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼもしくはその一部、またはジンクフィンガータンパク質系転写因子もしくはその一部、またはそれらの組合せを含む。
【0014】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩヌクレアーゼ、またはＭｅｇａＴａｌヌクレアーゼである。
【0015】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、またはＶＥＧＦ－Ｅ遺伝子である。
【0016】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ制御エレメントは、転写開始部位、コアプロモーター、近位プロモーター、遠位エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターエレメント、境界エレメント、または遺伝子座制御領域である。
【0017】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内上流または下流に位置している。
【0018】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の５００ｂｐ以内上流または下流に位置している。
【0019】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の３００ｂｐ以内上流または下流に位置している。
【0020】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の１０００ｂｐ以内上流から転写開始部位の３００ｂｐ以内下流に位置している。
【0021】
一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの改変はＤＮＡのメチル化である。
【0022】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ジンクフィンガータンパク質系転写因子、それらの一部、およびそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数を含む。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ１、および／またはＤＮＭＴ２であってよい。
【0023】
一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３Ａは配列番号２３のアミノ酸配列を含み、および／またはＤＮＭＴ３Ｌは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【0024】
一部の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質系転写因子はＫｒｕｐｐｅｌ関連抑制ボックス（ＫＲＡＢ）である。具体的には、ＫＲＡＢは配列番号２２のアミノ酸配列を含んでよい。
【0025】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはその一部、およびジンクフィンガータンパク質系転写因子またはその一部を含む。具体的には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼはＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌならびにそれらの組合せから選択してよく、ジンクフィンガータンパク質系転写因子はＫＲＡＢであってよい。
【0026】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩヌクレアーゼ、またはＭｅｇａＴａｌヌクレアーゼである。例えば、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質はｄＣａｓ９である。
【0027】
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ｄＣａｓ９、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）ｄＣａｓ９、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）ｄＣａｓ９、ユーバクテリウム・ベントリオスム（Eubacterium ventriosum）ｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・パスチュリアヌス（Streptococcus pasteurianus）ｄＣａｓ９、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）ｄＣａｓ９、スピロヘータ・グローブス（Sphaerochaeta globus）ｄＣａｓ９、アゾスピリルム（Azospirillum）（例えばＢ５１０株）ｄＣａｓ９、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）ｄＣａｓ９、ネイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）ｄＣａｓ９、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）ｄＣａｓ９、パルビバクルム・ラバメンチボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ｄＣａｓ９、ニトラチフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）（例えばＤＳＭ １６５１１株）ｄＣａｓ９、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）（例えばＣＦ８９－１２株）ｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（例えばＬＭＤ－９株）ｄＣａｓ９を含む。
【0028】
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【0029】
一部の実施形態では、本明細書で開示する融合分子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方に融合した遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む。
【0030】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質に直接融合している。
【0031】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、非モジュレーター、第２のモジュレーター、またはリンカーを介して、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質と間接的に融合している。
【0032】
一部の実施形態では、本明細書で開示する融合分子は、Ｃ末端でＫＲＡＢと、Ｎ末端でＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌと融合したｄＣａｓ９を含む。
【0033】
一部の実施形態では、融合分子は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
【0034】
一部の実施形態では、融合分子は少なくとも１つの核局在化配列をさらに含む。少なくとも１つの核局在化配列は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方に直接または間接的に融合していてよい。
【0035】
一部の実施形態では、融合分子をコードする核酸配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）である。
【0036】
一部の実施形態では、本明細書で開示する組成物は、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の標的ＤＮＡ配列と相補的である少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む。
【0037】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６０0ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内上流または下流に位置している。
【0038】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは配列番号２９～５８および６０～８４の核酸配列を含む。
【0039】
一部の実施形態では、融合分子はリポソームまたは脂質ナノ粒子の中にパッケージングされている。
【0040】
一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは、リポソームまたは脂質ナノ粒子の中にパッケージングされている。融合分子およびｓｇＲＮＡは、同じリポソームもしくは脂質ナノ粒子、または異なるリポソームもしくは脂質ナノ粒子の中にパッケージングされていてよい。
【0041】
一部の実施形態では、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（モル比２０％～７０％）、ＰＥＧ化脂質（モル比０％～３０％）、支持脂質（モル比３０％～５０％）、およびコレステロール（モル比１０％～５０％）からなっている。
【0042】
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、ｐＨ応答性のイオン化可能な脂質、熱応答性のイオン化可能な脂質、および光応答性のイオン化可能な脂質からなる群から選択される。
【0043】
一部の実施形態では、融合分子はＡＡＶベクターの中にパッケージングされている。
【0044】
一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは、ＡＡＶベクターの中にパッケージングされている。融合分子およびｓｇＲＮＡは、同じＡＡＶベクターの中または異なるＡＡＶベクターの中にパッケージングされていてよい。
【0045】
一部の実施形態では、本明細書で開示する組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【0046】
一態様では、本開示は、細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を調節する（例えば低減または排除する）方法であって、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列を細胞内に導入する工程を含む方法を提供し、遺伝子発現のモジュレーターはＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供し、それにより、細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の発現が調節される（例えば低減または排除される）。
【0047】
一態様では、本開示は、対象におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を調節する（例えば低減または排除する）インビボの方法であって、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列を対象の細胞に導入する工程を含む方法を提供し、遺伝子発現のモジュレーターは、ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供し、それにより、対象におけるＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を調節する（例えば低減または排除する）。
【0048】
一態様では、本開示は、対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状を処置または軽減するための方法であって、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列を対象の細胞に導入する工程を含む方法を提供し、遺伝子発現のモジュレーターは、ＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を提供し、それにより、対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状が処置または軽減される。
【0049】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ制御エレメントは、コアプロモーター、近位プロモーター、遠位エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターエレメント、境界エレメント、または遺伝子座調節領域である。
【0050】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内上流に位置している。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の１０００ｂｐ以内上流に位置している。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の３００ｂｐ以内上流に位置している。
【0051】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内下流に位置している。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の約３００ｂｐ以内下流に位置している。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内の少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位の１０００ｂｐ以内上流および転写開始部位の３００ｂｐ以内下流に位置している。
【0052】
一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの改変はＤＮＡのメチル化である。
【0053】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼまたはその一部を含む。
【0054】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ１、またはＤＮＭＴ２である。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３Ａは配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３Ｌは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【0055】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ジンクフィンガータンパク質系転写因子またはその一部を含む。一部の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質系転写因子はＫｒｕｐｐｅｌ関連抑制ボックス（ＫＲＡＢ）である。一部の実施形態では、ＫＲＡＢは配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【0056】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはその一部、およびジンクフィンガータンパク質系転写因子またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼはＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌならびにそれらの組合せから選択され、ジンクフィンガータンパク質系転写因子はＫＲＡＢである。
【0057】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩヌクレアーゼ、またはＭｅｇａＴａｌヌクレアーゼである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質はｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、スタフィロコッカス・アウレウスｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９、カンピロバクター・ジェジュニｄＣａｓ９、コリネバクテリウム・ジフテリアｄＣａｓ９、ユーバクテリウム・ベントリオスムｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・パスチュリアヌスｄＣａｓ９、ラクトバチルス・ファルシミニスｄＣａｓ９、スピロヘータ・グローブスｄＣａｓ９、アゾスピリルム（例えばＢ５１０株）ｄＣａｓ９、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＣａｓ９、ネイセリア・シネラｄＣａｓ９、ロゼブリア・インテスティナリスｄＣａｓ９、パルビバクルム・ラバメンチボランスｄＣａｓ９、ニトラチフラクター・サルスギニス（例えばＤＳＭ １６５１１株）ｄＣａｓ９、カンピロバクター・ラリ（例えばＣＦ８９－１２株）ｄＣａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィルス（例えばＬＭＤ－９株）ｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【0058】
一部の実施形態では、融合分子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方に融合した遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む。
【0059】
一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質に直接融合している。一部の実施形態では、遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターは、非モジュレーター、第２のモジュレーター、またはリンカーを介して、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質と間接的に融合している。一部の実施形態では、融合分子は、Ｃ末端でＫＲＡＢと、Ｎ末端でＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌと融合したｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、融合分子は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
【0060】
一部の実施形態では、融合分子は少なくとも１つの核局在化配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの核局在化配列は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方に直接融合している。一部の実施形態では、少なくとも１つの核局在化配列は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはその両方にリンカーを介して間接的に融合している。
【0061】
一部の実施形態では、融合分子をコードする核酸配列はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、融合分子をコードする核酸配列はメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）である。
【0062】
一部の実施形態では、本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内のＤＮＡ配列と相補的である少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を導入し、それにより、ＶＥＧＦ遺伝子もしくはＶＥＧＦ制御エレメントを融合分子の標的とし、またはｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する工程をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは配列番号２９～５８および６０～８４の核酸配列を含む。
【0063】
一部の実施形態では、融合分子はリポソームまたは脂質ナノ粒子の中で製剤化される。一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡはリポソームまたは脂質ナノ粒子の中で製剤化される。一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは同じリポソームまたは脂質ナノ粒子の中で製剤化される。一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは異なるリポソームまたは脂質ナノ粒子の中で製剤化される。
【0064】
一部の実施形態では、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（モル比２０％～７０％）、ＰＥＧ化脂質（モル比０％～３０％）、支持脂質（モル比３０％～５０％）、およびコレステロール（モル比１０％～５０％）からなっている。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、ｐＨ応答性のイオン化可能な脂質、熱応答性のイオン化可能な脂質、および光応答性のイオン化可能な脂質からなる群から選択される。
【0065】
一部の実施形態では、融合分子はＡＡＶベクターの中で製剤化される。一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは、ＡＡＶベクターの中で製剤化される。一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは、同じＡＡＶベクターの中で製剤化される。一部の実施形態では、融合分子およびｓｇＲＮＡは、異なるＡＡＶベクターの中で製剤化される。
【0066】
一部の実施形態では、融合分子は、局所注射、全身注入、またはそれらの組合せで、細胞に送達される。一部の実施形態では、融合分子は、眼内注射または硝子体内注射によって、対象の眼に送達される。
【0067】
一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマ、ネコ、およびイヌである。
【0068】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ関連障害は血管新生を伴う。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ関連障害は新生血管障害、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む眼科新生血管障害である。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ関連障害は、ウェット型ＡＭＤまたはドライ型ＡＭＤである。
【0069】
本開示は、配列番号２９～５８および６０～８４のいずれか１つの核酸配列を含むｓｇＲＮＡを提供する。本開示は、本明細書で開示するｓｇＲＮＡのいずれか１つをコードするＤＮＡ配列を提供する。
【0070】
一態様では、対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状の処置または軽減における使用のための上記の組成物が本明細書で提供される。
【0071】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ関連障害は新生血管障害、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む眼科新生血管障害である。
【0072】
一態様では、対象におけるＶＥＧＦ関連障害の症状を処置または軽減するための医薬の製造における上記の組成物の使用が本明細書で提供される。
【0073】
一態様では、上記の組成物または融合分子を含む容器を含むキットが本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【0074】
【図1】図１Ａは、マウスＶＥＧＦ－Ａ発現を標的とする「ＥＰＩＣＡＳ」二重プラスミドシステムおよびｓｇＲＮＡタイリングスクリーンデザインを示す概略図である。第１のプラスミド（「触媒タンパク質」プラスミドまたは「融合分子」プラスミド）は、ＣＡＧプロモーターの制御下のＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、および２Ａエレメントによって分離されたＧＦＰマーカーをコードする。第２のプラスミド（「ｓｇＲＮＡ」プラスミド）は、Ｕ６プロモーターの制御下のｓｇＲＮＡスカフォールド、およびＣＭＶプロモーターの制御下のｍＣｈｅｒｒｙマーカーを有している。タイリングスクリーンのｓｇＲＮＡは、マウスＶＥＧＦ－Ａタンパク質コーディング配列（ＣＤＳ）の転写開始部位（ＴＳＳ）＋２５０ｂｐ上流を標的としている。 図１Ｂは、触媒タンパク質プラスミドおよび種々の単一ＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡプラスミドによるマウスＮ２Ａ細胞株のトランスフェクションの４８時間後の相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。 図１Ｃは、触媒タンパク質プラスミドおよび種々の単一ＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡプラスミドまたはＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡプラスミドの混合物によるマウスＮ２Ａ細胞株のトランスフェクションの１週間後の相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。 図１Ｄは、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子座の亜硫酸水素塩ＰＣＲ解析の結果を示す概略図である。それぞれの行は１つの単一クローンを表し、それぞれの列は１つの特定のゲノム位置を示す。黒点はメチル化が成功した部位を表す。
【図2】図２Ａは、ＥＰＩＣＡＳ ｍＲＮＡプラスミドデザインを示す概略図である。ＥＰＩＣＡＳ ＯＲＦは、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢカセットを含む。プラスミドはＸｂａＩおよびＢｐｉＩ制限部位で消化され、線状化されたプラスミドを形成することができる。 図２Ｂは、ＥＰＩＣＡＳ ｍＲＮＡプラスミドから発現され、精製されたｍＲＮＡの電気泳動図である。 図２Ｃは、ＥＰＩＣＡＳ ｍＲＮＡが初代マウス肝細胞内の内因性ＶＥＧＦＡ遺伝子を成功裡にノックダウンできることを示す概略図である。左パネル：初代マウス肝細胞の顕微鏡写真、中央パネル：ＧＦＰ－Ｐ２Ａ－Ｃａｓｏｆｆ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ処理ありとなしでのトランスフェクションの７２時間後のＧＦＰの発現を示すフローサイトメトリーグラフ、右パネル：対照とＧＦＰ－Ｐ２Ａ－Ｃａｓｏｆｆ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡで処理した群の間のＧＦＰ陽性細胞における相対的ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ発現。
【図3】図３Ａは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）デザインの概略図である。遺伝子外ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエレメントおよびｓｇＲＮＡエレメントは、ＬＮＰによってカプセル化することができる。 図３Ｂは、ＥＰＩＣＡＳを含むＬＮＰを示す透過電子顕微鏡画像である。 図３Ｃは、ＬＮＰの粒径分布を示すグラフである。 図３Ｄは、Ａｉ９マウスの眼への脂質ナノ粒子の硝子体内注射によって送達されたルシフェラーゼｍＲＮＡのインビボ蛍光イメージングを示す一連の写真である。 図３Ｅは、ＥＰＩＣＡＳ ｍＲＮＡおよびマウスＶＥＧＦを標的とするｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのデリバリーのためのインビボ実験デザインの概略図である。眼の後方領域への注射によってＬＮＰをＡｉ９マウスに投与し、注射の５日後に網膜および脈絡膜におけるＶＥＧＦＡ遺伝子の発現を解析した。
【図4】図４Ａは、２９３Ｔレポーター細胞株におけるウサギＶＥＧＦＡのｓｇＲＮＡタイリングスクリーンデザインの概略図である。タイリングスクリーンのｓｇＲＮＡは、ウサギＶＥＧＦＡ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の５００ｂｐ上流および下流を標的とする。 図４Ｂは、ＥＰＩＣＡＳプラスミドおよびウサギＶＥＧＦＡを標的とするｓｇＲＮＡによるトランスフェクションの７２時間後のレポーター細胞の蛍光強度を示す一連のグラフである。 図４Ｃは、ＥＰＩＣＡＳプラスミドとともに良好なノックダウン効果を有していた、ウサギ細胞内の内因性遺伝子ＶＥＧＦＡを標的とする６種のｓｇＲＮＡのトランスフェクションの後の、ウサギＲＫ－１３細胞におけるＶＥＧＦＡのｍＲＮＡ発現を示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0075】
本開示は、インビボ遺伝子治療における使用のための細胞内の遺伝子産物（例えばＶＥＧＦ）の標的化された低減または排除のための遺伝子操作された融合分子［例えばＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合分子］を提供することによって、現行の技術に伴う課題を克服する。本開示の遺伝子操作された融合分子は、例えば肝臓の疾患、高コレステロールに伴う疾患、およびコレステロールの異常調節［例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール］に伴う疾患を含む遺伝子疾患の処置のために有用である。したがって、インビボデリバリーにおける使用のための遺伝子操作された融合分子およびその医薬製剤（例えば脂質ナノ粒子製剤）を作製する方法も提供される。
【0076】
Ｉ．定義
本明細書で用いる場合、用語「コーディング配列」または「コーディング核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コーディング配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞内における発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に連結された開始および終止のシグナルをさらに含み得る。コーディング配列はコドン最適化され得る。
本明細書で用いる場合、用語「コーディング配列」または「コーディング核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コーディング配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞内における発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に連結された開始および終止のシグナルをさらに含み得る。コーディング配列はコドン最適化され得る。
【0077】
核酸に関連して本明細書で用いられる用語「相補体」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ（例えばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成を意味し得る。「相補性」は、２つの核酸配列の間で共有された特性、例えばこれらが互いに逆平行に整列した場合を指し、それぞれの位置におけるヌクレオチド塩基は相補的になる。
【0078】
用語「修正する」、「ゲノム編集する」、および「復元する」は、変異型タンパク質または切断されたタンパク質をコードするか、またはタンパク質を全くコードしない変異型（mutant）遺伝子を変更して、完全長の機能性タンパク質または部分的に完全長の機能性タンパク質の発現が得られる変更を指す。変異型遺伝子の修正または復元は、変異を有する遺伝子の領域を置き換えること、または変異型遺伝子全体を相同組換え修復（ＨＤＲ）等の修復機構によって変異を有しない遺伝子のコピーで置き換えることを含み得る。変異型遺伝子の修正または復元には、遺伝子に二本鎖切断を生成し、次いで非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて修復することによって、早過ぎる終止コドン、異常なスプライスアクセプター部位、または異常なスプライスドナー部位を惹起するフレームシフト変異を修復することも含まれる。ＮＨＥＪは、修復の間に少なくとも１つの塩基対を付加または削除して、適正なリーディングフレームを復元し、早すぎる終止コドンを排除することができる。変異型遺伝子の修正または復元には、異常なスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー配列を破壊することも含まれる。変異型遺伝子の修正または復元には、２つのヌクレアーゼ標的部位の間のＤＮＡを除去し、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することによって適正なリーディングフレームを復元するために、同じＤＮＡ鎖上の２つのヌクレアーゼの同時の作用によって非必須遺伝子セグメントを削除することも含まれる。
【0079】
本明細書で用いる場合、用語「ドナーＤＮＡ」、「ドナー鋳型」、および「修復鋳型」は、目的の遺伝子の少なくとも一部を含む二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは完全機能性タンパク質または部分的機能性タンパク質をコードし得る。
【0080】
本明細書で用いる場合、用語「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は相互交換可能に用いられ、１つまたは複数のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡにおけるコドンのリーディングフレームにシフトを惹起する遺伝子変異の型を指す。リーディングフレームにおけるシフトは、タンパク質翻訳の際にミスセンス変異または早すぎる終止コドン等のアミノ酸配列の変化をもたらすことがある。
【0081】
本明細書で用いる場合、用語「機能性」および「完全機能性」は、生物学的活性を有するタンパク質を記述する。「機能性遺伝子」は、機能性タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
【0082】
本明細書で用いる場合、用語「融合タンパク質」は、もともと個別のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子の共有または非共有の結合によって直接または間接的に創成されたキメラタンパク質を指す。一部の実施形態では、融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
【0083】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コーディング配列は、細胞内での発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に連結された開始および終止のシグナルを含む。
【0084】
本明細書で相互交換可能に用いられる用語「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、ＤＮＡの相同の片が主として細胞サイクルのＧ２およびＳ期において核の中に存在する場合に、二本鎖ＤＮＡの損傷を修復する細胞内の機構を指す。ＨＤＲはドナーＤＮＡ鋳型を用いて修復をガイドし、遺伝子全体の標的化された付加を含むゲノムへの特定の配列変更を創成するために用いられる。ドナー鋳型がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムのような部位特異的なヌクレアーゼとともに提供されれば、細胞機構は相同組換えによって切断を修復することになり、これはＤＮＡ切断の存在下で数桁増強される。相同ＤＮＡ片が存在しない場合には、その代わりに非相同末端結合が起こり得る。
【0085】
本明細書で用いる用語「ゲノム編集」は遺伝子を変更することを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を修正または復元することを含み得る。ゲノム編集は変異型遺伝子または正常な遺伝子等の遺伝子をノックアウトすることを含み得る。ゲノム編集は目的の遺伝子を変化させることによって疾患を処置するために用いられる。
【0086】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して本明細書で用いる用語「同一」または「同一性」は、その配列が指定された領域にわたって同じである残基の指定されたパーセンテージを有することを意味する。そのパーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域にわたってその２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を指定された領域における位置の全数で除し、その結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算できる。２つの配列が異なる長さである場合、または整列によって１つまたは複数の付着末端が生じて特定された比較領域が単一配列のみを含む場合には、単一配列の残基は計算の分母には含まれるが分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は等価とみなしてよい。同一性は手計算で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを用いて実施してよい。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、それだけに限らないが、全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，パート１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３ページ（１９８８）に記載された方法が含まれる。
【0087】
本明細書で用いる場合、本明細書で相互交換可能に用いられる用語「変異型遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異を受けた遺伝子を指す。変異型遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響する遺伝材料の喪失、獲得、または交換等の変更を受けている。本明細書で用いる「破壊された遺伝子」は、早過ぎる終止コドンを惹起する変異を有する変異型遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、破壊されていない完全長の遺伝子産物に対して切り取られている。
【0088】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子外改変のモジュレーター」は、遺伝子外改変を介して（例えばヒストンのアセチル化もしくはメチル化、または標的遺伝子の制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、または転写開始部位におけるＤＮＡのメチル化を介して）遺伝子発現を標的とする薬剤を指す。クロマチンのリモデリングおよびＤＮＡのメチル化は、遺伝子転写を制御する２つの主要な機構である。特定の遺伝子外マーク（例えばＤＮＡのメチル化）は、構造的または生化学的に遺伝子の転写または遺伝子のサイレンシング／抑制を指令する。例えば、転写活性を制御する領域のＤＮＡのメチル化は、基礎となるＤＮＡ配列を変更することなく遺伝子発現を変化させる。遺伝子外改変（例えばＤＮＡのメチル化）を用いる転写制御は、他の遺伝子産物の発現に影響することなく、遺伝子発現の標的化された調節を可能にする。
【0089】
本明細書で用いる用語「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同鋳型を必要とせずに切断末端を直接ライゲートすることによってＤＮＡの二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端の鋳型に依存しない再ライゲーションは、ＤＮＡの切断点にランダムなミクロ挿入およびミクロ欠失（インデル）を導入する確率論的で誤差を生じやすい修復プロセスである。この方法は、標的とされた遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、欠失、または変化させるために用いられる。ＮＨＥＪは、典型的には修復をガイドするマイクロホモロジーと称される短い相同のＤＮＡ配列を用いる。これらのマイクロホモロジーは、多くの場合、二本鎖切断の末端の一本鎖オーバーハングに存在する。オーバーハングが完全に適合する場合には、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復するが、ヌクレオチドの喪失をもたらす不完全な修復も起こり得る。しかしこれはオーバーハングが適合しない場合により一層一般的である。
【0090】
本明細書で用いる用語「正常な遺伝子」は、遺伝材料の喪失、獲得、または交換等の変更を受けていない遺伝子を指す。正常な遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。
【0091】
本明細書で用いる用語「ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ」は、ｃａｓ９等のヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後で開始されるＮＨＥＪを指す。
【0092】
