特表 2025-502710 タンパク質配列修飾についての情報を抽出する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-28

(54)【発明の名称】タンパク質配列修飾についての情報を抽出する方法

(51)【国際特許分類】

   G16B 30/10 20190101AFI20250121BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20250121BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 1/12 20060101ALI20250121BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20250121BHJP

   C12N 9/66 20060101ALN20250121BHJP

   C12N 9/76 20060101ALN20250121BHJP

【ＦＩ】

G16B30/10

G01N27/62 V ZNA

G01N27/62 D

G01N33/68

C07K1/12

C12N9/50

C12N9/66

C12N9/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537871

(86)(22)【出願日】2022-12-23

(85)【翻訳文提出日】2024-07-31

(86)【国際出願番号】 EP2022087710

(87)【国際公開番号】W WO2023118561

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】21217437.9

(32)【優先日】2021-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ビュトナー マルク アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】フィヒトル ユルゲン

(72)【発明者】

【氏名】フォシカ エヴァ

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041FA13

2G041GA09

2G041HA01

2G041JA02

2G041LA08

2G045AA34

2G045DA36

2G045FA34

2G045FB01

2G045FB06

2G045JA03

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA22

(57)【要約】

タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出する方法が開示される。少なくとも２つの酵素消化に由来するペプチドに実施された質量分析測定から導出されたタンパク質データが受け取られる。候補配列修飾が特定される。残りの候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す、候補配列修飾のサブセットが決定される。候補配列修飾のサブセットの決定は、それぞれが修飾を含有する少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出するコンピュータ実装方法であって、
タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された少なくとも２つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から少なくとも部分的に導出されるタンパク質データを受け取ること；
前記受け取ったタンパク質データを使用して、前記タンパク質における候補配列修飾を特定すること；
残りの前記候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す前記候補配列修飾のサブセットを決定すること；および
候補配列修飾の前記決定されたサブセットを表すデータを出力すること
を含み、
候補配列修飾の前記サブセットの前記決定が、
それぞれが前記修飾を含有する少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に前記候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程
を含む、
前記コンピュータ実装方法。

【請求項2】

各ペプチド種が、少なくとも以下：
ｉ）アミノ酸配列；
ｉｉ）前記ペプチド種を生成した前記酵素消化；ならびに
ｉｉｉ）候補修飾が存在するか否かを示す修飾状態、および候補修飾が存在する場合、前記修飾の性質およびアミノ酸配列位置
により規定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

各ペプチド種が、以下：
ｉｖ）前記質量分析測定における電荷状態
によりさらに規定される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ペプチド種の選択されたサブセットに関連するデータを特定するために、前記タンパク質データを前処理すること、および候補配列修飾の前記サブセットの前記決定における使用から、ペプチド種の前記選択されたサブセットを除外すること、
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記前処理が、
ａ）ある候補修飾が存在する、およびｂ）同じアミノ酸配列を有するが前記候補修飾を有さない対応するペプチド種の前記質量分析測定における最高の強度が既定の閾値強度未満である、ペプチド種
を除外することを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記前処理が、
ａ）ある候補修飾が存在する、およびｂ）同じアミノ酸配列を有するが前記候補修飾を有さない対応するペプチド種の前記質量分析測定における最高精度スコアが既定の閾値スコア未満である、ペプチド種
を除外することを含み、
前記精度スコアは、前記質量分析測定における理論的断片と観察された断片とのマッチングの程度を表す、
請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

前記前処理が、
前記ペプチド種を生成した前記酵素消化の切断部位に候補修飾を有する各ペプチド種を除外すること；および／または
既定の閾値長さを超える長さを有するペプチド種を除外すること
を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

候補配列修飾の前記サブセットの前記決定が、
それぞれが前記修飾を含有し、かつ異なる酵素消化を使用して得られたペプチドから誘導された少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に前記候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

候補配列修飾の前記サブセットの前記決定が、
前記アミノ酸配列位置をカバーしかつ前記候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、前記アミノ酸配列位置をカバーしかつ前記候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比が既定の閾値比以上であるアミノ酸配列位置に前記候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出するコンピュータ実装方法であって、
タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された少なくとも２つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から少なくとも部分的に導出されるタンパク質データを受け取ること；
前記受け取ったタンパク質データを使用して、前記タンパク質における候補配列修飾を特定すること；
残りの前記候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す前記候補配列修飾のサブセットを決定すること；および
候補配列修飾の前記決定されたサブセットを表すデータを出力すること
を含み、
候補配列修飾の前記サブセットの前記決定が、
前記アミノ酸配列位置をカバーしかつ前記候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、前記アミノ酸配列位置をカバーしかつ前記候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比が既定の閾値比以上であるアミノ酸配列位置に前記候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程
を含む、
前記コンピュータ実装方法。

【請求項11】

前記既定の閾値比が２～１０％の範囲である、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

候補配列修飾の前記サブセットの前記決定が、
前記候補配列修飾が定量化条件を満たすことに依存して候補配列修飾を選択する工程
を含み、
前記候補配列修飾を有するペプチド種の少なくとも選択されたサブセットの前記質量分析測定により検出された量が、前記候補配列修飾を有するおよび有さない同じペプチド種の前記質量分析測定により検出された総量と比べて既定の定量化閾値を超えることを、前記定量化条件が示す、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出するコンピュータ実装方法であって、
タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された少なくとも２つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から少なくとも部分的に導出されるタンパク質データを受け取ること；
前記受け取ったタンパク質データを使用して、前記タンパク質における候補配列修飾を特定すること；
残りの前記候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す前記候補配列修飾のサブセットを決定すること；および
候補配列修飾の前記決定されたサブセットを表すデータを出力すること
を含み、
候補配列修飾の前記サブセットの前記決定が、
前記候補配列修飾が定量化条件を満たすことに依存して候補配列修飾を選択する工程
を含み、
前記候補配列修飾を有するペプチド種の少なくとも選択されたサブセットの前記質量分析測定により検出された量が、前記候補配列修飾を有するおよび有さない同じペプチド種の前記質量分析測定により検出された総量と比べて既定の定量化閾値を超えることを、前記定量化条件が示す、
前記コンピュータ実装方法。

【請求項14】

前記選択されたサブセットが、前記少なくとも２つの異なる酵素消化のうちの複数またはすべてに由来する複数またはすべてのペプチド種を含む、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも２つの異なる酵素消化が、１つまたは複数の配列特異的酵素消化および１つまたは複数の非特異的酵素消化を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

少なくとも、配列特異的酵素消化を使用して誘導された少なくとも１つのペプチド種によりカバーされる候補配列修飾のために、前記１つまたは複数の非特異的酵素消化を使用して誘導されたペプチド種を除外するように、前記ペプチド種の前記選択されたサブセットが選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

配列特異的酵素消化を使用して誘導された少なくとも１つのペプチド種によりカバーされない候補配列修飾のために、前記１つまたは複数の非特異的酵素消化を使用して誘導されたペプチド種を含むように、ペプチド種の前記選択されたサブセットが選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記配列特異的酵素消化が、以下：トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣのうちの１つまたは複数を含む、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記非特異的酵素消化が、以下：サーモリシン、エラスターゼ、プロナーゼ、プロアラナーゼ、ペプシン、キモトリプシンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記質量分析測定が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析を含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

各ペプチド種において、前記質量分析測定により検出された前記量が、
前記ペプチド種に対応する、前記質量分析測定における時間強度曲線部分下面積；または
前記ペプチド種に対応する、前記質量分析測定における時間強度曲線部分の最大値
として規定される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

各酵素消化が、以下：トリプシン；サーモリシン；ＡｓｐＮ；エラスターゼ；キモトリプシン；ＬｙｓＣ；ＬｙｓＮ；ＧｌｕＣ；ＡｒｇＣ；プロナーゼ；ペプシン；プロアラナーゼのうちの異なる１つまたは組合せを使用する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記受け取ったタンパク質データが、前記タンパク質の前記代表的な試料の各々の副次試料に実施された５または６つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から導出され、好ましくは前記５または６つの酵素消化がそれぞれ、以下：トリプシン、サーモリシン、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼのうちの異なる１つを使用する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記受け取ったタンパク質データにおけるペプチド種の１つまたは複数の群を特定することであって、ペプチド種の各群が、すべて同じ候補配列修飾を有するペプチド種のみを含有し、前記候補配列修飾が、候補配列修飾の前記決定されたサブセットの中にあり、各群で異なっている、前記特定すること；および
ペプチド種が、前記特定された群のそれぞれにあることを表すデータを出力すること
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

コンピュータプログラム、または前記コンピュータプログラムを担持するコンピュータ可読媒体もしくはデータキャリヤシグナルであって、
前記コンピュータプログラムが、前記プログラムがコンピュータにより実行されると前記請求項のいずれか一項に記載の前記方法を前記コンピュータに行わせる命令を含む、
前記コンピュータプログラム、または前記コンピュータプログラムを担持するコンピュータ可読媒体もしくはデータキャリヤシグナル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出することに関する。

【背景技術】

【0002】

複雑な生物工学的製造方法は、治療用タンパク質に様々な修飾を導入して、潜在的に高度に不均一な産物をもたらし得る。位置およびタイプに応じて、これらの修飾は、タンパク質の構造、安定性、免疫原性および生物活性に著しい影響を及ぼすことがある。よって、治療用タンパク質の広範囲な特徴づけが、安全および有効な医薬を患者に提供するための基礎である。

【0003】

治療用タンパク質における修飾を特定するために頻繁に使用される技術は、クロマトグラフィーペプチド分離および質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせたタンパク質分解性消化である。タンパク質分解酵素のトリプシンは、この手法の至適基準である。キモトリプシン、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、およびＡｒｇＣなどの他のプロテアーゼもプロテオミクスに使用されるが、その程度は低い。平行または順次タンパク質分解性消化の組合せの利用を介して配列カバレージを最大にするため、多酵素戦略が提案されている。

