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▶ サイロン セラピューティクス カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-24
(54)【発明の名称】ＭＵＣ－１に特異的に結合する抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20250117BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250117BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250117BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250117BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250117BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250117BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250117BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250117BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250117BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250117BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
C07K16/46
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P35/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024543379
(86)(22)【出願日】2022-01-24
(85)【翻訳文提出日】2024-07-19
(86)【国際出願番号】 KR2022001255
(87)【国際公開番号】W WO2023140412
(87)【国際公開日】2023-07-27
(31)【優先権主張番号】10-2022-0010120
(32)【優先日】2022-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524273638
【氏名又は名称】サイロン セラピューティクス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ムーン，ユー リ
(72)【発明者】
【氏名】ユーン，サンスーン
(72)【発明者】
【氏名】ジョ，テ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ア ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ソ ダム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
抗－ＭＵＣ１抗体、抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体、およびこれを含む癌の予防および／または治療用薬学的組成物が提供される。
【選択図】図１５
【選択図】図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、
配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）
を含む、抗－ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ－１）抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号２～６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８～１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、
配列番号１７～１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、
配列番号２０～２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号２８～３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号３４～３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）
を含む、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
配列番号７７～８６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号８７～９６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、ＭＵＣ１を発現する癌細胞の細胞死滅を誘導する活性を有するものである、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗－ＭＵＣ１抗体は、単クローン抗体である、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
配列番号１０９のアミノ酸配列を含むペプチドを特異的に認識するものである、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗原結合断片は、前記抗－ＭＵＣ１抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記抗－ＭＵＣ１抗体は、マウス由来抗体、マウス－ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載のＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、およびＴ細胞活性化抗原に対して特異的な１つ以上の抗原結合部位を含む、二重特異抗体。
【請求項10】
Ｔ細胞活性化抗原がＣＤ３ Ｔ細胞補助受容体（ＣＤ３）抗原である、請求項９に記載の二重特異抗体。
【請求項11】
前記二重特異抗体は、ＣＤ３抗原に対する抗原結合部位を含む抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３抗体またはその抗原結合断片、ＵＣＨＴ－１抗体またはその結合断片、またはＳＰ３４抗体またはその抗原結合断片である、請求項１０に記載の二重特異抗体。
【請求項12】
前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片のＣ末端またはＮ末端に連結されたものである、請求項１１に記載の二重特異抗体。
【請求項13】
前記抗－ＣＤ３抗体の抗原結合断片は、抗－ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の二重特異抗体。
【請求項14】
前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、
配列番号９８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、
配列番号９９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、
配列番号１００のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号１０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）
を含むものである、請求項１１に記載の二重特異抗体。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または請求項９～１４のいずれか１項に記載の二重特異抗体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項16】
前記癌は、血液癌、骨髄癌、甲状腺癌、子宮癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、および膵臓癌からなる群より選択される１種以上の癌である、請求項１５に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項17】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または請求項９～１４のいずれか１項に記載の二重特異抗体を暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項18】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項19】
請求項１８に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
抗－ＭＵＣ１抗体、抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体、およびこれを含む癌の予防および／または治療用薬学組成物が提供される。
【背景技術】
【0002】
ＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ－１）はムチン（ｍｕｃｉｎ）糖タンパク質の一種であり、多数の糖化された細胞外ドメインを含む膜貫通糖タンパク質である。ＭＵＣ１の長さは細胞表面で２００～５００ｎｍであり、ＭＵＣ１は正常上皮細胞の頂端膜に位置する。ＭＵＣ１は、乳房、胃、食道、膵臓、尿道、肺、腎臓および胆嚢のような多くの臓器の腺上または内腔上皮細胞で発現する。ムチンは膵臓、肺、乳房、卵巣などの癌を含み、多くの癌腫で過発現する。ムチンと癌の病的関連性について多くの研究が進められてきており、特に、ＭＵＣ１に対するいくつかの抗体が当分野で公知である。
【0003】
しかし、これらの治療的効能は依然として改善させることができ、このため、本出願は、改善された特徴を有する抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
一態様は、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0005】
他の態様は、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片と、抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片を含む、抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を提供する。
【0006】
さらに他の態様は、（ｉ）抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または（ｉｉ）前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0007】
さらに他の態様は、（ｉ）抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または（ｉｉ）前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を癌の予防または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法を提供する。
【0008】
さらに他の態様は、（ｉ）抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または（ｉｉ）前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の癌の予防または治療に使用するための用途または抗癌剤の製造に使用するための用途を提供する。
【0009】
さらに他の態様は、（ｉ）抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または（ｉｉ）抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび／または前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0010】
さらに他の態様は、前記（ｉ）抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または（ｉｉ）抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を暗号化するポリヌクレオチドを発現させる段階を含む、（ｉ）抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または（ｉｉ）前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
用語の定義
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与時、免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制すべくキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を利用して、抗－アイソタイプ（ａｎｔｉ－ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因になる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗－アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗－イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を含んでいる。このような副作用を改善すべく開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与時、免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制すべくキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を利用して、抗－アイソタイプ（ａｎｔｉ－ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因になる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗－アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗－イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を含んでいる。このような副作用を改善すべく開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。
【0012】
一具体例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス由来抗体）、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）、またはヒト化抗体であってもよい。前記抗体または抗原結合断片は、生体から分離されたもの、または非自然的に生産（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）されたものであってもよい。前記抗体または抗原結合断片は、組換え的または合成的に生産されたものであってもよい。前記抗体または抗原結合断片は、生体から分離されたもの、または非自然的に生成された（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。前記抗体または抗原結合断片は、合成的または組換え的に生成されたものであってもよい。
【0013】
他の例において、前記抗体は、ヒトを含む哺乳動物、鳥類などを含む任意の動物に由来（分離）するものであってもよい。例えば、前記抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体であってもよい。ここで、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体であって、ヒト免疫グロブリンライブラリーから分離された抗体または１つ以上のヒト免疫グロブリンに対して形質移植され、内在的免疫グロブリンは発現しない動物から分離された抗体を含む。
【0014】
抗－ＭＵＣ１抗体は、単クローン抗体または多クローン抗体であってもよいし、例えば、単クローン抗体であってもよい。単クローン抗体は、当業界で広く知られた方法の通りに製造できる。例えば、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ手法を用いて製造されてもよい。あるいは、抗－ＭＵＣ１抗体は、マウス由来の単クローン抗体で製造されてもよい。
【0015】
前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片において先に定義した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ部位、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を除いた残りの部位は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）に由来するものであってもよく、例えば、前記すべてのサブタイプの免疫グロブリンのフレームワーク部位、および／または軽鎖不変領域および／または重鎖不変領域に由来するものであってもよい。
【0016】
完全な抗体（例えば、ＩｇＧタイプ）は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【0017】
用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。
【0018】
用語、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたり、主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知の意味と同一のものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
【0019】
用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体中の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能をする領域を意味する。
【0020】
動物由来抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジで置換されるが、動物由来ＩｇＧ１ヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、２個の重鎖の間の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が３個から２個に減少して、ヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が互いに異なる効果を示す。したがって、ヒンジ領域の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ヒト化抗体の抗原結合効率性を増加させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列を変形させるためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者によく知られている。
【0021】
前記「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体構造に対するその断片で、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定しない。本発明における抗体の抗原結合断片は、前記相補性決定領域を１つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよい。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術により作製することができる。
【0022】
前記抗原結合断片のうちＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。
【0023】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点で、Ｆａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。