本明細書で用いる場合、本明細書で用いる用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有的に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は相補鎖の配列も画定する。即ち、核酸は描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアント（variant）を、所与の核酸として同じ目的のために用いてよい。即ち、核酸は実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、厳格なハイブリダイゼーション条件の下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。即ち、核酸は、厳格なハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズするプローブも包含する。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、二本鎖および一本鎖の配列の両方の部分を含んでもよい。核酸はゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方であるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む組合せを含んでよい。核酸は化学合成法または組換え法によって得てよい。
【0093】
本明細書で用いる場合、用語「作動可能に連結された」は、２つ以上の目的の生物学的配列が、意図した様式で機能することを可能にする関係にあるように、スペーサーまたはリンカーを伴い、または伴わずに、並置されることを指す。ポリペプチドに関して用いられる場合、これは、連結された産生物が意図した生物学的機能を有することを可能にするようにポリペプチド配列が連結されていることを意味することを意図している。ポリヌクレオチドに関して用いられる場合、１つの例として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが制御配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列、その他）と作動可能に連結されている場合、これはポリヌクレオチド配列が、そのポリヌクレオチドからのポリペプチドの制御された発現を可能にするように連結されていることを意味することを意図している。一部の実施形態では、遺伝子の発現は、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にある。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）にあり得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、それからプロモーターが誘導される遺伝子における、そのプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴わずに適応され得る。
【0094】
本明細書で用いる用語「部分的機能性」は、変異型遺伝子によってコードされ、機能性タンパク質より低いが、非機能性タンパク質よりは高い生物学的活性を有するタンパク質を記述している。一実施形態では、部分的機能性タンパク質は、対応する機能性タンパク質の生物学的活性の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％未満の生物学的活性を示す。
【0095】
本明細書で相互交換可能に用いられる用語「早過ぎる終止コドン」または「アウトオブフレーム終止コドン」は、ＤＮＡの配列におけるナンセンス変異を指し、これは野生型遺伝子では通常見られない位置に終止コドンをもたらす。早過ぎる終止コドンは、タンパク質の完全長のバージョンと比較して、切り取られたまたは短いタンパク質を惹起し得る。
【0096】
本明細書で用いる用語「プロモーター」は、細胞内で核酸の発現を付与、活性化、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強し、ならびに／または核酸の空間的な発現および／もしくは時間的な発現を変化させる、１つまたは複数の特定の転写制御配列を含んでよい。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含むことがあり、これらは転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することもある。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源から誘導され得る。プロモーターは、構成的に、または発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘起剤等の外部刺激に応じて差別的に、遺伝子成分の発現を制御し得る。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。
【0097】
本明細書で用いる用語「標的遺伝子」は、既知または想定上の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は遺伝的な疾患または障害に関与する変異した遺伝子であり得る。
【0098】
本明細書で用いる用語「標的領域」は、部位特異的ヌクレアーゼが結合するように設計された標的遺伝子の領域を指す。
【0099】
本明細書で用いる場合、用語「トランスジーン」は、１つの生命体から単離され、別の生命体に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝材料を指す。あるいは、用語「トランスジーン」は、化学的に合成されて生命体に導入される遺伝子または遺伝材料も指す。このＤＮＡの非天然セグメントは、トランスジェニックな生命体においてＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持し得るか、またはトランスジェニックな生命体の遺伝コードの正常な機能を変化させ得る。トランスジーンの導入は、生命体の表現型を変更させる可能性を有している。
【0100】
本明細書で用いる場合、用語「バリアント」は、核酸に関連して用いられる場合には、（ｉ）言及したヌクレオチド配列の一部または断片、（ｉｉ）言及したヌクレオチド配列またはその一部の相補体、（ｉｉｉ）言及した核酸またはその相補体と実質的に同一の核酸、または（ｉｖ）言及した核酸、その相補体、またはそれと実質的に同一の配列と厳格な条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、しかし少なくとも１つの生物学的活性を保持している。
【0101】
バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持したアミノ酸配列を有する言及したタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、即ち、アミノ酸を同様の特性（例えば親水性、荷電領域の程度および分布）を有する異なるアミノ酸で置き換えることは、当技術において典型的には軽微な変更を含むと認識される。これらの軽微な変更は、当技術で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって部分的に同定され得る。全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５～１３２ぺージ（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様のハイドロパシー指数を有するアミノ酸は置換され、それでもタンパク質の機能を保持していることが当技術で知られている。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸は置換される。生物学的機能を保持したタンパク質をもたらす置換を明らかにするためにアミノ酸の親水性も用いられる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を考慮することによって、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能になる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸について実施され得る。アミノ酸の疎水性指数と親水性値はいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、およびその他の特性によって明らかになるように、アミノ酸の相対的な類似性、特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【0102】
本明細書で用いる場合、本明細書で用いる用語「ベクター」は、複製の起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってよい。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってよい。ベクターはＤＮＡプラスミド等の自己複製型の染色体外ベクターであってよい。
【0103】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子導入」、「遺伝子デリバリー」、および「遺伝子形質導入」は、特定のヌクレオチド配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、融合タンパク質、ポリペプチド等を標的細胞に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。
【0104】
本明細書で用いる場合、用語「アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」、「ＡＡＶ遺伝子治療ベクター」、および「遺伝子治療ベクター」は、機能性または部分的機能性ＩＴＲ配列およびトランスジーンを有するベクターを指す。本明細書で用いる場合、用語「ＩＴＲ」は、反転ターミナルリピート（ＩＴＲ）を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、およびＡＡＶ－６を限定なく含む、アデノ随伴ウイルス血清型から誘導され得る。しかしＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列でなくてもよく、配列が機能的レスキュー、複製、およびパッケージングを提供する機能を保持している限り、変化してもよい（例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって）。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つまたは複数、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が全体としてまたは部分的に欠失していてもよいが、隣接する機能性ＩＴＲ配列を保持している。機能性ＩＴＲ配列は、例えばＡＡＶのビリオンまたは粒子をレスキューし、複製し、パッケージングするように機能する。即ち、「ＡＡＶベクター」は、本明細書でトランスジーンを対象の細胞に挿入するために必要な配列を少なくとも含むと定義される。ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要な配列（例えば機能性ＩＴＲ）が含まれてもよい。
【0105】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子治療」は、ポリペプチドまたは核酸配列が患者の細胞に移入され、それにより、特定の遺伝子の活性および／または発現が調節される、患者を処置する方法を指す。ある特定の実施形態では、遺伝子の発現が抑制される。ある特定の実施形態では、遺伝子の発現が増強される。ある特定の実施形態では、遺伝子の発現の時間的または空間的なパターンが調節される。
【0106】
「トランスジーン」は、トランスジェニックな配列または天然もしくは野生型のＤＮＡ配列を含み得る。トランスジーンは、霊長類対象のゲノムの一部になり得る。トランスジェニックな配列は、部分的にまたは全体として異種であってよい。即ち、トランスジェニックな配列またはその一部は、それが導入される細胞とは異なる種に由来してよい。
【0107】
本明細書で用いる場合、用語「安定的に維持された」は、細胞の多数の世代を通してそれらのトランスジェニックな要素（即ち所望の要素）の少なくとも１つを維持したトランスジェニックな対象（例えばヒトまたは非ヒト霊長類）の特徴を指す。例えば、この用語は、もともとトランスフェクトされた細胞の多くの細胞分裂サイクルを包含することを意図している。用語「安定なトランスフェクション」または「安定的にトランスフェクトされた」は、細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入および一体化を指す。用語「安定なトランスフェクタント」は、ゲノムＤＮＡに安定的に一体化された外来ＤＮＡを有する細胞を指す。
【0108】
本明細書で用いる場合、用語「トランスジーンコーディング」、「核酸分子コーディング」、「ＤＮＡ配列コーディング」、および「ＤＮＡコーディング」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、例えばポリペプチド（タンパク質）の鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定し得る。即ち、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードし得る。
【0109】
本明細書で用いる場合、用語「野生型」（ｗｔ）は、天然に存在する源から単離された際にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有している遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団中で最も頻繁に観察され、したがって遺伝子の「正常な」または「野生型の」形態が任意に設計される遺伝子である。対照的に、用語「改変された」または「変異体」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および／または機能的特性の改変（即ち、変化した特徴）を呈する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴の獲得によって特定される、天然に存在する変異体が単離され得ることが注目される。
【0110】
本明細書で用いる場合、用語「トランスフェクション」は、細胞による外来の核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の取り込みを指す。外因性の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が細胞膜の内部に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。当技術においていくつかのトランスフェクション手法が一般に知られている［例えば全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６ぺージ（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，（１９８６）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ １３：１９７ぺージ（１９８１）を参照されたい］。そのような手法は、遺伝子移入ベクターおよびその他の核酸分子等の１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を好適な受容体細胞に導入するために用いてよい。
【0111】
本明細書で用いる場合、用語「安定なトランスフェクション」および「安定的にトランスフェクトされた」は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入および一体化を指す。用語「安定なトランスフェクタント」は、ゲノムＤＮＡに安定的に一体化された外来ＤＮＡを有する細胞を指す。
【0112】
本明細書で用いる場合、用語「過渡的なトランスフェクション」または「過渡的にトランスフェクトされた」は、外来ＤＮＡがトランスフェクトされた細胞のゲノムの中に一体化されずにエピソームとして維持される、外来ＤＮＡの細胞への導入を指す。この間に、外来ＤＮＡは、染色体中の内因性遺伝子の発現を支配する規制的制御を受ける。用語「過渡的トランスフェクタント」は、外来ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを一体化することができなかった細胞を指す。本明細書で用いる場合、用語「形質導入」は、複製欠損のウイルスベクターを介する、例えば組換えＡＡＶビリオンを介する、インビボまたはインビトロ（in vitro）の受容体細胞へのＤＮＡ分子のデリバリーを意味する。
【0113】
本明細書で用いる場合、用語「受容体細胞」は、選択された目的のヌクレオチド配列を担持した核酸コンストラクトまたはベクターによってトランスフェクトもしくは形質導入された、またはトランスフェクトもしくは形質導入することができる細胞を指す。この用語は、選択したヌクレオチド配列が存在する限り、形態または遺伝的構成において元の親と同一であるか否かに関わらず、親細胞の子孫を含む。受容体細胞は、遺伝子治療粒子および／または遺伝子治療ベクターが投与された対象の細胞であってよい。
【0114】
本明細書で用いる場合、用語「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学手法によってともに結合されたＤＮＡのセグメントからなるＤＮＡ分子を指す。
【0115】
本明細書で用いる場合、用語「制御エレメント」は、核酸配列の発現を制御することができる遺伝エレメントを指す。例えば、プロモーターは、作動可能に連結されたコーディング領域の転写の開始を容易にする制御エレメントである。その他の制御エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、その他である。
【0116】
用語ＤＮＡ「制御配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流制御ドメイン、複製の起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、その他等の制御エレメントを集合的に指し、これらは受容体細胞におけるコーディング配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。これらの制御配列の全てが存在する必要はない。
【0117】
真核生物中の転写制御シグナルは一般に、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなっている［全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７ぺージ（１９８７）］。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞ならびにウイルスの遺伝子を含む多種の真核生物の源から単離されている（類似の対照配列、即ちプロモーターも、原核生物で見出されている）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、受容体細胞の型による。一部の真核生物のプロモーターおよびエンハンサーは広い宿主範囲を有しているが、他は限定された細胞型のサブセットにおいて機能的である［例えば全体が参照により本明細書に組み込まれるＶｏｓｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７ぺージ（１９８６）；および総説としてＭａｎｉａｔｉｓら（上掲）を参照］。例えば、ＳＶ４０アーリー遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳動物種由来の多種の細胞型において極めて活性であり、広範囲の哺乳動物細胞内でタンパク質を発現させるために用いられてきた［全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１ぺージ（１９８５）］。ヒト伸長因子１－アルファ遺伝子 ［Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５７９１ぺージ（１９８９）；Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ ９１：２１７ぺージ（１９９０）；ならびにＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１８：５３２２ぺージ（１９９０）］、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスの長いターミナルリピート［Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ７９：６７７７ぺージ（１９８２）］、ならびにヒトサイトメガロウイルス［Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１ぺージ（１９８５）］から誘導されるプロモーターおよびエンハンサーエレメントも多様な哺乳動物細胞型におけるタンパク質の発現のために有用であり、全体が参照により本明細書に組み込まれる。プロモーターおよびエンハンサーは、単独または一緒に、天然に見出すことができる。例えば、レトロウイルスの長いターミナルリピートはプロモーターとエンハンサーエレメントの両方を含む。一般にプロモーターおよびエンハンサーは転写または翻訳される遺伝子に依存しない。即ち、用いられるエンハンサーおよびプロモーターは、これらが作動可能に連結される遺伝子に関して「内因性」、「外因性」、または「異種」であってよい。「内因性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されたエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」のエンハンサーまたはプロモーターは、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指令されるように遺伝子操作（即ち分子生物学的手法）によって遺伝子に並置されたエンハンサー／プロモーターである。
【0118】
本明細書で用いられる場合、用語「組織特異的」は、核酸配列の発現が特定の細胞型または組織において実質的に大きい、プロモーター、エンハンサー等の制御エレメントまたは制御配列を指す。
【0119】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、高いレベルの組換えトランスクリプトの発現をもたらすことが多い。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡトランスクリプトからのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナーおよびアクセプター部位からなる［全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９），１６．７～１６．８ぺージ］。一般に用いられるスプライスドナーおよびアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ ＲＮＡ由来のスプライスジャンクションである。
【0120】
転写終止シグナルは、一般にポリアデニル化シグナルの下流に見出され、数百ヌクレオチドの長さである。本明細書で用いられる用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、発生期のＲＮＡトランスクリプトの終止とポリアデニル化の両方を指令するＤＮＡ配列を意味する。ポリＡテイルを欠くトランスクリプトは不安定で急速に分解するので、組換えトランスクリプトの効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターにおいて利用されるポリＡシグナルは、「異種」または「内因性」であってよい。内因性のポリＡシグナルは、ゲノム中の所与の遺伝子のコーディング領域の３’末端に天然に見出されるシグナルである。異種ポリＡシグナルは、１つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’末端に作動可能に連結されたシグナルである。一般に用いられる異種ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限断片上に含まれ、終止とポリアデニル化の両方を指令する（全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲、１６．６～１６．７ぺージ）。
【0121】
本明細書で用いられる場合、用語「対象」および「患者」は本明細書で相互交換可能に用いられ、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類、その他を含む。
【0122】
本明細書で定義される場合、「治療有効量」または「治療有効用量」は、所望の様式でタンパク質の活性を調節するために十分な量の所望のタンパク質を産生し、それにより、臨床的介入のための緩和的なツールを提供することができる、融合タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質ナノ粒子、リポソーム、ＡＡＶ粒子、またはビリオンの量または用量である。一部の実施形態では、本明細書に記載したトランスフェクトされた融合タンパク質、ポリペプチド、核酸、ＡＡＶ粒子、またはビリオンの治療有効量または用量は、融合タンパク質／遺伝子治療コンストラクトによって標的とされる遺伝子の抑制を付与するために十分である。
【0123】
本明細書で用いられる場合、例えば障害を「処置する」という用語は、障害を有しているか、障害を有するリスクにあるか、および／または障害の症状を経験している対象（例えばヒト）が、一実施形態では、例えば本明細書に記載した融合分子もしくは融合分子をコードする核酸、および／またはｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸が投与された場合に、融合分子もしくは融合分子をコードする核酸、および／またはｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸が決して投与されなかった場合よりも重篤でない症状を有するか、および／または早く回復することを意味する。
【0124】
ＩＩ．ＤＮＡ結合性タンパク質
本開示によって本明細書で定義される方法および組成物におけるある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えばＤＮＡ標的剤）は、（ＤＮＡ）ヌクレアーゼ、例えば配列特異的な様式でＤＮＡを標的とすることができるか、または配列特異的な様式でＤＮＡを標的とするように指令または指示することができるヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから誘導されるＤＮＡヌクレアーゼである。
本開示によって本明細書で定義される方法および組成物におけるある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えばＤＮＡ標的剤）は、（ＤＮＡ）ヌクレアーゼ、例えば配列特異的な様式でＤＮＡを標的とすることができるか、または配列特異的な様式でＤＮＡを標的とするように指令または指示することができるヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから誘導されるＤＮＡヌクレアーゼである。
【0125】
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム
ある特定の実施形態では、核酸結合性タンパク質は、（改変された）転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥＮシステムを用いるゲノム編集の例示的な方法は、例えばそれぞれ全体が参照により組み込まれるＣｅｒｍａｋ Ｔ．Ｄｏｙｌｅ ＥＬ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ．Ｗａｎｇ Ｌ．Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１；３９：ｅ８２ページ；Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｏｎｇ Ｌ．Ｌｏｄａｔｏ Ｓ．Ｋｏｓｕｒｉ Ｓ．Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ．Ａｒｌｏｔｔａ Ｐ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：１４９～１５３ぺージ、ならびに米国特許第８，４５０，４７１号、第８，４４０，４３１号、および第８，４４０，４３２号で見出すことができる。
ある特定の実施形態では、核酸結合性タンパク質は、（改変された）転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥＮシステムを用いるゲノム編集の例示的な方法は、例えばそれぞれ全体が参照により組み込まれるＣｅｒｍａｋ Ｔ．Ｄｏｙｌｅ ＥＬ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ．Ｗａｎｇ Ｌ．Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１；３９：ｅ８２ページ；Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｏｎｇ Ｌ．Ｌｏｄａｔｏ Ｓ．Ｋｏｓｕｒｉ Ｓ．Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ．Ａｒｌｏｔｔａ Ｐ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：１４９～１５３ぺージ、ならびに米国特許第８，４５０，４７１号、第８，４４０，４３１号、および第８，４４０，４３２号で見出すことができる。
【0126】
さらなるガイダンスとして限定なく、天然に存在するＴＡＬＥまたは「野生型ＴＡＬＥ」は、数多くのプロテオバクテリアの種によって分泌される核酸結合性タンパク質である。ＴＡＬＥポリペプチドは、主として３３、３４、または３５個のアミノ酸の長さで主としてアミノ酸の１２位および１３位で互いに異なる高度に保存されたモノマーポリペプチドのタンデムリピートからなる核酸結合ドメインを含む。一部の実施形態では、核酸はＤＮＡである。
【0127】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチドモノマー」または「ＴＡＬＥモノマー」は、ＴＡＬＥ核酸結合ドメインの中の高度に保存された反復ポリペプチド配列を指すために用いられ、用語「リピート可変二残基」または「ＲＶＤ」は、ポリペプチドモノマーの１２位および１３位の高度に可変なアミノ酸を指すために用いられることになる。
【0128】
本開示を通して提供されるように、ＲＶＤのアミノ酸残基は、アミノ酸のＩＵＰＡＣ一文字コードを用いて表される。ＤＮＡ結合ドメインの中に含まれるＴＡＬＥモノマーの一般的な表示は、Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４または３５であり、ここで数字（subscript）はアミノ酸の位置を示し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。Ｘ１２Ｘ１３はＲＶＤを示す。一部のポリペプチドモノマーでは、１３位の可変アミノ酸は失われているか存在せず、そのようなポリペプチドモノマーではＲＶＤは単一のアミノ酸からなる。そのような場合には、ＲＶＤはその代わりにＸ＊として表してよく、ここでＸはＸ１２を表し、（＊）はＸ１３が存在しないことを示す。ＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥモノマーのいくつかの繰り返しを含み、これは［Ｘ１－ｌｌ－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４または３５］ｚとして表される。ここで有利な実施形態では、ｚは少なくとも５～４０である。さらに有利な実施形態では、ｚは少なくとも１０～２６である。ＴＡＬＥモノマーは、そのＲＶＤにおけるアミノ酸の同一性によって決定されるヌクレオチド結合親和性を有している。例えば、ＮＩのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーはアデニン（Ａ）に優先的に結合し、ＮＧのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーはチミン（Ｔ）に優先的に結合し、ＨＤのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーはシトシン（Ｃ）に優先的に結合し、ＮＮのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーはアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の両方に優先的に結合する。本開示のさらに別の実施形態では、ＩＧのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーはＴに優先的に結合する。即ち、ＴＡＬＥの核酸結合ドメインにおけるポリペプチドモノマーリピートの数および順序が、その核酸標的特異性を決定する。本開示のさらなる実施形態では、ＮＳのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーは４つの塩基対全てを認識し、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣに結合し得る。ＴＡＬＥの構造および機能は、例えばそれぞれ全体が参照により組み込まれるＭｏｓｃｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１ぺージ（２００９）；Ｂｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９～１５１２ページ（２００９）；およびＺｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９～１５３ぺージ（２０１１）にさらに記載されている。ある特定の実施形態では、標的化はポリ核酸結合ＴＡＬＥＮ断片によって達成される。ある特定の実施形態では、標的ドメインは、触媒的に不活性なＴＡＬＥＮまたはその核酸結合断片を含むかまたはからなる。
【0129】
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム
ある特定の実施形態では、標的ドメインは、（改変された）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含むかまたはからなる。ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができるＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工の制限酵素を用いる。ＺＦＮを用いるゲノム編集の例示的な方法は、例えばそれぞれ全体が参照により組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，７４６，８３８号、第６，７９４，１３６号、第６，８２４，９７８号、第６，８６６，９９７号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、第７，０３０，２１５号、第７，２２０，７１９号、第７，２４１，５７３号、第７，２４１，５７４号、第７，５８５，８４９号、第７，５９５，３７６号、第６，９０３，１８５号、および第６，４７９，６２６号で見出すことができる。さらなるガイダンスとして限定なく、人工のジンクフィンガー（ＺＦ）技術は、ゲノム中の新規なＤＮＡ結合部位を標的とするＺＦモジュールのアレイを含む。ＺＦアレイ中のそれぞれのフィンガーモジュールは、３つのＤＮＡ塩基を標的とする。個別のジンクフィンガードメインのカスタム化されたアレイは、ＺＦタンパク質（ＺＦＰ）に組み立てられる。ＺＦＰは機能性ドメインを含んでよい。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＺＦタンパク質をＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインに融合することによって開発された（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ら、１９９４，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，８８３～８８７ぺージ；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ら、１９９６，Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ＦｏｋＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３，１１５６～１１６０ぺージ）。切断特異性の増大は、それぞれが短いスペーサーによって分離された異なるヌクレオチド配列を標的とするＺＦＮヘテロダイマーの対を使用することによって、オフターゲット活性の低下とともに達成することができる。（Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．ら、２０１１，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，７４～７９ぺージ）。ＺＦＰは転写アクチベーターおよびリプレッサーとして設計することもでき、多種の生命体において多くの遺伝子を標的とするために用いられてきた。ある特定の実施形態では、標的ドメインは、核酸結合性ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその核酸結合性断片を含むかまたはからなる。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（の断片）に結合する核酸は触媒的に不活性である。
ある特定の実施形態では、標的ドメインは、（改変された）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含むかまたはからなる。ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができるＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工の制限酵素を用いる。ＺＦＮを用いるゲノム編集の例示的な方法は、例えばそれぞれ全体が参照により組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，７４６，８３８号、第６，７９４，１３６号、第６，８２４，９７８号、第６，８６６，９９７号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、第７，０３０，２１５号、第７，２２０，７１９号、第７，２４１，５７３号、第７，２４１，５７４号、第７，５８５，８４９号、第７，５９５，３７６号、第６，９０３，１８５号、および第６，４７９，６２６号で見出すことができる。さらなるガイダンスとして限定なく、人工のジンクフィンガー（ＺＦ）技術は、ゲノム中の新規なＤＮＡ結合部位を標的とするＺＦモジュールのアレイを含む。ＺＦアレイ中のそれぞれのフィンガーモジュールは、３つのＤＮＡ塩基を標的とする。個別のジンクフィンガードメインのカスタム化されたアレイは、ＺＦタンパク質（ＺＦＰ）に組み立てられる。ＺＦＰは機能性ドメインを含んでよい。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＺＦタンパク質をＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインに融合することによって開発された（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ら、１９９４，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，８８３～８８７ぺージ；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ら、１９９６，Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ＦｏｋＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３，１１５６～１１６０ぺージ）。切断特異性の増大は、それぞれが短いスペーサーによって分離された異なるヌクレオチド配列を標的とするＺＦＮヘテロダイマーの対を使用することによって、オフターゲット活性の低下とともに達成することができる。（Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．ら、２０１１，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，７４～７９ぺージ）。ＺＦＰは転写アクチベーターおよびリプレッサーとして設計することもでき、多種の生命体において多くの遺伝子を標的とするために用いられてきた。ある特定の実施形態では、標的ドメインは、核酸結合性ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその核酸結合性断片を含むかまたはからなる。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（の断片）に結合する核酸は触媒的に不活性である。
【0130】
メガヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、標的ドメインは（改変された）メガヌクレアーゼを含み、これは大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを用いる例示的な方法は、それぞれ全体が参照により組み込まれる米国特許第８，１６３，５１４号、第８，１３３，６９７号、第８，０２１，８６７号、第８，１１９，３６１号、第８，１１９，３８１号、第８，１２４，３６９号、および第８，１２９，１３４号で見出すことができる。ある特定の実施形態では、標的化はポリ核酸結合性メガヌクレアーゼ断片によって達成される。ある特定の実施形態では、標的化はポリ核酸結合性で触媒的に不活性のメガヌクレアーゼ（断片）によって達成される。したがって特定の実施形態では、標的ドメインは核酸結合性メガヌクレアーゼまたはその核酸結合性断片を含むかまたはからなる。
