特表 2025-502657 細胞源識別可能な核酸コレクションを生成するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-28

(54)【発明の名称】細胞源識別可能な核酸コレクションを生成するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20250121BHJP

   C12Q 1/6855 20180101ALI20250121BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20250121BHJP

   C12Q 1/6853 20180101ALI20250121BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20250121BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20250121BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20250121BHJP

   C12M 1/28 20060101ALI20250121BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20250121BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z

C12Q1/6855 Z ZNA

C12Q1/6876 Z

C12Q1/6853 Z

C12Q1/6869 Z

C40B40/06

C12M1/00 A

C12M1/28

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535574

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(85)【翻訳文提出日】2024-06-13

(86)【国際出願番号】 US2022053883

(87)【国際公開番号】W WO2023122309

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/293,589

(32)【優先日】2021-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．ＮＯＮＩＤＥＴ

(71)【出願人】

【識別番号】500481499

【氏名又は名称】タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114557

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 英仁

(74)【代理人】

【識別番号】100078868

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 登夫

(72)【発明者】

【氏名】當利 和夫

(72)【発明者】

【氏名】ボスティック，マグノリア

(72)【発明者】

【氏名】シュ，ペン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，サリー エクス．

(72)【発明者】

【氏名】プ，シューユアン エリック

(72)【発明者】

【氏名】ユン，ユエ

(72)【発明者】

【氏名】ファーマー，アンドゥリュー エー．

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB20

4B029CC01

4B029GA03

4B029GB05

4B029HA05

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

(57)【要約】

組み合わせインデックス付け方法論を使用して、細胞又は細胞核などの複数の源からの源識別可能な核酸コレクションを調製する方法が提供される。一般に、この方法は、細胞源サブ部分の第１のセットを提供することを含み、各サブ部分は、初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む。次に、第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、第１のセットの各サブ部分の複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸が生成され、第１のセットの異なるサブ部分において用いられる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子は、所与のサブ部分内で同一であるが、異なるサブ部分間で異なる。次に、サブ部分の細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成し、次いで、第１のプールを、第１の識別子タグ付き核酸を有する複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分する。次に、第１の識別子及び第２の識別子の両方を含む、第２のセットの各サブ部分における複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸が産生されて（第２のセットの各サブ部分の第２の識別子は、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる）、初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する。各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸は、核酸の細胞源を識別する第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを含む。また、例えば、本明細書に記載の方法の実施形態を実行する際に使用するためのキット、組成物、及びデバイスも提供される。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞源サブ部分の第１のセットを提供することであって、各サブ部分が、前記初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む、提供することと、
（ｂ）第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、前記第１のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第１のセットの異なるサブ部分において用いられる前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記第１の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分間では異なる、生成することと、
（ｃ）ステップｂ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成することと、
（ｄ）前記第１の細胞源プールを、第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分することと、
（ｅ）第１の識別子及び第２の識別子の両方を含む、前記第２のセットの各サブ部分における前記複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸を産生することであって、前記第２のセットの各サブ部分の前記第２の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる、産生することと、を含み、
それによって、前記初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製し、各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸が、前記核酸の前記細胞源を識別する第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを含む、方法。

【請求項2】

前記細胞源が、細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞源が、核である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞源が、透過処理される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記サブ部分の第１のセットが、２～２５，０００のサブ部分を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドが、一意の分子識別子を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、リボ核酸鋳型を用いる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記リボ核酸鋳型が、ｍＲＮＡである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記鋳型スイッチング反応が、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、準ランダムプライマー、又は遺伝子特異的プライマーを用いる、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、デオキシリボ核酸を用いる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記鋳型スイッチング反応が、ランダムプライマー、準ランダムプライマー、又は遺伝子特異的プライマーを用いる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記サブ部分の第２のセットが、２～２５，０００のサブ部分を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記第２の識別子が、第１及び第２のサブ識別子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第２の識別子が、第２の鎖合成反応に組み込まれる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞源識別可能な核酸が、増幅媒介反応を使用して産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記細胞源識別可能な核酸が、ライゲーション媒介反応を使用して産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記細胞源識別可能な核酸が、タグメンテーション媒介反応を使用して産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記方法が、前記サブ部分の第２のセットの前記複数の細胞源を溶解することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記方法が、少なくとも１つの更なる識別子を組み込む核酸を産生するための少なくとも１つの追加のプール／分割ステップを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記方法が、前記複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを配列決定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記配列決定することが、次世代配列決定を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記方法が、少なくとも細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸の前記第１及び第２の識別子に基づいて、細胞源を前記核酸コレクションに割り当てることを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記細胞源が、免疫細胞源である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記免疫細胞源が、Ｔ細胞又はその核である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記免疫細胞源が、Ｂ細胞又はその核である、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記第１及び第２のセットにおけるサブ部分の数が、同一である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記第１及び第２のセットにおけるサブ部分の数が、異なる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記第２のセットにおけるサブ部分の数が、前記第１のセットにおけるサブ部分の数を超える、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

キットであって、
共通の第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを各々が含む、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物であって、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子が異なる、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物と、
複数の別個の第２の識別子核酸と、を含む、キット。

【請求項30】

前記複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物が、別個の容器内に存在する、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

前記別個の容器が、マルチウェルプレートのウェルである、請求項３０に記載のキット。

【請求項32】

所与の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の各鋳型スイッチオリゴヌクレオチドが、異なる一意の分子識別ドメインを更に含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項33】

前記複数の別個の第２の識別子核酸が、別個の容器内に存在する、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項34】

前記別個の容器が、マルチウェルプレートのウェルである、請求項３３に記載のキット。

【請求項35】

前記第２の識別子核酸が、プライマーである、請求項２９～３４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項36】

前記第２の識別子核酸が、アダプタである、請求項２９～３５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項37】

前記キットが、逆転写酵素を更に含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項38】

前記キットが、ポリメラーゼを更に含む、請求項２９～３７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項39】

前記キットが、リガーゼを更に含む、請求項２９～３８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項40】

前記キットが、トランスポザーゼを更に含む、請求項２９～３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項41】

前記キットが、緩衝液を更に含む、請求項２９～４０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項42】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞源サブ部分の第１のセットを提供することであって、各サブ部分が、前記初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む、提供することと、
（ｂ）第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、前記第１のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第１のセットの異なるサブ部分において用いられる前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記第１の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分間では異なる、生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成することと、
（ｄ）前記第１の細胞源プールを、前記第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分することと、
（ｅ）前記第２のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において、第２の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第２のセットの異なるサブ部分における第２の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分の各々の間では異なる、生成することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１及び第２の識別子タグ付き核酸を含む第２の細胞源プールを生成することと、
（ｇ）前記第２の細胞源プールを、前記第１及び第２の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第３のセットに配分することと、
（ｈ）第１の識別子、第２の識別子及び第３の識別子を含む、サブ部分の前記第３のセットの各サブ部分における前記複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸を産生することであって、前記第３のセットの各サブ部分の前記第３の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる、産生することと、を含み、
それによって、前記初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製し、各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸が、前記核酸の前記細胞源を識別する第１、第２及び第３の識別子の一意の組み合わせを含む、方法。

【請求項43】

ステップ（ｅ）が、前記第２の識別子を付加するために第２の鎖合成反応を使用して実行される、請求項４２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

次世代配列決定（ＮＧＳ）技術の開発により、生成された核酸ライブラリからの貴重なゲノム及びトランスクリプトーム情報の迅速な抽出が可能になった。

【0002】

Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及び／又はＮｅｘｔＳｅｑ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及び／又はＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｌ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及び／又はＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）などによって提供される配列決定プラットフォームなどの高スループットＮＧＳ技術は、以前に使用されたＳａｎｇｅｒ配列決定よりもより迅速かつ安価に核酸分子の配列決定を可能にし、したがって、これらの技術は、バイオテクノロジー及びバイオメディカル研究に革命をもたらした。更に、これらの技術が成熟し、よりユーザーフレンドリーになるにつれて、臨床応用におけるそれらの存在は増加し続けている。

【0003】

これらの強力な配列決定技術は、ライブラリ調製に特に重点を置いている。よく調製され、効率的に生成された逆転写相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリは、多様な範囲の目的のためにＮＧＳ技術を使用して分析することができる。

【0004】

現在のＮＧＳワークフローでは、バルク細胞集団又は単一細胞から得られた試料から調製されたライブラリを配列決定することができる。バルク細胞集団の配列決定では、単一細胞分解能でのゲノム及び／又はトランスクリプトーム変化を分析することができず、バルク集団における異なる細胞型の根本的な不均一性が隠蔽される可能性がある。核酸ライブラリが個々の細胞から調製される場合、ＮＧＳ技術により、単一細胞分解能でのゲノム及び／又はトランスクリプトーム変化の分析が可能になる。単一細胞配列決定により、バルク細胞配列決定よりも多くの利点が得られるが、単一細胞配列決定では、所与の核酸を元の源までさかのぼることができる必要がある。

【0005】

この要件に対処するために試料バーコード付け技術が開発されているが、所与の実験で現実的に処理することができる異なる細胞の数に関しては依然として上限がある。いくつかの事例では、単一の実験において処理されるのが望ましい細胞の数、例えば、細胞の全てが最終的に単一の配列決定準備済ライブラリ組成物においてプールされる場合、現在のプロトコルを使用して容易に処理できる数を超える。例えば、ヒト適応性免疫レパートリー試料の処理に関して、単一細胞分析は、ペアリング鎖情報（例えば、ＴＣＲのためのアルファ／ベータ／ガンマ／デルタペアリング及びＢＣＲのための重／軽ペアリング）を可能にする。しかしながら、所与の実験で調べることができる細胞の数は、例えば、最大１０，０００個の異なる細胞まで限定され、又は特殊な計装を必要とし得る。

【発明の概要】

【0006】

そのような事例では、本発明者らは、必要とされるのは、並行して１０，０００個を超える細胞の分析を可能にするアプローチであることを認識している。理想的には、必要とされるのは、並行して１０，０００個を超える細胞の分析を可能にする方法であり、更に、そのような方法が、現在の最先端技術で既知の計装を超えた特殊な装置を必要としない場合である。例えば、当該技術分野で必要とされるのは、１００，０００個以上の細胞、例えば、最大１００万個の単一細胞、又は１００万個を超える細胞が、単一の実験において並行して分析されるのを可能にするアプローチ（例えば、ＴＣＲ又はＢＣＲのためのペアリングされた鎖情報を与えるなど）である。加えて、本発明者らはまた、各試料中の単一細胞の数は少ないかもしれないが、独立した試料の数が大きいので、分析する必要のある細胞の集合数が大きい、単一細胞の複数の試料に対して単一細胞実験を実行するための方法が、当該技術分野で必要であることも認識している。例えば、当該技術分野で必要とされるのは、分析される細胞の総数が１００，０００個以上であるように、例えば、１００個以上の試料（各試料は１，０００個以上の細胞を含む）の分析を可能にするアプローチである。そのため、所与の実験において多数の細胞の処理を提供することができる改善された単一細胞配列決定技術の継続的な必要性が存在する。

【0007】

本発明の実施形態は、同じ細胞源から産生される核酸を一意に識別するための組み合わせインデックス付けアプローチを提供することによって、当該技術分野における上記及び他の必要性を満たす。本明細書に記載される本発明の実施形態によって使用される組み合わせインデックス付けアプローチは、アッセイされた集団内の各細胞が、アッセイされる他の細胞から分離されて容器内に個々に存在する必要がない、この一意の識別を提供することによって、当該技術分野に対する実質的な改善を表す。提供される組み合わせアプローチは、多数の単一細胞、例えば、１０，０００個以上の単一細胞、１００，０００個以上の単一細胞、又は１００万個以上の単一細胞の実用的な分析を可能にする。提供される組み合わせアプローチは、同じワークフローを使用してその成分、例えば、核に等しく適用される。例えば、この同じワークフローでは、例えば、１００，０００個以上の単一細胞又は単一核由来の核酸の配列決定準備済ライブラリがプールされ、一緒に配列決定され、各リードの結果として生じる配列情報はその元の細胞源までさかのぼって追跡することが可能である。更に、本明細書で提供される組み合わせ分析のための方法は、例えば、分析される細胞の総数が１００，０００個以上であるように、１００個以上の試料（各試料は１，０００個以上の細胞を含む）の分析などの、多くの独立した細胞試料の実用的な分析を可能にする。

【0008】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法が提供される。この方法の態様は、細胞源サブ部分の第１のセットを提供することを含み、各サブ部分は、初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む。次に、第１の識別子（本明細書では、第１のインデックス又は第１の細胞バーコードとも呼ばれる）を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、第１のセットの各サブ部分の複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸が生成され、第１のセットの異なるサブ部分において用いられる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子は、所与のサブ部分内で同一であるが、異なるサブ部分間で異なる。次に、サブ部分の細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成し、次いで、第１のプールを、第１の識別子タグ付き核酸を有する複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分する。次に、第１の識別子及び第２の識別子の両方を含む、第２のセットの各サブ部分における複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸が産生され、第２のセットの各サブ部分の第２の識別子は、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる。この方法は、初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを提供する。各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸は、核酸の細胞源を識別する第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを含む。

【0009】

他の実施形態では、追加ラウンドのインデックス（すなわち、識別子）を核酸コレクションに付加するために、所望に応じて、新しいサブ部分へのプール及び再分配の追加ラウンドを用いることができる。追加ラウンドのインデックス付けにより、方法論におけるより多くの個々の細胞又は核などの細胞成分の分析が可能になる。一般に、検査される細胞の総数は、ヌクレオチド配列識別子（例えば、バーコード、インデックス、タグ、又は任意のタイプの分子識別子）の一意の組み合わせ及び配向の総数が、研究者が調査したい一意の細胞の数よりも多いようなものであるべきである。

【0010】

また、例えば、本明細書に記載の方法の実施形態を実行する際に使用するためのキット、組成物、及びデバイスも提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】本発明の一実施形態によるワークフローを図示する。

【図1B】本発明の一実施形態によるワークフローを図示する。

【図1C】本発明の一実施形態によるワークフローを図示する。

【図1D】本発明の一実施形態によるワークフローを図示する。

【図2】本発明の一実施形態を示す概略図を提供する。

【図3】本発明の一実施形態を示す概略図を提供する。

【図4】本発明の一実施形態を示す概略図を提供する。

【図5】本発明の方法の一実施形態を概略的に示すフローチャートを提供する。

【図6】実施例２に記載されるように、本発明の実施形態を使用して作製したＮＧＳライブラリ生成物の構造を示す概略図を提供する。より具体的には、Ｔ細胞受容体遺伝子は、分析のために特異的に標的化される。図６に示すように、リード１は、標的化ＴＣＲ遺伝子の配列を提供する。リード２はまた、Ｔ細胞受容体遺伝子の配列を、第１の２つのインデックス配列、すなわち、第２のインデックス付けステップからのインデックス２（ＩＮ２、第２の識別子）、及び第１のインデックス付けステップからのインデックス１（ＩＮ１、第１の識別子）とともに提供する。インデックス３（第３の識別子）は、第３のインデックス付けステップでＰＣＲによって付加されたｉ７及びｉ５インデックスの組み合わせによって提供されるように示される。

【図7】本発明の一実施形態を示す概略図を提供し、具体的には、初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製するための方法を提供し、本方法は、核酸のインデックス付けの３つの独立したラウンドを使用する。

【図8A】本発明の実施形態による、（以下の実施例４に記載されるような）ＴＣＲ配列決定のための２ラウンドのバーコード付けプロトコルを図示する。

【図8B】２ラウンドのＴＣＲバーコード付けについて、１，０００個の細胞を含む８×８分割プールの実験設計を図示する。

【図8C】２ラウンドのＴＣＲバーコード付けについて、ＴＣＲｂライブラリからのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの結果を図示する。

【図8D】２ラウンドのＴＣＲバーコード付けについて、Ｌプロット分析を図示する。

【図9】本発明の実施形態による、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２にわたって分割された第２のラウンドのバーコード付けを用いた、ＴＣＲ配列決定のための２ラウンドのバーコード付けを図示する。

【図10A】本発明の実施形態による、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２にわたって分割された第３のラウンドのバーコード付けを用いた、（以下の実施例５に記載されるような）ＴＣＲ配列決定のための３ラウンドのバーコード付けを図示する。

【図10B】３ラウンドのＴＣＲバーコード付けについて、実施例５に記載されるように生成されたＴＣＲライブラリのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒの追跡を図示する。

【図10C】３ラウンドのＴＣＲバーコード付けについて、ライブラリで検出されたリードカウント、マッピング率、及びクロノタイプを示す表である。

【図11】本発明の実施形態による、ＴＣＲ配列決定のための代替の３ラウンドのバーコード付け戦略を図示する。

【図12A】本発明の実施形態による、（以下の実施例６に記載されるような）組み合わされた標的化配列決定及び５’差次的発現（５’ＤＥ）のための２ラウンドのバーコード付けを図示する。

【図12B】図１２Ａに図示されるプロトコルを使用して生成される生成物及びライブラリ構造を示す。

【図12C】品質メトリックに合格する検出された細胞の数を決定するために使用されるニープロットを提供する。この場合、Ｃｏｇｅｎｔ ＡＰソフトウェアを用いた、ＢＣ１、ＢＣ２ａ、ＢＣ２ｂ（ｉ７）及びｉ５を使用するデータ逆多重化に基づいて、１０，０００個を超えるリード／細胞を有する細胞。１３１０個の細胞は、１０，０００個を超えるリードを有し、下流分析に使用した。

【図12D】ヒトｈｇ３８（Ｋ５６２）又はマウスｍｍ１０（３Ｔ３）のいずれかへのマッピングに基づく、Ｋ５６２及び３Ｔ３細胞の平均マッピング統計量を提供する。遺伝子間、イントロン、エクソン、マルチマッピング、マッピングされていない、及びトリミングされたリードのパーセンテージを計算した。

【図12E】細胞当たりのリードの関数として、Ｋ５６２又は３Ｔ３細胞のいずれかにおいて検出される遺伝子の数を提供する。

【図12F】Ｌ－プロット分析を提供する。全てのＫ５６２、３Ｔ３及び混合細胞の配列決定リードを、ヒト（ｈｇ３８）及びマウス（ｍｍ１０）ゲノムの両方に対してマッピングし、各ゲノムにマッピングされた細胞当たりのマッピングされたリードの数に基づいてプロットした。

【図13A】実施例７に記載されるように、２ラウンドの分割－プールバーコード付け後に調製されたＴＣＲライブラリの生成物及びライブラリ構造を示す。

【図13B】ＴＣＲ分析について、１０ｎｇのＰＢＭＣ ＲＮＡで調製した全長ｃＤＮＡを示す。

【図13C】ＴＣＲ分析について、全長ｃＤＮＡから調製したＴＣＲａ、ＴＣＲｂ及びＴＣＲａ＋ｂライブラリを示す。

【図14】本発明の実施形態による、（以下の実施例８に記載されるような）組み合わされた標的化配列決定及び５’差次的発現（５’ＤＥ）のための３ラウンドのバーコード付けプロトコルを図示する。

【図15】本発明の様々な実施形態に従って生成されるライブラリ及び生成物を図示する。図１５パネルＡは、実施例８に記載されるような５’ＤＥライブラリ生成を示す。図１５パネルＢは、実施例８に記載されるようなＴＣＲライブラリの調製を示す。

【図16】実施例９に記載されるようなＴＳＯ分析の結果を提供する。

【図17】実施例１０に記載されるような、逆多重化後の単一細胞のニープロットを提供する。

【図18】実施例１０に記載されるように、本発明の実施形態に従って調製されたヒト－マウス細胞混合物のＬ－プロットを提供する。

【図19】実施例１１に記載されるように高濃度のＰＦＡ及びジギトニンを使用して、組み合わせインデックス付けのために処理されたヒト－マウス細胞混合物のＬ－プロットを提供する。

【0012】

定義
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、プライマー又は他のポリヌクレオチドが、プライマー又は他のポリヌクレオチドがいくつかの相補性を共有する標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズする条件を意味する。プライマーが標的核酸に特異的にハイブリダイズするかどうかは、ポリマーと標的核酸との間の相補性の程度、及びハイブリダイゼーションが行われる温度（プライマーの融解温度（Ｔ_Ｍ）によって知ることができる）などの因子によって決定される。融解温度は、プライマー－標的核酸二本鎖の半分がハイブリダイズしたままであり、二本鎖の半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、以下の式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）－（６０／Ｎ）を使用して実験的に決定又は予測され得、式中、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照されたい。様々なパラメータに依存する他のより高度なモデルを使用して、様々なハイブリダイゼーション条件に応じて、プライマー／標的二重鎖のＴｍを予測してもよい。特異的な核酸ハイブリダイゼーションを達成するためのアプローチは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に見出すことができる。

【0013】

本明細書で使用される「相補的」及び「相補性」という用語は、標的核酸の全て又は領域（例えば、生成物核酸の領域）に非共有結合によって塩基対合するヌクレオチド配列を指す。カノニカルなワトソンクリック塩基対合では、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）と同様に、チミン（Ｔ）と塩基対を形成する。ＲＮＡにおいて、チミンは、ウラシル（Ｕ）に置き換えられる。したがって、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である。ＲＮＡでは、ＡはＵに相補的であり、逆もまた同様である。典型的には、「相補的」は、少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。「相補的」という用語はまた、一方の鎖における全てのヌクレオチドが、対応する位置で他方の鎖中の全てのヌクレオチドに相補的であるように、完全に相補的である二本鎖を包含し得る。特定の場合において、ヌクレオチド配列は、全てのヌクレオチドが全ての対応する位置で標的核酸中の全てのヌクレオチドに相補的ではない、標的に部分的に相補的であり得る。例えば、プライマーは、標的核酸に完全に（すなわち、１００％）相補的であってもよく、又はプライマー及び標的核酸は、完全未満のある程度の相補性（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％）を共有してもよい。

【0014】

２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列をアライメントすることによって決定することができる（例えば、最適なアライメントのために第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較し、２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。１つの配列の位置が他の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占有されている場合、その分子はその位置で同一である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）を参照されたい。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３８９－３４０２（１９９７）に記載されるようなＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムの利用時には、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。一態様では、配列比較のためのパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定することができ、又は変化させることができる（例えば、ワード長＝５若しくはワード長＝２０）。

【0015】

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、２～５００ヌクレオチド、例えば２～２００ヌクレオチドのヌクレオチドの一本鎖多量体である。オリゴヌクレオチドは、合成であり得るか、又は酵素的に作製され得、いくつかの実施形態では、１０～５０ヌクレオチド長であり得る。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチド若しくは「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）又はデオキシリボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチド若しくは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）を含有し得る。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの混合物を含有し得る。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドは、修飾された、すなわち、例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、２’－フルオロＲＮＡなどを含む非天然ヌクレオチド若しくは修飾、連結修飾（例えば、ホスホロチオエート、３’－３’及び５’－５’逆連結）、５’及び／若しくは３’末端修飾（例えば、５’及び／若しくは３’アミノ、ビオチン、ＤＩＧ、ホスフェート、チオール、染料、クエンチャーなど）、１つ以上の蛍光標識されたヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドに所望の機能を提供する任意の他の特徴を含有し得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００、最大５００個のヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。

【0016】

「ドメイン」は、核酸に関して使用される場合、複数のヌクレオチドからなる核酸の伸長又は長さを指し、その伸長又は長さは、核酸に定義された機能を提供する。ドメインの例としては、バーコードドメイン（ソースバーコードドメインなど）、プライマー結合ドメイン、ハイブリダイゼーションドメイン、一意の分子識別子（ＵＭＩ）ドメイン、次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプタドメイン、ＮＧＳインデックス付けドメインなどが挙げられる。いくつかの事例では、「ドメイン」及び「領域」という用語は、同義的に使用され得、例えば、免疫受容体鎖ドメイン／領域が記載される場合、免疫受容体定常ドメイン／領域などを含む。所与のドメインの長さは様々であり得るが、いくつかの事例では、長さは、２～１００ｎｔ、例えば、５～５０ｎｔ、例えば、５～３０ｎｔの範囲である。増幅プライマー結合ドメインは、増幅プライマーにハイブリダイゼーションを介して結合するように構成されるドメインである。

【0017】

本明細書で使用される場合、「～に由来する」という表現は、第１の成分（例えば、第１の核酸分子）、又はその第１の成分からの情報が、異なる第２の成分（例えば、それが由来する第１の核酸分子とは構造、配列又は特徴が異なる第２の核酸分子）を単離、由来又は構築するために使用されるプロセスから生じる組成物を説明する。例えば、ｃＤＮＡ分子は、細胞中に見出される対応するｍＲＮＡに由来する。同様に、ＤＮＡライブラリは、細胞又は細胞集団から収集される全ＲＮＡに由来する。また、例えば、ｃＤＮＡライブラリは、細胞又は細胞集団から収集されるｍＲＮＡに由来し得る。

【0018】

本明細書で使用される場合、「バーコード」という表現は、最も広範には、例えば、６～１２ヌクレオチドの短い配列を説明し、これは、より大きなポリヌクレオチドに付加されると、そのより大きなポリヌクレオチドにタグ付けするのに役立ち、それによって、核酸のより大きなプール内の個々の核酸をカウント又は区別するための手段を提供する。本明細書で使用される場合、及び当業者によって認識されるように、広範なバーコード及びバーコード戦略が広く利用され、従来技術に記載されており、これらの全てが本明細書に記載されている本発明で使用される。本明細書で使用される場合、「バーコード」又は「インデックス」という用語は、タグ、識別子タグ、細胞バーコード、細胞バーコード配列、試料バーコード及び試料バーコード配列、ウェルバーコード、ソースバーコード配列、識別子、分子識別子、並びに他の類似及び等価の発現及び技術という用語と互換的に使用され得る。「一意の分子識別子」又は「ＵＭＩ」という表現はまた、様々な長さのランダマーを指し、また、本明細書で使用される場合、広義の「バーコード」にも包含される。

