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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】病原体検出システム
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20250117BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20250117BHJP
C12Q 1/682 20180101ALI20250117BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 B ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/682 Z
C12Q1/689 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542347
(86)(22)【出願日】2023-01-12
(85)【翻訳文提出日】2024-07-12
(86)【国際出願番号】 US2023060530
(87)【国際公開番号】W WO2023137362
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】18/153,260
(32)【優先日】2023-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/299,156
(32)【優先日】2022-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524266766
【氏名又は名称】ウィットワース ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ エス．メザー
(72)【発明者】
【氏名】ケント ジョーンズ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029FA01
4B029FA02
4B029FA03
4B029GA03
4B029GB01
4B029GB02
4B029GB09
4B029GB10
4B029HA09
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
病原体検出システムのためのシステムおよび装置が本明細書に記載される。例えば、病原体検出システムは、入口、出口、および反応チャンバを含む病原体検出装置；励起源および蛍光検出システムを含む撮像システム；基板；および加熱要素を含み得る。いくつかの例において、病原体検出システムは、サンプル中の１つ以上の病原体および／またはウイルスを検出するように構成され得る。例えば、病原体検出装置は、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一方を含む溶液を受け取り、その溶液を反応チャンバに送ることができる。溶液を加熱すると、病原体検出装置はさらに、１つ以上の蛍光色素を含むプローブを受け取ることができる。励起源は溶液を励起し、検出システムは１つ以上の蛍光色素の発光を検出できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
入口、出口、及び
反応
チャンバ
を含む病原体検出装置と、
励起源、及び
蛍光検出システム
を含む撮像システムと、
基板と、
加熱要素と
を含む、病原体検出システムであって、
前記病原体検出システムは、
前記病原体検出装置の入口で、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一つを含む溶液を受領する、
前記病原体検出装置の反応チャンバに前記溶液を送る、
前記加熱要素を介して前記溶液を加熱する、
前記病原体検出装置の入口で、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ、前記プローブを含有する１以上の蛍光色素の-少なくとも１つを受領する、
前記撮像システムの励起源を介して、前記溶液と前記プローブを励起する、
蛍光検出システムを介して、１つまたは複数の蛍光色素の発光を検出する
ように構成される、病原体検出システム。
【請求項2】
前記加熱要素は、 ペルチェ素子、
加熱ブロック、
熱電冷却装置、
ホットプレートまたは
抵抗加熱器
の少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記病原体検出装置が三次元（３Ｄ）プリンティングを使って製造される、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記病原体検出装置が樹脂を含み、前記樹脂が、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、
ビス（２，４，６－トリメチルベンゾイル）－フェニルホスフィンオキシド（イルガキュア８１９）；および
アボベンゾン
を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
前記病原体検出装置が、１つ以上のマイクロウェルをさらに含み、前記マイクロウェルが約１１６μｍ×約１１６μｍの寸法を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
病原体検出装置であって、前記病原体検出装置の入口で、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一つを含む溶液を受領する、
前記病原体検出装置の反応チャンバに前記溶液を送る、
加熱要素によって前記溶液を加熱する、
前記病原体検出装置の入口で、１以上の蛍光色素を含有するＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブの少なくとも１つを受領する、
前記病原体検出装置の撮像システムの励起源によって、前記溶液および前記プローブを励起する、および
前記病原体検出装置の蛍光検出システムによって、１つ以上の蛍光色素の発光を検出する
ように構成された、病原体検出装置
を含む装置。
【請求項7】
前記加熱要素は、ペルチェ素子、
加熱ブロック、
熱電冷却装置、
ホットプレート、または
抵抗加熱器
の少なくとも１つを含む請求項６に記載の装置。
【請求項8】
前記病原体検出装置が三次元（３Ｄ）プリンティングを使って製造される、請求項６に記載の装置。
【請求項9】
前記病原体検出装置が樹脂を含み、前記樹脂が、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、
ビス（２，４，６－トリメチルベンゾイル）－フェニルホスフィンオキシド（イルガキュア８１９）、および
アボベンゾン
を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項10】
前記病原体検出装置が、１つ以上のマイクロウェルをさらに含み、前記マイクロウェルが約１１６μｍ×約１１６μｍの寸法を有する、請求項６に記載の装置。
【請求項11】
（ａ）配列番号１、３、４、５、６もしくは７に記載の配列を有する核酸、または配列番号１、３、４、５、６もしくは７に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する核酸であって、（ｂ）配列番号２に記載の配列に対して逆相補体の配列、または配列番号２に記載の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列に対して逆相補体の配列を有する核酸に連結されたもの；または
（ｃ）配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列を有する核酸、または配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を有する核酸であって、
（ｄ）配列番号１５、１６もしくは２７に記載の配列に対して逆相補体の配列、または配列番号１５、１６もしくは２７に記載の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列に対して逆相補体の配列を有する核酸に連結されたもの；
を含む組成物であり、
（ａ）および（ｂ）、または（ｃ）および（ｄ）の配列は、約９０℃でハイブリダイズし、二重らせん構造を形成することによって連結され、（ａ）の核酸は蛍光団に連結され、消光剤から遠い位置にあり、それによって蛍光シグナルを生じる、組成物。
【請求項12】
（ａ）の核酸が、配列番号１、３、４、５、６もしくは７に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、（ｂ）の核酸が、配列番号２に記載の配列の逆相補体に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するか、または（ｃ）の核酸が、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、（ｄ）の核酸が、配列番号１５、１６、もしくは２７に記載の配列の逆相補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
（ａ）の核酸が、配列番号１、３、４、５、６もしくは７に記載の配列を有し、（ｂ）の核酸が、配列番号２に記載の配列の逆相補体を有するか、または（ｃ）の核酸が、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列を有し、（ｄ）の核酸が、配列番号１５、１６もしくは２７に記載の配列の逆相補体を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項14】
ループ構造を形成する核酸が、配列番号１、３、４、５、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列、または配列番号１、３、４、５、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項15】
ループ構造を形成する核酸が、配列番号１、３、４、５、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３に記載の配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項16】
細菌のＲＮＡまたはＤＮＡが、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、大腸菌群（coliform bacteria）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｃ．ｄｉｆｆ）、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、炭疽菌（ａｎｔｈｒａｘ）、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミドフィラ（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・マヨニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｍａｙｏｎｉｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ガルドネラ・ヴァギナリス（ｇａｒｄｎｅｒｅｌａａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、または淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来である請求項１１に記載の組成物。
【請求項17】
真菌のＲＮＡまたはＤＮＡが、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロスポルム・カニス（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、足白癬（ｔｉｎｅａ ｐｅｄｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）またはコクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）をコードする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項18】
寄生虫のＲＮＡまたはＤＮＡが、マラリア、トキソプラズマ症、トリコモナス症、ジアルジア鞭毛虫症、条虫、回虫、シラミ、疥癬、リーシュマニア症、または河川盲目症などの疾患を引き起こす原虫、蠕虫、外部寄生虫をコードする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項19】
前記蛍光団または前記消光剤が、シアニン（テトラメチルインド（ジ）－カルボシアニン）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、ローダミン、テトラクロロフルオレセインの誘導体であり、および消光剤は、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（Ｄａｂｓｙｌ）、ＩＲＤｙｅ（Ｃ５３Ｈ６２ＣｌＮ４Ｎａ３Ｏ１６Ｓ４）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ、ブラックホール消光剤の誘導体であり得る、請求項１１に記載の組成物。
【請求項20】
前記ＲＮＡまたはＤＮＡが、請求項１１～２０における前述の病原体の相補体となり得るＰＣＲ産物である請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、病原体検出システムを説明する。
【背景技術】
【0002】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムは、ウイルスまたは他の病原体を検出することができ、一般の人々に多くの利点および機会を提供する。例えば、ＰＣＲは、使用者に、生物学的サンプル中のウイルスの存在を効果的かつ正確に検出することを可能にする。しかしながら、ほとんどの従来のＰＣＲシステムおよび装置は、非常に労力を要し、高価であり、高度な環境制御を必要とする。従来のＰＣＲ装置に代わるものに、マイクロ流体装置が挙げられるが、これらの装置は一般的に高価である。そのため、ユーザーは代替となる、より手頃なＰＣＲ装置を望むかもしれない。
【0003】
関連出願との相互参照
このＰＣＴ国際出願は、２０２３年１月１１日出願の米国特許出願第１８／１５３，２６０号（名称「ＰＡＴＨＯＧＥＮ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ」）の優先権を主張するものであり、前記米国特許出願は、２０２２年１月１３日出願の米国仮特許出願第６３／２９９，１５６号対する優先権を主張し、前記米国特許出願は、前記仮出願の非仮出願であり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
このＰＣＴ国際出願は、２０２３年１月１１日出願の米国特許出願第１８／１５３，２６０号（名称「ＰＡＴＨＯＧＥＮ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ」）の優先権を主張するものであり、前記米国特許出願は、２０２２年１月１３日出願の米国仮特許出願第６３／２９９，１５６号対する優先権を主張し、前記米国特許出願は、前記仮出願の非仮出願であり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0004】
配列一覧への言及
本出願に関連する配列表は、紙媒体の代わりにＸＭＬ形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。シーケンスリストを含むＸＭＬファイルの名前は、Ｗ０５８－０００６ＵＳ．ｘｍｌである。このテキストファイルは１５８ ＫＢで、２０２３年１月５日に作成され、特許センター（Patent Center）を通じて電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙媒体の代わりにＸＭＬ形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。シーケンスリストを含むＸＭＬファイルの名前は、Ｗ０５８－０００６ＵＳ．ｘｍｌである。このテキストファイルは１５８ ＫＢで、２０２３年１月５日に作成され、特許センター（Patent Center）を通じて電子的に提出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第５，２８３，１７３号明細書
【特許文献2】米国特許第５，４６８，６１４号明細書
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988)
【非特許文献2】Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994)
【非特許文献3】Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994)
【非特許文献4】Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987)
【非特許文献5】Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)
【非特許文献6】Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)
【非特許文献7】Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)
【非特許文献8】Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y.