【0004】

これらの手法は、大量の質量分析（ＭＳ）データを導き出す。このことは、配列バリアント（ＳＶ）の存在を探す場合にとりわけ当てはまる。ＳＶは、タンパク質の一次構造におけるアミノ酸置換を表し、これは突然変異および取り込み誤りによって起こり得る。ＭＳ生データにおいてＳＶを特定するため、Ｍａｓｃｏｔ Ｅｒｒｏｒ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）またはＢｙｏｎｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）などの特別なソフトウエアを用いてもよい。これらのソフトウエアソリューションは、予測外の質量シフトを特定することができ、これらの質量シフトを修飾または配列バリアントとしてアノテートすることができる。

【0005】

ペプチド配列内の各アミノ酸のＳＶについて多数の可能性が存在するので、ソフトウエアＭＳ／ＭＳアルゴリズム（「偽陽性ヒット」）により特定されたランダムマッチの可能性は、化学修飾またはグリカンなどの翻訳後修飾（ＰＴＭ）における通常のデータベース検索と比較して高い。

【0006】

多数の偽陽性から真陽性を区別することは難題である。この検証方法は、現在手動で実施されており、完了するまで数日間または数週間までかかる可能性があり、また人的誤差も被りやすい。

【0007】

典型的な配列バリアント分析実験では、試料調製、ＬＣ－Ｍ／ＭＳ機器による試料分析、およびソフトウエア検索は、およそ２～３日間かかる。しかし、保持時間、質量精度およびＭＳ／ＭＳスペクトルなどの様々な基準を調べることによる後続の手動式「ヒット検証」は、数日間または数週間もかかることがある。

【0008】

タンパク質配列修飾、例えばＳＶについての情報を抽出する改善された方法を提供することが、本発明の目的である。

【発明の概要】

【0009】

本発明の一態様によると、タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出するコンピュータ実装方法であって、タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された、少なくとも２つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から少なくとも部分的に導出されるタンパク質データを受け取ること；受け取ったタンパク質データを使用して、タンパク質における候補配列修飾を特定すること；残りの候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す候補配列修飾のサブセットを決定すること；および候補配列修飾の決定されたサブセットを表すデータを出力することを含み、候補配列修飾のサブセットの決定が、それぞれが修飾を含有する少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程を含む、前記コンピュータ実装方法が提供される。

【0010】

よって、コンピュータ自動化手順を介し、それにより人的労力／時間を節約する、および／または誤差を低減することにより正確になる可能性が高い、候補配列修飾のサブセットを特定する方法が提供される。少なくとも２つの異なる酵素消化により得られるペプチドからタンパク質データを受け取ることは、タンパク質配列の信頼性の高いカバレージを増加し、下記に説明されているように、偽陽性をさらに低減し得るさらなるフィルタリング条件の土台を提供する。

【0011】

一実施形態において、候補配列修飾のサブセットの決定は、アミノ酸配列位置をカバーしかつ候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、アミノ酸配列位置をカバーしかつ候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比が既定の閾値比以上であるアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程を含む。この基準は、対応する修飾ペプチド種が対応する非修飾（野生型）ペプチド種と比較して相対的にまれに起こすペプチド種における候補修飾を除外する。本発明者たちは、このフィルタリング手法が偽陽性の低減に有効であることを見出した。

【0012】

一実施形態において、本方法は、ペプチド種の選択されたサブセットに関連するデータを特定するために、タンパク質データを前処理すること、および候補配列修飾のサブセットの決定における使用から、ペプチド種の選択されたサブセットを除外することを含む。前処理は、性能をさらに改善する。

【0013】

前処理は、ａ）ある候補修飾が存在する、およびｂ）同じアミノ酸配列を有するが候補修飾を有さない対応するペプチド種（「野生型」）の質量分析測定における最高の強度が既定の閾値強度未満である、ペプチド種、を除外することを含んでもよい。このフィルタリング手法は、一部のペプチドが物理化学的特性のために他より強度が低く、それがこれらの対応する配列によって規定されるという認識に基づいている。そのような配列への修飾は、典型的にはイオン化特性を完全に変化させることはない。よって、低強度「野生型」は、低強度（したがって、相対的に信頼性を欠いて特定された）修飾ペプチドに関連する傾向がある。したがって、後続分析からそのようなペプチド種を除外することは、偽陽性を有効に低減することに寄与する。

【0014】

前処理は、ａ）ある候補修飾が存在する、およびｂ）同じアミノ酸配列を有するが候補修飾を有さない対応するペプチド種の質量分析測定における最高精度スコアが既定の閾値スコア未満である、ペプチド種、を除外することを含んでもよい。精度スコアは、質量分析測定における理論的断片と観察された断片とのマッチングの程度を表す。このフィルタリング手法は、野生型ペプチド種の低精度スコアが、修飾を有する各々のペプチド種から得た情報が相対的に信頼性に欠けることを示すという認識に基づいている。したがって、後続分析からそのようなペプチド種を除外することは、偽陽性を有効に低減することに寄与する。

【0015】

前処理は、ペプチド種を生成した酵素消化の切断部位に候補修飾を有する各ペプチド種を除外することを含んでもよい。このフィルタリング手法は、修飾が酵素の消化行動に影響を及ぼすことがあり、これは、修飾の位置に対応する開始または終了点を有するペプチド種が、その修飾を検出するために最適ではないことを意味するという認識に基づいている。したがって、後続分析からこれらのペプチド種を除外することは、偽陽性を低減することに寄与する。

【0016】

前処理は、既定の閾値長さを超える長さを有するペプチド種を除外することを含んでもよい。このフィルタリング手法は、長いペプチド種に特定された修飾が、検証することが一般により困難であり、したがって信頼性が低いという認識に基づいている。したがって、既定の閾値長さより長いペプチド種を除外することは、偽陽性を低減するために有効である。

【0017】

一実施形態において、候補配列修飾のサブセットの決定は、それぞれが修飾を含有し、かつ異なる酵素消化を使用して得られたペプチドから誘導された少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補修飾を選択する工程を含む。本発明者たちは、この手法が偽陽性の除去に極めて有効であることを見出した。

【0018】

本発明のさらなる態様によると、タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出するコンピュータ実装方法であって、タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された少なくとも２つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から少なくとも部分的に導出されるタンパク質データを受け取ること；受け取ったタンパク質データを使用して、タンパク質における候補配列修飾を特定すること；残りの候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す候補配列修飾のサブセットを決定すること；および候補配列修飾の決定されたサブセットを表すデータを出力することを含み、候補配列修飾のサブセットの決定が、アミノ酸配列位置をカバーしかつ候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、アミノ酸配列位置をカバーしかつ候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比が既定の閾値比以上であるアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程を含む、前記コンピュータ実装方法が提供される。

【0019】

よって、コンピュータ自動化手順を介し、それにより人的労力／時間を節約する、および／または誤差を低減することにより正確になる可能性が高い、候補配列修飾のサブセットを特定する方法が提供される。確定比に従って候補修飾を除外することは、対応する修飾ペプチド種が対応する非修飾（野生型）ペプチド種と比較して相対的にまれに起こす候補修飾を除外する。本発明者たちは、このフィルタリング手法が偽陽性の低減に有効であることを見出した。

【0020】

一部の実施形態において、受け取ったタンパク質データは、タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された５または６つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から導出され、好ましくは５または６つの酵素消化はそれぞれ、以下：トリプシン、サーモリシン、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ（ＰｒｏＡｌａｎａｓｅ）のうちの異なる１つを使用する。本発明者たちは、これらの特定の回数の消化が、僅かな偽陽性に対する高い感度の有利なバランスを提供することを見出した。

【0021】

一部の実施形態において、本方法は、受け取ったタンパク質データにおけるペプチド種の１つまたは複数の群を特定することであって、ペプチド種の各群が、すべて同じ候補配列修飾を有するペプチド種のみを含有し、候補配列修飾が、候補配列修飾の決定されたサブセットの中にあり、各群で異なっている、前記特定すること；およびペプチド種が、特定された群のそれぞれにあることを表すデータを出力すること、をさらに含む。すべて同じ候補配列修飾を有するペプチド種の群を特定することは、ユーザーに情報をより組織的に提示することを可能にし、候補配列修飾の効率的な査定を促進する。この手法は、異なるペプチド種において同じ候補配列修飾をユーザーが複数回査定する二度手間を回避することを助ける。

【0022】

本発明のさらなる態様によると、タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出するコンピュータ実装方法であって、タンパク質の代表的な試料の各々の副次試料に実施された少なくとも２つの異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から少なくとも部分的に導出されるタンパク質データを受け取ること；受け取ったタンパク質データを使用して、タンパク質における候補配列修飾を特定すること；残りの候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す、候補配列修飾のサブセットを決定すること；および候補配列修飾の決定されたサブセットを表すデータを出力することを含み、候補配列修飾のサブセットの決定が、候補配列修飾が定量化条件を満たすことに依存して候補配列修飾を選択する工程を含み、候補配列修飾を有するペプチド種の少なくとも選択されたサブセットの質量分析測定により検出された量が、候補配列修飾を有するおよび有さない同じペプチド種の質量分析測定により検出された総量と比べて既定の定量化閾値を超えることを、定量化条件が示す、前記コンピュータ実装方法が提供される。

【0023】

よって、コンピュータ自動化手順を介し、それにより人的労力／時間を節約する、および／または誤差を低減することにより正確になる可能性が高い、候補配列修飾のサブセットを特定する方法が提供される。定量化条件が満たされるか否かに基づいて候補修飾を除外することは、偽陽性を低減するために特に有効であることが見出された。

【0024】

一実施形態において、少なくとも２つの異なる酵素消化は、１つまたは複数の配列特異的酵素消化および１つまたは複数の非特異的酵素消化を含み、少なくとも、配列特異的酵素消化を使用して誘導された少なくとも１つのペプチド種によりカバーされる候補配列修飾のために、１つまたは複数の非特異的酵素消化を使用して誘導されたペプチド種を除外するように、ペプチド種の選択されたサブセットが選択される。配列特異的酵素消化に由来するペプチド種を優先的または独占的に考慮すると、特に高い性能を提供し、偽陽性のさらなる低減を可能にすることが見出された。

【0025】

本開示の実施形態は、添付の図面を参照しながら単なる例としてさらに記載される。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】タンパク質配列についての情報を抽出する方法を描写するフローチャートである。