【0024】
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域だけを有している最小の抗体片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界で幅広く公知である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ；ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ－末端で直ちに連結されていて、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。前記ペプチドリンカーは先に説明した通りであり、例えば、１～１００個のアミノ酸の長さ、例えば、２～５０個のアミノ酸の長さまたは５～２５個のアミノ酸の長さであってもよいし、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。
【0025】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術により作製することができる。
【0026】
抗原結合断片、例えば、ｓｃＦＶにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介したり、介さずに連結可能である。前記ペプチドリンカーは、１～１００個または２～５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよいし、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａのような中性アミノ酸も含まれる。前記リンカーは、前記二重特異抗体の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定可能である。例えば、前記ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択された１種以上のアミノ酸を計１～１００個、２～５０個、または５～２５個含んでなるものであってもよい。一例において、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎは（Ｇ４Ｓ）の繰り返し数）であって、１～１０の整数、例えば、２～５の整数）で表されるものであってもよい。
【0027】
用語「拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」は、標的物（例えば、ＭＵＣ１）の生物学的活性の１つ以上を部分的ながら完全に遮断、抑制または中和させるすべての分子を含む概念で解釈される。例えば、「拮抗剤」抗体は、抗体が結合する抗原（例えば、ＭＵＣ１）の生物学的活性を抑制または減少させる抗体を意味する。拮抗剤は、リガンド（標的）に対する受容体に結合して、受容体リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を減少させたり、リガンドによって活性化されていた細胞を無能力化させたり、または死滅させる作用が可能である。また、拮抗剤は、受容体－リガンド間の相互作用を完全に断絶させたり、リガンドと競争的に受容体に結合したり、受容体の三次構造の変化または下向調節（ｄｏｗｎｒｅ ｇｕｌａｔｉｏｎ）によって前記受容体－リガンド間の相互作用を実質的に減少させることができる。
【0028】
抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片
本発明の一例は、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ－１）を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを提供する。
本発明の一例は、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ－１）を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを提供する。
【0029】
前記ＭＵＣ１は、ヒトＭＵＣ１、サル、イヌ、ラット、またはマウスなどのＭＵＣ１であってもよい。一例において、前記ヒトＭＵＣ１は、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｍ２（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ａ６ＺＩＤ５；ＮＣＢＩ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＳ０１２９４．１）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ１（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ２（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－２）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ３（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－３）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ４（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－４）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ５（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－５）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ６（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－６）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｙ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－７）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ８（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－８）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ９（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－９）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｆ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１０）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｙ－ＬＳＰ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１１）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｓ２（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１２）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｍ６（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１３）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ ＺＤ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１４）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｔ１０（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１５）、ＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｅ２（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１６）、またはＭＵＣ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｊ１３（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｐ１５９４１－１７）などであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0030】
一例において、前記ヒトＭＵＣ１は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１０１８０１６．１、ＮＰ＿００１０１８０１７．１、ＮＰ＿００１０３７８５５．１、ＮＰ＿００１０３７８５６．１、ＮＰ＿００１０３７８５７．１、ＮＰ＿００１０３７８５８．１、ＮＰ＿００１１９１２１４．１、ＮＰ＿００１１９１２１５．１、ＮＰ＿００１１９１２１６．１、ＮＰ＿００１１９１２１７．１、ＮＰ＿００１１９１２１８．１、ＮＰ＿００１１９１２１９．１、ＮＰ＿００１１９１２２０．１、ＮＰ＿００１１９１２２１．１、ＮＰ＿００１１９１２２２．１、ＮＰ＿００１１９１２２３．１、ＮＰ＿００１１９１２２４．１、ＮＰ＿００１１９１２２５．１、ＮＰ＿００１１９１２２６．１、ＮＰ＿００２４４７．４などで提供されるアミノ酸配列を有することができるが、これに制限されるわけではなく、それぞれのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１０１８０１６．２、ＮＭ＿００１０１８０１７．２、ＮＭ＿００１０４４３９０．２、ＮＭ＿００１０４４３９１．２、ＮＭ＿００１０４４３９２．２、ＮＭ＿００１０４４３９３．２、ＮＭ＿００１２０４２８５．１、ＮＭ＿００１２０４２８６．１、ＮＭ＿００１２０４２８７．１、ＮＭ＿００１２０４２８８．１、ＮＭ＿００１２０４２８９．１、ＮＭ＿００１２０４２９０．１、ＮＭ＿００１２０４２９１．１、ＮＭ＿００１２０４２９２．１、ＮＭ＿００１２０４２９３．１、ＮＭ＿００１２０４２９４．１、ＮＭ＿００１２０４２９５．１、ＮＭ＿００１２０４２９６．１、ＮＭ＿００１２０４２９７．１、ＮＭ＿００２４５６．５などで提供されるヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によって暗号化されるものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0031】
本明細書において、タンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有するいうのは、タンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドが前記配列を含むか、前記配列を必須的に含むか、前記配列からなることをすべて意味するために使用できる。
【0032】
これらのポリペプチドは、抗－ＭＵＣ１抗体の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）として使用可能である。この時、前記相補性決定部位は、通常のすべての方法により決定可能であり、例えば、ＩＭＧＴ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）またはＫａｂａｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）により決定できるが、これに制限されるわけではない。
【0033】
他の例において、前記ポリペプチドからなる群より選択された１種以上を含むＭＵＣ１標的ポリペプチド分子が提供される。
【0034】
前記ＭＵＣ１標的ポリペプチド分子は、先に説明した抗－ＭＵＣ１抗体の重鎖相補性決定部位、軽鎖相補性決定部位、またはこれらの組み合わせ；または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域、前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。
【0035】
前記ＭＵＣ１標的ポリペプチド分子は、これに限定されないが、抗－ＭＵＣ１抗体、前記抗体の抗原結合断片、または抗－ＭＵＣ１抗体類似体（抗体と類似の骨格と機能を有する構造体；例えば、ペプチボディ、ナノボディなど）、または多重結合抗体などの前駆体または構成部分（例えば、ＣＤＲ）として役割を果たすことができる。
【0036】
用語「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ペプチドと抗体のＦｃ部分などの不変部位の全部または一部が融合した融合タンパク質であって、抗体と類似の骨格と機能を有するタンパク質を意味する。ここで、先に説明した１種以上のペプチドが抗原結合部位（重鎖および／または軽鎖ＣＤＲまたは可変領域）として作用できる。
【0037】
用語「ナノボディ」は、単一－ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、抗体の単一可変ドメインをモノマー形態で含む抗体断片を意味し、完全な構造の抗体と類似に、特定の抗原に対して選択的に結合する特性を有する。ナノボディの分子量は、一般に約１２ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度で、完全な抗体（２個の重鎖と２個の軽鎖を含む）の一般的な分子量（約１５０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ）と比較して非常に小さく、場合によっては、Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ断片より小さい。
【0038】
具体的には、本発明は、ＭＵＣ１を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号７、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むことができ、さらに詳しくは、配列番号２～６、配列番号８～１５、配列番号１７～１８、配列番号２０～２６、配列番号２８～３２、および配列番号３４および配列番号３８からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【0039】
前記ポリペプチドおよびこれらの適用可能な相補性決定部位を下記表１にまとめた。下記表１中、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３は、重鎖相補性決定部位を意味し、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３は、軽鎖相補性決定部位を意味する。
【表1-1】
【0040】
【表1-2】
【0041】
一例において、前記ポリペプチドからなる群より選択された１種以上を相補性決定部位として含む抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0042】
前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖の相補性決定部位であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、
配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）
からなる群より選択される１種以上を含むものであってもよい。
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、
配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）
からなる群より選択される１種以上を含むものであってもよい。
【0043】
前記配列番号１のアミノ酸配列は、下記一般式１のアミノ酸配列の通りである：
［一般式１］（配列番号１）
Ｘ１－Ｙ－Ｗ－Ｍ－Ｘ２
Ｘ１はＤまたはＳ、
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＨである。
［一般式１］（配列番号１）
Ｘ１－Ｙ－Ｗ－Ｍ－Ｘ２
Ｘ１はＤまたはＳ、
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＨである。
【0044】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ１として使用可能な配列番号１のポリペプチドは、例えば、配列番号２～６からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、詳しい配列を前記表１と配列リストに記載されており、記載されたアミノ酸配列において太字の下線部分は変形されたアミノ酸を表す。
【0045】
前記配列番号７のアミノ酸配列は、下記一般式２のアミノ酸配列の通りである：
［一般式２］（配列番号７）
Ｘ３－Ｉ－Ｘ４－Ｘ５－Ｋ－Ｘ６－Ｙ－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｙ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｓ－Ｖ－Ｋ－Ｇ
Ｘ３はＱ、Ｆ、またはＶ、
Ｘ４はＲまたはＫ、
Ｘ５はＮ、Ｓ、Ｑ、またはＹ、
Ｘ６はＰまたはＡ、
Ｘ７はＮまたはＧ、
Ｘ８はＹ、Ｇ、またはＳ、
Ｘ９はＥまたはＴ、
Ｘ１０はＴまたはＫ、
Ｘ１１はＹまたはＥ、
Ｘ１２はＳ、Ａ、またはＶ、
Ｘ１３はＮ、Ｑ、またはＡである。
［一般式２］（配列番号７）
Ｘ３－Ｉ－Ｘ４－Ｘ５－Ｋ－Ｘ６－Ｙ－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｙ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｓ－Ｖ－Ｋ－Ｇ
Ｘ３はＱ、Ｆ、またはＶ、
Ｘ４はＲまたはＫ、
Ｘ５はＮ、Ｓ、Ｑ、またはＹ、
Ｘ６はＰまたはＡ、
Ｘ７はＮまたはＧ、
Ｘ８はＹ、Ｇ、またはＳ、
Ｘ９はＥまたはＴ、
Ｘ１０はＴまたはＫ、
Ｘ１１はＹまたはＥ、
Ｘ１２はＳ、Ａ、またはＶ、
Ｘ１３はＮ、Ｑ、またはＡである。
【0046】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ２として使用可能な配列番号７のポリペプチドは、例えば、配列番号８～１５からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、詳しい配列を前記表１と配列リストに記載されており、記載されたアミノ酸配列において太字の下線部分は変形されたアミノ酸を表す。
【0047】
前記配列番号１６のアミノ酸配列は、下記一般式３のアミノ酸配列の通りである：
［一般式３］（配列番号１６）
Ａ－Ｍ－Ｉ－Ｔ－Ｓ－Ｄ－Ｇ－Ｙ－Ａ－Ｘ１４－Ｄ－Ｙ
Ｘ１４はＭまたはＦである。
［一般式３］（配列番号１６）
Ａ－Ｍ－Ｉ－Ｔ－Ｓ－Ｄ－Ｇ－Ｙ－Ａ－Ｘ１４－Ｄ－Ｙ
Ｘ１４はＭまたはＦである。
【0048】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ３として使用可能な配列番号１６のポリペプチドは、例えば、配列番号１７～１８からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、詳しい配列を前記表１と配列リストに記載されており、記載されたアミノ酸配列において太字の下線部分は変形されたアミノ酸を表す。
【0049】
前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖の相補性決定部位であって、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）
からなる群より選択される１種以上を含むものであってもよい。
配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）
からなる群より選択される１種以上を含むものであってもよい。
【0050】
前記配列番号１９のアミノ酸配列は、下記一般式４のアミノ酸配列の通りである：
［一般式４］（配列番号１９）
Ｘ１５－Ｘ１６－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｘ１７－Ｌ－Ｘ１８－Ｓ－Ｓ－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｎ－Ｙ－Ｌ－Ａ
Ｘ１５はＫまたはＲ、
Ｘ１６はＳまたはＡ、
Ｘ１７はＬまたはＶ、
Ｘ１８はＬ、Ｙ、またはＨ、
Ｘ１９はＮまたはＳ、