【非特許文献9】Scatchard, et al., 1949, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660
【非特許文献10】Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989)
【非特許文献11】F. M. Ausubel, et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, (1987)
【非特許文献12】Methods IN Enzymology (Academic Press, Inc.)
【非特許文献13】M. MacPherson, et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991)
【非特許文献14】MacPherson et al., eds. PCR 2
【非特許文献15】Practical Approach, (1995)
【非特許文献16】Harlow and Lane, eds. Antibodies, A Laboratory Manual, (1988)
【非特許文献17】R. I. Freshney, ed. Animal Cell Culture (1987)
【非特許文献18】Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)
【発明の概要】
【0007】
以下、添付の図を参照しながら詳細に説明する。図中、参照番号の左端の桁（複数可）は、参照番号が最初に現れる図を示す。異なる図において同じ参照番号が使用されている場合は、類似または同一の項目を示す。添付の図に描かれているシステムは縮尺通りではなく、図中の構成要素は互いに縮尺通りに描かれていない場合がある。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
詳細な説明
上述したように、ウイルスやその他の病原体を検出および診断するための現在および従来の標準はＰＣＲである。ウイルスを検出するためには、ウイルスのゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）をビリオンのカプシドから抽出し、ＤＮＡまたはＲＮＡが検出できるまで（例えば約１００万倍）、特別なポリメラーゼを用いて相補鎖を何倍にもする。検出は通常、検出したいウイルス株に特異的な配列で設計されたＤＮＡプローブを用いて行われる。プローブには、例えば、分子ビーコンおよび／またはインターカレート色素が含まれる。ウイルスを検出するために使用されるシステムは、典型的には、光学的励起および／または検出と、ポリメラーゼを活性化してコピーするための制御されたサーマルサイクラーを備えた卓上定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）装置を含むことができる。このプロセスは通常、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、光学シグナルを検出するために、低温（約２０℃から約５０℃）から高温（約８０℃から約９０℃）のサイクルを約３０から約６０サイクル必要とする。その後、一般的にｑＰＣＲ曲線が作成され、サンプル中に相補的ＤＮＡが存在する場合には、その指数関数的な成長を示す。元のＤＮＡまたはＲＮＡの量は、高感度（例えば、１～１０００ゲノムコピー／ｍＬまで）に較正されたサイクル数まで遡ることができる。
上述したように、ウイルスやその他の病原体を検出および診断するための現在および従来の標準はＰＣＲである。ウイルスを検出するためには、ウイルスのゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）をビリオンのカプシドから抽出し、ＤＮＡまたはＲＮＡが検出できるまで（例えば約１００万倍）、特別なポリメラーゼを用いて相補鎖を何倍にもする。検出は通常、検出したいウイルス株に特異的な配列で設計されたＤＮＡプローブを用いて行われる。プローブには、例えば、分子ビーコンおよび／またはインターカレート色素が含まれる。ウイルスを検出するために使用されるシステムは、典型的には、光学的励起および／または検出と、ポリメラーゼを活性化してコピーするための制御されたサーマルサイクラーを備えた卓上定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）装置を含むことができる。このプロセスは通常、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、光学シグナルを検出するために、低温（約２０℃から約５０℃）から高温（約８０℃から約９０℃）のサイクルを約３０から約６０サイクル必要とする。その後、一般的にｑＰＣＲ曲線が作成され、サンプル中に相補的ＤＮＡが存在する場合には、その指数関数的な成長を示す。元のＤＮＡまたはＲＮＡの量は、高感度（例えば、１～１０００ゲノムコピー／ｍＬまで）に較正されたサイクル数まで遡ることができる。
【0010】
ＰＣＲは非常に高感度であるため、ウイルスを検出する環境は高度に制御されなければならず、ＨＥＰＡフィルター、ＨＶＡＣコントロール、層流、ヒュームフードなど様々な技術の使用が必要となる。さらに、ｑＰＣＲは高度に訓練されたスタッフによって集中管理されたラボで実施される。不純物のリスクを低減するため、ｑＰＣＲ法の幾つかは、サンプルの調製とウイルスやその他の病原体の検出を自動化した機器に依拠する。これらの自動ｑＰＣＲ法は、集中型ラボ施設での検査用に開発されたもので、ハイスループットと迅速な検査所要時間を容易にしている。これらの時間は通常、約２４時間から１４日間である。しかし、検出されるウイルスの性質上、ウイルスのさらなる拡散を防ぐため、結果を待つ間、サンプルを採取した患者が隔離されることがある。地域保健の役割に加え、このような長い隔離期間は患者を隔離に追い込み、うつ病などの深刻な心理的影響をもたらす可能性がある。さらに、隔離期間が長いと、仕事を休むなど生産性が低下する可能性もある。したがって、迅速な検査所要時間が重要である。陰性の結果を迅速に受け取ることで、患者は社会生活および職場に復帰し、幸福感および生産性を向上させることができる。あるいは、陽性の結果を迅速に受け取ることで、適切な接触追跡、再検査、処置が可能になり、感染の拡大および流行の進行を効果的に回避できるかもしれない。
【0011】
ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）病原体検出装置は、患者が迅速な結果を得ることができる方法の一つである。ＰＯＣ診断は、サンプルを検査機関に送るよりもむしろ、患者が医療を受ける場所、例えば医師の診察室でウイルスまたは他の病原体を検出することを可能にする医療アプローチである。現在のＰＣＲ自動化システムには、病院内に設置されたＰＯＣ装置が含まれる。例えば、いくつかのＰＯＣ ＰＣＲ装置はカートリッジシステムに依存している。そのようなシステムはサンプルをカートリッジに入れ、次いで、それをサーマルサイクラーに入れる。いくつかの例では、光学検出システムが病原体を検出するために使用され得る。これらのカートリッジは一般的にプラスチック製で、ウイルスまたは他の病原体を検出するための特定の検査を行うのに必要な試薬を含有し得る。しかし、これらのカートリッジはかさばり、製造に費用がかかる場合がある。
【0012】
現在のＰＯＣ ＰＣＲ装置に対する一つの解決策は、ラボオンチップ（ＬＯＣ）装置という形で提示されている。ＬＯＣ装置は通常ラボで行われる検査を行うことができるが、そのような検査を小さなチップ上に小型化したものである。これはハイスループットおよび自動処理などの利点を提供する。ＬＯＣ装置は通常、検査用流体中のサンプルを輸送するためのマイクロ流体チャンネルを含む。病原体の検出にＬＯＣ装置を使用すると、サンプル容量、試薬、廃棄物のフットプリントの削減など、多くの利点がある。しかし、ＬＯＣ装置は一般的に製造コストが非常に高い。例えば、従来のＬＯＣ装置は、クリーンルームと高度な訓練を受けたオペレーターを必要とするシリコン微細加工技術を用いて製造される。
【0013】
その解決策が、３次元（３Ｄ）プリンティングという形で提示される。３Ｄプリンティングは、コンピューター支援設計（ＣＡＤ）構造を使用して、さまざまな方法で（バルク材料から除去するのとは対照的に）追加、接合、または固化される材料を用いて３Ｄ造形を作成することを含む。したがって、ＬＯＣ装置は３Ｄプリンティングで製造することができる。ＬＯＣ装置の製造コストは、従来の技術よりも大幅に低いだけでなく、３Ｄプリンティングでは、クリーンルーム、無数の器具、訓練を受けた専門家が不要になる。
【0014】
病原体検出システム
本出願は、３ＤプリンティングされたＬＯＣ病原体検出システムを説明する。例えば、病原体検出のためのシステムは、ＬＯＣ装置を含むことができる。この装置は、いくつかの例では、入口、出口、および／または反応チャンバを含むことができる。本システムは、撮像システムをさらに含んでいてもよく、撮像システムは励起源および／または蛍光検出の構成要素を含み得る。さらに、本システムは、基板および／または発熱要素を含んでいてもよい。
本出願は、３ＤプリンティングされたＬＯＣ病原体検出システムを説明する。例えば、病原体検出のためのシステムは、ＬＯＣ装置を含むことができる。この装置は、いくつかの例では、入口、出口、および／または反応チャンバを含むことができる。本システムは、撮像システムをさらに含んでいてもよく、撮像システムは励起源および／または蛍光検出の構成要素を含み得る。さらに、本システムは、基板および／または発熱要素を含んでいてもよい。
【0015】
いくつかの例では、病原体検出システムは、１つ以上のウイルスまたは他の病原体を検出するように構成され得る。本開示では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するように構成されたシステムを説明するが、本システムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連する変異体を含む任意のウイルスまたは病原体の１つ以上を検出するために使用することができる。例えば、本システムは、病原体検出装置の入口で、生物学的試料を含む溶液を受け取ることができる。例えば、本システムは、本システムが検出すべきウイルスまたは病原体に関連するＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一方を受け取ることができる。溶液には、例えば緩衝液が含まれ得る。その後、本システムは、処理および検出のために、溶液を病原体検出装置の反応チャンバに送る。
【0016】