【図2】異なる消化に由来するペプチド種によるタンパク質配列の一部分のカバレージを概略的に描写する。

【図3】本開示の方法の性能を実証するデータを示す。図３は実際の産物開発プロジェクトの試料に基づいている。

【図4】本開示の方法の性能を実証するデータを示す。図４は、配列差異の公知の量を試料中に恣意的に「スパイク」して人工的に生成された試料に基づいている。

【図5】本開示の方法の性能を実証するデータを示す。図５は、配列差異の公知の量を試料中に恣意的に「スパイク」して人工的に生成された試料に基づいている。

【図6】本開示の方法の性能を実証するデータを示す。図６は、配列差異の公知の量を試料中に恣意的に「スパイク」して人工的に生成された試料に基づいている。

【図7】本開示の方法の性能を実証するデータを示す。図７は、配列差異の公知の量を試料中に恣意的に「スパイク」して人工的に生成された試料に基づいている。

【図8】本開示の方法の性能を実証するデータを示す。図８は、配列差異の公知の量を試料中に恣意的に「スパイク」して人工的に生成された試料に基づいている。

【図9】異なる消化および電荷状態の候補修飾を有するおよび有さないペプチド種の試料の検出量の例を概略的に描写する。

【図10】配列差異の公知の量を試料中に恣意的に「スパイク」して人工的に生成された試料を使用して導出されたデータである、定量化閾値を使用した、本開示の方法の性能を実証しているデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本開示の様々な実施形態は、コンピュータ実装されている方法に関する。本開示の方法の各工程は、用語の最も一般的な意味におけるコンピュータにより実施することができ、これは、専用デジタル回路を含む本方法のデータ処理工程を実施することができる任意の装置を意味する。コンピュータは、例えば、ＣＰＵ、ＲＡＭ、ＳＳＤ、マザーボード、ネットワークコネクション、ファームウエア、ソフトウエアを含む公知のコンピュータエレメント、および／またはコンピュータに必要な計算動作を実施させる当該技術に公知の他のエレメントの様々な組合せを含むことができる。必要な計算動作は、１つまたは複数のコンピュータプログラムにより規定され得る。１つまたは複数のコンピュータプログラムは、媒体またはデータキャリヤ、任意選択で、コンピュータ可読命令を記憶する非一時的媒体の形態で提供され得る。コンピュータ可読命令がコンピュータにより読み取られると、コンピュータは必要な方法工程を実施する。コンピュータは、自己完結型ユニット、例えば、汎用デスクトップコンピュータ、ラップトップ、タブレット、移動電話、または他のスマートデバイスからなり得る。あるいは、コンピュータは、インターネットまたはイントラネットなどのネットワークを介して互いに接続されている、複数の異なるコンピュータを有する分配型計算システムからなり得る。

【0028】

本開示の実施形態は、タンパク質におけるタンパク質配列修飾についての情報を抽出することに関する。例示的な方法の枠組みは、図１に概略的に描写され、下記に記載されている。

【0029】

方法は、分析されるタンパク質の代表的な試料の準備から始まる（工程Ｓ１）。タンパク質は、例えば、治療用タンパク質であり得る。試料は、当該技術に公知の様々な任意の形態で提供され得る。例えば、典型的なタンパク質試料は、細胞培養の上清から直接得てもよく、細胞破棄により、細菌細胞の封入体の可溶化および復元により、または組織からの抽出により回収してもよい。試料は、また、さらなる機械的または化学的精製工程、例えば、濾過、ダイアフィルトレーション、透析、遠心分離、沈殿、またはクロマトグラフィーに付されてもよい。一態様において、タンパク質試料は、本質的の他のタンパク質を含まず、すなわち、２０％未満、任意選択で１０％未満、任意選択で５％未満、任意選択で２％未満、任意選択で１％未満、任意選択で０．５％未満、任意選択で０．２％未満の他のタンパク質を含有する。典型的に、およそ３００～５００μｇの試料が準備され得る。

【0030】

試料は、最初に単一試料として処理され得る。例えば、試料は、一般的な消化（工程Ｓ２）、例えば、ＰＮＧアーゼを使用する酵素脱グリコシル化に付されてもよい。ペプチドパターンの翻訳をより困難にするさらなる断片をもたらすので、グリカンを除去することが望ましいこともある。

【0031】

工程Ｓ３では、代表的な試料が副次試料に分けられ、各副次試料が異なる酵素消化に付される。各消化は、異なる酵素または酵素の異なる組合せを使用する。他の条件も、異なる消化の間で変動することがあり、例えば、停止されるまで消化過程を進行させる時間である。典型的には、各消化は単一酵素を使用するが、単一の副次試料における酵素の組合せの使用は、時には適切であり得る（例えば、後続質量分析工程に好適な長さのペプチドを得るために）。本開示の配置では、少なくとも２つの異なる酵素消化が使用される（２つの対応する副次試料に対して）。一部の配置において、酵素消化の数は多く、例えば、少なくとも３つ、任意選択で少なくとも４つ、任意選択で少なくとも５つ、任意選択で少なくとも６つ、任意選択で少なくとも７つ、任意選択で少なくとも８つ、任意選択で少なくとも９つである。１つの配置において、酵素消化の数は、５～９つ、好ましくは５または６つである。異なる消化による副次試料の処理は、「消化１」、「消化２」などと標識されたボックスによって図１に概略的に描写されている。原則として、任意の数Ｎのそのような消化が実施され得る。

【0032】

各酵素消化は、以下：トリプシン；サーモリシン；ＡｓｐＮ；エラスターゼ；キモトリプシン；ＬｙｓＣ；ＬｙｓＮ；ＧｌｕＣ；ＡｒｇＣ；プロナーゼ；ペプシン；プロアラナーゼのうちの異なる１つまたは組合せを使用する。１つの特定の実施形態では、以下の９つの消化のすべてが使用される：トリプシンのみ；サーモリシンのみ；ＡｓｐＮのみ；エラスターゼのみ；キモトリプシンのみ；ＬｙｓＣ＋ＧｌｕＣ（例えば、１：２０の比）の組合せ；プロナーゼのみ；ペプシンのみ；プロアラナーゼのみ。消化は、例えば使用される酵素に応じて、０．５時間～４時間進行させることが可能であり得る。

【0033】

各消化に使用される酵素は、プロテアーゼのクラスに属し、タンパク質分解を駆動し、これは、ペプチド結合を切断してより小さなポリペプチドにすることによるタンパク質の分解である。切断の位置は、消化されるタンパク質および存在する酵素または酵素の組合せによって決まる。よって、各消化はペプチド種の異なる集団を生じる。

【0034】

工程Ｓ４において、消化により得られたペプチドは、質量分析測定により処理される。個別の消化の出力は、互いに別々に、または組み合わされて処理され得る。図１に示されている例では、消化１の出力（消化１を副次試料に適用して得られたペプチド）が第１の質量分析方法ＭＳにより処理される、消化２の出力（消化２を副次試料に適用して得られたペプチド）が第２の質量分析方法ＭＳにより処理される、等々である。一部の配置において、各質量分析方法は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を含む。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ペプチド種を分析するための周知の分析化学技術である。液体クロマトグラフィーカラムは、質量分析システムのイオン源と接続されており、このことは、液体クロマトグラフィーにより分離された試料の成分が質量分析システムに直接供給されることを可能にする。ペプチドｍ／ｚシグナルに対応する配列情報を得るため、質量分析システムは、タンデムモード（ＭＳ／ＭＳ）で作動して、試料組成についての広範囲な情報を獲得する。液体クロマトグラフィーカラムから受け取った成分はイオン化され、続いて第１質量分析計において質量対電荷比に従って分離される。次いで、分離されたイオンは、より小さな断片イオンに分割され、これはペプチド断片と称されることもある。ペプチド断片は、第２の質量分析計の作動により（例えば、同じまたは異なる質量分析計のいずれかによる第２の質量分析工程により）分離され、検出される。

【0035】

以降の工程Ｓ５は、コンピュータ実装され得る。

【0036】

コンピュータ実装工程において、各ペプチド種は、少なくとも以下：ｉ）アミノ酸配列；ｉｉ）ペプチド種を生成した酵素消化；ならびにｉｉｉ）候補修飾が存在するか否かを示す修飾状態、および候補修飾が存在する場合、修飾の性質およびアミノ酸配列位置、により規定され得る。一部の配置において、各ペプチド種は、ｉｖ）質量分析測定における電荷状態によりさらに規定される。

【0037】

工程Ｓ５では、工程Ｓ４の質量分析測定から少なくとも部分的に導出されたタンパク質データが受け取られる。よって、タンパク質データは、各々の副次試料に適用された異なる酵素消化により得られたペプチドに実施された質量分析測定から導出される。タンパク質データは、この方法で分析されたペプチドについての情報を表す、当該技術に公知の様々な形態のいずれかを取ることができる。例えば、タンパク質データは、測定されたペプチド（ＭＳ）またはペプチド断片（ＭＳ／ＭＳ）の質量を、修飾を有するおよび有さない対応するペプチド種の予測理論値と比較することによって得られる情報を含んでもよい。Ｍａｓｃｏｔ Ｅｒｒｏｒ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）またはＢｙｏｎｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）などの特別なソフトウエアを用いてもよい。これらのソフトウエアソリューションは、予測外の質量シフトを特定することができ、これらの質量シフトを配列修飾としてアノテートすることができる。

【0038】

工程Ｓ６では、工程Ｓ５から受け取ったタンパク質データを使用して、タンパク質における候補配列修飾を特定する。これは、タンパク質データを分析して、予想外の質量シフトが候補配列修飾であると特定することによって達成され得る、またはタンパク質データは、上述されたように、この情報が既にアノテートされていることがある。得られた候補配列修飾は、通常、妥当性について手動により検討して調べる必要がある（すなわち、偽陽性の数を低減するために）。下記に記載されている本方法の工程は、手動による検討を自動的な検討に置き換える、または手動による検討が必要な候補修飾の数を大きく低減する。