Ｘ２０はＱまたはＧ、
Ｘ２１はＫまたはＹである。
［一般式４］（配列番号１９）
Ｘ１５－Ｘ１６－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｘ１７－Ｌ－Ｘ１８－Ｓ－Ｓ－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｎ－Ｙ－Ｌ－Ａ
Ｘ１５はＫまたはＲ、
Ｘ１６はＳまたはＡ、
Ｘ１７はＬまたはＶ、
Ｘ１８はＬ、Ｙ、またはＨ、
Ｘ１９はＮまたはＳ、
Ｘ２０はＱまたはＧ、
Ｘ２１はＫまたはＹである。
【0051】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲ１として使用可能な配列番号１９のポリペプチドは、例えば、配列番号２０～２６からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、詳しい配列を前記表１と配列リストに記載されており、記載されたアミノ酸配列において太字の下線部分は変形されたアミノ酸を表す。
【0052】
前記配列番号２７のアミノ酸配列は、下記一般式５のアミノ酸配列の通りである：
［一般式５］（配列番号２７）
Ｗ－Ｘ２２－Ｓ－Ｘ２３－Ｒ－Ｘ２４－Ｘ２５
Ｘ２２はＡまたはＧ、
Ｘ２３はＴまたはＳ、
Ｘ２４はＥまたはＡ、
Ｘ２５はＳまたはＴである。
［一般式５］（配列番号２７）
Ｗ－Ｘ２２－Ｓ－Ｘ２３－Ｒ－Ｘ２４－Ｘ２５
Ｘ２２はＡまたはＧ、
Ｘ２３はＴまたはＳ、
Ｘ２４はＥまたはＡ、
Ｘ２５はＳまたはＴである。
【0053】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲ２として使用可能な配列番号２７のポリペプチドは、例えば、配列番号２８～３２からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、詳しい配列を前記表１と配列リストに記載されており、記載されたアミノ酸配列において太字の下線部分は変形されたアミノ酸を表す。
【0054】
前記配列番号３３のアミノ酸配列は、下記一般式６のアミノ酸配列の通りである：
［一般式６］（配列番号３３）
Ｑ－Ｑ－Ｘ２６－Ｆ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｐ－Ｘ２９－Ｔ
Ｘ２６はＣまたはＳ、
Ｘ２７はＳまたはＱ、
Ｘ２８はＹ、Ｔ、またはＳ、
Ｘ２９はＬまたはＹである。
［一般式６］（配列番号３３）
Ｑ－Ｑ－Ｘ２６－Ｆ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｐ－Ｘ２９－Ｔ
Ｘ２６はＣまたはＳ、
Ｘ２７はＳまたはＱ、
Ｘ２８はＹ、Ｔ、またはＳ、
Ｘ２９はＬまたはＹである。
【0055】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲ３として使用可能な配列番号２７のポリペプチドは、例えば、配列番号３４～３８からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、詳しい配列を前記表１と配列リストに記載されており、記載されたアミノ酸配列において太字の下線部分は変形されたアミノ酸を表す。
【0056】
一例において、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
【0057】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定部位、または前記１つ以上の重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
【0058】
配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定部位、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
【0059】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号２～６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８～１６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７～１８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）からなる群より選択された１種以上の重鎖相補性決定部位、または前記１つ以上の重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号２０～２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８～３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４～３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）からなる群より選択された１種以上の軽鎖相補性決定部位、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
配列番号２～６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８～１６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７～１８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）からなる群より選択された１種以上の重鎖相補性決定部位、または前記１つ以上の重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号２０～２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８～３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４～３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）からなる群より選択された１種以上の軽鎖相補性決定部位、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
【0060】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号２～６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８～１６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７～１８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号２０～２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８～３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４～３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
配列番号２～６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８～１６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７～１８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号２０～２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８～３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４～３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【0061】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、下記表２および表３に組み合わされた重鎖可変領域のＣＤＲ配列と軽鎖可変領域のＣＤＲ配列とを含むものであってもよい。
【表2】
【0062】
【表3】
【0063】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８、配列番号９、または配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）を含む重鎖相補性決定部位、または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖相補性決定部位、または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８、配列番号９、または配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）を含む重鎖相補性決定部位、または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖相補性決定部位、または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
【0064】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）を含む重鎖相補性決定部位、または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号２１、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４または配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖相補性決定部位、または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）を含む重鎖相補性決定部位、または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号２１、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４または配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖相補性決定部位、または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位との組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含むものであってもよい。
【0065】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
１）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
２）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
３）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
４）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；または
５）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
を含むものであってもよい。
１）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
２）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
３）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
４）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；または
５）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）；
を含むものであってもよい。
【0066】
前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、一般式１～６の相補性決定部位からなる群より選択された１種以上の相補性決定部位に加えて、１つ以上の重鎖可変領域のフレームワーク配列、１つ以上の軽鎖可変領域のフレームワーク配列、または１つ以上の重鎖可変領域のフレームワーク配列と１つ以上の軽鎖可変領域のフレームワーク配列とを含むことができる。前記軽鎖可変領域のフレームワーク配列と軽鎖可変領域のフレームワーク配列の一例は下記表４～表７に示す。
【表4】
【0067】
【表5】
【0068】
【表6】
【0069】
【表7】
【0070】
一例において、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
前記重鎖相補性決定部位（前記表２中、ＶＨ０～ＶＨ９）を含む重鎖可変領域、前記軽鎖相補性決定部位（前記表３中、ＶＬ０～ＶＬ９）を含む軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせであってもよい。例えば、前記重鎖可変領域は、配列番号７７～８６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよいし、前記軽鎖可変領域は、配列番号８７～９６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。
前記重鎖相補性決定部位（前記表２中、ＶＨ０～ＶＨ９）を含む重鎖可変領域、前記軽鎖相補性決定部位（前記表３中、ＶＬ０～ＶＬ９）を含む軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせであってもよい。例えば、前記重鎖可変領域は、配列番号７７～８６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよいし、前記軽鎖可変領域は、配列番号８７～９６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【0071】
したがって、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７７～８６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
配列番号８７～９６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
これらの組み合わせを含むものであってもよい。
配列番号７７～８６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
配列番号８７～９６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
これらの組み合わせを含むものであってもよい。
【0072】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７８、配列番号８１、配列番号８４、または配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９４、または配列番号９５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
配列番号７８、配列番号８１、配列番号８４、または配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９４、または配列番号９５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【0073】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７８、配列番号８１、または配列番号８４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
配列番号８９、配列番号９１、または配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
配列番号７８、配列番号８１、または配列番号８４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
配列番号８９、配列番号９１、または配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【0074】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、
１）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
２）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
３）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
４）配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
５）配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
６）配列番号８４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
を含むものであってもよい。
１）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
２）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
３）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
４）配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
５）配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
６）配列番号８４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
を含むものであってもよい。
【0075】
用語、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一具体例によれば、前記エピトープは、ＭＵＣ１タンパク質内の部位、例えば、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【0076】
したがって、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合するものであってもよい。
【0077】
多重結合抗体
本発明の一例は、ＭＵＣ１を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを含む多重結合抗体または多重特異的抗体に関し、さらに詳しくは、ＭＵＣ１を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドと共に、第２ターゲットを特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを含む二重特異抗体であってもよい。
本発明の一例は、ＭＵＣ１を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを含む多重結合抗体または多重特異的抗体に関し、さらに詳しくは、ＭＵＣ１を特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドと共に、第２ターゲットを特異的に認識したり、および／または特異的に結合可能なポリペプチドを含む二重特異抗体であってもよい。
【0078】
本明細書において、用語「多重結合抗体」は、２つまたはそれ以上の異なる抗原を認識および／または結合したり、同一の抗原の互いに異なる部位を認識および／または結合する抗体を意味するもので、前記多重結合抗体のうちの１つの抗原結合部位が先に説明したポリペプチドを含むものであってもよい。
【0079】
本発明の他の例は、ＭＵＣ１に特異的に結合する第１抗原－結合ドメインおよびＣＤ３に特異的に結合する第２抗原－結合ドメインを含む二重特異抗原－結合分子に関する。詳しくは、本発明の一例は、本発明によるＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、およびＴ細胞活性化抗原に対して特異的な１つ以上の抗原結合部位を含む、二重特異抗体に関する。
【0080】
前記二重特異抗体において、前記Ｔ細胞活性化抗原がＣＤ３ Ｔ細胞補助受容体（ＣＤ３；ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ３）抗原（例えば、抗－ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ（ε）抗原）であってもよいし、前記二重特異抗体は、ＣＤ３抗原に対する抗原結合部位を含む抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。