いくつかの例では、本システムは、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するために、加熱要素を介して溶液を加熱することができる。例えば、溶液がＤＮＡを含有する例では、ＤＮＡ増幅プロセスを活性化するために加熱要素を使用することができる。いくつかの例を挙げると、ＰＣＲ、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、自家持続配列複製（３ＳＲ（Ｓｅｌｆ－Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））、ローリングサークル増幅（ＲＣ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ））など、様々な増幅プロセスを使用することができる。いくつかの例では、溶液を含有する病原体検出装置は、加熱要素の上に直接置かれてもよい。加熱要素には、例えば、ペルチェ素子、加熱ブロック、熱電冷却素子、ホットプレート、および／または抵抗加熱器が含まれる。
【0017】
その後、本システムは、病原体検出システムの入口で、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブの少なくとも一方を受け取ることができる。いくつかの例では、プローブは１つ以上の蛍光色素を含む。プローブの使用を説明したが、インターカレート色素または分子ビーコンなど、他の様々な報告機構を使用してもよい。
【0018】
いくつかの例では、本システムは、次に、撮像システムの励起源を介して、溶液を励起することができる。励起源は、光励起を形作り、方向付けるための一連のレンズおよびミラーを含む光学撮像システムを含有することができる。溶液の励起に応答して、本システムは、蛍光検出システムを介して、１つ以上の蛍光色素の発光を検出することができる。例えば、本システムは、ラマン散乱およびレイリー散乱など、１つ以上の蛍光色素の発光を検出する際に、様々な光学的応答に依存することができる。本システムはさらに、いくつかの例を挙げると、電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、および光パワーメータなどの様々な検出装置に依存することができる。
【0019】
いくつかの例では、ＬＯＣ装置は３Ｄプリンティング法を用いて製造することができる。例えば、ＬＯＣは、ステレオリソグラフィー（stereolithography）（ＳＬＡ）３Ｄプリンティングを用いて製造することができ、この場合、光は、未現像の光硬化性樹脂のバットに集光され得る。硬化性樹脂は、光の波長が短くなるにつれて吸収が増加するため、光の浸透深度が減少する可能性がある。浸透の深さが減少すると、重合する樹脂の量が減少し、チャネルのＺ軸がより制御されることになる。樹脂はまた、約３００ナノメートル（ｎｍ）から約１０００ｎｍで特徴付けられる光吸収を有していてもよい。光源は、約３５０ｎｍから約３８０ｎｍのＬＥＤ光源を有するデジタル光処理（ＤＬＰ）プロジェクタを含んでもよいが、これらの波長に限定されない。光源は、電動ミラーマウントを使用してラスタースキャンされた光スポットを有するレーザーを含むことができるが、これに限定されない。
【0020】
本明細書で開示する病原体検出装置を製造するには、例えば、ビルドプラットフォームを樹脂のバット内に降下させることができる。ビルドプラットフォームをバット内に降ろすと、光源が所定のパターンで形成され得る。いくつかの例では、パターンは、ユーザーおよび／または別の装置によって予めプログラムされ得る。光は、樹脂槽を通してビルドプラットフォーム上に投射され、光に接触した未現像樹脂が固化されてビルドプラットフォーム上に現像済の樹脂の単層を形成する。いくつかの例では、ビルドプラットフォームは、１つ分層を下げ、新しい未現像樹脂で再コーティンし、設計が完了するまでこのプロセスを繰り返すことができる。光源は、現像済の樹脂の各層が異なるパターンで構成されるように、異なるパターンを照射するようにプログラムされてもよい。いくつかの例では、パターンが繰り返されてもよい。プロセスが完了したら、ビルドプラットフォームを未現像樹脂のバットから引き上げ、完成した３Ｄ病原体検出装置から残りの未現像樹脂を取り除くことができる。
【0021】
例では、病原体検出装置は、現像済の樹脂の層を形成するための一連のパターンを用いて製造され得るが、これに限定されない。例えば、一旦ビルドプラットフォームが未現像樹脂のバットに下げられると、光源は、ビルドプラットフォーム上に樹脂の第１の層が堆積されるように第１のパターンを放射することができ、第１の層は現像済の樹脂である。さらに、光源は、樹脂の第２の層が樹脂の第１の層上に堆積されるように第２のパターンで光を放射することができる。第２のパターンは、現像済の樹脂の第１および第２の部分と、未現像の樹脂の第３の部分とを含むことができ、第３の部分は、第２の層の第１および第２の部分の間に堆積されることができる。このように、第２の樹脂層は病原体検出装置の外壁を形成し始め、外壁は現像済の樹脂で構成される。
【0022】
いくつかの例では、光源は、樹脂の第三の層が樹脂の第２の層上に堆積されるような第三のパターンを放射することができる。第３の樹脂層は、現像済の樹脂であり得る第１の部分、第２の部分、および第３の部分を含むことができる。さらに、第３の層は、未現像樹脂であってもよい樹脂の第４の部分および第５の部分を含んでいてもよい。例では、第３の層の樹脂の第４の部分は、第３の層の第１の部分と第２の部分との間に堆積されてもよく、第３の層の第５の部分は、第３の層の樹脂の第２の部分と第３の部分との間に堆積されてもよい。そうすることによって、第３の層は、外壁の少なくとも一部および１つまたは複数の内壁の少なくとも一部など、病原体検出装置の一部を構成することができる。いくつかの例では、これは外側樹脂クラッド（cladding）の一部を形成することができ、外側樹脂クラッドは未現像樹脂で構成され、現像済の樹脂で囲まれうる。
【0023】
いくつかの例では、光源は、樹脂の第４の層が樹脂の第３の層上に堆積されるように第４のパターンを放射することができる。樹脂の第４の層は、現像済の樹脂であってもよい第１の部分、第２の部分、第３の部分、および／または第４の部分を含んでもよい。さらに、第４の層は、未現像樹脂であってもよい樹脂の第５の部分、第６の部分、および／または第７の部分を含んでもよい。そうすることにより、第４の層は第３の層の上に構築され、外側クラッドの外壁および／または内壁を伸長させ、内側樹脂クラッドの少なくとも一部を画定することができ、内側樹脂クラッドは外側樹脂クラッド内に堆積され得る。幾つかの例では、内側樹脂クラッディングは未現像樹脂で構成され、現像済の樹脂で囲まれ得る。
【0024】
いくつかの例では、光源は、樹脂の第５の層が樹脂の第４の層上に堆積され得るように、第３のパターンで光を放射し得る。第４の層の樹脂の第５の部分は、第４の層の第１の部分と第２の部分との間に堆積され、第４の層の樹脂の第６の部分は、第４の層の第２の部分と第３の部分との間に堆積され、第４の層の樹脂の第７の部分は、第４の層の第３の部分と第４の部分との間に堆積される。その結果、第５の層が第４の層の上に構築され、外側クラッドの外壁および／または内壁をさらに伸長し、現像済の樹脂によって囲まれた内側樹脂クラッドが完全に形成され得る。
【0025】
いくつかの例では、光源は、樹脂の第６の層が樹脂の第５の層上に堆積され得るように、第２のパターンで光を放射し得る。第６の層を堆積させることにより、外側クラッドの外壁および／または内壁はさらに伸長される。さらに、光源は、樹脂の第６の層上に樹脂の第７の層が堆積するように、第１のパターンで光を放射してもよい。そうすることにより、病原体検出装置は完全に形成され、内側樹脂クラッドが外側樹脂クラッド内に堆積され得る。
【0026】
内部構造に支持体を提供するために、ユーザーおよび／または別の装置は、層間および／または層の一部間に一時的な支持構造を作成するように光源をプログラムすることができ、この支持構造は製造の際に後で除去することができる。
【0027】
他の例では、病原体検出装置の製造は、逆ステレオリソグラフィー（inverted stereolithography）を用いた「ボトムアップ」アプローチを含むことができる。このプロセスは、ビルドプラットフォームを樹脂バットの底に接触するように下げることから開始する製造プロセスを要求し得る。光源は、樹脂バットを通して上方に第１のパターンを放射し、ビルドプラットフォームと接触させ、これによって、光が接触する可能性のある未現像樹脂を固化させ、現像することができる。いくつかの例では、バットを、予め決められた角度（一例として５度まで）で傾けて、今硬化した現像済み樹脂から剥がし、現像済み樹脂がビルドプラットフォームに付着したままバットの底部から剥離れる。現像済の樹脂とバットの底の間に新たにできた空間に、新しい液状の未現像樹脂が流れ込み、病原菌検出装置が完成するまでこの工程が繰り返される。
【0028】
いくつかの例では、病原体検出装置は、微小流体硬化と呼ばれる表面粗さ処理を経てもよい。３Ｄプリンティングを用いて病原体検出装置を製造した後、残存する重合していない未現像樹脂が装置のチャネル内に存在することがある。この未現像樹脂を除去するために、マイクロ流体コネクタに接続するようにチャネルをパターン化し、残りの未現像樹脂を排出し、少なくとも未現像樹脂の層を残す。残った樹脂は、排出後にＵＶＡランプで露光して重合させることができる。
【0029】
病原体プローブ
病原体検出のためのシステムおよび方法に加えて、本出願は、ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のようなウイルスを検出するための病原体検出システム（上記）において使用されるように設計された病原体プローブを記載する。例えば、病原体プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に設計された。このプローブは、現在知られているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（２０２１年１０月現在）を含む全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のタンパク質およびＤＮＡ配列データベースを用いてインシリコで設計された。ゲノムの特定の保存領域（スパイクタンパク質をコードするのに応答可能な領域）が選択され、約６０℃で変性するように３６塩基のヘアピン形状の病原体プローブが設計された：
５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号１）。可能性の高いＲＮＡ配列のシミュレーションから、図４に関して後述するように、５つの可能性の高い確認を得た。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的病原体プローブを、対応する赤色色素（ＴＹＥ６６５）、消光剤、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対応する１００塩基オリゴヌクレオチドとともに、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．に注文した：