【発明を実施するための形態】

【0019】

初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法が提供される。この方法の態様は、細胞源サブ部分の第１のセットを提供することを含み、各サブ部分は、初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む。次に、第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、第１のセットの各サブ部分の複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸が生成され、第１のセットの異なるサブ部分において用いられる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子は、所与のサブ部分内で同一であるが、異なるサブ部分間で異なる。次に、サブ部分の細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成し、次いで、第１のプールを、第１の識別子タグ付き核酸を有する複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分する。次に、第１の識別子及び第２の識別子の両方を含む、第２のセットの各サブ部分における複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸が産生されて（第２のセットの各サブ部分の第２の識別子は、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる）、初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する。各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸は、核酸の細胞源を識別する第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを含む。本発明の１つの方法は、図５に提供されるフローチャートに図示される。

【0020】

他の実施形態では、追加ラウンドのインデックスを核酸コレクションに付加するために、所望に応じて、新しいサブ部分へのプール及び再分配の追加ラウンドを用いることができる。ラウンドの数、及び各ラウンドにおける個々の細胞源サブ部分の総数は、方法論の任意の特定の適用のための方法を最適化するように、すなわち、ユーザーの目的に適合し、最適に検査される細胞の総数（すなわち、細胞源の総数）を反映するように選択される。

【0021】

一般に、検査される細胞の総数は、第１及び第２の付加ステップ（及び任意選択的な更なる追加）で付加されるヌクレオチド配列識別子（例えば、バーコード、タグ、又は任意のタイプの分子識別子）の可能な一意の組み合わせ及び配向の総数が、研究者が調査したい一意の細胞の数よりも大幅に大きいため、各細胞がヌクレオチド配列識別子の一意の組み合わせを取得し、それにより個々の細胞源に割り当てられる可能性が高い。例として、識別子の数が細胞源の数の１０倍である場合、約５％のダブレット率が達成される。細胞源に対する識別子の比率を増加又は減少させることにより、ダブレット率を所望に応じて増加又は減少させることができる。

【0022】

本発明がより詳細に記載される前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、もちろん、変動し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する対象となるためのものであり、限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。

【0023】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値、及びこの記載の範囲内の任意の他の記載される値又は中間値が本発明に包含されることが理解されるべきである。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含まれ得、また、記述の範囲内の任意の特定の除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記述の範囲が、制限の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる制限の一方又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

【0024】

ある範囲は、「約」という用語が数値に先行して本明細書で提示される。「約」という用語は、この用語が先行する正確な数、及びこの用語が先行する数に近い数又はほぼその数である数についての逐語的支持を提供するために本明細書で使用される。ある数が、具体的に列挙された数に近いか又はほぼその数であるかを決定する際に、列挙されていない数に近いか又はほぼその数は、提示される文脈において、具体的に列挙された数の実質的な同等性を提供する数であり得る。

【0025】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。また、本明細書に記載のものと同様の又は同等な任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試験に使用され得るが、代表的な例示的な方法及び材料が以下に記載される。

【0026】

本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるかのように参照により本明細書に組み込まれ、方法及び／又は材料を刊行物が引用されるものに関して開示及び記載するために参照により本明細書に組み込まれる。いずれもの刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、本発明が、従来発明のためそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきでない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なり得、これらは独立して確認する必要があり得る。

【0027】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」との単数形は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的な要素を排除するように設計され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求要素の列挙に関連した「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」及び「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語の使用のための、又は「消極的な」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。

【0028】

本開示を読むと当業者には明らかであろうように、本明細書に記載及び例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の様々な実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又はこれらと組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。

【0029】

装置及び方法は、文法的流動性のために、機能的な説明で記載されているか又は記載されるが、特許請求の範囲は、米国特許法第１１２条下で明確に記載されない限り、「手段」又は「ステップ」限定の構文によって必然的に限定されるとなんら解釈されるべきでなく、司法均等論下で特許請求の範囲によって提供される定義の意味及び均等物の完全な範囲を付与されるべきであり、特許請求の範囲は、米国特許法第１１２条下で明確に記載される場合、米国特許法第１１２条下で完全な法定による均等物が付与されるべきであることを明確に理解されたい。

【0030】

方法
上記に要約され、図に概略的に図示されるように、本明細書は、組み合わせインデックス付け技術を使用して、初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製するための方法を提供する。本明細書に記載のこれらの方法は、当業者に認識されるように、既存の細胞組み合わせインデックス付けプロトコルよりも利点を提供する。例えば、本明細書に記載の方法において、ｍＲＮＡ転写産物の全長を、長いリード配列決定技術を適用することなく、組み合わせてインデックス付けし、アッセイすることができる。更に、免疫細胞受容体中のものなどの５’末端配列は、分析のために具体的に標的化することができる。

【0031】

細胞源
本明細書で使用される場合、「細胞源」という表現は、核酸を含有する細胞又はその任意の成分を指す。細胞成分を使用する場合、その成分は、「核酸提供成分」と称される。いくつかの事例では、細胞源は、細胞又は細胞核のいずれかであり得る（ここで、「核」という用語は、細胞の染色体を含有する膜結合細胞小器官を指すべく、その従来の意味で使用される）。

【0032】

本発明の実施形態に従って細胞源識別可能な核酸が産生される初期の細胞源は、様々であり得、特に限定されない。細胞源が得られ得る細胞試料は、限定されないが、例えば、細胞組織、生検、血液試料、細胞培養物などを含む様々な源に由来し得る。更に、細胞試料は、特定の臓器、組織、腫瘍、新生物などに由来し得る。更に、任意の集団からの細胞は、細菌又は酵母を含む原核生物又は真核生物の集団などの、主題の方法で使用される細胞源の供給源であり得る。いくつかの事例では、主題の方法で利用される細胞源は、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）細胞試料、非ヒト霊長類細胞試料、ヒト細胞試料などの哺乳動物細胞試料であり得る。いくつかの事例では、哺乳動物細胞試料は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）血液試料、非ヒト霊長類血液試料、ヒト血液試料などを含むが、これらに限定されない、哺乳動物血液試料であってもよい。

【0033】

生物又は細胞培養物由来の細胞を使用する場合、特定の細胞型の細胞、例えば、免疫系細胞、神経細胞、心臓細胞、腫瘍細胞、又は任意の他の細胞型が好ましい場合がある。免疫系細胞を使用する場合、組み合わせインデックス付け分析で使用される細胞型をなお更に絞り込むことが好ましい場合がある。例えば、分析をＢ細胞又はＴ細胞のいずれかのみに限定することが好ましい場合がある。全血からの細胞を分析に使用する場合、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用することが好ましい場合がある。

【0034】

細胞源が細胞核である場合、核は、任意の好都合な核単離プロトコルを使用して初期細胞から得てもよい。細胞源が細胞であり、細胞が最初に単離されていない場合、例えば、細胞が組織の一部である場合、細胞は、例えば、任意の好都合な細胞単離プロトコルを使用して、初期細胞試料から得てもよい。

【0035】

初期の複数の細胞源における細胞又は細胞核の数は、用いられる複数ラウンドのインデックス付けによって十分な多様性が作成されることを考えると、最小数の細胞又は核の要件、又は分析され得る最大数の細胞又は核の上限のいずれにも特に限定若しくは制限されない。例えば、本発明の方法では、２、３、又はそれ以上のラウンドのインデックス付けが用いられ得る。初期の複数の細胞源における細胞又は細胞核の数は様々であり得るが、いくつかの事例では、初期の複数の細胞源の数は、２～１０，０００，０００の範囲であり、例えば、１，０００～１，０００，０００であり、１０，０００～１００，０００を含み、いくつかの事例では、複数の細胞源における初期の細胞源の数は、１，０００，０００以上など、１００，０００以上である。いくつかの実施形態では、初期の複数の細胞源は、任意の数の異なる独立した細胞試料、例えば、１～１００個の独立した試料又はそれ以上、例えば、１００～１，０００個又はそれ以上の独立した試料を含み得る。

【0036】

本明細書で使用される場合、「細胞源識別可能な」という表現は、所与のコレクションの核酸の源、例えば、単一細胞又は単一の核を、同一の細胞源から生成される所与の核酸集団の核酸が同一又は共通起源の源までさかのぼって追跡できるように、決定することができることを意味する。言い換えれば、所与の細胞源識別可能なコレクションの核酸は、同じ源、例えば、細胞又は核に由来していると決定できる核酸集団から構成される。本発明の方法は、初期の複数の細胞源からの細胞源識別可能な核酸コレクションの調製を提供し、各調製されたコレクションは、複数の細胞源のうちの異なる細胞源までさかのぼって追跡できる。言い換えれば、本発明の方法は、いくつかの初期の細胞源、例えば、細胞又は核からいくつかの核酸コレクションを調製することを可能にし、各調製されたコレクションは、初期の複数の細胞源のうちのそれ自体の一意の細胞源までさかのぼって追跡することができ、すなわち、核酸は、初期の複数の細胞源のうちのそれ自体の一意の細胞源に由来すると決定することができる。細胞源識別可能な核酸の識別子成分、例えば、以下により詳細に記載されるような第１及び第２の識別子は、所与の核酸コレクションの源、例えば、細胞又は核を遡及的に識別することを可能にし、それによって、集合的に、コレクションの核酸についてのソースバーコードとして機能する。更に、当業者には理解されるように、本方法によって用いられる細胞源は、例えば、細胞培養物からの個々の細胞を含むものに限定されない。本方法によって用いられる細胞源は、異なる集団又は異なる試料、例えば、異なる患者、異なる細胞培養物、異なる治療群、繁殖集団又は異なる細菌種からの異なる植物などからの細胞源であり得る。

【0037】

サブ部分の第１のセットの産生
本発明の実施形態の方法の態様は、細胞源サブ部分の第１のセットを提供することを含み、各サブ部分は、初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む。このステップにおいて、初期の複数の細胞源は、いくつかのサブ部分に分割され、そのサブ部分は、集合的に第１のセットを構成し、各サブ部分は、複数の異なる細胞源を含む。言い換えれば、各々が複数の細胞源から構成される複数のサブ部分が、初期の複数の細胞源から生成される。所望される場合、サブ部分は、例えば、マルチウェルプレートのウェルなどの固体バリアによって互いから隔離された容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）又は容器（ｖｅｓｓｅｌ）内に存在してもよい。あるいは、サブ部分は、当該技術分野で既知であるように、液滴に含有され得、例えば、液滴は、液滴コレクション中の任意の他の液滴とは異なる。第１のセットを構成するサブ部分の数は様々であり得るが、いくつかの事例では、その数は、２～２５，０００個のサブ部分、例えば、９６～１０，０００個のサブ部分、例えば、９６～３８４個のサブ部分の範囲である。上記に示されるように、第１のセットの各サブ部分は、複数の細胞源で構成されている、すなわち、複数の細胞源を含む。複数の細胞試料が分析されるいくつかの実施形態では、各々の独立した試料は、初期の細胞源コレクションのサブ部分であるとみなされる。第１のセットの所与のサブ部分を構成する細胞源の数は様々であり得るが、いくつかの事例では、その数は、１～１０，０００、例えば１０～１，０００の範囲であり、１００～１，０００を含む。

【0038】

例えば、上記及び以下に記載されるように、本発明の方法で用いられるサブ部分は、多様な異なる形式をとり得る。サブ部分は、例えば、チューブ、マルチウェルプレートのウェルなどを含むが、これらに限定されない、任意の好適な反応容器の形態をとり得る。いくつかの事例では、サブ部分は、マルチウェルデバイス（例えば、マルチウェルプレート又はマルチウェルチップ又は液滴など）のウェルである。いくつかの事例では、特定の反応ステップに必要な成分は、他の試薬の添加の前に反応容器内に配置され得、例えば、反応容器は、反応の１つ以上の成分で事前に調製され得る。例えば、反応容器は、１つ以上のオリゴヌクレオチドで事前に調製され得、そのようなオリゴヌクレオチドが水和（例えば、溶液若しくは液滴）又は脱水（例えば、乾燥、凍結乾燥）形態で反応容器内に配置される場合が含まれる。脱水反応成分、例えば、凍結乾燥オリゴヌクレオチド及び／又は酵素は、使用前に反応容器内で再水和されてもよく、又は他の反応成分若しくは細胞源の添加中に再水和されてもよい。反応混合物及びその成分を添加してもよく、主題の方法の反応が行われてもよいサブ部分として機能し得る反応容器は、様々であろう。有用な反応容器としては、例えば、チューブ（例えば、単一のチューブ、マルチチューブストリップなど）、ウェル（例えば、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は２０００、４０００、６０００、又は１０，０００以上のような任意の数のウェルを有するプレート）が挙げられるが、これらに限定されない。マルチウェルプレートは、例えば、以下でより詳細に説明するように、独立していてもよく、チップ及び／又はデバイスの一部であってもよい。例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は２０００、４０００、６０００、若しくは１００００個以上のような任意の数のウェルを有するプレートである。マルチウェルプレートは、チップ及び／又はデバイスの一部であり得る。本開示は、マルチウェルプレート内のウェルの数に限定されない。様々な実施形態では、プレート上のウェルの総数は、１００～２００，０００、又は５，０００～１０，０００である。他の実施形態では、プレートは、各々が５，０００～２０，０００ウェルを含む、より小さなチップを含む。例えば、正方形のチップは、０．１ｍｍの直径を有する１２５×１２５ナノウェルを含み得る。マルチウェルプレート内のウェル（例えば、ナノウェル）は、任意の好都合なサイズ、形状、又は体積で作製され得る。ウェルは、長さ１００μｍ～１ｍｍ、幅１００μｍ～１ｍｍ、及び深さ１００μｍ～５ｍｍ以上であってもよい。いくつかの事例では、ウェルは、例えば、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、１ｍｍ以下を含むが、これらに限定されない、５ｍｍ以下の深さを有し得る。様々な実施形態では、各ナノウェルは、１～６以上のアスペクト比（深さ対幅の比）を有する。一実施形態では、各ナノウェルは、１：６のアスペクト比を有する。横断面領域は、円形、楕円形、楕円形、円錐形、長方形、三角形、多面体、又は任意の他の形状であり得る。ウェルの任意の所与の深さにおける横断面積も、サイズ及び形状が様々であり得る。特定の実施形態では、ウェルは、０．１ｎＬ～１μＬの体積を有する。ナノウェルは、１μＬ以下、例えば５００ｎＬ以下の体積を有し得る。体積は、１００ｎＬ以下などの２００ｎＬ以下であってもよい。一実施形態では、ナノウェルの体積は、１００ｎＬである。必要に応じて、ナノウェルは、表面積対体積比を増加させるように作製され得、それによって、熱サイクルのランプ時間を減らすことができる、ユニットを通る熱伝達を促進する。各ウェル（例えば、ナノウェル）の空洞は、様々な構成を取り得る。例えば、ウェル内の空洞は、線形又は湾曲した壁によって分割されて別個であるが隣接する区画を形成することができ、又は円形の壁によって分割されて内側及び外側の環状区画を形成することができる。いくつかの実施形態では、例えば、アドレス指定可能なナノウェルのアレイの形態のマルチウェルプレートが用いられる。そのようなマルチウェルプレートの例は、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＭＳＮＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）の一部であるものである。ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムの詳細は、米国特許第７，８３３，７０９号及び第８，２５２，５８１号、並びに公開されている米国特許出願公開第２０１５／０３６２４２０号及び２０１６／０２４５８１３号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に更に見出される。

【0039】

第１の識別子タグ付き核酸の生成
例えば、上記のように、サブ部分の第１のセットの生成に続いて、本発明の実施形態の方法は、鋳型スイッチング媒介反応を使用して、第１のセットの各サブ部分の複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することを含む。このステップで生成又は産生される第１の識別子タグ付き核酸は、第１の識別子ドメイン又は領域を含む核酸である。所与の第１の識別子ドメインは、長さが限定されずに様々であり得、例えば、いくつかの事例では、４～２０ヌクレオチド（ｎｔ）、例えば、８～１２ｎｔの範囲であり、いくつかの実施形態では、所与の方法において用いられる他の第１の識別子ドメインの配列と区別可能な配列を有するであろう。いくつかの実施形態では、第１の識別子ドメインはまた、方法の後続のステップで用いられる第２の又は追加の識別子ドメインとは異なるであろう。第１の識別子タグ付き核酸を生成するために用いられるプロトコルに応じて、第１の識別子は、第１の識別子タグ付き核酸上の、タグ付き核酸の末端（ｅｎｄ）又は末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に近接する位置に存在し得る。

【0040】

更に他の実施形態では、第１のバーコード（すなわち、第１の識別子ドメイン配列）及び第２又は後続のバーコード（すなわち、第２の識別子ドメイン配列）が同一であり、やはり細胞源識別可能な核酸コレクションを生成するために使用され得ることが可能である。すなわち、バーコードが異なるラウンドで付加されるという事実により、各ラウンドにおけるバーコードが別のバーコード付けラウンドにおけるバーコードとは異なることを必要とせずに、付加の順序によってバーコードを区別することができる。

【0041】

上記のように、第１の識別子タグ付き核酸は、複数の細胞源内で生成され、これは、第１の識別子タグ付き核酸が、無傷であるが透過処理された細胞源の内側で生成されることを意味する。したがって、細胞源が細胞である場合、第１の識別子タグ付き核酸が細胞内で生成される。同様に、細胞源が核である場合、第１の識別子タグ付き核酸が核内で産生される。このステップで用いられる試薬を細胞源の初期鋳型核酸にアクセスさせるために、細胞源を透過処理してもよい。細胞源、例えば、細胞又は核を透過処理するための任意の好都合なプロトコルを用いてもよい。本明細書で使用される場合、「透過処理する」という用語は、鋳型スイッチング媒介反応で用いられる試薬、例えば、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド、逆転写酵素、第一鎖ｃＤＮＡプライマーなどに対して、膜、例えば、細胞膜又は核エンベロープを透過性にすることを意味する。本明細書で使用される場合、「透過性」という用語は、酵素、オリゴヌクレオチド（例えば、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド若しくはプライマー）など、又は核を囲む膜である細胞膜若しくは核エンベロープなどの脂質二重層膜を通過する他の材料の能力を指す。「透過性」という用語は、他の試薬に対する（例えば、特定のサイズの）特定の試薬に対する透過性を示す相対的な用語であり得る。本明細書に記載される実施形態では、透過処理している間、細胞源、例えば、細胞又は核は、構造的に無傷のままである。本明細書に記載の実施形態では、透過処理は、細胞源を、細胞及び／又は細胞小器官膜を多孔化することができる化学薬品と接触させることによって実行され得る。いくつかの事例では、化学剤は、洗剤であり、細胞源を、１つ以上の洗剤を含む緩衝液と接触させることによって、透過処理を実行することができる。「洗剤」という用語は、本明細書で使用される場合、両親媒性（部分的に親水性／極性及び部分的に疎水性／非極性）界面活性剤又は両親媒性界面活性剤の混合物を指す。洗剤は、それらの極性部分の電荷に従って、「アニオン性」（負電荷；例えば、アルキルベンゼンスルホネート及びデオキシコール酸などの胆汁酸を含むがこれらに限定されない）、「カチオン性」（正電荷；例えば、四級アンモニウム及びピリジニウム系洗剤を含むがこれらに限定されない）、「非イオン性」（無電荷；例えば、Ｔｗｅｅｎ及びＴｒｉｔｏｎなどのポリオキシエチレン／ＰＥＧ系洗剤、並びにＨＥＧＡ及びＭＥＧＡなどのグリコシド系洗剤を含むがこれらに限定されない）、並びに「双性イオン性」（洗剤分子上の正及び負電荷の数が等しいために無電荷；例えば、ＣＨＡＰＳ及びアミドスルホベタイン型洗剤を含むがこれらに限定されない）として広く分類することができる。いくつかの実施形態では、細胞源を透過処理するための好適な洗剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ジギトニン、ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ、サポニン、及びｔｗｅｅｎ２０が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核を透過処理するための好適な洗剤としては、非イオン性洗剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０、イオン性洗剤、ドデジル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸塩、サルコシル、及び当業者によって識別可能な追加の洗剤が挙げられるが、これらに限定されない。細胞及び核などの細胞小器官を透過処理するための洗剤の好適な濃度は、洗剤に応じて様々な濃度を含む（例えば、最大１％の最終濃度のドデシル硫酸ナトリウムを参照されたい）。それらの臨界ミセル濃度値（ＣＭＣ）及び他の特性を含む一般的な洗剤に関する追加情報は、“Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ：Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１８）から入手可能なＨａｎｄｂｏｏｋ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ＆Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｒｅｍｏｖａｌ”、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ：Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒ（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ｐ．２３９－２５３、及びＳｃｈｒａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ“Ｃ”（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００３．９９（０）：ｐ．３－４８に見ることができる。そのような情報により、熟練したユーザーは、洗剤の濃度を微調整して、ＣＭＣを超えず、細胞／細胞小器官の完全な溶解を引き起こさないようにすることが容易に可能となる。当業者には理解されるように、本明細書で説明される実施形態では、透過処理は、酵素及び他の試薬が細胞膜を受動的に通過し、細胞内又は細胞小器官内で酵素反応を実行することを可能にするが、一方で、核酸（例えば、ｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ）などの細胞材料は、細胞又は核内に捕捉されたままであり、拡散しない。

【0042】

本明細書に記載の方法の実施形態では、透過処理後、細胞又は細胞小器官、例えば、核を、細胞内又は細胞小器官内、例えば、核内で細胞源の内部の第１の識別子タグ付き核酸を産生することができる試薬と接触させる。上記で要約したように、第１の識別子タグ付き核酸は、鋳型スイッチング媒介反応を使用して細胞源内で生成される。「鋳型スイッチング媒介」反応とは、ポリメラーゼが鋳型核酸から鋳型スイッチオリゴヌクレオチドに切り替わる核酸合成反応を意味する。したがって、本発明の方法では、第１の識別子タグ付き核酸は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド及び好適なポリメラーゼを使用して細胞源において産生される。鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、鋳型スイッチング反応、例えば、ＲＮＡ鋳型の逆転写又はＤＮＡ鋳型の逆転写に利用されるオリゴヌクレオチドである。したがって、識別子タグ付き核酸の産生は、鋳型スイッチング及び特定の核酸ポリメラーゼの「鋳型切り替え」能力、すなわち、重合のための鋳型として第１の核酸鎖を使用し、次いで、重合反応を継続しながら、第２の鋳型核酸鎖（「鋳型スイッチ核酸」又は「アクセプタ鋳型」と称する場合もある）に切り替えることができる。結果は、第１の鋳型核酸鎖に相補的な５’領域及び鋳型スイッチ核酸に相補的な３’領域を有するハイブリッド核酸鎖の合成である。鋳型スイッチングに関連する方法及び試薬は、米国特許第９，４１０，１７３号及び第１０，９４１，３９７号（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）にも記載されている。

【0043】

本開示の方法は、鋳型スイッチングによる第１の識別子タグ付き核酸の産生において鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを利用する。したがって、方法の実施形態は、透過処理された細胞源を、細胞源における鋳型スイッチング反応を介して第１の識別子タグ付き核酸を生成するのに十分な試薬と接触させることを含み、そのような試薬は、以下でより詳細に記載するように、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド、鋳型スイッチングポリメラーゼ、第１の鎖プライマーなどを含み得る。

【0044】

「鋳型スイッチオリゴヌクレオチド」とは、核酸重合反応中に、ポリメラーゼが初期鋳型（例えば、鋳型核酸（例えば、ＲＮＡ鋳型又はＤＮＡ鋳型））から切り替わるオリゴヌクレオチド鋳型を意味する。この点において、鋳型は、「ドナー鋳型」と呼ばれ得、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、「アクセプタ鋳型」と呼ばれる場合もある。鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、修飾されているか、又はそうでなければ天然に存在しない１つ以上のヌクレオチド（又はその類似体）を含み得る。例えば、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、２’－フルオロＲＮＡなど）、連結修飾（例えば、ホスホロチオエート、３’－３’及び５’－５’逆連結）、５’及び／若しくは３’末端修飾（例えば、５’及び／若しくは３’アミノ、ビオチン、ＤＩＧ、ホスフェート、チオール、染料、クエンチャーなど）、１つ以上の蛍光標識されたヌクレオチド、又は鋳型スイッチオリゴヌクレオチドに所望の機能を提供する任意の他の特徴を含み得る。

【0045】

特定の態様では、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、その３’末端に位置する３’ハイブリダイゼーションドメインを含む。３’ハイブリダイゼーションドメインは、長さが様々であり得、いくつかの事例では、長さが２～１０ヌクレオチド、例えば長さが３～７ｎｔの範囲である。鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインは、非鋳型化配列に相補的な配列、例えば、新しく合成された逆転写された第１の鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加されたデオキシシチジン伸長を含み得る。以下でより詳細に記載される非鋳型化配列は、一般に、鋳型、例えば、ＲＮＡ鋳型又はＤＮＡ鋳型に対応せず、鋳型化されない配列を指す。鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインに存在する場合、非鋳型化配列は、３’ハイブリダイゼーションドメイン全体又はその一部分を包含し得る。いくつかの事例では、非鋳型化配列は、ヘテロ－ポリヌクレオチドを含み得るか、又はヘテロ－ポリヌクレオチドからなり得、そのようなヘテロ－ポリヌクレオチドの長さは、２～１０ｎｔの間で様々であり得、例えば、長さ３～７ｎｔであり、３ｎｔを含む。いくつかの事例では、非鋳型化配列は、ホモ－ポリヌクレオチドを含み得るか、又はホモ－ポリヌクレオチドからなり得、そのようなホモ－ポリヌクレオチドの長さは、２～１０ｎｔの間で様々であり得、例えば、長さ３～７ｎｔであり、３ｎｔを含む。いくつかの実施形態によれば、反応混合物に組み合わされたポリメラーゼ（例えば、ＭＭＬＶ ＲＴなどの逆転写酵素）は、ホモ－ヌクレオチド伸長（例えば、Ｃ－Ｃ－Ｃなどのホモ－トリヌクレオチド）が新生鎖の３’末端に付加され得るように末端トランスフェラーゼ活性を有し、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインは、新生鎖の３’末端のホモヌクレオチド伸長（例えば、Ｇ－Ｇ－Ｇなどのホモ－トリヌクレオチド）に相補的なホモヌクレオチド伸長を含む。他の態様では、末端トランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼが、新生鎖の３’末端にヌクレオチド伸長（例えば、トリヌクレオチド伸長）を付加する場合、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインは、シトシン及びグアニンを含むヘテロ－トリヌクレオチド伸長（例えば、ｒ（Ｃ／Ｇ）_３オリゴヌクレオチド）を含み、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドのヘテロ－トリヌクレオチド伸長は、新生鎖の３’末端に相補的である。３’ハイブリダイゼーションドメイン及び鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの例は、米国特許第５，９６２，２７２号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に更に記載されている。