ある特定の実施形態では、標的ドメインは（改変された）メガヌクレアーゼを含み、これは大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを用いる例示的な方法は、それぞれ全体が参照により組み込まれる米国特許第８，１６３，５１４号、第８，１３３，６９７号、第８，０２１，８６７号、第８，１１９，３６１号、第８，１１９，３８１号、第８，１２４，３６９号、および第８，１２９，１３４号で見出すことができる。ある特定の実施形態では、標的化はポリ核酸結合性メガヌクレアーゼ断片によって達成される。ある特定の実施形態では、標的化はポリ核酸結合性で触媒的に不活性のメガヌクレアーゼ（断片）によって達成される。したがって特定の実施形態では、標的ドメインは核酸結合性メガヌクレアーゼまたはその核酸結合性断片を含むかまたはからなる。
【0131】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
一部の実施形態では、本開示のＤＮＡ結合性タンパク質およびシングルガイドＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから誘導される。本開示は、ゲノム編集および遺伝疾患の処置における使用のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいて操作されるシステムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく操作されたシステムは、遺伝疾患、肝疾患、およびＬＤＬ等のコレステロールの調節異常に関与する遺伝子を含む任意の遺伝子（例えばＶＥＧＦ）を標的とするように設計してよい。本開示は、所望の特異性および活性（例えばＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を低減または排除すること）を有する、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質および／またはガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、Ｃａｓ９タンパク質、変異したＣａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質［例えばＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合分子］および少なくとも１つのｓｇＲＮＡ（例えばＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡ）を含んでよい。Ｃａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９に内在的であるものとは異なる活性を有するドメイン（例えばＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＫＲＡＢ）を含んでよい。
一部の実施形態では、本開示のＤＮＡ結合性タンパク質およびシングルガイドＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから誘導される。本開示は、ゲノム編集および遺伝疾患の処置における使用のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいて操作されるシステムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく操作されたシステムは、遺伝疾患、肝疾患、およびＬＤＬ等のコレステロールの調節異常に関与する遺伝子を含む任意の遺伝子（例えばＶＥＧＦ）を標的とするように設計してよい。本開示は、所望の特異性および活性（例えばＶＥＧＦ遺伝子産物の発現を低減または排除すること）を有する、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質および／またはガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、Ｃａｓ９タンパク質、変異したＣａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質［例えばＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合分子］および少なくとも１つのｓｇＲＮＡ（例えばＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡ）を含んでよい。Ｃａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９に内在的であるものとは異なる活性を有するドメイン（例えばＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＫＲＡＢ）を含んでよい。
【0132】
一般に、Ｃａｓタンパク質（本明細書でＣＲＩＳＰＲタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素、Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲエフェクター、またはＣａｓエフェクタータンパク質と相互交換可能に用いられる）および／またはガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分である。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲシステムは集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指令に関与するトランスクリプトおよびその他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（転写活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えばｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連する「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも称される）、またはここで用いられる用語としての「ＲＮＡ」［例えばＣａｓをガイドするＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよび転写活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ、またはシングルガイドＲＮＡ（別名ｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ）］、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のその他の配列およびトランスクリプトを含む。
【0133】
一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連してプロトスペーサーとも称される）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。本開示の操作されたシステムにおいて、ダイレクトリピートは、天然に存在する配列または天然に存在しない配列を包含し得る。本開示のダイレクトリピートは、天然に存在する長さおよび配列に限定されない。さらに、本開示のダイレクトリピートは、アプタマーまたはアダプタータンパク質に結合する配列等のヌクレオチドの挿入を含んでよい（機能性ドメインとの会合のため）。ある特定の実施形態では、挿入等を含むダイレクトリピートの一端は短いＤＲのほぼ前半部分であり、末端は短いＤＲのほぼ後半部分である。
【0134】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関連して、「標的配列」または「標的ポリヌクレオチド」は、それに対してガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、標的配列は細胞の核または細胞質に位置している。
【0135】
一般に、ガイド配列（またはスペーサー配列）は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を指令するために十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性（例えば完全な相補性）を有する任意のポリヌクレオチド配列であってよい。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを用いて最適に整列させた場合、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上である。
【0136】
ある特定の実施形態では、切断効率の調節は、ミスマッチ、例えばスペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含めて、スペーサー配列と標的配列との間の１つまたは２つのミスマッチ等の、１つまたは複数のミスマッチの導入によって利用することができる。二重のミスマッチが例えばより中央部（即ち３’または５’ではなく）にあれば、切断効率がより大きく影響される。したがって、ミスマッチの位置をスペーサーに沿って選択することによって、切断効率を調節することができる。例として、標的の１００％未満の切断が望ましい場合（例えば細胞集団において）には、スペーサーと標的配列との間の１つまたは複数、例えば好ましくは２つのミスマッチをスペーサー配列に導入してよい。ミスマッチの位置がスペーサーに沿ってより中心にあれば、切断パーセンテージはより低くなる。
【0137】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたはその成分を、標的の遺伝子座または核酸配列に１つまたは複数の変異を導入するために用いてよい。変異は、細胞のそれぞれの標的配列におけるガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを介する１つまたは複数のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでよい。変異は、前記細胞のそれぞれの標的配列におけるガイドＲＮＡを介する１～７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでよい。
【0138】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列とハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合したガイド配列を含む）の形成は、標的配列の中またはその近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内）における切断をもたらすが、特にＲＮＡ標的の場合には、例えば二次構造に依存することがある。一部の場合には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列とハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合したガイド配列を含む）の形成は、標的配列の中またはその近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内）における１つまたは両方の鎖（適用可能であれば）の切断をもたらす。
【0139】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（Ｃａｓを標的遺伝子座にガイドすることができる）は、（１）真核細胞内で標的遺伝子座（ポリヌクレオチド標的遺伝子座、例えばＲＮＡ標的遺伝子座）とハイブリダイズすることができるガイド配列、（２）ダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含んでよく、これらは単一のＲＮＡ、即ちｓｇＲＮＡ（５’から３’への配向で配置された）またはｃｒＲＮＡの中に存在する。
【0140】
本開示の実施において全て有用な、方法、材料、デリバリー媒体、ベクター、粒子、ＡＡＶ、ならびにそれらの作製および使用を含み、量および処方を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、その成分、およびそれらの成分のデリバリーに関する一般的な情報に関しては、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，６４１号、第８，９９３，２３３号、第８，９４５，８３９号、第８，９３２，８１４号、第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、および第８，６９７，３５９号、米国特許公開２０１４－０３１０８３０、２０１４－０２８７９３８ Ａ１、２０１４－０２７３２３４ Ａ１、２０１４－０２７３２３２ Ａ１、２０１４－０２７３２３１ Ａ１、２０１４－０２５６０４６ Ａ１、２０１４－０２４８７０２ Ａ１、２０１４－０２４２７００ Ａ１、２０１４－０２４２６９９ Ａ１、２０１４－０２４２６６４ Ａ１、２０１４－０２３４９７２ Ａ１、２０１４－０２２７７８７ Ａ１、２０１４－０１８９８９６ Ａ１、２０１４－０１８６９５８、２０１４－０１８６９１９ Ａ１、２０１４－０１８６８４３ Ａ１、２０１４－０１７９７７０ Ａ１、および２０１４－０１７９００６ Ａ１、２０１４－０１７０７５３、欧州特許２７８４１６２ Ｂ１および２７７１４６８ Ｂ１、欧州特許出願２７７１４６８、２７６４１０３、および２７８４１６２、ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ ２０２１／１８３８０７Ａ１（ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２１９７３）、ＷＯ ２０１４／０９３６６１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、ＷＯ ２０１４／０９３６９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、ＷＯ ２０１４／０９３５９５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、ＷＯ ２０１４／０９３７１８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、ＷＯ ２０１４／０９３７０９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、ＷＯ ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）、ＷＯ ２０１４／０９３６３５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、ＷＯ ２０１４／０９３６５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、ＷＯ ２０１４／０９３７１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、ＷＯ ２０１４／０９３７０１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、ＷＯ ２０１４／０１８４２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）、ＷＯ ２０１４／２０４７２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０）、ＷＯ ２０１４／２０４７２４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００）、ＷＯ２０１４／２０４７２５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３）、ＷＯ ２０１４／２０４７２６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４）、ＷＯ ２０１４／２０４７２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６）、ＷＯ ２０１４／２０４７２８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８）、ＷＯ ２０１４／２０４７２９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９）を参照する。
【0141】
Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質（例えば操作されたＣａｓタンパク質）は、野生型カウンターパートのＣａｓタンパク質と実質的に同一の（例えば８０％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、９８％～１００%、９９％～１００％、９９．９％～１００％、または約１００％の）ヌクレアーゼ活性を有し得る。ある特定の場合には、操作されたＣａｓタンパク質は、野生型カウンターパートのＣａｓタンパク質より高い（例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％高い）ヌクレアーゼ活性を有している。
Ｃａｓタンパク質（例えば操作されたＣａｓタンパク質）は、野生型カウンターパートのＣａｓタンパク質と実質的に同一の（例えば８０％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、９８％～１００%、９９％～１００％、９９．９％～１００％、または約１００％の）ヌクレアーゼ活性を有し得る。ある特定の場合には、操作されたＣａｓタンパク質は、野生型カウンターパートのＣａｓタンパク質より高い（例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％高い）ヌクレアーゼ活性を有している。
【0142】
あるいはまたはさらに、Ｃａｓタンパク質（例えば操作されたＣａｓタンパク質）は、野生型のカウンターパートＣａｓタンパク質より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％高い特異性を有し得る。特定の例では、Ｃａｓタンパク質（例えば操作されたＣａｓタンパク質）は、野生型のカウンターパートＣａｓタンパク質より少なくとも３０％高い特異性を有し得る。本明細書で用いられる場合、Ｃａｓの用語「特異性」は、オンターゲットおよびオフターゲットの事象を含む全てのポリヌクレオチド切断事象の数またはパーセンテージに対するオンターゲットのポリヌクレオチド切断事象の数またはパーセンテージに対応し得る。Ｃａｓタンパク質の活性および特異性は、これもＣａｓタンパク質の活性および特異性を検出するための方法の例を記載し、全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の他の箇所に詳細を記載した、Ｈｓｕ ＰＤら、ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７～８３２ぺージ；およびＳｌａｙｍａｋｅｒ ＩＭら、Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊａｎ ｌ；３５１（６２６８）：８４～８８ぺージに記載されたものと一致している。
【0143】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えばそのＲｕｖＣドメイン）は、１塩基だけ上流に（ＰＡＭに関して）スライドして付着切断を産生する。これは満たされて単一塩基の複製（即ち＋１の挿入）をもたらし得る。＋１挿入位置の例は、Ｚｕｏ，Ｚ．およびＬｉｕ，Ｊ．（２０１６）．Ｃａｓ９－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｎｄｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６，３７５８４ぺージに記載されている。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質は、野生型カウンターパートのＣａｓタンパク質と異なる＋１挿入頻度を有する。例えば、グアニンがＰＡＭに関して－２位に存在する場合の＋１挿入頻度は、チミジン、シチジン、またはアデニンがＰＡＭに関して－２位に存在する場合の＋１挿入頻度より高い。一部の場合には、＋１挿入はヒト細胞内の宿主機構による。一部の例では、Ｃａｓタンパク質は付着切断を生成し得る。付着切断は１ｂｐまたは１ヌクレオチドの５’オーバーハングであってよい。付着切断は１ｂｐまたは１ヌクレオチドの３’オーバーハングであってよい。
【0144】
Ｃａｓをコードする核酸分子は、コドン最適化してよい。コドン最適化配列の例は、この例において真核生物、例えばヒト（即ちヒトにおける発現のために最適化されている）、または本明細書で論じる別の真核生物、動物または哺乳動物における発現のために最適化された配列である。例えばＷＯ ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）におけるＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これは好ましいが、他の例も可能であることが認識され、ヒト以外の宿主種のためのコドン最適化、または特定の臓器のためのコドン最適化が知られている。一部の実施形態では、Ｃａｓをコードする酵素コーディング配列は、真核生物細胞等の特定の細胞内での発現のためにコドン最適化される。真核生物細胞は、本明細書で論じるヒトまたは非ヒト真核生物、または動物もしくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳動物もしくは霊長類を含むがそれらに限らない哺乳動物等の特定の生命体の細胞であるか、それらから誘導されてよい。一部の実施形態では、人類の生殖細胞系の遺伝的同一性を改変するためのプロセスおよび／またはヒトもしくは動物への実質的な医学的恩恵を何ら伴わずに苦痛を与える可能性がある、動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセス、ならびにこれらのプロセスに起因する動物は、除外してよい。一般に、コドン最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に用いられるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞内での発現を増強するために核酸配列を改変するプロセスを指す。多様な種が特定のアミノ酸のある特定のコドンへの特定の偏りを呈する。コドンの偏り（生命体の間でのコドンの使用の相違）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、これは（in tum）とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優位性は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に用いられるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、所与の生命体においてコドン最適化に基づいて最適の遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用表は、例えばｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手できる「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手することができ、これらの表はいくつかの方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら、「Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏr ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２ぺージ（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞内での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも利用可能で、例えばＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ社；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も利用可能である。一部の実施形態では、Ｃａｓをコードする配列中の１つまたは複数のコドン（例えば１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に用いられるコドンに対応している。
【0145】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は核酸切断活性を有し得る。Ｃａｓタンパク質はＲＮＡ結合およびＤＮＡ切断の機能を有し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓは、標的配列の位置またはその近傍での、例えば標的配列の中および／もしくは標的配列の相補体の中での、または標的配列に付随する配列での、例えば標的配列の最初もしくは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれ以上の塩基対の中での、１つまたは複数の核酸鎖の切断を指令し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の中での、および／または標的配列の相補体の中もしくは標的配列に付随する配列での、および／または標的配列の最初もしくは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれ以上の塩基対の中での、１つもしくは２つの鎖の２つ以上の切断［例えば１つ（one）、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の切断］を指令し得る。一部の実施形態では、切断はブラントであってよく、即ち平滑末端を生成してよい。一部の実施形態では、切断はスタガードであってよく、即ち粘着末端を生成してよい。
【0146】
一部の実施形態では、ベクターは、対応する野生型酵素に対して変異することがある、核酸を標的とするＣａｓタンパク質をコードし、それにより、核酸を標的とする変異したＣａｓタンパク質は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの１つまたは２つの鎖を切断する能力を欠いている。例えば、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く変異したＣａｓを産生するＨＮＨドメインの変化または変異であり、例えば、変異した酵素のＤＮＡ切断活性は、非変異形の酵素の核酸切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれ未満を超えない。例としては、変異形の核酸切断活性が全くないか、または非変異形と比較して無視できる程度である場合がある。本明細書で用いられる場合、酵素に関する用語「誘導された」は、誘導された酵素が高度の配列相同性を有しているという意味で主として野生型酵素に基づいているが、当技術で既知の方法または本明細書に記載した方法で変異している（改変されている）ことを意味する。
【0147】
典型的には、内因性の核酸標的システムに関連して、核酸標的複合体（標的配列とハイブリダイズし、核酸を標的とする１つまたは複数のエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを含む）の形成は、標的配列の中またはその近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内）におけるＤＮＡ鎖の切断をもたらす。本明細書で用いられる場合、用語「目的の標的遺伝子座に付随する配列」は、標的配列の近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内、ここで標的配列は目的の標的遺伝子座の中に含まれる）の配列を指す。
【0148】
エフェクタータンパク質は酵素に基づくか酵素から誘導され、したがって一部の実施形態では用語「エフェクタータンパク質」は確かに「酵素」を含むことが認識されよう。しかし、エフェクタータンパク質は、一部の実施形態で必要とされるように、デッドＣａｓタンパク質機能を含めて、ＤＮＡまたはＲＮＡとの結合活性を有するが、切断または傷付けの活性を必ずしも有しなくてよいことも認識されよう。
【0149】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、誘導システムの成分を形成し得る。システムの誘導的性質は、エネルギーの形態を用いる遺伝子編集または遺伝子発現の空間時間的制御を可能にすることになる。エネルギーの形態には、それだけに限らないが、電磁放射、音響エネルギー、化学的エネルギー、および熱エネルギーが含まれる。誘導システムの例には、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ－ＯｎまたはＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ、その他）、または光誘導システム（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ、ＬＯＶドメイン、またはクリプトクローム）が含まれる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、配列特異的な様式で転写活性の変更を指令する光誘導転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であってよい。光（light）の成分は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、光応答性チトクロームヘテロダイマー［例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来］、および転写活性化／抑制ドメインを含んでよい。誘導可能なＤＮＡ結合性タンパク質およびそれらの使用のための方法のさらなる例は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国６１／７３６４６５および６１／７２１，２８３、ならびにＷＯ ２０１４０１８４２３ Ａ２で提供されている。
【0150】
一部の実施形態では、変異したＣａｓは、低減されたオフターゲット効果、例えばガイドＲＮＡと複合した際に標的遺伝子座への改変を達成するが、オフターゲットに向かう活性を低減または排除する使用のために改善されたＣＲＩＳＰＲ酵素、ならびに例えばガイドＲＮＡと複合した際にＣＲＩＳＰＲ酵素の活性を増大させるために改善されたＣＲＩＳＰＲ酵素をもたらす１つまたは複数の変異を有し得る。本明細書で以下に記載する変異した酵素は本明細書の他の箇所に記載した本開示による方法のいずれにおいても用い得ることを理解されたい。本明細書の他の箇所に記載した方法、製品、組成物、および使用のいずれも、以下にさらに詳細に述べるように、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素とともに等しく適用可能である。
【0151】
オンターゲットとオフターゲットの活性および／もしくは特異性を増大または低減させるために、またはオンターゲットとオフターゲットの結合の結合および／もしくは特異性を増大または低減させるために、種々の組合せにおいて採用することができる方法および変異は、他の効果を促進するために行なわれる変異または改変を補償または増強するために用いることができる。他の効果を促進するために行なわれるそのような変異または改変は、Ｃａｓへの変異もしくは改変、および／またはガイドＲＮＡに行なわれる変異もしくは改変を含む。本開示の方法および変異は、Ｃａｓヌクレアーゼの活性および／または化学的に改変されたガイドＲＮＡとの結合を調整するために用いられる。
【0152】
ある特定の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質の触媒活性は変化または改変される。触媒活性が対応する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば変異していないＣａｓタンパク質）の触媒活性と異なれば、変異したＣａｓは変化したまたは改変された触媒活性を有していると理解されたい。触媒活性は、当技術で既知の手段によって決定することができる。例として限定なく、触媒活性は、インデルのパーセンテージの決定（例えば所与の時間の後、または所与の用量での）によって、インビトロまたはインビボで決定することができる。ある特定の実施形態では、触媒活性は増大する。ある特定の実施形態では、触媒活性は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％増大する。ある特定の実施形態では、触媒活性は低下する。ある特定の実施形態では、触媒活性は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または（実質的に）１００％低下する。本明細書における１つまたは複数の変異は触媒活性を不活化することがあり、それにより、全ての触媒活性が実質的に低下し、活性が検出可能なレベル未満に低下し、または測定できない触媒活性まで低下することがある。
【0153】
操作されたＣａｓタンパク質の１つまたは複数の特徴は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と異なることがある。そのような特徴の例には、触媒活性、ｇＲＮＡ結合、Ｃａｓタンパク質の特異性（例えば定義された標的の編集の特異性）、Ｃａｓタンパク質の安定性、オフターゲット結合、ターゲット結合、プロテアーゼ活性、ニッカーゼ活性、ＰＦＳ認識が含まれる。一部の例では、操作されたＣａｓタンパク質は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数の変異を含んでよい。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質の触媒活性は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して増大している。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質の触媒活性は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して低下している。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質のｇＲＮＡ結合は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して増大している。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質のｇＲＮＡ結合は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して低下している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の特異性は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して増大している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の特異性は、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して低下している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の安定性は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して増大している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の安定性は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して低下している。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質は、触媒活性を不活化する１つまたは複数の変異をさらに含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のオフターゲット結合は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して増大している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のオフターゲット結合は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して低下している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の標的結合は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して増大している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の標的結合は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して低下している。一部の実施形態では、操作されたＣａｓタンパク質は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して高いプロテアーゼ活性またはポリヌクレオチド結合能力を有している。一部の実施形態では、ＰＦＳ認識は対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比較して変化している。
【0154】
Ｃａｓタンパク質の例
Ｃａｓタンパク質の例には、クラスＩ（例えばＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）、およびクラス２（例えばＩＩ型、Ｖ型、およびＶＩ型）のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９、Ｃａｓ１２（例えばＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ）、Ｃａｓ１３（例えばＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、それらのバリアント（例えば変異形、切断形）、それらのホモログ、およびそれらのオルソログが含まれる。用語「オルソログ」および「ホモログ」は当技術で周知である。さらなるガイダンスとして、本明細書で用いられるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は構造的に関連していてよいが、関連していなくてもよく、または部分的にのみ構造的に関連している。本明細書で用いられるタンパク質の「オルソログ」は、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は構造的に関連していてよいが、関連していなくてもよく、または部分的にのみ構造的に関連している。
Ｃａｓタンパク質の例には、クラスＩ（例えばＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）、およびクラス２（例えばＩＩ型、Ｖ型、およびＶＩ型）のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９、Ｃａｓ１２（例えばＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ）、Ｃａｓ１３（例えばＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、それらのバリアント（例えば変異形、切断形）、それらのホモログ、およびそれらのオルソログが含まれる。用語「オルソログ」および「ホモログ」は当技術で周知である。さらなるガイダンスとして、本明細書で用いられるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は構造的に関連していてよいが、関連していなくてもよく、または部分的にのみ構造的に関連している。本明細書で用いられるタンパク質の「オルソログ」は、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は構造的に関連していてよいが、関連していなくてもよく、または部分的にのみ構造的に関連している。
【0155】
クラス２ Ｃａｓタンパク質