５’－ＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡ－３’（配列番号２）。ここで、下線部が病原体プローブと相補的である。サーマルサイクラーを用いてプローブの機能を確認するために融解曲線を得た。図７を参照して後述するように、約１１６μｍ×約１１６μｍの大きさの１，１６６マイクロウェルの反応チャンバを持つマイクロアレイを３Ｄプリンティングすることにより、原理実証実験を行った。
病原体検出のためのシステムおよび方法に加えて、本出願は、ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のようなウイルスを検出するための病原体検出システム（上記）において使用されるように設計された病原体プローブを記載する。例えば、病原体プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に設計された。このプローブは、現在知られているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（２０２１年１０月現在）を含む全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のタンパク質およびＤＮＡ配列データベースを用いてインシリコで設計された。ゲノムの特定の保存領域（スパイクタンパク質をコードするのに応答可能な領域）が選択され、約６０℃で変性するように３６塩基のヘアピン形状の病原体プローブが設計された：
５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号１）。可能性の高いＲＮＡ配列のシミュレーションから、図４に関して後述するように、５つの可能性の高い確認を得た。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的病原体プローブを、対応する赤色色素（ＴＹＥ６６５）、消光剤、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対応する１００塩基オリゴヌクレオチドとともに、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．に注文した：
５’－ＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡ－３’（配列番号２）。ここで、下線部が病原体プローブと相補的である。サーマルサイクラーを用いてプローブの機能を確認するために融解曲線を得た。図７を参照して後述するように、約１１６μｍ×約１１６μｍの大きさの１，１６６マイクロウェルの反応チャンバを持つマイクロアレイを３Ｄプリンティングすることにより、原理実証実験を行った。
【実施例】
【0030】
病原体検出システムの実施形態例
図１～図４は、病原体検出システムおよび病原体検出装置を用いて病原体を検出するための例示的な実施形態を示す。例えば、図１は、例示的な病原体検出システム１００を示す。病原体検出システム１００は、図２に関して後述する病原体検出装置１０２を含んでもよい。病原体検出装置１０２は、入口１０４、出口１０６、および反応チャンバ（本実施形態では図示せず）を含み得る。いくつかの例では、病原体検出システム１００は、１つ以上の病原体またはウイルスを検出するように構成され得る。例えば、本システムは、病原体検出装置１０２の入口で、溶液を受け取ることができる。溶液は、病原体検出システム１００が検出し得る１つ以上のウイルスおよび／または病原体のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの少なくとも一方を含有し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、いくつかの例では、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、大腸菌（coliform bacteria）、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、炭疽菌（ａｎｔｈｒａｘ）、マイコプラズマ、クラミドフィラ（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・マヨニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ガルドネラ・ヴァギナリス（ｇａｒｄｎｅｒｅｌａａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）などの１つ以上の病原体の相補体でありうる産物、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロスポルム・カニス（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、足白癬（ｔｉｎｅａ ｐｅｄｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ：Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、原虫、蠕虫、外部寄生虫であって、マラリア、トキソプラズマ症、トリコモナス症、ジアルジア鞭毛虫症、条虫、回虫、シラミ、疥癬、リーシュマニア症、河川盲目症などの疾患を引き起こす原虫、蠕虫、外部寄生虫をコードするものである。
図１～図４は、病原体検出システムおよび病原体検出装置を用いて病原体を検出するための例示的な実施形態を示す。例えば、図１は、例示的な病原体検出システム１００を示す。病原体検出システム１００は、図２に関して後述する病原体検出装置１０２を含んでもよい。病原体検出装置１０２は、入口１０４、出口１０６、および反応チャンバ（本実施形態では図示せず）を含み得る。いくつかの例では、病原体検出システム１００は、１つ以上の病原体またはウイルスを検出するように構成され得る。例えば、本システムは、病原体検出装置１０２の入口で、溶液を受け取ることができる。溶液は、病原体検出システム１００が検出し得る１つ以上のウイルスおよび／または病原体のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの少なくとも一方を含有し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、いくつかの例では、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、大腸菌（coliform bacteria）、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、炭疽菌（ａｎｔｈｒａｘ）、マイコプラズマ、クラミドフィラ（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・マヨニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ガルドネラ・ヴァギナリス（ｇａｒｄｎｅｒｅｌａａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）などの１つ以上の病原体の相補体でありうる産物、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロスポルム・カニス（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、足白癬（ｔｉｎｅａ ｐｅｄｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ：Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、原虫、蠕虫、外部寄生虫であって、マラリア、トキソプラズマ症、トリコモナス症、ジアルジア鞭毛虫症、条虫、回虫、シラミ、疥癬、リーシュマニア症、河川盲目症などの疾患を引き起こす原虫、蠕虫、外部寄生虫をコードするものである。
【0031】
いくつかの例では、溶液はまた、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ホウ酸、酢酸、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、イソプロパノール、エタノール、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、酢酸カリウム、超純水、水（Ｈ２Ｏ）またはＮＨ４Ｃｌからなり得る緩衝液を含み得る。いくつかの例では、病原体検出装置１０２は、例を挙げると、シリコン、スライドガラス、溶融シリカ、石英、サファイア、窒化ガリウム、ゲルマニウム、ゴリラガラス、酸化インジウムスズ、タンタル酸リチウム、窒化ケイ素、ゲルマニウムシリコン、炭化ケイ素、エピタキシャルシリコン、シリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ）、単結晶石英、酸化アルミニウム、コーニング・イーグル・グラス、ホウケイ酸塩、ＢＫ７ガラス、ソーダ石灰ガラス、熱酸化物、酸化亜鉛、ＩＩ－Ｖ族半導体、ＩＩ－ＶＩ族半導体、太陽電池、荷電結合素子、液晶ディスプレイからなり得る基板に結合されうる。
【0032】
いくつかの例では、病原体検出装置１０２は、加熱要素１１０に結合され得る。加熱要素は、いくつかの非限定的な例を挙げると、ペルチェ素子、加熱ブロック、熱電気冷却装置、ホットプレート、および／または抵抗加熱器を含むことができる。いくつかの例では、病原体検出装置１０２に熱を加えることにより、溶液中に含有されるＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅を開始することができる。いくつかの例を挙げると、ＰＣＲ、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、自家持続配列複製（３ＳＲ（Ｓｅｌｆ－Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））、ローリングサークル増幅（ＲＣ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ））など、様々な増幅プロセスを使用することができる。
【0033】
