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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-28
(54)【発明の名称】生体吸収性粒子及び使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/34 20170101AFI20250121BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250121BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20250121BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20250121BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20250121BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20250121BHJP
B82Y 5/00 20110101ALI20250121BHJP
B82Y 40/00 20110101ALI20250121BHJP
【ＦＩ】
A61K47/34
A61K31/7088
A61K9/51
A61K47/44
A61K47/26
A61K47/18
B82Y5/00
B82Y40/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537961
(86)(22)【出願日】2022-12-20
(85)【翻訳文提出日】2024-07-03
(86)【国際出願番号】 US2022053491
(87)【国際公開番号】W WO2023122079
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】63/265,732
(32)【優先日】2021-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/268,790
(32)【優先日】2022-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391028362
【氏名又は名称】ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド
【氏名又は名称原語表記】Ｗ．Ｌ． ＧＯＲＥ ＆ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＳ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
(71)【出願人】
【識別番号】513197954
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカ ナムローゼ フェンノートシャップ
(71)【出願人】
【識別番号】524234237
【氏名又は名称】ヤンセン リサーチ アンド ディベロップメント，リミティド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100128495
【弁理士】
【氏名又は名称】出野 知
(74)【代理人】
【識別番号】100208225
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 修二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100144417
【弁理士】
【氏名又は名称】堂垣 泰雄
(74)【代理人】
【識別番号】100147212
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 直樹
(72)【発明者】
【氏名】ロバート エル．クリーク
(72)【発明者】
【氏名】メイ リー
(72)【発明者】
【氏名】カイラ スチュアート
(72)【発明者】
【氏名】ドナ クライン
(72)【発明者】
【氏名】ファン トゥン ルー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076DD38
4C076DD51
4C076EE23
4C076EE24
4C076EE51
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
(57)【要約】
本開示は、核酸を含む生体吸収性粒子を提供する。生体吸収性粒子は、生体吸収性ポリマーマトリックス及び脂質塩をも含み、これら両方を変更することで粒子の特性に影響を与えることができる。生体吸収性粒子は、疾患の治療のために患者に投与することができる。生体吸収性粒子の製造方法及び使用方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、ポリマーマトリックス、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、及び、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１質量パーセントのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、製剤。
【請求項2】
前記複数の生体吸収性粒子は平均粒子サイズが３００ｎｍ未満である、請求項１記載の製剤。
【請求項3】
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約５質量パーセントのＡＳＯを含む、請求項１～２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項4】
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１０質量パーセントのＡＳＯを含む、請求項１～３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項5】
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１５質量パーセントのＡＳＯを含む、請求項１～４のいずれか１項記載の製剤。
【請求項6】
前記ポリマーマトリックスはトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）を含む、請求項１～５のいずれか１項記載の製剤。
【請求項7】
前記ポリマーマトリックスはＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマーを含む、請求項１～６のいずれか１項記載の製剤。
【請求項8】
ＴＭＣ／ＰＬＡの比は約２５／７５である、請求項７記載の製剤。
【請求項9】
前記ポリマーマトリックスはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマーを含む、請求項１～８のいずれか１項の製剤。
【請求項10】
前記生体吸収性粒子のそれぞれの表面に結合した表面ポリマーをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項記載の製剤。
【請求項11】
前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１０記載の製剤。
【請求項12】
前記生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む、請求項１１記載の製剤。
【請求項13】
前記複数の生体吸収性粒子は、約１０質量パーセント～約４０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、請求項１～１２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項14】
前記複数の生体吸収性粒子は、約２０質量パーセント～約３０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、請求項１～１３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項15】
前記複数の生体吸収性粒子はナノ粒子を含む、請求項１～１４のいずれか１項記載の製剤。
【請求項16】
前記複数の生体吸収性粒子はマイクロ粒子を含む、請求項１～１４のいずれか１項記載の製剤。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項記載の製剤を患者にデリバリーすること、及び、前記ポリマーマトリックスが患者内で分解し、患者内で核酸が放出されるのに十分な時間を与えること、
の工程を含む、治療を必要とする患者を治療する方法。
【請求項18】
（ａ）構造ポリマー及びカチオン性脂質を溶媒に溶解すること、（ｂ）溶解した構造ポリマー及びカチオン性脂質に長さ２～７５ヌクレオチドの核酸を添加すること、
（ｃ）前記構造ポリマー、前記カチオン性脂質及び前記核酸の混合物を第一の超音波処理で超音波処理して油中水型エマルジョンを作成すること、
（ｄ）前記油中水型エマルジョンに水溶液を添加すること、
（ｅ）前記油中水型エマルジョンを第二の超音波処理で超音波処理して水中油中水型エマルジョンを生成すること、
（ｆ）前記水中油中水型エマルジョンに水を添加すること、
（ｇ）前記水中油中水型エマルジョンから複数の粒子を収集すること、及び、
（ｈ）前記複数の粒子を洗浄すること，
を含む、生体吸収性粒子の製剤を製造する方法。
【請求項19】
前記カチオン性脂質及び前記構造ポリマーを質量比約１：４～約１：１の比率で溶解する、請求項１８記載の方法。
【請求項20】
前記核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、約５質量パーセント～約２０質量パーセントで複数の粒子に担持される、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項21】
前記第一の超音波処理及び前記第二の超音波処理は氷浴で完了される、請求項１８～２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項22】
前記水溶液はポリビニルアルコール溶液である、請求項１８～２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項23】
前記エマルジョンから複数の粒子を収集する工程は遠心分離によって完了される、請求項１８～２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項24】
油溶液を糖及びバッファーの存在下で凍結乾燥することをさらに含む、請求項１８～２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項25】
前記糖はトレハロースである、請求項２４記載の方法。
【請求項26】
前記バッファーはヒスチジンである、請求項２４～２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項27】
（ａ）患者に複数の粒子をデリバリーすること、ここで、各粒子は、（ｉ）ポリマーマトリックス、
（ｉｉ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された長さ２～７５のヌクレオチドの核酸、及び、
（ｉｉｉ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、各粒子における前記カチオン性脂質の前記ポリマーマトリックスに対する比は質量比で約１：４～約１：１である、及び、
（ｂ）前記ポリマーマトリックスが患者内で生分解し、前記核酸を放出するのに十分な時間を経過させること、
を含む、治療を必要とする患者を治療する方法。
【請求項28】
前記核酸は、前記複数の粒子に約５質量パーセント～約２０質量パーセントで装填されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、前記カチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＭＡ）又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）のいずれかである、請求項２７記載の方法。
【請求項29】
前記ポリマーマトリックスは患者の結腸内で生分解する、請求項２７又は２８記載の方法。
【請求項30】
各粒子は、各粒子の表面に表面ポリマーをさらに含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２７～２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項31】
各粒子は少なくとも５ｗｔ％のＰＥＧを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項32】
前記複数の粒子はナノ粒子を含む、請求項２７～３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項33】
患者は、炎症性腸疾患、心血管疾患、高血圧、慢性心不全、糖尿病、パーキンソン病、前立腺癌又は慢性腎臓病を有する、請求項２７～３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項34】
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、（ａ）ポリマーマトリックス、
（ｂ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された核酸、
（ｃ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、及び，
（ｄ）前記各生体吸収性粒子の表面に結合した表面ポリマー，
を含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記各生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む，製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本開示は、一般的に生体吸収性粒子に関する。より具体的には、本開示は、治療に使用されるポリマー、脂質塩及び核酸剤を含む粒子に関する。
本開示は、一般的に生体吸収性粒子に関する。より具体的には、本開示は、治療に使用されるポリマー、脂質塩及び核酸剤を含む粒子に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
医療分野における数多くの開発により、疾患と闘うための新しい技術が生まれている。そのような開発の１つは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの炎症性疾患を治療するために核酸を含む活性剤を使用することである。しかしながら、ＩＢＤの治療のために結腸に活性剤をデリバリーすることは、生理学的課題、生化学的障壁及び粘液及び上皮に関連するものを含む環境的障壁のために困難である可能性がある。
医療分野における数多くの開発により、疾患と闘うための新しい技術が生まれている。そのような開発の１つは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの炎症性疾患を治療するために核酸を含む活性剤を使用することである。しかしながら、ＩＢＤの治療のために結腸に活性剤をデリバリーすることは、生理学的課題、生化学的障壁及び粘液及び上皮に関連するものを含む環境的障壁のために困難である可能性がある。