【0046】

（鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する）３’ハイブリダイゼーションドメインに加えて、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、例えば、上記のように、第１の識別子ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の識別子ドメインは、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド上の、５’末端の３’、したがって３’ハイブリダイゼーションドメインの５’の位置に配置される。第１のセットのサブ部分の所与の細胞源の全てについて、同じ第１の識別子ドメインを有する同じ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを、鋳型スイッチング媒介反応に用いる。したがって、各サブ部分の各細胞源で産生される第１の識別子タグ付き核酸は、同一又は共通の第１の識別子ドメインを有する。しかしながら、第１のセットの異なるサブ部分とともに用いられる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、少なくともそれらの第１の識別子ドメインの配列に関して互いに異なるため、第１のサブ部分のタグ付き核酸の第１の識別子ドメインは、第１のセットの任意の他のサブ部分のタグ付き核酸の第１の識別子ドメインと区別することができる。したがって、第１のセットの異なるサブ部分で用いられる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子は、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる。所与のワークフロー内で、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（それらの第１の識別子の配列に関して互いに異なる）の数は、様々であり得、かつ所与の第１のセットの第１のサブ部分の数に対応し得、いくつかの事例では、２～２５，０００個の異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチド、例えば９６～１０，０００個の異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含む２～２５，０００個の異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの範囲であり得る。一般に、第１のサブ部分と同じ数の異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドがあるべきである。

【0047】

いくつかの実施形態によれば、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの５’末端の相補体（例えば、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの５’アダプタ配列）を合成した後、ポリメラーゼが鋳型スイッチオリゴヌクレオチドから異なる鋳型核酸に切り替わるのを防ぐ修飾を含む。有用な修飾としては、脱塩基損傷（例えば、テトラヒドロフラン誘導体）、ヌクレオチド付加物、イソヌクレオチド塩基（例えば、イソシトシン、イソグアニンなど）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

いくつかの事例では、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、一意の分子識別子を含み得る。用語「一意の分子識別子」及び「ＵＭＩ」は、所与の分子種の個々の分子のカウントに使用することができる、様々な長さ、例えば、いくつかの事例において６～１２ｎｔの長さの範囲のランダマーを指す。いくつかの事例では、カウントは、各個々の分子が一意のＵＭＩを受け取るように、多様なＵＭＩプールから目的の標的の個々の分子にＵＭＩを結合させることによって促進される。そのような場合、個々の転写分子をカウントすることによって、ＮＧＳライブラリの準備中に生成されたＰＣＲバイアスを補正することができ、試料集団のより定量的な理解を達成することができる。ＵＭＩは、いくつかの事例では、ソースバーコード配列（例えば、細胞バーコード配列、試料バーコード配列、ウェルバーコード配列など）などの他のバーコード配列と併せて使用され得る。鋳型スイッチオリゴヌクレオチド上に存在する場合、所与のサブ部分内で、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの集団が用いられてもよく、この鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの集団は、同一又は共通の第１の識別子ドメインを有し得るが、それらのＵＭＩドメインの配列に関して互いに異なる。そのような場合、ＵＭＩドメインに関して互いに異なるが、所与のサブ部分に提供される共通の第１の識別子ドメインを共有する異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの数は、様々であり得る。

【0049】

いくつかの事例では、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、アダプタドメイン（例えば、３’ハイブリダイゼーションドメインの定義されたヌクレオチド配列５’及び鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子ドメイン）を含み得る。アダプタドメインは、下流用途において様々な目的を果たし得る。いくつかの事例では、アダプタドメインは、更なる増幅、又は例えば、入れ子増幅若しくは抑制増幅のためのプライマー結合部位として、例えば、ＮＧＳ用途（以下により詳細に記載されるような）で用いられ得るような追加のドメインを導入するためのプライマー結合部位として機能し得る。いくつかの事例では、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、配列決定プラットフォームアダプタ構築物を含む。「配列決定プラットフォームアダプタ構築物」とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及び／若しくはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及び／若しくはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、又は目的の任意の他の配列決定プラットフォームなどの目的の配列決定プラットフォームによって利用される核酸ドメイン（例えば、配列決定プラットフォームアダプタ核酸配列）の少なくとも一部分を含む核酸構築物を意味する。特定の態様では、配列決定プラットフォームアダプタ構築物としては、表面結合配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおけるフロー細胞の表面に結合したＰ５又はＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば、「捕捉部位」若しくは「捕捉配列」）；配列決定プライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのリード１若しくはリード２プライマーが結合し得るドメイン）；バーコードドメイン（例えば、所与の試料からの全ての分子を特定のバーコード若しくは「タグ」でマーキングすることによって、試料多重化を可能にするように配列決定される核酸の試料源を一意に識別するドメイン）；バーコード配列決定プライマー結合ドメイン（バーコード配列決定に使用されるプライマーが結合するドメイン）；一意のタグが配列決定される事例数に基づいて発現レベルを決定するために、目的の分子を一意にマーキングするための分子識別ドメイン（例えば、４、６、若しくは他の数のヌクレオチドのランダム化タグなどの分子インデックスタグ）；又はそのようなドメインの任意の組み合わせが挙げられる。特定の態様では、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）及び分子識別ドメイン（例えば、分子インデックスタグ）は、同じ核酸に含まれてもよい。配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、目的の配列決定プラットフォームに好適な任意の長さ及び配列の核酸ドメイン（例えば、「配列決定アダプタ」）を含み得る。特定の態様では、核酸ドメインは、４～２００ヌクレオチド長である。例えば、核酸ドメインは、４～１００ヌクレオチド長、例えば、６～７５、８～５０、又は１０～４０ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態によれば、配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、２～８ヌクレオチド長、例えば、９～１５ヌクレオチド長、１６～２２ヌクレオチド長、２３～２９ヌクレオチド長、又は３０～３６ヌクレオチド長の核酸ドメインを含む。存在し得る配列決定プラットフォームアダプタ構築物を含むそのようなアダプタドメインの例としては、限定されないが、米国特許第９，７１９，１３６号、同第１０，４１５，０８７号、同第１０，７８１，４４３号、同第１０，９４１，３９７号、同第１０，９５４，５１０号、及び第１１，１２４，８２８号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。

【0050】

特定の態様では、配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、表面結合配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおけるフロー細胞の表面に結合したＰ５又はＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば、「捕捉部位」又は「捕捉配列」）である核酸ドメイン、配列決定プライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのリード１又はリード２プライマーが結合し得るドメイン）を含む。配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、目的の配列決定プラットフォームに好適な任意の長さ及び配列の核酸ドメイン（例えば、「配列決定アダプタ」）を含み得る。特定の態様では、核酸ドメインは、４～２００ｎｔ長である。例えば、核酸ドメインは、４～１００ｎｔ長、例えば、６～７５、８～５０、又は１０～４０ｎｔ長であり得る。特定の実施形態によれば、配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、２～８ｎｔ長、例えば、９～１５ヌクレオチド長、１６～２２ｎｔ長、２３～２９ｎｔ長、又は３０～３６ｎｔ長の核酸ドメインを含む。

【0051】

核酸ドメインは、目的の配列決定プラットフォームによって用いられるポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）が、例えば、核酸ドメインに隣接するｃＤＮＡ挿入物の合成による固相増幅及び／又は配列決定のために、核酸ドメインに特異的に結合することを可能にする長さ及び配列を有し得る。例示的な核酸ドメインとしては、Ｐ５（５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’）（配列番号０１）、Ｐ７（５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－３’）（配列番号０２）、リード１プライマー（５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）（配列番号０３）及びリード２プライマー（５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）（配列番号０４）ドメインが挙げられる。他の例示的な核酸ドメインとしては、Ａアダプタ（５’－ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ－３’）（配列番号０５）及びＰ１アダプタ（５’－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ－３’）（配列番号０６）がＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）ベースの配列決定プラットフォーム上で用いられるドメインが挙げられる。

【0052】

目的の配列決定プラットフォーム上での配列決定に有用なアダプタ構築物のヌクレオチド配列は、時間の経過とともに変動及び／又は変化し得る。アダプタ配列は、典型的には、配列決定プラットフォームの製造元によって（例えば、配列決定システムとともに提供される、及び／又は製造元のウェブサイトで入手可能な技術文書において）提供される。そのような情報に基づいて、配列決定プラットフォームアダプタ構築物の配列は、目的のプラットフォーム上で核酸挿入物（鋳型核酸に対応する）を配列決定することを可能にする構成において、１つ以上の核酸ドメインの全て又は一部分を含むように設計され得る。非鋳型化配列に含まれ得る配列決定プラットフォームアダプタ構築物、並びに本明細書に記載される他の核酸試薬は、米国特許出願第１４／４７８，９７８号（ＵＳ２０１５－０１１１７８９Ａ１として公開され、米国特許第１０，９４１，３９７号として発行され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に更に記載される。

【0053】

鋳型スイッチオリゴヌクレオチドに加えて、例えば、第１のセットのサブ部分の透過処理された細胞源と接触するように提供される試薬は、第１の鎖プライマー（すなわち、例えば、鋳型核酸、例えば、ＲＮＡ鋳型又はＤＮＡ鋳型からの合成をプライミングするための単一生成物核酸プライマー）を含み得る。第１の鎖プライマー（単一生成物核酸プライマー）は、鋳型結合ドメインを含む。例えば、核酸は、鋳型核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｓＤＮＡなどにハイブリダイズするように構成される第１の（例えば、３’）ドメインを含み得、鋳型核酸にハイブリダイズしない第２の（例えば、５’）ドメイン、例えば、以下でより詳細に説明するような非鋳型配列ドメインとしてみなされ得る１つ以上の追加のドメインを含んでも、含まなくてもよい。鋳型結合ドメインの配列は、独立して定義されてもよく、又は任意であってもよい。特定の態様では、鋳型結合ドメインは、定義された配列、例えば、ポリｄＴ又は遺伝子特異的配列を有する。他の態様では、鋳型結合ドメインは、任意の配列（例えば、ランダム六量体配列などのランダム配列）を有する。更に他の事例では、鋳型結合ドメインは、例えば、米国特許第８，２０６，９１３号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、準ランダムであってもよい。鋳型結合ドメインの長さは様々であり得るが、いくつかの事例では、このドメインの長さは、５～５０ｎｔ、例えば、６～２５ｎｔ、例えば、６～２０ｎｔの範囲である。第１の鎖プライマーは、修飾されているか、又はそうでなければ天然に存在しない１つ以上のヌクレオチド（又はその類似体）を含み得る。例えば、単一生成物核酸プライマーは、１つ以上のヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、２’－フルオロＲＮＡなど）、連結修飾（例えば、ホスホロチオエート、３’－３’及び５’－５’逆連結）、５’及び／若しくは３’末端修飾（例えば、５’及び／若しくは３’アミノ、ビオチン、ＤＩＧ、ホスフェート、チオール、染料、クエンチャーなど）、１つ以上の蛍光標識されたヌクレオチド、又は単一生成物核酸プライマーに所望の機能を提供する任意の他の特徴を含み得る。いくつかの事例では、第１の鎖プライマー（すなわち、単一生成物核酸プライマー）は、アダプタドメイン（例えば、単一生成物核酸プライマーの３’鋳型結合ドメインの定義されたヌクレオチド配列５’）を含んでもよく、アダプタドメインは、下流用途において様々な目的を果たし得る。いくつかの事例では、アダプタドメインは、本明細書に記載されるように、更なる増幅のためのプライマー結合部位として機能し得る。

【0054】

鋳型スイッチオリゴヌクレオチド及び第１の鎖プライマーに加えて、例えば、第１のセットのサブ部分の透過処理された細胞源と接触させるように提供される試薬は、鋳型スイッチングが可能であるポリメラーゼを含み得、ポリメラーゼは、第１の核酸鎖を重合のための鋳型として使用し、次いで、第２の鋳型核酸鎖の３’末端に切り替わり、すなわち、同じ重合反応を継続する。いくつかの事例では、鋳型スイッチングが可能なポリメラーゼは、逆転写酵素である。本発明の方法を実施するのに使用することができる鋳型スイッチングが可能な逆転写酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、第ＩＩ族イントロン由来逆転写酵素、及びその変異体、バリアント誘導体、又は機能性断片、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス又はＲＮａｓｅ Ｈ還元酵素が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ逆転写酵素（例えば、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｒ２非ＬＴＲエレメント逆転写酵素）であってもよい。主題の方法を実施するのに有用な鋳型スイッチングが可能なポリメラーゼは、市販されており、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手可能なＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素を含む。鋳型スイッチング能力に加えて、ポリメラーゼは、他の有用な機能を含んでもよい。例えば、ポリメラーゼは、末端トランスフェラーゼ活性を有し得、ポリメラーゼは、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子の３’ヒドロキシル末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加を触媒することができる。特定の態様では、ポリメラーゼが鋳型の５’末端に到達すると、ポリメラーゼは、鋳型によってコードされない新生鎖の３’末端に１つ以上の追加のヌクレオチドを組み込むことができる。例えば、ポリメラーゼが末端トランスフェラーゼ活性を有する場合、ポリメラーゼは、新生鎖の３’末端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くの追加のヌクレオチドを組み込むことが可能であり得る。ヌクレオチドの全ては、同じであってもよく（例えば、新生鎖の３’末端にホモヌクレオチド伸長を作成すること）、又はヌクレオチドのうちの１つ以上は、他のヌクレオチドと異なっていてもよい（例えば、新生鎖の３’末端にヘテロヌクレオチド伸長を作成すること）。特定の態様では、ポリメラーゼの末端トランスフェラーゼ活性により、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くの同じヌクレオチド（例えば、全てのｄＣＴＰ、全てのｄＧＴＰ、全てのｄＡＴＰ、又は全てのｄＴＴＰ）のホモヌクレオチド伸長が付加される。例えば、一実施形態によれば、ポリメラーゼは、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）である。ＭＭＬＶ ＲＴは、新生鎖の３’末端に追加のヌクレオチド（主にｄＣＴＰ、例えば、３つのｄＣＴＰ）を組み込む。本明細書の他の場所でより詳細に記載されるように、これらの追加のヌクレオチドは、例えば、鋳型から鋳型スイッチオリゴヌクレオチドへのポリメラーゼによる鋳型スイッチングを促進するために、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインと新生鎖の３’末端との間のハイブリダイゼーションを可能にするのに有用であり得る。

【0055】

第１の識別子タグ付き核酸が細胞源で産生される細胞源の鋳型核酸は、様々であり得る。特定の実施形態によれば、鋳型核酸は、鋳型リボ核酸（鋳型ＲＮＡ）である。鋳型ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランザクション低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファー－メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、低分子Ｃａｊａｌ体特異的（ｓｍａｌｌ Ｃａｊａｌ ｂｏｄｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｐｒｅｐａｒｅｄ）ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、短鎖一過性（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、又はそれらのＲＮＡ型若しくはサブタイプの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない任意のタイプのＲＮＡ（又はそのサブタイプ）であってもよい。特定の実施形態によれば、鋳型核酸は、鋳型デオキシリボ核酸（鋳型ＤＮＡ）である。鋳型ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（例えば、原核生物ゲノムＤＮＡ（例えば、細菌ゲノムＤＮＡ、古細菌ゲノムＤＮＡなど）、真核生物ゲノムＤＮＡ（例えば、植物ゲノムＤＮＡ、真菌ゲノムＤＮＡ、動物ゲノムＤＮＡ（例えば、哺乳動物ゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、げっ歯類ゲノムＤＮＡ（例えば、マウス、ラット））、昆虫ゲノムＤＮＡ（例えば、ショウジョウバエ）、両生類ゲノムＤＮＡ（例えば、ゼノプス）など））、ウイルスゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はそれらのＤＮＡ型若しくはそれらのサブタイプの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のタイプのＤＮＡ（又はそのサブタイプ）であってもよい。

【0056】

上記のような鋳型スイッチング反応により、第１の識別子タグ付き細胞源サブ部分の第１のセットが生成され、各細胞源サブ部分は、複数の細胞源を含み、複数の細胞源（ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）は、第１の識別子タグ付き核酸、例えば、第１の識別子ドメインを含む逆転写産物核酸を収容又は含有する（すなわち、内含する）。上記で概説したように、所与のサブ部分の細胞源内の第１の識別子タグ付き核酸の第１の識別子は、その第１の識別子を有する鋳型スイッチオリゴによって提供されたため、同一又は共通である。しかしながら、第１のセットの任意の２つのサブ部分の中では、タグ付き核酸の第１の識別子が異なるため、第１のサブ部分のタグ付き核酸は、第１のセットの任意の他のサブ部分のタグ付き核酸と区別することができる。

【0057】

第１のセットのサブ部分の細胞源内の第１の識別子タグ付き核酸の生成に用いられる試薬は、任意の好都合なプロトコルを使用して細胞源に提供され得る。例えば、上記で示されるように、試薬は、容器内に細胞源を導入する前に、必要に応じて、乾燥された形態又は液体形態で、サブ部分用容器（例えば、ウェル）内に存在し得る。あるいは、試薬は、例えば、手動でそれらを容器内に導入することによって、例えば、自動液体分配システムなどを使用して容器内に分配することによって、細胞源を収容するサブ部分用容器に提供され得る。いくつかの実施形態では、例えば、アドレス指定可能なナノウェルのアレイの形態で、マルチウェルプレートと、試料ディスペンサーとを含むマルチ試料ナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）システムが用いられる。そのようなＭＳＮＤシステムの例は、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＭＳＮＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）である。ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムの詳細は、米国特許第７，８３３，７０９号及び第８，２５２，５８１号、並びに公開されている米国特許出願公開第２０１５／０３６２４２０号及び２０１６／０２４５８１３号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に更に見出される。

【0058】

プール／再配分
第１の識別子タグ付き細胞源サブ部分の第１のセットの産生後、第１の識別子タグ付き細胞源サブ部分を組み合わせるか、又はプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成する。異なるサブ部分の細胞源は、任意の好都合なプロトコルを使用して組み合わせてもよく、又はプールしてもよい。結果として生じる第１の細胞源プールにおける細胞源の数は様々であり得、いくつかの事例では、１０，０００～１，０００，０００個の細胞又は１０，０００～１００，０００個の細胞など、２～１０，０００，０００個の細胞の範囲である。

【0059】

プールの後、得られた第１の細胞源プールを、第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分する。言い換えれば、第１の細胞源プールは、複数のサブ部分に分割又は分離され、これらは、集合的にサブ部分の第２のセットを構成し、異なるサブ部分は、複数の（ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ）又は複数の（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）細胞源を含み、異なるサブ部分を構成する複数の細胞源は、例えば、上記のように、第１の識別子タグ付き核酸を含む。第２のセットを構成するサブ部分の数は様々であり得るが、いくつかの事例では、その数は、２～２５，０００個のサブ部分、例えば、９６～１０，０００個のサブ部分（９６～５，１８４個のサブ部分を含む）の範囲である。いくつかの事例では、第２のセットにおけるサブ部分の数は、第１のセットにおけるサブ部分の数と同一である。上記に示されるように、第２のセットの各サブ部分は、複数の細胞源で構成されている、すなわち、複数の細胞源を含む。第２のセットの所与のサブ部分を構成する細胞源の数は様々であり得るが、いくつかの事例では、その数は、１～１０，０００、例えば１００～１，０００の範囲であり、１００～５００を含む。

【0060】

第２のセットの所与のサブ部分内で、そのサブ部分を構成する複数の細胞源は、細胞源に存在する第１の識別子タグ付き核酸の第１の識別子ドメインに関して各々異なる。プール／再配分ステップのために、第１のセットの異なるサブ部分からの細胞源は、第２のセットの同じサブ部分に組み合わされる。この同じサブ部分内で、細胞源内の第１の識別子タグ付き核酸は、第１の識別子ドメインの配列に関して互いに異なる。したがって、第２のセットの所与のサブ部分は、複数の異なる第１の識別子ドメインを有し、各々の異なるドメインは、それ自体の細胞源内に存在する。

【0061】

細胞源識別可能な核酸の産生
本発明の一実施形態では、プールされた細胞源の第１のセットをサブ部分の第２のセットに配分した後、次いで、第２のセットのサブ部分における複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸が産生される。上述のように、細胞源識別可能な核酸は、その起源又は供給源が、核酸内に存在する識別子配列に基づいて決定され得る核酸であり、識別子配列は、少なくとも第１及び第２の識別子配列を含む。したがって、細胞源識別可能な核酸は、第１の識別子及び第２の識別子の両方を含み、これらの組み合わせから得られる配列情報は、細胞源識別可能な核酸が調製された源又は起源、すなわち開始細胞源を決定することを可能にする。以下でより詳細に検討するように、第２の識別子は、例えば、細胞源識別可能な核酸を調製するために使用されるプロトコルに応じて、連続したヌクレオチドの単一のドメインから構成され得るか、又は２つ以上の、例えば、第１及び第２の異なるサブ識別子ドメインから構成され得る。各サブ部分において、細胞源識別可能な核酸上に存在する第２の識別子は、同一である。更に、第２のセットの異なるサブ部分の第２の識別子は、異なる。したがって、第２のセットの各サブ部分の第２の識別子は、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる。したがって、第２のセットの異なるサブ部分の細胞源識別可能な核酸は、それらの第２の識別子によって互いに区別することができる。いくつかの実施形態では、サブ部分の第２のセットにおける核酸と会合した第２の識別子とサブ部分の第１のセットにおける核酸と会合した第１の識別子との組み合わせは、第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを、それらの核酸の細胞源を識別する所与の細胞源から生成される各核酸コレクションに付与する。他の実施形態では、第１の識別子、第２の識別子、及び追加ラウンドのインデックス付けにおいて付加される任意の第３又は追加の識別子の組み合わせは、初期の複数の細胞源からの特定の細胞源に由来する核酸に一意の識別を付与する。

【0062】

適切な数の初期の細胞源、並びに異なる第１の識別子及び第２の識別子（及び対応する第１のサブ部分及び第２のサブ部分）、又は任意選択的に、後続ラウンドのインデックス付けからの第３若しくは更なる識別子を選択することによって、同一の第１及び第２の識別子を有する２つの異なる細胞源に由来する核酸の確率が、無視できる、すなわち、ゼロに近い確率、又は５％未満の確率、又は２％未満の確率、１％未満の確率、０．１％未満の確率、又は０．０１％未満の確率であるいくつかの組み合わせを容易に提供することができる。

【0063】

上記のように、第２のセットのサブ部分における第１の識別子タグ付き核酸に組み込まれる第２の識別子は、例えば、細胞源識別可能な核酸を調製するために使用されるプロトコルに応じて、連続したヌクレオチドの単一のドメインから構成され得るか、又は２つ以上の、例えば、第１及び第２の異なるサブ識別子ドメインから構成され得る。したがって、いくつかの事例では、第２の識別子は、連続したヌクレオチドの単一ドメインからなり得、そのようなドメインの長さは、いくつかの事例において４～２０、例えば８～１２の範囲で様々であり得る。この実施形態の第２の識別子は、例えば、増幅反応（１つ以上の増幅ラウンド、例えば、１つ以上のＰＣＲラウンドを含み得る）におけるプライマーによって、ライゲーションアダプタの一部として、タグメンテーションを介してなどにより、いくつかの異なる方法で導入され得る。更に他の事例では、第２の識別子は、２つ以上の、例えば、第１及び第２の異なるサブ識別子ドメインで構成される。これらのサブ識別子ドメインの長さは、４～２０、例えば８～１２の範囲で様々であり得る。本実施形態の第２の識別子は、いくつかの異なる方法で、例えば、増幅反応（１つ以上の増幅ラウンド、例えば、１つ以上のＰＣＲラウンドを含み得る）におけるプライマーによって、ライゲーションアダプタの一部として、タグメンテーションを介してなどにより導入され得る。２つ以上の、例えば、第１及び第２のサブ識別子が第２の識別子を構成するために用いられるこれらの実施形態では、サブ識別子の同じ組み合わせが所与のサブ集団に対して使用され、サブ識別子の異なる組み合わせが異なるサブ集団に対して使用される。しかしながら、所与の第１のサブ識別子は、１つのサブ集団のみに対して使用される必要はない。代わりに、所与のサブ集団の第１及び第２のサブ識別子の組み合わせが第２のセットの他のサブ集団を区別するように、同じ第１のサブ識別子は、それが各サブ集団内の異なる第２のサブ識別子と対合される限り、異なるサブ集団で使用され得る。このようにして、細胞源識別可能な核酸を産生するために用いられる総サブ識別子コレクションは、第２のセットにおけるサブ集団の総数よりも少なくてもよく、いくつかの事例では、サブ識別子の総数は、第２のセットにおけるサブ集団の総数の１～３０％、例えば、１～２５％、又は３～１０％である。

【0064】

所望の場合、細胞源識別可能な核酸の産生の前に、核酸は、例えば、細胞源を溶解することによって、第２のセットのサブ集団内の細胞源から放出され得る。溶解は、例えば、細胞源の加熱又は凍結融解、又は洗剤若しくは他の化学方法の使用、又はこれらの組み合わせによって達成することができる。しかしながら、任意の好適な溶解方法を使用することができる。いくつかの事例では、軽度の溶解手順を有利に使用して、核クロマチンの放出を防止し、それによってｃＤＮＡライブラリのゲノム汚染を回避し、ｍＲＮＡの分解を最小限に抑えることができる。例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０の存在下で細胞を７２℃で２分間加熱することは、核クロマチンから検出可能なゲノム汚染をもたらさない一方で、細胞を溶解するのに十分である。あるいは、細胞を水中で１０分間６５℃に加熱することができる（Ｅｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ６０（４）：４３９－５１（２００８））か、又は０．５％ ＮＰ－４０を補充したＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で９０秒間７０℃に加熱することができる（Ｋｕｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４（５）：ｅ４２（２００６））か、又は溶解は、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼで、又はグアニジンイソチオシアネートなどのカオトロピック塩の使用によって達成することができる（米国公報第２００７／０２８１３１３号）。