【0039】

工程Ｓ７では、残りの候補配列修飾よりも高い平均確率で真性配列修飾を表す、候補配列修飾のサブセットが決定される。決定されたサブセットは、このように真性修飾である可能性が高い修飾のリストを表す。リストは、コンピュータ実装工程を介して得られ、よって、手動による検討の必要性を低減または回避する。リストは、ユーザー選択に従ったユーザーへの出力（工程Ｓ８）であり得る（例えば、出力データストリームもしくはファイルとして、またはコンピュータディスプレイ上の指示として）。候補配列修飾のサブセットの決定は、ペプチド種（消化により誘導されたペプチドの）によるアミノ酸位置のカバレージに基づいた、任意選択で異なる酵素消化に由来するペプチド種によるカバレージに基づいたフィルタリングを含む。

【0040】

タンパク質配列の例示的セグメントのアミノ酸位置のカバレージが、図２に概略的に描写されている。ここで、配列（１０と標識された）の下方の水平線は、異なるペプチド種を表す。ペプチド種は、これらを得るためにどの酵素消化が使用されたかに従って、群１１～１７に群分けされている。よって、群１１は、第１の酵素消化を使用して得られたペプチド種の部分を示す、群１２は、第２の酵素消化を使用して得られたペプチド種の部分を示す、群１３は、第３の酵素消化を使用して得られたペプチド種の部分を示す、等々である。分かるように、異なるペプチド種によるカバレージは、アミノ酸配列１０に沿った位置に従って変わる。位置Ａでは、例えば、カバレージは、群１１、１２、１３、１６および１７のペプチド種により提供され（群１４および１５はカバレージがない）、一方、位置Ｂでは、カバレージは、群１１～１５および１７のペプチド種により提供される（群１６はカバレージがない）。

【0041】

配置において、工程Ｓ７のサブセットの決定は、それぞれが修飾を含有する（少なくとも２つの酵素消化により得られたペプチドから誘導された）少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択することを含む。よって、修飾を有する十分に多い数の異なるペプチド種（同じまたは異なる消化に由来する）によりカバーされていない位置における候補配列修飾が、除外される。よって、決定工程Ｓ７は、対応する配列位置が、ペプチド種によりどのようにカバーされているかに少なくとも基づいて、候補修飾を除外するフィルタとして作用する。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「ｎｏＰｅｐ」と称される。多くの異なるペプチド種における同じ修飾の観察は、修飾が真性修飾であるより高い可能性を示す。よって、単一のペプチド種（または少数の異なるペプチド種）のみが存在する修飾の除去は、偽陽性（すなわち、真性ではない候補配列修飾）を効率的に低減する。このフィルタリング手法の有効性は、下記に記載されている図４および５に示されているデータによって実証されている。下記に記載されているように、工程Ｓ７は、他の除外基準に基づいてフィルタを追加的に含んでもよい。

【0042】

異なるペプチド種によるカバレージに基づいたフィルタリングをより厳格にすることができ、それによって偽陽性の除外を増加することができる。最適なバランスは、偽陽性を除外する信頼性と真陽性の除外の回避または最小化との間で取られてもよい。一部の配置では、フィルタリングを強化して、修飾を有する少なくとも３つ、任意選択で少なくとも４つ、任意選択で少なくとも５つ、任意選択で少なくとも６つの異なるペプチド種によりカバーされていない候補配列修飾を除外する。そのような強化フィルタリングの効果が、図５Ｂに示されている。

【0043】

一部の実施形態において、工程Ｓ７のサブセットの決定は、それぞれが修飾を含有し、かつ異なる酵素消化を使用して得られたペプチドから誘導された少なくとも２つの異なるペプチド種によりカバーされているアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択することを含む。よって、少なくとも２つの異なる酵素消化に由来するペプチド種によりカバーされていない位置の候補配列修飾が、除外される。よって、決定工程Ｓ７は、対応する配列位置が、異なる酵素消化に由来するペプチド種によりどのようにカバーされているかに少なくとも基づいて、候補修飾を除外するフィルタとして作用する。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「消化の数」と称される。この手法は、偽陽性の除去に極めて有効であり、それは、そのような偽陽性が主にランダムに起こり、多数の異なる消化により生成されたペプチド種に存在する可能性が低いからである。他方、真陽性は、異なる酵素により生成されたペプチドに見られる。このフィルタリング手法の有効性は、下記に記載されている図３に示されているデータによって実証されている。

【0044】

異なる酵素消化によるカバレージに基づいたフィルタリングをより厳格にすることができ、それによって偽陽性の除外を増加することができる。最適なバランスは、偽陽性を除外する信頼性と真陽性の除外の回避または最小化との間で取られてもよい。一部の配置では、フィルタリングを強化して、少なくとも３つ、任意選択で少なくとも４つ、任意選択で少なくとも５つの異なる酵素消化を有するペプチド種によりカバーされていない候補配列修飾を除外する。そのような強化フィルタリングの効果が、図５Ａに示されている。

【0045】

工程Ｓ７の前の前処理
一部の配置において、タンパク質データは、工程Ｓ７の分析の前に前処理される。タンパク質データの前処理は、ペプチド種の選択されたサブセットに関連するデータを特定すること、および工程Ｓ７の候補配列修飾のサブセットの決定における使用から、ペプチド種の選択されたサブセットを除外することを含む。

【0046】

一部の配置において、ペプチド種は、ａ）ある候補修飾が存在する場合、およびｂ）同じアミノ酸配列を有するが候補修飾を有さない対応するペプチド種の質量分析測定における最高強度（頂点のピーク高さ）が既定の閾値強度未満である場合に、除外される。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「ＷＴ強度」と称される。そのような「野生型」ペプチド種（すなわち、修飾を有さないペプチド種）の質量分析測定における低強度は、修飾を有する対応するペプチド種から得た情報が、相対的に信頼性に欠けることを示す。本質的に、質量分析測定は、この特定の配列（修飾を有するまたは有さない）を有するペプチド種を測定するには相対的に非効率である。換言すると、一部のペプチドは、各々の配列によって規定される物理化学的特性のため、他より強度が低い。そのような配列への修飾は、典型的にはイオン化特性を完全に変化させることはない。よって、低強度「野生型」は、低強度（したがって、相対的に信頼性に欠ける）修飾ペプチドに関連する傾向がある。したがって、後続分析からそのようなペプチド種を除外することは、偽陽性を効率的に低減することに寄与する。これは、下記に考察されている図７に示されているデータによって実証されている。

【0047】

一部の配置において、ペプチド種は、ａ）ある候補修飾が存在する場合、およびｂ）同じアミノ酸配列を有するが候補修飾を有さない対応するペプチド種の質量分析測定における最高精度スコアが既定の閾値スコア未満である場合に、除外される。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「ＷＴスコア」と称される。この文脈における「精度スコア」は、理論的断片化パターンと、質量分析測定により生成された断片化パターンとを比較するアルゴリズムを適用した結果を指す。精度スコアは、マッチングの程度／理論的断片および観察された断片の相関関係、を定量化する計量であり得る。スコアが高いほど、高い相関関係（より良好なマッチング）を示す。上記に考察された低強度の場合と同様に、野生型ペプチド種の低精度スコアは、修飾を有する対応するペプチド種から得た情報が相対的に信頼性に欠けることを示す。したがって、後続分析からそのようなペプチド種を除外することは、偽陽性を効率的に低減することに寄与する。

【0048】

一部の配置において、前処理は、ペプチド種を生成した酵素の切断部位に候補修飾を有する各ペプチド種を除外することを含む。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「除外切断部位」と称される。修飾は、酵素の消化行動に影響を及ぼすことがあり、これは、修飾の位置に対応する開始または終了点を有するペプチド種が、その修飾を検出するために最適ではないことを意味する。したがって、後続分析からこれらのペプチド種を除外することは、偽陽性を低減することに寄与する。

【0049】

一部の配置において、前処理は、既定の閾値長さを超える長さを有するペプチド種を除外することを含む。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「ペプチド長さ」と称される。長いペプチド種に特定された修飾は、検証することが一般により困難であり、したがって信頼性が低い。長いペプチド種（例えば、＞３５００Ｄａ）は、典型的には高度に荷電されている（４～６）。高度に荷電されたペプチドは、典型的には不十分なＭＳ／ＭＳカバレージを引き起こす。この理由は、高度に荷電されたペプチドが、質量分析装置の衝突セルに向かってかなり速く加速され、このことが、低荷電ペプチド種と比較して少ない断片をもたらすからである。異なる断片化モードを使用して、高度に荷電されたペプチドから「良好な」ＭＳ／ＭＳデータ（すなわち、高断片イオンカバレージ、高い強度）を得ることが可能である。しかし、そのような断片化モード（例えば、電子移動解離（ＥＴＤ））は、典型的に少ない電化を有する小さなペプチド種への代替案（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））より低いＭＳ／ＭＳスコアをもたらす傾向がある。したがって、既定の閾値長さより長いペプチド種を除外することは、偽陽性を低減するために有効である。

【0050】

工程Ｓ７における他の選択基準
一部の配置において、工程Ｓ７における候補配列修飾のサブセットの決定は、アミノ酸配列位置をカバーしかつ候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、アミノ酸配列位置をカバーしかつ候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比が既定の閾値比以上であるアミノ酸配列位置に候補配列修飾があることに依存して、候補配列修飾を選択する工程を含む。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、例えば、下記に「比フィルタ」と称される。この基準は、対応する修飾ペプチド種が対応する非修飾（野生型）ペプチド種と比較して相対的にまれに起こすペプチド種における候補修飾を除外する。このフィルタリング手法の有効性は、下記に記載されている図６に示されているデータによって実証されている。一部の実施形態において、最少比（既知閾値比）は、２～１０％の範囲、好ましくは２～５％の範囲、好ましくは２～４％の範囲、好ましくは２．５～３．５％の範囲、好ましくは約３％に設定される。

【0051】

性能を実証する実験
性能を実証する実験は、本方法により出力される候補配列修飾のサブセットを得るため、候補配列修飾の選択または割引用の構成選択肢を規定する「フィルタ設定」を参照しながら、下記に記載される。フィルタ設定は、以下（これらのうちのいくつかは上記で考察されている）を含む。