【発明の概要】
【0003】
要旨
１つの態様（「態様１」）において、製剤は複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子はポリマーマトリックス、前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質を含み、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１質量パーセントのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。
１つの態様（「態様１」）において、製剤は複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子はポリマーマトリックス、前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質を含み、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１質量パーセントのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。
【0004】
別の態様（「態様２」）において、態様１に加えて、前記複数の生体吸収性粒子は平均粒子サイズが３００ｎｍ未満である。
【0005】
別の態様（「態様３」）において、態様１又は２のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約５質量パーセントのＡＳＯを含む。
【0006】
別の態様（「態様４」）において、態様１～３のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１０質量パーセントのＡＳＯを含む。
【0007】
別の態様（「態様５」）において、態様１～４のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１５質量パーセントのＡＳＯを含む。
【0008】
別の態様（「態様６」）において、態様１～５のいずれか１つに加えて、前記ポリマーマトリックスはトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）を含む。
【0009】
別の態様（「態様７」）において、態様１～６のいずれか１つに加えて、前記ポリマーマトリックスはＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマーを含む。
【0010】
別の態様（「態様８」）において、態様７に加えて、ＴＭＣ／ＰＬＡの比は約２５／７５である。
【0011】
別の態様（「態様９」）において、態様１～８のいずれか１つに加えて、前記ポリマーマトリックスはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマーを含む。
【0012】
別の態様（「態様１０」）において、態様１～９のいずれか１つに加えて、前記生体吸収性粒子のそれぞれの表面に結合した表面ポリマーを含む。
【0013】
別の態様（「態様１１」）において、態様１０に加えて、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【0014】
別の態様（「態様１２」）において、態様１１に加えて、前記生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む。
【0015】
別の態様（「態様１３」）において、態様１～１２のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子は、約１０質量パーセント～約４０質量パーセントのカチオン性脂質を含む。
【0016】
別の態様（「態様１４」）において、態様１～１３のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子は、約２０質量パーセント～約３０質量パーセントのカチオン性脂質を含む。
【0017】
別の態様（「態様１５」）において、態様１～１４のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子はナノ粒子を含む。
【0018】
別の態様（「態様１６」）において、態様１～１４のいずれか１つに加えて、前記複数の生体吸収性粒子はマイクロ粒子を含む。
【0019】
１つの態様（「態様１７」）において、治療を必要とする患者を治療する方法は、態様１～１６のいずれかに記載の製剤を患者にデリバリーし、前記ポリマーマトリックスが患者内で分解し、患者内で核酸が放出されるのに十分な時間を与えることを含む。
【0020】
１つの態様（「態様１８」）において、生体吸収性粒子の製剤を製造する方法は、構造ポリマー及びカチオン性脂質を溶媒に溶解すること、溶解した構造ポリマー及びカチオン性脂質に長さ２～７５ヌクレオチドの核酸を添加すること、前記構造ポリマー、前記カチオン性脂質及び前記核酸の混合物を第一の超音波処理で超音波処理して油中水型エマルジョンを作成すること、前記油中水型エマルジョンに水溶液を添加すること、前記油中水型エマルジョンを第二の超音波処理で超音波処理して水中油中水型エマルジョンを生成すること、前記水中油中水型エマルジョンに水を添加すること、前記水中油中水型エマルジョンから複数の粒子を収集すること、及び、前記複数の粒子を洗浄することを含む。
【0021】
別の態様（「態様１９」）において、態様１８に加えて、前記カチオン性脂質及び前記構造ポリマーを質量比約１：４～約１：１の比率で溶解する。
【0022】
別の態様（「態様２０」）において、態様１８又は１９に加えて、前記核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、約５質量パーセント～約２０質量パーセントで前記複数の粒子に担持される。
【0023】
別の態様（「態様２１」）において、態様１８～２０のいずれか１つに加えて、前記第一の超音波処理及び前記第二の超音波処理は氷浴で完了される。
【0024】
別の態様（「態様２２」）において、態様１８～２１のいずれか１つに加えて、前記水溶液はポリビニルアルコール溶液である。
【0025】
別の態様（「態様２３」）において、態様１８～２２のいずれか１つに加えて、前記エマルジョンから前記複数の粒子を収集する工程は遠心分離によって完了される。
【0026】
別の態様（「態様２４」）において、態様１８～２３のいずれか１つに加えて、油溶液を糖及びバッファーの存在下で凍結乾燥することを含む。
【0027】
別の態様（「態様２５」）において、態様２４に加えて、前記糖はトレハロースである。
【0028】
別の態様（「態様２６」）において、態様２４又は２５に加えて、前記バッファーはヒスチジンである。
【0029】
１つの態様（「態様２７」）において、治療を必要とする患者を治療する方法は、（１）患者に複数の粒子をデリバリーすること、ここで、各粒子はポリマーマトリックス、前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された長さ２～７５のヌクレオチドの核酸及び前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質を含み、各粒子における前記カチオン性脂質の前記ポリマーマトリックスに対する比は質量比で約１：４～約１：１である、及び（２）前記ポリマーマトリックスが患者内で生分解し、前記核酸を放出するのに十分な時間を経過させることを含む。
【0030】
別の態様（「態様２８」）において、態様２７に加えて、前記核酸は、前記複数の粒子に約５質量パーセント～約２０質量パーセントで装填されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、前記カチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＭＡ）又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）のいずれかである。
【0031】
別の態様（「態様２９」）において、態様２７又は２８に加えて、前記ポリマーマトリックスは患者の結腸内で生分解する。
【0032】
別の態様（「態様３０」）において、態様２７～２９のいずれか１つに加えて、各粒子は、各粒子の表面に表面ポリマーをさらに含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【0033】
別の態様（「態様３１」）において、態様３０に加えて、各粒子は少なくとも５ｗｔ％のＰＥＧを含む。
【0034】
別の態様（「態様３２」）において、態様２７～３１のいずれか１つに加えて、前記複数の粒子はナノ粒子を含む。
【0035】
別の態様（「態様３３」）において、態様２７～３２のいずれか１つに加えて、患者は、炎症性腸疾患、心血管疾患、高血圧、慢性心不全、糖尿病、パーキンソン病、前立腺癌及び慢性腎臓病のうちの少なくとも１つを有する。
【0036】
１つの態様（「態様３４」）において、製剤は複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子はポリマーマトリックス、前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された核酸、前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、及び前記各生体吸収性粒子の表面に結合した表面ポリマーを含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記各生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む。
【図面の簡単な説明】
【0037】
図面の簡単な説明
添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれており、本明細書に組み込まれてその一部を構成し、実施形態を例示し、記載とともに本開示の原理を説明するのに役立つ。
添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれており、本明細書に組み込まれてその一部を構成し、実施形態を例示し、記載とともに本開示の原理を説明するのに役立つ。
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【発明を実施するための形態】
【0050】
詳細な説明
定義及び用語
本開示は、限定的に解釈されるべきものではない。例えば、本出願で使用される用語は、当該分野の人々がそのような用語に与える意味の関係で広く解釈されるべきである。
定義及び用語
本開示は、限定的に解釈されるべきものではない。例えば、本出願で使用される用語は、当該分野の人々がそのような用語に与える意味の関係で広く解釈されるべきである。
【0051】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内を意味し、これは、値が測定又は決定される方法、例えば測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該分野の慣例に従って、１標準偏差以内又は１標準偏差を超えることを意味することができる。あるいは、「約」は、与えられた値の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、この用語は、値の５倍以内、又は２倍以内など、何倍か以内のことを意味することができる。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合に、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値に対する許容誤差範囲内を意味するものと想定すべきである。
【0052】
様々な実施形態の説明
当業者であれば、本開示の様々な態様は、意図された機能を発揮するように構成された任意の数の方法及び装置によって実現できることを容易に理解できる。また、本明細書で参照される添付の図面は、必ずしも縮尺どおりに描かれているわけではなく、本開示の様々な態様を説明するために誇張されていることがあり、その点において、図面は限定的なものとして解釈されるべきではないことにも留意されたい。
当業者であれば、本開示の様々な態様は、意図された機能を発揮するように構成された任意の数の方法及び装置によって実現できることを容易に理解できる。また、本明細書で参照される添付の図面は、必ずしも縮尺どおりに描かれているわけではなく、本開示の様々な態様を説明するために誇張されていることがあり、その点において、図面は限定的なものとして解釈されるべきではないことにも留意されたい。
【0053】
まず、図１を参照すると、例示的な生体吸収性粒子、ナノ粒子１００の図が示されている。ナノ粒子１００は、表面１１０、ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０を含む。脂質１４０と核酸１５０はナノ粒子１００内で互いに分離して示されているが、脂質１４０はナノ粒子１００内で核酸１５０と複合化していることが好ましいことが理解される。例示的な実施形態において、ナノ粒子１００はサイズが約３００ｎｍ以下である。別の例示的な実施形態において、ナノ粒子１００はサイズが約１００ｎｍ～約３００ｎｍである。最も好ましい実施形態において、ナノ粒子１００はサイズが約２００ｎｍ～約３００ｎｍである。ナノ粒子１００が本明細書で示され、説明されているが、本開示は、約３００ｎｍより大きいサイズ、例えば約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１０００ｎｍ（１μｍ）又はそれ以上のマイクロ粒子にも関する。また、ナノ粒子１００は、中性又は中性に近い電荷、例えば、約－２０ｍｖ～約＋２０ｍｖのゼータ電位を有してよい。あるいは、ナノ粒子１００は、約－１０ｍｖ～約＋１０ｍｖのゼータ電位を有してよい。好ましくは、中性又は中性に近いナノ粒子１００は、約０ｍｖのゼータ電位を有してよい。
【0054】
図１はナノ粒子１００の表現にすぎず、ポリマーマトリックス１２０内の異種特徴としての脂質１４０及び核酸１５０の描写は、説明目的のみであることに留意されたい。ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０は、完全に又は部分的に均質であることができる。あるいは、ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０は、完全に又は部分的に不均質であることができる。ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０は、完全に又は部分的にエマルジョンであることができる。ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０は、完全に又は部分的にサスペンションであることができる。ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０は、当業者によって理解され、認識されるような完全に又は部分的に他の任意の混合物の形態であることができる。さらに、ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０は、任意の物質状態であることができる。例えば、核酸１５０は、ポリマーマトリックス１２０(例えば、固体ポリマーマトリックス)内にカプセル化された固体又は液体であることができる。ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び核酸１５０のそれぞれについては、以下でさらに説明する。