【0081】
具体的には、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片と、抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片とを含む二重特異抗体（つまり、抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体）に関する。前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、それぞれの抗原であるＭＵＣ１およびＣＤ３に対する親和度および活性を維持しながら上昇効果を発揮することができる。
【0082】
前記二重特異抗体は、第１抗原のＭＵＣ１に特異的に結合し、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片は、前述したものと同一のものであってもよい。
【0083】
また、前記二重特異抗体は、第２抗原のＣＤ３に特異的に結合し、具体的には、抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、サル、マウスなどのＣＤ３に結合する、抗体またはその抗原－結合断片であってもよい。前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、例えば、Ｔ細胞－媒介の細胞死滅が有利または好ましい環境下、ＣＤ３を発現するＴ細胞を標的化したり、Ｔ細胞活性化を刺激するのに有用である。本発明の抗－ＣＤ３抗体、またはその抗原結合断片は、特定の細胞タイプ、例えば、腫瘍細胞または感染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）に対してＣＤ３－媒介のＴ細胞活性化を指示する二重特異抗体の部分として含まれる。
【0084】
前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体であれば制限なく使用可能であり、例えば、ＯＫＴ３抗体またはその抗原結合断片、ＵＣＨＴ－１抗体またはその抗原結合断片、ＳＰ３４抗体またはその抗原結合断片などを使用することができるが、これに制限されるわけではない。前記ＯＫＴ３抗体は、マウスまたはヒト化された免疫グロブリンＩｇＧ２ａアイソタイプの単クローン抗体であってもよい。前記ＵＣＨＴ－１抗体は、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体の～２０ｋＤａ ＣＤ３ε小単位と反応することが知られており、ＳＰ３４抗体は、ＣＤ３ε小単位に結合することが知られている。前記ＯＫＴ３抗体、ＵＣＨＴ－１抗体、またはＳＰ３４抗体の入手方法は、通常、当業界でよく知られている。
【0085】
一具体例において、前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、下記のポリペプチドからなる群より選択された１種以上のＣＤＲ配列、好ましくは６個のＣＤＲ配列を含むことができる（下記表８参照）：
配列番号９７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、
配列番号９８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、
配列番号９９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、
配列番号１００のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号１０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）。
配列番号９７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ１）、
配列番号９８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ２）、
配列番号９９のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ－ＣＤＲ３）、
配列番号１００のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ１）、
配列番号１０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ－ＣＤＲ３）。
【0086】
さらに詳しくは、前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１０３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１０４または配列番号１０５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
配列番号１０３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１０４または配列番号１０５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【表8】
【0087】
前記抗－ＣＤ３抗体の抗原結合断片は、抗－ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよい。
【0088】
本発明による抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、前記抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片が、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片のＣ末端またはＮ末端に連結されたものであってもよい。
【0089】
例えば、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の重鎖Ｎ末端またはＣ末端に結合した抗ＣＤ３抗体ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ－ＭＵＣ１ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ－ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｓｃＦｖまたはａｎｔｉ－ＭＵＣ１ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍ－ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ）、抗－ＭＵＣ１軽鎖Ｎ末端またはＣ末端に結合した抗ＣＤ３抗体ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ－ＭＵＣ１ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ－ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｓｃＦｖまたはａｎｔｉ－ＭＵＣ１ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍ－ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ）であってもよい。また、抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖがｍｏｎｏｖａｌｅｎｔまたはｄｉｖａｌｅｎｔで結合している二重抗体を含むことで抗－ＭＵＣ１抗体の抗原結合部位と抗－ＣＤ３抗体の抗原結合部位が１つずつあったり（１＋１）、２つと１つずつあって１つの二重抗体内に３つの抗原結合部位があったり（１＋２または２＋１）、抗原結合部位が２つずつ４つある（２＋２）形態の二重特異抗体であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0090】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、および前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端、例えば、軽鎖のＮ末端に連結された抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片を含むものであってもよい。一例において、前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、ＭＵＣ１に対する完全な抗体（例えば、ＩｇＧ型抗体）および前記抗体の軽鎖のＮ末端に連結された抗－ＣＤ３抗体の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）を含むものであってもよい。
【0091】
前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体において、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片と抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介したり、介さずに連結可能である。また、抗原結合断片内の重鎖部分と軽鎖部分、例えば、ｓｃＦｖ断片内の重鎖可変領域と軽鎖可変領域もペプチドリンカーを介したり、介さずに連結可能である。前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片と抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片とを連結するペプチドリンカーと、抗原結合断片内の重鎖部分と軽鎖部分とを連結するペプチドリンカーは、同一でも異なっていてもよい。前記ペプチドリンカーは、１～１００個または２～５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよいし、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａのような中性アミノ酸も含まれる。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は当業界で公知である。一方、前記リンカーは、前記二重特異抗体の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定可能である。例えば、前記ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を、計１～１００個、２～５０個、または５～２５個を含んでなるものであってもよい。一例において、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎは（ＧＧＧＧＳ）の繰り返し数）であって、１～１０の整数、例えば、２～５の整数）で表されるものであってもよい。
【0092】
一例において、前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片に位置する軽鎖のＮ末端に結合した抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ形態であってもよい。前記のように、抗ＣＤ３抗体ｓｃＦｖが抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片に位置する軽鎖のＮ末端に結合した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、抗ＣＤ３抗体ｓｃＦｖが抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片に位置する軽鎖のＣ末端に結合した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体より、癌細胞に対する細胞毒性、癌細胞増殖抑制効果、および／または癌の治療効果にさらに優れることができる。
【0093】
医薬用途（ｍｅｄｉｃａｌ ｕｓｅ）
他の態様は、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
他の態様は、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0094】
他の態様は、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法を提供する。前記癌の予防および／または治療方法は、前記投与する段階の前に、癌の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0095】
前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片は、癌の予防または治療に有用に使用することができる。本明細書で提供される前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片は、ＭＵＣ１の作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）としての機能を示すので、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片が効能（例えば、癌細胞死滅などの抗癌効能）を十分に発揮するために、適用対象癌は、当該癌細胞がＭＵＣ１を発現することが有利であり得、例えば、ＭＵＣ１を発現する固形癌であってもよい。具体的には、本発明の一例は、固形癌標的指向および治療が向上したＭＵＣ－１に特異的に結合する新規な抗体およびその用途に関する。一例において、前記癌は、血液癌（例えば、Ｂ細胞リンパ腫など）、骨髄癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば、子宮頸癌）、皮膚癌、黒色腫、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、および膵臓癌、または抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合する抗原のエピトープが３０％以上発現する固形癌からなる群より選択される１種以上を含むが、これに制限されるわけではない。
【0096】
前記薬学的組成物または方法において、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤などからなる群より選択された１種以上の添加剤と共に提供できる。
【0097】
前記薬学的に許容される担体は、抗体の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記薬学的組成物は、前記成分のほか、薬学的組成物の製造に通常用いられる希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
【0098】
前記薬学的組成物、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片は、経口または非経口投与可能である。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与されてもよい。
【0099】
前記薬学的組成物、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。例えば、前記薬学的組成物、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１～５０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記１日投与量は、単位容量形態で１つの製剤に製剤化されるか、適切に分量して製剤化されるか、多用量容器内に入れて製造されてもよい。用語「薬学的有効量」は、前記有効成分（つまり、前記抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片）が所望の効果、つまり、癌を予防および／または治療する効果を示すことのできる量を意味し、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。
【0100】
前記薬学的組成物は、当該当業者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0101】
また、前記薬学的組成物は、個別治療剤として投与されたり、他の治療剤と併用して投与され、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよい。
【0102】
一方、前記薬学的組成物は、抗体または抗原結合断片を含むので、免疫リポソームに剤形化されてもよい。抗体を含むリポソームは、当業界で広く知られた方法により製造できる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリコール－誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として逆相蒸発法により製造できる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド－切替反応によりリポソームに接合される。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加的にリポソーム内に含まれてもよい。
【0103】
前記薬学的組成物の投与対象または前記予防および／または治療方法の投与対象患者は、哺乳類、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、またはラット、マウスなどの齧歯類などであってもよいが、これに制限されるわけではなく、既存の抗癌剤、例えば、前記標的細胞膜タンパク質（例えば、ＭＵＣ１に対する拮抗剤に対して耐性が生じた癌患者であってもよい。
【0104】
ポリペプチド、組換えベクター、および抗体の製造方法
本発明の他の例は、前記のようなポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを提供する。一具体例において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２～６、配列番号８～１５、配列番号１７～１８、配列番号２０～２６、配列番号２８～３２、および配列番号３４および配列番号３８からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを暗号化するものであってもよい。
本発明の他の例は、前記のようなポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを提供する。一具体例において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２～６、配列番号８～１５、配列番号１７～１８、配列番号２０～２６、配列番号２８～３２、および配列番号３４および配列番号３８からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを暗号化するものであってもよい。
【0105】
さらに他の具体例において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号７７～９６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを暗号化するものであってもよい。
【0106】
さらに他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【0107】
さらに他の例は、前記組換えベクターで形質転換された組換え細胞を提供する。
【0108】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用可能なベクターは、当業界で時々使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製できるが、これに制限されない。
【0109】
前記組換えベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動的に連結可能である。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることによって、他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。
【0110】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築される。前記発現用ベクターは、当業界において植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに用いられる通常のものを使用可能である。前記組換えベクターは、当業界で公知の多様な方法により構築できる。