【0052】

「ＳＶスコア」－候補修飾を含有する断片の質量分析測定における、理論的断片と観察された断片（ペプチド種）との相関関係の程度を表す精度スコアである。

【0053】

「ＷＴスコア」－候補修飾を含有しない断片の質量分析測定における、理論的断片と観察された断片（ペプチド種）との相関関係の程度を表す精度スコアである。

【0054】

「ｐｐｍ」－質量分析測定の質量精度である。

【0055】

「ＭＳ１ Ｃｏｒｒ」－同じ配列、消化タイプ、電荷状態、修飾および修飾位置を有するペプチド種のすべての特定のため、最高のＭＳ１相関関係（理論的な同位体パターンと測定された同位体パターンを比較する）を表す計量である。スコア１は完全なマッチである。

【0056】

「ペプチド長さ」－ペプチド種におけるアミノ酸の数である。

【0057】

「ＷＴ強度」－同じ消化タイプを有し、存在するすべての電荷状態を考慮して、候補修飾を含有する修飾ペプチド種に対応する非修飾ペプチド種のすべての特定のための、質量分析測定における最高強度（頂点のピーク高さ）を示す。

【0058】

「除外切断部位」－酵素切断部位に対応する候補配列修飾が除外されるか否かを示す「はい」または「いいえ」の設定である。

【0059】

「レシオフィルタ」－アミノ酸配列位置をカバーし、かつ候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、アミノ酸配列位置をカバーし、かつ候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比である。

【0060】

「ｎｏＰｅｐ」－候補配列修飾のアミノ酸配列位置をカバーし、かつ修飾を含有するペプチド種の数である。

【0061】

「消化の数」－候補配列修飾のアミノ酸配列位置をカバーし、修飾を含有し、異なる酵素消化を使用して得られたペプチドから誘導されたペプチド種の数である。

【0062】

「ＸＩＣ比」－候補配列修飾のＸＩＣ面積と、修飾を含有しない対応するペプチド種のＸＩＣ面積との比を使用した、候補配列修飾の最小ＸＩＣ比を示す。

【0063】

図３は７つの異なる産物開発プロジェクトへの本方法の適用を描写する表である。

【0064】

図３に示されているデータを生成するため、７つの異なるプロジェクトによる精製タンパク質試料（通常、３５０μｇ）を、８Ｍの塩酸グアニジンにおいてｐＨ７．０で変性させ、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の添加により還元し、３７℃で１時間インキュベートした。還元試料のＳ－カルボキシメチル化を、ヨードアセチル酸の添加により実施した。いくつかの酵素により消化する前に、バッファーを、ＮＡＰ５カラムを使用して消化バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）に交換した。試料を９つの等しい画分に分けて、異なる酵素を添加した。消化条件は酵素依存性であった。以下の条件を使用した。

【0065】

【表1】

【0066】

得られた消化を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計（データ依存性設定）に接続されたＲＰ－ＬＣにより分離させた。分離には、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（水、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）による１２０分勾配（移動相Ａ：０．１％ｖ／ｖのギ酸（ＦＡ）を有する水；移動相Ｂ：０．１％ｖ／ｖのＦＡを有するアセトニトリル）を使用した。Ｆｕｓｉｏｎ－Ｏｒｂｉｔｒａｐでは、データ依存性設定を使用した。

【0067】

図３の第１縦列（Ｐｒｏｊｅｋｔ）は、プロジェクトを表す番号を含む。第２の縦列は、本方法の工程Ｓ６において特定された候補配列修飾の数を表す。第３の縦列は、工程Ｓ７で決定されたサブセットにおける配列修飾の数を示す。括弧内の数は、偽陽性の低減率を示し、例えば、第１横列の９／２４４７＝０．４％は、９９．６％のヒットがフィルタ除去されたことを意味する。フィルタ設定は以下のとおりであった：ＷＴ強度＞１ｅ６；ＳＶスコア＞１４０；ＷＴスコア＞２２０；ペプチド長さ：５～３２；ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５；ｐｐｍ＜４；消化の数≧２（Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータ依存性トップタイムにより適用されたデータ；ＩｏｎＴｒａｐ中ＣＩＤ；１２０分勾配、９つの消化）。これらの結果は、本方法が多数の候補配列修飾から高い信頼性で真陽性を特定すること、ならびにそのような多量の候補配列修飾のうちからすべての、または実質的にすべての偽陽性を高い信頼性で除外することができることを実証している。図３のデータは、スパイクイン（ｓｐｉｋｅｄ－ｉｎ）配列修飾により人工的に作り出されたデータセットではないことに留意すること。図３のデータは、本方法を使用した実際のプロジェクトによる試料の分析から導出されている。どのようなＳＶが試料に実際に存在しているか不明であるので、感度（すなわち、真陽性）についての結果は、この場合に提供することができない。図４～８の基礎となるスパイクインデータ（下記に考察される）と対照的であり、ここでは、試料中にどれぐらい多くの公知であり予想されたＳＶが、本方法を使用して特定されるかを評価することが可能である。

【0068】

図４～８および１０は、本開示の実施形態の性能を実証する実験の結果を示す棒グラフである。

【0069】

試料に存在するすべての配列修飾が検出され得るか否かを定量的に決定するため、それぞれ第１抗体を含有する９個の異なる試験試料（１～９）を、表２に示されているように、溶液に第２抗体を０．５％レベルで添加することによってスパイクした。９個の試験試料の追加のセット（１０～１８）は、第２抗体を第１抗体により０．５％のレベルでスパイクすることによって生成した。

【0070】

【表2】

【0071】

合計で１８個のそのようなスパイキング試料が生成された。これらのスパイキング試料の消化、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計に接続されたＲＰ－ＬＣを使用した後続の分析を、図３について上記に記載されたように実施した。

【0072】

これらの１８個の試料において、理論的合計の１４０個の位置は、その位置から≧７アミノ酸ＮおよびＣ末端までの、そうでなければ同一の配列内にある第１と第２抗体の間で１個のアミノ酸のみによって異なり、天然に存在する配列バリアントを模倣することが予想される。得られたＬＣ－ＭＳ／ＭＳファイルを、Ｓｏｆｔｗａｒｅ－Ｔｏｏｌ Ｂｙｏｎｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ／ＵＳＡ）の使用により処理して、タンパク質データにした。このソフトウエアは、実験データ（ペプチド質量（ＭＳ）およびペプチド断片（ＭＳ／ＭＳ））を、インシリコで生成された対応する「主抗体」（すなわち、試料中に９９．５パーセントで存在する抗体）のアミノ酸配列の理論的データと比較した。結果をランク付けし、Ｂｙｏｎｉｃにより生成された算出データセットを使用してソフトウエアＢｙｏｌｏｇｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）により可視化した。Ｂｙｏｌｏｇｉｃからエクスポートされた１８個の試料のタンパク質データをプールし、次いで分析した。スパイクされた試料において正確に決定された配列バリアントの数を、理論的予想配列バリアントと比較することによって、本方法における全体的な感度（真陽性）に対する個別のフィルタ設定の影響を定量的に査定することが可能であった。

【0073】

図４～８および１０では、それぞれの場合において、棒は対で表されており、それぞれの対は、左側に白一色棒および右側に網掛け棒を含む。それぞれの白一色棒の高さは、感度％を表し、左側の縦軸に提示されているスケールに対応する。感度は、得られた真性候補配列修飾と、スパイキングに使用された抗体の配列に基づいた真性候補配列修飾の算出合計との比と定義される。それぞれの網掛け棒の高さは、偽陽性の総数を表し、右側の縦軸に提示されているスケールに対応する。偽陰性は、スパイキングによりもたらされる真性配列修飾に対応しない候補配列修飾であり、絶対数で提示されている。図４Ｂおよび５～８において、偽陽性の数は、偽陽性候補配列修飾の数を表す。図４Ａにおいて、偽陽性数は偽陽性配列修飾を有するペプチド種の数に対応し、それは、これらの結果を生成するために使用される方法が（本開示の方法と異なり）、同じ候補修飾を有する異なるペプチド種を１つのヒットにプールする工程を含まないからである。

【0074】

図４Ａおよび４Ｂは、代替的手法と比較して改善された性能を実証する比較実験の結果を描写するグラフである。このグラフは６つの異なる構成（それぞれ設定Ａ～Ｆと称される）のそれぞれに一対の棒を描写している。

【0075】

設定Ａ～Ｃ（図４Ａに示されている）は、本開示の方法が使用されない構成を参照する。それぞれの場合では、トリプシンが主酵素として使用される。「トリプシン＿旧」と称され得る設定Ａの構成では、トリプシンのみを使用して、質量分析のためにペプチドを得る。「３酵素＿旧」と称され得る設定Ｂの構成では、トリプシンを最初に使用し、Ａｓｐ－Ｎおよびサーモリシンを代替的酵素として使用して、トリプシン「野生型」ペプチドが検出されなかった配列カバレージにおけるギャップを埋めた。代替的酵素の最も強力な野生型ペプチドのみを、それぞれのギャップを埋めるために使用した。「９酵素＿旧」と称され得る設定Ｃの構成では、設定Ｂの手法を拡大して、トリプシンに加えて８つの代替的酵素／酵素混合物を使用して、トリプシン「野生型」ペプチドが検出されなかった配列カバレージにおけるギャップを埋めた。代替的酵素の最も強力な野生型ペプチドのみを、それぞれのギャップを埋めるために使用した。８つの代替的酵素／酵素混合物は、Ａｓｐ－Ｎ、サーモリシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ／Ｌｙｓ－Ｃ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ、およびエラスターゼであった。設定Ａ～Ｃでは、配列バリアントをＸＩＣ比の＞０．１％でフィルタ処理した。他のフィルタ設定は、ｐｐｍ＝±４ｐｐｍ、サイズ＝７５０～３１００ダルトン、精度スコア＞１４０、強度＞１ｅ７であった。