【0055】
限定されない実施形態において、ナノ粒子１００のポリマーマトリックス１２０は、生体吸収性又は生分解性ポリマーである。ポリマーマトリックス１２０は、親水性マトリックスよりも分解が遅いように、本質的に疎水性であることができる。ポリマーマトリックス１２０は、また、炎症を最小限に抑えるために低い酸分解を示すことができる。１つの実施形態において、ポリマーマトリックス１２０は、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ベースのポリマー、例えば、ＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマー（以下、「ＰＬＡ：ＴＭＣ」）であることができる。ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーは、例えば、ＴＭＣモノマーを、乳酸などの適切なコモノマー、例えばＬ－乳酸コモノマーと組み合わせてポリ（Ｌ,乳酸－ＴＭＣ）（以下、「Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ」）を生成する、Ｄ－乳酸コモノマーと組み合わせてポリ(Ｄ,乳酸-ＴＭＣ)(以下、「Ｄ－ＰＬＡ：ＴＭＣ」)を生成する、Ｌ－乳酸及びＤ－乳酸とＴＭＣのコモノマーと組み合わせてポリ(ＤＬ,乳酸-ＴＭＣ) (以下、「Ｄ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ」)を生成するなど、当該技術分野で周知の方法を使用して合成することができる。ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーは、Ｄ－ＰＬＡ／ＴＭＣの質量比が５５％／４５％（５５：４５）又は７５％／２５％（７５：２５）、Ｌ－ＰＬＡ／ＴＭＣの質量比が５５％／４５％（５５：４５）又は７５％／２５％（７５：２５）、Ｄ,Ｌ－ＰＬＡ／ＴＭＣの質量比が５０％／５０％（５０：５０）又は７５％／２５％（７５：２５）であることができる(すべて質量基準)。幾つかの態様において、ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーは、４５～６０ｗｔ％のＰＬＡ及び４０～５５ｗｔ％のＴＭＣを含むことができる。別の実施形態において、ポリマーマトリックス１２０は、ＰＬＡ、ＴＭＣ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの別のポリマーの三元共重合体(以下、「ＰＬＡ：ＴＭＣ：ＰＥＧ」)を含むことができる。さらに別の実施形態において、ポリマーマトリックス１２０は、ＰＬＡ及びポリグリコール酸(ＰＧＡ)コモノマーを含むポリ(乳酸－コ－グリコール酸)（ＰＬＧＡ）コポリマーを含むことができる。
【0056】
使用されるポリマーの種類、使用されるポリマーの比率、及びポリマーマトリックス１２０の製造方法はすべて、ポリマーマトリックス１２０の特性を調整するために変更されうる。このような特性としては、ポリマーマトリックス１２０が分解し又は核酸１５０を放出する能力、ポリマーマトリックス１２０に対するｐＨの影響、ナノ粒子１００のサイズ、ナノ粒子１００に装填される脂質１４０及び核酸１５０の量、ナノ粒子１００の物理的特性(例えば、密度、融点、ガラス転移温度、弾性率など)、及びナノ粒子１００の化学的特性(例えば、分子量、極性、電荷など)を挙げることができる。１つの実施形態において、ポリマーマトリックス１２０は、患者の消化管内で分解するように製剤化される。特に、ポリマーマトリックス１２０は、患者の結腸内で分解するように製剤化されうる。
【0057】
１つの実施形態において、ナノ粒子１００の脂質１４０はカチオン性脂質塩である。特に、脂質１４０は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）又は１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＭＡ）であることができる。他の実施形態において、任意の脂質１４０は使用されうる。ナノ粒子１００には、約１０ｗｔ％～約４０ｗｔ％の脂質１４０又は約２０ｗｔ％～約３０ｗｔ％の脂質１４０が装填されうるが、ナノ粒子１００に装填される脂質１４０の量は、サイズ、核酸１５０の装填及び/又は放出、電荷、ゼータ電位などのナノ粒子１００の特性を調整するために変更されうる。脂質１４０の装填は、ポリマーマトリックス１２０の量に対する比率として表されることができる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／ポリマーマトリックス１２０の質量比が約１：４となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／ポリマーマトリックス１２０の質量比が約１：１となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／ポリマーマトリックス１２０の質量比が約１：２となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／ポリマーマトリックス１２０の質量比が約３：４となるように脂質１４０が装填されうる。脂質１４０の装填量は、核酸１５０の量に対する比率として表すこともできる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／核酸１５０の質量比が約１：１となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／核酸１５０の質量比が約２：１となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／核酸１５０の質量比が約５：４となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／核酸１５０の質量比が約７：４となるように脂質１４０が装填されうる。ナノ粒子１００には、脂質１４０／核酸１５０の質量比が約３：２となるように脂質１４０が装填されうる。脂質１４０の装填により、ナノ粒子１００の特性をより細かく調整することができる。一般に、ナノ粒子１００に装填される脂質１４０の量の増加は、核酸１５０の装填量の増加及びゼータ電位の増加に対応する(図７～８)。ナノ粒子１００は、典型的に、中性又はわずかに負の電荷を持つことが望ましいが、これはナノ粒子１００内の脂質１４０の装填量及び種類によって変更することができる。
【0058】
ナノ粒子１００の核酸１５０は短鎖ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、核酸１５０はオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、短いＤＮＡ及び/又はＲＮＡ分子、及び/又はオリゴマーであり、疾患の治療、遺伝子検査及び研究において幅広い用途がある。オリゴヌクレオチドを治療薬として使用することは、遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合するか、又は標的遺伝子に直接結合するかのいずれかによって、配列特異的な方法でタンパク質合成の基本機構に干渉する能力に依存している。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であることができる。ＡＳＯは、遺伝子発現を制御し、炎症性疾患及び腫瘍性疾患を治療するために使用することができる。
【0059】
オリゴヌクレオチドは、分子全体を構成するヌクレオチド残基の配列及び数によって特性化される。分子を構成するＤＮＡ及び/又はＲＮＡヌクレオチド単位の数は、通常、オリゴヌクレオチドの長さを表す。例えば、１０ヌクレオチド又は塩基のオリゴヌクレオチドは、「１０マー」オリゴヌクレオチドである。しばしば、バックボーン又は糖環の化学修飾は、例えばヌクレアーゼ耐性又は標的に対する特異性を高めるために行われる。
【0060】
生体吸収性粒子を作成するために使用される超音波処理工程中に核酸が剪断されるのを避けるために、７５ヌクレオチド未満の核酸が好ましい。さらに好ましくは、核酸は４０ヌクレオチド未満である。
【0061】
ナノ粒子１００には、少なくとも５ｗｔ％の核酸１５０、約５ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約３０ｗｔ％又はそれ以上の核酸１５０が装填されうるが、この量はナノ粒子１００の特性を調整するために変更されうる。
【0062】
ナノ粒子１００は、患者の消化管内で分解し、医療処置のために核酸１５０を放出するように構成される。１つの例において、ナノ粒子１００は患者の結腸内で吸収/分解されるように構成されており、したがって核酸１５０は結腸内に直接デリバリーされ、炎症性腸疾患(クローン病、潰瘍性大腸炎など)を治療することができる。さらに、ナノ粒子１００は、患者の任意の臓器内又は消化管(胃、腸など)の任意の地点で分解され、吸収され、又は活性剤を放出するように構成されうる。図示した実施形態において、ナノ粒子１００には炎症性腸疾患の治療に適した核酸１５０が装填されているが、他の実施形態において、ナノ粒子１００には、限定するわけではないが、心臓血管疾患、高血圧、慢性心不全、糖尿病、パーキンソン病、前立腺癌及び慢性腎臓病を含む、多種多様な医療問題の治療に適した核酸１５０又は任意の有効成分又は薬剤が装填されうる。
【0063】
次に図２を参照すると、別の例示的なナノ粒子１００’が示されている。図２のナノ粒子１００’は、図１のナノ粒子１００と類似しており、本明細書で説明されている点を除き、同様の参照番号は同様の要素を示している。図２に示すように、ナノ粒子１００’は、表面ポリマー１７０’も含みうる。１つの実施形態において、表面ポリマー１７０’は、ナノ粒子１００’の少なくとも表面１１０’に共有結合している。表面ポリマー１７０’の非限定的な例は、ＰＬＡとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコポリマーである。ＰＥＧが表面ポリマー１７０’として使用されるときに（単独で、又はコポリマーとして）、表面１１０’は「ＰＥＧ化」されていると説明されうる。表面ポリマー１７０’は、表面ポリマー１７０’の物理的ブレンドの存在下でナノ粒子１００’を形成することによって、又は表面ポリマー１７０’とポリマーマトリックス１２０’を含む三元共重合体を形成することによって、ナノ粒子１００’の表面１１０’に付加することができる。さらに、表面ポリマー１７０’は、ナノ粒子１００’上に位置するカップリング基を介して表面 １１０’に付加することができる。このようなカップリング基の非限定的な例としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）、スクシンイミジル活性エステル、及びＮＨ２－ＰＥＧが挙げられる。他の実施形態において、表面ポリマー１７０’は、ナノ粒子１００’が製造された後に表面１１０’に付加することができる。表面ポリマー１７０’は、ナノ粒子１００’の移動、ナノ粒子１００’の生体吸収、ナノ粒子１００’の分解、又はナノ粒子１００’の物理的特性又は化学的特性の変更を補助することができる。各ナノ粒子１００’は、少なくとも約１ｗｔ％、少なくとも約５ｗｔ％、少なくとも約１０ｗｔ％、少なくとも約１５ｗｔ％、又は少なくとも約２０ｗｔ％の表面ポリマー１７０’を含むことができる。幾つかの実施形態において、各ナノ粒子は、約１ｗｔ％～約２０ｗｔ％、約１ｗｔ％～約１５ｗｔ％、約１ｗｔ％～約１０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約１５ｗｔ％、又は約５ｗｔ％～約１０ｗｔ％で含むことができる。
【0064】
ここで図３を参照すると、図１のナノ粒子１００を製造する方法３００が示されている。製造方法３００には、適切な溶媒中に構造ポリマーマトリックス１２０及び脂質塩１４０を溶解すること３１０、核酸１５０を添加して混合物を超音波処理して油中水型エマルジョンを生成すること３２０、ポリビニルアルコールなどの水溶液を添加すること３３０、得られた混合物を超音波処理して油中水中油中水型エマルジョンを生成すること３４０、水を添加すること３５０、乾燥、遠心分離又は別の適切な方法によってナノ粒子１００を収集すること３６０、及び、ナノ粒子１００を洗浄すること３７０を含む。この方法はナノ粒子１００を製造する１つの方法を示しているが、方法３００に、油中水型エマルジョンを数時間ゆっくり振盪すること、水を添加した３５０の後、二重エマルジョンを一晩撹拌すること、洗浄３７０の後にナノ粒子１００を水中に分散すること、及び/又は洗浄３７０の後にナノ粒子１００を凍結乾燥するなどを含む追加の工程を加えることができる。溶解工程３１０は、ポリマーマトリックス１２０及び脂質１４０を効果的に溶解できる任意の溶媒、例えば、限定するわけではないが、塩化メチレンを使用して完了することができる。超音波処理工程３２０、３４０は、氷浴上で行うことができる。他の実施形態において、超音波処理は、様々な温度で、様々な時間にわたって、様々な振幅で行うことができる。製造方法３００の実施形態については、例７を参照されたい。ナノ粒子１００が製造されると、当該技術分野で知られているように、そして後の実施例で説明するように、ナノ粒子を分析することができる。
【0065】
ここで図４を参照すると、図２のナノ粒子１００’の製造方法３００’は部分的に示されている。図４に示される製造方法３００’は、図３の製造方法３００と類似しており、本明細書で説明されているものを除き、同様の参照番号は同様の要素を特定している。図４に示されるように、表面ポリマー１７０’は、溶解３１０’中にポリマーマトリックス１２０’及び脂質塩１４０’に付加される。
【0066】
ここで図５を参照すると、治療方法４００が示されている。この治療方法４００は、図１のナノ粒子１００に関して説明されているが、この治療方法４００は、図２のナノ粒子１００’にも同様に適用可能である。治療方法４００は、患者にナノ粒子１００を投与すること４１０、ここで、ポリマーマトリックス１２０は患者内で分解し４２０、続いてナノ粒子１００から患者に核酸４３０を放出すること４３０を含む。ナノ粒子１００は、丸薬、錠剤又は溶液を介して経口投与されるか４１０、又は注射によって投与される４１０ことができる。経口投与される場合に、ナノ粒子１００は、消化管内の点又は特定の領域で分解するカプセル（図示せず）内に最初に配置されうる。１つの実施形態において、カプセルは、ｐＨの変化に応じてカプセルが分解できるように腸溶性コーティングを有する。
【0067】
ナノ粒子１００は、ポリマーマトリックス１２０、脂質１４０及び/又は核酸１５０が体内に吸収されるように、生体吸収性となるように構成されている。吸収の１つの可能な方法は、細胞内での飲作用によるものである。飲作用において、細胞膜が伸びて細胞外物質の周囲に折り畳まれ、内部化された小胞を形成するパウチを形成する。小胞は最終的にリソソームと融合し、そこで内容物 (この場合はナノ粒子１００)が消化される。このようにして、ポリマーマトリックス１２０は、細胞の内部消化プロセスを通じて消化管内の細胞内で分解でき、その後、核酸１５０が細胞にデリバリーされる。このようにして、核酸１５０を患者の標的領域にデリバリーして、過敏性腸症候群、心血管疾患、高血圧、慢性心不全、糖尿病、パーキンソン病、前立腺癌又は慢性腎臓病などの様々な病気を治療することができる。