【0065】

上記のように、細胞源識別可能な核酸は、第２の識別子（第２の識別子が第１及び第２のサブ識別子を含む場合を含む）をサブ部分の第１の識別子タグ付き核酸と会合させて、第１及び第２の識別子の両方を含む細胞源識別可能な核酸を産生する任意の好都合なプロトコルを使用して、第２のセットのサブ部分において産生され得る。そのようなプロトコルの例としては、増幅プロトコル、ライゲーションプロトコル、タグメンテーションプロトコル、第２の鎖合成反応などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなプロトコルにおける反応混合物成分を、反応の所望の細胞源識別可能な核酸生成物を生成するのに十分な条件下で組み合わせる。例えば、いくつかの事例では、増幅反応の反応成分を、１つ以上の増幅ラウンド、例えば、１つ以上のＰＣＲラウンドを介して、細胞源識別可能な核酸生成物を生成するのに十分な条件下で組み合わせる。いくつかの事例では、ライゲーション反応の反応成分を、ライゲーションされた細胞源識別可能な生成物核酸を産生するのに十分な条件下で組み合わせる。更に他の事例では、タグメンテーション反応の反応成分を、細胞源識別可能なタグメンテーション核酸を産生するのに十分な条件下で組み合わせ、この核酸は、後続の反応ステップで使用されてもされなくてもよく、又は後続の反応ステップに供されてもされなくてもよい。

【0066】

調製された反応混合物は、所望の細胞源識別可能な生成物核酸を産生するのに十分な条件を生成するのに必要な成分を提供する。「所望の細胞源識別可能な核酸を産生するのに十分な条件」とは、反応中の関連する核酸及び／又は他の反応成分が所望の方法で互いに相互作用することを可能にする反応条件を意味する。例えば、いくつかの事例では、条件は、反応混合物の核酸がハイブリダイズするのに十分であり得る。いくつかの事例では、条件は、反応混合物の酵素が、例えば、重合、加水分解、ライゲーション、タグメンテーションなどの化学プロセスを触媒するのに十分であり得る。好適な反応条件を達成することは、反応混合物成分、その濃度、及び反応温度を選択して、例えば、関連する核酸が配列特異的な方法で互いにハイブリダイズすること、関連するポリメラーゼが核酸の伸長をもたらすことなどを含む、関連するプロセスが進行する環境を作成することを含み得る。反応の特定の核酸（例えば、鋳型核酸、オリゴヌクレオチド、プライマーなど）に加えて、反応混合物は、適切なｐＨ、塩濃度（例えば、ＫＣｌ濃度）などを確立する緩衝液成分を含み得る。二本鎖核酸複合体を生成するのに十分な条件には、ハイブリダイゼーションに適切な条件（「ハイブリダイゼーション条件」とも呼ばれる）が含まれ得る。

【0067】

好適な反応条件を達成することは、反応混合物成分、その濃度、及び反応温度を選択して、１つ以上のポリメラーゼが活性である環境及び／又は反応中の関連する核酸が所望の方法で互いに相互作用する（例えば、ハイブリダイズする）環境を作成することを含み得る。好適な反応条件では、反応成分に加えて、反応混合物は、伸長反応、例えば、第２鎖合成反応、及び／又は鋳型スイッチングが生じるのに適切なｐＨ、塩濃度（例えば、ＫＣｌ濃度）、金属補因子濃度（例えば、Ｍｇ^２＋又はＭｎ^２＋濃度）などを確立する緩衝液成分を含み得る。他の成分は、１つ以上のヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤及び／若しくはＤＮａｓｅ阻害剤）、ＧＣリッチ配列の増幅／複製を促進するための１つ以上の添加剤（例えば、ＧＣ－Ｍｅｌｔ（商標）試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））、ベタイン、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、１，２－プロパンジオール、若しくはそれらの組み合わせ）、１つ以上の分子群集剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）、１つ以上の酵素安定化成分（例えば、１～１０ｍＭ（例えば、５ｍＭ）の範囲の最終濃度で存在するＤＴＴ）、並びに／又はポリメラーゼ媒介伸長反応及び／若しくは鋳型スイッチングを促進するのに有用な任意の他の反応混合物成分などが含まれ得る。

【0068】

１つ以上の反応混合物は、増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）、ライゲーション、第２の鎖合成、又はタグメンテーションに好適なｐＨを有してもよい。特定の実施形態では、反応混合物のｐＨは、５～９、例えば７～９、８～９、例えば８～８．５の範囲である。いくつかの事例では、反応混合物は、ｐＨ調整剤を含む。目的のｐＨ調整剤としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、塩酸、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。例えば、反応混合物のｐＨは、適切な量のｐＨ調整剤を添加することによって所望の範囲に調整することができる。

【0069】

プライマー伸長反応に好適な温度範囲は、用いられる特定のポリメラーゼ、用いられる任意のプライマーの融解温度（Ｔｍ）などの要因に従って様々であり得る。いくつかの事例では、逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）を用いてもよく、ハイブリダイズしたプライマーの逆転写酵素媒介伸長に十分な反応混合物条件は、反応混合物を、４℃～７２℃、例えば、１６℃～７０℃、例えば、３７℃～５０℃、例えば、４０℃～４５℃（４２℃を含む）の範囲の温度にすることを含む。

【0070】

上記に要約したように、第２の識別子配列は、様々な手段によって、例えば、増幅媒介反応、ライゲーション媒介反応、タグメンテーション媒介反応、第２の鎖合成反応、等温増幅反応、鋳型スイッチング反応などを介して、第１の識別子タグ付き核酸と会合し得る。例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチド上に存在する第２の識別子配列は、増幅反応中に第１の識別子タグ付き核酸に組み込まれ得る。いくつかの事例では、第２の識別子配列は、第１の識別子タグ付き核酸に直接結合してもよい。非鋳型化配列を核酸に直接結合させる方法は様々であり、例えば、ライゲーション、化学合成／連結、酵素ヌクレオチド付加（例えば、末端トランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼによる）などを含み得るが、これらに限定されない。更に他の事例では、第２の識別子配列は、タグメンテーションを使用して第１の識別子タグ付き核酸に会合され得る。

【0071】

増幅が用いられる場合、第２の識別子と、第２のセットのサブ部分における第１の識別子タグ付き核酸との会合は、１つ以上の増幅ラウンド、例えば、ＰＣＲラウンドを利用してもよく、プライマー、例えば、フォワード及びリバース増幅プライマーは、好適な増幅ポリメラーゼと組み合わせて使用されて、第１及び第２の識別子ドメインを含む細胞源識別可能な核酸を産生してもよく、第２の識別子ドメインは、単一の連続したドメイン又は２つ以上のサブドメインから構成されてもよい。そのような実施形態では、プライマーは、第１の識別子タグ付き核酸の相補的部位にハイブリダイズするように構成されたプライマー結合部位を含み得る。増幅実施形態で使用されるプライマーは、第１の識別子タグ付き核酸における対応するドメインにハイブリダイズする鋳型結合ドメインを有する。この鋳型結合ドメインは、上記のように、例えば、遺伝子特異的、任意、例えば、ランダム、準ランダムなどとして定義され得る。１つ以上の増幅ラウンドで使用される所与のプライマーは、第２の識別子成分、例えば、ドメイン全体又はそのサブ識別子を含み得る。例えば、第２の識別子が第１及び第２のサブ識別子から構成される場合、第１及び第２のプライマーの各々は、サブ識別子のうちの１つ、例えば、プライマーのプライマー結合部位の５’位を含み得る。加えて、増幅媒介反応に用いられるプライマーは、所望に応じて、１つ以上の追加のドメインを含み得る。そのような追加のドメインには、多くの場合、上記のようなアダプタドメイン（例えば、配列決定プラットフォームアダプタ構築物）が含まれるが、これらに限定されない。

【0072】

細胞源識別可能な核酸を産生するための増幅媒介反応はまた、例えば、プライミングされた第１の識別子タグ付き核酸等の増幅での使用に好適なポリメラーゼを用いてもよい。熱安定性ポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されない任意の好都合な増幅ポリメラーゼが使用され得る。有用な増幅ポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｅｒｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、米国特許第６，１２７，１５５号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、及びそれらの誘導体などが挙げられる。いくつかの事例では、増幅ポリメラーゼは、例えば、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタートＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどを含むが、これらに限定されない、ホットスタートポリメラーゼであってもよい。増幅ポリメラーゼは、増幅ポリメラーゼの最終濃度が所望の量の生成物核酸を産生するのに十分であるように、反応混合物に組み合わされてもよい。特定の態様では、増幅ポリメラーゼ（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼなど）は、反応混合物中に、例えば、０．５～１００Ｕ／μＬ、例えば、１～５０Ｕ／μＬ、例えば、５～２５Ｕ／μＬ、例えば、２０Ｕ／μＬを含む、０．１～２００ユニット／μＬ（Ｕ／μＬ）の最終濃度で存在する。主題の方法の核酸反応、例えば、増幅反応は、ｄＮＴＰを反応混合物に組み合わせることを含み得る。特定の態様では、４つの天然に存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）の各々を反応混合物に添加する。例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰは、各ｄＮＴＰの最終濃度が、０．０１～１００ｍＭ、例えば、０．１～１０ｍＭ（０．５～５ｍＭ（例えば、１ｍＭ）を含む）であるように、反応混合物に添加され得る。いくつかの事例では、反応混合物に添加される１つ以上のタイプのヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド、例えば、結合若しくはそれに結合された他の部分（例えば、蛍光部分、ビオチン部分）を有する修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又は主題の方法若しくは目的の下流用途において使用されることが見出される任意の他のタイプの天然に存在しないヌクレオチドであってもよい。

【0073】

反応混合物は、限定されないが、例えば、核酸の変性／融解、核酸のハイブリダイゼーション／アニーリング、ポリメラーゼ媒介の伸び／伸長などを含む反応の様々な態様を駆動するために様々な温度にさらされてもよい。様々なプロセスが実行される温度は、例えば、融解温度、アニーリング温度、伸び温度などを含む発生するプロセスに従って参照され得る。そのようなプロセスに最適な温度は、例えば、使用されるポリメラーゼに応じて、核酸の特徴などに応じて変化する。逆転写酵素及び増幅ポリメラーゼを含む特定のポリメラーゼに最適な温度は、参照テキストから容易に得られ得る。核酸に関連する最適温度、例えば、アニーリング及び融解温度は、例えば、全長、ハイブリダイゼーション長、Ｇ／Ｃ含有率（ｃｏｎｔｅｎｔ）、二次構造予測などを含む主題の核酸の既知の特性に基づいて容易に計算され得る。

【0074】

上述のように、第２の識別子を第１の識別子タグ付き核酸と会合させて細胞源識別可能な核酸を産生するための増幅媒介反応は、１つ以上の増幅ラウンド、例えば、ＰＣＲ適用ラウンドを含み得る。例えば、各第１のラウンドプライマーは、第２の識別子の異なるサブドメインを含み得、そのようなプライマーを用いた第１の識別子タグ付き核酸の増幅により、第１の識別子だけでなく、第２の識別子を集合的に構成する第１及び第２のサブドメインを含むアンプリコンが産生される。あるいは、第１の増幅ラウンドは、例えば、遺伝子特異的鋳型結合ドメインを含むプライマーを用いて増幅が実行される、第１の識別子タグ付き核酸の所望の画分を増幅するプライマーとともに採用され得る。この第１のラウンドの後、第１及び第２のサブドメインを導入するプライマーの第２のラウンドを実行して、細胞源識別可能な核酸を産生してもよい。所与のワークフローで使用される周囲の増幅の数は、所望に応じて様々であり得る。

【0075】

特定の態様では、第２の識別子配列は、ライゲーションプロトコルを使用して、第１の識別子タグ付き核酸と会合される。これらの事例において、第２の識別子配列は、第１の識別子タグ付き核酸の末端にライゲーションされる核酸上に存在し得る。任意の好都合なリガーゼ、例えば、Ｔ４リガーゼを用いてもよい。いくつかの事例では、第２の識別子は、第１の識別子タグ付き核酸にライゲーションされるステム－ループアダプタ構築物に組み込まれてもよい。そのようなアダプタに関する更なる詳細は、米国特許第７，８０３，５５０号、同第８，０７１，３１２号、同第８，３９９，１９９号、同第８，７２８，７３７号、同第９，５９８，７２７号、同第１０，１９６，６８６号、同第１０，２０８，３３７号、及び同第１１，０７２，８２３号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。

【0076】

更に他の実施形態では、本方法は、タグメンテーション反応を利用し、例えば、タグメンテーション反応成分の使用を含み得、第２の識別子配列を第１の識別子タグ付き核酸と会合させることができる。使用される反応成分及びタグメンテーションのプロセスは、必要に応じて様々であり得る。タグメンテーションに用いられるトランスポゾームは、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端ドメイン及び第２の識別子配列、例えば、第２のサブ識別子ドメインを含むトランスポゾン核酸を含み得る。これらのドメインは、機能的に定義されるため、研究者によって要求されるように、同じ配列内の１つであっても、異なる配列であってもよい。ドメインはまた、第２の識別子配列ドメインの一部がトランスポゾン末端ドメインに存在し得るように、重複し得る。タグメンテーションプロセス、トランスポジションベースの配列操作、及びタグメンテーション又はトランスポジションベースの反応に用いられ得る成分は、例えば、米国特許第１０，０１７，７５９号、同第９，７９０，４７６号、同第９，６８３，２３０号、同第９，３８８，４６５号、同第９，２３８，６７１号、同第９，１９３，９９９号、同第８，３８３，３４５号、同第６，２９４，３８５号、同第６，１５９，７３６号、同第５，８６９，２９６号、及び同第５，６７７，１７０号（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。様々なタグメンテーションプロセス、及び／又はその１つ以上の成分は、本明細書に記載の方法での使用に適合され得る。いくつかの事例では、得られるタグメンテーションされた試料は、例えば、タグメンテーション反応中に付加される１つ以上のタグメンテーション後プライマー結合部位にハイブリダイズする１つ以上のタグメンテーション後ＰＣＲプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅条件に供され得る。タグメンテーション後プライマーは、例えば、配列決定プラットフォームアダプタ構築物ドメインなどの非鋳型化配列を含み得る。非鋳型化配列は、本明細書の他の箇所に記載される核酸ドメイン（例えば、表面結合配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチドに特異的に結合するドメイン、配列決定プライマー結合ドメイン、バーコードドメイン、バーコード配列決定プライマー結合ドメイン、分子識別ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせ）のうちのいずれかを含み得る。そのような実施形態は、例えば、タグメンテーションされた試料の核酸が、目的の配列決定プラットフォームでの配列決定に有用又は必要な全てのアダプタドメインを含まず、残りのアダプタドメインが、タグメンテーションされた試料の核酸の増幅に使用されるプライマーによって提供される、使用を見出す。

【0077】

細胞源識別可能な核酸を産生するために使用される任意のプロトコルでは、そのようなプロトコルで用いられる試薬は、細胞源識別可能な核酸生成物に追加の特徴を導入するために使用され得、そのような追加の特徴は、細胞源識別可能な核酸の下流処理で使用される特徴であり得る。例えば、細胞源識別可能な核酸の生成が配列決定ライブラリ生成プロトコルの一部である場合、例えば、上記のように、例えば、上記のような配列決定プラットフォームアダプタ構築物ドメイン、例えば、配列決定アダプタプラットフォーム構築物などを追加するために、後続の増幅ラウンドで用いられ得るプライマー結合ドメインなど、細胞源識別可能な核酸に組み込まれる追加の特徴を含み得る。

【0078】

代表的な実施形態
以下のセクションは、本発明の代表的な実施形態を提供し、この実施形態では、合成ＮＧＳプロトコルによる配列決定で使用する準備ができた細胞源識別可能な核酸が調製される。この実施形態は、初期の複数の細胞核から細胞源識別可能な核酸を産生するためのワークフローを図示する図１Ａ～１Ｄに概略的に示されるが、細胞核の代わりに全細胞を使用することもできる。

【0079】

このプロトコルの間、細胞源材料の完全性は無傷のままであることに留意することが重要である。例えば、細胞がプロトコルで使用される場合、細胞は無傷のままである。細胞核がプロトコルで使用される場合、核は無傷のままである。

【0080】

図１Ａに図示されるように、複数の細胞核を９６ウェルプレートのウェルに分配する。いくつかの実施形態では、９６ウェルプレート上の各ウェルは細胞核を受容するが、プロトコルの要件ではない。更に、プロトコルは、９６ウェルプレートの使用に限定されず、当業者は、任意の好適な容器、チューブ、又は容器が本発明と同等の使用を見出すことを認識しており、更に例えば、２４ウェル若しくは３８４ウェルを有するマルチウェルプレート、又は任意の他のマルチウェル形式プレートは全て、本発明とともに使用される。

【0081】

図１Ａに示すように、複数の核を９６ウェルプレートの各ウェルに分配する。例えば、一般に１００～１，０００個程度の核、例えば、１００個の核、２００個の核、又は３００個の核の複数個が、各ウェルに分配される。

【0082】

核は、ウェルへの分配の前又は後のいずれかで透過処理され、組み合わせインデックス付け試薬、例えば、鋳型スイッチング試薬は、核に入り、分析される核酸にアクセスすることができる。

【0083】

細胞核を９６ウェルプレートのウェルに分配した後、一意の第１の識別子を含むウェル特異的鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを各ウェルに分配する。各ウェルは、その一意の第１の識別子の配列によって、任意の他のウェルに分配された鋳型スイッチオリゴヌクレオチドとは異なる、一意のウェル特異的鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を受容する。したがって、各ウェルは、ウェルに送達されるウェル特異的鋳型スイッチオリゴヌクレオチドによって提供される異なる第１の識別子を受容する。鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドに加えて、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを含む鋳型スイッチング試薬もウェルに送達され、逆転写反応は、第１の鎖ｃＤＮＡがポリＡプライミングによって産生されるように生じさせ、第１の鎖は、その３’末端に鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子配列を含む。その結果、マルチウェルプレートの各ウェル内の核の各々は、それらの細胞核に存在したｍＲＮＡに対応する（すなわち、由来する）ｃＤＮＡ分子を含有する。図１Ａの下部パネルに図示されるように、得られるｃＤＮＡ分子は各々、第１の識別子でタグ付けされる。すなわち、各ｃＤＮＡは、第１の識別子タグ付き核酸であり、単一のウェルにおける全ての核内のｃＤＮＡの第１の識別子は、同一である。しかしながら、異なるウェルにおける核内のｃＤＮＡの第１の識別子は、異なる。

【0084】

このプロトコルの続きを図１Ｂに示す。図１Ｂ、左上パネルに示されるように、逆転写により、ウェル特異的な第１の識別子を有するｃＤＮＡを含む９６ウェルプレートが生成される。すなわち、このｃＤＮＡは、第１の識別子タグ付き核酸である。単一のウェル内の各核内の第１の識別子は同一であるが、第１の識別子は、異なるハッチパターンによって表されるように、９６ウェルプレートの異なるウェルの間で異なる。各ウェルの核を収集し、次いで単一のチューブにプールし、洗浄して、溶解した核並びに過剰なプライマー及びＲＴ試薬を除去する（図１Ｂ、右上パネル）。次いで、得られたプールされた核を、各ウェルに１００個の核を有する別の９６ウェルプレートのウェルに再配分する。次いで、各ウェル内の核を溶解して、核内に存在する第１の識別子タグ付きｃＤＮＡを放出する。図１Ｂ、下部パネルに示すように、各ウェルは、異なる溶解核から放出されたｃＤＮＡのコレクションを含み、異なるウェルからのコレクションの第１の識別子は、互いに異なる。

【0085】

このプロトコルが、図１Ｃに更に図示されている。図１Ｃでは、９６ウェルプレートの各ウェルは、示されるように、複数の異なる元の核からの第１の識別子タグ付き核酸のプール又は混合物を含み、複数の異なる第１の識別子が各ウェル内に存在する。次いで、第２の識別子を集合的に構成する第１及び第２のサブ識別子のウェルに一意の組み合わせを、ウェルの各々における第１の識別子タグ付き核酸と会合させる。第１及び第２のサブ識別子の一意の組み合わせは、集合的に各ウェルに一意の第２の識別子を提供する。図１Ｃに示されるように、ＴＳＯによって導入された第１の遺伝子特異的プライマー及びアダプタドメイン、例えば、リードプライマー２ドメインに相補的なプライマーを用いる第１のＰＣＲラウンドを使用して、第１の識別子タグ付き核酸のサブセットを増幅する。次いで、第２の増幅ラウンドを、第２の識別子を集合的に構成する異なるサブドメインを導入するプライマーとともに用いる。一意の第２の識別子は、第１及び第２のサブ識別子の一意の組み合わせを各ウェルに提供することによって提供され、一意の組み合わせは、ウェルの数よりも数が少ない、より限定されたサブ識別子ドメインのセットから提供される。図示のアプローチでは、異なる第１のサブ識別子がプレート上のウェルの各列に提供され、異なる第２のサブ識別子がプレート上のウェルの各行に提供され、プレートの各ウェルが第１及び第２のサブ識別子のそれ自体の一意の組み合わせを有することになる。各ウェル内で、第１及び第２のサブ識別子を、増幅媒介反応を使用して、ウェル内の第１の識別子タグ付き核酸と会合させる。図示の増幅媒介反応では、上記のように、目的の遺伝子、例えば、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子を、３’末端上で（アダプタなしで）かつＴＳＯからのＲＰ２などのアダプタを用いて増幅する第１のＰＣＲラウンドが実行され、このＰＣＲラウンドは、全てのウェルに対して同じプライマーを用いる。この第１のＰＣＲラウンドに続いて、半ネスト化されたＰＣＲは、クラスター生成配列Ｐ７を５’末端に付加し（ＲＰ２アダプタ配列にアニールし）、リードプライマー１及びクラスター生成配列Ｐ５を３’末端（ネスト化された遺伝子特異的プライマー）に付加する。このＰＣＲはまた、各ウェルに異なるｉ５及びｉ７インデックス（第１及び第２のサブ識別子）を付加する。この場合、所与の列内の全てのウェル（円及びダイヤモンドとして示される）に同じｉ７インデックスが付加され、所与の行内の全てのウェル（星及び六角形として示される）に同じｉ５インデックスが付加される組み合わせパターンを使用する。異なるｉ７インデックスは、異なる列のウェルに与えられ、異なるｉ５インデックスは、異なる行のウェルに与えられる。このようにして、異なるｉ５及びｉ７インデックスの一意の組み合わせが各ウェルに付加され、これらのインデックスは第１及び第２の識別子として機能する。ｉ５及びｉ７インデックスの組み合わせは、一意の第２の識別子を、各ウェルの第１の識別子タグ付き核酸と集合的に会合させる。図１Ｃの右下パネルは、左上のプレートに示されている左上のウェル内で発生すると予測される反応を示している。

【0086】

図１Ｄは、図１Ａ～図１Ｃに示されるプロトコルによって産生される細胞源識別可能な核酸を図示する。図１Ｄに示されるように、細胞源識別可能な核酸は、例えば、図１Ｃに示される９６ウェルプレートの左上のウェルから得られ、左から右に、Ｐ５ドメイン、左上ウェルに特異的なｉ５ドメイン、リードプライマー１ドメイン、第１のＰＣＲラウンドで増幅された遺伝子特異的プライマー、例えば、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子によって増幅された遺伝子の５’末端、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドによって提供される第１の識別子（すなわち、バーコード）、リードプライマー２ドメイン、左上ウェルに特異的なｉ７ドメイン、及びＰ７ドメインを含む。同じｉ５インデックス、ＴＳＯ第１の識別子及びｉ７インデックスの組み合わせを共有する全ての核酸は、同じ元の核から得られたものと決定することができる。図１Ｄに図示される細胞源識別可能な核酸は、次世代配列決定（ＮＧＳ）のための準備ができており、配列の取得後、例えば、コレクションの核酸の、第１の識別子、ｉ５及びｉ７インデックスによって示されるように、少なくとも第１及び第２の識別子に基づいて、同じ第１の識別子及びｉ５、ｉ７インデックスを共有するコレクションの細胞源識別可能な核酸に、細胞源、すなわち、起源となる核を割り当てることができる。

【0087】

反復
所望される場合、所与のワークフローは、少なくとも１つの更なる識別子を組み込む核酸を産生するための少なくとも１つの追加のプール／分割ステップを更に含み得る。例えば、第１の識別子タグ付き核酸の産生の後であるが、細胞源の溶解の前に、そこに存在する識別子タグ付き核酸を含む細胞源を、例えば、上記のように、プールし、サブ部分のセットに配分してもよい。識別子を、任意の適切な方法によって、各サブ部分の細胞源に存在する識別子タグ付き核酸と会合させ、それによって、別の識別子を識別子タグ付き核酸と会合させてもよい。最終の細胞源識別可能な核酸に所望の数の異なる識別子を提供するために、任意の数の追加のプール／分割ステップを用いてもよい。そのような実施形態の所与のワークフローにおける任意の溶解を、サブ部分の最終セットにおける細胞源に対して行う。この最後のステップにより、各インデックス付けラウンドにおいて付加された識別子のそれらの一意の組み合わせによって識別され得る細胞源識別可能な核酸の生成が完了する。

【0088】

更なる処理
第２のセットの異なるサブ部分における細胞源識別可能な核酸の産生に続いて、異なるサブ部分をプールして、例えば、更なる処理のために、第２のセットの２つ以上の（各々を含む）サブ部分からの異なる細胞源識別可能な核酸を単一の組成物に組み合わせてもよい。そのような実施形態において組み合わされる、又はプールされる異なるサブ部分の数は、いくつかの事例では、２～２５，０００又はそれ以上、例えば、９６～１０，０００（３８４～５，１８４を含む）の範囲で様々であり得る。

【0089】

例えば、説明されるように、調製された細胞源識別可能な核酸を、所望に応じて、例えば、特定のワークフローに応じて更に処理してもよい。例えば、細胞源識別可能な核酸は、配列決定用途、例えば、次世代配列決定用途のために調製してもよい。そのような事例において、組成物を構成する細胞源識別可能な核酸コレクションは、全てのドメイン、例えば、上記のようなアダプタが、すでに核酸に組み込まれているという点で、配列決定準備ができていてもよい。例えば、所与の配列決定用途で使用するために必要であり得る配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、細胞源識別可能な核酸の調製中に、例えば、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド、増幅プライマー、トランスポゾン核酸などの細胞源識別可能な核酸の調製に用いられる成分上にそのようなものを含めることによって、細胞源識別可能な核酸に組み込まれ得る。