【0076】

設定Ｄ～Ｆ（設定Ｄは図４Ａに示されており、設定ＥおよびＦは図４Ｂに示されている）は、９つの酵素／酵素混合物（トリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、サーモリシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ／Ｌｙｓ－Ｃ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ、およびエラスターゼ）が等しく使用されている構成を参照する。フィルタリングした後に保持された野生型ペプチドに対応するすべての配列バリアントを使用した。

【0077】

「９酵素＿新」と称され得る設定Ｄの構成では、９つすべての酵素を等しく使用した（代替的酵素の最も強力な野生型ペプチドのみを、それぞれのギャップを埋めるために使用したわけではない）が、本開示の実施形態によるフィルタリングを適用しなかった。「野生型ペプチド」は、以下の前フィルタ処理設定：ｐｐｍ＝±４ｐｐｍ、サイズ＝７５０～３１００ダルトン、精度スコア＞１４０、強度＞１ｅ６を使用して前フィルタ処理した。

【0078】

「９酵素＿新＋フィルタ１」と称され得る設定Ｅの構成では、９つのすべての酵素を本開示の実施形態によるフィルタリングと共に使用した。フィルタリングは、以下の設定により実施して、配列バリアントを見逃さないことを確実にした：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞２％、消化の数≧１、ｎｏＰｅｐ≧２、ＸＩＣ比＞０．１％。

【0079】

「９酵素＿新＋フィルタ２」と称され得る設定Ｆの構成では、９つのすべての酵素を本開示の実施形態によるフィルタリングと共に使用した。フィルタリングは、以下の設定により実施して、旧手法に類似した（すなわち、設定Ｂに類似した）感度を達成したが、偽陽性の低減は＞９０％であった：ＳＶスコア＞１８０、ＷＴスコア＞２６０ｐｐｍ±３ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９６、ペプチド長さ＝７～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞１０％、ｎｏＰｅｐ≧２、消化の数≧１、ＸＩＣ比＞０．１％。

【0080】

設定Ｄは高い感度を達成するが、高い擬陽性も達成し、一方で設定ＥおよびＦは、本開示の実施形態が感度と偽陽性との改善されたバランスを提供することを実証していることが、図４Ａおよび４Ｂから分かる。設定Ｅでは、感度は設定Ｄと同じように高いが、かなり少ない偽陽性を有する。設定Ｆでは、設定Ａ～Ｃにより表される旧手法のいずれかと同じような高い感度が達成されるが、かなり少ない偽陽性（＞９２％の低減）を有する。

【0081】

図５Ａは、それぞれが修飾を含有し、かつ異なる酵素消化（フィルタ設定「消化の数」に対応する）を使用して得られたペプチドからそれぞれ誘導されている異なるペプチド種によるアミノ酸配列の必要とされるカバレージの関数として、本開示の実施形態の方法において感度および偽陽性がどのように変動するかを実証するさらなる実験の結果を描写するグラフである。フィルタリング工程の前に、予測修飾の総数（真性ヒットおよび偽陽性ヒットを含む）は、２５６９４であった。「１」と標識された第１の棒対は、単一ペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。「２」と標識された第２の棒対は、２つの異なる消化に由来する２つのペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。「３」と標識された第３の棒対は、３つの異なる消化に由来する３つのペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。「４」と標識された第４のカラム対は、最小カバレージが４つの異なる消化に由来する４つのペプチド種によるものである場合に対応する。他のフィルタ設定は、それぞれの場合に一定に保持されており、以下のとおりであった：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞０％、ｎｏＰｅｐ≧１、ＸＩＣ比＞０％。

【0082】

異なる酵素消化に由来する異なるペプチド種による最小カバレージを増加することは、偽陽性を素早く減少させ、同時に感度に対して限定された悪影響を有することが、図５Ａから分かる。２つのペプチドの最小カバレージを必要とすることは、偽陽性に有意な低減をもたらし、感度に測定可能な変化をもたらさない。２つの異なる消化に由来する２つのペプチドの最小カバレージを必要とすることは、高い感度と僅かな偽陽性の良好なバランスを提供する。

【0083】

図５Ｂは、異なるペプチド種によるアミノ酸配列の必要とされるカバレージ（フィルタ設定「ｎｏＰｅｐ」に対応する）の関数として、本開示の実施形態の方法において感度および偽陽性がどのように変動するかを実証するさらなる実験の結果を描写するグラフである。フィルタリング工程の前に、予測修飾の総数（真性ヒットおよび偽陽性ヒットを含む）は、２５６９４であった。「１」と標識された第１の棒対は、単一ペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。「２」と標識された第２の棒対は、２つのペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。「３」と標識された第３の棒対は、３つのペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。「４」と標識された第４のカラム対は、４つのペプチド種による最小カバレージが候補選択のために必要である場合に対応する。他のフィルタ設定は、それぞれの場合に同じに保持されており、以下のとおりであった：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞０％、消化の数≧１、ｎｏＰｅｐ≧１、ＸＩＣ比＞０％。

【0084】

異なるペプチド種による最小カバレージを増加することは、偽陽性を素早く減少させ、同時に感度に対して限定された悪影響を有することが、図５Ｂから分かる。２つのペプチドの最小カバレージを必要とすることは、偽陽性に有意な低減をもたらし、感度に測定可能な変化をもたらさない。３つのペプチドの最小カバレージを必要とすることは、高い感度と僅かな偽陽性の良好なバランスを提供する。

【0085】

図６は、アミノ酸配列位置をカバーし、かつ候補配列修飾を含有するペプチド種の数と、アミノ酸配列位置をカバーし、かつ候補配列修飾を含有しないペプチド種の数との比（フィルタ設定「レシオフィルタ」に対応する）の最小値の関数として、本開示の実施形態の方法において感度および偽陽性がどのように変動するかを実証するさらなる実験の結果を描写するグラフである。第１の棒対は、少なくとも１％であることを要する比の値に対応する。第２から第５の対の棒は、最小比の値の２％、３％、５％および１０％をそれぞれ表す。他のフィルタ設定は、それぞれの場合に同じに保持されており、以下のとおりであった：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、消化の数≧１、ｎｏＰｅｐ≧２、ＸＩＣ比＞０％。

【0086】

最小比の値を増加することは、偽陽性に素早い減少をもたらし、感度に有意の遅い低減をもたらすことが、図６から分かる。図５Ａおよび５Ｂのように、本明細書におけるフィルタリング工程の前の予測修飾の総数（真性ヒットおよび偽陽性ヒットを含む）は、２５６９４であった。最小比の値を１％から２％に増加すると、偽陽性を有意に減少させ、一方で感度には有意に影響しない。最小比の値を３％に増加すると、高い感度と非常に僅かな偽陽性との良好なバランスをもたらす。最小比の値が高いと、極めて僅かな偽陽性をもたらし、同時に感度を有用なレベルに保持する。

【0087】

図７は、質量分析測定の必要とされる最小強度（フィルタ設定「ＷＴ強度」に対応する）の関数として、本開示の実施形態の方法において感度および偽陽性がどのように変動するかを実証するさらなる実験の結果を描写するグラフである。左から右に１ｅ＋０５から１ｅ＋０８に増加する最小強度にそれぞれ対応する棒の対が示されている。他のフィルタ設定は、それぞれの場合に同じに保持されており、以下のとおりであった（レシオフィルタなし）：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞０％、消化の数≧１、ｎｏＰｅｐ≧２、ＸＩＣ比＞０．１％。

【0088】

最小強度の値を増加することは、偽陽性に素早い減少をもたらし、感度に有意の遅い低減をもたらすことが、図７から分かる。図５および６のように、本明細書におけるフィルタリング工程の前の予測修飾の総数（真性ヒットおよび偽陽性ヒットを含む）は、２５６９４であった。最小強度の値を１ｅ＋０５から１ｅ＋０６％に増加すると、偽陽性を有意に減少させ、一方で感度には有意に影響しない。最小強度の値を１ｅ＋０７に増加すると、高い感度と非常に僅かな偽陽性との良好なバランスをもたらす。最小強度の値が高いと、極めて僅かな偽陽性をもたらし、同時に感度を有用なレベルに保持する。

【0089】

図８は、酵素の増加数の関数として、本開示の実施形態の方法において感度および偽陽性がどのように変動するかを実証するさらなる実験の結果を描写するグラフである。２～９つの酵素を含む酵素群にそれぞれ対応する棒の対が、以下のように示されている：
群ｉ＝トリプシン、ペプシン；
群ｉｉ＝トリプシン、ペプシン、プロアラナーゼ；
群ｉｉｉ＝トリプシン、サーモリシン、ペプシン、プロアラナーゼ；
群ｉｖ＝トリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ；
群ｖ＝トリプシン、サーモリシン、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ；
群ｖｉ＝トリプシン、サーモリシン、ＡｓｐＮ、エラスターゼ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ；
群ｖｉｉ＝トリプシン、サーモリシン、ＡｓｐＮ、エラスターゼ、ＧｌｕＣ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ；
群ｖｉｉｉ＝トリプシン、サーモリシン、ＡｓｐＮ、エラスターゼ、キモトリプシン、ＧｌｕＣ、プロナーゼ、ペプシン、プロアラナーゼ。

【0090】

対照として、１つの酵素（ペプシン）のみの感度および偽陽性が群ｉｘに示されている。酵素消化に使用された９つのうち、ペプシンは、下記に記述されたフィルタ設定を使用した場合、最高の感度を示した。したがって、酵素消化に使用される至適基準のトリプシンの代わりにペプシンを、ここで比較として使用した。

【0091】

同じフィルタ設定をそれぞれの場合適用し、以下のとおりであった：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞２％、消化の数≧１、ｎｏＰｅｐ≧２、ＸＩＣ比＞０．１％。

【0092】

酵素の数の増加は感度を増加させるが、偽陽性も増加させることが、図８から分かる。図５～７のように、本明細書におけるフィルタリング工程の前の予測修飾の総数（真性ヒットおよび偽陽性ヒットを含む）は、９つすべての酵素を使用した場合、２５６９４であった。単一の消化に由来するデータのみを使用した対照と比較して、かなり良好な感度を、２つの酵素の使用により既に達成することができる。高い感度と少ない数の偽陽性との特に良好なバランスは、５～６つの酵素で達成されるが、より多くの数の酵素は、適度な偽陽性を伴ってさらに良好な感度を達成する。