【0068】
図１～２に示されるナノ粒子１００、１００’及び図３～５に示される方法は、デバイス／方法の様々な特徴の例として提供されており、これらの図示された特徴の組み合わせは明らかに本発明の範囲内であるが、その例及びその説明は、本明細書で提供される発明概念が、より少ない特徴、追加の特徴又は代替の特徴から、図１～５に示される特徴の１つ以上に限定されることを示唆するものではない。例えば、様々な実施形態において、図５に示される方法の工程は、図３を参照して説明した工程を含むことができる。逆もまた真であることも理解されたい。さらに、図１に示される１つ以上の構成要素を、図２に示される構成要素に加えて、又は構成要素の代替として使用することができる。
【0069】
試験方法
特定の方法及び装置が以下に記載されているが、当業者によって適切であると判断される他の方法又は装置を代わりに使用してもよいことを理解されたい。
特定の方法及び装置が以下に記載されているが、当業者によって適切であると判断される他の方法又は装置を代わりに使用してもよいことを理解されたい。
【0070】
固有粘度
固有粘度（ＩＶ）は、抽出溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を使用して、Cannon MiniPV-HX自動粘度計を使用して測定された。
固有粘度（ＩＶ）は、抽出溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を使用して、Cannon MiniPV-HX自動粘度計を使用して測定された。
【0071】
ナノ粒子サイズ
ナノ粒子サイズは、マルチアングル光散乱モードでUltrasizer (Marlven Panalytical) を使用して測定された。
ナノ粒子サイズは、マルチアングル光散乱モードでUltrasizer (Marlven Panalytical) を使用して測定された。
【0072】
電荷
ナノ粒子分散体のゼータ電位は、マルチアングル光散乱モードでUltrasizer (Marlven Panalytical)を使用して測定された。
ナノ粒子分散体のゼータ電位は、マルチアングル光散乱モードでUltrasizer (Marlven Panalytical)を使用して測定された。
【0073】
オリゴヌクレオチドの放出
ナノ粒子から放出されるオリゴヌクレオチドの量及び速度は、例９で詳述されるようにゲル電気泳動によって測定された。
ナノ粒子から放出されるオリゴヌクレオチドの量及び速度は、例９で詳述されるようにゲル電気泳動によって測定された。
【0074】
ＰＥＧ密度特性
ナノ粒子表面上のＰＥＧ含有量は、例２１で詳述したようにＵＶアッセイによって測定された。
ナノ粒子表面上のＰＥＧ含有量は、例２１で詳述したようにＵＶアッセイによって測定された。
【実施例】
【0075】
例
ポリマー合成
例１～５で特定される生体吸収性ポリマーは、「吸収性ＤＬ-ラクチドトリメチレンカーボネートコポリエステルの分析及び特性」、Journal of Material Science: Materials in Medicine 4(1993) pp. 381-88で説明されている方法に従って合成された。
ポリマー合成
例１～５で特定される生体吸収性ポリマーは、「吸収性ＤＬ-ラクチドトリメチレンカーボネートコポリエステルの分析及び特性」、Journal of Material Science: Materials in Medicine 4(1993) pp. 381-88で説明されている方法に従って合成された。
【0076】
例１：Ｌ-ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー特性
本例では、Ｌ-ＰＬＡ：ＴＭＣの比率が７５：２５のコポリマーについて説明している。表１は、精製サンプルの形のこの例の組成物の特性データを示している。精製サンプルを得るために、Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣのコポリマーをクロロホルム（ＣＨＣｌ３）に２～５ｗｔ％で溶解し、１０倍イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で沈殿させ、次いで、真空乾燥した。この例において、ＩＶ (ＨＦＩＰ)＝１．３４９ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は３２．９５℃と決定された。
本例では、Ｌ-ＰＬＡ：ＴＭＣの比率が７５：２５のコポリマーについて説明している。表１は、精製サンプルの形のこの例の組成物の特性データを示している。精製サンプルを得るために、Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣのコポリマーをクロロホルム（ＣＨＣｌ３）に２～５ｗｔ％で溶解し、１０倍イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で沈殿させ、次いで、真空乾燥した。この例において、ＩＶ (ＨＦＩＰ)＝１．３４９ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は３２．９５℃と決定された。
【0077】
例２： Ｄ,Ｌ-ＰＬＡ：ＴＭＣ-ＰＥＧ５Ｋコポリマーの特性化
本例では、８６．４：８．７：４．９の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋについて説明する。表１は、この組成物の特性データを示す。この例では、ＩＶ （ＨＦＩＰ）＝１．３ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は３１．７℃と決定された。
本例では、８６．４：８．７：４．９の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋについて説明する。表１は、この組成物の特性データを示す。この例では、ＩＶ （ＨＦＩＰ）＝１．３ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は３１．７℃と決定された。
【0078】
例３： Ｄ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋコポリマーの特性化
本例では、７３．４：２１．８：４．８の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋについて説明する。表１は、この組成物の特性データを示す。この例において、ＩＶ （ＨＦＩＰ）＝１．２ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は２０．４℃と決定された。
本例では、７３．４：２１．８：４．８の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋについて説明する。表１は、この組成物の特性データを示す。この例において、ＩＶ （ＨＦＩＰ）＝１．２ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は２０．４℃と決定された。
【0079】
例４： Ｄ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋコポリマーの特性化
本例では、８２：８：１０の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋについて説明する。表１に、この組成物の特性データを示す。この例において、ＩＶ （ＨＦＩＰ）＝１．０ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は２６．２℃と決定された。
本例では、８２：８：１０の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋについて説明する。表１に、この組成物の特性データを示す。この例において、ＩＶ （ＨＦＩＰ）＝１．０ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は２６．２℃と決定された。
【0080】
例５：Ｄ,Ｌ-ＰＬＡ：ＴＭＣ―ＰＥＧ１０Ｋコポリマーの特性化
本例では、８６．５：８．５：５の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ１０Ｋについて説明する。表１は、この組成物の特性データを示す。この例において、ＩＶ（ＨＦＩＰ）＝１．４ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は３４．５℃と決定された。
本例では、８６．５：８．５：５の比率のコポリマーＤ,Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ１０Ｋについて説明する。表１は、この組成物の特性データを示す。この例において、ＩＶ（ＨＦＩＰ）＝１．４ｄＬ/ｇであり、ポリマーのガラス転移温度は３４．５℃と決定された。
【表1】
【0081】
例６：オリゴヌクレオチドの説明
本例は、ナノ粒子カプセル化の例で利用されるオリゴヌクレオチドについて説明する。
本例は、ナノ粒子カプセル化の例で利用されるオリゴヌクレオチドについて説明する。
【0082】
ナノ粒子カプセル化に使用される「オリゴ-１」と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの両端に５ヌクレオチドの２'Ｏ－メチル化が施された２０マーのオリゴヌクレオチドである。
【0083】
ナノ粒子カプセル化に使用される「オリゴ-２」と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、メチル化されていないＣ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇであり、星印はホスホロチオエート結合を示す。
【0084】
ナノ粒子のカプセル化に使用される「オリゴ-３」と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ｍＧ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＣ＊Ｔ＊ｍＧであり、メチル化は「ｍ」で示され、星印はホスホロチオエート結合を示す。
【0085】
例７：低レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ-ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、本明細書に記載のように、低レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰ、具体的には１９ｗｔ％の脂質塩ＤＯＴＡＰと１：１の比率の脂質塩ＤＯＴＡＰ／オリゴ－１の存在下で、Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子中にオリゴ－１をカプセル化することを示している。
本例は、本明細書に記載のように、低レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰ、具体的には１９ｗｔ％の脂質塩ＤＯＴＡＰと１：１の比率の脂質塩ＤＯＴＡＰ／オリゴ－１の存在下で、Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子中にオリゴ－１をカプセル化することを示している。
【0086】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ ７５：２５(「ＬＴ－７５」)ポリマー(例１に記載のとおり)及び５０ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液(DNase/RNaseフリー蒸留水、Invitrogen)０．５ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。混合物を、１/４インチのテーパープローブを備えたBranson SXF150超音波発生装置を使用して、氷水浴上で１分間超音波処理した。超音波処理には、振幅４５％の連続モードを使用した。油中水型(Ｗ/Ｏ)エマルジョンを、１００ｒｐｍ/分の速度で一晩シェーカーに置いた。分離した混合物を氷水上で再度１分間超音波処理し、良好な分散体を生成した。次に、約１５ｍＬの５％ポリビニルアルコール (Aldrich、Mowiol 4-88)水溶液を分散体に加えた。得られた混合物を、同じ超音波発生器及びプローブを使用して氷水浴上で２分間超音波処理した。超音波処理には４５％の振幅で連続モードを使用し、水中油型エマルジョンを生成した。次に、５００ｒｐｍで磁気撹拌しながら、２３０ｍＬの脱イオン水をエマルジョンに加えた。エマルジョンを室温で一晩撹拌し、塩化メチレンを除去した。これにより硬化したナノ粒子が得られ、これを４℃で３０分間５０００ｒｐｍで遠心分離して収集した (Beckman-Coulter Avanti-J15R 遠心分離機)。ナノ粒子を０．２ｗｔ％のポリビニルアルコール溶液中に再分散し、再度遠心分離して残留化学物質を除去した。上澄み液は廃棄した。洗浄したナノ粒子を脱イオン水１０ｍＬに分散させた。分散させたナノ粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。２０，０００倍で撮影した凍結乾燥したナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を図１３に示す。ナノ粒子は球形であり、単一であると決定された。
【0087】
例８：例７のナノ粒子のサイズ及び電荷の特性評価
本例は、例７に従って形成されたナノ粒子のサイズ及びゼータ電位の特性評価を示す。
本例は、例７に従って形成されたナノ粒子のサイズ及びゼータ電位の特性評価を示す。
【0088】
例７で説明したナノ粒子分散体を、試験前に脱イオン水で５～１０倍に希釈した。ナノ粒子分散体のサイズ及びゼータ電位の特性評価は、Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical、Malvern 英国)を使用した動的光散乱を利用して行った。結果を表２にまとめる。結果は図６にも示されており、ナノ粒子の直径(サイズとも呼ばれる)とナノ粒子に装填された脂質のレベルとの関係を示している。図８は、ゼータ電位とナノ粒子に装填された脂質のレベルとの関係を示している。
【0089】
例９：例７のナノ粒子のオリゴヌクレオチド装填特性評価
本例は、ナノ粒子のオリゴヌクレオチド装填の特性評価アッセイについて説明する。結果を表２及び図７にまとめる。
本例は、ナノ粒子のオリゴヌクレオチド装填の特性評価アッセイについて説明する。結果を表２及び図７にまとめる。
【0090】