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はクラス２のＣａｓタンパク質、即ちクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質である。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、サブタイプ、例えばＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型、ＩＩ－Ｃ型、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、またはＶ－Ｕ型であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、またはＣａｓ１２ｄである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、およびその他のＣａｓ９オルソログであってよい。Ｃａｓ１２は、ＦｎＣａｓ１２ａを含むＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、およびＣａｓ１２ｃ、またはそれらのホモロジーもしくはオルソログであってよい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの定義および例示的なメンバーには、Ｋｉｒａ Ｓ．ＭａｋａｒｏｖａおよびＥｕｇｅｎｅ Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ，Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ aｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７～７５ぺージ；およびＳｅｒｇｅｙ Ｓｈｍａｋｏｖら、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２０１７ Ｍａｒ；１５（３）：１６９～１８２ぺージに記載されたものが含まれる。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はクラス２のＣａｓタンパク質、即ちクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質である。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、サブタイプ、例えばＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型、ＩＩ－Ｃ型、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、またはＶ－Ｕ型であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、またはＣａｓ１２ｄである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、およびその他のＣａｓ９オルソログであってよい。Ｃａｓ１２は、ＦｎＣａｓ１２ａを含むＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、およびＣａｓ１２ｃ、またはそれらのホモロジーもしくはオルソログであってよい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの定義および例示的なメンバーには、Ｋｉｒａ Ｓ．ＭａｋａｒｏｖａおよびＥｕｇｅｎｅ Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ，Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ aｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７～７５ぺージ；およびＳｅｒｇｅｙ Ｓｈｍａｋｏｖら、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２０１７ Ｍａｒ；１５（３）：１６９～１８２ぺージに記載されたものが含まれる。
【0156】
Ｃａｓタンパク質リンカー
一部の例では、Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインおよび少なくとも１つのＨＮＨドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインを接続する第１および第２のリンカードメインをさらに含んでよい。Ｃａｓ９においてＨＮＨドメインとＲｕｖＣドメインを接続する第１のリンカー（Ｌ１）および第２のリンカー（Ｌ２）は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ら、「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ」Ｃｅｌｌ １５６（Ｆｅｂ．２７，２０１４）：９３５～９４９ぺージおよびＲｉｂｅｉｒｏ，Ｌ．ら、（２０１８）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｅｘｐａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－ Ｃａｓ９ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１８巻、論文ＩＤ １６５２５６７（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１８／１６５２５６７）による研究に記載されている。Ｒｉｂｅｉｒｏの図１は、Ｃａｓ９の全体の構成、構造、および機能を示しており、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。具体的には、図１Ａは、本明細書に記載するように、リンカーＬ１（アミノ酸７６５～７８０にわたる）およびＬ２（アミノ酸９０６～９１８にわたる）を含むＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインの遺伝子構築を示すＳｐＣａｓ９のドメイン構成の概略表現を示す。
一部の例では、Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインおよび少なくとも１つのＨＮＨドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインを接続する第１および第２のリンカードメインをさらに含んでよい。Ｃａｓ９においてＨＮＨドメインとＲｕｖＣドメインを接続する第１のリンカー（Ｌ１）および第２のリンカー（Ｌ２）は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ら、「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ」Ｃｅｌｌ １５６（Ｆｅｂ．２７，２０１４）：９３５～９４９ぺージおよびＲｉｂｅｉｒｏ，Ｌ．ら、（２０１８）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｅｘｐａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－ Ｃａｓ９ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１８巻、論文ＩＤ １６５２５６７（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１８／１６５２５６７）による研究に記載されている。Ｒｉｂｅｉｒｏの図１は、Ｃａｓ９の全体の構成、構造、および機能を示しており、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。具体的には、図１Ａは、本明細書に記載するように、リンカーＬ１（アミノ酸７６５～７８０にわたる）およびＬ２（アミノ酸９０６～９１８にわたる）を含むＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインの遺伝子構築を示すＳｐＣａｓ９のドメイン構成の概略表現を示す。
【0157】
同様に、スタフィロコッカス・アウレウスのＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）のドメイン構成を、第１および第２のリンカードメインを参照する際に利用することができる。一態様では、リンカー１ドメイン領域は残基４８１～５１９にわたり、ＳａＣａｓ９中のＲｕｖＣ－ＩＩドメインをＨＮＨドメインに接続している。一部の実施形態では、リンカー２領域は残基６２９～６４９にわたり、ＳａＣａｓ９のＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインを接続している。したがって、第１および／または第２のリンカードメインは、Ｃａｓ９オルソログにおいて変異していてもよく、野生型ＳａＣａｓ９のアミノ酸に対応するアミノ酸残基を参照してよい。参照により本明細書に組み込まれるＮｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ａｕｇ ２７；１６２（５）：１１１３～１１２６ぺージ；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０８．００７を参照されたい。特に、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕの図１、Ｓ１～Ｓ３はＣａｓ９タンパク質のドメイン構成の詳細を示しており、その教示のため、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
【0158】
第１および第２のリンカーは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、またはそれ以上のアミノ酸を含んでよい。第１および第２のリンカーは、野生型リンカーに対応し得る。一部の態様では、第１および第２のリンカーは、第１および／または第２のリンカーに１つまたは複数の変異を含んでよい。一態様では、第１および／または第２のリンカーは、Ｃａｓ９タンパク質の特異性を改善する１つまたは複数の変異を含む。
【0159】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインとＲｕｖＣドメインを接続するリンカーＬ１およびＬ２は、野生型アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインとＲｕｖＣドメインを接続するリンカーは、１つまたは複数のアミノ酸に変異を含む。例としての実施形態では、第１のリンカー（Ｌ１）は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸Ｔ７６９Ｉに対応する変異を含み、および／または第２のリンカー（Ｌ２）は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸Ｇ９１５Ｍに対応する変異を含む。例としての実施形態では、１つまたは複数のリンカー変異、例えばＴ７６９ＩおよびＧ９１５Ｍは、Ｃａｓ９タンパク質に改善された特異性を付与する。
【0160】
一実施形態では、第１および第２のリンカーにおける１つまたは複数（more）の変異は、本明細書に記載したように、特異性のさらなる改善および／または野生型Ｃａｓ９タンパク質と実質的に等価な活性の保持のために、Ｃａｓ９タンパク質の他の部分における１つまたは複数の変異と組み合わせてよい。一実施形態では、リンカーにおける変異および／またはＣａｓタンパク質内のさらなる変異は、特異性を増強／改善し、野生型Ｃａｓ９の（to）野生型活性を実質的に保持する、本明細書に詳細を述べた方法を利用して、同定することができる。
【0161】
クラス２、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質（ＩＩ型Ｃａｓタンパク質）であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２、ＩＩ型のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９であってよい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその断片、Ｃａｓ９融合タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその断片をコードする核酸、またはＣａｓ９融合タンパク質をコードする核酸を含んでよい。「Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ付随タンパク質９）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿２６９２１５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＲＮＡ結合活性、ＤＮＡ結合活性、および／またはＤＮＡ切断活性（例えばエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性）を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。「Ｃａｓ９機能」は、例えば本明細書に記載したように、それだけに限らないが、蛍光分極に基づく核酸結合アッセイ、蛍光分極に基づくストランド侵入アッセイ、転写アッセイ、ＥＧＦＰ破壊アッセイ、ＤＮＡ切断アッセイ、および／またはサーベイヤーアッセイを含むいくつかのアッセイのいずれかによって定義することができる。「Ｃａｓ９核酸分子」は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＣａｓ９核酸分子配列は、ゲノム配列番号ＮＣ＿００２７３７で提供されている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９、例えば天然に存在するＳ．ピオゲネスのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳ．アウレウスのＣａｓ９ （ＳａＣａｓ９）またはそれらのバリアントの阻害剤が本明細書で開示される。Ｃａｓ９は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）による標的ＤＮＡの塩基対形成を用いて外来ＤＮＡを認識する。Ｃａｓ９によって任意のゲノム遺伝子座において標的化された鎖切断を誘導することが比較的容易であるため、多数の細胞型および生命体における効率的なゲノム編集が可能になった。Ｃａｓ９誘導体も、転写アクチベーター／リプレッサーとして用いることができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質（ＩＩ型Ｃａｓタンパク質）であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２、ＩＩ型のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９であってよい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその断片、Ｃａｓ９融合タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその断片をコードする核酸、またはＣａｓ９融合タンパク質をコードする核酸を含んでよい。「Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ付随タンパク質９）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿２６９２１５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＲＮＡ結合活性、ＤＮＡ結合活性、および／またはＤＮＡ切断活性（例えばエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性）を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。「Ｃａｓ９機能」は、例えば本明細書に記載したように、それだけに限らないが、蛍光分極に基づく核酸結合アッセイ、蛍光分極に基づくストランド侵入アッセイ、転写アッセイ、ＥＧＦＰ破壊アッセイ、ＤＮＡ切断アッセイ、および／またはサーベイヤーアッセイを含むいくつかのアッセイのいずれかによって定義することができる。「Ｃａｓ９核酸分子」は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＣａｓ９核酸分子配列は、ゲノム配列番号ＮＣ＿００２７３７で提供されている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９、例えば天然に存在するＳ．ピオゲネスのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳ．アウレウスのＣａｓ９ （ＳａＣａｓ９）またはそれらのバリアントの阻害剤が本明細書で開示される。Ｃａｓ９は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）による標的ＤＮＡの塩基対形成を用いて外来ＤＮＡを認識する。Ｃａｓ９によって任意のゲノム遺伝子座において標的化された鎖切断を誘導することが比較的容易であるため、多数の細胞型および生命体における効率的なゲノム編集が可能になった。Ｃａｓ９誘導体も、転写アクチベーター／リプレッサーとして用いることができる。
【0162】
一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはそのバリアントである。一部の例では、Ｃａｓ９は、天然に存在する任意の細菌性Ｃａｓ９を含む野生型Ｃａｓ９であってよい。Ｃａｓ９オルソログは、典型的には３～４個のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの一般的な構成を共有している。５’最末端のＲｕｖＣドメインは非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインは相補鎖を切断する。全ての表記はガイド配列に準拠している。５’ＲｕｖＣドメインの触媒残基は、目的のＣａｓ９の他のＣａｓ９オルソログ［Ｓ．ピオゲネスＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、Ｓ．サーモフィルスＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、Ｓ．サーモフィルスＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、およびフランシセラ・ノビシダ（Franciscilla novicida）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来］との相同性比較によって同定され、保存されたＡｓｐ残基（Ｄ１０）はアラニンに変異し、Ｃａｓ９は相補鎖切断酵素に変換される。したがって、Ｃａｓ酵素は、天然に存在する任意の細菌性Ｃａｓ９を含む野生型Ｃａｓ９であってよい。ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ、またはＣａｓ９酵素は、コドン最適化されていてよく、または任意のキメラ、変異体、ホモログ、またはオルソログを含む改変されたバージョンであってよい。本開示のさらなる態様では、Ｃａｓ９酵素は１つまたは複数の変異を含んでよく、機能性ドメインとの融合を伴いまたは伴わずに、一般的なＤＮＡ結合性タンパク質として用いてよい。
【0163】
変異は、人工的に導入された変異、または機能獲得型変異、もしくは機能喪失型変異であってよい。一部の実施形態では、転写活性化ドメインはＶＰ６４であってよい。一部の実施形態では、転写リプレッサードメインはＫＲＡＢまたはＳＩＤ４Ｘであってよい。本開示のその他の態様は、ヌクレアーゼ、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクローム、光誘導性／制御性ドメインもしくは化学的誘導性／制御性ドメインを含むがそれらに限らないドメインと融合した、変異したＣａｓ９酵素に関する。本開示は、細胞内のこれらのＲＮＡの性能を増強することを可能にするｓｇＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡ、またはガイドもしくはキメラガイド配列を含んでよい。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は任意のＣａｓ酵素であってよい。一部の場合には、Ｃａｓ９酵素はＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９であるか、これらから誘導される。本明細書で用いる場合、酵素に関連する用語「誘導された」は、誘導された酵素が、高度の配列同一性を有しているという意味で主として野生型酵素に基づいているが、当技術で既知のまたは本明細書に記載したある方法で変異している（改変されている）ことを意味する。一例では、変異は第１のリンカードメイン、第２のリンカードメイン、および／またはタンパク質のその他の部分における１つまたは複数の変異を含んでよい。高度の配列同一性は、野生型酵素に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を含んでよい。
【0164】
Ｃａｓ酵素は、同定されたＣａｓであってよい。それは、これがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム由来の多数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的な酵素のクラスを指し得るからである。一部の場合には、Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９）またはｓａＣａｓ９（Ｓ．アウレウスＣａｓ９）由来またはそれらから誘導される。「ＳｔＣａｓ９」は、Ｓ．サーモフィルス由来の野生型Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｇ３ＥＣＲ１）を指す。同様に、「ＳｐＣａｓ９」は、Ｓ．ピオゲネス由来の野生型Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９９ＺＷ２）を指す。本明細書で用いる場合、酵素に関連する用語「誘導された」は、誘導された酵素が、高度の配列同一性を有しているという意味で主として野生型酵素に基づいているが、当技術で既知のまたは本明細書に記載したある方法で変異している（改変されている）ことを意味する。用語ＣａｓおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、他が明らかでない限り、本明細書で一般に相互交換可能に用いられることが認識されよう。上述のように、本明細書で用いる残基の番号付けの多くは、ストレプトコッカス・ピオゲネスにおけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を指す。
【0165】
特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラチフラクター、スタフィロコッカス、パルビバクルム、ロゼブリア、ネイセリア、グルコンアセトバクター、アゾスピリルム、スピロヘータ、ラクトバチルス、ユーバクテリウム、コリネバクテ、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、ロドバクター（Rhodobacter）、リステリア（Listeria）、パルジバクター（Paludibacter）、クロストリジウム（Clostridium）、ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）、クロストリジアリジウム（Clostridiaridium）、レプトトリキア（Leptotrichia）、フランシセラ（Francisella）、レジオネラ（Legionella）、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、メタノメチオフィルス（Methanomethyophilus）、ポルフィロモナス（Porphyromonas）、プレボテラ（Prevotella）、バクテロイデテス（Bacteroidetes）、ヘルココッカス（Helcococcus）、レトスピラ（Letospira）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、デスルホナトロヌム（Desulfonatronum）、オピツタセアエ（Opitutaceae）、ツベリバチルス（Tuberibacillus）、バチルス（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacilus）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、またはアシダミノコッカス（Acidaminococcus）、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラチフラクター、スタフィロコッカス、パルビバクルム、ロゼブリア、ネイセリア、グルコンアセトバクター、アゾスピリルム、スピロヘータ、ラクトバチルス、ユーバクテリウム、コリネバクター（Corynebacter）、ステレラ（Sutterella）、レジオネラ、トレポネーマ（Treponema）、フィリファクター（Filifactor）、ユーバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、マイコプラズマ（Mycoplasma）、バクテロイデス、フラビイボラ（Flaviivola）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、スピロヘータ、アゾスピリルム、グルコンアセトバクター、ネイセリア、ロゼブリア、パルビバクルム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、またはカンピロバクターを含む属由来の生命体に由来するかそれらに起源するＣａｓ９エフェクタータンパク質である。
【0166】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ミュータンス（S. mutans）、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）、Ｓ．エキシミリス（S. equisimilis）、Ｓ．サングイニス（S. sanguinis）、Ｓ．ニューモニア（S. pneumonia）、Ｃ．ジェジュニ（C. jejuni）、Ｃ．コリ（C. coli）、Ｎ．サルスギニス（N salsuginis）、Ｎ．テルガルクス（N tergarcus）、Ｓ．アウリクラリス（S. auricularis）、Ｓ．カルノサス（S. carnosus）、Ｎ．メニンギチデス（N meningitides）、Ｎ．ゴノレアエ（N gonorrhoeae）、Ｌ．モノシトゲネス（L. monocytogenes）、Ｌ．イバノビイ（L. ivanovii）、Ｃ．ボツリヌム（C. botulinum）、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）、Ｃ．テタニ（C. tetani）、またはＣ．ソルデリイ（C. sordellii）、フランシセラ・ツラレンシス１（Francisella tularensis 1）、フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis subsp. novicida）、プレボテラ・アルベンシス（Prevotella albensis）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）ＭＣ２０１７ １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス（Butyrivibrio proteoclasticus）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Peregrinibacteria bacterium）ＧＷ２０１１ ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア・バクテリウム（Parcubacteria bacterium）ＧＷ２０１１ ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ（Smithella）亜種ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス亜種ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセアエ・バクテリウムＭＡ２０２０、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Candidatus Methanoplasma termitum）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、モラケセラ・ボボクリ（Moraxella bovoculi）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、ラクノスピラセアエ・バクテリウムＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス３（Porphyromonas crevioricanis 3）、プレボテラ・ディジエンス（Prevotella disiens）、およびポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）から選択される生命体に由来するかそれらに起源する。一部の実施形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、またはストレプトコッカス・サーモフィルスのＣａｓ９由来の生命体に由来するかそれらに起源するＣａｓ９エフェクタータンパク質。
【0167】
より好ましい実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、またはストレプトコッカス・サーモフィルスのＣａｓ９から選択される細菌種から誘導される。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、フランシセラ・ツラレンシス１、プレボテラ・アルベンシス、ラクノスピラセアエ・バクテリウムＭＣ２０１７１、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア・バクテリウムＧＷ２０１１ ＧＷＡ２ ３３ ＪＯ、パルクバクテリア・バクテリウムＧＷ２０１１ ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ亜種ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス亜種ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセアエ・バクテリウムＭＡ２０２０、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、ユーバクテリウム・エリゲンス、モラケセラ・ボボクリ２３７、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラセアエ・バクテリウムＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス３、プレボテラ・ディジエンス、およびポルフィロモナス・マカカエから選択される細菌種から誘導される。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、アシダミノコッカス亜種ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセアエ・バクテリウムＭＡ２０２０から選択される細菌種から誘導される。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダを含むがそれだけに限らない、フランシセラ・ツラレンシス１の亜種に由来する。
【0168】
Ｃａｓ９酵素は、Ｓ．ピオゲネス血清型Ｍ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９９ＺＷ２）、Ｓ．アウレウスＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｊ７ＲＵＡ５）、ユーバクテリウム・ベントリオスムＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ５Ｚ３９５）、アゾスピリルム（Ｂ５１０株）Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｄ３ＮＴ０９）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（ＡＴＣＣ ４９０３７株）Ｃａｓ９（ＵｎｉｔＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ９ＨＫＰ２）、ナイセリア・シネレアＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｄ０Ｗ２Ｚ９）、ロゼブリア・インテスティナリスＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｃ７Ｇ６９７）、パルビバクルム・ラバメンチボランス（ＤＳ－１株）Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ７ＨＰ８９）、ニトラチフラクター・サルスギニス（ＤＳＭ １６５１１株）Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｅ６ＷＺＳ９）、カンピロバクター・ラリＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｇ１ＵＦＮ３）を含むが、それだけに限らない。
【0169】
ストレプトコッカス・ピオゲネスから誘導されるＣａｓ９または密接に関連する任意のＣａｓ９による酵素作用により、ガイド配列の２０ヌクレオチドとハイブリダイズして標的配列の２０ヌクレオチドの後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例にはＮＧＧ／ＮＲＧまたは本明細書に記載したように決定することができるＰＡＭが含まれる）を有する標的部位配列において二本鎖切断が生成される。部位特異的なＤＮＡ認識および切断のためのＣａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、部分的にガイド配列とハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列、およびＰＡＭ配列によって定義される。ＣＲＩＳＰＲシステムのさらなる態様は、ＫａｒｇｉｎｏｖおよびＨａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７ぺージに記載されている。４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣｓｎｌのクラスター、ならびに２つの非コーディングＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、および非反復配列（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）の短いストレッチが挟まれた反復配列（ダイレクトリピート）の特徴的なアレイを含むストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座。このシステムにおいて、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、４つの逐次的ステップで生成する。第１に、２つの非コーディングＲＮＡ、即ちプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのダイレクトリピートとハイブリダイズし、これが次に処理されて個別のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡになる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロデュプレックス形成を介して、プロトスペーサーと対応するＰＡＭとからなるＤＮＡ標的にＣａｓ９を方向付ける。最後に、Ｃａｓ９がＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサーの中にＤＳＢを創成する。２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に隣接する単一のスペーサーからなるプレｃｒＲＮＡアレイも、用語「ｔｒａｃｒメイト配列」に包含される。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、構成的に存在するか、誘導的に存在するか、条件付きで存在するか、または投与もしくは送達してよい。Ｃａｓ９の最適化を用いて機能を増強するか、または新たな機能を開発してよい。キメラＣａｓ９タンパク質を生成することができ、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合性タンパク質として用いてもよい。Ｃａｓ９について提供される構造情報を用いてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをさらに操作および最適化してよく、これを拡張して他のＣＲＩＳＰＲ酵素システムにおける構造機能関係、特に他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ９オルソログにおける構造機能関係を検討してもよい。結晶構造情報［２０１３年１２月１２日出願の米国仮出願６１／９１５，２５１、２０１４年１月２２日出願の６１／９３０，２１４、２０１４年４月１５日出願の６１／９８０，０１２、およびＮｉｓｈｉｍａｓｕら、「Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｉｎ Ｃｏｍpｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ」Ｃｅｌｌ １５６（５）：９３５～９４９ぺージ、ＤＯＩ：ｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０２．００１（２０１４）に記載され、そのそれぞれおよび全てが参照により本明細書に組み込まれる］は、誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに組み込むことができるモジュラーまたはマルチパートのＣＲＩＳＰＲ酵素を切り詰め、創成するための構造情報を提供する。特に、構造情報はＳ．ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）について提供されており、これを他のＣａｓ９オルソログまたは他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素に拡張してよい。Ｃａｓ９遺伝子はいくつかの多様な細菌ゲノム、典型的にはｃａｓｌ、ｃａｓ２、およびｃａｓ４遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲカセットと同じ遺伝子座で見出されている。さらに、Ｃａｓ９タンパク質は、トランスポゾンＯＲＦ－Ｂと相同の容易に特定できるＣ末端領域を含み、活性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンに富む領域を含む。
【0170】
ｄＣａｓ９
Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活化されないように変異させることができる。最近、エンドヌクレアーゼ活性を有しないＳ．ピオゲネス由来の不活化されたＣａｓ９タンパク質（ｉＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」とも称する）が、立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするためにｇＲＮＡによって細菌、酵母、およびヒトの細胞内の遺伝子に対して標的化されている。本明細書で用いる場合、「ｄＣａｓ分子」は、ｄＣａｓタンパク質またはその断片を指すことがある。本明細書で用いる場合、「ｄＣａｓ分子」は、ｄＣａｓタンパク質またはその断片を指すことがある。本明細書で用いる場合、用語「ｉＣａｓ」および「ｄＣａｓ」は相互交換可能に用いられ、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ随伴タンパク質を指す。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、ＤＮＡ切断ドメインに１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、ＲｕｖＣまたはドメインに１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、ＲｕｖＣとＨＮＨドメインの両方に１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、野生型Ｃａｓ分子の断片である。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は野生型Ｃａｓ分子由来の機能性ドメインを含み、機能性ドメインは、Ｒｅｅｌドメイン、架橋ヘリックスドメイン、またはＰＡＭ相互作用ドメインから選択される。一実施形態では、ｄＣａｓ分子のヌクレアーゼ活性は、対応する野生型Ｃａｓ分子の活性と比較して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減する。
Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活化されないように変異させることができる。最近、エンドヌクレアーゼ活性を有しないＳ．ピオゲネス由来の不活化されたＣａｓ９タンパク質（ｉＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」とも称する）が、立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするためにｇＲＮＡによって細菌、酵母、およびヒトの細胞内の遺伝子に対して標的化されている。本明細書で用いる場合、「ｄＣａｓ分子」は、ｄＣａｓタンパク質またはその断片を指すことがある。本明細書で用いる場合、「ｄＣａｓ分子」は、ｄＣａｓタンパク質またはその断片を指すことがある。本明細書で用いる場合、用語「ｉＣａｓ」および「ｄＣａｓ」は相互交換可能に用いられ、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ随伴タンパク質を指す。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、ＤＮＡ切断ドメインに１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、ＲｕｖＣまたはドメインに１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、ＲｕｖＣとＨＮＨドメインの両方に１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、野生型Ｃａｓ分子の断片である。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は野生型Ｃａｓ分子由来の機能性ドメインを含み、機能性ドメインは、Ｒｅｅｌドメイン、架橋ヘリックスドメイン、またはＰＡＭ相互作用ドメインから選択される。一実施形態では、ｄＣａｓ分子のヌクレアーゼ活性は、対応する野生型Ｃａｓ分子の活性と比較して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減する。
【0171】