【0093】

一部の実施形態において、本方法は、受け取ったタンパク質においてペプチド種の１つまたは複数の群を特定することを含み、ペプチド種のそれぞれの群は、すべてが同じ候補配列修飾を有するペプチド種のみを含有する。候補配列修飾は、候補配列修飾の決定されたサブセットにあり、各群で異なっている。よって、群分け方法を、上記に記載されたフィルタリング工程の任意の組合せの後に実施することができる。本方法は、ペプチド種が、特定された群のそれぞれにあることを表すデータを出力することを含んでもよい。データは、特定された各群におけるペプチド種のリストを含んでもよい。データは、グラフとして、または他の非テキストベースの表現としての表示に適応し得る。方法は、選択可能な選択肢を提供して、１つまたは複数の群を規定するように実行され得る。選択可能な選択肢は、適用されるフィルタ設定の規定を含むことができる（例えば、ＷＴ強度＞１ｅ６、ＳＶスコア＞１４０、ペプチド長さ５～３２、ＭＳ１スコア＞０．９５などに対応する）。選択可能な選択肢は、修飾の規定を含むことができる（例えば、アラニンからセリンＳＶへの交換）。選択可能な選択肢は、修飾の位置についての規定を含むことができる。位置は、鎖（例えば、軽鎖ＬＣ）およびアミノ酸（例えば、アミノ酸２５）のいずれかまたは両方の規定を含むことができる。

【0094】

一部の実施形態において、工程Ｓ７におけるサブセットの決定は、候補配列修飾が、定量化条件を満たすことに依存して、候補配列修飾を選択することを含む。定量化条件は、候補配列修飾を有するペプチド種の検出された相対量（すなわち、修飾を有するおよび有さない対応するペプチド種の合計検出量に対して）が、相対的に高いはずであることを概ね必要とする。本発明者たちは、そのような定量化条件を満たすことが、候補配列修飾が真性配列修飾であることに強く創刊する可能性があり、したがってフィルタリングのために有効な基礎を提供すると推論した。このタイプのフィルタリングに対応するフィルタ設定は、本明細書において「Ｑｕａｎｔ」と称され得る。

【0095】

そのようなフィルタを有効に実行することの課題は、適切な計量を公式化して、候補配列修飾を有するペプチド種の検出された相対量を正確に表すことである。状況の複雑さが、図９に概略的に例証されており、質量分析測定の例示的な結果を描写している。

【0096】

図９は、候補配列修飾を有するおよび有さないペプチド種をボックスとして概略的に描写している。ボックスの右側縦列は、候補修飾を有するペプチド種を表す（右側縦列の各ボックス中に黒色垂直棒線により概略的に示されている）。ボックスの左側縦列は、候補修飾を有さない対応するペプチド種（すなわち、野生型ペプチド種）を表す。９つの横列（ａ）～（ｉ）は、各横列が一対の対応するペプチド種（候補配列修飾を有するおよび有さない）を含有して提示されている。各ボックス内において、電荷状態は、Ζ２（二倍荷電）、Ζ３（三倍荷電）またはΖ４（四倍荷電）により示されている。各々のペプチド種に対応する、質量分析測定における時間強度曲線部分は、カウント^＊ｓを伴う「面積」の後に示されている。「ｎ．ｄ．」とマークされているボックスは、検出されていないペプチド種（修飾を有する）に対応する。横列は、異なるペプチド種またはペプチド種の異なる電荷状態に対応する。示されている例において、ペプチド種は、３つの異なる消化（Ｄｉｇ１、Ｄｉｇ２およびＤｉｇ３と示されている）に由来する。Ｄｉｇ１およびＤｉｇ２のそれぞれには、２つの異な電荷状態（ｚ２およびｚ３）の単一ペプチド種が示されている（Ｄｉｇ１にＰｅｐ１およびＤｉｇ２にＰｅｐ２が標識されている）横列（ａ）および（ｂ）はＤｉｇ１由来のＰｅｐ１に対応し、横列（ｃ）および（ｄ）はＤｉｇ２由来のＰｅｐ２に対応する。Ｄｉｇ３では、２つのペプチド種が示されている（Ｐｅｐ３およびＰｅ４と標識されている）。横列（ｅ）および（ｆ）は、電荷状態のｚ２およびｚ３のＰｅｐ３に対応する。横列（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）は、電荷状態のｚ２、ｚ３およびｚ４のＰｅｐ４に対応する。この特定に例において、Ｄｉｇ１はキモトリプシン消化であり、Ｐｅｐ１は、アミノ酸配列範囲６１３～６２９に対応するペプチド種であった。Ｄｉｇ２はトリプシン消化であり、Ｐｅｐ２は、アミノ酸配列範囲６０８～６２３に対応するペプチド種であった。Ｄｉｇ３はＬｙｓＣ＋ＧｌｕＣ消化であり、Ｐｅｐ３は、アミノ酸配列範囲６０４～６２０に対応するペプチド種であり、Ｐｅｐ４は、同じＬｙｓＣ＋ＧｌｕＣ消化から誘導されるアミノ酸配列範囲６０４～６２３に対応するペプチド種であった。

【0097】

原則として様々な計量を公式化して、配列修飾を有するペプチド種の検出された相対量を表すことができる。

【0098】

本発明者たちにより考慮される計量の例を下記に記載し、計量１～７と称する。各計量の決定値を既定の定量化閾値と比較して、Ｑｕａｎｔフィルタリングを実行してもよい（すなわち、工程Ｓ７のサブセットが候補配列修飾を含むか否かを決定するため）。

【0099】

例示的な配置において、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）であり得る質量分析測定は、時間強度曲線を出力する。所定のペプチド種では、ペプチド種の検出量は、ペプチド種の対応する曲線部分の最大値（ピーク強度）およびペプチド種に対応する曲線部分下面積の両方に強く相関する。下記の計量についての考察において、個別のペプチド種の検出量を考察する場合、「面積」が参照される。方法は、面積の代わりに最大値（ピーク強度）を使用して、実際、ペプチド種の検出量に相関する質量分析測定から抽出された任意の他の好適なパラメータを使用して、実行することもできる。

【0100】

図９の縦列２１に列挙されているパーセンテージは、それぞれの横列において、右側縦列のペプチド種（すなわち、修飾を有する）の面積と、右側および左側縦列のペプチド種（すなわち、修飾を有するおよび修飾を有さない）の合計との、パーセンテージで表されている比を表す。よって、縦列２１のパーセンテージは、候補配列修飾を有するペプチド種の相対的検出量を決定することに関連する情報を提供する。しかし、パーセンテージはサイズによって有意に変動することが分かる。縦列２２に列挙されているパーセンテージは、所定のペプチド種（すべての電荷状態を含む）に対応する横列の各群において、修飾を有するすべての電荷状態の面積（すなわち、考慮されるペプチド種の右側縦列のすべてのボックスの面積）の合計と、修飾を有するおよび有さないペプチド種のすべての電荷状態の面積の合計（すなわち、考慮されるペプチド種の右側および左側縦列のすべてのボックスの面積の合計）との比（パーセンテージで表されている）を表す。よって、例えばＰｅｐ１では、０．１５％の値は、１００％×４．３×１０^６／（４．３×１０^６＋４．４×１０^８＋２．４×１０^９）によりもたらされる。ここでも、有意な変動が縦列２２のパーセンテージに見られる。

【0101】

計量１および３では、修飾を担持するペプチド種に対応するすべての野生型の最も強力なもの（最大面積）のみを使用して、修飾の相対量を算出した。よって、計量は、図９の横列のうちの１つ（すなわち、縦列２１の値のうちの１つ）のみを使用して算出される。計量１の場合では、選択は、選択された１つの消化に由来するペプチド種に限定される。典型的には、選択された消化はトリプシン消化であるが、これが必須ではない。計量３の場合では、すべての消化に由来するペプチド種が考慮される。

【0102】

一例において、計量１のために選択された消化は、Ｄｉｇ２（トリプシン）であり得る。２電荷状態を有する１つのペプチド種（Ｐｅｐ２）は、図９の例のＤｉｇ２を使用して誘導した。計量１によると、Ｐｅｐ２の修飾の担持するペプチド種に対応する最大面積野生型は、横列（ｃ）のものであり、それは、修飾を有するペプチド種には、横列（ｄ）に対応する電荷状態が検出されないからである（すなわち、右側縦列のボックスは「ｎ．ｄ．」である）。よって計量１は、この例では０．３３％である。

【0103】

計量１に選択された消化がＤｉｇ２の代わりにＤｉｇ３である場合、修飾を担持するペプチド種に対応する最大面積野生型は、横列（ｆ）のものであり、Ｐｅｐ３のｚ３電荷状態に対応する。よって計量１は、この例では０．１３％である。

【0104】

計量３では、すべての消化に由来するペプチド種が考慮され、それによると、計量３の算出に使用された修飾を担持するペプチド種に対応する最大面積野生型は、すべての消化の修飾を担持するペプチド種に対応する最大面積野生型を有する横列（ｆ）であるから、横列（ｆ）のものでもある。横列（ｂ）は、最大面積野生型を有するが、修飾を有する型（右側縦列）は、検出されず（「ｎ．ｄ．」）、そのため横列（ｂ）は使用されない。

【0105】

計量２は計量１および３の変形であり、ここでは、修飾を有するペプチド種のすべての電荷状態が、個別の電荷状態が修飾を有するか否かにかかわりなく考慮される。次いで、計量２は、縦列２２について什器に記載された方法に従って算出される。計量２は、最大面積野生型（すべての電荷状態を考慮して）を含有するペプチド種に対応する、縦列２２のパーセンテージである。計量２は、選択された消化に由来するペプチドのみ、またはすべての消化に由来するペプチド種を考慮してもよい。選択された消化がＤｉｇ２である場合、計量２の出力は０．０７％であり、それは、１つのペプチド種のみがＤｉｇ２に由来するからである。選択された消化がＤｉｇ３である場合、計量２の出力は０．３０％であり、それは、Ｐｅｐ３が、最大面積野生型を含有するＤｉｇ３を使用して誘導されたペプチド種であるからである。すべての消化が考慮される場合、計量２の出力は０．１５％であり、それは、全体としてＰｅｐ１が最大面積野生型を有するからである（横列（ｂ））。