ナノ粒子を計量し、１ｍＬのジメチルスルホキシド（Sigma Aldrich）中に溶解した。ナノ粒子/ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を３７℃の水浴で２時間インキュベートし、ナノ粒子を完全に溶解させた。オリゴヌクレオチドを脂質塩から脱複合化するために、２００μＬのＤＭＳＯ/ナノ粒子溶液を、ヌクレアーゼフリーの脱イオン水（Invitrogen）中の１００ｍｇ/ｍＬヘパリン（Sigma Aldrich）及び１００ｍＭオクチルＢ－Ｄ－ガラクトシド（Sigma Alrdich）溶液５００μＬに加えた。溶液を室温で５分間ボルテックスし、室温で３０分間シェーカーテーブルに置き、さらに５分間ボルテックスした後に、電気泳動ゲルに流して定量化した。電気泳動用に、２つのオリゴヌクレオチド標準を、ヌクレアーゼフリー水(Invitrogen)でそれぞれ２ｎｇ/μＬ及び１ｎｇ/μＬの濃度で調製した。オリゴヌクレオチド標準溶液には、試薬に起因する蛍光を考慮に入れるために、ナノ粒子サンプルに同じ濃度のヘパリン及びオクチルＢ－Ｄ－ガラクトシドが含まれている。各サンプル又は標準の１０μＬをマイクロ遠心管に入れた。２μＬの６Ｘ DNA オレンジローディングダイ(Invitrogen)を各サンプルに加え、よく混ぜた。各混合物の１２μＬすべてを、１Ｘ ＴＢＥバッファー中の１０ウェルの４～２０％ＴＢＥゲル (Invitrogen)のウェルに加えた。ゲルを２５０Ｖで２５分間試験した。ゲルを取り出し、１Ｘ Sybr Gold (１Ｘ ＴＢＥバッファーで希釈した５０，０００Ｘストック、Invitrogen)で２０分間、穏やかに揺すりながら染色した。ゲルを、BioRad Gel Doc システムでImage Readyソフトウェア(Biorad)を使用して画像化した。Image Readyソフトウェア(Biorad)の標準を使用して標準曲線を作成し、標準曲線から未知のサンプルの濃度を決定した。結果を表２にまとめ、図７は代表的な試験を示しており、核酸の装填量(ｗｔ％)とナノ粒子に装填された脂質のレベルとの関係を示している。
【0091】
例１０：中レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、本明細書に記載のとおりの、中レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰ、具体的には２６ｗｔ％の脂質塩ＤＯＴＡＰ及び３：２の脂質塩ＤＯＴＡＰ／オリゴ－１の比の存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
本例は、本明細書に記載のとおりの、中レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰ、具体的には２６ｗｔ％の脂質塩ＤＯＴＡＰ及び３：２の脂質塩ＤＯＴＡＰ／オリゴ－１の比の存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
【0092】
ナノ粒子は、約２２０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を８ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解することによって調製した。１３０ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)０．５ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。例７で説明したのと同じ手順に従ってナノ粒子を作製し、洗浄した。洗浄したナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させた。分散したナノ粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0093】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチド装填量を例９で説明したように測定した。結果を表２にまとめる。代表的な試験を図６～８に示す。
【0094】
例１１：高レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、本明細書に記載のとおりの、高レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰ、具体的には３２ｗｔ％の脂質塩ＤＯＴＡＰ及び２：１の脂質塩ＤＯＴＡＰ／オリゴ－１の比の存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
本例は、本明細書に記載のとおりの、高レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰ、具体的には３２ｗｔ％の脂質塩ＤＯＴＡＰ及び２：１の脂質塩ＤＯＴＡＰ／オリゴ－１の比の存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
【0095】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を室温で６ｍＬの塩化メチレンに溶解することによって調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)０．５ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。ナノ粒子を、例７で説明したのと同じ手順に従って作成及び洗浄した。洗浄したナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させた。分散したナノ粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0096】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチド装填量を例９で説明したように測定した。結果を表２にまとめる。代表的な試験を図６～８に示す。
【0097】
例１２：低レベルの脂質塩ＤＯＴＭＡを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、本明細書に記載のとおりの低レベルの脂質塩ＤＯＴＭＡの存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
本例は、本明細書に記載のとおりの低レベルの脂質塩ＤＯＴＭＡの存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
【0098】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)及び５０ｍｇの脂質塩ＤＯＴＭＡ（１,２－ジ－Ｏ―オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド塩 Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。０．５ｍＬの１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)をポリマー/ＤＯＴＭＡ油溶液にピペットで入れた。ナノ粒子を例７で説明したのと同じ手順に従って製造及び洗浄した。洗浄されたナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散した。分散されたナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0099】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を、例９で説明したように測定した。結果を表２にまとめている。代表的な試験を図６～８に示す。
【0100】
例１３：高レベルの脂質塩ＤＯＴＭＡを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、本明細書に記載のとおりの高レベルの脂質塩ＤＯＴＭＡの存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
本例は、本明細書に記載のとおりの高レベルの脂質塩ＤＯＴＭＡの存在下でのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
【0101】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＭＡ（１,２－ジ－Ｏ―オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩 Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液(DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。ナノ粒子を例７に記載したものと同じ手順に従って作製及び洗浄した。洗浄したナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させた。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0102】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８に記載のとおり測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を例９に記載のとおり測定した。結果を表２にまとめる。代表的な試験を図６～８に示す。
【0103】
例１４：低レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＰＬＧＡコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、比較として低レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＧＡコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
本例は、比較として低レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＧＡコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
【0104】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＰＬＧＡポリマー(Resomer（登録商標） RG 756 S、ポリ (D,L-ラクチド-コ-グリコリド)、Evonik Industries、ドイツから購入)及び５０ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩 Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)０．５ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。ナノ粒子を例７で説明したのと同じ手順に従って製造及び洗浄した。洗浄されたナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させた。分散された粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0105】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を例９で説明したように測定した。結果を表２にまとめている。
【0106】
例１５：高レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＰＬＧＡコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、比較として高レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＧＡコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
本例は、比較として高レベルの脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＧＡコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１のカプセル化を示す。
【0107】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＰＬＧＡポリマー(Resomer（登録商標） RG 756 S、ポリ (D,L-ラクチド-コ-グリコリド)、Evonik Industries、ドイツから購入)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１水溶液(DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。ナノ粒子を例７で説明したのと同じ手順に従って作製及び洗浄した。洗浄したナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させた。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0108】
【0109】
例１６：オリゴヌクレオチドの放出
ｐＨ７及びｐＨ４でのカプセル化されたオリゴヌクレオチドの放出、及び結果の概要を図９～１０に示し、放出された核酸の量を、本明細書で説明したように、理論的な装填量のパーセンテージ及びインキュベーション時間の関数として示している。
ｐＨ７及びｐＨ４でのカプセル化されたオリゴヌクレオチドの放出、及び結果の概要を図９～１０に示し、放出された核酸の量を、本明細書で説明したように、理論的な装填量のパーセンテージ及びインキュベーション時間の関数として示している。
【0110】
ｐＨ７でカプセル化されたオリゴヌクレオチドのバースト放出があるかどうかを決定するために、例１１に従って作成された１ｍｇ/ｍＬのオリゴヌクレオチドナノ粒子分散体１ｍＬを、１０％ウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で、３７℃で３０分間、１時間、４時間又は２４時間の時点でインキュベートした。分析用のサンプルを、比較のために２つの方法で収集した。第一の方法では、インキュベートしたサンプルを試験管から直接取り出し、例９で説明したように電気泳動ゲル(実線)で泳動させた。この方法では、ナノ粒子はゲルに入るには大きすぎること、及びゲル中に検出された量はアッセイで放出された「遊離」オリゴヌクレオチドのみであることを考慮に入れている。第二の方法では、インキュベートしたサンプルを４℃で１時間、１０，０００ｒｐｍ (Beckman Coulter)で遠心分離し、ナノ粒子を「遊離」オリゴヌクレオチド(破線)から分離した。次に、遠心分離サンプルの上清を電気泳動ゲルで泳動させた。これら２つの方法を使用して、いずれかの方法が力又は電流によってオリゴヌクレオチドをナノ粒子から人工的に分離しているかどうかを決定した。
【0111】
ｐＨ４でのカプセル化されたオリゴヌクレオチドの放出を確認するために、例１１に従って作製した１ｍｇ/ｍＬオリゴヌクレオチドナノ粒子分散体１ｍＬを、ｐＨ４のリン酸クエン酸緩衝液中でインキュベートした。インキュベーション及びゲル電気泳動を含む残りの分析は、ｐＨ７サンプルと同じである。
【0112】
例１７：脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ及びＰＬＡ―ＰＥＧコポリマー中のオリゴ－１のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ ―ＴＭＣ及びＰＬＡ―ＰＥＧ、２Ｋ～５Ｋコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ ―ＴＭＣ及びＰＬＡ―ＰＥＧ、２Ｋ～５Ｋコポリマーナノ粒子へのオリゴ－１オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