いくつかの例では、病原体検出装置１０２は、病原体検出装置１０２の入口１０４において、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡプローブの少なくとも一方を受け取ることができ、これは図４～６に関して後述する。プローブを受け取ることに応答して、病原体検出システム１００は、次に、励起源１１４を介して、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡとプローブとを含有する溶液を励起することができる。励起源は、光励起を形作り、方向付けるための一連のレンズおよびミラーを含む光学撮像システムを含むことができる。
【0034】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびにプローブを含む溶液の励起に応答して、病原体検出システム１００は、次に、検出システム１１６を介して、１つまたは複数の蛍光色素の発光１１８を検出することができる。例えば、病原体検出システム１００は、１つ以上の蛍光色素の発光を検出する際に、ラマン散乱およびレイリー散乱などの様々な光学的応答に依存してもよい。システムはさらに、いくつかの例を挙げると、電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、および光パワーメータなどの様々な検出装置に依存してもよい。
【0035】
図２は、例示的な病原体検出装置２００の二次元上面図である。図１に関して上述したように、かつ病原体検出装置１０２と同様に、病原体検出装置２００は、病原体検出システム１００のような病原体検出システムにおいて実施されてもよい。例えば、病原体検出装置２００は、入口２０２、出口２０４、および／または反応チャンバ２０６を含むことができる。いくつかの例では、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有する緩衝液などの入力試料が、入口２０２を介して病原体検出装置２００に導入され得る。その後、溶液は、処理および検出のために反応チャンバ２０６に送られる。例として、ＤＮＡ検出の場合、ウイルスゲノムＤＮＡは試薬と混合され、ＤＮＡ増幅のために反応チャンバ２０６に送られる。
【0036】
いくつかの例では、入口２０２および／または出口２０４は、いくつかの非限定的な例を挙げると、サンプルを１つの反応チャンバから別の反応チャンバに移送し、試薬、流体、および／または気体を導入し得るマイクロ流体チューブを介して、シリンジおよび／または他のポンプを使用して接続され得る。
【0037】
現在の実施形態では、単純な入口２０２、出口２０４、および反応チャンバ２０６が描かれているが、病原体検出装置２００は、任意の数の入口２０２、出口２０４、および反応チャンバ２０６を含むことができ、これは、検出可能な病原体および／またはウイルスに対応するＤＮＡおよび／またはＲＮＡの１つまたは複数のサンプルについて多重サンプル試験を行うことができる。複数の反応チャンバ２０６の場合、検査される病原体および／またはウイルスに応じて、同じまたは異なる試薬（複数可）が入口２０２に導入され得る。
【0038】
図３および図４は、図１および図２に関して記載されたものと同一または類似であってもよい、病原体検出装置の製造方法の概略図を示す。図３および図４に関して記載される操作は、段階的工程で記載されるが、工程は、異なる順序で、および／または並行して実行されてもよく、図示される工程よりも多いまたは少ない工程を含んでもよいことが理解されるべきである。
【0039】
図３は、病原体検出装置の製造方法の模式図３００を示す。例において、病原体検出装置は、現像済の樹脂の層を生成するための一連のパターンを用いて製造されてもよい。例えば、病原体検出装置は、ユーザーが指定したパターンで光を放射するＤＬＰプロジェクタを用いたＳＬＡ３Ｄプリンティングを用いて製造することができるが、これに限定されない。
【0040】
ステップ１において、ビルドプラットフォーム３０２は、未現像のＵＶ硬化性樹脂のバットに下ろされ得るが、これに限定されない。樹脂は、ベースとしてポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）モノマーで構成される処方から作製され、光重合開始剤であるビス（２，４，６－トリメチルベンゾイル）－フェニルホスフィンオキシド（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ８１９）を用いて硬化され得る。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルのｚ－高さの詳細を最適化するために、添加剤であるＵＶ吸収剤を添加してもよい。紫外線吸収剤はアボベンゾンを含有することができるが、これに限定されない。いくつかの例では、樹脂は３Ｄプリンタの光源、例えば約３６５ｎｍの光に感応性であり得る。この感度は、病原体検出装置をプリンティングする際に、樹脂を可視光に対して透明にし、光が病原体検出装置を通って移動することを可能にする。いくつかの例では、樹脂は多層であってもよい。層には、例えば、マイクロ流体チャンネル、ミキサー、光導波路、ヒーター、フィルター、光検出器、化学検出器反応室、電源、導体などが含まれる。
【0041】
いくつかの例では、光源は、ビルドプラットフォーム３０２に向けられた光の第１のパターンで、指定された波長の１つ以上のレーザーを放射することができる。未現像樹脂と接触すると、未現像樹脂は重合し、ビルドプラットフォーム３０２上に堆積した現像済の樹脂の第１の層３０４を形成する。例では、光のパターンは予めプログラムされ、ユーザーおよび／または別の機械によって決定され得る。
【0042】
ステップ２において、光源は、ビルドプラットフォーム３０２および現像済の樹脂の第１の層３０４に向けて第２のパターンで光を放射し、樹脂の第２の層を現像済みの樹脂の第１の層３０４上に堆積させることができる。いくつかの例では、第２のパターンは、未現像樹脂の特定部分が光と接触し、未現像樹脂を重合させて現像済の樹脂を生成する一方で、未現像樹脂の他の部分が未現像のままとなるように光を放射することができる。例えば、光源は、樹脂の第２の層が現像済み樹脂３０６の部分を含み得る一方、第２の部分は未現像樹脂３０８のままであり、未現像樹脂３０６の第２の層が現像済み樹脂３０８の第２の層の部分の間に堆積するように第２のパターンで光を放射することができる。
【0043】
ステップ３において、光源は、現像済み樹脂の第２の層３０４および未現像樹脂の第２の層３０８を含む樹脂の第２の層上に樹脂の第３の層が堆積されるように第３のパターンで光を発することができる。ステップ２と同様に、第３のパターンは、現像済み樹脂３１０の部分と未現像樹脂３１２の部分を含むことができ、未現像樹脂３１２の第３の層の部分は、現像済み樹脂３１０の第３の層の間に堆積する。
【0044】
ステップ４において、光源は、現像済み樹脂の第３の層３１０および未現像樹脂の第３の層３１２を含む樹脂の第３の層上に樹脂の第４の層が堆積されるように、第４のパターンで光を放射することができる。ステップ２および３と同様に、第４のパターンは、現像済み樹脂３１４の部分および未現像樹脂３１６の部分を含むことができ、未現像樹脂３１６の第４の層の部分は、現像済み樹脂３１４の第４の層の部分の間に堆積する。
【0045】
ステップ５において、光源は、ステップ３と同様に、現像済み樹脂の第４の層３１４および未現像樹脂の第４の層３１６を含む樹脂の第４の層上に樹脂の第５の層が堆積されるように、第３のパターンで光を放射してもよい。ステップ２、３、４と同様に、第５のパターンは、現像済み樹脂３１８と未現像樹脂３２０の部分を含むことができ、未現像樹脂３２０の第５の層の部分は、現像済み樹脂３１８の第５の層の部分の間に堆積する。
【0046】
ステップ６において、光源は、第５の現像済み樹脂層３１８および第５の未現像樹脂層３２０を含む第５の樹脂層上に第６の樹脂層が堆積するように、ステップ２と同様の第２のパターンで光を放射してもよい。ステップ２、３、４、および５と同様に、第６のパターンは、現像済み樹脂３２２および未現像樹脂３２４の部分を含むことができ、未現像樹脂３２４の第６の層の部分は、現像済み樹脂３２２の第６の層の部分の間に堆積する。
【0047】
ステップ７において、光源は、ステップ１と同様に、現像済み樹脂の第６層３２２および未現像樹脂の第６層３２４を含む樹脂の第６層上に樹脂の第７層が堆積されるように、第１のパターンで光を発することができる。ステップ１と同様に、第７の層は現像済み樹脂３２６の一部を含むことができる。
【0048】
ステップ８では、病原体検出装置を反転させ、未現像の樹脂を排出する。
【0049】
図４は、病原体検出装置を製造する代替方法の模式図４００を示す。図４に図示される方法は、上述の図３に図示される方法と同じであってもよく、または類似していてもよい。例えば、ステップ１において、非限定的な例を挙げると、ビルドプラットフォーム４０２が、未現像のＵＶ硬化性樹脂のバットに下げられてもよい。いくつかの例では、樹脂は、３６５ｎｍの光などの３Ｄプリンタの光源に感応性であり得る。いくつかの例では、光源は、ビルドプラットフォーム４０２に向けられた光の第１のパターンで、指定された波長の１つまたは複数のレーザーを放射できる。未現像樹脂と接触すると、未現像樹脂は重合して現像済み樹脂４０４の第１の層を形成する。
【0050】
ステップ２において、光源は、樹脂の第２の層を現像済み樹脂の第１の層４０４上に堆積させることができるように、ビルドプラットフォーム４０２および現像済み樹脂４０４の第１の層に向けて第２のパターンで光を放射しうる。いくつかの例では、第２のパターンは、未現像樹脂の特定部分が光と接触し、未現像樹脂を重合させて現像済み樹脂を生成し、未現像樹脂の他の部分は未現像のままとなるように光を放射することができる。例えば、光源は、樹脂の第２の層が現像済み樹脂４０６の部分を含む一方、第２の部分が未現像樹脂４０８のままであり、未現像樹脂４０６の第２の層が第２の現像済み樹脂４０８の第２の層の部分の間に堆積するように、第２のパターンで光を放射することができる。
【0051】
ステップ３において、光源は、現像済み樹脂４０４の第２の層および未現像樹脂４０８の第２の層を含む樹脂の第２の層上に樹脂の第３の層が堆積されるように第３のパターンで光を放射することができる。ステップ２と同様に、第３のパターンは、現像済み樹脂４１０の部分と未現像樹脂４１２の部分を含むことができ、未現像樹脂４１２の第３の層の部分は、現像済み樹脂４１０の第３の層の間に堆積する。
【0052】
ステップ４では、病原菌検出装置を反転させ、未発達の樹脂を排出する。
【0053】
病原体プローブの実施形態例
図５Ａおよび図５Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に設計された、現在の実施形態ではヘアピンプローブとして描かれている病原体プローブの例示的なコンフォーメーション５００ａおよび５００ｂを示す。例えば、病原体プローブは、当時知られていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を含むＮＣＢＩのタンパク質およびＤＮＡ配列データベースを用いて設計された。ゲノムの特定の保存領域が選択され、３６塩基の病原体プローブが約６０℃で変性するように設計された：