【0111】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築される。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合サイトおよび転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むか、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられてもよいし、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。
【0112】
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであってもよい。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定かつ連続的にクローニングまたは発現させることができる細胞として当業界で公知のいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブチリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラチフィリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが用いられるが、これに制限されるわけではない。
【0113】
前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界で広く知られた運搬方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。
【0114】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界で広く知られた方法により容易に実施できる。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含まれている培地で形質転換体を培養することによって、形質転換体を容易に選別することができる。
【0115】
さらに他の例は、前記組換え細胞で前記ポリヌクレオチドを発現させる段階を含むポリペプチドまたは抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記ポリヌクレオチドを発現させる段階は、前記組換え細胞をこれに含まれているポリヌクレオチドの発現を許容する条件下で培養する段階を含むものであってもよい。前記ポリペプチドまたは抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片の製造方法は、前記発現させる段階または培養する段階の後に、ポリペプチドまたは抗－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合断片、または前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体またはその抗原結合断片を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【0116】
抗－ＭＵＣ１抗体、および抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、癌細胞の成長を効果的に阻害できるので、癌の予防または治療効果に優れている。
【図面の簡単な説明】
【0117】
【図1】図１は、膵臓癌特異的なＭＰ１単クローン抗体の末梢血液および正常膵臓上皮細胞と膵臓癌細胞の結合反応を示す。（顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、正常膵臓上皮細胞（Ｈ６Ｃ７）、５種の膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１））
【図7A】図７Ａおよび図７Ｂは、ＭＰ１に反応する膵臓癌細胞株表面の抗原定量結果を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｒａｙ方法を用いたＭＰ１単クローン抗体のエピトープマッピング結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0118】
以下、本発明を以下の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるわけではない。
【0119】
実施例１．ＭＰ１単クローン抗体の発掘
膵臓癌に特異的な新たな抗体を開発するために次のような実験を行い、開発抗体は、膵臓癌だけでなく、乳癌と胃癌においても一部発現し、固形癌特異的抗体でＭＰ１と命名することにした。
膵臓癌に特異的な新たな抗体を開発するために次のような実験を行い、開発抗体は、膵臓癌だけでなく、乳癌と胃癌においても一部発現し、固形癌特異的抗体でＭＰ１と命名することにした。
【0120】
実施例１－１．ＭＰ単クローン抗体作製のためのターゲット部位の設計および選定方法
膵臓癌で発現する特異的な抗原に対する単クローン抗体を開発するために、多様な膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１をマウスに免疫化した後、これに対する単クローン抗体を細胞融合方法で確立した。この後、ハイブリドーマ選別過程で膵臓癌細胞株に陽性でかつ正常膵臓細胞株のＨ６Ｃ７と末梢血液に陰性の抗体を選んで選別した。
膵臓癌で発現する特異的な抗原に対する単クローン抗体を開発するために、多様な膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１をマウスに免疫化した後、これに対する単クローン抗体を細胞融合方法で確立した。この後、ハイブリドーマ選別過程で膵臓癌細胞株に陽性でかつ正常膵臓細胞株のＨ６Ｃ７と末梢血液に陰性の抗体を選んで選別した。
【0121】
実施例１－２．ハイブリドーマ製造抗体の選別
膵臓癌特異的単クローン抗体を開発するために、５種の膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１）を同数で混合して、６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス１匹あたり１×１０７の数だけマウス腹腔（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）に３週間の間隔で３回注入して免疫化した。前記のように免疫化されたマウスの脾臓を切除して単一細胞浮遊液を得て、ＲＰＭＩ１６４０で２回程度洗浄した後、０．４％ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（ｓｉｇｍａ）を１：１（ｖ／ｖ）で混合した後、顕微鏡で染色されない細胞を測定するトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）染色法で細胞数を計数した。細胞融合ｐａｒｔｎｅｒ細胞としてはＸ６３ ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）を用い、前記脾臓細胞と同一に洗浄後、細胞数を計数した。前記骨髄（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と脾臓細胞とを混合した後、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１５００を添加して細胞を融合させた後、細胞を遠心分離した。融合したハイブリドーマ細胞は１ｘＨＡＴが含まれているＲＰＭＩ（２０％ＦＢＳ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）に懸濁させて９６－ウェルプレートに１５０ｕｌ分注した後、３７℃５％ＣＯ２培養器で培養した。前記融合後、一定期間、ＨＡＴが含まれている培地で選別過程を進行させ、群落を形成したウェルが観察されると、ＨＴ培地に切り替えて３７℃５％ＣＯ２培養器で４８時間培養後、正常膵臓細胞株Ｈ６Ｃ７と免疫に使用された５種の膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１をそれぞれ次のように蛍光染色を実行し、フローサイトメトリー分析した。準備された細胞にハイブリドーマ培養上澄液を１００ｕｌずつ入れて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を水洗し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で水洗した後、フローサイトメトリー測定した。
膵臓癌特異的単クローン抗体を開発するために、５種の膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１）を同数で混合して、６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス１匹あたり１×１０７の数だけマウス腹腔（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）に３週間の間隔で３回注入して免疫化した。前記のように免疫化されたマウスの脾臓を切除して単一細胞浮遊液を得て、ＲＰＭＩ１６４０で２回程度洗浄した後、０．４％ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（ｓｉｇｍａ）を１：１（ｖ／ｖ）で混合した後、顕微鏡で染色されない細胞を測定するトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）染色法で細胞数を計数した。細胞融合ｐａｒｔｎｅｒ細胞としてはＸ６３ ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）を用い、前記脾臓細胞と同一に洗浄後、細胞数を計数した。前記骨髄（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と脾臓細胞とを混合した後、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１５００を添加して細胞を融合させた後、細胞を遠心分離した。融合したハイブリドーマ細胞は１ｘＨＡＴが含まれているＲＰＭＩ（２０％ＦＢＳ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）に懸濁させて９６－ウェルプレートに１５０ｕｌ分注した後、３７℃５％ＣＯ２培養器で培養した。前記融合後、一定期間、ＨＡＴが含まれている培地で選別過程を進行させ、群落を形成したウェルが観察されると、ＨＴ培地に切り替えて３７℃５％ＣＯ２培養器で４８時間培養後、正常膵臓細胞株Ｈ６Ｃ７と免疫に使用された５種の膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１をそれぞれ次のように蛍光染色を実行し、フローサイトメトリー分析した。準備された細胞にハイブリドーマ培養上澄液を１００ｕｌずつ入れて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を水洗し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で水洗した後、フローサイトメトリー測定した。
【0122】
実施例１－３．
末梢血液に対する結合程度を確認するために、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、Ｚｅｎｂｉｏ）にハイブリドーマ上澄液を１００ｕｌ入れて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を洗浄し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で洗浄した後、フローサイトメトリー測定してその結果を記載した（図１）。図１は、膵臓癌特異的なＭＰ１単クローン抗体の末梢血液と正常膵臓上皮細胞（Ｈ６Ｃ７）および多様な種類の膵臓癌細胞との反応度検査結果を示す。
末梢血液に対する結合程度を確認するために、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、Ｚｅｎｂｉｏ）にハイブリドーマ上澄液を１００ｕｌ入れて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を洗浄し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で洗浄した後、フローサイトメトリー測定してその結果を記載した（図１）。図１は、膵臓癌特異的なＭＰ１単クローン抗体の末梢血液と正常膵臓上皮細胞（Ｈ６Ｃ７）および多様な種類の膵臓癌細胞との反応度検査結果を示す。
【0123】
図１に示されているように、前記方法で多様な膵臓癌細胞株に陽性でかつ正常膵臓上皮細胞のＨ６Ｃ７と末梢血液の顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）とリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）および単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）にすべて陰性の単クローン抗体（以下、ＭＰ１と命名する）を選別し、最終的に制限希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）により単一コロニーのＭＰ１ハイブリドーマ細胞を確保した。
【0124】
実施例２．多様な細胞株における抗体発現分析
実施例２－１．多様な細胞株における抗体発現
ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）とＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により確保した多様な癌細胞株におけるＭＰ１単クローン抗体の結合の有無をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。具体的には、癌細胞株は、ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）とＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で提示された培養培地と方法により、１０％ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地あるいはＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃で５％ＣＯ２状態の培養器を用いて培養した。また、ヒト膵臓上皮細胞株のＨ６Ｃ７はｋｅｒａｆａｓｔ社から購入して、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃：１７００５０４２）を用いて、３７℃で５％ＣＯ２状態の培養器を用いて培養した。
実施例２－１．多様な細胞株における抗体発現
ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）とＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により確保した多様な癌細胞株におけるＭＰ１単クローン抗体の結合の有無をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。具体的には、癌細胞株は、ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）とＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で提示された培養培地と方法により、１０％ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地あるいはＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃で５％ＣＯ２状態の培養器を用いて培養した。また、ヒト膵臓上皮細胞株のＨ６Ｃ７はｋｅｒａｆａｓｔ社から購入して、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃：１７００５０４２）を用いて、３７℃で５％ＣＯ２状態の培養器を用いて培養した。
【0125】
前記培養された多様な癌細胞に本発明のＭＰ１単クローン抗体をそれぞれ入れて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を入れて４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）で分析して、多様な固形癌細胞株におけるＭＰ１抗体の反応度を確認した（表９）。
【0126】
下記表９と表１０に記載しているように、ＭＰ１単クローン抗体は、膵臓癌および胃癌、乳癌、肺癌細胞株の一部と皮膚癌、前立腺癌細胞株では高く結合するのに対し、正常膵臓上皮細胞株のＨ６Ｃ７を含むＴ細胞、Ｂ細胞および脳癌、胆道癌、大腸癌細胞株では結合しなかったり、結合が弱く現れることを確認した。ＰＢＭＣは正常血液細胞には陰性であることを示したものである。
【0127】
ＭＰ１は、多様な膵臓癌細胞で陽性反応を示し、正常膵臓上皮細胞には陰性反応を示して、膵臓癌治療剤として使用できることを示す。
【表9-1】
【0128】
【表9-2】
【0129】
【表10】
【0130】
実施例２－２．ＩＨＣ（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析
人体の膵臓癌および乳癌組織においてＭＰ１単クローン抗体の結合抗原分布を免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）法で確認した。人体の膵臓癌および乳癌組織は韓国の忠北（チュンブク）大学病院から得ており、忠北大学病院病理課でパラフィン切片を作製した。
人体の膵臓癌および乳癌組織においてＭＰ１単クローン抗体の結合抗原分布を免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）法で確認した。人体の膵臓癌および乳癌組織は韓国の忠北（チュンブク）大学病院から得ており、忠北大学病院病理課でパラフィン切片を作製した。
【0131】
染色しようとする人体の乳癌組織を通常の方法でホルマリン固定後、パラフィン包埋してマイクロａｒｒａｙ切片を作製した。その後、スライド上に載せて、染色読取用の単一組織スライドを作製した。次に、ＭＰ１抗体を用いて、次のような方法で免疫組織化学染色を行った。キシレン（Ｘｙｌｅｎｅ）を１０分ずつ３回処理し、エタノールを１００％、８０％、５０％の順に処理し、最後に蒸留水で洗浄することによって脱パラフィン過程を進行させた。１ＸＴＢＳで洗浄後、１０ｍＭ Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ（ｐＨ６．０）抗原再生溶液にスライドを入れて２０分間電子レンジで抗原再生した。水道水を用いて徐々にスライド温度を下げ、１ＸＴＢＳに１０分間保管した。一次抗体としてマウスＭＰ１抗体を組織に処理して常温１時間反応後、１ＸＴＢＳで３回洗浄し、二次抗体として抗マウス抗体－ＨＲＰ接合体を常温で３０分間反応させた。１ＸＴＢＳで３回洗浄し、ＤＡＢ発色を１分３０秒間行い、１ＸＴＢＳで３回洗浄し、Ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇを４５秒間行い、流れる水道水にスライドを入れて１０分間洗浄した。脱水過程は脱パラフィン過程の逆順に進行させ、封入して、顕微鏡読取または写真撮影をした。
【0132】
【0133】
実施例３．ＭＰ１単クローン抗体に対する抗原分析
実施例３－１．ＭＰ１単クローン抗体の抗原サイズの確認
本発明のＭＰ１単クローン抗体が認知する抗原のタンパク質サイズを調べるために、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を実行した。ＭＰ１に対する抗原発現の高い膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ－２にｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．＃：１１３６１７０００１）が含まれている細胞溶解溶液（ＮＰ４０ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、８％ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌに電気泳動させて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）にｔｒａｎｓｆｅｒした。以後、精製されたＭＰ１単クローン抗体をｍｅｍｂｒａｎｅに処理した後、ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で発色させてバンドを確認した（図３）。図３から確認できるように、測定結果、ＭＰ１単クローン抗体が認知する抗原のサイズは約３００ｋＤａ近傍と確認された。