【0113】
ナノ粒子は、約１２０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)、４０ｍｇのＰＬＡ―ＰＥＧコポリマー(Sigma、メトキシポリ(エチレングリコール)-b-ポリ(D,L-ラクチド)、Ｍｗ＝２Ｋ～５Ｋ)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解することによって調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－１オリゴヌクレオチド水溶液(DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。混合物を、１/４インチのテーパープローブを備えた Branson SXF150 超音波処理器を使用して、氷水浴で１分間超音波処理した。超音波処理には、振幅４５％の連続モードを使用した。油中水型(Ｗ/Ｏ)エマルジョンを１００ｒｐｍ/分の速度でシェーカーに一晩置いた。分離した混合物を氷水で１分間再度超音波処理し、良好な分散体を生成した。
【0114】
次に、０．５ｗｔ/ｖ％のコール酸(Sigma)水溶液約１５ｍＬを分散体に加えた。得られた混合物を、同じ超音波発生器とプローブを使用して氷水浴で１分間超音波処理した。超音波処理には、振幅４５％の連続モードを使用し、水中油型エマルジョンを生成した。さらに、５００ｒｐｍで磁気撹拌しながら、脱イオン水２３０ｍＬをエマルジョンに加えた。エマルジョンを室温で一晩撹拌し、塩化メチレンを除去した。その結果、硬化したナノ粒子が得られ、これを４℃で３０分間５０００ｒｐｍの遠心分離(Beckman Coulter 遠心分離機)によって収集した。ナノ粒子を脱イオン水に再分散し、再度遠心分離して残留化学物質を除去した。上澄み液を廃棄した。洗浄したナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散した。分散したナノ粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を凍結乾燥した。
【0115】
ナノ粒子のサイズとゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を例９で説明したように測定した。結果を表４にまとめる。
【0116】
例１８：接線流ろ過システムを使用した粒子の洗浄
本例は、粒子の凝固を起こさずにナノ粒子を洗浄するために使用される洗浄プロセスを示している。
本例は、粒子の凝固を起こさずにナノ粒子を洗浄するために使用される洗浄プロセスを示している。
【0117】
ここで、ナノ粒子エマルジョンを洗浄し濃縮するために、接線流ろ過技術を使用する。このシステムでは、膜モジュール MIDIKROS 20CM 500K MPES 0.5MM FLL X FLL、Repligen Corporation (マサチューセッツ州ウォルサム)、製品 ID: D02-E500-05-N、mPES 膜、500 kD、20 cmを備えたPall Corporation (ニューヨーク州ポートワシントン) の Minimate EVO システム、製品 ID: OAPMPUNV を使用する。粒子エマルジョンは、最初に４００ｍＬから３０ｍＬに濃縮される。次に、濃縮されたエマルジョンに７０ｍＬの脱イオン水を攪拌下で加える。エマルジョンを、再び３０ｍＬに濃縮する。このプロセスを２回繰り返す。３回目には、エマルジョンを１００ｍＬから約１５ｍＬに濃縮する。次に、洗浄された粒子エマルジョンを、清潔な遠心分離管にポンプで送る。
【0118】
例１９：脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ中のオリゴ－２ナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのオリゴ－２オリゴヌクレオチドのＰＬＡ－ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのオリゴ－２オリゴヌクレオチドのＰＬＡ－ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのカプセル化を示す。
【0119】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－２オリゴヌクレオチド水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。混合物を、１/４インチのテーパープローブを装備したBranson SXF150 超音波処理機を使用して、氷水浴上で１分間超音波処理した。超音波処理には、振幅Ｃ４５％で連続モードを使用した。油中水型（Ｗ/Ｏ）エマルジョンを１００ｒｐｍ/分の速度で一晩シェーカーに置いた。分離された混合物を再度氷水で１分間超音波処理して、良好な分散体を生成した。次に、約１５ｍＬの０．５ｗｔ/ｖ％コール酸(Sigma)水溶液を分散体に加えた。得られた混合物を、同じ超音波処理機とプローブを使用して氷水浴上で１分間超音波処理した。超音波処理には振幅４５％で連続モードを使用し、水中油型エマルジョンを作成した。さらに、５００ｒｐｍで磁気撹拌しながらエマルジョンに脱イオン水２３０ｍＬを加えた。エマルジョンを室温で一晩撹拌し、塩化メチレンを除去した。この結果、硬化したナノ粒子が得られ、例１８で説明した方法を使用して洗浄した。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体は、粒子及びトレハロースの質量比が１：１０のトレハロース(Sigma)と、５ｍＭヒスチジンバッファーの存在下で粒子分散体中ｐＨ４．０で凍結乾燥した。
【0120】
凍結乾燥した粒子を脱イオン水とＰＢＳの両方で再構成した。脱イオン水及びＰＢＳのどちらにおいても、再構成された分散体に凝集は見られなかった。粒子分布を図１１に示した。
【0121】
洗浄及び再構成後のナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を例９で説明したように測定した。結果を表４にまとめる。
【0122】
例２０：脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ中のオリゴ－３のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ―ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－３オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ―ＴＭＣコポリマーナノ粒子へのオリゴ－３オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
【0123】
ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ７５：２５ポリマー(例１に記載のとおり)、１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－３オリゴヌクレオチド水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。混合物を、１/４インチのテーパープローブを備えたBranson SXF150 超音波発生装置を使用して、氷水浴上で１分間超音波処理した。超音波処理には、振幅Ｃ４５％の連続モードを使用した。油中水型（Ｗ/Ｏ）エマルジョンをシェーカーに置き、１００ｒｐｍ/分の速度で一晩撹拌した。分離した混合物を再度氷水で１分間超音波処理し、良好な分散体を生成した。次に、０．５ｗｔ/ｖ％のコール酸（Sigma）水溶液約１５ｍＬを分散体に加えた。得られた混合物を、同じ超音波発生器とプローブを使用して氷水浴で1分間超音波処理した。超音波処理には連続モードを使用し、振幅４５％で処理して水中油型エマルジョンを生成した。さらに、脱イオン水２３０ｍＬを、５００ｒｐｍで磁気撹拌しながらエマルジョンに加えた。エマルジョンを室温で一晩撹拌して、塩化メチレンを除去した。これにより硬化したナノ粒子が得られ、これを例１８で説明したとおりの接線流ろ過システムを使用して洗浄した。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を、例１９で説明したように凍結乾燥した。
【0124】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を例９で説明したように測定した。結果を表４にまとめている。
【0125】
例２１：ＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧ粒子上のＰＥＧ表面密度及び被覆率の特性評価
本例では、例２、３及び５のポリマーから作られたナノ粒子の表面上のＰＥＧ含有量の特性評価について説明する。
本例では、例２、３及び５のポリマーから作られたナノ粒子の表面上のＰＥＧ含有量の特性評価について説明する。
【0126】
ＰＥＧ化ナノ粒子は、約１６０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋ ８６．４：８．７：４．９ポリマー(例２で説明したとおり)を室温で６ｍｌの塩化メチレンに溶解することによって調製された。次に、約１５ｍＬの０．５ ｗｔ/ｖ％のコール酸(Sigma)水溶液をポリマー塩化メチレン溶液に加えた。得られた混合物を、同じ超音波発生器とプローブを使用して氷水浴上で１分間超音波処理した。超音波処理には４５％の振幅で連続モードを使用し、水中油型エマルジョンを生成した。さらに、５００ｒｐｍで磁気撹拌しながら、脱イオン水２３０ｍＬをエマルジョンに加えた。エマルジョンを室温で一晩撹拌して、塩化メチレンを除去した。これにより、例１８で説明したとおりの接線流ろ過システムを使用して洗浄された硬化ナノ粒子が得られた。
【0127】
ＰＥＧ化ナノ粒子は、Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ５Ｋポリマー７３．４：２１．８：４．８(例３に記載のとおり)及びＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧ１０Ｋポリマー８６．５：８．５：５(例５に記載のとおり)からも、上記と同じ方法で調製した。ＰＥＯとモリブドリン酸の錯形成反応を利用したＵＶアッセイを使用して、ナノ粒子上のＰＥＧ含有量を検出した。ＰＥＧ濃度を、検量線を使用してブランクと試験溶液の吸光度の差から求めた。Koopalら（「ポリエチレンオキシド分子量が水溶液中の濃度の測定に及ぼす影響」、Talanta、1982年、第29巻、p.495-501）によると、この方法はＰＥＯ分子量に依存しない。したがって、検量線は、異なる濃度（１０～５００μｇ/ｍＬ）の分子量５ＫのＰＥＧを使用して確立された。ブランクは脱イオン水から得られた。
【0128】
各バッチのナノ粒子の試験ＰＥＧ含有量を表３に示す。粒子上のＰＥＧ含有量はポリマー中の含有量に近く、これは、ほとんどのＰＥＧが粒子の表面にあることを意味する。
【表3】
【0129】
例２２： 脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧコポリマー中のオリゴ－２のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ－２オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ－２オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
【0130】
ナノ粒子は、約１００ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ：ＰＥＧ７３．４：２１．８：４．８ターポリマー(例３に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－２水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。例１８で説明したのと同じ手順に従ってナノ粒子を作製し、洗浄した。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を、トレハロース(Sigma)の存在下で、粒子／トレハロースの質量比が１：５になるように凍結乾燥した。また、凍結乾燥した粒子を脱イオン水及びＰＢＳで再構成した。脱イオン水及びＰＢＳのどちらでも、粒子の凝集は観察されなかった。
【0131】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を、少し変更を加えて例９で説明したように測定した。粒子を最初にアセトンに分散させ、室温で少なくとも３０分間放置した。次に、粒子を溶解するためにＤＭＳＯを加えた。ＤＭＳＯとアセトンの比率は、体積比で４：１である。ゲル電気泳動用に、透明な粒子ＤＭＳＯ/アセトン溶液を得た。ナノ粒子表面のＰＥＧ密度を例２１で説明したように測定した。予測例２８に従って補正することができる。結果を表４にまとめている。
【0132】
例２３：脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ－ＰＥＧコポリマー中のオリゴ－３のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ－３オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ－３オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
【0133】
ナノ粒子は、約１００ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ：ＰＥＧ７３．４：２１．８：４．８ターポリマー（例３に記載のとおり）及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc）を室温で６ｍＬの塩化メチレンに溶解することによって調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ ２ 水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。例１８で説明したのと同じ手順に従ってナノ粒子を作製し、洗浄した。分散したナノ粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を例２２で説明したように凍結乾燥した。
【0134】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を、少し変更を加えて例９で説明したように測定した。粒子は最初にアセトンに分散し、室温で少なくとも３０分間置いた。次に、ＤＭＳＯを加えて粒子を溶解した。ＤＭＳＯ／アセトンの比率は４：１である。ゲル電気泳動用に透明な粒子ＤＭＳＯ/アセトン溶液を得た。ナノ粒子表面上のＰＥＧ密度を例２１に記載のとおりに測定した。予測例２８に従って補正することができる。結果を表４にまとめる。
【0135】