好適なｄＣａｓ分子は、野生型Ｃａｓ分子から誘導することができる。Ｃａｓ分子は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来であってよい。一実施形態では、好適なｄＣａｓ分子は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、またはＣａｓ１０分子から誘導することができる。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、Ｃａｓ９分子から誘導される。ｄＣａｓ９分子は、例えばＤＮＡ切断ドメイン、例えばヌクレアーゼドメイン、例えばＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメインにおいてＣａｓ９分子に点変異（例えば置換、欠失、または付加）を導入することによって得ることができる。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６～２１ぺージを参照されたい。例えば、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインに２つの点変異を導入することによって、Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ結合活性を保持しながらＣａｓ９ヌクレアーゼ活性が低減される。一実施形態では、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの活性部位内の２つの点変異は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの変異である。あるいは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子のｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ結合活性を保持しながら、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を無効にするためにＤ１０およびＨ８４０を欠失させることができる。一実施形態では、RｕｖＣおよびＨＮＨ活性部位内の２つの点変異は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子のＤ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異である。
【0172】
種々の実施形態では、本開示は、ｄＣａｓ分子またはそれらのバリアントのいずれかのバリアントもしくは変異体を含む。ｄＣａｓ９の全てのバリアントおよび変異体は、ＳｐＣａｓ９（ストレプトコッカス・ピオゲネスから単離されたＣａｓ９）、ＳａＣａｓ９（スタフィロコッカス・アウレウスから単離されたＣａｓ９）、ＳｔＣａｓ９（ストレプトコッカス・サーモフィルスから単離されたＣａｓ９）、ＮｍＣａｓ９（ネイセリア・メニンギチデスから単離されたＣａｓ９）、ＦｎＣａｓ９（フランシセラ・ノビシダから単離されたＣａｓ９）、ＣｊＣａｓ９（カンピロバクター・ジェジュニから単離されたＣａｓ９）、ＳｃＣａｓ９［ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）から単離されたＣａｓ９］、ならびに上記のＣａｓ９の任意のバリアントおよび変異体形、例えば高忠実度Ｃａｓ９（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｊａｎ ２８）および増強されたＳｐＣａｓ９（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１６ Ｊａｎ ０１）から誘導されたものを含むが、それだけに限らない、本明細書で開示する方法、組成物、またはキットにおいて用いることができる。このリストはいくつかの例示的選択肢を提供するためのみであって、排他的ではない。
【0173】
一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、配列番号１に従って番号付けしてＤ１０および／またはＨ８４０に変異を含むストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９分子である。一実施形態では、ｄＣａｓ分子は、配列番号１に従って番号付けしてＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａの変異を含むストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９分子である。
【0174】
ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号１）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号１）
【0175】
一実施形態では、ｄＣａｓ９分子は、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列、配列番号２もしくは３と実質的に同一（例えば配列同一性において少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列、または配列番号２もしくは３に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上の変更、例えばアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失を有する配列、またはそれらの任意の断片を含むスタフィロコッカス・アウレウスｄＣａｓ９分子である。
【0176】
天然に存在する他の任意のＣａｓ９（例えば他の種由来のＣａｓ９）または操作されたＣａｓ９分子に同様の変異を適用することもできる。ある特定の実施形態では、ｄＣａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９分子、スタフィロコッカス・アウレウスｄＣａｓ９分子、カンピロバクター・ジェジュニｄＣａｓ９分子、コリネバクテリウム・ジフテリアｄＣａｓ９分子、ユーバクテリウム・ベントリオスムｄＣａｓ９分子、ストレプトコッカス・パスチュリアヌスｄＣａｓ９分子、ラクトバチルス・ファルシミニスｄＣａｓ９分子、スピロヘータ・グローブスｄＣａｓ９分子、アゾスピリルム（Ｂ ５１０株）ｄＣａｓ９分子、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスｄＣａｓ９分子、ネイセリア・シネレアｄＣａｓ９分子、ロゼブリア・インテスティナリスｄＣａｓ９分子、パルビバクルム・ラバメンチボランスｄＣａｓ９分子、ニトラチフラクター・サルスギニス（ＤＳＭ １６５１ １株）ｄＣａｓ９分子、カンピロバクター・ラリ（ＣＦ８９－１２株）ｄＣａｓ９分子、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＬＭＤ－９株）ｄＣａｓ９分子、またはそれらの断片を含む。
【0177】
ある特定の実施形態では、本開示は、ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９分子、スタフィロコッカス・アウレウスｄＣａｓ９分子、カンピロバクター・ジェジュニｄＣａｓ９分子、コリネバクテリウム・ジフテリアｄＣａｓ９分子、ユーバクテリウム・ベントリオスムｄＣａｓ９分子、ストレプトコッカス・パスチュリアヌスｄＣａｓ９分子、ラクトバチルス・ファルシミニスｄＣａｓ９分子、スピロヘータ・グローブスｄＣａｓ９分子、アゾスピリルム（Ｂ ５１０株）ｄＣａｓ９分子、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスｄＣａｓ９分子、ネイセリア・シネレアｄＣａｓ９分子、ロゼブリア・インテスティナリスｄＣａｓ９分子、パルビバクルム・ラバメンチボランスｄＣａｓ９分子、ニトラチフラクター・サルスギニス（ＤＳＭ １６５１ １株）ｄＣａｓ９分子、カンピロバクター・ラリ（ＣＦ８９－１２株）ｄＣａｓ９分子、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＬＭＤ－９株）ｄＣａｓ９分子、またはそれらの断片をコードするヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0178】
例示的なｄＣａｓ９タンパク質は、表１に列挙したものを含むが、それらに限定されない。
【0179】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【0180】
Ｃａｓ９融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、融合分子［例えばＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ］を含んでよい。融合分子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質（例えばｄＣａｓ９）および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーター（例えばＫＲＡＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチド）を含んでよい。一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子発現のリプレッサー（例えばＫＲＡＢ）、遺伝子発現のアクチベーター、または遺伝子外改変のモジュレーター（例えばＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合タンパク質）またはそれらの任意の組合せから選択される。当技術で遺伝子発現の様々なモジュレーターが知られている。例えば全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｈａｋｏｒｅら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６；１３：１２７～３７ぺージを参照されたい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、融合分子［例えばＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ］を含んでよい。融合分子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質（例えばｄＣａｓ９）および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーター（例えばＫＲＡＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチド）を含んでよい。一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子発現のリプレッサー（例えばＫＲＡＢ）、遺伝子発現のアクチベーター、または遺伝子外改変のモジュレーター（例えばＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合タンパク質）またはそれらの任意の組合せから選択される。当技術で遺伝子発現の様々なモジュレーターが知られている。例えば全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｈａｋｏｒｅら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６；１３：１２７～３７ぺージを参照されたい。
【0181】
遺伝子発現のリプレッサー
一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子発現のリプレッサーを含む。リプレッサーは、遺伝子発現の任意の既知のリプレッサー、例えばＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＭＡＸ－相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、クロモシャドウドメイン、ＥＡＲ抑制ドメイン（ＳＲＤＸ）、真核生物放出因子１（ＥＲＦｌ）、真核生物放出因子３（ＥＲＦ３）、テトラサイクリンリプレッサー、ｌａｄリプレッサー、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）Ｇボックス結合因子１および２、ショウジョウバエ（Drosophila Groucho）、トリパータイトモチーフ含有２８（ＴＲＴＭ２８）、核受容体共リプレッサー１、核受容体共リプレッサー２、またはそれらの断片もしくは融合体から選択されるリプレッサーであってよい。
一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子発現のリプレッサーを含む。リプレッサーは、遺伝子発現の任意の既知のリプレッサー、例えばＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＭＡＸ－相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、クロモシャドウドメイン、ＥＡＲ抑制ドメイン（ＳＲＤＸ）、真核生物放出因子１（ＥＲＦｌ）、真核生物放出因子３（ＥＲＦ３）、テトラサイクリンリプレッサー、ｌａｄリプレッサー、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）Ｇボックス結合因子１および２、ショウジョウバエ（Drosophila Groucho）、トリパータイトモチーフ含有２８（ＴＲＴＭ２８）、核受容体共リプレッサー１、核受容体共リプレッサー２、またはそれらの断片もしくは融合体から選択されるリプレッサーであってよい。
【0182】
Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）
ＫＲＡＢドメインは、多くのジンクフィンガータンパク質系転写因子のＮ末端部分に存在する一種の転写抑制ドメインである。ＫＲＡＢドメインは、ＤＮＡ結合ドメインによって標的ＤＮＡに繋がれた場合に、転写リプレッサーとして機能する。ＫＲＡＢドメインは荷電したアミノ酸が富化されており、サブドメインＡおよびＢに分割されていることがある。ＫＲＡＢのＡおよびＢのサブドメインは可変スペーサーセグメントによって分離されていることがあり、多くのＫＲＡＢタンパク質はＡサブドメインのみを含む。ＫＲＡＢ Ａサブドメインにおける４５アミノ酸の配列が、転写抑制に重要であることが示されてきた。Ｂサブドメインはそれ自体では転写を抑制しないが、ＫＲＡＢ Ａサブドメインによって発揮される抑制を強化する。ＫＲＡＢドメインは、共リプレッサーＫＡＰ１（ＫＲＡＢ関連タンパク質１。転写仲介因子１ベータ、ＫＲＡＢ－Ａ相互作用タンパク質、およびトリパータイトモチーフタンパク質２８としても知られている）およびヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、ならびにその他のクロマチン調節タンパク質を動員し、ヘテロクロマチンの形成を通して転写の抑制をもたらす。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＫＲＡＢドメインまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、ＫＲＡＢドメインまたはその断片は、ｄＣａｓ９分子のＮ末端に融合する。一実施形態では、ＫＲＡＢドメインまたはその断片は、ｄＣａｓ９分子のＣ末端に融合する。一実施形態では、ＫＲＡＢドメインまたはその断片は、ｄＣａｓ９分子のＮ末端とＣ末端の両方に融合する。一実施形態では、融合分子は、配列番号２２の配列、配列番号２２と実質的に同一（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列、または配列番号２２に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上の変更、例えばアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失を有する配列、またはそれらの任意の断片を含む。
ＫＲＡＢドメインは、多くのジンクフィンガータンパク質系転写因子のＮ末端部分に存在する一種の転写抑制ドメインである。ＫＲＡＢドメインは、ＤＮＡ結合ドメインによって標的ＤＮＡに繋がれた場合に、転写リプレッサーとして機能する。ＫＲＡＢドメインは荷電したアミノ酸が富化されており、サブドメインＡおよびＢに分割されていることがある。ＫＲＡＢのＡおよびＢのサブドメインは可変スペーサーセグメントによって分離されていることがあり、多くのＫＲＡＢタンパク質はＡサブドメインのみを含む。ＫＲＡＢ Ａサブドメインにおける４５アミノ酸の配列が、転写抑制に重要であることが示されてきた。Ｂサブドメインはそれ自体では転写を抑制しないが、ＫＲＡＢ Ａサブドメインによって発揮される抑制を強化する。ＫＲＡＢドメインは、共リプレッサーＫＡＰ１（ＫＲＡＢ関連タンパク質１。転写仲介因子１ベータ、ＫＲＡＢ－Ａ相互作用タンパク質、およびトリパータイトモチーフタンパク質２８としても知られている）およびヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、ならびにその他のクロマチン調節タンパク質を動員し、ヘテロクロマチンの形成を通して転写の抑制をもたらす。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＫＲＡＢドメインまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、ＫＲＡＢドメインまたはその断片は、ｄＣａｓ９分子のＮ末端に融合する。一実施形態では、ＫＲＡＢドメインまたはその断片は、ｄＣａｓ９分子のＣ末端に融合する。一実施形態では、ＫＲＡＢドメインまたはその断片は、ｄＣａｓ９分子のＮ末端とＣ末端の両方に融合する。一実施形態では、融合分子は、配列番号２２の配列、配列番号２２と実質的に同一（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列、または配列番号２２に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上の変更、例えばアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失を有する配列、またはそれらの任意の断片を含む。
【0183】
例示的なＫＲＡＢドメイン配列：ＲＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬＤＴＡＱＱＩＶＹＲＮＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥＰ（配列番号２２）
【0184】
ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）
ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）は、いくつかの転写抑制タンパク質の上に存在する相互作用ドメインである。これは、ｍＳｉｎ３の対形成した両親媒性アルファヘリックス２（ＰＡＨ２）ドメイン、即ちｍＳｉｎ３ Ａ共リプレッサー等の転写リプレッサータンパク質に結合した転写リプレッサードメインと相互作用する。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ｍＳｉｎ３相互作用ドメインまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、連結された４つのｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、連結された４つのｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）は、ｄＣａｓ９分子のＣ末端に融合している。
ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）は、いくつかの転写抑制タンパク質の上に存在する相互作用ドメインである。これは、ｍＳｉｎ３の対形成した両親媒性アルファヘリックス２（ＰＡＨ２）ドメイン、即ちｍＳｉｎ３ Ａ共リプレッサー等の転写リプレッサータンパク質に結合した転写リプレッサードメインと相互作用する。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ｍＳｉｎ３相互作用ドメインまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、連結された４つのｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、連結された４つのｍＳｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）は、ｄＣａｓ９分子のＣ末端に融合している。
【0185】
ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）
Ｍｘｉ１はＭＹＣのリプレッサーである。Ｍｘｉ１は、おそらくＭＹＣに結合してＭＹＣが機能するために必要とされるＭＹＣ関連因子Ｘ（ＭＡＸ）への結合について競合することによって、ＭＹＣの転写活性に拮抗する。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｍｘｉ１またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、Ｍｘｉ１はｄＣａｓ９分子のＣ末端に融合している。
Ｍｘｉ１はＭＹＣのリプレッサーである。Ｍｘｉ１は、おそらくＭＹＣに結合してＭＹＣが機能するために必要とされるＭＹＣ関連因子Ｘ（ＭＡＸ）への結合について競合することによって、ＭＹＣの転写活性に拮抗する。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｍｘｉ１またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、Ｍｘｉ１はｄＣａｓ９分子のＣ末端に融合している。
【0186】
遺伝子発現のアクチベーター
一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子発現のアクチベーターを含む。アクチベーターは、遺伝子発現の任意の既知のアクチベーター、例えばＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ｐ６５活性化ドメイン、エプスタイン－バーウイルスＲトランスアクチベーターＲｔａ分子、またはそれらの断片であってよい。ｄＣａｓ９分子とともに用い得る活性化は当技術で既知である。例えば全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｖｅｚら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２０１６）１３：５６３～６７ぺージを参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子発現のアクチベーターを含む。アクチベーターは、遺伝子発現の任意の既知のアクチベーター、例えばＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ｐ６５活性化ドメイン、エプスタイン－バーウイルスＲトランスアクチベーターＲｔａ分子、またはそれらの断片であってよい。ｄＣａｓ９分子とともに用い得る活性化は当技術で既知である。例えば全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｖｅｚら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２０１６）１３：５６３～６７ぺージを参照されたい。
【0187】
ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０
ＶＰ１６は、転写アクチベーターを動員してプロモーターおよびエンハンサーにする１６アミノ酸のウイルスタンパク質配列である。ＶＰ６４は、ＶＰ１６の４つのコピーを含む転写アクチベーター、例えばＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーによって接続されたＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む分子である。ＶＰ１６０は、ＶＰ１６の１０個のコピーを含む転写アクチベーターである。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ１６の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ６４と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ１６０と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、ＶＰ６４は、ｄＣａｓ９分子のＣ末端、Ｎ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に融合している。
ＶＰ１６は、転写アクチベーターを動員してプロモーターおよびエンハンサーにする１６アミノ酸のウイルスタンパク質配列である。ＶＰ６４は、ＶＰ１６の４つのコピーを含む転写アクチベーター、例えばＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーによって接続されたＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む分子である。ＶＰ１６０は、ＶＰ１６の１０個のコピーを含む転写アクチベーターである。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ１６の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ６４と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ１６０と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一実施形態では、ＶＰ６４は、ｄＣａｓ９分子のＣ末端、Ｎ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に融合している。
【0188】
ｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）
ｐ６５ＡＤは、Ｆ－κＢ転写因子の核型の６５ｋＤａポリペプチドの主要なトランス活性化ドメインである。ヒト転写因子ｐ６５の例示的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースで受託番号Ｑ０４２０６の下に入手可能である。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ｐ６５またはその断片、例えばｐ６５ＡＤと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
ｐ６５ＡＤは、Ｆ－κＢ転写因子の核型の６５ｋＤａポリペプチドの主要なトランス活性化ドメインである。ヒト転写因子ｐ６５の例示的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースで受託番号Ｑ０４２０６の下に入手可能である。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ｐ６５またはその断片、例えばｐ６５ＡＤと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0189】
エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）Ｒトランスアクチベーター（Ｒｔａ）
ＥＢＶの前初期タンパク質であるＲｔａは、溶菌遺伝子発現を誘導する転写アクチベーターであり、ウイルスの再活性化を誘発する。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｒｔａまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
ＥＢＶの前初期タンパク質であるＲｔａは、溶菌遺伝子発現を誘導する転写アクチベーターであり、ウイルスの再活性化を誘発する。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｒｔａまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0190】
ＶＰ６４、ｐ６５、Ｒｔａ融合体
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ６４、ｐ６５、Ｒｔａ、またはそれらの任意の組合せと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。その中で３つの転写活性化ドメインが短いアミノ酸リンカーを用いて融合されたトリパータイトアクチベーターＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲとしても知られている）は、ｄＣａｓ９分子と融合した場合に効果的に標的遺伝子発現を上方制御することができる。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰＲと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰ６４、ｐ６５、Ｒｔａ、またはそれらの任意の組合せと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。その中で３つの転写活性化ドメインが短いアミノ酸リンカーを用いて融合されたトリパータイトアクチベーターＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲとしても知られている）は、ｄＣａｓ９分子と融合した場合に効果的に標的遺伝子発現を上方制御することができる。一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＶＰＲと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0191】
相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、３つの成分、（１）ｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合体、（２）テトラループおよびステムループに２つのＭＳ２ ＲＮＡアプタマーを組み込んだｇＲＮＡ、および（３）ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１活性化ヘルパータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。このシステムは相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）と命名され、３つのアクチベータードメインＶＰ６４、Ｐ６５、およびＨＳＦｌが一緒になっており、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｎｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１７：５８３～８ぺージに記載されている。
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、３つの成分、（１）ｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合体、（２）テトラループおよびステムループに２つのＭＳ２ ＲＮＡアプタマーを組み込んだｇＲＮＡ、および（３）ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１活性化ヘルパータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。このシステムは相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）と命名され、３つのアクチベータードメインＶＰ６４、Ｐ６５、およびＨＳＦｌが一緒になっており、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｎｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１７：５８３～８ぺージに記載されている。
【0192】
Ｌｄｂｌ自己会合ドメイン
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｌｄｂｌ自己会合ドメインと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。Ｌｄｂｌ自己会合ドメインは、エンハンサー関連内因性Ｌｄｂｌを動員する。
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｌｄｂｌ自己会合ドメインと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。Ｌｄｂｌ自己会合ドメインは、エンハンサー関連内因性Ｌｄｂｌを動員する。
【0193】
遺伝子外改変のモジュレーター
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、遺伝子発現のモジュレーターと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子外改変のモジュレーターを含む。一実施形態では、融合分子は、標的遺伝子の制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、または転写開始部位において、遺伝子外改変を介して、例えばヒストンのアセチル化もしくはメチル化、またはＤＮＡのメチル化を介して、標的遺伝子の発現を調節する。モジュレーターは、遺伝子外改変の任意の既知のモジュレーター、例えばヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えばｐ３００触媒ドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ［例えばＳＵＶ３９Ｈ１またはＧ９ａ（ＥＨＭＴ２）］、ヒストンデメチラーゼ（例えばＬＳＤ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えばＤＮＭＴ３ａまたはＤＮＭＴ３ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ）、ＤＮＡデメチラーゼ（例えばＴＥＴ１触媒ドメインまたはＴＤＧ）、またはそれらの断片であってよい。
一実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、遺伝子発現のモジュレーターと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、遺伝子外改変のモジュレーターを含む。一実施形態では、融合分子は、標的遺伝子の制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、または転写開始部位において、遺伝子外改変を介して、例えばヒストンのアセチル化もしくはメチル化、またはＤＮＡのメチル化を介して、標的遺伝子の発現を調節する。モジュレーターは、遺伝子外改変の任意の既知のモジュレーター、例えばヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えばｐ３００触媒ドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ［例えばＳＵＶ３９Ｈ１またはＧ９ａ（ＥＨＭＴ２）］、ヒストンデメチラーゼ（例えばＬＳＤ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えばＤＮＭＴ３ａまたはＤＮＭＴ３ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ）、ＤＮＡデメチラーゼ（例えばＴＥＴ１触媒ドメインまたはＴＤＧ）、またはそれらの断片であってよい。
【0194】
ヒストン改変活性
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはヒストン改変活性を有し得る。ヒストン改変活性は、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、またはヒストンメチルトランスフェラーゼの活性を含んでよいが、それだけに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはヒストン改変活性を有し得る。ヒストン改変活性は、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、またはヒストンメチルトランスフェラーゼの活性を含んでよいが、それだけに限定されない。
【0195】
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し得る。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００またはＣＲＥＢ結合性タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質またはその断片であってよい。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、アセチルトランスフェラーゼｐ３００またはその断片、例えばｐ３００の触媒コアと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＣＲＥＢ結合性タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0196】
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはヒストンデメチラーゼ活性を含んでよい。例えば、遺伝子外改変のモジュレーターは、核酸またはタンパク質（例えばヒストン）からメチル（ＣＨ３－）基を除去する酵素を含んでよい。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｌｙｓ特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0197】
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＳＵＶ３９Ｈ１またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、Ｇ９ａ（ＥＨＭＴ２）またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0198】
ＤＮＡデメチラーゼ活性
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはＤＮＡデメチラーゼ活性を有し得る。例えば、遺伝子外改変のモジュレーターは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構として、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに変換（covert）し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、１０－１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはＤＮＡデメチラーゼ活性を有し得る。例えば、遺伝子外改変のモジュレーターは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構として、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに変換（covert）し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、１０－１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）またはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0199】
ＤＮＡメチラーゼ活性
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはＤＮＡメチラーゼ活性を有し得る。例えば、遺伝子外改変のモジュレーターは、メチル基のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシン、またはアデニンへの転移に関与するメチラーゼ活性を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３Ａまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３Ｌまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３ＬおよびＤＮＭＴ３Ｌまたはそれらの断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチドと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
一部の実施形態では、遺伝子外改変のモジュレーターはＤＮＡメチラーゼ活性を有し得る。例えば、遺伝子外改変のモジュレーターは、メチル基のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシン、またはアデニンへの転移に関与するメチラーゼ活性を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３Ａまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３Ｌまたはその断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３ＬおよびＤＮＭＴ３Ｌまたはそれらの断片と融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物は、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチドと融合したｄＣａｓ９分子を含む融合分子を含む。
【0200】
ＤＮＭＴ３Ａ：
MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV（配列番号２３）
MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV（配列番号２３）