【0106】

計量４～７では、計量は多数の異なる消化に由来するペプチド種の面積についての情報の組合せに基づいて算出される。

【0107】

計量４は、多数の（例えば、すべての）消化に由来するが、前フィルタリングを使用して、野生型ペプチド種の面積（左側縦列）が閾値（例えば、１０^７カウント^＊ｓ）未満である横列をフィルタ除去したペプチド種を含む、修飾を有するペプチド種および電荷状態のすべての組合せ（すなわち、右側縦列が「ｎ．ｄ．」ではない図９のすべての横列）を考慮する。よって、左側縦列面積が閾値を超え、かつ右側縦列が「ｎ．ｄ．」ではない横列のみが考慮される。次いで、計量は、縦列２１の対応するパーセンテージの平均として算出される。よって、閾値面積が図９の例において１０^７カウント^＊ｓである場合、右側縦列に「ｎ．ｄ．」を有さないすべての横列が考慮される。計量４は、横列（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）の縦列２１の値の平均であり、０，６６％をもたらす。閾値面積が３×１０^８カウント^＊ｓに上昇されると、横列（ｅ）はフィルタ除去され、計量４は、代わりに横列（ａ）、（ｃ）、（ｆ）および（ｈ）の縦列２１の値の平均となり、０．５２％をもたらす。

【0108】

計量５～７では、本明細書において重み付け定量化と称される方法が使用される。このタイプの手法では、面積についての情報を組み合わせて、定量化計量を以下に式に従ってパーセンテージとして表すことができる：

式中、Σ修飾の面積は、修飾ペプチド種の面積の合計であり、Σ野生型の面積は、修飾ペプチド種に対応する野生型ペプチド種の面積の合計である（対応することは、電荷状態に対応することも必要とする）。それぞれの場合において、修飾を有する検出ペプチド種が存在する電荷状態のみが考慮される。よって、図９の例では、横列（ｂ）、（ｄ）、（ｇ）および（ｉ）は寄与しない。

【0109】

計量５では、すべての消化に由来するペプチド種が考慮される。よって、図９の例では、計量５の出力は横列（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）を考慮する。計量５の出力は、横列（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）の両方の縦列のすべての面積の合計により割られた、横列（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）右側縦列のすべての面積の合計であり、０．４７％に等しい。

【0110】

計量６では、配列特異的酵素に由来するペプチド種のみが考慮される。図９の例では、このことは、キモトリプシンを使用して実施されたＤｉｇ１に由来するペプチド種の除外をもたらす。計量６の出力は、横列（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）の両方の縦列のすべての面積の合計により割られた、横列（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）右側縦列のすべての面積の合計であり、０．３９％に等しい。

【0111】

計量７では、計量５および６の手法の組合せを使用して、より完全なカバレージを提供する。よって、配列特異的酵素消化によるカバレージがあり、かつギャップが非特異的酵素消化により埋められている配列特異的酵素消化のみが使用される。換言すると、配列特異的酵素消化がカバレージを提供する候補修飾では、配列特異的酵素消化は、計量６について上記に記載されているように使用される。修飾が任意の配列特異的酵素消化によりカバーされていない場合、非特異的酵素消化を使用する必要があり、このことは、この候補修飾およびタンパク質に利用可能なすべてのペプチド種が、計量５について上記に記載されているように使用される。この場合は特別であり、それは非特異的酵素消化のみが使用されるからである。計量５は、配列特異的および非得的酵素消化を使用することができる。

【0112】

様々な計量の有効性を、１４０個の配列差異が１％の割合でスパイクされた試料を使用して試験した。結果を下記の表１に示す。計量１および２のために選択された消化はトリプシンであった。計量４の閾値を１０^７カウント^＊ｓに設定した。

【0113】

【表1】

【0114】

最高の性能手法は、計量５、６および７に基づいたものであることが分かり、これらはすべて標的の１％からの非常に低い平均偏差を達成する。計量６は、「５×低すぎる」の増加に関して計量５より良好な性能を達成するが、「ＳＶ（％）」に関しては悪化している。計量７は、最高の全体的性能を達成する。

【0115】

上記の洞察に基づいて、配置において、候補配列修飾を有するペプチド種の少なくとも選択されたサブセットの質量分析測定により検出された量が、候補配列修飾を有するおよび有さない同じペプチド種（サブセットが複数のペプチド種を含む場合、複数のペプチド種であり得る）の質量分析測定により検出された合計量に対して、既定の定量化閾値を超えることを示すように、定量化条件は構成される。配置において、選択されたサブセットは、使用される少なくとも２つの異なる酵素消化の複数またはすべてに由来する複数またはすべてのペプチド種（例えば、上記に考察された計量５、６または７により表されている）を含む。よって定量化条件は、

上述の表式、または類似もしくは同等の表式、例えば、見合った値を使用して、計量を算出して、既定の定量化閾値と比較することができる。

【0116】

一部の配置において、少なくとも２つの異なる酵素消化は、１つまたは複数の配列特異的酵素消化および１つまたは複数の非特異的酵素消化を含む。これは、図９に例証されている例に当てはまる。そのような配置において、ペプチド種の選択されたサブセットは、計量６の場合のように、１つまたは複数の非特異的酵素消化を使用して誘導されたペプチド種を除外するように選択され得る。よって、選択されたサブセットは、複数の配列特異的酵素消化に由来するペプチド種からなり得る。配列特異的酵素消化を使用して誘導された少なくとも１つのペプチド種によりカバーされない候補配列修飾のために、１つまたは複数の非特異的酵素消化を使用して誘導されたペプチド種を含むように、ペプチド種の選択されたサブセットが選択され得る。よって、特異的酵素消化カバレージを有さないギャップは、非特異的酵素消化（例えば、計量７）を使用して埋めることができる。あるいは、すべての関連するペプチド種が含まれてもよく、使用される酵素修飾の性質（例えば、計量５）に基づいてペプチド種のサブセットが選択されることはない。

【0117】

本開示の意味の範囲内の配列特異的酵素消化は、予測可能な方法によりタンパク質の配列における特定のアミノ酸または隣接アミノ酸の配列のタンパク質Ｎ末端またはＣ末端を切断する、少なくとも１つのタンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）により実施される消化であってもよく、例えば、トリプシンは、タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸ＫまたはＲのタンパク質Ｃ末端を切断する。他の酵素消化、すなわち、配列特異的ではない酵素消化は、本開示において非特異的酵素消化と称され得る。切断部位は、使用される非特異的酵素消化が予測可能性の低いものまたは予測不能なものであり得るが、特定のプロテアーゼを使用した特定のタンパク質の消化には再現性がある場合に作り出される。

【0118】

配置において、配列特異的酵素消化は、以下の酵素：トリプシン、エンドプロテイナーゼＡＳｐＮ、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣのうちの１つもしくは複数を含む、または１つもしくは複数からなる。

【0119】

配置において、非特異的酵素消化は、以下の酵素：サーモリシン、エラスターゼ、プロナーゼ、プロアラナーゼ、ペプシン、キモトリプシンのうちの１つまたは複数を含む、または１つもしくは複数からなる。

【0120】

図１０は、定量化閾値（フィルタ設定「Ｑｕａｎｔ」に対応し、上記に記載された計量７を使用する）の増加数の関数として、本開示の実施形態の方法において感度および偽陽性がどのように変動するかを実証するさらなる実験の結果を描写するグラフである。棒の対は、それぞれ、左側から右側へ増加する定量化閾値（Ｑｕａｎｔ）の０、０．１、０．２、０．３および０．５にそれぞれ対応して示されている。定量化閾値の増加は、偽陽性の抑制を改善するが、感度も低減し得る。定量化閾値は、要件に従って選択される可能性があり、上記の値は単なる例示ためである。一部の実施形態において、定量化閾値は、０．０５、０．１、０．２または０．３以上であるように選択される。一部の実施形態において、定量化閾値は、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１以下であるように追加的に（必要に応じて）または代替的に選択される。他のフィルタ設定は、それぞれの場合に同じに保持されており、以下のとおりであった：ＳＶスコア＞１４０、ＷＴスコア＞１４０ｐｐｍ±４ｐｐｍ、ＭＳ１ Ｃｏｒｒ＞０．９５、ペプチド長さ＝５～３２アミノ酸、ＷＴ強度＞１ｅ６、除外切断部位＝「はい」、レシオフィルタ＞２％、ｎｏＰｅｐ≧２。各候補修飾のためのヒットの選択（タンパク質および修飾のタイプにより規定される）は、配列特異的酵素消化（すなわち、この場合にはＡｓｐ－Ｎ、トリプシンおよびＧｌｕＣ＋ＬｙｓＣ）からもたらされる修飾ペプチド種のみを使用して実施した。特異的酵素消化が利用可能ではない場合には、非特異的酵素消化によるすべてのヒットが定量化に考慮される。

【0121】

Ｑｕａｎｔフィルタ設定を増加することは、偽陽性に素早い減少をもたらし、感度に耐用可能な遅い低減をもたらすことが、図１０から分かる。例えば、Ｑｕａｎｔフィルタ設定の０．１を用いると、偽陽性の数は、有益な３３％（３５８６から２４０５）の低減があり、得られた真陽性の僅か１．４％（１００．０％から９８．６％）の低減があった。Ｑｕａｎｔフィルタ設定＝０（Ｑｕａｎｔフィルタなし）により得られた結果は、図５Ｂ、６および７を参照しながら上記に記載されたフィルタを適用した結果に既に対応している：
－修飾毎に少なくとも２つのペプチド（図５Ｂ）、
－レシオフィルタ＞２％（図６）、
－唯一の高強度ＷＴ（＞１ｅ６）（図７）。

【0122】

このフィルタリングのため、偽陽性の数は、Ｑｕａｎｔフィルタを適用する前であっても既に高度に低減されている。この文脈において、３３％の観察された改善は、とりわけ有意である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2024-09-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

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【国際調査報告】