例２４：脂質塩ＤＯＴＭＡを含むＰＥＧ：Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－３のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ－３オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ－３オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
【0136】
ナノ粒子は、約１００ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ：ＰＥＧ７３．４：２１．８：４．８ターポリマー(例３に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＭＡ（１,２－ジ－Ｏ―オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド塩 Avanti Polar Lipids Inc)を室温で６ｍＬの塩化メチレンに溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－２水溶液(DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。例１８で説明したのと同じ手順に従ってナノ粒子を作製し、洗浄した。分散したナノ粒子約１ｍＬをサイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を例２２で説明したように凍結乾燥した。
【0137】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を、少し変更を加えて例９で説明したように測定した。粒子を最初にアセトンに分散させ、室温で少なくとも３０分間放置した。次にＤＭＳＯを加えて粒子を溶解した。ＤＭＳＯ／アセトンの比率は体積比で４：１である。ゲル電気泳動用の透明な粒子ＤＭＳＯ/アセトン溶液を得た。ナノ粒子表面のＰＥＧ密度を例２１で説明したように測定した。予測例２８に従って補正されうる。結果を表４にまとめている。
【0138】
例２５：脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＰＥＧ：Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣコポリマー中のオリゴ－２のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＥＧ―ＰＬＡ－ＴＭＣターポリマーナノ粒子へのオリゴ－２のカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＥＧ―ＰＬＡ－ＴＭＣターポリマーナノ粒子へのオリゴ－２のカプセル化を示す。
【0139】
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧターポリマーナノ粒子へのモデルオリゴ-2オリゴヌクレオチドのカプセル化を示す。
【0140】
ナノ粒子は、約１００ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ：ＰＥＧ８６．５：８．５：５ターポリマー(例５に記載のとおり)及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc)を６ｍＬの塩化メチレンに室温で溶解して調製した。１００ｍｇ/ｍＬのオリゴ－２水溶液(DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。例１８に記載したものと同じ手順に従ってナノ粒子を作製し、洗浄した。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を例２２に記載のとおり凍結乾燥させた。
【0141】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例８に記載のとおり測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を、若干の変更を加えて例９に記載のとおりに測定した。粒子を最初にアセトンに分散し、室温で少なくとも３０分間放置した。次に、粒子を溶解するためにＤＭＳＯを加えた。ＤＭＳＯ／アセトンの比率は、体積比で４：１である。ゲル電気泳動用の透明な粒子 ＤＭＳＯ/アセトン溶液を得た。ナノ粒子表面上のＰＥＧ密度を例２１で説明したように測定した。予測例２８に従って補正することができる。結果を表４にまとめている。
【0142】
例２６：脂質塩ＤＯＴＡＰを含むＰＥＧ：Ｌ－ＰＬＡ：ＴＭＣ及びＬＴ７５コポリマー中のオリゴ－２のナノ粒子
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＥＧ－ＰＬＡ－ＴＭＣ及びＬＴ７５コポリマーナノ粒子へのオリゴ－２のカプセル化を示す。
本例は、脂質塩ＤＯＴＡＰの存在下でのＰＥＧ－ＰＬＡ－ＴＭＣ及びＬＴ７５コポリマーナノ粒子へのオリゴ－２のカプセル化を示す。
【0143】
ナノ粒子は、約８０ｍｇのＬ－ＰＬＡ：ＴＭＣ：ＰＥＧ（５Ｋ）８２：８：１０ポリマー（例４に記載のとおり）及び１００ｍｇの脂質塩ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物塩、Avanti Polar Lipids Inc）を室温で６ｍＬの塩化メチレンに溶解することによって調製した。１００ｍｇ/ｍＬのモデルオリゴ－２オリゴヌクレオチド水溶液 (DNase/RNase フリー蒸留水、Invitrogen)１ｍＬをポリマー/ＤＯＴＡＰ油溶液にピペットで入れた。ナノ粒子は、例１６で説明したのと同じ手順に従って作成及び洗浄した。洗浄したナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散した。分散したナノ粒子約１ｍＬを、サイズ及びゼータ電位の特性評価のために取っておいた。残りの分散体を例２２で説明したように凍結乾燥した。
【0144】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を例７で説明したように測定し、オリゴヌクレオチドの装填量を、少し変更を加えて例９で説明したように測定した。粒子をまずアセトンに分散し、室温で少なくとも３０分間放置した。次にＤＭＳＯを加えて粒子を溶解した。ＤＭＳＯ／アセトンの比率は４：１である。ゲル電気泳動用の透明な粒子 ＤＭＳＯ/アセトン溶液を得た。ナノ粒子表面上のＰＥＧ含有量を例２１で説明したように測定した。試験したＰＥＧ含有量が高いことは、試薬がオリゴ及び/又は脂質塩と複合化していることを示しており、予測例２８に従って補正できる。結果を表４にまとめた。
*例１７で説明したように、アッセイ開発のばらつきにより含有量が低い
例２２、２３、２４、２５及び２６で得られたこれらの測定されたＰＥＧｗｔ％値は、予測例２８に従って補正できる。
【表4】
例２２、２３、２４、２５及び２６で得られたこれらの測定されたＰＥＧｗｔ％値は、予測例２８に従って補正できる。
【0145】
例２７：ゲル抽出アッセイ
図１２は、上記例で説明したとおりのナノ粒子の標準、抽出及び特定の例のゲルアッセイを示している。
図１２は、上記例で説明したとおりのナノ粒子の標準、抽出及び特定の例のゲルアッセイを示している。
【0146】
予測例２８：ＰＥＧ表面密度及び被覆率アッセイのバックグラウンド読み取り値の決定
本例は、ＰＥＧ表面密度及び被覆率アッセイのバックグラウンド読み取り値を決定して、バックグラウンド読み取り値で初期ＰＥＧ読み取り値を調整できるようにする方法を示す。バックグラウンド読み取り値は、アッセイでの非特異的結合から生じる可能性があり、したがって、存在しない場合にはＰＥＧで正の値になる。この補正を行うと、ＰＬＡ－ＰＥＧ又はＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧを用いて生成された粒子のＰＥＧ表面密度及び被覆率のより正確な補正値が得られる。バックグラウンド読み取り値は、ＬＴ－７５、ＡＳＯ、脂質塩及びＰＥＧなしの粒子に基づいている。
本例は、ＰＥＧ表面密度及び被覆率アッセイのバックグラウンド読み取り値を決定して、バックグラウンド読み取り値で初期ＰＥＧ読み取り値を調整できるようにする方法を示す。バックグラウンド読み取り値は、アッセイでの非特異的結合から生じる可能性があり、したがって、存在しない場合にはＰＥＧで正の値になる。この補正を行うと、ＰＬＡ－ＰＥＧ又はＰＬＡ－ＴＭＣ－ＰＥＧを用いて生成された粒子のＰＥＧ表面密度及び被覆率のより正確な補正値が得られる。バックグラウンド読み取り値は、ＬＴ－７５、ＡＳＯ、脂質塩及びＰＥＧなしの粒子に基づいている。
【0147】
オリゴ－２及びＤＯＴＡＰを含むナノ粒子の場合に、ＬＴ－７５、オリゴ－２及びＤＯＴＡＰのナノ粒子を調製し(例１９に記載のとおり)、アッセイ(例２１に記載のとおり)によってＰＥＧ表面密度及び被覆率を分析して、ＰＥＧのバックグラウンド読み取り値を決定する。
【0148】
ＰＥＧ表面密度及び被覆率の補正値を評価するために、バックグラウンド読み取り値で得られた値をＰＥＧを含むナノ粒子から減算する。
【0149】
本出願の発明は、上記で、一般的に及び特定の実施形態に関して説明されている。開示の範囲から逸脱することなく、実施形態に様々な修正及び変更を加えることができることは当業者に明らかである。したがって、実施形態は、添付の請求項及びその均等の範囲内であれば、本発明の修正及び変更を網羅するものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-03
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0149】
本出願の発明は、上記で、一般的に及び特定の実施形態に関して説明されている。開示の範囲から逸脱することなく、実施形態に様々な修正及び変更を加えることができることは当業者に明らかである。したがって、実施形態は、添付の請求項及びその均等の範囲内であれば、本発明の修正及び変更を網羅するものとする。
（態様）
（態様１）
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、
ポリマーマトリックス、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、及び、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１質量パーセントのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、製剤。
（態様２）
前記複数の生体吸収性粒子は平均粒子サイズが３００ｎｍ未満である、態様１記載の製剤。
（態様３）
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約５質量パーセントのＡＳＯを含む、態様１～２のいずれか１項記載の製剤。
（態様４）
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１０質量パーセントのＡＳＯを含む、態様１～３のいずれか１項記載の製剤。
（態様５）
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１５質量パーセントのＡＳＯを含む、態様１～４のいずれか１項記載の製剤。
（態様６）
前記ポリマーマトリックスはトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）を含む、態様１～５のいずれか１項記載の製剤。
（態様７）
前記ポリマーマトリックスはＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマーを含む、態様１～６のいずれか１項記載の製剤。
（態様８）
ＴＭＣ／ＰＬＡの比は約２５／７５である、態様７記載の製剤。
（態様９）
前記ポリマーマトリックスはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマーを含む、態様１～８のいずれか１項の製剤。
（態様１０）
前記生体吸収性粒子のそれぞれの表面に結合した表面ポリマーをさらに含む、態様１～９のいずれか１項記載の製剤。
（態様１１）
前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、態様１０記載の製剤。
（態様１２）
前記生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む、態様１１記載の製剤。
（態様１３）
前記複数の生体吸収性粒子は、約１０質量パーセント～約４０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、態様１～１２のいずれか１項記載の製剤。
（態様１４）
前記複数の生体吸収性粒子は、約２０質量パーセント～約３０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、態様１～１３のいずれか１項記載の製剤。
（態様１５）
前記複数の生体吸収性粒子はナノ粒子を含む、態様１～１４のいずれか１項記載の製剤。
（態様１６）
前記複数の生体吸収性粒子はマイクロ粒子を含む、態様１～１４のいずれか１項記載の製剤。
（態様１７）
態様１～１６のいずれか１項記載の製剤を患者にデリバリーすること、及び、
前記ポリマーマトリックスが患者内で分解し、患者内で核酸が放出されるのに十分な時間を与えること、
の工程を含む、治療を必要とする患者を治療する方法。
（態様１８）
（ａ）構造ポリマー及びカチオン性脂質を溶媒に溶解すること、
（ｂ）溶解した構造ポリマー及びカチオン性脂質に長さ２～７５ヌクレオチドの核酸を添加すること、
（ｃ）前記構造ポリマー、前記カチオン性脂質及び前記核酸の混合物を第一の超音波処理で超音波処理して油中水型エマルジョンを作成すること、
（ｄ）前記油中水型エマルジョンに水溶液を添加すること、
（ｅ）前記油中水型エマルジョンを第二の超音波処理で超音波処理して水中油中水型エマルジョンを生成すること、
（ｆ）前記水中油中水型エマルジョンに水を添加すること、
（ｇ）前記水中油中水型エマルジョンから複数の粒子を収集すること、及び、
（ｈ）前記複数の粒子を洗浄すること，
を含む、生体吸収性粒子の製剤を製造する方法。
（態様１９）
前記カチオン性脂質及び前記構造ポリマーを質量比約１：４～約１：１の比率で溶解する、態様１８記載の方法。
（態様２０）
前記核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、約５質量パーセント～約２０質量パーセントで複数の粒子に担持される、態様１８又は１９記載の方法。
（態様２１）
前記第一の超音波処理及び前記第二の超音波処理は氷浴で完了される、態様１８～２０のいずれか１項記載の方法。
（態様２２）
前記水溶液はポリビニルアルコール溶液である、態様１８～２１のいずれか１項記載の方法。
（態様２３）
前記エマルジョンから複数の粒子を収集する工程は遠心分離によって完了される、態様１８～２２のいずれか１項記載の方法。
（態様２４）
油溶液を糖及びバッファーの存在下で凍結乾燥することをさらに含む、態様１８～２３のいずれか１項記載の方法。
（態様２５）
前記糖はトレハロースである、態様２４記載の方法。
（態様２６）
前記バッファーはヒスチジンである、態様２４～２５のいずれか１項記載の方法。
（態様２７）
（ａ）患者に複数の粒子をデリバリーすること、ここで、各粒子は、
（ｉ）ポリマーマトリックス、
（ｉｉ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された長さ２～７５のヌクレオチドの核酸、及び、