実施例３－１．ＭＰ１単クローン抗体の抗原サイズの確認
本発明のＭＰ１単クローン抗体が認知する抗原のタンパク質サイズを調べるために、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を実行した。ＭＰ１に対する抗原発現の高い膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ－２にｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．＃：１１３６１７０００１）が含まれている細胞溶解溶液（ＮＰ４０ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、８％ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌに電気泳動させて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）にｔｒａｎｓｆｅｒした。以後、精製されたＭＰ１単クローン抗体をｍｅｍｂｒａｎｅに処理した後、ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で発色させてバンドを確認した（図３）。図３から確認できるように、測定結果、ＭＰ１単クローン抗体が認知する抗原のサイズは約３００ｋＤａ近傍と確認された。
【0134】
実施例３－２．ＭＰ１単クローン抗原の分離分析
本発明のＭＰ１単クローン抗体が認知する抗原を同定するために、免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を行った。まず、ＭＰ１単クローン抗体に対する反応性の高い細胞株のＣａｐａｎ－２細胞株を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞溶解溶液（ＮＰ４０ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、遠心分離により細胞残存物を除去し、上澄液を集めて、ＭＰ１抗体が認知する抗原分離材料として使用した。タンパク質－Ｇセファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にＭＰ１単クローン抗体を入れて４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳに２回洗浄した後、予め作っておいたＣａｐａｎ－２ライセート（ｌｙｓａｔｅ）を入れて４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳで２回洗浄した。これから得られた免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った後、ｇｅｌをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ－２５０染色後、３００ｋＤａ近傍のＭＰ１に対する抗原と推定されるｂａｎｄを切断して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析をＰｒｏｔｅｏｍｅＴｅｃｈに同定依頼した。同定はＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析して得られた結果をＭＡＳＣＯＴでプロセシングした。このような一連の分析で得られたｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｔ１００種を細胞表面に発現しながら、３００ｋＤａ近傍のタンパク質サイズを有する抗原に分析範囲を限定して選別した結果、ＭＵＣ１をＭＰ１単クローン抗体に対する抗原として選定することができた（図４）。ＭＰ１から分離されたペプチド配列はＱＧＧＦＬＧＬＳＮＩＫ（配列番号１０７）である。
本発明のＭＰ１単クローン抗体が認知する抗原を同定するために、免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を行った。まず、ＭＰ１単クローン抗体に対する反応性の高い細胞株のＣａｐａｎ－２細胞株を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞溶解溶液（ＮＰ４０ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、遠心分離により細胞残存物を除去し、上澄液を集めて、ＭＰ１抗体が認知する抗原分離材料として使用した。タンパク質－Ｇセファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にＭＰ１単クローン抗体を入れて４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳに２回洗浄した後、予め作っておいたＣａｐａｎ－２ライセート（ｌｙｓａｔｅ）を入れて４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳで２回洗浄した。これから得られた免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った後、ｇｅｌをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ－２５０染色後、３００ｋＤａ近傍のＭＰ１に対する抗原と推定されるｂａｎｄを切断して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析をＰｒｏｔｅｏｍｅＴｅｃｈに同定依頼した。同定はＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析して得られた結果をＭＡＳＣＯＴでプロセシングした。このような一連の分析で得られたｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｔ１００種を細胞表面に発現しながら、３００ｋＤａ近傍のタンパク質サイズを有する抗原に分析範囲を限定して選別した結果、ＭＵＣ１をＭＰ１単クローン抗体に対する抗原として選定することができた（図４）。ＭＰ１から分離されたペプチド配列はＱＧＧＦＬＧＬＳＮＩＫ（配列番号１０７）である。
【0135】
実施例３－３．ＥＬＩＳＡによるＭＰ１単クローン抗体の抗原同定結果の検証
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで得られた抗原同定結果を検証するために、組換えタンパク質ＭＵＣ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．＃：１２１２３－ＨＣＣＨ）に対するＭＵＣ１単クローン抗体の反応性をＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙで確認した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで得られた抗原同定結果を検証するために、組換えタンパク質ＭＵＣ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．＃：１２１２３－ＨＣＣＨ）に対するＭＵＣ１単クローン抗体の反応性をＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙで確認した。
【0136】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたりの組換えタンパク質ＭＵＣ１を１００ｎｇ入れて３７℃で１時間反応させて抗原をコーティングした後、１ｘｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｓｉｇｍａ）をｗｅｌｌあたり２００ｕｌ入れて３７℃で１時間反応させてブロッキングした。前記準備されたプレートにＭＰ１単クローン抗体および対照群抗体、ＰＢＳ１００ｕｌをそれぞれ入れた後、３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳで水洗して、結合しない抗体は除去した。以後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を希釈して入れて３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ入れて１０分間反応させた後、硫酸５０ｕｌを入れて反応を中止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。組換えタンパク質ＭＵＣ１に対して、ＭＰ１単クローン抗体は図５のように反応性を示した。図５は、ＭＰ１単クローン抗体に対する抗原がＭＵＣ１であることをＥＬＩＳＡで検証した結果である。
【0137】
実施例３－４．ＩＰおよびＩＢによるＭＰ１単クローン抗体の抗原同定結果の検証
前記実験において、ＭＰ１単クローン抗体がＭＵＣ１を抗原として認知することをウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）でもう一度検定した。実施例３－２に記述したものと同様に、多様な膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ１溶解液を準備し、タンパク質－Ｇセファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に商用化されたＭＵＣ１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｃａｔ．＃Ｃ５９５（ＮＣＲＣ４８））とＭＰ１単クローン抗体をそれぞれ４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳで２回洗浄した後、予め作っておいたライセート（ｌｙｓａｔｅ）を入れて４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳで２回洗浄した。これから得られた免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を１０分間沸かした後、８％ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌに電気泳動させて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）にｔｒａｎｓｆｅｒした。以後、精製されたＭＰ１単クローン抗体をｍｅｍｂｒａｎｅに処理した後、ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で発色させてバンドを確認した。商用化されたＭＵＣ１抗体と膵臓癌細胞株とを反応させた免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）をＭＰ１抗体でｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇをした結果、Ｃａｐａｎ－２ライセート単独およびＭＰ１と膵臓癌細胞株ライセートとの免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）サンプルと同一の３００ｋＤａの位置でバンドを確認することができた。図６は、ＭＰ１単クローン抗体に対する抗原がＭＵＣ１であることをウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）で検証した結果である。
前記実験において、ＭＰ１単クローン抗体がＭＵＣ１を抗原として認知することをウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）でもう一度検定した。実施例３－２に記述したものと同様に、多様な膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ１溶解液を準備し、タンパク質－Ｇセファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に商用化されたＭＵＣ１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｃａｔ．＃Ｃ５９５（ＮＣＲＣ４８））とＭＰ１単クローン抗体をそれぞれ４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳで２回洗浄した後、予め作っておいたライセート（ｌｙｓａｔｅ）を入れて４℃で４時間混合後、１ＸＰＢＳで２回洗浄した。これから得られた免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を１０分間沸かした後、８％ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌに電気泳動させて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）にｔｒａｎｓｆｅｒした。以後、精製されたＭＰ１単クローン抗体をｍｅｍｂｒａｎｅに処理した後、ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で発色させてバンドを確認した。商用化されたＭＵＣ１抗体と膵臓癌細胞株とを反応させた免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）をＭＰ１抗体でｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇをした結果、Ｃａｐａｎ－２ライセート単独およびＭＰ１と膵臓癌細胞株ライセートとの免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）サンプルと同一の３００ｋＤａの位置でバンドを確認することができた。図６は、ＭＰ１単クローン抗体に対する抗原がＭＵＣ１であることをウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）で検証した結果である。
【0138】
実施例４．細胞表面抗原の定量化
膵臓癌細胞表面上のＭＰ１単クローン抗体に結合する抗原の発現レベルは、細胞表面抗原を測定するための定量的流動細胞測定法キットのＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ、Ｃａｔ．＃：Ｋ００７８）を用いて測定した。算定グラフによるＢｅａｄの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較で細胞株の抗体結合能力（ＡＢＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を計算することができる。図７Ａは、ＭＰ１単クローン抗体をＱＩＦＩＫＩＴを用いて多様な膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ１）の細胞表面上で検出されたＭＰ１に反応する抗原の発現レベルを示す結果である。
膵臓癌細胞表面上のＭＰ１単クローン抗体に結合する抗原の発現レベルは、細胞表面抗原を測定するための定量的流動細胞測定法キットのＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ、Ｃａｔ．＃：Ｋ００７８）を用いて測定した。算定グラフによるＢｅａｄの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較で細胞株の抗体結合能力（ＡＢＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を計算することができる。図７Ａは、ＭＰ１単クローン抗体をＱＩＦＩＫＩＴを用いて多様な膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ１）の細胞表面上で検出されたＭＰ１に反応する抗原の発現レベルを示す結果である。
【0139】
実施例５．エピトープマッピング（ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ）
次に、エピトープマッピングに使用したＭＵＣ－１抗原の一部の配列（アミノ酸８９５～１２６４番目のアミノ酸配列である）である（表１１）。抗原同定検証に使用した組換えＭＵＣ－１抗原のアミノ酸配列を含む部位を選定して、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｒａｙによりエピトープマッピングを進行させた。
次に、エピトープマッピングに使用したＭＵＣ－１抗原の一部の配列（アミノ酸８９５～１２６４番目のアミノ酸配列である）である（表１１）。抗原同定検証に使用した組換えＭＵＣ－１抗原のアミノ酸配列を含む部位を選定して、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｒａｙによりエピトープマッピングを進行させた。
【0140】
図７Ｂから確認できるように、ＭＰ１抗体は、ＰＡＨＧＶＴＳ配列を含むペプチドに用量依存的に結合し、よって、ＭＰ１の抗原結合部位つまり、エピトープはＰＡＨＧＶＴＳ（配列番号１０９）と確認された。
【表11】
【0141】
実施例６．ＭＰ１抗体可変領域の配列およびアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）分析
実施例６－１．アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の決定
実施例１で製造されたＭＰ１単クローン抗体のアイソタイプを決定するために、ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。その結果、ＭＰ１単クローン抗体はｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ／ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎと確認された。
実施例６－１．アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の決定
実施例１で製造されたＭＰ１単クローン抗体のアイソタイプを決定するために、ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。その結果、ＭＰ１単クローン抗体はｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ／ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎと確認された。
【0142】
実施例６－２．ＭＰ１抗体可変領域配列分析
ＭＰ１抗体遺伝子はＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。ＭＰ１ハイブリドーマから分離したＲＮＡからＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔを用いてＰＣＲを行い、これをｐＧＥＭ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シーケンシングによりＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通してマウス抗体遺伝子を確認した。表１２は、分析されたＭＰ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域における配列を示す。下記記載のアミノ酸配列において太字の下線部分は相補性決定部位を示す。下記表１２中、配列位置はＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍの基準によって作成したものである。
ＭＰ１抗体遺伝子はＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。ＭＰ１ハイブリドーマから分離したＲＮＡからＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔを用いてＰＣＲを行い、これをｐＧＥＭ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シーケンシングによりＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通してマウス抗体遺伝子を確認した。表１２は、分析されたＭＰ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域における配列を示す。下記記載のアミノ酸配列において太字の下線部分は相補性決定部位を示す。下記表１２中、配列位置はＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍの基準によって作成したものである。
【表12】
【0143】
実施例７．ＭＰ１ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の開発