【0090】

更に他の事例では、細胞源識別可能な核酸を、配列決定準備済ライブラリを生成するために更に処理してもよく、そのような事例では、任意の好都合なアプローチを用いてもよい。そのような実施形態では、そのような構築物のうちの１つ以上を、その調製後に、細胞源識別可能な核酸に組み込んでもよい。所望される場合、そのようなアダプタ構築物を、様々な手段によって、目的の核酸、例えば、細胞源識別可能な核酸に添加してもよい。例えば、アダプタ配列は、末端トランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼの作用を通じて添加され得る。アダプタ配列は、増幅反応中に核酸に組み込んでもよい。場合によっては、アダプタ配列は、核酸、例えば、細胞源識別可能な核酸に直接結合され得る。アダプタ配列を核酸に直接結合させる方法は様々であり、例えば、ライゲーション、化学合成／連結、酵素ヌクレオチド付加（例えば、末端トランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼによる）、タグメンテーションなどを含み得るが、これらに限定されない。

【0091】

いくつかの事例では、この方法は、配列決定プラットフォームアダプタ構築物、及び／又は任意の使用のための任意の配列を含むアダプタを、核酸の末端に結合させることを含み得る。例えば、いくつかの事例では、主題の方法で利用されるオリゴヌクレオチド及び／又はプライマーは、配列決定プラットフォームアダプタ構築物を含んでいなくてもよく、したがって、所望の配列決定プラットフォームアダプタ構築物は、目的の細胞源識別可能な核酸の産生後に結合されてもよい。目的の核酸又はその誘導体の末端に結合されたアダプタ構築物は、本明細書に記載される方法のオリゴヌクレオチド及び／又はプライマーの任意選択的な配列決定プラットフォームアダプタ構築物に関して上に記載される要素のうちのいずれかを含む、下流配列決定用途に有用な任意の配列要素を含み得る。例えば、目的の核酸又はその誘導体の末端に結合したアダプタ構築物は、表面結合配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチドに特異的に結合するドメイン、配列決定プライマー結合ドメイン、バーコードドメイン、バーコード配列決定プライマー結合ドメイン、分子識別ドメイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸ドメイン又はその相補体を含み得る。

【0092】

配列決定プラットフォームアダプタ構築物の結合は、任意の好適なアプローチを使用して達成され得る。特定の態様では、アダプタ構築物は、「シームレスな」クローニング戦略と同一又は類似のアプローチを使用して、生成物核酸又はその誘導体の末端に結合される。シームレスな戦略は、１ラウンド以上の制限酵素分析及び消化、ＤＮＡ末端修復、脱リン酸化、ライゲーション、酵素不活性化及びクリーンアップ、並びに対応する核酸材料の損失を排除する。目的のシームレスな結合戦略には、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手可能なＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングシステム、Ｌｉ＆Ｅｌｌｅｄｇｅ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５１－２５６に記載されているＳＬＩＣ（配列及びリガーゼ非依存性クローニング）、Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３４３－３４５に記載されているＧｉｂｓｏｎアセンブリ、Ｑｕａｎ＆Ｔｉａｎ（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（７）：ｅ６４４１に記載されているＣＰＥＣ（環状ポリメラーゼ伸長クローニング）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（８）：ｅ５５に記載されているＳＬｉＣＥ（シームレスライゲーションクローニング抽出物）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）シームレスクローニング技術が含まれる。

【0093】

任意の好適なアプローチは、目的の配列決定プラットフォームのための有用な又は必要な配列決定ドメインの全て未満を有する目的の核酸又はその誘導体に追加の核酸配列決定ドメインを提供するために用いられ得る。例えば、目的の核酸又はその誘導体は、それらの５’末端（例えば、目的の核酸又はその誘導体に相補的なプライマーの領域の５’）にアダプタ配列を有するＰＣＲプライマーを使用して増幅され得、その結果、アンプリコンは、任意の所望の構成で、元の核酸中のアダプタ配列だけでなく、プライマー中のアダプタ配列も含む。シームレスなクローニング戦略、制限消化／ライゲーション、タグメンテーションなどに基づくものを含む、他のアプローチが使用され得る。次世代配列決定ライブラリに核酸ドメインを加えるための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、限定されないが、米国特許第１１，１２４，８２８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0094】

例えば、上記のように、処方されたライブラリ調製及び／又は増幅ステップの後に、調製されたライブラリは、配列決定の準備ができているとみなされ得る。特定の実施形態では、提供される方法は、調製されたライブラリをＮＧＳプロトコルに供することを更に含み得る。プロトコルは、任意の好適なＮＧＳ配列決定プラットフォーム上で実施してもよい。目的のＮＧＳ配列決定プラットフォームとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及び／若しくはＮｅｘｔＳｅｑ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及び／若しくはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及び／若しくはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）、又は目的の任意の他の配列決定プラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。ＮＧＳプロトコルは、用いられる特定のＮＧＳ配列決定システムに応じて様々であろう。例えば、更なる増幅（例えば、固相増幅）、アンプリコンの配列決定、及び配列決定データの分析を含み得る、ＮＧＳライブラリを配列決定するための詳細なプロトコルは、用いられるＮＧＳ配列決定システムの製造元から入手可能である。

【0095】

他の変形例としては、例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及びＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ＧＳ ＦＬＸ＋及びＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）、又は目的の任意の他の配列決定プラットフォームからの配列決定システムによって必要とされる配列決定ドメインでＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）特異的配列決定ドメインを置き換えることが挙げられる。

【0096】

細胞源
上述のように、本発明の実施形態に従って、細胞源識別可能な核酸が産生される初期の細胞源は、様々であり得る。細胞源が得られ得る細胞試料は、限定されないが、例えば、細胞組織、生検、血液試料、細胞培養物などを含む様々な源に由来し得る。更に、細胞試料は、特定の臓器、組織、胚、胚盤胞、腫瘍、新生物などに由来し得る。限定されないが、本発明の任意の実施形態で分析することができる細胞試料の数は、研究者の希望に基づいて変えることができる。複数の細胞試料を使用する場合、各々の独立した試料は、初期の細胞源の初期のサブ部分として扱われる。更に、任意の集団からの細胞は、細菌又は酵母を含む原核生物又は真核生物の集団などの、主題の方法で使用される細胞源の供給源であり得る。いくつかの事例では、主題の方法で利用される細胞源は、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）細胞試料、非ヒト霊長類細胞試料、ヒト細胞試料などの哺乳動物細胞試料であり得る。いくつかの事例では、哺乳動物細胞試料は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）血液試料、非ヒト霊長類血液試料、ヒト血液試料などを含むが、これらに限定されない、哺乳動物血液試料であってもよい。

【0097】

いくつかの事例では、主題の方法で利用される細胞源は、リンパ球源、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞などを含むがこれらに限定されない免疫細胞源であり得る。対象の免疫細胞はまた、例えば、末梢血単核細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球などを含み得る。

【0098】

いくつかの事例では、主題の方法で利用される細胞源は、植物に由来してもよく、単子葉植物又は双子葉植物、例えば、以下を含むが、これらに限定されない：研究植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、並びに果物（例えば、リンゴ、アプリコット、アボカド、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カンタロープ、ココナッツ、クランベリー、ナツメヤシ、イチジク、メロン、グレープフルーツ、ブドウ、グアバ、ハニーデュー（ｈｏｎｅｙｄｅｗ）、キウイフルーツ、レモン、ライム、マンゴー、ネクタリン、オリーブ、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、セイヨウナシ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、プルーン、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、スイカ、など）、穀物（例えば、大麦、豆、キャノーラ、トウモロコシ、綿、亜麻仁、干し草、オート麦、ピーナッツ、米、ソルガム、大豆、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、タバコ、小麦、など）、野菜（例えば、アーティチョーク、アスパラガス、豆、ビート、パクチョイ、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン（ｃｏｌｌａｒｄ ｇｒｅｅｎ）、スイートトウモロコシ（ｃｏｒｎ－ｓｗｅｅｔ）、キュウリ、ナス、エンダイブ、グリーン、ケールグリーン、レタス、パセリ、パースニップ、エンドウ豆、ペッパー、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラディッシュ、ルバーブ、ルタバガ、ほうれん草、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、サツマイモ、トマティーヨ、トマト、カブ、ヒシの実など）などの農業植物。

【0099】

本明細書に記載のそれに関連する方法で使用するための単一細胞の細胞源は、任意の好都合な方法によって得られ得る。例えば、いくつかの事例では、単一細胞は、細胞試料の希釈を制限することによって得られ得る。いくつかの事例では、本方法は、単一細胞を得るステップを含んでもよい。単一細胞懸濁液は、例えば、トリプシン又はパパインを酵素的に使用して組織試料中の細胞を接続するタンパク質を消化するか、又は培養物中の接着細胞を放出するか、又は試料中の細胞を機械的に分離することを含む、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して得ることができる。

【0100】

いくつかの事例では、単一細胞は、細胞選別機器具を使用して細胞試料を選別することによって得られ得る。本明細書で使用される場合、「細胞選別機」とは、本明細書に記載されるようなライブラリ調製のプロセスなど、下流プロセスに適切な容器への個々の細胞の選別を可能にする任意の器具を意味する。有用な細胞選別機には、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で利用される器具などのフローサイトメーターが含まれる。フローサイトメトリーは、異なる粒子（例えば、細胞）タイプ、すなわち、流体媒体中のラベル（波長、強度）、サイズなどの別の用語から変化する粒子を識別及び区別するためのマルチパラメータデータを使用する周知の方法論である。試料のフローサイトメトリー分析では、最初に、試料のアリコートをフローサイトメーターのフロー経路に導入する。フロー経路内で、試料中の細胞は、１つ以上の検知領域を実質的に一度に１つずつ通過し、細胞の各々は、単一の波長（又はいくつかの事例では、２つ以上の異なる光源）で光源に別々に個々に曝露され、必要に応じて、散乱及び／又は蛍光パラメータの測定値が、細胞ごとに別々に記録される。各細胞について記録されたデータは、リアルタイムで分析されるか、又は必要に応じて後の分析のために、コンピュータなどのデータ記憶及び分析手段に記憶される。フローサイトメーターを使用して選別された細胞は、共通の容器（すなわち、単一のチューブ）に選別され得るか、又は個々の容器に別々に選別され得る。例えば、いくつかの事例では、細胞は、以下に記載されるように、マルチウェルプレートの個々のウェルに選別され得る。

【0101】

用途
例えば、上述のように、本発明による細胞源核酸を調製する方法を用いて、様々な異なる目的のために配列準備済ライブラリを調製してもよい。特定の実施形態では、主題の方法を使用して、目的の配列決定プラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｒｏｃｈｅなどによって提供される配列決定プラットフォーム）上での下流配列決定のためのｍＲＮＡに対応する発現ライブラリを生成してもよい。

【0102】

調製されたライブラリは、様々な下流分析に利用され得、いくつかの事例では、ライブラリの調製は、所望のタイプの下流分析のために特異的に再構成され得る。例えば、いくつかの事例では、調製されたライブラリを、ｍＲＮＡ、並びにノンコーディングＲＮＡ（例えば、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、非ポリアデニル化ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡ）などの非ｍＲＮＡ ＲＮＡ種の分析を含む、全トランスクリプトーム分析（ＷＴＡ）に供してもよい。したがって、いくつかの事例では、ライブラリ調製は、例えば、ポリ（Ａ）テールへのハイブリダイゼーションに依存しないプライマー（例えば、ランダムプライマー）を利用することによって、又は例えば、生成物の二本鎖ｃＤＮＡの産生前に天然にポリアデニル化されていないＲＮＡ種にポリ（Ａ）テールを付加することによって、トランスクリプトーム内の非ｍＲＮＡ ＲＮＡの分析を可能にするように特異的に構成され得る。

【0103】

いくつかの事例では、ライブラリ、例えば、ＷＴＡ用ライブラリの調製は、試料及び／又はライブラリ内のリボソームＲＮＡの量を減少させるステップを含み得る。これは、本発明の任意のインデックス付けステップの前に、例えば、ＲｉｂｏＧｏｎｅ（商標）製品（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、又はインデックス付き断片の生成後（例えば、米国特許第１０，１５０，９８５号に記載されるようなＺａｐＲ技術など）、例えば、配列決定前の全てのインデックス付けステップの終わりを含む任意のインデックス付けステップの後に行ってもよい。不要なリボソームＲＮＡを低減及び／又は除去する任意の好都合な方法は、例えば、親和性精製、汚染核酸の分解（例えば、ＲｉｂｏＧｏｎｅ（商標）製品（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、並びに米国特許第９，４２８，７９４号及び同第１０，１５０，９８５号（その開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているそれらの方法を使用することを含む）、選択的除去のために用いられてもよい。

【0104】

特定の実施形態では、調製されたライブラリは、例えば、１つ以上の遺伝子の相対的発現（すなわち、上方又は下方調節）が決定される場合を含む、差次的発現分析で利用されてもよい。差次的発現は、定性的又は定量的に決定され得、そのような分析は、トランスクリプトームワイドであり得るか、又は標的化され得る。したがって、対象差次的発現分析において評価される発現転写産物の数は様々であろう。本明細書で使用される差次的発現分析は、対象ゲノムで分析される発現された転写産物の数に関して限定されない。いくつかの実施形態では、差次的発現分析により、分析のために特異的に標的化されるマーカー遺伝子のパネルなどの限られた数の転写産物を評価してもよい。あるいは、細胞の転写分全体を、差次的発現について評価してもよい。

【0105】

標的化発現分析が限定され得る転写産物カテゴリーには、様々であり、例えば、サイトカイン、ケモカイン、又は免疫細胞サブセットの細胞表面マーカー、キナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、創薬可能な遺伝子などの免疫遺伝子転写産物が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫遺伝子の有用なカテゴリー及びサブカテゴリーには、概して、免疫系の機能及び病原体に対する防御の成功に関与する遺伝子群が含まれ、これらとしては、限定されないが、免疫系プロセスに関連する遺伝子（例えば、遺伝子オントロジー（ＧＯ）受託番号ＧＯ：０００２３７６（ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ（．）ｏｒｇでオンラインで入手可能）によって識別される遺伝子）が含まれ、これらには、例えば、Ｂ細胞媒介免疫、Ｂ細胞選択、Ｔ細胞媒介免疫、Ｔ細胞選択、免疫応答の活性化、抗原プロセシング及び提示、粘膜関連リンパ組織における抗原サンプリング、好塩基球媒介免疫、好酸球媒介免疫、血球分化、血球増殖、免疫エフェクタープロセス、免疫応答、免疫系発達、免疫記憶プロセス、白血球活性化、白血球恒常性、白血球媒介免疫、白血球移動、リンパ球共刺激、リンパ球媒介免疫、肥満細胞媒介免疫、骨髄細胞恒常性、骨髄性白血球媒介免疫、ナチュラルキラー細胞媒介免疫、免疫系プロセスの陰性調節、好中球媒介免疫、免疫系プロセスの陽性調節、免疫応答の分子媒介物質の産生、免疫調節免疫系プロセス、免疫受容体の体細胞多様化、寛容誘導などが含まれるが、これらに限定されない。目的の特定の遺伝子としては、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン受容体、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＰＤ－１などが含まれるが、これらに限定されない。

【0106】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＲＮＡ試料から免疫細胞受容体レパートリーライブラリを調製することを含む。主題の方法の態様は、ＲＮＡ試料から生成された生成物二本鎖ｃＤＮＡから免疫細胞特異的ｃＤＮＡを増幅して、免疫細胞受容体レパートリーライブラリを産生することを含む。「免疫細胞受容体レパートリーライブラリ」とは、一般に、細胞又は細胞集団の１つ以上のタイプの免疫受容体の全長又は部分的な配列を含む核酸ライブラリを意味する。例えば、免疫細胞受容体レパートリーライブラリは、単一細胞について、あるいは、単一の細胞試料若しくは単一の対象に由来する細胞集団、又は細胞試料集団（例えば、２以上の対象からの試料集団を含む）について生成され得る。いくつかの事例では、主題のライブラリは、識別核酸配列の付加後に、プールされ得る個々の単一細胞から生成され得る。

【0107】

上述のように、免疫細胞受容体レパートリーライブラリのメンバーは、長さが様々であり得、全長であってもよく、又は全長未満であってもよい。いくつかの事例では、ライブラリのメンバーは、免疫細胞受容体の５’末端を優先的に含む。目的の免疫細胞受容体としては、限定されないが、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が挙げられる。

【0108】

いくつかの事例では、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリは、ＴＣＲレパートリーライブラリを含んでもよい。ＴＣＲ複合体は、ジスルフィド結合膜アンカーヘテロ二量体タンパク質であり、通常はＴ細胞の表面上で発現され、ＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高可変アルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。多くの天然ＴＣＲは、ヘテロ二量体αβ又はγδ形態で存在する。ヘテロ二量体αβ形態の完全な内因性ＴＣＲ複合体は、８つの鎖、すなわち、アルファ鎖（本明細書ではＴＣＲα又はＴＣＲアルファと称される）、ベータ鎖（本明細書ではＴＣＲβ又はＴＣＲベータと称される）、デルタ鎖、ガンマ鎖、２つのエプシロン鎖、及び２つのゼータ鎖を含む。アルファ及びベータＴＣＲ鎖は、可変（Ｖ）領域及び定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲ多様性は、遺伝子組換え（アルファ鎖のＶＪ組換え及びベータ鎖のＶＤＪ組換え）から生成され、抗原（すなわち、ペプチド／ＭＨＣ）認識にとって重要な交差領域をもたらす。

【0109】

いくつかの事例では、ＴＣＲレパートリーライブラリは、ＴＣＲ－α鎖配列、ＴＣＲ－β鎖配列、又はＴＣＲ－α鎖配列及びＴＣＲ－β鎖配列の両方を含み得る。主題のＴＣＲレパートリーライブラリのＴＣＲ鎖配列は、全長ＴＣＲ鎖配列（例えば、全長ＴＣＲアルファ鎖配列、全長ＴＣＲベータ鎖配列）又は部分ＴＣＲ鎖配列（例えば、部分長ＴＣＲアルファ鎖配列、部分長ＴＣＲベータ鎖配列）を含み得る。

【0110】

主題のＴＣＲレパートリーライブラリメンバーが部分ＴＣＲ鎖配列を含む場合、部分ＴＣＲ鎖配列は、ＴＣＲ鎖可変領域全体又は本質的にＴＣＲ鎖可変領域全体（例えば、ＴＣＲアルファ鎖可変領域、ＴＣＲベータ鎖可変領域）を含み得る。いくつかの事例では、得られるライブラリメンバーは、ＴＣＲ可変領域及びＴＣＲ定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの事例では、得られたライブラリメンバーは、ＴＣＲアルファ及び／又はベータ鎖５’ｍＲＮＡ末端に対応する配列を含む。いくつかの事例では、得られるライブラリメンバーは、ＴＣＲアルファ又はベータ鎖５’末端から対応する鎖定常領域の少なくとも一部分までの配列を含む。

【0111】

特定の実施形態では、免疫細胞特異的ライブラリの調製は、ＴＣＲ特異的増幅を含んでもよい。そのようなＴＣＲ特異的増幅は、ＴＣＲ特異的プライマーを利用してもよい。「ＴＣＲ特異的プライマー」とは、ＴＣＲ鎖（例えば、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖）核酸配列の領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味する。いくつかの事例では、ＴＣＲ特異的プライマーは、１つのタイプのＴＣＲ鎖のみ、例えば、ＴＣＲアルファ鎖のみ又はＴＣＲベータ鎖のみにハイブリダイゼーションしてもよい。場合によっては、ＴＣＲ特異的プライマーは、２つ以上のタイプのＴＣＲ鎖にハイブリダイズするように構成されてもよく、例えば、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の両方にハイブリダイズするように構成されてもよい。

【0112】

ＴＣＲ特異的プライマーは、ＴＣＲアルファ鎖定常領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。例えば、いくつかの事例では、ＴＣＲ特異的プライマーは、例えば、ヒトＴＣＲアルファ鎖定常領域、マウスＴＣＲアルファ鎖定常領域、アカゲザル、ハムスター、ラクダなどを含む、哺乳動物ＴＣＲアルファ鎖定常領域又はその相補体にハイブリダイズし得る。

【0113】

例示的なヒトＴＣＲアルファ鎖定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号０７）。
これは、以下の核酸配列によってコードされる：
ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＡ（配列番号０８；Ｔ細胞受容体アルファ鎖Ｃ領域、ヒト；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４７８３４．１、ＡＡＯ７２２５８．１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８４８）。

【0114】

例示的なマウスＴＣＲアルファ鎖定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＰＹＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＴＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号０９；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８４９）、又は
ＰＮＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＴＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３２２６．１）
これらは、それぞれ以下の核酸配列によってコードされる：
ＣＣＡＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号１１）、
及び
ＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０７６６２．１）。

【0115】

ＴＣＲ特異的プライマーは、ＴＣＲベータ鎖（例えば、ＴＣＲベータ１鎖定常領域又はＴＣＲベータ２鎖定常領域）定常領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。例えば、いくつかの事例では、ＴＣＲ特異的プライマーは、例えば、ヒトＴＣＲベータ鎖定常領域、マウスＴＣＲベータ鎖定常領域、アカゲザル、ハムスター、ラクダなどを含む、哺乳動物ＴＣＲベータ鎖定常領域又はその相補体にハイブリダイズし得る。

【0116】

例示的なヒトＴＣＲベータ鎖１定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ（配列番号１３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５０；ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ２５１３４．１）
これは、以下の核酸配列によってコードされる：
ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ１０１７７８．１、Ｘ００４３７．１）。

【0117】

例示的なヒトＴＣＲベータ鎖２定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ（配列番号１５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ５Ｂ９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０６６２．１）
これは、以下の核酸配列によってコードされる：
ＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧ（配列番号１６；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ３４７４０．１）。

【0118】

例示的なマウスＴＣＲベータ鎖１定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ（配列番号１７；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５２）
これは、以下の核酸配列によってコードされる：
ＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡ（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ１８８４０８．１）。

【0119】

例示的なマウスＴＣＲベータ鎖２定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＨＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＧＬＶＬＭＡＭＶＫＫＫＮＳ（配列番号１９、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５１）
これは、以下の核酸配列によってコードされる：
ＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＡＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡ（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ４６８４１．１）。

【0120】

いくつかの事例では、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリは、ＢＣＲレパートリーライブラリを含んでもよい。ＢＣＲ複合体は、Ｂ細胞の表面上に見出され、膜結合免疫グロブリン（すなわち、抗体）結合部分を含み、重鎖及び軽鎖を含み、その各々が定数（Ｃ）及び可変（Ｖ）領域を含有する。ＢＣＲの免疫グロブリン鎖は、ジスルフィド架橋によって、シグナル伝達ＣＤ７９Ａ／Ｂ鎖に結合される。ＢＣＲのイムノグロブリン鎖は、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥを含む様々なアイソタイプであってもよい。ＴＣＲと同様に、ＢＣＲの免疫グロブリン部分は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを受けて、集団内に膨大な多様性を生成する。

【0121】

いくつかの事例では、免疫細胞受容体レパートリーライブラリは、ＢＣＲレパートリーライブラリを含み得、例えば、ＢＣＲレパートリーライブラリは、ＢＣＲ免疫グロブリン鎖配列（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥ鎖配列を含む）を含み得る。主題のＢＣＲレパートリーライブラリの免疫グロブリン鎖配列は、全長免疫グロブリン鎖配列（例えば、全長重鎖配列、全長軽鎖配列）又は部分免疫グロブリン配列（例えば、部分重鎖配列、部分軽鎖配列）を含み得る。

【0122】

主題のＢＣＲレパートリーライブラリメンバーが部分免疫グロブリン鎖配列を含む場合、部分免疫グロブリン鎖配列は、免疫グロブリン可変領域全体又は本質的に免疫グロブリン可変領域全体（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変領域、免疫グロブリン重鎖可変領域）を含み得る。いくつかの事例では、得られるライブラリメンバーは、免疫グロブリン可変領域及び免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの事例では、得られるライブラリメンバーは、免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖５’ｍＲＮＡ末端に対応する配列を含む。いくつかの事例では、得られるライブラリメンバーは、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖５’末端から、対応する免疫グロブリン鎖定常領域の少なくとも一部分までの配列を含む。

【0123】

特定の実施形態では、免疫細胞特異的ライブラリの調製は、ＢＣＲ特異的増幅（例えば、免疫グロブリン鎖特異的増幅を含む）を含み得る。そのような免疫グロブリン特異的増幅は、免疫グロブリン特異的プライマーを使用し得る。「免疫グロブリン特異的プライマー」とは、免疫グロブリン鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖）核酸配列の領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味する。いくつかの事例では、免疫グロブリン特異的プライマーは、１つのタイプの免疫グロブリン鎖のみ、例えば、免疫グロブリン重鎖のみ、免疫グロブリン軽鎖のみ、ＩｇＤ鎖のみ、ＩｇＭ鎖のみ、ＩｇＡ鎖のみ、ＩｇＧ鎖のみ、ＩｇＥ鎖のみなどにハイブリダイズし得る。

【0124】

免疫グロブリン特異的プライマーは、免疫グロブリン重鎖定常領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。例えば、いくつかの事例では、免疫グロブリン特異的プライマーは、例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域などを含む、哺乳動物免疫グロブリン重鎖定常領域又はその相補体にハイブリダイズし得る。

【0125】

免疫グロブリン特異的プライマーは、免疫グロブリン軽鎖定常領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。例えば、いくつかの事例では、免疫グロブリン特異的プライマーは、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域、アカゲザル、ハムスター、ラクダなどを含む、哺乳動物免疫グロブリン軽鎖定常領域又はその相補体にハイブリダイズし得る。

【0126】

例えば、免疫受容体特異的増幅を含む、ライブラリ調製中に実行される増幅は、単一の増幅ラウンドで実行することができ、又は複数の増幅ラウンドを用いてもよい。例えば、いくつかの事例では、第１の増幅ラウンドの後、第１のラウンドで利用されない１つ以上の増幅プライマーを反応混合物に添加して、第１の増幅ラウンドの生成物を核酸鋳型として使用する第２の増幅ラウンドを促進し得る。いくつかの事例では、第２の又は後続の増幅ラウンドは、ネスト化された増幅、すなわち、第２の又は後続の増幅ラウンドで利用されるプライマー結合部位が、第１の増幅ラウンドで生成される生成物の範囲内（すなわち、３’又は５’末端からの１つ以上のヌクレオチド）にある場合を含み得る。使用される場合、ネスト化の程度は、所望に応じて様々であり、例えば、第２の又は後続のプライマー結合部位が、第１の増幅ラウンドで生成されたアンプリコンの３’又は５’末端からの、１個以上（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上などを含む）ヌクレオチドである場合を含む。