（ｉｉｉ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、各粒子における前記カチオン性脂質の前記ポリマーマトリックスに対する比は質量比で約１：４～約１：１である、及び、
（ｂ）前記ポリマーマトリックスが患者内で生分解し、前記核酸を放出するのに十分な時間を経過させること、
を含む、治療を必要とする患者を治療する方法。
（態様２８）
前記核酸は、前記複数の粒子に約５質量パーセント～約２０質量パーセントで装填されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、前記カチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＭＡ）又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）のいずれかである、態様２７記載の方法。
（態様２９）
前記ポリマーマトリックスは患者の結腸内で生分解する、態様２７又は２８記載の方法。
（態様３０）
各粒子は、各粒子の表面に表面ポリマーをさらに含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、態様２７～２９のいずれか１項記載の方法。
（態様３１）
各粒子は少なくとも５ｗｔ％のＰＥＧを含む、態様３０記載の方法。
（態様３２）
前記複数の粒子はナノ粒子を含む、態様２７～３１のいずれか１項記載の方法。
（態様３３）
患者は、炎症性腸疾患、心血管疾患、高血圧、慢性心不全、糖尿病、パーキンソン病、前立腺癌又は慢性腎臓病を有する、態様２７～３２のいずれか１項記載の方法。
（態様３４）
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、
（ａ）ポリマーマトリックス、
（ｂ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された核酸、
（ｃ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、及び，
（ｄ）前記各生体吸収性粒子の表面に結合した表面ポリマー，
を含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記各生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む，製剤。
（態様）
（態様１）
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、
ポリマーマトリックス、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、及び、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１質量パーセントのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、製剤。
（態様２）
前記複数の生体吸収性粒子は平均粒子サイズが３００ｎｍ未満である、態様１記載の製剤。
（態様３）
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約５質量パーセントのＡＳＯを含む、態様１～２のいずれか１項記載の製剤。
（態様４）
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１０質量パーセントのＡＳＯを含む、態様１～３のいずれか１項記載の製剤。
（態様５）
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも約１５質量パーセントのＡＳＯを含む、態様１～４のいずれか１項記載の製剤。
（態様６）
前記ポリマーマトリックスはトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）を含む、態様１～５のいずれか１項記載の製剤。
（態様７）
前記ポリマーマトリックスはＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマーを含む、態様１～６のいずれか１項記載の製剤。
（態様８）
ＴＭＣ／ＰＬＡの比は約２５／７５である、態様７記載の製剤。
（態様９）
前記ポリマーマトリックスはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマーを含む、態様１～８のいずれか１項の製剤。
（態様１０）
前記生体吸収性粒子のそれぞれの表面に結合した表面ポリマーをさらに含む、態様１～９のいずれか１項記載の製剤。
（態様１１）
前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、態様１０記載の製剤。
（態様１２）
前記生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む、態様１１記載の製剤。
（態様１３）
前記複数の生体吸収性粒子は、約１０質量パーセント～約４０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、態様１～１２のいずれか１項記載の製剤。
（態様１４）
前記複数の生体吸収性粒子は、約２０質量パーセント～約３０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、態様１～１３のいずれか１項記載の製剤。
（態様１５）
前記複数の生体吸収性粒子はナノ粒子を含む、態様１～１４のいずれか１項記載の製剤。
（態様１６）
前記複数の生体吸収性粒子はマイクロ粒子を含む、態様１～１４のいずれか１項記載の製剤。
（態様１７）
態様１～１６のいずれか１項記載の製剤を患者にデリバリーすること、及び、
前記ポリマーマトリックスが患者内で分解し、患者内で核酸が放出されるのに十分な時間を与えること、
の工程を含む、治療を必要とする患者を治療する方法。
（態様１８）
（ａ）構造ポリマー及びカチオン性脂質を溶媒に溶解すること、
（ｂ）溶解した構造ポリマー及びカチオン性脂質に長さ２～７５ヌクレオチドの核酸を添加すること、
（ｃ）前記構造ポリマー、前記カチオン性脂質及び前記核酸の混合物を第一の超音波処理で超音波処理して油中水型エマルジョンを作成すること、
（ｄ）前記油中水型エマルジョンに水溶液を添加すること、
（ｅ）前記油中水型エマルジョンを第二の超音波処理で超音波処理して水中油中水型エマルジョンを生成すること、
（ｆ）前記水中油中水型エマルジョンに水を添加すること、
（ｇ）前記水中油中水型エマルジョンから複数の粒子を収集すること、及び、
（ｈ）前記複数の粒子を洗浄すること，
を含む、生体吸収性粒子の製剤を製造する方法。
（態様１９）
前記カチオン性脂質及び前記構造ポリマーを質量比約１：４～約１：１の比率で溶解する、態様１８記載の方法。
（態様２０）
前記核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、約５質量パーセント～約２０質量パーセントで複数の粒子に担持される、態様１８又は１９記載の方法。
（態様２１）
前記第一の超音波処理及び前記第二の超音波処理は氷浴で完了される、態様１８～２０のいずれか１項記載の方法。
（態様２２）
前記水溶液はポリビニルアルコール溶液である、態様１８～２１のいずれか１項記載の方法。
（態様２３）
前記エマルジョンから複数の粒子を収集する工程は遠心分離によって完了される、態様１８～２２のいずれか１項記載の方法。
（態様２４）
油溶液を糖及びバッファーの存在下で凍結乾燥することをさらに含む、態様１８～２３のいずれか１項記載の方法。
（態様２５）
前記糖はトレハロースである、態様２４記載の方法。
（態様２６）
前記バッファーはヒスチジンである、態様２４～２５のいずれか１項記載の方法。
（態様２７）
（ａ）患者に複数の粒子をデリバリーすること、ここで、各粒子は、
（ｉ）ポリマーマトリックス、
（ｉｉ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された長さ２～７５のヌクレオチドの核酸、及び、
（ｉｉｉ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、各粒子における前記カチオン性脂質の前記ポリマーマトリックスに対する比は質量比で約１：４～約１：１である、及び、
（ｂ）前記ポリマーマトリックスが患者内で生分解し、前記核酸を放出するのに十分な時間を経過させること、
を含む、治療を必要とする患者を治療する方法。
（態様２８）
前記核酸は、前記複数の粒子に約５質量パーセント～約２０質量パーセントで装填されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、前記カチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＭＡ）又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）のいずれかである、態様２７記載の方法。
（態様２９）
前記ポリマーマトリックスは患者の結腸内で生分解する、態様２７又は２８記載の方法。
（態様３０）
各粒子は、各粒子の表面に表面ポリマーをさらに含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、態様２７～２９のいずれか１項記載の方法。
（態様３１）
各粒子は少なくとも５ｗｔ％のＰＥＧを含む、態様３０記載の方法。
（態様３２）
前記複数の粒子はナノ粒子を含む、態様２７～３１のいずれか１項記載の方法。
（態様３３）
患者は、炎症性腸疾患、心血管疾患、高血圧、慢性心不全、糖尿病、パーキンソン病、前立腺癌又は慢性腎臓病を有する、態様２７～３２のいずれか１項記載の方法。
（態様３４）
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、
（ａ）ポリマーマトリックス、
（ｂ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化された核酸、
（ｃ）前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、及び，
（ｄ）前記各生体吸収性粒子の表面に結合した表面ポリマー，
を含み、前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記各生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＰＥＧを含む，製剤。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の生体吸収性粒子を含み、各生体吸収性粒子は、ポリマーマトリックス、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、及び、
前記ポリマーマトリックス内にカプセル化されたカチオン性脂質、
を含み、前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも１質量パーセントのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み、
前記ポリマーマトリックスは、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマー、またはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマーおよびＴＭＣを含む、製剤。
【請求項2】
前記複数の生体吸収性粒子は平均粒子サイズが３００ｎｍ未満である、請求項１記載の製剤。
【請求項3】
前記複数の生体吸収性粒子は少なくとも５質量パーセントのＡＳＯを含む、請求項１～２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項4】
ＴＭＣ／ＰＬＡの比は約２５／７５である、請求項１記載の製剤。
【請求項5】
前記生体吸収性粒子のそれぞれの表面に結合した表面ポリマーをさらに含む、請求項１～２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項6】
前記表面ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５記載の製剤。
【請求項7】
前記複数の生体吸収性粒子は、１０質量パーセント～４０質量パーセントのカチオン性脂質を含む、請求項１～２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項8】
前記複数の生体吸収性粒子はナノ粒子を含む、請求項１～２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項9】
前記複数の生体吸収性粒子はマイクロ粒子を含む、請求項１～２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項10】
（ａ）構造ポリマー及びカチオン性脂質を溶媒に溶解すること、（ｂ）溶解した構造ポリマー及びカチオン性脂質に長さ２～７５ヌクレオチドの核酸を添加すること、
（ｃ）前記構造ポリマー、前記カチオン性脂質及び前記核酸の混合物を第一の超音波処理で超音波処理して油中水型エマルジョンを作成すること、
（ｄ）前記油中水型エマルジョンに水溶液を添加すること、
（ｅ）前記油中水型エマルジョンを第二の超音波処理で超音波処理して水中油中水型エマルジョンを生成すること、
（ｆ）前記水中油中水型エマルジョンに水を添加すること、
（ｇ）前記水中油中水型エマルジョンから複数の粒子を収集すること、及び、
（ｈ）前記複数の粒子を洗浄すること，
を含み、
前記構造ポリマーは、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ＴＭＣとポリ乳酸（ＰＬＡ）とのコポリマー、またはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマーおよびＴＭＣから選択される、生体吸収性粒子の製剤を製造する方法。
【請求項11】
前記カチオン性脂質及び前記構造ポリマーを質量比１：４～１：１の比率で溶解する、請求項１０記載の方法。
【請求項12】
前記核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、５質量パーセント～２０質量パーセントで複数の粒子に担持される、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項13】
前記第一の超音波処理及び前記第二の超音波処理は氷浴で完了される、請求項１０～１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項14】
前記水溶液はポリビニルアルコール溶液である、請求項１０～１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項15】
前記エマルジョンから複数の粒子を収集する工程は遠心分離によって完了される、請求項１０～１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項16】
油溶液を糖及びバッファーの存在下で凍結乾燥することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項17】
前記糖はトレハロースである、請求項１６記載の方法。
【請求項18】
前記バッファーはヒスチジンである、請求項１６～１７のいずれか１項記載の方法。
【国際調査報告】