二重抗体を製造するに先立ち、マウス起源の抗体の人体投与時、ヒト抗－マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＨＡＭＡ）反応によって現れる免疫原性を減少させ、Ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙの高い抗体を確保するために、ＭＰ１可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と残りの部分をヒトのＦｃに代替したヒト化抗体を作製した。選別したヒト化抗体は、抗原特異性および親和度が本来のマウス由来ＭＰ１抗体と類似していることを確認した。
二重抗体を製造するに先立ち、マウス起源の抗体の人体投与時、ヒト抗－マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＨＡＭＡ）反応によって現れる免疫原性を減少させ、Ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙの高い抗体を確保するために、ＭＰ１可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と残りの部分をヒトのＦｃに代替したヒト化抗体を作製した。選別したヒト化抗体は、抗原特異性および親和度が本来のマウス由来ＭＰ１抗体と類似していることを確認した。
【0144】
実施例７．１ Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎによる組換え抗体の配列選定
マウス抗体ＭＰ１（重鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７７；軽鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）の重鎖および軽鎖それぞれのＣＤＲ部位配列は、ＶＨ－ＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＤＹＷＭＮ）；ＶＨ－ＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＱＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴＹＹＳＮＳＶＫＧ）；ＶＨ－ＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＡＭＩＴＳＤＧＹＡＭＤＹ）；ＶＬ－ＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＫＳＳＱＳＬＬＬＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）；ＶＬ－ＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８（ＷＡＳＴＲＥＳ）；ＶＬ－ＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（ＱＱＣＦＳＹＰＬＴ）である。マウス抗体ＭＰ１の重鎖と軽鎖アミノ酸配列を最大限に類似に維持しながら、抗原結合力が同等であったり優れたヒト化抗体を、ヒト抗体遺伝子をコードしているｇｅｒｍｌｉｎｅの配列に基づいてＦｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎに対する配列部位をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法で組換え選別した。マウス抗体ＭＰ１の重鎖、軽鎖それぞれの配列と最も類似性が高くて、ヒト化組換え抗体配列のｂａｃｋｂｏｎｅとして用いたヒト抗体Ｇｅｒｍｌｉｎｅ遺伝子は下記表１３の通りである。
マウス抗体ＭＰ１（重鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７７；軽鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）の重鎖および軽鎖それぞれのＣＤＲ部位配列は、ＶＨ－ＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＤＹＷＭＮ）；ＶＨ－ＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＱＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴＹＹＳＮＳＶＫＧ）；ＶＨ－ＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＡＭＩＴＳＤＧＹＡＭＤＹ）；ＶＬ－ＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＫＳＳＱＳＬＬＬＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）；ＶＬ－ＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８（ＷＡＳＴＲＥＳ）；ＶＬ－ＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（ＱＱＣＦＳＹＰＬＴ）である。マウス抗体ＭＰ１の重鎖と軽鎖アミノ酸配列を最大限に類似に維持しながら、抗原結合力が同等であったり優れたヒト化抗体を、ヒト抗体遺伝子をコードしているｇｅｒｍｌｉｎｅの配列に基づいてＦｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎに対する配列部位をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法で組換え選別した。マウス抗体ＭＰ１の重鎖、軽鎖それぞれの配列と最も類似性が高くて、ヒト化組換え抗体配列のｂａｃｋｂｏｎｅとして用いたヒト抗体Ｇｅｒｍｌｉｎｅ遺伝子は下記表１３の通りである。
【0145】
前記選別されたヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を下記表１４に示した。下記記載のアミノ酸配列において太字の下線部分は相補性決定部位を示す。
【表13】
【0146】
【表14-1】
【0147】
【表14-2】
【0148】
実施例７．２ヒト化組換え抗体の発現および分析
前記表１４の重鎖９種（ＶＨ１～ＶＨ９を含む）と軽鎖９種（ＶＬ１～ＶＬ９を含む）の発現遺伝子に相当するアミノ酸配列をｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎしてＤＮＡ配列を合成し、合成したＤＮＡを用いて、ヒトＦｃ部位遺伝子（重鎖はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子、軽鎖はヒトＩｇ ｋａｐｐａ ｃｏｎｓｔａｎｔ遺伝子）にｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲで連結させて、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）に含まれているｐｃＤＮＡ３．４ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。作製されたヒト化ＭＰ１抗体の軽鎖および重鎖発現プラスミドを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞株にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて、４８ウェルスケールで一時発現生産した。
前記表１４の重鎖９種（ＶＨ１～ＶＨ９を含む）と軽鎖９種（ＶＬ１～ＶＬ９を含む）の発現遺伝子に相当するアミノ酸配列をｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎしてＤＮＡ配列を合成し、合成したＤＮＡを用いて、ヒトＦｃ部位遺伝子（重鎖はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子、軽鎖はヒトＩｇ ｋａｐｐａ ｃｏｎｓｔａｎｔ遺伝子）にｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲで連結させて、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）に含まれているｐｃＤＮＡ３．４ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。作製されたヒト化ＭＰ１抗体の軽鎖および重鎖発現プラスミドを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞株にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて、４８ウェルスケールで一時発現生産した。
【0149】
発現したヒト化抗体培養液を用いて、１）膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ－２に染色して細胞表面の結合の有無を、２）抗－ｈｕｍａｎ Ｉｇ抗体ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡによりヒト化抗体の発現の有無を確認した。全体８１種の重鎖、軽鎖の組み合わせ（つまり、表１４に記載された９種の重鎖可変領域から選択されたいずれか１つの重鎖可変領域を含む重鎖、および表１４に記載された９種の軽鎖可変領域から選択されたいずれか１つの軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗体の組み合わせ）の中から、元のマウス抗体またはキメラ抗体の細胞表面結合と類似のパターンの結合を示すヒト化抗体の組み合わせを確認することができ、一時発現させたヒト化抗体の発現程度を確認したｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ結果に基づいて全般的に抗体発現したことを確認することができた（表１５）。
【表15】
【0150】
前記表１５中、細胞表面結合（％）は、陰性対照群に比べて細胞表面に抗体が結合した陽性率を％で表したものであり、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）はｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡの４５０ｎｍ ＯＤ ｖａｌｕｅである。
【0151】
前記表１５に作製した８１種の抗体のうちＣａｐａｎ－２の細胞表面結合（％）が高い２０個の抗体を示した。表１２から確認できるように、ＶＨ８／ＶＬ３（重鎖８番／軽鎖３番の組み合わせの抗体；つまり、表１４の重鎖可変領域ＶＨ８を含む重鎖、および表１４の軽鎖可変領域ＶＬ３を含む軽鎖を含む抗体；以下、同一である）、ＶＨ１／ＶＬ５、ＶＨ４／ＶＬ４、ＶＨ４／ＶＬ５、ＶＨ１／ＶＬ４、ＶＨ８／ＶＬ４、ＶＨ１／ＶＬ２、ＶＨ７／ＶＬ４、ＶＨ７／ＶＬ３、ＶＨ８／ＶＬ２、ＶＨ４／ＶＬ８、およびＶＨ４／ＶＬ７抗体がＣａｐａｎ－２の細胞表面結合に優れていた。
【0152】
一次の一時発現において陽性度の高いヒト化抗体の重鎖および軽鎖の組み合わせの抗体遺伝子を４８ウェルから６ウェルスケールに拡張して一時発現を再び実行した後、発現した抗体はＣａｐａｎ－２膵臓癌細胞株との結合力を再確認した（図８）。
【0153】
図８のように、ＶＨ１／ＶＬ５、ＶＨ４／ＶＬ４、ＶＨ４／ＶＬ５、ＶＨ１／ＶＬ４、ＶＨ１／ＶＬ２、およびＶＨ７／ＶＬ４抗体がＣａｐａｎ－２の細胞表面結合に優れていた。
【0154】
実施例８．ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｂ／ｆｏｒｍａｔ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
実施例８－１．ヒト化ＭＰ１抗体を用いたＴ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ二重抗体の発現
多様な二重抗体形態のうちＴ細胞活性および高い抗癌機能を示し、同時に、Ｆｃ部位を保有して半減期が元の抗体に近く維持されるｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙを発現させた。Ｔ細胞活性のための抗－ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞活性を示すＯＫＴ３抗体のヒト化抗体可変領域を用いた。ヒト化ＯＫＴ３抗体の配列はＵＳ２００９０２０２５３２Ａ１特許から引用して用い、下記表１３中の配列番号１０３、配列番号１０５および配列番号１０６に相当する配列である。配列番号１０３は、ヒト化ＯＫＴ３抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列であり、配列番号１０４は、ヒト化ＯＫＴ３抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列であり、配列番号１０５は、ヒト化ＯＫＴ３抗体のｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列を示す。ヒト化ＯＫＴ３抗体は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の間に［ＧＧＧＳ］ｎ＝５ｌｉｎｋｅｒで連結されたｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）で構成し、ヒト化ＭＰ１抗体の軽鎖Ｎ末端（ＬＣＮ ｖｅｒｓｉｏｎ）またはＣ末端（ＬＣＣ ｖｅｒｓｉｏｎ）に［ＧＧＧＳ］ｎ＝３ｌｉｎｋｅｒで連結されるようにした。
実施例８－１．ヒト化ＭＰ１抗体を用いたＴ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ二重抗体の発現
多様な二重抗体形態のうちＴ細胞活性および高い抗癌機能を示し、同時に、Ｆｃ部位を保有して半減期が元の抗体に近く維持されるｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙを発現させた。Ｔ細胞活性のための抗－ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞活性を示すＯＫＴ３抗体のヒト化抗体可変領域を用いた。ヒト化ＯＫＴ３抗体の配列はＵＳ２００９０２０２５３２Ａ１特許から引用して用い、下記表１３中の配列番号１０３、配列番号１０５および配列番号１０６に相当する配列である。配列番号１０３は、ヒト化ＯＫＴ３抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列であり、配列番号１０４は、ヒト化ＯＫＴ３抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列であり、配列番号１０５は、ヒト化ＯＫＴ３抗体のｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列を示す。ヒト化ＯＫＴ３抗体は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の間に［ＧＧＧＳ］ｎ＝５ｌｉｎｋｅｒで連結されたｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）で構成し、ヒト化ＭＰ１抗体の軽鎖Ｎ末端（ＬＣＮ ｖｅｒｓｉｏｎ）またはＣ末端（ＬＣＣ ｖｅｒｓｉｏｎ）に［ＧＧＧＳ］ｎ＝３ｌｉｎｋｅｒで連結されるようにした。
【0155】
ヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖは、ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ結合を誘導してｓｔａｂｉｌｉｔｙを高めるために、重鎖可変領域の４４番目グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）と軽鎖可変領域の１００番目グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）をシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）に切り替えた（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．２５ｎｏ．７ｐｐ．３２１－３２９、２０１２）。
【0156】
二重抗体として発現させるために、ヒト化ＭＰ１重鎖遺伝子（前記表１１中、ＶＨ１～ＶＨ９のいずれか１つの重鎖を暗号化する遺伝子）ｐｌａｓｍｉｄとＬＣＮまたはＬＣＣタイプのヒト化ＭＰ１軽鎖－ＯＫＴ３ｓｃＦｖ遺伝子（前記表１１中、ＶＬ４またはＶＬ５の軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖配列を暗号化する遺伝子－ＯＫＴ３ｓｃＦｖ遺伝子）ｐｌａｓｍｉｄを１：１．７の比率でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。７日または１０日経過後、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた二重抗体培養液を用いて抗体発現（抗ｈｕｍａｎ Ｉｇを用いたｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）、細胞株結合（細胞表面染色およびＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ分析）、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙを行い、活性が確認された二重抗体培養液はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ方法で精製した。
【0157】
前記のように作製した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の配列（抗－ＭＵＣ１抗体の軽鎖配列および抗－ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ配列）を下記表１３に示した。抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ）が抗－ＭＵＣ１抗体の軽鎖のＣ末端に結合した形態をＬＣＣ、軽鎖のＮ末端に結合した形態をＬＣＮと表記した。
【0158】
下記表１６中、ＬＣＣタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体として（図９参照）、ＬＣＣ ｖｅｒｓｉｏｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＭＰ１ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＃４－ＯＫＴ３ｓｃＦｖは、表１４の軽鎖４番（ＶＬ４）の軽鎖可変領域（配列番号９１）を含む軽鎖配列（配列番号１１０）のＣ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の軽鎖配列（配列番号１１２）を示す。ＬＣＣ ｖｅｒｓｉｏｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＭＰ１ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＃５－ＯＫＴ３ｓｃＦｖは、表１４の軽鎖５番（ＶＬ５）の軽鎖可変領域（配列番号９２）を含む軽鎖配列（配列番号１１１）のＣ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の軽鎖配列（配列番号１１３）を示す。
【0159】
下記表１６中、ＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体として（図１２参照）、ＬＣＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＭＰ１ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＃４－ＯＫＴ３ｓｃＦｖは、表１４の軽鎖４番（ＶＬ４）の軽鎖可変領域（配列番号９１）を含む軽鎖配列（配列番号１１０）のＮ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の軽鎖配列（配列番号１１４）を示す。ＬＣＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＭＰ１ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＃４－ＯＫＴ３ｓｃＦｖは、表１４の軽鎖５番（ＶＬ５）の軽鎖可変領域（配列番号９２）を含む軽鎖配列（配列番号１１１）のＣ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の軽鎖配列（配列番号１１５）を示す。
【0160】