図５Ａおよび図５Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に設計された、現在の実施形態ではヘアピンプローブとして描かれている病原体プローブの例示的なコンフォーメーション５００ａおよび５００ｂを示す。例えば、病原体プローブは、当時知られていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を含むＮＣＢＩのタンパク質およびＤＮＡ配列データベースを用いて設計された。ゲノムの特定の保存領域が選択され、３６塩基の病原体プローブが約６０℃で変性するように設計された：
【0054】
５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号１）。
【0055】
プローブの可能な誘導体は、例えば、以下のものがあるが、これらに限定されない。
５’－ＧＣＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＧＣＧ－３）（配列番号４）、
５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＵＡＧＡＵＣＵＵＣＡＡＵＡＡＡＵＧＡＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号５）、
５’－ＧＣＧＧＧＣＵＣＡＵＵＵＡＵＵＧＡＡＧＡＵＣＵＡＣＵＵＵＵＣＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号６）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＣＵＵＵＵＣＡＵＣＵＡＧＡＡＧＵＵＡＵＵＵＡＣＵＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号７）。
可能性の高いＲＮＡ配列のシミュレーションから、約６３．４℃の最も高い融解温度を持つ５つの可能性の高いコンフォーメーション４００を得た。いくつかの例では、病原体プローブは、赤色色素（ＴＹＥ６６５）のような対応する色素、消光剤、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対応する１００塩基オリゴヌクレオチドを含むことができる：
５’－ＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡ－３’（配列番号２）。ここで、下線部分は病原体プローブと相補的である。
５’－ＧＣＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＧＣＧ－３）（配列番号４）、
５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＵＡＧＡＵＣＵＵＣＡＡＵＡＡＡＵＧＡＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号５）、
５’－ＧＣＧＧＧＣＵＣＡＵＵＵＡＵＵＧＡＡＧＡＵＣＵＡＣＵＵＵＵＣＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号６）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＣＵＵＵＵＣＡＵＣＵＡＧＡＡＧＵＵＡＵＵＵＡＣＵＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号７）。
可能性の高いＲＮＡ配列のシミュレーションから、約６３．４℃の最も高い融解温度を持つ５つの可能性の高いコンフォーメーション４００を得た。いくつかの例では、病原体プローブは、赤色色素（ＴＹＥ６６５）のような対応する色素、消光剤、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対応する１００塩基オリゴヌクレオチドを含むことができる：
５’－ＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡ－３’（配列番号２）。ここで、下線部分は病原体プローブと相補的である。
【0056】
あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノムの異なるセグメントは、５’－ＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵＵＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＵＣＡＡＵＵＡＣＣＣＣＣＵＧＣＡＵＡＣＡＣＵＡＡＵＵＣＵＵＵＣＡＣＡＣＧＵＧＧＵＧＵＵＵＡＵＵＡＣＣＣＵＧＡＣＡ－３’（配列番号１５）またはそのＤＮＡ等価物５’－ＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡ－３’（配列番号１６）を選択した。標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノム配列のＤＮＡ等価物、逆相補体は、５’－ＴＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴ－３’（配列番号２７）である。
【0057】
これらは以下のプライマーに対応する。
フォワードプライマー：５’－ＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣ－３’（配列番号１７）および
リバースプライマー：５’－ＴＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧ－３’（配列番号１８）。
フォワードプライマー：５’－ＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣ－３’（配列番号１７）および
リバースプライマー：５’－ＴＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧ－３’（配列番号１８）。
【0058】
これらのプライマーの逆相補体は以下の通りである：
フォワードプライマー：５’－ＧＧＴＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴ－３’（配列番号１９）および
リバースプライマー：５’－ＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡ－３’（配列番号２０）。
フォワードプライマー：５’－ＧＧＴＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴ－３’（配列番号１９）および
リバースプライマー：５’－ＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡ－３’（配列番号２０）。
【0059】
配列番号１５および１６のゲノム配列から、さまざまな病原体プローブが設計された。可能なプローブのデザインには、例えば以下のようなものがあるが、これらに限定されない。
５’－ＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＧＣＧＣ－３’（配列番号２１）、
５’－ＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＡ－３’（配列番号２２）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２３）、
５’－ＧＣＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＣ－３’（配列番号２４）、
５’－ＴＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡ－３’（配列番号２５）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２６）、
５’－ＧＣＧＣＣＣＵＧＵＣＡＧＧＧＵＡＡＵＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧＵＧＵＧＡＡＡＧＡＡＵＵＧＧＧＣＧＣ －３’（配列番号２８）、
５’－ＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＡＡ－３’（配列番号２９）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＵＡＡＧＡＵＵＡＡＣＡＣＡＣＵＧＡＣＵＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号３０）、
５’－ＣＧＣＧＧＧＡＣＡＧＵＣＣＣＡＵＵＡＵＵＵＧＵＧＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵＵＣＵＵＡＡＣＣＣＧＣＧ－３’（配列番号３１）、
５’－ＵＵＡＣＣＣＣＣＵＧＣＡ－３’（配列番号３２）、および
５’－ＣＧＣＣＣＧＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵＵＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号３３）。
５’－ＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＧＣＧＣ－３’（配列番号２１）、
５’－ＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＡ－３’（配列番号２２）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２３）、
５’－ＧＣＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＣ－３’（配列番号２４）、
５’－ＴＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡ－３’（配列番号２５）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２６）、
５’－ＧＣＧＣＣＣＵＧＵＣＡＧＧＧＵＡＡＵＡＡＡＣＡＣＣＡＣＧＵＧＵＧＡＡＡＧＡＡＵＵＧＧＧＣＧＣ －３’（配列番号２８）、
５’－ＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＡＡ－３’（配列番号２９）、