【0201】
ＤＮＭＴ３Ｌ：
MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQ NSLPL（配列番号２４）
MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQ NSLPL（配列番号２４）
【0202】
ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチド
MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL（配列番号２７）
MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL（配列番号２７）
【0203】
一実施形態では、Ｃａｓ９融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）、例えばＣａｓ９のＮ末端及び／またはＣ末端に融合したＬＳも含む。
【0204】
核局在化配列は当技術で既知である。一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号２５もしくは２６のアミノ酸配列、配列番号２５もしくは２６と実質的に同一（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一）の配列、または配列番号２５もしくは２６に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変更、例えばアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失を有する配列、またはそれらの任意の断片を含む。
【0205】
配列番号２５（例示的な核局在化配列）：
ＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ
ＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ
【0206】
配列番号２６（例示的な核局在化配列）：
ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ
ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ
【0207】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、ｄＣａｓ９分子および遺伝子発現のモジュレーター、またはｄＣａｓ９分子および遺伝子発現のモジュレーターをコードする核酸を含んでよい。一実施形態では、ｄＣａｓ９分子および遺伝子発現のモジュレーターは共有的に連結されている。一実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、ｄＣａｓ９分子に共有結合で直接融合している。一実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、非モジュレーターもしくはリンカーを介して、または第２のモジュレーターを介して、ｄＣａｓ９分子に共有結合で間接的に融合している。一実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、ｄＣａｓ９分子のＮ末端および／またはＣ末端にある。一実施形態では、ｄＣａｓ９分子および遺伝子発現のモジュレーターは、非共有結合で連結されている。例示的な配列には、それだけに限らないが、表２に列挙したものが含まれる。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９と遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターの間のリンカーは、表２に列挙したリンカーに対応するアミノ酸配列を含む。
【0208】
【表2】
【0209】
一実施形態では、ｄＣａｓ９分子は、第１のタグ、例えば第１のペプチドタグと融合している。一実施形態では、遺伝子発現のモジュレーターは、第２のタグ、例えば第２のペプチドタグと融合している。一実施形態では、第１および第２のタグ、例えば第１のペプチドタグおよび第２のペプチドタグは互いに非共有結合で相互作用し、それにより、ｄＣａｓ９分子と遺伝子発現のモジュレーターを緊密に接近させる。
【0210】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは、融合分子または融合分子をコードする核酸を含む。一実施形態では、融合分子は、遺伝子発現のモジュレーターと融合したｄＣａｓ９を含む配列を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９分子、スタフィロコッカス・アウレウスｄＣａｓ９分子、カンピロバクター・ジェジュニｄＣａｓ９分子、コリネバクテリウム・ジフテリアｄＣａｓ９分子、ユーバクテリウム・ベントリオスムｄＣａｓ９分子、ストレプトコッカス・パスチュリアヌスｄＣａｓ９分子、ラクトバチルス・ファルシミニスｄＣａｓ９分子、スピロヘータ・グローブスｄＣａｓ９分子、アゾスピリルム（Ｂ５１０株）ｄＣａｓ９分子、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスｄＣａｓ９分子、ネイセリア・シネレアｄＣａｓ９分子、ロゼブリア・インテスティナリスｄＣａｓ９分子、パルビバクルム・ラバメンチボランスｄＣａｓ９分子、ニトラチフラクター・サルスギニス（ＤＳＭ １６５１１株）ｄＣａｓ９分子、カンピロバクター・ラリ（ＣＦ８９－１２株）ｄＣａｓ９分子、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＬＭＤ－９株）ｄＣａｓ９分子、またはそれらの断片を含む。
【0211】
一実施形態では、融合分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、直接または間接的に（例えばリンカーを介して）融合した、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチド（３Ａ３Ｌ）、ｄＣａｓ９ペプチド、およびＫＲＡＢペプチドドメインを含む、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合分子である。
【0212】
一実施形態では、融合分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、直接または間接的に（例えばリンカーを介して）融合した、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ融合ペプチド（３Ａ３Ｌ）、ｄＣａｓ９ペプチド、およびＫＲＡＢペプチドドメインを含む、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合分子である。
【0213】
一実施形態では、融合分子は、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８と実質的に同一の（例えば配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い）配列、または配列番号２８に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変更、例えば置換、挿入、もしくは欠失を有する配列、またはそれらの任意の断片を含む。
【0214】
ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
【化1】
【0215】
ｇＲＮＡ
本明細書で用いる場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する用語「ガイド配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズし、核酸標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指令するために十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。ガイド配列は標的配列とデュプレックスを形成し得る。デュプレックスはＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、またはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスであってよい。用語「ガイド分子」および「ガイドＲＮＡ」および「シングルガイドＲＮＡ」は本明細書で相互交換可能に用いられ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができ、標的核酸配列とハイブリダイズして複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指令するために十分な標的核酸配列との相補性を有するガイド配列を含むＲＮＡ系分子を指す。ガイド分子またはガイドＲＮＡは、本明細書に記載したように、具体的には１つまたは複数の化学的（chemically）改変［例えば２つのリボヌクレオチドの化学的連結（chemical linking）または１つもしくは複数のリボヌクレオチドの１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチドによる置換え］を有するＲＮＡ系分子を包含する。
本明細書で用いる場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する用語「ガイド配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズし、核酸標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指令するために十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。ガイド配列は標的配列とデュプレックスを形成し得る。デュプレックスはＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、またはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスであってよい。用語「ガイド分子」および「ガイドＲＮＡ」および「シングルガイドＲＮＡ」は本明細書で相互交換可能に用いられ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができ、標的核酸配列とハイブリダイズして複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指令するために十分な標的核酸配列との相補性を有するガイド配列を含むＲＮＡ系分子を指す。ガイド分子またはガイドＲＮＡは、本明細書に記載したように、具体的には１つまたは複数の化学的（chemically）改変［例えば２つのリボヌクレオチドの化学的連結（chemical linking）または１つもしくは複数のリボヌクレオチドの１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチドによる置換え］を有するＲＮＡ系分子を包含する。
【0216】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のガイド分子またはガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「ダイレクトリピート」を包含する）およびガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも称する）を含んでよい。一部の実施形態では、本明細書に記載したＣＲＩＳＰＲシステム－Ｃａｓシステムまたは複合体は、ｔｒａｃｒ配列を含まず、および／またはその存在に依拠しない。ある特定の実施形態では、ガイド分子は、ガイド配列またはスペーサー配列と融合したまたはこれに連結されたダイレクトリピート配列を含むか本質的にこれからなるか、これからなってよい。一部の実施形態では、ガイド分子またはｓｇＲＮＡは、配列番号５９で説明されるｔｒａｃｒ配列を含む。
【0217】
例示的なｔｒａｃｒ配列：
ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ（配列番号５９）
ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ（配列番号５９）
【0218】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関連して、「標的配列」は、それに対してガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的ＤＮＡ配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。
【0219】
ある特定の実施形態では、ガイド分子のガイド配列またはスペーサーの長さは、長さ１５～５０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサーの長さは、少なくとも長さ１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサーの長さは、長さ１５～１７ヌクレオチド、長さ１７～２０ヌクレオチド、長さ２０～２４ヌクレオチド、長さ２３～２５ヌクレオチド、長さ２４～２７ヌクレオチド、長さ２７～３０ヌクレオチド、長さ３０～３５ヌクレオチド、または長さ３５ヌクレオチド超である。
【0220】
一部の実施形態では、ガイド配列は、長さ１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチドである。
【0221】
一部の実施形態では、ガイド分子（ダイレクトリピートおよび／またはスペーサー）の配列は、ガイド分子内の二次構造の程度を低減するように選択される。一部の実施形態では、核酸を標的とするガイドＲＮＡのヌクレオチドの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、またはそれ未満が、最適に折り畳まれた場合に自己相補性塩基対形成に寄与する。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定してよい。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの計算に基づいている。そのようなアルゴリズムの一例は、ＺｕｋｅｒおよびＳｔｉｅｇｌｅｒ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３～１４８ぺージ］に記載されたｍＦｏｌｄである。折り畳みアルゴリズムの別の例は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａで開発されたセントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである［例えばＡ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒら、２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３～２４ぺージ；ならびにＰＡ ＣａｒｒおよびＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１～６２ページを参照］。
【0222】
上記のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムの標的化を提供するｇＲＮＡを利用している。ｇＲＮＡは２つの非コーディングＲＮＡ、即ちｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合体である。ｓｇＲＮＡは、相補性塩基対形成によって標的特異性を付与する２０ｂｐのプロトスペーサーをコードする配列を所望のＤＮＡ標的と交換することによって、所望の任意のＤＮＡ配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与する天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスを模倣している。このデュプレックスは、例えば４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含んでよく、Ｃａｓ９が標的核酸を切断するためのガイドとして作用する。
【0223】
本明細書で相互交換可能に用いられる用語「標的領域」、「標的配列」、または「プロトスペーサー」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムが標的とする標的遺伝子の領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システムは少なくとも１つのｇＲＮＡを含んでよく、ｇＲＮＡは異なるＤＮＡ配列を標的とする。標的ＤＮＡ配列は重複していてもよい。標的配列またはプロトスペーサーには、プロトスペーサーの３’末端にＰＡＭ配列が続く。異なるＩＩ型システムは異なるＰＡＭを必要とする。例えば、Ｓ．ピオゲネスＩＩ型システムは「ＮＧＧ」配列を用いており、ここで「Ｎ」は任意のヌクレオチドであってよい。
【0224】
一部の実施形態では、細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも２つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも３つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも５つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも６つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも７つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも９つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１１の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１２の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１３の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１４の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１６の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１７の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１９の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４５の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも５０の異なるｇＲＮＡであってよい。
【0225】
一部の実施形態では、細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも５０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも４５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも４０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも３５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも３０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも２５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも２０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも１６の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも１２の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも１つのｇＲＮＡ～少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つのｇＲＮＡ～少なくとも５０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも４５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも４０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも３５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも３０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも２５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも２０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも１６の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも１２の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも５０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも４５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも４０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも３５の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも３０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも２５の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも２０の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも１６の異なるｇＲＮＡ、または８つの異なるｇＲＮＡ～少なくとも１２の異なるｇＲＮＡの間でよい。
【0226】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写を増大または低減させるように選択される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子（例えばＶＥＧＦ）の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流、例えば標的遺伝子の転写開始部位の０～１０００ｂｐ上流の領域を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写開始部位の０～５０ｂｐ、０～１００ｂｐ、０～１５０ｂｐ、０～２００ｂｐ、０～２５０ｂｐ、０～３００ｂｐ、０～３５０ｂｐ、０～４００ｂｐ、０～４５０ｂｐ、０～５００ｂｐ、０～５５０ｂｐ、０～６００ｂｐ、０～６５０ｂｐ、０～７００ｂｐ、０～７５０ｂｐ、０～８００ｂｐ、０～８５０ｂｐ、０～９００ｂｐ、０～９５０ｂｐ、または０～１０００ｂｐ上流の領域を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写開始部位の約1００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内上流の領域を標的とする。一実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子のＴＳＳの０～３００ｂｐ上流の領域を標的とする。
【0227】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写開始部位の下流、例えば標的遺伝子の転写開始部位の０～１０００ｂｐ下流の領域を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写開始部位の０～５０ｂｐ、０～１００ｂｐ、０～１５０ｂｐ、０～２００ｂｐ、０～２５０ｂｐ、０～３００ｂｐ、０～３５０ｂｐ、０～４００ｂｐ、０～４５０ｂｐ、０～５００ｂｐ、0～５５０ｂｐ、０～６００ｂｐ、０～６５０ｂｐ、０～７００ｂｐ、０～７５０ｂｐ、０～８００ｂｐ、０～８５０ｂｐ、０～９００ｂｐ、０～９５０ｂｐ、または０～１０００ｂｐ下流の領域を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写開始部位の約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、または約１５００ｂｐ以内下流の領域を標的とする。一実施形態では、ｇＲＮＡは標的遺伝子のＴＳＳの０～３００ｂｐ下流の領域を標的とする。
【0228】
ＶＥＧＦ
本明細書で用いる場合、用語「ＶＥＧＦ」は、血管内皮増殖因子を指す。ＶＥＧＦ経路は血管の発達の多数の態様に関与しており、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｅ、およびそれらの個別の受容体を含む血管新生アクチベーターとして作用するタンパク質のファミリーを含む。ＶＥＧＦ－ＡはＶＥＧＦまたは血管透過性因子（ＶＰＦ）とも称され、抗血管新生療法のターゲットである。ＶＥＧＦ－Ａは、単一のＶＥＧＦ遺伝子、即ちＶＥＧＦｍ、ＶＥＧＦ４５、ＶＥＧＦｉｅｓ、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６のｍＲＮＡの選択的スプライシングに起因する５つのアイソフォームに存在する。
本明細書で用いる場合、用語「ＶＥＧＦ」は、血管内皮増殖因子を指す。ＶＥＧＦ経路は血管の発達の多数の態様に関与しており、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｅ、およびそれらの個別の受容体を含む血管新生アクチベーターとして作用するタンパク質のファミリーを含む。ＶＥＧＦ－ＡはＶＥＧＦまたは血管透過性因子（ＶＰＦ）とも称され、抗血管新生療法のターゲットである。ＶＥＧＦ－Ａは、単一のＶＥＧＦ遺伝子、即ちＶＥＧＦｍ、ＶＥＧＦ４５、ＶＥＧＦｉｅｓ、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６のｍＲＮＡの選択的スプライシングに起因する５つのアイソフォームに存在する。
【0229】
ヒトＶＥＧＦＡは６ｐ２１．１の細胞遺伝学的位置を有し、ゲノム座標は第６染色体のフォワード鎖の４３，７７０，２０９～４３，７８６，４８７位に存在する。ヒトＶＥＧＦの配列の例は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ ７４２２およびＥｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ ＥＮＳＧ０００００１１２７１５で見出すことができる。ＶＥＧＦＡは血管内皮細胞の増殖および遊走を誘導し、生理学的および病理学的の両方の血管新生に重要である。マウスにおけるこの遺伝子の破壊は、胚血管形成の異常をもたらした。
【0230】
一部の実施形態では、本方法は、本明細書で開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるトランスフェクションの後で、ＶＥＧＦＡの発現レベルの有意な減少を示した。一部の実施形態では、対照（例えばＶＥＧＦＡを標的としないｓｇＲＮＡによるトランスフェクション）と比較して、ＶＥＧＦ発現レベルの低下は約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、または約９５％以上である。
【0231】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＡ発現レベルの低下は、本明細書で開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるトランスフェクションの後、少なくとも約９６時間、少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約４週、少なくとも約６週、少なくとも約２か月、またはそれ以上長く保持される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦレベルの低下は、約１週～約４週、約１週～約３週、約１週～約２週、約２週～約４週、約２週～約３週、または約３週～約４週、保持される。
【0232】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＡの発現レベルの低下は、ベースラインまたはＶＥＧＦＡの所定のレベルの比較に基づいている。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＡのレベルの低下は、対象からの第１の試料からのＶＥＧＦの第１のレベルと対象からの第２の試料からのＶＥＧＦの第２のレベルとの比較に基づいてよい。
【0233】
本開示は、マウスまたはウサギのＶＥＧＦＡ標的遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列を提供する。例示的なｓｇＲＮＡは、表３ａおよび表３ｂに列挙したものを含むが、それだけに限定されない。本開示は、ヒトＶＥＧＦＡを標的とするｓｇＲＮＡ配列（これはサルＶＥＧＦＡにおける相同領域も標的とする）も提供する。例示的なｓｇＲＮＡは、表４に列挙したものを含むが、それだけに限定されない。
【0234】
【表3】
【0235】
【表4】
【0236】
【表5】
【0237】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とする。一実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子のエンハンサー領域を標的とする。ｇＲＮＡは、標的結合領域、Ｃａｓ９結合領域、および転写終止領域に分割することができる。標的結合領域は、標的遺伝子中の標的領域とハイブリダイズする。そのような標的結合領域を設計する方法は当技術で既知である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｏｅｎｃｈら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２：１２６２～７ぺージ；およびＤｏｅｎｃｈら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６）３４：１８４～９１ぺージを参照されたい。設計ツールは、例えばＦｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｌａｂ’ｓ ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ ｌａｂ’ｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ－ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（Ｃａｓ－ＯＦ Ｆｉｎｄｅｒ）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ、およびＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒで入手可能である。ある特定の実施形態では、標的結合領域は、長さ約１５～５０ヌクレオチド（長さ約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ヌクレオチド）の間であってよい。ある特定の実施形態では、標的結合領域は、長さ約１９～約２１ヌクレオチドの間であってよい。一実施形態では、標的結合領域は、長さ１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドである。
【0238】
一実施形態では、標的結合領域は、標的遺伝子内の標的領域と相補的、例えば完全に相補的である。一実施形態では、標的結合領域は、標的遺伝子内の標的領域と実質的に相補的である。一実施形態では、標的結合領域は、標的遺伝子内の標的領域と相補的でない１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下のヌクレオチドを含む。
【0239】
一実施形態では、標的結合領域は、例えば非天然ヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを標的結合領域に組み込むことによって、ＲＮＡ不安定化配列エレメントを除去または改変することによって、ＲＮＡ安定化配列エレメントを付加することによって、またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の安定性を増大することによって、安定性を改善し、または半減期を延長させるように操作される。一実施形態では、標的結合領域は、その転写を増強するように操作される。一実施形態では、標的結合領域は、二次構造形成を低減するように操作される。一実施形態では、ｇＲＮＡのＣａｓ９結合領域は、ｇＲＮＡの転写を増強するように改変される。一実施形態では、ｇＲＮＡのＣａｓ９結合領域は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の安定性またはアセンブリーを改善するように改変される。
【0240】
デリバリーシステム
本開示は、本明細書のシステムおよび組成物の成分を細胞、組織、器官、または生命体に導入するためのデリバリーシステムも提供する。デリバリーシステムは、１つまたは複数のデリバリー媒体および／またはカーゴを含んでよい。
本開示は、本明細書のシステムおよび組成物の成分を細胞、組織、器官、または生命体に導入するためのデリバリーシステムも提供する。デリバリーシステムは、１つまたは複数のデリバリー媒体および／またはカーゴを含んでよい。
【0241】
カーゴ
デリバリーシステムは、１つまたは複数のカーゴを含んでよい。カーゴは、本明細書のシステムおよび組成物の１つまたは複数の成分を含んでよい。カーゴは、以下の、ｉ）１つまたは複数のＣａｓタンパク質をコードするプラスミド、ｉｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするプラスミド、ｉｉｉ）１つまたは複数のＣａｓタンパク質のｍＲＮＡ、ｉｖ）１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ｖ）１つまたは複数のＣａｓタンパク質、ｖｉ）それらの任意の組合せの１つまたは複数を含んでよい。一部の例では、カーゴは、１つまたは複数のＣａｓタンパク質および１つまたは複数の（例えば複数の）ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを含んでよい。一部の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数のＣａｓタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡを含んでよい。
デリバリーシステムは、１つまたは複数のカーゴを含んでよい。カーゴは、本明細書のシステムおよび組成物の１つまたは複数の成分を含んでよい。カーゴは、以下の、ｉ）１つまたは複数のＣａｓタンパク質をコードするプラスミド、ｉｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするプラスミド、ｉｉｉ）１つまたは複数のＣａｓタンパク質のｍＲＮＡ、ｉｖ）１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ｖ）１つまたは複数のＣａｓタンパク質、ｖｉ）それらの任意の組合せの１つまたは複数を含んでよい。一部の例では、カーゴは、１つまたは複数のＣａｓタンパク質および１つまたは複数の（例えば複数の）ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを含んでよい。一部の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数のＣａｓタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡを含んでよい。
【0242】
一部の例では、カーゴは、１つまたは複数のＣａｓタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡを、例えばリボヌクレオプロテイン複合体（ＲＮＰ）の形態で含んでよい。リボヌクレオプロテイン複合体は、本明細書の方法およびシステムによって送達してよい。一部の場合には、リボヌクレオプロテインは、ポリペプチド系のシャトル剤によって送達してよい。一例では、リボヌクレオプロテインは、例えばＷＯ２０１６１６１５１６に記載されているように、細胞浸透ドメイン（ＣＰＤ）に作動可能に連結されたエンドソームリーケージドメイン（ＥＬＤ）を含む合成ペプチドを用いてヒスチジンリッチドメインおよびＣＰＤに送達してよい。
【0243】
物理的デリバリー
一部の実施形態では、カーゴは、物理的デリバリー法によって細胞に導入してよい。物理的方法の例には、マイクロインジェクション、電気穿孔法、および水力学的デリバリーが含まれる。
一部の実施形態では、カーゴは、物理的デリバリー法によって細胞に導入してよい。物理的方法の例には、マイクロインジェクション、電気穿孔法、および水力学的デリバリーが含まれる。
【0244】
マイクロインジェクション
細胞へのカーゴの直接のマイクロインジェクションは、例えば９０％超または約１００％の高い効率を達成することができる。一部の実施形態では、マイクロインジェクションは、顕微鏡および細胞膜に穿刺して細胞内の目標部位にカーゴを直接送達するための針（例えば直径０．５～５．０μｍ）を用いて実施してよい。マイクロインジェクションは、インビトロおよびエクスビボ（ex vivo）のデリバリーのために用いてよい。
細胞へのカーゴの直接のマイクロインジェクションは、例えば９０％超または約１００％の高い効率を達成することができる。一部の実施形態では、マイクロインジェクションは、顕微鏡および細胞膜に穿刺して細胞内の目標部位にカーゴを直接送達するための針（例えば直径０．５～５．０μｍ）を用いて実施してよい。マイクロインジェクションは、インビトロおよびエクスビボ（ex vivo）のデリバリーのために用いてよい。
【0245】
Ｃａｓタンパク質および／もしくはガイドＲＮＡをコードする配列、ｍＲＮＡ、および／またはガイドＲＮＡを含むプラスミドをマイクロインジェクションしてよい。一部の場合には、マイクロインジェクションは、ｉ）ＤＮＡを細胞核に直接送達するため、および／またはｉｉ）ｍＲＮＡ（例えばインビトロで転写された）を細胞核または細胞質に送達するために用いてよい。ある特定の例では、マイクロインジェクションは、ｓｇＲＮＡを核に直接送達し、ＣａｓをコードするｍＲＮＡを細胞質に送達して、例えば翻訳および核へのＣａｓのシャトリングを容易にするために用いてよい。
【0246】
マイクロインジェクションは、遺伝的子改変された動物を生成するために用いてよい。例えば、遺伝子編集カーゴを接合体に注射して、効率的な生殖細胞系列改変を可能にしてよい。そのようなアプローチによって、所望の改変を有する正常な胚および満期の子マウスを得ることができる。マイクロインジェクションは、例えばＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉを用いて、細胞のゲノム内の特定の遺伝子を過渡的に上方制御または下方制御するために用いることもできる。
【0247】
電気穿孔法
一部の実施形態では、カーゴおよび／またはデリバリー媒体は、電気穿孔法によって送達してよい。電気穿孔法は、高圧パルス電流を用いて、緩衝液中に懸濁された細胞の細胞膜内にナノメーターサイズの細孔を過渡的に開け、数十ナノメーターの水力学的直径を有する成分を細胞内に流入させることを可能にする。一部の場合には、電気穿孔法は種々の細胞型で用いられ、カーゴを効率的に細胞内に移入する。電気穿孔法はインビトロおよびエクスビボのデリバリーで用いてよい。
一部の実施形態では、カーゴおよび／またはデリバリー媒体は、電気穿孔法によって送達してよい。電気穿孔法は、高圧パルス電流を用いて、緩衝液中に懸濁された細胞の細胞膜内にナノメーターサイズの細孔を過渡的に開け、数十ナノメーターの水力学的直径を有する成分を細胞内に流入させることを可能にする。一部の場合には、電気穿孔法は種々の細胞型で用いられ、カーゴを効率的に細胞内に移入する。電気穿孔法はインビトロおよびエクスビボのデリバリーで用いてよい。
【0248】
電気穿孔法は、特定の電圧および薬剤を適用することによって、例えばヌクレオフェクションによって、哺乳動物細胞の核に（to）カーゴを送達するために用いてもよい。そのようなアプローチには、Ｗｕ Ｙ，ら（２０１５）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５：６７～７９ぺージ；Ｙｅ Ｌ，ら、（２０１４）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１：９５９１～６ぺージ；Ｃｈｏｉ ＰＳ，Ｍｅｙｅｒｓｏｎ Ｍ．（２０１４）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３７２８ぺージ；Ｗａｎｇ Ｊ，Ｑｕａｋｅ ＳＲ．（２０１４）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１１：１３１５７～６２ぺージに記載されたものが含まれる。電気穿孔法は、例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ Ｍ，ら（２０１５）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６：７３９１ぺージに記載された方法によって、カーゴをインビボで送達するために用いてもよい。
【0249】
水力学的デリバリー
水力学的デリバリーも、カーゴを送達するため、例えばインビボのデリバリーのために用いてよい。一部の例では、水力学的デリバリーは、対象（例えば動物またはヒト）の血流に、例えばマウスについては尾静脈を通じて、遺伝子編集カーゴを含む大量（例えば体重の８～１０％）の溶液を迅速に押し込むことによって実施してよい。血液は非圧縮性であるので、一度に注入された大量の液体は水力学的圧力の増大をもたらし、これが内皮細胞および実質細胞への透過性を一時的に増強し、通常は細胞膜を横断できないカーゴの細胞内への通過を可能にする。このアプローチは、裸のＤＮＡプラスミドおよびタンパク質を送達するために用いてよい。送達されたカーゴは、肝臓、腎臓、肺、筋肉、および／または心臓で富化される。