前記４種の抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の軽鎖配列において抗－ＭＵＣ１抗体の軽鎖とヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体との間は［ＧＧＧＳ］ｎ＝３ｌｉｎｋｅｒで連結した。抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の重鎖は、表１４の重鎖１番～重鎖９番（ＶＨ１～ＶＨ９）の重鎖可変領域（配列番号７８～配列番号８６）を含む重鎖配列を使用した。
【表16-1】
【0161】
【表16-2】
【0162】
実施例８－２．ＬＣＣタイプのヒト化ＭＰ１二重抗体の機能分析
実施例８－１で製造したＬＣＣタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体に対して、ＭＵＣ１抗原に対して陽性のＡｓＰＣ１膵臓癌の細胞表面結合力と細胞毒性分析（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）を行った。前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体がタンパク質レベルで発現することを、抗ｈｕｍａｎ Ｉｇ／抗ｈｕｍａｎ Ｉｇ－ＨＲＰを用いたＳａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡで確認し（表１７）、これらの二重抗体はＭＵＣ１抗原陽性の膵臓癌細胞のＡｓＰＣ１に結合することを、細胞表面染色およびフローサイトメーターにより確認した（図１０）。
実施例８－１で製造したＬＣＣタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体に対して、ＭＵＣ１抗原に対して陽性のＡｓＰＣ１膵臓癌の細胞表面結合力と細胞毒性分析（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）を行った。前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体がタンパク質レベルで発現することを、抗ｈｕｍａｎ Ｉｇ／抗ｈｕｍａｎ Ｉｇ－ＨＲＰを用いたＳａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡで確認し（表１７）、これらの二重抗体はＭＵＣ１抗原陽性の膵臓癌細胞のＡｓＰＣ１に結合することを、細胞表面染色およびフローサイトメーターにより確認した（図１０）。
【0163】
対照群としては、抗－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ／ＯＫＴｓｃＦｖヒト化二重抗体（ＭＳＴＮ－ＯＫＴ３）を使用した。前記ＭＳＴＮ－ＯＫＴ３は、国際公開公報（ＷＯ２０１２／０８７９６２）に記載されたｈ７Ｄ９．ｖ３抗体の配列を用いて、前記ｈ７Ｄ９．ｖ３抗体の軽鎖のＣ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ配列（配列番号１０６）が結合したＬＣＣタイプの二重特異抗体である。
【表17】
【0164】
前記表１７中、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）は、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡの４５０ｎｍ ＯＤ ｖａｌｕｅであり、一例において、抗体「ＶＨ１／ＶＬ５」は、表１４の重鎖１番（ＶＨ１）の重鎖可変領域（配列番号７８）を含む重鎖、および表１４の軽鎖５番（ＶＬ５）の軽鎖可変領域（配列番号９２）のＣ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した軽鎖（配列番号１１３）を含む抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を意味する。
【0165】
前記表１７で抗体が発現したにもかかわらず、図１０でフローサイトメーターで陰性を示すのは、ヒト化抗体の組み合わせ過程で元の抗体の親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を消失したからである。また、図１０から確認できるように、二重特異抗体の組み合わせのうち軽鎖４番－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体と一緒に発現させた二重特異抗体の組み合わせ（つまり、表１４の重鎖１番～重鎖９番のいずれか１つの重鎖可変領域と軽鎖４番の軽鎖可変領域のＣ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体が結合した軽鎖を含む二重特異抗体）はすべて細胞表面結合が現れたが、軽鎖５番－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体と一緒に発現させた二重特異抗体の組み合わせは、重鎖１番／軽鎖５番、重鎖２番／軽鎖５番、重鎖７番／軽鎖５番の組み合わせだけが細胞表面結合が現れた。
【0166】
発現させた二重特異抗体は、ターゲット細胞としてＣａｐａｎ－２とＡｓＰＣ－１細胞株を、エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）としてヒトＴ細胞を用いてＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙを行った。ターゲット細胞とエフェクター細胞との比率は１：１０とし、二重抗体の投入量は１ｕｇ／ｍｌと同一にした。４８時間後、ターゲット細胞の死滅の有無はＥＺ－Ｃｙｔｏｘ（ＤｏｇｅｎＢｉｏ、Ｃａｔ．＃：ＥＺ－１０００）を用いて測定し、次のような公式で％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙを計算し、これを図１１に示した。
【0167】
％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝（１－（抗体投与ウェルの測定値／ターゲットおよび効能細胞ウェルの測定値））Ｘ１００
【0168】
図１１から確認できるように、実施例８－２で製造したＬＣＣタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、対照群抗体（ＭＳＴＮ－ＯＫＴ３）より効果が低く、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙが３０％未満と効果がよく見られなかった。
【0169】
実施例８－３．ＬＣＮタイプのヒト化ＭＰ１二重抗体の機能分析（１）
実施例８－１で製造したＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体に対して、ＭＵＣ１抗原に対して陽性のＣａｐａｎ－１、ＡｓＰＣ１膵臓癌の細胞表面結合力と細胞毒性分析（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）を行った。
実施例８－１で製造したＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体に対して、ＭＵＣ１抗原に対して陽性のＣａｐａｎ－１、ＡｓＰＣ１膵臓癌の細胞表面結合力と細胞毒性分析（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）を行った。
【0170】
前記表１６のように発現させたＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体がタンパク質レベルで発現することを、抗ｈｕｍａｎ Ｉｇ／抗ｈｕｍａｎ Ｉｇ－ＨＲＰを用いたＳａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡで確認し、これらの二重特異抗体はＭＵＣ１抗原陽性の膵臓癌細胞のＣａｐａｎ－１、ＡｓＰＣ１に結合することを、細胞表面染色およびフローサイトメーターにより確認した。
【0171】
このような結果を図１３および図１４に示した。対照群としては、表１２のマウスＭＵＣ１抗体の重鎖可変領域（配列番号７７）を含む重鎖、および表１４の軽鎖４番（ＶＬ４）の軽鎖可変領域（配列番号９１）を含む軽鎖配列（配列番号１１０）のＮ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体が結合した軽鎖を含む抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体（ｃｈｉ／４）を使用した。
【0172】
図１３および図１４に示されているように、重鎖１番／軽鎖４番（「１／４」、つまり、表１４の重鎖１番（ＶＨ１）の重鎖可変領域（配列番号７８）を含む重鎖、および表１４の軽鎖４番（ＶＬ４）の軽鎖可変領域（配列番号９１）のＮ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した軽鎖（配列番号１１４）を含む抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体；以下、同一である。）、重鎖４番／軽鎖４番（「４／４」）、重鎖７番／軽鎖４番（「７／４」）の組み合わせの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体が、対照群と比較して癌細胞に対する毒性効果に優れていることを確認した。
【0173】
このような結果は、ＬＣＣタイプの二重特異抗体（実施例８－２）よりＬＣＮタイプの二重特異抗体（実施例８－３）がＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙを示すのに容易な癌細胞とＴ細胞との間の微細距離をより近く維持して結合することができ、これによってより高いＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙを示すことができることを示す。
【0174】
実施例８－４．ＬＣＮタイプのヒト化ＭＰ１二重抗体の機能分析（２）
実施例８－１で製造したＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体に対して、ＭＵＣ１抗原に対して陽性のＡｓＰＣ－１およびＣａｐａｎ－２（膵臓癌細胞株）、ＳＮＵ－６０１（胃癌細胞株）、Ｔ４７Ｄ（乳癌細胞株）細胞株に対してＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙを行って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を確認し、その結果を図１５に示した。
実施例８－１で製造したＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体に対して、ＭＵＣ１抗原に対して陽性のＡｓＰＣ－１およびＣａｐａｎ－２（膵臓癌細胞株）、ＳＮＵ－６０１（胃癌細胞株）、Ｔ４７Ｄ（乳癌細胞株）細胞株に対してＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙを行って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を確認し、その結果を図１５に示した。
【0175】
抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体としては、ヒト化比率がより高い重鎖１番／軽鎖５番の組み合わせの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体、つまり、表１４の重鎖１番（ＶＨ１）の重鎖可変領域（配列番号７８）を含む重鎖、および表１４の軽鎖５番（ＶＬ５）の軽鎖可変領域（配列番号９２）のＮ末端にヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体（配列番号１０６）が結合した軽鎖（配列番号１１５）を含む抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を使用した。
【0176】
図１５に示されているように、投与したＬＣＮタイプの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の濃度に比例して、癌細胞に対する細胞毒性効果を示すことを確認した。
【0177】
実施例９．膵臓癌マウス実験モデルを用いたヒト化二重抗体の治療効果評価
抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体のｉｎ ｖｉｖｏ免疫抗癌効果を確認するために、人体由来の膵臓癌細胞株のＡｓＰＣ－１を移植したＮＯＧマウス動物モデルを対象に抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の投与による腫瘍の大きさ減少の有無を評価した。前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、実施例８－４で用いた抗体と同一の抗体を使用した（ＬＣＮタイプの重鎖１番／軽鎖５番の組み合わせの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体）。
抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体のｉｎ ｖｉｖｏ免疫抗癌効果を確認するために、人体由来の膵臓癌細胞株のＡｓＰＣ－１を移植したＮＯＧマウス動物モデルを対象に抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体の投与による腫瘍の大きさ減少の有無を評価した。前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体は、実施例８－４で用いた抗体と同一の抗体を使用した（ＬＣＮタイプの重鎖１番／軽鎖５番の組み合わせの抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体）。
【0178】
マウスモデルの準備
マウスは、実質的なヒト免疫細胞による抗体の抗癌効果を評価するために、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および大食細胞、樹状細胞の機能が欠乏しているＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ、ＩＬ－２ＲγＫＯ ｍｉｃｅ、ＫＯＡＴＥＣＨ）を使用した。５×１０６個の膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ－１を８週齢のＮＯＧマウス横腹に皮下注射（Ｉ．Ｐ．、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、１－２週経過後に、１００～１５０ｍｍ３の腫瘍の体積が形成されたマウスを、各グループあたり５匹ずつを選別して実験に使用した。
マウスは、実質的なヒト免疫細胞による抗体の抗癌効果を評価するために、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および大食細胞、樹状細胞の機能が欠乏しているＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ、ＩＬ－２ＲγＫＯ ｍｉｃｅ、ＫＯＡＴＥＣＨ）を使用した。５×１０６個の膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ－１を８週齢のＮＯＧマウス横腹に皮下注射（Ｉ．Ｐ．、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、１－２週経過後に、１００～１５０ｍｍ３の腫瘍の体積が形成されたマウスを、各グループあたり５匹ずつを選別して実験に使用した。
【0179】
Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣの準備
Ｚｅｎｂｉｏ社から購入したＨｕｍａｎ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）は、抗体注入１０日前に１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０（ＧｅｎｅＤｉｒｅＸ、Ｃａｔ＃：ＣＣ１１２－０５００）で解凍後、１日目にＩＦＮ－ｒ（ｊｗクレアジェン、Ｃａｔ＃：ＨＩＦＮＧ－１００）２５０ｎｇ／ｍｌ処理し、２日目にＩＬ－２（ｊｗクレアジェン、ＪＷ－Ｈ０３１－０１００）３０ｎｇ／ｍｌ、ＯＫＴ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ＃：１３０－０９３－３８７）５０ｎｇ／ｍｌを添加した後、５日間放置した。その後、培養６日目から培養１６日目までＩＬ－２ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－ｒ５０ｎｇ／ｍｌを、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養してＰＢＭＣの数を拡張させた。
Ｚｅｎｂｉｏ社から購入したＨｕｍａｎ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）は、抗体注入１０日前に１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０（ＧｅｎｅＤｉｒｅＸ、Ｃａｔ＃：ＣＣ１１２－０５００）で解凍後、１日目にＩＦＮ－ｒ（ｊｗクレアジェン、Ｃａｔ＃：ＨＩＦＮＧ－１００）２５０ｎｇ／ｍｌ処理し、２日目にＩＬ－２（ｊｗクレアジェン、ＪＷ－Ｈ０３１－０１００）３０ｎｇ／ｍｌ、ＯＫＴ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ＃：１３０－０９３－３８７）５０ｎｇ／ｍｌを添加した後、５日間放置した。その後、培養６日目から培養１６日目までＩＬ－２ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－ｒ５０ｎｇ／ｍｌを、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養してＰＢＭＣの数を拡張させた。
【0180】
ヒト化ＭＰ１二重抗体の抗癌効能評価
腫瘍が形成されたＮＯＧマウスは６グループに分けて、０日目に１グループはＰＢＳ２００μｌを腹腔（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）に注入し、５グループのマウスは１匹あたり５×１０６細胞数のＰＢＭＣを腹腔に注入した（つまり、１ＸＰＢＳで５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬとなるように懸濁液を調製して腹腔に注入した）。この後、４グループのマウスに前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇでＰＢＭＣ注入後、３、７、１０、１４日目に計４回静脈内注射（Ｉ．Ｖ．、ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、皮下注入した癌細胞の大きさを観察および測定した。
腫瘍が形成されたＮＯＧマウスは６グループに分けて、０日目に１グループはＰＢＳ２００μｌを腹腔（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）に注入し、５グループのマウスは１匹あたり５×１０６細胞数のＰＢＭＣを腹腔に注入した（つまり、１ＸＰＢＳで５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬとなるように懸濁液を調製して腹腔に注入した）。この後、４グループのマウスに前記抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇでＰＢＭＣ注入後、３、７、１０、１４日目に計４回静脈内注射（Ｉ．Ｖ．、ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、皮下注入した癌細胞の大きさを観察および測定した。
【0181】
図１６は、抗－ＭＵＣ１／抗－ＣＤ３二重特異抗体を用いたヒトＰＢＭＣを注入したヒト化条件のマウス膵臓癌動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効能を示す結果である。ＰＢＭＣのみ投与群（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＰＢＭＣ）に比べて抗体投与群（ＭＰ１－１ｍｇ／ｋｇおよびＭＰ１－３ｍｇ／ｋｇ）の高い抗癌効果（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；ＴＧＩ）を示した。
【0182】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連して、以上に述べた実施例はすべての面で例示的であり、限定的ではないと理解しなければならない。本発明の範囲は上記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】