【0127】

いくつかの事例では、第２の又は後続のラウンド増幅はネスト化されず、例えば、第２の増幅ラウンドが、以前の増幅ラウンドで利用された１つ以上のプライマー結合部位、又は以前の増幅ラウンド中に加えられたプライマー結合部位（例えば、非鋳型化配列の一部として添加されたプライマー結合部位）を利用する場合を含む。いくつかの事例では、第２の又は後続の増幅ラウンドは、一方の末端にあるネスト化されたプライマー増幅部位、他方の末端にあるネスト化されていない（例えば、以前に使用されたプライマー結合部位又は追加されたプライマー結合部位）プライマー増幅部位を利用し得、ネスト化された部位が、アンプリコンの３’末端又はアンプリコンの５’末端にある場合を含む。

【0128】

キット、組成物及びデバイス
本開示の態様は、組成物及びキット、並びにそれらとともに、又はそれらの中で使用するためのデバイスも含む。

【0129】

最も一般的には、「キット」という用語は、プロセス、方法、アッセイ、分析、試料の操作などの実行を容易にする物品の任意の組立体を説明するために使用される。キットは、キットの使用方法を説明する説明書（例えば、本発明の方法を説明する説明書）、方法に必要な化学試薬又は酵素、プライマー、プローブ、緩衝液、任意のタイプの容器（例えば、試料収集又は試料操作のための容器）又は反応容器、又は任意の他の成分を含有することができる。キットは、本発明の方法を実行するために必要な全ての成分を含有する必要はない。本発明の組成物及びキットは、例えば、主題の方法に関して上述した反応成分のうちのいずれかの１つ以上を含み得る。

【0130】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、共通の第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを各々が含む複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物であって、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子が異なる、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物と、例えば、サブドメインとして提供され得る複数の別個の第２の識別子核酸と、を含み得る。そのような事例では、所与の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物は、同一又は共通鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの多くのコピー、又は同一又は共通の第１の識別子配列を共有するが、ＵＭＩドメインに関して各々異なる様々な鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの集団から作製され得る。必要に応じて、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、異なる容器内、例えば、マイクロウェルプレートの異なるマイクロウェルを含む、マルチプレートの異なるウェル内に存在し得る。鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物と同様に、異なる第２の識別子核酸は、別個の容器、例えば、マイクロウェルプレートの異なるマイクロウェルを含むマルチプレートの異なるウェルに存在してもよく、別個の容器は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物を保持する容器とは異なる。

【0131】

キットは、例えば、上記のように、本発明の実施形態で用いられる１つ以上の追加の試薬を更に含んでもよく、そのような試薬は、１つ以上のポリメラーゼ（例えば、鋳型スイッチングポリメラーゼ、逆転写酵素、増幅ポリメラーゼなど）、リガーゼ、トランスポザーゼ、プライマー、緩衝液、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰなど、又はそれらのうちの任意の１つ若しくはそれらの任意の組み合わせを含む）などを含んでもよいが、これらに限定されない。主題のキットは、例えば、対照核酸（例えば、対照核酸鋳型）などを含む１つ以上の試験試薬を含んでもよく、又は組成物及びデバイスは、これらを備えてもよい。いくつかの事例では、試薬は、凍結乾燥酵素（例えば、凍結乾燥逆転写酵素、凍結乾燥ＤＮＡポリメラーゼ）などの凍結乾燥形態で提供され得る。

【0132】

いくつかの事例では、本発明の組成物及び／又はキットの成分は、「カクテル」として提示されてもよく、本明細書で使用される場合、カクテルは、単一の容器内の２つ以上の異なるが同様の成分のコレクション又は組み合わせを指す。必要に応じて、キットの成分は、別個の容器内に存在してもよく、又は複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。主題の組成物は、任意の好適な環境に存在してもよい。一実施形態によれば、組成物は、反応チューブ（例えば、０．２ｍＬチューブ、０．６ｍＬチューブ、１．５ｍＬチューブなど）、又はウェル若しくはマイクロ流体チャンバ若しくは液滴、又は他の好適な容器内に存在する。特定の態様では、組成物は、２つ以上（例えば、複数の）反応チューブ又はウェル（例えば、プレート、例えば、９６ウェルプレート、マルチウェルプレート、例えば、約１０００、５０００、又は１０，０００以上のウェルを含有する）に存在する。チューブ及び／又はプレートは、例えば、ポリプロピレンなどの任意の好適な材料、ＰＤＭＳ、又はアルミニウムで作製されてもよい。容器は、核酸の容器の壁への吸着を低減するように処置されてもよい。特定の態様では、組成物が存在するチューブ及び／又はプレートは、組成物への効率的な熱伝達を提供する（例えば、ヒートブロック、水浴、サーモサイクラーなどに配置された場合）ため、組成物の温度は、例えば、特定の酵素反応が生じるために必要に応じて、短期間内に変更してもよい。特定の実施形態によれば、組成物は、薄壁のポリプロピレンチューブ、又は薄壁のポリプロピレンウェルを有するプレート、又は高い熱伝導率を有するアルミニウムなどの材料に存在する。

【0133】

いくつかの事例では、個々の容器（例えば、別個のチューブ）のコレクション又は複数の容器、例えば、マルチウェルデバイスを含有するコレクションは、液体又は乾燥形態で提供され得る試薬を含み得る。

【0134】

任意の好適な反応容器を、主題のキット若しくはデバイスに用いることができ、かつ／又は主題の組成物を含有することができる。有用な反応容器としては、例えば、チューブ（例えば、単一のチューブ、マルチチューブストリップなど）、ウェル（例えば、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は２０００、４０００、６０００、又は１００００以上のような任意の数のウェルを有するプレート）が挙げられるが、これらに限定されない。マルチウェルプレートは、例えば、以下でより詳細に説明するように、独立していてもよく、チップ及び／又はデバイスの一部であってもよい。したがって、特定の実施形態では、用いられる反応容器は、マルチウェルデバイスの１つ以上のウェルである。本開示は、用いられるマルチウェルデバイス（例えば、プレート又はチップ）のタイプによって限定されない。一般に、そのようなデバイスは、液体（例えば、重力だけでは液体をウェルから流出させることができないように、ウェル内に閉じ込められた液体）を含有する、又は含有するように寸法決めされた複数のウェルを有する。１つの例示的なチップは、５１８４ウェルＳＭＡＲＴＣＨＩＰ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）である。他の例示的なチップは、米国特許第８，２５２，５８１号、同第７，８３３，７０９号、及び同第７，５４７，５５６号に提供され、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、例えば、チップ、ウェル、熱循環条件、及びその中で使用される関連する試薬の教示を含む）。他の例示的なチップとしては、ＱＵＡＮＴＳＴＵＤＩＯ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって販売される）において使用されるＯＰＥＮＡＲＲＡＹ（商標）プレートが挙げられる。別の例示的なマルチウェルデバイスは、９６ウェル又は３８４ウェルプレートである。

【0135】

上記の構成要素に加えて、対象のキットは、例えば、上記のような対象方法を実践するために、キットの構成要素を使用するための説明書を更に含んでもよい。説明書は、一般に、好適な記録媒体に記録される。説明書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷され得る。したがって、説明書は、添付文書としてキットに存在してもよく、キット又はその構成要素の容器のラベル（すなわち、包装又はサブ包装に関連付けられた）に存在してもよい。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ポータブルフラッシュドライブ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）などに存在する電子記憶データファイルとして存在する。更に他の実施形態では、実際の説明書は、キットには存在しないが、例えば、インターネットを介して、遠隔ソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を閲覧することができる、及び／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、これは、説明書を得るための手段が好適な基材上に記録されることを意味する。

【0136】

以下の実施例は、例示として提供され、限定として提供されるものではない。

【実施例】

【0137】

実施例１ 複数の細胞又は核の各々における１つ以上の遺伝子の発現の分析
この実施例は、図２及び３に広く示されている。細胞又は核を、適切な溶液（例えば、ＮＰ４０又はジギトニンを有する１％又は４％のパラホルムアルデヒド）中で固定及び透過処理する。固定細胞又は核を、マルチウェルデバイスのウェル（例えば、９６ウェル又は３８４ウェルプレート）に等分する。あるいは、ウェルは、物理的なウェルである必要はなく、液滴で構成されてもよく、細胞又は核を異なる液滴に配分する。ウェル又は容器当たりの細胞又は核の数は、研究者が実行したい実験の規模に応じて適宜変動し得る。例えば、プレートの９６又は３８４ウェルの各々について、ウェル当たり１００個又は１，０００個の細胞を分析することができる。逆転写酵素、オリゴｄＴ、第１の細胞特異的バーコード（すなわち、ウェル特異的な第１の識別子又は第１のインデックス）と、ＰＣＲ用アダプタハンドル（すなわち、プライマー結合部位）と、を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）、ｄＮＴＰ、及び緩衝塩を含む逆転写混合物をウェルの各々に添加し、ＲＴ反応を進行させる（例えば、３７～５０℃、例えば、４２℃などの任意の適切な温度で、反応を完了するのに十分な時間、例えば、６０～９０分以上）。これは、図２のステップＡに示される。反応を停止し、細胞又は核をウェルの各々から収集し、一緒にプールし、次いで、第２のマルチウェルデバイスのウェルに再分配する。あるいは、細胞又は核は、別の液滴セットに再分配され得る。任意選択的に、溶解緩衝液をウェルの各々に添加して、細胞又は核の各々から核酸を放出する。任意選択的に、核酸は、各ウェルにおいて独立して精製される。次いで、ＰＣＲを実行するのに有効な試薬をウェルに添加する。これらは、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、及び２つ以上のＰＣＲプライマーを含み得る。第１のプライマーは、図２のステップＢに示されるように、逆転写酵素ステップで使用されるＴＳＯに存在するアダプタハンドル（プライマー結合部位）配列、及び遺伝子特異的配列（例えば、ＴＣＲ定常領域遺伝子配列）、ポリＡ配列、アダプタハンドル、又はランダム配列のいずれかに相補的な領域を３’末端に有する１つ以上の第２のプライマーに特異的である。一実施形態では、２つ以上のＰＣＲプライマーの各々は、組み合わせたときに、第２の細胞特異的バーコード配列（すなわち、第２の識別子タグ）を提供するバーコード配列（図２においてＢＣ２Ａ及びＢＣ２Ｂとして示される）を更に含有する。代替的な実施形態では、ＢＣ２Ａ又はＢＣ２Ｂは、第２の細胞特異的バーコード配列（すなわち、第２の識別子タグ）として単独で使用することができる。任意選択的に、ＰＣＲプライマーはまた、次世代配列決定のための追加の配列も含み得る。例えば、リードプライマー配列、ｐ５、ｐ７配列などの配列決定プラットフォームアダプタ構築物である。あるいは、これらの配列決定プラットフォームアダプタ構築物配列は、第２のＰＣＲラウンドにおいて付加することができる。第２のＰＣＲラウンドを伴うこの代替実施形態を図３に示し、第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）を追加のステップＣとして示す。このステップＣでは、ネスト化された３’プライマーを、ステップＢからの二次プライマー結合部位に対して内部的に使用する。このネスト化されたプライマーは、三次プライミング部位（ステップＢの二次プライミング部位への５’）に相補的な配列、任意選択的な二次タグ配列（第２のサブ識別子、ＢＣ２Ｂ）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ｐ７配列を含む。

【0138】

図２及び３に示されるように、第２の識別子タグは、２つの部分（ＢＣ２Ａ及びＢＣ２Ｂ）として付加される。図２に示される実施形態では、ＢＣ２Ａ及びＢＣ２Ｂの両方が、ＰＣＲ１の一部として付加される（図２のステップＢ）。図３に示す実施形態では、図３のステップＢでＢＣ２Ａを付加し、ステップＣと同様にＢＣ２Ｂを付加する。

【0139】

次いで、得られた配列決定生成物を、次世代配列決定プラットフォームを使用して配列決定して、遺伝子配列情報及びバーコード情報（第１の（ＴＳＯ）バーコード（すなわち、第１の識別子）及び第２の（組み合わされたＰＣＲバーコード；第２の識別子）の組み合わせ）を取得し、各個々の細胞又は核に遺伝子特異的な配列を追跡することができる一意の細胞特異的バーコードを提供する。したがって、元のコレクションの細胞又は核の各々で検出された遺伝子又は遺伝子の発現が決定される。

【0140】

実施例２ 本発明の実施形態
この実施例は、第２のマルチウェルデバイスへの細胞又は核の再分配まで、実施例１と同一の初期ステップに従う。この実施例は、図７に広く示されている。

【0141】

分析される細胞又は核を、適切な溶液（例えば、ＮＰ４０又はジギトニンを有する１％又は４％のパラホルムアルデヒド）中で固定及び透過処理する。固定細胞又は核を、マルチウェルデバイスのウェル（例えば、９６ウェル又は３８４ウェルプレート）に等分する。あるいは、物理的なウェルの代わりに、細胞又は核を、当該技術分野で既知であるように、複数の液滴に配分することができる。

【0142】

ウェル又は容器当たりの細胞又は核の数は、研究者が実行したい実験の規模に応じて適宜変動し得る。例えば、プレートの９６又は３８４ウェルのウェルの各々について、ウェル当たり１００個又は１，０００個の細胞を使用することができる。逆転写酵素、オリゴｄＴ、第１の細胞特異的バーコード（すなわち、ウェル特異的な第１の識別子タグ）と、ＰＣＲ用アダプタハンドル（すなわち、プライマー結合部位）と、を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）、ｄＮＴＰ、及び緩衝塩を含む逆転写混合物をウェルの各々に添加し、ＲＴ反応を進行させる（例えば、３７～５０℃、例えば、４２℃などの任意の適切な温度で、反応を完了するのに十分な時間、例えば、６０～９０分以上）。反応を停止し、細胞又は核をウェルの各々から収集し、一緒にプールし、次いで、第２のマルチウェルデバイスのウェルに再分配する。あるいは、細胞又は核は、別の液滴セットに再分配されてもよい。

【0143】

第２の鎖合成及び／又は等温増幅は、再分配された細胞又は核上で実行される。この段階では、再分配された材料は、依然として、第２のマルチウェルデバイスの個々のウェル内に、無傷の細胞又は無傷の核として残っている。第２の鎖合成は、反応緩衝液、ｄＮＴＰ、第２の鎖プライマー、例えば、第２のウェル特異的バーコード（すなわち、第２の識別子タグ）及び第２のプライマー結合部位を含むプライマー、並びにポリメラーゼのうちの１つ以上をウェルに添加することによって開始される。第２の鎖合成を実行し、第２のバーコード５’をＴＳＯバーコード（すなわち、ウェル特異的な第１の識別子タグ）に付加する。任意選択的に、等温増幅は、標的特異的配列、オリゴｄＴ配列、第１のラウンドで付加されたアダプタハンドル配列に相補的な配列、又はランダム配列のいずれかを３’末端に有する１つ以上のリバースプライマーを含むことによって実行され、それによって、２つのバーコードを有する細胞特異的核酸を生成する。各ステップ（鋳型スイッチングステップ及び第２の鎖合成ステップ）からの１つは、組み合わせると、第１のマルチウェルデバイスのどのウェル、及び第２のマルチウェルデバイスのどのウェルが、いずれかの特定の細胞又は核が最初に位置したかを識別することができる。

【0144】

この第２のバーコード付けステップの完了後、細胞を第２のプレートの各ウェルから再び収集し、一緒にプールし、第３のマルチウェルデバイスに再分配する。任意選択的に、細胞又は核は、溶解され、核酸は、各ウェルにおいて独立して精製される。次いで、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、及び２つのＰＣＲプライマーを含むＰＣＲ用試薬をウェルに添加する。第１のプライマーは、第２の鎖合成ステップで使用されるプライマーに存在するアダプタハンドル配列（第２のプライマー結合）、及び上記第２のステップで使用されるリバースプライマーに対して内部にネスト化された遺伝子特異的配列（例えば、ＴＣＲ定常領域遺伝子配列）、又は第２のインデックス付けステップで使用されるリバースプライマーに含まれたアダプタハンドルのいずれかに相補的な領域を３’末端に有する１つ以上の第２のプライマーに特異的である。これらのＰＣＲプライマーの一方又は両方は、単独で又は組み合わせて第３の細胞特異的バーコード配列を提供するバーコード配列（すなわち、第３の識別子タグ）を含有してもよい。

【0145】

任意選択的に、ＰＣＲプライマーはまた、次世代配列決定のための追加の配列も含み得る。例えば、リードプライマー配列、ｐ５、ｐ７配列などの配列決定プラットフォームアダプタ構築物である。あるいは、これらの配列決定プラットフォームアダプタ構築物配列は、第３の識別子配列（第３の細胞特異的バーコード配列）を付加するために使用されるＰＣＲ反応に続いて、別のＰＣＲのラウンドにおいて付加され得る。

【0146】

次いで、得られた配列決定生成物を、次世代配列決定プラットフォームを使用して配列決定し、遺伝子配列情報及びバーコード情報を取得する。各インデックス付加ラウンドからのバーコードの組み合わせは、個々の細胞又は核配列が、各それぞれのマルチウェルデバイスの第１、第２、及び第３の一意のウェルを細胞又は核が一意に通過することによって生じた細胞又は核を識別する。すなわち、例えば、第１の（ＴＳＯ）バーコード、第２のバーコード（第２の鎖合成からの）及びＰＣＲからの第３のバーコードは、各個々の細胞又は核に遺伝子特異的配列を追跡することができる一意の細胞特異的バーコードを提供する。したがって、元のコレクションの細胞又は核の各々で検出された遺伝子又は遺伝子の発現が決定される。

【0147】

図６は、実施例２に記載されるように、本発明の実施形態を使用して作製したＮＧＳライブラリ生成物の構造を示す概略図を提供する。より具体的には、Ｔ細胞受容体遺伝子は、分析のために特異的に標的化される。図６に示すように、リード１は、標的化ＴＣＲ遺伝子の配列を提供する。リード２はまた、Ｔ細胞受容体遺伝子の配列を、第１の２つのインデックス配列、すなわち、第２のインデックス付けステップからのインデックス２（ＩＮ２）、及び第１のインデックス付けステップからのインデックス１（ＩＮ１）とともに提供する。インデックス３は、第３のインデックス付けステップでＰＣＲによって付加されたｉ７及びｉ５インデックスの組み合わせによって提供されるように示される。

【0148】

実施例３ 本発明の実施形態
実施例３は、図４に広く示され、実施例１と同様の方法で実行されるが、以下に記載されるように、第２のステップで３’バーコードを付加する方法が異なる。この実施例は、実施例１と同じ初期ステップに従い、第１の細胞特異的バーコード（すなわち、ウェル特異的第１の識別子タグ）を付加する。本方法論のステップを以下に記載する。

【0149】

細胞又は核を、適切な溶液（例えば、ＮＰ４０又はジギトニンを有する１％又は４％のパラホルムアルデヒド）中で固定及び透過処理する。固定細胞又は核を、マルチウェルデバイスのウェル（例えば、９６ウェル又は３８４ウェルプレート）に等分する。あるいは、ウェルは、物理的である必要はなく、液滴で構成されてもよく、細胞又は核を異なる液滴に配分する。ウェル又は容器当たりの細胞又は核の数は、研究者が実行したい実験の規模に応じて適宜変動し得る。例えば、プレートの９６又は３８４ウェルの各々について、ウェル当たり１００個又は１，０００個の細胞である。逆転写酵素、オリゴｄＴ、第１の細胞特異的バーコード（すなわち、ウェル特異的な第１の識別子タグ）と、ＰＣＲ用アダプタハンドル（すなわち、プライマー結合部位）と、を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）、ｄＮＴＰ、及び緩衝塩を含む逆転写混合物をウェルの各々に添加し、ＲＴ反応を進行させる（例えば、３７～５０℃、例えば、４２℃などの任意の適切な温度で、反応を完了するのに十分な時間、例えば、６０～９０分以上）。これは、図４のステップＡに示される。反応を停止し、細胞又は核をウェルの各々から収集し、一緒にプールし、次いで、第２のマルチウェルデバイスのウェルに再分配する。あるいは、細胞又は核は、別の液滴セットに再分配されてもよい。

【0150】

所望であれば、溶解緩衝液をウェルの各々に添加して、細胞又は核の各々から核酸を放出する。任意選択的に、核酸は、各ウェルにおいて独立して精製される。次いで、図４のステップＢ－ＰＣＲ１に図示されるように、ＰＣＲを実行するのに有効な試薬をウェルに添加する。これらは、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、及び２つ以上のＰＣＲプライマーを含み得る。第１のプライマーは、逆転写酵素ステップで使用されるＴＳＯに存在するアダプタハンドル（プライマー結合部位）配列、及び遺伝子特異的配列（例えば、ＴＣＲ定常領域遺伝子配列）、ポリＡ配列、アダプタハンドル、又はランダム配列のいずれかに相補的な領域を３’末端に有する１つ以上の第２のプライマーに特異的である。これは、図４にステップＢとして示される。このステップでは、第２の細胞特異的バーコード配列（第２の識別子）の全て又は一部分が、ＴＳＯにおけるプライマー結合部位に結合するプライマーに含まれる。図４では、これをＢＣ２Ａとして示す。増幅後、ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）ライブラリ調製キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の修正版を使用して、すなわち、単一のアダプタのみを使用して、ステップＢで生成された断片の３’末端に、第２の細胞特異的バーコードの全て又はサブ部分を含むヘアピンアダプタを付加し、バーコードを有するアダプタを断片の３’末端に付加する。これは、図４のステップＣに詳述されている。

【0151】

任意選択的に、ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）の代わりにタグメンテーションを使用して、バーコードアダプタを断片の末端に付加することができる。このアダプタの付加後、ＰＣＲを実行して、３’末端上にアダプタを有する配列のみを増幅し、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７配列などの次世代配列に必要な任意の追加の配列を付加する。必要に応じて、例えば、必要とされるバーコード付きオリゴの総数を減少させるために、鋳型スイッチオリゴ内のハンドルに特異的なプライマーは、第２の細胞特異的バーコードのサブ部分（すなわち、第２の識別子タグ）を含むことができる。このサブ識別子（図４のＢＣ２Ａ）は、３’アダプタ内のタグ（図４のＢＣ２Ｂ）によって提供されるサブ識別子と組み合わされると、第２の細胞特異的バーコード配列（すなわち、第２の識別子タグ）を提供する。ＢＣ２Ａ又はＢＣ２Ｂのいずれかが、他方のタグを使用する必要なしに第２の識別子タグ全体として使用され得ること、又はＢＣ２Ａ及びＢＣ２Ｂの組み合わせを使用して、組み合わされた第２の識別子を提供することができることは、当業者によって理解されるべきである。

【0152】

次いで、得られた配列決定生成物を、次世代配列決定プラットフォームを使用して配列決定して、遺伝子配列情報及びバーコード情報（第１の（ＴＳＯ）バーコード、第２のバーコード（第２の鎖合成由来）、及びＰＣＲからの第３のバーコードの組み合わせ）を取得し、各個々の細胞又は核に遺伝子特異的配列を追跡することができる一意の細胞特異的バーコードを提供する。したがって、元のコレクションの細胞又は核の各々で検出された遺伝子又は遺伝子の発現が決定される。

【0153】

図２、図３、及び図４に図示されるように、バーコードＢＣ２Ａ及び２Ｂは、計算上、第２のプールステップのウェルを一意に画定する単一の一意の二次バーコードであるように組み合わせることができる。ＢＣ１とＢＣ２を組み合わせて、元のプールからの細胞を一意に定義する。

【0154】

実施例４ Ｊｕｒｋａｔ細胞とＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞との混合物からのＴＣＲベータ鎖の２ラウンドのバーコード付け
図８Ａ及び図８Ｂは、ＴＣＲ配列決定ライブラリを調製するために用いられた２ラウンドのバーコード付けプロトコルを図示する。図８Ａに示すように、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、４体積の冷メタノールで－２０℃で３０分間インキュベートすることによって固定した（図８Ａ、ステップＢ）。固定細胞を－２０℃の冷凍庫から取り出し、メタノールを除去した後、ＰＢＳ緩衝液、ＢＳＡ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、及びＤＴＴを含む５００ｕｌの再水和緩衝液で氷上で再水和した。１，０００個の固定Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、陰性対照としてＰＢＳを有する３つのチューブ並びに２つのチューブの各々に配分した（図８Ｂ）。逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ポリ－ｄＴオリゴ、第１のチューブ特異的バーコード（ＢＣ１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）、ｄＮＴＰ、並びにＲＴ緩衝液を含む逆転写混合物を各チューブに添加し、ＲＴ反応を４２℃で９０分間実行した（図８Ａ、ステップＣ）。細胞を各チューブから収集し、一緒にプールした（図８Ａ、ステップＤ）。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。再懸濁された細胞を、８本のチューブの新しいセットに再分配した（図８Ａ、ステップＥ、及び図８Ｂ）。

【0155】

ＤＮＡポリメラーゼ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列を含むＰＣＲプライマー、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズするプライマー（ＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマー）、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ１混合物を、再懸濁細胞を含有する８本のチューブに添加した。次いで、４０μｌでＰＣＲ１を実行した（図８Ａ、ステップＦ）。ＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーは、ＲＮａｓｅの非存在下でＰＣＲプライマーとして機能するキメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドであるが、例えば、ＵＳ２０２０－０３３２３４１Ａ１として公開されている米国特許出願第１６／６０３，７８８号（代理人整理番号ＣＬＯＮ－１６９）（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、様々なＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＡなど）による消化によってＰＣＲ後に不活性にすることができる。