５’－ＣＧＣＣＣＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＵＡＡＧＡＵＵＡＡＣＡＣＡＣＵＧＡＣＵＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号３０）、
５’－ＣＧＣＧＧＧＡＣＡＧＵＣＣＣＡＵＵＡＵＵＵＧＵＧＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵＵＣＵＵＡＡＣＣＣＧＣＧ－３’（配列番号３１）、
５’－ＵＵＡＣＣＣＣＣＵＧＣＡ－３’（配列番号３２）、および
５’－ＣＧＣＣＣＧＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵＵＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号３３）。
【0060】
図６は、サンプル中のウイルスの存在を検出するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質にプローブを結合させるための例示的な工程６００を示す。工程６００は、上述および図１～４に関して説明したように、病原体検出システムにおける病原体検出装置において実施することができる。例えば、ステップ１（「１」で示される）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合するように設計された病原体プローブ５０２を例示する。プローブ６０２は蛍光団６０４を含んでいてもよく、これは特定の波長の光で照射された場合、蛍光を発するタイプの蛍光プローブであってよい。プローブはまた、消光剤６０６を含んでいてもよく、この消光剤は特定の周波数および／または色範囲の光を吸収する。いくつかの例では、病原体プローブ６０２のステム６０８の１つ以上の部分が相補的であり、消光剤が蛍光団に結合できるようになっている。
【0061】
ステップ２（「２」で示す）は、図１に記載した加熱要素１０６のような熱にさらされた後のプローブ６０２を示す。例えば、プローブ６０２を含有するサンプルに熱を加えることに応答して、プローブ６０２は結合を解除し、蛍光団６０４および消光剤６０６は互いに分離することができる。いくつかの例では、蛍光団６０４および消光剤６０６は、蛍光団が蛍光を発することができるように、互いに離れた距離にあってよい。
【0062】
ステップ３（「３」で示す）では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がプローブ６０２に結合できる。例えば、サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｃＤＮＡを含有する場合、ｃＤＮＡはプローブ６０２に優先的に結合する。いくつかの例では、ステップ２で上げた温度を下げてもよい。ｃＤＮＡに結合しているプローブ６０２は、再折り畳みが妨げられ、蛍光を発することがある。しかし、結合が解除されたプローブ６０２は、ステップ１で描かれたのと同様に、再度折り畳まれる可能性がある。したがって、標的ＤＮＡがサンプル中に多く存在するほど、サンプルからより多くの蛍光が検出される可能性がある。
【0063】
図７は、図６に示したプロセスに対応する標準融解曲線を示す。例えば、「１」で示すように、プローブは第１の温度で結合している。しかし、融点７０２を越えて温度を上げると、「２」で示すように、プローブは結合しなくなる。いくつかの例では、プローブを含有するサンプルは相補的ＤＮＡを含有し、この相補的ＤＮＡは結合していないプローブと結合し、蛍光を発する。しかし、いくつかの例では、「３」で示されるように、サンプルは相補的ＤＮＡを含まず、プローブは相補的ＤＮＡに結合しないままである。温度を低下するのに応じて、結合していないプローブは自身に再結合し、蛍光をほとんど発しなくなる。
【0064】
図８は、プローブの原理の実証を示す。例えば、画像８００（ａ）および８００（ｂ）ならびに対応する強度プロット８００（ｃ）および８００（ｄ）を作成するために、相補的な標的ＤＮＡを含有しないプローブをｑＰＣＲサーマルサイクラーに導入し、温度を約２５℃から約９０℃まで上昇させ、温度を約２０秒間保持し、温度を約２５℃まで下降させるサイクルを５回繰り返した。次に、種々の条件を用いて試薬を導入し、ｑＰＣＲを使用して調査し、溶融曲線を得た。いくつかの例では、プローブ自体を単独でｑＰＣＲに導入した場合、蛍光は低く、標的ＤＮＡが存在しないことを示した。同様に、プローブをランダムなプラスミドＤＮＡと混合してｑＰＣＲサイクルに導入した場合も、蛍光は低く、標的ＤＮＡが存在しないことを示した。しかし、相補的な合成標的ＤＮＡと混合された設計したプローブをｑＰＣＲサイクルに導入すると、プローブは相補的ＤＮＡと結合して高い蛍光を発し、標的ＤＮＡが存在することを示した。
【0065】
これらの試薬の組み合わせは、図１～４に記載された病原体検出装置のような３Ｄプリンティングされたマイクロウェルアレイ装置に導入され、オレンジ色の励起および収集赤色蛍光バンドパスフィルターを使用して共焦点顕微鏡システムで画像化された。８００ａは、共焦点顕微鏡を用いて撮像された蛍光の画像を示し、これにはプローブおよび陰性プラスミンランダムＤＮＡが存在した。図示されているように、蛍光は検出されなかった。あるいは、８００ｂに示されるように、プローブと相補的な標的ＤＮＡが導入され、高レベルの蛍光が得られ、標的ＤＮＡ鎖（合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸）の陽性かつ特異的な検出を示す。
【0066】
画像８００（ａ）および８００（ｂ）の一部から強度を抽出し、それぞれ８００（ｃ）および８００（ｄ）にプロットした。描かれているように、８００（ｂ）に示されているプラスミドＤＮＡサンプルでは、強度は２±１相対単位である。しかしながら、標的ＤＮＡが存在する場合、強度は８０±１であり、その結果、陽性サンプルのシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）は～７となり、～３００ｎＭ未満の検出限界（limit-of-detection、ＬＯＤ）が可能であることを示唆している。
【0067】
図９Ａおよび図９Ｂは、プローブの原理の実証の代替実施形態を示す。図９Ａは、例示的な病原体検出装置の３Ｄプリントされたマイクロウェルデザイン９００（ａ）を示す。例えば、図８に関して説明したのと同様に、約１１６μｍ×約１１６μｍの寸法を有する１，１６６個のマイクロウェルからなるマイクロアレイ反応チャンバを３Ｄプリントすることにより、原理実証実験を行った。図９Ｂは、図９Ａに描かれているものと同様の、３Ｄプリントされたマイクロウェルの明視野顕微鏡画像９００（ｂ）の例を示している。例えば、図９Ｂは、病原体検出装置内の標的ＤＮＡの存在を示す画像を示す。例えば、相補的な合成標的ＤＮＡと混合した設計プローブを病原体検出装置に導入すると、プローブは相補的ＤＮＡと結合し、高い蛍光を発するので、標的ＤＮＡの存在を示す。
【0068】
本明細書に開示され、参照される配列の変異体もまた含まれる。本明細書に開示したプローブの核酸配列の変異体には、本明細書に開示した核酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、または９９％の配列同一性を有する配列も含まれる。
【0069】
「％配列同一性」とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上の配列間の関係をいう。当技術分野では、「同一性」はまた、そのような配列の文字列間の一致によって決定される核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」（しばしば「類似性」と呼ばれる）は、以下に記載されているものを含む公知の方法により容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）（非特許文献１）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）（非特許文献２）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）（非特許文献３）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）（非特許文献４）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）（非特許文献５）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間の最良の一致を与えるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムで体系化されている。配列のアラインメントおよび同一性のパーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて実施されうる。配列の多重アラインメントはまた、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１－１５３（１９８９）（非特許文献６））を、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０，ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いて行うこともできる。関連プログラムには、プログラムのＧＣＧ群（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０（１９９０）（非特許文献７）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；およびＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ Ｓｙｍｐ．］（１９９４）， Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２， １１１－２０．編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．出版社：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（非特許文献８））。本開示の文脈において、配列解析ソフトウェアが解析に使用される場合、解析結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書で使用する「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに最初にロードされる値またはパラメータのセットを意味する。
【0070】