水力学的デリバリーも、カーゴを送達するため、例えばインビボのデリバリーのために用いてよい。一部の例では、水力学的デリバリーは、対象（例えば動物またはヒト）の血流に、例えばマウスについては尾静脈を通じて、遺伝子編集カーゴを含む大量（例えば体重の８～１０％）の溶液を迅速に押し込むことによって実施してよい。血液は非圧縮性であるので、一度に注入された大量の液体は水力学的圧力の増大をもたらし、これが内皮細胞および実質細胞への透過性を一時的に増強し、通常は細胞膜を横断できないカーゴの細胞内への通過を可能にする。このアプローチは、裸のＤＮＡプラスミドおよびタンパク質を送達するために用いてよい。送達されたカーゴは、肝臓、腎臓、肺、筋肉、および／または心臓で富化される。
【0250】
トランスフェクション
カーゴ、例えば核酸は、核酸を細胞内に導入するためのトランスフェクション法によって細胞に導入してよい。トランスフェクション法の例には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インパレフェクション、光学的トランスフェクション、独自の薬剤によって強化された核酸の取り込みが含まれる。
カーゴ、例えば核酸は、核酸を細胞内に導入するためのトランスフェクション法によって細胞に導入してよい。トランスフェクション法の例には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インパレフェクション、光学的トランスフェクション、独自の薬剤によって強化された核酸の取り込みが含まれる。
【0251】
デリバリー媒体
デリバリーシステムは、１つまたは複数のデリバリー媒体を含んでよい。デリバリー媒体は、カーゴを細胞、組織、器官、または生命体（例えば動物または植物）に送達し得る。カーゴは、包装され、運搬され、またはその他の方法でデリバリー媒体に付随してよい。デリバリー媒体は、送達すべきカーゴの型に基づいて選択され、ならびに／またはデリバリーはインビトロおよび／もしくはインビボである。デリバリー媒体の例には、ベクター、ウイルス、非ウイルス性媒体、および本明細書に記載したその他のデリバリー剤が含まれる。
デリバリーシステムは、１つまたは複数のデリバリー媒体を含んでよい。デリバリー媒体は、カーゴを細胞、組織、器官、または生命体（例えば動物または植物）に送達し得る。カーゴは、包装され、運搬され、またはその他の方法でデリバリー媒体に付随してよい。デリバリー媒体は、送達すべきカーゴの型に基づいて選択され、ならびに／またはデリバリーはインビトロおよび／もしくはインビボである。デリバリー媒体の例には、ベクター、ウイルス、非ウイルス性媒体、および本明細書に記載したその他のデリバリー剤が含まれる。
【0252】
本開示によるデリバリー媒体は１００ミクロン（μｍ）未満の最大寸法（例えば直径）を有してよい。一部の実施形態では、デリバリー媒体は１０μｍ未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、デリバリー媒体は２０００ナノメーター（ｎｍ）未満の最大寸法を有してよい。一部の実施形態では、デリバリー媒体は１０００ナノメーター（ｎｍ）未満の最大寸法を有してよい。一部の実施形態では、デリバリー媒体は９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満の最大寸法（例えば直径）を有してよい。一部の実施形態では、デリバリー媒体は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有してよい。
【0253】
一部の実施形態では、デリバリー媒体は粒子であるか、粒子を含んでよい。例えば、デリバリー媒体は、ナノ粒子［例えば１０００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する粒子］であるか、ナノ粒子を含んでよい。粒子は様々な形態、例えば固体粒子（例えば銀、金、鉄、チタン等の金属、非金属、液体系固体、ポリマー）、粒子の懸濁液、またはそれらの組合せとして供給してよい。金属、誘電体、および半導体の粒子、ならびにハイブリッド構造（例えばコアシェル粒子）を調製してよい。
【0254】
ベクター
システム、組成物、および／またはデリバリーシステムは、１つまたは複数のベクターを含んでよい。本開示はベクターシステムも含む。ベクターシステムは１つまたは複数のベクターを含んでよい。一部の実施形態では、ベクターは、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖の核酸分子、１つまたは複数の遊離末端を含むか遊離末端を含まない（例えば環状の）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、および当技術で既知の他の種々のポリヌクレオチドを含む。ベクターは、プラスミド、例えば標準的な分子クローニング手法によってその中にさらなるＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループであってよい。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞における自己複製が可能であってよい（例えば、細菌の複製の起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。一部のベクター（例えば非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムの中に一体化され、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。ある特定の例では、ベクターは、例えばそれが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる発現ベクターであってよい。一部の場合には、発現ベクターは、真核細胞における発現のためであってよい。組換えＤＮＡ手法において有用な一般的な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。
システム、組成物、および／またはデリバリーシステムは、１つまたは複数のベクターを含んでよい。本開示はベクターシステムも含む。ベクターシステムは１つまたは複数のベクターを含んでよい。一部の実施形態では、ベクターは、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖の核酸分子、１つまたは複数の遊離末端を含むか遊離末端を含まない（例えば環状の）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、および当技術で既知の他の種々のポリヌクレオチドを含む。ベクターは、プラスミド、例えば標準的な分子クローニング手法によってその中にさらなるＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループであってよい。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞における自己複製が可能であってよい（例えば、細菌の複製の起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。一部のベクター（例えば非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムの中に一体化され、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。ある特定の例では、ベクターは、例えばそれが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる発現ベクターであってよい。一部の場合には、発現ベクターは、真核細胞における発現のためであってよい。組換えＤＮＡ手法において有用な一般的な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。
【0255】
ベクターの例には、ｐＧＥＸ、ｐＭＡＬ、ｐＲＩＴ５、大腸菌（E.coli）発現ベクター（例えばｐＴｒｃ、ｐＥＴ ｌ ｌｄ）、酵母発現ベクター（例えばｐＹｅｐＳｅｃｌ、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２、およびｐｉｃＺ）、バキュロウイルスベクター（例えばＳＦ９細胞等の昆虫細胞内での発現のため）（例えばｐＡｃシリーズおよびｐＶＬシリーズ）、哺乳動物発現ベクター（例えばｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣ）が含まれる。
【0256】
ベクターは、ｉ）Ｃａｓコーディング配列、および／またはｉｉ）単一の、もしくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも３２、少なくとも４８、少なくとも５０のガイドＲＮＡコーディング配列を含んでよい。単一のベクターにおいて、それぞれのＲＮＡコーディング配列についてプロモーターが存在してよい。その代わりにまたはさらに、単一のベクターにおいて、多数のＲＮＡコーディング配列を制御する（例えば転写および／または発現を駆動する）プロモーターが存在してもよい。
【0257】
制御エレメント
ベクターは、１つまたは複数の制御エレメントを含んでよい。制御エレメントは、Ｃａｓタンパク質、アクセサリータンパク質、ガイドＲＮＡ（例えばシングルガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ）、またはそれらの組合せのコーディング配列に作動可能に連結され得る。用語「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御エレメントに連結されていること（例えばインビトロの転写／翻訳システムで、またはベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞内で）を意味することを意図している。ある特定の例では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントを含んでよい。
ベクターは、１つまたは複数の制御エレメントを含んでよい。制御エレメントは、Ｃａｓタンパク質、アクセサリータンパク質、ガイドＲＮＡ（例えばシングルガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ）、またはそれらの組合せのコーディング配列に作動可能に連結され得る。用語「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御エレメントに連結されていること（例えばインビトロの転写／翻訳システムで、またはベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞内で）を意味することを意図している。ある特定の例では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントを含んでよい。
【0258】
制御エレメントの例には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーマル進入部位（ＩＲＥＳ）、およびその他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列等の転写終止シグナル）が含まれる。そのような制御エレメントは、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ（１９９０）に記載されている。制御エレメントは、多くの型の宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を指令する制御エレメント、およびある特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を指令する制御エレメント（例えば組織特異的制御配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば筋肉、神経、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えばリンパ球）における発現を指令し得る。制御エレメントは、時間依存的な様式で、例えば細胞サイクル依存的または発達段階依存的な様式で、組織または細胞型に特異的であっても特異的でなくてもよい発現を指令し得る。
【0259】
プロモーターの例には、１つまたは複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つまたは複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つまたは複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組合せが含まれる。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、それだけに限らないが、Ｕ６およびＨＩプロモーターが含まれる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例には、それだけに限らないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（ＲＳＶエンハンサーを含んでもよい）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶエンハンサーを含んでもよい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターが含まれる。
【0260】
ウイルスベクター
カーゴはウイルスによって送達してよい。一部の実施形態では、ウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターは、ウイルス（例えばレトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためのウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含んでよい。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運搬されるポリヌクレオチドも含む。ウイルスおよびウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボのデリバリーのために用いてよい。
カーゴはウイルスによって送達してよい。一部の実施形態では、ウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターは、ウイルス（例えばレトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためのウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含んでよい。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運搬されるポリヌクレオチドも含む。ウイルスおよびウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボのデリバリーのために用いてよい。
【0261】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本明細書のシステムおよび組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達してよい。ＡＡＶベクターをそのようなデリバリーのために用いてよい。デペンドウイルス属およびパルボビリダエファミリーのＡＡＶは一本鎖ＤＮＡウイルスである。一部の実施形態では、ＡＡＶによって送達されたゲノム材料は、例えば外因性ＤＮＡとして細胞内に無期限に存在することができ、またはいくらかの改変を加えて宿主ＤＮＡに直接一体化することができるので、ＡＡＶは与えられたＤＮＡの持続的な源を提供し得る。一部の実施形態では、ＡＡＶはヒトにおいて疾患を惹起せず、または疾患に関連しない。ウイルスそれ自体は、先天的もしくは適応的な免疫応答または付随する毒性を殆どまたは全く誘発せずに、細胞に効率的に感染することができる。
本明細書のシステムおよび組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達してよい。ＡＡＶベクターをそのようなデリバリーのために用いてよい。デペンドウイルス属およびパルボビリダエファミリーのＡＡＶは一本鎖ＤＮＡウイルスである。一部の実施形態では、ＡＡＶによって送達されたゲノム材料は、例えば外因性ＤＮＡとして細胞内に無期限に存在することができ、またはいくらかの改変を加えて宿主ＤＮＡに直接一体化することができるので、ＡＡＶは与えられたＤＮＡの持続的な源を提供し得る。一部の実施形態では、ＡＡＶはヒトにおいて疾患を惹起せず、または疾患に関連しない。ウイルスそれ自体は、先天的もしくは適応的な免疫応答または付随する毒性を殆どまたは全く誘発せずに、細胞に効率的に感染することができる。
【0262】
本明細書で用いることができるＡＡＶの例には、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－８、およびＡＡＶ－９が含まれる。ＡＡＶの型は標的とされる細胞に関して選択してよく、例えば脳または神経細胞を標的とするためにＡＡＶの血清型１、２、５、またはハイブリッドカプシドＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの任意の組合せを選択することができ、心臓組織を標的とするためにはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓へのデリバリーのために有用である。ＡＡＶ－２系ベクターは、もともとＣＦＴＲのＣＦ気道へのデリバリーのために提案された。ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、およびＡＡＶ－９等の他の血清型は、肺上皮組織の種々のモデルにおいて改善された遺伝子導入効率を呈する。ＡＡＶによって標的とされる細胞型の例は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｒｉｍｍ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７～５９１１ぺージ（２００８）およびＷＯ ２０２１／１８３８０７Ａ１に記載されている。
【0263】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＡＡＶ粒子は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞内で創成してよい。特定の向性を有する粒子が創成されれば、これらを用いて、天然のウイルス粒子と同じ方法で標的細胞株に感染させられる。これにより、感染した細胞型におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分の持続的な存在が可能になり、このデリバリーのバージョンが長期発現の望ましい場合に特に適するようになる。用いることができるＡＡＶの用量および処方の例には、米国特許第８，４５４，９７２号および第８，４０４，６５８号に記載されたものが含まれる。
【0264】
ＡＡＶを用いる本明細書のシステムおよび組成物によるデリバリーのために種々の戦略が用いられる。一部の例では、ＣａｓおよびｇＲＮＡのコーディング配列が１つのＤＮＡプラスミドベクターに直接パッケージングされ、１つのＡＡＶ粒子を介して送達される。一部の例では、Ｃａｓを発現するように既に操作された細胞にｇＲＮＡを送達するためにＡＡＶを用いてよい。一部の例では、ＣａｓおよびｇＲＮＡのコーディング配列が分離された２つのＡＡＶ粒子の中で作製され、これが標的細胞の共トランスフェクションのために用いられる。一部の例では、マーカー、タグ、およびその他の配列を、Ｃａｓおよび／またはｇＲＮＡのコーディング配列として同じＡＡＶ粒子の中にパッケージングしてよい。
【0265】
レンチウイルス
本明細書のシステムおよび組成物は、レンチウイルスによって送達してよい。レンチウイルスベクターをそのようなデリバリーのために用いてよい。レンチウイルスは、有糸分裂細胞と有糸分裂後の細胞の両方に感染してそれらの遺伝子を発現する能力を有する複雑なレトロウイルスである。
本明細書のシステムおよび組成物は、レンチウイルスによって送達してよい。レンチウイルスベクターをそのようなデリバリーのために用いてよい。レンチウイルスは、有糸分裂細胞と有糸分裂後の細胞の両方に感染してそれらの遺伝子を発現する能力を有する複雑なレトロウイルスである。
【0266】
レンチウイルスの例には、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的とし得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、眼科の治療に用いられるウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）系の最小非霊長類レンチウイルスベクターが含まれる。ある特定の実施形態では、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的とするｓｉＲＮＡ、核小体局在ＴＡＲデコイ、および抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッドリボザイムを有する自己不活化レンチウイルスベクター［例えばＤｉＧｉｕｓｔｏら、（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照］を、本明細書の核酸標的システムに用いて、および／または適合させてよい。
【0267】
レンチウイルスは、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質等の他のウイルスタンパク質と疑似型化してよい。これを行なう場合、レンチウイルスの向細胞性を所望によって広くまたは狭くなるように変化させることができる。一部の場合には、安定性を改善するために、第２世代および第３世代のレンチウイルスシステムによって必須遺伝子を３つのプラスミドに分割してよく、これにより、細胞内での生きたウイルス粒子の偶発的な再構成の可能性が低減され得る。
【0268】
一部の例では、一体化能力を利用し、例えば遺伝子およびシグナル伝達経路のスクリーニングおよび／または研究のために、レンチウイルスを用いて種々の遺伝子改変を含む細胞のライブラリーを創成してよい。
【0269】
アデノウイルス
本明細書のシステムおよび組成物は、アデノウイルスによって送達してよい。アデノウイルスベクターをそのようなデリバリーのために用いてよい。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡゲノムを含む２０面体のヌクレオカプシドを有する非エンベロープウイルスを含む。アデノウイルスは、分裂性および非分裂性の細胞に感染し得る。一部の実施形態では、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに一体化されず、遺伝子編集の応用においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのオフターゲット効果を制限するために用いてよい。
本明細書のシステムおよび組成物は、アデノウイルスによって送達してよい。アデノウイルスベクターをそのようなデリバリーのために用いてよい。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡゲノムを含む２０面体のヌクレオカプシドを有する非エンベロープウイルスを含む。アデノウイルスは、分裂性および非分裂性の細胞に感染し得る。一部の実施形態では、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに一体化されず、遺伝子編集の応用においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのオフターゲット効果を制限するために用いてよい。
【0270】
非ウイルス媒体
デリバリー媒体は非ウイルス媒体を含んでよい。一般に、核酸および／またはタンパク質を送達することができる方法および媒体を、本明細書のシステム組成物を送達するために用いてよい。非ウイルス媒体の例には、脂質ナノ粒子、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、ＤＮＡナノクルー、金ナノ粒子、ストレプトリジン０、多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）、脂質コートメソポーラスシリカ粒子、およびその他の無機ナノ粒子が含まれる。
デリバリー媒体は非ウイルス媒体を含んでよい。一般に、核酸および／またはタンパク質を送達することができる方法および媒体を、本明細書のシステム組成物を送達するために用いてよい。非ウイルス媒体の例には、脂質ナノ粒子、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、ＤＮＡナノクルー、金ナノ粒子、ストレプトリジン０、多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）、脂質コートメソポーラスシリカ粒子、およびその他の無機ナノ粒子が含まれる。
【0271】
脂質粒子
デリバリー媒体は、脂質粒子、例えば脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）およびリポソームを含んでよい。
デリバリー媒体は、脂質粒子、例えば脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）およびリポソームを含んでよい。
【0272】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
ＬＮＰは、カチオン性脂質粒子（例えばリポソーム）の中に核酸をカプセル化し、比較的容易に細胞へ送達され得る。一部の例では、脂質ナノ粒子はウイルス成分を何ら含まず、それにより、安全性および免疫原性の懸念を最小化することを助ける。脂質粒子は、インビトロ、エクスビボ、およびインビボのデリバリーのために用いてよい。脂質粒子は、種々のスケールの細胞集団に用いてよい。
ＬＮＰは、カチオン性脂質粒子（例えばリポソーム）の中に核酸をカプセル化し、比較的容易に細胞へ送達され得る。一部の例では、脂質ナノ粒子はウイルス成分を何ら含まず、それにより、安全性および免疫原性の懸念を最小化することを助ける。脂質粒子は、インビトロ、エクスビボ、およびインビボのデリバリーのために用いてよい。脂質粒子は、種々のスケールの細胞集団に用いてよい。
【0273】
ＬＮＰは、当技術で既知の種々の方法、例えば有機相と水相を混合することによって、容易に調製することができる。２つの相の混合は、微小流体デバイスおよび衝突流反応器によって達成することができる。有機相と水相をより適切に混合することによって、ＬＮＰのより良い埋め込み速度と粒径分布が得られる。好ましくは、ＬＮＰの粒径は、有機相と水相の混合速度を変更することによって調節することができる。混合速度を速くすれば、より小さな粒径のＬＮＰが調製される。埋め込み効率は、ＬＮＰシステムのＮ／Ｐ比を制御することによって最適化できる。一部の好ましい実施形態では、Ｎ／Ｐ比は１：１～９：１である。
【0274】
一部の例では、ＬＮＰは、ＤＮＡ分子（例えばＣａｓおよび／またはｇＲＮＡのコーディング配列を含むＤＮＡ分子）および／またはＲＮＡ分子（例えばＣａｓのｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）を送達するために用いてよい。ある特定の場合には、ＬＮＰは、Ｃａｓ／ｇＲＮＡのＲＮＰ複合体を送達するために用いてよい。
【0275】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ［例えばＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ－３Ｌ）－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを含むｍＲＮＡ融合分子およびＶＥＧＦを標的とする少なくとも１つのｓｇＲＮＡ］を送達するために用いられる。
【0276】
ＬＮＰの成分は、カチオン性脂質、即ち１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－を含んでよい。一部の実施形態では、ＬＮＰはイオン化可能な脂質を含んでよい。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質には、それだけに限らないが、ｐＨ応答性のイオン化可能な脂質、熱応答性のイオン化可能な脂質、および光応答性のイオンが含まれる。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質には、それだけに限らないが、ｐＨ、温度、または光等のある種の条件の下でイオン化されるカチオン性脂質およびアニオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、ＬＮＰのイオン化可能な脂質のモル比は、２０％～７０％（約２０％～７０％、約２０％～６５％、約２０％～６０％、約２０％～５５％、約２０％～５０％、約２０％～４５％、約２０％～４０％、約２０％～３５％、約２０％～３０％、約２０％～２５％、約３０％～７０％、約３０％～６５％、約３０％～６０％、約３０％～５５％、約３０％～５０％、約３０％～４５％、約３０％～４０％、約３０％～３５％、約４０％～７０％、約４０％～６５％、約４０％～６０％、約４０％～５５％、約４０％～５０％、約４０％～４５％、約５０％～７０％、約５０％～６５％、約５０％～６０％、約５０％～５５％、約６０％～７０％、または約６０％～６５％）である。
【0277】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＰＥＧ化された脂質を含んでよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のＰＥＧ化脂質のモル比は、０％～約３０％（例えば約０％～約３０％、約０％～約２５％、約０％～約２０％、約０％～約１５％、約０％～約１０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約３０％、または約２０％～約２５％）である。
【0278】
一部の実施形態では、ＬＮＰは支持脂質を含んでよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中の支持脂質のモル比は、３０％～約５０％（例えば約３０％～約５０％、約３０％～約４５％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、約４０％～約５０％、または約４０％～約４５％）である。
【0279】
一部の実施形態では、ＬＮＰはコレステロールを含んでよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のコレステロールのモル比は、１０％～約５０％（例えば約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２０％～約２５％、約３０％～約５０％、約３０％～約４５％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、約４０％～約５０％、または約４０％～約４５％）である。
【0280】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質（モル比２０％～７０％）、ＰＥＧ化された脂質（モル比０％～３０％）、支持脂質（モル比３０％～５０％）、およびコレステロール（モル比１０％～５０％）の混合物を含んでよい。
【0281】
リポソーム
一部の実施形態では、脂質粒子はリポソームであってよい。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層または多層の脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層からなる球状の小胞構造である。一部の実施形態では、リポソームは、生体親和性、非毒性であり、親水性と親油性の両方の薬物分子を送達し、それらのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、それらのロードを生物学的膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を通して輸送することができる。
一部の実施形態では、脂質粒子はリポソームであってよい。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層または多層の脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層からなる球状の小胞構造である。一部の実施形態では、リポソームは、生体親和性、非毒性であり、親水性と親油性の両方の薬物分子を送達し、それらのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、それらのロードを生物学的膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を通して輸送することができる。
【0282】
リポソームは、いくつかの異なる型の脂質、例えばリン脂質から作製することができる。リポソームは、１，２－ジステアロリル（stearoryl）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、モノシアロガングリオシド、またはそれらの任意の組合せ等の、天然のリン脂質および脂質を含んでよい。
【0283】
リポソームの構造および特性を改変するために、他のいくつかの添加物をリポソームに加えてもよい。例えば、リポソームは、例えば安定性を増大するため、および／またはリポソームの内部カーゴの漏洩を防止するために、コレステロール、スフィンゴミエリン、および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）をさらに含んでよい。
【0284】
安定な核酸－脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）
一部の実施形態では、脂質粒子は、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）であってよい。ＳＮＡＬＰは、イオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）（例えば低いｐＨでカチオン性）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、拡散性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。一部の例では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、３－Ｎ－その他の脂質を含んでよい。
一部の実施形態では、脂質粒子は、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）であってよい。ＳＮＡＬＰは、イオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）（例えば低いｐＨでカチオン性）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、拡散性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。一部の例では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、３－Ｎ－その他の脂質を含んでよい。
【0285】
脂質粒子は、他の１つまたは複数の型の脂質、例えばアミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－リポプレックスおよび／またはポリプレックス等のカチオン性脂質を含んでもよい。
【0286】
一部の実施形態では、デリバリー媒体は、リポプレックスおよび／またはポリプレックスを含む。リポプレックスは、陰性に荷電した細胞膜に結合し、細胞内にエンドサイトーシスを誘導する。リポプレックスの例には、脂質および非脂質成分を含む複合体があり得る。リポプレックスおよびポリプレックスの例には、ＦｕＧＥＮＥ－６試薬、脂質およびその他の成分を含む非リポソーマル溶液、両性イオン性アミノ脂質（ＺＡＬ）、Ｃａ２ｐ（例えばＤＮＡ／Ｃａ２＋ミクロ複合体を形成する）、ポリエテンイミン（ＰＥＩ）（例えば分枝ＰＥＩ）、およびポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）が含まれる。
【0287】
細胞浸透性ペプチド
一部の実施形態では、デリバリー媒体は細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ＣＰＰは、種々の分子カーゴ（例えばナノサイズの粒子から小さな化学分子およびＤＮＡの大きな断片まで）の細胞内取り込みを容易にする短いペプチドである。
一部の実施形態では、デリバリー媒体は細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ＣＰＰは、種々の分子カーゴ（例えばナノサイズの粒子から小さな化学分子およびＤＮＡの大きな断片まで）の細胞内取り込みを容易にする短いペプチドである。
【0288】
ＣＰＰは、様々な寸法、アミノ酸配列、および電荷であってよい。一部の例では、ＣＰＰは原形質膜を転位させ、種々の分子カーゴの細胞質またはオルガネラへのデリバリーを容易にすることができる。ＣＰＰは、様々な機構、例えば膜における直接浸透、エンドサイトーシスによって媒介される進入、および過渡的構造の形成による転位を介して、細胞内に導入してよい。
【0289】
ＣＰＰは、高い相対的存在量のリジンまたはアルギニン等の陽性荷電のアミノ酸を含むか、または極性／荷電アミノ酸と非極性で疎水性のアミノ酸の交互のパターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有し得る。これら２つの型の構造は、それぞれポリカチオン性または両親媒性と称される。第３のクラスのＣＰＰは、低い正味電荷を有し非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであるか、または細胞への取り込みに重要な疎水性アミノ酸基を含む。もう一つの型のＣＰＰは、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）である。ＣＰＰの例には、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン、および（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘはアミノヘキサノイルを指す）が含まれる。ＣＰＰの例および関連する応用には、米国特許第８，３７２，９５１号に記載されたものも含まれる。
【0290】
ＣＰＰは、インビトロおよびエクスビボの仕事に極めて容易に用いることができ、それぞれのカーゴおよび細胞型のための広範囲の最適化が通常、必要である。一部の例では、ＣＰＰはＣａｓタンパク質に直接共有結合してよく、これは次にｇＲＮＡと複合体を形成して細胞に送達される。一部の例では、多数の細胞へのＣＰＰ－ＣａｓとＣＰＰ－ｇＲＮＡの個別のデリバリーを実施してよい。ＣＰＰはＲＮＰを送達する（delivery）ために用いてもよい。
【0291】
ＤＮＡナノクルー
一部の実施形態では、デリバリー媒体は、ＤＮＡナノクルーを含む。ＤＮＡナノクルーは、球状構造のＤＮＡ（例えばヤムイモの球の形状をもっている）を指す。ナノクルーは、構造の自己集合において助けとなる回文配列によるローリングサークル増幅によって合成してよい。次いで球にペイロードをロードしてよい。ＤＮＡナノクルーの例は、Ｓｕｎ Ｗら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；１３６（４２）：１４７２２～５ぺージ；およびＳｕｎ Ｗｅｔら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）：１２０２９～３３ぺージに記載されている。ＤＮＡナノクルーは、Ｃａｓ：ｇＲＮＡリボヌクレオプロテイン複合体の中のｇＲＮＡと部分的に相補的であるべき回文配列を有し得る。ＤＮＡナノクルーは、エンドソーム脱出を誘導するためにコーティング、例えばＰＥＩによってコーティングしてよい。
一部の実施形態では、デリバリー媒体は、ＤＮＡナノクルーを含む。ＤＮＡナノクルーは、球状構造のＤＮＡ（例えばヤムイモの球の形状をもっている）を指す。ナノクルーは、構造の自己集合において助けとなる回文配列によるローリングサークル増幅によって合成してよい。次いで球にペイロードをロードしてよい。ＤＮＡナノクルーの例は、Ｓｕｎ Ｗら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；１３６（４２）：１４７２２～５ぺージ；およびＳｕｎ Ｗｅｔら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）：１２０２９～３３ぺージに記載されている。ＤＮＡナノクルーは、Ｃａｓ：ｇＲＮＡリボヌクレオプロテイン複合体の中のｇＲＮＡと部分的に相補的であるべき回文配列を有し得る。ＤＮＡナノクルーは、エンドソーム脱出を誘導するためにコーティング、例えばＰＥＩによってコーティングしてよい。
【0292】
金ナノ粒子
一部の実施形態では、デリバリー媒体は、金ナノ粒子（ＡｕＮＰまたはコロイド状金とも称する）を含む。金ナノ粒子は、カーゴ、例えばＣａｓ：ｇＲＮＡ ＲＮＰと複合体を形成し得る。金ナノ粒子は、コーティング、例えばシリケートおよびエンドソーム破壊ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）によるコーティングを行なってよい。金ナノ粒子の例には、ＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＳｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ［ＳＮＡ（商標）］コンストラクト、およびＭｏｕｔ Ｒ，ら（２０１７）．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：２４５２～８ぺージ；Ｌｅｅ Ｋ，ら（２０１７）．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １：８８９～９０１ぺージに記載されたものが含まれる。