【0156】

ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮａｓｅＨ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列、ＢＣ２ａ（ｉ５）及びＰ５アダプタ配列を含むＢＣ２ａ（ｉ５）プライマー；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列、ＢＣ２ｂ（ｉ７）及びＰ７アダプタ配列を含むＢＣ２ｂ（ｉ７）プライマー；ＴＣＲｂ ＰＣＲ２プライマー（ＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーに対して内部の点でＴＣＲｂ定常領域にハイブリダイズし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列を更に含む）；ｄＮＴＰ；並びにＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ２混合物を、ＰＣＲ１反応生成物を含有する８本のチューブに直接添加した。次いで、ＰＣＲ２を７０ｕｌで実行した（図８Ａ、ステップＨ）。得られたＴＣＲｂライブラリは、第１及び第２のラウンドのバーコード（ＢＣ１、ＢＣ２ａ（ｉ５）及びＢＣ２ｂ（ｉ７））の両方でマークされた全ての分子を含有する。

【0157】

８つのバーコード付きＴＣＲｂライブラリを磁気ビーズで精製し、Ｑｕｂｉｔ、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｋｉｔ（８つのライブラリのうちの１つを図８Ｃに示す）、及びｑＰＣＲによって定量した。次いで、それらを一緒にプールし、ペアリングエンド配列決定（２×１５１ＰＥ）のために、ＮｅｘｔＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に装填した。得られた配列決定リードをＢＣ１、ＢＣ２ａ（ｉ５）及びＢＣ２ｂ（ｉ７）で逆多重化し、Ｃｏｇｅｎｔ ＡＰソフトウェア（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）によって分析した。６４個の予想されるバーコードの組み合わせ（８個の第１のラウンドのバーコード×８個の第２のラウンドのバーコード）を全て検出し、結果を、検出したＪｕｒｋａｔクロノタイプ（アミノ酸配列：ＣＡＳＳＦＳＴＣＳＡＮＹＧＹＴＦ）及びＣＣＲＦクロノタイプ（アミノ酸配列：ＣＡＳＳＬＧＴＤＴＱＹＦ）のリード数に基づいてプロットした（図８Ｄ）。予想通り、ほとんどのリードは、Ｊｕｒｋａｔ又はＣＣＲＦクロノタイプに割り当てられた。これにより、ＴＳＯからの第１のラウンドのバーコードの使用を含む組み合わせバーコード付け戦略が予想どおりに機能していたことが確認された。

【0158】

なお、ＰＣＲ１用のフォワードプライマーが、部分的な第２のラウンドのバーコードＢＣ２ａ、Ｐ５配列、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列を含む、代替のバーコード付け戦略も想定される。これを図９に示す。

【0159】

実施例５ ＰＢＭＣ ＲＮＡからのＴＣＲアルファ及びベータ鎖の３ラウンドのバーコード付け
配列決定ライブラリを、図１０Ａに図示される３ラウンドのバーコード付けプロトコルを使用して調製した。ＰＢＭＣ ＲＮＡ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）を５ｎｇ／ｕｌに希釈し、２ｕｌ（１０ｎｇ）をエッペンドルフチューブに分配した。陰性対照として、２ｕｌのＲＮａｓｅフリー水を別のチューブに分配した。逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ポリ－ｄＴオリゴ、第１のバーコード（ＢＣ１）及び第２の鎖合成のためのプライマー結合部位（第２のＳＳハンドル）を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）、ｄＮＴＰ、並びにＲＴ緩衝液を含む逆転写混合物を各チューブに加え、ＲＴ反応を２０ｕｌで４２℃で９０分間実行し、続いて７０℃で１０分間インキュベートした（図１０Ａ、ステップＣ）。この反応に使用されるＴＳＯは、ＲＮａｓｅの非存在下で鋳型スイッチングオリゴとして機能するが、例えば、ＵＳ２０２０－０３３２３４１Ａ１として公開されている米国特許出願第１６／６０３，７８８号（代理人整理番号ＣＬＯＮ－１６９）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、様々なＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＡなど）での消化により使用後に不活性化することができるキメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ＢＣ１を含むＲＴ生成物を磁気ビーズによって精製し、１３ｕｌの溶出緩衝液中に溶出させた。

【0160】

逆転写酵素；ＲＮａｓｅＨ；ＴＳＯプライマー結合配列にハイブリダイズする配列、ＢＣ２及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列を含む第２のＳＳオリゴ；ｄＮＴＰ；並びに第２のＳＳ反応緩衝液を含む第２の鎖合成混合物（第２のＳＳ）を、１３ｕｌの精製されたＲＴ生成物を収容するクリーンチューブに添加した。次いで、第２のＳＳ反応を２０ｕｌで４２℃で１０分間実行し、続いて７０℃で１０分間インキュベーションした（図１０Ａ、ステップＦ）。ＢＣ１及びＢＣ２を有する第２のＳＳ生成物を磁気ビーズによって精製し、１２ｕｌの溶出緩衝液中に溶出した。

【0161】

ＤＮＡポリメラーゼ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列、ＢＣ３ｂ（ｉ７）及びＰ７アダプタ配列を含むＢＣ３ｂ（ｉ７）プライマー；Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズするＴＣＲａ ＰＣＲ１プライマー；Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズするＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマー；ｄＮＴＰ；並びにＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ１混合物を、精製された第２ＳＳの生成物１０ｕｌを収容するクリーンチューブに添加し、次いで４０ｕｌでＰＣＲ１を実行した（図１０Ａ、ステップＩ）。上記のＴＣＲａ ＰＣＲ１プライマー及びＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーは両方とも、ＲＮａｓｅの非存在下でＰＣＲプライマーとして機能することができるが、例えば、ＵＳ２０２０－０３３２３４１Ａ１として公開されている米国特許出願第１６／６０３，７８８号（代理人整理番号ＣＬＯＮ－１６９）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、使用後に様々なＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＡなど）で消化することによって不活性化することができるキメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。

【0162】

ＰＣＲ１に続いて、ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮａｓｅＨ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列、ＢＣ３ａ（ｉ５）及びＰ５アダプタ配列を含むＢＣ３ａ（ｉ５）プライマー；ＴＣＲａ ＰＣＲ１プライマーに対して内部の点でＴＣＲａ定常領域にハイブリダイズし、更にＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列を含むＴＣＲｂ ＰＣＲ２プライマー；ＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーに対して内部の点でＴＣＲｂ定常領域にハイブリダイズし、更にＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列を含むＴＣＲｂ ＰＣＲ２プライマー；ｄＮＴＰ；並びにＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ２混合物を、ＰＣＲ１チューブに直接添加した。次いで、ＰＣＲ２を７０ｕｌで実行した（図１０Ａ、ステップＫ）。ＰＣＲ２の後、第１、第２、及び第３のラウンドのバーコード（ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３ａ（ｉ５）、及びＢＣ３ｂ（ｉ７））でマークされた分子を含むＴＣＲライブラリを磁気ビーズによって精製し、Ｑｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｋｉｔによって定量した。１０ｎｇのＰＢＭＣ ＲＮＡからのみ得られたライブラリは、予想されるサイズ（約６５０ｂｐ）を有するように適合させた（図１０パネルＢ）。

【0163】

ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に装填して、ペアエンド配列決定（２×１５１ＰＥ）を行い、得られた配列決定データをＣｏｇｅｎｔ ＡＰソフトウェア（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して分析した。４１０，６９６個のリードが逆多重化後に得られ、２８６，０７０個のリード（７０％のマッピング率を表す）がＴＣＲａ及びＴＣＲｂにマッピングされた。検出されたクローンタイプの数は、９３（ＴＣＲａ）及び８９０（ＴＣＲｂ）であった（図１０パネルＣ）。この結果は、ＴＳＯを使用して第１のラウンドのバーコード（第１の識別子）を供給し、第２の鎖合成を使用して第２のラウンドのバーコード（第２の識別子）を提供する３ラウンドの組み合わせバーコード付け戦略が予想どおりに機能することを実証する。

【0164】

なお、ＰＣＲ１用のフォワードプライマーが、バーコード配列を含まない、代替のバーコード付け戦略も想定されることに留意されたい。これを図１１に示す。

【0165】

実施例６ 組み合わされた標的化配列決定と５’差次的発現（５’ＤＥ）のための２ラウンドのバーコード付け
配列決定ライブラリを、図１２Ａに図示されるプロトコルを使用して生成した。１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用してＫ５６２及び３Ｔ３細胞を固定し、０．０１％ジギトニンで透過処理した（図１２Ａ、ステップＢ）。洗浄後、細胞を、各ウェルが約１，０００個の細胞を含有するように、９６ウェルプレートの３９個のウェル（Ｋ５６２細胞に対して８個のウェル、３Ｔ３細胞に対して８個のウェル、並びにＫ５６２及び３Ｔ３細胞の混合物に対して２３個のウェル）に等分した。逆転写酵素；ＲＮａｓｅ阻害剤；ポリ－ｄＴ配列及びＰＣＲハンドル配列を含むＲＴオリゴ；第１のウェル特異的バーコード（ＢＣ１）及びＰＣＲ用のプライマー結合部位を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）；ｄＮＴＰ；並びにＲＴ緩衝液を含む逆転写混合物を各ウェルに添加し、ＲＴ反応を４２℃で９０分間実行した（図１２Ａ、ステップＣ）。次いで、ウェルの各々から細胞を収集し、一緒にプールした。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した。

【0166】

再懸濁細胞を、ＩＣＥＬＬ８機器（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して、ＩＣＥＬＬ８ナノウェルチップの１，２９６個のウェルに再分配した（図１２Ａ、ステップＥ）。ＲＴオリゴからのＰＣＲハンドル配列にハイブリダイズする逆ＰＣＲプライマー、並びにＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ緩衝液を含有するＰＣＲ試薬とともに、部分的な第２のラウンドのウェル特異的バーコード（ＢＣ２ａ及びＢＣ２ｂのいずれか）対のうちの１つを含む２つのフォワードＰＣＲプライマーをチップに順次分配した。２つのフォワードプライマーを、一方がチップ上のウェルの特定の行を画定し、他方がウェルの特定の列を画定するように付加した。したがって、組み合わせて、それらは一意のウェル位置を画定する。第１のフォワードＰＣＲプライマーは、ＴＳＯによって提供されるＰＣＲハンドルにハイブリダイズすることができる配列、ＢＣ２ａ、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列を含む。第２のフォワードＰＣＲプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列、ＢＣ２ｂ、及びＰ７配列を含む。したがって、図１２Ａ、ステップＦに示すように、これらのプライマーを合わせると、両方のプライマーに由来する配列を組み合わせて最終的に含むＰＣＲ生成物を生成する「ステップアウト」ＰＣＲ反応が可能になる。

【0167】

この第２のバーコード付けステップの完了後、バーコード付き全長ｃＤＮＡを遠心分離によってＩＣＥＬＬ８チップから抽出し、磁気ビーズで精製した。Ｑｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｋｉｔによる定量後、ｃＤＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴキットを使用した差動遺伝子発現分析（５’ＤＥ）のための配列決定ライブラリを調製し、続いてＰ７プライマー及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５インデックスプライマーを使用したＰＣＲを行った（図１２Ｂ）。精製及び定量の後、最後の５’ＤＥライブラリを、ペアエンド配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑに装填した（２×７５ＰＥ）。得られた配列決定リードを逆多重化し、Ｃｏｇｅｎｔ ＡＰソフトウェア（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して分析した。

【0168】

Ｃｏｇｅｎｔ ＡＰソフトウェアを使用してＢＣ１、ＢＣ２ａ、ＢＣ２ｂ（ｉ７）及びｉ５インデックスを使用して配列決定リードを逆多重化した後、１０，０００リード／細胞を超える１３１０個の細胞を識別した（図１２Ｃ）。これらの細胞からのデータを、（図１２Ｄ～１２Ｆに示されるように）下流分析に使用した。特に、図１２Ｆに示されるＬ－プロット分析は、ヒトゲノム（ｈｇ３８；Ｋ５６２細胞の代表）又はマウスゲノム（ｍｍ１０；３Ｔ３細胞の代表）のいずれかに対するデータの高いマッピング率を明らかに示し、ダブレット率は非常に低かった。これは、この組み合わせバーコード付け戦略が単一細胞データを生成することができることを実証した。

【0169】

実施例７ ＰＢＭＣ ＲＮＡを使用する、組み合わされたＴＣＲ鎖の標的化配列決定と５’差次的発現（５’ＤＥ）のための２ラウンドのバーコード付け
ＰＢＭＣ ＲＮＡ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を５．０ｎｇ／ｕｌに希釈し、２ｕｌ（１０ｎｇ）をエッペンドルフチューブに分配した。逆転写酵素；ＲＮａｓｅ阻害剤；ポリ－ｄＴ配列及びＰＣＲハンドル配列を含むＲＴオリゴ；第１のウェル特異的バーコード（ＢＣ１）及びＰＣＲ用のプライマー結合部位を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）；ｄＮＴＰ；並びにＲＴ緩衝液を含む逆転写混合物をチューブに添加し、ＲＴ反応を２０ｕｌ、４２℃で９０分間実行し、続いて７０℃で１０分間インキュベートした（図１２Ａ、ステップＣ）。ＢＣ１を含むＲＴ生成物を磁気ビーズによって精製し、１２ｕｌの溶出緩衝液中に溶出させた。

【0170】

ＲＴオリゴからのＰＣＲハンドル配列にハイブリダイズする逆ＰＣＲプライマー、並びにＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ試薬とともに、部分的な第２のラウンドのウェル特異的バーコード（ＢＣ２ａ又はＢＣ２ｂのいずれか）対のうちの１つを含む２つのフォワードＰＣＲプライマーをチューブに添加した。一方が部分的な第２のラウンドのバーコード配列ＢＣ２ａを提供し、他方が部分的な第２のラウンドのバーコード配列ＢＣ２ｂを提供するように、２つのフォワードプライマーを添加した。したがって、それらを組み合わせて、一意の第２のラウンドのバーコードを定義する。第１のフォワードＰＣＲプライマーは、ＴＳＯによって提供されるＰＣＲハンドルにハイブリダイズすることができる配列、ＢＣ２ａ、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列を含む。第２のフォワードＰＣＲプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列、ＢＣ２ｂ、及びＰ７配列を含む。したがって、図１２Ａ、ステップＦに示すように、これらのプライマーを合わせると、両方のプライマーに由来する配列を組み合わせて最終的に含むＰＣＲ生成物を生成する「ステップアウト」ＰＣＲ反応が可能になる。

【0171】

ＰＣＲによるこの第２のバーコード付けステップの完了後、バーコード付き全長ｃＤＮＡを磁気ビーズで精製した。Ｑｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｋｉｔ（図１３Ｂ）による定量後、ｃＤＮＡを以下のように３つのチューブに等分した：
ＴＣＲａ用チューブ１、
ＴＣＲｂ用チューブ２、及び
ＴＣＲａ及びｂ用チューブ３。

【0172】

ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐ７プライマー、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ１混合物を３つのチューブの各々に添加した。次に、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズするＴＣＲａ ＰＣＲ１プライマーをチューブ１に加えた。Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖の定常領域を特異的にハイブリダイズするＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーをチューブ２に加え、ＴＣＲａとＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーの両方をチューブ３に加えた。次いで、ＰＣＲ１を４０ｕｌで実行した（図１３Ａ）。上記のＴＣＲａ ＰＣＲ１プライマー及びＴＣＲｂ ＰＣＲ１プライマーは両方とも、ＲＮａｓｅの非存在下でＰＣＲプライマーとして機能することができるが、例えば、ＵＳ２０２０－０３３２３４１Ａ１として公開されている米国特許出願第１６／６０３，７８８号（代理人整理番号ＣＬＯＮ－１６９）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、使用後に様々なＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＡなど）で消化することによって不活性化することができるキメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。

【0173】

ＰＣＲ１に続いて、ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮａｓｅＨ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ１配列、ｉ５インデックス及びＰ５アダプタ配列を含むｉ５インデックスを有するＰ５インデックスプライマー；ｄＮＴＰ；並びにＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ２混合物を、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖（チューブ１）の定常領域を特異的にハイブリダイズするＴＣＲａ ＰＣＲ２プライマー、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖（チューブ２）の定常領域を特異的にハイブリダイズするＴＣＲｂ ＰＣＲ２プライマー、又はＴＣＲａ及びＴＣＲｂ ＰＣＲ２プライマー（チューブ３）の両方のいずれかとともに、３つのチューブの各々に添加した。ＴＣＲａ及びｂ ＰＣＲ２プライマーの各々はまた、ＲＰ１配列も含む。次いで、ＰＣＲ２を７０ｕｌで実行した（図１３Ａ）。

【0174】

ＰＣＲ２の後、磁気ビーズによって、ＢＣ１、ＢＣ２ａ、ＢＣ２ｂ（ｉ７）及びＴＣＲ特異的インデックス（ｉ５）の全ての３つのバーコード配列を有するＴＣＲライブラリを精製し、Ｑｕｂｉｔ、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｋｉｔ（図１３Ｃ）及びｑＰＣＲによって定量した。ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｎｉＳｅｑシーケンサーに装填して、ペアエンド配列決定（２×１５１ＰＥ）を行い、得られた配列決定データをＣｏｇｅｎｔ ＡＰソフトウェア（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）で分析した。以下の表１に提供される配列決定結果の要約：

【表1】

【0175】

この結果は、この組み合わせバーコード付け戦略が機能することを示す。

【0176】

実施例８ 組み合わされた標的化配列決定と５’差次的発現（５’ＤＥ）のための３ラウンドのバーコード付け
３ラウンドのバーコード付けを使用して標的化配列決定及び５’差異発現ライブラリを生成するためのプロトコルを図１４に示す。この実施例では、細胞は固定され、プレート（例えば、９６ウェルプレート）のウェルにわたって分配される。逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ポリ－ｄＴオリゴ、第１のバーコード（ＢＣ１）及び第２の鎖合成のためのプライマー結合部位（第２のＳＳハンドル）を含む鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）、ｄＮＴＰ、並びにＲＴ緩衝液を含む逆転写混合物を各ウェルに加え、ＲＴ反応を実行する（図１４、ステップＣ）。この反応に使用されるＴＳＯは、ＲＮａｓｅの非存在下で鋳型スイッチングオリゴとして機能するが、例えば、ＵＳ２０２０－０３３２３４１Ａ１として公開されている米国特許出願第１６／６０３，７８８号（代理人整理番号ＣＬＯＮ－１６９）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、様々なＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＡなど）での消化により使用後に不活性化することができるキメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。次いで、ＢＣ１を含む各ウェルからの細胞をプールする（図１４、ステップＤ）。次いで、プールされた細胞を、新たなマルチウェルプレート又はナノウェルチップ内のウェルの第２のセットに再分配する（図１４、ステップＥ）。

【0177】

逆転写酵素；ＲＮａｓｅＨ；ＴＳＯプライマー結合配列にハイブリダイズする配列、ＢＣ２及びＰＣＲハンドル配列を含む第２のＳＳオリゴ；ｄＮＴＰ；並びに第２のＳＳ反応緩衝液を含む第２の鎖合成混合物（第２のＳＳ）を各ウェルに添加する。次いで、第２のＳＳ反応を実行する（図１４、ステップＦ）。次に、ＢＣ１及びＢＣ２を含む第２のＳＳ生成物を含む細胞をプールする（図１４、ステップＧ）。次いで、プールされた細胞を、新たなマルチウェルプレート又はナノウェルチップ内のウェルの第３のセットに再分配する（図１４、ステップＨ）。

【0178】

ＲＴオリゴからのＰＣＲハンドル配列にハイブリダイズする逆ＰＣＲプライマー、並びにＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ緩衝液を含有するＰＣＲ試薬とともに、部分的な第３のラウンドのウェル特異的バーコード（ＢＣ３ａ又はＢＣ３ｂのいずれか）対のうちの１つを含む２つのフォワードＰＣＲプライマーを各ウェルに添加する。一方が部分的な第３のラウンドのバーコード配列ＢＣ３ａを提供し、他方が部分的な第３のラウンドのバーコード配列ＢＣ３ｂを提供するように、２つのフォワードプライマーを添加する。したがって、それらを組み合わせて、一意の第３のラウンドのバーコードを定義する。第１のフォワードＰＣＲプライマーは、第２のバーコード付けラウンドからの第２の鎖合成プライマーによって提供されるＰＣＲハンドルにハイブリダイズすることができる配列、ＢＣ３ａ、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列を含む。第２のフォワードＰＣＲプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＰ２配列、ＢＣ３ｂ、及びＰ７配列を含む。したがって、図１４、ステップＩに示すように、これらのプライマーを合わせると、両方のプライマーに由来する配列を組み合わせて最終的に含むＰＣＲ生成物を生成する「ステップアウト」ＰＣＲ反応が可能になる。

【0179】

ＰＣＲによるこの第３のバーコード付けステップの完了後、バーコード付き全長ｃＤＮＡは、実施例６（５’ＤＥについてはＮｅｘｔｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用して）又は実施例７（ＴＣＲ特異的ライブラリ生成のための２ラウンドＰＣＲ）のいずれかに記載されているプロセスと同様のプロセスを使用して、最終５’ＤＥ及び／若しくはＴＣＲ又は他の遺伝子特異的ライブラリに変換することができる。これのためのステップ及び生成された最終ライブラリの構造を図１５に示す。図１５パネルＡは、（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いて）タグメンテーションを使用して５’ＤＥライブラリを生成するためのステップを示す。他の実施形態では、ヘアピンアダプタの組み合わされた断片化及びライゲーションは、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号６３４７６４、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）に記載されるように使用することができる。図１５パネルＢは、第３のバーコード付けラウンド後にＴＣＲライブラリを生成するためのステップを示す。

【0180】

実施例９ 精製ＲＮＡを使用した、異なるインデックスを有する鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）の分析
異なる一意の８ｎｔインデックスを有するＴＳＯの性能を、逆転写（ＲＴ）反応において試験した。１０ｎｇの精製Ｋ５６２ＲＮＡを、４μｌのＲＴ緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ、３７５ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ_２）、１μｌのランダム六量体、１μｌのヌクレアーゼフリー水と混合し、８５℃で６分間加熱することによって断片化し、次いで直ちに氷上で冷却した。４．５ｕｌのＴＳＯ緩衝液、０．５ｕｌのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｕｌの逆転写酵素（２００ｕ／ｕｌ）、８ｎｔの第１の識別子（すなわち、第１のインデックス）を有する１ｕｌのＴＳＯ（５０μＭ）、及び６ｕｌのＲＮａｓｅフリー水を含有するＲＴ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを、断片化されたＲＮＡに添加した。９６ウェルプレートの各ウェルは、一意の第１の識別子を有するＴＳＯを含有した。ＲＴ反応を、２５℃、１０分、４２℃、９０分、次いで７２℃、５分で実行した。ＲＴ反応後、２５ｕｌの２Ｘ ＣＢ緩衝液、１ｕｌのＤＮＡポリメラーゼ、１ｕｌの５’ＰＣＲプライマー、及び１ｕｌの３’ＰＣＲプライマーを含有するＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを添加して、以下のＰＣＲプログラムでＲＴ生成物を増幅した：９４℃、１分；９８℃、１５秒、５５℃、１５秒、６８℃、３０秒の１０サイクル；６８℃、２分；４℃で保持。ＰＣＲ生成物を磁気ビーズによって精製し、ＰＣＲ生成物の濃度をＱｕｂｉｔによって測定した。

【0181】

図１６に示すように、８ｎｔの第１の識別子を有する全ての試験されたＴＳＯは、良好なライブラリ収率を生成した。ＴＳＯなしの場合、ＲＴ反応は、非常に低い収率を有した。この結果は、ＲＴステップ中でのＴＳＯを使用した第１の識別子の付加が、精製されたＲＮＡを使用して成功したことを示す。

【0182】

第１の識別子の長さは、６～１２ヌクレオチド（ｎｔ）の間で様々であり得る。ＲＴ緩衝液中のＭｇ^２＋濃度は、２～１２ｍＭの間で様々であり得る。ランダムプライマーの長さは、６～１５ｎｔの間で様々であり得る。ＲＴ反応におけるＴＳＯ最終濃度は、０．５～５μＭの間で様々であり得る。ＲＴ反応におけるランダムプライマー最終濃度は、０．５～５μＭの間で様々であり得る。ＲＮＡ断片化温度は、６５℃～９５℃の間で様々であり得、インキュベーション時間は、１～３０分の間で様々であり得る。ＲＴ反応は、一定温度インキュベーションであってもよく、熱循環の有無にかかわらず温度勾配であってもよい。

【0183】

実施例１０ 単一細胞での組み合わせインデックス付けの分析
細胞又は核を適切な固定溶液（例えば、１～４％のパラホルムアルデヒド、グリオキサール、ＤＳＰ、ＤＳＴ、メタノールなど）に固定した。固定細胞又は核を、マルチウェルデバイス（例えば、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート、ナノウェルＩＣＥＬＬ８チップなど）のウェルに等分した。細胞ＲＮＡを断片化し、次いで細胞透過処理試薬（例えば、０．０１～０．５％のジギトニン、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＮＰ４０など）を含有する逆転写Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを熱処理細胞に添加した。第１の識別子を、鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）を使用することによって、インサイチュでの逆転写（ＲＴ）反応中に付加し、鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）の各々が一意の第１の識別子を担持する。次いで、第１の識別子を有するｃＤＮＡを含有する細胞をプールし、次いで複数の区画（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）（例えば、９６ウェルプレート若しくは３８４ウェルプレート、又は５１８４ナノウェルＩＣＥＬＬ８チップ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ））に再度分割し、各第２の区画が異なる第１の識別子を有する複数の細胞を含有するようにした。次に、一意の第２の識別子を担持するプライマーを有するＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを各分画に加え、ＰＣＲ反応を実施して、第２の識別子を最終ライブラリＤＮＡに組み込んだ。必要に応じて、細胞は、追加のプール分割ラウンドを経ることができ、増幅又はライゲーションによってより多くの識別子を付加することができる。識別子付加ステップの複数のラウンドは、手動で、又はロボット液体ハンドラなどの自動化によって行った。各個々の細胞からの最終的なライブラリＤＮＡは、識別子の一意の組み合わせを有する。次いで、ｒＲＮＡをライブラリから枯渇させ、クリーンアップ及び定量後、ライブラリをシーケンサー（例えば、Ｍｉｓｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、Ｎｏｖａｓｅｑなど、全てＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡによって製造された）上で配列決定した。