変異体にはまた、本明細書に開示した配列に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、参照配列と同じ機能を提供する核酸分子が含まれる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性、剪断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベートした後、０．１ＸＳＳＣ中５０℃で洗浄することを含む。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーの変化は、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの割合が低いとストリンジェンシーが低くなる）、塩条件または温度の操作によって主に達成される。例えば、中程度に高いストリンジェンシー条件には、６ＸＳＳＰＥ（２０ＸＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中で３７℃で一晩インキュベートした後、１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳによって５０℃で洗浄することが含まれる。加えて、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行う洗浄は、より高い塩濃度（例えば５ＸＳＳＣ）で行うことができる。上記の条件の変更は、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドの抑制に使用される代替ブロッキング試薬を含めるか、または置換することによって達成される。典型的なブロッキング試薬には、Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の独自製剤が含まれる。特定のブロッキング試薬を含めると、適合性の問題から、上記のハイブリダイゼーション条件を調節しなければならないことがある。
【0071】
「特異的に結合する」とは、親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡会合定数）が１０５Ｍ－１以上でありながら、関連する環境試料中の他の分子または成分と有意に会合しない、２つの結合分子の会合を指す。本明細書において、「特異的に結合する」は「結合する」ともいう。結合は、「高親和性」または「低親和性」に分類することができる。特定の実施形態において、「高親和性」とは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、または少なくとも１０１３Ｍ－１のＫａを有する結合を指す。特定の実施形態において、「低親和性」とは、最大１０７Ｍ－１、最大１０６Ｍ－１、最大１０５Ｍ－１のＫａを有する結合を指す。結合を検出するためだけでなく、結合親和性を決定するための様々なアッセイが知られており、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析がある（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、１９４９、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（非特許文献９）；および米国特許第５，２８３，１７３号明細書（ＵＳ５，２８３，１７３）（特許文献１）、米国特許第５，４６８，６１４号明細書（ＵＳ５，４６８，６１４）（特許文献２）、またはこれらに相当するものも参照のこと）。
【0072】
特に断らない限り、本開示の実施態様は、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を用いることができる。これらの方法は、以下の刊行物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（非特許文献１０）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８７）（非特許文献１１）；シリーズＭｅｔｈｏｄｓ ＩＮ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）（非特許文献１２）；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）（非特許文献１３）； ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら，ｅｄｓ．ＰＣＲ ２（非特許文献１４）：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９９５）（非特許文献１５）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）（非特許文献１６）；およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄｓ．Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（非特許文献１７）。
【0073】
ウイルスタンパク質をコードするＲＮＡは、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フラビルウイルス、ハンタウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、オルソミクソウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、海綿状ウイルスまたはトガウイルスに由来し得る。特定の実施形態において、ウイルスタンパク質をコードするＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス（flu viruses）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎、単純ヘルペス、ＨＩＶ、インフルエンザ、日本脳炎、麻疹、ポリオ、狂犬病、呼吸器合胞体（ＲＳ）、風疹、天然痘、帯状疱疹、西ナイル、および／またはジカ熱に由来し得る。
【0074】
ＣＭＶタンパク質には、エンベロープ糖タンパク質ＢおよびＣＭＶ ｐｐ６５が含まれ、ＥＢＶタンパク質には、ＥＢＶ ＥＢＮＡＩ、ＥＢＶ Ｐ１８およびＥＢＶ Ｐ２３が含まれ、肝炎タンパク質には、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、ＭおよびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのＰｒｅ－Ｓ抗原、ＨＢＣＡＧ ＤＥＬＴＡ、ＨＢＶ ＨＢＥ、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、ＨＣＶ ＮＳ３およびＨＣＶ ＮＳ４が含まれ、単純ヘルペスタンパク質には、即時型初期タンパク質および糖タンパク質Ｄが含まれ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質には、ＨＩＶ ｇｐ３２、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ Ｐ１７／２４、ＨＩＶ Ｐ２４、ＨＩＶ Ｐ５５ ＧＡＧ、ＨＩＶ Ｐ６６ ＰＯＬ、ＨＩＶ ＴＡＴ、ＨＩＶ ＧＰ３６、Ｎｅｆタンパク質および逆転写酵素などのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物が含まれ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス抗原には、Ｌ１タンパク質が含まれ、インフルエンザタンパク質には、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼが含まれ、日本脳炎タンパク質には、タンパク質Ｅ、Ｍ－Ｅ、Ｍ－Ｅ－ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１－ＮＳ２Ａおよび８０％Ｅが含まれ、マラリアタンパク質には、プラスモディウムタンパク質サーカムスポロゾイト（the Plasmodium proteins circumsporozoite）（ＣＳＰ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびフルクトースビスリン酸アルドラーゼが含まれ、麻疹タンパク質には、麻疹ウイルス融合タンパク質が含まれ、狂犬病タンパク質には、狂犬病糖タンパク質および狂犬病核タンパク質が含まれ、呼吸器合胞体タンパク質にはＲＳＶ融合タンパク質およびＭ２タンパク質が含まれ、ロタウイルスタンパク質にはＶＰ７ｓｃが含まれ、風疹タンパク質にはＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質が含まれ、帯状疱疹タンパク質にはｇｐｌとｇｐｌｌが含まれ、ジカタンパク質には前膜（pre-membrane）、エンベロープ（Ｅ）、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩ、非構造タンパク質１～５が含まれる。
【0075】
追加の特定の例示的なウイルスタンパク質配列には、以下が含まれる。
【0076】
【表1】
【0077】
その他のウイルス抗原の例については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ． ａｎｄ Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）（非特許文献１８）を参照。
【0078】
結論
上述の議論は、記載された装置および技術の例示的な実現を示すが、記載された機能を実現するために他のアーキテクチャが使用されてもよく、本開示の範囲内であることが意図される。さらに、主題は、構造的特徴および／または方法論的行為に特有の言語で説明されてきたが、添付の特許請求の範囲において定義される主題は、必ずしも説明される特定の特徴または行為に限定されないことを理解されたい。むしろ、特定の特徴および行為は、特許請求の範囲を実施する例示的な形態として開示されている。
上述の議論は、記載された装置および技術の例示的な実現を示すが、記載された機能を実現するために他のアーキテクチャが使用されてもよく、本開示の範囲内であることが意図される。さらに、主題は、構造的特徴および／または方法論的行為に特有の言語で説明されてきたが、添付の特許請求の範囲において定義される主題は、必ずしも説明される特定の特徴または行為に限定されないことを理解されたい。むしろ、特定の特徴および行為は、特許請求の範囲を実施する例示的な形態として開示されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【配列表】
【国際調査報告】