一部の実施形態では、デリバリー媒体は、金ナノ粒子（ＡｕＮＰまたはコロイド状金とも称する）を含む。金ナノ粒子は、カーゴ、例えばＣａｓ：ｇＲＮＡ ＲＮＰと複合体を形成し得る。金ナノ粒子は、コーティング、例えばシリケートおよびエンドソーム破壊ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）によるコーティングを行なってよい。金ナノ粒子の例には、ＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＳｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ［ＳＮＡ（商標）］コンストラクト、およびＭｏｕｔ Ｒ，ら（２０１７）．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：２４５２～８ぺージ；Ｌｅｅ Ｋ，ら（２０１７）．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １：８８９～９０１ぺージに記載されたものが含まれる。
【0293】
ｉＴＯＰ
一部の実施形態では、デリバリー媒体はｉＴＯＰを含む。ｉＴＯＰは、いずれの形質導入ペプチドにも依存せずに、天然のタンパク質の細胞内への高度に効率的なデリバリーを駆動する小分子の組合せを指す。ｉＴＯＰは、オスモサイトーシスおよびプロパンベタインによる形質導入の誘導に用いられ、ＮａＣｌに媒介される高浸透圧と形質導入化合物（プロパンベタイン）の併用によって、細胞外高分子の細胞内へのマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘発する。ｉＴＯＰ法および試薬の例には、Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ ＤＳ，Ｐａｇｌｉｅｒｏ ＲＪ，Ｐｒａｓ Ａら、（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：６７４～６９０ぺージに記載されたものが含まれる。
一部の実施形態では、デリバリー媒体はｉＴＯＰを含む。ｉＴＯＰは、いずれの形質導入ペプチドにも依存せずに、天然のタンパク質の細胞内への高度に効率的なデリバリーを駆動する小分子の組合せを指す。ｉＴＯＰは、オスモサイトーシスおよびプロパンベタインによる形質導入の誘導に用いられ、ＮａＣｌに媒介される高浸透圧と形質導入化合物（プロパンベタイン）の併用によって、細胞外高分子の細胞内へのマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘発する。ｉＴＯＰ法および試薬の例には、Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ ＤＳ，Ｐａｇｌｉｅｒｏ ＲＪ，Ｐｒａｓ Ａら、（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：６７４～６９０ぺージに記載されたものが含まれる。
【0294】
ポリマー系粒子
一部の実施形態では、デリバリー媒体はポリマー系粒子（例えばナノ粒子）を含んでよい。一部の実施形態では、ポリマー系粒子は膜融合のウイルス機構を模倣し得る。ポリマー系粒子はインフルエンザウイルスの機構の合成コピーであってよく、酸性コンパートメントの形成が関与するプロセスであるエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれる種々の型の核酸（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ）とトランスフェクション複合体を形成する。後期エンドソームの低いｐＨは、粒子表面を疎水性にし、膜の横断を容易にする化学的スイッチとして作用する。いったんサイトゾルに入れば、粒子は細胞作用のためにそのペイロードを放出する。この活性エンドソーム脱出技術は天然の取り込み経路を用いているので、安全であり、トランスフェクション効率を最大化する。一部の実施形態では、ポリマー系粒子は、アルキル化およびカルボキシアルキル化された分枝ポリエチレンイミンを含んでよい。一部の例では、ポリマー系粒子は、ＶＩＲＯＭＥＲ、例えばＶＩＲＯＭＥＲ ＲＮＡｉ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＲＥＤ、ＶＩＲＯＭＥＲ ｍＲＮＡ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＣＲＩＳＰＲである。本明細書のシステムおよび組成物を送達する方法の例には、Ｂａｗａｇｅ ＳＳら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｃａｓｌ３ａ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｌ０．ｌ ｌ０１／３７０４６０ｖ１．ｆｕｌｌ ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３７０４６０、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ，ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．１６９９３．６１２８１、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－Ｆａｃｔｂｏｏｋ ２０１８：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｕｓｅｒｓ’ ｄａｔａ．，ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．２３９１２．１６６４２に記載されたものが含まれる。
一部の実施形態では、デリバリー媒体はポリマー系粒子（例えばナノ粒子）を含んでよい。一部の実施形態では、ポリマー系粒子は膜融合のウイルス機構を模倣し得る。ポリマー系粒子はインフルエンザウイルスの機構の合成コピーであってよく、酸性コンパートメントの形成が関与するプロセスであるエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれる種々の型の核酸（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ）とトランスフェクション複合体を形成する。後期エンドソームの低いｐＨは、粒子表面を疎水性にし、膜の横断を容易にする化学的スイッチとして作用する。いったんサイトゾルに入れば、粒子は細胞作用のためにそのペイロードを放出する。この活性エンドソーム脱出技術は天然の取り込み経路を用いているので、安全であり、トランスフェクション効率を最大化する。一部の実施形態では、ポリマー系粒子は、アルキル化およびカルボキシアルキル化された分枝ポリエチレンイミンを含んでよい。一部の例では、ポリマー系粒子は、ＶＩＲＯＭＥＲ、例えばＶＩＲＯＭＥＲ ＲＮＡｉ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＲＥＤ、ＶＩＲＯＭＥＲ ｍＲＮＡ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＣＲＩＳＰＲである。本明細書のシステムおよび組成物を送達する方法の例には、Ｂａｗａｇｅ ＳＳら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｃａｓｌ３ａ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｌ０．ｌ ｌ０１／３７０４６０ｖ１．ｆｕｌｌ ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３７０４６０、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ，ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．１６９９３．６１２８１、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－Ｆａｃｔｂｏｏｋ ２０１８：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｕｓｅｒｓ’ ｄａｔａ．，ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．２３９１２．１６６４２に記載されたものが含まれる。
【0295】
ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）
デリバリー媒体はストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）であってよい。ＳＬＯは、哺乳動物の細胞膜に細孔を創成することによって働く、グループＡストレップトコッカスによって産生される毒素である。ＳＬＯは可逆的な様式で作用し、全体の生存率を犠牲にすることなく、細胞のサイトゾルへのタンパク質（例えば１００ｋＤａまで）のデリバリーを可能にする。ＳＬＯの例には、Ｓｉｅｒｉｇ Ｇら、（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：４４６～５５ぺージ；Ｗａｌｅｖ Ｉら、（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：３１８５～９０ぺージ；Ｔｅｎｇ ＫＷら、（２０１７）Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２５４６０に記載されたものが含まれる。
デリバリー媒体はストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）であってよい。ＳＬＯは、哺乳動物の細胞膜に細孔を創成することによって働く、グループＡストレップトコッカスによって産生される毒素である。ＳＬＯは可逆的な様式で作用し、全体の生存率を犠牲にすることなく、細胞のサイトゾルへのタンパク質（例えば１００ｋＤａまで）のデリバリーを可能にする。ＳＬＯの例には、Ｓｉｅｒｉｇ Ｇら、（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：４４６～５５ぺージ；Ｗａｌｅｖ Ｉら、（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：３１８５～９０ぺージ；Ｔｅｎｇ ＫＷら、（２０１７）Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２５４６０に記載されたものが含まれる。
【0296】
多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）
デリバリー媒体は多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）を含んでよい。ＭＥＮＤは、凝縮プラスミドＤＮＡ、ＰＬＬコア、および脂質フィルムシェルを含んでよい。ＭＥＮＤは、細胞浸透性ペプチド（例えばステアリルオクタアルギニン）をさらに含んでよい。細胞浸透性ペプチドは、脂質シェルの中に存在してよい。脂質エンベロープは、１つまたは複数の機能性成分、例えばポリエチレングリコール（例えば血管循環時間を増大させるため）、特定の組織／細胞を標的化するためのリガンド、さらなる細胞浸透性ペプチド（例えば細胞デリバリーをより大きくするため）、エンドソーム脱出を増強するための脂質、および核デリバリータグの１つまたは複数によって改変してもよい。一部の例では、ＭＥＮＤはテトララメラＭＥＮＤ（Ｔ－ＭＥＮＤ）であってよく、これは細胞核およびミトコンドリアを標的とし得る。ある特定の例では、ＭＥＮＤはＰＥＧ－ペプチド－ＤＯＰＥコンジュゲートＭＥＮＤ（ＰＰＤ－ＭＥＮＤ）であってよく、これは膀胱がん細胞を標的とし得る。ＭＥＮＤの例には、Ｋｏｇｕｒｅ Ｋら、（２００４）．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ９８：３１７～２３ぺージ；Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔら、（２０１２）．Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ４５：１１１３～２１ぺージに記載されたものが含まれる。
デリバリー媒体は多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）を含んでよい。ＭＥＮＤは、凝縮プラスミドＤＮＡ、ＰＬＬコア、および脂質フィルムシェルを含んでよい。ＭＥＮＤは、細胞浸透性ペプチド（例えばステアリルオクタアルギニン）をさらに含んでよい。細胞浸透性ペプチドは、脂質シェルの中に存在してよい。脂質エンベロープは、１つまたは複数の機能性成分、例えばポリエチレングリコール（例えば血管循環時間を増大させるため）、特定の組織／細胞を標的化するためのリガンド、さらなる細胞浸透性ペプチド（例えば細胞デリバリーをより大きくするため）、エンドソーム脱出を増強するための脂質、および核デリバリータグの１つまたは複数によって改変してもよい。一部の例では、ＭＥＮＤはテトララメラＭＥＮＤ（Ｔ－ＭＥＮＤ）であってよく、これは細胞核およびミトコンドリアを標的とし得る。ある特定の例では、ＭＥＮＤはＰＥＧ－ペプチド－ＤＯＰＥコンジュゲートＭＥＮＤ（ＰＰＤ－ＭＥＮＤ）であってよく、これは膀胱がん細胞を標的とし得る。ＭＥＮＤの例には、Ｋｏｇｕｒｅ Ｋら、（２００４）．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ９８：３１７～２３ぺージ；Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔら、（２０１２）．Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ４５：１１１３～２１ぺージに記載されたものが含まれる。
【0297】
脂質コートメソポーラスシリカ粒子
デリバリー媒体は脂質コートメソポーラスシリカ粒子を含んでよい。脂質コートメソポーラスシリカ粒子は、メソポーラスシリカナノ粒子コアおよび脂質膜シェルを含んでよい。シリカコアは大きな内部表面積を有し、高いカーゴローディング容量をもたらし得る。一部の実施形態では、細孔径、細孔化学、および全体の粒子サイズを、様々な型のカーゴをロードするために改変してよい。粒子の脂質コーティングは、カーゴローディングを最大化し、循環時間を増大させ、正確な標的化およびカーゴ放出を提供するために、改変してもよい。脂質コートメソポーラスシリカ粒子の例には、Ｄｕ Ｘら、（２０１４）．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５：５５８０～９０ぺージ；Ｄｕｒｆｅｅ ＰＮら、（２０１６）．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １０：８３２５～４５ぺージに記載されたものが含まれる。
デリバリー媒体は脂質コートメソポーラスシリカ粒子を含んでよい。脂質コートメソポーラスシリカ粒子は、メソポーラスシリカナノ粒子コアおよび脂質膜シェルを含んでよい。シリカコアは大きな内部表面積を有し、高いカーゴローディング容量をもたらし得る。一部の実施形態では、細孔径、細孔化学、および全体の粒子サイズを、様々な型のカーゴをロードするために改変してよい。粒子の脂質コーティングは、カーゴローディングを最大化し、循環時間を増大させ、正確な標的化およびカーゴ放出を提供するために、改変してもよい。脂質コートメソポーラスシリカ粒子の例には、Ｄｕ Ｘら、（２０１４）．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５：５５８０～９０ぺージ；Ｄｕｒｆｅｅ ＰＮら、（２０１６）．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １０：８３２５～４５ぺージに記載されたものが含まれる。
【0298】
無機ナノ粒子
デリバリー媒体は無機ナノ粒子を含んでよい。無機ナノ粒子の例には、炭素ナノチューブ （ＣＮＴ）［例えばＢａｔｅｓ Ｋａｎｄ Ｋｏｓｔａｒｅｌｏｓ Ｋ．（２０１３）．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６５：２０２３～３３ぺージに記載されている］、裸のメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）［例えばＬｕｏ ＧＦら、（２０１４）．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４：６０６４ぺージに記載されている］、および緻密なシリカナノ粒子（ＳｉＮＰ）［Ｌｕｏ ＤおよびＳａｌｔｚｍａｎ ＷＭ．（２０００）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：８９３～５ぺージに記載されている］が含まれる。
デリバリー媒体は無機ナノ粒子を含んでよい。無機ナノ粒子の例には、炭素ナノチューブ （ＣＮＴ）［例えばＢａｔｅｓ Ｋａｎｄ Ｋｏｓｔａｒｅｌｏｓ Ｋ．（２０１３）．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６５：２０２３～３３ぺージに記載されている］、裸のメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）［例えばＬｕｏ ＧＦら、（２０１４）．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４：６０６４ぺージに記載されている］、および緻密なシリカナノ粒子（ＳｉＮＰ）［Ｌｕｏ ＤおよびＳａｌｔｚｍａｎ ＷＭ．（２０００）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：８９３～５ぺージに記載されている］が含まれる。
【0299】
使用の方法
本明細書の組成物およびシステムは、植物および真菌等の非動物生命体の改変、および動物の改変、植物、動物、およびヒトにおける疾患の処置および診断を含む種々の適用のために用いてよい。一般に、組成物およびシステムを、細胞、組織、器官、または生命体に導入してよく、そこで１つまたは複数の遺伝子の発現および／または活性が改変される。
本明細書の組成物およびシステムは、植物および真菌等の非動物生命体の改変、および動物の改変、植物、動物、およびヒトにおける疾患の処置および診断を含む種々の適用のために用いてよい。一般に、組成物およびシステムを、細胞、組織、器官、または生命体に導入してよく、そこで１つまたは複数の遺伝子の発現および／または活性が改変される。
【0300】
細胞および生命体
本開示は、操作されたＣａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞、組織、生命体を提供する。本開示は、本明細書に記載した方法または組成物のいずれかにおける真核生物または真核細胞における発現のためにコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本開示の一実施形態では、コドン最適化されたエフェクタータンパク質は、本明細書で論じる任意のＣａｓタンパク質であり、真核細胞または生命体、例えば本明細書の他の箇所で述べた細胞または生命体、例えば限定するものではないが酵母細胞またはマウス細胞、ラット細胞、およびヒト細胞を含む哺乳動物の細胞もしくは生命体または非ヒト真核生命体、例えば植物における作動可能性のためにコドン最適化される。
本開示は、操作されたＣａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞、組織、生命体を提供する。本開示は、本明細書に記載した方法または組成物のいずれかにおける真核生物または真核細胞における発現のためにコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本開示の一実施形態では、コドン最適化されたエフェクタータンパク質は、本明細書で論じる任意のＣａｓタンパク質であり、真核細胞または生命体、例えば本明細書の他の箇所で述べた細胞または生命体、例えば限定するものではないが酵母細胞またはマウス細胞、ラット細胞、およびヒト細胞を含む哺乳動物の細胞もしくは生命体または非ヒト真核生命体、例えば植物における作動可能性のためにコドン最適化される。
【0301】
ある特定の実施形態では、目的の標的遺伝子座の改変は、少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の発現が増大している、少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の発現が減少している、少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む真核細胞、または編集されたゲノムを含む真核細胞をもたらし得る。
【0302】
ある特定の実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞であってよい。
【0303】
さらなる実施形態では、本明細書に記載した天然に存在しないもしくは操作された組成物、ベクターシステム、またはデリバリーシステムを、部位特異的遺伝子ノックアウト、部位特異的ゲノム編集、ＲＮＡ配列特異的干渉、またはマルチプレックスゲノム操作のために用いてよい。
【0304】
本明細書に記載した細胞、細胞株、または生命体からの遺伝子産物も提供される。ある特定の実施形態では、発現される遺伝子産物の量は、変化した発現または編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物の量より多いことも少ないこともある。ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、変化した発現または編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物と比較して変化することがある。
【0305】
例示的な療法
本開示は、種々の疾患および障害における処置のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載した本開示は、ＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦＡ）遺伝子を調節するために細胞がＣＲＩＳＰＲまたは塩基エディターによってエクスビボで編集され、引き続いて編集された細胞がそれを必要とする患者に投与される、治療のための方法に関する。一部の実施形態では、編集は細胞内のＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦＡ）遺伝子の発現をノッキングイン、ノッキングアウト、またはノッキングダウンすることを含む。
本開示は、種々の疾患および障害における処置のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載した本開示は、ＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦＡ）遺伝子を調節するために細胞がＣＲＩＳＰＲまたは塩基エディターによってエクスビボで編集され、引き続いて編集された細胞がそれを必要とする患者に投与される、治療のための方法に関する。一部の実施形態では、編集は細胞内のＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦＡ）遺伝子の発現をノッキングイン、ノッキングアウト、またはノッキングダウンすることを含む。
【0306】
一部の実施形態では、本明細書に記載したＶＥＧＦＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＥＧＦＡによって媒介される細胞プロセスを阻害するために有用であり、ＶＥＧＦＡまたはＶＥＧＦＡ関連受容体の作用によって刺激される異常な血管新生および／またはリンパ管新生に付随する障害（例えば種々の眼科障害およびがん）の予防または治療のための適応を有する。
【0307】
少なくとも１つのＤＮＡ結合性タンパク質および遺伝子発現の少なくとも１つのモジュレーターを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸配列、およびＶＥＧＦ遺伝子の近傍および／またはＶＥＧＦ制御エレメント内のＤＮＡ配列を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡを含む、本明細書に記載したＶＥＧＦＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＥＧＦ－Ａの除去、阻害、または低減によって改善され、改良され、阻害され、または防止される状態の任意の疾患を処置または防止するために治療的に有用である。
【0308】
ＶＥＧＦＡの阻害または低減によって改善される特定の条件の非網羅的なリストには、外傷、発作、もしくは腫瘍に伴う脳浮腫等の血管内皮細胞の過剰な増殖、血管透過性、浮腫、乾癬もしくはリウマチ性関節炎を含む関節炎等の炎症性障害に伴う浮腫、喘息、熱傷に伴う全身性浮腫、腫瘍、炎症、もしくは外傷に伴う腹水および胸水、慢性気道炎症、毛細血管漏出症候群、敗血症、タンパク質の漏出の増大に伴う腎疾患、ならびに加齢性黄斑変性症および糖尿病性網膜症等の眼科障害によって特徴付けられる臨床状態が含まれる。
【0309】
「新生血管障害」は、変化した、異常調節された、または調節されない血管新生によって特徴付けられる障害または疾患の状態である。新生血管障害の例には、新生形質転換（例えばがん）および糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性症を含む眼科の新生血管障害が含まれる。
【0310】
「眼科の新生血管障害」は、患者の眼における変化した、異常調節された、または調節されない血管新生によって特徴付けられる障害である。そのような障害には、視神経円板の血管新生、虹彩の血管新生、網膜の血管新生、脈絡膜の血管新生、角膜の血管新生、硝子体の血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性、ぶどう膜炎、網膜の炎症性疾患、および増殖性硝子体網膜症が含まれる。
【0311】
一部の実施形態では、本明細書で開示した組成物および方法によって処置されるべき疾患は、血管新生（血管の形成）を伴う。一部の実施形態では、疾患は新生血管障害、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む眼科の血管新生障害であり、ドライＡＭＤおよびウェットＡＭＤを含む。
【実施例】
【0312】
［実施例１］
融合分子プラスミドの構築およびノックダウン効率
融合分子プラスミドの構築およびノックダウン効率
【0313】
「ＥＰＩＣＡＳ」システムを形成するために２つのプラスミドを構築した（図１Ａ）。「融合分子」または「触媒タンパク質」プラスミドは、ｄＣａｓ９、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、およびＫＲＡＢペプチドをコードする。融合したＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｌ（３Ａ３Ｌ）ペプチドはｄＣａｓ９のＮ末端に存在し、ＫＲＡＢはｄＣａｓ９のＣ末端に存在する。即ち、融合分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、３Ａ３Ｌ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを有する。「ｓｇＲＮＡ」プラスミドは、ＶＥＧＦａ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列をコードする。「スカフォールド」は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の遺伝子またはプロモーターの配列である。マウスＶＥＧＦａ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流および下流２５０ｂｐ以内の領域を標的とするために多数のｓｇＲＮＡを設計した。具体的には、７種のｓｇＲＮＡ（配列番号２９～３５）を設計し、引き続くトランスフェクションのために対応するｓｇＲＮＡプラスミドを生成した。
【0314】
個別のｓｇＲＮＡプラスミドを、触媒タンパク質のプラスミドとともにマウスＮ２Ａ細胞株（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に共トランスフェクトした。４８時間後、上位１０％のＧＦＰ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋の細胞をＦＡＣＳによって選別した。ＶＥＧＦａのｍＲＮＡ発現レベルを評価するためにＲＴ－ＱＰＣＲ実験を実施した。試験した７種のｓｇＲＮＡ全てが、Ｎ２Ａ細胞内で有意に下方制御されたＶＥＧＦの発現を示し、約８０％のノックダウン効率を示した。その中で、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ５、およびｓｇＲＮＡ７をトランスフェクトした細胞が、約８４％に達する最良のノックダウン効果を示した（図１Ｂ）。
【0315】
次に、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、およびｓｇＲＮＡ５を、長期にわたるノックダウン効果の保持をさらに試験するために選択した。ｓｇＲＮＡプラスミドを、触媒タンパク質のプラスミドとともにマウスＮ２Ａ細胞株に共トランスフェクトした。４８時間後に、上位１０％のＧＦＰ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋の細胞をＦＡＣＳによって選別し、培養を継続した。１週間後に細胞を収集し、ＶＥＧＦａのｍＲＮＡ発現レベルを評価するためにＲＴ－ＱＰＣＲ実験を実施した。結果は、遺伝子サイレンシング効果がトランスフェクションの４８時間後と比較して保持され、改善さえされて、９０％超に達したことを示した（図１Ｃ）。ＶＥＧＦａ ｍＲＮＡは細胞内で比較的長い半減期を有し、既存のＶＥＧＦａ ｍＲＮＡの分解および新たなＶＥＧＦａ ｍＲＮＡの合成の妨害の両方が、１週間後のＶＥＧＦａ ｍＲＮＡの低いレベルに寄与していることが推測される。
【0316】
さらに、２つ以上のｓｇＲＮＡの組合せがＮ２Ａ細胞におけるＶＥＧＦａの遺伝子発現レベルをさらに低減させ得るか否かを決定するために、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、およびｓｇＲＮＡ５の組合せ（ｓｇＭｉｘ）を試験した。結果は、ｓｇＭｉｘがＶＥＧＦａの発現レベルを有意にノックダウンすることを示した（図１Ｃ）。
［実施例２］
融合分子をコードするｍＲＮＡのインビトロ転写
［実施例２］
融合分子をコードするｍＲＮＡのインビトロ転写
【0317】
インビトロの転写および精製を用いて、ＥＰＩＣＡＳシステムの融合分子または触媒タンパク質に対応するｍＲＮＡを産生した。最初に、５’ＵＴＲ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－３’ＵＴＲ－ポリＡのカセットを含む融合分子エレメントの全てを含むプラスミドを構築した。プラスミド配列は、ＸｂａＩおよびＢｐｉＩ制限酵素消化によって直線化した（図２Ａ）。直線化したＤＮＡ鋳型、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、およびキャップアナログを含むインビトロ転写反応を実施して、Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含むｍＲＮＡを産生した。ＤＮａｓｅ ＩによってＤＮＡ鋳型を消化した後、ｍＲＮＡ産生物を精製して緩衝液を交換し、最終ｍＲＮＡ産生物の純度をキャピラリーゲル電気泳動によって評価した（図２Ｂ）。１００マーのｓｇＲＮＡは、市販供給元（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）による固相合成条件の下での最小末端改変によって化学合成した。
【0318】
インビトロで転写されたｍＲＮＡの機能を試験するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＳｎｒｐｎ－ＧＦＰレポーターシステムを構築した。レポーターシステムは、合成のメチル化センシングプロモーター（刷り込み遺伝子Ｓｎｒｐｎのプロモーター由来の保存された配列エレメント）を用いて、ＧＦＰの発現を制御する。このレポーターコンストラクトをゲノム遺伝子座に挿入することによって、近傍の配列のメチル化状態が示された。リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸを用いて、上記のインビトロで転写されたｍＲＮＡ（ＧＦＰ－Ｐ２Ａ－Ｃａｓｏｆｆ ｍＲＮＡ）を、Ｓｎｒｐｎ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡとともにマウス一次肝細胞に共トランスフェクトクトした（図２Ｃ、左パネル）。ＦＡＣＳ解析によって、ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡによるトランスフェクションの７２時間後にＧＦＰ＋細胞の割合が有意に増大することが示され、マウス肝細胞内でリポーターシステムが成功裡に確立されたことが示唆された（図２Ｃ、中央パネル）。さらに、トランスフェクションの７２時間後のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの発現レベルは明らかに低減していた（図２Ｃ、右パネル）。
【0319】
総合して、これらの結果は、ＥＰＩＣＡＳ ｍＲＮＡが、過渡的トランスフェクションを用いて長期間にわたってＶＥＧＦＡの発現をサイレンシングさせることができることを示している。
［実施例３］
融合分子をコードするｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子カプセル化
［実施例３］
融合分子をコードするｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子カプセル化
【0320】
当技術で既知の標準的な方法を用いて、融合分子ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡをマウス脈絡膜に送達するためのＬＮＰを製剤化した。ＬＮＰは、融合分子ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを１：１の重量比で含んでいた（図３Ａ）。イオン化可能な脂質（モル比４９．５％）、ＰＥＧ化脂質（モル比２．５％）、支持脂質（ＤＰＰＣ）（モル比９．９％）、およびコレステロール（モル比３８．１％）の混合物、即ち脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、適切に設計された衝突流反応器または微小流体デバイスを用いて製剤化した。イオン化可能な脂質の割合を変更することによって、ｓｇＲＮＡとｍＲＮＡの放出速度を改変することができる。イオン化可能な脂質の割合を多くすることによって（モル比５５％超）、ｓｇＲＮＡはｍＲＮＡより速く放出された。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像により、ＬＮＰが球状でナノサイズの粒子であることが示された（図３Ｂ）。ＬＮＰは、動的光散乱（ＮａｎｏＳＺ社、Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて、均一なサイズ（７８．２±５．２ｎｍ、ＰＤＩ＜０．１０）を有していた（図３Ｃ）。
【0321】
ＬＮＰがインビボでｍＲＮＡを後網膜および脈絡膜の領域に成功裡に送達することができるか否かを試験するため、ルシフェラーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰを産生し、Ａｉ９マウス（Ｊａｘ Ｌａｂ社）の眼に硝子体内注射によって投与した。ＥＦ１Ａ－Ｃｒｅ－ＧＦＰを発現するＡＡＶ８ウイルスを陽性対照として用い、ＰＢＳを陰性対照として用いた。蛍光のインビボイメージング結果により、ＬＮＰはｍＲＮＡを極めて効率的な様式で網膜色素上皮（ＲＰＥ）および脈絡膜に送達できることが示された（図３Ｄ）。陽性対照ＡＡＶ８は、ＲＰＥおよび脈絡膜に効率的に感染できた。
［実施例４］
マウスにおける融合分子をコードするｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡのＬＮＰデリバリーを用いるＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシング
［実施例４］
マウスにおける融合分子をコードするｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡのＬＮＰデリバリーを用いるＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシング
【0322】
ＬＮＰによって送達されるｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡがＶＥＧＦａ ｍＲＮＡのレベルを成功裡にノックダウンできるか否かを試験するため、ＥＰＩＣＡＳ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ３を含むＬＮＰを産生し、Ａｉ９マウスの眼に硝子体内注射によって投与した。注射の５日後にマウスを安楽死させ、網膜および脈絡膜を取得して、ｍＲＮＡの精製のために処理した。ＲＴ－ＱＰＣＲ実験を実施して、ＶＥＧＦａのｍＲＮＡ発現レベルを評価した。
【0323】
結果は、対照ＰＢＳ群と比較して、脈絡膜におけるＶＥＧＦａの有意に下方制御された発現を示し（図３Ｅ）、インビボにおけるＶＥＧＦ遺伝子発現をサイレンシングするＥＰＩＣＡＳシステムの有効性が示された。他方、網膜におけるＶＥＧＦａの発現の低減は対照群と比較して有意ではなく、遺伝子発現の低減における脈絡膜の潜在的な選好性が示された。
［実施例５］
ウサギ細胞におけるウサギＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシング
［実施例５］
ウサギ細胞におけるウサギＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシング
【0324】
ウサギＶＥＧＦａ ｓｇＲＮＡ（配列番号６０～８４）をスクリーニングするためのレポーターシステムを確立した。ウサギＶＥＧＦａ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流５００ｂｐから第１エクソンまでおよび第１エクソンのＣ末端のＧＦＰを含む人工配列を構築した（図４Ａ）。ピギーバックトランスポゾンシステムを用いて、人工配列を２９３Ｔ細胞のゲノムに一体化した。ＧＦＰを安定的にトランスフェクトした細胞株が得られ、これをｓｇＲＮＡのスクリーニングに用いた。この実験において、レポーター細胞をＥＰＩＣＡＳプラスミドおよびｓｇＲＮＡでトランスフェクトし、７２時間後にレポーター細胞の蛍光強度を検出した。フローサイトメトリー解析の結果は、大部分のｓｇＲＮＡがＧＦＰの強度を有意に低下させたことを示した（図４Ｂ）。良好なノックダウン効果を有していたｓｇＲＮＡの６種のうち４種を、ＥＰＩＣＡＳプラスミドとともにウサギＲＫ－１３細胞にトランスフェクトし、ウサギ細胞内の内因性遺伝子ＶＥＧＦＡを標的とした。ＱＰＣＲの結果は、これらのｓｇＲＮＡがＲＫ－１３細胞内のＶＥＧＦＡのｍＲＮＡ発現を有意に低減させたことを示した（図４Ｃ）。
［実施例６］
ヒト細胞株におけるヒトＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシング
［実施例６］
ヒト細胞株におけるヒトＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシング
【0325】
ヒト細胞株におけるＶＥＧＦ遺伝子サイレンシングの有効性を試験するため、レポーター細胞株を構築した。ＣＭＶプロモーターで駆動されるカセットを有するようにプラスミドを構築した。ここでカセットは以下のエレメントを５’から３’の方向で有していた。５’－ｐＣＭＶ－３００ｂｐ－ＴＳＳ－＋３００ｂｐ－ＶＥＧＦエクソン１－２Ａ－ＧＦＰ－３’。このレポーターシステムにおいて、ＣＭＶプロモーターはＶＥＧＦおよびＧＦＰ蛍光の発現を駆動する。ＶＥＧＦがサイレンシングされれば、ＧＦＰの転写が終止する。ピギーバックトランスポザーゼ（ＰＢａｓｅ）プラスミドとともに、レポータープラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。レポーターカセットの一体化に成功した細胞を、ＧＦＰ蛍光の発現によってＦＡＣＳで選別した。
【0326】
サルおよびヒトのＶＥＧＦ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流および下流の３００ｂｐ内の相同領域を標的とするように多数のｓｇＲＮＡを設計した（図５Ａ）。２３個のｓｇＲＮＡ（配列番号３６～５８）を、ｓｇＲＮＡのそれぞれ１つをコードするプラスミドの構築のために選択した。個別のｓｇＲＮＡプラスミドを、触媒タンパク質（ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ）プラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。４８時間または９６時間後、ＧＦＰ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋二重陽性細胞をＦＡＣＳによって選別した。ＲＴ－ＱＰＣＲ実験を実施して、ＶＥＧＦａのｍＲＮＡ発現レベルを評価した。
【0327】
試験した大部分のｓｇＲＮＡは、２９３Ｔ細胞内で有意に下方制御されたＶＥＧＦａの発現を示した（図５Ｂ）。ｓｇＲＮＡ１０、ｓｇＲＮＡ１９、ｓｇＲＮＡ２０、ｓｇＲＮＡ２１、ｓｇＲＮＡ２２、およびｓｇＲＮＡ２３をトランスフェクトした細胞が、４８時間後に５０％を超えるＶＥＧＦａの下方制御をもたらした。９６時間後にはＶＥＧＦＡの発現レベルは低くなり、ｓｇＲＮＡ１９、ｓｇＲＮＡ２０、およびｓｇＲＮＡ２２は８０％を超える下方制御に達した。
【0328】
総合して、これらの結果は、ＥＰＩＣＡＳシステムが、マウス細胞とヒト細胞の両方において高い効率および持続性でＶＥＧＦＡの発現を成功裡にサイレンシングしたことを示し、遺伝子外編集によるＶＥＧＦ遺伝子の発現のサイレンシングを支持している。ＬＮＰは、ＥＰＩＣＡＳシステムをインビボで成功裡に送達するために用いられた。したがって、ＥＰＩＣＡＳシステムのＬＮＰ製剤は、ＡＭＤ等のＶＥＧＦ関連疾患の処置に用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】