【0184】

この実施例では、細胞（Ｋ５６２（ヒト）：３Ｔ３（マウス）を１：１の比率で）を１％パラホルムアルデヒドで固定し、各ウェルがウェル当たり約２０００個の細胞を含有するように、９６ウェルプレートのウェルにわたって等分した。ＲＮＡ断片化は、５μｌの固定細胞を４μｌのＲＴ緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ、３７５ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ_２）及び１２μＭのランダム六量体１μｌと混合し、次いで細胞を８５℃で６分間加熱することによって実施した。次いで、細胞を直ちに氷上で冷却した。４．５ｕｌのＴＳＯ緩衝液、１ｕｌのジギトニン（０．２％）、０．５ｕｌのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｕｌの逆転写酵素（２００Ｕ／ｕｌ）、及び１ｕｌのＲＮａｓｅフリー水を含有するＲＴ混合物を調製し、プレートの各ウェルに添加した。次いで、一意の第１の識別子を有する１ｕｌのＴＳＯ（５０ｕＭ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、ＰＡＴＥを２５℃で１０分間、次いで４２℃で９０分間インキュベートすることによって、ＲＴ反応を実施した。ＲＴ反応が完了した後、９６ウェルプレートの全てのウェルからの細胞を一緒にプールし、ＰＢＳで一度洗浄し、３０ｕｌの液体を残して細胞を再懸濁し、次いで、ＩＣＥＬＬ８機器（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用してＩＣＥＬＬ８チップのナノウェルにわたって分配した。次いで、この実験で第２の識別子として使用されるｉ５、ｉ７インデックス、及びＰＣＲ混合物（ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ及び２Ｘ ＣＢ緩衝液、いずれもＴａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡによって供給された）をＩＣＥＬＬ８チップに分配して、細胞と混合した。以下のプログラムでオンチップでＰＣＲを実行した：９４℃、１分；１００℃、１５秒、４９．３℃、５秒、５４．５℃、１０秒、７２．２℃、９秒、６７．９℃、３１秒の１０サイクル；６７．９℃、２分；４℃で保持。ＰＣＲ反応後、ライブラリをプールし、磁気ビーズによってクリーンアップした。ビーズを、２．２μｌの１０Ｘ ＺａｐＲ緩衝液、１．５μｌのｓｃＺａｐＲ、１．５μｌの加熱プローブ及び１６．８μｌのヌクレアーゼフリー水を含有するＺａｐＲ混合物（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）で溶出し、ＺａｐＲ反応を３７℃で１時間及び７２℃で１０分間実施して、ライブラリからｒＲＮＡを除去した。ＺａｐＲが完了した後、以下のプログラムで、２０ｕｌのＺａｐＲ生成物を収容する各チューブに８０ｕｌのＰＣＲ混合物（２ｕｌのＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ、２ｕｌのＰＣＲ２プライマー、５０ｕｌの２Ｘ ＣＢ緩衝液、及び２６ｕｌのヌクレアーゼフリー水）を添加することによって、第２のＰＣＲ反応を実行して、ライブラリを増幅した：９４℃、１分；９８℃、１５秒、５５℃、１５秒、６８℃、３０秒の５サイクル；４℃で保持。第２のＰＣＲ反応の後、生成物を磁気ビーズによって精製し、Ｑｕｂｉｔ、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ及びｑＰＣＲによって定量した。定量に基づいて、ライブラリＤＮＡを４ｎＭに希釈した。５ｕｌの４ｎＭのライブラリを、５ｕｌの新たに作製した０．２ＮのＮａＯＨと混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、５μｌの２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）を添加し、続いて９８５μｌのＨＴ緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を添加した結果は、２０ｐＭの変性ライブラリであった。次いで、これを以下のように１．５ｐＭに希釈した。変性ライブラリ溶液（９７μｌ）及びＰｒｅｃｈｉｌｌｅｄ ＨＴ１（１２０３μｌ）を、配列決定のためにＮｅｘｔｓｅｑカートリッジ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に装填した。

【0185】

表２に示すように、配列決定リードの９３．４％が正常にバーコード付けされ、総リード数の６．６％のみが未決定であった。逆多重化されたリードを使用して「ニープロット」を作成し、識別することができるＱＣを合格する細胞の数を決定した。図１７に示すように、１１３３個の細胞が正常にバーコード付けされ、ＱＣ閾値に合格した（２０，０００リード／細胞）。これは、ＴＳＯによる鋳型スイッチングを使用して第１の識別子を付加すること、及びＰＣＲを使用して第２の識別子を付加することによって、組み合わせインデックス付けが達成されたことを実証する。この場合、第２の識別子は、２ａ＋２ｂ、すなわちｉ５及びｉ７の形態であり、これらは各々、ＩＣＥＬＬナノウェルチップの行又は列のいずれかを画定するが、組み合わせは、特定のウェルに対して一意である。組み込まれた第１及び第２の識別子の組み合わせは、固定細胞の元のプールからの各個々の単一細胞に対して一意である。Ｃｏｇｅｎｔ ＮＧＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を用いて、配列決定リードを分析し、それらをヒト及びマウスゲノムの両方に対してマッピングした。マッピング結果を使用して「Ｌ－プロット」を作成し、これを使用して、個々に捕捉された細胞のパーセンテージ、並びに細胞ダブレットの存在を決定した。図１８に示されるように、Ｌ－プロットのｘ軸は、ヒトゲノムに対してマッピングされたリードを示し、ｙ軸は、マウスゲノムに対してマッピングされたリードを示す。ヒト及びマウス細胞は、Ｌ－プロット上で十分に分離された。ダブレット比率は、使用されるインデックスの数及びアッセイされた細胞の総数に基づいて予想された予想比率１０．５％に近い９．８％であると計算された。これは、組み合わせインデックス付けワークフロー中に細胞間クロストークが最小限であったこと、したがって、この方法を使用して単一細胞を個々に識別できることを実証する。表３に示すように、配列決定データは、良好なエクソン及びイントロン比率、並びに低い遺伝子間／ミトコンドリア／リボソーム比率を有する全体的に良好なマッピングメトリックを示した。５８９６個の遺伝子を、１４８，０００リード／細胞の平均配列決定深度で検出した。これらのデータは、この例示的な実施形態に従って実施される本発明が、良好な性能でハイスループットで単一細胞の全ＲＮＡ－ｓｅｑを分析することができることを実証する。

【表2】

【表3】

【0186】

実施例１１ 高濃度のＰＦＡ及びジギトニンを有する単一細胞レベルでの組み合わせインデックス付けの分析
この実施例では、４００万個の細胞（Ｋ５６２：３Ｔ３が１：１の比率で）を３００ｇで３分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの４％ＰＦＡ中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートして、細胞固定した。次いで、５００ｇで５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。細胞ペレットを、３ｍＭのグリシン（ｐＨ７．５）１ｍｌに再懸濁し、氷上で５分間インキュベートして、固定プロセスをクエンチした。細胞を５００ｇで５分間遠心分離することによって再びペレット化して、グリシン溶液を除去し、次に、１％の第２の希釈剤及び１％のＲＮａｓｅ阻害剤を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。９μｌの固定細胞を４μｌのＲＴ緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ、３７５ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ_２）と混合し、８５℃で６分間インキュベートして、ＲＮＡ断片化を行った。次に、１ｕｌの１．４％ジギトニンを加熱した細胞に添加し、混合物を室温で５分間インキュベートして細胞透過処理した。最終的なジギトニン濃度は、０．１％であった。ＲＴ混合物（４．５ｕｌのｓｃＴＳＯ混合物、０．５ｕｌのＲＮａｓｅ阻害剤、１ｕｌの逆転写酵素（２００ｕ／ｕｌ）、１ｕｌの１２ｕＭランダムプライマー）を、透過処理細胞を含有する９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレートを４２℃で９０分間インキュベートしてＲＴ反応させた。ＲＴ後、９６ウェルプレートの全てのウェルからの細胞を一緒にプールし、０．０４％ＢＳＡでＰＢＳで一度洗浄し、２５ｕｌの液体を残して細胞を再懸濁し、次いでＩＣＥＬＬ８機器（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用してＩＣＥＬＬ８チップのナノウェルに分配した。次いで、ｉ５、ｉ７インデックス及びＰＣＲ混合物（ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ及び２Ｘ ＣＢ緩衝液－両方ともＴａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ製）をＩＣＥＬＬ８チップに分配して、細胞と混合した。以下のプログラムでオンチップでＰＣＲを実行した：７２．１℃、３分；９８．２℃、１８秒；９６．５℃、４２秒；１００℃、１０秒、５４．４℃、５秒、５９．６℃、１０秒、７２．２℃、９秒、６７．９℃、１分５１秒の１０サイクル；４℃で保持。ＰＣＲ反応後、ライブラリをプールし、磁気ビーズを使用してクリーンアップした。ビーズを、２．２μｌの１０Ｘ ＺａｐＲ緩衝液、１．５μｌのｓｃＺａｐＲ、１．５μｌの加熱プローブ混合物、及び１６．８μｌのヌクレアーゼフリー水を含有するＺａｐＲ混合物（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）で溶出した。次いで、ＺａｐＲ反応（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を３７℃で１時間実施し、続いて７２℃で１０分間インキュベーションして、ライブラリからｒＲＮＡを除去した。ＺａｐＲ反応が完了した後、以下のプログラムで、２０ｕｌのＺａｐＲ生成物を収容する各チューブに８０ｕｌのＰＣＲ混合物（２ｕｌのＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ、２ｕｌのＰＣＲ２プライマー、５０ｕｌの２Ｘ ＣＢ緩衝液、及び２６ｕｌのヌクレアーゼフリー水）を添加することによって、第２のＰＣＲ反応を実行して、ライブラリを増幅した：９４℃、１分；９８℃、１５秒、５５℃、１５秒、６８℃、３０秒の５サイクル；４℃で保持。ＰＣＲ反応が完了した後、生成物を磁気ビーズによって精製し、Ｑｕｂｉｔ、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ及びｑＰＣＲによって定量した。定量に基づいて、ライブラリＤＮＡを４ｎＭに希釈した。５ｕｌの４ｎＭのライブラリを、５ｕｌの新たに作製した０．２ＮのＮａＯＨと混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、５μｌの２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）を添加し、続いて９８５μｌのＨＴ緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を添加した結果は、２０ｐＭの変性ライブラリであった。次いで、これを１．７ｐＭに希釈し、配列決定のためにＮｅｘｔｓｅｑカートリッジＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に装填した。

【0187】

配列決定の後、Ｃｏｇｅｎｔ ＮＧＳ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を用いて、ヒト及びマウスゲノムの両方に対してマッピングされた配列決定リードを分析した。マッピング結果を使用して、Ｌ－プロットを作成した。図１９に示すように、ｘ軸は、ヒトゲノムに対するリードマッピングを示し、ｙ軸は、マウスゲノムに対するリードマッピングを示した。結果は、ヒト及びマウス細胞がＬ－プロット上で十分に分離されていたことを示した。ダブレット比率は５．８％であり、計算された予想比率５％に近かった。これは、４％ＰＦＡ及び０．１％ジギトニンによる組み合わせインデックス付けワークフロー中に細胞－細胞クロストークが最小限であったことを証明した。

【0188】

実施例１２ 異なる細胞固定溶液の試験
この実施例では、Ｋ５６２細胞を使用して、異なる固定溶液を試験した。２００万個の細胞を最初にＰＢＳで洗浄し、次いで、１～５と標識した５本のチューブに分割した。各チューブ中の細胞を、２００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。各チューブ（１～５）において、細胞ペレットを、４％ＰＦＡ、１％ＰＦＡ、０．５％ＰＦＡ、０．２５％ＰＦＡ、又はＰＢＳのいずれか１つの０．５ｍＬ中に完全に再懸濁した。次いで細胞を氷上で１０分間インキュベートした。次いで２５μｌの２％ジギトニンを各チューブの細胞に添加し、氷上で３分間インキュベートして細胞を透過処理した。透過処理後、２ｍＬのクエンチ溶液（１ＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８）、１％ＲＮａｓｅ阻害剤、１％ＢＳＡ）をチューブ１～４に加えて、細胞固定をクエンチした。２ｍＬのＰＢＳ溶液（ＰＢＳ、１％ＲＮａｓｅ阻害剤、１％ＢＳＡ）を対照としてチューブ５に添加した。次いで、細胞を、４℃で１０分間、２００ｇでの遠心分離によってペレット化し、２００μｌの再懸濁液（ＰＢＳ、１％のＲＮａｓｅ阻害剤、１％の第２の希釈剤、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）中に再懸濁した。各チューブ中の１０μｌの細胞を１０μｌのトリパンブルーと混合し、顕微鏡下でチェックした。表４に示すように、広範囲のＰＦＡ濃度（０．２５％～４％）は、固定化及び細胞透過処理後に大きな細胞塊を形成することなく非常に良好な細胞回復を示した。細胞固定がなく、ジギトニン処理を用いた対照細胞は、単一細胞が非常に少ない明らかな大きな細胞塊を形成した。これは、広範囲のＰＦＡ濃度が単一細胞研究のための細胞固定に使用され得ることを示した。

【表4】

【0189】

実施例１３ ジギトニンの滴定による異なる細胞透過処理条件の試験
この実施例では、Ｋ５６２細胞を使用して、異なる透過処理条件を試験した。２００万個の細胞を、最初にＰＢＳで洗浄し、次いで、５分間、２００ｇでの遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを、固定のために０．５ｍＬの１％ＰＦＡに完全に再懸濁した。次いで、細胞を氷上で１０分間インキュベートした。次いで、２ｍＬのクエンチ溶液（１ＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８）、１％のＲＮａｓｅ阻害剤、１％のＢＳＡ）を添加し、細胞固定をクエンチした。次いで、細胞を、４℃で１０分間、２００ｇでの遠心分離によってペレット化し、２００μｌの再懸濁液（ＰＢＳ、１％のＲＮａｓｅ阻害剤、１％の第２の希釈剤、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）中に再懸濁した。次いで、細胞をカウントし、２００，０００細胞／ｍＬの濃度で再懸濁溶液中で希釈した。各チューブ中の１０μｌの細胞を１０μｌのトリパンブルー及び２つの異なる濃度の２μｌのジギトニンと混合し、顕微鏡下でチェックした。表５に示されるように、ジギトニンを含まない細胞（試料ＩＤ３）は、トリパンブルーによってほとんど青く染色されず、１％のＰＦＡによって固定された細胞膜が、ジギトニンを添加しなかった場合に透過性ではなかったことを示している。ジギトニン（０．１％又は０．０１％）を添加すると、細胞は全てトリパンブルー（試料ＩＤ１及び２）によって青く染色され、広範な濃度のジギトニンにより細胞膜が透過性になったことを示している。

【表5】

【0190】

上記の発明は、明確な理解のために例示及び例によって多少詳しく説明されてきたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、それらの発明に対して特定の変更及び修正が行われ得ることは、容易に明らかである。

【0191】

したがって、上記は単に本発明の原理を例示するにすぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その精神及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解されるであろう。更に、本明細書に列挙された全ての例及び条件的文言は、主として本発明の原理及び発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このように具体的に列挙された例及び条件への限定ではないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態を記載する、本明細書の全ての記述、並びにそれらの具体例は、それらの構造的及び機能的等価物の両方を包含することが意図されている。更に、そのような同等物は、現在既知の同等物及び将来開発される同等物の両方、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を実施する開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示及び記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。

【0192】

関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に従って、本出願は、２０２１年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２９３，５８９号の出願日への優先権を主張し、その出願の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2025502657000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-06-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞源サブ部分の第１のセットを提供することであって、各サブ部分が、前記初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む、提供することと、
（ｂ）第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、前記第１のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第１のセットの異なるサブ部分において用いられる前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記第１の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分間では異なる、生成することと、
（ｃ）ステップｂ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成することと、
（ｄ）前記第１の細胞源プールを、第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分することと、
（ｅ）第１の識別子及び第２の識別子の両方を含む、前記第２のセットの各サブ部分における前記複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸を産生することであって、前記第２のセットの各サブ部分の前記第２の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる、産生することと、を含み、
それによって、前記初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製し、各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸が、前記核酸の前記細胞源を識別する第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを含む、方法。

【請求項2】

前記細胞源が、細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞源が、核である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞源が、透過処理される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記サブ部分の第１のセットが、２～２５，０００のサブ部分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドが、一意の分子識別子を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、リボ核酸鋳型を用いる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記リボ核酸鋳型が、ｍＲＮＡである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、準ランダムプライマー、又は遺伝子特異的プライマーを用いる、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、デオキシリボ核酸を用いる、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、ランダムプライマー、準ランダムプライマー、又は遺伝子特異的プライマーを用いる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記サブ部分の第２のセットが、２～２５，０００のサブ部分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２の識別子が、第１及び第２のサブ識別子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記第２の識別子が、第２の鎖合成反応に組み込まれる、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞源識別可能な核酸が、増幅媒介反応を使用して産生される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記細胞源識別可能な核酸が、ライゲーション媒介反応を使用して産生される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記細胞源識別可能な核酸が、タグメンテーション媒介反応を使用して産生される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記方法が、前記サブ部分の第２のセットの前記複数の細胞源を溶解することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記方法が、少なくとも１つの更なる識別子を組み込む核酸を産生するための少なくとも１つの追加のプール／分割ステップを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記方法が、前記複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを配列決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記配列決定することが、次世代配列決定を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記方法が、少なくとも細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸の前記第１及び第２の識別子に基づいて、細胞源を前記核酸コレクションに割り当てることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記細胞源が、免疫細胞源である、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記免疫細胞源が、Ｔ細胞又はその核である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記免疫細胞源が、Ｂ細胞又はその核である、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記第１及び第２のセットにおけるサブ部分の数が、同一である、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記第１及び第２のセットにおけるサブ部分の数が、異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記第２のセットにおけるサブ部分の数が、前記第１のセットにおけるサブ部分の数を超える、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

キットであって、
共通の第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを各々が含む、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物であって、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子が異なる、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物と、
複数の別個の第２の識別子核酸と、を含む、キット。

【請求項30】

前記複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物が、別個の容器内に存在する、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

前記別個の容器が、マルチウェルプレートのウェルである、請求項３０に記載のキット。

【請求項32】

所与の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の各鋳型スイッチオリゴヌクレオチドが、異なる一意の分子識別ドメインを更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項33】

前記複数の別個の第２の識別子核酸が、別個の容器内に存在する、請求項２９に記載のキット。

【請求項34】

前記別個の容器が、マルチウェルプレートのウェルである、請求項３３に記載のキット。

【請求項35】

前記第２の識別子核酸が、プライマーである、請求項２９に記載のキット。

【請求項36】

前記第２の識別子核酸が、アダプタである、請求項２９に記載のキット。

【請求項37】

前記キットが、逆転写酵素を更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項38】

前記キットが、ポリメラーゼを更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項39】

前記キットが、リガーゼを更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項40】

前記キットが、トランスポザーゼを更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項41】

前記キットが、緩衝液を更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項42】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞源サブ部分の第１のセットを提供することであって、各サブ部分が、前記初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む、提供することと、
（ｂ）第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、前記第１のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第１のセットの異なるサブ部分において用いられる前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記第１の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分間では異なる、生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成することと、
（ｄ）前記第１の細胞源プールを、前記第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分することと、
（ｅ）前記第２のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において、第２の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第２のセットの異なるサブ部分における第２の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分の各々の間では異なる、生成することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１及び第２の識別子タグ付き核酸を含む第２の細胞源プールを生成することと、
（ｇ）前記第２の細胞源プールを、前記第１及び第２の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第３のセットに配分することと、
（ｈ）第１の識別子、第２の識別子及び第３の識別子を含む、サブ部分の前記第３のセットの各サブ部分における前記複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸を産生することであって、前記第３のセットの各サブ部分の前記第３の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる、産生することと、を含み、
それによって、前記初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製し、各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸が、前記核酸の前記細胞源を識別する第１、第２及び第３の識別子の一意の組み合わせを含む、方法。

【請求項43】

ステップ（ｅ）が、前記第２の識別子を付加するために第２の鎖合成反応を使用して実行される、請求項４２に記載の方法。

【手続補正書】

【提出日】2024-12-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞源サブ部分の第１のセットを提供することであって、各サブ部分が、前記初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む、提供することと、
（ｂ）第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、前記第１のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第１のセットの異なるサブ部分において用いられる前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記第１の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分間では異なる、生成することと、
（ｃ）ステップｂ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成することと、
（ｄ）前記第１の細胞源プールを、第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分することと、
（ｅ）第１の識別子及び第２の識別子の両方を含む、前記第２のセットの各サブ部分における前記複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸を産生することであって、前記第２のセットの各サブ部分の前記第２の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる、産生することと、を含み、
それによって、前記初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製し、各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸が、前記核酸の前記細胞源を識別する第１及び第２の識別子の一意の組み合わせを含む、方法。

【請求項2】

前記細胞源が、細胞又は核である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｉ）前記細胞源が、透過処理され、
（ｉｉ）前記サブ部分の第１のセットが、２～２５，０００のサブ部分を含み、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドが、一意の分子識別子を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、リボ核酸鋳型を用い、
任意選択的に、前記リボ核酸鋳型がｍＲＮＡであり、
さらに任意選択的に、前記リボ核酸鋳型がｍＲＮＡであり、前記鋳型スイッチング媒介反応が、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、準ランダムプライマー、又は遺伝子特異的プライマーを用いる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記鋳型スイッチング媒介反応が、デオキシリボ核酸を用い、任意選択的に、前記鋳型スイッチング媒介反応がランダムプライマー、準ランダムプライマー、又は遺伝子特異的プライマーを用いる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

（ｉ）前記サブ部分の第２のセットが、２～２５，０００のサブ部分を含み、
（ｉｉ）前記第２の識別子が、第１及び第２のサブ識別子を含み、
（ｉｉｉ）前記第２の識別子が、第２の鎖合成反応に組み込まれ、
（ｉｖ）前記細胞源識別可能な核酸が、増幅媒介反応を使用して産生され、
（ｖ）前記細胞源識別可能な核酸が、ライゲーション媒介反応を使用して産生され、及び／又は、
（ｖｉ）前記細胞源識別可能な核酸が、タグメンテーション媒介反応を使用して産生される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項7】

前記方法が、
（ｉ）前記サブ部分の第２のセットの前記複数の細胞源を溶解すること、
（ｉｉ）少なくとも１つの更なる識別子を組み込む核酸を産生するための少なくとも１つの追加のプール／分割ステップ、
（ｉｉｉ）前記複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを配列決定することであって、任意選択的に、前記配列決定することが次世代配列決定を含む、配列決定すること、及び／又は、
（ｉｖ）少なくとも細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸の前記第１及び第２の識別子に基づいて、細胞源を前記核酸コレクションに割り当てること
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞源が、免疫細胞源であり、任意選択的に、
（ｉ）前記免疫細胞源が、Ｔ細胞又はその核であり、又は、
（ｉｉ）前記免疫細胞源が、Ｂ細胞又はその核である、
請求項１又は２に記載の方法。

【請求項9】

前記第１及び第２のセットにおけるサブ部分の数が、同一である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項10】

前記第１及び第２のセットにおけるサブ部分の数が異なり、任意選択的に、前記第２のセットにおけるサブ部分の数が前記第１のセットにおけるサブ部分の数を超える、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項11】

キットであって、
共通の第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを各々が含む、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物であって、異なる鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの第１の識別子が異なる、複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物と、
複数の別個の第２の識別子核酸と、
を含み、
任意選択的に、前記複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物が別個の容器内に存在し、
さらに任意選択的に、前記複数の別個の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物が別個の容器内に存在し、前記別個の容器がマルチウェルプレートのウェルである、キット。

【請求項12】

（ｉ）所与の鋳型スイッチオリゴヌクレオチド組成物の各鋳型スイッチオリゴヌクレオチドが、異なる一意の分子識別ドメインを更に含み、
（ｉｉ）前記複数の別個の第２の識別子核酸が別個の容器内に存在し、任意選択的に、前記別個の容器がマルチウェルプレートのウェルであり、
（ｉｉｉ）前記第２の識別子核酸が、プライマーであり、及び／又は、
（ｉｖ）前記第２の識別子核酸が、アダプタである、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

前記キットが、
（ｉ）逆転写酵素、
（ｉｉ）ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）リガーゼ、
（ｉｖ）トランスポザーゼ、及び／又は、
（ｖ）緩衝液
を更に含む、請求項１１又は１２に記載のキット。

【請求項14】

初期の複数の細胞源に由来する複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞源サブ部分の第１のセットを提供することであって、各サブ部分が、前記初期の複数の細胞源のうちの複数の細胞源を含む、提供することと、
（ｂ）第１の識別子を含む鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いる鋳型スイッチング媒介反応を使用して、前記第１のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において第１の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第１のセットの異なるサブ部分において用いられる前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記第１の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分間では異なる、生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１の識別子タグ付き核酸を含む第１の細胞源プールを生成することと、
（ｄ）前記第１の細胞源プールを、前記第１の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第２のセットに配分することと、
（ｅ）前記第２のセットの各サブ部分の前記複数の細胞源において、第２の識別子タグ付き核酸を生成することであって、前記第２のセットの異なるサブ部分における第２の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、前記異なるサブ部分の各々の間では異なる、生成することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）で産生された前記サブ部分の前記細胞源をプールして、第１及び第２の識別子タグ付き核酸を含む第２の細胞源プールを生成することと、
（ｇ）前記第２の細胞源プールを、前記第１及び第２の識別子タグ付き核酸を含む複数の細胞源を各々が含むサブ部分の第３のセットに配分することと、
（ｈ）第１の識別子、第２の識別子及び第３の識別子を含む、サブ部分の前記第３のセットの各サブ部分における前記複数の細胞源から細胞源識別可能な核酸を産生することであって、前記第３のセットの各サブ部分の前記第３の識別子が、所与のサブ部分内では同一であるが、異なるサブ部分間では異なる、産生することと、を含み、
それによって、前記初期の複数の細胞源からの複数の細胞源識別可能な核酸コレクションを調製し、各細胞源識別可能な核酸コレクションの核酸が、前記核酸の前記細胞源を識別する第１、第２及び第３の識別子の一意の組み合わせを含む、方法。

【請求項15】

ステップ（ｅ）が、前記第２の識別子を付加するために第２の鎖合成反応を使用して実行される、請求項１４に記載の方法。

【国際調査報告】